RS66947B1

RS66947B1 - Jedinjenje inhibitora više kinaza, i njegova kristalna forma i upotreba

Info

Publication number: RS66947B1
Application number: RS20250631A
Authority: RS
Inventors: Frank Wu
Original assignee: Transthera Sciences Nanjing Inc
Priority date: 2016-12-13
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2025-07-31
Also published as: KR102373577B1; JP2019518784A; EP3447056B1; US20190040064A1; CN108218868B; RU2723985C9; US10889586B2; US10208042B1; PT3447056T; RU2723985C1; SI3447056T1; HUE071671T2; JP6594571B2; ES3033634T3; US20190152972A1; CN108218868A; BR112019008295A2; BR112019008295B1; CA3041155C; DK3447056T3

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST

[0001] Pronalazak pripada oblasti medicinske tehnologije, posebno se odnosi na jedinjenje inhibitora više kinaza, njegovu kristalnu formu i upotrebu.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Normalna deoba ćelija je od suštinskog značaja za zdravlje organizma i opstanak ćelijskih organa. Tokom ovog procesa, unutarćelijski materijal se u potpunosti rekombinuje, a dve identične kopije hromozoma se razdvajaju u dve ćelije kćerke pomoću bipolarnog deobnog vretena. Kada dođe do greške u procesu mitoze, broj hromozoma u ćeliji postaje abnormalan, što može dovesti do ćelijske smrti ili podstaći razvoj normalnih ćelija u tumorske ćelije. Proces mitoze uglavnom zavisi od tri mehanizma: ①lokalizacija proteina; ②proteoliza; ③ fosforilacija. U ovim procesima učestvuju neke serin/treonin kinaze, poznate i kao mitotske kinaze.

[0003] Aurora kinaza je jedna vrsta mitotskih kinaza i otkrivena je 1995. godine. Ekspresija Aurora kinaze je prvi put primećena u ljudskom tumorskom tkivu 1998. godine Sada je postala značajna meta za istraživanja u borbi protiv raka. Porodica Aurora kinaza uključuje tri visoko homologne kinaze: Aurora A, Aurora B i Aurora C. Među njima, Aurora A i Aurora B se mogu detektovati.

[0004] Sada je dokazano da je Aurora A onkogen, čija prekomerna ekspresija blokira pravilno formiranje kompleksa mitotske kontrolne tačke, što dovodi do genetske nestabilnosti i formiranja tumora. Aurora B je važna kinaza koja reguliše normalnu mitozu ćelija. Prekomerna ekspresija Aurore B je široko rasprostranjena u tumorima. Tumorske ćelije postaju osetljivije kada je Aurora B inhibirana. S obzirom na ključne uloge Aurore A i Aurore B u procesu ćelijske mitoze, istraživanje i razvoj antitumorskih lekova koji ciljaju Aurora kinazu privlače sve više pažnje. Pored toga, Aurora kinaze su neefikasne protiv ćelija koje ne proliferišu, jer se eksprimiraju i aktiviraju tokom mitoze. Stoga, inhibitori Aurora kinaze spadaju u ciljane antitumorske lekove i imaće veće prednosti u odnosu na druge nespecifične citotoksične lekove.

[0005] Pored povezanosti sa prekomernom ekspresijom mitotskih kinaza, rast i migracija tumora takođe zavise od stvaranja velikog broja novih krvnih sudova, u čemu VEGF/VEGFR (vaskularni endotelni faktor rasta/receptor za vaskularni endotelni faktor rasta) put igra ključnu ulogu u neovaskularizaciji tumora. Među njima, VEGFR je tip tirozin kinaznog transmembranskog glikoproteina koji se sastoji od ekstracelularnog regiona sastavljenog od 7 Ig-sličnih domena, jednog transmembranskog domena i citoplazmatskog regiona sa strukturom tirozin kinaze. Postoje tri podtipa VEGFR-a, a to su VEGFR1, VEGFR2 i VEGFR3. Konformacija VEGFR-a se menja nakon vezivanja sa VEGF-om, što dovodi do dimerizacije receptora, autofosforilacije tirozinskog mesta u unutarćelijskom segmentu i aktivacije nizvodnog puta prenosa signala. VEGFR2 (KDR) je uglavnom distribuiran u vaskularnim endotelnim ćelijama i hematopoetskim matičnim ćelijama. VEGFR2(KDR) je usko povezan sa disfunkcijom hematopoetskog sistema pre malignih proliferativnih lezija, kao što su trombocitemija, primarna trombocitemija, mijelofibroza (MF), hronična idiopatska mijelofibroza (IMF), policitemija (PV), prekancerozni mijelodisplastični sindrom i hematološki maligniteti. Među njima, hematološki maligniteti uključuju, ali nisu ograničeni na, leukemiju (ne-Hodgkinov limfom), Hodgkinovu bolest (takođe poznatu kao Hodgkinov limfom) i mijelom, na primer, akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), akutnu promijelocitnu leukemiju (APL), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), hroničnu mijeloidnu leukemiju (CML), hroničnu neutrofilnu leukemiju (CNL), itd.

[0006] Trenutno postoje klinički inhibitori protiv Aurore A i Aurore B pojedinačno, kao i inhibitori protiv VEGFR-a. Međutim, ne postoje inhibitori više kinaza koji su istovremeno efikasni protiv navedenih kinaza. WO2013123840A1 otkriva klasu derivata azabenzo[f]azulena koji imaju antitumorske efekte, bez navođenja njihovog terapijskog mehanizma. EP 2818171 A1 otkriva derivate aza-benzo[f]azulena i njihovu upotrebu u lečenju raka, ali nijedno od jedinjenja otkrivenih u njemu ne ispunjava kriterijume predmetnog pronalaska da R4ne može biti C1-6alkil kada je Y CR3, P je CR4i W je N. WO 2006/040036 A1 otkriva pirazolobenzodiazepine kao inhibitore CDK2, a CN 1348455 A otkriva jedinjenja pirazolobenzodiazepina. Međutim, ovi dokumenti ne otkrivaju jedinjenje predstavljeno formulom (I) prema predmetnom pronalasku, u kojem je W definisano kao N.

SAŽETAK PRONALASKA

[0007] Predmetni pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima. Uopšteno, predmetni pronalazak obezbeđuje klasu jedinjenja (inhibitori više kinaza) prikazanih formulama (I) i (II), ili njihove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomere, koji su sposobni da inhibiraju, regulišu i/ili modulišu aktivnost jedne ili više protein kinaza kao što su Aurora kinaza i VEGFR kinaza; kristalnu formu I jedinjenja prikazanog formulom (III); i farmaceutske formulacije i farmaceutske kompozicije koje sadrže navedena jedinjenja i/ili kristalnu formu I, za upotrebu u lečenju bolesti posredovanih abnormalnostima ovih kinaza, posebno bolesti povezanih sa rakom. Pronalazak takođe obezbeđuje metode za pripremu navedenih jedinjenja i kristalne forme, kao i jedinjenja, kristalnu formu, farmaceutske formulacije i/ili farmaceutske kompozicije za upotrebu u lečenju goreopisanih bolesti kod sisara, posebno kod ljudi.

[0008] U tu svrhu, predmetni pronalazak prvenstveno obezbeđuje jedinjenje prikazano formulom (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomere:

pri čemu,

X se bira između CH ili N;

R1se bira iz grupe koju čine vodonik, C1-6alkil, C3-6cikloalkil, C1-6alkoksi, halogenovani C1-6alkil i halogenovani C1-6alkoksi;

R2se bira iz grupe koju čine vodonik, C1-6alkil i C3-6cikloalkil;

Y je CR3;

P je CR4;

W je N;

R3se bira iz grupe koju čine vodonik, hidroksil, amino, karboksil, cijano, nitro, halogen, C1-6alkil, C1-6alkoksi, C3-6cikloalkiloksi, oksa C5-8cikloalkiloksi, halogenovani C1-6alkoksi, C2-8alkenil, C2-8alkinil, C3-6cikloalkilamino, C1-6alkilsulfonil, C3-8cikloalkilsulfonil, C1-6alkilkarbonil, C3-6cikloalkilkarbonil, -NR11-(CH2)n-N(R7)(R8), C1-6alkiltio-(CH2)n-, -(CH2)n-(3-14)-člani cikloalkil, -(CH2)n-(6-14)-člani aril, -(CH2)n-(5-14)-člani heterociklil i -(CH2)n-(5-14)-člani heteroaril; pri čemu je n=0-6; heterociklil ili heteroaril ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, a atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, atom C koji formira prsten u cikloalkilu, arilu, heterociklilu ili heteroarilu može biti opciono oksidovan u C(O); a cikloalkil, aril, heteroaril ili heterociklil mogu biti opciono supstituisani sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila ili C3-6cikloalkila;

R4je -(CH2)n-(5-14)-člani heterociklil, pri čemu je n=0-6; heterociklil ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, a atom C koji formira prsten može biti opciono oksidovan u C(O); a heterociklil može biti opciono supstituisan sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila ili C3-6cikloalkila;

R7i R8su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, C1-6alkil, C3-6cikloalkil, C1-

6alkoksi, halogenovani C1-6alkil ili halogenovani C1-6alkoksi;

Ar se bira iz grupe koju čine 3-14-člani cikloalkil, 6-14-člani aril, 5-14-člani heterociklil i 5-14-člani heteroaril; heterociklil ili heteroaril ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, a atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, atom C koji formira prsten u cikloalkilu, arilu, heterociklilu ili heteroarilu može biti opciono oksidovan u C(O); a Ar može biti opciono supstituisan sa 1 do 3 R6;

R6je svaki nezavisno izabran iz grupe koju čine vodonik, hidroksil, amino, karboksil, cijano, nitro, halogen, C1-6alkil, C3-6cikloalkil, C1-6alkoksi, C3-6cikloalkiloksi , halogenovani C1-6alkoksi, halogenovani C1-6alkil, C3-6cikloalkil, C2-8alkenil, C2-8alkinil, - NR11-(CH2)n-N(R9)(R10), amino C1-6alkil, C3-6cikloalkilamino, C1-6alkilsulfonil, C3-8cikloalkilsulfonil, C1-6alkilkarbonil, C3-6cikloalkilkarbonil, C1-6alkiltio, -(CH2)n-(6-14)-člani cikloalkil, -(CH2)n-(6-14)-člani aril, -(CH2)n-(5-14)-člani heterociklil i -(CH2)n-(5-14)-člani heteroaril; pri čemu je n=0-6, a cikloalkil, aril, heteroaril ili heterociklil mogu biti opciono supstituisani sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila;

R9i R10su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, C1-6alkil, C3-6cikloalkil, C1-

6alkoksi, halogenovani C1-6alkil i halogenovani C1-6alkoksi; i

R11se bira iz grupe koju čine vodonik, C1-6alkil i C3-6cikloalkil.

[0009] Jedno otelotvorenje predmetnog pronalaska odnosi se na prethodno pomenuto jedinjenje prikazano formulom (I), njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomere, pri čemu,

R1se bira između C1-3alkila, poželjno metila ili etila;

R2se bira iz grupe koju čine vodonik, metil i etil;

X je N;

Ar se bira iz grupe koju čine 6-14-člani aril ili 5-10-člani heteroaril; heteroaril ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, a atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, atom C koji formira prsten u arilu i heteroarilu može biti opciono oksidovan u C(O), pri čemu Ar može biti opciono supstituisan sa 1 do 3 R6; i

R6je svaki nezavisno izabran iz grupe koju čine vodonik, amino, cijano, halogen, C1-4alkil, trifluorometil, metilsulfonil, -(CH2)n-(5-10)-člani heterociklil, -(CH2)n-(5-10)člani heteroaril, pri čemu je n=0-6, a heteroarilni prsten a heterociklil može biti opciono supstituisan sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila.

[0010] Jedno otelotvorenje predmetnog pronalaska odnosi se na prethodno pomenuto jedinjenje prikazano formulom (II), njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomere:

pri čemu,

Ar se bira iz grupe koju čine fenil i 5-6-člani heteroaril; heteroaril ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, a atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, atom C koji formira prsten u arilu i heteroarilu može biti opciono oksidovan u C(O), pri čemu Ar može biti opciono supstituisan sa 1 do 3 R6;

R6je svaki nezavisno izabran iz grupe koju čine vodonik, amino, cijano, halogen, C1-4alkil, trifluorometil i metilsulfonil, a halogen je poželjno hlor;

R3se bira iz grupe koju čine vodonik, hidroksil, amino, karboksil, cijano, nitro, halogen, C1-4alkil, C1-4alkoksi, C3-6cikloalkiloksi, oksa C5-8cikloalkiloksi, halogenovani C1-4alkoksi, C2-6alkenil, C2-6alkinil, C3-6cikloalkilamino, C1-4alkilsulfonil, C3-8cikloalkilsulfonil, C1-4alkilkarbonil, C3-6cikloalkilkarbonil, -NR11-(CH2)n-N(R7)(R8), -(CH2)n-(3-14)-člani cikloalkil, -(CH2)n-(5-11)-člani heterociklil i -(CH2)n-(5-10)-člani heteroaril; pri čemu je n=0-6; heterociklil ili heteroaril ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, a atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, atom C koji formira prsten u cikloalkilu, heterociklilu ili heteroarilu može biti opciono oksidovan u C(O); a cikloalkil, heteroaril i heterociklil mogu biti opciono supstituisani sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila ili C3-6cikloalkila;

R4je -(CH2)n-(5-11)-člani heterociklil, pri čemu je n=0-6; heterociklil ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, a atom C koji formira prsten može biti opciono oksidovan u C(O); a heterociklil može biti opciono supstituisan sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila ili C3-6cikloalkila. R7i R8su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, metil, etil, izopropil ili ciklopropil; i

R11se bira iz grupe koju čine vodonik, C1-6alkil i C3-6cikloalkil.

[0011] Jedno otelotvorenje predmetnog pronalaska odnosi se na prethodno pomenuto jedinjenje prikazano formulom (I) ili (II), njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomere, pri čemu,

[0012] Ar se može izabrati iz grupe koju čine:

R3se bira iz grupe koju čine: vodonik, metil, etil, izopropil,

R4se bira iz grupe koju čine:

[0013] Jedno otelotvorenje predmetnog pronalaska odnosi se na prethodno pomenuto jedinjenje formule (I) ili (II), njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomere, pri čemu, Ar se bira između fenila ili 5-6-članog heteroarila, Ar može biti opciono supstituisan sa 1-3 R6, R6je svaki nezavisno izabran iz grupe koju čine vodonik, amino, cijano, halogen, C1-4alkil, trifluorometil ili metilsulfonil;

R3se bira između vodonika ili C1-4alkila; i

R4je -(CH2)n-(5-11)-člani heterociklil; pri čemu je n=0-6; heterociklil ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, a atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, atom C koji formira prsten može biti opciono oksidovan u C(O); a heterociklil može biti opciono supstituisan sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila ili C3-6cikloalkila.

[0014] Jedno otelotvorenje predmetnog pronalaska odnosi se na prethodno pomenuto jedinjenje formule (I) ili (II), njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomere, pri čemu,

Ar se bira između fenila ili piridila; Ar može biti opciono supstituisan sa 1 do 3 R6, pri čemu je R6svaki nezavisno izabran iz grupe koju čine vodonik, amino, cijano, halogen, C1-4alkil, trifluorometil i metilsulfonil;

R3se bira između vodonika ili C1-4alkila; i

R4je -(CH2)n-(5-6)-člani monoheterociklil ili -(CH2)n-(7-11)-člani kondenzovani heterociklil, pri čemu je n=0-6; heterociklil ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, a atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, atom C koji formira prsten može biti opciono oksidovan u C(O); a heterociklil može biti opciono supstituisan sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila ili C3-6cikloalkila; i poželjno, R4se bira iz grupe koju čine:

n=0-3; pri čemu heterociklil može biti opciono supstituisan sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkil grupa ili C3-6cikloalkil grupa.

[0015] U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, prethodno pomenuto jedinjenje prikazano formulom (I) ili (II), njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomeri prikazani su u tabeli 1:

Tabela 1

[0016] Specifična jedinjenja otkrivena u tabeli 1 koja ne spadaju u opseg priloženih patentnih zahteva data su kao referentni primeri.

