KR20200042485A - EGFR 및 cMET에 결합하는 항체 - Google Patents

EGFR 및 cMET에 결합하는 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표피성장인자 수용체(EGFR)의 세포외 부위에 결합하는 제1 가변 도메인 및 수용체 티로신 키나아제인 인간 MET 원발암 유전자 (cMET)의 세포외 부위에 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 공통 경쇄를 포함할 수 있다. 이는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 전장(full length) 항체일 수 있다. 일 구현예에서 상기 이중특이적 항체는 1:1의 항-EGFR, 항-cMET 화학양론을 가지는 IgG1 포맷 항체이다. 일 구현예에서, 상기 항체는 EGFR에 결합하는 하나의 가변 도메인과 cMET에 결합하는 하나의 가변 도메인을 가진다.

Description

EGFR 및 cMET에 결합하는 항체
본 발명은 항체 분야에 관련된 것이며, 구체적으로는 인간 항체를 포함하는, 이상 세포가 관련된 질환의 치료를 위한 치료용 항체에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 보다 구체적으로는 다중특이적 항체를 포함하는, EGFR 및 cMET에 결합하는 항체와, EGFR 및 cMET 양성 세포, 특히 종양세포와 결합시키기 위한 이들 항체의 용도에 관한 것이다.
표피성장인자(EGF) 수용체(EGFR)는 세포외 단백질 리간드의 표피성장인자 패밀리(EGF-family) 멤버이다. EGFR은 또한 ErbB-1 수용체로도 알려져 있다. 이 수용체는 과거 다양한 이름(EGFR; ERBB; ERBB1; HER1; PIG61; mENA)을 가지고 있었다. 본 발명에서 인간에서의 ErbB-1, EGFR 또는 HER1 은 서로 교환적으로 쓰일 수 있다. EGFR은 ErbB 패밀리 수용체의 멤버로서, 4개의 밀접하게 연관된 수용체 티로신 키나아제인 ErbB-1(EGFR), ErbB-2 (HER2/c-neu; Her2), ErbB-3 (Her 3) 및 ErbB-4 (Her 4)의 하위 패밀리이다.
EGFR는 세포 표면에 존재하며, 표피성장인자 및 전환성장인자 α(TGFα)를 포함하는 특정 리간드에 결합함으로써 활성화될 수 있다. 성장인자 리간드에 의해 활성화되면, 수용체는 불활성의 모노머 형태에서 활성의 호모다이머로 전환된다. 리간드 결합 후 호모다이머를 형성하는 것 외에도, EGFR은 ErbB2와 같은 ErbB 수용체 패밀리의 다른 멤버와 쌍을 이루어 활성화된 헤테로다이머를 형성한다. 다이머는 리간드-결합이나 활성화된 EGFR 클러스터 없이도 리간드 결합 후에 형성될 수 있다.
EGFR 다이머화는 내재적인 세포내 단백질-티로신 키나아제(PTK) 활성을 자극한다. 이러한 활성은 세포 증식 및 분화로 이어지는 몇몇 신호 전달 캐스케이드를 유도한다. EGFR의 키나아제 도메인은 복합체를 이루는 다른 수용체의 티로신 잔기를 교차 인산화할 수 있고, 이를 통해 활성화될 수 있다.
돌연변이를 포함하는 EGFR은 몇몇 형태의 암에서 동정되었다. 이는 다양한 종류의 항암 치료의 타겟이다. 이러한 치료는 폐암 치료를 위한 제피티닙(Gefitinib) 및 에를로티닙(Erlotinib)과 같은 EGFR 티로신 키나아제 억제제(EGFR-TKI)와, 대장암 및 두경부암 치료를 위한 세툭시맙 및 파니투무맙과 같은 항체를 포함한다.
세툭시맙(Cetuximab) 및 파니투무맙(panitumumab)은 수용체를 억제하는 단클론 항체이다. 임상 연구 중에 있는 다른 단클론 항체로는 잘루투무맙(zalutumumab), 니모투주맙(Nimotuzumab) 및 마투주맙(matuzumab)이 있다. 단클론 항체는 리간드가 수용체에 결합하는 것을 차단함으로써 세포외 리간드-유도 수용체 활성화를 차단한는 것을 목적으로 한다. 결합 부위가 차단되면, 신호-유도 분자는 효과적으로 결합하지 못하여 다운스트림 신호전달을 활성화하지 못하게 된다. 리간드-유도 수용체 활성화는 불활성화된 수용체 형태를 안정화시킴으로써 억제될 수도 있다(마투주맙).
지금까지, EGFR 표적 치료는 시간에 따른 치료 저항성을 야기하였다. EGFR-TKI에 대한 저항성을 설명하는 다양한 메카니즘이 제안되었다. 진행성 비소세포 폐암(NSCLC) 환자에서 저항성의 메카니즘은 2차 돌연변이(예를 들어 T790M, C797S)의 발생, 대체 신호의 활성화(예를 들어 Met, HGF, AXL, Hh, IGF-1R), 비정상적 하위 경로(예를 들어 AKT 돌연변이, PTEN의 상실), EGFR-TKI-매개 아폽토시스 경로(예를 들어 BCL2-유사 11/BIM 삭제 다형성) 및 조직학적 변형을 포함한다. 몇몇 저항성의 메카니즘이 알려졌지만 아직 알려지지 않은 것들도 있다. 유사하게, EGFR 항체를 투여받은 결장직장암 환자는 시간이 경과함에 따라 저항성이 나타난다. 이는 KRAS 돌연변이의 출연 때문일 수 있다. KRAS 돌연변이를 가지지 않는 환자들은 항-EGFR 항체 치료 동안 저항성의 획득에 MET 원발암 유전자(Proto-Oncogene)의 증폭이 관여하였을 수 있다(Bardelli et al., 2013; Cancer Discov. Jun;3(6):658-73. doi: 10.1158/2159-8290.CD-12-0558). 종양은 처음부터 저항성을 가질 수도 있고 치료 도중 저항성이 생길 수도 있다. EGFR-표적 치료에 대한 저항성은 많은 EGFR 양성 암에서 관찰되며, 치료 기준을 개선하고 EGFR-표적 치료 저항성에 대한 대처 측면에서 보다 우수한, 효과적인 EGFR 암의 치료방법 개발이 요구되고 있다.
다양한 종양에서 MET 원발암 유전자인 수용체 티로신 키나아제(cMET) 및 간세포 성장인자(HGF)가 감소함이 보고되었다. 몇몇 암에서 리간드에 의한 cMET 활성화가 관찰되었다. 폐암, 유방암 및 다발성 골수종에서 혈청 및 종양내 HGF가 증가함이 관찰되었다(J. M. Siegfried et al., Ann Thorac Surg 66, 1915 (1998); P. C. Ma et al., Anticancer Res 23, 49 (2003); B. E. Elliott et al. Can J Physiol Ph암acol 80, 91 (2002); C. Seidel, et al, Med Oncol 15, 145 (1998)). 대장직장암, 폐암, 위암 및 신장암과 같은 다양한 암에서 cMET의 과발현, 증폭 또는 돌연변이가 일어나고, 리간드-비의존성 수용체 활성화가 일어날 수 있음이 보고되었다(C. Birchmeier et al, Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915 (2003); G. Maulik et al., 사이토카인 성장 Factor Rev 13, 41 (2002)). HGF의 발현 역시 HGF/cMET 신호 경로의 활성화와 관련이 이 있으며, 종양이 EGFR 표적 치료를 회피하는 탈출 메카니즘 중의 하나이다.
cMET 수용체는 공통의 전구체가 이황화-결합된 α/β 헤테로다이머로 단백질 분해되면서 생성된다. cMET의 세포 외 부분은 세 개의 도메인 형태로 구성된다. N-말단 영역은 α-서브유닛 전체와 β-서브유닛 일부를 포함하는 세마포린(Sema) 도메인을 형성한다. Sema 도메인 후에는 플렉신-세마포린-인테그린(PSI) 도메인이 나타나며, 4개의 이황화 결합을 포함한다. 이 도메인은 면역글로불린-유사 도메인과 관련이 있는 면역글로불린-플렉신(plexin)-전사(IPT) 도메인을 경유하여 막관통 나선과 결합한다. 세포내에서, cMET 수용체는 특유의 막근접 서열 및 카복시-말단 서열이 양옆에 결합된 티로신 키나아제 촉매 도메인을 포함한다(Organ and Tsao. Therapeutic advances in medical oncology 3.1_suppl (2011): 본 명세서에 참조로서 삽입된 S7-S19).
cMET의 리간드인 간세포 성장인자(HGF; 산란인자(scatter factor)로도 알려짐) 및 이의 스플라이싱된 아형(NK1, NK2)은 cMET 수용체의 알려진 리간드이다. HGF은 강력한 미토젠/모르포겐으로서 1991년에 동정되었다. HGF/cMET 신호 경로는 다양한 암의 발생 및 진행에 중요한 역할을 한다. 인간 암에서 HGF 또는 cMET의 조절이상 및/또는 과활성화는 불량한 예후와 관련이 있다. cMET는 과발현, 증폭, 또는 돌연변이을 통해 활성화될 수 있다. 활성화는 암의 발달, 진행, 침습적 성장 및 전이를 촉진할 수 있다. cMET는 HGF와 연계되거나 HGF와는 독립적으로 활성화될 수 있다. HGF-독립적인 활성화는 cMET 과발현의 경우에 발생한다. cMET가 풍부한 경우에도 리간드의 부재 시 (헤테로)다이머화 및 세포내 신호전달을 촉발할 수 있다. 추가적인 리간드도 이러한 cMET 과발현 세포의 작용에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. cMET 증폭은 cMET 과발현과 관련이 있으며 종양 아형의 바이오마커로 부각되었다.
HGF는 전신에 걸쳐 발현되어, 이 성장인자가 종양 기질 뿐 아니라 전신적으로 나타나는 사이토카인임을 알 수 있다. cMET 활성화의 양성 측분비(paracrine) 및/또는 자가분비(autocrine) 루프는 추가적인 cMET 발현을 야기할 수 있다. HGF 특이적 항체인 릴로투무맙(Rilotumumab, AMG102)은 위암 치료용으로 개발되었다. 임상 I상 및 Ⅱ상에서 유망한 결과를 보였으나 위암에 대한 1차 요법으로 시스플라틴과 카페시타빈을 사용한 Ⅲ상(RILOMET-2)은 자료안전성감시위원회 위원회에 따라 종료되었다(20070622).
EGFR-표적 치료에 대한 저항성과 cMET/HGF 신호의 관련성으로 인해 저항성을 조절하는 방법의 연구가 활성화되었다. 현재, 항-HGF 항체; 항 cMET 또는 cMET 항체와 cMET/EGFR(Lee et al., 2015; Immunotargets and Therapy 4: 35-44)를 포함하는 항체 기반 치료법은 임상적으로 효과적이지 않은 것으로 나타났다. cMET 항체인 오나투주맙(Onartuzumab, MetMabTM) 및 에미베투주맙(Emibetuzumab, LY-2875358)이 임상 Ⅱ상에서 평가되었다. 이들 중 오나투주맙이 EGFR-억제제인 에를로티닙과 병용투여시 결장직장암에 효과적인 것으로 나타났다. 그러나 이들 결과는 Ⅲ상의 무작위 임상시험에서 반복재현되지 못했다. MetMAb은 cMET에 대한 단가(monovalent) 단클론 항체(mAb)로서, HGF와 cMET의 결합 및 이에 따른 경로 활성화를 차단한다(Jin et al., 2008 Cancer Research Vol.68:pp4360-68).
항-EGFR, cMET 및 HGF 면역치료의 문제점을 극복하기 위해, 본 발명은 표피성장인자 수용체(EGFR)의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제1 가변 도메인 및 cMET 원발암 유전자인 수용체 티로신 키나아제(cMET)에 결합할 수 있는 제2 가변 도메인을 포함하는 신규한 이중특이적 항체를 제공한다.
지금까지, 몇몇 이중특이적 EGFR x cMET 항체가 당업계에 알려졌다. Castoldi R. 등(2013)은 항체 5D5(또는 MetMab)의 cMET 결합 부위와 세툭시맙의 EGFR 결합 부위를 가지는 MetHer1로 명명된 이중특이적 EGFR x cMET 항체를 보고하였다. 상기 이중특이적 항체는 2:1의 고정된 EGFR 및 cMET 결합 화학양론을 가졌다(보충도면 참조).
US2014-0378664는 다양한 이중특이적 항체들 중 cMET x EGFR 이중특이적 항체에 대해 개시한다. 완전한 이중특이적 항체는 단일 단백질로서 생산되어 이후 단백질 분해과정을 통해 절단된다. 2개의 VH/VL 도메인이 단일쇄 Fv 절편으로서 만들어진다. 항체의 결합은 위암 세포주에서 cMET 분해와 Akt 인산화를 유도한다. Moores 등(2016)은 조절된 Fab-암 교환 (cFAE)에 의해 생산되는 JNJ-61186372로 명명된 이중특이적 cMET x EGFR 항체에 대해 기술하였으는데, 상기 항체는 면역원성에 중요한 EU 번호 기준 405번 및 409번 위치에 돌연변이를 가진다. JNJ-61186372는 cMET의 리간드인 HGF를 발현하는 종양 세포주 H1975가 이식된 모델에서 인 비보 활성을 나타냈다. 이 종양 모델은 항체의 ADCC 활성에 좌우되는 것으로 알려졌다(Ahmed et al., 2015). JNJ-61186372는 cMET에 대한 친화도가 EGFR에 대한 그것보다 약 40배 높은 친화도 불균형을 가지며(Moores et al. (2016)), 잘루투무맙 유래 항-EGFR 암(arm)은 주입 시 피부질환 등의 반응을 유발하는 것으로 알려졌다.
LY3164530는 세툭시맙의 EGFR 결합 도메인이 단일쇄 Fv 절편으로서 cMET 결합 항체인 LY2875358(에미베투주맙; Kim and Kim 2017)의 중쇄 가변 도메인에 융합된 이중특이적 cMET x EGFR 항체이다. 이는 각 항원에 대한 2개의 결합 부위를 가지는 소위 이중 가변 도메인 항체로 불리운다. 이 항체가 HGF를 억제함을 보여주는 데이터는 없다. 상기 항체는 활성 증진 효능 없이 cMET 및 EGFR에 결합하는 것으로 보고되었다. 저자는 다양한 cMET, EGFR 및 cMET x EGFR 표적 치료에 대해 리뷰하고 이들 억제제가 임상시험에서 유의한 효능을 보이지 못한다고 결론내렸다.
이에, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 우수한 특정을 가지는 새로운 이중특이적 cMET x EGFR 항체가 요구되고 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 인간 표피성장인자 수용체 (EGFR)의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제1 가변 도메인 및 수용체 티로신 키나아제인 인간 MET 원발암 유전자(cMET)의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제2 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다.
상기 이중특이적 항체는 공통 경쇄를 포함할 수 있다. 제1 및 제2 가변 도메인은 바람직하게는 동일하거나 실질적으로 동일한(공통) 경쇄 가변영역을 포함한다. 상기 공통 경쇄 가변영역은 재조합을 거친 다양한 인간 가변영역 유전자 분절과 쌍을 이루는 것으로 알려진 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 공통 경쇄는 바람직하게는 생식계열 Vk 유전자 분절, 바람직하게는 the O12 / IgVκ1-39*01 가변영역 유전자 분절에 의해 인코딩되는 가변영역이다. 바람직한 경쇄 가변영역은 재배열된(rearranged) IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01을 포함한다. cMET 결합 암의 경쇄 및 EGFR 결합 암의 경쇄는 바람직하게는 동일한(공통) 경쇄이다. 공통 경쇄는 바람직하게는 인간 경쇄 불변영역과 결합된 재배열된 카파(kappa) 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01이다. 이중특이적 항체는 인간 항체일 수 있다. 이중특이적 항체는 전장(full length) 항체일 수 있다. 이는 EGFR에 결합할 수 있는 하나의 가변 도메인 및 cMET에 결합할 수 있는 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일 구현예에 따르면 인간 EGFR에 결합할 수 있는 상기 가변 도메인은 유익하게 마우스 EGFR 및/또는 게잡이원숭이 EGFR에도 결합할 수 있다. 인간 EGFR에 결합할 수 있는 상기 가변 도메인은 인간 EGFR의 도메인 Ⅲ게 결합할 수 있다. cMET에 결합할 수 있는 가변 도메인은 5D5 항체가 cMET에 결합하는 것을 차단할 수 있다. cMET에 결합할 수 있는 가변 도메인은 HGF가 cMET에 결합하는 것을 차단할 수 있다. cMET에 대한 항체의 Kd 값은 EGFR에 대한 항체의 Kd 값보다 적어도 10배 낮을 수 있다. 하나의 CH3 도메인의 405번 및 409번 위치의 아미노산은 다른 CH3 도메인(EU-번호)의 상응하는 위치의 아미노산과 동일할 수 있다.
상기 제1 가변 도메인은 CDR1 서열 SYGIS, CDR2 서열 WISAYX1X2NTNYAQKLQG 및 CDR3 서열 X3X4X5X6HWWLX7A를 포함하되, 상기 X1=N 또는 S; X2=A 또는 G; X3=D 또는 G; X4=R, S 또는 Y; X5=H, L 또는 Y; X6=D 또는 W 그리고 X7=D 또는 G이며; X1-X7 이외의 위치에 0-5개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가질 수 있다.
상기 제2 가변 도메인은 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개의 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 서열번호: 1-23 중 하나의 서열의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항체에서
X1=N; X2=G; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W 및 X7=G;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W 및 X7=G;
X1=S; X2=G; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W 및 X7=G;
X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D;
X1=S; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D;
X1=N; X2=G; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D 및 X7=G;
X1=N; X2=A; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D 및 X7=G; 또는
X1=S; X2=G; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D 및 X7=G일 수 있다.
일 구현예에 따르면,
X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D; 또는
X1=S; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D일 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면 X3-X7=DRHWD이고 X1 및 X2는 NG;SG 또는 NA이다.
본 발명의 이중특이적 항체에서, 제2 가변 도메인의 중쇄 가변영역은 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 포함하는 서열번호: 1-3; 7; 8; 10; 13; 15; 16; 17; 21; 22 또는 23 중 하나의 서열의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 전형적으로, 상기 개체는 이상 세포 관련 질환, 예를 들어 종양을 겪고 있는 개체일 수 있다.
본 발명은 또한 표피성장인자 수용체(EGFR)의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제1 가변 도메인 및 MET 원발암 유전자인 수용체 티로신 키나아제(cMET)의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제2 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 제공하되, 상기 제1 가변 도메인은 CDR1 서열 SYGIS; CDR2 서열 WISAYX1X2NTNYAQKLQG 및 서열 X3X4X5X6HWWLX7A을 포함하는 CDR3을 가지는 중쇄 가변영역을 포함하고,
상기 X1=N 또는 S; X2=A 또는 G; X3=D 또는 G; X4=R, S 또는 Y; X5=H, L 또는 Y; X6=D 또는 W 그리고 X7=D 또는 G이며; X1-X7 이외의 위치에 0-5개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지고, 상기 제2 가변 도메인은 0-10개, 바람직하게는 0-5개의 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 서열번호: 1-23 중 하나의 서열의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다.
상기 제1 가변 도메인은 바람직하게는 CDR1 서열 SYGIS; CDR2 서열 WISAYNGNTNYAQKLQG 및 서열 DRHWHWWLDAFDY를 포함하는 CDR3을 가지는 중쇄 가변영역을 포함하고, 상기 제2 가변 도메인은 바람직하게는 CDR1 서열 SYSMN; CDR2 서열 WINTYTGDPTYAQGFTG 및 CDR3 서열 ETYYYDRGGYPFDP를 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다.
본 발명은 또한 종양과 같은 이상 세포 관련 질환을 가진 대상체의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 종양 또는 암과 같은 이상 세포 관련 질환을 치료하기 위한 의약을 생산하는 용도로 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 종양, 바람직하게는 EGFR 양성 종양, cMET 양성 종양 또는 EGFR 및 cMET 양성 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 상처 치유 분석에서 EBC1 세포의 HGF 유도된 이동(migration)을 억제한다. 바람직하게는 상기 억제는 세툭시맙 및 MetMab의 조합에 의한 억제보다 우수하다. 예를 들어, 상기 억제는 HGF가 존재하고 EGF가 존재 또는 부재할 때(HGF는 15 ng/ml로 존재하고 EGF가 존재할 경우 12.5 ng/ml로 존재한다) 상처 봉합의 방지를 통해 달성되는 것이 바람직하다.
본 발명의 항체는 TKI과 병용사용되었을 때 HGF를 억제하고 EGFR TKI 저항성 종양 세포주인 PC-9 및 HCC827의 EGF/HGF 유도된 성장을 억제한다. 상기 TKI는 바람직하게는 제피티닙이다.
본 발명의 항체는 HGF 유도된 HGF 반응성 세포, 바람직하게는 EGFR TKI 저항성 종양 세포주인 PC-9 또는 HCC827의 성장을 억제한다.
본 발명의 항체는 높은 친화도의 이가 EGFR 항체와 관련된 발진 및 설사와 같은 독성 유발 없이 EGF 유도된 EGF 반응성 세포의 성장을 억제한다. 이는 본 발명의 항체가 고유의 독성을 가진 TKI와의 이상적인 병용 사용에 적합하도록 한다.
본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 항체는 EGFR 티로신 키나아제 억제제, 예를 들어 에를로티닙, 제피티닙, 또는 아파티닙, 에를로티닙, 제피티닙 또는 아파티닙의 유사체 또는 각 화합물의 하나 이상의 조합 및/또는 이들의 유사체에 저항성을 가지는 종양의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 치료는 EGFR 티로신 키나아제 억제제, 예를 들어 에를로티닙의 투여를 추가적으로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 이중특이적 항체는 EGFR 티로신 키나아제 억제제와 동시에, 순차적으로 또는 분리되어 투여될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체 또는 그 변이체의 중쇄(들) 또는 중쇄 가변영역(들)을 단독으로 또는 함께 인코딩하는 핵산 분자 또는 일군(group)의 핵산 분자를 제공한다. 또한 본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산 분자 또는 일군의 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 중쇄는 IgG1 항체, 바람직하게는 인간 IgG1 항체의 불변영역을 포함한다. 상기 IgG1 불변영역의 CH2 영역은 항체의 ADCC 및/또는 CDC 활성이 변동되도록 조작(engineered)될 수도, 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변동은 ADCC 및/또는 CDC 활성의 강화로 나타난다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 항체의 CH3-영역은 EGFR에 결합하는 제1 중쇄 및 cMET에 결합하는 제2 중쇄를 포함하는 중쇄 헤테로다이머화가 촉진되도록 조작될 수 있다
본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항체 또는 그 변이체를 단독으로 또는 함께 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 세포를 이용하여 이중특이적 항체 또는 그 변이체를 생한하는 방법으로서, 바람직하게는 세포 배양액으로부터 상기 이중특이적 항체 또는 그 변이체를 수집하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항체 또는 그 변이체를 포함하는 세포 시스템을 제공한다.
본 발명은 또한 이중특이적 항체를 발현하고/또는 이중특이적 항체를 인코딩하는 핵산 분자(들)을 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 표지(label), 바람직하게는 인 비보 이미징을 위한 표지를 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다.
