RS67353B1

RS67353B1 - Poboljšana il-6 antitela

Info

Publication number: RS67353B1
Application number: RS20251073A
Authority: RS
Inventors: Michael March Schmidt; Alison Tisdale; Eric Steven Furfine; Grigorios Zarbis-Papastoitsis
Original assignee: F Hoffmann La Roche Ltd
Priority date: 2014-11-07
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2025-11-28
Also published as: EP4268843A2; CN107249631B; EP3632931A1; SI4268843T1; JP6594438B2; WO2016073890A1; HUE046181T2; ZA201702985B; BR112017008672A2; EP3215530B9; SA517381458B1; MX2017005992A; PT4268843T; CL2017001135A1; PL4268843T3; MA62787B1; PL3215530T3; EP4268843B1; RS59805B1; HRP20191945T1

Description

[0001] OPIS

[0002] Srodne prijave

[0003] Ova prijava ima pravo prvenstva u odnosu na U.S. Privremenu prijavu br.62/077,105, podnetoj 7. novembra 2014. godine; U.S. Privremenu prijavu br. 62/087,448, podnetoj 4. decembra 2014. godine; i U.S. Privremenu prijavu br.62/247,705, podnetoj 28. oktobra 2015. godine.

[0004] Oblast pronalaska

[0005] Oblast pronalaska se odnosi na IL-6. Konkretnije, oblast se odnosi na modulatore IL-6 i njihovu primenu u lečenju bolesti kao što su bolesti oka.

[0006] Osnova pronalaska

[0007] IL-6 je pleiotropni citokin sa utvrđenim ulogama u zapaljenju, hematopoezi, angiogenezi, diferencijaciji ćelija i preživljavanju neurona. Predmetni pronalazak se odnosi na poboljšana IL-6 antitela i njihove primene. WO 2014/074905, WO 2007/076927, WO 2008/144763, Kalai (1997) Europ J Biochem 249, 690-700, Finch (2011) J Mol Biol 411, 791-807 i WO 2004/045507 opisuju anti-IL-6 antitela i njihovu terapijsku primenu. US 6277375 B1, Rudikoff (1982), PNAS 79, 1979-1983, Winkler (2000), J Immunol 165, 4505-4514, Chien (1989) PNAS 86, 5532-5536, i Panka (1993) Mol Immunol 30, 1013-1020 opisuju generisanje i modifikaciju antitela.

[0008] Rezime

[0009] Predmetni pronalazak se odnosi na IL-6 antitela i fragmente (npr. antigen vezujuće fragmente) ili njihove derivate, kao i na nukleinske kiseline koje kodiraju IL-6 antitela i fragmente. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na primenu takvih antitela, fragmenata ili derivata. Antitela i fragmenti ili njihovi derivati mogu se primeniti, na primer, u lečenju bolesti povezane sa IL-6. U otelotvorenjima, antitelo, fragment ili njegov derivat mogu da se vežu (npr. specifično vežu) za IL-6, npr. za humani IL-6. U otelotvorenjima, antitelo, fragment ili njegov derivat mogu da se vežu (npr. specifično vežu) za mesto II IL-6 (npr. mesto II humanog IL-6).

[0010] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na anti-IL6 antitelo koje sadrži (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži sekvencu

(SEQ ID NO:31),

[0011] (b) CDR2 teškog lanca koji sadrži sekvencu

(SEQ ID NO:32),

[0012] (c) CDR3 teškog lanca koji sadrži sekvencu

(SEQ ID NO:33), (d) CDR1 lakog lanca koji sadrži sekvencu (SEQ ID NO:34), (e) CDR2 lakog lanca koji sadrži sekvencu (SEQ ID NO: 35), i

[0013] (f) CDR3 lakog lanca koji sadrži sekvencu

(SEQ ID NO:36).

[0014] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na anti-IL6 antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:37 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:38, osim što anti-IL6 antitelo ima ukupno 1, 2 ili 3 mutacije, i pri čemu varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO:31),

[0015] (SEQ ID NO:33) i pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinske sekvence

(SEQ ID NO:34),

[0017] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na anti-IL6 antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:41 i sekvencu lakog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:42, osim što antitelo sadrži ukupno 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija u odnosu na SEQ ID NO:41 i/ili SEQ ID NO:42, i pri čemu varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinske sekvence

(SEQ ID NO:31), (SEQ ID NO:32) i (SEQ ID NO:33) i pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinske sekvence

(SEQ ID

[0019] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na anti-IL6 antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:47 i sekvencu lakog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:42, osim što anti-IL6 antitelo sadrži ukupno 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija u odnosu na SEQ ID NO:47 i/ili SEQ ID NO:42 i sadrži aminokiselinske sekvence CDR teškog lanca

[0020] NO:33) i aminokiselinske sekvence CDR lakog lanca

(SEQ ID NO:34)

[0022] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži anti-IL6 antitela i, opciono, farmaceutski prihvatljiv nosač, kao i na antitelo ili na kompoziciju za primenu u lečenju očne bolesti koju karakteriše povišeni nivo IL-6 i/ili za primenu u lečenju dijabetičkog makularnog edema (DME), dijabetičke retinopatije, suvog oka (npr. bolesti suvog oka ili sindroma suvog oka), alergijskog konjunktivitisa, uveitisa, starosne makularne degeneracije (AMD), proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR), regmatogenog odvajanja mrežnjače (RRD), okluzije retinalne vene (RVO), optičkog neuromijelitisa (NMO), transplantacije rožnjače, abrazije rožnjače ili fizičke povrede oka.

[0023] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu koja kodira anti-IL6 antitelo, vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu i/ili ćeliju koja sadrži vektor.

[0024] U otelotvorenjima, VH CDR3 sadrži sekvencu SEQ ID NO:33.

[0025] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima povećan afinitet za humani IL-6 i/ili povećanu potentnost. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima povećan afinitet za humani IL-6 i/ili povećanu potentnost u poređenju sa antitelom ili antigen vezujućim fragmentom (npr. inače identično antitelo ili antigen vezujući fragment) koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži (i) VH CDR1 koji sadrži sekvencu (SEQ ID NO:45), (ii) VH CDR2 koji sadrži sekvencu (SEQ ID NO:46) i (ii) VH CDR3, pri čemu je jedno ili više (npr.1, 2, 3 ili sve) od sledećeg tačno: X<1>je A, X<2>je S, X<3>je I i X<4>je S.

[0026] Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrži VH CDR1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:31, VH CDR2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:32 i opciono VH CDR3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:33.

[0027] U otelotvorenjima, varijabilni region teškog lanca se razlikuje za ne više od 3, 2 ili 1 aminokiseline od SEQ ID NO:37. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO:37. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja se sastoji od SEQ ID NO:37.

[0028] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu koja je najmanje 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična sa SEQ ID NO:39. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu koja se razlikuje za ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline od SEQ ID NO:39. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži SEQ ID NO:39. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je Fab.

[0029] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu koja je najmanje 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična sa SEQ ID NO:54. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu koja se razlikuje za ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline od SEQ ID NO:54. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži SEQ ID NO:54. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je Fab.

[0030] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je scFv. U otelotvorenjima, vezivanje antitela ili antigena sadrži ili se sastoji od scFv sekvence

[0031]

[0033] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu koja je najmanje 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična sa SEQ ID NO:52 ili SEQ ID NO:53. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži SEQ ID NO:52 ili SEQ ID NO:53. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je scFv.

[0034] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu teškog lanca koja se razlikuje za ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline od SEQ ID NO:41. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO:41. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu teškog lanca koja se sastoji od SEQ ID NO:41.

[0035] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima povećan afinitet za humani IL-6 i/ili povećanu potentnost u poređenju sa EBI-029 ili njegovim fragmentom. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima povećan afinitet za humani IL-6 i/ili povećanu potentnost u poređenju sa antitelom ili antigen vezujućim fragmentom koji sadrži VH CDR1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:4, VH CDR2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:5 i opciono VH CDR3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:6. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima povećan afinitet za humani IL-6 i/ili povećanu potentnost u poređenju sa antitelom ili antigen vezujućim fragmentom koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:17. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima povećan afinitet za humani IL-6 i/ili povećanu potentnost u poređenju sa antiteloma ili antigen vezujućim fragmentom koji sadrži SEQ ID NO:24. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima povećan afinitet za humani IL-6 i/ili povećanu potentnost u poređenju sa antitelom ili antigen vezujućim fragmentom koji sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:11.

[0036] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvence EBI-030 ili EBI-031 kao što je navedeno u tabeli 4. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži domene EBI-030 ili EBI-031 kao što je prikazano na sl.15 (npr. jedan ili više FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4, CH1, šarka, CH2 i CH3 sekvence teškog lanca i/ili FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 i CK sekvence lakog lanca). U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži teški lanac i laki lanac. U otelotvorenjima, teški i laki lanci su povezani jednom ili više disulfidnih veza. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je Fab. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je scFv. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je Fab, Fab', F(ab')2, scFv ili Fv fragment.

[0037] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima povećan afinitet za humani IL-6 i/ili povećanu potentnost u poređenju sa antitelom ili antigen vezujućim fragmentom koji sadrži jednu ili više odgovarajućih sekvenci EBI-029, ili sekvenci antitela opisanog u WO2014/074905. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima povećan afinitet za humani IL-6 i/ili povećanu potentnost u poređenju sa tocilizumabom.

[0038] Tabela 4: Sažetak pregleda sekvenci EBI-029, EBI-030 i EBI-031

[0040]

[0041]

[0042]

[0043]

[0045] aa=aminokiselina; na=nukleinska kiselina; HC=teški lanac; LC=laki lanac; VH= varijabilni region teškog lanca;

[0046] VL=varijabilni region lakog lanca

[0047] Povećani afinitet i/ili povećana potentnost mogu se proceniti korišćenjem ovde opisanih postupaka i/ili postupaka poznatih u struci.

[0048] U otelotvorenjima, afinitet se procenjuje korišćenjem površinske plazmonske rezonance (SPR).

[0049] U otelotvorenjima, afinitet se povećava za najmanje 1,5, 1,6, 1,7, 1,8.1,9, 2, 3 ili 4 puta. U otelotvorenjima, potentnost se povećava. U otelotvorenjima, potentnost se povećava, što je naznačeno smanjenjem IC50 i/ili smanjenjem IC90. U otelotvorenjima, IC50 se smanjuje za najmanje 5, 10, 20, 30, 40 ili 50 puta. U otelotvorenjima, IC50 se smanjuje za najmanje oko 50 puta. U otelotvorenjima, IC90 se smanjuje za najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ili 500 puta. U otelotvorenjima, IC90 se smanjuje za najmanje oko 100 puta.

[0050] U otelotvorenjima, potentnost se procenjuje, npr. korišćenjem HEK-Blue™ testa ili testa proliferacije T1165.

[0051] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment inhibira signalizaciju cis-IL-6, npr. kao što je procenjeno na osnovu vrednosti IC50 ili IC90 dobijene korišćenjem ovde opisanog HEK-Blue™ testa, npr. sa 20 pM slobodnog IL-6.

[0052] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima IC50 manji od 47 pM i/ili IC90 manji od 4350 pM. U otelotvorenjima, IC50 je manji od 47 pM, npr. manji od 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 ili 1 pM. U otelotvorenjima, IC90 je manji od 4350 pM, npr. manji od 4000, 2000, 1000, 100, 50, 40, 30, 20, 15, 10 ili 5 pM. U otelotvorenjima, IC50 i/ili IC90 se procenjuju u HEK-Blue™ testu sa 20 pM IL-6.

[0053] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment blokira slobodni IL-6 sa većom potentnošću u poređenju sa tocilizumabom, npr. kao što je procenjeno na osnovu IC50 vrednosti dobijenih pomoću HEK-Blue™ testa sa 20 pM IL-6. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment inhibira IL-6 sa više od 900 puta većom potentnošću u poređenju sa tocilizumabom. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je EBI-031 ili njegov antigen vezujući fragment. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima IC50 manji od 15 pM, npr. IC50 od 14,2 pM, za inhibiciju IL-6.

[0054] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment blokira signalizaciju trans-IL-6, npr. kao što je procenjeno korišćenjem ovde opisanog HEK-Blue™ testa, npr. sa 200 pM hiper IL-6. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment inhibira signalizaciju putem hiper IL-6. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment inhibira signalizaciju putem hiper IL-6 sa većom potentnošću od tocilizumaba, npr. sa više od 900 puta većom potentnošću u poređenju sa tocilizumabom. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment inhibira signalizaciju putem hiper IL-6 sa IC50 manjim od 1 µM. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment inhibira signalizaciju putem hiper IL-6 sa IC50 manjim od 1 nM. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment inhibira signalizaciju putem hiper IL-6 sa IC50 manjim od 100 pM ili manjim od 50 pM, npr. sa IC50 od oko 14-15 pM. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je EBI-031 ili njegov antigen vezujući fragment.

[0055] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment inhibira signalizaciju cis-IL-6 i signalizaciju trans-IL-6.

[0056] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je efikasan u blokiranju signalizacije IL-6 u oku za najmanje 1 mesec, 2 meseca, 3 meseca, 4 meseca, 5 meseci ili 6 meseci, npr. nakon intravitrealne primene. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment blokira 95% signalizacije IL-6 u oku za najmanje 1 mesec, 2 meseca, 3 meseca, 4 meseca, 5 meseci ili 6 meseci, npr. nakon intravitrealne primene. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment blokira 95% signalizacije IL-6 u oku za oko 150 dana.

[0057] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima povećan afinitet za humani IL-6 u odnosu na kontrolno antitelo, npr. u odnosu na EBI-029 ili njegov fragment. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima povećan afinitet za humani IL-6 u odnosu na antitelo ili antigen vezujući fragment koji je inače identičan, osim što ne sadrži navedenu jednu ili više aminokiselina izabranih između V28, P30, T51 i G55 i umesto toga sadrži jednu ili više (npr.1, 2, 3 ili 4) aminokiselina izabranih između A28, S30, 151 i S55. U otelotvorenjima, afinitet se povećava za najmanje 1,5, 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 2, 3 ili 4 puta. U otelotvorenjima, afinitet se procenjuje korišćenjem površinske plazmonske rezonance (SPR).

[0058] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima npr. povećanu potenstnost u odnosu na kontrolno antitelo, npr. u odnosu na EBI-029 ili njegov fragment. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima povećanu potentnost u odnosu na antitelo ili antigen vezujući fragment koji je inače identičan, osim što ne sadrži navedenu jednu ili više aminokiselina izabranih između V28, P30, T51 i G55 i umesto toga sadrži jednu ili više (npr. 1, 2, 3 ili 4) aminokiselina izabranih između A28, S30, I51 i S55.

[0059] U otelotvorenjima, potentnost se povećava, što je naznačeno smanjenjem IC50 i/ili smanjenjem IC90. U otelotvorenjima, IC50 se smanjuje za najmanje 5, 10, 20, 30, 40 ili 50 puta. U otelotvorenjima, IC50 se smanjuje za najmanje oko 50 puta. U otelotvorenjima, IC90 se smanjuje za najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ili 500 puta. U otelotvorenjima, IC90 se smanjuje za najmanje oko 100 puta.

[0060] U otelotvorenjima, potentnost se procenjuje korišćenjem HEK-Blue™ testa ili testa proliferacije T1165.

[0061] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima IC50 manji od 47 pM i/ili IC90 manji od 4350 pM. U otelotvorenjima, IC50 je manji od 47 pM, npr. manji od 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 ili 1 pM. U otelotvorenjima, IC90 je manji od 4350 pM, npr. manji od 4000, 2000, 1000, 100, 50, 40, 30, 20, 15, 10 ili 5 pM. U otelotvorenjima, IC50 i/ili IC90 se procenjuju u HEK-Blue™ testu sa 20 pM IL-6.

[0062] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži V28, P30, T51 i G55, a antitelo ili antigen vezujući fragment pokazuje poboljšani afinitet za humani IL-6 i/ili poboljšanu potentnost u poređenju sa antitelom ili antigen vezujućim fragmentom koji je inače identičan, osim što sadrži A28, S30, I51 i S55.

[0063] U otelotvorenjima, ovde opisano antitelo ili antigen vezujući fragment dalje sadrži varijabilni region lakog lanca ili njegov antigen vezujući fragment, koji sadrži VL CDR1, VL CDR2 i VL CDR3.

[0064] U otelotvorenjima, VL CDR1 sadrži sekvencu SEQ ID NO:34, VL CDR2 sadrži sekvencu SEQ ID NO:35, a VL CDR3 sadrži sekvencu SEQ ID NO:36.

[0065] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment dalje sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO:38 ili koja se razlikuje od SEQ ID NO:38 za ne više od 3, 2 ili 1 aminokiseline.

[0066] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment dalje sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO:38. U otelotvorenjima, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži SEQ ID NO:38.

[0067] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment dalje sadrži sekvencu lakog lanca koja se razlikuje za ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline od SEQ ID NO:42.

[0068] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment dalje sadrži sekvencu lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO:42.

[0069] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment dalje sadrži sekvencu lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:42 ili sekvencu koja se razlikuje za ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline od SEQ ID NO:42. U otelotvorenjima, sekvenca lakog lanca sadrži SEQ ID NO:42.

[0070] Antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži

[0071] (i) VH CDR1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:31, VH CDR2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:32 i VH CDR3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:33 i

[0072] (ii) VL CDR1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:34, VL CDR1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:35 i VL CDR3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:36.

[0073] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 antitelo ili njegov fragment. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je IgG1 ili IgG2 antitelo ili njegov fragment. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je IgG1 Fab ili IgG2.Fab. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je IgG2 antitelo ili antigen vezujući fragment.

[0074] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je konstruisan da smanji ili eliminiše ADCC aktivnost.

[0075] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je monoklonsko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je humanizovano ili humano monoklonsko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment.

[0076] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:37, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:38. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži prethodno navedene varijabilne regione teškog i lakog lanca, osim što ima mutaciju, npr. ukupno najviše 1, 2 ili 3 mutacije. U otelotvorenjima, mutacija(mutacije) ne smanjuje afinitet i/ili potentnost antitela ili antigen vezujućeg fragmenta.

[0077] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO:41 i sekvencu lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO:42.

[0078] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sakvencu teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:41, i sakvencu lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:42.

[0079] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO:47 i sekvencu lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO:42.

[0080] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu teškog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:41 i sekvencu lakog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:42, osim što antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži ukupno 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija u odnosu na SEQ ID NO:41 i/ili SEQ ID NO:42. U otelotvorenjima, mutacija(mutacije) je u regionu(regionima) okvira. U otelotvorenjima, mutacija ne smanjuje afinitet i/ili potentnost antitela ili antigen vezujućeg fragmenta u odnosu na antitelo ili antigen vezujući fragment koji ne sadrži navedenu mutaciju.

[0081] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu teškog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:47 i sekvencu lakog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:42, osim što antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži ukupno 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija u odnosu na SEQ ID NO:47 i/ili SEQ ID NO:42. U otelotvorenjima, mutacija(mutacije) je u regionu(regionima) okvira. U otelotvorenjima, mutacija ne smanjuje afinitet i/ili potentnost antitela ili antigen vezujućeg fragmenta u odnosu na antitelo ili antigen vezujući fragment koji ne sadrži navedenu mutaciju.

[0082] U jednom otelotvorenju, antitelo ili antigen vezujući fragment je Fab.

[0083] U jednom otelotvorenju, antitelo ili antigen vezujući fragment je IgG1 Fab.

[0084] U jednom otelotvorenju, antitelo ili antigen vezujući fragment je izolovani Fab koji sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO:39 i sekvencu lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO:42. U jednom otelotvorenju, antitelo ili antigen vezujući fragment je izolovani Fab koji sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO:39 i sekvencu lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO:42.

[0085] U jednom otelotvorenju, antitelo ili antigen vezujući fragment je IgG2 Fab.

[0086] U jednom otelotvorenju, antitelo ili antigen vezujući fragment je izolovani Fab koji sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO:54 i sekvencu lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO:42. U jednom otelotvorenju, antitelo ili antigen vezujući fragment je izolovani Fab koji sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO:54 i sekvencu lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO:42.

[0087] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu teškog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:39 i sekvencu lakog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:42, osim što antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži mutaciju (npr. ukupno 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija u odnosu na SEQ ID NO:39 i/ili SEQ ID NO:42). U otelotvorenjima, mutacija(mutacije) je u regionu(regionima) okvira. U otelotvorenjima, mutacija ne smanjuje afinitet i/ili potentnost antitela ili antigen vezujućeg fragmenta u odnosu na antitelo ili antigen vezujući fragment koji ne sadrži navedenu mutaciju.

[0088] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu teškog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:54 i sekvencu lakog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:42, osim što antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži mutaciju (npr. ukupno 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija u odnosu na SEQ ID NO:54 i/ili SEQ ID NO:42). U otelotvorenjima, mutacija(mutacije) je u regionu(regionima) okvira. U otelotvorenjima, mutacija ne smanjuje afinitet i/ili potentnost antitela ili antigen vezujućeg fragmenta u odnosu na antitelo ili antigen vezujući fragment koji ne sadrži navedenu mutaciju.

[0089] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment može da se veže za najmanje jedan od R24, K27, Y31, D34, S118 ili V121 humanog IL-6. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment može da se veže za R24, K27, Y31, D34, S118 i V121 humanog IL-6. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment može da se veže za najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4 ili najmanje 5 R24, K27, Y31, D34, S118 i V121 humanog IL-6. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment mogu da se vežu (npr. mogu da se specifično vežu) za mesto II humanog IL-6.

[0090] U otelotvorenjima, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu da se vežu za IL-6 na temperaturi T<m>od 70 °C ili više.

[0091] U otelotvorenjima, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu da se vežu za IL-6 na temperaturi T<m>od 80°C ili više.

[0092] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili njegov fragment (npr. njegov antigen vezujući fragment) se veže za najmanje jedan od R24, K27, Y31, D34, S118 i V121 humanog IL-6.

[0093] U otelotvorenjima, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment se veže za najmanje dva od R24, K27, Y31, D34, S118 i V121 humanog IL-6. U otelotvorenjima, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment se veže za najmanje tri od R24, K27, Y31, D34, S118 i V121 humanog IL-6. U otelotvorenjima, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment se veže za najmanje četiri od R24, K27, Y31, D34, S118 i V121 humanog IL-6. U otelotvorenjima, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment se veže za najmanje pet od R24, K27, Y31, D34, S118 i V121 humanog IL-6. U otelotvorenjima, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment se veže za R24, K27, Y31, D34, S118 i V121 humanog IL-6.