[0017] Pošto se kristalna forma jedinjenja znatno razlikuje od drugih formi u pogledu stabilnosti i rastvorljivosti, proučavanje kristalne forme je veoma važno u razvoju leka. Istraživači su proučavali jedinjenje formule (III) kako sledi i dobili su kristalnu formu jedinjenja. Na osnovu toga, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje kristalnu formu I jedinjenja formule (III).

[0018] Kristalna forma I jedinjenja prikazanog formulom (III), 4-(5-(2-hlorofenil)-3-metil-2,10-dihidropirazolo[4,3-b]pirido[4,3-e][1,4]diazepan-8-il)morfolin, ima karakteristične pikove na 7.4±0.2°, 17.9±0.2°, 18.9±0.2°, 19.4±0.2°, 21.5±0.2° i 23.7±0.2° u difrakcionom obrascu rendgenske praškaste difrakcije. U specifičnom otelotvorenju rendgenske praškaste difrakcije predmetnog pronalaska, može se koristiti Cu-Kα zračenje, a karakteristični pikovi su predstavljeni uglovima 2θ;

U jednom otelotvorenju pronalaska, pored gore opisanih karakterističnih pikova, kristalna forma I jedinjenja prikazanog formulom (III) takođe ima karakteristične pikove na 14,0 ±0,2 °, 15,0 ±0,2 °, 20,7 ±0,2 ° i 25,4 ±0,2 °.

[0019] U jednom otelotvorenju pronalaska, pored gore opisanih karakterističnih pikova, kristalna forma I jedinjenja prikazanog formulom (III) takođe ima karakteristične pikove na 11,7 ±0,2 °, 22,8 ±0,2 ° i 27,8 ±0,2 ° predstavljene uglom 2θ u difrakcionom obrascu rendgenske praškaste difrakcije.

[0020] Pronalazak takođe obezbeđuje metodu za pripremu kristalne forme I jedinjenja formule (III), koja može obuhvatati:

rastvaranje jedinjenja prikazanog formulom (III) u pojedinačnom ili mešanom rastvaraču uz zagrevanje, i hlađenje radi taloženja kristalne forme I;

ili

suspendovanje jedinjenja prikazanog formulom (III) u pojedinačnom ili mešanom rastvaraču, mešanje i filtriranje da bi se dobila kristalna forma I;

ili

rastvaranje jedinjenja formule (III) u pojedinačnom ili mešanom rastvaraču, i koncentrovanje pod vakuumom da bi se dobila kristalna forma I.

[0021] U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, pojedinačni ili mešani rastvarač koji se koristi u gore navedenoj metodi za pripremu kristalne forme I može biti jedan ili više izabranih iz grupe koju čine metanol, etanol, tetrahidrofuran, 2-metiltetrahidrofuran, dihlormetan, dihloretan, etil-acetat, acetonitril, dimetil-sulfoksid, dimetil-sulfoksid/voda, metanol/tetrahidrofuran, metanol/2-metiltetrahidrofuran, metanol/dihlormetan, etanol/2-metiltetrahidrofuran i dihlormetan/voda; poželjno metanol, etanol, tetrahidrofuran, 2-metiltetrahidrofuran, dimetil-sulfoksid, dimetil-sulfoksid/voda, metanol/tetrahidrofuran, metanol/2-metiltetrahidrofuran, etanol/2-metiltetrahidrofuran i/ili dihlormetan/voda.

[0022] „Dimetil-sulfoksid/voda“ u predmetnom pronalasku označava mešavinu dimetilsulfoksida i vode; „metanol/tetrahidrofuran“ označava mešavinu metanola i tetrahidrofurana; „“metanol/2-metiltetrahidrofuran„“ označava mešavinu metanola i 2-metiltetrahidrofurana, „metanol/dihlormetan“ označava mešavinu metanola i dihlormetana, „etanol/2-metiltetrahidrofuran“ označava mešavinu etanola i 2-metiltetrahidrofurana, a „dihlormetan/voda“ označava mešavinu dihlormetana i vode.

[0023] U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, prethodno pomenuti pojedinačni ili mešani rastvarač se koristi u količini potrebnoj da se obezbedi rastvaranje svih polaznih supstanci, na primer, zapremina pojedinačnog ili mešanog rastvarača potrebna za 1 g jedinjenja prikazanog formulom (III) je od 90 mL do 200 mL.

[0024] Zapreminski odnos mešanog rastvarača koji se koristi može biti u opsegu od 0,1-20:1, poželjno u opsegu od 1-10:1, a još poželjnije u opsegu od 1-5:1. Na primer, etanol/2-metiltetrahidrofuran je 5:1, dihlormetan/voda je 2:1, metanol/dihlormetan je 5:1, i slično.

[0025] Pronalazak takođe obezbeđuje metodu za pripremu kristalne forme I jedinjenja prikazanog formulom (III), koja može obuhvatati:

pranje jedinjenja prikazanog formulom (III) odgovarajućom količinom pojedinačnog ili

mešanog rastvarača, mešanje, filtriranje (poželjno filtriranje pod sniženim pritiskom) i sušenje da bi se dobila kristalna forma I.

[0026] Pojedinačni ili mešani rastvarač je jedan ili više izabranih iz grupe koju čine metanol, etanol, tetrahidrofuran, 2-metiltetrahidrofuran, dihlormetan, dihloretan, etil-acetat, acetonitril, dimetil-sulfoksid, dimetil-sulfoksid/voda, metanol/tetrahidrofuran, metanol/2-metiltetrahidrofuran, metanol/dihlormetan, etanol/2-metiltetrahidrofuran, dihlormetan/voda; poželjno metanol, etanol, tetrahidrofuran, 2-metiltetrahidrofuran, dimetil-sulfoksid, dimetilsulfoksid/voda, metanol/tetrahidrofuran, metanol/2-metiltetrahidrofuran, etanol/2-metiltetrahidrofuran i/ili dihlormetan/voda.

[0027] Pronalazak takođe obezbeđuje metodu za pripremu jedinjenja prikazanog formulom (III), koja obuhvata:

(1) reakciju jedinjenja prikazanog formulom (III-A) sa jedinjenjem prikazanim formulom (III-B) da bi se dobilo jedinjenje formule (III-C);

(2) reakciju jedinjenja prikazanog formulom (III-C) sa jedinjenjem prikazanim formulom (III-D) da bi se dobilo jedinjenje formule (III-E);

(3) uklanjanje zaštitne grupe sa jedinjenja prikazanog formulom (III-E) da bi se dobilo jedinjenje prikazano formulom (III-F) ili (III-F') kao prelazno stanje;

(4) dobijanje jedinjenja prikazanog formulom (III) iz jedinjenja prikazanog formulom (III-F) ili (III-F');

pri čemu, skraćenica „PMB“ označava p-metoksibenzil.

[0028] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži prethodno pomenuta jedinjenja formule (I) ili (II), i farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomere istih.

[0029] U jednom otelotvorenju pronalaska, farmaceutska formulacija može sadržati jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, i može se primeniti oralno, parenteralno, rektalno ili putem plućne primene na pacijentu ili subjektu kojem je to potrebno. Za oralnu primenu, farmaceutska kompozicija se može formulisati u konvencionalnu čvrstu formulaciju kao što su tableta, kapsula, pilula, granula, itd.; ili u oralnu tečnu formulaciju kao što su oralni rastvor, oralna suspenzija, sirup, itd. Prilikom pripreme oralne formulacije može se dodati odgovarajuće punilo, vezivo, sredstvo za raspadanje, lubrikant ili slično. Za parenteralnu primenu, farmaceutska kompozicija se može formulisati kao injekcija, uključujući injekcionu tečnost, sterilni prašak za injekcije i koncentrovani rastvor za injekcije. Kada se formuliše injekcija, formulacija se može proizvesti konvencionalnom metodom u farmaceutskoj tehnologiji. Moguće je formulisati injekciju sa odgovarajućim dodatnim agensima u skladu sa svojstvima leka, ili bez dodatnih agenasa. Za rektalnu primenu, farmaceutska kompozicija se može formulisati kao supozitorija ili slično. Za plućnu primenu, farmaceutska kompozicija se može formulisati kao inhalant ili sprej, itd.

[0030] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži prethodno pomenuto jedinjenje formule (I) ili (II) ili farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomere istih, i jedan ili više drugih terapijski aktivnih agenasa.

[0031] U jednom specifičnom otelotvorenju predmetnog pronalaska, kompozicija se može koristiti u kombinovanoj primeni, u „terapijski efektivnoj količini“, prethodno pomenutog jedinjenja formule (I) ili (II) ili farmaceutski prihvatljivih soli ili stereoizomera istih, zajedno sa jednim ili više drugih terapijski aktivnih agenasa, kao što je sekvencijalna primena, simultana primena, ili alternativno, terapijski aktivni sastojci se formulišu u složenu formulaciju za primenu.

[0032] Drugi terapijski aktivni agens je antimetabolit, inhibitor faktora rasta, inhibitor mitoze, antineoplastični hormoni, alkilirajući agensi, metali, inhibitori topoizomeraze, hormonski lekovi, imunomodulatori, tumor-supresorski geni, vakcine protiv raka, imuni kontrolni punktovi, ili antitela ili malomolekulski lekovi povezani sa tumorskom imunoterapijom.

[0033] Pronalazak takođe obezbeđuje prethodno pomenuta jedinjenja formule (I) ili (II) ili farmakološki prihvatljive soli ili stereoizomere istih, ili prethodno pomenutu farmaceutsku formulaciju ili farmaceutsku kompoziciju, za upotrebu u lečenju raka posredovanog višestrukim kinazama, kao što su rak pluća, karcinom skvamoznih ćelija, rak bešike, rak želuca, rak jajnika, rak peritoneuma, rak dojke, duktalni karcinom dojke, rak glave i vrata, karcinom endometrijuma, rak tela materice, rak rektuma, rak jetre, karcinom bubrega, tumor bubrežne karlice, karcinom jednjaka, adenokarcinom jednjaka, gliom, rak prostate, rak štitne žlezde, rak ženskog reproduktivnog sistema, karcinom in situ, limfom, neurofibromatoza, rak kostiju, rak kože, rak mozga, rak debelog creva, rak testisa, gastrointestinalni stromalni tumor, rak usne duplje, rak ždrela, multipli mijelom, leukemija, ne-Hodgkinov limfom, horioadenom debelog creva, melanom, citom i sarkom.

[0034] „Terapijski efektivna količina“ koja se ovde koristi odnosi se na količinu prethodno pomenutog jedinjenja, kristalnu formu I i/ili farmaceutske formulacije koja je sposobna da barem ublaži simptome stanja kod pacijenta kada se primeni. Stvarna količina koja obuhvata „terapijski efektivnu količinu“ će varirati u zavisnosti od različitih okolnosti uključujući, ali ne ograničavajući se na, specifično stanje koje se leči, težinu stanja, telesnu građu i zdravlje pacijenta, i put primene. Stručni medicinski radnici mogu lako odrediti odgovarajuću količinu koristeći metode poznate u oblasti medicinskog lečenja.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0035] „Halogen“ kako se koristi u predmetnom pronalasku označava fluor, hlor, brom, jod i slično, a poželjno fluor i hlor.

[0036] Kako se ovde koristi, „okso“ označava da bilo koji C atom u supstituentu može biti oksidovan u „-C(O)-“; ako je sadržan heteroatom, heteroatom može formirati oksid, npr.

može biti oksidovan u

S može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2.

[0037] Kako se ovde koristi, „halogenovani“ označava da bilo koji atom vodonika u supstituentu može biti zamenjen jednim ili više halogena koji su identični ili različiti. „Halogen“ je definisan kao gore.

[0038] alkil“ kako se koristi u predmetnom pronalasku označava linearnu ili razgranatu alkil grupu dobijenu uklanjanjem jednog atoma vodonika iz ugljovodoničnog ostatka sa 1 do 6 atoma ugljenika, kao što su metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, izobutil, sec-butil, tert-butil, n-pentil, izopentil, 2-metilbutil, neopentil, 1-etilpropil, n-heksil, izoheksil, 4-metilpentil, 3-metilpentil, 2-metilpentil, 1-metilpentil, 3,3-dimetilbutil, 2,2-dimetilbutil, 1,1-dimetilbutil, 1,2-dimetilbutil, 1,3-dimetilbutil, 2,3-dimetilbutil, 2-etilbutil i 1-metil-2-metilpropil, itd. „C1-4alkil“ označava gore navedene primere sa 1 do 4 atoma ugljenika.

[0039] „C2-8alkenil“ kako se koristi u predmetnom pronalasku označava linearnu ili razgranatu alkenil grupu dobijenu uklanjanjem jednog atoma vodonika iz olefinskog ostatka sa 2 do 8 atoma ugljenika koji sadrži dvostruku vezu ugljenik-ugljenik, kao što su vinil, 1-propenil, 2-propenil, 1-butenil, 2-butenil, 1,3-butadienil, 1-pentenil, 2-pentenil, 3-pentenil, 1,3-pentadienil, 1,4-pentadienil, 1-heksenil i 1,4-heksadienil, itd.

[0040] alkinil grupa“ predmetnog pronalaska označava linearnu ili razgranatu alkinil

grupu dobijenu uklanjanjem jednog atoma vodonika iz alkinskog ostatka sa 2 do 8 atoma ugljenika koji sadrži trostruku vezu ugljenik-ugljenik, kao što su etinil, propinil, 2-butinil, 2-pentinil, 3-pentinil, 4-metil-2-pentinil, 2-heksinil, 3-heksinil, itd. alkilkarbonilamino“, „C1-6alkilaminokarbonil“, „C1-6alkilsulfonil“, „C1-6alkilkarbonil“, „C1-6alkiltio“ predmetnog pronalaska označavaju redom C1-6alkil-C(O)-NH-, C1-6alkil-NH-C(O)-, C1-6alkil-S(O)2-, C1-

6alkil-C(O)-, C1-6alkil-S-; „C1-6alkil“ je definisan kao gore, poželjno „C1-4alkil“.

[0041] alkoksi“ predmetnog pronalaska označava grupu u kojoj je alkil“kako je

gore definisano vezan za atom kiseonika, koji je zauzvrat vezan za osnovni ostatak, to jest, „C1-

6alkil-O-“ grupa, kao što su metoksi, etoksi, propoksi, izopropoksi, n-butoksi, tert-butoksi, npentiloksi, neopentiloksi i n-heksiloksi, itd. alkoksi“ se odnosi na gorepomenute primere sa 1 do 4 atoma ugljenika, to jest, „C1-4alkil-O-“ grupe.

[0042] „Cikloalkil“, „aril“, „heterociklil“ i „heteroaril“ predmetnog pronalaska uključuju monociklični sistem i sistem kondenzovanih prstenova (biciklični sistem ili policiklični sistem). Monociklični sistem se odnosi na grupu u obliku samo jednog prstena, a sistem kondenzovanih prstenova se odnosi na policikličnu strukturu prstena formiranu od dve ili više cikličnih struktura povezanih u obliku orto-kondenzovanih, spiro ili premošćenih prstenova. Orto-kondenzovani prsten se odnosi na strukturu kondenzovanog prstena formiranu od dve ili više cikličnih struktura koje međusobno dele dva susedna atoma prstena (tj. dele jednu vezu). Premošćeni prsten se odnosi na strukturu kondenzovanog prstena formiranu od dve ili više cikličnih struktura koje međusobno dele dva nesusedna atoma prstena. Spiro prsten se odnosi na strukturu kondenzovanog prstena formiranu od dve ili više cikličnih struktura koje međusobno dele jedan atom prstena. Cikloalkil, aril, heterociklil ili heteroaril definisani brojem atoma u predmetnom pronalasku uključuju monociklične i kondenzovane strukture prstena koje se mogu formirati, osim ako nije drugačije navedeno.

