ES3025738T3

ES3025738T3 - Antibodies that bind egfr and cmet

Info

Publication number: ES3025738T3
Application number: ES18766377T
Authority: ES
Inventors: Cecilia Geuijen; Robertus Roovers; Mark Throsby; Kruif Cornelis De; Ton Logtenberg
Original assignee: Merus BV
Current assignee: Merus BV
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2018-08-09
Publication date: 2025-06-09
Anticipated expiration: 2038-08-09
Also published as: FI3665198T3; US11773170B2; JP2025176063A; AU2018312816A1; TWI874301B; US20200247892A1; WO2019031965A1; SI3665198T1; DK3665198T3; LT3665198T; KR20200042485A; PT3665198T; EP4553088A2; EP4553088A3; KR20260051470A; FI3665198T9; HRP20250474T2; CN118562014A; CA3072404A1; EP3665198A1

Abstract

La invención, tal como se describe en el presente documento, se refiere a anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio variable capaz de unirse a una porción extracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y un segundo dominio variable capaz de unirse a una porción extracelular del protooncogén MET, receptor de tirosina quinasa (cMET). El anticuerpo puede comprender una cadena ligera común, ser un anticuerpo humano o un anticuerpo de longitud completa. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo con formato IgG1 con una estequiometría anti-EGFR y anti-eMET de 1:1. En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene un dominio variable capaz de unirse al EGFR y un dominio variable capaz de unirse a cMET. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos que se unen a EGFR y cMET

La invención se refiere al campo de los anticuerpos. En particular, se refiere al campo de los anticuerpos terapéuticos, incluidos los anticuerpos humanos, para su uso en el tratamiento de enfermedades que involucran células aberrantes. Además, se relaciona con los anticuerpos que se unen a EGFR y cMET, incluidos los anticuerpos multiespecíficos, y su uso en la unión de células positivas para EGFR y cMET, particularmente células tumorales.

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (EGFR) es un receptor de superficie celular para miembros de la familia del factor de crecimiento epidérmico (familia EGF) de ligandos de proteínas extracelulares. El EGFR también se conoce como receptor ErbB-1. El receptor ha recibido varios nombres en el pasado (EGFR; ERBB; ERBB1; HER1; PIG61; mENA). En la presente invención los nombres ErbB-1, EGFR o HER1 en humanos se utilizarán indistintamente. El EGFR es un miembro de la familia de receptores ErbB, una subfamilia de cuatro receptores de tirosina quinasas estrechamente relacionados: ErbB-1 (EGFR), ErbB-2 (HER2/c-neu; Her2), ErbB-3 (Her 3) y ErbB-4 (Her 4).

El EGFR existe en la superficie celular y puede activarse mediante la unión de sus ligandos específicos, incluidos el factor de crecimiento epidérmico y el factor de crecimiento transformante a (TGFa). Tras la activación por sus ligandos de factores de crecimiento, el receptor puede experimentar una transición desde una forma mayoritariamente monomérica inactiva a un homodímero activo. Además de formar homodímeros después de la unión del ligando, el EGFR puede emparejarse con otro miembro de la familia de receptores ErbB, como ErbB2, para crear un heterodímero activado. También pueden formarse dímeros en ausencia de unión del ligando y pueden formarse grupos del EGFR activados después de la unión del ligando.

La dimerización del EGFR estimula la actividad intrínseca de la proteína tirosina quinasa (PTK) intracelular. Esta actividad induce varias cascadas de transducción de señales que conducen a la proliferación y diferenciación celular. El dominio quinasa del EGFR puede fosforilar de forma cruzada los residuos de tirosina de otros receptores con los que forma complejo y puede activarse de esa manera.

Se han identificado mutaciones que involucran al EGFR en varios tipos de cáncer. Es el objetivo de una clase en expansión de terapias contra el cáncer. Estas terapias incluyen inhibidores de la tirosina quinasa del EGFR (EGFR-TKI), como gefitinib y erlotinib para el cáncer de pulmón, y anticuerpos como cetuximab y panitumumab para el cáncer de colon y el cáncer de cabeza y cuello.

Cetuximab y panitumumab son anticuerpos monoclonales que inhiben el receptor. Otros monoclonales en desarrollo clínico son zalutumumab, nimotuzumab y matuzumab. Los anticuerpos monoclonales tienen como objetivo bloquear la activación del receptor inducida por el ligando extracelular, principalmente bloqueando la unión del ligando al receptor. Si el sitio de unión está bloqueado, las moléculas inductoras de señales pueden no unirse de manera efectiva y, por lo tanto, tampoco activar la señalización posterior. La activación del receptor inducida por ligando también puede inhibirse mediante la estabilización de la conformación del receptor inactivo (matuzumab).

Hasta la fecha, las terapias dirigidas al EGFR se han asociado con el desarrollo de resistencia al tratamiento a lo largo del tiempo. Se han descrito varios mecanismos de resistencia a los EGFR-TKI. En pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) avanzado, los mecanismos de resistencia incluyen la aparición de mutaciones secundarias (e.g., T790M, C797S), la activación de señalización alternativa (e.g., Met, HGF, AXL, Hh, IGF-1R), vías aberrantes posteriores (e.g., mutaciones de AKT, pérdida de PTEN), el deterioro de la vía de apoptosis mediada por EGFR-TKI (e.g., polimorfismo de eliminación 11/BIM similar a BCL2) y transformación histológica. Aunque se han identificado algunos mecanismos de resistencia, aún quedan otros por identificar. De manera similar, los pacientes con cáncer colorrectal que son tratados con anticuerpos del EGFR también desarrollan resistencia con el tiempo. Esto puede ocurrir debido a la aparición de mutaciones KRAS. De aquellos sin mutaciones KRAS, la amplificación del protooncogén MET puede estar asociada con resistencia adquirida durante la terapia anti-EGFR (Bardelli et al., 2013; Cancer Discov. Jun; 3(6): 658-73. doi: 10.1158/2159-8290.CD-12-0558). El tumor puede ser resistente desde el principio o desarrollar resistencia durante el tratamiento. Se observa resistencia a la terapia dirigida al EGFR en muchos cánceres positivos para el EGFR y ha demostrado una necesidad en la técnica de tratamientos contra el cáncer del EGFR más eficaces que mejoren el estándar de atención y sean superiores en términos de capacidad para abordar la resistencia a la terapia dirigida al EGFR.

Se ha informado de una desregulación del protooncogén MET, del receptor de tirosina quinasa (cMET) y del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) en una variedad de tumores. Se ha observado la activación de cMET impulsada por ligando en varios tipos de cáncer. Se observan niveles elevados de HGF sérico e intratumoral en cáncer de pulmón, cáncer de mama y mieloma múltiple (J.M. Siegfried et al., Ann Thorac Surg 66, 1915 (1998); P C. Ma et al., Anticancer Res 23, 49 (2003); B. E. Elliott et al., Can J Physiol Pharmacol 80, 91 (2002); C. Seidel, et al., Med Oncol 15, 145 (1998)). Se ha informado sobre la sobreexpresión de cMET, la amplificación o mutación de cMET en varios tipos de cáncer, como el cáncer colorrectal, de pulmón, gástrico y de riñón, y puede impulsar la activación del receptor independiente del ligando (C. Birchmeier et al., Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915 (2003); G. Maulik et al., Cytokine GroWth Factor Rev 13, 41 (2002)). La expresión de HGF también está asociada con la activación de la vía de señalización HGF/cMET y también es uno de los mecanismos de escape de los tumores bajo selección mediante terapia dirigida a<e>G<f>R.

El receptor cMET se forma mediante el procesamiento proteolítico de un precursor común en un heterodímero a/p unido por disulfuro de un solo paso. La porción extracelular de cMET se compone de tres tipos de dominios. El pliegue de la región N-terminal forma un gran dominio de semaforina (Sema), que abarca toda la subunidad a y parte de la subunidad p. El dominio plexina-semaforina-integrina (PSI) sigue al dominio Sema e incluye cuatro enlaces disulfuro. Este dominio está conectado a la hélice transmembrana a través de cuatro dominios de transcripción de inmunoglobulina-plexina (IPT), que están relacionados con dominios similares a las inmunoglobulinas. Intracelularmente, el receptor cMET contiene un dominio catalítico de tirosina quinasa flanqueado por secuencias distintivas yuxtamembrana y carboxiterminal (Organ and Tsao. Therapeutic advances in medical oncology 3.1_suppl (2011): S7-S19).

El ligando de cMET, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF; también conocido como factor de dispersión) y sus isoformas de empalme (NK1, NK2) son ligandos conocidos del receptor cMET El HGF fue identificado en 1991 como un potente mitógeno/morfógeno. La vía de señalización HGF/cMET juega un papel importante en el desarrollo y progresión de varios tipos de cáncer. La desregulación y/o hiperactivación de HGF o cMET en cánceres humanos están relacionadas con un mal pronóstico. cMET puede activarse mediante sobreexpresión, amplificación o mutación. La activación puede promover el desarrollo, la progresión, el crecimiento invasivo y la metástasis de los cánceres. cMET puede activarse de manera asociada al HGF e independiente del HGF. La activación independiente de HGF ocurre en casos de sobreexpresión de cMET La abundancia de cMET también puede desencadenar la (hetero)dimerización y la señalización intracelular en ausencia de ligando. El ligando adicional no parece afectar la función de dichas células con sobreexpresión de cMET La amplificación de cMET está asociada con la sobreexpresión de cMET y ha surgido como un biomarcador de subtipos de tumores.

El HGF se expresa de forma ubicua en todo el cuerpo, lo que demuestra que este factor de crecimiento es una citocina disponible sistémicamente y que además proviene del estroma tumoral. Un ciclo paracrino y/o autocrino positivo de activación de cMET puede conducir a una mayor expresión de cMET El anticuerpo específico del HGF Rilotumumab (AMG102) fue desarrollado para el cáncer gástrico. Los ensayos de fase I y fase II parecían prometedores, pero un estudio de fase III con cisplatino y capecitabina como terapia de primera línea en cáncer gástrico (RILOMET-2) se interrumpió después de una revisión de seguridad del estudio 20070622 planificada previamente por un comité de monitoreo de datos.

La relevancia de la señalización cMET/HGF en la resistencia a las terapias dirigidas al EGFR ha estimulado el desarrollo de formas de abordar la resistencia. Hasta la fecha, los enfoques basados en anticuerpos incluyen anticuerpos anti-HGF; anticuerpos anti cMET o cMET y<c>MET/EGF<r>(revisados en Lee et al., 2015; Immunotargets and Therapy 4: 35-44) no han resultado clínicamente eficaces. Los anticuerpos cMET Onartuzumab (MetMab™) y Emibetuzumab (LY-2875358) se han evaluado en ensayos clínicos de fase II. De estos, Onartuzumab pareció ser eficaz contra el cáncer colorrectal en un tratamiento combinado junto con el inhibidor del EGFR erlotinib. Sin embargo, estos resultados no pudieron repetirse en un ensayo clínico aleatorizado de fase III. MetMAb es un anticuerpo monoclonal monovalente (mAb) contra cMET, que bloquea la unión de HGF a cMET y la posterior activación de la vía (Jin et al., 2008 Cancer Research Vol. 68: pp 4360 68).

Para superar un problema con las inmunoterapias anti-EGFR, cMET y HGF, la presente invención proporciona nuevos anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio variable que puede unirse a una parte extracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y un segundo dominio variable que puede unirse a una parte extracelular del protooncogén cMET, el receptor de tirosina quinasa (cMET).

Hasta la fecha, se han descrito en la técnica ciertos anticuerpos biespecíficos EGFR x cMET Castoldi R. et. al, (2013) describen un anticuerpo biespecífico EGFR x cMET denominado MetHer1 con el sitio de unión cMET del anticuerpo 5D5 (o MetMab) y el sitio de unión EGFR de cetuximab. El anticuerpo biespecífico tiene una estequiometría de unión del EGFR y cMET fija de 2:1 (ver Figuras suplementarias).

El documento US20140378664 describe un anticuerpo cMET x EGFR biespecífico entre varios otros anticuerpos biespecíficos. El anticuerpo biespecífico completo se produce como una única proteína que luego se escinde proteolíticamente. Los dos dominios VH/VL se producen como fragmentos Fv de cadena única. La unión del anticuerpo induce la degradación de cMET y la fosforilación de Akt en una línea celular de cáncer gástrico. Moores et al., (2016) describen un anticuerpo cMET x EGFR biespecífico denominado JNJ-61186372 producido por intercambio controlado de brazos Fab (cFAE) que tiene mutaciones en las posiciones 405 y 409 según la numeración de la UE, que puede tener potencial de inmunogenicidad. Se demostró que JNJ-61186372 estaba activoin vivoutilizando un modelo de xenoinjerto con la línea de células tumorales H1975 que expresa el ligando cMET HGF. Se sabe que este modelo de tumor depende de la actividad de ADCC del anticuerpo (Ahmed et al., 2015). Se ha informado que JNJ-61186372 tiene un desequilibrio de afinidad de aproximadamente 40 veces mayor afinidad por cMET que por EGFR (Moores et al., (2016)), y se sabe que el brazo anti-EGFR derivado de zalutumumab causa reacciones relacionadas con la infusión, trastornos de la piel, entre otros problemas.

LY3164530 es un anticuerpo cMET x EGFR biespecífico, que contiene el dominio de unión a EGFR de cetuximab como un fragmento Fv de cadena única fusionado al dominio variable de cadena pesada del anticuerpo de unión a cMET LY2875358 (Emibetuzumab; Kim and Kim 2017). Se trata de un anticuerpo denominado de dominio variable dual, que comprende dos sitios de unión para cada uno de los antígenos. No se proporcionan datos sobre la inhibición de HGF para el anticuerpo. Según se informa, el anticuerpo se une e internaliza cMET y EGFR sin actividad agonista. Los autores revisan varias terapias dirigidas a cMET, EGFR y cMET x EGFR y llegan a la conclusión de que hasta la fecha ninguno de estos inhibidores ha demostrado una eficacia significativa en ensayos clínicos.

Por lo tanto, existe una necesidad de nuevos anticuerpos cMET x EGFR biespecíficos, incluidos aquellos que pueden tener características superiores como las descritas en este documento.

Resumen de la invención

La presente invención es tal como se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio variable que puede unirse a una parte extracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) humano y un segundo dominio variable que puede unirse a una parte extracelular del protooncogén MET humano, receptor de tirosina quinasa (cMET), en donde el primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYGlS; una secuencia de CDR2 WISAYNGNTNYAQKLQG y una CDR3 que comprende la secuencia DRHWHWWLDAFDY; y en donde el segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYSMN; una secuencia de CDR2 WINTYTGDPTYAQGFTG y una secuencia de CDR3 ETYYYDRGGYPFDP;

o

en donde el primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYGIS; una secuencia de CDR2 WISAYNANTNYAQKLQG y una CDR3 que comprende la secuencia DRHWHWWLDAFDY y en donde el segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 TYSMN; una secuencia de CDR2 WINTYTGDPTYAQGFTG y una CDR3 que comprende la secuencia ETYFYDRGGYPFDP; y

en donde el primer y segundo dominios variables comprenden además una cadena ligera que comprende una secuencia de CDR1 QSISSY, una secuencia de CDR2 AAS y una secuencia de CDR3 Qq Sy STP

El anticuerpo biespecífico puede comprender una cadena ligera común. El primer y segundo dominios variables comprenden preferiblemente la misma o sustancialmente la misma región variable de cadena ligera (común). Dicha región variable de cadena ligera común puede ser una que se sabe que se empareja bien con una diversidad de segmentos de genes de la región variable humana que han experimentado recombinación. Más preferiblemente, dicha cadena ligera común es una región variable codificada por un segmento del gen Vk de la línea germinal, preferiblemente el segmento del gen de la región variable O12/IgVKl-39*01. La región variable de cadena ligera preferida comprende el IgVKl-39*01/IGJKl*01 o IgVKl-39*01/IGJK5*01 reordenado. La cadena ligera del brazo de unión de cMET y la cadena ligera del brazo de unión del EGFR son preferiblemente la misma cadena ligera (común). La cadena ligera común es preferiblemente la cadena ligera kappa reordenada IgVKl-39*01/IGJKl*01 o IgVKl-39*01/IGJK5*01 unida a una región constante de cadena ligera humana. El anticuerpo biespecífico puede ser un anticuerpo humano. El anticuerpo biespecífico puede ser un anticuerpo de longitud completa. Puede tener un dominio variable que pueda unirse a EGFR y un dominio variable que pueda unirse a cMET. En un aspecto, el dominio variable que puede unirse al EGFR humano también puede unirse de manera beneficiosa al EGFR de ratón y/o al EGFR de cynomolgus. El dominio variable que puede unirse al EGFR humano puede unirse al dominio III del EGFR humano. El dominio variable que puede unirse a cMET puede bloquear la unión del anticuerpo 5D5 a cMET. El dominio variable que puede unirse a cMET puede bloquear la unión de HGF a cMET. La Kd del anticuerpo para cMET puede ser al menos 10 veces menor que la Kd del anticuerpo para EGFR. Los aminoácidos en las posiciones 405 y 409 en un dominio CH3 pueden ser los mismos que los aminoácidos en las posiciones correspondientes en el otro dominio CH3 (numeración de la UE).

El primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una

secuencia de CDR1 SYGIS; una secuencia de CDR2 WISAYNGNTNYAQKLQG y una CDR3 que comprende la secuencia DRHWHWWLDAFDY; o una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYGIS; una secuencia de CDR2 WISAYNANTNYAQKLQG y una CDR3 que comprende la secuencia DRHWHWWLDAFDY.

El segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYSMN; una secuencia de CDR2 WINTYTGDPTYAQGFTG y una secuencia de CDR3 ETYYYDRGGYPFDP; o una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 TYSMN; una secuencia de CDR2 WINTYTGDPTYAQGFTG y una CDR3 que comprende la secuencia ETYFYDRGGYPFDP.

Se describen anticuerpos biespecíficos en los que la región variable de cadena pesada del segundo dominio variable comprende la secuencia de aminoácidos de una de las secuencias de la SEQ ID NO: 13 o 23 con 0 10, preferiblemente 0-5, inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos, en donde dichas inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos no están dentro de las secuencias de CDR como se reivindica.

En realizaciones, el primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 S<y>GIS; una secuencia de C<d>R2 WISAYNGNTNYAQKLQG y una CDR3 que comprende la secuencia DRHWHWWLDAFDY y el segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYSMN; una secuencia de CDR2 WINTYTGDPTYAQGFTG y una secuencia de CDR3 ETYYYDRGGYPFDP.

En realizaciones, el primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 Sy GIS; una secuencia de Cd R2 WISAYNANTNYAQKLQG y una CDR3 que comprende la secuencia DRHWHWWLDAFDY y el segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 TYSMN; una secuencia de CDR2 WINTYTGDPTYAQGFTG y una CDR3 que comprende la secuencia ETYFYDRGGYPFDP.

La invención también proporciona un anticuerpo biespecífico como se reivindica en este documento para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad que involucra células aberrantes, tal como un tumor.

Un anticuerpo de una invención como se reivindica en este documento inhibe preferiblemente la migración inducida por HGF de células EBC1 en un ensayo de cicatrización de heridas. Preferiblemente la inhibición es mejor que la combinación de cetuximab y MetMab. Por ejemplo, se prefiere lograr la inhibición a través de la prevención del cierre de heridas en presencia de HGF con o sin EGF (el HGF está presente en 15 ng/mL y el EGF, cuando está presente, está presente en una cantidad de 12,5 ng/mL).

Un anticuerpo de una invención reivindicada en este documento inhibe el crecimiento inducido por HGF y EGF/HGF de las líneas de células tumorales resistentes a TKI del EGFR PC-9 y HCC827 cuando se usa en combinación con un inhibidor de la tirosina quinasa (TKI). El TKI es preferiblemente gefitinib.

Un anticuerpo de una invención reivindicada en este documento inhibe el crecimiento inducido por HGF de una célula sensible al HGF, preferiblemente de la línea de células tumorales resistentes a TKI del EGFR PC-9 o HCC827.

Un anticuerpo de una invención reivindicada en este documento inhibe el crecimiento inducido por EGF de una célula sensible a EGF, sin inducir toxicidades tales como erupción cutánea y diarrea asociadas con los anticuerpos EGFR bivalentes de alta afinidad. Esto hace que el anticuerpo sea ideal para combinarlo con TKI que tienen su propio perfil de toxicidad.

Se describe además en este documento una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico como se reivindica.

Un anticuerpo de la invención puede usarse en un método para tratar un tumor que es resistente al tratamiento con un inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR, por ejemplo, resistente a erlotinib, gefitinib o afatinib, un análogo de erlotinib, gefitinib o afatinib o una combinación de uno o más de los respectivos compuestos y/o análogos de los mismos.