[0094] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je monoklonsko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je humanizovano monoklonsko antitelo. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je humano monoklonsko antitelo.

[0095] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment pokazuje <10% agregacije pri koncentraciji od 100-150 mg/ml, npr. pri koncentraciji od oko 142 mg/ml u PBS-u, pH 7,4. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima poboljšana farmakokinetička svojstva u poređenju sa drugim terapeutskim sredstvom, npr. u poređenju sa tocilizumabom, bevacizumabom, ranibizumabom i/ili Eylea®. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima poboljšano zadržavanje u oku kada se primenjuje u oko, npr. intravitrealno, npr. intravitrealnom injekcijom. U otelotvorenjima, poboljšano zadržavanje u oku je naznačeno povećanim poluživotom u oku, npr. u staklastom telu, mrežnjači, očnoj vodici, horoidei i/ili beonjači.

[0096] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment ima poluživot u staklastom telu od najmanje 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 dana. U otelotvorenjima, poluživot u staklastom telu je najmanje 10 dana. U otelotvorenjima, poluživot u staklastom telu se procenjuje kod životinje, npr. kod zeca ili majmuna. U otelotvorenjima, poluživot u staklastom telu se procenjuje kod čoveka.

[0097] U otelotvorenjima, ovde opisano antitelo ili antigen vezujući fragment ima smanjeni sistemski poluživot (npr. niži T<1/2β>) i/ili poboljšani sistemski klirens, npr. smanjeni sistemski poluživot ili brži sistemski klirens u poređenju sa drugim terapeutskim sredstvom, npr. tocilizumabom, bevacizumabom, ranibizumabom i/ili afliberceptom (Eylea®). U otelotvorenjima, sistemski poluživot (npr. T<1/2β>) je niži od tocilizumaba i/ili aflibercepta (Eylea®). U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži Fc domen koji sadrži mutaciju (npr. na 1, 2, 3 ili 4 mutacije) na jednom ili više položJ koji odgovaraju H311, D313, I254 ili H436 (numeracija kao u SEQ ID NO:41). U nekim otelotvorenjima, supstituciona mutacija je izabrana iz jedne ili više od H311A, H311E, H311N, D313T, I254A, I254R i H436A. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži Fc domen koji sadrži mutaciju koja odgovara H311A (numeracija kao u SEQ ID NO:41). U otelotvorenjima, Fc domen je Fc domen IgG1. U otelotvorenjima, Fc domen je Fc domen IgG2.

[0098] U otelotvorenjima, Fc domen je Fc domen humanog IgG1 koji ima sekvencu SEQ ID NO:50 i opciono sadrži mutaciju na jednom ili više podvučenih položaja: (H90, D92, I33 i H215):

[0100]

[0102] (SEQ ID NO:50).

[0103] U otelotvorenjima, Fc domen IgG1 sadrži mutaciju koja odgovara jednom ili više H90A, H90E, H90N, D92T, I33A, I33R i H215A (numeracija shodno SEQ ID NO:50).

[0104] U otelotvorenjima, Fc domen je Fc domen humanog IgG2 koji ima sekvencu SEQ ID NO:51 i opciono sadrži mutaciju na jednom ili više podvučenih položaja (H86, D88, I29 i H211):

[0107]

[0109] SEQ ID NO:51).

[0110] U otelotvorenjima, Fc domen IgG2 sadrži mutaciju koja odgovara jednom ili više H86A, H86E, H86N, D88T, I29A, I29R i H211A (numeracija shodno SEQ ID NO:51).

[0111] U otelotvorenjima, Fc mutacija smanjuje sistemsku akumulaciju antitela ili antigen vezujućeg fragmenta (npr. povećava klirens ili smanjuje poluživot, npr. T<1/2β>) antitela ili antigen vezujućeg fragmenta. U otelotvorenjima, sistemska akumulacija je smanjena u poređenju sa drugim terapeutskim sredstvom (npr. tocilizumab, bevacizumab, ranibizumab i/ili aflibercept). U otelotvorenjima, sistemska akumulacija je smanjena u poređenju sa akumulacijom tocilizumaba i/ili aflibercepta. U otelotvorenjima, sistemska akumulacija je smanjena u poređenju sa sistemskom akumulacijom odgovarajućeg antitela ili antigen vezujućeg fragmenta koji ne sadrži mutaciju. U otelotvorenjima, sistemska akumulacija se procenjuje nakon intravitrealne primene antitela ili antigen vezujućeg fragmenta.

[0112] U drugom aspektu, ovde je dat postupak smanjenja sistemskih efekata inhibicije IL-6 kod ispitanika, pri čemu se postupak sastoji od primene na ispitaniku antitela ili njegovog fragmenta koji sadrži mutirani Fc domen, kao što je ovde opisano. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment može da inhibira aktivnost IL-6 i ima smanjenu aktivnost Fc (npr. smanjeno vezivanje za FcRn) u poređenju sa odgovarajućim antitelom ili njegovim fragmentom koji imaju Fc domen divljeg tipa. U nekim slučajevima, postupak smanjenja sistemskih efekata inhibicije IL-6 kod ispitanika uključuje primenu na ispitaniku antagonista IL-6 koji se sastoji od mutiranog Fc domena, kao što je ovde opisano.

[0113] U daljem aspektu, ovde je data nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira antitelo ili antigen vezujući ffragment opisanog u ovom dokumentu. U otelotvorenjima, nukleinska kiselina kodira aminokiselinsku sekvencu koja je ovde izložena. U otelotvorenjima, aminokiselinska sekvenca sadrži SEQ ID NO:40, ID BR. SEKV:43 ili SEQ ID NO:48. U otelotvorenjima, nukleinska kiselina kodira sekvencu izloženu u tabeli 4.

[0114] Ovde je takođe dat vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu. Ovde je takođe data ćelija koja sadrži nukleinsku kiselinu ili vektor.

[0115] U otelotvorenjima, ovde opisano IL-6 antitelo ili antigen vezujući fragmentse koristi u lečenju ispitanika (npr. čoveka) sa bolešću povezanom sa IL-6. U otelotvorenjima, bolest je bolest oka, npr. bolest oka koju karakteriše povišen nivo IL-6, npr. u staklastom telu.

[0116] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment se koristi u lečenju ispitanika (npr. čoveka) sa dijabetičkim makularnim edemom (DME), dijabetičkom retinopatijom, uveitisom, glaukomom, suvim okom (npr. bolest suvog oka ili sindrom suvog oka), alergijskim konjunktivitisom, bolom u oku, regmatogenim odvajanjem mrežnjače (RRD), starosnom makularnom degeneracijom (AMD), proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR), okluzijom retinalne vene (RVO), optičkim neuromijelitisom (NMO), transplantacijom rožnjače, abrazijom rožnjače ili fizičkom povredom oka. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment se koristi u lečenju ispitanika (npr. čoveka) sa DME.

[0117] U otelotvorenjima, ovde opisano IL-6 antitelo ili antigen vezujući fragment se koristi u pripremi leka za lečenje bolesti povezane sa IL-6. U otelotvorenjima, bolest je bolest oka, npr. bolest oka koju karakteriše povišen nivo IL-6 u staklastom telu. U otelotvorenjima, bolest povezana sa IL-6 je dijabetički makularni edem (DME), dijabetička retinopatija, uveitis, suvo oko (npr. bolest suvog oka ili sindrom suvog oka), starosna makularna degeneracija (AMD), proliferativna dijabetička retinopatija (PDR), regmatogeno odvajanje mrežnjače (RRD), okluzija retinalne vene (RVO), optički neuromijelitis (NMO), transplantacija rožnjače, abrazija rožnjače ili fizička povreda oka. U otelotvorenjima, bolest povezana sa IL-6 je dijabetički makularni edem. U otelotvorenjima, lek je formulisan za isporuku u staklasto telo oka ispitanika (npr. za intravitrealnu injekciju).

[0118] Ovde je takođe data kompozicija koja sadrži antitelo ili antigen vezujući fragment opisanog u ovom dokumentu. U otelotvorenjima, kompozicija dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i jednu ili više farmaceutski prihvatljivih pomoćnih supstanci.

[0119] U otelotvorenjima, kompozicija se koristi u lečenju bolesti povezane sa IL-6. U otelotvorenjima, bolest je bolest oka, npr. bolest oka koju karakteriše povišen nivo IL-6 u staklastom telu. U otelotvorenjima, kompozicija se koristi u lečenju dijabetičkog makularnog edema (DME), dijabetičke retinopatije, uveitisa, suvog oka (npr. bolesti suvog oka ili sindroma suvog oka), starosne makularne degeneracije (AMD), proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR), regmatogenog odvajanja mrežnjače (RRD), okluzije retinalne vene (RVO), optičkog neuromijelitisa (NMO), transplantacije rožnjače, abrazije rožnjače ili fizičke povrede oka.

[0120] Upućivanja na metode lečenja u narednim paragrafima ovog opisa treba tumačiti kao reference na jedinjenja, farmaceutske kompozicije ili lekove predmetnog pronalaska za upotrebu u metodi lečenja terapijom.

[0121] Ovde je takođe data metoda lečenja bolesti povezane sa IL-6, pri čemu se metoda sastoji od primene na ispitaniku terapeutski efikasne količine IL-6 antitela ili fragmenta opisanog u ovom dokumentu. U otelotvorenjima, bolest povezana sa IL-6 je bolest oka, npr. bolest oka koju karakteriše povišen nivo IL-6 u staklastom telu. U otelotvorenjima, bolest povezana sa IL-6 je dijabetički makularni edem (DME), dijabetička retinopatija, uveitis, suvo oko (npr. bolest suvog oka ili sindrom suvog oka), starosna makularna degeneracija (AMD), proliferativna dijabetička retinopatija (PDR), regmatogeno odvajanje mrežnjače (RRD), okluzija retinalne vene (RVO), optički neuromijelitis (NMO), transplantacija rožnjače, abrazija rožnjače ili fizička povreda oka. U otelotvorenjima, bolest povezana sa IL-6 je dijabetički makularni edem.

[0122] U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment, ili kompozicija koja sadrži antitelo ili antigen vezujući fragment, isporučuje se u staklasto telo oka ispitanika (npr. intravitrealnom injekcijom). U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment, ili kompozicija koja sadrži antitelo ili antigen vezujući fragment, koristi se za intravitrealnu injekciju.

[0123] U otelotvorenjima, bolest povezana sa IL-6 je dijabetički makularni edem i antitelo ili fragment, ili kompozicija koja sadrži antitelo ili antigen vezujući fragment, isporučuje se u staklasto telo oka ispitanika.

[0124] Ovde je takođe dato antitelo ili njegov fragment (npr. antigen vezujući fragment) (npr. IL-6 antitelo ili njegov fragment, kao što je ovde opisano), ili kompozicija koja sadrži takvo antitelo ili njegov fragment, za upotrebu u lečenju bolesti povezane sa IL-6 (npr. za upotrebu u lečenju ispitanika, npr. ljudskog ispitanika, koji ima bolest povezanu sa IL-6).

[0125] U otelotvorenjima, navedena bolest je bolest oka koju karakteriše povišen nivo IL-6, npr. u staklastom telu. U otelotvorenjima, navedena bolest je dijabetički makularni edem (DME), dijabetička retinopatija, uveitis, suvo oko (npr. poremećaj suvog oka ili bolest suvog oka), alergijski konjunktivitis, starosna makularna degeneracija (AMD), proliferativna dijabetička retinopatija (PDR), regmatogeno odvajanje mrežnjače (RRD), okluzija retinalne vene (RVO), optički neuromijelitis (NMO), transplantacija rožnjače, abrazija rožnjače ili fizička povreda oka. U otelotvorenjima, navedena bolest je DME. U otelotvorenjima, navedena bolest je bolest suvog oka. U otelotvorenjima, navedena bolest je sindrom suvog oka. U otelotvorenjima, navedena bolest je uveitis. U otelotvorenjima, navedena bolest je AMD. U otelotvorenjima, navedena bolest je PDR. U otelotvorenjima, navedena bolest je transplantacija rožnjače, abrazija rožnjače ili fizička povreda oka. U otelotvorenjima, antitelo ili njegov fragment (npr. antigen vezujući fragment) je pogodan za isporuku u staklasto telo oka. U otelotvorenjima, antitelo ili njegov fragment (npr. antigen vezujući fragment) se isporučuje u staklasto telo oka.

[0126] Ovde je takođe data metoda lečenja bolesti povezane sa IL-6, pri čemu se metoda sastoji od primene na ispitaniku IL-6 antitela ili njegovog fragmenta (npr. njegovog antigen vezujućeg fragmenta), npr. IL-6 antitela ili njegovog fragmenta, kao što je ovde opisano. U otelotvorenjima, IL-6 antitelo ili njegov fragment (npr. njegov antigen vezujući fragment) se primenjuje u terapeutski efikasnoj količini. U otelotvorenjima, bolest povezana sa IL-6 je bolest oka koju karakteriše povišen nivo IL-6 u staklastom telu. U otelotvorenjima, bolest povezana sa IL-6 je dijabetički makularni edem (DME), dijabetička retinopatija, uveitis, sindrom suvog oka, bolest suvog oka, starosna makularna degeneracija (AMD), proliferativna dijabetička retinopatija (PDR), okluzija retinalne vene (RVO), optički neuromijelitis (NMO), transplantacija rožnjače, abrazija rožnjače ili fizička povreda oka.

[0127] U otelotvorenjima, antitelo ili njegov fragment (npr. njegov antigen vezujući fragment) je pogodan za isporuku u staklasto telo oka. U otelotvorenjima, antitelo ili njegov fragment (npr. antigen vezujući fragment) se isporučuje u staklasto telo oka ispitanika. U otelotvorenjima, bolest povezana sa IL-6 je dijabetički makularni edem i antitelo ili njegov fragment se isporučuje u staklasto telo oka ispitanika.

[0128] Ovde je takođe dat komplet koji sadrži IL-6 antitelo ili kompoziciju koji su ovde izloženi i opciono, uputstvo za upotrebu.

[0129] Ovde je takođe dato pakovanje ili sredstvo, npr. sredstvo za isporuku leka, koje sadrži IL-6 antitelo ili kompoziciju koji su ovde izloženi. U otelotvorenjima, navedeno sredstvo je konfigurisano za isporuku antitela ili kompozicije u oko, npr. u staklasto telo. Ovde je takođe dat komplet koji sadrži navedeno pakovanje ili sredstvo.

[0130] Kao što se ovde koristi, termin „antitelo“ je sinonim za imunoglobulin i treba ga razumeti kao opšte poznato u struci. Termin antitelo nije ograničen nijednim posebnim postupkom proizvodnje antitela. Na primer, termin antitelo obuhvata, između ostalog, rekombinantna antitela, monoklonska antitela i poliklonska antitela. Kao što se ovde koristi, antitelo je tetramer, i ako nije drugačije izloženo, svako se sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan laki lanac i jedan teški lanac. Amino terminalni kraj svakog lanca sadrži varijabilni region od oko 100 do 120 ili više aminokiselina koje igraju primarnu ulogu u prepoznavanju antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca sadrži konstantni region sa primarnom ulogom u efektorskoj funkciji antitela. Klase humanih lakih lanaca nazivaju se kapa i lambda laki lanci. Klase teških lanaca su mu, delta, gama, alfa ili epsilon i definišu izotip antitela. Izotipovi antitela su IgM, IgD, IgG, IgA, odnosno IgE. U okviru lakih i teških lanaca, varijabilnim i konstantnim regionima pridružuje se „J“ region od oko 12 ili više aminokiselina, pri čemu teški lanac takođe uključuje „D“ region od oko tri ili više aminokiselina.

[0131] Varijabilni regioni svakog para teških/lakih lanaca (VH i VL), respektivno, formiraju mesto vezivanja antigena. Shodno tome, netaknuto IgG antitelo, na primer, ima dva mesta vezivanja. Osim kod bifunkcionalnih ili bispecifičnih antitela, dva mesta vezivanja su ista.

[0132] Varijabilni regioni teških i lakih lanaca antitela pokazuju istu opštu strukturu relativno očuvanih regiona okvira (FR) kojima se pridružuju tri hipervarijabilna regiona, takođe nazvana regionima koji određuju komplementarnost ili CDR. Termin „varijabilni” se odnosi na činjenicu da se određeni delovi varijabilnih domena znatno razlikuju u sekvenci između antitela i uključeni su u vezivanje i specifičnost svakog pojedinačnog antitela za njegov specifični antigen. Varijabilnost leži pre svega u CDR regionima, koji su odvojeni visoko očuvanim regionima okvira (FR). Dodeljivanje aminokiselina svakom domenu vrši se u skladu sa definicijama u radu Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), ili Chothia i Lesk, J Mol Biol 196: 901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989), koji opisuju metode poznate u struci.

[0133] „Divlji tip“ se može odnositi na najzastupljeniji alel ili vrstu koja se nalaze u populaciji ili na antitelo dobijeno od nemanipulisane životinje, u poređenju sa alelom ili polimorfizmom, ili varijantom ili derivatom dobijenim oblikom manipulacije, kao što je mutageneza, upotreba rekombinantnih metoda i tako dalje za promenu aminokiseline molekula koji vezuje antigen.

[0134] Termin „fragment antitela“ se odnosi na deo netaknutog ili lanca pune dužine ili antitela, uglavnom ciljnog vezivanja ili varijabilnog regiona. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente. „Funkcionalni fragment“ ili „analog anti-IL-6 II antitela“ je fragment koji može sprečiti ili značajno smanjiti sposobnost IL-6 da se veže za receptor, smanjiti sposobnost kompleksa IL-6/IL-6R da se veže za gp130, ili smanjiti sposobnost liganda da se veže za gp130 ili da inicira signalizaciju. Kao što se ovde koristi, „antigen vezujući fragment“ ili „funkcionalni fragment“ je generalno sinonim za „fragment antitela“ i može se odnositi na fragmente, kao što su Fv, Fab, F(ab')2 i tako dalje, koji mogu sprečiti ili značajno smanjiti sposobnost IL-6 da se veže za receptor, smanjiti sposobnost kompleksa IL-6/IL-6R da se veže za gp130 ili da inicira signalizaciju.

[0135] „Derivat“ antitela je polipeptid koji uključuje najmanje jedan CDR antitela koje je ovde izloženo. Tipično, derivat se može vezati za mesto II IL-6.

[0136] „Takmičiti“ podrazumeva da se prvo antitelo, ili njegov fragment, može takmičiti za vezivanje sa drugim antitelom ili njegovim fragmentom, tako da je vezivanje prvog antitela sa njegovim epitopom detektabilno smanjeno u prisustvu drugog antitela u poređenju sa vezivanjem prvog antitela u odsustvu drugog antitela. U nekim slučajevima, termin se takođe može odnositi na vezivanje drugog antitela za njegov epitop koje je detektabilno smanjeno u prisustvu prvog antitela. Mehanizam takve kompeticije može biti putem, u neograničavajućim primerima, sterične prepreke, konformacione promene, vezivanja za zajednički epitop.

[0137] Termin „procenat identičnosti sekvence“ u kontekstu sekvenci nukleinskih kiselina podrazumeva ostatke u dve sekvence koje su iste kada su poravnate za maksimalnu korespondenciju. Dužina poređenja identičnosti sekvence može biti kod najmanje oko devet nukleotida, na primer, najmanje oko 18 nukleotida, najmanje oko 24 nukleotida, najmanje oko 28 nukleotida, najmanje oko 32 nukleotida, najmanje oko 36 nukleotida ili najmanje oko 48 ili više nukleotida. Algoritmi poznati u struci mogu se koristiti za merenje identičnosti nukleotidnih sekvenci. Na primer, polinukleotidne sekvence se mogu uporediti korišćenjem FASTA, Gap ili Bestfit (Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI). FASTA, uključuje, npr., programe FASTA2 i FASTA3, pruža poravnavanja i procenat identičnosti sekvenci regiona najboljeg preklapanja između sekvenci upita i pretrage (Pearson, Methods Enzymol 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol Biol 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol 266: 227-258 (1996); Pearson, J Mol Biol 276: 71-84 (1998)). Obično se koriste podrazumevani parametri za određeni program ili algoritam. Na primer, procenat identičnosti sekvence između sekvenci nukleinskih kiselina može se odrediti korišćenjem FASTA sa njenim podrazumevanim parametrima (veličina reči 6 i NOPAM faktor za matricu bodovanja) ili korišćenjem Gap-a sa njegovim podrazumevanim parametrima kao što je predviđeno u GCG verziji 6.1.

[0138] Termin „procenat identičnosti sekvence“ u kontekstu aminokiselinskih sekvenci podrazumeva ostatke u dve sekvence koje su iste kada su poravnate za maksimalnu korespondenciju. Dužina poređenja identičnosti sekvence može biti kod najmanje pet aminokiselinskih ostataka, na primer, najmanje oko 20 aminokiselinskih ostataka, najmanje oko 30 aminokiselinskih ostataka, najmanje oko 50 aminokiselinskih ostataka, najmanje oko 100 aminokiselinskih ostataka, najmanje oko 150 aminokiselinskih ostataka ili najmanje oko 200 ili više aminokiselinskih ostataka. Identičnost sekvence za polipeptide se obično meri korišćenjem softvera za analizu sekvence. Algoritmi za određivanje procenta identičnosti sekvence poznati su u struci. Na primer, aminokiselinske sekvence se mogu uporediti korišćenjem FASTA, Gap ili Bestfit (Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI). Softver za analizu proteina upoređuje sekvence koristeći merenja sličnosti dodeljena različitim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne supstitucije aminokiselina. Na primer, GCG sadrži programe kao što su „Gap“ i „Bestfit“, koji se mogu koristiti sa podrazumevanim parametrima koji su navedeni u programima za određivanje homologije sekvence ili identičnosti sekvence između blisko povezanih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog analoga. Videti, npr. GCG verziju 6.1 (University of Wisconsin, Madison, WI). Polipeptidne sekvence se takođe mogu uporediti pomoću FASTA koristeći podrazumevane ili preporučene parametre, videti GCG verziju 6.1. FASTA (npr. FASTA2 i FASTA3) pruža poravnavanja i procenat identičnosti sekvence regiona najboljeg preklapanja između sekvenci upita i pretrage (Pearson, Methods Enzymol 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol Biol 132: 185-219 (2000)). Drugi algoritam koji se može koristiti prilikom upoređivanja sekvence sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je računarski program BLAST, npr. blastp ili tblastn, koristeći podrazumevane parametre koji su isporučeni sa programima. Videti, npr. Altschul et al., J Mol Biol 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res 25:3389-402 (1997).