[0043] „Cikloalkil“ predmetnog pronalaska označava monociklični cikloalkil, biciklični cikloalkil sistem ili policiklični cikloalkil sistem. Ove grupe mogu biti zasićene ili nezasićene, ali nisu aromatične. Monociklični cikloalkil može biti C3-8cikloalkil, C3-6cikloalkil, C5-8cikloalkil, i slično. Primeri monocikličnog cikloalkila uključuju, ali nisu ograničeni na, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil, ciklooktil, ciklobutenil, ciklopentenil, cikloheksenil, 1,4-cikloheksadienil, cikloheptenil, 1,4-cikloheptadienil, ciklooktenil, 1,5-ciklooktadienil i slično. Orto-kondenzovani cikloalkil može biti 6-12-člani orto-kondenzovani cikloalkil, 7-10-člani orto-kondenzovani cikloalkil, a tipični primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, biciklo[3.1.1]heptan, biciklo[2.2.1]heptan, biciklo[2.2.2]oktan, biciklo[3.2.2]nonan, biciklo[3.3.1]nonan i biciklo[4.2.1]nonan. Spirociklični cikloalkil može biti 6-12-člana spirociklična grupa, 7-11-člana spirociklična grupa ili slično, a primeri uključuju, ali nisu ograničeni na,

Premošćeni cikloalkil može biti 6-12-člana grupa premošćenog prstena i 7-11-člana grupa premošćenog prstena, a primeri uključuju, ali nisu ograničeni na:

[0044] „3-14-člani cikloalkil“, „3-10-člani cikloalkil“ i „3-6-člani cikloalkil“ predmetnog pronalaska uključuju monociklične i kondenzovane strukture prstena koje se mogu formirati, osim ako nije drugačije navedeno.

[0045] „Heterociklil“ predmetnog pronalaska označava nearomatičnu cikličnu grupu u kojoj je najmanje jedan atom ugljenika u prstenu zamenjen heteroatomom izabranim između O, S i N, poželjno zamenjen sa 1-3 heteroatoma, i pri čemu atom ugljenika, atom azota i atom sumpora mogu biti oksidovani.

[0046] „Heterociklil“ označava monociklični heterociklil, biciklični heterociklil ili policiklični heterociklil sistem, uključujući zasićeni, delimično zasićeni heterociklil, ali isključujući aromatične prstenove. Monoheterociklil može biti 3-8-člani heterociklil, 3-8-člani zasićeni heterociklil, 3-6-člani heterociklil, 4-7-člani heterociklil, 5-7-člani heterociklil, 5-6-člani heterociklil, 5-6-člani heterociklil koji sadrži kiseonik, 5-6-člani heterociklil koji sadrži azot, 5-6-člani zasićeni heterociklil ili slično. Primeri monoheterociklila uključuju, ali nisu ograničeni na, aziridinil, oksiranil, tiiranil, azetidinil, oksetanil, tietanil, tetrahidrofuranil, tetrahidropirolil, tetrahidrotiofenil, imidazolidinil, pirazolidinil, 1,2-oksazolidinil, 1,3-oksazolidinil, 1,2-tiazolidinil, 1,3-tiazolidinil, tetrahidro-2H-piranil, tetrahidro-2H-tiopiranil, piperidinil, piperazinil, morfolinil, 1,4-dioksanil, 1,4-tioksanil; primeri delimično zasićenog heterociklila uključuju, ali nisu ograničeni na, 4,5-dihidroizooksazolil, 4,5-dihidrooksazolil, 2,5-dihidrooksazolil, 2,3-dihidrooksazolil, 3,4-dihidro-2H-pirolil, 2,3-dihidro-1H-pirolil, 2,5-dihidro-1H-imidazolil, 4,5-dihidro-1H-imidazolil, 4,5-dihidro-1H-pirazolil, 4,5-dihidrogen-3H-pirazolil, 4,5-dihidrotiazolil, 2,5-dihidrotiazolil, 2H-piranil, 4H-piranil, 2H-tiopiranil, 4H-tiopiranil, 2,3,4,5-tetrahidropiridil, 1,2-izooksazinil, 1,4-izooksazinil, ili 6H-1,3-oksazinil i slično. Kondenzovani heterociklični prsten uključuje orto-kondenzovani heterociklil, spiroheterociklil, premošćeni heterociklil, i može biti zasićen, delimično zasićen ili nezasićen, ali ne i aromatičan. Kondenzovani heterociklil je 5- ili 6-člani monociklični heterociklični prsten kondenzovan sa benzenskim prstenom, tj.5- ili 6-člani monociklični cikloalkil, 5- ili 6-člani monociklični cikloalkenil, 5- ili 6-člani monociklični heterociklil, ili 5- ili 6-člani monociklični heteroaril. Orto-kondenzovani heterociklil može biti 6-12-člani ortokondenzovani heterociklil, 7-11-člani orto-kondenzovani heterociklil, 6-10-člani ortokondenzovani heterociklil, 6-12-člani zasićeni orto-kondenzovani heterociklil, i 7-11-člani zasićeni orto-kondenzovani heterociklil, a primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, 3-azabiciklo[3.1.0]heksil, 3,6-diazabiciklo[3.2.0]heptil, 3,8-diazabiciklo[4.2.0]oktil, 3,7-diazabiciklo[4.2.0]oktil, oktahidropirolo[3,4-c]pirolil, oktahidropirolo[3,4-b]pirolil, oktahidropirolo[3,4-b][1,4]oksazinil, oktahidro-1H-pirolo[3,4-c]piridinil, 2,3-dihidrobenzofuran-2-il, 2,3-dihidrobenzofuranil-3-il, indolin-1-il, indolin-2-il, indolin-3-il, 2,3-dihidrobenzotiofen-2-il, oktahidro-1H-indolil, oktahidrobenzofuranil.

[0047] Spiroheterociklil može biti 6-12-člani spiroheterociklil, 7-11-člani spiroheterociklil, 7-11-člani zasićeni spiroheterociklil, 6-12-člani zasićeni spirociklil, a primeri uključuju, ali nisu ograničeni na:

[0048] Premošćeni heterociklil može biti 6-12-člani premošćeni heterociklil, 7-11-člani premošćeni heterociklil, 6-12-člani zasićeni premošćeni heterociklil, i 7-11-člani zasićeni premošćeni heterociklil, a primeri uključuju, ali nisu ograničeni na:

[0049] 5-14-člani heterociklil, 5-11-člani heterociklil, 5-10-člani heterociklil, 6-10-člani heterociklil, 7-11-člani heterociklil, 7-11-člani zasićeni heterociklil predmetnog pronalaska uključuju monociklične i kondenzovane strukture prstena koje se mogu formirati, osim ako nije drugačije navedeno.

[0050] Aril predmetnog pronalaska se odnosi na aromatičnu cikličnu grupu, uključujući monociklični sistem, biciklični sistem ili policiklični sistem, i može biti 6-14-člani aril, uključujući „6-8-člani monociklični aril“, na primer, fenil, ciklooktenil, itd.; i „8-14-člani aril sa kondenzovanim prstenom“, kao što su pentalenil, naftil, fenantril, i slično.

[0051] Termin „heteroaril“ kako se ovde koristi odnosi se na aromatičnu cikličnu grupu u kojoj je najmanje jedan atom ugljenika u prstenu zamenjen heteroatomom izabranim između O, S i N, poželjno 1 do 3 heteroatoma, uključujući uslov da su atom ugljenika ili atom sumpora oksidovani, na primer, atom ugljenika je zamenjen sa C(O), S(O), S(O)2. Heteroaril uključuje monociklični heteroaril i kondenzovani heteroaril, koji može biti 5-14-člani heteroaril, 5-10-člani heteroaril, 5-7-člani heteroaril, 5-6-člani heteroaril, 8-10-člani heteroaril. Reprezentativni primeri monocikličnog heteroarila uključuju, ali nisu ograničeni na, furanil, imidazolil, izoksazolil, tiazolil, izotiazolil, oksadiazolil, oksazolil, izoksazolil, piridil, piridazinil, pirimidinil, pirazinil, pirazolil, pirolil, tetrazolil, tiadiazolil, tiazolil, tienil, triazolil i triazinil. Kondenzovani heteroaril se odnosi na biciklični ili policiklični sistem prstenova kondenzovan sa fenilom, cikloalkilom, cikloalkenilom, heterociklilom ili heteroarilom. Kondenzovani heteroaril može biti 8-12-člani heteroaril, 8-10-člani heteroaril, 9-10-člani heteroaril. Reprezentativni primeri kondenzovanog heteroarila uključuju, ali nisu ograničeni na, benzimidazolil, benzofuranil, benzotienil, benzotienil, benzooksadiazolil, benzotiazolil, cinolinil, 5,6-dihidrohinolin-2-il, 5,6-dihidroizohinolin-1-il, indazolil, indolil, izohinolil, naftiridinil, purinil, hinolil, 5,6,7,8-tetrahidrohinol-2-il, 5,6,7,8-tetrahidrohinolil, 5,6,7,8-tetrahidrohinol-4-il, 5,6,7,8-tetrahidroizohinol-1-il, 4,5,6,7-tetrahidro[c][1,2,5]oksadiazol i 6,7-dihidro[c][1,2,5]oksadiazol-4(5H) keto. U određenim otelotvorenjima, kondenzovani heteroaril je 5- ili 6-člani monociklični heteroarilni prsten kondenzovan sa fenilnim prstenom, tj. 5- ili 6-članim monocikličnim cikloalkilom, 5- ili 6-članim monocikličnim cikloalkenilom, 5- ili 6-članim monocikličnim heterociklilom, ili 5- ili 6-članim monocikličnim heteroarilom.

[0052] 5-14-člani heteroaril, 5-10-člani heteroaril, 6-10-člani heteroaril, 5-6-člani heteroaril i 8-10-člani heteroaril predmetnog pronalaska uključuju monociklične i kondenzovane strukture prstena koje se mogu formirati, osim ako nije drugačije navedeno.

[0053] „Farmaceutski prihvatljive soli“ kako se ovde koriste označavaju farmaceutski prihvatljive adicione soli i solvate kiselina i baza. Takve farmaceutski prihvatljive soli uključuju soli sledećih kiselina: kao što su hlorovodonična kiselina, fosforna kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, sumporasta kiselina, mravlja kiselina, toluensulfonska kiselina, metansulfonska kiselina, azotna kiselina, benzoeva kiselina, limunska kiselina, vinska kiselina, maleinska kiselina, jodovodonična kiselina, alkanske kiseline (kao što je sirćetna kiselina, HOOC-(CH2)n-COOH (gde je n od 0 do 4)), i slično. Takve farmaceutski prihvatljive soli takođe uključuju soli baza kao što su natrijum, kalijum, kalcijum, amonijum i slično. Stručnjacima u ovoj oblasti poznat je širok spektar netoksičnih farmaceutski prihvatljivih adicionih soli.

[0054] „Stereoizomer“ jedinjenja formule (I) ili (II) predmetnog pronalaska označava enantiomer u slučaju da jedinjenje formule (I) ili (II) ima asimetrični atom ugljenika; cis-trans izomer u slučaju da jedinjenje ima dvostruku vezu ugljenik-ugljenik ili cikličnu strukturu; tautomere u slučaju da je u jedinjenju prisutan keton ili oksim. Enantiomeri, diastereoizomeri, racemski izomeri, cis-trans izomeri, tautomeri, geometrijski izomeri, epimeri i njihove smeše jedinjenja formule (I) ili (II) su svi uključeni u opseg pronalaska.

Korisni efekti pronalaska:

[0055]

(1) Jedinjenja formule (I) ili (II) i kristalna forma I jedinjenja formule (III) predmetnog pronalaska su dvostruki inhibitori mitoze i angiogeneze.

(2) Lekovi su efikasniji putem koordinacije više kinaza i pokazuju bolje farmakološke aktivnosti kao što su enzimologija, citologija i farmakodinamika, itd.

(3) Jedinjenje predmetnog pronalaska ima bolja farmakokinetička svojstva, fizičkohemijska svojstva i/ili toksikološka svojstva, kao i podesnost za lek.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0056] Da bi se jasnije ilustrovala otelotvorenja predmetnog pronalaska i tehnička rešenja iz prethodnog stanja tehnike, crteži koji se koriste u otelotvorenjima i prethodnom stanju tehnike su ukratko predstavljeni u nastavku.

Slika 1 je difraktogram praha dobijen rendgenskom difrakcijom (XRPD) kristalne forme I jedinjenja formule (III).

Slika 2 je dijagram diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) kristalne forme I jedinjenja formule (III).

OTELOTVORENJA

[0057] Predmetni pronalazak će u nastavku biti detaljnije opisan uz pozivanje na prateće crteže, kako bi se jasnije ilustrovale svrhe, tehnička rešenja i prednosti predmetnog pronalaska. Dole navedeni primeri koji ne spadaju u opseg priloženih patentnih zahteva dati su samo kao referenca i nisu otelotvorenja prema pronalasku.

Primer pripreme 1: Sinteza intermedijera 1-(4-metoksibenzil)-5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-amina

[0058]

Korak 1: Sinteza N-(5-metil-1H-pirazol-3-il)acetamida

[0059]

[0060] 5-metil-1H-pirazol-3-amin (300 g, 3,09 mol, 1,0 ekv) je odmeren u tikvicu sa okruglim dnom od 5 L i rastvoren dodavanjem vode (2800 mL) uz mehaničko mešanje na sobnoj temperaturi. Natrijum-bikarbonat (780 g, 9,28 mol, 3 ekv) je dodavan u porcijama, nakon čega je mešanje nastavljeno još 30 min. Zatim je anhidrid sirćetne kiseline (592 ml, 6,2 mol, 2 ekv) dodavan kap po kap i polako u reakcioni sistem tokom otprilike 1 sat uz kontrolisanu brzinu kapanja. U ovom trenutku, stvorena je velika količina penaste bele čvrste supstance. Temperatura je podignuta na 100 °C i reakcioni sistem je mešan 2 sata. Čvrsta supstanca se postepeno rastvarala, a sistem je postao bistar. Zatim je zagrevanje prekinuto, a sistem je ohlađen na sobnu temperaturu. Nakon mešanja preko noći, istaložila se velika količina bele kristalne čvrste supstance. Druga šarža 5-metil-1H-pirazol-3-amina (300 g) je ubačena u paralelnu reakciju. Nakon završetka reakcija, dve šarže su spojene i filtrirane, a čvrsta supstanca je isprana vodom (500 mL × 2) i osušena da bi se dobila bela čvrsta supstanca (554 g, prinos 62%).

[0061]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 10.32 (s, 1H), 6.21 (s, 1H), 2.18 (s, 3H), 1.97 (s, 3H).

Korak 2: Sinteza N-(5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)acetamida

[0062]

[0063] Koncentrovana sumporna kiselina (2 L, oko 36,8 mol, 9,2 ekv) je sipana u tikvicu sa okruglim dnom od 5 L, i N-(5-metil-1H-pirazol-3-il)acetamid (554 g, 3,98 mol, 1 ekv) je dodavan u porcijama tokom 1 sat uz mehaničko mešanje u prisustvu kupatila sa ledenom vodom. Mešanje je nastavljeno dok se čvrsta supstanca nije potpuno rastvorila. Zatim je pušljiva azotna kiselina (250 mL, oko 5,7 mol, 1,4 ekv) dodata u sistem tokom 2 sata uz kontrolisanu temperaturu manju od 15 °C. Kraj reakcije je praćen pomoću LC-MS nakon što je reakcija nastavljena još 15 minuta. Velika količina bele čvrste supstance se odmah istaložila nakon što je reakcioni sistem polako sipan u 5 L vode sa smrvljenim ledom uz mehaničko mešanje. Smeša je ostavljena da stoji preko noći i filtrirana. Dobijena čvrsta supstanca je isprana vodom (1000 mL × 2), da bi se dobila bela čvrsta supstanca (587 g, prinos 80%) nakon sušenja infracrvenim zracima.

[0064]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 10.22 (s, 1H), 2.44 (s, 1H), 2.13 (s, 3H).

Korak 3: Sinteza 5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-amina

[0066] Voda (1,1 L) i koncentrovana hlorovodonična kiselina (1 L, oko 12 mol, 4 ekv) su sipane u tikvicu sa okruglim dnom i četiri grla od 5 L, i postepeno zagrevane do 80 °C. N-(5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)acetamid (587 g, 3 mol, 1 ekv) je dodavan u porcijama tokom otprilike 1 sat uz mehaničko mešanje. Smeša je nastavljena da se refluksuje na 100 °C oko 1 sat dok sistem nije postao bistar. Smeša je filtrirana nakon hlađenja da bi se uklonila nerastvorna materija. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod, koji je potom pulpiran sa metil-terc-butil etrom i filtriran. Dobijeni filterski kolač je osušen da bi se dobila narandžasta čvrsta supstanca (610 g sirovog proizvoda).