Se describe además en este documento, pero no forma parte de las reivindicaciones adjuntas, una molécula de ácido nucleico o un grupo de moléculas de ácido nucleico que, solas o juntas, codifican una o más cadenas pesadas o una o más regiones variables de cadena pesada de un anticuerpo biespecífico divulgado en este documento o una variante del mismo. También se proporciona una molécula de ácido nucleico o un grupo de moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo divulgado en este documento.

En una realización preferida, la cadena pesada de un anticuerpo como se reivindica comprende una región constante de un anticuerpo IgG1, preferiblemente un anticuerpo IgG1 humano. La región CH2 de dicha región constante IgG1 puede diseñarse para alterar la actividad de ADCC y/o CDC del anticuerpo, o no. En una realización preferida, dicha alteración da como resultado una actividad de ADCC y/o CDC mejorada. En una realización preferida, la región de CH3 del anticuerpo está diseñada para facilitar la heterodimerización de cadenas pesadas que comprenden una primera cadena pesada que se une a EGFR y una segunda cadena pesada que se une a cMET.

Se describe además en este documento, pero no forma parte de las reivindicaciones adjuntas, una célula que comprende una o más moléculas de ácido nucleico que solas o juntas codifican un anticuerpo biespecífico o una variante del mismo como se divulga en este documento. También se proporcionan métodos para producir un anticuerpo biespecífico o una variante del mismo divulgados en este documento utilizando una célula como se describe, preferiblemente junto con la recolección del anticuerpo biespecífico o una variante del mismo a partir de un cultivo de las células.

Se describe además en este documento, pero no forma parte de las reivindicaciones adjuntas, un sistema celular que comprende un anticuerpo biespecífico o una variante del mismo divulgado en este documento.

Se describe además en este documento, pero no forma parte de las reivindicaciones adjuntas, una célula que expresa el anticuerpo biespecífico y/o comprende la(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifican dicho anticuerpo biespecífico.

Un anticuerpo biespecífico como se reivindica en este documento puede comprender además una etiqueta, preferiblemente una etiqueta para obtención de imágenesin vivo.

Descripción detallada de la invención

EGFR es un miembro de una familia de cuatro receptores de tirosina quinasas (RTK), llamados Her- o cErbB-1, -2, -3 y -4. El EGFR tiene un dominio extracelular (ECD) que se compone de cuatro subdominios, dos de los cuales están involucrados en la unión del ligando y uno de los cuales está involucrado en la homodimerización y heterodimerización Ferguson (2008). Los números de referencia utilizados en esta sección se refieren a la numeración de las referencias en la lista encabezada "citadas en la especificación". El EGFR integra señales extracelulares de una variedad de ligandos para producir diversas respuestas intracelulares (Yarden et al. 2001; y Jorrisen et al. 2003). El EGFR está implicado en varias neoplasias malignas epiteliales humanas, en particular cánceres de mama, vejiga, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de colon, cáncer de ovario, cabeza y cuello y cerebro. Se han encontrado mutaciones activadoras en el gen, así como sobreexpresión del receptor y de sus ligandos, dando lugar a bucles de activación autocrinos (para una revisión, véase Robertson et al. 2000). Por lo tanto, este RTK se ha utilizado ampliamente como objetivo para la terapia contra el cáncer. Se han desarrollado inhibidores de moléculas pequeñas dirigidos a RTK y anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos a los dominios de unión del ligando extracelular, y hasta ahora han demostrado varios éxitos clínicos, aunque principalmente para un grupo selecto de pacientes. Los números de acceso a la base de datos de la proteína EGFR humana y el gen que la codifica son (GenBank NM_005228.3). Otros identificadores de base de datos para el gen y/o proteína son HGNC: 3236; Entrez Gene: 1956; Ensembl: ENSG00000146648; OMIM: 131550 y UniProtKB: P00533. Los números de acceso se proporcionan principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de la proteína EGFR como objetivo, la secuencia real de la proteína EGFR unida por un anticuerpo puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen codificante, como las que ocurren en algunos cánceres o similares. Cuando en este documento se hace referencia al EGFR, la referencia se refiere al EGFR humano a menos que se indique lo contrario. El sitio de unión al antígeno que se une al EGFR, se une al EGFR y a una variedad de variantes del mismo, como las expresadas en algunos tumores positivos para EGFR.

El término "ligando del EGFR" como se utiliza en este documento se refiere a polipéptidos que se unen y activan el EGFR. Los ejemplos de ligandos del EGFR incluyen, entre otros, EGF, TGF-a,<h>B-EGF, anfirregulina, betacelulina y epirregulina (para revisión Olayioye MA et al.; EMBO J (2000) Vol. 19: pp 3159-3167). El término incluye fragmentos biológicamente activos y/o variantes de un polipéptido natural.

cMET, también llamado receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFR) o proteína tirosina quinasa MET, es una proteína que en los humanos está codificada por el gen MET La proteína posee actividad tirosina quinasa. La proteína precursora de cadena única primaria se escinde postraduccionalmente para producir las subunidades alfa y beta, que están unidas por disulfuro para formar el receptor maduro.

La activación aberrante de cMET puede inducir el crecimiento tumoral, la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) que suministran nutrientes al tumor y la propagación del cáncer a otros órganos (metástasis). La activación aberrante de cMET está desregulada en muchos tipos de neoplasias malignas humanas, incluidos los cánceres de riñón, hígado, estómago, mama y cerebro. El gen cMET se conoce con diferentes nombres, como protooncogén MET, receptor de tirosina quinasa; receptor del factor de crecimiento de hepatocitos; tirosina-proteína quinasa Met; receptor del factor de dispersión; protooncogén C-Met; receptor HGF/SF; receptor HGF; receptor SF; EC 2.7.10.1; protooncogén Met; EC 2.7.10; DFNB97; AUTS9; RCCP2; C-Met; MET; h Gf R; los identificadores externos para cMET son HGNC: 7029; Entrez Gene: 4233; Ensembl: ENSG00000105976; OMIM: 164860 y UniProtKB: P08581. Los números de acceso se proporcionan principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de la proteína cMET como objetivo, la secuencia real de la proteína cMET unida por un anticuerpo puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen codificante, como las que ocurren en algunos cánceres o similares. Cuando en este documento se hace referencia a cMET, la referencia se refiere a cMET humano a menos que se indique lo contrario. El sitio de unión al antígeno que se une a cMET, se une a cMET y una variedad de variantes del mismo, como las expresadas en algunos tumores positivos para cMET.

Un anticuerpo generalmente reconoce sólo una parte de un antígeno. El antígeno suele ser, aunque no necesariamente, una proteína. El sitio de reconocimiento o unión de un antígeno, al que se une un anticuerpo, se denomina epítopo, donde un epítopo puede ser lineal o conformacional. La unión de un anticuerpo a un antígeno suele ser específica. La "especificidad" de un anticuerpo se refiere a su selectividad por un epítopo particular, mientras que la "afinidad" se refiere a la fuerza de la interacción entre el sitio de unión del antígeno del anticuerpo y el epítopo al que se une.

Los ejemplos de anticuerpos de la invención divulgados en este documento se unen a EGFR y cMET, preferiblemente EGFR humano y cMET humano. Un anticuerpo biespecífico EGFR/cMET de la invención divulgada en este documento se une a EGFR y, en condiciones por lo demás idénticas, al menos 100 veces menos a los receptores homólogos ErbB-2 y ErbB-4 de la misma especie. Un anticuerpo biespecífico EGFR/cMET de la invención como se divulga en este documento se une a cMET y, en condiciones por lo demás idénticas, al menos 100 veces menos a los receptores ErbB-2 y ErbB-4 de la misma especie. Teniendo en cuenta que los receptores son receptores de la superficie celular, la unión puede evaluarse en las células que expresan el/los receptor(es). Un anticuerpo biespecífico de la invención divulgada en este documento se une preferiblemente al EGFR humano, al EGF<r>de cynomolgus y/o al EGFR de ratón.

Un anticuerpo que se une a EGFR y cMET también puede unirse a otras proteínas si dichas proteínas contienen el mismo epítopo. Por lo tanto, el término "unión" no excluye la unión de los anticuerpos a otra proteína o proteínas que contengan el mismo epítopo. Esta unión suele denominarse reactividad cruzada. Un anticuerpo biespecífico EGFR/cMET normalmente no se une a otras proteínas que no sean EGFR y/o cMET en la membrana de las células en un ser humano postnatal, preferiblemente adulto. Un anticuerpo de acuerdo con la invención divulgada en este documento normalmente es capaz de unirse a EGFR con una afinidad de unión (es decir, constante de disociación de equilibrio Kd) de al menos 1x10e-6 M, como se describe con más detalle a continuación.

El término "anticuerpo" tal como se utiliza en el presente documento significa una molécula proteínica que pertenece preferiblemente a la clase de proteínas de inmunoglobulina. Un anticuerpo generalmente contiene dos dominios variables que se unen a un epítopo de un antígeno. Dichos dominios se derivan o comparten homología de secuencia con el dominio variable de un anticuerpo. Un anticuerpo biespecífico de la invención como se divulga en este documento comprende dos dominios variables. Los anticuerpos para uso terapéutico son preferiblemente lo más parecidos posible a los anticuerpos naturales del sujeto a tratar (por ejemplo, anticuerpos humanos para sujetos humanos). La unión de anticuerpos se puede expresar en términos de especificidad y afinidad. La especificidad determina qué antígeno o epítopo del mismo está específicamente unido por el dominio de unión. Normalmente, los anticuerpos para aplicaciones terapéuticas pueden tener afinidades de hasta 1x10e-10 M o más. Los anticuerpos tales como los anticuerpos biespecíficos de la invención divulgada en este documento comprenden preferiblemente los dominios constantes (parte Fc) de un anticuerpo natural. Un anticuerpo de la invención como se divulga en este documento es típicamente un anticuerpo biespecífico de longitud completa, preferiblemente de la subclase IgG humana. Preferiblemente, los anticuerpos de la presente invención son de la subclase IgG1 humana. Dichos anticuerpos de la invención tal como se divulgan en este documento pueden tener buenas propiedades de ADCC, tienen una vida media favorable tras la administraciónin vivoa seres humanos y existe tecnología de ingeniería CH3 que puede proporcionar cadenas pesadas modificadas que forman preferentemente heterodímeros en lugar de homodímeros tras la coexpresión en células clonales. La actividad de ADCC de un anticuerpo también se puede mejorar a través de técnicas conocidas por las personas expertas en la materia.

Un anticuerpo de la invención como se divulga en este documento es preferiblemente un anticuerpo de "longitud completa". El término "longitud completa" según la invención tal como se divulga en este documento se define como que comprende un anticuerpo esencialmente completo, que sin embargo no necesariamente tiene todas las funciones de un anticuerpo intacto. Para evitar dudas, un anticuerpo de longitud completa contiene dos cadenas pesadas y dos ligeras. Cada cadena contiene regiones constantes (C) y variables (V), que pueden dividirse en dominios designados CH1, CH2, CH3, VH y CL, VL. Normalmente, un anticuerpo se une al antígeno a través de los dominios variables contenidos en la porción Fab y, después de la unión, puede interactuar con moléculas y células del sistema inmunológico a través de los dominios constantes, principalmente a través de la porción Fc. Los anticuerpos de longitud completa según la invención divulgada en este documento abarcan anticuerpos en los que pueden estar presentes mutaciones que proporcionan las características deseadas. Los anticuerpos en los que se eliminan uno o varios residuos de aminoácidos, sin alterar esencialmente las características de especificidad y/o afinidad del anticuerpo resultante, se incluyen dentro del término "anticuerpo de longitud completa". Por ejemplo, un anticuerpo IgG puede tener 1-20 inserciones, eliminaciones o sustituciones de residuos de aminoácidos o una combinación de ellos en la región constante.

Un anticuerpo de la invención como se divulga en este documento es preferiblemente un anticuerpo IgG biespecífico, preferiblemente un anticuerpo IgG1 de longitud completa biespecífico y más preferiblemente un IgG1 humano. Se prefieren los anticuerpos IgG de longitud completa debido a su vida media típicamente favorable y al deseo de permanecer lo más cerca posible de las moléculas totalmente autólogas (humanas) por razones de inmunogenicidad. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo IgG1 de longitud completa, un IgG2 de longitud completa, un IgG3 de longitud completa o un IgG4 de longitud completa.

Un anticuerpo biespecífico como se reivindica en este documento comprende un primer dominio variable que puede unirse a una parte extracelular del EGFR y un segundo dominio variable que puede unirse a una parte extracelular de cMET, en donde el primer dominio variable se une a EGFR con una afinidad que es menor que cetuximab, que tiene una Kd de 0.39 nM (Kim et al 2008). El primer dominio variable se une preferiblemente a EGFR con una Kd que está entre 10e-6 M y 10e-9 M. La Kd está preferiblemente entre 10e-7 M y 10e-9 M, preferiblemente entre 10e-8 M y 10e-9 M. El segundo dominio variable se une preferiblemente a cMEt con una Kd que es 10e-7 M o menos. La Kd está preferiblemente entre 10e-7 M y 10e-11 M. El segundo dominio variable preferiblemente tiene una mayor afinidad por cMET que la que tiene el primer dominio variable por EGFR. En otras palabras, en esta realización preferida, la Kd del anticuerpo para cMET es menor que la Kd del anticuerpo para EGFR. En una realización preferida, la Kd del anticuerpo para cMET es al menos 5 y preferiblemente al menos 10 veces menor que la Kd del anticuerpo para EGFR. En esta realización, los valores de Kd para los respectivos antígenos son preferiblemente los indicados en este párrafo. Este desequilibrio apropiado de afinidad permite que el anticuerpo biespecífico de la invención divulgada en este documento se acople a una célula, preferentemente a través de la unión a EGFR, y bloquee la unión del ligando HGF a cMET.

El dominio variable que puede unirse a EGFR es preferiblemente un dominio variable que, en el contexto de un anticuerpo monoespecífico bivalente, inhibe la muerte inducida por EGF de las células A431. La inhibición de la muerte celular inducida por EGF se mide preferiblemente a una concentración de 10 nM de EGF y 10 pg/mLde anticuerpo. La inhibición de la muerte celular inducida por EGF es detectable comparando el número de células con y sin el anticuerpo después de 3 a 7 días de cultivo de A431 en condiciones que son permisivas (excepto para el EGF) para el crecimiento de células A431. Sin limitarse a la teoría, se cree que la unión del anticuerpo al EGFR bloquea la unión del EGF al EGFR. El dominio variable que puede unirse a EGFR es preferiblemente un dominio variable que, en el contexto de un anticuerpo monoespecífico bivalente, inhibe la proliferación inducida por EGF de células BxPC3 o BxPC3-luc2.

Un anticuerpo de la invención como se divulga en este documento inhibe preferiblemente la migración inducida por HGF de células EBC1 en un ensayo de cicatrización de heridas. El ensayo de cicatrización de heridas es preferiblemente un ensayo como el descrito en los ejemplos. La inhibición de la cicatrización de heridas es mejor que la combinación de cetuximab y MetMab. La inhibición normalmente no es del 100 %. También se produce cierta cicatrización de heridas en presencia de un anticuerpo inhibidor.

Un anticuerpo de la invención como se divulga en este documento inhibe el crecimiento inducido por HGF y EGF/HGF de las líneas de células tumorales resistentes a TKI del EGFR PC-9 y HCC827 cuando se usa en combinación con un TKI. El TKI es preferiblemente gefitinib.

Un anticuerpo de la invención como se divulga en este documento inhibe el crecimiento inducido por HGF de una célula sensible al HGF, preferiblemente de la línea de células tumorales resistentes al TKI del EGFR PC-9 o HCC827.

Un anticuerpo de la invención como se divulga en este documento inhibe el crecimiento inducido por EGF de una célula sensible a EGF, sin inducir toxicidades comunes significativas tales como erupción cutánea y diarrea, etc., asociadas con anticuerpos EGFR bivalentes de alta afinidad. Esto hace que el anticuerpo sea ideal para combinarlo con TKI que tienen su propio perfil de toxicidad.

El crecimiento inducido se mide preferiblemente utilizando un ensayo como el descrito en los ejemplos. La inhibición normalmente no es del 100 %. También se produce cierto crecimiento en el contexto de un anticuerpo inhibidor.

El dominio variable que puede unirse a EGFR y que comprende la secuencia de aminoácidos de MF3370 o variante del mismo como se indica en este documento, se une preferiblemente al dominio III del EGFR (véase la tabla 4 de la solicitud de patente internacional PCT/NL2015/050124; WO2015/130172). La unión del dominio variable al EGFR puede inhibirse mediante cetuximab. El dominio variable se une a un epítopo que es diferente del epítopo que reconocen cetuximab y zalutumumab. Por ejemplo, el dominio variable se une al EGFR de ratón mientras que cetuximab y zalutumumab no lo hacen, lo que indica que uno o más de los residuos que difieren entre el dominio III del EGFR de ratón y humano juegan un papel en la unión de cetuximab y zalutumumab, pero no en un anticuerpo de la invención. Una ventaja de un anticuerpo biespecífico de la invención que tiene reactividad cruzada con EGFR humano, de ratón y de cynomolgus es que permite el uso de estudios de xenoinjerto con modelos de cáncer humano, que pueden ser más predictivos con respecto a la efectividad y toxicidad ya que el anticuerpo también se une a las células normales de ratón que tienen el receptor, mientras que también puede usarse en estudios de toxicología de cynomolgus. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio variable que puede unirse a una parte extracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR) y un segundo dominio variable que puede unirse a una parte extracelular del protooncogén MET humano, receptor de tirosina quinasa (cMET), en donde dicho primer dominio variable también puede unirse al EGFR de ratón, al EGFR de cynomolgus o a ambos.

Un dominio variable cMET comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos de MF4356 o una variante del mismo como se indica en este documento, y preferiblemente bloquea la unión del anticuerpo MetMab a cMET. El dominio variable bloquea preferiblemente la unión del ligando HGF a cMET El dominio variable bloquea la unión del anticuerpo MetMab a cMET cuando la unión de MetMab a cMET en condiciones de unión de la mitad del máximo se reduce en al menos un 40 % y preferiblemente al menos un 60 % en presencia de una cantidad saturante de dicho dominio variable. El dominio variable se proporciona preferiblemente en el contexto de un anticuerpo monoespecífico bivalente. El dominio variable cMET puede unirse preferiblemente al dominio sema de cMET. El dominio variable cMET de un anticuerpo según la invención puede competir con 5D5 por la unión a cMET o no competir con los anticuerpos de referencia anti-cMET informados, tales como 5D5. Véase la Tabla 2.

Un dominio variable de un anticuerpo como se reivindica en este documento puede unirse a EGFR (el primer dominio variable) y comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYGIS; una secuencia de CDR2 WISAYNGNTNYAQKLQG y una CDR3 que comprende la secuencia DRHWHWWLDAFDY; o una secuencia de CDR1 SYGIS; una secuencia de CDR2 WISAYNANTNYAQKLQG y una CDR3 que comprende la secuencia DRHWHWWLDAFDY

El primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de MF3370 o MF8233 como se representa en la figura 7 que tiene como máximo 10, preferiblemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 0, 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de los mismos con respecto a la secuencia indicada, por lo que dichas inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos no están dentro de las secuencias de CDR indicadas. En una realización preferida, el primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de MF3370 o MF8233 como se muestra en la figura 7.

El dominio variable que puede unirse a cMET (el segundo dominio variable) comprende preferiblemente una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de las secuencias de SEQ ID NO: 13 o 23 con 0-10, preferiblemente 0-5, inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos, en donde dichas inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos no están dentro de las secuencias de CDR indicadas. La región variable de cadena pesada del segundo dominio variable comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 23 con 0-10, preferiblemente 0-5 inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos, en donde dichas inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos no están dentro de las secuencias de CDR indicadas.

El primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYGIS; una secuencia de CDR2 WISAYNGNTNYAQKLQG y una C<d>R3 que comprende la secuencia DRHWHWWLDAFDY y en donde el segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYSMN; una secuencia de Cd R2 WINTYTGDPTYAQGFTG y una secuencia de CDR3 ETYYYDRGGYPFDP, en donde el primer y el segundo dominio variable comprenden una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos CDR1 - QSISSY, CDR2 - AAS, CDR3 - QQSYSTP

Un anticuerpo biespecífico según se reivindica comprende un primer dominio variable que puede unirse a una parte extracelular del EGFR y un segundo dominio variable que puede unirse a una parte extracelular de cMET, en donde el primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYGIS; una secuencia de CDR2 WISAYNANTNYAQKLQG y una CDR3 que comprende la secuencia DRHWHWWLDAFDY, y en donde el segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 TYSMN; una secuencia de CDR2 WINTYTGDPTYAQGFTG y una CDR3 que comprende la secuencia ETYFYDRGGYPFDP, en donde el primer y el segundo dominios variables comprenden además una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos CDR1 - QSISSY, CDR2 -AAS, CDR3 - QQSYSTP, es decir, las CDR de IGKV1-39 (según IMGT).