EGFR은 Her- 또는 cErbB-1, -2, -3 및 -4의 4개의 수용체 티로신 키나아제(RTK)의 패밀리 멤버이다. EGFR은 4개의 서브도메인으로 구성된 세포외 도메인(ECD)을 가지는데, 이중 2개가 리간드 결합에 관여하고 1개가 호모-다이머화 및 헤테로-다이머화에 관여한다(Ferguson, 2008). 본 실시예에서 사용된 참조 번호는 참고문헌의 번호를 나타내며, 이들은 참조로서 삽입되어 있다. EGFR은 다양한 리간드로부터 세포외 신호를 집적하여 다양한 세포내 반응을 일으킨다(Yarden at al. 2001; and Jorrisen et al. 2003). EGFR은 몇몇 인간 상피성 악성 종양, 특히 유방암, 방광암, 비소세포, 대장암, 난소암, 두경부암 및 뇌암과 관련되어 있다. 자가분비 활성화 루프를 일으키는 수용체 및 이의 리간드의 과발현 뿐 아니라, 유전자 내의 활성화 돌연변이가 발견되었다(Robertson et al. 2000). 따라서 이러한 RTK는 암 치료에 널리 사용되어 왔다. RTK를 표적화하는 저분자 억제제와 세포외 리간드-결합 도메인에 대한 단클론 항체(mAbs)가 개발되어 선택된 그룹의 환자들 대상이긴 하나 지금까지 몇몇 임상적 성공을 거두었다. 인간 EGFR 단백질과 이의 인코딩 유전자의 데이터베이스 접근 번호는 (GenBank NM_005228.3)이다. 이 유전자 및/또는 단백질의 다른 데이터베이스 식별자는 HGNC: 3236; Entrez Gene: 1956; Ensembl: ENSG00000146648; OMIM: 131550 및 UniProtKB: P00533이다. 접근번호는 우선적으로 타겟으로서 EGFR 단백질을 동정하기 위해 제공된다. 항체에 의해 결합되는 EGFR 단백질의 실제 서열은 예를 들어 종양 등에서 나타나는 인코딩 유전자의 돌연변이로 인해 다양할 수 있다. 본 명세서에서 EGFR을 언급하는 경우, 달리 기술되지 않는 한 인간 EGFR을 지칭한다. EGFR와 결합하는 항원-결합 부위는 EGFR와 EGFR 양성 종양에서 발현되는 이의 다양한 변이체에 결합한다.
본 명세서에서 용어“EGFR 리간드”는 EGFR에 결합하여 이를 활성화하는 폴리펩타이드를 의미한다. EGFR 리간드의 예에는 EGF, TGF-α, HB-EGF, 앰피래귤린, 베타셀룰린 및 에피레귤린이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(Olayioye MA et al.; EMBO J (2000) Vol 19: pp 3159-3167). 상기 용어는 천연의 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 가지는 절편 및/또는 변이체를 포함한다.
티로신-단백질 키나아제 MET 또는 간세포 성장인자 수용체(HGFR)로도 불리우는 cMET은 인간의 MET 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. 상기 단백질은 티로신 키나아제 활성을 가진다. 1차 단일쇄 전구체 단백질은 번역후 절단되어 알파 및 베타 서브유닛을 만드는데, 이들은 이황화 결합으로 연결되어 성숙한 수용체를 형성한다.
비정상적으로 활성화된 cMET는 종양 성장, 종양에 영양을 공급하는 새로운 혈관의 형성(혈관신생) 및 암의 다른 기관으로의 확산(전이)을 유도한다. cMET는 신장암, 간암, 위함, 유방암 및 뇌암을 포함하는 다양한 인간 악성 종양에서 증가한다. cMET 유전자는 MET 원발암 유전자, 수용체 티로신 키나아제; 간세포 성장인자 수용체; 티로신-단백질 키나아제 Met; 산란 인자 수용체; 원발암 유전자 C-Met; HGF/SF 수용체; HGF 수용체; SF 수용체; EC 2.7.10.1; Met 원발암 유전자; EC 2.7.10; DFNB97; AUTS9; RCCP2; C-Met; MET; HGFR와 같은 다양한 다른 이름으로도 알려져 있다. cMET의 외부 Id는 HGNC: 7029; Entrez Gene: 4233; Ensembl: ENSG00000105976; OMIM: 164860 및 UniProtKB: P08581이다. 접근번호는 우선적으로 타겟으로서 cMET 단백질을 동정하기 위해 제공된다. 항체에 의해 결합되는 cMET 단백질의 실제 서열은 예를 들어 종양 등에서 나타나는 인코딩 유전자의 돌연변이로 인해 다양할 수 있다. 본 명세서에서 cMET을 언급하는 경우, 달리 기술되지 않는 한 인간 cMET을 지칭한다. cMET과 결합하는 항원-결합 부위는 cMET과 cMET 양성 종양에서 발현되는 이의 다양한 변이체에 결합한다.
항체는 전형적으로 항원의 일부분만을 인식한다. 항원은 전형적으로 단백질이지만 반드시 그렇지는 않다. 항체가 결합하는 항원의 인식 또는 결합 부위를 에피토프라고 부르며, 이는 선형일 수도 있고 입체적일수도 있다. 전형적으로는 항원과 항체의 결합은 특이적이다. 용어 항체의‘특이성’은 특정 에피토프에 대한 선택성을 의미하는 반면,‘친화도’항체의 항원 결합 부위와 에피토프 간의 상호작용의 강도를 의미한다.
본 발명의 예시적인 항체는 EGFR 및 cMET과 결합하며, 바람직하게는 인간 EGFR 및 인간 cMET와 결합한다. 본 발명의 EGFR/cMET 이중특이적 항체는 EGFR와 결합하며, 동일한 조건 하에서 동일한 종의 다른 ErbB-2 및 ErbB-4 수용체와 최소 100배 낮은 친화도로 결합한다. 본 발명의 EGFR/cMET 이중특이적 항체는 cMET와 결합하며, 동일한 조건 하에서 동일한 종의 다른 ErbB-2 및 ErbB-4 수용체와 최소 100배 낮은 친화도로 결합한다. 수용체가 세포 표면 수용체임을 고려하면, 결합은 전형적으로 상기 수용체를 발현하는 세포 표면에서 측정한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게는 인간, 게잡이원숭이 EGFR 및/또는 마우스 EGFR에 결합한다.
EGFR 및 cMET에 결합하는 항체는 동일한 에피토프를 가지는 다른 단백질에도 결합할 수 있다. 따라서, 용어“결합”은 본 발명의 항체와 동일한 에피토프를 가지는 다른 단백질(들)간의 결합을 제외하는 의미가 아니다. 이러한 다른 단백질은 바람직하게는 인간 단백질이 아니다. 이러한 결합은 전형적으로 교차 반응성이라 부른다. EGFR/cMET 이중특이적 항체는 전형적으로 출생 후, 바람직하게는 성인 인간의 세포막 상의 EGFR 및/또는 cMET 이외의 다른 단백질과 결합하지 않는다. 본 발명의 항체는 하기에서 상세하게 설명하는 바와 같이 전형적으로 최소 1x10e-6 M의 친화도(즉 평형 해리상수 Kd)로 EGFR와 결합한다.
본 명세서에서 용어“항체”는 단백질 분자로서, 바람직하게는 항원의 에피토프에 결합하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 부류에 속하는 단백질이다. 항체는 전형적으로 항원 상의 에피토프와 결합할 수 있는 2개의 가변 도메인을 포함한다. 이러한 도메인은 항체의 가변 도메인에서 유래하거나 이와 서열 유사성을 공유한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게는 2개의 가변 도메인을 포함한다. 치료 용도의 항체는 치료 대상체의 천연 항체와 가능한 한 유사한 것이 바람직하다(예를 들어 인간 대상체에 대해 인간 항체를 사용). 항체 결합여부는 특이성과 친화도로 표현될 수 있다. 특이성은 어떤 항원 또는 이의 에피토프에 결합 도메인이 특이적으로 결합할지를 결정한다. 친화도는 특정 항원 또는 에피토프와의 결합 강도에 대한 척도이다. 전형적으로, 치료 용도의 항체는1x10e-10M 또는 그 이상의 친화도를 가진다. 본 발명의 이중특이적 항체와 같은 항체는 자연적 항체의 불변 도메인(Fc 부위)을 포함한다. 본 발명의 항체는 전형적으로 이중특이적 전장(전장) 항체이며, 바람직하게는 인간 IgG 아형이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 IgG1 아형이다. 이러한 항체는 우수한 ADCC 특성을 가지고, 인간에게 인 비보 투여시 우수한 반감기를 가지며, CH3 조작 기술에 의해 공발현시 호모다이머 보다는 헤테로다이머를 더 잘 형성하는 변형된 중쇄를 제공할 수 있다. 항체의 ADCC 활성은 당업계에 알려진 기술로서 개선될 수 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는“전장”항체이다. 용어‘전장(full 길이)’은 완전한 항체를 필수적으로 포함함을 의미하나, 천연의 항체의 모든 기능을 반드시 다 가질 필요는 없다. 다시 말해, 전장 항체는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 가진다. 각각의 쇄는 불변(C) 영역과 가변(V) 영역을 가지는데, 이들은 다시 CH1, CH2, CH3, VH, CL 및 VL 도메인으로 나누어진다. 전형적으로, 항체는 Fab 부위에 포함된 가변 도메인을 경유하여 항원에 결합하며, 결합 후 불변 도메인, 주로 Fc 부위를 통해 면역체계의 분자나 세포와 상호작용할 수 있다. 본 발명에 따른 전장 항체는 원하는 특성을 제공하는 돌연변이가 존재하는 항체를 포함한다. 결합 특성을 본질적으로 변경시키기 않는 하나 또는 몇 개의 아미노산 잔기의 삭제를 수반하는 항체는“전장 항체”에 포함된다. 예를 들어, IgG 항체는 불변 부위에 1-20개 아미노산 잔기의 삽입, 삭제 또는 이들의 조합이 포함될 수 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 이중특이적 IgG 항체이고, 바람직하게는 이중특이적 전장 IgG1 항체이며, 보다 바람직하게는 인간 IgG1 항체이다. 전장 IgG1는 전형적으로 긴 순환 반감기를 가져 바람직하며, 인간에서의 면역원성을 차단하기 위해, 이중특이적 IgG 항체는 인간 IgG1인 것이 바람직하다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 전장 IgG1, 전장 IgG2, 전장 IgG3 또는 전장 IgG4 항체이다.
본 발명은 EGFR의 세포외 부위에 결합하는 제1 가변 도메인과 cMET의 세포외 부위에 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 항체로서, 상기 제1 가변 도메인은 0.39 nM의 Kd 값(Kim et al 2008)을 가지는 세툭시맙보다 낮은 친화도로 EGFR과 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다. 제1 가변 도메인은 바람직하게는 10e-6 M 및 10e-9 M 사이의 Kd 값으로 EGFR에 결합한다. Kd 값은 바람직하게는 10e-7 M 및 10e-9 M 사이이고, 바람직하게는 10e-8 M 및 10e-9 M 사이이다. 제2 가변 도메인 바람직하게는 10e-7 M 이하의 Kd 값으로 cMET에 결합한다. Kd 값은 바람직하게는 10e-7 M 및 10e-11 M 사이이다. 제2 가변 도메인은 바람직하게는 제1 가변 도메인의 EGFR에 대한 친화도에 비해 더 높은 cMET에 대한 친화도를 가진다. 다시 말해 cMET에 대한 항체의 Kd 값은 EGFR에 대한 항체의 Kd 값보다 낮은 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 tcMET에 대한 항체의 Kd 값은 최소 5이고 바람직하게는 EGFR에 대한 항체의 Kd 값보다 최소 10배가 낮다. 각 항원에 대한 Kd 값은 본 문단에서 기재한 바와 같은 것이 바람직하다. 이러한 적절한 친화도 불균형으로 인해 본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게는 EGFR 결합을 경유하여 세포에 결합하고 리간드 HGF와 cMET의 결합을 차단할 수 있다.
이가 단일특이적 항체의 측면에서, EGFR에 결합할 수 있는 가변 도메인은 EGF 유도된 A431 세포의 사멸을 억제할 수 있는 가변 도메인이다. EGF 유도된 세포 사멸의 억제는 바람직하게는 10nM EGF 및 10 μg/ml 항체의 농도에서 측정된다. EGF 유도된 세포 사멸의 억제는 항체의 존재 또는 부재 하에 A431세포가 성장할 수 있는 조건에서 A431 배양 3-7일 뒤의 세포 수를 비교함으로써 측정될 수 있다. 이론에 구속되는 것은 아니나, 항체와 EGFR의 결합은 EGF가 EGFR에 결합하는 것을 차단하는 것으로 여겨진다. EGFR에 결합할 수 있는 가변 도메인은 바람직하게는, 이가 단일특이적 항체의 측면에서, EGF 유도된 BxPC3 또는 BxPC3-luc2 세포의 증식을 억제하는 가변 도메인이다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 상처 치유 분석에서 HGF 유도된 EBC1 세포의 이동을 억제한다. 상처 치유 분석은 바람직하게는 실시예에서 기술된 어세이 방법에 따른다. 상처 치유의 억제는 억제 세툭시맙 및 MetMab의 조합보다 우수하다. 억제는 전형적으로 100%가 아니다. 다소간의 상처 치유는 억제적 항체의 존재 하에서도 일어난다.
본 발명의 항체는 TKI와 병용 사용되었을 때 HGF and EGF/HGF 유도된 성장 of the EGFR TKI 저항성 종양 세포주인 PC-9 및 HCC827의 HGF 및 EGF/HGF 유도된 성장을 억제한다. TKI는 바람직하게는 제피티닙이다.
본 발명의 항체는 HGF 반응성 세포, 바람직하게는 EGFR TKI 저항성 종양 세포주인 PC-9 또는 HCC827의 HGF 유도된 성장을 억제한다.
본 발명의 항체는 발진 및 설사 등 높은 친화도의 이가 EGFR 항체와 관련된 일반적인 독성을 유의하게 유발하지 않으면서 EGF 유도된 EGF 반응성 세포의 성장을 억제한다. 이는 본 발명의 항체가 고유의 독성을 가진 TKI와의 이상적인 병용 사용에 적합하도록 한다.
유도된 성장은 바람직하게는 실시예에 기재된 분석 방법을 통해 측정된다. 억제는 전형적으로 100%가 아니다. 다소간의 성장은 억제적 항체의 존재 하에서도 일어난다.
EGFR에 결합할 수 있고 MF3370 또는 그 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인은 바람직하게는 EGFR 도메인 Ⅲ에 결합한다(표 4 of 국제특허출원 PCT/NL2015/050124; WO2015/130172의 표 4 참조, 본 명세서에 참조로서 삽입됨). 가변 도메인과 EGFR의 결합은 세툭시맙에 의해 억제될 수 있다. 가변 도메인은 세툭시맙과 잘루투무맙에 의해 인식되는 에피토프와 상이한 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 가변 도메인은 마우스 EGFR에 결합하는 반면 세툭시맙 및 잘루투무맙은 그렇지 않아, 마우스 및 인간 EGFR 도메인 Ⅲ에서 차이나는 하나 이상의 잔기가 세툭시맙 및 잘루투무맙 결합에 중요한 역할을 하지만, 본 발명의 항체에서는 그렇지 않다는 것을 알 수 있다. 인간, 마우스, 게잡이원숭이 EGFR의 교차반응성을 가지는 본 발명의 이중특이적 항체의 이점은 인간 암 모델의 이식 연구에 사용할 경우 항체는 수용체를 가지는 정상 마우스 세포에도 결합할 수 있고 게잡이원숭이 독성 연구에도 사용될 수 있어 효율성과 독성을 보다 잘 예측할 수 있다는 점이다. 본 발명은 또한 인간 표피성장인자 수용체(EGFR)의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제1 가변 도메인 및 인간 MET 원발암 유전자인 수용체 티로신 키나아제(cMET)의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제2 가변 도메인을 포함하며, 상기 제1 가변 도메인은 마우스 EGFR, 게잡이원숭이 EGFR 또는 둘 다와도 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 제공한다.
cMET 가변 도메인은 바람직하게는 MF4356 또는 그 변이체의 아미노산 서열을 포함하며, 바람직하게는 MetMab 항체와 cMET의 결합을 차단한다. 가변 도메인은 바람직하게는 리간드 HGF와 to cMET의 결합을 차단한다. 가변 도메인은 상기 가변 도메인의 포화량이 존재 시 반치(half-maximum) 결합 조건에서의 MetMab와 cMET 결합이 최소 40%, 바람직하게는 최소 60% 감소하였을 때 MetMab 항체와 cMET의 결합을 차단한다. 가변 도메인은 바람직하게는 이가 단일특이적 항체로 제공된다. cMET 가변 도메인은 바람직하게는 cMET의 동일한 도메인에 결합한다. 본 발명의 cMET 가변 도메인은 compete with 5D5와 cMET에 경쟁적으로 결합할 수도 있고 5D5와 같은 보고된 항-cMET 참조 항체와 경쟁하지 않을 수도 있다(표 2).
본 발명의 가변 도메인은 EGFR(제1 가변 도메인)이고 바람직하게는 CDR1 서열 SYGIS; CDR2 서열 WISAYX1X2NTNYAQKLQG 및 서열 X3X4X5X6HWWLX7A을 포함하는 CDR3을 가지는 중쇄 가변영역을 포함하되, 상기 X1=N 또는 S; X2=A 또는 G; X3=D 또는 G; X4=R, S 또는 Y; X5=H, L 또는Y; X6=D 또는 W 그리고 X7=D 또는 G이다.
X1-7은 바람직하게는:
X1=N; X2=G; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W 및 X7=G;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W 및 X7=G;
X1=S; X2=G; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W 및 X7=G;
X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D;
X1=S; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D;
X1=N; X2=G; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D 및 X7=G;
X1=N; X2=A; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D 및 X7=G; 또는
X1=S; X2=G; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D 및 X7=G이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면
X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D; 또는
X1=S; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D이다.
바람직하게는 X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D이다.
제1 가변 도메인의 CDR3 서열에서 서열 X3X4X5X6HWWLX7A에서의 아미노산 A 다음의 아미노산은 다양할 수 있다. 서열 X3X4X5X6HWWLX7A 다음의 아미노산 서열은 FDY일 수 있다. 제1 가변 도메인 바람직하게는 서열 X3X4X5X6HWWLX7AF, 바람직하게는 X3X4X5X6HWWLX7AFD, 보다 바람직하게는 X3X4X5X6HWWLX7AFDY을 포함한다.
제1 가변 도메인은 바람직하게는 CDR1 서열 SYGIS; CDR2 서열 WISAYNGNTNYAQKLQG 및 CDR3 서열 X3X4X5X6HWWLX7A을 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다.
제1 가변 도메인은 바람직하게는 CDR1서열 SYGIS; CDR2 서열 WISAYNGNTNYAQKLQG 및 서열 DRHWHWWLDA를 포함하는 CDR3을 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다. 제1 가변 도메인의 CDR3 내 서열 LDA 이후의 아미노산은 다양한 수 있다. 서열 LDA 다음의 아미노산 서열은 FDY일 수 있다. 제1 가변 도메인의 CDR3는 바람직하게는 서열 DRHWHWWLDAF, 바람직하게는 DRHWHWWLDAFD, 보다 바람직하게는 DRHWHWWLDAFDY을 포함한다.
제1 가변 도메인은 바람직하게는 도 7에 나타난 MF3353; MF8229; MF8228; MF3370; MF8233; MF8232; MF3393; MF8227 또는 MF8226의 아미노산 서열에서 최대 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 제1 가변 도메인은 도 7에 나타난 MF3353; MF8229; MF8228; MF3370; MF8233; MF8232; MF3393; MF8227 또는 MF8226의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다.
cMET에 결합할 수 있는 가변 도메인(제2 가변 도메인)은 바람직하게는 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개의 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 서열번호: 1-23 중 하나의 서열의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다. 상기 제2 가변 도메인의 중쇄 가변영역은 바람직하게는 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 포함하는 서열번호: 1-3; 7; 8; 10; 13; 15; 16; 17; 21; 22 또는 23 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 제2 가변 도메인의 중쇄 가변영역은 바람직하게는 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 포함하는 서열번호: 2; 7; 8; 10; 13 또는 23 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 제2 가변 도메인의 중쇄 가변영역은 바람직하게는 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 포함하는 서열번호: 13 또는 23의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 제1 가변 도메인은 CDR1 서열 SYGIS; CDR2 서열 WISAYNGNTNYAQKLQG; 및 서열 DRHWHWWLDA, 바람직하게는 DRHWHWWLDAFDY을 포함하는 CDR3를 가지는 중쇄 가변영역을 포함하며, 상기 제2 가변 도메인은 CDR1 서열 SYSMN; CDR2 서열 WINTYTGDPTYAQGFTG; 및 CDR3 서열 ETYYYDRGGYPFDP를 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다. 제1 및 제2 가변 도메인의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 바람직하게는 각각 아미노산 서열 CDR1-QSISSY, CDR2-AAS, CDR3-QQSYSTP를 각각 포함한다(즉, IGKV1-39 (IMGT에 따름)의 CDR).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 제1 가변 도메인은 CDR1 서열 SYGIS; CDR2 서열 WISAYNGNTNYAQKLQG; 및 서열 DRHWHWWLDA를 포함하는 CDR3를 가지는 중쇄 가변영역을 포함하며, 상기 제2 가변 도메인은 중쇄 가변영역 with CDR1 서열 TYSMN; CDR2 서열 WINTYTGDPTYAQGFTG; 및 서열 ETYFYDRGGYPFD를 포함하는 CDR3를 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다. 제1 및 제2 가변 도메인의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 바람직하게는 각각 아미노산 서열 CDR1-QSISSY, CDR2-AAS, CDR3-QQSYSTP를 각각 포함한다(즉, IGKV1-39 (IMGT에 따름)의 CDR).
바람직하게는, 본 발명의 이중특이적 항체는 EGFR의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제1 가변 도메인 및 cMET의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제2 가변 도메인을 포함하며, 상기 제1 가변 도메인은 CDR1 서열 SYGIS; CDR2 서열 WISAYNANTNYAQKLQG; 및 서열 DRHWHWWLDA를 포함하는 CDR3를 가지는 중쇄 가변영역을 포함하고 상기 제2 가변 도메인은 CDR1 서열 SYSMN; CDR2 서열 WINTYTGDPTYAQGFTG; 및 CDR3 서열 ETYYYDRGGYPFDP을 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다. 제1 및 제2 가변 도메인의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 바람직하게는 각각 아미노산 서열 CDR1-QSISSY, CDR2-AAS, CDR3-QQSYSTP를 각각 포함한다(즉, IGKV1-39 (IMGT에 따름)의 CDR).