Korak 4: Sinteza 1-(4-metoksibenzil)-5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-amina

[0067]

[0068] 5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-amin hidrohlorid (200 g, 1,12 mol, 1 ekv) je sipan u tikvicu sa okruglim dnom od 3 L, rastvoren dodavanjem DMF (1,8 L) uz mehaničko mešanje na sobnoj temperaturi, kalijum-karbonat (335 g, 2,42 mol, 2,1 ekv) je dodavan polako u porcijama tokom oko 40 minuta, a zatim je 4-metoksibenzil-hlorid (177 g, 1,13 mol, 1 ekv) dodavan kap po kap tokom 30 minuta. Reakcioni sistem je mešan na sobnoj temperaturi preko noći. Pomoću TLC i LC-MS je utvrđeno da je ostala mala količina polaznog materijala. Druge dve šarže 5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-amin hidrohlorida (200 g, 1,12 mol) su ubačene u paralelne reakcije. Nakon završetka reakcija, smeše su filtrirane.. Filtrati su spojeni, koncentrovani pod sniženim pritiskom dok nije ostala polovina rastvarača, sipani u ledenu vodu (oko 2,5 L) uz mešanje da bi se istaložila smeđe-žuta čvrsta supstanca, i ostavljeni da stoje preko noći. Filterski kolač je ispran sa DCM (1000 mL×3), koncentrovan pod sniženim pritiskom, sipan u ledenu vodu (oko 1000 mL) da bi se istaložila smeđe-žuta čvrsta supstanca, i ostavljen da stoji preko noći. Gore istaložena čvrsta supstanca je spojena, isprana vodom (500 mL×2). Nakon sušenja pod vakuumom, čvrsta supstanca je pulpirana sa etil-acetatom, filtrirana i osušena da bi se dobila žuta čvrsta supstanca (268 g, prinos 30%).

[0069]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 7.18 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.18 (s, 2H), 5.09 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.56 (s, 3H).

Primer pripreme 2: Sinteza intermedijera (6-bromo-4-jodo-piridin-3-il)(2-hlorofenil)metanona

[0070]

Korak 1: Sinteza (6-bromopiridin-3-il)(2-hlorofenil)metanola

[0071]

Bezvodni tetrahidrofuran (500 mL) i 2,5-dibromopiridin (100,0 g, 0,42 mol, 1,0 ekv) su dodati u tikvicu sa četiri grla od 2 L, i smeša je ohlađena na 2 °C uz mešanje u prisustvu kupatila sa ledenom vodom. Izopropil-magnezijum-hlorid (210,5 mL, 2,0 M, 0,42 mol, 1,0 ekv) je zatim dodavan kap po kap tokom otprilike 0,5 sati uz kontrolisanu temperaturu ne višu od 10 °C. Reakcioni sistem je mešan na sobnoj temperaturi (20 °C) 1 sat, a zatim ohlađen na 10 °C pomoću kupatila sa ledenom vodom. Rastvor 2-hlorobenzaldehida (62,3 g, 0,443 mol, 1,05 ekv) u tetrahidrofuranu (200 mL) je dodavan kap po kap tokom otprilike 0,5 sati. Nakon mešanja na 10 °C 2 sata, kraj reakcije je praćen pomoću TLC. Zasićeni vodeni rastvor amonijum-hlorida (300 mL) je dodat u reakcioni sistem. Nakon mešanja 10 minuta, organska faza je odvojena od smeše i koncentrovana do žutog ulja. Vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc (1,0 L × 2). Dobijeni produkt je zatim spojen sa gore dobijenim žutim uljem, ispran vodom (500 mL) pa zasićenim slanim rastvorom (500 mL), sušen preko bezvodnog Na2SO4i koncentrovan da bi se dobilo smeđe ulje (140 g sirovog proizvoda).

Korak 2: Sinteza (6-bromopiridin-3-il)(2-hlorofenil)metanona

[0072]

(6-bromopiridin-3-il)(2-hlorofenil)metanol (140 g sirovog proizvoda) je dodat u DCM (1,3 L), zatim su dodati TEMPO (1,51 g, 9,4 mmol) i NaBr (1,92 g, 18,8 mmol). Reakcioni sistem je ohlađen na 3 °C u prisustvu kupatila sa ledenom vodom, i kap po kap je dodavan vodeni rastvor NaClO (1,34 mol/L, 600 L, 0,71 mol) neutralizovan sa NaHCO3(45,0 g) na temperaturi ne višoj od 20 °C. Nakon završetka dodavanja, reakcija je mešana 10 minuta, a zatim je kraj reakcije praćen pomoću TLC. Vodena faza odvojena iz reakcione smeše je ekstrahovana sa DCM (1,0 L). Organske faze su spojene, isprane vodom (1,0 L) pa zasićenim slanim rastvorom (1,0 L), i sušene preko bezvodnog Na2SO4. Nakon koncentrovanja dobijeno je žuto ulje, koje je pulpirano sa 150 mL metil-terc-butil etra/500 mL petroletra da bi se dobila žuta čvrsta supstanca (50,3 g, prinos: 39,7% za dva koraka).

Korak 3: Sinteza (6-bromo-4-jodo-piridin-3-il)(2-hlorofenil)metanona

[0073]

[0074] U atmosferi azota, rastvor litijum/magnezijum-hlorida tetrametilpiperidin (281 mL, 1,5 mol/L, 0,43 mol, 2,5 ekv) je dodat u tikvicu sa četiri grla od 2 L i ohlađen na -65 °C u prisustvu kupatila sa suvim ledom/etanolom. Rastvor (6-bromopiridin-3-il)(2-hlorofenil)metanona (50,0 g, 0,17 mol, 1,0 ekv) u tetrahidrofuranu (50 mL) je dodavan kap po kap tokom otprilike 0,5 sati. Zatim je reakciona smeša zagrevana na -45 °C uz mešanje 1 sat, a potom ponovo ohlađena na -65 °C. Rastvor I2(129,3 g, 0,51 mol, 3,0 ekv) u tetrahidrofuranu (400 mL) je dodavan kap po kap tokom otprilike 1 sat. Reakcioni sistem je mešan 20 minuta, a kraj reakcije je praćen pomoću TLC. Zatim su u reakcioni sistem dodati zasićeni vodeni rastvor amonijum-hlorida (500 mL) i zasićeni vodeni rastvor NaHSO3(500 mL), mešano je 15 minuta, a zatim filtrirano. Nerastvorne materije su isprane etil-acetatom (500 mL × 2). Filtrati su spojeni. Odvojena vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc (1,0 L × 2). Sve organske faze su spojene, isprane vodom (800 mL) pa zasićenim slanim rastvorom (800 mL), sušene preko bezvodnog Na2SO4i koncentrovane da bi se dobila žuta čvrsta supstanca. Žuta čvrsta supstanca je pulpirana sa metilterc-butil etrom (500 mL)/petroletrom (500 mL) i osušena da bi se dobila žuta čvrsta supstanca (30 g, prinos: 41,8%).

[0075] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.38-7.50 (m, 2H), 7.51-7.65 (m, 2H), 8.17 (s, 1H), 8.24 (s, 1H).

Primer pripreme 3: Sinteza intermedijera (6-bromo-4-((1-(4-metoksibenzil)-5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)piridin-3-il)(2-hlorofenil)metanona

[0076]

Korak 1: Sinteza (6-bromo-4-((1-(4-metoksibenzil)-5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)piridin-3-il)(2-hlorofenil)metanona

[0077]

[0078] 1-(4-metoksibenzil)-5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-amin (14,92 g, 56,9 mmol) je dodat u bezvodni tetrahidrofuran (100 mL), rastvoren uz mešanje pod azotom. NaH (40% masenog udela, 4,82 g, 0,11 mol) je dodavan u serijama u ledenom kupatilu, i mešan 1 sat nakon dodavanja, a zatim je kap po kap dodavan rastvor (6-bromo-4-jodo-piridin-3-il)(2-hlorofenil)metanona (20 g, 47,4 mmol) u tetrahidrofuranu (100 mL). Reakcija je izvođena 16 sati na sobnoj temperaturi. Kraj reakcije je praćen pomoću TLC. Metanol (30 mL) je dodat da prekine reakciju, a zatim zasićeni rastvor amonijum-hlorida (50 mL). Dobijena smeša je filtrirana da bi se dobio žuti proizvod (25 g, prinos 80%).

[0079]<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.36 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.66-7.53 (m, 4H), 7.33 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.33 (d, J=8.8 Hz, 1H), 6.96 (d, J=8.8 Hz, 1H), 5.39 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 2.73(s, 3H).

Primer 1: Sinteza jedinjenja 1

[0080]

Sintetički put:

[0081]

[0082] Korak 1: Intermedijer 1-3 je pripremljen prema metodi iz Primera pripreme 2.

[0083] Korak 2: Intermedijer 1-4 je pripremljen prema metodi iz Primera pripreme 3.

Korak 3: Sinteza intermedijera 1-5

[0084]

[0085] Intermedijer 1-4 (5 g, 9 mmol) je dodat u bakar(I)-jodid (5,13 g, 27 mmol) i natrijummetansulfinat (2,76 g, 27 mmol). Zatim je ubrizgan DMSO (100 mL) nakon što je reaktor tri puta ispran azotom. Reakcioni sistem je zagrevan na 130 °C i reagovao 5 sati. Kraj reakcije je praćen pomoću TLC. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika-gel koloni (eluirano dihlormetanom) da bi se dobilo 1,1 g žute čvrste supstance, sa prinosom od 23%.

Korak 4: Sinteza intermedijera 1-6

[0086]

[0087] Intermedijer 1-5 (1,1 g, 2,0 mmol) je dodat u dihlormetan (3 mL) i rastvoren. Trifluorosirćetna kiselina (10 mL) je polako dodavana kap po kap. Smeša je zagrevana na 70 °C i reagovala 8 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Rastvarač i trifluorosirćetna kiselina su rotaciono upareni da bi se dobilo 1,5 g smeđe čvrste supstance, koja je direktno korišćena u sledećem koraku.

Korak 5: Sinteza jedinjenja 1

[0088]

[0089] Intermedijer 1-6 (1,5 g, 3,4 mmol) je dodat u 2-metiltetrahidrofuran (15 mL) i rastvoren. Kalaj(II)-hlorid dihidrat (5,4 g, 24,1 mmol) je dodat u atmosferi azota. Smeša je zagrevana na 100 °C i reagovala 16 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Smeša je podešena na pH=10 dodavanjem vodenog rastvora natrijum-hidroksida i filtrirana preko celita. Filtrat je ekstrahovan sa 2-metiltetrahidrofuranom i koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika-gel koloni (EA: DCM=1:3) da bi se dobilo jedinjenje 1 kao žuta čvrsta supstanca (60 mg, prinos 10%).

[0090]<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 11.84 (s, 1H), 9.12 (s, 1H), 7.43-7.51 (m, 4H), 7.17 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 3.11 (s, 3H), 1.96 (s, 3H).

Primer 2: Sinteza jedinjenja 2

[0091]

Korak 1: Sinteza intermedijera 2-1

[0092]

[0093] Intermedijer 1-4 (3 g, 5,4 mmol) je dodat u toluen (90 mL), ciklopropilboronsku kiselinu (0,70 g, 8,1 mmol), paladijum-acetat (0,121 g, 0,54 mmol), tricikloheksilfosfin (0,310 g, 1,1 mmol) i kalijum-fosfat (4,0 g, 18,8 mmol). Reaktor je 3 puta ispran azotom. Reakcioni sistem je zagrevan na 120 °C i reagovao 16 sati. Kraj reakcije je praćen pomoću TLC. Smeša je nakon hlađenja ekstrahovana sa EA (100 mL), a odvojena vodena faza je ekstrahovana sa EA (20 mL). Organske faze su spojene, isprane zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida, sušene preko bezvodnog natrijum-sulfata, filtrirane, koncentrovane i pulpirane sa smešom etil-acetat : metil-terc-butil etar (1:3, 10 mL). Smeša je osušena da bi se dobila narandžasta čvrsta supstanca (3,0 g, prinos 86%).

Korak 2: Sinteza intermedijera 2-2

[0095] Intermedijer 2-1 (2,9 g, 5,6 mmol) je dodat u toluen (60 mL) i rastvoren. Trifluorosirćetna kiselina (30 mL) je dodavana kap po kap polako. Smeša je nakon dodavanja zagrevana na 100 °C i reagovala 8 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Rastvarač i trifluorosirćetna kiselina su rotaciono upareni da bi se dobilo 1,9 g smeđe čvrste supstance, koja je direktno korišćena u sledećem koraku.

Korak 3: Sinteza jedinjenja 2

[0096]

[0097] Intermedijer 2-2 (1,9 g, 3,7 mmol) je dodat u 2-metiltetrahidrofuran (35 mL) i rastvoren. Kalaj(II)-hlorid dihidrat (5,4 g, 24,8 mmol) je polako dodavan u atmosferi azota. Smeša je zagrevana na 100 °C i reagovala 16 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Smeša je podešena na pH=10 dodavanjem vodenog rastvora natrijum-hidroksida i filtrirana preko celita. Filtrat je ekstrahovan sa 2-metiltetrahidrofuranom i koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika-gel koloni (eluirano sa EA: DCM=1:3) da bi se dobila žuta čvrsta supstanca (0,35 g, prinos 27%).

[0098]<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 11.65 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.33-7.47 (m, 4H), 7.01 (s, 1H), 6.40(s, 1H), 1.96 (s, 3H), 1.71-1.75 (m, 1H), 0.72-0.84 (m, 4H).

Primer 3: Sinteza jedinjenja 3

[0099]

Korak 1: Sinteza intermedijera 3-1

[0100]

[0101] Intermedijer 1-4 (3 g, 5,4 mmol) je dodat u THF (300 mL). U atmosferi azota, kap po kap je dodavan rastvor natrijum-metoksida u metanolu (pripremljen reakcijom natrijumhidrida (1,4 g, 35 mmol) i metanola (6 ml)). Smeša je zagrevana na 50 °C i reagovala 16 sati. Kraj reakcije je praćen pomoću TLC. Nakon hlađenja, u reakcioni sistem je dodat zasićeni vodeni rastvor amonijum-hlorida (20 mL), a zatim je ekstrahovan sa 2-metiltetrahidrofuranom (50 mL). Organske faze su spojene, isprane zasićenim slanim rastvorom, sušene preko bezvodnog natrijum-sulfata, filtrirane i koncentrovane. Sirovi proizvod je pulpiran sa smešom metanol/metil-terc-butil etar (1:3) da bi se dobila žuta čvrsta supstanca (2,1 g, prinos 77%).

Korak 2: Sinteza intermedijera 3-2

[0102]

[0103] Intermedijer 3-1 (1,8 g, 3,5 mmol) je dodat u toluen (30 mL) i rastvoren. Trifluorosirćetna kiselina (20 mL, 0,268 mol) je dodavana kap po kap polako. Smeša je zagrevana na 110 °C i reagovala 16 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Rastvarač i trifluorosirćetna kiselina su rotaciono upareni. Ostatak je pulpiran sa metil-terc-butil etrom (20 mL) i filtriran da bi se dobila crvena čvrsta supstanca (0,92 g, prinos 52%).

Korak 3: Sinteza jedinjenja 3

[0104]

[0105] Intermedijer 3-2 (0,92 g, 1,8 mmol) je dodat u 2-metiltetrahidrofuran (15 mL) i rastvoren. Kalaj(II)-hlorid dihidrat (2,9 g, 12,8 mmol) je dodat u atmosferi azota. Smeša je zagrevana na 100 °C i reagovala 16 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Smeša je podešena na pH=10 dodavanjem vodenog rastvora natrijum-hidroksida i filtrirana preko celita. Filtrat je ekstrahovan sa 2-metiltetrahidrofuranom i koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika-gel koloni (eluiranje sa EA:DCM=1:3) da bi se dobilo jedinjenje 3 kao žuta čvrsta supstanca (0,32 g, prinos 52%).

[0106]<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ:11.69 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 7.36-7.49 (m, 4H), 6.90 (s, 1H), 5.96(s, 1H), 3.68 (s, 3H), 1.99 (s, 3H).