La CDR1, CDR2 y CDR3 de una cadena ligera del primer y segundo dominio variable como se describe en este documento comprenden respectivamente la secuencia de aminoácidos CDR1 - QSISSY, CDR2 - AAS, CDR3 - QQSYSTP, es decir, las CDR de IGKV1-39 (según IMGT). En algunas realizaciones de un anticuerpo biespecífico como se describe en este documento, el primer y el segundo dominio variable comprenden una cadena ligera común, preferiblemente una cadena ligera de la Figura 9B.

El término 'biespecífico' (bs) en el contexto de la presente invención significa que un anticuerpo es capaz de unirse a dos objetivos diferentes o dos epítopos en el mismo objetivo, donde un dominio variable del anticuerpo (como se definió anteriormente) se une a un epítopo en EGFR y un segundo dominio variable se une a un epítopo en cMET Dependiendo del nivel de expresión, la localización (sub)celular y la estequiometría de los dos antígenos reconocidos por un anticuerpo biespecífico, ambos brazos Fab del anticuerpo pueden o no unirse simultáneamente a su epítopo. Un brazo del anticuerpo biespecífico normalmente contiene el dominio variable de un anticuerpo y el otro brazo contiene el dominio variable de otro anticuerpo (es decir, un brazo del anticuerpo biespecífico está formado por una cadena pesada emparejada con una cadena ligera, mientras que el otro brazo está formado por una cadena pesada diferente emparejada con una cadena ligera). Por lo tanto, la estequiometría de un anticuerpo biespecífico preferido de la invención divulgada en el presente documento es 1:1, unión del EGFR:cMET

Las regiones variables de cadena pesada del anticuerpo biespecífico de la invención como se divulga en este documento son típicamente diferentes entre sí, mientras que las regiones variables de cadena ligera son preferiblemente las mismas. Un anticuerpo biespecífico en el que diferentes regiones variables de cadena pesada están asociadas con la misma región variable de cadena ligera también se denomina anticuerpo biespecífico con una región variable de cadena ligera común (cLcv). Se prefiere que la región constante de la cadena ligera también sea la misma. Se dice que estos anticuerpos biespecíficos tienen una cadena ligera común (cLc). Por lo tanto, se proporciona además un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención como se divulga en este documento, en donde ambos brazos comprenden una cadena ligera común.

El término 'cadena ligera común' según la invención divulgada en este documento se refiere a dos o más cadenas ligeras en un anticuerpo biespecífico que pueden ser idénticas o tener algunas diferencias en la secuencia de aminoácidos mientras que la especificidad de unión del anticuerpo de longitud completa no se ve afectada. Por ejemplo, es posible, dentro del alcance de la definición de cadenas ligeras comunes tal como se utiliza en este documento, preparar o encontrar cadenas ligeras que no sean idénticas pero que aún sean funcionalmente equivalentes, por ejemplo, introduciendo y probando cambios de aminoácidos conservadores, cambios de aminoácidos en regiones que no contribuyen o solo contribuyen parcialmente a la especificidad de unión cuando se combinan con la cadena pesada, y similares. Los términos 'cadena ligera común', 'LC común', 'cLC', 'cadena ligera única' con o sin la adición del término 'reordenada' se utilizan en este documento indistintamente. Los términos 'región variable de cadena ligera común', 'VL común', 'LCv común', 'cLCv', 'VL única' con o sin la adición del término 'reordenado' se utilizan en este documento indistintamente. Un aspecto preferido de la presente invención es que un anticuerpo biespecífico tenga una cadena ligera común (región variable) que pueda combinarse con al menos dos, y preferiblemente una pluralidad de cadenas pesadas (regiones variables) de diferente especificidad de unión para formar anticuerpos con dominios de unión a antígeno funcionales (por ejemplo, el documento WO2009/157771). La cadena ligera común (región variable) es preferiblemente una cadena ligera humana (región variable). Una cadena ligera común (región variable) preferiblemente tiene una secuencia de línea germinal. Una secuencia de línea germinal preferida es una región variable de cadena ligera que tiene buena estabilidad termodinámica, rendimiento y solubilidad. Una cadena ligera de línea germinal preferida es O12. Una cadena ligera común comprende preferiblemente la cadena ligera codificada por un segmento del gen Vk humano de línea germinal, y es preferiblemente la cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada IgVKl-39*01/IGJKl*01 (Figura 9A). La región variable de la cadena ligera común es preferiblemente la región variable de la cadena ligera kappa humana de la línea germinal reordenada IgVKl-39*01/IGJKl*01. Una cadena ligera común comprende preferiblemente una región variable de cadena ligera como se representa en la figura 9B o 9D con 0-5 inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos. La cadena ligera común comprende además preferiblemente una región constante de cadena ligera, preferiblemente una región constante de cadena ligera kappa. Un ácido nucleico que codifica la cadena ligera común puede optimizarse en codones para el sistema celular utilizado para expresar la proteína de la cadena ligera común. El ácido nucleico codificante puede desviarse de una secuencia de ácido nucleico de la línea germinal.

En una realización preferida, la cadena ligera comprende una región de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de un segmento del gen O l2 / IgVKl-39*01 como se representa en la figura 9A con 0-10, preferiblemente 0-5 inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos. La frase "cadena ligera O12" se utilizará a lo largo de la especificación como abreviatura de "una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de un segmento del gen 012 / IgVKl-39*01 como se muestra en la figura 9A con 0 10, preferiblemente 0-5 inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos". IgVK1-39 es la abreviatura de gen de inmunoglobulina variable kappa 1-39. El gen también se conoce como Inmunoglobulina Kappa Variable 1-39; IGKV139; IGKV1-39; O12a o 012. Los identificadores externos del gen son HGNC: 5740; Entrez Gene: 28930; Ensembl: ENSG00000242371. En la figura 9E se muestra una secuencia de aminoácidos preferida para IgVK1-39. En este documento se enumera la secuencia de la región V. La región V se puede combinar con una de las cinco regiones J. Las Figuras 9B y 9D describen dos secuencias preferidas para IgVK1-39 en combinación con una región J. Las secuencias unidas se indican como IGKV1-39/jk1 e lGKV1-39/jk5; los nombres alternativos son IgVK1-39*01/IGJK1*01 o IgVK1-39*01/IGJ<k>5*01 (nomenclatura según la base de datos IMGT en la red informática mundial en imgt.org).

Se prefiere que la región variable de cadena ligera que comprende O12 / IgVK1-39*01 sea una secuencia de línea germinal. Se prefiere además que la región variable de cadena ligera que comprende IGJ<k>1*01 o /IGJk5*01 sea una secuencia de línea germinal. En una realización preferida, las regiones variables de cadena ligera IGKV1-39/jk1 o IGKV1-39/jk5 son secuencias de línea germinal.

En una realización preferida, la región variable de la cadena ligera comprende una línea germinal O12/IgVK1-39*01. En una realización preferida, la región variable de la cadena ligera comprende la cadena ligera kappa IgVKl-39*01/IGJKl*01 o IgVKl-39*01/IGJK5*01. En una realización preferida, un IgVKl-39*01/IGJKl*01. La región variable de la cadena ligera comprende preferiblemente una cadena ligera kappa de línea germinal IgVKl-39*01/IGJKl*01 o una cadena ligera kappa de línea germinal IgVK1-39*01/IGJtó*01, preferiblemente una IgVKl-39*01/IGJKl*01 de línea germinal.

Las células B maduras que producen un anticuerpo con una cadena ligera 012 a menudo producen una cadena ligera que ha sufrido una o más mutaciones con respecto a la secuencia de la línea germinal, es decir, la secuencia normal en las células no linfoides del organismo. El proceso responsable de estas mutaciones a menudo se denomina (hiper)mutación somática. La cadena ligera resultante se denomina cadena ligera madurada por afinidad. Estas cadenas ligeras, cuando se derivan de una secuencia de línea germinal 012, son cadenas ligeras derivadas de O12. En esta especificación, la frase "cadena ligera común" incluirá "cadenas ligeras derivadas de la cadena ligera común" y la frase "cadenas ligeras O12" incluirá cadenas ligeras derivadas de O12. Las mutaciones que se introducen mediante hipermutación somática también pueden introducirse artificialmente en el laboratorio. En el laboratorio también se pueden introducir otras mutaciones sin afectar las propiedades de la cadena ligera en especie, no necesariamente en cantidad. Una cadena ligera es al menos una cadena ligera O12 si comprende una secuencia como la que se muestra en la figura 9A, figura 9B, figura 9D o figura 9E con 0-10, preferiblemente 0-5 inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos. En una realización preferida, la cadena ligera O12 es una cadena ligera que comprende una secuencia como la que se muestra en la figura 9A; 9B; 9D o 9E con 0-9, 0 8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4 inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos. En una realización preferida, la cadena ligera O12 es una cadena ligera que comprende una secuencia como la que se muestra en la figura 9A, figura 9B, figura 9D o figura 9E con 0-5, preferiblemente 0 4, más preferiblemente 0-3 inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos. En una realización preferida, la cadena ligera O12 es una cadena ligera que comprende una secuencia como la que se muestra en la figura 9A, figura 9B, figura 9D o figura 9E con 0-2, más preferiblemente 0-1, lo más preferiblemente 0 inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos. En una realización preferida, la cadena ligera O12 es una cadena ligera que comprende una secuencia como la que se representa en la figura 9A o la figura 9B con las inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos mencionadas o una combinación de las mismas. En una realización preferida, la cadena ligera comprende la secuencia de la figura 9A. En una realización preferida, la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de la figura 9B. Las sustituciones de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos mencionadas son preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas, las inserciones, eliminaciones, sustituciones o combinaciones de las mismas no están en la región CDR1, CDR2 o CDR3, y preferiblemente no en la región FR4 de la cadena VL.

La cadena ligera común puede tener una cadena ligera kappa. La parte constante de una cadena ligera común de la invención como se divulga en este documento puede ser una región constante de una cadena ligera kappa o lambda. Se trata preferiblemente de una región constante de una cadena ligera kappa, preferiblemente en donde dicha cadena ligera común es una cadena ligera de línea germinal, preferiblemente una cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada que comprende el segmento del gen IgVKl-39, más preferiblemente la cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada IgVKl-39*01/IGJKl*01 (Figura 9). Los términos cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada IgVK1-39*01/IGJK1*01, IGKV1-39/IGKJ1, cadena ligera huVK1-39 o, de forma abreviada, huVK1-39, o simplemente 1-39 se utilizan indistintamente en toda la solicitud.

Una célula que produce una cadena ligera común puede producir, por ejemplo, una cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada IgVK1-39*01/IGJK1*01 y una cadena ligera que comprende la región variable de la cadena ligera mencionada fusionada a una región constante lambda.

En una realización preferida, la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK o DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK con 0-10, preferiblemente 0-5 inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos, en donde dichas inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos no están dentro de las secuencias de CDR indicadas. En una realización preferida, la región variable de cadena ligera comprende 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4, preferiblemente 0-3, preferiblemente 0-2, preferiblemente 0-1 y preferiblemente 0 inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos indicada, o una combinación de las mismas, por lo que dichas inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos no están dentro de las secuencias de CDR indicadas. Una combinación de inserción, eliminación, adición o sustitución es una combinación como se reivindica si las secuencias alineadas no difieren en más de 5 posiciones. En una realización preferida, la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK o DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK. En una realización preferida, la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK. En otra realización preferida, la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK.

Las inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones o combinaciones de aminoácidos no están en la región CDR3 de la región variable de la cadena ligera, ni en la región CDR1 o CDR2 de la región variable de la cadena ligera. En una realización preferida, la región variable de cadena ligera no comprende una eliminación, adición o inserción con respecto a la secuencia indicada. Una sustitución de aminoácidos es preferiblemente una sustitución de aminoácidos conservadora. La CDR1, CDR2 y CDR3 de una cadena ligera de un anticuerpo de la invención comprenden respectivamente la secuencia de aminoácidos CDR1 - QSISSY, CDR2 - AAS, CDR3 - QQSYSTP, es decir, las CDR de IGKV1-39 (según IMGT).

Los anticuerpos biespecíficos como se describe en este documento tienen una combinación de región variable de cadena pesada/región variable de cadena ligera (VH/VL) que se une a una parte extracelular del EGFR y una segunda combinación VH/VL que se une a una parte extracelular de cMET. En una realización preferida, la VL en dicha primera combinación VH/VL es similar a la VL en dicha segunda combinación VH/v L. En una realización más preferida, las VL en la primera y segunda combinación VH/VL son idénticas. En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo de longitud completa que tiene una combinación de cadena pesada/ligera (H/L) que se une a una parte extracelular del EGFR y una combinación de cadena H/L que se une a una parte extracelular de cMET. En una realización preferida, la cadena ligera en dicha primera combinación de cadena H/L es similar a la cadena ligera en dicha segunda combinación de cadena H/L. En una realización más preferida, las cadenas ligeras en la primera y segunda combinaciones de cadenas H/L son idénticas.

Se han publicado varios métodos para producir una célula huésped cuya expresión favorezca la producción del anticuerpo biespecífico o viceversa, los anticuerpos monoespecíficos. Se prefiere que la expresión celular de las moléculas de anticuerpos se favorezca hacia la producción del anticuerpo biespecífico sobre la producción de los respectivos anticuerpos monoespecíficos. Esto se logra típicamente modificando la región constante de las cadenas pesadas de modo que favorezcan la heterodimerización (es decir, la dimerización con la cadena pesada de la otra combinación de cadena pesada/ligera) sobre la homodimerización. En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico de la invención como se divulga en este documento comprende dos cadenas pesadas de inmunoglobulina diferentes con dominios de heterodimerización compatibles. Se han descrito en la técnica varios dominios de heterodimerización compatibles. Los dominios de heterodimerización compatibles son preferiblemente dominios de heterodimerización CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina compatibles. Cuando se utilizan dominios CH3 de tipo silvestre, la coexpresión de dos cadenas pesadas diferentes (A y B) y una cadena ligera común dará como resultado tres especies de anticuerpos diferentes, AA, AB y BB. AA y b B son designaciones para los dos anticuerpos monoespecíficos y bivalentes, y AB es una designación para el anticuerpo biespecífico. Para aumentar el porcentaje del producto biespecífico deseado (AB) se puede emplear la ingeniería CH3, o, en otras palabras, se pueden utilizar cadenas pesadas con dominios de heterodimerización compatibles, como se define a continuación. La técnica describe varias formas en las que se puede lograr dicha heterodimerización de cadenas pesadas. Una forma de hacerlo es generar anticuerpos biespecíficos del tipo 'botón en ojal'.

El término 'dominios de heterodimerización compatibles' como se utiliza en este documento se refiere a dominios de proteínas que están diseñados de tal manera que el dominio diseñado A' formará preferentemente heterodímeros con el dominio diseñado B' y viceversa, la homodimerización entre A'-A' y B'-B' se ve disminuida.

En los documentos US13/866,747 (ahora publicado como US 9,248,181), US14/081,848 (ahora publicado como US 9,358,286) y PCT/NL2013/050294 (publicado como WO2013/157954 se divulgan métodos y medios para producir anticuerpos biespecíficos utilizando dominios de heterodimerización compatibles. Estos medios y métodos también pueden emplearse favorablemente en la presente invención. Específicamente, un anticuerpo biespecífico de la invención como se divulga en este documento comprende preferiblemente mutaciones para producir una expresión sustancial de moléculas de IgG biespecíficas de longitud completa en células huésped. Las mutaciones preferidas son las sustituciones de aminoácidos L351K y T366K en el primer dominio CH3 (la cadena pesada de la 'variante KK') y las sustituciones de aminoácidos L351D y L368E en el segundo dominio (la cadena pesada de la 'variante DE'), o viceversa. Las patentes US 9,248,181 y US 9,358,286, así como la solicitud PCT WO2013/157954 demuestran que la variante DE y la variante KK se emparejan preferentemente para formar heterodímeros (las denominadas moléculas biespecíficas 'DEKK'). La homodimerización de cadenas pesadas variantes DE (homodímeros DEDE) se ve desfavorecida debido a la repulsión entre los residuos cargados en la interfaz CH3-CH3 entre cadenas pesadas idénticas.

Los anticuerpos biespecíficos se pueden generar mediante la transfección (transitoria) de plásmidos que codifican una cadena ligera y dos cadenas pesadas diferentes que están diseñadas mediante CH3 para garantizar una heterodimerización eficiente y la formación de los anticuerpos biespecíficos. La producción de estas cadenas en una sola célula conduce a la formación favorecida de anticuerpos biespecíficos frente a la formación de anticuerpos monoespecíficos. Las mutaciones preferidas para producir esencialmente sólo moléculas de IgG1 de longitud completa biespecíficas son las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 351 y 366, e.g., L351K y T366K (numeración según la numeración de la UE) en el primer dominio CH3 (la cadena pesada de la 'variante KK') y las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 351 y 368, por ejemplo, L351D y L368E en el segundo dominio CH3 (la cadena pesada de la 'variante DE'), o viceversa (véanse, por ejemplo, las figuras 10E y 10F).

En una realización, la combinación de cadena pesada/cadena ligera que comprende el dominio variable que se une a EGFR, comprende una variante DE de la cadena pesada. En esta realización, la combinación de cadena pesada/cadena ligera que comprende el dominio variable que puede unirse a cMET comprende una variante KK de la cadena pesada. La variante KK de la cadena pesada que se une a cMET no produce homodímeros, lo que hace que el efecto observado de la inhibición de la activación de cMET inducida por HGF por el anticuerpo biespecífico sea muy preciso. Evita la activación de cMET que a veces se observa con anticuerpos cMET bivalentes (agonismo).

La región Fc media las funciones efectoras de un anticuerpo, como la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). Dependiendo de la aplicación del anticuerpo terapéutico o de la proteína de fusión Fc, puede ser deseable reducir o aumentar la función efectora. Puede desearse una función efectora reducida cuando se desea activar, mejorar o estimular una respuesta inmune como en algunas de las realizaciones de la invención como se divulga en este documento. Los anticuerpos con funciones efectoras reducidas se pueden utilizar para atacar moléculas de la superficie celular de las células inmunes, entre otras.

Los anticuerpos con funciones efectoras reducidas son preferiblemente anticuerpos IgG que comprenden una región de bisagra inferior/CH2 modificada, por ejemplo, para reducir la interacción del receptor Fc o para reducir la unión de C1q. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo IgG con un dominio CH2 mutante y/o de bisagra inferior, de modo que se reduce la interacción del anticuerpo IgG biespecífico con un receptor Fc-gamma. Un anticuerpo que comprende una región CH2 mutante es preferiblemente un anticuerpo IgG1. Tal dominio de bisagra inferior y/o CH2 de IgG1 mutante preferiblemente comprende una sustitución de amino en la posición 235 y/o 236 (numeración de la UE), preferiblemente una sustitución L235G y/o G236R (Figura 10D).

Un anticuerpo de la invención como se divulga en este documento preferiblemente tiene función efectora. Un anticuerpo biespecífico de la invención como se divulga en este documento comprende preferiblemente citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). El anticuerpo se puede diseñar para mejorar la actividad de ADCC (para una revisión, ver Cancer Sci. 2009 Sep; 100(9): 1566-72. Anticuerpos terapéuticos diseñados con funciones efectoras mejoradas. Kubota T, Niwa R, Satoh M, Akinaga S, Shitara K, Hanai N). Existen varios métodosin vitropara determinar la eficacia de los anticuerpos o células efectoras para provocar ADCC. Entre estos se encuentran los ensayos de liberación de cromo-51 [Cr51], los ensayos de liberación de europio [Eu] y los ensayos de liberación de azufre-35 [S35]. Generalmente, una línea celular objetivo marcada que expresa un determinado antígeno expuesto en la superficie se incuba con un anticuerpo específico para ese antígeno. Después del lavado, las células efectoras que expresan el receptor Fc CD16 se incuban junto con las células diana marcadas con anticuerpos. La lisis de la célula diana se mide posteriormente mediante la liberación de una etiqueta intracelular mediante un contador de centelleo o espectrofotometría. En un aspecto, un anticuerpo biespecífico de la invención como se divulga en este documento exhibe actividad de ADCC. En tal aspecto, el anticuerpo biespecífico puede tener una actividad de ADCC mejorada. En otro aspecto, un anticuerpo biespecífico de la invención como se divulga en este documento no exhibe actividad de ADCC. En tal aspecto, el anticuerpo puede tener ADCC reducida por medio de una o más mutaciones CH2 como se describe en otra parte del presente documento y mediante técnicas conocidas en la materia. Una técnica para mejorar la ADCC de un anticuerpo es la afucosilación. (Véase por ejemplo Junttila, T.T., K. Parsons, et al. (2010). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer". Cancer Research 70(11): 4481-4489). Por lo tanto, se proporciona además un anticuerpo biespecífico según la invención como se divulga en este documento, que está afucosilado. Como alternativa, o adicionalmente, se pueden utilizar múltiples otras estrategias para lograr la mejora de la ADCC, incluyendo, por ejemplo, la glicoingeniería (Kyowa Hakko/Biowa, GlycArt (Roche) y Eureka Therapeutics) y la mutagénesis, todas las cuales buscan mejorar la unión de Fc al FcyRIIIa activador de baja afinidad, y/o reducir la unión al FcyRIIb inhibidor de baja afinidad. Un anticuerpo biespecífico de la invención como se divulga en este documento está preferiblemente afucosilado para mejorar la actividad de ADCC. Un anticuerpo biespecífico de la invención como se divulga en este documento comprende preferiblemente una cantidad reducida de fucosilación de la estructura de carbohidrato ligada a N en la región Fc, en comparación con el mismo anticuerpo producido en una célula CHO normal.