바람직하게는, 본 발명의 이중특이적 항체는 EGFR의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제1 가변 도메인 및 cMET의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제2 가변 도메인을 포함하며, 상기 제1 가변 도메인은 CDR1 서열 SYGIS; CDR2 서열 WISAYNANTNYAQKLQG; 및 서열 DRHWHWWLDA를 포함하는 CDR3를 가지는 중쇄 가변영역을 포함하고 상기 제2 가변 도메인은 CDR1 서열 TYSMN; CDR2 서열 WINTYTGDPTYAQGFTG; 및 서열 ETYFYDRGGYPFDP를 포함하는 CDR3를 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다. 제1 및 제2 가변 도메인의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 바람직하게는 각각 아미노산 서열 CDR1-QSISSY, CDR2-AAS, CDR3-QQSYSTP를 각각 포함한다(즉, IGKV1-39 (IMGT에 따름)의 CDR).
바람직하게는, 본 발명의 이중특이적 항체는 EGFR의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제1 가변 도메인 및 cMET의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제2 가변 도메인을 포함하며, 상기 제1 가변 도메인은 CDR1 서열 SYGIS; CDR2 서열 WISAYSGNTNYAQKLQG; 및 서열 DRHWHWWLDA를 포함하는 CDR3를 가지는 중쇄 가변영역을 포함하고 상기 제2 가변 도메인은 CDR1 서열 SYSMN; CDR2 서열 WINTYTGDPTYAQGFTG; 및 CDR3 서열 ETYYYDRGGYPFDP를 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다. 제1 및 제2 가변 도메인의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 바람직하게는 각각 아미노산 서열 CDR1-QSISSY, CDR2-AAS, CDR3-QQSYSTP를 각각 포함한다(즉, IGKV1-39 (IMGT에 따름)의 CDR).
바람직하게는, 본 발명의 이중특이적 항체는 EGFR의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제1 가변 도메인 및 cMET의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제2 가변 도메인을 포함하며, 상기 제1 가변 도메인은 CDR1 서열 SYGIS; CDR2 서열 WISAYSGNTNYAQKLQG; 및 서열 DRHWHWWLDA를 포함하는 CDR3를 가지는 중쇄 가변영역을 포함하고 상기 제2 가변 도메인은 CDR1 서열 TYSMN; CDR2 서열 WINTYTGDPTYAQGFTG; 및 서열 ETYFYDRGGYPFDP를 포함하는 CDR3를 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다. 제1 및 제2 가변 도메인의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 바람직하게는 각각 아미노산 서열 CDR1-QSISSY, CDR2-AAS, CDR3-QQSYSTP를 각각 포함한다(즉, IGKV1-39 (IMGT에 따름)의 CDR).
제1 및 제2 가변 도메인의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 바람직하게는 각각 아미노산 서열 CDR1-QSISSY, CDR2-AAS, CDR3-QQSYSTP를 각각 포함한다(즉, IGKV1-39 (IMGT에 따름)의 CDR). 일 구현예에 따르면 본 발명의 이중특이적 항체에서 제1 및 제2 가변 도메인은 공통 경쇄, 바람직하게는 도 9b의 경쇄를 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면 EGFR/cMET 이중특이적 항체는 도 1에 나타난 MF3755 중쇄 가변영역의 DR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 인간 EGFR의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제1 가변 도메인과 도 1에 나타난 MF4297의 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는, 인간 cMET의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제2 가변 도메인을 포함한다. 상기 제2 가변 도메인의 경쇄 가변영역은 본 발명에서 기술한 공통 경쇄 가변영역이다. 제1 및 제2 가변 도메인의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 바람직하게는 각각 아미노산 서열 CDR1-QSISSY, CDR2-AAS, CDR3-QQSYSTP를 각각 포함한다(즉, IGKV1-39 (IMGT에 따름)의 CDR). 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 제1 가변 도메인은 도 1에 나타난 MF3755 중쇄 가변영역의 아미노산 서열에서 최대 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 항체는 도 1에 나타난 MF4297의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열에서 최대 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 제1 가변 도메인은 도 1에 나타난 MF3755의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다. cMET에 결합할 수 있는 가변 도메인(제2 가변 도메인)은 바람직하게는 도 1에 나타난 MF4297의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열에서 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 중쇄 가변영역을 포함한다. 상기 가변 도메인의 중쇄 가변영역 바람직하게는 도 1에 나타난 MF4297의 아미노산 서열을 포함한다.
용어‘이중특이적’(bs)은 두 개의 상이한 타겟 또는 동일한 타겟의 두 개의 에피토프에 결합할 수 있는 항체로서, 예를 들어 항체의 하나의 가변 도메인(상기 정의된 바와 같은)은 EGFR 상의 에피토프에 결합하고 제2 가변 도메인은 cMET 상의 에피토프에 결합하는 항체를 의미한다. 이중특이적 항체에 의해 인식되는 두 항원의 발현 수준, (아)세포의 위치 및 화학양론에 따라, 항체의 양 Fab 암은 동시에 각 에피토프에 결합할 수도, 그렇지 않을 수도 있다. 이중특이적 항체의 한쪽 암(arm)은 전형적으로 하나의 항체의 가변 도메인을 포함하고, 다른쪽 암은 또 다른 항체의 가변 도메인을 포함한다(즉 이중특이적 항체의 한쪽 암은 하나의 중쇄와 하나의 경쇄가 조합되어 형성되고 다른쪽 암은 하나의 경쇄와 조합된 상이한 중쇄에 의해 형성된다). 따라서, 본 발명의 바람직한 이중특이적 항체의 화학양론은 1:1, EGFR:cMET 결합이다.
본 발명의 이중특이적 항체의 중쇄 가변영역은 전형적으로 서로 상이한 반면, 경쇄 가변영역은 바람직하게는 서로 동일하다. 상이한 중쇄 가변영역이 동일한 경쇄 가변영역과 결합한 이중특이적 항체도 공통 경쇄 가변영역(cLcv)을 가지는 이중특이적 항체로 불리운다. 바람직하게는 경쇄 불변 영역도 동일하다. 이러한 이중특이적 항체는 공통 경쇄(cLc)를 가지는 것으로 지칭된다. 본 발명은 또한 양쪽 암이 공통 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다.
본 명세서에서 용어‘공통 경쇄’는 동일하거나 전장 항체의 결합 특이성에 영향을 미치지 않을 정도의 아미노산 서열 상이성을 가지는 이중특이적 항체 내의 둘 이상의 경쇄를 의미한다. 예를 들어 동일하지는 않지만 기능적으로 동등한 경쇄를 발견하거나 제작하는 것은 보존적인 아미노산 변형을 도입하고 이를 시험하여 중쇄 등과 결합하였을 때 결합특이성에 영향을 미치지 않거나 부분적으로만 미치는지를 확인함으로써 가능하다. 재배열된(rearranged)’이라는 용어의 부가 여부와 무관하게, 용어‘공통 경쇄 가변 영역’, ‘공통 VL’,‘cLC’,‘단일 경쇄’는 본 명세서에서 모두 서로 교환되어 쓰일 수 있는 용어이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 이중특이적 항체는 상이한 결합 특이성을 가지는 최소 두 개, 바람직하게는 복수의 의 중쇄 (가변영역)와 조합된 공통 경쇄(가변영역)를 가져 기능적인 항원 결합 도메인을 가지는 항체를 형성한다(예를 들어 WO2009/157771). 공통 경쇄(가변영역)는 바람직하게는 인간 경쇄(가변영역)이다. 공통 경쇄(가변영역)는 바람직하게는 생식계열 서열을 가진다. 바람직한 생식계열 서열은 열역학적 안정성, 수율 및 가용성이 뛰어난 경쇄 가변영역이다. 바람직한 생식계열 경쇄는 O12이다. 공통 경쇄는 바람직하게는 생식계열 인간 Vk 유전자 분절, 바람직하게는 재배열된 생식계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01(도 9a)에 의해 인코딩된다. 공통 경쇄 가변영역는 바람직하게는 재배열된 생식계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01의 가변 영역이다. 공통 경쇄 바람직하게는 0-5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 도 9b 또는 9d에 나타난 경쇄 가변영역을 포함한다. 공통 경쇄는 바람직하게는 경쇄 불변영역, 바람직하게는 카파 경쇄 불변영역을 추가적으로 포함한다. 공통 경쇄를 인코딩하는 핵산은 공통 경쇄 단백질을 발현하는 세포 시스템에 대해 최적화된 코던일 수 있다. 상기 인코딩 핵산은 생식계열 핵산 서열이 아닐 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 경쇄는 0-10개, 바람직하게는 0-5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 도 9a에 나타난 O12 / IgVκ1-39*01 유전자 분절의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 영역을 포함한다. 용어“O12 경쇄”는 본 명세서 전반에 걸쳐“도 9a에 나타난 O12 / IgVκ1-39*01 유전자 분절의 아미노산 서열, 바람직하게는 상기 아미노산 서열에서 0-10개, 바람직하게는 0-5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 경쇄”를 의미한다. IgVκ1-39는“Immunoglobulin Variable Kappa 1-39 Gene”의 약어이다. 이 유전자는 Immunoglobulin Kappa Variable 1-39; IGKV139; IGKV1-39; O12a 또는 O12의 다른 이름으로도 알려져 있다. 상기 유전자의 외부 Id는 HGNC: 5740; Entrez Gene: 28930; Ensembl: ENSG00000242371이다. IgVκ1-39의 바람직한 아미노산 서열은 도 9e에 나타나 있다. 이는 V-영역의 서열을 보여준다. V-영역은 5개의 J-영역 중 하나와 조합될 수 있다. 도 9b 및 9d는 J-영역과 조합되는 바람직한 IgVκ1-39 서열을 보여준다. 조합된 서열은 IGKV1-39/jk1 및 IGKV1-39/jk5로 표시하였으며, 또 다른 이름은 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01이다(월드와이드웹 imgt.org의 IMGT 데이터베이스에 따른 명명법).
바람직하게는 경쇄 가변영역을 포함하는 O12 / IgVκ1-39*01는 생식계열 서열이다. 보다 바람직하게는 경쇄 가변영역을 포함하는 IGJκ1*01 또는 /IGJκ5*01는 생식계열 서열이다. 바람직한 구현예에 따르면, IGKV1-39/jk1 또는 IGKV1-39/jk5 경쇄 가변영역은 생식계열 서열이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 경쇄 가변영역은 생식계열 O12 / IgVκ1-39*01를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 경쇄 가변영역은 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01를 포함한다. 바람직하게는 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01를 포함한다. 경쇄 가변영역 바람직하게는 생식계열 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 생식계열 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01을, 바람직하게는 생식계열 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01을 포함한다.
O12 경쇄를 가지는 항체를 생산하는 성숙 B-세포는 종종 생식계열 서열, 예를 들어 유기체의 비-림프 세포의 정상 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 가지는 경쇄를 생산한다. 이러한 돌연변이의 원인이 되는 과정을 종종 체세포 (과)돌연변이라고 한다. 이와 같이 생성된 경쇄는 친화도 성숙 경쇄로 불린다. 이러한 경쇄는, O12 생식계열 서열로부터 유래한 경우 O12-유래 경쇄이다. 본 명세서에서 용어“공통 경쇄”는 공통 경쇄-유래 경쇄를 포함하며, 용어“O12 경쇄”는 O12-유래 경쇄를 포함한다. 체세포 과돌연변이로 인해 발생한 돌연변이는 실험실에서 인위적으로 유발될 수도 있다. 실험실에서는 경쇄의 특성에 영향을 미치지 않는 다른 돌연변이도 유발될 수 있으며, 양에 영향을 미치지 않을 필요는 없다. 경쇄는 0-10개, 바람직하게는 0-5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 9a, 도 9b; 도 9d 또는 도 9e에 나타난 서열을 포함하는 경우, 적어도 O12 경쇄이다. 바람직한 구현예에 따르면 상기 O12 경쇄는 0-9개, 0-8개, 0-7개, 0-6개, 0-5개, 0-4개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 도 9a; 9b; 9d or 9e의 서열을 포함하는 경쇄이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 O12 경쇄는 0-5개, 바람직하게는 0-4개, 보다 바람직하게는 0-3개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 도 9a, 도 9b; 도 9d 또는 도 9e에 나타난 서열을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 O12 경쇄는 0-2개, 보다 바람직하게는 0-1개, 가장 바람직하게는 0개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 도 9a, 도 9b; 도 9d 또는 도 9e에 나타난 서열을 포함하는 경쇄이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 O12 경쇄는 상술한 아미노산 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 도 9a 또는 도 9b에 나타난 서열을 포함하는 경쇄이다. 바람직한 구현예에 따르면 경쇄는 도 9a의 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면 경쇄 가변영역은 도 9b의 서열을 포함한다. 상술한 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이며, 상기 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합은 바람직하게는 VL 쇄의 CDR3 영역에 존재하지 않고, 바람직하게는 VL 쇄의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역 또는 FR4 영역에 존재하지 않는다.
상기 공통 경쇄는 람다 경쇄를 가질 수 있어 본 발명의 내용에 포함되지만, 카파 경쇄가 바람직하다. 본 발명의 공통 경쇄의 불변 부분은 카파 또는 람다 경쇄의 불변영역일 수 있다. 카파 경쇄의 불변영역은, 바람직하게는 상기 공통 경쇄가 생식계열 경쇄이고, 바람직하게는 IgVKl-39 유전자 분절을 포함하는 재배열된 생식계열 인간 카파 경쇄이며, 가장 바람직하게는 재배열된 생식계열 인간 카파 경쇄 IgVKl-39*01/IGJKl*01이다(도 9). 용어“재배열된 생식계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01”, “IGKV1-39/IGKJ1”,“huVκ1-39 경쇄”또는 줄여서“huVκ1-39”또는 간단히“1-39”는 본 명세서에서 모두 서로 교환되어 쓰일 수 있는 용어이다.
공통 경쇄를 생산하는 세포는 예를 들어 재배열된 생식계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 및 람다 불변영역에 융합된 상기 경쇄의 가변영역을 포함하는 경쇄를 생산할 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 경쇄 가변영역은 0-10개, 바람직하게는 0-5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK or DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 경쇄 가변영역은 각 지시된 아미노산 서열에 대해 0-9개, 0-8개, 0-7개, 0-6개, 0-5개, 0-4개, 바람직하게는 0-3개, 바람직하게는 0-2개, 바람직하게는 0-1개, 그리고 바람직하게는 0개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 포함한다. 삽입, 삭제, 첨가 또는 치환의 조합은 정렬된 서열이 5개 위치 이상에서 상이하지 않은 경우의 조합이다. 바람직한 구현예에 따르면 상기 경쇄 가변영역은 DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK or DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면 상기 경쇄 가변영역은 DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면 상기 경쇄 가변영역은 DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 아미노산 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합은 바람직하게는 경쇄 가변영역의 CDR3 영역에 존재하지 않으며, 바람직하게는 경쇄 가변영역의 CDR1 또는 CDR2 영역에 존재하지 않는다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 경쇄 가변영역은 각 서열에 대한 삭제, 첨가 또는 삽입을 포함하지 않는다. 이 경우 중쇄 가변영역은 각 아미노산 서열에 대해 0-5개 아미노산의 치환을 가질 수 있다. 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산의 치환이다. 본 발명의 항체의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 바람직하게는 각각 아미노산 서열 CDR1-QSISSY, CDR2-AAS, CDR3-QQSYSTP를 각각 포함한다(즉, IGKV1-39 (IMGT에 따름)의 CDR).
본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게는 EGFR의 세포외 부위에 결합할 수 있는 하나의 중쇄 가변영역/경쇄 가변영역(VH/VL)의 조합과 cMET의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제2 VH/VL 조합을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 제 1 VH/VL 조합 내의 VL은 제 2 VH/VL 조합 내의 VL와 유사하다. 보다 바람직하게는, 제1 및 제2 VH/VL 조합의 VL은 동일하다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 이중특이적 항체는EGFR의 세포외 부위에 결합하는 하나의 중쇄/경쇄(H/L) 조합과 cMET의 세포외 부위에 결합하는 하나의 H/L 조합을 가지는 전장 항체이다. 바람직한 구현예에 따르면 상기 제1 H/L 쇄 조합의 경쇄는 상기 제2 H/L 쇄 조합의 경쇄와 유사하다. 보다 바람직하게는, 제1 및 제2 H/L 쇄 조합의 경쇄는 동일하다.
단일특이적 항체보다 이중특이적 항체가 더 잘 생성되도록 하거나 혹은 그 반대의 생산을 위한 몇몇 방법이 보고되었다. 본 발명에서는 세포가 각각의 단일특이적 항체보다는 이중특이적 항체가 더 잘 생산하도록 하는 것이 바람직하다. 이는 전형적으로 헤테로다이머화(즉 중쇄/경쇄 조합의 다이머화)가 호모다이머화보다 더 잘 일어나도록 중쇄 불변영역을 변형함으로써 이루어질수 있다. 바람직한 구현예에 따르면 본 발명의 이중특이적 항체는 적합한 헤테로다이머화 도메인을 가지는 두 개의 상이한 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 다양한 적절한 헤테로다이머화 도메인이 당업계에 알려져 있다. 적합한 헤테로다이머화 도메인은 바람직하게는 적합한 면역글로불린 중쇄 CH3 헤테로다이머화 도메인이다. 야생형 CH3 도메인이 사용될 경우, 두 개의 상이한 중쇄(A 및 B)와 공통 경쇄의 공발현은 AA, AB 및 BB의 3개의 상이한 항체를 형성한다. AA 및 BB는 두 개의 단일특이적 항체인 이가(bivalent) 항체를 나타내고, AB는 이중특이적 항체를 나타낸다. 원하는 이중특이적 산물(AB)의 비율을 높이기 위해 CH3 조작 기술이 사용될 수 있는데, 즉 후술하는 바와 같이 적합한 헤테로다이머화 도메인을 가지는 중쇄를 사용할 수 있다. 이러한 중쇄의 헤테로다이머화를 위한 다양한 방법이 알려져 있다. 이러한 방법 중 하나는 '놉-인투-홀(knob into hole)' 이중특이적 항체를 제작하는 것이다.
용어‘적합한 헤테로다이머화 도메인’은 변형된(engineered) 도메인 A’가 우선적으로 변형된 도메인 B’와 함께 헤테로다이머를 형성하거나 그 반대의 작용을 하고, A’-A’및 B’-B’사이의 호모다이머화는 감소되도록 변형된 단백질 도메인을 의미한다.
US13/866,747(등록번호 US 9,248,181), US14/081,848 (등록번호 US 9,358,286) 및 PCT/NL2013/050294(공개번호 WO2013/157954); 본 명세서에 참조로서 삽입됨)에는 헤테로다이머화 도메인을 이용하여 이중특이적 항체를 생산하는 수단과 방법이 기재되어 있으며, 이들 수단과 방법은 본 발명에서도 사용될 수 있다.
US13/866,747(등록번호 US 9,248,181), US14/081,848 (등록번호 US 9,358,286) 및 PCT/NL2013/050294(공개번호 WO2013/157954); 본 명세서에 참조로서 삽입됨)에는 헤테로다이머화 도메인을 이용하여 이중특이적 항체를 생산하는 수단과 방법이 기재되어 있으며, 이들 수단과 방법은 본 발명에서도 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 이중특이적 항체는 이중특이적 전장 IgG 분자만을 생산하기 위한 돌연변이를 포함한다. 바람직한 돌연변이는 제1 CH3 도메인(‘KK-변이체’중쇄)에서의 L351K 및 T366K와 제2 도메인(‘DE-변이체’ 중쇄)의 L351D 및 L368E 아미노산 치환, 또는 그 반대이다. US 9,248,181, US 9,358,286 및 WO2013/157954 PCT 출원(본 명세서에 참조로서 삽입됨)에서 DE-변이체 및 KK-변이체가 짝을 이루어 헤테로다이머(소위‘DEKK’ 이중특이적 분자)를 형성함을 보여주었다. DE-변이체 중쇄의 호모다이머화(DEDE 호모다이머)는 동일한 중쇄 간 CH3-CH3 경계면의 하전된 잔기들의 척력으로 인해 잘 일어나지 않는다.
이중특이적 항체는 경쇄 및 CH3가 효율적인 헤테로다이머화 및 이중특이적 항체 형성이 가능하도록 변형된 두 개의 상이한 중쇄를 인코딩하는 플라스미드의 (일시적)형질주입을 통해 만들어질 수 있다. 단일 세포에서 이들 쇄의 형성은 단일특이적 항체보다 이중특이적 항체가 더 잘 만들어지도록 한다. 이중특이적 전장 IgG1 분자 만을 생산하기 위한 바람직한 돌연변이는 제1 CH3 도메인에서의 351 및 366번 잔기에서의 아미노산 치환, 예를 들어 L351K 및 T366K(EU 번호에 따름)('KK-변이체' 중쇄)과, 제2 CH3 도메인에서의 351 및 368번 잔기에서의 아미노산 치환, 예를 들어 L351D 및 L368E('DE-변이체' 중쇄), 또는 그 반대이다(예를 들어 도 10e 및 10f).
일 구현예에 따르면, EGFR에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 중쇄/경쇄 조합은 중쇄의 DE 변이체를 포함한다. 이 경우 cMET에 결합할 수 있는 가변 도메인을 포함하는 중쇄/경쇄 조합은 중쇄의 KK 변이체를 포함한다. cMET에 결합하는 중쇄의 KK 변이체는 호모다이머를 형성하지 않으므로 이중특이적 항체가 HGF 유도된 cMET 활성화 억제효과를 매우 명확하게 달성할 수 있도록 한다. 이로써 cMET 항체에서 가끔 관찰되는 cMET의 활성화(작용 항체)를 회피할 수 있다.
Fc 영역은 보체 의존적 세포독성(CDC), 항체-의존적 세포독성(ADCC) 및 항체-의존적 세포 식균작용(ADCP)과 같은 작동 기능(effector function)을 매개한다. 치료 항체 또는 Fc 융합 단백질 적용 여부에 따라, 작동 기능을 감소시키거나 증가시키는 것이 요구될 수 있다. 본 발명의 몇몇 구현예에서, 면역 반응이 활성화되거나, 강화되거나 자극될 때 작동 기능이 감소되어야 한다. 감소된 작동 기능을 가지는 항체는 다른 세포들 중 면역세포의 세포-표면 분자 타겟팅에 사용될 수 있다. 감소된 작동 기능을 가지는 항체는 바람직하게는 예를 들어 Fc-수용체 상호작용을 감소시키거나 C1q 결합을 감소기키기 위해 변형된 CH2/하부 힌지 영역을 가지는 IgG 항체이다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 돌연변이 CH2 및/또는 하부 힌지 도메인을 가져 Fc-감마 수용체와의 상호작용이 감소된 이중특이적 IgG 항체이다. 돌연변이 CH2 영역을 포함하는 항체는 바람직하게는 IgG1 항체이다. 이러한 돌연변이 IgG1 CH2 및/또는 하부 힌지 도메인은 바람직하게는 235 및/또는 236 (EU 번호에 따름) 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 바람직하게는 L235G 및/또는 G236R 치환을 포함한다(도 10d).