Primer 4: Sinteza jedinjenja 4

[0107]

Korak 1: Sinteza intermedijera 4-1

[0108]

[0109] Intermedijer 1-4 (3 g, 5,4 mmol) je dodat u cezijum-karbonat (6,8 g, 26,5 mmol), 3,4,7,8-tetrametil-1,10-fenantrolin (0,127 g, 0,54 mmol), bakar(I)-jodid (0,080 g, 0,54 mmol) i 3-hidroksitetrahidrofuran (1,0 g, 10,8 mmol). Reaktor je tri puta ispran azotom i dodat je toluen (20 mL). Reakcioni sistem je zagrevan na 100 °C i reagovao 16 sati. Kraj reakcije je praćen pomoću TLC. Nakon hlađenja, u reakcioni sistem je dodat zasićeni vodeni rastvor amonijum-hlorida (20 mL). Odvojena vodena faza je ekstrahovana sa etil-acetatom (50 mL). Organske faze su spojene, isprane zasićenim slanim rastvorom, sušene preko bezvodnog natrijum-sulfata, filtrirane i koncentrovane. TSirovi proizvod je pulpiran sa smešom metanol / metil-terc-butil etar (1:3) da bi se dobila žuta čvrsta supstanca (0,7 g, prinos 23%).

Korak 2: Sinteza intermedijera 4-2

[0110]

[0111] Intermedijer 4-1 (0,7 g, 1,3 mmol) je dodat u dihlormetan (3 mL) i rastvoren. Trifluorosirćetna kiselina (10 mL) je dodavana kap po kap polako. Nakon dodavanja, smeša je zagrevana na 70 °C i reagovala 16 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Rastvarač i trifluorosirćetna kiselina su rotaciono upareni da bi se dobila crvena čvrsta supstanca (0,94 g), koja je direktno korišćena u sledećem koraku.

Korak 3: Sinteza jedinjenja 4

[0112]

[0113] Intermedijer 4-2 (0,94 g, 2,1 mmol) je dodat u 2-metiltetrahidrofuran (15 mL) i rastvoren. Kalaj(II)-hlorid dihidrat (3,34 g, 14,8 mmol) je dodat u atmosferi azota. Smeša je zagrevana na 100 °C i reagovala 16 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Smeša je podešena na pH=10 dodavanjem vodenog rastvora natrijum-hidroksida i filtrirana preko celita. Filtrat je ekstrahovan sa 2-metiltetrahidrofuranom i koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika-gel koloni (eluiranje sa EA: DCM=1:3) da bi se dobilo jedinjenje 4 kao žuta čvrsta supstanca (0,066 g, prinos 10%).

[0114]<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ:11.69 (s, 1H), 8.65 (s, 1H), 7.37-7.49 (m, 4H), 6.88 (s, 1H), 5.92(s, 1H), 5.29-5.30 (m, 1H), 3.61-3.78(m, 4H), 2.07-2.12 (m, 1H), 2.00(s, 3H), 1.86-1.90 (m, 1H).

Primer 5: Sinteza 5-(2-hlorofenil)-3-metil-8-(4-metilpiperazin-1-il)-2,10-dihidropirazolo[4,3-b]pirido[4,3-e][1,4]diazepina (Jedinjenje 22)

[0115]

Korak 1: Sinteza (2-hlorofenil)(4-((1-(4-metoksibenzil)-5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)-6-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-3-il)metanona

[0116]

(6-bromo-4-((1-(4-metoksibenzil)-5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)piridin-3-il)(2-hlorofenil)metanon (intermedijer 1-4) (0,80 g, 1,4 mmol) je rastvoren u DMSO (10 mL) i dodat je metilpiperazin (0,431 g, 4,3 mmol). Smeša je zagrevana na 110 °C i reagovala 4 sata. TLC je pokazao kraj reakcije. Nakon hlađenja, reakciona tečnost je sipana u vodu (100 mL), i istaložila se velika količina čvrste supstance. Smeša je filtrirana. Filterski kolač je rastvoren u dihlormetanu, sušen i koncentrovan pod vakuumom da bi se dobila žuta čvrsta supstanca (1,0 g sirovog proizvoda).

Korak 2: Sinteza (2-hlorofenil)(4-((5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)-6-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-3-il)metanona

[0117]

(2-hlorofenil-4-((1-(4-metoksibenzil)-5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)-6-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-3-il)metanon (1,0 g, sirovi proizvod) je rastvoren u dihlormetanu (3 mL), a zatim je kap po kap i polako dodata trifluorosirćetna kiselina (10 mL). Zatim je smeša zagrevana na 70 °C i reagovala 16 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Sistem je koncentrovan pod vakuumom da bi se dobila crvena čvrsta supstanca (1,2 g, sirovi proizvod), koja je direktno korišćena u sledećem koraku bez prečišćavanja.

Korak 3: Sinteza 5-(2-hlorofenil)-3-metil-8-(4-metilpiperazin-1-il)-2,10-dihidropirazolo[4,3-b]pirido[4,3-e][1,4]diazepina

[0118]

(2-hlorofenil)(4-((5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)-6-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-3-il)metanon (1,2 g, sirovi proizvod) je rastvoren u 2-metiltetrahidrofuranu (20 mL) i dodat je kalaj(II)-hlorid dihidrat (4,2 g, 18,6 mmol) u atmosferi azota. Smeša je zagrevana na 90 °C i reagovala 16 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Smeša je podešena na pH=10 dodavanjem vodenog rastvora natrijum-hidroksida i filtrirana preko celita. Filtrat je ekstrahovan sa 2metiltetrahidrofuranom i koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika-gel koloni (dihlormetan : metanol=10:1) da bi se dobilo jedinjenje 22 kao žuta čvrsta supstanca (0,033 g, prinos: 5,8% za tri koraka).

[0119]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 11.56 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.33-7.45 (m, 4H), 6.88 (s, 1H), 5.96 (s, 1H), 3.37 (m, 4H), 2.33 (m, 4H), 2.19 (s, 3H), 1.97 (s, 3H).

[0120] Molekulska formula: C21H22ClN7, Molekulska masa: 407,91, LC-MS (Pos, m/z)=408 [M+H<+>].

Primer 6: Sinteza 4-(5-(2-hlorofenil)-3-metil-2,10-dihidropirazolo[4,3-b]pirido[4,3-e][1,4]diazepan-8-il)morfolina (Jedinjenje 29)

[0121]

Korak 1: Sinteza (6-bromo-4-((5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)piridin-3-il)(2-hlorofenil)metanona

[0122]

(6-bromo-4-((1-(4-metoksibenzil)-5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)piridin-3-il)(2-hlorofenil)metanon (intermedijer 1-4) (0,80 g, 1,4 mmol) je rastvoren u DCM (2 mL), a zatim je dodata trifluorosirćetna kiselina (10 mL). Smeša je zagrevana na 70 °C i reagovala 4 sata.

LC-MS je pokazao kraj reakcije. Reakciona smeša je ohlađena i koncentrovana pod vakuumom da bi se dobila žuta čvrsta supstanca (1,0 g, sirovi proizvod).

Korak 2: Sinteza 8-bromo-5-(2-hlorofenil)-3-metil-2,10-dihidropirazolo[4,3-b]pirido[4,3-e][1,4]diazepina

[0123]

[0124] (6-bromo-4-((5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)piridin-3-il)(2-hlorofenil)metanon (1,0 g, sirovi proizvod) je rastvoren u 2-metiltetrahidrofuranu (15 mL), a zatim je dodat kalaj(II)-hlorid dihidrat (3,2 g, 14,2 mmol). Smeša je zagrevana na 100 °C i reagovala 16 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Smeša je podešena na pH=10 dodavanjem vodenog rastvora natrijum-hidroksida i filtrirana preko celita. Filtrat je ekstrahovan sa 2-metiltetrahidrofuranom i koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika-gel koloni (dihlormetan : metanol = 30:1) da bi se dobio proizvod (60 mg, prinos 10,7% za dva koraka).

Korak 3: Sinteza 4-(5-(2-hlorofenil)-3-metil-2,10-dihidropirazolo[4,3-b]pirido[4,3-e][1,4]diazepan-8-il)morfolina

[0125]

[0126] 8-bromo-5-(2-hlorofenil)-3-metil-2,10-dihidropirazolo[4,3-b]pirido[4,3-e][1,4]diazepan (60 mg, 0,16 mmol) je rastvoren u DMSO (2 mL), a zatim je dodat morfolin (14 mg, 0,20 mmol) pod azotom. Smeša je zagrevana na 110 °C i reagovala 6 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Reakciona tečnost je sipana u vodu (10 mL), ekstrahovana dihlormetanom (20 mL × 2) i koncentrovana. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika-gel koloni (dihlormetan : metanol = 20:1) da bi se dobio proizvod (16 mg, prinos 25%).

[0127]<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 11.56 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.33-7.47 (m, 4H), 6.88 (s, 1H), 5.96 (s, 1H), 3.62 (m, 4H), 3.33 (m, 4H), 1.97 (s, 3H).

[0128] Molekulska formula: C20H19ClN6O, Molekulska masa: 394,86, LC-MS (Pos, m/z)=394,96 [M+H<+>].

Primer 7: sinteza jedinjenja 33

Korak 1: Sinteza intermedijera 33-1

[0129]

[0130] Intermedijeru 1-43,5 g (6,3 mmol) je dodato 3,8 g (19,1 mmol) kalijum-karbonata i 1,06 g (0,63 mmol) tetrakis(trifenilfosfin)paladijuma(0). Reaktor je tri puta ispran azotom, zatim je kap po kap dodato 2 ml trimetilboroksina (6,8 mmol), a potom je dodato 40 ml dioksana. Reakciona smeša je zagrevana na 110 °C i reagovala 16 sati. Kraj reakcije je praćen pomoću TLC. Nakon hlađenja, reakciona tečnost je sipana u 100 ml vode, i istaložila se velika količina čvrste supstance. Nakon filtracije, smeša je naneta na silika-gel i podvrgnuta hromatografiji na koloni, eluirana smešom dihlormetan : metanol = 100:1, i rotaciono uparena do suvoće, dajući 1,8 g intermedijera 33-1 kao žutu čvrstu supstancu, sa prinosom od 58,8%.

Korak 2: Sinteza intermedijera 33-2

[0131]

[0132] 1,8 g (3,6 mmol) intermedijera 33-1 je dodato u 0,65 g NBS (N-bromosukcinimida) (3,6 mmol) i 100 ml ugljen-tetrahlorida, mešano da se rastvori 30 minuta, a zatim je dodato 89 mg benzoil-peroksida (0,36 mmol). Reakciona smeša je zagrevana na 100 °C i reagovala 16 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Nakon što je rastvarač uparen, smeša je rastvorena u 20 ml metilen-hlorida, filtrirana preko silika-gela i uparena do suvoće, dajući 2,0 g intermedijera 33-2 kao žutu čvrstu supstancu, koja je direktno korišćena u sledećem koraku.

Korak 3: Sinteza intermedijera 33-3

[0133]

[0134] Intermedijeru 33-2 (2,0 g, 3,5 mmol) je dodato 0,55 g etilpiperazina (4,8 mmol), 0,73 g kalijum-karbonata (5,2 mmol) i 20 ml acetonitrila. Smeša je zagrevana na 80 °C i reagovala 8 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Rastvarač je uparen, i dodato je 100 ml DCM i 50 ml vodenog rastvora amonijum-hlorida. Nakon razdvajanja faza, sušenja i koncentrovanja, dobijeno je 1,9 g intermedijera 33-3 kao crvena čvrsta supstanca, koja je direktno korišćena u sledećem koraku.

Korak 4: Sinteza intermedijera 33-4

[0136] 1,9 g intermedijera 33-3 (3,2 mmol) je dodato u dihlormetan (3 mL) da se rastvori. Zatim je polako kap po kap dodata trifluorosirćetna kiselina (10 mL). Nakon dodavanja, smeša je zagrevana na 70 °C i reagovala 16 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Rastvarač i trifluorosirćetna kiselina su upareni da bi se dobilo 2,4 g intermedijera 33-4 kao crvena čvrsta supstanca, koja je direktno korišćena u sledećem koraku.

Korak 4: Sinteza jedinjenja 33

[0137]

[0138] Intermedijer 33-4 (2,4 g, 4,9 mmol) je dodat u 2-metiltetrahidrofuran (25 mL) da se rastvori. Zatim je dodat kalaj(II)-hlorid dihidrat (7,8 g, 34,8 mmol) u atmosferi azota, i smeša je zagrevana na 90 °C. Nakon 16 sati reakcije, LC-MS je pokazao kraj reakcije. Smeša je podešena na pH=10 dodavanjem vodenog rastvora natrijum-hidroksida i filtrirana preko celita. Filtrat je ekstrahovan sa 2-metiltetrahidrofuranom i koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika-gel koloni (dihlormetan : metanol = 10:1) da bi se dobilo jedinjenje 33 (0,047 g, prinos 10%).

[0139]<1>H NMR (400 MHz, DMSO): 11.50(S,1H), 8.72(S,1H), 7.43-7.47(m, 4H), 7.27 (s, 1H), 6.67(s, 1H), 3.47(s, 2H), 3.06(m, 4H), 2.97(m, 2H), 2.71(s, 4H), 2.12(s, 3H), 1.26-1.29(t, 3H).

Primer 8: sinteza jedinjenja 34

Korak 1: Sinteza intermedijera 34-1

[0140]

[0141] Intermedijer 1-4 (120 mg, 0,216 mmol, 1 ekv) je dodat u DMSO (2 mL), zatim su dodati tiomorfolin-1,1-dioksid (58,1 mg, 0,43 mmol, 2 ekv) i DIEA (diizopropiletilamin) (83,6 mg, 0,65 mmol, 3 ekv). Smeša je zagrevana na 80 °C i reagovala 3 sata. Kraj reakcije je praćen pomoću TLC. U reakcionu tečnost je kap po kap dodata voda (10 ml) i istaložen je čvrsti intermedijer 34-1 (70 mg, sirov), koji je direktno korišćen u sledećem koraku.

Korak 2: Sinteza intermedijera 34-2

[0142]

[0143] Intermedijer 34-1 (70 mg, 0,11 mmol, 1 ekv) je dodat u 2 ml trifluorosirćetne kiseline. Smeša je zagrevana na 80 °C i reagovala 5 sata. Kraj reakcije je praćen pomoću TLC.

Reakciona tečnost je uparena do suvoće i pulpirana sa MTBE (10 mL) da bi se dobio intermedijer 34-2 kao žuta čvrsta supstanca (30 mg, sirovi proizvod).

Korak 3: Sinteza jedinjenja 34

[0144]

[0145] Intermedijer 34-2 (300 mg, 0,62 mmol, 1 ekv) je dodat u tikvicu sa jednim grlom od 25 ml, zatim su dodati 2-metiltetrahidrofuran (20 ml) i kalaj(II)-hlorid (966 g, 4,28 mmol, 7 ekv). Smeša je zagrevana na 90 °C i mešana 5 sati. Kraj reakcije je praćen pomoću TLC. Reakcioni rastvor je ohlađen i pH je podešen na oko 8 sa natrijum-hidrogenkarbonatom. Smeša je ekstrahovana sa DCM (50 ml), a organska faza je odvojena, sušena, spojena i uparena do suvoće, dajući jedinjenje 34 (21 mg, prinos: 2,1% za tri koraka) nakon prečišćavanja preparativnom hromatografijom na silika-gel ploči (DCM: MeOH = 30 :1).

[0146]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6):11.60(s, 1H), 8.30(s, 1H), 7.33-7.49(m, 4H), 6.92(s, 1H), 6.11(s, 1H), 3.88(m, 4H), 3.08-3.10(m, 4H), 1.98(s, 3H).

Primer 9: sinteza jedinjenja 37

[0147]

[0148] Korak 1: 500 mg intermedijera 1-4 je odmereno i dodato u 15 ml acetonitrila da se rastvori, zatim je dodato 200 mg trietilamina i 200 mg BOC-piperazina. Smeša je zagrevana do refluksa 3 sata. Kraj reakcije je praćen pomoću TLC, a reakcioni rastvor je uparen do suvoće da bi se dobio intermedijer 37-1 kao žuta čvrsta supstanca, 400 mg, prinos 80%.

[0149] Korak 2: Intermedijer 37-1 je rastvoren u 15 ml TFA, i smeša je zagrevana do refluksa 6 sati. Kraj reakcije je praćen pomoću LC-MS. Smeša je uparena do suvoće. Nakon filtracije, sirovi proizvod je pulpiran sa metil-terc-butil etrom da bi se dobilo jedinjenje 37-2 kao žuta čvrsta supstanca (300 mg, prinos >100%).

[0150] Korak 3: Intermedijer 37-2 je rastvoren u 15 ml metiltetrahidrofurana, zatim je dodato 500 mg kalaj(II)-hlorid dihidrata. Smeša je zagrevana na 90 °C i refluksovana 5 sati, i reakcija je završena da bi se dobilo jedinjenje 37 (16 mg, prinos 5%).