Una variante de un anticuerpo o anticuerpo biespecífico como se describe en este documento comprende una parte funcional, un derivado y/o un análogo del anticuerpo o anticuerpo biespecífico. La variante mantiene la especificidad de unión del anticuerpo (biespecífico). La parte funcional, derivada y/o análoga mantiene la especificidad de unión del anticuerpo (biespecífico). La especificidad de unión se define por la capacidad de unir una parte extracelular de una primera proteína de membrana y una segunda proteína de membrana como se describe en este documento.

Un anticuerpo biespecífico de la invención se utiliza preferiblemente en seres humanos. Un anticuerpo preferido de la invención es un anticuerpo humano o humanizado. La región constante de un anticuerpo biespecífico de la invención es preferiblemente una región constante humana. La región constante puede contener una o más, preferiblemente no más de 10, preferiblemente no más de 5 diferencias de aminoácidos con la región constante de un anticuerpo humano de origen natural. Se prefiere que la parte constante se derive íntegramente de un anticuerpo humano de origen natural. Varios anticuerpos producidos en este documento se derivan de una biblioteca de dominios variables de anticuerpos humanos. Como tales, estos dominios variables son humanos. Las regiones CDR únicas pueden derivarse de humanos, ser sintéticas o derivarse de otro organismo. La región variable se considera una región variable humanizada cuando tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región variable de un anticuerpo humano natural, pero para las regiones CDR. En dichas realizaciones, la VH de un dominio variable de un anticuerpo que se une a EGFR o cMET de la invención puede contener una o más, preferiblemente no más de 10, preferiblemente no más de 5 diferencias de aminoácidos con la región variable de un anticuerpo humano de origen natural, sin contar las posibles diferencias en la secuencia de aminoácidos de las regiones CDR. La región variable de cadena ligera de un dominio de unión del EGFR y/o un dominio de unión de cMET en un anticuerpo de la invención puede contener una o más, preferiblemente no más de 10, preferiblemente no más de 5 diferencias de aminoácidos con la región variable de un anticuerpo humano de origen natural, sin contar las posibles diferencias en la secuencia de aminoácidos de las regiones CDR. La cadena ligera de un anticuerpo de la invención puede contener una o más, preferiblemente no más de 10, preferiblemente no más de 5 diferencias de aminoácidos con la región variable de un anticuerpo humano de origen natural, sin contar las posibles diferencias en la secuencia de aminoácidos de las regiones CDR. Estas mutaciones también ocurren en la naturaleza en el contexto de la hipermutación somática.

Los anticuerpos pueden derivarse de varias especies animales, al menos con respecto a la región variable de cadena pesada. Es una práctica común humanizar, e.g., las regiones variables de la cadena pesada murina. Hay varias formas en las que esto se puede lograr, entre las que se encuentran el injerto de CDR en una región variable de cadena pesada humana con una estructura 3D que coincide con la estructura 3D de la región variable de cadena pesada murina; la desinmunización de la región variable de cadena pesada murina, preferiblemente realizada mediante la eliminación de epítopos de células T o B conocidos o sospechosos de la región variable de cadena pesada murina. La eliminación se realiza típicamente sustituyendo uno o más de los aminoácidos del epítopo por otro aminoácido (normalmente conservador), de modo que la secuencia del epítopo se modifica de modo que ya no sea un epítopo de células T o B.

Las regiones variables de cadena pesada murina desinmunizadas son menos inmunogénicas en humanos que la región variable de cadena pesada murina original. Preferiblemente, una región o dominio variable de la invención como se divulga en este documento se humaniza aún más, tal como por ejemplo se recubre. Al utilizar técnicas de recubrimiento, los residuos externos que el sistema inmunológico encuentra fácilmente se reemplazan selectivamente con residuos humanos para proporcionar una molécula híbrida que comprende una superficie recubierta débilmente inmunogénica o sustancialmente no inmunogénica. Un animal como el utilizado en la invención tal como se divulga en este documento es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un primate, lo más preferiblemente un ser humano.

Un anticuerpo biespecífico según la invención tal como se reivindica en el presente documento comprende preferiblemente una región constante de un anticuerpo humano. Según las diferencias en sus dominios constantes de cadena pesada, los anticuerpos se agrupan en cinco clases o isotipos: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Estas clases o isotipos comprenden al menos una de dichas cadenas pesadas que se nombra con una letra griega correspondiente. Una realización preferida comprende un anticuerpo en donde dicha región constante se selecciona del grupo de regiones constantes IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, más preferiblemente dicha región constante comprende una región constante IgG, es decir, seleccionada del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Preferiblemente, dicha región constante es una región constante IgG1 o IgG4, más preferiblemente una región constante IgG1 mutada. Algunas variaciones en la región constante de IgG1 ocurren en la naturaleza y/o se permiten sin cambiar las propiedades inmunológicas del anticuerpo resultante. También se puede introducir variación artificialmente para instalar ciertas características preferidas en el anticuerpo o partes del mismo. Estas características se describen en este documento, por ejemplo, en el contexto de CH2 y CH3. Normalmente se permiten entre aproximadamente 1-10 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de ellas en la región constante.

Una cadena VH de la Figura 1, 7 u 8 preferiblemente tiene como máximo 15, preferiblemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de los mismos con respecto a la cadena VH representada en las Figuras 1, 7 u 8, preferiblemente tiene 0, 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de los mismos con respecto a la cadena VH representada en las Figuras 1, 7 u 8, preferiblemente 0, 1, 2, 3 o 4 inserciones, eliminaciones, sustituciones o una combinación de las mismas, preferiblemente 0, 1, 2 o 3 inserciones, eliminaciones, sustituciones o una combinación de las mismas, más preferiblemente 0; 1 o 2 inserciones, eliminaciones, sustituciones o una combinación de las mismas, y preferiblemente 0 o 1 inserción, eliminación, sustitución o una combinación de las mismas con respecto a la cadena VH representada en las Figuras 1, 7 u 8. Las una o más inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de los mismos no están en la región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena VH. También es preferible que no estén presentes en la región Fr4. Una sustitución de aminoácidos es preferiblemente una sustitución de aminoácidos conservadora.

Los métodos racionales han evolucionado hacia la minimización del contenido de residuos no humanos en el contexto humano. Hay varios métodos disponibles para injertar con éxito la propiedad de unión al antígeno de un anticuerpo en otro anticuerpo. Las propiedades de unión de los anticuerpos pueden depender predominantemente de la secuencia exacta de la región CDR3, a menudo respaldada por la secuencia de las regiones CDR1 y CDR2 en el dominio variable combinada con la estructura apropiada del dominio variable en su conjunto. La secuencia de aminoácidos de una región CDR como se muestra en este documento, determinada con la definición de Kabat. Actualmente existen varios métodos disponibles para injertar regiones CDR en un dominio variable adecuado de otro anticuerpo. Algunos de estos métodos se analizan en JC Almagro and J. Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633. Por lo tanto, la invención proporciona además un anticuerpo biespecífico humano o humanizado que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión a antígeno que se une a cMET, en donde el dominio variable que comprende el sitio de unión a EGFR comprende una secuencia de CDR3 de VH como se representa para MF3370 en la Figura 1, y en donde el dominio variable que comprende el sitio de unión a cMET comprende una región CDR3 de VH como se representa para MF4356 en la Figura 1. La región variable VH que comprende el sitio de unión del EGFR comprende preferiblemente la secuencia de la región CDR1, la región CDR2 y la región CDR3 de una cadena VH como se muestra para MF3370 en la Figura 1. La región variable VH que comprende el sitio de unión de cMET comprende preferiblemente la secuencia de la región CDR1, la región CDR2 y la región CDR3 de una cadena VH como se muestra para MF4356 en la Figura 1. El injerto de CDR también se puede utilizar para producir una cadena VH con las regiones CDR de un VH de la Figura 1, pero que tenga una estructura diferente. El marco diferente puede ser de otro VH humano o de un mamífero diferente. Por lo tanto, la invención proporciona además un anticuerpo biespecífico humano o humanizado que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión a antígeno que se une a cMET, en donde el dominio variable que comprende el sitio de unión a EGFR comprende una secuencia de CDR3 de VH como se representa para MF8233 en la Figura 7, y en donde el dominio variable que comprende el sitio de unión a cMET comprende una región CDR3 de VH como se representa para MF8230 en la Figura 8. La región variable VH que comprende el sitio de unión del EGFR comprende preferiblemente la secuencia de la región CDR1, la región CDR2 y la región CDR3 de una cadena VH como se muestra para MF8233 en la Figura 7. La región variable VH que comprende el sitio de unión de cMET comprende preferiblemente la secuencia de la región CDR1, la región CDR2 y la región CDR3 de una cadena VH como se muestra para MF8230 en la Figura 8. El injerto de CDR también se puede utilizar para producir una cadena VH con las regiones CDR de un VH de la Figura 7 o la Figura 8, pero que tienen un marco diferente. El marco diferente puede ser de otro VH humano o de un mamífero diferente.

Por lo tanto, la invención proporciona además un anticuerpo biespecífico humano o humanizado que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión a antígeno que se une a cMET, en donde el dominio variable que comprende el sitio de unión del EGFR comprende una secuencia de CDR1, CDR2 y CDR3 de VH como se representa para MF3370 en la Figura 1, y en donde el dominio variable que comprende el sitio de unión de cMET comprende una región CDR1, CDR2 y CDR3 de VH como se representa para MF8230 en la Figura 8. El injerto de CDR también se puede utilizar para producir una cadena VH con las regiones CDR de un VH de la Figura 7 o la Figura 8, pero que tienen un marco diferente. El marco diferente puede ser de otro VH humano o de un mamífero diferente.

Por lo tanto, la invención proporciona además un anticuerpo biespecífico humano o humanizado que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión a antígeno que se une a cMET, en donde el dominio variable que comprende el sitio de unión del EGFR comprende una secuencia de CDR1, CDR2 y CDR3 de VH como se representa para MF8233 en la Figura 7, y en donde el dominio variable que comprende el sitio de unión de cMET comprende una región CDR1, CDR2 y CDR3 de VH como se representa para MF4356 en la Figura 8. El injerto de CDR también se puede utilizar para producir una cadena VH con las regiones CDR de un VH de la Figura 7 o Figura 8, pero que tienen un marco diferente. El marco diferente puede ser de otro VH humano o de un mamífero diferente.

La invención proporciona además un anticuerpo biespecífico humano o humanizado que comprende un primer dominio variable que se une a EGFR y un segundo dominio variable que se une a cMET, en donde el primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de MF3370 como se muestra en la figura 7 que tiene como máximo 10, preferiblemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 0, 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de los mismos y en donde el segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de MF4356 que se muestra en la figura 8 (SEQ ID NO: 23) con 0-10, preferiblemente 0-5, inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos, en donde dichas inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos no están dentro de las secuencias de CDR indicadas. La invención proporciona además un anticuerpo biespecífico humano o humanizado que comprende un primer dominio variable que se une a EGFR y un segundo dominio variable que se une a cMET, en donde el primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de MF8233 como se muestra en la figura 7 que tiene como máximo 10, preferiblemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 0, 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de los mismos y en donde el segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de MF8230 representada en la figura 8 (SEQ ID NO: 13) con 0-10, preferiblemente 0-5, inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos, en donde dichas inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos no están dentro de las secuencias de CDR indicadas.

Las 15 sustituciones de aminoácidos mencionadas como máximo, preferiblemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente 0, 1, 2, 3, 4 o 5, son preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas, las inserciones, eliminaciones, sustituciones o una combinación de las mismas no están en la región CDR1, CDR2 o CDR3 de la cadena VH y preferiblemente no en la región FR4.

Hay varios métodos disponibles para producir anticuerpos biespecíficos. Un método implica la expresión de dos cadenas pesadas diferentes y dos cadenas ligeras diferentes en una célula y la recolección de anticuerpos producidos por la célula. Los anticuerpos producidos de esta manera generalmente contendrán una colección de anticuerpos con diferentes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras, algunas de las cuales son el anticuerpo biespecífico deseado. El anticuerpo biespecífico se puede purificar posteriormente de la colección. La proporción de anticuerpos biespecíficos con respecto a otros que produce la célula se puede aumentar de diversas maneras. En una realización preferida, la proporción aumenta expresando no dos cadenas ligeras diferentes sino una cadena ligera común en la célula. Cuando una cadena ligera común se expresa con dos cadenas pesadas diferentes, la proporción entre el anticuerpo biespecífico y el otro anticuerpo producido por la célula mejora significativamente con respecto a la expresión de dos cadenas ligeras diferentes. La proporción de anticuerpos biespecíficos que produce la célula se puede mejorar aún más estimulando el emparejamiento de dos cadenas pesadas diferentes entre sí en lugar del emparejamiento de dos cadenas pesadas idénticas. Se divulgan métodos y medios para producir anticuerpos biespecíficos (a partir de una sola célula), mediante lo cual se proporcionan medios que favorecen la formación de anticuerpos biespecíficos sobre la formación de anticuerpos monoespecíficos. Estos métodos también pueden emplearse favorablemente para producir anticuerpos biespecíficos de la presente invención. Así, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para producir un anticuerpo biespecífico a partir de una sola célula, en donde dicho anticuerpo biespecífico comprende dos dominios CH3 que son capaces de formar una interfaz, comprendiendo dicho método proporcionar en dicha célula a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica un 1er dominio CH3 que comprende una cadena pesada, b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un 2do dominio CH3 que comprende una cadena pesada, en donde dichas moléculas de ácido nucleico están provistas de medios para el emparejamiento preferencial de dicho 1er y 2do dominio CH3 que comprenden cadenas pesadas, comprendiendo además dicho método la etapa de cultivar dicha célula huésped y permitir la expresión de dichas dos moléculas de ácido nucleico y recoger dicho anticuerpo biespecífico del cultivo. Dichas primera y segunda moléculas de ácido nucleico pueden ser parte de la misma molécula de ácido nucleico, vector o vehículo de administración de genes y pueden estar integradas en el mismo sitio del genoma de la célula huésped. Alternativamente, dichas primera y segunda moléculas de ácido nucleico se proporcionan por separado a dicha célula.

Se describe en el presente documento un método para producir un anticuerpo biespecífico según la invención como se divulga en el presente documento a partir de una sola célula, en donde dicho anticuerpo biespecífico comprende dos dominios CH3 que son capaces de formar una interfaz, comprendiendo dicho método proporcionar:

- una célula que tiene a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a EGFR y que contiene un primer dominio CH3, y b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a ErbB-3 y que contiene un segundo dominio CH3, en donde dichas moléculas de ácido nucleico están provistas de medios para el emparejamiento preferencial de dichos primer y segundo dominios CH3,

dicho método comprende además la etapa de cultivar dicha célula y permitir la expresión de las proteínas codificadas por dichas dos moléculas de ácido nucleico y recolectar dicho anticuerpo IgG biespecífico del cultivo. En una realización particularmente preferida, dicha célula también tiene una tercera molécula de ácido nucleico que codifica una cadena ligera común. Dicha primera, segunda y tercera molécula de ácido nucleico pueden ser parte de la misma molécula de ácido nucleico, vector o vehículo de administración de genes y pueden estar integradas en el mismo sitio del genoma de la célula huésped. Alternativamente, dichas primera, segunda y tercera moléculas de ácido nucleico se proporcionan por separado a dicha célula. Una cadena ligera común preferida se basa en 012, preferiblemente es la cadena ligera kappa humana de la línea germinal reordenada IgVKl 39*01/IGJk1*01, como se describió anteriormente. Los medios para el emparejamiento preferencial de dicho primer y segundo dominio CH3 son preferiblemente las mutaciones correspondientes en el dominio CH3 de las regiones codificantes de la cadena pesada. Las mutaciones preferidas para producir preferentemente anticuerpos biespecíficos son las sustituciones de aminoácidos L351K y T366K (numeración de la UE) en el primer dominio CH3 y las sustituciones de aminoácidos L351D y L368E en el segundo dominio CH3, o viceversa. Además, se proporciona en este documento un método para producir un anticuerpo biespecífico como se reivindica, en donde dicho primer dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351K y T366K (numeración de la UE) y en donde dicho segundo dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351D y L368E, comprendiendo además dicho método la etapa de cultivar dicha célula y permitir la expresión de proteínas codificadas por dichas moléculas de ácido nucleico y recolectar dicho anticuerpo biespecífico del cultivo. También se proporciona un método para producir un anticuerpo biespecífico, en donde dicho primer dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351D y L368e (numeración de la UE) y en donde dicho segundo dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351K y T366K, comprendiendo además dicho método la etapa de cultivar dicha célula y permitir la expresión de dichas moléculas de ácido nucleico y recolectar dicho anticuerpo biespecífico del cultivo. Los anticuerpos que se pueden producir mediante estos métodos también son parte de la presente invención. Los dominios de heterodimerización CH3 son preferiblemente dominios de heterodimerización IgG1. Las regiones constantes de cadena pesada que comprenden los dominios de heterodimerización CH3 son preferiblemente regiones constantes IgG1.

Se describe además una molécula de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de un anticuerpo. La molécula de ácido nucleico (normalmente una molécula de ácido nucleicoin vitro,aislada o recombinante) codifica preferiblemente una región variable de cadena pesada como se representa en la Figura 7 o la Figura 8, o una región variable de cadena pesada como se representa en la Figura 7 o la Figura 8 que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de los mismos. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en la Figura 7 o la Figura 8. La optimización del codón está optimizada para la especie y/o el tipo de célula de la célula productora de anticuerpos. Por ejemplo, para la producción de CHO, la secuencia de ácido nucleico de la molécula está optimizada en codones para las células de hámster chino. Se describe además una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de la Figura 7 o la Figura 8.

Una molécula de ácido nucleico como se divulga en este documento es típicamente, pero no exclusivamente, un ácido ribonucleico (ARN) o un ácido desoxirribonucleico (ADN). Hay ácidos nucleicos alternativos disponibles para una persona experta en la materia. Un ácido nucleico como se divulga en este documento está comprendido, por ejemplo, en una célula. Cuando dicho ácido nucleico se expresa en dicha célula, dicha célula puede producir un anticuerpo según una invención. Por lo tanto, la divulgación incluye una célula que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención y/o un ácido nucleico como se divulga en este documento. Dicha célula es preferiblemente una célula animal, más preferiblemente una célula de mamífero, más preferiblemente una célula de primate, lo más preferiblemente una célula humana. Una célula adecuada es cualquier célula capaz de comprender y preferiblemente producir un anticuerpo como se reivindica en este documento y/o un ácido nucleico como se divulga en este documento.

Se describe además una célula que comprende un anticuerpo como se reivindica en este documento. Preferiblemente, dicha célula (normalmente una célulain vitro,aislada o recombinante) produce dicho anticuerpo. Dicha célula también puede ser una célula almacenada que es capaz de producir dicho anticuerpo cuando se saca del almacenamiento y se cultiva. En una realización preferida, dicha célula es una célula de hibridoma, una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula NS0 o una célula PER-C6™. En una realización particularmente preferida dicha célula es una célula CHO. Además, se proporciona un cultivo celular que comprende una célula como se divulga en este documento. Varias instituciones y empresas han desarrollado líneas celulares para la producción a gran escala de anticuerpos, por ejemplo, para uso clínico. Ejemplos no limitantes de dichas líneas celulares son las células CHO, las células NS0 o las células PER.C6™. Estas células también se utilizan para otros fines, como la producción de proteínas. Las líneas celulares desarrolladas para la producción a escala industrial de proteínas y anticuerpos se denominarán en adelante líneas celulares industriales. Por lo tanto, una realización preferida incluye el uso de una línea celular desarrollada para la producción a gran escala de anticuerpos para la producción de un anticuerpo como se reivindica en este documento, que incluye preferiblemente una célula para producir un anticuerpo que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una VH, una VL y/o una cadena pesada de MF3370 y MF4356 como se representa en la Figura 7 o la Figura 8.