[0139] Protein ili polipeptid je „suštinski čist“, „suštinski homogen“ ili „suštinski prečišćen“ kada najmanje oko 60 do 75% uzorka pokazuje jednu vrstu polipeptida. Polipeptid ili protein mogu biti monomerni ili multimerni. Suštinski čist polipeptid ili protein može da sadrži oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ili 99% čistoće; na primer, suštinski čist polipeptid ili protein je 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ili 99% čist. Čistoća ili homogenost proteina može se proceniti na bilo koji odgovarajući način, kao što je poliakrilamid gel elektroforeza uzorka proteina, nakon čega sledi vizuelizacija jedne ili više traka povezanih sa proteinom ili polipeptidom (npr. nakon bojenja gela), HPLC sa isključivanjem veličine, HPLC sa katjonskom razmenom, redukovana kapilarna elektroforeza u SDS-u, mapiranje peptida ili mapiranje glikana. Veća rezolucija se može postići, na primer, korišćenjem metoda poznatih u struci ili drugim sredstvima prečišćavanja.

[0140] Termin „suštinska sličnost“ kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, podrazumeva da kada se optimalno poravna sa odgovarajućim nukleotidnim umetanjima ili brisanjima drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), identičnost nukleotidne sekvence postoji u najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, i najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, na primer, 85%, 90%, 95%, 96%, 98% ili 99% identičnosti sekvence mereno bilo kojim poznatim algoritmom identičnosti sekvence, kao što su FASTA, BLAST ili Gap.

[0141] Kao što se primenjuje na polipeptide, termin „suštinska identičnost“ ili „suštinska sličnost“ podrazumeva da dve aminokiselinske sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što su programi GAP ili BESTFIT koristeći podrazumevane gap težine koje su isporučene sa programima, dele najmanje oko 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence; npr.70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence. U određenim realzacijama, položaji ostataka koji nisu identični razlikuju se po konzervativnim supstitucijama aminokiselina.

[0142] „Terapeutski efikasna količina“ se odnosi na onu količinu terapeutskog sredstva koje se primenjuje i koje će ublažiti najmanje jedan znak ili simptom bolesti koja se leči ili pojačati ili poboljšati profilaktički i/ili terapeutski efekat(efekte) druge terapije (npr. drugog terapeutskog sredstva) korisnog za lečenje bolesti povezane sa IL-6. Podrazumeva se da se terapeutski efikasna količina može primeniti u više doza tokom ograničenog vremenskog perioda ili kao hronično lečenje.

[0143] „Lečiti“, „lečenje“ i „tretiranje“ se odnose na metodu ublažavanja jednog ili više znakova ili simptoma bolesti.

[0144] Kao što se ovde koristi, termin „bolest“ uključuje bolesti i poremećaje.

[0145] Dodatne karakteristike i prednosti predmetnog pronalaska konkretnije su opisane u nastavku.

[0146] Kratak opis slika

[0147] Sl. 1 predstavlja grafikon koji ilustruje rezultate eksperimenta u kojem je anti-IL-6 antitelo primenjeno IVT injekcijom na CNV modelu pacova. Anti-VEGF antitelo je primenjeno kao pozitivna kontrola, a negativna kontrola je bila samo vehikulum. p = 0,0054 15. dana i p = 0,000522. dana za kontrolu anti-IL-6 u odnosu na vehikulum.

[0148] Sl. 2 predstavlja grafikon koji ilustruje rezultate eksperimenta vezivanja kojim se ispituje sposobnost mišjeg 64 antitela da inhibira vezivanje IL-6/IL-6R za gp130.

[0149] Sl. 3 A predstavlja grafikon koji ilustruje eksperiment u kojem je 020 testiran na sposobnost blokiranja signalizacije IL-6 u odsustvu viška rastvorljivog IL-6Rα. Eksperimenti su vršeni na HEK-Blue-IL-6 ćelijama sa 0,2 ng/ml IL-6 i 2 µg/ml IL6Rα.

[0150] Sl. 3B predstavlja grafikon koji ilustruje eksperiment u kojem je 020 testiran na sposobnost blokiranja signalizacije IL-6 u prisustvu viška rastvorljivog IL-6Rα. Eksperimenti su vršeni na HEK-Blue-IL-6 ćelijama sa 0,2 ng/ml IL-6 i 2 µg/ml IL6Rα.

[0151] Sl. 4 predstavlja grafikon koji ilustruje rezultate eksperimenta u kojem je monoklonsko anti-IL-6 antitelo („IL-6 blokada“) primenjeno IVT injekcijom na CNV modelu miša. Kontrole nisu bile lečenje (kontralateralno oko), intravitrealna injekcija anti-VEGF antitela („VEGF blokada“) ili intravitrealna injekcija anti-HRP izotipskog kontrolnog antitela („kontrolno antitelo“).

[0152] Sl. 5 prikazuje vezivanje za IL-6, u odnosu na antitelo divljeg tipa (EBI-029), u antitelima koja imaju sledeće mutacije (1) I51T/S55G, (2) A28V/I51T/S55G, (3) S30P/I51T,/S55G i (4) A28V/S30P/I51T/S55G (takođe se naziva EBI-030).

[0153] Sl. 6 prikazuje frakcionu signalizaciju u HEK-Blue™ IL6 reporterskim ćelijama tretiranim sa IL-6 i jednim od sledećih Fab: (1) WT (EBI-029), (2) A28V/I51T/S55G, (3) S30P/I51T/S55G, (4) A28V/S30P/I51T/S55G (EBI-030).

[0154] Sl. 7 prikazuje luminiscenciju (meru IL-6 indukovane proliferacije) u T1165.85.2.1 ćelijama tretiranim IL-6 i jednim od sledećih Fab u prikazanoj koncentraciji: (1) WT (EBI-029), (2) A28V/I51T/S55G, (3) S30P/I51T/S55G, (4) A28V/S30P/I51T/S55G (EBI-030).

[0155] Sl. 8 prikazuje frakcionu signalizaciju u HEK-Blue™ IL6 reporterskim ćelijama tretiranim sa 20 pM IL-6 i različitim koncentracijama (1) EBI-029 IgG2 (EBI029) proizvedenih u HEK-6E ćelijama, (2) EBI-030 IgG2 (EBI030) proizvedenih u HEK-6E ćelijama i (3) EBI-030 IgG2-H311A (EBI030 H311A) proizvedenih u HEK-6E ćelijama; (4) tocilizumaba (TOCI) i (5) EBI-030 IgG2 proizvedenih u stabilnom CHO skupu (EBI-030 CHO).

[0156] Sl. 9 prikazuje farmakokinetički model opisan u primeru 20.

[0157] Sl. 10 prikazuje efekat povećanja potentnosti antitela na trajanje inhibicije IL-6 u oku, kao što je simulirano korišćenjem farmakokinetičkog modela opisanog u primeru 20.

[0158] Sl. 11 prikazuje koncentraciju leka EBI-029, EBI-029-H311A, EBI-030, EBI-030-H311A, Eylea® i tocilizumaba (TCZ) u staklastom telu tokom vremena nakon intravitrealne primene.

[0159] Sl. 12 prikazuje koncentraciju leka EBI-029, EBI-030, EBI-030-H311A, Eylea® i tocilizumaba (TCZ) u mrežnjači tokom vremena nakon intravitrealne primene.

[0160] Sl. 13 prikazuje koncentraciju leka EBI-029, EBI-030, EBI-030-H311A, Eylea® i tocilizumaba (TCZ) u očnoj vodici tokom vremena nakon intravitrealne primene.

[0161] Sl. 14 prikazuje koncentraciju leka EBI-029, EBI-030, EBI-030-H311A, Eylea® i tocilizumaba (TCZ) u horoidei tokom vremena nakon intravitrealne primene.

[0162] Sl. 15A prikazuje lokacije FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4, CH1, šarke, CH2 i CH3 u sekvencama teškog lanca EBI-029 (SEQ ID NO:11), EBI-030 (SEQ ID NO:41) i EBI-031 (EBI-031 se ovde takođe naziva EBI-030-H311A) (SEQ ID NO:47).

[0163] Sl. 15B prikazuje lokacije FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 i CK u sekvenci lakog lanca (EBI-029, EBI-030 i EBI-031 imaju istu sekvencu lakog lanca) (ID BR. SEKV:12).

[0164] Sl. 16A prikazuje frakcionu signalizaciju u HEK-Blue™ IL-6 reporterskim ćelijama tretiranim sa 20 pM IL-6 i različitim koncentracijama EBI-031 ili tocilizumaba.

[0165] Sl. 16B prikazuje frakcionu signalizaciju u HEK-Blue™ IL-6 reporterskim ćelijama tretiranim sa 200 pM hiper IL-6 i različitim koncentracijama EBI-031 ili tocilizumaba.

[0166] Sl. 17 prikazuje rezultate računskih simulacija opisanih u primeru 24.

[0167] Sl. 18 prikazuje šematski dijagram tri različite strukturne izoforme IgG2 antitela usled mešanja disulfidnih veza.

[0168] Sl. 19 prikazuje RP-HPLC hromatograme uzoraka EBI-031: netretirani (gornji panel), 5mM DTT (srednji panel), 10 mM cistein (donji panel).

[0169] Sl. 20 prikazuje RP-HPLC hromatograme uzoraka EBI-031 prikupljenih iz različitih EBI-031 ćelijskih linija: kultura skale od 200L klonske ćelijske linije (gornji panel), kultura skale od 10L iz matične ćelijske linije (srednji panel) i stabilno transfektovani skup ćelija (donji panel).

[0170] Sl. 21 prikazuje RP-HPLC hromatogram za EBI-031 prikupljenog iz kulture skale od 200L klonske ćelijske linije i označava i kvantifikuje koje izoforme su predstavljene svakim pikom na hromatogramu.

[0171] Sl. 22A predstavlja grafikon koji prikazuje farmakokinetičke podatke dobijene od afričkog zelenog majmuna (K797), kao što je opisano u primeru 26.

[0172] Sl. 22B predstavlja grafikon koji prikazuje farmakokinetičke podatke dobijene od afričkog zelenog majmuna (K679), kao što je opisano u primeru 26.

[0173] Sl. 23 predstavlja grafikon koji prikazuje farmakokinetičke podatke dobijene od oba afrička zelena majmuna (K797 ili K679) i krive uklapanja.

[0174] Sl. 24A prikazuje koncentraciju leka EBI-031 u staklastom humoru tokom vremena nakon intravitrealne primene.

[0175] Sl. 24B prikazuje koncentraciju leka EBI-031 u očnoj vodici tokom vremena nakon intravitrealne primene.

[0176] Sl. 24C prikazuje koncentraciju leka EBI-031 u horoidei tokom vremena nakon intravitrealne primene.

[0177] Sl. 24D prikazuje koncentraciju leka EBI-031 u konjunktivi tokom vremena nakon intravitrealne primene.

[0178] Sl. 24E prikazuje koncentraciju leka EBI-031 u rožnjači tokom vremena nakon intravitrealne primene.

[0179] Sl. 24F prikazuje koncentraciju leka EBI-031 u cilijarnom telu šarenice tokom vremena nakon intravitrealne primene.

[0180] Sl. 24G prikazuje koncentraciju leka EBI-031 u sočivu tokom vremena nakon intravitrealne primene.

[0181] Sl. 24H prikazuje koncentraciju leka EBI-031 u mrežnjači tokom vremena nakon intravitrealne primene.

[0182] Sl. 24I prikazuje koncentraciju leka EBI-031 u beonjači tokom vremena nakon intravitrealne primene.

[0183] Detaljan opis

[0184] IL-6 je impliciran kao faktor u brojnim bolestima kao što je reumatoidni artritis i prijavljeno je da je značajno povećan kod brojnih bolesti, uključujući bolesti oka. IL-6 može delovati i putem cis- i trans-mehanizama. U cis mehanizmu, veruje se da se slobodni IL-6 vezuje za membranski vezani IL-6 receptor (IL-6R se takođe naziva IL-6Rα i CD126), a kompleks IL-6/IL-6R zatim stupa u interakciju sa gp130 (takođe se naziva CD130, onkostatinski M receptor, IL-6Rbeta i IL-6 signalni pretvarač), kako bi aktivirao signalizaciju u ćeliji koja sadrži kompleks. U trans mehanizmu, slobodni IL-6 se vezuje za rastvorljivi IL-6 receptor (sIL-6R). Kompleks IL-6/sIL-6R se zatim može vezati za gp130 prisutan u ćelijskoj membrani. Ključna razlika između ovih mehanizama je u tome što više tipova ćelija eksprimira gp130 nego što eksprimira IL-6R, čija je ekspresija ograničenija. Stoga, kod bolesti za koje je poželjno inhibirati signalizaciju IL-6, na primer kod onih kod kojih je poželjno široko inhibirati signalizaciju IL-6, korisno je inhibirati i cis- i trans-IL-6 signalizaciju. Podnosioci prijave su konstruisali antagoniste IL-6, npr. anti-IL-6 antitela, fragmente i derivate koji mogu da inhibiraju i cis i trans signalizaciju putem IL-6. Pored toga, podnosioci prijave su konstruisali takve antagoniste IL-6 kako bi postigli brži sistemski klirens. Antagonisti IL-6, npr. IL-6 antitela i fragmenti ili njihovi derivati, opisani su u WO2014/074905. Predmetni pronalazak se odnosi na poboljšana IL-6 antitela i njihove primene.

[0185] Kao što se ovde koristi, termini u jednini, uključujući, ali se ne ograničavajući na „jedan“ ili „taj“, uključuju množinu, osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije.

[0186] Karakteristike antagonista IL-6 (IL-6a)

[0187] Generalno, ovde opisani antagonist IL-6 (IL-6a) se specifično vezuje za mesto II (mesto 2) IL-6 i koristan je za lečenje bolesti oka povezane sa IL-6 i određenih drugih bolesti. Bolest oka povezana sa IL-6 je ona kod koje je neželjeni simptom ili biološka aktivnost bolesti povezana sa ekspresijom ili prisustvom IL-6. U nekim otelotvorenjima IL-6a ima visok afinitet i za slobodni i za vezani IL-6, relativno je stabilan u organizmu, može inhibirati vezivanje za gp130 IL-6 vezanog za IL-6R (ovde nazvan kompleks IL-6/IL-6R ili IL-6/IL-6R) i može imati terapijski efekat. Generalno, IL-6a je antitelo ili je izveden iz antitela. Na primer, IL-6a je humanizovani Fab visokog afiniteta koji se može specifično vezati za mesto II IL-6 i potencijalno blokira i cis- i trans- IL-6 signalizaciju. U drugom primeru, IL-6a je antitelo pune dužine, npr. IgG1 ili IgG2 antitelo.

[0188] U nekim otelotvorenjima, Fab je takođe konfigurisan kao Fc-konstruisana sekvenca ili je u antitelima pune dužine. U nekim otelotvorenjima, Fc-konstruisan IL-6a (npr. Fckonstruisani Fab) ima brži sistemski klirens u poređenju sa odgovarajućom kontrolom, npr. u poređenju sa odgovarajućim antitelima, fragmentima ili njihovim derivatima koji nemaju konstruisani Fc. Ove i druge karakteristike IL-6a su dalje opisane u ovom dokumentu.

[0189] Podnosioci prijave su dizajnirali antagoniste IL-6 koji se selektivno vezuju za mesto II IL-6 kako bi obezbedili široku inhibiciju signalizacije IL-6, jer takvi molekuli mogu inhibirati vezivanje gpl30 za IL-6, bez obzira na to da li je IL-6 slobodan ili vezan za membranu IL-6R ili sIL-6R. Pored toga, ciljanje liganda (IL-6) za razliku od IL-6 receptora može izbeći klirens i toksičnost posredovanu receptorom zbog ADCC-a (ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela). Pošto IL-6 ima i patološku i zaštitnu ulogu u bolesti, upotreba antagonista IL-6 (IL-6a) za lečenje bolesti povezane sa povećanim IL-6 može poboljšati određene aspekte stanja, ali takođe može izazvati značajne neželjene efekte, npr. sistemske efekte. Ova dvojnost puteva IL-6 (tj. sposobnost da se imaju poželjni i/ili neželjeni efekti) može učiniti nepoželjnim lečenje poremećaja povezanog sa IL-6 nekim sistemskim inhibitorom. Shodno tome, ovde navedene kompozicije i metode mogu biti korisni za tretmane koji inhibiraju najmanje jednu aktivnost IL-6, ali nemaju nepotreban efekat na pozitivne aktivnosti IL-6, delimično zato što se kompozicije mogu formulisati za lokalnu isporuku, npr. za lokalnu isporuku u oko. Na primer, u određenim aspektima, IL-6a je dizajniran da bude veličine pogodne za isporuku na određeno mesto. U nekim otelotvorenjima, IL-6a je antitelo pune dužine. U nekim otelotvorenjima, IL-6a je izveden iz antitela i u formatu je koji može imati duže zadržavanje u staklastom telu oka i ograničeno sistemsko curenje. U nekim otelotvorenjima, IL-6a je modifikovano antitelo (npr. antitelo sa modifikovanim Fc domenom) koje ima duže zadržavanje u staklastom telu oka i/ili ograničeno sistemsko curenje u poređenju sa odgovarajućim nemodifikovanim antitelima. U nekim otelotvorenjima, IL-6a je IgG2 antitelo.

[0190] U nekim aspektima, IL-6a je relativno mali IL-6a kao što je fragment antitela ili drugi derivat antitela koji je manji od antitela pune dužine, npr. Fab koji je izveden iz IL-6 antitela. U nekim slučajevima, IL-6a je u formatu koji može preći sa jednog dela tkiva na drugi sa povećanom kinetikom u poređenju sa odgovarajućim IL-6 antitelima pune dužine. U nekim otelotvorenjima, IL-6a je Fab koji je projektovan da bude veći molekul, za koji je verovatnije da ima povećano zadržavanje na lokaciji na koju je isporučen u poređenju sa samim Fab, npr. IL-6a je dimerizovan preko Fc domena. U određenim otelotvorenjima, Fc domen je konstruisan tako da je Fc deo ablirao ili smanjio vezivanje za FcRn koje može smanjiti sistemsku akumulaciju u poređenju sa istim IL-6 entitetom vezivanja koji uključuje Fc divljeg tipa. Konstruisani Fc domen može biti, npr., IgG1 domen ili IgG2 domen.

[0191] Tipično, ovde opisani antagonisti IL-6 imaju dovoljno visok afinitet za svoj cilj, IL-6, da bi bili efikasni u ublažavanju najmanje jednog neželjenog efekta IL-6 i dovoljno su stabilni da budu korisni kao terapeutici.

[0192] Generalno, PK IL-6a, npr. IL-6a pogodan za upotrebu u oku ima dovoljno dug poluživot na mestu isporuke, npr. u staklastom telu, da bi se obezbedio terapeutski efekat. U neograničavajućim primerima, PK može biti poluživot od najmanje 8 dana, 10 dana, 14 dana, 21 dan, 28 dana ili 30 dana.

[0193] Identifikacija antagonista IL-6 koji se vezuju za mesto II

[0194] Generalno, bilo koja metoda poznata u struci može se koristiti za generisanje molekula koji se može vezati za IL-6, na primer, polipeptidne biblioteke ili molekularne biblioteke mogu se pregledati na kandidatna jedinjenja u testu sposobnosti polipeptida ili jedinjenja da se vežu za IL-6. Kada se identifikuje takvo kandidatsko jedinjenje, mesto vezivanja jedinjenja može se odrediti metodama poznatim u struci. Na primer, molekul se može testirati na sposobnost vezivanja za IL-6 divljeg tipa i vezivanje u poređenju sa sposobnošću jedinjenja da se veže za IL-6 mutiran na mestu I, mestu II ili mestu III. U otelotvorenjima, IL-6a kao što je ovde opisano zadržava sposobnost vezivanja za kompleks IL-6/IL-6Rα i za IL-6, i sprečava vezivanje IL-6/IL-6Rα za gp130. U otelotvorenjima, IL-6a kao što je ovde opisano može se takmičiti sa gp130 za vezivanje za kompleks IL-6/IL-6Rα, npr. vezivanjem za mesto II IL-6. Takve aktivnosti vezivanja mogu se analizirati metodama poznatim u struci.

[0195] Kandidati za IL-6a mogu se testirati, na primer, korišćenjem HEK-Blue™ IL-6 testnog sistema (InvivoGen, San Dijego). HEK-Blue™ IL-6 ćelije su HEK293 ćelije koje su stabilno transfektovane humanim IL-6R i STAT3-indukovanim SEAP reporterskim genom. U prisustvu IL-6, aktivira se STAT3 i luči se SEAP. SEAP se procenjuje korišćenjem, na primer, QUANTI-Blue™ (InvivoGen, San Dijego). Dodavanje antagonista IL-6 u ćelije sprečava sekreciju ili smanjuje nivo SEAP-a kao rezultat inhibicije i slobodnog i rastvorljivog IL-6 vezanog receptora.

[0196] K<D>se odnosi na konstantu ravnoteže afiniteta vezivanja određene interakcije antitela i antigena ili interakcije fragmenta i antigena antitela. U otelotvorenjima, ovde opisano antitelo ili antigen vezujući fragment vezuje se za antigen (npr. IL-6) sa K<D>koji je manji ili jednak 250 pM, npr. manji ili jednak 225 pM, 220 pM, 210 pM, 205 pM, 150 pM, 100 pM, 50 pM, 20 pM, 10 pM ili 1 pM. K<D>se može odrediti metodama poznatim u struci, na primer korišćenjem površinske plazmonske rezonance, na primer, korišćenjem BiaCore™ sistema.

[0197] K<off>se odnosi na konstantu brzine disocijacije određene interakcije antitela i antigena ili kompleksa fragmenta i antigena antitela. Konstanta brzine disocijacije se može odrediti korišćenjem površinske plazmonske rezonance, na primer korišćenjem BiaCore™ sistema. Relativno spor K<off>može doprineti poželjnim karakteristikama terapije, npr. omogućavajući ređu primenu inhibitora kod ispitanika kome je potrebno takvo lečenje.

[0198] Specifičnost

[0199] U nekim otelotvorenjima, ovde opisani IL-6a se specifično vezuje za cilj, npr. IL-6. Generalno, „specifično vezivanje“ kao što se ovde koristi ukazuje na to da se molekul preferencijalno vezuje za izabrani molekul i pokazuje mnogo manji afinitet vezivanja za jedan ili više drugih molekula. U otelotvorenjima, afinitet vezivanja za drugi molekul je 1, 2, 3 ili više redova veličine manji od afiniteta vezivanja za ciljni.