[0151]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 11.60(s, 1H), 8.30(s, 1H), 7.33-7.49(m, 4H), 6.92(s, 1H), 6.11(s, 1H), 3.88(m, 4H), 2.08-2.10(m, 4H), 1.98(s, 3H).

Primer 10: sinteza jedinjenja 38

[0152]

[0153] Korak 1: Boc-piperazin 300 mg, 450 mg intermedijera 33-2 i kalijum-karbonat 300 mg su odmereni i dodat im je 20 ml acetonitrila da se rastvore. Smeša je zagrevana na 60 °C i reagovala 6 sati. Kraj reakcije je praćen pomoću LC-MS. Dodato je 300 ml vode i 50 ml dihlormetana. Odvojena uljana faza je sušena i uparena do suvoće, dajući intermedijer 38-1, 300 mg.

[0154] Korak 2: 15 ml trifluorosirćetne kiseline je sipano u 300 mg jedinjenja 38-1. Smeša je zagrevana na 90 °C i refluksovana 4 sata. Kraj reakcije je praćen pomoću LC-MS, i reakciona smeša je uparena do suvoće, dajući 200 mg jedinjenja 38-2.

[0155] Korak 3: 1,10 g kalaj(II)-hlorid dihidrata je odmereno i dodato sa intermedijerom 38-2, 15 ml metiltetrahidrofurana i 0,2 ml vode. Smeša je zagrevana na 90 °C i reagovala 16 sati. Nakon što je reakcija završena, pH reakcione smeše je podešen na 10, filtrirana je, uparena do suvoće i sušena, dobijajući 36 mg jedinjenja 38 u prinosu od 21%.

[0156]<1>H NMR (400 MHz, DMSO): 11.69(s, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.38-7.49(m, 4H), 7.10-7.25(m, 1H), 2.57-2.58(m, 4H), 2.26(s, 2H), 2.35(s, 4H), 1.98(s, 3H).

Primer 11: Sinteza jedinjenja 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 48

Sintetički put je bio sledeći:

[0157]

[0158] Opšta sintetička metoda: 8-bromo-5-(2-hlorofenil)-3-metil-2,10-dihidropirazolo[4,3-b]pirido[4,3-e][1,4]diazepan (1 ekv), pripremljen u koraku 2 Primera 6, je rastvoren u DMSO (5 ml), i dodat mu je amin (5 ekv) različitih struktura pod azotom. Smeša je zagrevana na 100 °C i reagovala 16 sati. TLC je pokazao da je reakcija završena. Reakciona tečnost je sipana u ledenu vodu (50 ml), i istaložio se sirovi proizvod kao žuta čvrsta supstanca.

[0159] 11.1 Sinteza jedinjenja 41: Struktura amina je bila

čvrsti sirovi proizvod je prečišćen preparativnom hromatografijom na silika-gel ploči (DCM: MeOH=30: 1) da bi se dobilo jedinjenje 41 (15 mg, prinos: 13,8%).

[0160]<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): 8.85(s, 1H), 7.28-7.42(m, 4H), 5.91(s, 1H), 5.62(s, 1H), 3.98-4.02(d, 2H), 2.66-2.72(t, 2H), 2.29(s, 3H), 2.22(s, 4H), 1.14-1.16(m, 6H).

[0161] 11.2 Sinteza jedinjenja 42: Struktura amina je bila

čvrsti sirovi proizvod je rastvoren u dihlormetanu (20 ml), sušen preko magnezijum-sulfata i uparen do suvoće da bi se dobilo jedinjenje 42 (22 mg, prinos: 20,4%).

[0162]<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): 8.85(s,1H), 7.28-7.42(m, 4H), 5.91(s, 1H), 5.62(s, 1H), 3.98-4.02(d, 2H), 2.66-2.72(t, 2H), 2.29(s, 3H), 2.22(m, 4H), 1.14-1.16(m, 6H).

Sirovi proizvod je osušen da bi se dobilo jedinjenje 44 (90 mg, prinos: 40,35%).

[0164]<1>H NMR (400 MHz, DMSO): 11.59(s,1H), 8.26(s,1H), 7.32-7.48(m,4H), 6.89(s,1H), 5.77(s,1H), 1.98(s,3H), 1.62(m,1H), 0.33-0.43(m,4H).

[0165] 11.4 Sinteza jedinjenja 45: Struktura amina je bila

sirovi proizvod je rastvoren u dihlormetanu (10 ml), sušen preko magnezijum-sulfata i uparen do suvoće da bi se dobila žuta čvrsta supstanca, koja je isprana smešom dihlormetan : petroletar = 1:1 da bi se dobilo jedinjenje 45 (42 mg, prinos: 20,1%).

[0166]<1>H NMR (400 MHz, DMSO): 11.59(s,1H), 8.28(s,1H), 7.32-7.48(m,4H), 6.86(s,1H), 4.62-4.67(m,3H), 3.54-3.71(dd,2H), 3.07-3,13(m,2H), 1.98(s,3H), 1.77-1.84(m,2H), 0.82-0.87(m,2H).

jenja 46: Struktura amina je bila

Sirovi proizvod je osušen da bi se dobilo jedinjenje 46 (130 mg, prinos: 59,9%).

[0168]<1>H NMR (400 MHz, DMSO):11.55(s,1H), 8.28(s,1H), 7.32-7.48(m,4H), 6.87(s,1H), 5.69(s,1H), 3.76-3.80(m,2H), 3.46-3.53(m,4H), 3.17-3,20(d,2H), 2.95(s,2H), 1.97(s,3H).

Sirovi proizvod je osušen da bi se dobilo jedinjenje 43 (55 mg, prinos: 57,9%).

[0170]<1>H NMR (400 MHz, DMSO): 11.59(s,1H), 8.30(s,1H), 7.33-7.46(m,4H), 6.90(s,1H), 5.92(s,1H), 3.89(s,2H), 3.65-3.67(m,2H), 3.31-3.36(m,2H), 3.15-3,17(d,1H), 2.86(s,3H), 1.97(s,3H).

Sirovi proizvod je osušen da bi se dobilo jedinjenje 40 (30 mg, prinos: 39,9%).

[0172]<1>H NMR (400 MHz, DMSO): 11.57(s,1H), 8.24(s,1H), 7.33-7.46(m,4H), 6.89(s,1H),5.96(s,1H), 3.79-3.93(m,4H), 3.45-3.46(m,2H), 2.75-2.81(t,1H), 3.15-3,17(d,1H), 1.97(s,3H), 1.08-1.09(d,3H).

Sirovi proizvod je osušen da bi se dobilo jedinjenje 48 (127 mg, prinos: 60%).

[0174]<1>H NMR (400 MHz, DMSO): 11.56(s,1H), 8.33(s, 1H), 7.32-7.43(m, 4H), 6.84(s, 1H), 5.53(s, 1H), 4.67(s, 3H), 4.01(s, 4H), 1.97(s, 3H).

Primer 12: sinteza jedinjenja 47

Korak 1: Sinteza intermedijera 47-1

[0175]

[0176] Intermedijer 1-4 (500 mg, 0,9 mmol, 1 ekv) je dodat u DMF (20 mL), zatim su dodati kalijum-fosfat (573 mg, 2,7 mmol, 3 ekv), 2-(3,6-dihidro-2H-piran-4-il)-4,4,5,5-tetrahidro-1,3,2-dioksaborolan (246 mg, 1,17 mmol, 1,2 ekv), paladijum-acetat (10 mg, 0,045 mmol, 0,05 ekv). Reaktor je tri puta ispran azotom. Smeša je zagrevana na 100 °C i reagovala 16 sata. Kraj reakcije je praćen pomoću TLC. Reakciona tečnost je sipana u ledenu vodu (50 ml) i ekstrahovana etil-acetatom (50 ml × 3). Organska faza je odvojena, sušena, uparena do suvoće, dajući intermedijer 47-1 kao žutu čvrstu supstancu (500 mg, sirovi proizvod je direktno korišćen u sledećem koraku).

Korak 2: Priprema intermedijera 47-2

[0177]

[0178] U atmosferi azota, intermedijer 47-1 (1,50 g, 2,67 mmol, 1 ekv) je dodat u tikvicu sa jednim grlom od 100 ml, zatim su dodati THF (5 ml), metanol (5 ml), paladijum na ugljeniku (0,15 g). Trietilsilan (3,1 g, 26,7 mmol, 10 ekv) je dodavan kap po kap u atmosferi azota, i smeša je mešana na 15 °C 5 minuta. Potpuna konverzija polaznih materijala je praćena pomoću TLC. Nakon reakcije, reakciona smeša je filtrirana, a filtrat je uparen do suvoće. Sirovi proizvod je dodat u MTBE (10 ml) i filtriran da bi se dobio 47-2 (0,67 g, prinos 44,67%).

Korak 3: Sinteza intermedijera 47-3

[0180] Intermedijer 47-2 (0,67 g, 1,2 mmol, 1 ekv) je dodat u tikvicu sa jednim grlom od 25 ml, a zatim je dodata trifluorosirćetna kiselina (5 ml). Smeša je zagrevana na 80 °C i reagovala 16 sata. Kraj reakcije je praćen pomoću TLC. Reakciona tečnost je uparena do suvoće, dajući intermedijer 47-3 kao žuto ulje (1,0 g, sirovi proizvod je direktno korišćen u sledećem koraku).

Korak 4: Sinteza jedinjenja 47

[0181]

[0182] Intermedijer 47-3 (1,0 g, 1,2 mmol, 1 ekv) je dodat u tikvicu sa jednim grlom od 25 ml, zatim su dodati 2-metiltetrahidrofuran (5 ml) i kalaj(II)-hlorid (1,89 g, 8,6 mmol). Smeša je zagrevana na 90 °C i mešana 5 sati. Kraj reakcije je praćen pomoću TLC. Reakciona tečnost je ohlađena i pH je podešen na 8 sa natrijum-hidrogenkarbonatom. Smeša je ekstrahovana sa DCM (50 ml), a organska faza je odvojena, sušena, spojena i uparena do suvoće, dajući jedinjenje 47 (36 mg, prinos: 6,2% za dva koraka) nakon prečišćavanja preparativnom hromatografijom na silika-gel ploči (DCM: MeOH = 30: 1).

[0183]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6):11.68(s, 1H), 8.45(s, 1H), 7.36-7.49(m, 4H), 7.11(s, 1H), 6.41(s, 1H), 3.86-3.88(d, 2H), 3.35-3.38(m, 2H), 2.55-2.59(m, 3H), 1.97(s, 3H), 1.48-1.63(m, 3H).

Primer 13: Priprema Kristalne forme I predmetnog pronalaska

[0184] Jedinjenje 29 (500,0 mg) formule (III) je dodato u tikvicu sa jednim grlom od 100 mL, a zatim je dodato 80,0 mL smeše etanol : 2-metiltetrahidrofuran = 5:1 (v:v). Reakciona tečnost je zagrevana na 100 °C da se razbistri, polako je dodavano jedinjenje 29 u porcijama, ukupno 100,00 mg, dok se reakciona tečnost nije razbistrila. Zatim je rastvor prirodno ohlađen na sobnu temperaturu, mešan preko noći, filtriran i osušen da bi se dobilo 320,00 mg kristalne forme I.

[0185] Koristeći Cu-Kα zračenje, rendgenska praškasta difrakcija kristalne forme I izražena uglom 2θ (°) pokazala je jake karakteristične pikove na 7,4±0,2°, 17,9±0,2°, 18,9±0,2°, 19,4±0,2°, 21,5±0,2° i 23,7±0,2°; kao i karakteristične pikove na 14,0±0,2°, 15,0±0,2°, 20,7±0,2° i 25,4±0,2°; i takođe karakteristične pikove na 11,7±0,2°, 22,8±0,2° i 27,8±0,2°. XRPD analiza je prikazana na Slici 1.

[0186] Endoterma kristalne forme I koja počinje na oko 311 °C i endotermni pik na oko 312 °C su izmereni diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom. DSC spektar je prikazan na Slici 2.

Primer 14: Priprema Kristalne forme I predmetnog pronalaska

[0187] Jedinjenje 29 (500,0 mg) formule (III) je dodato u tikvicu sa jednim grlom od 100 mL, a zatim je dodato 6,0 mL smeše dimetil-sulfoksid : voda = 2:1 (v:v). Reakciona smeša je zagrevana na 100 °C, i polako kap po kap je dodato 57 mL smeše dimetil-sulfoksid : voda = 2:1, dok se rastvor nije razbistrio. Reakciona smeša je prirodno ohlađena na sobnu temperaturu, mešana preko noći, filtrirana i osušena da bi se dobilo 320,00 mg kristalne forme I.

Primer 15: Priprema Kristalne forme I predmetnog pronalaska

[0188] Jedinjenje 29 (500,0 mg) formule (III) je dodato u tikvicu sa jednim grlom od 100 mL, dodata je smeša MeOH: DCM = 5:1 (60 mL) i zagrevano do potpunog rastvaranja. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom na 35-40 °C na rotacionom uparivaču da bi se dobila kristalna forma I (320,00 mg).

Primer 16: Priprema Kristalne forme I predmetnog pronalaska

[0189] Jedinjenje 29 (500,0 mg) formule (III) je dodato u tikvicu sa jednim grlom od 25 mL, a zatim je dodat MeOH (1,5 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 7 dana, filtrirana pod sniženim pritiskom, sušena da bi se dobila kristalna forma I (320,00 mg).

Primer 17: Priprema Kristalne forme I predmetnog pronalaska

[0190] Korak 1: Sinteza (2-hlorofenil)(4-((1-(4-metoksibenzil)-5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)-6-morfolinopiridin-3-il)metanona (Intermedijer III-E)

(6-bromo-4-((1-(4-metoksibenzil)-5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)piridin-3-il)(2-hlorofenil)metanon (intermedijer III-C) (150,0 g, 269 mmol) je rastvoren u DMSO (300 mL). Smeša je zagrevana na 50 °C da se rastvori čvrsta supstanca, a zatim je kap po kap dodat morfolin (III-D) (70,4 g, 808 mmol). Zatim je smeša zagrevana na 90 °C i reagovala 3 sata. TLC je pokazao kraj reakcije. Reakciona tečnost je sipana u vodu (3 L), velika količina čvrste supstance se istaložila i filtrirana. Filterski kolač je ispran vodom (500 mL), sušen da bi se dobio intermedijer III-E kao žuta čvrsta supstanca (160,0 g sirovog proizvoda).

Korak 2: Sinteza (2-hlorofenil)(4-((-5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)-6-morfolinopiridin-3-il)metanona (Intermedijer III-F)

[0191]

[0192] (2-hlorofenil)(4-((1-(4-metoksibenzil)-5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)-6-morfolinopiridin-3-il)metanon (Intermedijer III-E) (160,0 g, sirovi proizvod) je dodat u trifluorosirćetnu kiselinu (500 mL). Smeša je zagrevana na 80 °C i reagovala 8 sati. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Zatim je reakciona smeša koncentrovana, sirovi proizvod je pulpiran sa metil-terc-butil etrom (800 mL), filtriran da bi se dobio intermedijer III-F kao crvena čvrsta supstanca boje cigle (160 g, sirovi proizvod).

[0193] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ ppm: 13.63 (brs., 1H), 12.39 (s, 1H), 7.95-7.93(d, J=10.6 Hz, 2H), 7.62-7.48 (m, 4H), 3.74-3.70 (m, 4H), 3.64-3.63 (m, 4H), 2.58(s, 3H).

[0194] U procesu pripreme, takođe je moguće dobiti prelazno stanje formule (III-F') iz formule (III-E), a dobijeni sirovi proizvod je podvrgnut kiselom procesu (na primer, tretiran hlorovodoničnom kiselinom) da bi se konačno dobio ciljni intermedijer formule (III-F).