Se describe además en este documento un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar una célula como se divulga en este documento y recolectar dicho anticuerpo de dicho cultivo. Preferiblemente dicha célula se cultiva en un medio libre de suero. Preferiblemente dicha célula está adaptada para el crecimiento en suspensión. Además, se proporciona un anticuerpo que se puede obtener mediante un método para producir un anticuerpo como se reivindica en este documento. El anticuerpo se purifica preferiblemente del medio de cultivo. Preferiblemente dicho anticuerpo está purificado por afinidad.

Una célula como se divulga en este documento es, por ejemplo, una línea celular de hibridoma, una célula CHO, una célula 293F, una célula NS0 u otro tipo de célula conocido por su idoneidad para la producción de anticuerpos para fines clínicos. En una realización particularmente preferida dicha célula es una célula humana. Preferiblemente una célula que es transformada por una región E1 de adenovirus o un equivalente funcional de la misma. Un ejemplo preferido de dicha línea celular es la línea celular PER.C6TM o equivalente de la misma. En una realización particularmente preferida, dicha célula es una célula CHO o una variante de la misma. Preferiblemente una variante que hace uso de un sistema de vector de glutamina sintetasa (GS) para la expresión de un anticuerpo.

Los anticuerpos como se reivindican en este documento se pueden producir a niveles > 50 mg/L después de la transfección transitoria en células 293F en suspensión. Los anticuerpos biespecíficos se pueden purificar hasta una pureza superior al 98 % con rendimientos > 70 %. Los estudios de caracterización analítica muestran perfiles de anticuerpos IgG1 biespecíficos que son comparables a los de la IgG1 monoespecífica bivalente. En términos de actividad funcional, un anticuerpo biespecífico como el reivindicado en este documento puede demostrar una potencia superior en comparación con cetuximabin vitroein vivo.

Se describe además en este documento una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con una invención como se divulga en este documento. La composición farmacéutica comprende preferiblemente un excipiente o vehículo preferiblemente farmacéuticamente aceptable.

Un anticuerpo puede incluir una etiqueta, preferiblemente una etiqueta para obtención de imágenesin vivo.Normalmente, dicha etiqueta no es necesaria para aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, en un entorno de diagnóstico, una etiqueta puede ser útil. Por ejemplo, en la visualización de células diana en el cuerpo. Existen diversas etiquetas adecuadas y muchas de ellas son bien conocidas en la técnica. En una realización preferida, la etiqueta es una etiqueta radiactiva para detección. En otra realización preferida, la etiqueta es una etiqueta infrarroja. Preferiblemente, la etiqueta infrarroja es adecuada para la obtención de imágenesin vivo.El experto en la materia dispone de diversas etiquetas infrarrojas. Las etiquetas infrarrojas preferidas son, por ejemplo, IRDye 800; IRDye 680RD; IRDye 680LT; IRDye 750; IRDye 700DX; IRDye 800RS IRDye 650; IRDye 700 fosforamidita; IRDye 800 fosforamidita (LI-COR USA; 4647 Superior Street; Lincoln, Nebraska).

La invención proporciona además un anticuerpo como se reivindica en este documento para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor. El tumor es preferiblemente un tumor positivo para EGFR, cMET o EGFR/cMET Antes de iniciar dicho tratamiento, el método preferentemente comprende además determinar si dicho sujeto tiene dicho tumor positivo para EGFR, cMET o EGFR/cMET La invención proporciona además un anticuerpo como se reivindica o una composición farmacéutica como se divulga en este documento para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un tumor positivo para EGFR, cMET o EGFR/cMET.

Para establecer si un tumor es positivo para EGFR, el experto puede, por ejemplo, determinar la amplificación del EGFR y/o la tinción inmunohistoquímica. Al menos el 10 % de las células tumorales en una biopsia deben ser positivas. La biopsia también puede contener 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % o más de células positivas. Para establecer si un tumor es positivo para cMET, el experto puede, por ejemplo, determinar la amplificación y/o tinción de cMET en inmunohistoquímica. Al menos el 10 % de las células tumorales en una biopsia deben ser positivas. La biopsia también puede contener 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % o más de células positivas.

Los anticuerpos como se reivindican en este documento se pueden aplicar a una amplia gama de cánceres, como cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón incluido cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de vejiga y similares. El tumor puede ser un cáncer positivo para EGFR, cMET o EGFR/cMET. Los anticuerpos según se reivindican pueden utilizarse preferentemente en el tratamiento de un cáncer positivo, es decir, un cáncer de mama, tal como un cáncer de mama en fase temprana. En otra realización, dichos anticuerpos pueden ser preferiblemente para su uso en el tratamiento del cáncer positivo para EGFR, cMET o EGFR/cMET que es el cáncer colorrectal. Los anticuerpos como se reivindican en este documento se pueden aplicar a una amplia gama de cánceres positivos para EGFR, cMET o EGFR/cMET, como cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón incluido cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de vejiga y similares. El sujeto es preferiblemente un sujeto humano. El sujeto es preferiblemente un sujeto elegible para una terapia con anticuerpos utilizando un anticuerpo específico EGFR como cetuximab. En una realización preferida, los anticuerpos pueden usarse preferiblemente en el tratamiento de un sujeto que comprende un tumor, preferiblemente un cáncer positivo para EGFR/cMET, preferiblemente un tumor/cáncer con un fenotipo resistente a RTK del EGFR, un fenotipo resistente a anticuerpos monoclonales EGFR o una combinación de los mismos.

La cantidad de anticuerpos que se administra a un paciente normalmente está dentro de la ventana terapéutica, lo que significa que se utiliza una cantidad suficiente para obtener un efecto terapéutico, mientras que la cantidad no exceda un valor umbral que dé lugar a un grado inaceptable de efectos secundarios. Cuanto menor sea la cantidad de anticuerpos necesarios para obtener el efecto terapéutico deseado, mayor será normalmente la ventana terapéutica. Por lo tanto, se prefiere un anticuerpo como el reivindicado en este documento que ejerza suficientes efectos terapéuticos en dosis bajas. La dosis puede estar dentro del rango del régimen de dosificación de cetuximab. La dosis también puede ser menor.

Un anticuerpo biespecífico según una invención como se reivindica en este documento induce preferiblemente menos toxicidad cutánea en comparación con cetuximab en condiciones por lo demás similares. Un anticuerpo biespecífico como se reivindica en este documento preferiblemente produce menos quimiocinas proinflamatorias, preferiblemente de CXCL14 en comparación con cetuximab en condiciones similares. Un anticuerpo biespecífico como se reivindica en este documento preferiblemente induce un menor deterioro de las ARNasas antimicrobianas, preferiblemente la Rnasa 7, en comparación con cetuximab en condiciones similares.

La presente invención describe, entre otros, anticuerpos que se dirigen a los receptores EGFR y cMET y dan como resultado una potente inhibición de la proliferación de líneas de células cancerosasin vitroy la inhibición del crecimiento tumoralin vivo.Un anticuerpo biespecífico como se reivindica en este documento puede combinar perfiles de baja toxicidad con alta eficacia. Un anticuerpo como el reivindicado en este documento puede ser útil en varios tipos y líneas de terapias dirigidas al EGFR. Un anticuerpo como se reivindica en este documento puede tener una ventana terapéutica mayor en comparación con un anticuerpo que se une al mismo antígeno(s) con ambos brazos. Un anticuerpo biespecífico como el reivindicado en este documento puede exhibir mejores efectos inhibidores del crecimientoin vitro, in vivoo una combinación de los mismos en comparación con el anticuerpo cetuximab.

La invención también proporciona un anticuerpo biespecífico como se reivindica en este documento, para su uso en el tratamiento de sujetos que pueden tener uno o más de una variedad de diferentes tipos de tumores. El tumor puede ser un tumor positivo para EGFR, un tumor positivo para cMET o un tumor positivo para EGFR y cMET El tumor puede ser cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas, o cáncer de vejiga. El tumor puede ser resistente al tratamiento con un inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR. El inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR es preferiblemente erlotinib, gefitinib o afatinib, un análogo de erlotinib, gefitinib o afatinib o una combinación de uno o más de los respectivos compuestos y/o análogos de los mismos. El tratamiento preferiblemente comprende además un tratamiento con un inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR. Cuando se trata juntamente con un inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR, el tumor puede ser resistente al tratamiento con el inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR. El tratamiento conjunto restaura al menos parcialmente la sensibilidad del tumor al inhibidor de la tirosina quinasa. El inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR puede ser un inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR de primera generación. Ejemplos de inhibidores de la tirosina quinasa del EGFR de primera generación clínicamente relevantes son erlotinib y gefitinib. En esta y otras realizaciones, el tumor puede ser un tumor asociado al HGF.

Un tumor positivo para EGFR es típicamente un tumor que tiene una mutación activadora del EGFR. Una mutación activadora del EGFR es una mutación del EGFR que resulta en la activación de la vía de señalización EGF/EGFR. La mutación activadora del EGFR puede ser importante para un estado canceroso del tumor. Una de las formas en que estos tumores pueden volverse insensibles a la terapia dirigida al EGFR es mediante la activación de la vía de señalización HGF/cMET. El tumor puede ser un tumor asociado al HGF. La activación de la vía de señalización cMET/HGF es una de las formas en que un tumor positivo para EGFR puede escapar al tratamiento con una terapia dirigida al EGFR. La vía cMET/HGF se puede activar de varias maneras. Se describen en la técnica varios métodos de activación, algunos de los cuales se detallan en este documento. Un anticuerpo como se reivindica en este documento es particularmente adecuado para el tratamiento de tumores en los que la activación de la vía de señalización cMET/HGF está asociada con la presencia o el exceso de HGF. Estos tumores positivos para cMET se denominan tumores asociados al HGF o tumores dependientes de HGF. Un anticuerpo como se reivindica en este documento también se puede utilizar para inhibir al menos en parte este posible mecanismo de escape de los tumores positivo para EGFR. Estos tumores pueden escapar a la terapia dirigida al EGFR a través del crecimiento seleccionado de células tumorales en las que, además, se activa la vía de señalización cMET/HGF. Estas células pueden estar presentes al inicio de la terapia dirigida al EGFR. Estas células tienen una ventaja de crecimiento selectivo sobre las células tumorales negativas para la señalización HGF/cMET El tumor puede ser un tumor en el que se activa la vía de señalización HGF/cMET El tumor puede ser un tumor que esté asociado con niveles elevados del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) o sobreexpresión del receptor de HGF c-Met. El tumor puede ser un tumor en el que el crecimiento es impulsado por el EGF y/o HGF. Se dice que un tumor es impulsado por un determinado factor de crecimiento si la vía de señalización se activa en las células del tumor en respuesta a la presencia del factor de crecimiento y la eliminación del factor de crecimiento da como resultado la inhibición del crecimiento de las células del tumor. La reducción se puede medir mediante la reducción de la división celular y/o la muerte celular inducida, como la apoptosis. Un tumor es un tumor asociado al HGF si, en condiciones que de otro modo serían permisivas para el crecimiento del tumor, este crece o crece más rápido en presencia de HGF.

Se han revisado las terapias dirigidas al EGFR para varios tumores por Vecchione et al., EGFR-targeted therapy". Experimental cell research Vol 317 (2011): 2765-2771. En general, la terapia dirigida al EGFR es una terapia con una molécula que interactúa con el EGFR e inhibe la señalización mediada por el EGFR en la célula.

El anticuerpo para uso en el tratamiento como se indica en este documento comprende además preferiblemente la etapa de determinar si el tumor es un tumor asociado al HGF.

Un anticuerpo como se reivindica en este documento puede inhibir el crecimiento de un tumor asociado al HGF.

Cuando en el presente documento se dan intervalos entre el número 1 y el número 2, el intervalo incluye el número 1 y el número 2. Por ejemplo, un intervalo entre 2-5 incluye los números 2 y 5.

Cuando en este documento se hace referencia a una afinidad mayor que otra, la Kd = menor que la otra Kd. Para evitar dudas, una Kd de 10e-9 M es menor que una Kd de 10e-8 M. La afinidad de un anticuerpo con una Kd de 10e-9 M por un objetivo es mayor que cuando la Kd es 10e-8 M.

Una referencia en el presente documento a un documento de patente u otro asunto que se cita no debe tomarse como una admisión de que ese documento o asunto era conocido o de que la información que contiene era parte del conocimiento general común en la fecha de prioridad de cualquiera de las reivindicaciones.

Con fines de claridad y una descripción concisa, las características se describen en este documento como parte de la misma realización o de realizaciones separadas, sin embargo, se apreciará que el alcance de la invención tal como se divulga en este documento puede incluir realizaciones que tengan combinaciones de todas o algunas de las características descritas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de los dominios variables a los que se hace referencia en esta solicitud. Las secuencias de VH, CDR1, CDR2 y CDR3, así como FR1, FR2 y FR3 de MF3370 y MF4356 son parte de las reivindicaciones adjuntas.

Figura 2. Funcionalidad de los anticuerpos bivalentes cLC anti-EGFR en la inhibición de la muerte inducida por EGF de las células A431. El eje Y (recuentos) muestra la lectura de fluorescencia del ensayo, que recuerda el número de células metabólicamente activas, en función de la concentración de anticuerpo utilizado (eje X). PG3370 es capaz de inhibir la muerte celular inducida por EGF y, por lo tanto, muestra un mayor crecimiento de las células al aumentar la concentración de anticuerpos. Las moléculas que tienen secuencias de aminoácidos de la región variable de cetuximab/Erbitux, denominadas en este documento cetuximab o anticuerpo de referencia cetuximab, se utilizaron en experimentos como estándar interno (puntos negros).

Figura 3. El efecto de biespecificidades de cMET x EGFR sobre la cicatrización de heridas en células H385 (panel A) y células EBC-1 (panel B).

Las células se incubaron sin (simulación) o con 12.5 ng/mL de EGF o 15 ng/mL de HGF o una combinación de HGF y EGF (15 ng/mL y 12.5 ng/mL) con la adición de 5 cMET x EGFR biespecíficos individuales. Como control se incluyó cetuximab en combinación con Fab 2994. El eje Y representa el porcentaje de cierre de la herida medido mediante microscopía de lapso de tiempo.

Figura 4. Análisis FACS sobre la expresión del EGFR y cMET en células de NSCLC resistentes a TKI, células HCC827 y PC-9.

(A) Ambas líneas celulares se caracterizaron para la expresión del EGFR (eje x) y cMET (eje y) utilizando anticuerpos marcados con fluorescencia. Todas las células HCC827 muestran expresión del EGFR y pueden subdividirse en una población de EGFRalto, cMETpos y una población de EGFRpos, cMETneg. Las células PC-9 contienen una pequeña población de células de EGFRalto y cMETpos y una población mínima de células de EGFRpos y cMETneg.

(B) Gráfico que representa la distribución de las diferentes poblaciones celulares en células PC-9 y HCC827.

Figura 5. Ejemplo del efecto de PB8532 y PB8388 sobre la resistencia inducida por HGF a los inhibidores de TKI en células PC-9 (panel A) y HCC827 (panel B).

Las células fueron tratadas previamente con PB8532, PB8388 biespecíficos o la mezcla Fab cetuximab/5D5 y se incubaron con HGF y/o EGF en combinación con un inhibidor de TKI, después de lo cual se midió la proliferación. PB8532 inhibe la resistencia a gefitinib mediada por HGF y mediada por EGF en células PC-9 y células HCC827.

Figura 6. Efecto del tratamiento con los anticuerpos indicados sobre la fosforilación de cMET inducida por HGF o la fosforilación del EGFR inducida por EGF en células PC-9 y HCC827. Los anticuerpos (100 nM) se incubaron durante 15 minutos a 37 °C y luego se generaron extractos de células y se aplicaron al análisis de transferencia Western para la detección de (p)EGFR y (p)cMET Se incluyó el anticuerpo anti-vinculina como control de carga de proteína.

Figura 7. MF3370 y variantes del mismo. Las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 en MF8226 están subrayadas de izquierda a derecha. Las CDR en las otras secuencias están en las posiciones correspondientes. Las secuencias de VH, CDR1, CDR2 y CDR3, así como FR1, FR2 y FR3 de MF4356 y MF8230 son parte de las reivindicaciones adjuntas.

Figura 8. MF4356 y variantes del mismo. Las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 en MF4356 están subrayadas de izquierda a derecha. Las CDR en las otras secuencias están en las posiciones correspondientes. Las secuencias de VH, CDR1, CDR2 y CDR3, así como FR1, FR2 y FR3 de MF4356 y MF8230 son parte de las reivindicaciones adjuntas.

Figura 9. Cadena ligera común utilizada en IgG mono y biespecífica.

Figura 9A: Secuencia de aminoácidos de cadena ligera común. Figura 9B: Secuencia y traducción del ADN del dominio variable de cadena ligera común (IGKV1-39/jk1). Figura 9C: Secuencia y traducción del ADN de la región constante de la cadena ligera común. Figura 9D: Traducción del dominio variable de la cadena ligera común IGKV1-39/jk5. Figura 9E: Región V IGKV1-39A.

Figura 10. Cadenas pesadas de IgG para la generación de moléculas biespecíficas. Figura 10A: Región CH1. Figura 10B: región de bisagra. Figura C: Región CH2. Figura 10D: CH2 que contiene sustituciones silenciadoras L235G y G236R. Figura 10E: Dominio CH3 que contiene sustituciones L351K y T366K (KK). Figura 10F; Dominio CH3 que contiene las sustituciones L351D y L368E (DE).

Figura 11. Inhibición de la unión de EGF a EGFR recombinante en ELISA.

Se permitió que el EGF biotinilado se uniera al EGFR recubierto en presencia de una dilución seriada de IgG. Se utilizó cetuximab como control positivo y PG2708 como anticuerpo de control negativo (Neg ctrl Ab). La unión de EGF se detectó mediante estreptavidina HRP

Figura 12. Determinación de la reactividad cruzada del EGFR de cynomolgus mediante análisis de FACS. Las células CHO-K1 se transfectaron con constructos del EGFR humano o EGFR de cynomolgus. Se permitió que los anticuerpos se unieran a las células transfectadas y a las células CHO-K1 a 5 pg/mL. Se utilizó cetuximab como control positivo y PG2708 como anticuerpo de control negativo (Neg ctrl Ab). Los anticuerpos unidos se detectaron mediante un anticuerpo conjugado con PE.

Figura 13. Determinación de la reactividad cruzada del EGFR y cMET de ratón mediante ELISA. Panel superior; se probó una concentración fija de anticuerpo (5 pg/mL) en una titulación en serie en placas de microtitulación recubiertas con EGFR de ratón y EGFR humano. Se permitió que los anticuerpos anti-EGFR y PG2708 (neg Ctrl Ab) se unieran y fueran detectados por un anticuerpo conjugado con HRP. Panel inferior; se permitió una titulación en serie de anticuerpos para unirse al cMET recubierto humano y de ratón. El anticuerpo reactivo cruzado humano/ratón BAF527 se incluyó como anticuerpo de control positivo y se agregó PG2708 como anticuerpo de control negativo (Neg Ctrl Ab). Los anticuerpos unidos se detectaron mediante estreptavidina HRP.

Figura 14. Inhibición de la proliferación de N87 dependiente de ligando. Se incubó una titulación seriada de anticuerpos con células N87 en presencia de HGF (A), EGF (B) o EGF/HGF (C). La proliferación celular se midió mediante azul Alamar. Se incluyó Fab 5D5/cetuximab en una concentración equimolar como anticuerpo de control positivo. El eje Y representa la intensidad de fluorescencia como indicador de la proliferación celular. El eje X representa las diferentes concentraciones de los anticuerpos probados.

Figura 15. Un ejemplo de la actividad de ADCC de los anticuerpos biespecíficos cMETxEGFR en células N87 (A) y células m KN-45 (B) utilizando el ensayo informador de ADCc de alta afinidad FcyRIIIa. El eje X representa la concentración de anticuerpo añadido. El eje Y representa la luminiscencia (RLU) como lectura de la actividad de ADCC. El anticuerpo anti-EGFR cetuximab se incluyó como anticuerpo de control positivo.

Figura 16. El efecto del HGF sobre la eficacia de los TKI erlotinib y gefitinib en células PC-9 (A) y HCC827 (B). Las células se incubaron con concentraciones crecientes de HGF (0 a 120 ng/mL) en combinación con 300 nM de erlotinib o gefitinib, después de lo cual se midió la proliferación celular. En ambas líneas celulares, el HGF indujo una resistencia dependiente de la dosis a los t K i.