[0200] Kao što je razmotreno iznad, IL-6 može biti prisutan kao slobodni IL-6 i kao IL-6 vezan za rastvorljivi IL-6Rα. Podnosioci prijave su identifikovali mesto II IL-6 kao optimalni cilj za antagonist IL-6 u poređenju sa inhibitorom koji se vezuje za mesto I IL-6. Inhibitor mesta I može inhibirati vezivanje slobodnog IL-6 za IL-6Rα. Međutim, takav inhibitor ne može sprečiti aktivnost iniciranu već postojećim kompleksima IL-6/IL-6R, osim zamenom ograničenom k<off>kompleksa. Druga alternativa, inhibitor koji se vezuje za IL-6Rα, manje je pogodan jer može imati ograničenu sposobnost sprečavanja aktivnosti IL-6, osim ako nije prisutan u koncentracijama zasićenja. Pošto je količina IL-6 receptora generalno prilično visoka u poređenju sa količinom IL-6, ovaj pristup može zahtevati primenu nepoželjno velike količine kompozicije koja inhibira aktivnost IL-6 vezivanjem za receptor. U otelotvorenjima, antagonisti IL-6 opisani u ovom dokumentu (npr. antitela i fragmenti i njihovi derivati opisani u ovom dokumentu) mogu blokirati aktivnost IL-6 čak i kada je IL-6 vezan za IL-6R. Shodno tome, prednost IL-6a kao što je ovde opisano je da će možda biti potrebno primeniti relativno manje kompozicije da bi se postigao terapeutski efekat u poređenju sa inhibitorom koji cilja na receptor IL-6. Prijavljeno je da se antitela na receptore brzo uklanjaju klirensom posredovanim receptorima koji značajno ograničava njihovu farmakokinetiku, što zahteva veće doze, češće doziranje ili oboje. Pored toga, IL-6 antitela i na receptor i na mesto I predstavljaju problem u tome što značajno povećavaju koncentraciju IL-6 u tkivu narušavajući normalan put klirensa liganda posredovan receptorom, čime se ispitanik izlaže potencijalno nepoželjnim nivoima IL-6 u tkivu. Pored toga, upotreba inhibitora koji cilja IL-6Rα može zahtevati prisustvo inhibitora u blizini oba mesta na kojima se traži inhibicija i mesta na kojima to nije poželjno, npr. sistemsko lečenje. Upotreba IL-6a koji se vezuje za mesto II, mesto na koje se vezuje gpl30, omogućava inhibiciju putem slobodnog IL-6, kao i IL-6 koji je vezan za IL-6R, ali još uvek nije aktivirao put IL-6 putem gpl30. Shodno tome, bez želje da budu vezani teorijom, ovde opisani antagonisti IL-6 su dizajnirani da se vezuju za oba oblika IL-6 (rastvorljivi i vezani za receptore), konkretno antagonisti IL-6 se vezuju za mesto II IL-6, koje je dostupno u oba oblika. Kompozicije koje sadrže IL-6a kao što je ovde opisano mogu inhibirati i cis i trans signalizaciju putem IL-6.

[0201] U nekim slučajevima, ovde navedena jedinjenja i metode su dizajnirani da obezbede efikasnu blokadu IL-6 dovoljnu za lečenje najmanje jednog znaka ili simptoma poremećaja povezanog sa IL-6, na primer, inhibiciju angiogeneze i/ili upale.

[0202] Ovde opisana jedinjenja su korisna za lečenje bolesti oka koje karakteriše nepoželjno visok nivo IL-6, npr. u staklastom telu (videti Yuuki et al., J Diabetes Compl 15:257 (2001); Funatsu et al., Ophthalmology 110: 1690,(2003); Oh et al., Curr Eye Res 35:1116 (2010); Noma et al., Eye 22:42 (2008); Kawashima et al., Jpn J Ophthalmol 51:100 (2007); Kauffman et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 35:900 (1994); Miao et al., Molec Vis 18:574(2012)).

[0203] Generalno, IL-6a kao što je ovde opisano je snažan antagonist signalizacije IL-6. U nekim otelotvorenjima, IL-6a opisan u ovom dokumentu ima visok afinitet za IL-6, na primer, IC50 manji ili jednak 100 pM u HEK-Blue IL-6 testu koristeći 10 pM IL-6. Visoki afinitet IL-6a može se odrediti na osnovu K<D>IL-6a, na primer, K<D>manji ili jednak 1 nM, manji ili jednak 500 pM, manji ili jednak 400 pM, manji ili jednak 300 pM, manji ili jednak 240 pM, ili manji ili jednak 200 pM.

[0204] Za proizvodnju biološkog IL-6a (npr. proteina ili polipeptida kao što je antitelo, fragment ili njegov derivat) koji je koristan za lečenje poremećaja povezanog sa povećanom ekspresijom ili aktivnošću IL-6, obično je poželjno da biološki IL-6a ima visoku produktivnost. Na primer, odgovarajuća produktivnost je veća ili jednaka 1 g/L (npr. veća ili jednaka 2 g/L, veća ili jednaka 5 g/L, ili veća ili jednaka 10 g/L).

[0205] Da bi se antagonist IL-6 efikasno primenio, neophodno je da inhibitor ima rastvorljivost kompatibilnu sa koncentracijom u kojoj će biti primenjen. Na primer, u slučaju antitela pune dužine IL-6a, rastvorljivost je veća ili jednaka 20 mg/ml, veća ili jednaka 10 mg/ml, veća ili jednaka 5 mg/ml, ili veća ili jednaka 1 mg/ml.

[0206] Pored toga, da bi lečenje bilo održivo, inhibitor mora imati visoku stabilnost na telesnoj temperaturi mesta isporuke i aktivnosti, kao i stabilnost skladištenja. U otelotvorenjima, inhibitor ima T<m>veći ili jednak 60°C (npr. veći ili jednak 60°C, veći ili jednak 62,5°C, veći ili jednak 65°C, veći ili jednak 70°C, veći ili jednak 73°C, ili veći ili jednak 75°C). U otelotvorenjima, inhibitor ima T<onset>veći ili jednak 45°C, npr. veći ili jednak 50°C, veći ili jednak 51°C, veći ili jednak 55°C, ili veći ili jednak 60°C. Metode određivanja T<m>i T<onset>mogu se odrediti metodama poznatim u struci.

[0207] Antagonisti koji imaju željene karakteristike mogu se izabrati iz odgovarajućih tipova molekula poznatih u struci, na primer antitela, uključujući fragmente i derivate antitela ciljnog mesta II IL-6 koje generalno zadržava ili održava dovoljne karakteristike matičnog IL-6 antitela (npr. željena svojstva vezivanja). Takvi antagonisti uključuju F<ab>fragmente, scFvs, F<ab>fragmente projektovane da uključe Fc deo i antitela pune dužine projektovana da imaju okvir različit od matičnog antitela ciljnog mesta II IL-6.

[0208] U nekim aspektima, IL-6a koji je ovde izložen sadrži antigen-vezujuće mesto humanog antitela koje se može takmičiti ili unakrsno takmičiti sa antitelima ili njihovim fragmentima koji se mogu vezati za mesto II IL-6. Na primer, antitelo ili njegov fragment mogu da sadrže VH domen i VL domen koji su ovde izloženi, pri čemu VH i VL domeni sadrže skup CDR-ova antitela koje se vezuje za IL-6/mesto II koje je ovde izloženo.

[0209] Bilo koja pogodna metoda može se koristiti za određivanje domena i/ili epitopa vezanog za IL-6a, na primer, mutiranjem različitih mesta na IL-6. Ona mesta na kojima mutacije sprečavaju ili smanjuju vezivanje IL-6a i liganda IL-6 učestvuju ili direktno u vezivanju za IL-6a ili indirektno utiču na mesto vezivanja, npr. utičući na konformaciju IL-6. Druge metode se mogu koristiti za određivanje aminokiselina vezanih za IL-6a. Na primer, može se koristiti skeniranje vezivanja za peptide, kao što je enzimski imunološki test (ELISA) zasnovan na PEPSCAN-u. U skeniranju vezivanja za peptide ovog tipa, kratko preklapajući peptidi izvedeni iz antigena se sistematski pregledaju radi vezivanja za vezujući član. Peptidi se mogu kovalentno spojiti sa potpornom površinom da bi se formirao niz peptida. Peptidi mogu biti u linearnoj ili ograničenoj konformaciji. Ograničena konformacija se može proizvesti korišćenjem peptida koji imaju terminalni cisteinski (cys) ostatak na svakom kraju peptidne sekvence. Ostaci cys-a mogu se kovalentno spojiti direktno ili indirektno sa potpornom površinom tako da se peptid drži u konformaciji sa petljom. Shodno tome, peptid koji se koristi u metodi može imati cys ostatak dodat na svaki kraj peptidne sekvence koja odgovara fragmentu antigena. Mogu se koristiti i peptidi sa dvostrukom petljom, u kojima se cys ostatak dodatno nalazi na sredini ili blizu sredine peptidne sekvence. Cys ostaci se mogu kovalentno spojiti direktno ili indirektno na noseću površinu tako da peptidi formiraju konformaciju sa dvostrukom petljom, sa jednom petljom sa svake strane centralnog cys ostatka. Peptidi se mogu sintetički generisati, a cys ostaci se stoga mogu projektovati na željenim lokacijama, uprkos tome što se ne javljaju prirodno u sekvenci mesta II IL-6. Opciono, linearni i ograničeni peptidi se mogu pregledati u testu vezivanja za peptide. Skeniranje vezivanja za peptide može uključivati identifikaciju (npr. korišćenjem ELISA testa) skupa peptida na koje se vezujući član vezuje, pri čemu peptidi imaju aminokiselinske sekvence koje odgovaraju fragmentima IL-6a (npr. peptidi koji uključuju oko 5, 10 ili 15 neprekidnih ostataka IL-6a), i poravnavanje peptida kako bi se odredio otisak ostataka vezanih za vezujući član, pri čemu otisak sadrži ostatke zajedničke preklapajućim peptidima. Alternativno ili dodatno, metoda skeniranja vezivanja za peptide može se koristiti za identifikaciju peptida na koje se IL-6a vezuje sa najmanje izabranim odnosom signal:šum.

[0210] Druge metode poznate u struci mogu se koristiti za određivanje ostataka vezanih antitelima i/ili za potvrđivanje rezultata skeniranja vezivanja za peptide, uključujući, na primer, mutagenezu kontrolisanoj lokacijom (npr. kao što je ovde opisano), razmenu deuterijuma vodonika, masenu spektrometriju, NMR i kristalografiju rendgenskih zraka.

[0211] Tipično, IL-6a koristan kao što je ovde opisano je molekul humanog antitela, molekul humanizovanog antitela ili njegov vezujući fragment. Generalno, antitelo je monoklonsko antitelo. Poreklo takvog antitela može biti ljudsko, mišje, pacovsko, kamiljino, zečje, ovčje, svinjsko ili goveđe i može se generisati u skladu sa metodama poznatim onima u struci.

[0212] Generalno, IL-6a se sastoji najmanje od CDR-a antitela koje se može specifično vezati za IL-6 (npr. humani IL-6), npr. za mesto II IL-6. Struktura za nošenje CDR-a ili skupa CDR-a predmetnog pronalaska može biti sekvenca antitela teškog ili lakog lanca ili njihov značajan deo u kojem se CDR ili skup CDR-a nalazi na lokaciji koja odgovara CDR-u ili skupu CDR-a prirodno prisutnih varijabilnih domena VH i VL antitela kodiranih preuređenim genima imunoglobulina. Strukture i lokacije varijabilnih domena imunoglobulina mogu se odrediti pozivanjem na Kabat, et al., 1983 (National Institutes of Health), a njihova ažuriranja se mogu pronaći pod „Kabat“ pomoću bilo kog internet pretraživača.

[0213] IL-6a, kao što je ovde izloženo, je tipično antitelo koje se generalno sastoji od VH domena i/ili VL domena antitela. VH domen sadrži skup CDR-a teškog lanca (VHCDR), a VL domen sadrži skup CDR-a lakog lanca (VLCDR). Primeri takvih CDR-a dati su ovde u odeljku Primeri. Molekul antitela može da sadrži VH domen antitela koji sadrži VHCDR1, VHCDR2 i VHCDR3 i okvir. Alternativno ili takođe može da sadrži VL domen antitela koji sadrži VLCDR1, VLCDR2 i VLCDR3 i okvir.

[0214] Ovde su izloženi IL-6 antagonisti koji sadrže VHCDR1 i/ili VHCDR2 i/ili VHCDR3 poput onih koji su ovde izloženi i/ili VLCDR1 i/ili VLCDR2 i/ili VLCDR3 poput onih koji su ovde izloženi. IL-6a može da sadrži jedan ili više CDR-a bilo kog antitela, fragmenta ili derivata opisanih u ovom dokumentu. IL-6a može da sadrži skup VHCDR-a (npr. VHCDR1, VHCDR2 i VHCDR3), a opciono može da sadrži i skup VLCDR-a (npr. VLCDR1, VLCDR2 i VLCDR3). CDR mogu biti izvedeni iz jednog ili više antitela, fragmenata ili derivata opisanih u ovom dokumentu. Na primer, VLCDR mogu biti izvedeni iz istog ili drugog antitela kao VHCDR.

[0215] Generalno, VH domen je uparen sa VL domenom kako bi se obezbedilo antigenvezujuće mesto antitela. Na primer, HC domen SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:3 je uparen sa LC domenom SEQ ID NO:2. U otelotvorenjima, molekul antitela, njegov fragment ili derivat sadrži VHCDR1, VHCDR2 i VHCDR3 SEQ ID NO:37. U otelotvorenjima, molekul antitela, njegov fragment ili derivat sadrži VHCDR1, VHCDR2 i VHCDR3 koji se kolektivno razlikuju od VHCDR1, VHCDR2 i VHCDR3 SEQ ID NO:37 za ne više od 1, ne više od 2, ne više od 3 aminokiseline.

[0216] Molekul antitela, njegov fragment ili derivat može da sadrži VL domen SEQ ID NO:38, ili (ii) skup VLCDR (npr. VLCDR1, VLCDR2 i VLCDR3) iz VL domena. U otelotvorenjima, molekul antitela, njegov fragment ili derivat sadrži VLCDR1, VLCDR2 i VLCDR3 SEQ ID NO:38. Algoritmi koji se mogu koristiti za izračunavanje procenta identičnosti dve aminokiselinske sekvence uključuju npr. BLAST, FASTA ili Smith-Waterman algoritam, npr. primenom podrazumevanih parametara.

[0217] IL-6a kao što je ovde opisano može da sadrži konstantne regione antitela ili njihove delove, npr. konstantne regione humanog antitela ili njihove delove. Na primer, VL domen može biti vezan na svom C-terminalnom kraju za konstantne domene lakog lanca antitela, uključujući humane CK ili CL lance. Slično tome, IL-6a zasnovan na VH domenu može biti vezan na svom C-terminalnom kraju za ceo ili deo (npr. domen CH1) teškog lanca imunoglobulina izvedenog iz bilo kog izotipa antitela, npr. IgG, IgA, IgE i IgM i bilo koju od podklasa izotipa, posebno IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment je konstruisan da smanji ili eliminiše ADCC aktivnost.

[0218] U nekim otelotvorenjima, antitelo predmetnog pronalaska je IgG2 antitelo. U otelotvorenju, antitelo predmetnog pronalaska sadrži IgG2 okvir, IgG2 konstantni region ili IgG2 Fc region kao što je ovde opisano.

[0219] IgG2 antitela mogu postojati kao tri glavne strukturne izoforme: IgG2-A, IgG2-B i IgG2-A/B (Wypych J. et al. Journal of Biological Chemistry. 2008, 283:16194-16205). Ova strukturna heterogenost je posledica različitih konfiguracija disulfidnih veza koje povezuju Fab krakove sa regionom šarki teškog lanca. U izoformi IgG2-A nema disulfidnih veza koje povezuju Fab krakove sa regionom šarke. U izoformi IgG2-B, oba Fab kraka imaju disulfidne veze koje povezuju teški i laki lanac sa regionom šarke. Izoforma IgG2-A/B je hibrid između izoformi IgG2-A i IgG2-B, sa samo jednim Fab krakom koji ima disulfidne veze koje povezuju teški i laki lanac jednog Fab kraka sa regionom šarke. Konverzija IgG2 antitela između dve ili svih različitih strukturnih izoformi, takođe se naziva i disulfidno mešanje, javlja se prirodno in vivo i in vitro i za prirodna i za rekombinantna antitela. Kao rezultat toga, formulacije IgG2 antitela u struci obuhvataju heterogenu mešavinu izoformi IgG2-A, IgG2-B i IgG2-A/B. Različite izoforme IgG2 mogu imati jedinstvena i različita funkcionalna svojstva, kao što su razlike u stabilnosti, agregaciji, viskoznosti, vezivanju za Fc receptor ili potentnosti. Prisustvo više izoformi ili povećanih nivoa određene izoforme u formulaciji IgG2 antitela može negativno uticati na stabilnost, agregaciju ili potentnost.

[0220] Predmetni pronalazak daje antitelo sa prednošću primarnog postojanja u izoformi IgG2-A ili IgG2-A/B. Antitelo predmetnog pronalaska ne postoji u izoformi IgG2-B, ili ne postoji u izoformi IgG2-B tokom značajnog vremenskog perioda. Dakle, kompozicije i formulacije koje sadrže antitelo predmetnog pronalaska su manje heterogeni od drugih IgG2 antitela poznatih u struci, i stoga su poželjniji za upotrebu u terapijskoj primeni.

[0221] Kompozicije koje sadrže antitela predmetnog pronalaska sadrže prvenstveno izoforme IgG2-A i/ili IgG2-A/B antitela. U otelotvorenju, kompozicija koja sadrži ovde opisano antitelo sadrži najmanje 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99% izoformi IgG2-A ili IgG2-A/B antitela. U otelotvorenju, kompozicija koja sadrži ovde opisano antitelo sadrži najmanje 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99% izoformi IgG2-A ili IgG2-A/B zajedno. U takvim otelotvorenjima, kompozicija koja sadrži ovde opisano antitelo ne sadrži značajnu količinu izoformi IgG2-B antitela. Na primer, kompozicija sadrži manje od 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% ili 0,1% izoformi IgG2-B antitela.

[0222] U nekim slučajevima, antitelo predmetnog pronalaska se dalje modifikuje metodama poznatim u struci, stvara sekvencu koja ima specifičan alotip, na primer alotip koji dominira u populaciji koja ima određeno geografsko poreklo. U nekim slučajevima, konstantni region humanog teškog lanca se modifikuje u tu svrhu.

[0223] IL-6a može biti molekul antitela, njegov vezujući fragment ili varijanta koja ima jedan ili više CDR-a, na primer, skup CDR-a, u okviru antitela. Na primer, jedan ili više CDR-a ili skup CDR-a antitela (npr. antitelo ili njegov fragment ili derivat kao što je ovde opisano) mogu se presaditi u okvir (npr. humani okvir) kako bi se obezbedio molekul antitela. Regioni okvira mogu biti izvedeni iz sekvenci gena humane germinativne linije, ili biti bez germinativne linije po poreklu.

[0224] Ostaci VH i/ili VL okvira mogu se modifikovati kao što je ovde razmotreno i prikazano, npr. korišćenjem mutageneze kontrolisane lokacijom.

[0225] Promene aminokiselina mogu se izvršiti u jednom ili više regiona okvira i/ili jednom ili više CDR-a izvedenih iz antitela IL-6a usmerenog na mesto II IL-6 (ovde nazvano „referentno IL-6 antitelo“) korišćenjem metoda i parametara poznatih u struci. Ovde je takođe uključen rezultujući antagonist IL-6 koji zadržava vezivanje za mesto II IL-6 (npr. mesto II humanog IL-6) i obično ima najmanje isto vezivanje ili povećan afinitet u poređenju sa referentnim IL-6 antitelom. U nekim slučajevima, da bi se poboljšao parametar kao što je stabilnost, može se uvesti promena koja rezultira smanjenjem afiniteta vezivanja izvedenog IL-6a u poređenju sa referentnim IL-6a (npr. referentno antitelo) kako bi se stvorio koristan IL-6a. U nekim otelotvorenjima, npr. u nekim slučajevima u kojima se referenca odnosi na vezivanje za FcRn ili farmakokinetički (PK) parametar kao što je poluživot u staklastom telu ili sistemskom poluživotu (npr. u krvi, plazmi, serumu, limfi, jetri, bubregu, drugom tkivu ili telesnoj tečnosti), referentno antitelo može biti antitelo koje se ne vezuje specifično za IL-6.

[0226] Promena aminokiselinske sekvence polipeptida IL-6a može uključivati zamenu jednog ili više aminokiselinskih ostataka neprirodno prisutnom ili nestandardnom aminokiselinom, modifikaciju jednog ili više aminokiselinskih ostataka u neprirodni ili nestandardni oblik, ili umetanje jedne ili više neprirodno prisutnih ili nestandardnih aminokiselina u sekvencu. Primeri brojeva i lokacija izmena u sekvencama predmetnog pronalaska opisani su na drugom mestu u ovom dokumentu. Prirodno prisutne aminokiseline uključuju 20 „standardnih“ L-aminokiselina identifikovanih kao G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E svojim standardnim jednoslovnim kodovima. Nestandardne aminokiseline uključuju bilo koji drugi ostatak koji može biti ugrađen u polipeptidnu osnovu ili biti rezultat modifikacije postojećeg aminokiselinskog ostatka. Nestandardne aminokiseline mogu biti prirodne ili neprirodne. U struci je poznato nekoliko prirodno prisutnih nestandardnih aminokiselina, kao što su 4-hidroksiprolin, 5-hidroksilizin, 3-metilhistidin i N-acetilserin. Oni aminokiselinski ostaci koji su derivatizovani na svom N-alfa položaju biće locirani samo na N-terminalnom kraju aminokiselinske sekvence. Aminokiselina je tipično L-aminokiselina. U nekim slučajevima aminokiselina je D-aminokiselina. Stoga, izmena može da sadrži modifikaciju L-aminokiseline u D-aminokiselinu, ili njenu zamenu D-aminokiselinom. Metilirani, acetilirani i/ili fosforilirani oblici aminokiselina su takođe poznati, pri čemu aminokiseline u predmetnom pronalasku mogu biti podložne takvoj modifikaciji.