본 발명의 항체는 바람직하게는 작동 기능을 가진다. 본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게는 항체-의존적 세포독성(ADCC)을 포함한다. 항체는 ADCC 활성이 강화되도록 변형될 수 있다(Cnacer Sci. 2009 Sep;100(9):1566-72. Engineered therapeutic antibodies with improved effector functions. Kubota T, Niwa R, Satoh M, Akinaga S, Shitara K, Hanai N). ADCC를 유도하는 항체 또는 작동 세포의 효능을 측정하는 몇몇 인 비트로 방법이 존재하는데, 여기엔 크롬-51 [Cr51] 방출 어세이, 유러퓸 [Eu] 방출 어세이 및 황-35 [S35] 방출 어세이가 있다. 보통, 특정 표면-노출된 항원을 발현하는 표지된 타겟 세포주를 상기 항원 특이적인 항체와 함께 배양한다. 세척 후, Fc 수용체인 CD16을 발현하는 작동 세포를 항체-표지된 표적 세포와 함께 배양하였다. 이후 신틸레이션 계수기 또는 분광광도계로 세포내 표지의 방출 여부를 조사하여 표적 세포 용해를 측정하였다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 이중특이적 항체는 ADCC 활성을 나타낸다. 이 경우 이중특이적 항체는 증가된 ADCC 활성을 가질 수 있다. 또 다른 구현예에 따르면 본 발명의 이중특이적 항체는 ADCC 활성을 가지지 않는다. 이 경우 항체는 당업계에 알려진 기술을 이용하여 하나 이상의 CH2 돌연변이를 도입함으로써 감소된 ADCC 활성을 가진다. 항체의 ADCC를 강화하는 기술 중 하나로 탈푸코스화(afucosylation)가 있다(예를 들어 Junttila, T. T., K. Parsons, et al. (2010). "Superior In Vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer." Cancer Research 70(11): 4481-4489 참조). 따라서 본 발명은 또한 탈푸코스화된 본 발명의 이중특이적 항체를 제공한다. 택일적으로, 혹은 추가적으로, ADCC 강화를 위해 예를 들어 당질공학(glycoengineering)(Kyowa Hakko/Biowa, GlycArt (Roche) and Eureka Therapeutics) 및 돌연변이 유발(Xencor and Macrogenics)을 포함하는 많은 다른 전략이 사용될 수 있는데, 이들은 모두 Fc가 낮은-친화도의 활성화 FcγRⅢa에 잘 결합하도록 하거고/또는 낮은 친화도의 억제성 FcγRⅡb와의 결합을 감소시키기 위한 것이다. 본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게는 ADCC 활성 증진을 위해 탈푸코스화되된다. 본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게는 통상의 CHO 세포에서 생산된 동일한 항체와 비교하여 Fc 부위에서 N-결합 탄수화물 구조의 푸코스화 정도가 감소되어 있다.
본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 변이체는 이들의 기능적 일부, 유도체 및/또는 유사체를 포함한다. 변이체는 (이중특이적) 항체의 결합 특이성을 유지한다. 기능적 일부, 유도체 및/또는 유사체는 (이중특이적) 항체의 결합 특이성을 유지한다. 결합 특이성은 제1 막단백질 및 제2 막단백질의 세포외 부위에 결합하는 능력으로 정의된다.
본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게는 인간을 대상으로 사용된다. 본 발명의 바람직한 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체이다. 본 발명의 이중특이적 항체의 불변영역은 바람직하게는 인간 불변영역이다. 불변영역은 천연의 인간 항체의 불변영역과 비교하여 하나 이상, 바람직하게는 10개 이하, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 불변영역은 전체적으로 천연의 인간 항체로부터 유래하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 제작되는 다양한 항체는 인간 항체 가변 도메인 라이브러리에서 유래한다. 이에, 이들 가변 도메인은 인간 유래이다. 특이적인 CDR 부위는 인간으로부터 유래하거나, 합성되거나 또는 다른 생물로부터 유래할 수 있다. 가변영역은 천연의 인간 항체와 CDR 부위는 다르더라도 가변영역의 아미노산 서열이 동일할 경우 인간 가변영역으로 간주된다. 이 경우, EGFR 또는 cMET과 결합하는 항체의 가변 도메인의 VH는 CDR 영역의 아미노산 서열 차이를 제외하고 천연의 인간 항체의 가변영역과 비교하여 하나 이상, 바람직하게는 10개 이하, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체의 EGFR 결합 도메인 및/또는 cMET 결합 도메인의 경쇄 가변영역은 CDR 영역의 아미노산 서열 차이를 제외하고 천연의 인간 항체의 가변영역과 비교하여 하나 이상, 바람직하게는 10개 이하, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체의 경쇄는 CDR 영역의 아미노산 서열 차이를 제외하고 천연의 인간 항체의 가변영역과 비교하여 하나 이상, 바람직하게는 10개 이하, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 체세포 과변이 상황에서 자연계에서도 일어날 수 있다.
항체는 적어도 중쇄 가변영역에 관해선 다양한 동물종에서 유래할 수 있다. 예를 들어 뮤린 중쇄 가변영역을 인간화하는 것은 통상적인 기술이다. 이를 위해 다양한 방법이 적용될 수 있는데, 그 중엔 뮤린 중쇄 가변영역의 3차원 구조에 맞게 입체적으로 인간 중쇄 가변영역에 CDR을 이식하는 방법; 바람직하게는 T- 또는 B- 세포의 알려진 에피토프 또는 에피토프로 예상되는 부위의 제거를 통한 중쇄 가변영역의 탈면역화(deimmunization)가 있다. 제거는 전형적으로 에피토프 내의 1개 이상의 아미노산을 다른 아미노산(전형적으로 보존적인 아미노산)으로 치환하여 에피토프의 서열이 더 이상 T- 또는 B-세포 에피토프로 기능하지 못하도록 변형하는 것이다.
탈면역화된 뮤린 중쇄 가변영역은 본래의 뮤린 중쇄 가변영역에 비하여 인간에서의 면역원성이 떨어진다. 바람직하게는 가변영역 또는 도메인이 추가적으로 인간화되어 베니어링(veneering)될 수 있다. 베니어링 기술을 이용하여, 면역체계에 이미 노출된 외부의 잔기가 선택적으로 인간 잔기로 대체되어 약한 면역원성을 가지거나 실질적으로 탈면역화된 베니어된 표면을 가지는 하이브리드 분자를 제공할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 동물은 바람직하게는 포유류이고, 보다 바람직하게는 영장류이며, 가장 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 이중특이적는 바람직하게는 인간 항체의 불변영역을 포함한다. 중쇄 불변 도메인의 차이에 따라, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE의 5개 클래스 또는 아형으로 분류된다. 이들 클래스 또는 아형은 상응하는 그리스 문자로 명명된 적어도 하나의 중쇄를 포함한다. 바람직하게는 상기 불변 부위는 IgG 불변 영역, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 상기 불변영역은 IgG1 또는 IgG4 불변영역이고, 보다 바람직하게는 변이된 IgG1 불변영역이다. IgG1 불변 영역에서 항체의 면역학적 특성에 영향을 미치지 않는 자연적인 몇몇 변이가 발생한다. 변이는 항체 또는 그 일부의 바람직한 특성을 부여하기 위해 인공적으로도 도입될 수 있다. 전형적으로 1-10개 사이의 아미노산 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합이 불변영역에서 일어날 수 있다.
도 1, 7 또는 8에 나타난 VH 쇄는 해당 VH 쇄에 대해 바람직하게는 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지고, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지며, 바람직하게는 0, 1, 2, 3 또는 4개의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지고, 바람직하게는 0, 1, 2 또는 3개의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지며, 보다 바람직하게는 0, 1 또는 2개의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지고, 바람직하게는 0 또는 1개의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가진다. 하나 이상의 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합은 바람직하게는 VH 쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역에서 발생하지 않는다. 이들은 바람직하게는 FR4 부위에도 존재하지 않는다. 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산의 치환이다.
비-인간 잔기를 최소화하기 위한 합리적인 방법이 개발되어 왔다. 특정 항체의 항원-결합 특징을 다른 항체에 이식하기 위한 다양한 방법이 이용될 수 있다. 항체의 결합 특성은 CDR3 영역의 정확한 서열에 의해 주로 결정되는데, 적절한 가변 도메인 전체 구조와 조합되어 가변 도메인의 CDR1 및 CDR2 영역의 서열에 의해 종종 뒷받침된다. CDR 영역을 다른 항체의 적절한 가변 도메인에 이식하는 다양한 방법이 알려져 있다. 이들 몇몇 방법은 본 명세서에 참조로서 삽입된 J.C. Almagro1 and J. Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633에서 검토되었다. 따라서 본 발명은 EGFR과 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 cMET과 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하면서, EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 1에 나타난 MF3370의 VH CDR3 서열을 포함하며, cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 1에 나타난 MF4356의 VH CDR3 서열을 포함하는 인간 또는 인간화된 이중특이적 항체를 제공한다. EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 영역은 바람직하게는 도 1에 나타난 MF3370의 VH 쇄의 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. cMET 결합 부위를 포함하는 VH 가변 영역은 바람직하게는 도 1에 나타난 MF4356의 VH 쇄의 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. 도 1의 VH의 CDR 영역을 가지는 VH 쇄를 생산하기 위해 CDR3 이식을 할 수도 있다
CDR 이식은 도 1의 VH의 CDR 영역을 가지면서 상이한 프레임워크를 가지는 VH 쇄를 만들기 위해 이용될 수도 있다. 상이한 프레임워크는 다른 인간 또는 다른 포유류의 VH의 프레임워크일 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 EGFR에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 cMET에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 7에 나타난 MF8233의 VH CDR3 서열을 포함하고, 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 8에 나타난 MF8230의 VH CDR3 서열을 포함하는 인간 또는 인간화된 이중특이적 항체를 제공한다. EGFR 결합 부위를 포함하는 VH 가변영역은 바람직하게는 도 7에 나타난 MF8233 VH 쇄의 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역의 서열을 포함한다. cMET 결합 부위를 포함하는 VH 가변영역은 바람직하게는 도 8에 나타난 MF8230 VH 쇄의 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역의 서열을 포함한다. CDR 이식은 도 7 또는 도 8의 VH의 CDR 영역을 가지면서 상이한 프레임워크를 가지는 VH 쇄를 만들기 위해 이용될 수도 있다. 상이한 프레임워크는 다른 인간 또는 다른 포유류의 VH의 프레임워크일 수 있다.
본 발명은 또한 EGFR에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 cMET에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 1에 나타난 MF3370의 VH CDR3 서열을 포함하고, 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 8에 나타난 MF8230의 VH CDR3 서열을 포함하는 인간 또는 인간화된 이중특이적 항체를 제공한다. 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 바람직하게는 도 1에 나타난 MF3370 VH쇄의 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 바람직하게는 도 8에 나타난 MF8230 VH쇄의 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. CDR 이식은 도 7 또는 도 8의 VH의 CDR 영역을 가지면서 상이한 프레임워크를 가지는 VH 쇄를 만들기 위해 이용될 수도 있다. 상이한 프레임워크는 다른 인간 또는 다른 포유류의 VH의 프레임워크일 수 있다.
본 발명은 또한 EGFR에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 cMET에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 7에 나타난 MF8233의 VH CDR3 서열을 포함하고, 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 8에 나타난 MF4356의 VH CDR3 서열을 포함하는 인간 또는 인간화된 이중특이적 항체를 제공한다. 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 바람직하게는 도 7에 나타난 MF8233 VH쇄의 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 바람직하게는 도 8에 나타난 MF4356 VH쇄의 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. CDR 이식은 도 7 또는 도 8의 VH의 CDR 영역을 가지면서 상이한 프레임워크를 가지는 VH 쇄를 만들기 위해 이용될 수도 있다. 상이한 프레임워크는 다른 인간 또는 다른 포유류의 VH의 프레임워크일 수 있다.
본 발명은 또한 EGFR에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 cMET에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 7에 나타난 MF8232의 VH CDR3 서열을 포함하고, 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 8에 나타난 MF8230의 VH CDR3 서열을 포함하는 인간 또는 인간화된 이중특이적 항체를 제공한다. 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 바람직하게는 도 7에 나타난 MF8232 VH쇄의 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 바람직하게는 도 8에 나타난 MF8230 VH쇄의 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. CDR 이식은 도 7 또는 도 8의 VH의 CDR 영역을 가지면서 상이한 프레임워크를 가지는 VH 쇄를 만들기 위해 이용될 수도 있다. 상이한 프레임워크는 다른 인간 또는 다른 포유류의 VH의 프레임워크일 수 있다.
본 발명은 또한 EGFR에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 cMET에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 7에 나타난 MF8232의 VH CDR3 서열을 포함하고, 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 8에 나타난 MF4356의 VH CDR3 서열을 포함하는 인간 또는 인간화된 이중특이적 항체를 제공한다. 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 바람직하게는 도 7에 나타난 MF8232 VH쇄의 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 바람직하게는 도 8에 나타난 MF4356 VH쇄의 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. CDR 이식은 도 7 또는 도 8의 VH의 CDR 영역을 가지면서 상이한 프레임워크를 가지는 VH 쇄를 만들기 위해 이용될 수도 있다. 상이한 프레임워크는 다른 인간 또는 다른 포유류의 VH의 프레임워크일 수 있다.
본 발명은 또한 EGFR에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 cMET에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 7에 나타난 MF3370의 아미노산 서열에서 최대 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 서열을 포함하고, 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 8에 나타난 MF4356의 아미노산 서열(서열번호: 23)에서 최대 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 서열을 포함하는 인간 또는 인간화된 이중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 EGFR에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 cMET에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 7에 나타난 MF8233의 아미노산 서열에서 최대 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 서열을 포함하고, 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 8에 나타난 MF8230의 아미노산 서열(서열번호: 13)에서 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 서열을 포함하는 인간 또는 인간화된 이중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 EGFR에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 cMET에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 7에 나타난 MF3370의 아미노산 서열에서 최대 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 서열을 포함하고, 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 8에 나타난 MF8230의 아미노산 서열(서열번호: 13)에서 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 서열을 포함하는 인간 또는 인간화된 이중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 EGFR에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 cMET에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 7에 나타난 MF8233의 아미노산 서열에서 최대 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 서열을 포함하고, 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 8에 나타난 MF4356의 아미노산 서열(서열번호: 23)에서 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 서열을 포함하는 인간 또는 인간화된 이중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 EGFR에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 cMET에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 7에 나타난 MF8232의 아미노산 서열에서 최대 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 서열을 포함하고, 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 8에 나타난 MF4356의 아미노산 서열(서열번호: 23)에서 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 서열을 포함하는 인간 또는 인간화된 이중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 EGFR에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 cMET에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 상기 EGFR 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 7에 나타난 MF8232의 아미노산 서열에서 최대 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 서열을 포함하고, 상기 cMET 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 8에 나타난 MF8230의 아미노산 서열(서열번호: 13)에서 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 서열을 포함하는 인간 또는 인간화된 이중특이적 항체를 제공한다.
상기 언급한 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 및 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산의 치환, 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합이며, 바람직하게는 VH 쇄의 CDR3 영역에서는 발생하지 않으며, 바람직하게는 VH 쇄의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역에서 발생하지 않고, 바람직하게는 FR4 영역에서 발생하지 않는다.
이중특이적 항체를 생산하는 다양한 방법이 개시되어 있다. 이중 하나의 방법은 하나의 세포에서 두개의 상이한 중쇄 및 두개의 상이한 경쇄를 발현시키고 세포에 의해 생산된 항체를 수집하는 것이다. 이렇게 생산된 항체는 전형적으로 상이한 조합의 중쇄 및 경쇄를 가지는 항체의 집합이 되고 이들 중 일부에 원하는 이중특이적 항체가 있다. 이중특이적 항체는 이후 집합물로부터 정제될 수 있다. 세포에서 생산된 항체들 중 이중특이적 항체의 비율은 다양한 방법으로 증가시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 비율은 하나의 세포에서 두 개의 상이한 경쇄가 아닌 하나의 공통 경쇄를 발현시킴으로써 증가시킬 수 있다. 공통 경쇄가 두개의 상이한 중쇄와 함께 발현되면, 세포에 의해 생산되는 항체들 중 이중특이적 항체의 비율은 두 개의 상이한 경쇄를 발현하는 경우에 비하여 유의하게 개선된다. 세포에 의해 생산되는 이중특이적 항체의 비율은 두 개의 동일한 중쇄보다 두개의 상이한 중쇄의 짝지움(pairing)을 더 촉진함으로써 보다 더 개선될 수 있다. 세포에 의해 생산되는 이중특이적 항체의 비율은 두 개의 동일한 중쇄보다 두개의 상이한 중쇄의 짝지움(pairing)을 더 촉진함으로써 보다 더 개선될 수 있다. (단일 세포로부터) 단일특이적 항체보다 이중특이적 항체가 더 잘 생성되도록 하는 다양한 이중특이적 항체 생산방법 및 수단이 알려져 있으며, 이러한 방법은 본 발명에서 바람직하게 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 단일세포로부터 경계면을 형성할 수 있는 두 개의 CH3 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 세포 내에서 a) 중쇄를 포함하는 제1 CH3 도메인을 인코딩하는 제1 핵산 분자, b) 중쇄를 포함하는 제2 CH3 도메인을 인코딩하는 제2 핵산 분자를 제공하는 단계를 포함하되, 상기 핵산 분자는 상기 제1 및 제2 CH3 도메인의 우선적인 짝지움을 위한 수단을 가지고, 상기 방법은 상기 세포를 배양하여 상기 핵산 서열이 발현되도록 하는 단계 및 배양액으로부터 상기 이중특이적 항체를 수집하는 단계를 추가적으로 포함한다. 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 동일한 핵산분자, 벡터 또는 유전자 전달 비이클의 일부분으로서 숙주세포 유전자의 동일한 부위에 삽입되었을 수 있고, 또는 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 상기 세포에 개별적으로 공급될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 제공하는 단계를 포함하는 경계면(interface)을 형성할 수 있는 2개의 CH3 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항체를 단일 세포로부터 생산하는 방법을 제공한다:
- a) EGFR과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하고 제1 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 인코딩하는 제1 핵산 분자, 및 b) ErbB-3와 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하고 제2 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 가지는 세포, 상기 핵산 분자는 상기 제1 및 제2 CH3 도메인의 우선적인 짝지움(pairing)을 위한 수단을 포함한다.
상기 방법은 상기 세포를 배양하여 상기 두 개의 핵산 분자가 인코딩하는 단백질이 발현되도록 하는 단계 및 배양액으로부터 상기 상기 이중특이적 IgG 항체를 수집하는 단계를 추가적으로 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 세포는 공통 경쇄를 인코딩하는 제3의 핵산 분자를 가진다. 상기 제1, 제2 및 제3 핵산분자는 동일한 핵산분자, 벡터 또는 유전자 전달 비이클의 일부분으로서 숙주세포 유전자의 동일한 부위에 삽입되었을 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 세포는 공통 경쇄를 인코딩하는 제3의 핵산 분자를 가진다. 상기 제1, 제2 및 제3 핵산분자는 동일한 핵산분자, 벡터 또는 유전자 전달 비이클의 일부분으로서 숙주세포 유전자의 동일한 부위에 삽입될 수 있다. 또는, 상기 제1, 제2 및 제3 핵산분자는 개별적으로 상기 세포에 제공될 수 있다. 바람직한 공통 경쇄는 O12에 기반하며, 바람직하게는 상술한 바와 같이 재배열된 생식계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1 39*01/IGJκ1*01이다. 상기 제1 및 상기 제2 CH3 도메인의 바람직한 짝지움을 위한 수단은 바람직하게는 중쇄 코딩 영역의 CH3 도메인의 상응하는 돌연변이이다. 이중특이적 항체 항체만을 우선적으로 생산하기 위한 바람직한 돌연변이는 제1 CH3 도메인에서의 L351K 및 T366K(EU 번호) 아미노산 치환 및 제2 CH3 도메인에서의 L351D 및 L368E 아미노산 치환, 또는 그 반대이다. 본 발명은 또한 상기 제1 CH3 도메인이 L351K 및 T366K(EU 번호)의 아미노산 치환을 포함하고 상기 제2 CH3 도메인이 아미노산 치환 L351D 및 L368E의 아미노산 치환을 포함하여, 상기 세포를 배양하여 상기 핵산 분자를 발현되도록 하는 단계 및 배양액으로부터 상기 이중특이적 항체를 수집하는 단계를 추가적으로 포함하는 이중특이적 항체의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 제1 CH3 도메인이 L351D 및 L368E(EU 번호)의 아미노산 치환을 포함하고 상기 제2 CH3 도메인이 아미노산 치환 L351K 및 T366K의 아미노산 치환을 포함하여, 상기 세포를 배양하여 상기 핵산 분자를 발현되도록 하는 단계 및 배양액으로부터 상기 이중특이적 항체를 수집하는 단계를 추가적으로 포함하는 이중특이적 항체의 생산 방법을 제공한다. 이러한 방법에 의해 생산될 수 있는 항체는 역시 본 발명의 일부분이다. CH3 헤테로다이머화 도메인은 바람직하게는 IgG1 헤테로다이머화 도메인이다. CH3 헤테로다이머화 도메인을 포함하는 중쇄 불변영역은 바람직하게는 IgG1 불변영역이다.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 항체 중쇄 가변영역을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자(전형적으로 인 비트로, 분리되거나 재조합된 핵산 분자)는 바람직하게는 도 7 또는 도 8에 나타난 중쇄 가변영역, 또는 도 7 또는 도 8에 나타난 중쇄 가변영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 중쇄 가변영역을 인코딩한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 핵산 분자는 도 7 또는 도 8에 나타난 아미노산 서열을 인코딩하는 코던 최적화된 핵산서열을 포함한다. 상기 코던 최적화는 종(species) 및/또는 항체 생산 세포의 세포 형태에 대해 최적화된다. 예를 들어, CHO 생산을 위해 분자의 핵산 서열은 중국 햄스터 세포에 코던 최적화된다. 본 발명은 또한 도 7 또는 도 8의 중쇄를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 필수적이진 않지만 전형적으로 리보핵산(RNA) 또는 디옥시리보핵산(DNA)이다. 이용 가능한 또 다른 핵산은 당업자에게 알려져 있다. 본 발명의 핵산 분자는 예를 들어 세포에 포함되어 있다. 상기 핵산 분자가 상기 세포에서 발현되면, 상기 세포는 본 발명의 항체를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예는 본 발명의 항체 및/또는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 바람직하게는 동물 세포이고, 보다 바람직하게는 포유류 세포이며, 보다 바람직하게는 영장류 세포이고, 가장 바람직하게는 인간 세포이다. 본 발명의 목적 상 적합한 세포는 본 발명의 항체 및/또는 핵산을 포함하거나 바람직하게는 이를 생산할 수 있는 세포이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 포함하는 세포를 제공한다. 또한 단독으로 혹은 함께 본 발명의 항체를 인코딩할 수 있는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다. 바람직하게는 상기 세포(전형적으로 인 비트로, 분리되거나 재조합된 세포)는 상기 항체를 생산한다. 상기 세포는 저장된 세포로서 저장고에서 꺼내 배양함으로써 상기 항체를 생산할 수 있는 세포일 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면 상기 세포는 하이브리도마 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포 또는 PER-C6TM 세포이다. 특히 바람직한 구현예에 따르면 상기 세포는 CHO 세포이다. 본 발명은 또한 본 발명의 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공한다. 다양한 기관과 기업에서 예를 들어 임상적인 사용을 위해 항체를 대량 생산하기 위한 세포주를 개발하였다. 이러한 세포의 예로 CHO 세포, NS0 세포 또는 PER.C6TM 세포가 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는 단백질 생산과 같은 다른 목적으로도 사용된다. 단백질 및 항체의 산업적 규모의 생산을 위한 세포주는 본 명세서에서 산업적 세포주로 칭한다. 따라서, 바람직한 구현예에 따르면 본 발명은 본 본 발명의 항체의 대량 생산을 위해 개발된 세포주의 본 발명의 항체 생산을 위한 용도를 제공하며, 바람직하게는 본 발명의 항체를 생산하는 상기 세포는 도 7 및 8에 나타난 VH, VL 및/또는 중쇄를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 세포를 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 상기 항체를 수집하는 단계를 포함하는 항체 생산 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 세포는 무혈청 배지에서 배양한다. 바람직하게는 상기 세포는 부유 생장에 적응되어 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체 생산 방법으로 수득할 수 있는 항체를 제공한다. 상기 항체는 바람직하게는 배양 배지로부터 정제된 항체이다. 바람직하게는 상기 항체 친화도를 이용하여 정제된 항체이다.