Figura 17. Prueba de unión por afinidad de variantes de c-MET x EGFR mejoradas con ADCC. Las células CHO-Kl que expresan EGFR de forma estable (A) o las células MKN-45 que expresan c-MET de forma endógena (B) se incubaron a razón de 2*105 células/pocillo con concentraciones crecientes de anticuerpos según se indica. Después del lavado, se detectó la unión con anti-IgG-PE humano (3 pg/mL). Las células teñidas se analizaron en un sistema iQue y se calculó la intensidad de fluorescencia media (MFI). Los anticuerpos de control fueron MF1337xMF1337; control negativo de TTxTT; triángulos oscuros en la parte inferior) y MF4356xMF3770 (PB8532p04; control positivo c-METxEGFR para c-MET; triángulos negros). TT significa toxoide tetánico. ADCC indica anticuerpos con función de ADCC mejorada a través de la cotransfección con ADN que codifica la enzima RMD para eliminar un residuo de fucosa de la región Fc de IgG1.

Figura 18. Resultados del ensayo informador de ADCC para confirmar la función efectora de ADCC mejorada. Las células BxPC-3 que expresan EGFR (izquierda) o las células MKN-45 que expresan c-MET (derecha) se mezclaron con células efectoras de ADCC en una proporción E:T de 15:1 y se incubaron en presencia de una titulación del anticuerpo de prueba (0.01 a 10 pg/mL). Después de 6 horas, se agregó el reactivo Bio-Glo y se midió la luminiscencia utilizando un lector de microplacas. Cuanto mayor sea el nivel de luminiscencia, mayor será el grado de interacción entre las células diana y efectoras inducido por el anticuerpo de prueba. Los paneles superiores muestran los resultados del ensayo de alta afinidad y los paneles inferiores los del ensayo de baja afinidad. El anticuerpo de control negativo fue PG1337p218 (anti-TT, triángulos claros en la parte inferior); los otros anticuerpos de control fueron 3178x4280 (HER3 x EGFR, mejorado con ADCC, círculos claros cerrados (en la parte superior del panel superior izquierdo); 3178x4280 (HER3 x EGFR, sin mejora de la ADCC, cruces negras, en la parte inferior); 4356x3370 (c-MET x EGFR, mejorado con ADCC, círculos claros abiertos); 3370x4356 (EGFR x c-MET, sin mejora de la ADCC, cruces negras y líneas discontinuas); y Cetuximab (anti-EGFR, círculos negros pequeños).

Figura 19. Erlotinib induce una respuesta antitumoral en ratones NGS-hHGFki injertados con células HCC827 mientras los ratones reciban tratamiento. La flecha negra indica el inicio del tratamiento.

Figura 20. PB8532 solo y en combinación con erlotinib induce una respuesta antitumoral en ratones NGS-hHGFki injertados con células HCC827. La flecha negra indica el inicio del tratamiento; las flechas grises en el eje X indican tratamientos semanales con anticuerpos.

Figura 21. La respuesta antitumoral inducida por PB8532 solo y en combinación con erlotinib es superior a la de erlotinib, incluso después de suspender el tratamiento. La flecha negra indica el inicio del tratamiento; las flechas grises en el eje X indican tratamientos semanales con anticuerpos.

Figura 22. La respuesta antitumoral inducida por PB8532 solo y en combinación con erlotinib es superior a la de erlotinib. La flecha negra indica el inicio del tratamiento; las flechas grises en el eje X indican tratamientos semanales con anticuerpos. El tratamiento con el anticuerpo cMET LY2875358 con y sin tratamiento con erlotinib fue menos efectivo que el PB8532 incluso sin tratamiento con erlotinib.

Figura 23. La respuesta antitumoral inducida por el anticuerpo biespecífico cMETxEGFR PB19478 es efectiva también cuando el tumor desarrolla resistencia a erlotinib. Las flechas negras indican el inicio del tratamiento con erlotinib y el inicio del tratamiento con PB19478.

Ejemplos

Como se utiliza en este documento, "MFXXXX", donde X es independientemente un número 0-9, se refiere a un Fab que comprende un dominio variable en donde el VH tiene la secuencia de aminoácidos identificada por los 4 dígitos. A menos que se indique lo contrario, la región variable de la cadena ligera del dominio variable normalmente tiene una secuencia de la Figura 9A, normalmente 9B. "MFXXXX VH" se refiere a la secuencia de aminoácidos del VH identificado por los 4 dígitos. El MF comprende además una región constante de una cadena ligera y una región constante de una cadena pesada que normalmente interactúa con una región constante de una cadena ligera. PG se refiere a un anticuerpo monoespecífico que comprende cadenas pesadas y ligeras idénticas. PB se refiere a un anticuerpo biespecífico con dos cadenas pesadas diferentes. Las regiones variables VH de las cadenas pesadas difieren y típicamente también la región CH3, en donde una de las cadenas pesadas tiene una mutación KK de su dominio CH3 y la otra tiene la mutación DE complementaria de su dominio CH3 (ver como referencia PCT/NL2013/050294 (publicado como WO2013/157954)).

Ejemplo 1:Materiales y métodos

Líneas celulares:

Se adquirieron las líneas celulares EBC-1 [JCRB0820], PC-9 [RCB0446], H358 [ATCC® CRL-5807™], HCC827 [ATCC® CRL-2868™],MKN-45 [DSMZ ACC 409] N87 [ATCC®CRL-5822™] y A431 [ATCC® CRL-1555™] y se mantuvieron rutinariamente en medios de crecimiento suplementados con 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS). Las células HEK293F Freestyle se obtuvieron de Invitrogen y se mantuvieron de forma rutinaria en medio 293 FreeStyle.

Constructos de ADNc:

Generación de vectores de expresión de cMET y EGFR para la generación de líneas celulares estables (cMET y EGFR) y para la inmunización (cMET)

El ADNc de longitud completa de cada objetivo, incluidos los sitios de restricción únicos para la clonación y la secuencia de consenso de Kozak para una traducción eficiente, se sintetizó o se obtuvo mediante amplificación por PCR en un constructo de expresión disponible comercialmente, que contiene el ADNc objetivo, con cebadores específicos que introdujeron sitios de restricción únicos para la clonación y la secuencia de consenso de Kozak para una traducción eficiente. El ADNc de longitud completa de cada objetivo se clonó en un constructo de expresión eucariota como pcDNA3.1, mientras que los dominios extracelulares se clonaron en pVAX1 y pDisplay. Las secuencias de inserción se verificaron mediante comparación con las secuencias de aminoácidos de referencia del NCBI.

Secuencia de aminoácidos de longitud completa del inserto del EGFR humano para expresión en la superficie celular (idéntico al del GenBank: NP_00533):

MRPSGTAGAALLM<j>LAM<j>CPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEWLGNLEIT

YVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELP

MRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGE

ENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNP

TTYQMDYNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGI

GIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQ

AWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTIN

WKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEG

EPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYAD

AGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLR

RLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELR

EATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLN

WCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALE

SILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWM

IDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDWDADEYLIPQ

QGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLP

VPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAH

WAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA

De las cuales:

- MRPSGTAGAALLALLAALCPASR: péptido señal.

- ALEEKKVCQGTSNKLTQLGT FEDHFLSLQRMFNNCEWLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEV

AGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNY DANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNN

PALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSG

RCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGA

TCVKKCPRNYWTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIK

HFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEI

IRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISN

RGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPE

CLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCT

GPGLEGCPTNGPKIPS: ECD delEGFRhumano.

- IATGMVGALLLLLVVALGIGLFM: región TM prevista.

- RRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGL

WIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKAl'lKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCL

LDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARMVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEE

KEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLP

QPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALM

DEEDMDDWDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYS

SDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEY

LNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSE

FIGA: cola ¡ntracelular.

Secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del EGFRvarlII humano, una variante natural del EGFR VAR_066493 [Ji H., Zhao X; PNAS 103:7817-7822(2006)] causada por una eliminación en el marco de lectura de los exones 2-7. El _ de abajo indica la ubicación donde faltan los aminoácidos 30 - 297

MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKK_GNYWTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCR

KVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEIT

GFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAWSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLC

YANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDK

CNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTL

VWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS

De las cuales:

- MRPSGTAGAALLALLAALCPASR: péptido señal.

- ALEEKK_GNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSI

NATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHA

FENLEIIRGRTKQHGQFSLAWSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQK

TKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSEC

IQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPN

ctygctgpglegcptngpki PS:ECD de EGFRvarI 11

Secuencia de aminoácidos del dominio EGFR extracelular quimérico de macaco (Macaca mulatta) híbrido con el dominio transmembrana e intracelular del EGFR humano para su expresión en la superficie celular (idéntico a la del GenBank: XP_014988922.1. Secuencia del EGFR humano subrayada en el ejemplo siguiente.

MGPSGTAGAALLALLAA1CPASRALEEKKVCQGT SNKLTQLGTFEDHFL SLQRMFNNCEWLGNLEIT

YVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELP

MRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSEFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGE

ENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNP

TTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGI

GIGEFKDTLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQ

AWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTIN

WKKLFGTSSQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCQNVSRGRECVDKCNILEG

EPREFVENSECIQCHPECLPQVMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYAD

AGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCARMGPKIPSIATGMLGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLR

RLLQERELVEPLTPSGEñPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVñIKELR

EATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLN

WCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALE

SILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWM

IDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQ

QGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSMMSTVACIDRHGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLP

VPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAH

WAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA

De las cuales:

- MGPSGTAGAALLALLAALCPASR: péptido señal.

- LEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVA

GYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNP ALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGR CRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGAT CVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKH

FKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEII

RGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNR

GENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPEC

LPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTG

PGLEGCPTNGPKIPS:ECI) de cyKGFR

Secuencia de aminoácidos del inserto cMET humano de longitud completa para expresión en la superficie celular (idéntico a la del GenBank: P08581-2). La secuencia difiere de la secuencia de referencia en la posición con una inserción en 755-755: S ^ STWWKEPLNIVSFLFCFAS

MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNGECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATN

YIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSV

NRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSS

Y FPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPE FRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQ

TFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDD

ILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSG

CEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSIST FIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPH

VNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDK

CVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTL

TLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGN

YLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIH

PTKSFISTWWKEPLNIVSFLFCFASGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEI

ICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDID

PEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFTGL

IAGVVSISTALLLLLGFFLWLKKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVD

YRATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVV

IGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDMDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPN

VLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYLASKKFVHRDLA

ARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWS FGVLLW

ELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPS FSELVSRISAIFS

T FIGEHYVHVNATYVNVKCVAPY PSLLS SEDNADDEVDTRPASFWETS

De las cuales:

- MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNG: péptido señal

- ECKEALñKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVñEYKT

GPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALWDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADI

QSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKET

KDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHS

YMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMD

RSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQR

VDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQWVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEH

TLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICL

PAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAM

NKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCT

LKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKN

LNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLI

YVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLK

lnselniewkqaisstvlgkvivqpdqnft:ECI) de cMKT humano

- GLLAGVVSISTALLLLLGFFLWL: región transmembrana

- KKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQ NGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHWIGPSSLIVHFNEVIG RGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSP LWLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVAD FGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTF DITVYLLQGRRIiLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVN VKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS: región intracelular

Anticuerpos de referencia

Los anticuerpos anti-cMET son conocidos en la técnica (Tabla 1). Los anticuerpos cMET bivalentes monoespecíficos se construyeron de acuerdo con la información publicada y se expresaron en células Freestyle 293F. En la Tabla 1 se muestra la información divulgada relacionada. Se construyeron anticuerpos bivalentes monoespecíficos dirigidos contra cMET de acuerdo con la información publicada y se expresaron en células Freestyle 293F. Para los ensayos de bloqueo del ligando HGF, los segmentos de genes codificantes de VH y VL de anticuerpos anti-cMET derivados de patentes se volvieron a clonar en un vector de visualización en fagos para su visualización en bacteriófagos filamentosos.

El anticuerpo de referencia cetuximab (Erbitux) se utilizó como anticuerpo de referencia para el panel de Fab del EGFR.

La proteína de Fab 2994 se generó a partir de IgG PG2994 purificada mediante digestión con papaína. Por lo tanto, PG2994 se incubó con papaína acoplada a perlas (Pierce #44985) y se dejó digerir durante 5.5 horas a 37 °C bajo rotación. Los fragmentos Fab se purificaron de la mezcla de digestión mediante filtración sobre MabSelectSure LX. Flujo a través de fracciones que contienen proteína de Fab, concentrada a 3 mL usando vivaspin20 10 kDa y purificada adicionalmente por filtración en gel usando una columna superdex75 16/600 en PBS.

Ejemplo 2

Generación de anticuerpos monoclonales bivalentes y caracterización de anticuerpos

Los genes VH de anticuerpos únicos, a juzgar por la secuencia del gen VH y algunas variantes de secuencia del mismo, se clonaron en el vector principal IgG1. Las células 293F Freestyle adaptadas a la suspensión se cultivaron en matraces T125 en una plataforma de agitación hasta una densidad de 3.0 * 106 células/mL. Las células se sembraron a una densidad de 0.3-0.5 * 106 células viables/mL en cada pocillo de una placa de 24 pocillos profundos. Las células fueron transfectadas transitoriamente con el ADN estéril individual: mezcla de PEl y posterior cultivo. Siete días después de la transfección, se recogió el sobrenadante y se filtró a través de 0.22 |<j>M (Sartorius) y se purificó en perlas de proteína A mediante purificación por lotes seguida de un intercambio de tampón a PBS.

Inhibición de la apoptosis mediada por EGF

Concentraciones elevadas (10 nM) de EGF inducen muerte celular (apoptótica) en células A431 [Gulli et al., 1996)]. Este efecto se puede revertir de forma dependiente de la dosis mediante la adición de anticuerpos anti-EGFR bloqueadores de ligando, como cetuximab.

Para probar la IgG anti-EGFR bivalente y su potencia para inhibir la muerte celular inducida por EGF de las células A431, los anticuerpos se incubaron en una titulación en serie (desde 10 jg/mLen adelante) en presencia de 10 nM de EGF. Cada placa de ensayo contenía una dilución seriada de anticuerpo de control negativo (Ctrl Ab; PG2708) y positivo (cetuximab) que sirvieron como controles de referencia. El tercer día, se añadió azul Alamar (Invitrogen, # DAL1100) (20 jL por pocillo) y se midió la fluorescencia después de 6 horas de incubación (a 37 °C) con azul Alamar usando una excitación de 560 nm y una lectura de 590 nm en un lector de microplacas multimodo Biotek Synergy 2. La Figura 2 muestra la actividad de los anticuerpos EGFR de cLC en comparación con la de cetuximab y el anticuerpo de control. Los anticuerpos PG4280, 3755 y 3752 fueron más potentes en comparación con cetuximab, mientras que los anticuerpos PG4281 y PG3370 mostraron menos eficacia.

ELISA bloqueador de EGF

Se probaron fagos específicos del EGFR para determinar su unión al EGFR recombinante en ausencia y presencia de un exceso molar de ligando (EGF). Por lo tanto, se recubrió durante la noche placas ELISA con 5 jg/m L de IgG antihumana de cabra MAXISORP™ a 4 °C. Los pocillos de las placas ELISA se bloquearon con PBS (pH 7.2) con 2 % de ELK durante 1 h a temperatura ambiente y con agitación (700 rpm). A continuación, se dejó incubar 5 jg/m L del EGFR-Fc humano recombinante durante 1 hora a temperatura ambiente. Mientras tanto, la IgG se mezcló en una titulación en serie con EGF biotinilado humano durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar el EGFR-Fc humano no unido, se agregó la mezcla de anticuerpo/EGF y se dejó unirse durante 1 hora a temperatura ambiente. El EGF unido se detectó mediante HRP-estreptavidina durante 1 hora a temperatura ambiente. Como control, el procedimiento se realizó simultáneamente con un anticuerpo específico para los antígenos recubiertos (no se muestra) y un fago de control negativo (Neg Ctrl Ab). El anticuerpo secundario unido se visualizó mediante tinción con TMB/H2O2 y la tinción se cuantificó mediante medición de la OD450 nm. La Figura 11 muestra que el anticuerpo PG3370, que es menos potente en la inhibición de la apoptosis mediada por EGF, muestra una actividad de bloqueo de EGF similar en comparación con cetuximab.

Prueba de reactividad cruzada del EGFR de Cynomolgus y EGFR de ratón

Para probar si los IgG anti-EGFR eran reactivos con el EGFR de cynomolgus, los constructos que codificaban el EGFR humano de longitud completa, así como el constructo de expresión que codificaba el ECD de cynomolgus fusionado al EGFR humano intracelular, se transfectaron en células CHO (negativas al antígeno) y luego las células se tiñeron con los anticuerpos anti-EGFR a razón de 5 pg/mL y finalmente se analizaron por FACS. Como control positivo para la tinción, se utilizó el anticuerpo de uso clínico cetuximab, ya que se sabe que este anticuerpo reacciona de forma cruzada con el EGFR de cynomolgus. Se demostró que PG3370, PG3752, PG4280 y PG4281 eran reactivos con el EGFR de cynomolgus, ya que la tinción de las células que expresaban EGFR humano era prácticamente indistinguible de la de las células que expresaban el receptor quimérico (Figura 12).

Para probar la reactividad cruzada de los anticuerpos IgG anti-EGFR con el EGFR murino, se realizó una prueba ELISA. Se realizó una titulación en serie de ECD-Fc del EGFR de ratón recombinante, comenzando con 5 pg/mL y diluido hasta 0.038 pg/mL, y se recubrió durante la noche con placas ELISA MAXISORP™ a 4 °C. La unión de la IgG anti-EGFR a este antígeno se analizó a una concentración fija de 5 pg/mL y se dejó unirse durante 1 hora a temperatura ambiente. Como control positivo de la inmunorreactividad de los anticuerpos, se realizó la misma configuración de ELISA utilizando la proteína de fusión EGFR ECD-Fc humana como antígeno (R&D Systems). A continuación, se añadió conjugado de IgG de cabra anti-ratón HRP (BD Biosciences) y se dejó unir durante 2 horas a temperatura ambiente. La IgG unida se detectó mediante medición de OD450nm. Se demostró que el anticuerpo PG3370 reconoce el EGFR murino, así como el EGFR humano con afinidad similar (Figura l3, panel superior). Cetuximab no reconoce el EGFR de ratón (125084 Revisión de farmacología de Erbitux Parte 2 - FDA). Por lo tanto, PG3370 y cetuximab no reconocen el mismo epítopo en el EGFR humano.

Prueba de reactividad cruzada de cMET en ratones

Para probar la reactividad cruzada del PG3342 con el cMET murino, se realizó una prueba ELISA. Se diluyó una concentración fija de HGF R/c-MET Fc de ratón (R&D Systems) a 2.5 pg/mL en PBS y se recubrió durante la noche en placas ELISA MAXISORP™ a 4 °C. La unión de la IgG anti-cMET a este antígeno se evaluó mediante una titulación semilogarítmica a partir de 10 pg/mL. Se permitió que los anticuerpos se unieran durante 1 hora a temperatura ambiente. Como control positivo de la inmunorreactividad de los anticuerpos, se realizó la misma configuración de ELISA utilizando la proteína de fusión HGF R/c-MET Fc humana como antígeno (R&D Systems). A continuación, se añadió el conjugado de IgG anti-ratón de cabra HRP (BD Biosciences) y se dejó unirse durante 2 horas a temperatura ambiente. La IgG unida se detectó mediante medición de OD450nm. BAF527, un anticuerpo de control positivo que contiene un anticuerpo policlonal de cabra purificado por afinidad contra cMET de ratón acoplado a biotina. No se observó reactividad cruzada con el anticuerpo PG3342 del cMET murino (Figura 13, panel inferior).

Ensayo de bloques cruzados de anticuerpos cMET

Se analizaron fagos específicos de cMET para determinar la competencia con anticuerpos de referencia de cMET en ELISA. Por lo tanto, se recubrieron placas ELISA MAXISORP™ con 2.5 pg/mL de proteína de fusión cMET-Fc durante la noche a 4 °C. Los pocillos de las placas ELISA se bloquearon con PBS (pH 7.2) con 2 % de ELK durante 1 hora a temperatura ambiente, con agitación (700 rpm). Se añadió la siguiente referencia o control negativo de IgG a una concentración de 5 pg/mL y se dejó unir durante 15 minutos a temperatura ambiente a 700 rpm. A continuación, se añadieron 5 pL de fago precipitado con PEG y se dejó unir durante 1 hora a temperatura ambiente a 700 rpm. Los fagos unidos se detectaron con anticuerpo anti-M13 marcado con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente a 700 rpm. Como control, el procedimiento se realizó simultáneamente con un anticuerpo específico para los antígenos recubiertos y un fago de control negativo. El anticuerpo secundario unido se visualizó mediante tinción con TMB/H2O2 y la tinción se cuantificó mediante medición de la OD450 nm. La Tabla 2 demuestra que MF4040 y MF4356 muestran competencia con el anticuerpo de referencia 5D5. MF4297 compite con 13.3.2 y C8H241 en menor medida. Todos los fagos de control positivo muestran una competencia completa con la IgG correspondiente, mientras que el control sin anticuerpos no influye en el ensayo de competencia.