[0195]

[0196] (2-hlorofenil)(4-((5-metil-4-nitro-1H-pirazol-3-il)amino)-6-morfolinopiridin-3-il)metanon (Intermedijer III-F) (160 g, sirovi proizvod) je rastvoren u 2-metiltetrahidrofuranu (1,6 L), a zatim je dodat kalaj(II)-hlorid dihidrat (320 g, 1420 mmol). Smeša je zagrevana na 90 °C i reagovala 4 sata. LC-MS je pokazao kraj reakcije. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu (10 °C), reakciona tečnost je sipana u zasićeni rastvor natrijum-hidrogenkarbonata (4 L), dodat je 2-metiltetrahidrofuran (1 L), i filtrirano. Filtrat je razdvojen. Vodena faza je ekstrahovana sa 2-metiltetrahidrofuranom (1 L). Organske faze su spojene, isprane vodom (2 L) pa slanim rastvorom (2 L), sušene preko bezvodnog natrijum-sulfata, koncentrovane pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod je pulpiran sa metil-tercbutil etrom (400 mL) i filtriran da bi se dobila žuta čvrsta supstanca (65,0 g, čistoća 95%), prečišćena hromatografijom na silika-gelu (dihlormetan : metanol = 20: 1) da bi se dobila bledožuta čvrsta supstanca (55 g). Čvrsta supstanca je rastvorena u DMSO (oko 200 mL) i zagrevana na 40-50 °C, dok se čvrsta supstanca nije rastvorila. Gornji rastvor je polako dodavan kap po kap u destilovanu vodu (2 L), zatim se istaložila velika količina čvrste supstance, mešano na sobnoj temperaturi preko noći, i filtrirano pod vakuumom. Filterski kolač je sušen u vakuumu na 35 °C da bi se dobila bledožuta praškasta čvrsta supstanca (53 g, prinos 49,9% za tri koraka).

[0197]<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 11.58 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.33-7.47 (m, 4H), 6.90 (s, 1H), 5.96 (s, 1H), 3.61 (m, 4H), 3.31 (m, 4H), 1.98 (s, 3H).

[0198] Kristalna forma ovog uzorka je određena rendgenskom praškastom difrakcijom, i kristalna forma je bila ista kao kristalna forma dobijena u metodama pripreme iz Primera 13, 14, 15 i 16, to jest, kristalna forma I.

[0199] Predmetni pronalazak se može bolje razumeti iz sledećih bioloških eksperimentalnih primera. Međutim, stručnjaci iz ove oblasti će razumeti da opis eksperimentalnih primera ima za cilj samo da ilustruje pronalazak, i ne treba i neće ograničavati pronalazak na to.

Biološki eksperimentalni primer 1: Test enzimske aktivnosti jedinjenja predmetnog pronalaska

[0200] Test uzorci: Jedinjenja 1 do 4 predmetnog pronalaska (redni brojevi i strukture prikazani su u tabeli 1), koncentracija razblaženja: 0,03 µM - 3 µM, ukupno 10 gradijenata koncentracije.

[0201] Test metoda: Testovi enzimske aktivnosti Aurora kinaze (uključujući Aurora A i Aurora B) i VEGFR2 (KDR) su izvedeni korišćenjem multifunkcionalnog čitača mikrotitarskih ploča.

Eksperimentalna metoda:

(1) Test aktivnosti Aurora A kinaze:

[0202] Protein Aurora A kinaze i jedinjenja su sukcesivno dodavani u sledeći reakcioni sistem: 8 mM MOPS pH 7,0, 0,2 mM EDTA, 200 µM LRRASLG (Kemptid), 10 mM magnezijumacetat i [γ-<33>P]-ATP (radioaktivna aktivnost je bila približno 500 cpm/pmol). Zatim je u gore navedeni reakcioni sistem dodat ATP da započne reakciju, i inkubirano je na sobnoj temperaturi 40 minuta. Reakcija je zatim prekinuta dodavanjem 3% rastvora fosforne kiseline. Iz reakcionog sistema je uzeto 10 µL, a zatim dodato kap po kap na P30 filtermatsku filtersku membranu, isprano tri puta u 75 mM rastvoru fosforne kiseline po 5 minuta, a zatim isprano jednom metanolom. Nakon što je filterska membrana osušena, brojanje je izvršeno pomoću tečnog scintilacionog brojača.

(2) Test for Aurora B kinase activity:

[0203] Protein Aurora B kinaze i jedinjenja su sukcesivno dodavani u sledeći reakcioni sistem: 8 mM MOPS pH 7,0, 0,2 mM EDTA, 30 µM AKRRRLSSLRA, 10 mM magnezijum-acetat i [γ-<33>P]-ATP (radioaktivna aktivnost je bila približno 500 cpm/pmol). Zatim je u gore navedeni reakcioni sistem dodat ATP da započne reakciju, i inkubirano je na sobnoj temperaturi 40 minuta. Reakcija je zatim prekinuta dodavanjem 3% rastvora fosforne kiseline. Iz reakcionog sistema je uzeto 10 µL, a zatim dodato kap po kap na P30 filtermatsku filtersku membranu, isprano tri puta u 75 mM rastvoru fosforne kiseline po 5 minuta, a zatim isprano jednom metanolom. Nakon što je filter osušen, brojanje je izvršeno pomoću tečnog scintilacionog brojača.

(3) Test aktivnosti KDR kinaze:

[0204] Protein KDR kinaze i jedinjenja su sukcesivno dodavani u sledeći reakcioni sistem: 8 mM MOPS pH 7,0, 0,2 mM EDTA, 0,33 mg/mL mijelinski bazni protein, 10 mM magnezijumacetat i [γ-<33>P]-ATP (radioaktivna aktivnost je bila približno 500 cpm/pmol). Zatim je u gore navedeni reakcioni sistem dodat ATP da započne reakciju, i inkubirano je na sobnoj temperaturi 40 minuta. Reakcija je zatim prekinuta dodavanjem 3% rastvora fosforne kiseline. Iz reakcionog sistema je uzeto 10 µL, a zatim dodato kap po kap na P30 filtermatsku filtersku membranu, isprano tri puta u 75 mM rastvoru fosforne kiseline po 5 minuta, a zatim isprano jednom metanolom. Nakon što je filter osušen, brojanje je izvršeno pomoću tečnog scintilacionog brojača. Rezultati testa su prikazani u tabeli 2.

Tabela 2 Inhibitorna aktivnost jedinjenja 1 do 4 predmetnog pronalaska na Aurora kinazu i KDR kinazu (IC50)

[0205] Kao što se može videti iz eksperimentalnih rezultata u tabeli 2, jedinjenja predmetnog pronalaska imaju dobru inhibitornu aktivnost protiv više kinaza, što ukazuje da jedinjenja predmetnog pronalaska imaju dobar potencijal za kliničku primenu u lečenju bolesti posredovanih abnormalnom ekspresijom Aurora kinaze (uključujući Aurora A i Aurora B) i VEGFR2 (KDR).

Biološki eksperimentalni primer 2: Test enzimske aktivnosti jedinjenja predmetnog pronalaska

[0206] Test uzorci: Jedinjenja predmetnog pronalaska (redni brojevi i strukture prikazani su u tabeli 1), koncentracija razblaženja: 0,03 µM - 3 µM, ukupno 10 gradijenata koncentracije.

[0207] Kontrolni lek: Jedinjenje 1-2 otkriveno u WO2013123840A1

[0208] Test metoda: Testovi enzimske aktivnosti Aurora kinaze (uključujući Aurora A i Aurora B) i VEGFR2 (KDR) su izvedeni korišćenjem multifunkcionalnog čitača mikrotitarskih ploča.

Eksperimentalna metoda:

[0209]

(1) Priprema ploče sa jedinjenjima

a) Ploče sa 96 bunara, 10 grupa doza, trostruka serijska razblaženja, u svaki bunar je dodat DMSO, maksimalna koncentracija od 500 µM (50 puta koncentrovanije jedinjenje).

b) Ploče sa 384 bunara, razblaženo sa 1X kinaznim puferom (50 mM HEPES, pH 7,5; 0,0015% Brij-35; 2 mM DTT), svaki bunar sadrži 5X jedinjenje rastvoreno u 5 µL 10% DMSO. Svaki bunar negativne kontrole sadrži 5 µL 1X kinaznog pufera koji sadrži 10% DMSO.

(2) Procedura testa

[0210] Aurora A, Aurora B i KDR su rastvoreni u 1X kinaznom puferu i pripremljeni kao 2,5X rastvor enzima. Nakon što je jedinjenje u različitim koncentracijama reagovalo sa 2,5X rastvorom enzima na sobnoj temperaturi 10 minuta, dodati su peptidni supstrat obeležen sa FAM i ATP da bi se pokrenula reakcija. Nakon inkubacije od 40 minuta, dodato je 25 µL zaustavnog rastvora (100 mM HEPES, pH 7,5; 0,015% Brij-35; 0,2% Reagens za oblaganje #3; 50 mM EDTA) da bi se zaustavila reakcija, a konačni podaci su očitani na Caliper instrumentu. Rezultati testa su prikazani u tabeli 3.

Tabela 3 Inhibitorna aktivnost jedinjenja predmetnog pronalaska na Aurora kinazu i KDR kinazu (IC50)

[0211] Kao što se može videti iz eksperimentalnih rezultata u tabeli 3, jedinjenja predmetnog pronalaska imaju dobru inhibitornu aktivnost protiv više kinaza, što ukazuje da jedinjenja predmetnog pronalaska imaju dobar potencijal za kliničku primenu u lečenju bolesti posredovanih abnormalnom ekspresijom Aurora kinaze (uključujući Aurora A i Aurora B) i VEGFR2 (KDR).

Biološki eksperimentalni primer 3: Test citološke aktivnosti jedinjenja predmetnog pronalaska

[0212] Test uzorak: Jedinjenja predmetnog pronalaska (redni brojevi i strukture prikazani su u tabeli 1).

[0213] Kontrolni lek: Jedinjenje 1-2 otkriveno u WO2013123840A1

[0214] Test metoda: Efekat jedinjenja na proliferaciju ćelija različitih ćelijskih linija je ispitan Cell Titer-Glo metodom.

Eksperimentalna metoda:

[0215] Svaka ćelijska linija je zasejana u ploču sa 96 bunara dan ranije, i nakon inkubacije preko noći, dodati su lekovi u različitim koncentracijama do finalne koncentracije od 0-10000 nM, sa 3-5 puta razblaženjem, za ukupno 10 tačaka koncentracije. Nakon inkubacije od 72 sata, u smešu je dodat Cell Titer-Glo reagens ekvilibriran na sobnoj temperaturi, promućkano za inkubaciju od 10 minuta, a zatim ostavljeno da stoji na sobnoj temperaturi 2 minuta da se stabilizuje svetlosni signal. Multifunkcionalni čitač mikrotitarskih ploča je korišćen za očitavanje podataka iz svakog bunara i njihovu analizu. Rezultati testa su prikazani u tabelama 4-5:

Tabela 4 Celularna inhibitorna aktivnost IC50(nM) jedinjenja predmetnog pronalaska Test uzorci OVCAR- OVCAR- Caov- A2780 TOV- Hep3B KG- Kasumi-

Tabela 5 Celularna inhibitorna aktivnost IC50(nM) jedinjenja predmetnog pronalaska

[0216] Kao što se može videti iz rezultata eksperimenata u tabelama 4-5, jedinjenja predmetnog pronalaska imaju dobru inhibitornu aktivnost protiv različitih ćelija raka i mogu se koristiti za lečenje odgovarajućih kanceroznih oboljenja.

Biološki eksperimentalni primer 4: Određivanje enzimske aktivnosti kristalne forme I jedinjenja formule (III) (Jedinjenje 29)

[0217] Test uzorak: Kristalna forma I pripremljena u primeru 13, koncentracija razblaženja: 0,03 µM - 3 µM, ukupno 10 gradijenata koncentracije.

[0218] Test metoda: Test enzimske aktivnosti kinaza prikazanih u tabeli 1 je izveden korišćenjem multifunkcionalnog čitača mikrotitarskih ploča.

Eksperimentalna metoda:

[0219]

(1) Priprema ploče sa jedinjenjima

a) Ploče sa 96 bunara, 10 grupa doza, trostruka serijska razblaženja, u svaki bunar se dodaje DMSO, do koncentracije od 500 µM (50X jedinjenje).

(2) Procedura testa

[0220] Kinaze prikazane u tabeli 6 su rastvorene u 1X kinaznom puferu i pripremljene kao 2,5X rastvor enzima, svaka ponaosob. Nakon što su kristalna forma I i 2,5X rastvor enzima reagovali na sobnoj temperaturi 10 minuta, dodati su peptidni supstrat obeležen sa FAM i ATP da bi se pokrenula reakcija. Nakon inkubacije od 40 minuta, dodato je 25 µL zaustavnog rastvora (100 mM HEPES, pH 7,5; 0,015% Brij-35; 0,2% Reagens za oblaganje #3; 50 mM EDTA) da bi se zaustavila reakcija. Konačni podaci su očitani na Caliper instrumentu. Rezultati testa su prikazani u tabeli 6.

Tabela 6 Određivanje kinazno-inhibitorne aktivnosti kristalne forme I jedinjenja formule (III) (IC50)

[0221] Iz eksperimentalnih rezultata u tabeli 6, kristalna forma I jedinjenja formule (III) predmetnog pronalaska ima dobru inhibitornu aktivnost protiv različitih kinaza, što ukazuje da jedinjenja predmetnog pronalaska imaju dobar potencijal za kliničku primenu u lečenju bolesti posredovanih abnormalnom ekspresijom različitih kinaza, kao što su Aurora, VEGFR2 (KDR), FGFR, FLT i JAK.

Biološki eksperimentalni primer 5: In vivo farmakodinamička studija jedinjenja predmetnog pronalaska na supkutanom ksenograft tumorskom modelu humane akutne granulocitne leukemije Kasumi-1 ćelija

[0222]

Test uzorak: Kristalna forma I pripremljena u primeru 17 (kristalna forma I jedinjenja 29)

Životinje, ćelije, reagensi i instrumenti: Kasumi-1 ćelije, poreklom iz ATCC.

CB17 SCID miševi, 6-8 nedelja, ženke, dostupni od kompanije Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd.

Eksperimentalna metoda:

1. Formiranje i grupisanje miševa sa tumorom

[0223] Kasumi-1 ćelije su kultivisane in vitro u monosloju, a uslovi kulture su bili sledeći: RPMI1640 medijum dopunjen sa 10% fetalnog goveđeg seruma inaktivisanog toplotom i 1% dvostrukog antibiotika penicilin-streptomicin, 37 °C i 5% CO2. Pasažiranje je vršeno dva do tri puta nedeljno. Kada su ćelije bile u fazi eksponencijalnog rasta, ćelije su sakupljene, prebrojane i inokulisane.

[0224] 0,2 mL suspenzije ćelija koja sadrži oko 1 x 10<7>Kasumi-1 ćelija (ćelije suspendovane u 1:1 osnovnom RPMI 1640 medijumu i hranljivom gelu) je supkutano inokulisano u desni deo leđa ženki CB17 SCID miševa. Primena terapije po grupama je započeta kada je prosečni volumen tumora dostigao 100-150 mm<3>. Metoda grupisanja: Životinje su merene pre primene terapije i izmeren je volumen tumora. Grupisanje je izvršeno prema volumenu tumora, sa 8 miševa po grupi.

2. Režim doziranja

[0225]

Tabela 7. Režim doziranja

3. Eksperimentalni pokazatelji za praćenje

[0226] Zdravlje i smrtnost životinja su praćeni svakodnevno Telesna težina je merena dva puta nedeljno, a uzorci su sakupljeni nakon poslednje doze i izmerena je težina tumora. Efikasnost u pogledu težine tumora je procenjena pomoću TGI%, inhibicija rasta tumora (TGI)% = (TWcTWT) / TWc × 100%, TWc: težina tumora kontrolne grupe, TWT: težina tumora tretirane grupe. Prema smernicama NIH, lek se smatra efikasnim ako je TGI ≥ 58%.

Tabela 8 Efekat na težinu tumora kod miševa sa Kasumi-1 tumorom

[0227] Iz eksperimentalnih rezultata u tabeli 8, može se videti da jedinjenje 29 (kristalna forma I) ima značajan inhibitorni efekat na Kasumi-1 ćelijski ksenograft model, što ukazuje da jedinjenje predmetnog pronalaska ima dobar potencijal za kliničku primenu kod akutne leukemije.