본 발명의 세포는 예를 들어 하이브리도마 세포주, CHO 세포, 293F 세포, NS0 세포 또는 임상적 사용을 위한 항체 생산에 적합하다고 알려진 여하한 형태의 세포이다. 특히 바람직하게는 상기 세포는 인간 세포이고, 바람직하게는 아데노바이러스 E1 영역 또는 그 기능적 동등체에 의해 형질전환된 세포이다. 이러한 세포의 바람직한 예는 PER.C6TM 세포주 또는 그 동등체이다. 특히 바람직하게는 상기 세포는 CHO 세포 또는 그 변이체이고, 바람직하게는 글루타민 신타아제(GS) 벡터 시스템을 이용하여 항체를 발현하는 변이체이다.
본 발명의 항체는 부유 293F 세포에 일시적 형질주입 후 > 50 mg/L 수준으로 생산될 수 있다. 상기 이중특이적 항체는 98% 이상의 순도와 > 70%의 수율로 정제될 수 있다. 분석적 특성조사 결과 이중특이적 lgGl 항체 프로파일은 이가 단일특이적 lgG1과 유사하였다. 기능적 활성의 측면에서 본 발명의 이중특이적 항체는 인 비트로 및 인 비보 모두에서 세툭시맙보다 더 우수한 활성을 보일 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 약제학적 조성물은 바람직하게는 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함한다.
본 발명의 항체는 표지(label), 바람직하게는 인 비보 이미징을 위한 표지를 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 표지는 전형적으로 치료적 적용에는 필요하지 않다. 예를 들어 신체 내에서 타겟 세포를 시각화함으로써 진단 목적에서는 표지가 도움이 될 수 있다. 적합한 다양한 표지가 있으며 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직한 구현예에 따르면 상기 표지는 검출을 위한 방사성 표지이다. 다른 바람직한 구현예에 따르면 상기 표지는 적외선 표지이다. 바람직하게는 적외선 표지는 인 비보 이미징에 적합하다. 다양한 적외선 표지가 당업계에 알려져 있다. 바람직한 적외선 표지는 예를 들어, IRDye 800; IRDye 680RD; IRDye 680LT; IRDye 750; IRDye 700DX; IRDye 800RS IRDye 650; IRDye 700 포스포아미다이트; IRDye 800 포스포아미다이트 (LI-COR USA; 4647 Superior Street; Lincoln, Nebraska)가 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 종양에 걸렸거나 또는 종양에 결릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 종양은 바람직하게는 EGFR 양성 종양, cMET 양성 종양 또는 EGFR 및 cMET 양성 종양이다. 치료를 개시하기 전에 본 발명의 방법은 바람직하게는 상기 대상체가 EGFR, cMET 또는 EGFR/cMET 양성 종양을 가졌는지 여부를 결정하는 단계가 추가적으로 포함한다. 본 발명은 또한 EGFR, cMET 또는 EGFR/cMET 양성 종양에 걸렸거나 이에 걸릴 위험이 있는 대상체의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
종양이 EGFR 양성인지를 판단하기 위해 당업자는 예를 들어 EGFR 증폭 및/또는 면역조직화학 염색을 사용할 수 있다. 생체검에서 최소 10%의 종양 세포가 양성이어야 한다. 생체검사는 또한 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 그 이상의 양성 세포를 포함할 수 있다. 종양이 cMET 양성인지를 판단하기 위해 당업자는 예를 들어 cMET 증폭 및/또는 면역조직화학 염색을 사용할 수 있다. 생체검에서 최소 10%의 종양 세포가 양성이어야 한다. 생체검사는 또한 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 그 이상의 양성 세포를 포함할 수 있다.
본 발명은 유방암, 대장암, 췌장암,위암, 난소암, 결장직장암, 두경부암암, 비소세포 폐암을 포함하는 폐암, 방광암 등의 광범위한 암에 적용될 수 있다. 종양은 EGFR, cMET 또는 EGFR/cMET 양성 암일 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 EGFR, cMET 또는 EGFR/cMET 양성 암은 초기 유방암과 같은 유방암이다. 또 다른 구현예에 따르면 상기 EGFR, cMET 또는 EGFR/cMET 양성 암은 결장직장암이다. 본 발명은 유방암, 대장암, 췌장암,위암, 난소암, 결장직장암, 두경부암암, 비소세포 폐암을 포함하는 폐암, 방광암 등과 같은 광범위한 EGFR, cMET 또는 EGFR/cMET 양성 암에 적용될 수 있다. 상기 대상체는 바람직하게는 인간 대상체이다. 상기 대상체는 바람직하게는 세툭시맙과 같은 EGFR 특이적 항체를 이용한 항체 치료에 적합한 대상체이다. 바람직한 구현예에 따르면 본 발명은 EGFR/cMET 양성 암, 바람직하게는 EGFR RTK 저항성 표현형, EGFR 단클론 항체 저항성 표현형 또는 이들의 조합을 가지는 종양/암을 치료한다.
환자에게 투여되는 본 발명의 항체의 양은 전형적으로 치료범위 내에 있으며, 이는 치료적 효과를 달성하기에 충분하되, 수인 불가한 부작용의 역치 값을 초과하지 않는 양을 의미한다. 원하는 치료적 효과를 달성하는데 필요한 항체의 양이 적을수록 치료범위는 전형적으로 넓다. 본 발명의 항체는 낮은 용향으로도 충분한 치료 효과를 발휘하여 바람직하다. 용량은 세툭시맙의 처방 용향의 범위 내일 수 있으며, 이보다 낮을 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게는 동일한 조건 하에서 세툭시맙보다 낮은 피부 독성을 유발한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게는 동일한 조건 하에서 세툭시맙보다 낮은 친염증성 케모카인, 바람직하게는 CXCL14를 유도한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게는 동일한 조건 하에서 세툭시맙보다 항균성 RNAse, 바람직하게는 Rnase 7이 덜 손상되어 있다.
본 발명은 EGFR를 표적으로 하는 다른 항체들 중 EGFR 및 cMET 수용체를 타겟으로 하여 인 비트에서 암세포주를 강력하게 억제하고 인 비보에서 종양 성장을 억제하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 이중특이적 항체는 낮은 독성과 높은 효능이 조합되어 있다. 본 발명의 이중특이적 항체는 다양한 형태의 EGFR-표적치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 양쪽 암(arm)이 동일한 항원(들)과 결합하는 항체와 비교하여 증가된 치료 범위를 가진다. 본 발명의 이중특이적 항체는 인 비트로, 인 비보 또는 이들의 조합에서 세툭시맙 항체보다 더 우수한 성장 억제 효과를 보인다.
본 발명은 또한 다양한 암에 결렸을 수 있는 대상체의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 상기 종양은 EGFR 양성 종양, cMET 양성 종양 또는 EGFR 및 cMET 양성 종양일 수 있다. 상기 종양은 유방암; 대장암, 췌장암, 위암, 난소암, 결장직장암, 두경부암암, 비소세포 폐암을 포함하는 폐암 또는 방광암일 수 있다. 상기 종양은 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 저항성일 수 있다. 상기 EGFR 티로신 키나아제 억제제는 바람직하게는 에를로티닙, 제피티닙 또는 아파티닙, 에를로티닙, 제피티닙 또는 아파티닙의 유사체 또는 각 화합물 및/또는 이들의 유사체의 하나 이상의 조합이다. 본 발명의 치료는 EGFR 티로신 키나아제 억제제를 이용한 치료를 추가적으로 포함한다. EGFR 티로신 키나아제 억제제를 함께 투여할 경우 종양은 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 저항성을 가지게 될 수 있다. 병용 투여는 최소한 부분적으로 티로신 키나아제 억제제에 대한 종양의 민감성을 회복시킨다. EGFR 티로신 키나아제 억제제는 1세대 EGFR 티로신 키나아제 억제제일 수 있다. 임상적으로 적합한 EGFR 티로신 키나아제 억제제의 예는 에를로티닙 및 제피티닙이다. 종양은 HGF-관련 종양일 수 있다.
EGFR-양성 종양은 전형적으로 EGFR 활설화 돌연변이를 가지는 종양이다. EGFR 활성화 돌연변이는 EGF/EGFR 신호 경로의 활성화를 야기하는 EGFR 돌연변이다. EGFR 활성화 돌연변이는 종양의 암화 단계에서 중요할 수 있다. 이러한 종양이 EGFR 표적 치료에 대해 비민감성을 가지게 되는 원인 중 하나는 HGF/cMET 신호 경로의 활성화이다. 종양은 HGF-관련 종양일 수 있다. cMET/HGF 신호 경로의 활성화는 EGFR-양성 종양이 EGFR-표적 치료로부터 회피할 수 있는 방법이 된다. cMET/HGF 경로는 다양한 방법으로 활성화될 수 있으며, 이는 당업계에 잘 알려져 있고 이중 일부는 본 발명에서 자세히 소개되어 있다. 본 발명의 항체는 과량의 HGF로 인해 cMET/HGF 신호 경로가 활성화된 종양의 치료에 특히 적합하다. 이러한 cMET 양성 종양은 HGF-관련 종양 또는 HGF-의존성 종양으로 불린다. 본 발명의 항체는 EGFR 양성 종양의 이러한 가능한 회피 매카니즘을 최소 부분적으로 억제하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 종양은 cMET/HGF 신호 경로가 활성화된 종양세포의 선택적인 성장을 통해 EGFR-표적 치료를 회피할 수 있다. 이러한 세포는 EGFR-표적 치료 개시시점에 존재할 수 있다. 이러한 세포는 HGF/cMET 신호 음성 종양 세포에 비해 성장에 있어서의 이점이 있다. 상기 종양은 HGF/cMET 신호 경로가 활성화된 종양일 수 있다. 상기 종양은 종양 간세포 성장인자(HGF)의 증가 또는 HGF 수용체 c-Met의 과발현과 관련된 종양일 수 있다. 상기 종양은 EGF 및/또는 HGF에 의해 성장이 촉진되는 종양일 수 있다. 성장인자에 존재에 반응함으로써 종양 세포에서 신호 경로가 활성화되고 상기 성장인자의 제거가 종양 세포 성장 억제로 이어질 경우, 종양이 특정 성장인자에 의해 유도되었다고 말할 수 있다. “감소”는 감소된 세포분열 및/또는 아폽토시스와 같은 세포 사멸의 유도를 통해 측정될 수 있다. 종양 성장이 가능한 조건에서 HGF의 존재 하에 종양이 성장하거나 더 빨리 성장하는 경우, 종양은 HGF-관련 종양이다.
다양한 종양에 대한 EGFR-타겟 치료는 Vecchione 등(EGFR-targeted therapy." Experimental cell research Vol 317 (2011): 2765-2771)에서 검토되었다. 보통 EGFR-표적 치료는 EGFR과 상호작용하는 분자를 이용한 치료이며 세포에서 EGFR-매개 신호를 억제한다.
본 발명의 치료방법 또는 치료에 사용하기 위한 항체의 용도는 바람직하게는 종양이 HGF-관련 종양인지를 결정하는 단계를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 항체는 HGF-관련 종양의 성장을 억제할 수 있다.
cMET 결합 가변 도메인이 CDR2 서열 “WINTYTGDPTYAQGFTG”을 가질 경우, CDR2도“WINTYTGDPTYAQGFT”일 수 있다.
수치 범위가 1과 2 사이일 때, 상기 범위는 숫자 1 및 2를 포함한다. 예를 들어 2-5의 범위는 숫자 2 및 5를 포함한다.
본 명세서에서 더 친화도가 높다고 언급할 경우에, Kd 값의 크기는 더 낮다. 다시 말해 10e-9 M의 Kd 값은 10e-8 M의 Kd 값보다 낮으며, 10e-9 M의 Kd 값을 가지는 항체는 10e-8 M의 Kd 값을 가지는 항체에 비하여 타겟에 대한 친화도가 높다.
본 명세서에서 인용된 특허문헌 또는 다른 문헌은 본 발명의 어떠한 청구항에 대한 우선일(priority date) 당시 상기 문헌이 알려지거나 상기 문헌에 포함된 정보가 일반적인 상식임을 인정하는 것은 아니다.
명확하고 간결한 설명을 위해 본 발명의 특징을 동일하거나 분리된 구현예로 서술하였으나, 본 발명의 범위에는 서술된 기술적 특징들의 전부 또는 일부가 조합된 구현예들도 포함될 수 있는 것으로 인정된다.
도 1은 본 발명에서 언급하는 가변 도메인들의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열을 보여주는 그림이다.
도 2는 항-EGFR cLC 이가 항체가 EGF 유도된 A431 세포 사멸을 억제하는 작용을 보여주는 그림이다. Y축은 사용된 항체 농도(X축)에 따른, 대사 활성을 가지는 세포 수를 반영하는 어세이의 형광 강도를 나타낸다. PG3370은 EGF-유도 세포 사멸을 억제할 수 있으며, 이에 항체 농도가 증가할수록 세포 성장이 강화됨을 보여주었다. 본 발명에서 세툭시맙 또는 참조 항체 세툭시맙으로 불리우는 세툭시맙/어비툭스의 가변영역 아미노산 서열을 가지는 분자가 내부 표분 물질로 사용되었다(검은 점).
도 3은 H385 세포(패널 A) 및 EBC-1 세포(패널 B)에서 cMET x EGFR 이중특이적 항체의 상처 치유 효과를 보여주는 그림이다. 세포를 단독으로(mock) 또는 12.5 ng/ml EGF 또는 15 ng/ml HGF, 혹은 HGF 및 EGF(15 ng/ml 및 12.5 ng/ml)와 추가적인 5개의 개별적인 cMET x EGFR 이중특이적 항체와 조합하여 배양하였다. 대조군으로서 세툭시맙과 2994의 조합을 이용하였다. Y축은 시간 경과(time-lapse) 현미경으로 측정한 상처 봉합 비율을 나타낸다.
도 4는 TKI 저항성 NSCLC 세포, HCC827 및 PC-9 세포에서 EGFR 및 cMET 발현에 대한 FACS 분석 결과를 보여주는 그림이다. 도 4a는 형광 표지된 항체를 이용하여 양 세포주의 EGFR 발현(x축) 및 cMET 발현(y축)에 대해 조사한 결과이다. 모든 HCC827 세포는 EGFR를 발현하였으며 EGFRhigh, cMETpos 집단 및 EGFRpos, cMETneg p집단으로 나뉘었다. PC-9 세포에는 EGFRhigh 및 cMETpos 세포의 작은 집단과 EGFRpos 및 cMETneg 세포의 최소 집단이 포함되었다. 도 4b는 PC-9 및 HCC827 세포에서의 상이한 세포 집단의 분포를 보여주는 그래프이다.
도 5는 PB8532 및 PB8388가 PC-9(패널 A) 및 HCC827(패널 B) 세포에서 HGF 유도된 TKI 억제제에 대한 저항성에 미치는 효과를 보여주는 그림이다. 세포에 이중특이적 PB8532, PB8388, 또는 세툭시맙/5D5 Fab 혼합물을 미리 처리하고 TKI 억제제와 함께 HGF 및/또는 EGF를 넣고 배양한 다음 증식을 측정하였다. PB8532는 PC-9 세포 및 HCC827 세포에서의 HGF 및 EGF 매개 제피티닙 저항성을 억제한다.
도 6은 각 항체가 PC-9 및 HCC827 세포에서 HGF 유도된 cMET 인산화 또는 EGF 유도된 EGFR 인산화에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. 항체 (100nM)를 15분간 37℃에서 배양하고 세포 추출물에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 (p)EGFR 및 (p)cMET를 검출하였다. 항-빈쿨린(vinculin) 항체를 단백질 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 7은 MF3370 및 그 변이체들의 서열을 보여주는 그림이다. MF4356의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 좌에서 우 방향으로 밑줄을 그었다. 다른 서열에서의 CDR도 상응하는 위치에 존재한다.
도 8은 MF4356 및 그 변이체들의 서열을 보여주는 그림이다. MF4356의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 좌에서 우 방향으로 밑줄을 그었다. 다른 서열에서의 CDR도 상응하는 위치에 존재한다.
도 9는 단일- 및 이중특이적 IgG에 사용된 공통 경쇄를 보여주는 그림이다. 도 9a: 공통 경쇄 아미노산 서열. 도 9b: 공통 경쇄 가변 도메인 DNA 서열 및 번역(IGKV1-39/jk1). 도 9c: 공통 경쇄 불변영역 DNA 서열 및 번역. 도 9d: IGKV1-39/jk5 공통 경쇄 가변 도메인 번역. 도 9e: V-영역 IGKV1-39A.
도 10은 이중특이적 분자 생성을 위한 IgG 중쇄를 보여주는 그림이다. 도 10a: CH1 도메인. 도 10b: 힌지 영역. 도 10c : CH2 영역. 도 10d: L235G 및 G236R 침묵화 치환을 포함하는 CH2 도메인. 도 10e: L351K 및 T366K(KK)를 포함하는 CH3 도메인. 도 10f; L351D 및 L368E (DE)를 포함하는 CH3 도메인.
도 11은 ELISA를 통해 EGF와 재조합 EGFR의 결합 억제를 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 연속적으로 희석한 IgG의 존재 하에 바이오틴화된 EGF가 코팅된 EGFR에 결합할 수 있도록 하였다. 세툭시맙은 양성 대조군으로 사용되었으며 PG2708은 음성 대조군 항체(Neg ctrl Ab)로 사용되었다. EGF 결합은 스트렙타비딘 HRP로 검출하였다.
도 12는 FACS 분석을 통해 게잡이원숭이 EGFR 교차반응성을 측정한 결과를 나타낸다. CHO-K1 세포에 인간 EGFR 또는 게잡이원숭이 EGFR 컨스트럭트를 형질도입하였다. 항체가 형질주입된 세포 및 CHO-K1 세포에 5㎍/ml로 결합할 수 있도록 하였다. 세툭시맙을 양성 대조군으로, PG2708을 음성 대조군 항체(Neg ctrl Ab)로 이용하였다. 결합한 항체는 PE 접합 항체로 검출하였다.
도 13은 ELISA로 마우스 EGFR 및 cMET 교차반응성을 측정한 결과이다. 상부 패널; 고정된 농도의 항체(5㎍/ml)를 일련의 역가로 마우스 EGFR and 인간 EGFR가 코팅된 미세역가 플레이트에서 시험하였다. 항-EGFR 항체 및 PG2708(neg Ctrl Ab)가 결합하도록 하고 HRP 접합 항체로 검출하였다. 하부 패널; 순차적 역가의 항체를 코팅된 인간 및 마우스 cMET에 결합하도록 하였다. 인간/마우스 교차반응성을 가지는 BAF527 항체를 양성 대조군에 포함시키고 PG2708를 음성 대조군 항체(Neg Ctrl Ab)로 추가하였다. 결합한 항체는 스트렙타비딘 HRP로 검출하였다.
도 14는 리간드 의존성 N87 증식의 억제를 보여주는 그림이다. 일련의 역가의 항체를 N87 세포와 함께 HGF(도 14a), EGF(도 14b) 또는 EGF/HGF(도 14c)의 존재 하에 배양하였다. 세포 증식을 알라마 블루(Alamar Blue)로 측정하였다. 등몰(equimolar) 농도의 Fab 5D5/세툭시맙이 양성 대조군 항체로 사용되었다. Y축은 세포 증식의 표지자인 형광 강도를 나타내고, X축은 시험된 항체 농도를 나타낸다.
도 15는 고친화도 FcγRⅢa ADCC 수용체 어세이를 이용하여 N87 세포(도 15a) 및 MKN-45 세포(도 15b)에서의 cMET x EGFR 이중특이적 항체의 ADCC 활성을 측정한 결과를 보여주는 그림이다. X축은 첨가된 항체 농도를 나타낸다. Y축 ADCC 활성을 반영하는 발광(RLU)이다. 항-EGFR 항체인 세툭시맙이 양성 대조군 항체로 사용되었다.
도 16은 PC-9(도 16a) 및 HCC827(도 16b) 세포에서 TKI인 에를로티닙과 제피티닙의 효능에 HGF가 미치는 영향을 보여주는 그림이다. 세포를 300 nM 에를로티닙 또는 제피티닙과 함께 HGF 농도를 증가시키면서(0에서 120 ng/mL) 배양한 뒤 세포 증식을 측정하였다. 양 세포주 모두에서 HGF가 용량 의존적으로 TKI에 대한 저항성을 유도하였다.
도 17은 ADCC-강화된 c-MET x EGFR 변이체에서늬 결합 친화도 조사 결과를 보여주는 그림이다. EGFR를 안정적으로 발현하는 CHO-Kl 세포(도 17a) 또는 c-MET을 내재적으로 발현하는 MKN-45 세포(도 17b)를 항체 농도를 증가시키면서 2x105 세포/웰로 배양하였다. 세척 후, 항-인간 lgG-PE (3μg/ml)를 이용하여 결합을 검출하였다. 염색된 세포를 iQue 시스템으로 분석하고 평균 형광강도(MFI)를 계산하였다. 대조군 항체는 MF1337 x MF1337; TT x TT 음성 대조군; 바닥의 어두운 삼각형) 및 MF4356 x MF3770 (PB8532p04; c-MET에 대한 c-MET x EGFR 양성 대조군; 검은 삼각형). TT는 파상풍 독소를 가리킨다. ADCC는 RMD 효소를 인코딩하는 DNA의 공-형질주입을 통해 IgG1의 Fc 영역의 푸코오스를 제거함으로써 ADCC 기능이 강화된 항체를 의미한다.
도 18은 강화된 ADCC 작동 기능을 확인하기 위한 ADCC 리포터 어세이 결과를 보여주는 그림이다. EGFR-발현 BxPC-3 세포(좌측) 또는 c-MET-발현 MKN-45 세포(우측)를 ADCC 작동(effector) 세포와 15:1의 E:T 비율로 혼합하고 시험 항체의 역가(0.01-10 μg/ml) 존재 하에 배양하였다. 6시간 뒤 Bio-Glo 시약을 첨가하고 마이크로플레이트 리더를 이용하여 발광을 측정하였다. 발광 정도가 높을수록, 시험 항체에 의해 유도된 타겟과 작동 세포 간의 상호작용 정도가 높다. 상부 패널은 고친화도 어세이 결과를, 하부 패널은 저친화도 어세이 결과를 보여준다. 음성 대조군 항체는 PG1337p218(항-TT, 바닥의 밝은 삼각형)이고; 다른 대조군 항체는 3178 x 4280(HER3 x EGFR, ADCC-강화됨, 닫힌 밝은 원(좌상단 패널); 3178 x 4280 (HER3 x EGFR, ADCC-강화 없음, 검은 십자가, 바닥); 4356 x 3370 (c-MET x EGFR, ADCC-강화됨, 열린 밝은 원); 3370 x 4356 (EGFR x c-MET, ADCC-강화 없음, 검은 십자가 및 점선); 및 세툭시맙 (항-EGFR, 작은 검은 원)이다.