[0227] Aminokiselinske sekvence u domenima antitela i vezujućim članovima predmetnog pronalaska mogu da sadrže neprirodne ili nestandardne aminokiseline kao što je ovde razmotreno. Nestandardne aminokiseline (npr. D-aminokiseline) mogu se inkorporirati u aminokiselinsku sekvencu korišćenjem metoda poznatih u struci, na primer u sintezi molekula ili modifikacijom nakon sinteze ili zamenom aminokiseline. U nekim slučajevima, Daminokiselina se koristi za povećanje farmakokinetike IL-6a.

[0228] Novi VH ili VL regioni koji nose sekvence predmetnog pronalaska izvedene iz CDR-a mogu se generisati korišćenjem slučajne mutageneze jedne ili više izabranih sekvenci VH i/ili VL nukleinskih kiselina za generisanje mutacija unutar celog varijabilnog domena. Na primer, može se koristiti PCR sklon greškama (Chao et al., Nature Protocols, 1:755-768 (2006)). U nekim otelotvorenjima, jedna ili dve aminokiselinske supstitucije se vrše unutar celog varijabilnog domena ili skupa CDR-a. Druge metode poznate u struci mogu se koristiti za generisanje mutacija, na primer mutageneza kontrolisana lokacijom, obično u jednom ili više CDR-a.

[0229] Jedna od metoda proizvodnje antitela IL-6a je promena VH domena kao što je ovde izloženo dodavanjem, brisanjem, zamenom ili umetanjem jedne ili više aminokiselina. Izmenjeni VH domen se može kombinovati sa VL domenom (npr. VL domen koji je ovde izložen), koji se takođe može izmeniti kao što je ovde opisano i korišćenjem metoda poznatih u struci. Takvi izmenjeni molekuli se testiraju na njihovu sposobnost vezivanja za mesto II IL-6 i opciono na druga željena svojstva kao što je povećani afinitet u poređenju sa referentnim molekulom. U nekim slučajevima, varijanta VH ili VL domena može imati 1, 2, 3, 4 ili 5 takvih izmena (npr.1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih supstitucija).

[0230] U otelotvorenjima, IL-6a predmetnog pronalaska je fragment antitela koji se vezuje za mesto II IL-6 i obuhvata antigen-vezujuće mesto, npr. može se vezati za mesto II IL-6. Fragmenti antitela predmetnog pronalaska se generalno dobijaju počev od referentnog (matičnog) molekula antitela, kao što je molekul antitela koji sadrži SEQ ID NO:41 i SEQ ID NO:42. Fragmenti antitela mogu se generisati metodama poznatim u struci kao što su rekombinantna DNK, enzimsko cepanje (na primer, korišćenjem pepsina ili papaina), hemijsko cepanje antitela (na primer, hemijska redukcija disulfidnih mostova). Fragmenti antitela koji sadrže antigen-vezujuće mesto antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na molekule kao što su Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd i disulfidno stabilizovani varijabilni region (dsFv). Mogu se napraviti različiti drugi molekuli antitela, uključujući jedno ili više antigen-vezujuća mesta antitela, uključujući na primer F(ab’)2, F(ab)3, dijatela, trijatela, tetratela i minitela. Primeri molekula antitela i metode za njihovu konstrukciju i upotrebu opisani su u Holliger and Hudson, 2005, Nat Biotechnol 23:1126-1136. Neograničavajući primeri vezujućih fragmenata su Fab fragment sastavljen od VL, VH, konstantnog domena lakog lanca (CL) i konstantnog domena teškog lanca 1 (CH1); Fd fragment sastavljen od VH i CH1 domena; Fv fragment sastavljen od VL i VH domena jednog antitela; dAb fragment sastavljen od VH ili VL domena; izolovani CDR regioni; F(ab')2 fragment, bivalentni fragment koji se sastoji od dva povezana Fab fragmenta; jednolančani Fv molekul (scFv), u kojem su VH domen i VL domen povezani peptidnim linkerom koji omogućava da se dva domena povežu i formiraju antigen-vezujuće mesto; bispecifični jednolančani Fv dimer (na primer kao što je izloženo u WO 1993/011161) i dijatelo, koje je viševalentni ili multispecifični fragment konstruisan korišćenjem fuzije gena (na primer kao što je izloženo u WO94/13804). Molekuli Fv, scFv ili dijatela mogu se stabilizovati ugradnjom disulfidnih mostova koji povezuju domene VH i VL. Minitela koja se sastoje od scFv spojenih sa CH3 domenom takođe se mogu koristiti kao IL-6a. Ostali fragmenti i derivati antitela koji se mogu koristiti kao IL-6a uključuju Fab', koji se razlikuje od Fab fragmenta dodavanjem nekoliko aminokiselinskih ostataka na karboksilnom kraju CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz regiona šarke antitela, i Fab'-SH, koji je Fab' fragment u kojem cisteinski ostatak(ostaci) konstantnih domena nose slobodnu tiolnu grupu.

[0231] U nekim slučajevima, IL-6a koji je fragment antitela je hemijski modifikovan da bi se poboljšalo ili uvelo poželjno svojstvo, na primer PEGilacija da bi se povećao poluživot ili inkorporacija.

[0232] dAb (domensko antitelo) je mali monomerni antigen-vezujući fragment antitela (varijabilni region teškog ili lakog lanca antitela). VH dAb se prirodno javljaju kod kamelida (npr. kamile i lame) i mogu se proizvesti imunizacijom kamelida ciljnim antigenom, izolacijom B ćelija specifičnih za antigen i direktnim kloniranjem dAb gena iz pojedinačnih B ćelija. IL-6a predmetnog pronalaska može biti dAb koji se sastoji od VH ili VL domena suštinski kao što je ovde navedeno, ili VH ili VL domena koji se sastoji od skupa CDR-a suštinski kao što je ovde navedeno.

[0233] Antitela predmetnog pronalaska uključuju bispecifična antitela u kojima su dva različita varijabilna regiona kombinovana u istom molekulu. Il-6a se može ugraditi kao deo bispecifičnog antitela pripremljenog metodama poznatim u struci, na primer, pripremljenog hemijski ili iz hibridnih hibrida. Takav molekul može biti fragment bispecifičnog antitela gore razmotrenog tipa. Jedan neograničavajući primer metode za generisanje bispecifičnog antitela je BiTE™ tehnologija u kojoj se mogu koristiti domeni vezivanja dva antitela različite specifičnosti i direktno povezati putem kratkih fleksibilnih peptida. Ovo kombinuje dva antitela na kratkom jednom polipeptidnom lancu. Dijatela i scFv se mogu konstruisati bez Fc regiona, koristeći samo varijabilne domene, potencijalno smanjujući efekte antiidiotipske reakcije. Bispecifična antitela mogu biti konstruisana kao ceo IgG, kao bispecifični Fab'2, kao Fab' PEG, kao dijatela ili kao bispecifični scFv. Dalje, dva bispecifična antitela se mogu povezati korišćenjem rutinskih metoda poznatih u struci za formiranje četvorovalentnih antitela.

[0234] Bispecifična diatela, za razliku od bispecifičnih celih antitela, su korisna, delom zato što se mogu konstruisati i eksprimirati u E. coli. Dijatela (i mnogi drugi polipeptidi, kao što su fragmenti antitela) odgovarajućih specifičnosti vezivanja mogu se lako izabrati pomoću prikaza faga (WO 1994/13804) iz biblioteka. Ako jedna ruka dijatela treba da bude konstantna, na primer, sa specifičnošću usmerenom protiv mesta II IL-6, onda se može napraviti biblioteka gde je drugi krak raznovrstan i izabrano antitelo odgovarajuće specifičnosti.

[0235] Bispecifična cela antitela mogu se napraviti alternativnim metodama konstruisanja kao što je opisano u WO 1996/27011, WO 1998/50431 i WO 2006/028936.

[0236] U nekim slučajevima, IL-6a predmetnog pronalaska sadrži antigen-vezujuće mesto unutar molekula koji nije antitelo, na primer, ugradnjom jednog ili više CDR-a, npr. skupa CDR-a, u proteinsku skelu koja nije antitelo, kao što je dalje razmotreno u nastavku. U nekim slučajevima, CDR-i su ugrađeni u skele koje nisu antitela. Mesto vezivanja mesta II IL-6 može se obezbediti rasporedom CDR-a na proteinskim skelama koje nisu antitela, kao što su fibronektin ili citohrom B, ili randomizovanjem ili mutiranjem aminokiselinskih ostataka petlje unutar proteinske skele kako bi se dala specifičnost vezivanja za mesto II IL-6. Skele za konstruisanje novih mesta vezivanja u proteinima su poznate u struci. Na primer, proteinske skele za imitacije antitela izložene su u WO200034784, koji opisuje proteine (imitacije antitela) koji uključuju domen fibronektina tipa III koji ima najmanje jednu randomizovanu petlju. Odgovarajuću skelu u koju se ugrađuje jedan ili više CDR-a, npr. skup HCDR-a, može obezbediti bilo koji član domena superporodice gena imunoglobulina. Skela može biti humani ili nehumani protein. Prednost proteinske skele koja nije antitelo je u tome što može da obezbedi antigen-vezujuće mesto u molekulu skele koji je manji i/ili lakši za proizvodnju od barem nekih molekula antitela. Mala veličina vezujućeg elementa može dati korisna fiziološka svojstva, kao što je sposobnost ulaska u ćelije, prodiranja duboko u tkiva ili dostizanja ciljeva unutar drugih struktura, ili vezivanja unutar proteinskih šupljina ciljnog antigena. Tipični su proteini koji imaju stabilnu osnovu i jednu ili više promenljivih petlji, u kojima je aminokiselinska sekvenca petlje ili petlji specifično ili nasumično mutirana da bi se stvorilo antigen-vezujuće mesto koje vezuje ciljni antigen. Takvi proteini uključuju IgG-vezujuće domene proteina A iz S. aureus, transferin, tetranektin, fibronektin (npr. koristeći 10. domen fibronektina tipa III), lipokaline, kao i gama-kristalne i druge Affilin™ skele (Scil Proteins, Halle, Nemačka). Primeri drugih pristupa uključuju sintetička mikrotela zasnovana na ciklotidima -- male proteine koji imaju intramolekularne disulfidne veze, mikroproteine (npr. Versabodies™, Amunix Inc., Mountain View, CA) i proteine koji ponavljaju ankirin (DARPins, npr., od Molecular Partners AG, Zurich-Schlieren, Švajcarska). Takvi proteini takođe uključuju male, konstruisane proteinske domene kao što su, na primer, imuno-domeni (videti na primer, U.S. Patent Publication br. 2003/082630 i 2003/157561). Imuno-domeni sadrže najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) antitela.

[0237] IL-6a može da sadrži dodatne aminokiseline, npr. da bi preneo molekulu drugu funkcionalnu karakteristiku pored sposobnosti vezivanja antigena.

[0238] U nekim slučajevima, IL-6a nosi detektabilnu oznaku ili je konjugovan sa toksinom ili ciljnim delom ili enzimom (npr. preko peptidilne veze ili linkera). Na primer, IL-6a može da sadrži katalitičko mesto (npr. u enzimskom domenu), kao i antigen-vezujuće mesto (npr. mesto vezivanja za mesto II IL-6), tako da se antigen-vezujuće mesto vezuje za antigen i na taj način cilja katalitičko mesto na IL-6 ili kompleks IL-6/IL-6R. Katalitičko mesto može, u nekim slučajevima, dodatno inhibirati biološku funkciju IL-6, npr. cepanjem IL-6, IL-6R ili drugog molekula koji je povezan sa kompleksom IL-6a/IL-6.

[0239] U nekim aspektima, predmetni pronalazak uključuje antitelo IL-6a koje je modifikovano u poređenju sa referentnim antitelom kako bi se promenila, na primer, povećala, smanjila ili eliminisala funkcija biološkog dejstva IL-6a. U jednom primeru, Fc region je modifikovan ili je matični Fc domen zamenjen modifikovanim Fc domenom kako bi se promenila farmakokinetika modifikovanog IL-6a u poređenju sa nemodifikovanim matičnim. U nekim otelotvorenjima, IL-6a je konstruisan da ima IgG2 okvir. U drugim otelotvorenjima, IL-6a je u okviru IgG1 ili IgG2 i ima modifikovani Fc koji povećava afinitet vezivanja IL-6a na pH 6,0 i ne menja značajno afinitet vezivanja na pH 7,0 u poređenju sa matičnim ili drugim referentnim IL-6a. U otelotvorenjima, Fc domen je modifikovan i IL-6a ima smanjenu sistemsku akumulaciju, smanjen poluživot i/ili povećan sistemski klirens u poređenju sa matičnim ili drugim referentnim IL-6a.

[0240] U nekim otelotvorenjima, antitelo IL-6a je modifikovano da poveća fiksaciju komplementa i citotoksičnost zavisnu od komplementa. U drugim aspektima, antitelo IL-6a je modifikovano tako da povećava sposobnost antitela u poređenju sa referentnim antitelom da aktivira efektorske ćelije i učestvuje u citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC). U nekim slučajevima, antitela kako su ovde izložena mogu se modifikovati kako bi se poboljšala njihova sposobnost aktiviranja efektorskih ćelija i učestvovanja u citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i kako bi se poboljšala njihova sposobnost fiksiranja komplementa i učestvovanja u citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC).

[0241] U nekim otelotvorenjima, ovde izložena antitela su modifikovana kako bi se smanjila njihova sposobnost da fiksiraju komplement i učestvuju u citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC). U drugim otelotvorenjima, antitela su modifikovana kako bi se smanjila njihova sposobnost da aktiviraju efektorske ćelije i učestvuju u citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC). U još drugim otelotvorenjima, antitelo kao što je ovde izloženo može se modifikovati kako bi se smanjila njegova sposobnost da aktivira efektorske ćelije i učestvuje u citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i kako bi se smanjila njegova sposobnost da fiksira komplement i učestvuje u citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC).

[0242] Generalno je korisno izbegavati čestu isporuku doze IL-6a, na primer, kada se isporučuje injekcijom u oko. Da bi se olakšala ova karakteristika, u određenim otelotvorenjima, poluživot na mestu isporuke, npr. staklasto telo, IL-6a kao što je ovde izloženo iznosi najmanje 4 dana, na primer, najmanje 7 dana, najmanje 9 dana, najmanje 11 dana ili najmanje 14 dana. U određenim otelotvorenjima, srednji poluživot IL-6a je najmanje 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, 14 dana, 15 dana, 16 dana, 17 dana, 18 dana, 19 dana, 20 dana, 25 dana, 30 dana, 40 dana, 50 dana ili 60 dana. Metode povećanja vremena poluživota antitela poznate su u struci, na primer kao što je opisano u U.S. Pat. br.6.277.375 i međunarodnim publikacijama br. WO 1998/23289 i WO 1997/3461. U nekim otelotvorenjima, poluživot IL-6a je veći na ciljnom mestu isporuke, npr. staklastom telu, nego sistemski poluživot, npr. poluživot u krvi, serumu, plazmi, limfi, jetri, bubregu ili drugom tkivu ili telesnoj tečnosti).

[0243] U drugoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje proizvod,uključujući pakovanje. Pakovanje uključuje kompoziciju koja sadrži IL-6a kao što je ovde izloženo, i uputstvo za upotrebu ili etiketu koja ukazuje na to da se kompozicija može koristiti za lečenje poremećaja povezanog sa IL-6. Tipično, kompozicija je IL-6a u kompoziciji koja sadrži farmaceutski prihvatljivu pomoćnu supstancu.

[0244] U nekim slučajevima, predmetni pronalazak je komplet koji se sastoji od kompozicije koja sadrži IL-6a kao što je ovde izloženo, i uputstva za primenu kompozicije na ispitaniku kome je potrebno lečenje.

[0245] U otelotvorenjima u kojima je veliki IL-6a poželjan, npr. za poboljšanje zadržavanja IL-6a na mestu isporuke ili u njegovoj blizini, deo koji povećava veličinu, ali ne utiče značajno negativno na funkciju IL-6a (npr. afinitet vezivanja IL-6 za IL-6 ili kompleks IL-6/IL-6R) može biti povezan sa Il-6a. Na primer, Fab može biti genetski modifikovan da bi se eksprimirao kao pojedinačni polipeptidi koji sadrže Fab i Fc deo.

[0246] U otelotvorenjima u kojima je poželjna relativno mala veličina IL-6a, mogu se koristiti fragmenti IL-6 antitela, na primer, scFv ili Fab fragment. IgG antitelo je veličine oko 150 kD, Fab oko 50 kD, a scFv oko 25 kD. U nekim otelotvorenjima , IL-6a kao što je ovde opisano je veličine manje od oko 50 kD. Takav antagonist može biti, na primer, manji ili jednak 50kD i veći od 10 kD, manji ili jednak 50 kD i veći od 20 kD, ili manji ili jednak 50 kD i veći ili jednak 25 kD.

[0247] U nekim slučajevima, stabilnost IL-6 antagonista, npr. antitela ili drugog inhibitora koji ima disulfide, poboljšava se stvaranjem varijante u kojoj je jedan ili više disulfidnih mostova stabilniji nego u matičnom molekulu.

[0248] Još jedna prednost određenih IL-6a molekula opisanih u ovom dokumentu može biti dostupnost efektivnih molekula koji imaju veličinu pogodnu za njihov način isporuke, mesto isporuke ili način aktivnosti. Na primer, IL-6a u Fab formatu može se koristiti za lokalnu primenu. Metode konstruisanja takvih molekula su opisane ovde i poznate u struci.

[0249] Indikacije/bolest povezana sa IL-6

[0250] Bolesti koje se mogu lečiti sa IL-6a predmetnog pronalaska uključuju one bolesti kod kojih je povišeni IL-6 povezan sa stanjem bolesti ili kao preduslov za stanje bolesti. Takve bolesti uključuju one kod kojih angiogeneza i upala podstaknuti IL-6 doprinose patologiji bolesti. Ovo uključuje bolesti kod kojih je IL-6 povišen u poređenju sa normalnim nivoima, npr. bolesti kod kojih je IL-6 povišen u staklastom telu (kao što su npr. dijabetički makularni edem, dijabetička retinopatija i uveitis) ili tkivima oka. Primeri uključuju određene bolesti oka, uključujući, bez ograničenja, suvo oko (npr. bolest suvog oka ili sindrom suvog oka), alergijski konjunktivitis, uveitis, starosnu makularnu degeneraciju (AMD), proliferativnu dijabetičku retinopatiju (PDR), dijabetički makularni edem (DME), regmatogeno odvajanje mrežnjače (RRD), okluziju retinalne vene (RVO), optički neuromijelitis (NMO). Drugi poremećaji oka koji se mogu lečiti uključuju one uzrokovane traumom kao što je transplantacija rožnjače, abrazija rožnjače ili druga takva fizička povreda oka. Shodno tome, predmetni pronalazak uključuje lečenje isoitanika koji ima bolest povezanu sa IL-6 sa IL-6a opisanom u ovom dokumentu.

[0251] U nekim otelotvorenjima, bolest povezana sa IL-6 je inflamatorna bolest. U nekim otelotvorenjima, bolest ili glaukom.

[0252] U nekim otelotvorenjima, bolest je bol u oku.

[0253] U nekim otelotvorenjima, lečenje ispitanika takođe uključuje utvrđivanje da li ispitanik ima bolest povezanu sa IL-6, i opciono, da li je ispitanik otporan na druge tretmane koji ne inhibiraju IL-6, kao što su steroidi ili anti-VEGF terapeutici.

[0254] Jedan problem sa određenim terapeuticima na bazi antitela koji su efikasni na određenom lokusu kao što je oko, na primer u staklastom telu, su neželjena dejstva koja su rezultat sistemske primene. Jedno rešenje je da se obezbede terapeutici koji se mogu isporučiti lokalno, za razliku od sistemskog kao što je prikazano molekulima opisanim u ovom dokumentu. Pošto će se neki terapeutici koji se lokalno isporučuju, npr. u staklasto telo, u određenoj meri pojaviti sistemski, korisno je dizajnirati molekul koji će imati relativno brzu sistemsku izmenu. Podnosioci prijave imaju projektovane primere IL-6 antitela dizajniranih za brzu sistemsku izmenu, npr. u poređenju sa matičnim molekulom ili referentnim antitelom. To je postignuto mutiranjem Fc domena da bi se modifikovalo vezivanje molekula za FcRn, npr. da bi se smanjilo recikliranje IL-6a posredovano FcRn-om.

[0255] Dijabetički makularni edem (DME). Dijabetički makularni edem (DME) uključuje okluziju i curenje krvnih sudova mrežnjače, uzrokujući smanjenu oštrinu vida i potencijalno slepilo. Standardni tretmani za DME uključuju lokalnu primenu steroida ili anti-VEGF antitela. Međutim, mnogi pacijenti su refraktorni na ove terapije. Patogeneza dijabetičkog makularnog edema uključuje komponente angiogeneze, upale i oksidativnog stresa. IL-6 je indukovan hipoksijom i hiperglikemijom i može povećati vaskularnu upalu, vaskularnu propusnost i patološku angiogenezu. IL-6 može direktno indukovati ekspresiju VEGF-a i može promovisati horoidalnu neovaskularizaciju u životinjskim modelima. Kod pacijenata sa DME, nivoi IL-6 u oku su u pozitivnoj korelaciji sa debljinom makule i težinom bolesti. Nivoi IL-6 su, kako se izveštava, povišeni kod pacijenata kod kojih nije uspela anti-VEGF terapija, dok se kod pacijenata koji reaguju na anti-VEGF smanjuju. Shodno tome, primena IL-6a kao što je ovde opisano je korisna za lečenje dijabetičara u kombinaciji sa anti-VEGF terapijom ili kao alternativa anti-VEGF terapiji, uključujući pacijente koji ne reaguju na anti-VEGF terapiju. Lečenje makularnog edema sa IL-6a takođe može poboljšati bezbednost uklanjanjem potrebe za potpunim inhibiranjem bilo kog mehanizma za inhibiciju patologije, čime se čuvaju neke od željenih, fizioloških uloga svakog citokina. Shodno tome, lokalno lečenje sa IL-6a u kombinaciji sa VEGF inhibicijom može smanjiti učestalost doziranja i smanjiti neželjena dejstva lečenja.