Primer 6: PK evaluacija kod bigl pasa predmetnog pronalaska

[0228] Test uzorak: Kristalna forma I pripremljena u primeru 17 (kristalna forma I jedinjenja 29)

Eksperimentalna metoda:

1. Primena terapije i sakupljanje uzoraka krvi

[0229]

(1) Primena terapije na životinjama: Sve životinje su bile bez hrane više od 12 sati pre primene terapije, a hranjene su 4 sata nakon primene terapije. Voda nije bila ograničena pre i posle primene terapije tokom eksperimenta. Bigl psima je intravenski data pojedinačna doza od 1 mg/kg kristalne forme I jedinjenja 29 (formulacija: 10% DMA 20% (30% Solutol) 70% fiziološkog rastvora), a krv je sakupljana 0 sati pre primene i 0,083, 0,25, 0,50, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 12 i 24 sata nakon dprimene. Bigl psima je oralno data pojedinačna doza od 2 mg/kg kristalne forme I jedinjenja 29 (formulacija: 10% DMA 20% (30% Solutol) 70% fiziološkog rastvora), a krv je sakupljana 0 sati pre primene i 0,25, 0,50, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 12 i 24 sata nakon primene, i 200 µL krvi je uzeto kroz malu safensku venu i stavljeno u suvu epruvetu sa EDTA-K2.

(2) Priprema plazme: Uzorak pune krvi je razdvojen centrifugiranjem na niskoj brzini (1800 g, 5 min, 4 °C) (puna krv je sakupljena i stavljena u ledeno kupatilo, a odvajanje plazme treba da se završi u roku od 30 min) da bi se dobila plazma, a odvojena plazma je čuvana u frižideru na -20 °C za analizu.

2. Metoda analize uzoraka

[0230] Uzorak za ispitivanje (-80 °C) je izvađen iz frižidera, otopljen prirodnim putem na sobnoj temperaturi i vorteksovan 5 min; 20 µL uzorka plazme je precizno aspirirano u epruvetu za centrifugiranje zapremine 1,5 mL; dodato je 200 µL radnog rastvora internog standarda u koncentraciji od 50 ng/mL, i dobro promešano; nakon vorteksovanja od 5 min, smeša je centrifugirana 5 min (12000 rpm); 50 µL supernatanta je precizno aspirirano u ploče sa 96 bunara prethodno napunjene sa 150 µL vode po bunaru; vorteksovano 5 min, a LC-MS/MS određivanje je izvršeno sa zapreminom injekcije od 15 µL.

3. Metoda obrade podataka

[0231] Koncentracija test uzorka je dobijena korišćenjem Analyst 1.6.1 od AB SCIEX. Microsoft Excel je korišćen za izračunavanje srednje vrednosti, standardne devijacije, koeficijenta varijacije i drugih parametara (podaci direktno dobijeni iz Analyst 1.6.1 se ne računaju), PK parametri su izračunati korišćenjem Pharsight Phoenix 6.1 softvera NCA.

Eksperimentalni rezultati:

[0232]

Tabela 9. PK parametri kod bigl pasa

[0233] Može se videti iz eksperimentalnih rezultata u tabeli 9 da jedinjenje 29 (kristalna forma I) ima dobra farmakokinetička svojstva kod bigl pasa, pokazuje veoma dobru podesnost za lek i ima veoma veliki potencijal za kliničku primenu.

[0234] Gore navedeno su samo poželjna otelotvorenja predmetnog pronalaska, i nisu namenjena da ograniče predmetni pronalazak.

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje predstavljeno formulom (I), njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomeri,

pri čemu, X se bira između CH ili N; R1se bira iz grupe koju čine vodonik, C1-6alkil, C3-6cikloalkil, C1-6alkoksi, halogenovani C1-6alkil i halogenovani C1-6alkoksi; R2se bira iz grupe koju čine vodonik, C1-6alkil i C3-6cikloalkil; Y je CR3; P je CR4; W je N; R3se bira iz grupe koju čine vodonik, hidroksi, amino, karboksi, cijano, nitro, halogen, C1-6alkil, C1-6alkoksi, C3-6cikloalkiloksi, oksa C5-8cikloalkiloksi, halogenovani C1-6alkoksi, C2-8alkenil, C2-8alkinil, C3-6cikloalkilamino, C1-6alkilsulfonil, C3-8cikloalkilsulfonil, C1-6alkilkarbonil, C3-6cikloalkilkarbonil, -NR11-(CH2)n-N(R7)(R8), C1-6alkiltio-(CH2)n- , -(CH2)n-(3-14)-člani cikloalkil, -(CH2)n-(6-14)-člani aril, -(CH2)n-(5-14)-člani heterociklil i -(CH2)n-(5-14)-člani heteroaril; pri čemu je n=0-6; heterociklil ili heteroaril ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, a atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, atom C koji formira prsten u cikloalkilu, arilu, heterociklilu ili heteroarilu može biti opciono oksidovan u C(O); a cikloalkil, aril, heteroaril ili heterociklil mogu biti opciono supstituisani sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila ili C3-6cikloalkila; R4je -(CH2)n-(5-14)-člani heterociklil, pri čemu je n=0-6; heterociklil ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, a atom C koji formira prsten može biti opciono oksidovan u C(O); a heterociklil može biti opciono supstituisan sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila ili C3-6cikloalkila; R7i R8su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, C1-6alkil, C3-6cikloalkil, C1- 6alkoksi, halogenovani C1-6alkil i halogenovani C1-6alkoksi; Ar se bira iz grupe koju čine 3-14-člani cikloalkil, 6-14-člani aril, 5-14-člani heterociklil i 5-14-člani heteroaril, heterociklil ili heteroaril ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, a atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, atom C koji formira prsten u cikloalkilu, arilu, heterociklilu ili heteroarilu može biti opciono oksidovan u C(O), a Ar može biti opciono supstituisan sa 1 do 3 R6; R6je svaki nezavisno izabran iz grupe koju čine vodonik, hidroksi, amino, karboksi, cijano, nitro, halogen, C1-6alkil, C3-6cikloalkil, C1-6alkoksi, C3-6cikloalkiloksi, halogenovani C1-6alkoksi, halogenovani C1-6alkil, C3-6cikloalkil, C2-8alkenil, C2-8alkinil, -NR11-(CH2)n-N(R9)(R10) , amino C1-6alkil, C3-6cikloalkilamino, C1-6alkilsulfonil, C3-8cikloalkilsulfonil, C1-6alkilkarbonil, C3-6cikloalkilkarbonil, C1-6alkiltio, -(CH2)n-(6-14)-člani cikloalkil, -(CH2)n-(6-14)-člani aril, -(CH2)n-(5-14)-člani heterociklil i -(CH2)n-(5-14)-člani heteroaril; pri čemu je n=0-6, a cikloalkil, aril, heteroaril, heterociklil mogu biti opciono supstituisani sa jednim ili više nezavisnih C1- 3alkila; R9i R10su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, C1-6alkil, C3-6cikloalkil, C1- 6alkoksi, halogenovani C1-6alkil i halogenovani C1-6alkoksi; i R11se bira iz grupe koju čine vodonik, C1-6alkil i C3-6cikloalkil.
2. Jedinjenje, njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomeri prema patentnom zahtevu 1, pri čemu, X je N; R1se bira između C1-3alkila, poželjno metila ili etila; R2se bira iz grupe koju čine vodonik, metil i etil; Ar se bira iz grupe koju čine 6-14-člani aril ili 5-10-člani heteroaril; heteroaril ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, a atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, atom C koji formira prsten u arilu i heteroarilu može biti opciono oksidovan u C(O), pri čemu Ar može biti opciono supstituisan sa 1 do 3 R6; i R6je svaki nezavisno izabran iz grupe koju čine vodonik, amino, cijano, halogen, C1-4alkil, trifluorometil, metilsulfonil, -(CH2)n-(5-10)-člani heterociklil i -(CH2)n-(5-10)-člani heteroaril; pri čemu je n=0-6; a heteroaril i heterociklil mogu biti opciono supstituisani sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila.
3. Jedinjenje, njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomeri prema patentnom zahtevu 2, pri čemu je jedinjenje predstavljeno formulom (II):

pri čemu, Ar se bira iz grupe koju čine fenil i 5-6-člani heteroaril, heteroaril ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, a atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, atom C koji formira prsten u arilu i heteroarilu može biti opciono oksidovan u C(O), pri čemu Ar može biti opciono supstituisan sa 1 do 3 R6; R6je svaki nezavisno izabran iz grupe koju čine vodonik, amino, cijano, halogen, C1-4alkil, trifluorometil i metilsulfonil; a halogen je poželjno hlor; R3se bira iz grupe koju čine vodonik, hidroksi, amino, karboksi, cijano, nitro, halogen, C1-4alkil, C1-4alkoksi, C3-6cikloalkiloksi, oksa C5-8cikloalkiloksi, halogenovani C1-4alkoksi, C2-6alkenil, C2-6alkinil, C3-6cikloalkilamino, C1-4alkilsulfonil, C3-8cikloalkilsulfonil, C1-4alkilkarbonil, C3-6cikloalkilkarbonil, -NR11-(CH2)n-N(R7)(R8), -(CH2)n-(3-14)-člani cikloalkil, -(CH2)n-(5-11)-člani heterociklil i -(CH2)n-(5-10)-člani heteroaril; pri čemu je n=0-6; heterociklil ili heteroaril ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, a atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, atom C koji formira prsten u cikloalkilu, heterociklilu ili heteroarilu može biti opciono oksidovan u C(O); i cikloalkil, heteroaril, i heterociklil mogu biti opciono supstituisani sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila ili C3-6cikloalkil; R4je -(CH2)n-(5-11)-člani heterociklil, pri čemu je n=0-6; heterociklil ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, a atom C koji formira prsten može biti opciono oksidovan u C(O); a heterociklil može biti opciono supstituisan sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila ili C3-6cikloalkila; R7i R8su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, metil, etil, izopropil, i ciklopropil; i R11se bira iz grupe koju čine vodonik, C1-6alkil i C3-6cikloalkil.
4. Jedinjenje, njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomeri prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu, Ar se može izabrati iz grupe koju čine:

R3se bira iz grupe koju čine: vodonik, metil, etil, izopropil,

R4se bira iz grupe koju čine:
5. Jedinjenje, njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomeri prema patentnom zahtevu 3, pri čemu, Ar se bira između fenila ili 5-6-članog heteroarila; Ar može biti opciono supstituisan sa 1 do 3 R6, R6je svaki nezavisno izabran iz grupe koju čine vodonik, amino, cijano, halogen, C1-4alkil, trifluorometil i metilsulfonil; R3se bira između vodonika ili C1-4alkila; i R4je -(CH2)n-(5-11)-člani heterociklil; pri čemu je n=0-6; heterociklil ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, a atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, atom C koji formira prsten može biti opciono oksidovan u C(O); a heterociklil može biti opciono supstituisan sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila ili C3-6cikloalkila.
6. Jedinjenje, njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomeri prema patentnom zahtevu 5, pri čemu, Ar se bira između fenila ili piridila; Ar može biti opciono supstituisan sa 1 do 3 R6, pri čemu je R6svaki nezavisno izabran iz grupe koju čine vodonik, amino, cijano, halogen, C1-4alkil, trifluorometil i metilsulfonil; R3se bira između vodonika ili C1-4alkila; i R4je -(CH2)n-(5-6)-člani monoheterociklil ili -(CH2)n-(7-11)-člani kondenzovani heterociklil, pri čemu je n=0-6; heterociklil ima najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju čine O, S i N, a atom S koji formira prsten može biti opciono oksidovan u S(O) ili S(O)2, atom C koji formira prsten može biti opciono oksidovan u C(O); a heterociklil može biti opciono supstituisan sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkila ili C3-6cikloalkil; i poželjno, R4se bira iz grupe koju čine:

n=0-3; pri čemu heterociklil može biti opciono supstituisan sa jednim ili više nezavisnih C1-3alkil grupa ili C3-6cikloalkil grupa.
7. Jedinjenje, njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomeri prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu je jedinjenje izabrano između:
8. Jedinjenje, njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomeri prema patentnom zahtevu 1, pri čemu kristalna forma I jedinjenja formule (III), 4-(5-(2-hlorofenil)-3-metil-2,10-dihidropirazolo[4,3-b]pirido[4,3-e][1,4]diazepan-8-il)morfolin, ima karakteristične pikove na 7,4±0,2°, 17,9±0,2°, 18,9±0,2°, 19,4±0,2°, 21,5±0,2° i 23,7±0,2° u difrakcionom obrascu rendgenske praškaste difrakcije; poželjno, za rendgensku praškastu difrakciju se koristi Cu-Kα zračenje, a karakteristični pik je izražen uglom 2θ; dalje poželjno, kristalna forma I takođe ima karakteristične pikove na 14,0±0,2°, 15,0±0,2°, 20,7±0,2°, 25,4±0,2°; još poželjnije, kristalna forma I takođe ima karakteristične pikove na 11,7±0,2°, 22,8±0,2°, 27,8±0,2°;
9. Metoda za pripremu kristalne forme I definisane u patentnom zahtevu 8, pri čemu metoda obuhvata: rastvaranje jedinjenja formule (III) u pojedinačnom ili mešanom rastvaraču uz zagrevanje, i hlađenje radi taloženja kristalne forme I; ili suspendovanje jedinjenja formule (III) u pojedinačnom ili mešanom rastvaraču, mešanje i filtriranje da bi se dobila kristalna forma I; ili rastvaranje jedinjenja formule (III) u pojedinačnom ili mešanom rastvaraču i koncentrovanje pod vakuumom da bi se dobila kristalna forma I; ili pranje jedinjenja prikazanog formulom (III) odgovarajućom količinom pojedinačnog ili mešanog rastvarača, mešanje, filtriranje i sušenje da bi se dobila kristalna forma I; pri čemu je, poželjno, pojedinačni ili mešani rastvarač jedan ili više izabranih iz grupe koju čine: metanol, etanol, tetrahidrofuran, 2-metiltetrahidrofuran, dihlormetan, dihloretan, etil-acetat, acetonitril, dimetil-sulfoksid, dimetil-sulfoksid/voda, metanol/tetrahidrofuran, metanol/2-metiltetrahidrofuran, metanol/dihlormetan, etanol/2-metiltetrahidrofuran, dihlormetan/voda.
10. Metoda za pripremu jedinjenja formule (III), koja obuhvata: (1) reakciju jedinjenja formule (III-A) sa jedinjenjem formule (III-B) da bi se dobilo jedinjenje formule (III-C); (2) reakciju jedinjenja formule (III-C) sa jedinjenjem formule (III-D) da bi se dobilo jedinjenje formule (III-E); (3) uklanjanje zaštitne grupe sa jedinjenja formule (III-E) da bi se dobilo jedinjenje formule (III-F) ili formule (III-F'); i (4) dobijanje jedinjenja formule (III) iz jedinjenja formule (III-F) ili (III-F');

pri čemu termin PMB predstavlja p-metoksibenzil.
11. Farmaceutska formulacija, koja sadrži jedinjenje, njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomere prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, pri čemu, poželjno, farmaceutska formulacija sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.
12. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži jedinjenje, njegove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomere prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, i jedan ili više drugih terapijski aktivnih agenasa, pri čemu su drugi terapijski aktivni agensi antimetaboliti, inhibitori faktora rasta, inhibitori mitoze, antitumorski hormoni, alkilirajući agensi, metali, inhibitori topoizomeraze, hormoni, imunomodulatori, tumor-supresorski geni, vakcine protiv raka, imuni kontrolni punktovi ili antitela povezana sa tumorskom imunoterapijom, ili malomolekulski lekovi.
13. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je kompozicija za kombinovanu primenu jedinjenja, njegovih farmaceutski prihvatljivih soli ili stereoizomera i jednog ili više drugih terapijski aktivnih agenasa.
14. Jedinjenja, njihove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomeri prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 11, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 12 ili 13, za upotrebu u lečenju raka posredovanog abnormalnošću više kinaza, pri čemu rak uključuje rak pluća, karcinom skvamoznih ćelija, rak bešike, rak želuca, rak jajnika, rak peritoneuma, rak dojke, duktalni karcinom dojke, rak glave i vrata, karcinom endometrijuma, rak tela materice, rak rektuma, rak jetre, karcinom bubrega, tumor bubrežne karlice, karcinom jednjaka, adenokarcinom jednjaka, gliom, rak prostate, rak štitne žlezde, rak ženskog reproduktivnog sistema, karcinom in situ, limfom, neurofibromatoza, rak kostiju, rak kože, rak mozga, rak debelog creva, rak testisa, gastrointestinalni stromalni tumor, rak usne duplje, rak ždrela, multipli mijelom, leukemiju, ne-Hodgkinov limfom, horioadenom debelog creva, melanom, citom i sarkom.