도 19는 에를로티닙이 투약이 지속되는 동안 HCC827 세포가 이식된 NGS-hHGFki 마우스에서의 항-종양 반응을 유도함을 보여주는 그림이다. 검은 화살표는 처리 개시시점을 나타낸다.
도 20은 PB8532 단독 혹은 에를로티닙과의 병용 사용이 HCC827 세포가 이식된 NGS-hHGFki 마우스에서의 항-종양 반응을 유도함을 보여주는 그림이다. 검은 화살표는 처리 개시시점을; X축의 회색 화살표는 매주 처리 시점을 각각 나타낸다.
도 21은 PB8532 단독 및 에를로티닙과 병용 사용하여 유도된 항-종양 반응이 투약이 중단된 후에도 에를로티닙에 의한 것보다 우수함을 보여주는 그림이다. 검은 화살표는 처리 개시시점을; X축의 회색 화살표는 매주 처리 시점을 각각 나타낸다.
도 22는 PB8532 단독 및 에를로티닙과 병용 사용하여 유도된 항-종양 반응이 에를로티닙에 의한 것보다 우수함을 보여주는 그림이다. 검은 화살표는 처리 개시 시점을; X축의 회색 화살표는 매주 처리 시점을 각각 나타낸다. cMET 항체인 LY2875358를 단독으로 또는 에를로티닙과 병용하여 사용할 경우 에를로티닙 없이 PB8532만을 사용하는 경우보다 효과가 낮았다.
도 23은 cMET x EGFR 이중특이적 항체인 PB19478에 의해 유도된 항-종양 반응이 에를로티닙에 대한 저항성을 가지는 종양에서도 효과적임을 보여주는 그림이다. 검은 화살표는 에를로티닙 처리 개시 및 PB19478 처리 개시를 나타낸다.
실시예
본 명세서에서 사용된“MFXXXX”(X는 독립적으로 숫자 0-9)는 VH가 4자리 숫자로 식별되는 아미노산 서열을 가지는 가변 도메인을 포함하는 Fab를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한 가변 도메인의 경쇄 가변부위는 전형적으로 도 1a, 전형적으로 도 1b의 서열을 가진다. “MFXXXX VH” 는 4자리숫자로 식별되는 VH 의 아미노산 서열을 지칭한다. MF는 경쇄의 불변영역 및 이와 정상적으로 상호 작용하는 중쇄의 불변영역을 포함한다. PG는 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단일특이적 항체를 지칭한다. PB는 2개의 상이한 중쇄가 있는 이중특이적 항체를 지칭한다. 중쇄의 가변부위는 서로 다르고, 전형적으로 CH3 영역이며, 여기서 중쇄 중 하나는 CH3 도메인의 KK 돌연변이를 갖고, 다른 하나는 CH3 도메인의 보완적 DE 돌연변이를 갖는다. (PCT/NL2013/050294 참조(공개번호 WO2013/157954)).
실시예 1 : 재료 및 방법
세포주:
EBC-1 [JCRB0820], PC-9 [RCB0446], H358 [ATCC® CRL-5807™], HCC827 [ATCC®CRL-2868™],MKN-45 [DSMZ ACC 409] N87 [ATCC®CRL-5822™] 및 A431 [ATCC® CRL-1555™]세포주를 구입하였고, 10% 열로 불활성화된 우태아혈청(FBS)이 보충된 성장배지에서 관례대로 유지시켰다. HEK293F Freestyle 세포는 Invitrogen에서 구입하였고 293 FreeStyle 배지에서 관례대로 유지되었다.
cDNA 컨스트럭트:
안정한 세포주(cMET 및 EGFR)생성 및 면역화(cMET)를 위한 cMET 및 EGFR 발현 벡터들의 생성
클로닝을 위한 고유의 제한부위와 효율적인 번역을 위한 코작 보존적 서열을 포함하는 각 표적의 전장 cDNA를 합성하거나, 또는 표적 cDNA를 포함하며, 복제를 위한 고유의 제한부위와 효율적인 번역을 위해 도입된 특정 프라이머와 코작 보존적 서열을 포함한 상업적으로 이용 가능한 발현 컨스트럭트에서 PCR 증폭을 통하여 획득되었다. 각 표적의 전장 cDNA는 pcDNA3.1 와 같은 진핵 발현 컨스트럭트로 복제되었고, 한편 세포외 도메인은 pVAX1 및 pDisplay로 복제되었다. 삽입 서열은 참조 아미노산 서열과 비교하여 검증되었다.
세포 표면 발현을 위해 삽입될 전장 인간 EGFR 아미노산 서열 (GenBank: NP_00533와 동일함):
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA
이 중:
- MRPSGTAGAALLALLAALCPASR: 신호 펩타이드.
-ALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS: 인간 EGFR의 ECD.
- IATGMVGALLLLLVVALGIGLFM: 예측되는 TM 영역.
-RRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA: 세포 내 테일.
2-7번 엑손의 인-프레임 삭제에 의해 야기되는 자연 발생 EGFR 변이체 VAR_066493[Ji H., Zhao X; PNAS 103:7817-7822(2006)]인 인간 EGFRvarⅢ의 세포외 도메인의 아미노산 서열. _는 30-297번 아미노산이 결실된 위치를 나타낸다.
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKK_GNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS
이 중 :
- MRPSGTAGAALLALLAALCPASR:신호 펩타이드.
-ALEEKK_GNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS: EGFRvarⅢ 의 ECD
세포 표면 발현을 위한 인간 EGFR 막관통 및 세포내 도메인과 키메라 마카크 (Macaca mulatta) 세포외 EGFR 도메인의 하이브리드의 아미노산 서열(GenBank: XP_014988922.1과 동일함). 인간 EGFR 서열은 밑줄로 표시하였다.
MGPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSEFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDTLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSSQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCQNVSRGRECVDKCNILEGEPREFVENSECIQCHPECLPQVMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCARNGPKIPSIATGMLGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA
이 중:
- MGPSGTAGAALLALLAALCPASR: 신호 펩타이드.
-LEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS: cyEGFR의 ECD
세포 표면에서 발현을 위한 전장 인간 cMET 삽입 아미노산 서열(GenBank: P08581-2와 동일함). 서열은 755-755 위치에 삽입이 일어나 참조 서열과 상이하다: S → STWWKEPLNIVSFLFCFAS
MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNGECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISTWWKEPLNIVSFLFCFASGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFTGLIAGVVSISTALLLLLGFFLWLKKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYLASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS
이 중 :
- MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNG: 신호 펩타이드
-ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFT: 인간 cMET의 ECD
- GLIAGVVSISTALLLLLGFFLWL: 막관통 영역
-KKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS: 세포내 영역
참조 항체
항-cMET 항체는 당업계에 알려져있다(표 1). 단일특이적 이가 cMET 항체는 공개된 정보에 따라 구성되었으며 293F Freestyle 세포에서 발현되었다. 표 1은 관련 공개정보를 보여준다. cMET에 대한 단일특이적 이가 항체는 공개된 정보에 따라 구성되었으며 293F Freestyle 세포에서 발현되었다. HGF 리간드 차단 분석을 위해 특허-유래 항-cMET 항체의 VH- 및 VL-인코딩 유전자 분절을 필라멘트형 박테리오파지에서 디스플레이하기 위해 파지 디스플레이 벡터에서 재-클로닝하였다.
참조 항체인 세툭시맙(Erbitux)은 EGFR Fab 패널에 대한 참조 항체로 사용되었다.
2994 Fab 단백질은 파파인 분해에 의해 정제된 PG2994 IgG 로부터 생성되었다. 따라서 PG2994를 비드에 커플링된 파파인과 배양하고(Pierce #44985), 37℃에서 5.5시간동안 회전시키면서 분해시켰다. MabSelectSure LX를 통한 여과에 의해 분해 혼합물로부터 Fab 단백질을 포함하는 분절들을 정제하였다. Fab 단백질을 함유하는 분획을 통한 흐름은, 비바스핀20 10kDa을 사용하여 3ml로 농축되었고, 추가로 PBS중 수퍼데스75 16/600을 사용하여 겔여과에 의해 정제하였다.
실시예 2
이가 단클론 항체의 생성과 항체 특성분석
VH 유전자 서열 및 그의 일부 서열 변이체를 기반으로 고유 항체의 VH 유전자를 판단하고, 이를 골격 IgG1 벡터에 클로닝하였다. 현탁액에 적응된 293F Freestyle 세포를 3.0 x 106세포/ml 밀도가 될 때까지 진탕기를 사용하여 T125 플라스크에서 배양하였다. 세포는 24-딥 웰 플레이트의 각웰에 0.3-0.5 x 106 생존 세포/ml의 밀도로 씨딩하였다. 세포는 개개의 멸균 DNA:PEl 혼합물로 일시적으로 형질주입되었고, 추가로 배양되었다. 형질주입 7일 후, 상등액을 수거하여 0.22μM(Sartorius)로 여과하고 배치(batch) 정제를 통해 단백질 A 비드에서 정제된 후 완충액을 PBS로 교환하였다.
EGF 매개 아폽토시스의 억제
EGF의 높은 농도(10nM)는 A431 세포의 사멸을 유도한다 [Gulli et al., 1996)]. 이 효과는 세툭시맙과 같은 리간드-차단 항-EGFR 항체의 첨가에 의해 용량- 의존적으로 되돌릴 수 있다.
이가 항-EGFR IgG이 A431 세포의 EGF-유도 세포 사멸을 억제하는 효능을 시험하기 위해, 10 nM EGF의 존재 하에 항체를 연속 적정하면서- 10μg/ml부터- 배양하였다. 각 분석 플레이트에는 참조 대조군으로 작용하는 음성(Ctrl Ab; PG2708) 및 양성 대조군 항체(세툭시맙)의 일련의 희석물이 포함되었다. 3일 째에, 알라마 블루(Invitrogen, # DAL1100)를 첨가하고(웰당 20㎕), 37℃에서 6시간 배양 후 Biotek Synergy 2 멀티-모드 마이크로 플레이트 리더에서 560nm 여기(excitation)와 590nm 판독값을 사용하여 형광을 측정하였다. 도 2는 세툭시맙과 대조군 항체의 활성과 비교한 cLC EGFR 항체 의 활성을 보여준다. 항체 PG4280, 3755 및 3752는 세툭시맙보다 더 강력했지만, 항체 PG4281와 PG3370는 효능이 더 낮았다.
EGF 차단(blocking) ELISA
과량(molar excess)의 리간드(EGF)의 부재 및 존재 하에 EGFR 특이적 파지와 재조합 EGFR의 결합 여부를 시험하였다. 이에 고트 항-인간 IgG 5μg/ml를 4℃에서 MAXISORPTMELISA 플레이트에 밤새 코팅하였다. ELISA 플레이트의 웰들은 진탕(700rpm)하는 동안 상온에서 1시간 동안 2% ELK를 함유하는 PBS(pH 7.2)로 블로킹하였다. 다음으로, 5μg/ml 재조합 인간 EGFR-Fc를 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 한편, IgG와 바이오틴화된 인간 EGF를 연속적정으로 상온에서 1시간동안 혼합하였다. 결합되지 않은 인간 EGFR-Fc를 세척한 후, 항체/EGF 혼합물이 첨가하고 상온에서 1시간 동안 결합시켰다. 결합된 EGF는 상온에서 1시간 동안 HRP-스트렙타비딘으로 검출하였다. 대조군으로서, 코팅된 항원(도시되지 않음) 및 음성 대조군 파지(Neg Ctrl Ab)에 특이적 항체들에 대해 절차가 동시에 수행되었다. 결합된 이차 항체는 TMB/H2O2 염색에 의해 시각화하고, 염색은 OD450nm 측정으로 정량화하였다. 도 11은 EGF 매개 세포사멸에서는 덜 강력한 PG3370 항체가 세툭시맙과 비교하여 유사한 EGF 차단 활성을 나타냄을 보여준다.
게잡이원숭이 EGFR과 마우스 EGFR 교차 반응성 시험
항-EGFR IgG가 게잡이원숭이 EGFR과 반응하는지 여부를 시험하기 위해, 세포 내 인간 EGFR에 융합된 게잡이원숭이의 ECD를 인코딩하는 발현 컨스트럭트 뿐만 아니라, 전장 인간 EGFR을 인코딩하는 컨스트럭트 모두 (항원 음성) CHO 세포에 형질주입하고, 5μg/ml의 항-EGFR 항체로 세포를 염색한 뒤 FACS로 분석하였다. 염색을 위한 양성 대조군으로, 임상적으로 사용되는 항체 세툭시맙이 사용되었는데, 이는 이 항체가 게잡이원숭이 EGFR과 교차반응하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 인간 EGFR을 발현하는 세포 염색이 사실상 키메라 수용체를 발현하는 세포 염색 결과와 구분되지 않음으로써, PG3370, PG3752, PG4280 및 PG4281는 게잡이원숭이 EGFR과 반응하는 것으로 나타났다 (도 12).
항-EGFR IgG가 뮤린 EGFR과 교차반응성을 가지는지를 시험하기 위해 ELISA를 수행하였다. 5μg/ml에서 0.038μg/ml까지 희석된 재조합 마우스 EGFR ECD-Fc의 일련의 역가를 4℃에서 MAXISORPTMELISA 플레이트에 밤새 코팅하였다. 항-EGFR IgG의 결합을 5μg/ml 고정된 농도에서 시험하고, 상온에서 1시간동안 결합시켰다. 항체의 면역 반응성에 대한 양성 대조군으로서, 항원(R&D systems)으로 인간 EGFR ECD-Fc 융합단백질을 사용하여 동일한 ELISA를 수행하였다. 다음으로, 고트 항-마우스 IgG HRP 접합체(BD Biosciences)를 상온에서 2시간동안 결합시켰다. 결합된 IgG는 OD450nm 측정에 의해 검출되었다. 항체 PG3370은 유사한 친화도로 인간 EGFR와 뮤린 EGFR을 인식하는 것으로 나타났다(도 13 상부 패널). 세툭시맙은 마우스 EGFR을 인식하지 못한다(125084 Erbitux Pharmacology Review Part 2 - FDA). 이에, PG3370과 세툭시맙은 인간 EGFR에서 동일한 에피토프를 인식하지 못한다.
마우스 cMET 교차 반응성 시험
PG3342의 뮤린 cMET에 대한 교차반응성을 시험하기 위해 ELISA를 수행하였다. 고정된 농도의 마우스 HGF R/c-MET Fc(R&D systems) HGF R/c-MET Fc를 PBS에서 2.5μg/ml로 희석하고 4℃에서 MAXISORPTM ELISA 플레이트에 밤새 코팅하였다. 이 항원에 대한 항-cMET IgG 의 결합을 반-로그 적정으로 10 ㎍/ml로 시작하여 시험하였다. 항체를 상온에서 1시간동안 결합시켰다. 항체의 면역-반응성에 대한 양성 대조군으로서, 항원(R&D systems)으로 인간 HGF R/c-MET Fc 융합단백질을 사용하여 동일한 ELISA를 수행하였다. 다음으로, 고트 항-마우스 IgG HRP 접합체(BD Biosciences)를 첨가하고, 상온에서 2시간동안 결합시켰다. 결합된 IgG는 OD450nm 측정으로 검출하였다. 바이오틴에 커플링된 마우스 cMET에 대한 항체인 항원 친화도-정제된 다클론 고트 IgG인 BAF527를 양성 대조군 항체로 사용하였다. PG3342 항체에서는 뮤린 cMET에 대한 교차 반응성이 관찰되지 않았다(도 13 하부 패널).
교차 차단 어세이 cMET 항체
cMET 특이적 파지들이 cMET 참조 항체와 경쟁하는지를 ELISA를 통해 조사하였다. 이에 2.5μg/ml의 cMET-Fc 융합단백질을 4℃에서 MAXISORPTM ELISA 플레이트에 밤새 코팅하였다. ELISA 플레이트의 웰을 진탕(700rpm)하면서 상온에서 1시간 동안 2% ELK를 함유하는 PBS(pH 7.2)로 블로킹하였다. 다음으로, 참조 또는 음성 대조군 IgG를 5 μg/ml의 농도로 첨가하고 700rpm에서 상온에서 15분 동안 결합시켰다. 다음으로, 5μl의 PEG 침전된 파지를 첨가하고 700rpm에서 상온에서 1시간동안 결합시켰다. 결합된 파지는 700rpm에서 상온에서 1시간동안 HRP로 표지된 항-M13 항체로 검출하였다. 대조군의 실험 과정은 코팅된 항원에 특이적 항체 및 음성 대조군 파지와 동시에 수행되었다. 결합된 이차 항체는 TMB/H2O2 염색으로 가시화하고 염색은 OD450nm 측정으로 정량화하였다. 표 2는 MF4040 및 MF4356가 5D5 참조 항체와 경쟁함을 보여준다. MF4297는 13.3.2 및 C8H241과는 경쟁의 정도가 덜하였다. 양성 대조군 파지들은 상응하는 IgG와 모두 완전한 경쟁을 하는 반면, 어떠한 대조군 항체도 경쟁 분석에 영향을 미치지 않는다.
이중특이적 항체의 생성
효율적인 헤테로다이머화와 이중특이적 항체의 형성을 보장하기 위해 보유중인 CH3 공학기술을 사용하여 상이한 VH 도메인을 가진 IgG를 인코딩하는 2개의 플라스미드의 일시적 공-형질주입으로 이중특이적 항체를 생성하였다. 공통 경쇄는 동일한 플라스미드 혹은 다른 플라스미드를 통해 같은 세포내에서 공-형질주입된다. 본 발명자들의 출원(예를들어, WO2013/157954 및 WO2013/157953; 본 명세서에 참조로서 삽입됨)에서 본 발명자들은 단일 세포로부터 이중특이적 항체를 생산하는 방법과 수단을 개시하였으며, 이에 의해 단일특이적 항체의 형성보다 이중특이적 항체가 더 잘 형성되도록 하는 수단을 제공하였다. 이들 방법 역시 본 발명에서 유익하게 이용될 수 있다. 구체적으로, 이중특이적 전장 IgG 분자 만을 생산하기위해 선호되는 돌연변이는 351번과 366번 위치에서의 아미노산 치환, 예를 들어 제1 CH3 도메인에서 L351K과 T366K(EU 번호)('KK-변이체' 중쇄)와; 351번과 368 번 위치에서 아미노산 치환, 예를 들어 제2 CH3 도메인에서 에서 L351D 및 10L368E ('DE-변이체' 중쇄) 등이다. 본 발명자들의 종래 출원에서 음으로 하전된 DE-변이체 중쇄와 양으로 하전된 KK-변이체 중쇄가 헤테로다이머(소위‘DEKK’이중특이적 분자)를 형성하기 위해 우선적으로 짝을 이룸을 입증하였다. DE-변이체 중쇄(DE-DE 호모다이머) 또는 KK-변이체 중쇄(KK-KK 호모다이머)의 호모다이머화는 동일한 중쇄 사이의 CH3-CH3 경계면에서 하전된 잔기들사이의 강한 반발로 인해 잘 일어나지 않는다.
cMET 및 EGFR Fab 암을 적절한 KK 및 DE 벡터에서 클로닝하였다(표 3). 생산 후, 이중특이적 IgG를 단백질-A 배치 정제로 정제하고 완충액을 PBS로 교환하였다. 성공적인 생산으로 최소농도 0.1 mg/ml의 IgG1 전장 항체가 생성되었으며, 고유코드(PBnnnnn; 여기서 nnnnn은 무작위로 생성된 수를 나타낸다)를 지정하여 2개의 서로 다른 표적결합 Fab 분절들의 특이적 조합을 식별하였다. 성공적으로 생산된 이중특이적 IgG가 각각의 표적에 결합하는지 여부를 ELISA로 시험하였다.
실시예 3
EGF/HGF 및 HGF 및 EGF 증식 분석에서 c-MET x EGFR 이중특이적 항체의 스크리닝
HGF/EGF, HGF 및 EGF 분석을 통해 cMET x EGFR 이중특이적 항체의 패널의 효능을 N87 세포에서 시험되었다. 공식명칭 NCI-N87인 N87 세포주는 전이 부위에서 유래된 위암 세포주이고, 높은 EGFR 발현 수준과 중간 cMET 발현수준을 가지고 있다(Zhang et al, 2010). 항체는 10 ㎍/ml부터 3.16 ng/ml 범위까지 8단계 반-로그 적정으로 시험되었다. 각 항체는 두 번 시험되었다. 항-RSV-G 항체 PG2708는 음성 대조군으로 사용되었다. 참조 항체 2994 Fab는 HGF 분석에서 양성 대조군으로 사용되었으며, 참조 항체 세툭시맙은 EGF 분석에서 양성 대조군으로 사용되었다.
등몰의(equimolar) 1:1 세툭시맙/5D5 Fab은 EGF, HGF 및 EGF/HGF 분석에서 양성 대조군으로 사용되었다.
배지 대조군 뿐 아니라 하나 또는 조합된 리간드가 포함될 웰을 이용하여 어세이를 수행하였다. 화학적으로 정의된 기아(starvation) 배지(CDS: RPMI1640 배지, ml 당 80U 페니실린 및 80μg 스트렙토마이신, 0.05% (w/v) BSA 및 10μg/ml 홀로-트랜스페린 포함)에 항체를 희석하고, 50μl의 희석된 항체를 96 웰 바닥 플레이트(Costar)에 첨가하였다. 리간드(400ng/ml HGF 및 4ng/ml EGF를 포함하는 저장액을 웰 당 50μl, a EGF/HGF 농도의 4 ng/ml, EGF/400 ng/ml 및 CDS에 희석된 HGF: R&D systems, cat. nr. 396-HB 및 236-EG)를 첨가하였다. N87 세포를 트립신화하고, 수집하여 계수한 다음 100μl CDS에 넣은 8000개 세포를 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 주변 효과를 피하기 위해, 컨테이너 내의 37℃ 세포 배양 인큐베이터에 3일간 넣기 전에 플레이트를 한시간 동안 상온에 놓아두었다. 4일 째에, 알라마 블루(Invitrogen, # DAL1100)를 첨가하고(웰당 20μl) 6시간 동안 37℃로 배양한 뒤 형광을 측정하였다 Biotek Synergy 2 멀티-모드 마이크로 플레이트 리더에서 560nm 여기(excitation)와 590nm 판독값을 사용하여 형광을 측정하였다. 형광 값은 억제되지 않은 성장(항체 없이 두 리간드를 첨가)에 대해 정규화하였다. HGF, EGF 및 EGF/HGF 증식 어세이의 예는 도 14에 나타내었다(각각 도 14a, 14b 및 14c).