Generación de anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos se generaron mediante cotransfección transitoria de dos plásmidos que codifican IgG con diferentes dominios VH, utilizando una tecnología de ingeniería CH3 patentada para garantizar una heterodimerización eficiente y la formación de anticuerpos biespecíficos. La cadena ligera común también se cotransfecta en la misma célula, ya sea en el mismo plásmido o en otro plásmido. En nuestras solicitudes pendientes junto con la presente (por ejemplo,

los documentos WO2013/157954 y WO2013/157953) hemos divulgado métodos y medios para producir anticuerpos biespecíficos a partir de una sola célula, mediante lo cual se proporcionan medios que favorecen la formación de anticuerpos biespecíficos sobre la formación de anticuerpos monoespecíficos. Específicamente, las mutaciones preferidas para producir esencialmente solo moléculas de IgG de longitud completa biespecíficas son sustituciones de aminoácidos en las posiciones 351 y 366, e.g., L351K y T366K (numeración de acuerdo con la numeración de la UE) en el primer dominio CH3 (la cadena pesada de la 'variante KK') y sustituciones de aminoácidos en las posiciones 351 y 368, e.g., L351D y 10 L368E en el segundo dominio CH3 (la cadena pesada de la 'variante DE'), o viceversa. Previamente se demostró en nuestras solicitudes pendientes junto con la presente que la cadena pesada de la variante DE con carga negativa y la cadena pesada de la variante KK con carga positiva se emparejan preferentemente para formar heterodímeros (las denominadas moléculas biespecíficas 'DEKK'). La homodimerización de cadenas pesadas variantes DE (homodímeros DE-DE) o de cadenas pesadas variantes KK (homodímeros KK-KK) se ve desfavorecida debido a la fuerte repulsión entre los residuos cargados en la interfaz CH3-CH3 entre cadenas pesadas idénticas.

Los brazos Fab de cMET y EGFR se clonaron en los vectores KK y DE apropiados (Tabla 3). Después de la producción, las IgG biespecíficas se purificaron mediante purificación por lotes de proteína A y el tampón se intercambió a PBS. Las producciones exitosas dieron como resultado un anticuerpo IgG1 de longitud completa, con una concentración mínima de 0.1 mg/mL, al que se le asignó un código único (PBnnnnn; donde nnnnn representa un número generado aleatoriamente) para identificar la combinación específica de 2 fragmentos Fab de unión al objetivo diferentes. Las IgG biespecíficas producidas con éxito se probaron para determinar su unión a sus respectivos objetivos en ELISA.

Ejemplo 3

Detección de anticuerpos biespecíficos c-MET x EGFR en un Ensayo de proliferación de EGF/HGF y HGF y EGF

Se probó la potencia de un panel de anticuerpos cMET x EGFR biespecíficos en células N87 utilizando ensayos HGF/EGF, HGF y EGF. La línea celular N87, nombre oficial NCI-N87, es una línea celular de carcinoma gástrico derivada de un sitio metastásico y tiene niveles altos de expresión del EGFR y niveles intermedios de expresión de cMET (Zhang et al, 2010). Los anticuerpos se probaron en una titulación semilogarítmica de 8 pasos que varió de 10 pg/mL a 3.16 ng/mL. Cada anticuerpo se probó por duplicado. El anticuerpo anti-RSV-G PG2708 se utilizó como control negativo. El anticuerpo de referencia Fab 2994 se utilizó como control positivo para el ensayo de HGF y el anticuerpo de referencia cetuximab se utilizó como control positivo para el ensayo del EGF.

Se utilizó cetuximab/Fab 5D5 en una relación equimolar 1:1 como control positivo para los ensayos del EGF, HGF y EGF/HGF.

Se incluyeron pocillos con uno o una combinación de ligando, así como un control de medio para determinar la ventana de ensayo. Los anticuerpos se diluyeron en un medio de inanición químicamente definido (CDS: se agregó medio RPMI1640, que contenía 80 U de penicilina y 80 pg de estreptomicina por mL, 0.05 % (p/v) de BSA y 10 pg/mL de holotransferrina) y 50 pL de anticuerpo diluido a los pocillos de una placa negra de fondo transparente de 96 pocillos (Costar). Se añadió ligando (50 pL por pocillo de una solución madre que contenía 400 ng/mL de HGF y 4 ng/mL de Eg F, y una concentración de eGf/HGF de 4 ng/mL de EGF/400 ng/mL de HGF diluido en CDS: R&D Systems, cat. nr. 396-HB y 236-EG). Las células N87 se tripsinizaron, se recolectaron y se contaron y se agregaron 8000 células en 100 pL de CDS a cada pocillo de la placa. Para evitar efectos de borde, las placas se dejaron durante una hora a temperatura ambiente antes de colocarlas en un recipiente dentro de una incubadora de cultivo celular a 37 °C durante tres días. El cuarto día, se añadió azul Alamar (Invitrogen, # DAL1100) (20 pL por pocillo) y se midió la fluorescencia después de 6 horas de incubación (a 37 °C) con azul Alamar usando una excitación de 560 nm y una lectura de 590 nm en un lector de microplacas multimodo Biotek Synergy 2. Los valores de fluorescencia se normalizaron para el crecimiento no inhibido (sin anticuerpo, pero ambos ligandos añadidos). En la Figura 14 se muestra un ejemplo de un ensayo de proliferación de HGF, EGF y EGF/HGF (Figura 14A, B y C respectivamente).

En la Tabla 4 se enumeran los resultados de los distintos experimentos. En el ensayo del HGF/EGF de N87, se identificaron catorce biespecificidades de cMETxEGFR diferentes con potencia comparable a los anticuerpos monoespecíficos de referencia (mezcla equimolar de cetuximab y Fab 5D5): PB7679, PB7686, PB8218, PB8244, PB8292, PB8316, PB8340, PB8364, PB8388, PB8511, PB8535, PB8583, PB8607 y PB8640.

En el ensayo del EGF de N87, se identificaron once biespecificidades de cMETxEGFR diferentes con potencia comparable al cetuximab monoespecífico: PB7679, PB8244, PB8292, PB8340, PB8364, PB8388, PB8511, PB8535, PB8583, PB8607 y PB8640. Todos contienen el brazo Fab EGFR MF3755. En el ensayo de HGF N87 se identificaron nueve biespecíficos que mostraron una mayor potencia en comparación con el anticuerpo de referencia monoespecífico Fab 5D5: PB8218, PB8388, PB8511, PB8532, PB8535, PB8545, PB8583, PB8639 y PB8640. Contienen seis brazos Fab cMET diferentes: MF4040, MF4297, MF4301, MF4356, MF4491 y MF4506.

Actividad de ADCC

Se probó la actividad de ADCC de las 24 biespecificidades de cMetxEGFR en las líneas de células tumorales N87 (EGFR alto, cMET bajo) y MKN-45 (e GfR bajo, cMET amplificado). El ensayo de ADCC se realizó utilizando el kit de Bioensayo de ADCC Promega en formato de placa de 384 pocillos. Los anticuerpos se probaron por duplicado en 9 concentraciones diferentes en diluciones seriadas semilogarítmicas que oscilaban entre 10 pg/mL y 1 ng/mL.

El anticuerpo de referencia cetuximab se incluyó como control positivo para el ensayo y se utilizó PG2708 como anticuerpo de control negativo. Los anticuerpos o el control del medio de ensayo (sin IgG) se incubaron durante 6 horas de inducción a 37 °C con células efectoras de ADCC y células diana (N87 o MKN-45). La actividad de luciferasa se cuantificó utilizando el reactivo de luciferasa Bio-Glo.

En la Figura 15 se muestra un ejemplo del ensayo de ADCC. Ninguna de las biespecificidades de cMETxEGFR mostró una actividad de ADCC significativa en ambas líneas celulares. El anticuerpo de referencia de control positivo cetuximab mostró una actividad de ADCC dependiente de la dosis en ambas líneas celulares.

Se seleccionaron cinco biespecíficos compuestos por brazos de EGFR y cMet que mostraron alta eficacia en el ensayo de HGF/EGF de N87 y mostraron alta diversidad de secuencia (Tabla 5) para un análisis posterior. Dos de los cinco biespecíficos contienen MF4356, que compite con 5D5 por la unión a cMET (Tabla 2). En la Tabla 5 se resumen las características de los candidatos seleccionados.

Ensayo de migración de células en la cicatrización de heridas

Se probaron dos líneas celulares de NSCLC en el ensayo de cicatrización de heridas: EBC-1 y H358. Se eligieron estas líneas celulares porque expresan altos niveles del EGFR y c-Met (Zhang et al, 2010; Fong et al., 2013). El ensayo se realizó utilizando el ensayo de cicatrización de heridas en placa de 24 pocillos CytoSelectTM (Cell Biolabs, CBA-120) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se sembraron 2.5-4 * 105 células cancerosas en cada pocillo y se incubaron durante la noche a 37 °C para formar una monocapa. Se retiraron los pocillos para crear un campo de herida de 0.9 mm. Tras lavar con PBS para eliminar las células muertas y los residuos de la herida, las células se incubaron durante 15 minutos a 37 °C con medio completo (0.5 % de FBS) que contenían biespecíficos (100 nM) o una mezcla de anticuerpos de control cetuximab:Fab2994 (100 nM, relación molar 1:1). Luego cada pocillo se suplementó con factores de crecimiento: HGF (15 ng/mL), EGF (12.5 ng/mL) o una combinación de ambos (15 y 12.5 ng/mL). Se realizó un seguimiento en un periodo de tiempo desde el cierre de la herida durante 14 h a 37 °C con un microscopio confocal (Zeiss LSM780). Se muestra el grado ( %) de cierre de la herida en relación con los controles no tratados.

Las células H358 mostraron un aumento en la migración (porcentaje de cierre de la herida) tras la exposición solo al HGF o EGF, que fue más efectivo con una combinación de HGF y EGF (Figura 3). Este aumento de la migración fue anulado por la adición de la mayoría de los biespecíficos y fue más pronunciado con PB8532. Esta inhibición fue comparable a la combinación de cetuximab y Fab 5D5 excepto por la inhibición de la migración en presencia de EGF/HGF.

Las células EBC-1 mostraron un ligero aumento en la migración con la adición de HGF; y ningún aumento en la migración en presencia de EGF o la combinación de EGF/HGF. Sin embargo, el cierre de la herida podría verse inhibido en todas las condiciones de ensayo por los biespecíficos, en particular por PB8532. PB8532 fue tan eficaz o más eficaz (EGF/HGF) que la combinación de cetuximab/Fab 5D5.

Análisis de la expresión de EGFR y cMET en células PC-9 y HCC827 mediante citometría de flujo

La resistencia adquirida a erlotinib puede resultar de una activación aberrante de la activación de c-MET mediada por HGF. Las líneas celulares de NSCLC PC-9 y HCC827 se seleccionaron para investigar la capacidad de los anticuerpos biespecíficos cMET xEGFR para inhibir la proliferación mediada por ligando en un entorno resistente a los inhibidores de la tirosina quinasa (TKI). Ambas líneas celulares no albergan mutaciones del EGFR y son resistentes en presencia de HGF tanto a erlotinib como a gefitinib o a una combinación de gefitinib y erlotinib (sólo PC-9). En las células PC-9, se ha informado que la resistencia a erlotinib inducida por HGF puede eliminarse con un inhibidor de cMET (Nakade et al., 2014) y la resistencia a gefitinib puede eliminarse con un anticuerpo anti-HGF (Yano, 2008). PC-9 y HCC827 se caracterizaron para la expresión de cMET y EGFR mediante análisis de FACS, utilizando anticuerpos marcados con fluorescencia. Las células se recolectaron con PBS 2 mM de EDTA. Se incubaron suspensiones de células individuales (10e6 células en 50 pL) con anticuerpos marcados con fluorescencia en hielo durante 20 minutos en un tampón de tinción (PBS 2 % de FBS 2 mM de EDTA). Los siguientes anticuerpos se utilizaron solos o en combinación: conjugado Met Alexa Fluor 488 (clon D1C2, Cell Signaling, dilución 1:50); conjugado de EGF receptor Alexa Fluor 647 (clon D38B1, Cell Signaling, dilución 1:50). Después de la incubación, las células se lavaron con tampón de tinción y se realizó un análisis de FACS en un citómetro de flujo BD FACSVerse.

Todas las células HCC827 muestran expresión del EGFR y pueden subdividirse en una población de EGFRalto, cMETpos y una población de EGFRpos, cMETneg (Figura 4). Las células PC-9 contienen una pequeña población de células EGFRalto y cMETpos y una población mínima de células EGFRpos y cMETneg.

Ensayo de proliferación de PC-9 y HCC827

Se realizaron experimentos iniciales para determinar la concentración de HGF que establece resistencia a erlotinib y gefitinib en células PC-9 y HCC827. Después de una noche de inanición en un medio que contenía 0.5 % de FBS, las células se incubaron con concentraciones crecientes de HGF, que oscilaban entre 0 y 120 ng/mL suplementadas con 300 nM de erlotinib o gefitinib, en 10%de FBS. Después de 72 horas de incubación, se evaluó la proliferación celular utilizando el reactivo WST-1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midió con un lector de microplacas en longitudes de onda de prueba y referencia de 450 y 630 nm, respectivamente. Tanto en PC-9 (Figura 16A) como en HCC287 (Figura 16B) la adición de HGF indujo resistencia a los TKI de manera dependiente de la dosis.

Se probaron PB8532 y PB8388 para determinar su eficacia en un entorno de resistencia a TKI. Se sembraron 4 x 103 células cancerosas en placas de 96 pocillos en 100 pL de RPMI 1640 completo (10 % de FBS). Tras una noche de ayuno en un medio que contenía 0.5 % de FBS, las células se preincubaron durante 15 minutos a 37 °C con Biclonics® (100 nM) o mezcla de anticuerpos monoespecíficos de control cetuximab:Fab2994 (100 nM, relación molar 1:1). Luego, cada pocillo se suplementó con medio completo (10 % de FBS) que contenía gefitinib o erlotinib (300 nM) con o sin HGF (30 ng/mL), EGF (30 ng/mL) o una combinación de ambos (a 30 ng/mL). Después de 72 horas de incubación, se evaluó la proliferación celular utilizando el método WST-1.

La Figura 5 muestra que PB8532 puede inhibir la resistencia a gefitinib mediada por HGF y EGF en células PC-9. En las células HCC827, PB8532 inhibió la resistencia al TKI mediada por HGF y fue más potente que la combinación de administración de cetuximab Fab 5D5 monoespecífico dual. Se obtuvieron resultados comparables con el TKI erlotinib.

Ejemplo 4. Inhibición de la fosforilación de EGF y cMET por PB8532

Después de la inanición durante la noche en un medio sin FBS, las células se incubaron durante 15 minutos a 37 °C con un medio (0.5 % de FBS) que contenía PB8532 (100 nM) o una mezcla de anticuerpos monoespecíficos de control cetuximab:Fab2994 (100 nM, relación molar 1:1). Luego se estimularon las células con factores de crecimiento: HGF (30 ng/mL) o EGF (50 ng/mL) durante 15 minutos a 37 °C. Tras la estimulación, las células se lavaron con PBS en presencia de 1 mM de ortovanadato (Sigma-Aldrich). La extracción de proteínas se realizó utilizando tampón de lisis RIPA(50 mM de Tris HCl pH 8, 150 mM de NaCl, 1 % de Triton X-100, 0.5 % de desoxicolato de sodio, 0.1 % de SDS) suplementado con Coctel inhibidor completo de proteasa (Roche), inhibidor de fosfatasa PhosSTOP (Roche) y ortovanadato (1 mM, Sigma-Aldrich). Los lisados se incubaron en hielo durante 30 minutos antes de centrifugarlos durante 15 minutos a 4 °C para eliminar los restos celulares. Después de la centrifugación, se recogió el sobrenadante y se determinaron las concentraciones de proteínas utilizando el reactivo de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de proteína se desnaturalizaron añadiendo tampón de carga 6X (p-mercaptoetanol 0.6 M; SDS 8 %; Tris-HCl 0.25 M pH 6.8; glicerol 40 %; Azul de bromofenol 0.2 %) e incubando a 95 °C durante 5 minutos. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema de transferencia Trans-Blot® Turbo™ (Bio-Rad). Las membranas se bloquearon para la unión inespecífica en leche desnatada en polvo al 5 % en solución salina tamponada con Tris-Tween al 0.1 % (50 mM de Tris HCl, pH 7.6; 150 mM de NaCl; 0.1 % de Tween; TBS-T) durante 1 h a temperatura ambiente (TA) y se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche (ON) a 4 °C. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: Fosfo-Met (Tyr1234/1235, clon D26, Cell Signaling) 1:500 en TBS-T 5 % de BSA; Met (clon D1c 2, Cell Signaling) 1:1000 en TBS-T 5 % de BSA; receptor de fosfo-EGF (Tyr1068), clon D7A5, Cell Signaling) 1:1000 en TBS-T 5 % de leche desnatada en polvo; receptor de EGF (clon D38B1, Cell Signaling) 1:1000 en TBS-T 5 % de BSA; Vinculina (anti-vinculina monoclonal, V9131, SIGMA Aldrich) 1:4000 en TBS-T 5 % de leche desnatada en polvo. Después de la incubación con los anticuerpos primarios indicados, las membranas se lavaron durante 15 minutos en TBS-T y se incubaron con anticuerpo secundario (1:5000 en TBS-T 5 % de leche desnatada en polvo) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios: IgG-HRP de cabra anti-conejo (sc-2004, Santa Cruz Biotechnology); IgG-HRP de cabra anti-ratón (sc-2005, Santa Cruz Biotechnology). La señal se visualizó con reactivos quimioluminiscentes mejorados (ECL; Invitrogen) o sustrato quimioluminiscente femto SuperSignal West (Thermo Scientific) con un generador de imágenes digital (ImageQuant LAS 4000, GE Health Care Life Science Technologies).

La Figura 6 muestra un análisis de transferencia Western del experimento realizado.

En las células PC-9, PB8532 y 5D5/cetuximab fueron capaces de reducir la fosforilación inducida por HGF. Además, ambos anticuerpos redujeron ligeramente la fosforilación de EGF en ausencia y presencia de EGF.

En las células HCC827, PB8532 redujo la fosforilación de cMET en presencia y ausencia de HGF. No se observó ningún efecto con la combinación 5D5/cetuximab. Además, en esta línea celular, PB8532 redujo la fosforilación del EGFR inducida por EGF en contraste con la combinación de 5D5 con cetuximab.

Ejemplo 5

La Figura 7 muestra varias secuencias para regiones variables alternativas de la cadena pesada de un dominio variable de unión a EGFR como se divulga en este documento. La Figura 8 representa varias secuencias para regiones variables alternativas de la cadena pesada de un dominio variable de unión de cMET como se divulga en este documento. Las regiones variables de cadena pesada se utilizaron para crear varios anticuerpos cMET x EGFR biespecíficos diferentes. La cadena ligera de estos anticuerpos tiene la secuencia que se muestra en la figura 9B. Los anticuerpos biespecíficos se produjeron como se describe en el ejemplo 1. Los anticuerpos también se produjeron como una versión mejorada de ADCC. Se produjeron versiones mejoradas de ADCC incluyendo en la cotransfección de los constructos de anticuerpos, un ADN que codifica una enzima reductasa que elimina un residuo de fucosa de la región Fc de IgG1.

La Figura 17 representa una titulación de varios anticuerpos biespecíficos producidos en células CHO-K1 EGFR descritas en el ejemplo 2 (panel A) y en células MKN-45 que expresan endógenamente c-MET (panel B). Las células se incubaron a razón de 2*105 células/pocillo con concentraciones crecientes de anticuerpos según se indica. Después del lavado, se detectó la unión con anti-IgG-PE humano (3 pg/mL). Las células teñidas se analizaron en un sistema iQue y se calcularon la intensidad de fluorescencia media (MFI) y el área bajo la curva (AUC). Los anticuerpos de control fueron MF1337xMF1337 (PG1337p218; control negativo de TTxTT; triángulos oscuros en la parte inferior) y MF4356xMF3770 (PB8532p04; control positivo de c-METxEGFR; triángulos negros). TT significa toxoide tetánico. Un dominio variable que comprende el VH de MF1337 (ver figura 1) y una cadena ligera común como se describe en este documento, se une al toxoide tetánico y, por lo tanto, no se espera que se una a las células EGFR CHO-K1 y a las células MKN-45. La nota (ADCC) indica que los anticuerpos se producen con una función de ADCC mejorada a través de la cotransfección con ADN que codifica la enzima RMD para eliminar un residuo de fucosa de la región Fc de IgG1. Ver la tabla 6 para obtener una lista de los anticuerpos biespecíficos utilizados y su codificación PB.