[0256] Kod DME-a postoje pozitivne korelacije između nivoa IL-6 u staklastom telu i težine bolesti i VEGF refraktornih ispitanika. Shodno tome, IL-6a kao što je ovde opisano može se koristiti za lečenje ispitanika sa DME koji su refraktivni na steroidnu terapiju, anti-VEGF terapiju ili oboje. U nekim slučajevima, IL-6a se koristi u kombinaciji sa anti-VEGF terapijom ili steroidnom terapijom, npr. za lečenje DME.

[0257] Ovde opisani IL-6a se takođe može koristiti za lečenje poremećaja kao što su rak, npr. rak prostate, leukemija, multipli mijelom, inflamatorne (kao što su hronične inflamatorne proliferativne bolesti) i autoimune bolesti, npr. reumatoidni artritis, Kastlemanova bolest (hiperplazija gigantskih ili angiofolikularnih limfnih čvorova, limfni hamartom, angiofolikularna hiperplazija limfnih čvorova), juvenilni idiopatski artritis (uključujući poliartikularni juvenilni idiopatski artritis i sistemski juvenilni idiopatski artritis), Stillova bolest (koja obuhvata juvenilni idiopatski artritis i pojavu Stillove bolesti kod odraslih), Stillova bolest, amiloidna A amiloidoza, polimijalgija reumatika, remiting seronegativni simetrični sinovitis sa jamskim edemom, spondiloartritidi, Behčetova bolest (uključujući lečenje očnih manifestacija), ateroskleroza, psorijaza, sistemski eritemski lupus, polimiozitis (inflamatorna miopatija), recidivirajući polihondritis, stečena hemofilija A, multipla skleroza, anemija usled upale i Kronova bolest.

[0258] Antagonisti IL-6 su takođe korisni za lečenje određenih neuroloških bolesti, na primer depresije i Alchajmerove bolesti.

[0259] Druge bolesti koje se mogu lečiti ovde opisanim IL-6a uključuju, bez ograničenja, sistemsku sklerozu, Takayasu arteritis, arteritis gigantskih ćelija, bolest kalema protiv domaćina i periodični sindrom povezan sa TNF-receptorom (TRAPS).

[0260] Doziranje

[0261] IL-6 antitelo ili njegov fragment može se dati ispitaniku (npr. pacijentu) kod koga se eksprimiraju, npr. abnormalno visoki nivoi IL-6. Antitelo ili njegov fragment se može primeniti jednom, ili se može primeniti više puta. Antitelo se može primenjivati, na primer, od tri puta dnevno do jednom svakih šest meseci ili duže. Primena može biti po rasporedu kao tri puta dnevno, dva puta dnevno, jednom dnevno, jednom u dva dana, jednom u tri dana, jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom mesečno, jednom u dva meseca, jednom u tri meseca i jednom u šest meseci. Antitelo ili njegov fragment se može primenjivati kontinuirano putem mini pumpe ili drugim putem kao što je implantaciona kapsula sa sporim oslobađanjem ili putem inkapsulirane ćelije koja proizvodi antitelo ili njegov fragment. Antitelo ili njegov fragment se može primeniti mukoznim, bukalnim, intranazalnim, inhalacionim, intravenskim, subkutanim, intramuskularnim, parenteralnim, intraokularnim ili intratumorskim putem. Antitelo ili njegov fragment se može primeniti jednom, najmanje dva puta ili najmanje tokom vremenskog perioda dok se stanje ne leči, ublaži ili izleči. Antitelo ili njegov fragment će se generalno primenjivati sve dok je stanje prisutno. Antitelo ili njegov fragment će se generalno primenjivati kao deo farmaceutske kompozicije kao što je ovde opisano. Doza antitela će generalno biti u opsegu od 0,1 do 100 mg/kg, 0,5 do 50 mg/kg, 1 do 20 mg/kg i 1 do 10 mg/kg. Koncentracija antitela ili njegovog fragmenta u serumu može se izmeriti bilo kojom odgovarajućom metodom. Jedna od karakteristika određenih jedinjenja opisanih u ovom dokumentu je da zahtevaju relativno retko doziranje, na primer, jednom nedeljno, dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, jednom u četiri nedelje, jednom u dve nedelje, jednom u 8 nedelja, jednom u 12 nedelja, jednom u 16 nedelja, jednom u 32 nedelje, jednom mesečno, jednom u dva meseca, jednom u tri meseca ili jednom u šest meseci. U nekim slučajevima jedinjenje se primenjuje po potrebi, određeno, na primer, stanjem ispitanika. Karakteristika ovde opisanih antagonista IL-6 koja omogućava relativno retko doziranje je kombinacija visoke potentnosti koja se postiže, barem delimično, sporom stopom oslobađanja nakon vezivanja za IL-6 i sposobnošću da se isporuči relativno visoka koncentracija jedinjenja.

[0262] U nekim slučajevima, IL-6a se primenjuje kao monoterapija. U drugim otelotvorenjima, IL-6a se primenjuje istovremeno sa metotreksatom ili drugim antiartrotičnim lekom koji modifikuje bolest.

[0263] Generisanje antitela

[0264] Antitelo IL-6a ili njegov derivat ili fragment mogu se proizvesti metodama poznatim u struci kao što je metodologija monoklonskih antitela (npr. videti Koler i Milštajn (1975) Nature 256: 495). Mogu se koristiti i druge tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela, kao što je virusna ili onkogena transformacija B limfocita.

[0265] Himerna ili humanizovana antitela mogu se pripremiti na osnovu sekvence mišjeg monoklonskog antitela pripremljenog metodama poznatim u struci. DNK koja kodira imunoglobuline teškog i lakog lanca može se dobiti iz mišjeg hibrida od interesa i konstruisana da sadrži nemišje (npr. humane) sekvence imunoglobulina koristeći standardne tehnike molekularne biologije. Na primer, da bi se stvorilo himerno antitelo, mišji varijabilni regioni mogu se povezati sa humanim konstantnim regionima korišćenjem metoda poznatih u struci (videti npr. U.S. Pat. br. 4.816.567). Da bi se stvorilo humanizovano antitelo, mišji CDR regioni mogu se ubaciti u humani okvir koristeći metode poznate u struci (videti npr. U.S. Pat. br. 5.225.539 i U.S. Pat.5,530,101; 5,585,089; 5,693,762; i 6,180,370).

[0266] U otelotvorenjima, ovde opisani IL-6a (npr. anti-IL-6 antitelo ili derivat ili njegov fragment) može specifično da veže humani IL-6. U otelotvorenjima, IL-6a se može specifično vezati za mesto II IL-6 (npr. mesto II humanog IL-6).

[0267] U nekim otelotvorenjima, antitelo IL-6a je monoklonsko antitelo. Takva antitela se mogu generisati pomoću transgenih ili transhromozomskih miševa koji se sastoje od delova ljudskog imunog sistema, a ne mišjeg sistema. Ovi transgeni i transhromozomski miševi uključuju „humane Ig miševe“ kao što su HuMAb Mouse® i KM Mouse® (videti, npr. US Pat. br. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; i 5.770.429; U.S. Pat. br. 5.545.807; PCT publikacije br.: WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 i WO 99/45962; i PCT publikacija br. WO 01/14424).

[0268] U drugom aspektu, humana anti-IL-6 antitela mogu se podići pomoću miša koji nosi sekvence humanog imunoglobulina na transgenima i transhomozomima, kao što je miš koji nosi transgen humanog teškog lanca i transhromozom humanog lakog lanca. Takvi miševi su detaljno opisani u PCT publikaciji br. WO 02/43478.

[0269] Drugi transgeni životinjski sistemi koji eksprimiraju gene humanog imunoglobulina dostupni su u struci i mogu se koristiti za podizanje antitela IL-6a. Na primer, može se koristiti alternativni transgeni sistem koji se naziva Xenomouse<TM>(Abgenix, Inc.); takvi miševi su opisani u, na primer, U.S. Pat. br. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584; i 6.162.963. Nadalje, transhromozomski životinjski sistemi koji eksprimiraju gene humanog imunoglobulina dostupni su u struci i mogu se koristiti za podizanje antitela IL-6a. Na primer, miševi koji nose i humani transhromozom teškog lanca i humani transhromozom lakog lanca opisani su u Tomizuka et al. (2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:722-727). Humana monoklonska antitela se takođe mogu pripremiti pomoću SCID miševa u koje su humane imunološke ćelije rekonstituisane tako da se odgovor humanog antitela može generisati nakon imunizacije. Takvi miševi su, na primer, opisani u U.S. Pat. br.5,476,996 i 5,698,767.

[0270] Biblioteke prikaza faga

[0271] U nekim slučajevima, antitelo IL-6a ili njegov derivat ili fragment se proizvodi metodom koja uključuje sintezu biblioteke humanih antitela korišćenjem faga, skrining biblioteke sa IL-6, npr. humanim IL-6, ili njegovim fragmentom, izolaciju faga koji se vezuje za IL-6 i dobijanje antitela iz faga.

[0272] Rekombinantno humano antitelo IL-6a se takođe može izolovati skriningom biblioteke rekombinantnih kombinatornih antitela. Generalno, biblioteka je scFv biblioteka za prikaz faga, generisana korišćenjem humanih VL i VH cDNK pripremljenih iz mRNK izolovanih iz B ćelija. Metode pripreme i skrininga takvih biblioteka poznate su u struci. Kompleti za generisanje biblioteka za prikaz faga su komercijalno dostupni (npr. Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, kataloški br.27-9400-01; i Stratagene SurfZAP<TM>komplet za prikaz faga, kataloški br. 240612). Druge metode i reagensi koji se mogu koristiti u generisanju i skriningu biblioteka za prikaz antitela su poznati u struci (videti, npr. US Pat. br. 5.223.409; PCT publikacije br. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum Antibod Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J Mol Biol 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc Acid Res 19:4133-4137 (1991); i Barbas et al., Proc Natl Acad Sci USA 88:7978-7982 (1991).

[0273] U primeru za izolaciju i proizvodnju humanih IL-6 antitela sa željenim karakteristikama, humano IL-6 antitelo se prvo koristi za odabir humanih sekvenci teškog i lakog lanca koje imaju sličnu aktivnost vezivanja prema IL-6, koristeći metode otiskivanja epitopa opisane u PCT publikaciji br. WO 93/06213. Biblioteke antitela koje se koriste u ovoj metodi su uglavnom scFv biblioteke pripremljene i pregledane kao što je opisano u PCT publikaciji br. WO 92/01047; McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); i Griffiths et al., EMBO J 12:725-734 (1993),

[0274] Kada se izaberu početni humani VL i VH domeni, vrše se eksperimenti „kombinovanja“, u kojima se različiti parovi inicijalno izabranih VL i VH segmenata pregledaju na vezivanje za IL-6 radi odabira željenih kombinacija VL/VH parova. Da bi se izabrale poželjne karakteristike IL-6a, VL i/ili VH segmenti izabranog para mogu biti nasumično mutirani. Ovo in vitro sazrevanje afiniteta može se postići, na primer, pojačavanjem VH i VL domena korišćenjem PCR prajmera komplementarnih CDR-u jednog ili oba izabrana VH i VL domena, pri čemu prajmeri sadrže slučajnu smešu četiri nukleotidne baze na određenim pozicijama tako da rezultujući PCR proizvodi kodiraju VH i VL segmente u koje su uvedene slučajne mutacije u VH i/ili VL. Takvi nasumično mutirani VH i VL segmenti mogu se ponovo pregledati na vezivanje za IL-6, npr. za mesto II IL-6.

[0275] Nakon skrininga i izolacije antitela IL-6a iz biblioteke za prikaz rekombinantnog imunoglobulina, nukleinske kiseline koje kodiraju izabrano antitelo mogu se oporaviti iz paketa za prikaz (npr. iz genoma faga) i subklonirati u druge vektore ekspresije koristeći tehnike rekombinantne DNK poznate u struci. Takvim antitelima se može dalje manipulisati da bi se proizveo fragment antitela kao što je ovde opisano.

[0276] Farmakokinetika (PK)

[0277] Testiranje na PK može se izvršiti korišćenjem ovde opisanih metoda i/ili metoda poznatih u struci. Jedna od prepreka za određivanja koja zahtevaju korišćenje životinje, na primer određivanje PK, je ta da humani IL-6 ima manje od 50% homologije sa nekim životinjama koje se obično koriste za takvo testiranje. Jedna od metoda testiranja PK je stoga korišćenje transgenog miša koji eksprimira humani IL-6. U nekim otelotvorenjima, neljudski primat se koristi za određivanje PK.

[0278] U nekim otelotvorenjima, anti-IL6 antitelo je mutirano kako bi se promenila njegova farmakokinetika, npr. promenom pH osetljivosti vezivanja za FcRn. Metoda dobijanja takvih mutacija opisana je u odeljku Primeri. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, IL-6a ima izmenjenu sistemsku PK u poređenju sa matičnim IL-6a ili referentnim molekulom. U nekim slučajevima PK se ne menja ili se poboljšava u staklastom telu. U nekim otelotvorenjima, IL-6a ima smanjenu sistemsku farmakokinetiku (npr. smanjen poluživot i/ili povećan klirens, npr. kao što se ispituje u cirkulatornoj tečnosti kao što je krv, plazma, limfa ili serum) u poređenju sa matičnim IL-6a ili referentnim molekulom.

[0279] Modeli za testiranje antagonista IL-6

[0280] Antagonisti IL-6 mogu se testirati na modelima bolesti za isporuku IL-6, posebno u pogledu efikasnosti lečenja i ograničenih štetnih efekata na povoljna svojstva IL-6. Na primer, uveitis se može testirati na eksperimentalnom modelu autoimunog uveitisa kod pacova ili miševa (Caspi, Invest Ophthalmol Vis Sci 52:1873; Agarwal et al., 900: 443-69, 2012) korišćenjem interfotoreceptorskog retinoidno-vezujućeg proteina (IRBP) u kompletnoj imunizaciji Freundovim adjuvansom (CFA). Ostali modeli uključuju one poznate u struci za uveitis izazvan dendritičkim ćelijama, usvojni prenos kultivisanih efektorskih T ćelija, spontanu EAU kod IRBP TCR Tg miševa, uveitis izazvan endotoksinom, autoimuni uveoretinitis (Haruta et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 53:3264 (2011); Yoshimura et al., Rheumatology 48:347–354 (2009)).

[0281] Drugi modeli sistema koji se mogu koristiti za ispitivanje efekata IL-6a u lečenju bolesti povezane sa IL-6 su, na primer, model horoidalne neovaskularizacije (CNV) (Izumi-Nagai et al., Am J Pathol 170:6 (2007); Krzystolik et al., Arch Ophthalmol 120:338 (2002)) i dijabetičkih modela kao što su oni opisani u Kern et al. (Animal Models Of Diabetic Complications Consortium (P01 DK57733), Update Report (septembar 2001 – januar 2004)). Životinjski modeli korisni za testiranje IL-6a kod reumatoidnog artritisa poznati su u struci, npr. videti Asquith et al. (Eur J Immunol 39:2040-4 (2009)) i Kollias et al. (Ann Rheum Dis 70:1357-62 (2011).

[0282] CNV modeli su reprezentativni, npr. za humana stanja AMD-a i DME-a. Modeli neovaskularizacije mrežnjače su korisni, npr. za proučavanje ishemijskih retinopatija, npr. dijabetičke retinopatije ili retinopatije nedonoščadi. U struci su poznati različiti modeli horoidalne i retinalne neovaskularizacije (videti, npr. Grossniklaus, H.E. et al. Prog Retin Eye Res. 2010 Nov;29(6):500-19. doi: 10.1016/j.preteyeres.2010.05.003. Epub 2010 May 19; Saisin, Y et al. (2003) Journal of Cellular Physiology, 195:241-248; Takahashi, K. et al. (2003) Investigative Ophthalmology & Visual Science, 44(1): 409-415; Lima e Silva, R. et al. (2007) FASEB Journal, 21: 3219-3230; Tobe et al. (1998) American Journal of Pathology, 153(5): 1641-1646; Dong, A et al. (2011) PNAS, 108(35): 14614-14619; Dong et al. (2009) J Cell Physiol 219: 544-552; Smith, LE et al. 1994 Invest Ophthalmol Vis Sci 1994; 35:101-111; Shen, J. et al. (2007) Investigative Ophthalmology & Visual Science, 48(9): 4335-4341) i može se koristiti za istraživanje efikasnosti IL-6a. Horoidalna neovaskularizacija (CNV) može biti indukovana, npr. laserima, svetlom, operacijom ili genetskim modifikacijama. Modeli neovaskularizacije mrežnjače izazvane kiseonikom poznati su u struci i opisani su, npr. u Smith, LE et al. 1994 Invest Ophthalmol Vis Sci 1994; 35:101-111; Shen, J. et al. (2007) Investigative Ophthalmology & Visual Science, 48(9):4335-4341.

[0283] Takođe se može koristiti model ishemije/reperfuzije. Videti, npr. Zheng, L et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science, tom 48 br.1 str.361-367, 2007. Na primer, 1. dana, igla veličine 30G pričvršćena za kesu za tečnost se ubacuje u rožnjaču anesteziranih miševa i intraokularni pritisak (IOP) se povećava na približno 120 mmHg da bi se generisala ishemija. Nakon 30-90 minuta igla se vadi, IOP se normalizuje, dolazi do povrata cirkulacije mrežnjače. Ekspresija inflamatornih markera, uključujući TNF-α i ICAM-1, može se proceniti tehnikom Vestern blot i qPCR 2.-6. dana. Pored toga, gubitak ganglijskih ćelija može se proceniti histologijom 3.-14. dana, a kapilarna degeneracija se meri tehnikom digestije tripsina 10.-14. dana. Za terapijska ispitivanja, ispitni proizvod (npr.1 µL odgovarajuće koncentracije, npr. 20 mg/ml IL6a) se ubrizgava intravitrealno ili neposredno pre ili posle indukcije ishemije.

[0284] Kombinovane terapije

[0285] U nekim otelotvorenjima, IL-6a se primenjuje u kombinaciji sa drugim terapeutskim entitetom. Na primer, IL-6a se primenjuje u režimu lečenja koji uključuje VEGF inhibitor kao što je npr. ranibizumab. U nekim otelotvorenjima, IL-6a se primenjuje u režimu lečenja koji uključuje PDGF inhibitor kao što je npr. anti-PDGF antitelo ili anti-PDGF receptorsko antitelo (npr. imatinib). U nekim otelotvorenjima, IL-6a se primenjuje u kombinaciji sa inhibitorom puta komplementa, npr. lampalizumabom (inhibitorom faktora D) ili inhibitorom C5.

[0286] Isporuka antagonista IL-6

[0287] Ovde opisani antagonist ili kompozicija IL-6 može se isporučiti lokalno, bilo u direktnom kontaktu sa ćelijom ili tkivom koje je usmereno na inhibiciju IL-6 ili u njihovoj blizini. Neograničavajući primeri takvih metoda isporuke uključuju injektovanje, infuziju ili implantaciju supstance koja sadrži antagonist IL-6.

[0288] U otelotvorenjima, IL-6a ili kompozicija se primenjuju intraokularno, npr. intravitrealno, npr. putem intravitrealne injekcije, oftalmološkog umetka ili genetske isporuke.

[0289] U nekim otelotvorenjima, kompozicija IL-6a se primenjuje kao oftalmološka formulacija. Metode mogu uključivati primenu kompozicije IL-6a i oftalmološki prihvatljivog nosača. U nekim otelotvorenjima, oftalmološka formulacija je tečna, polučvrsta, umetnuta, filmska, mikročestica ili nanočestica. Kompozicija IL-6a se može primeniti, npr. topikalno ili injekcijom (npr. intravitrealnom injekcijom).

[0290] U nekim otelotvorenjima, kompozicija IL-6a je formulisana za intravensku primenu. U nekim otelotvorenjima, kompozicija IL-6a je formulisana za lokalnu primenu, npr. u oko. Topikalna formulacija može biti tečna formulacija ili polučvrsta, na primer, topikalna formulacija može uključivati vodeni rastvor, vodenu suspenziju, mast ili gel. Oftalmološka formulacija IL-6a može se topikalno naneti na prednji deo oka, ispod gornjeg kapka, na donji kapak i u slepoočnicu. Tipično, oftalmološka formulacija je sterilna. Oftalmološka formulacija IL-6a može da sadrži jednu ili više farmaceutskih pomoćnih supstanci pogodnih za pripremu oftalmoloških formulacija. Primeri takvih pomoćnih supstanci su konzervansi, puferski agensi, helatni agensi, antioksidansi i soli za regulaciju osmotskog pritiska. Oftalmološke formulacije, uključujući i masti i suspenzije, obično imaju viskoznost koja je pogodna za izabrani put primene. U nekim otelotvorenjima, oftalmološka formulacija ima viskoznost od oko 1.000 do oko 30.000 centipoaza.

[0291] U nekim otelotvorenjima, formulacija je tečna formulacija koja se sastoji od polimera. Takav polimer se može koristiti za poboljšanje bioraspoloživosti, podizanje viskoznosti ili smanjenje drenaže tečne formulacije iz oka. Pogodni polimeri uključuju, ali se ne ograničavaju na one opisane u Wagh et al. (Asian J Pharm, 2:12-17, 2008). U neograničavajućim primerima, polimer je natrijum hijaluronaza, hitozan, ciklodekstrin (npr. hidroksipropil-β-ciklodekstrin), poligalakturonska kiselina, ksiloglukan, ksantan guma, gelan guma, tiomer, poli(orto ester) (npr. Einmahl, ADV Drug Deliv Rev 53:45 -73, 2001), ili polisaharid semena tamarinda (npr. Ghelardi et al., Antimicrob Agents Chemother 48:3396-3401, 2004).

[0292] U nekim otelotvorenjima, formulacija koja se sastoji od kompozicije IL-6a za oftalmološku isporuku može da sadrži jedan ili više surfaktanata, adjuvanata, pufera, antioksidanata, regulatora toničnosti, konzervansa (npr. EDTA, BAK (benzalkonijum hlorid), natrijum hlorit, natrijum perborat, polikvaterijum-1), zgušnjivača ili modifikatora viskoznosti (npr. karboksimetil celuloze, hidroksimetil celuloze, polivinil alkohola, polietilen glikola, glikol 400, propilen glikol hidroksimetil celuloze, hidrokspropil-guar, hijaluronska kiselina i hidroksipropil celuloze) i slično. Aditivi u formulaciji mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na natrijum hlorid, natrijum bikarbonat, sorbinsku kiselinu, metil paraben, propil paraben, hlorheksidin, ricinusovo ulje i natrijum perborat.