표 4에 다양한 실험 결과를 나열하였다. N87 HGF/EGF 어세이에서, 단일특이적 참조 항체(세툭시맙 및 5D5 Fab의 등몰(equimolar) 혼합물)와 유사한 효능을 보이는 14개의 상이한 cMET x EGFR 이중특이적 항체를 동정하였다: PB7679, PB7686, PB8218, PB8244, PB8292, PB8316, PB8340, PB8364, PB8388, PB8511, PB8535, PB8583, PB8607 및 PB8640.
N87 EGF 어세이에서, 단일특이적 항체인 세툭시맙과 유사한 효능을 보이는 11개의 상이한 cMET x EGFR 이중특이적 항체를 동정하였다: PB7679, PB8244, PB8292, PB8340, PB8364, PB8388, PB8511, PB8535, PB8583, PB8607 및 PB8640. 이들은 모두 EGFR Fab 암인 MF3755를 포함한다. HGF N87 어세이에서 단일특이적 5D5 Fab 참조 항체보다 우수한 활성을 보이는 11개의 이중특이적 항체를 동정하였다: PB8218, PB8388, PB8511, PB8532, PB8535, PB8545, PB8583, PB8639 및 PB8640. 이들은 MF4040, MF4297, MF4301, MF4356, MF4491 및 MF4506의 6개 상이한 cMET Fab 암을 포함하였다.
ADCC 활성
종양 세포주 N87(EGFR-high, cMET-low) 및 MKN-45(EGFR-low, cMET-amplified)에 대한 24개 cMet x EGFR 이중특이적 항체의 ADCC 활성을 측정하였다. ADCC 어세이는 384-웰 플레이트 포맷에서 Promega ADCC 바이오어세이 킷을 이용하여 수행하였다. 항체는 10 ㎍/ml에서 1 ng/ml 범위의 반-로그 연속 희석된 9가지 상이한 농도에서 2번씩 시험되었다.
세툭시맙 참조 항체를 양성 대조군으로 이용하여 PG2708를 음성 대조군 항체로 이용하였다. 항체 또는 어세이 배지 대조군(IgG 무첨가)을 6시간 동안 37℃에서 ADCC 작동 세포 및 표적 세포(N87 또는 MKN-45)와 함께 배양하였다. 루시퍼라제 시약을 이용하여 루시퍼라제 활성을 정량하였다.
ADCC 어세이 결과는 도 15에 나타내었다. cMET x EGFR 이중특이적 항체 중 양 세포주에서 유의한 ADCC 활성을 나타내는 것은 없었다. 양성 대조군 참조 세툭시맙 항체는 양 세포 모두에 용량 의존적 ADCC 활성을 보였다.
N87 HGF/EGF 어세이에서 높은 효능을 보이고 서열 다양성이 높은(표 5) EGFR 및 cMet 암으로 구성된 5개의 이중특이적 항체를 이용하여 추가 분석을 수행하였다. 이들 5개 이중특이적 항체 중 2개는 cMET과의 결합에서 5D5와 경쟁하는 MF4356를 포함하였다(표 2). 선정된 후보들의 특성은 표 5에 요약하였다.
상처 치유 세포 이동 분석
EBC-1 및 H358의 두 개 NSCLC 세포주로 상처 치유 분석을 수행하였다. 이들 세포주는 EGFR 및 c-Met를 고발현하기 때문에 선정되었다(Zhang et al, 2010; Fong et al., 2013). 어세이는 CytoSelectTM 24-웰 플레이트 상처 치유 분석(Cell Biolabs, CBA-120)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 요약하면, 2.5 - 4 x 105 암세포를 각 웰에 씨딩하고 밤새 37℃에서 배양하여 단일층을 형성하였다. 이후 웰 삽입물을 제거하여 0.9mm의 상처 부위를 형성하였다. PBS로 세척하여 상처 부위의 죽은 세포 및 잔해를 제거한 뒤, 세포를 15분간 37℃에서 이중특이적 항체(100nM) 또는 세툭시맙:Fab2994 대조군 항체 혼합물(100nM, 몰비 1:1)과 함께 완전 배지(0.5% FBS)에서 배양하였다. 각 웰에 HGF(15ng/ml), EGF(12.5 ng/ml) 또는 이들이 조합(15 및 12.5 ng/ml)된 성장인자를 보충하였다. 공초점 현미경(Zeiss LSM780)으로 시간 경과에 따른 상처 봉합 모니터링을 37℃에서 14시간 동안 수행하였다. 비처리 대조군과 비교한 상처 봉합 정도(%)를 표시하였다.
H358 세포는 HGF 또는 EGF 단독성분에 노출되자마자 이동(상처 봉합 비율)이 증가하였으며, HGF 및 EGF의 조합을 사용한 경우 가장 효율적이었다(도 3). 이러한 이동의 증가는 이중특이적 항체를 투여하자 사라졌으며, 이는 PB8532에서 가장 두드러졌다. 이러한 억제는 EGF/HGF에 의한 이동 억제를 제외하고는 세툭시맙 및 5D5 Fab의 조합에 의한 효과와 유사하였다.
EBC-1 세포는 HGF를 투여하자 경미하게 이동이 증가하였고 EGF 또는 EGF/HGF 조합을 사용할 시 이동 증가가 없었다. 그러나, 상처 봉합은 모든 분석 조건에서 이중특이적 항체, 특히 PB8532에 의해 억제되었다. PB8532는 세툭시맙/5D5 Fab의 조합만큼 혹은 그보다 더(EGF/HGF) 효과적이었다.
유세포 분석을 이용한 PC-9 및 HCC827 세포에서의 EGFR 및 cMET 발현 분석
에를로티닙에 대한 획득된 저항성은 HGF 매개된 c-MET의 비정상적인 활성화 때문일 수 있다. cMET xEGFR 이중특이적 항체가 티로신 키나아제 억제제(TKI) 저항성을 가지는 세포에서 리간드 매개 증식을 억제하는 능력이 있는지를 조사하기 위해 NSCLC 세포주인 PC-9 및 HCC827를 선정하였다. 두 세포주 모두 EGFR 돌연변이를 가지지 않고, HGF 존재 하에 에를로티닙, 제피티닙 또는 이들의 조합(PC-9 만)에 대해 저항성을 가진다. PC-9 세포에서, HGF-유도 에를로티닙 저항성은 cMET 억제제에 의해 제거될 수 있으며(Nakade et al., 2014) 제피티닙 저항성 항-HGF 항체에 의해 제거될 수 있는 것으로 보고되었다(Yano, 2008). PC-9 및 HCC827의 cMET 및 EGFR 발현 특성을 형광 표지된 항체를 이용한 FACS로 분석하였다. 세포를 PBS 2mM EDTA와 함께 배양하였다. 단일 세포 현탄액(50μl 내 10e6 세포)을 염색 완충액(PBS 2% FBS 2mM EDTA)에서 형광 표지된 항체와 얼음 상에서 20분 동안 배양하였다. 다음의 항체를 단독으로 또는 조합하여 사용하였다: Met Alexa Fluor 488 접합 항체(Clone D1C2, Cell Signaling, 1:50 희석); EGF Receptor Alexa Fluor 647 접합 항체(Clone D38B1, Cell Signaling, 1:50 희석). 배양 후, 세포를 염색 완충액으로 세척하고 BD FACSVerse 유세포 분석기에서 FACS 분석을 수행하였다.
모든 HCC827 세포는 EGFR를 발현하였으며 EGFRhigh, cMETpos 집단과 EGFRpos, cMETneg 집단으로 나뉘었다(도 4). PC-9 세포에는 EGFRhigh 및 cMETpos 세포의 소집단과 EGFRpos 및 cMETneg 세포의 동물 집단이 포함되었다.
PC-9 및 HCC827 증식 어세이
초기 실험은 PC-9 및 HCC827 세포에서 에를로티닙 및 제피티닙 저항성을 발생시키는 HGF 농도를 결정하기 위하여 수행되었다. 0.5% FBS가 포함된 기근 배지에서 밤새 배양 후, 세포를 10% FBS에 300 nM 에를로티닙 또는 제피티닙을 보충하고 0에서 120 ng/mL까지 HGF 농도를 증가시키면서 배양하였다. 72시간 동안 배양 후, WST-1 시약을 이용하여 제조자의 지시에 따라 세포 증식을 측정하였다. 마이크로플레이트 리더로 시험 및 참조 파장을 각각 450 및 630nm로 하여 흡광도를 측정하였다. PC-9(도 16A) 및 HCC287(도 16b) 모두에서 HGF의 첨가는 용량 의존적으로 TKI에 대한 저항성을 유도하였다.
TKI 저항성 부여에 있어서의 PB8532 및 PB8388의 효능을 시험하였다. 4 x 103개 암세포를 100mL 완전 RPMI 1640(10% FBS)에서 96-웰플레이트에 씨딩하였다. 밤새 0.5% FBS를 포함하는 기근 배지에서 배양 후 세포를 Biclonics®(100nM) 또는 세툭시맙:Fab2994 대조군 단일특이적 항체 혼합물 (100nM, 몰비 1:1)과 함께 15분 동안 37℃에서 전-배양하였다. 이후 각 웰에 제피티닙 또는 에를로티닙 (300nM)을 포함하고, HGF(30ng/ml), EGF (30ng/ml) 또는 이 둘의 조합(30 ng/ml)을 포함하거나 포함하지 않는 완전 배지(10% FBS)를 보충하였다. 배양 72시간 뒤에, WST 방법을 이용하여 세포 증식을 측정하였다.
도 5는 PC-9 세포에서 PB8532가 HGF 및 EGF 매개된 제피티닙 저항성을 억제할 수 있음을 보여준다. HCC827 세포에서 PB8532는 HGF 매개 TKI 저항성을 억제하였으며, 두 개의 단일특이적 항체인 세툭시맙과 5D5 Fab 조합의 경우보다 높은 효능을 보였다. TKI인 에를로티닙에 대해서도 유사한 효과를 얻었다.
실시예 4 : PB8532에 의한 EGF 및 cMET 인산화의 억제
FBS가 없는 기근 배지에서 밤새 배양한 뒤, 세포를 PB8532(100nM) 또는 세툭시맙:Fab2994 대조군 단일특이적 항체 혼합물(100nM, 몰비 1:1)을 함유하는 배지(0.5% FBS)에서 15분간 37℃에서 배양하였다. 이후 세포를 HGF(30ng/ml) 또는 EGF(50 ng/ml)의 성장 인자로 15분 간 37℃에서 자극하였다. 자극 후, 세포를 1mM 오소바나데이트(Sigma-Aldrich) 존재 하에 PBS로 세척하였다. 완전 프로테아제 억제제 칵테일(Roche), PhosSTOP 포스파타아제 억제제(Roche) 및 오소바나데이트(1mM, Sigma-Aldrich)가 보충된 RIPA 라이시스 완충액(50mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% 디옥시콜산 나트륨, 0.1% SDS)을 이용하여 단백질 추출을 수행하였다. 얼음 상에서 용해물을 30분 동안 배양하고 4℃에서 15분간 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 원심분리 후, 상등액을 수집하고 비시초닌산 (BCA) 시약(Pierce)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 단백질 농도를 측정하였다. 로딩 완충액 6X (β-머캅토에탄올 0.6 M; SDS 8%; Tris-HCl 0.25 M pH 6.8; 글리세롤 40%; 브로모페놀 블루 0.2%)을 첨가하고 95℃에서 5분간 배양함으로써 단백질 시료를 변성시켰다. 전기영동 후, Trans-Blot® Turbo™ Blotting System(Bio-Rad)을 이용하여 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. TBS-Tween 0.1 % (50 mM Tris HCl ph 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween; TBS-T)에 용해된 5% 탈지건조유로 상온에서 1시간 동안 막에 대한 비-특이적 결합을 차단하였으며 이후 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음의 1차 항체가 사용되었다: TBS-T 5% BSA 내의 Phospho-Met(Tyr1234/1235, Clone D26, Cell Signaling) 1:500; TBS-T 5% BSA 내의 Met(Clone D1C2, Cell Signaling) 1:1000; TBS-T 5% 탈지건조유 내의 Phospho-EGF 수용체(Tyr1068, Clone D7A5, Cell Signaling) 1:1000; TBS-T 5% BSA 내의 EGF 수용체(Clone D38B1, Cell Signaling) 1:1000; TBS-T 5% 탈지건조유 내의 빈쿨린(단클론 항-빈쿨린, V9131, SIGMA Aldrich) 1:4000. 상기 1차 항체와 배양한 뒤 막을 TBS-T에서 15분간 세척하고 상온에서 1시간 동안 2차 항체(TBS-T 5% 탈지건조유 내에서 1:5000)와 배양하였다. 사용된 2차 항체는 다음과 같다: 고트 항-래빗 IgG-HRP (sc-2004, Santa Cruz biotechnology); 고트 항-마우스 IgG-HRP(sc-2005, Santa Cruz biotechnology). 신호는 디지털 이미지기(ImageQuant LAS 4000, GE Health Care Life Science Technologies)를 통해 강화 화학발광 시약(ECL; Invitrogen) 또는 SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific)를 이용하여 시각화하였다.
도 6은 수행된 실험들에 대한 웨스턴 블롯 분석결과를 보여준다.
PC-9 세포에서, PB8532 및 5D5/세툭시맙은 HGF 유도된 인산화를 감소시켰다. 또한 두 항체 모두 EGF의 존재 또는 부재 하에 EGF 인산화를 경미하게 감소시켰다.
HCC827 세포에서 PB8532는 HGF의 존재 또는 부재 하에 cMET의 인산화를 감소시켰다. 5D5/세툭시맙의 조합에 의한 효과는 관찰되지 않았으며, 나아가 이 세포주에서 PB8532는 5D5 및 세툭시맙 조합을 사용한 경우와 달리 EGF 유도된 EGFR 인산화를 감소시켰다.
실시예 5
도 7은 본 발명의 EGFR 결합 가변 도메인의 택일적인 중쇄 가변영역의 다양한 서열을 보여준다. 도 8은 본 발명의 cMET 결합 가변 도메인의 택일적인 중쇄 가변영역의 다양한 서열을 보여준다. 중쇄 가변영역은 많은 상이한 cMET x EGFR 이중특이적 항체를 생성하기 위해 사용되었다. 이들 항체 내에서의 상기 경쇄는 도 9b에 표시된 서열을 가진다. 이중특이적 항체는 실시예 1이 기재된 방법에 따라 제작되었다. 항체는 ADCC 강화 버전으로도 생산되었다. ADCC 강화 버전은 항체 컨스트럭트와 IgG1 Fc 영역의 푸코오스 잔기를 제거하는 환원 효소 인코딩 DNA를 공-형질주입함으로써 제작되었다.
도 17은 실시예 2의 CHO-K1 EGFR 세포(패널 A)와 내재적으로 c-MET를 발현하는 MKN-45 세포(패널 B)에서, 제작된 다양한 이중특이적 항체의 적정을 보여주는 그림이다. 항체 농도를 증가시키면서 세포를 2x105 세포/웰로 배양하였다. 세척 후, 항-인간 lgG-PE(3 μg/ml)를 이용하여 결합을 검출하였다. 염색된 세포를 iQue 시스템으로 분석하고 평균 형광 강도(MFI) 및 곡선하 면적(AUC)을 계산하였다. 대조군 항체는 MF1337 x MF1337 (PG1337p218; TT x TT 음성 대조군; 바닥의 어두운 삼각형) 및 MF4356 x MF3770 (PB8532p04; c-METxEGFR 양성 대조군; 검은색 삼각형)를 사용하였다. TT는 파상풍 독소를 의미하며, MF1337의 VH(도 1)의 가변 도메인 및 본 발명의 공통 경쇄를 포함하고, 파상풍 독소에 결함하여 CHO-K1 EGFR 세포 및 MKN-45 세포에는 결합하지 않을 것으로 예상된다. 표시(ADCC)는 항체가 IgG1의 Fc 영역에서 푸코오스 잔기를 제거하기 위해 RMD 효소를 인코딩하는 DNA와 공-형질주입함으로써 ADCC가 강화된 항체로서 생산되었음을 의미한다. PB 코딩에 이용된 이중특이적 항체 목록은 표 6에 표시하였다.
ADCC 리포터 어세이
RMD - 인코딩 DNA의 공-형질주입이 ADCC 작동 기능을 성공적으로 강화하였는지를 조사하기 위해 ADCC 리포터 어세이를 수행하였다. 모든 시료를 BxPC3 세포(EGFR 발현) 및 MKN-45 세포(c-MET 발현)을 이용하여 고친화도 및 저친화도 어세이를 통해 2회 시험하였다. 어세이를 위한 고친화도 작동 세포는 인간 FcyRⅢa의 V-변이체를 발현하고, 저친화도 작동 세포는 F-변이체를 발현한다.
요약하면, B x PC3 및 MKN-45 표적 세포를 수집하고 30 μL에서 1000 세포/웰로 플레이팅하여 37℃, 5% C02, 95% 상대습도에서 밤새 배양하였다. 다음날, 배지를 제거하고 10μL 항체 희석액을 각 웰에 첨가하였다(항체 희석 l.5 x; 9 반-로그 희석 단계와 함께 연속 적정한 결과 어세이 농도가 1ng/ml에서 10 μg/ml이 됨). 같은 날, 작동(effector) 세포를 37℃에서 해동하고 630 μL를 15ml 튜브 내의 3.6 ml 어세이 완충액에 첨가하고 뒤집으면서 혼합하였다; 이후 상기 용액 5μL(15,000 세포)를 어세이 플레이트의 웰에 첨가하였다. 15 μL Bio-Glo 시약을 어세이 웰에 첨가하기 전에 플레이트를 6시간 동안 37℃, 5% C02, 95% 상대습도에서 배양하였다. 발광은 EnVision 플레이트 리더로 측정하였다.
시험된 시료 목록은 표 6에 정리되었으며, 이들 어세이의 결과는 도 18에 나타내었다. ADCC-강화되지 않은 항-HER3 x EGFR 대조군 항체(배치 PB4522p25; WO2015/130172에서 언급하는 MF4280 x MF3178)는 4개의 어세이 모두에서 음성이었다(검의 화살표와 실선으로 표시, 도 18의 위에서 4번째). 반면, ADCC-강화된 버전의 항체(PB4522p34)는 4개의 어세이 모두에서 양성이었다(오렌지색 원). 유사하게, ADCC-강화되지 않은 항-cMET x EGFR 대조군 항체(PB8532p04)는 4개의 어세이 모두에서 음성이었고(도 18의 검은색 십자가 및 점선), PB8532p05 배치도 역시 ADCC가 강화되지 않았다(녹색 별표). 별표가 표시된 3개의 선은 모두 4개 패널 모두에서 바닥에 위치한다. 그러나, ADCC-강화된 p06 변이체(PB8532p06)는 4개 어세이에서 모두 양성이었다(오렌지색 열린 원). PB8532p06와 유사한 ADCC의 작동 또는 기능의 강화가 5개의 이중특이적 항체(PB19474 내지 PB19478)에서도 관찰되었다. 이는 RMD-인코딩 DNA의 공-형질주입이 ADCC 작동 기능을 성공적으로 강화함을 보여준다.
실시예 6
PB8532의 cMET 가변 도메인의 중쇄 가변영역(VH)은 도 8에 MF4356의 아미노산 서열을 포함한다. PB19748의 cMET 가변 도메인의 VH는 MF8230의 아미노산 서열을 포함한다(도 8). PB8532의 EGFR 가변 도메인의 VH는 도 7의 MF3370의 아미노산 서열을 포함한다. PB19748의 cMET 가변 도메인의 VH는 도 7의 MF8233의 아미노산 서열을 포함한다. PB8532 및 PB19748 내의 경쇄는 동일하며 도 9b에 표시되었다. cMET 항체인 LY2875358 항체는 Kim and Kim 2017에 기재되어 있다. 종양이식 마우스 모델에서 cMET x EGFR 이중특이적 항체인 PB8532 또는 PB19748가 단독으로 또는 수용체 티로신 키나아제 억제제인 에를로티닙과 조합하여 인 비보 종양 성장을 억제하는 능력을 시험하였다. 선정된 모델에서, HCC827 종양 세포를 면역결핍 NOD SCID 감마(NSG) 인간 간세포 성장인자 녹-인(hHGFki) 마우스로서, 내재적 마우스 HGF 대신 인간 HGF(리간드 또는 cMET)를 발현하는 마우스에 이식하였다. NSG-hHGFki 마우스는 NOD.Cg-Hgftm1.1(HGF)AveoPrkdcscidIl2rgtm1Wjl/J(stk#014553) (NOD.Cg-Hgftm1.1(HGF) Aveo Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/J)의 전체 명칭으로 로 알려져 있다. 이들은 TorB 세포, 기능적 NK 세포를 가지지 않으며, 종양 이식이 더 잘되도록 하는 사이토카인 신호가 결핍되어 있다. HCC827는 EGFR 및 cMET를 발현하는 확립된 인간 비소세포폐암(NSCLC) 세포주로서 HGF 존재 하에 에를로티닙 저항성을 가지는 것으로 알려졌다.
이 모델에서 에를로티닙이 종양 성장에 미치는 효과를 조사하기 위해, 2개 그룹의 마우스로 1차 실험을 진행하였다. 종양 세포 이식에 앞서, 20% 우태아혈청(FBS)이 보충된 배지에서 컨플루언시가 80%를 넘지 않도록 세포를 밤새 배양함으로써 HCC827 세포의 세포 주기를 부스팅하였다. 다음날, NSG-hHGFki 마우스(The Jackson Laboratory)에 17 x 10e6의 HCC827 종양 세포를 300 μl PBS 및 고농도의 기저막 기질을 포함하는 30% 마트리젤에서 피하접종하였다. 생성된 종양을 매주 2회 캘리퍼스를 이용하여 크기를 측정하고, 평균 종양 부피가 약 200 mm3에 이르렀을 때 마우스를 무작위로 두 그룹(종양 성장 및 부피에 따라 그룹 당 4-7마리)으로 나누고 투약을 시작하였다.
에를로티닙 현탄액을 0.05% 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC) 및 물에 용해된 0.2% Tween 80에서 초음파 처리하여 매주 새로 제작하였다.
19일째부터, 에를로티닙 용액을 사용하여 5마리 마우스에 매일(QD) 위관으로 6 mg/kg를 투여하였고(n=5), 4마리 마우스 그룹은 매일 200μl 비이클(0.05% HPMC 및 물에 용해된 0.1% Tween 80)를 위관투여하였다. 종양 부피는 주 2회 캘리퍼스로 측정하고, 각 그룹의 평균 종양부피(및 SEM)를 계산하였다. 종양 크기가 1500 mm3에 이르렀을 때 마우스를 안락사시켰다. 투약은 48일째 이후에 중단하였으며, 생존 마우스에서의 62일째까지의 종양 부피를 측정하였다.