Ensayo informador de ADCC

Se realizó un ensayo informador de ADCC para determinar si la cotransfección de ADN codificante de RMD mejoraba con éxito la función efectora de ADCC. Todas las muestras se probaron por duplicado en células BxpC3 (que expresan EGFR) y células MKN-45 (que expresan c-MET) utilizando el ensayo de alta afinidad y de baja afinidad. Las células efectoras de alta afinidad del ensayo expresan la variante V del FcyRllla humano y las células efectoras de baja afinidad expresan la variante F.

Brevemente, las células objetivo BxPC3 y MKN-45 se recolectaron y se sembraron a razón de 1000 células/pocillo en 30 pL y se incubaron durante la noche a 37 °C, 5 % de CO2, 95 % de humedad relativa. Al día siguiente, se retiró el medio y se agregaron 10 pL de dilución de anticuerpo a cada pocillo (dilución de anticuerpo 1.5x; titulación en serie de 9 pasos con pasos de dilución semilogarítmica que dieron como resultado una concentración de ensayo de 1 ng/mL a 10 pg/mL). El mismo día, las células efectoras se descongelaron a 37 °C y se agregaron 630 pL a 3.6 mL de tampón de ensayo en un tubo de 15 mLy se mezclaron por inversión; luego se agregaron 5 pL de esta solución (15,000 células) a los pocillos de la placa de ensayo. La placa se incubó durante 6 horas a 37 °C, 5 % de CO2, 95 % de humedad relativa antes de agregar 15 pL de reactivo Bio-Glo a los pocillos de ensayo. La luminiscencia se midió utilizando un lector de placas EnVision.

En la Tabla 6 se proporciona una lista de muestras analizadas y los resultados de los ensayos se proporcionan en la Figura 18. El anticuerpo de control anti-HER3 x Eg Fr sin mejora de la ADc C (lote PB4522p25; MF4280xMF3178 descrito en el documento WO2015/130172) fue negativo en los cuatro ensayos (indicado por cruces negras y líneas continuas (4to desde arriba) en la Figura 18). Por el contrario, la versión mejorada de ADCC de este anticuerpo (PB4522p34) fue positiva en los cuatro ensayos (indicados por círculos naranjas continuos). De manera similar, el anticuerpo de control antic-MET x EGFR sin mejora de la ADCC (PB8532p04) fue negativo en los cuatro ensayos (indicado por cruces negras y líneas discontinuas en la Figura 18), al igual que el lote PB8532p05 que también fue sin mejora de la ADCC (indicado por asteriscos verdes). Las tres líneas con asteriscos están en la parte inferior de los cuatro paneles. Sin embargo, la variante p06 con mejora de la ADCC (PB8532p06) fue positiva en todos los ensayos (indicado por círculos naranja abiertos). También se observó una función efectora de ADCC mejorada similar a la de PB8532p06 para los cinco biespecíficos (PB19474 a PB19478). Esto significó que la cotransfección del ADN codificante de RMD mejoró con éxito la función efectora del ADCC.

Ejemplo 6

La región variable de cadena pesada (VH) del dominio variable cMET de PB8532 comprende el aminoácido de MF4356 como se muestra, por ejemplo, en la figura 8. El VH del dominio variable de cMET de PB19748 comprende la secuencia de aminoácidos de MF8230 (ver figura 8). El VH del dominio variable EGFR de PB8532 comprende el aminoácido de MF3370 como se muestra, por ejemplo, en la figura 7. El VH del dominio variable EGFR de PB19748 comprende la secuencia de aminoácidos de MF8233 de la figura 7. La cadena ligera en PB8532 y PB19748 es la misma y se representa en la figura 9B. El anticuerpo cMET LY2875358 se describe entre otros en Kim y Kim 2017. Se probó la capacidad del anticuerpo biespecífico cMETxEGFR PB8532 o PB19748 para inhibir el crecimiento tumoralin vivosolo y en combinación con el inhibidor de la tirosina quinasa del receptor erlotinib en un modelo de ratón de xenoinjerto. En el modelo elegido, las células tumorales HCC827 se injertan en ratones inmunodeficientes NOD SCID gamma (NSG) con desactivación del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (hHGFki), que expresan HGF humano (ligando para cMET) en lugar de HGF endógeno de ratón. Los ratones NSG-hHGFki se conocen completamente como NOD.Cg-Hgftm11(HGF)Aveo Prkdcscid Il2rgtmiwil/J (stk#014553) (NOD.Cg-Hgftm1.1(HGF)Aveo Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/J). No tienen células T o B, carecen de células NK funcionales y son deficientes en la señalización de citocinas, lo que permite un mejor injerto del tumor. HCC827 es una línea celular de carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) humano establecida que expresa EGFR y cMET y se sabe que es resistente a erlotinib en presencia de HGF.

Para establecer el efecto de erlotinib sobre el crecimiento tumoral en este modelo, se realizó un primer experimento con dos grupos de ratones. Antes del injerto de células tumorales, se estimuló el ciclo celular de las células HCC827 cultivándolas durante la noche en un medio suplementado con 20 % de suero bovino fetal (FBS) con una confluencia que no excediera el 80 %. Al día siguiente, a ratones NSG-hHGFki (The Jackson Laboratory) se les inocularon por vía subcutánea 17x10e6 células tumorales HCC827 suspendidas en 300 pL de PBS más un 30 % de matrigel que contenía una alta concentración de matriz de membrana basal. Los tumores resultantes se midieron dos veces por semana utilizando calibradores. Cuando el volumen tumoral medio alcanzó aproximadamente 200 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en dos grupos (4-7 ratones por grupo dependiendo del crecimiento y volumen del tumor) y se inició el tratamiento farmacológico.

Se preparó una suspensión fina de erlotinib cada semana en 0.05 % de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y 0.2 % de Tween-80 en agua mediante sonicación.

A partir del día 19, se utilizó la solución de erlotinib para tratar a 5 ratones una vez al día (QD) por sonda nasogástrica con una dosis de 6 mg/kg (n=5), y a un grupo de 4 ratones se les administró una vez al día por sonda nasogástrica con 200 pL de vehículo (0.05 % de HPMC y 0.1 % de Tween 80 en agua). El volumen del tumor se midió dos veces por semana utilizando calibradores y se calculó el volumen tumoral medio (y SEM) para cada grupo. Cuando el tamaño del tumor alcanzó los 1500 mm3 los ratones fueron sacrificados. El tratamiento se interrumpió después del día 48 y se midió el volumen del tumor en los ratones sobrevivientes hasta el día 62.

En un segundo experimento que probó la capacidad del anticuerpo biespecífico PB8532 para inhibir el crecimiento tumoral en este modelo (solo y en combinación con erlotinib), a ratones NSG-hHGFki con tumores (generados como se describió anteriormente) se les administró uno de seis tratamientos o tratamientos combinados, mediante los cuales el anticuerpo se administró semanalmente por inyección intraperitoneal (ip) y erlotinib o el vehículo se administró una vez al día (QD) por sonda. Como control negativo, los ratones también fueron tratados con PB17160, un anticuerpo biespecífico compuesto por el mismo brazo Fab anti-cMET que en PB8532, en combinación con un brazo Fab específico para un objetivo irrelevante. Un objetivo irrelevante es, por ejemplo, un objetivo que no está presente en el ratón y en el tumor. A menudo se utiliza un dominio variable específico del toxoide tetánico. Un dominio variable de unión al toxoide tetánico adecuado tiene el VH de MF1337 (véase la figura 1) y una luz común como se divulga en este documento, preferiblemente una secuencia de la figura 9. Los anticuerpos biespecíficos con un brazo objetivo y un brazo no objetivo (TT) se describen, entre otros, en el documento WO2017/069628, ver MF1337. Otro objetivo irrelevante es el RsV-G. Un dominio variable adecuado del RSV-G tiene la VH de MF2708 de la figura 1 y una cadena ligera común, preferiblemente una de la figura 9, preferiblemente la 9B.

El día 21, cuando el volumen tumoral medio había alcanzado aproximadamente 200 mm3, los ratones fueron divididos aleatoriamente en seis grupos (5-7 ratones por grupo dependiendo del crecimiento y volumen del tumor) y se inició el tratamiento farmacológico: sonda diaria con vehículo solo (n = 5); inyecciones ip semanales de 25 mg/kg de anticuerpo PB8532 más sonda diaria con vehículo (n = 7); inyecciones ip semanales de 25 mg/kg de anticuerpo PB17160 más sonda oral diaria con vehículo (n = 6); sonda oral diaria con 6 mg/kg de erlotinib (n = 7); inyecciones ip semanales de 25 mg/kg de anticuerpo PB8532 más sonda oral diaria con 6 mg/kg de erlotinib (n = 7); o inyecciones ip semanales de 25 mg/kg de anticuerpo PB17160 más sonda oral diaria con 6 mg/kg de erlotinib (n = 7). Como antes, se monitoreó el volumen del tumor y se calculó el volumen tumoral medio (y SEM) en cada grupo. Todos los tratamientos se interrumpieron después del día 60 y se midió el volumen del tumor en los ratones sobrevivientes hasta el día 82.

En un tercer experimento se probó la capacidad del anticuerpo biespecífico PB19478 para inhibir el crecimiento tumoral en este modelo (solo y en combinación con erlotinib). A los ratones NSG-hHGFki con tumores (generados como se describe arriba) se les administró uno de seis tratamientos o tratamientos combinados, en los cuales el anticuerpo se administró semanalmente mediante inyección intraperitoneal (i.p.) y el erlotinib o el vehículo se administró una vez al día (QD) mediante sonda gástrica.

El día 23, cuando el volumen tumoral medio había alcanzado aproximadamente 200 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos (5-6 ratones por grupo dependiendo del crecimiento y volumen del tumor) y se inició el tratamiento farmacológico: sonda diaria con vehículo solo (n = 5); inyecciones ip semanales de 25 mg/kg de anticuerpo PB19478 más sonda diaria con vehículo (n = 5); sonda oral diaria con 6 mg/kg de erlotinib (n = 6); inyecciones ip semanales de 25 mg/kg de anticuerpo PB19478 más sonda oral diaria con 6 mg/kg de erlotinib (n = 4, un ratón murió durante el experimento); inyecciones ip semanales de 25 mg/kg de anticuerpo LY2875358 más sonda diaria con vehículo (n = 5); inyecciones ip semanales de 25 mg/kg de anticuerpo LY2875358 más sonda oral diaria con 6 mg/kg de erlotinib (n = 3, dos ratones murieron durante el experimento). Como antes, se monitoreó el volumen del tumor y se calculó el volumen tumoral medio (y SEM) en cada grupo. Todos los tratamientos se interrumpieron después del día 93 y se midió el volumen del tumor en los ratones sobrevivientes hasta el día 93.

En un cuarto experimento se comprobó el efecto de una administración posterior de PB19478. A los ratones NSG-hHGFki con tumores (generados como se describe arriba) se les administró uno de dos tratamientos: el anticuerpo se administró semanalmente mediante inyección intraperitoneal (i.p.) y el erlotinib o el vehículo se administró una vez al día (QD) mediante sonda gástrica.

El día 21, cuando el volumen tumoral medio había alcanzado aproximadamente 200 mm3, atodos los 14 ratones se les inició un tratamiento oral diario con 6 mg/kg de erlotinib. El día 51, cuando el volumen tumoral medio había superado claramente los 500 mm3 los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en dos grupos. Un grupo de seis recibió tratamiento oral diario con 6 mg/kg de erlotinib y un grupo de 8 recibió inyecciones intraperitoneales semanales de 25 mg/kg del anticuerpo PB19478 más 6 mg/kg de erlotinib diarios. Como antes, se monitoreó el volumen del tumor y se calculó el volumen tumoral medio (y SEM) en cada grupo. Todos los tratamientos se interrumpieron después del día 72.

Los resultados del primer experimento demuestran que erlotinib fue capaz de inducir una respuesta antitumoral en ratones NGS-hHGFki injertados con células HCC827, pero sólo mientras los ratones recibieron el tratamiento (Figura 19). En el período sin fármaco que comenzó después de aproximadamente 4 semanas de tratamiento, el volumen del tumor aumentó claramente en los ratones que habían sido tratados con erlotinib.

El anticuerpo biespecífico anti-cMETxEGFR PB8532 también fue capaz de inducir una respuesta antitumoral en ratones NGS-hHGFki injertados con células HCC827 (Figura 20). Este efecto fue mayor cuando el anticuerpo se administró en combinación con dosis diarias de erlotinib. En 2.5 semanas todos los tumores desaparecieron con la combinación de PB8532 con erlotinib. El anticuerpo de control PB17160 dirigido a cMet con un brazo Fab no indujo respuesta antitumoral, con o sin erlotinib. Por lo tanto, el direccionamiento específico del brazo Fab de cMet mediante la combinación con un brazo Fab dirigido a EGFR en el anticuerpo biespecífico PB8532 puede superar la resistencia a erlotinib mediada por HGF.

En el período sin fármaco que comenzó después de aproximadamente 51^ semanas de tratamiento, PB8532 fue claramente más eficaz que erlotinib para reducir el volumen del tumor (Figura 21) y no se observó nuevo crecimiento del tumor en el grupo de combinación de PB8532 erlotinib.

El anticuerpo biespecífico anti-cMETxEGFR PB19478 también fue capaz de inducir una respuesta antitumoral en ratones NGS-hHGFki injertados con células HCC827 (Figura 22). Este efecto fue mayor cuando el anticuerpo se administró en combinación con dosis diarias de erlotinib. En 2 semanas todos los tumores desaparecieron con la combinación de PB19478 con o sin erlotinib. Con erlotinib el tumor no reapareció en el período de prueba. Sin erlotinib, el tumor reapareció poco después, alrededor del día 50, y permaneció en el nivel de detección hasta que finalmente creció más a partir del día 80. El anticuerpo monoclonal humanizado emibetuzumab (LY3875358) fue menos eficaz, también cuando se combinó con el inhibidor del EGFR erlotinib. Por lo tanto, el direccionamiento específico del brazo Fab de cMet mediante la combinación con un brazo Fab dirigido a EGFR en el anticuerpo biespecífico PB8532 o PB19478 puede superar la resistencia a erlotinib mediada por HGF.

La Figura 23 muestra que cuando se tratan tumores en un momento en el que comienza a desarrollarse resistencia al erlotinib, hay un efecto inmediato del anticuerpo biespecífico PB19478.

En conjunto, los datos de este modelo de xenoinjerto de células tumorales HCC827 injertadas en ratones NSG-hHGFki inmunodeficientes muestran que PB8532, PB19478 y los anticuerpos que tienen secuencias de VH similares dadas en las figuras 7 y 8 tienen la capacidad de superar la resistencia a erlotinib mediada por HGFin vivo.El tratamiento combinado continúa siendo eficaz después de suspender el tratamiento.

Arte citado

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125084 Erbitux Pharmacology Review Part 2 - FDA.

Tabla 1. Anticuerpos de referencia con especificidades reportadas contra dominios extracelulares de cMET. Nombre Nombre INN Epítopo MOA

5D5 MetMAb Dominio Sema Bloqueo de HGF

13.3.2

224G11

C8-H241 LY-2875358 Bloqueo de HGF, internalización R13 13-MET

Tabla 2. Competencia de los anticuerpos de referencia cMet con los anticuerpos cLC cMET. Se muestran los valores de OD450. Los valores de OD450 indican la existencia o falta de competencia con el anticuerpo indicado. MF4506 no fue probado.

Tabla 3. Lista de los 24 anticuerpos biespecíficos cMETxEGFR seleccionados después de experimentos de titulación dependientes de la dosis en un ensayo de proliferación de HGF/EGF en N87. Se indica el número de MF de los brazos de EGFR y cMET en cada PB individual, así como su secuencia de HCDR3

Tabla 4. Resumen de los experimentos de titulación de anticuerpos realizados utilizando ensayos de proliferación de HGF/EGF, HGF y EGF en N87 con los 24 anticuerpos biespecíficos cMETxEGFR. Los biespecíficos se indican como PBXXXX y los diferentes brazos Fab con MGXXXX. La actividad de los biespecíficos en los ensayos individuales se indica como: - sin efecto; inhibición de la proliferación menor que el control positivo; + = inhibición de la proliferación comparable al anticuerpo de control positivo Fab 5D5; ++ = inhibición de la proliferación mayor que el anticuerpo de control positivo Fab 5D5.

Tabla 5. Composición de los anticuerpos biespecíficos EGFRxcMET más potentes y su competencia con los anticuerpos de referencia.

Tabla 6. Composición de anticuerpos biespecíficos. El número pXX indica el número de la serie de producción y puede utilizarse para identificar si el anticuerpo se produjo en una versión de ADCC o no.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio variable que puede unirse a una parte extracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR) y un segundo dominio variable que puede unirse a una parte extracelular del protooncogén MET humano, receptor de tirosina quinasa (cMET), en donde el primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYGIS; una secuencia de CDR2 WISAYNGNTNYAQKLQG y una CDR3 que comprende la secuencia DRHWHWWLDAFDY; y en donde el segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYSMN; una secuencia de Cd R2 WINTYTGDPTYAQGFTG y una secuencia de CDR3 ETYYYDRGGYPFDP;

o

2. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, que es un anticuerpo humano.

3. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1 o 2, que es un anticuerpo de longitud completa.

4. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es un anticuerpo en formato de IgG1 que tiene una estequiometría anti-EGFR, anti-cMET de 1:1.

5. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que tiene un dominio variable que puede unirse a EGFR y un dominio variable que puede unirse a cMET.

6. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el dominio variable que puede unirse al EGFR humano también puede unirse al EGFR de cynomolgus y de ratón.

7. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el dominio variable que puede unirse al EGFR humano se une al dominio III del EGFR humano.

8. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el dominio variable que puede unirse a cMET bloquea la unión del anticuerpo 5D5 a cMET

9. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el dominio variable que puede unirse a cMET bloquea la unión de HGF a cMET.

10. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que los aminoácidos en las posiciones 405 y 409 en un dominio CH3 son los mismos que los aminoácidos en las posiciones correspondientes en el otro dominio CH3 (numeración de la UE).

11. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la región variable de cadena pesada del segundo dominio variable comprende la secuencia de aminoácidos de una de las secuencias de la SEQ ID NO: 13 o 23 con 0-10, preferiblemente 0-5, inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos, en donde dichas inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos no están dentro de las secuencias de CDR indicadas.

12. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de una de las secuencias de

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGW

ISAYNGNrrNYAQKLQGHVrrMrITDTSrrSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAKDR

I fWI 1WWLDAFDYWGQGTLVTVSS (MF3370).

o

q v q l v q s g a e v k k p g a s v k v s c k a s g y t f t s y g is w v r q a p g q g l e w m g w is a y n a n t n y a q k l q g r v t m t TDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAKDR HWHWWLDAFDYWGQGTLVTSS (MF8233), con 0-10, preferiblemente 0-5, unas inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos, en donde dichas inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos no están dentro de las secuencias de CDR indicadas.

13. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYGIS; una secuencia de CDR2 WISAYNGNTNYAQKLQG y una CDR3 que comprende la secuencia DRHWHWWLDAFDY y en el que el segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYSMN; una secuencia de CDR2 WINTYTGDPTYAQGFTG y una secuencia de CDR3 ETYYYDRGGYPFDP.

14. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 SYGIS; una secuencia de CDR2 WISAYNANTNYAQKLQG y una CDR3 que comprende la secuencia DRHWHWWLDAFDY y en el que el segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia de CDR1 TYSMN; una secuencia de Cd R2 WINTYTGDPTYAQGFTG y una CDR3 que comprende la secuencia ETYFYDRGGYPFDP.

15. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que el primer y segundo dominio variable comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK o DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK, con 0-10, preferiblemente 0-5, inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos, en el que dichas inserciones, eliminaciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos o una combinación de los mismos no están dentro de las secuencias de CDR.

16. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor.

17. El anticuerpo biespecífico para uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el tumor es un tumor positivo para EGFR, un tumor positivo para cMET o un tumor positivo para EGFR y cMET.

18. El anticuerpo biespecífico para uso de acuerdo con la reivindicación 16 o la reivindicación 17, en el que el tumor es un cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células no pequeñas o cáncer de vejiga.

19. El anticuerpo biespecífico para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16-18, en el que el tumor es resistente al tratamiento con un inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR.

20. El anticuerpo biespecífico para uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR es erlotinib, gefitinib o afatinib, un análogo de erlotinib, gefitinib o afatinib o una combinación de uno o más de los respectivos compuestos y/o análogos de los mismos.

21. El anticuerpo biespecífico para uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR es erlotinib.