[0293] U nekim otelotvorenjima, u kompoziciji se koristi prečišćena ili dejonizovana voda. PH se može podesiti dodavanjem bilo kojih fiziološki i oftalmološki prihvatljivih pH kiselina, baza ili pufera u opsegu od oko 5,0 do 8,5, npr. pH 7,0, pH 7,3, pH, 7,4 ili pH 7,5. Oftalmološki prihvatljivi primeri kiselina uključuju sirćetnu, bornu, limunsku, mlečnu, fosfornu, hlorovodoničnu i slično, a primeri baza uključuju natrijum hidroksid, natrijum fosfat, natrijum borat, natrijum citrat, natrijum acetat, natrijum laktat, trometamin, trihidroksimetilaminometan i slično. Primeri soli i pufera koji se mogu koristiti u formulaciji uključuju citrat/dekstrozu, natrijum bikarbonat, amonijum hlorid i smeše gore navedenih kiselina i baza.

[0294] U nekim otelotvorenjima, osmotski pritisak oftalmološke kompozicije može biti od oko 10 miliosmola (mOsM) do oko 400 mOsM, na primer, 200 do 400 mOsM, ili 220 do 370 mOsM. Generalno, osmotski pritisak se može podesiti pomoću fiziološki i oftalmološki prihvatljivih soli ili pomoćnih supstanci. U nekim otelotvorenjima, natrijum hlorid je uključen u formulaciju, na primer, natrijum hlorid je prisutan u formulaciji u koncentraciji u opsegu od 0,01% do 1% težinski, ili od 0,05% do 0,45% težinski, na osnovu ukupne težine kompozicije. Ekvivalentne količine jedne ili više soli sastavljenih od katjona kao što su kalijum, amonijum i slično i anjona kao što su hlorid, citrat, askorbat, borat, fosfat, bikarbonat, sulfat, tiosulfat, bisulfat, natrijum bisulfat, amonijum sulfat i slično se takođe mogu koristiti pored ili umesto natrijum hlorida za postizanje osmolalnosti unutar željenog opsega. U nekim otelotvorenjima, šećer kao što su manitol, dekstroza, sorbitol, glukoza i slično se takođe koristi za podešavanje osmolalnosti.

[0295] U nekim otelotvorenjima, metode uključuju formiranje ili snabdevanje depoa agensa u kontaktu sa spoljnom površinom oka. Depo se odnosi na izvor agensa koji se ne uklanja brzo suzama ili drugim mehanizmima za čišćenje oka. To omogućava kontinuirano, održivo prisustvo visokih koncentracija agensa u tečnosti na spoljnoj površini oka jednom primenom. U nekim otelotvorenjima, depo može ostati do osam sati ili više. U nekim otelotvorenjima, formulacija oftalmološkog depoa uključuje, ali se ne ograničava na vodene polimerne suspenzije, masti i čvrste umetke.

[0296] U nekim otelotvorenjima, polučvrsta kompozicija je tečna formulacija koja povećava viskoznost nakon primene u oko, obično zbog prisustva polimera u tečnoj formulaciji za koju se povećanje viskoznosti javlja sa promenom temperature, pH ili koncentracije elektrolita. Polimer može biti, na primer, celulozaacetoftalat, poliakrilna kiselina, gelanska guma, hijaluronaza, hitozan, soli alginske kiseline (npr. natrijum alginat) ili blok kopolimer etilen oksida i propilen oksida (npr. Pluronic®, BASF; poloksamer). U nekim otelotvorenjima, poliakrilna kiselina je unakrsno povezana akrilna kiselina (npr. Carbopol®). U nekim otelotvorenjima, polučvrsta kompozicija se sastoji od smeše karbopola i blok kopolimera etilen oksida i propilen oksida; smeše metil celuloze i hidroksietil celuloze; ili smeše polietilen glikola i blok kopolimera etilen oksida i propilen oksida.

[0297] U nekim otelotvorenjima, IL-6a koji sadrži oftalmološku formulaciju je mast ili gel. U nekim otelotvorenjima, oftalmološka formulacija je nosač za isporuku na bazi ulja. Na primer, formulacija može da sadrži naftnu ili lanolinsku bazu kojoj se dodaje kompozicija IL-6a (na primer na 0,1 do 2%) i pomoćne materije. Uobičajene baze mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na mineralno ulje, petrolatum i njihove kombinacije. U nekim otelotvorenjima, mast se nanosi kao traka na donji kapak.

[0298] U nekim slučajevima oftalmološka kompozicija je oftalmološki umetak. U otelotvorenjima, kompozicija se daje intravitrealno preko oftalmološkog umetka.

[0299] Na primer, oftalmološki umetak je biološki inertan, mekan, bioerodibilan, viskoelastičan, stabilan na sterilizaciju nakon izlaganja terapeutskim sredstvima, otporan na infekcije bakterijama koje se prenose vazduhom, bioerodibilan, biokompatibilan i/ili viskoelastičan. U nekim otelotvorenjima, umetak se sastoji od oftalmološki prihvatljive matrice, npr. polimerne matrice. Matrica je tipično polimer, a kompozicija IL-6a je dispergovana unutar matrice ili vezana za polimernu matricu. U nekim otelotvorenjima, sredstvo se polako oslobađa iz matrice rastvaranjem ili hidrolizom kovalentne veze. U nekim otelotvorenjima, polimer je bioerodibilan (rastvorljiv) i njegova brzina rastvaranja može da kontroliše brzinu oslobađanja sredstva dispergovanog u njemu. U drugom obliku, polimerna matrica je biorazgradivi polimer koji se razlaže, kao što je hidroliza, čime se oslobađa sredstvo vezano za njega ili dispergovano u njemu. U daljim otelotvorenjima, matrica i sredstvo mogu biti okruženi dodatnim polimernim premazom za dalju kontrolu oslobađanja. U nekim otelotvorenjima, umetak sadrži biorazgradivi polimer kao što je polikaprolakton (PCL), kopolimer etilen/vinil acetata (Eva), polialkil cijanoakrilat, poliuretan, najlon ili poli(dl-laktidko-glikolid) (PLGA), ili kopolimer bilo kog od njih. U nekim slučajevima, sredstvo se raspršuje u materijal matrice ili se raspršuje među monomernom kompozicijom koja se koristi za pravljenje materijala matrice pre polimerizacije. U nekim otelotvorenjima, količina sredstva je od oko 0,1 do oko 50%, ili od oko 2 do oko 20%. Biorazgradiva ili bioerodibilna polimerna matrica može da se koristiti tako da se istrošeni umetak ne mora ukloniti iz oka. Kako se biorazgradivi ili bioerodibilni polimer razgrađuje ili rastvara, sredstvo se oslobađa.

[0300] U daljim otelotvorenjima, oftalmološki umetak se sastoji od polimera, uključujući, ali se ne ograničavajući na one opisane u Wagh, et al., „Polymers used in ocular dosage form and drug delivery systems“, Asian J. Pharm., strane 12-17 (januar 2008. U nekim otelotvorenjima, umetak sadrži polimer izabran između polivinilpirolidona (PVP), akrilatnog ili metakrilatnog polimera ili kopolimera (npr. Eudragit® porodica polimera iz Rohm ili Degussa), hidroksimetil celuloze, poliakrilne kiseline, poli (amidoamin) dendrimera, poli(dimetilsiloksana), polietilen oksida, poli(laktid-ko-glikolida), poli(2-hidroksietilmetakrilata), polivinil alkohola) ili poli(propilen fumarata). U nekim otelotvorenjima, umetak sadrži Gelfoam®. U nekim otelotvorenjima, umetak je poliakrilna kiselina konjugata 450 kDa-cisteina.

[0301] Umetak može da sadrži jezgro koje sadrži kompoziciju IL-6a i spoljašnju cev (npr. kao što je opisano u U.S. Patent Pub. br.20040009222). U nekim slučajevima, spoljašnja cev može biti propusna, polupropusna ili nepropusna za lek. U nekim otelotvorenjima, jezgro uključuje polimernu matricu koja nema značajan uticaj na brzinu oslobađanja kompozicije IL-6a. U nekim slučajevima, spoljašnja cev, polimerna matrica jezgra, ili oboje, je bioerodibilno. Koekstrudirani proizvod može da se segmentira u sredstvu za isporuku leka. U nekim otelotvorenjima, sredstvo je nepremazano tako da su odgovarajući krajevi otvoreni, ili je sredstvo premazano, na primer, slojem koji je propusan za kompoziciju IL-6a, polupropusan za kompoziciju IL-6a ili bioerodibilan. U određenim otelotvorenjima, kompozicija IL-6a i najmanje jedan polimer se mešaju u obliku praha.

[0302] U nekim otelotvorenjima, oftalmološka kompozicija je oftalmološki film. Polimeri pogodni za takve filmove uključuju, ali se ne ograničavaju na one opisane u Wagh, et al. (supra). U nekim otelotvorenjima, film je meko kontaktno sočivo, na primer, sočivo sastavljeno od kopolimera N, N-dietilakrilamida i metakrilne kiseline unakrsno povezanih sa etilenglikol dimetakrilatom.

[0303] U određenim otelotvorenjima, IL-6a je u umetku koji je u tubularnom obliku i može biti segmentiran.

[0304] U nekim otelotvorenjima, kompozicija IL-6a je formulisana u terapeutski efikasnoj količini, obložena ili dispergovana u polimernoj matrici, tako da je kompozicija IL-6a u granularnom obliku ili u obliku čestica. U nekim otelotvorenjima, kompozicija IL-6a se oslobađa iz formulacije dok se lek iz granula rastvara u matrici ili unutar nje, difundira kroz matricu i oslobađa se u okolnu fiziološku tečnost. U nekim otelotvorenjima, brzina oslobađanja je ograničena prvenstveno brzinom rastvaranja kompozicije IL-6a iz granula/čestica u matricu; koraci difuzije kroz matricu i disperzije u okolni fluid prvenstveno nisu ograničavajući za brzinu oslobađanja. U određenim otelotvorenjima, polimerna matrica nije bioerodibilna, dok je u drugim otelotvorenjima bioerodibilna. Primeri nebioerodibilnih polimernih matrica mogu se formirati od poliuretana, polisilikona, poli(etilen-ko-vinil acetata) (Eva), polivinil alkohola i njihovih derivata i kopolimera. Primeri bioerodibilnih polimernih matrica mogu se formirati od polianhidrida, polilaktične kiseline, poliglikolne kiseline, poliortoestera, polialkilcijanoakrilata i njihovih derivata i kopolimera.

[0305] U nekim slučajevima, kompozicija IL-6a je formulisana u kolagenom materijalu. Na primer, umetak može biti rastvorljivi oftalmološki umetak leka (npr. polimerni ovalni film koji se može uvesti u gornju konjuktivalnu kesu za isporuku leka; eliptični umetak kao što je OCUSERT ® (pilokarpinski očni terapijski sistem, koji je razvila Alza Corporation) koji je napravljen od etilen vinil acetata; Lacrisert®, umetak u obliku šipke napravljen od celuloze; Novi oftalmološki sistemi za isporuku leka (NODS), napravljeni od poli(vinil alkohola); ili umeci kao što su oni opisani u Fabrizio (ADV Drug Deliv Rev. 16: 95-106, 1998). U nekim slučajevima, umetak sadrži kolagen, želatin ili polimer, pri čemu je polimer izabran između polikaprolaktona (PCL), kopolimera etilen/vinil acetata (EVA), polialkil cijanoakrilata, poliuretana, najlona, poli(dl-laktid-ko-glikolida) (PLGA) ili kopolimera bilo kog od njih. U nekim slučajevima, umetak se implantira ispod gornjeg kapka. U nekim slučajevima, umetak se implantira u zadnji segment oka, u horoidalni prostor ili u beonjaču. U nekim otelotvorenjima, umetak se implantira intravitrealno ili subretinalno. U nekim otelotvorenjima, umetak se injektira subretinalno. Metode primene i tehnike za njihovu pripremu navedene su u Remingtonovim: The Practice of Science of Pharmacy, 20, izdanje (Lippincott Williams & Wilkins, 2006).

[0306] U drugim otelotvorenjima, umetak koji sadrži kompoziciju IL-6a obezbeđuje održivo oslobađanje sredstva u staklasto telo oka. Kao što se ovde koristi, „produženo oslobađanje“ znači da kompozicija oslobađa sredstvo tokom dužeg vremenskog perioda na kontrolisan način. U nekim otelotvorenjima, umetak oslobađa sredstvo takvom brzinom da koncentracija vodenog sredstva ostaje manja od koncentracije sredstva u staklastom telu tokom oslobađanja. U nekim otelotvorenjima, koncentracija vodenog sredstva je od oko 0,002 µg/ml do oko 0,01 µg/ml ili od oko 0,01 µg/ml, do oko 0,05 µg/ml, ili manje od oko 0,05 µg/ml. U nekim otelotvorenjima, sredstvo se oslobađa brzinom od oko 1 μg/dan do oko 50 μg/dan, ili od oko 1 μg/dan do oko 10 μg/dan. U nekim otelotvorenjima, umetak dalje sadrži dodatno terapeutsko sredstvo, kao što je gore opisano, npr. fluocinolon acetonid (kao što je onaj koji se nalazi u oftalmološkom umetku Retisert®).

[0307] U nekim otelotvorenjima, oftalmološka kompozicija obuhvata mikrosfere ili nanočestice. U nekim otelotvorenjima, mikrosfere sadrže želatin. U nekim otelotvorenjima, mikrosfere se injektiraju u zadnji segment oka, u horoidalni prostor, u beonjaču, intravitrealno ili subretinalno. U nekim otelotvorenjima, mikrosfere ili nanočestice sadrže polimer, uključujući, ali se ne ograničavajući na one opisane u Wagh, et al. (Asian J Pharm 2:12-17, 2008). U nekim otelotvorenjima, polimer je hitozan, polikarboksilna kiselina kao što je poliakrilna kiselina, čestice albumina, estri hijaluronske kiseline, poliitakonska kiselina, poli(butil)cijanoakrilat, polikaprolakton, poli(izobutil)kaprolakton, poli(mlečna kiselina-koglikolna kiselina) ili poli(mlečna kiselina). U nekim otelotvorenjima, mikrosfere ili nanočestice se sastoje od čvrstih lipidnih čestica.

[0308] U nekim otelotvorenjima, kompozicija IL-6a sadrži jonoizmenjivačku smolu. U nekim otelotvorenjima, jonoizmenjivačka smola je neorganski zeolit ili sintetička organska smola. U nekim otelotvorenjima, jonoizmenjivačka smola uključuje, ali se ne ograničava na one opisane u Wagh, et al., supra. U nekim otelotvorenjima, jonoizmenjivačka smola je delimično neutralizovana poliakrilna kiselina.

[0309] Kompozicija IL-6a se može obezbediti u vodenoj polimernoj suspenziji. U nekim otelotvorenjima, kompozicija IL-6a ili polimerno sredstvo za suspenziju se suspenduje u vodenom medijumu (npr. ima svojstva kao što je gore opisano). Primeri polimernih suspenzionih sredstava uključuju, ali se ne ograničavaju na dekstrane, polietilen glikole, polivinilpirolidon, polisaharidne gelove, Gelrite®, celulozne polimere kao što je hidroksipropil metilceluloza i polimere koji sadrže karboksi kao što su polimeri ili kopolimeri akrilne kiseline, kao i druge polimerne demulcente. U nekim otelotvorenjima, polimerno suspenziono sredstvo je polimer koji bubri u vodi, nerastvorljiv u vodi, posebno unakrsno povezan polimer koji sadrži karboksi. U nekim otelotvorenjima, polimerno suspenziono sredstvo sadrži od najmanje oko 90% do oko 99,9%, ili od oko 95% do oko 99,9%, težinski, na osnovu ukupne težine prisutnih monomera, jednog ili više monoetilenski nezasićenih monomera koji sadrže karboksi. U nekim otelotvorenjima, monoetilenski nezasićeni monomer koji sadrži karboksi sadrži akrilnu kiselinu, metakrilnu kiselinu, etakrilnu kiselinu, metilakrilnu kiselinu (krotonsku kiselinu), cis-.alfa.-metilkrotonsku kiselinu (anđelinsku kiselinu), trans-a-metilkrotonsku kiselinu (tigličku kiselinu), α-butilkrotonsku kiselinu, alfa-fenilakrilnu kiselinu, α-benzilakrilnu kiselinu, αcikloheksilakrilnu kiselinu, fenilakrilnu kiselinu (cimetnu kiselinu), kumarsku kiselinu (ohidroksicinaminsku kiselinu) i umbelinsku kiselinu (p-hidroksikumarinsku kiselinu). U nekim otelotvorenjima, polimer je unakrsno povezan polifunkcionalnim sredstvom za unakrsno povezivanje (npr. difunkcionalno sredstvo za unakrsno povezivanje). U nekim otelotvorenjima, sredstvo za unakrsno povezivanje je sadržano u količini od oko 0,01% do oko 5%, ili od oko 0,1% do oko 5,0%, ili od oko 0,2% do oko 1%, na osnovu ukupne težine prisutnih monomera. U nekim otelotvorenjima, sredstva za unakrsno povezivanje su nepolialkenil polieter difunkcionalni monomeri za unakrsno povezivanje kao što su divinil glikol, 2,3-dihidroksiheksa-1,5-dien, 2,5-dimetil-1,5-heksadien, divinilbenzen, N,N-dialil akrilamid, N,N-dialimetakrilamid; sredstva za unakrsno povezivanje polialkenil polietera koja sadrže dve ili više alkenil eterskih grupa po molekulu, npr. alkenil eterske grupe koje sadrže terminalne H<2>C=C grupe, pripremljene eterifikacijom polihidričnog alkohola koji sadrži najmanje četiri atoma ugljenika i najmanje tri hidroksilne grupe sa alkenil halogenidom kao što je alil bromid ili slično, npr. polialil saharoza, polialil pentaeritritol, ili slično; diolfinska nehidrofilna makromerna sredstva za unakrsno povezivanje koja imaju molekularnu težinu od oko 400 do oko 8.000, kao što su nerastvorljivi diakrilati i poliakrilati i metilakrilati diola i poliola, diizocijanat hidroksialkil akrilatni ili metakrilatni produkti reakcijeizocijanatnih prepolimera dobijenih iz poliester diola, polieterskih diola ili polisiloksanskih diola sa hidroksialkilmetakrilatima i slično.

[0310] U nekim otelotvorenjima, unakrsno povezani polimeri su napravljeni od monoetilensko nezasićenog monomera ili monomera koji sadrže karboksi, kao jedinog monoetilensko nezasićenog monomera prisutnog, zajedno sa sredstvom ili sredstvima za unakrsno povezivanje. U nekim otelotvorenjima, polimeri su oni u kojima je do oko 40%, a poželjno od oko 0% do oko 20% težinski, monoetilenskih nezasićenih monomera ili monomera koji sadrže karboksi, zamenjeno jednim ili više monoetilenskih nezasićenih monomera ili monomera koji sadrže samo fiziološki i oftalmološki neškodljive supstituente, uključujući estere akrilne i metakrilne kiseline kao što su metil metakrilat, etil akrilat, butil akrilat, 2-etilheksilakrilat, oktil metakrilat, 2-hidroksietilmetakrilat, 3-hidroksipropilakrilat i slično, vinil acetat, N-vinilpirolidon i slično (npr. Mueller et al. U.S. Pat. br. 4.548.990). U nekim otelotvorenjima, polimeri uključuju polikarbofil (Noveon AA-1), Carbopol® i DuraSite®. U nekim otelotvorenjima, unakrsno povezani polimeri se pripremaju suspenzijom ili emulzijom polimerizacijom monomera, korišćenjem konvencionalnih katalizatora polimerizacije slobodnih radikala, do veličine suvih čestica ne veće od oko 50 µm u ekvivalentnom sfernom prečniku. U nekim otelotvorenjima, prosečna veličina suvih čestica je od oko 1 do oko 30 μm, ili od oko 3 do oko 20 μm u ekvivalentnom sfernom prečniku. U nekim otelotvorenjima, polimerne čestice se dobijaju mehaničkim mlevenjem većih polimernih čestica. U daljim otelotvorenjima, takvi polimeri će imati molekulsku težinu od oko 250.000 do oko 4.000.000, i od 3.000.000.000 do 4.000.000.000. U drugim otelotvorenjima, čestice unakrsno povezanog polimera su monodisperzne, što znači da imaju raspodelu veličine čestica tako da najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% čestica nalazi u μm opsegu glavne raspodele veličine čestica. U daljim otelotvorenjima, veličina monodisperznih čestica znači da nema više od oko 20%, oko 10% ili oko 5% čestica veličine ispod 1 µm. U nekim otelotvorenjima, vodena polimerna suspenzija sadrži od oko 0,05 do oko 1%, od oko 0,1 do oko 0,5%, ili od oko 0,1 do oko 0,5%, agensa i od oko 0,1 do oko 10%, od oko 0,5 do oko 6,5%, od oko 0,5 do oko 2,0%, od oko 0,5% do oko 1,2%, od oko 0,6 do oko 0,9%, ili od oko 0,6 do oko 0,8% polimernog suspendujućeg sredstva. Iako se pominje u jednini, treba shvatiti da se jedna ili više vrsta polimernog suspenzivnog sredstva može koristiti sa ukupnom količinom koja se nalazi u navedenim opsezima. U jednom otelotvorenju, količina nerastvorljivih lagano unakrsno povezanih polimernih čestica, pH i osmotski pritisak mogu biti međusobno povezani i sa stepenom unakrsnog povezivanja da bi se dobila kompozicija koja ima viskoznost u opsegu od oko 500 do oko 100.000 centipoaza, a poželjno od oko 1.000 do oko 30.000 ili oko 1.000 do oko 10.000 centipoaza, mereno na sobnoj temperaturi (oko 25°C.) pomoću Brookfield digitalnog LVT viskozimetra opremljenog vretenom broj 25 i adapterom za mali uzorak 13R pri 12 o/min. U nekim otelotvorenjima, viskoznost je od oko 10 do oko 400 centipoaza, od oko 10 do oko 200 centipoaza ili od oko 10 do oko 25 centipoaza.