2차 실험에서 PB8532 이중특이적 항체(단독 또는 에를로티닙과 조합)가 종양 성장을 억제하는 능력을 시험하기 위해, 종양을 가지는 NSG-hHGFki 마우스(상술한 방법으로 제작)에 6개중 한 가지 치료 또는 조합된 치료를 제공하였으며, 항체는 매주 복강(i.p.) 주사되고 에를로티닙 또는 비이클은 매일(QD) 위관투여되었다. 음성 대조군으로서, 마우스에 PB8532와 동일한 항-cMET Fab 암과 무관한 타겟에 특이적인 Fab 암을 조합하여 제작한 이중특이적 항체인 PB17160를 처리하였다. 무관한 타겟은 예를 들어 마우스에 존재하지 않거나 종양이 아닌 것을 의미한다. 종종 파상풍 독소 특이적 가변 도메인이 사용된다. 적합한 파상풍 독소 결합 가변 도메인은 MF1337의 VH(도 1) 및 본 발병에서 서술한 공통 경쇄, 바람직하게는 도 9의 서열을 를 가진다. 표적화 암(arm)과 비-표적화(TT) 암을 가지는 이중특이적 항체는 WO2017/069628에 기재되어 있으며(MF1337 참조) 본 명세서에 참조로서 삽입되어 있다. 또 다른 무관한 타겟은 RSV-G이다. 적합한 RSV-G 가변 도메인은 도 1의 MF2708의 VH와 공통 경쇄, 바람직하게는 도 9, 바람직하게는 9b에 나타난 공통 경쇄를 포함한다.
21일 째 평균 종양부피가 약 200 mm3에 이르렀을 때, 마우스를 무작위로 6개 그룹(종양의 성장 및 부피에 따라 그룹 당 5-7마리 마우스)으로 나누고 투약을 시작하였다: 비이클만 매일 위관투여(n=5); 25 mg/kg PB8532 항체를 매주 복강주사하고 비이클을 매일 위관투여(n=7); 25 mg/kg PB17160 항체를 매주 복강주사하고 비이클을 매일 경구 위관투여(n=6); 6 mg/kg 에를로티닙을 매일 경구 위관투여(n=7); 25 mg/kg PB8532 항체를 매주 복강주사하고 6 mg/kg 에를로티닙을 매일 경구 위관투여(n=7); 또는 25 mg/kg PB17160 항체를 매주 복강주사하고 6 mg/kg 에를로티닙을 매일 경구 위관투여(n=7). 이전과 마찬가지로, 종양 부피를 모니터링하여 각 그룹의 평균 종양부피(및 SEM)을 계산하였다. 모든 투약은 60일째 이후에 중단하였으며, 생존 마우스에서의 82일째까지의 종양 부피를 측정하였다.
3차 실험에서 PB19478 이중특이적 항체(단독 또는 에를로티닙과 조합)가 종양 성장을 억제하는 능력을 시험하였다. 종양을 가지는 NSG-hHGFki 마우스(상술한 방법으로 제작)에 6개중 한 가지 치료 또는 조합된 치료를 제공하였으며, 항체는 매주 복강(i.p.) 주사되고 에를로티닙 또는 비이클은 매일(QD) 위관투여되었다.
23일 째 평균 종양부피가 약 200 mm3에 이르렀을 때, 마우스를 무작위로 6개 그룹(종양의 성장 및 부피에 따라 그룹 당 5-6마리 마우스)으로 나누고 투약을 시작하였다: 매일 비이클 만 위관투여(n=5); 매주 복강주사25 mg/kg PB19478 항체를 매주 복강주사하고 비이클을 매일 위관투여(n=5); 6 mg/kg 에를로티닙을 매일 경구 위관투여(n=6); 25 mg/kg PB19478 항체를 매주 복강주사하고 6 mg/kg 에를로티닙을 매일 경구 위관투여(n=4, 한 마리 마우스는 실험 도중 사망); 25 mg/kg LY2875358 항체를 매주 복강주사하고 비이클을 매일 위관투여(n=5); 25 mg/kg LY2875358 항체를 매주 복강주사하고 6 mg/kg 에를로티닙을 매일 경구 위관투여(n=3, 두 마리 마우스가 실험 도중 사망). 이전과 마찬가지로, 종양 부피를 모니터링하여 각 그룹의 평균 종양부피(및 SEM)을 계산하였다. 모든 투약은 93일째 이후에 중단하였으며, 생존 마우스에서의 93일째까지의 종양 부피를 측정하였다.
4차 실험에서 이후의 PB19478 투여에 의한 효과를 시험하였다. 종양을 가지는 NSG-hHGFki 마우스(상술한 방법으로 제작)에 두 가지 중 하나를 투여하였으며, 항체는 매주 복강(i.p.) 주사하였고 에를로티닙 또는 비이클은 매일(QD) 위관투여하였다.
21일 째 평균 종양부피가 약 200 mm3에 이르렀을 때 모든 14마리 마우스에 6mg/kg 에를로티닙을 경구 위관투여하였다. 51일 째 평균 종양부피가 약 500 mm3를 넘어갈 때 마우스를 무작위로 두 그룹으로 나누었다. 6마리로 구성된 하나의 그룹에 6 mg/kg 에를로티닙을 매일 경구 위관투여하고 8마리로 구성된 나머지 그룹에 25 mg/kg PB19478 항체를 매주 복강주사하면서 6 mg/kg 에를로티닙을 매일 경구 위관투여하였다. 전과 마찬가지로, 종양 부피를 모니터링하고 각 그룹에 대한 평균 종양부피(및 표준 오차)를 계산하였다. 모든 투약은 72일째 이후에 중단하였다.
1차 실험의 결과를 통해 에를로티닙이 HCC827 세포가 이식된 NGS-hHGFki 마우스에서 항-종양 반응을 유도할 수 있으나, 이는 투약을 받는 기간 동안만 지속됨을 알 수 있다(도 19). 투약 후 4주 뒤에 실행된 무-투여 기간(drug-free period)에 에를로티닙을 투여했던 마우스에서 종양 부피가 명확하게 증가하였다.
항-cMET x EGFR 이중특이적인 항체인 PB8532은 HCC827 세포가 이식된 NGS-hHGFki 마우스에서 항-종양 반응을 유도할 수 있다(도 20). 이러한 효과는 일일 용량의 에를로티닙과 병용투여될 경우 더욱 증가하였다. PB8532와 에를로티닙의 병용 투여에 의해 2.5주 내에 모든 종양이 사라졌다. 하나의 Fab 암을 가지는 cMet-타겟팅 대조군 항체인 PB17160는 단독투여하던 혹은 에를로티닙과 병용투여하던 항-종양 반응을 유도하지 못했다. 따라서, 이중특이적 항체 PB8532 내의 EGFR 타겟팅 Fab 암과 함께 cMet Fab 암을 특이적으로 타겟팅하면 HGF 매개 에를로티닙 저항성을 극복할 수 있다. 투약 후 5½주 뒤에 실행된 무-투여 기간에, PB8532는 에를로티닙보다 종양 부피를 감소시키는 데에 확실히 보다 효과적이었으며(도 21), PB8532 + 에를로티닙 조합 그룹에서 종양 재성장은 관찰되지 않았다.
항-cMET x EGFR 이중특이적 항체인 PB19478도 HCC827 세포가 이식된 NGS-hHGFki 마우스에서의 항-종양 반응을 유도할 수 있다(도 22). 이러한 효과는 항체가 일일 용량의 에를로티닙과 병용투여되었을 때 더 크다. PB19478 단독 혹은 에를로티닙과 병용 투여시 2주 내에 모든 종양이 사라졌다. 에를로티닙과 병용투여시 시험기간 동안 종양은 재발하지 않았다. 에를로티닙과 병용 사용하지 않은 경우 종양은 약 50일 뒤 재발하였으며 80일부터 더 자리기 전까지는 검출 수준에 머물렀다. 인간화된 단클론 항체인 에미베투주맙(LY3875358)은 EGFR 억제제인 에를로티닙과 조합된 경우에도 덜 효과적이었다. 이에, 이중특이적 항체 PB8532 또는 PB19478 내의 EGFR 표적화 Fab 암과 cMet Fab 암의 조합에 의한 특이적인 표적화로 HGF 매개된 에를로티닙 저항성을 극복할 수 있다.
도 23은 에를로티닙 저항성이 발생하기 시작하는 시점에 종양을 치료할 경우 이중특이적 항체 PB19478가 즉각적인 효과를 발휘함을 보여주는 그림이다.
이를 종합하면 면역결핍 NSG-hHGFki 마우스에 HCC827 종양 세포를 이식한 종양 모델에 대한 데이터로부터 PB8532, PB19478 및 도 7, 8에 나타난 서열과 유사한 VH 서열을 가지는 항체 인 비보에서 HGF-매개 에를로티닙 저항성을 극복할 수 있음을 알 수 있다. 병용 치료는 치료 종료 후에도 효과를 보였다.
cMET 세포외 도메인에 대한 특이성이 보고된 참조 항체.
Name INN name 에피토프 MOA
5D5 MetMAb Sema 도메인 HGF block
13.3.2
224G11
C8-H241 LY-2875358 HGF block, internalization
R13 13-MET
Figure pct00001
N87 HGF/EGF 증식 어세이에서 용량 의존적 역가 실험으로 선정된 24개 cMET x EGFR 이중특이적 항체. 각 PB에서의 EGFR 및 cMET 암의 번호와 HCDR3 서열을 표시함.
PBs PBs MF's
EGFR cMET
PB7678 MF4280 EGYYETTTYYYNLFDS MF4298 KLEPTGYYYYYMDV
PB7679 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4487 KTSRYSGYHYYMDV
PB7686 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4507 AHYDILTG
PB8021 MF3755 ERFLEWLHFDY MF3462 GKSHYSWDAFDY
PB8218 MF3752 DRNWGWDFDY MF4040 GTYYYGSGSFSTRVFDAFDV
PB8244 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4044 QSRRYSGYASYFDY
PB8292 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4130 QRRAYSGYNWYFDL
PB8301 MF4280 EGYYETTTYYYNLFDS MF4130 QRRAYSGYNWYFDL
PB8316 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4293 RNDFWSGYLFDY
PB8339 MF3752 DRNWGWDFDY MF4294 KTTVGYYYYYMDV
PB8340 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4294 KTTVGYYYYYMDV
PB8364 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4296 GPELGYYYYYMDI
PB8388 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4297 ASSMITFGGVIVSWFDP
PB8511 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4301 RVNRYSGYATYFDL
PB8532 MF3370 DRHWHWWLDAFDY MF4356 ETYYYDRGGYPFDP
PB8535 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4356 ETYYYDRGGYPFDP
PB8545 MF4281 GDLFITGTLDY MF4356 ETYYYDRGGYPFDP
PB8582 MF3752 DRNWGWDFDY MF4491 RTSRYSGYHYYLDV
PB8583 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4491 RTSRYSGYHYYLDV
PB8607 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4505 LLYDLFDL
PB8639 MF3752 DRNWGWDFDY MF4506 SIDMATITDAFDI
PB8640 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4506 SIDMATITDAFDI
PB8687 MF3752 DRNWGWDFDY MF4508 GTTGNPYYFYYYMDV
PB8688 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4508 GTTGNPYYFYYYMDV
24개의 cMET x EGFR 이중특이적 항체를 이용한 N87 HGF/EGF, HGF 및 EGF 증식 어세이를 통한 항체 역가 실험결과의 요약. 이중특이적 항체는 PBXXXX로 표시하고 상이한 Fab 암은 MGXXXX로 표시하였다. 각 어세이에서의 이중특이적 항체의 활성은 다음과 같이 표현하였다: - 효과 없음; + 양성 대조군보다 증식 억제 효과 낮음; ++ 양성 대조군 항체인 5D5 Fab과 증식 억제 효과가 유사함; +++ 양성 대조군 항체인 5D5 Fab보다 증식 억제 효과가 우수함
PB PBs MF's N87 증식 assays
EGFR cMET HGF/EGF HGF EGF
PB7678 MF4280 MF4298 + + +
PB7679 MF3755 MF4487 ++ - ++
PB7686 MF3755 MF4507 ++ + +
PB8021 MF3755 MF3462 + + +
PB8218 MF3752 MF4040 ++ +++ +
PB8244 MF3755 MF4044 ++ + ++
PB8292 MF3755 MF4130 ++ + ++
PB8301 MF4280 MF4130 + ++ +
PB8316 MF3755 MF4293 ++ + +
PB8339 MF3752 MF4294 + + +
PB8340 MF3755 MF4294 ++ + ++
PB8364 MF3755 MF4296 ++ + ++
PB8388 MF3755 MF4297 ++ +++ ++
PB8511 MF3755 MF4301 ++ +++ ++
PB8532 MF3370 MF4356 + +++ +
PB8535 MF3755 MF4356 ++ +++ ++
PB8545 MF4281 MF4356 + +++ +
PB8582 MF3752 MF4491 + - +
PB8583 MF3755 MF4491 ++ +++ ++
PB8607 MF3755 MF4505 ++ - ++
PB8639 MF3752 MF4506 + +++ +
PB8640 MF3755 MF4506 ++ +++ ++
PB8687 MF3752 MF4508 + ++ +
PB8688 MF3755 MF4508 + - +
가장 우수한 EGFRxcMET 이중특이적 항체의 조성 및 참조 항체와의 경쟁
이중특이적 항체 EGFR 암 cetux 대비 EGFR 차단(IC50기반) cMET 암 상호 참조항체 차단
PB8535 MF3755 100% MF4356 5D5
PB8640 MF3755 100% MF4506 ND
PB8388 MF3755 100% MF4297 13.3.2
PB8218 MF3752 80% MF4040 5D5
PB8532 MF3370 80% MF4356 5D5
이중특이적 항체의 조성. pXX 번호는 생산 실행 번호를 나타내며, 항체가 ADCC 버전에서 생산되었는지 여부를 식별하기 위해 사용됨.
이중특이적 항체 cMET 암 EGFR 암 ADCC 증진
세툭시맙 - - -
PB8532p05 MF4356 MF3370 No
PB19474p01 MF4356 MF8232 Yes
PB19475p01 MF4356 MF8233 Yes
PB19476p01 MF8230 MF3370 Yes
PB19477p01 MF8230 MF8232 Yes
PB19478p01 MF8230 MF8233 Yes
PB8532p06 MF4356 MF3370 Yes
PB8532p04 MF4356 MF3370 No
HER-3 암 EGFR 암
PB4522p34 MF3178 MF4280 Yes
PB4522p25 MF3178 MF4280 No
TT 암 TT 암
PG1337p218 MF1337 MF1337 No
SEQUENCE LISTING <110> Merus N.V. <120> Antibodies that bind EGFR and cMET. <130> P114616PC00 <140> PCT/NL2018/050537 <141> 2018-08-09 <150> EP 17185572.9 <151> 2017-08-09 <160> 103 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF8225 <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Ser Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Phe Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Pro Phe Asp Pro 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF8243 <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Tyr Tyr Tyr Asp Arg Gly Gly Tyr Pro Phe Asp Pro 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF8224 <400> 3 Gln Val Gln Leu Met Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Pro Phe Asp Pro 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF8239 <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Val Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Phe Pro Phe Asp Pro 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF8242 <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala 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Ser Tyr Tyr Tyr Asp Arg Asn Asp Tyr Pro Phe Asp Pro 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF8240 <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Asn Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Tyr Tyr Tyr Asp Val Gly Gly Tyr Pro Phe Asp Pro 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF8234 <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr 20 25 30 Ala 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<222> (2)..(2) <223> Can also be S or Y <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Can also be L or Y <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Can also be W <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> Can also be G <400> 34 Asp Arg His Asp Xaa His Trp Trp Leu Asp Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 35 Asp Arg His Trp His Trp Trp Leu Asp Ala Phe 1 5 10 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 36 Asp Arg His Trp His Trp Trp Leu Asp Ala Phe Asp 1 5 10 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 37 Asp Arg His Trp His Trp Trp Leu Asp Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1-tail <400> 38 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3-tail <400> 39 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr 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Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 85 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> common light chain <400> 85 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 86 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> common light chain <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 86 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tac 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt acc cct cca 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 87 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 87 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 88 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> common light chain <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 88 cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 324 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 89 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 89 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 90 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GKV1-39/jk5 common light chain <400> 90 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 91 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V-region IGKV1-39A <400> 91 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 <210> 92 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 region <220> <221> CDS <222> (1)..(294) <400> 92 gct agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 ctc agc agc gtc gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 aga gtt 294 Arg Val <210> 93 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 93 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 94 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge <220> <221> CDS <222> (1)..(45) <400> 94 gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca 45 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 95 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 95 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 96 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 region <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <400> 96 gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa 48 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg 96 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 144 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag 192 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac 240 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 288 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa 330 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 97 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 97 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 98 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 containing L235G and G236R silencing substitutions: <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <400> 98 gca cct gaa ctc ggc agg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa 48 Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg 96 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 144 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag 192 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac 240 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 288 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa 330 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 99 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 99 Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 100 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3: KK of DEKK <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 100 ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc aag ccc cca tcc cgg gag 48 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg aag tgc ctg gtc aaa ggc ttc 96 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag 144 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc 192 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg 240 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac 288 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt tga 321 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 101 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 101 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 102 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3: DE of DEKK <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 102 ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc gac ccc cca tcc cgg gag 48 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Asp Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc gag gtc aaa ggc ttc 96 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe 20 25 30 tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag 144 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc 192 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg 240 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac 288 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt tga 321 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 103 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 103 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Asp Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105

Claims (45)

  1. 인간 표피성장인자 수용체 (EGFR)의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제1 가변 도메인 및 수용체 티로신 키나아제인 인간 MET 원발암 유전자 (cMET)의 세포외 부위에 결합할 수 있는 제2 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 공통 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 전장(full length) 항체인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 1:1의 항-EGFR, 항-cMET 화학양론을 가지는 IgG1 포맷 항체인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 EGFR과 결합할 수 있는 하나의 가변도메인과 cMET와 결합할 수 있는 하나의 가변도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 EGFR과 결합할 수 있는 가변도메인은 게잡이원숭이 및 마우스의 EGFR과도 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 EGFR과 결합할 수 있는 가변도메인은 인간 EGFR의 도메인 Ⅲ와 결합하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 cMET과 결합할 수 있는 가변도메인은 5D5 항체가 cMET에 결합하는 것을 차단하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 cMET과 결합할 수 있는 가변도메인은 HGF가 cMET에 결합하는 것을 차단하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CH3 도메인의 405번 및 409번 위치의 아미노산은 다른 CH3 도메인(EU-번호)의 상응하는 위치의 아미노산과 동일한 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가변 도메인은 CDR1 서열 SYGIS, CDR2 서열 WISAYX1X2NTNYAQKLQG 및 CDR3 서열 X3X4X5X6HWWLX7A를 포함하되, 상기 X1=N 또는 S; X2=A 또는 G; X3=D 또는 G; X4=R, S 또는 Y; X5=H, L 또는 Y; X6=D 또는 W 그리고 X7=D 또는 G이며; X1-X7 이외의 위치에 0-5개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지고, 상기 제2 가변 도메인은 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개의 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 서열번호: 1-23 중 하나의 서열의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  13. 제 12 항에 있어서,
    X1=N; X2=G; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W 및 X7=G;
    X1=N; X2=A; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W 및 X7=G;
    X1=S; X2=G; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W 및 X7=G;
    X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D;
    X1=N; X2=A; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D;
    X1=S; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D;
    X1=N; X2=G; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D 및 X7=G;
    X1=N; X2=A; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D 및 X7=G; 또는
    X1=S; X2=G; X3=G; X4=Y; X5=L;X6=D 및 X7=G인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D;
    X1=N; X2=A; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D; 또는
    X1=S; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D; 또는
    X1=N; X2=A; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W 및 X7=D인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 가변 도메인의 중쇄 가변영역은 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 포함하는 서열번호: 1-3; 7; 8; 10; 13; 15; 16; 17; 21; 22 또는 23 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 가변 도메인의 중쇄 가변영역은 0 - 10개, 바람직하게는 0 - 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 포함하는 서열번호: 2; 7; 8; 10; 13 또는 23 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가변 도메인은 CDR1 서열 SYGIS; CDR2 서열 WISAYNGNTNYAQKLQG; 및 DRHWHWWLDA 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하고, 상기 제2 가변 도메인은 CDR1 서열 SYSMN; CDR2 서열 WINTYTGDPTYAQGFTG 및 CDR3 서열 ETYYYDRGGYPFDP을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  19. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가변 도메인은 CDR1 서열 SYGIS; CDR2 서열 WISAYNANTNYAQKLQG; 및 DRHWHWWLDA 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하고, 상기 제2 가변 도메인은 CDR1 서열 TYSMN; CDR2 서열 WINTYTGDPTYAQGFTG 및 CDR3 서열 ETYFYDRGGYPFDP을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 가변 도메인은 공통 경쇄, 바람직하게는 도 9b의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 HGF 유도된 HGF-성장 반응성 세포의 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는 항체.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 EGF 유도된 EGF-성장 반응성 세포의 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는 항체.
  23. 이상 세포 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 항체.
  24. 종양을 가지는 대상체의 치료에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 종양은 EGFR 양성 종양, cMET 양성 종양 또는 EGFR 및 cMET 양성 종양인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 상기 종양은 유방암; 대장암, 췌장암, 위암, 난소암, 결장직장암, 두경부암암, 비소세포 폐암을 포함하는 폐암 또는 방광암인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  27. 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 EGFR 티로신 키나아제 억제제를 이용한 치료에 저항성을 가지는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 EGFR 티로신 키나아제 억제제는 에를로티닙, 제피티닙, 또는 아파티닙, 또는 에를로티닙, 제피티닙 또는 아파티닙의 유사체 또는 각 화합물 및/또는 이들의 유사체의 하나 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 EGFR 티로신 키나아제 억제제는 에를로티닙인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  30. 제 23 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 EGFR 티로신 키나아제 억제제를 이용한 치료를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 EGFR 티로신 키나아제 억제제은 에를로티닙인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  32. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 상기 EGFR 티로신 키나아제 억제제와 동시에, 순차적으로 또는 분리되어 투여되는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  33. 이상 세포 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체로서, 상기 이중특이적 항체는 EGFR 티로신 키나아제 억제제와 동시에, 순차적으로 또는 분리되어 투여되는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  34. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 개체는 이상 세포 관련 질환을 가진 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서, 상기 종양은 EGFR 양성 종양, cMET 양성 종양 또는 EGFR 및 cMET 양성 종양인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 34 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 유방암, 대장암, 췌장암, 위암, 난소암, 결장직장암, 두경부암암, 비소세포 폐암을 포함하는 폐암 또는 방광암인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 EGFR 티로신 키나아제 억제제를 이용한 치료에 저항성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 EGFR 티로신 키나아제 억제제는 에를로티닙, 제피티닙 또는 아파티닙; 에를로티닙, 제피티닙 또는 아파티닙의 유사체; 또는 상기 각 화합물 및/또는 이들의 유사체의 하나 이상의 조합인 것으로 특징으로 하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 티로신 키나아제 억제제는 에를로티닙인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 34 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 대상체에 EGFR 티로신 키나아제 억제제를 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 EGFR 티로신 키나아제 억제제는 에를로티닙인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 상기 EGFR 티로신 키나아제 억제제와 동시에, 순차적으로 또는 분리되어 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 이상 세포를 포함하는 질환을 치료하기 위한 의약을 생산하는 용도로 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체.
  45. 인간 EGFR, 마우스 EGFR 및 게잡이원숭이 EGFR의 세포외 부위에 결합할 수 있는 가변 도메인을 포함하는 항체.
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