[0311] U nekim otelotvorenjima, vodene polimerne suspenzije mogu biti formulisane tako da zadrže isti ili suštinski isti viskozitet u oku koji su imale pre primene u oko. U nekim otelotvorenjima, one se mogu formulisati tako da dođe do povećanog geliranja u kontaktu sa suznom tečnošću. Na primer, kada se formulacija koja sadrži DuraSite® ili drugi sličan polimer tipa poliakrilne kiseline primenjuje u oko pri pH vrednosti manjoj od oko 6,7, polimer može da nabubri u kontaktu sa suznom tečnošću jer ima viši pH (oko 7). Ovo geliranje ili povećanje geliranja može dovesti do zarobljavanja suspendovanih čestica, čime se produžava vreme zadržavanja kompozicije u oku. U nekim otelotvorenjima, sredstvo se polako oslobađa kako se suspendovane čestice rastvaraju tokom vremena. U nekim otelotvorenjima, ovaj put isporuke povećava udobnost pacijenta i povećava vreme kontakta sredstva sa očnim tkivima, čime se povećava stepen apsorpcije leka i trajanje delovanja formulacije u oku. Sredstva sadržana u ovim sistemima za isporuku leka će se oslobađati iz gelova brzinama koje zavise od faktora kao što su sam lek i njegov fizički oblik, stepen opterećenja lekom i pH sistema, kao i od bilo kojih adjuvanasa za isporuku leka, kao što su jonoizmenjivačke smole kompatibilne sa površinom oka, koje takođe mogu biti prisutne.

[0312] U nekim otelotvorenjima, antagonist IL-6 se daje ispitaniku korišćenjem genetske isporuke, npr. lokalne genetske isporuke. Takva isporuka može biti preko sistema tranzijentne ekspresije, stabilnog (npr. integrisanog) sistema ekspresije kao što je sistem za isporuku lentivirusa proizvođača Bluebird Bio (Cambridge, MA), ili isporuka u fabrici ćelija kao što su one koje proizvodi Neurotech (Cumberland, Rhode Island).

[0313] Sve tehničke karakteristike mogu se pojedinačno kombinovati u svim mogućim kombinacijama takvih karakteristika.

[0314] Prethodna otelotvorenja treba razmotriti u svim aspektima ilustrativno, a ne ograničavajuće na predmetni pronalazak opisan u ovom dokumentu.

[0315] Primeri

[0316] Sledeći neograničavajući primeri dalje ilustruju otelotvorenja predmetnog pronalaska opisana u ovom dokumentu.

[0317] Primer 1: Validacija lokalne blokade IL-6 u modelu horoidalne neovaskularizacije (CNV)

[0318] Da bi se utvrdilo da li lokalna blokada IL-6 može biti efikasna za lečenje bolesti oka, npr. dijabetičkog makularnog edema (DME) ili vlažnog AMD-a, lokalno je primenjeno anti-IL-6 antitelo korišćenjem modelnog sistema za horoidalnu neovaskularizaciju. Laserski indukovani CNV model (eyecro.com/in-vivo/laser-induced-choroidal-neovascularizationcnv/) reprodukuje mnoge patološke procese koji su u osnovi DME, uključujući upalu i angiogenezu. Ispitivanja su sprovedena na pacovima na EyeCRO (Oklahoma City, OK). Šest životinja u svakoj grupi podvrgnuto je bilateralnom laserskom tretmanu 0. dana kako bi se proizvele tri lezije po oku. 3. i 10. dana, 3 µg poliklonalnog anti-rat-IL-6 antitela (R&D Systems AF506; Minneapolis, MN) je primenjeno na ispitnoj grupi intravitrealnom (IVT) injekcijom, dok je PBS ili anti-VEGF poliklonalno antitelo (R&D Systems AF564) primenjeno na kontrolne grupe tretirane vehikulumom i pozitivne kontrolne grupe, respektivno. In vivo angiografija je obavljena 15. i 22. dana za merenje površine lezije. I 15. i 22. dana, grupa tretirana sa anti-IL-6 imala je značajno smanjenu neovaskularizaciju u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom vehikulumom. Nije bilo značajne razlike u odgovoru između grupe tretirane sa anti-IL-6 i pozitivne kontrolne grupe tretirane anti-VEGF antitelom. Sl. 1 prikazuje rezultate takvog eksperimenta. Ovi podaci pokazuju da IL-6a, npr. anti-IL6 antitelo, primenjeno IVT injekcijom može smanjiti neovaskularizaciju na CNV modelu pacova na slične nivoe kao pozitivna kontrolna grupa tretirana anti-VEGF antitelom (p = 0,005415. dana i p = 0,0005 22. dana za kontrolnu grupu tretiranu anti-IL-6 u odnosu na onu koja je tretirana vehikulumom).

[0319] Ovi podaci ukazuju na to da lokalna blokada IL-6 može biti korisna za lečenje bolesti oka kao što su bolesti koje uključuju vaskularno curenje, npr. makularni edem.

[0320] Primer 2: Kandidati za antagoniste IL-6 antitela

[0321] Kandidati za antagoniste IL-6 antitela razvijeni su korišćenjem procesa koji je prvo uključivao imunizacije. Imunizacije su izvršene po uputstvu pronalazača od strane ugovorne istraživačke organizacije (CRO). Pet BALB/C miševa je injektovano supkutano sa 80 µg humanog IL-6 (R&D Systems, kat. br.206-IL/CF, Minneapolis, MN) u PBS-u koji sadrži 1 M NaCl sa Frojdovim adjuvansom. Izvršene su dve dodatne doze sa 80 µg i 50 µg IL-6. Ćelije slezine su uzete iz miša sa najvećim titrom i spojene sa ćelijama mijeloma P3x763Ag8.653 da bi se formirali hibridomi.

[0322] Supernatanti hibridoma su provereni na IL-6 vezivanje i antagonizam. Za vezivanje ELISA, Costar 9018 mikrotitarske ploče su obložene sa 1 µg/ml humanog IL-6 u PBS-u preko noći na 4°C. Bunarčići su blokirani PBS-om koji sadrži 2% BSA, isprani, a zatim inkubirani sa 50 µL svakog supernatanta hibridoma razblaženog u odnosu 1:2 PBS-om koji sadrži 2% BSA. Nakon 60 minuta, mikrotitarske ploče su isprane tri puta sa 300 µl PBS-a koji sadrži 0,1% Tween-20. Anti-mouse-HRP razblažen u odnosu 1:3000 u PBS-BSA je zatim dodat u svaki bunarčić i inkubiran 30 minuta. Bunarčići su isprani kao što je gorenavedeno, zatim je dodat supstrat 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) i signal je izmeren na 450 i 550 nm. Za ispitivanja antagonizma, HEK-Blue™-IL6 reporterske ćelije (InvivoGen, San Diego, CA) su inkubirane sa povećanim koncentracijama humanog IL-6 u prisustvu 1:10 razblaženog supernatanta hibridoma. Nakon 20-24 sata, 20 µl supernatanta je pomešano sa 180 µl QuantiBlue™ (InvivoGen) i apsorbancija je izmerena na 655 nm.

[0323] Na osnovu ispitivanja vezivanja i antagonizma, podnosioci prijave su izabrali hibridom 64 kao olovo i subklonirali ga u CRO. Hibridom 64 (mišji monoklon) je dalje testiran na sposobnost inhibicije vezivanja kompleksa IL-6/IL-6Rα za gp130 korišćenjem enzimski povezanog imunosorbantnog testa (ELISA). Hibridom 64 u koncentraciji od 1,5 µg/ml značajno je smanjio vezivanje kompleksa IL-6/IL-6Rα za imobilizovani gp130 ELISA testom (sl. 2).

[0324] Potkloni su ponovo pregledani i varijabilni domeni potklona 64,58 su pojačani PCR-om od 5’ i sekvencirani. Sekvence varijabilnog domena miša (koje se nazivaju m64) su sledeće:

[0325] m64 VH (varijabilni teški lanac)

[0328]

[0330] m64 VL (varijabilni laki lanac)

[0333]

[0335] SEKV.:14)

[0336] Da bi se stvorile humanizovane sekvence, regioni koji određuju komplementarnost (CDR) m64 su presađeni u ljudski okvir germinativne linije izabran za sličnost sa sekvencom miša računskim algoritmom. Humanizovane sekvence (koje se nazivaju h64) bile su sledeće (izmenjeni ostaci u poređenju sa m64 sekvencama su podvučeni) i imaju oko 79,5% identičnosti (VH) i 84,4% identičnosti (VL) sa mišjim sekvencama:

[0339]

[0341] (SEQ ID NO:15)

[0342] Humanizovane sekvence su sintetizovane DNK2.0 (Menlo Park, CA), a zatim klonirane u vektore ekspresije izvedene iz pcDNK3.1 kao linijske fuzije sa humanim IgG1 konstantnim domenima. IgG su eksprimirani tranzijentnom transfekcijom u Freestyle™-293 ćelijama (Invitrogen, Grand Island, NY) i prečišćeni hromatografijom koja koristi protein-A. I u ispitivanjima vezivanja i antagonizma, IgG h64 je pokazao značajno smanjenu potentnost u poređenju sa svojim prethodnikom m64. Stoga je prikaz kvasca korišćen za vraćanje izgubljenog afiniteta.

[0343] Da bi se sprovelo sazrevanje afiniteta dizajnirano za obnavljanje ili poboljšanje afiniteta humanizovanog h64IgG, sekvence antitela h64 su ponovo klonirane da bi se generisao Fab molekul u pYC2/CT vektorima kvasca u kojima je FabH lanac spojen sa anti-FITC scFv 4m5.3 preko (G4S)3 linkera (SEQ ID NO:29). Biblioteka varijanti h64 je zatim generisana PCR-om sklonim greškama prema protokolu Chao et al. (2006, Nature Protocols, 1:755-768). Varijante H64 su eksprimirane i površinski uhvaćene kvascem označenog sa FITC-PEG-NHS, a zatim inkubirane sa biotinilisanim humanim IL-6. Vezani IL-6 je detektovan streptavidinom-APC, a ćelije sa najvećom količinom vezanog IL-6 u odnosu na količinu prikazanih Fab su izabrane na ćelijskom sorteru BD FACSAria™. Nakon četiri kruga selekcije, izabrana je i sekvencirana populacija varijanti višeg afiniteta. Sekvenca klona izabranog sazrevanjem afiniteta (koja se naziva h64-1.4) je sledeća sa izabranim mutacijama (tj. mutiranim u poređenju sa sekvencama h64 VH i VL) podebljanim slovima, a CDR-i su podvučeni. To su varijabilni domeni 018 (kao i molekuli 020 i 029 IL-6a opisani u nastavku). Imajte na umu da puni Fab uključuju CK i IgG1 CH1 domene. U kontekstu ove prijave, pozivanje na aminokiselinsku sekvencu „Fab“ teškog lanca ili lakog lanca znači da sekvenca može biti deo funkcionalne sekvence Fab koja se sastoji od sekvence izvedene iz lakog lanca i sekvence izvedene iz teškog lanca.

[0344] h64-1.4 VH (018VH)(varijabilni domen)

[0346]

[0348] ID NO:18)

[0349] Varijabilni domeni h64-1.4 su ponovo klonirani u pcDNK3.1 humani IgG1 vektor i eksprimirani kao IgG1 pune dužine u Freestyle™-HEK293 ćelijama (Life Technologies). Dobijeni prečišćeni IgG bio je značajno potentniji od originalnog h64 antitela u ispitivanjima vezivanja i ćelijskog antagonizma. Ispitivanjem afiniteta korišćenjem sistema kvasca, afinitet se povećao sa 343 pM za originalni humanizovani molekul na 43 pM. Potentnost antagonista bila je oko desetostruko povećana kao što je ispitano korišćenjem HEK-Blue ćelijskog sistema.

[0350] H64-1.4 IgG je reformatiran kao Fab za upotrebu u očnim i drugim indikacijama. Pored toga, izvršen je još jedan krug generisanja biblioteke i selekcija na bazi kvasca kako bi se dodatno poboljšao afinitet. Nakon četiri kruga selekcije, došlo je do značajnog obogaćivanja za varijantu VH sa mutacijom A79V. Antitela, varijante i njihovi fragmenti koji obuhvataju varijantu A79V nazivaju se 019 IL-6a antitela, varijante i njihovi fragmenti.

[0351] Primer 3: Izbor formata

[0352] Da bi se istražili odgovarajući formati za antagonist IL-6 zasnovan na antitelima, antitela IL-6 izabrana kao što je opisano iznad testirana su na tranzijentnu ekspresiju, stabilnost, svojstva agregacije, afinitet vezivanja i IC50 koristeći Fab, SCFV(VH-VL) i SCFV(VL-VH) oblike sekvenci 018.

[0353] Rezultati ovih ispitivanja za jedan od molekula kandidata za IL-6a (sekvence koje sadrže varijabilni region 018) prikazani su u tabeli 1.

[0354] Tabela 1

[0356]

[0358] Ovi podaci pokazuju metod identifikacije ključnih karakteristika različitih formata antagonista IL-6 zasnovanih na antitelima i ilustruju da za antagoniste IL-6 koji sadrže varijabilne regione 018, format 018Fab ima najpovoljnije karakteristike u većini ključnih kategorija, tj. ekspresiju, stabilnost, agregaciju i afinitet vezivanja u poređenju sa scFv konfiguracijom. IC50 od 018 Fab se nalazi u razumnom opsegu za terapijsku upotrebu.

[0359] Primer 4: Primeri IL-6a antitela, fragmenata i derivata

[0360] Kandidati su identifikovali sledeće sekvence koristeći ovde opisane metode. Podvučene sekvence predstavljaju CDR-e teških i lakih lanaca. Ostale sekvence se mogu naći u celoj specifikaciji.

[0361] Polipeptidna sekvenca teškog lanca 018 (pune dužine; f1018HC) u IgG1 okviru

[0364]

[0366] Sekvenca nukleinske kiseline teškog lanca 018 (pune dužine; fl018HC) u IgG1 okviru (SEQ ID NO:20)

[0367] Polipeptidna sekvenca teškog lanca 018 Fab (018FabHC) u IgG1 okviru. CDR-i su podvučeni

[0370]

[0372] Polipeptidna sekvenca lakog lanca pune dužine 018 (fl018LC). CDR-i su podvučeni

[0375]

[0377] Ovo je takođe sekvenca lakog lanca za 020 i 029 IL-6 antagoniste sekvence nukleinske kiseline lakog lanca pune dužine 018 (018LC) u IgG1 okviru

[0380]

[0382] (SEQ ID NO: 26)

[0383] Teški lanac 019 Fab (019FabHC, ista sekvenca kao 018FabHC osim za A79V (podebljano/kurzivno)

[0386]

[0387] 019 VH (varijabilni region/019HC)

[0390]

[0392] Sekvenca lakog lanca antitela 019 (019LC) (polipeptida i nukleinske kiseline) je ista kao 018LC

[0394]

[0396] Primer 5: Mapiranje epitopa i strukture

[0397] Mapiranje epitopa

[0398] Funkcionalno mapiranje epitopa izvršeno je na izabranim kandidatima za antagoniste IL-6. Utvrđeno je da kandidatsko antitelo (mišje 64 antitelo) nije smanjilo vezivanje IL-6Rα za IL-6 u ELISA testu, što ukazuje na to da se kandidatsko antitelo ne vezuje za mesto I. Sprovedeni su dodatni eksperimenti koji pokazuju da je himerno mišje 64 antitelo smanjilo vezivanje kompleksa IL-6/IL-6Rα za gp130 u ELISA testu, što ukazuje na to da mesto II ili mesto III IL-6 sadrži mesto vezivanja za antitelo. Takođe je utvrđeno da mišje 64 antitelo nije značajno blokiralo vezivanje poznatog antitela koje se vezuje za mesto III AH-65 (Immunotech, Marsej, Francuska) za IL-6, što ukazuje na to da se kandidatsko antitelo vezuje za mesto II IL-6. Ovi podaci pokazuju da se antitela protiv mesta II mogu generisati i pokazuju metod identifikacije takvih antitela.

[0399] Da bi se dalje definisao epitop, mutacije u IL-6 su generisane u kvascu kao fuzije do 4m5.3 (Boder et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97, 10701-10705; Chao et al., 2006, Nat Protoc 1, 755–768). Mutacije eksprimirane u humanom IL-6 sa sledećim pojedinačnim ili dvostrukim mutacijama: R24E/D27E, R30E, Y31E, D34R, S118R/V121E, W157E, Q159E/T162P, K171E i R179E. Eksprimirani mutirani molekuli IL-6 korišćeni su u ispitivanjima vezivanja sa 018 (Fab). Smanjeni afinitet za 018 (Fab) je primećen za R24E/K27E, Y31E, D34R i S118R/V121R, koji se svi nalaze na mestu II IL-6. Shodno tome, ovde opisani predmetni pronalazak uključuje antitelo koje se vezuje za najmanje jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest aminokiselina na položaju 24, 27, 31, 34, 118 i 121 humanog IL-6 ili ekvivalentnog mesta u IL-6.

[0400] Strukturna definicija mesta II epitopa

[0401] Za strukturno definisanje mesta II izračunata su sledeća rastojanja. Izračunavanja se zasnivaju na IL-6/IL-6α/gp130 heksamernoj kristalnoj strukturi, PDB 1P9M (Boulanger et al., 2003, Science 300: 2101-2104). Heliks 1 IL-6 ide između mesta I i mesta II, što rezultira određenim ostacima koji se nalaze blizu mesta II, ali imaju bočne lance koji ukazuju na mesto I, npr. R30. D2 i D3 se odnose na ekstracelularne domene IL-6Rα.

[0402] Utvrđeno je da se sledeće aminokiseline IL-6 nalaze u radijusu od 5 Å gp130-D2-D3: L19, R24, K27, Q28, R30, Y31, D34, E110, Q111, R113, A114, M117, S118, V121, Q124, F125 i K128

[0403] Utvrđeno je da se sledeće aminokiseline nalaze u radijusu od 7 Å gp130-D2-D3: L19, E23, R24, I25, K27, Q28, I29, R30, Y31, D34, K41, Q102, E109, El 10, Q111, A112, R113, A114, V115, Q116, M117, S118, K120, V121, L122, Q124, F125 i K128.

[0404] Shodno tome, molekul, npr. antitelo ili njegov fragment koji može da veže jednu ili više aminokiselina IL-6 u radijusu od 5 Å ili 7 Å mesta II može biti IL-6a.

[0405] Sekvenca humanog IL-6 data je u nastavku kao referenca (podvučena sekvenca je vodeća sekvenca). Aminokiseline u radijusu od 7 Å gp130-D2-D3 su u kurzivu. Numeracija aminokiselina, npr. mutacije koje se koriste za definisanje epitopa, je bez vodeće sekvence:

[0406] Humani IL-6

[0409]

[0411] Sprovedeni su eksperimenti ispitivanja Fab fragmenta humanizovanog antitela h64-1.4 i pokazano je da je u stanju da blokira i cis i trans IL-6 signalizaciju, što je posledica ciljanja mesta II. Potentnost Fab fragmenta je bila nepromenjena u prisustvu rastvorljivog IL-6 receptora (sIL-6R). Ovo je u suprotnosti sa anti-IL-6R IgG koji je imao smanjenu potentnost u prisustvu sIL6R, i koji blokira samo cis signalizaciju.

[0412] Ovi eksperimenti pokazuju da se antitelo ili fragment antitela kao što je Fab fragment koji cilja mesto II može koristiti za inhibiciju i cis i trans signalizacije Il-6.

[0413] Primer 6: Ispitivanja na primatima

[0414] Pošto se aktivnosti kod neprimata mogu u velikoj meri razlikovati od onih kod primata, kandidati za antagoniste IL-6 se obično dalje procenjuju za PK i druge parametre koristeći primate koji nisu ljudi. Humani IL-6 se razlikuje od IL-6 kod cinomolgus majmuna i rezus majmuna na sedam mesta, od kojih je jedan na mestu II (aminokiselina 28) i isti je na mestu II kod IL-6 afričkog zelenog majmuna. Čini se da ovo smanjuje vezivanje antitela koje se sastoji od 018 sekvenci za samo oko 3-4 puta. Sposobnost vezivanja za IL-6 kod neljudskog primata je korisna karakteristika antagonista IL-6, što olakšava razvoj kandidata kao leka, npr. omogućavanjem testiranja kao što je toksikološko testiranje na neljudskim primatima.

[0415] Kao i kod većine IL-6 antitela, ovde opisana anti-IL-6 antitela nisu unakrsno reagovala sa IL-6 kod glodara, zečeva ili pasa zbog niske homologije sekvence. Međutim, u ispitivanjima afiniteta, utvrđeno je da 018 Fab vezuje IL-6 kod cinomolgus majmuna i afričkog zelenog majmuna sa približnim afinitetom kao kod ljudi (tabela 2).

[0416] Tabela 2: Jednovalentni afinitet (018 Fab) za različite IL-6 različitih vrsta

[0418]

[0420] Ovi podaci dalje pokazuju sposobnost IL-6a kao što je ovde opisano da se specifično veže i sposobnost razvoja molekula koji ima karakteristike koje omogućavaju testiranje, npr. za toksikološka i reproduktivna ispitivanja, na pogodnoj životinji.

[0421] Primer 7: Povećanje ekspresije IL-6a

[0422] Da bi se povećala ekspresija 018 Fab i 019 Fab polipeptida, napravljeni su konstrukti koji uvode pet dodatnih aminokiselina (DKTHT (SEQ ID NO:30)) u teški lanac u regionu CH1/šarke koristeći metode poznate u struci. Sekvenca izmenjenog teškog lanca 018Fab prikazana je u nastavku kao SEQ ID NO:24. Izmenjena sekvenca 018 se ovde naziva 020, a izmenjena sekvenca 019 se ovde naziva 021. Molekul 020 (teški lanac 020Fab i laki lanac 018Fab) imao je poboljšanu ekspresiju u poređenju sa matičnim Fab koji je imao teške lance 018Fab i lake lance 018Fab. Molekul 019 nije pokazao značajnu razliku u afinitetu u poređenju sa molekulom 020. Ekspresija i 020 i 019 je povećana za oko dva puta, respektivno, pri čemu afiniteti nisu bili pogođeni promenom.

[0423] 020 teški lanac (Fab sa DKTHT (SEQ ID NO:30) na karboksi terminalnom kraju))

[0426]

[0428] IL-6 antagonizam korišćenjem 020Fab izmeren je u HEK-Blue™ IL-6 reporterskim ćelijama (InvivoGen, San Diego, CA). Ćelije su inkubirane u smeši od 10 pM IL-6 i različitih koncentracija antitela 020 ili IL-6Rα (Cell Sciences, Canton, MA), sa ili bez 50 nM IL-6Rα. Nakon 20-24 sata inkubacije, 20 µL supernatanta ćelijske kulture je pomešano sa 180 µL QuantiBlue™ (InvivoGen) supstrata i inkubirano jedan sat; apsorbancija je zatim izmerena na 655 nm. Sl.3A i Slika 3B prikazuju podatke iz ovih eksperimenata, pokazujući sposobnost 020 da inhibira aktivnost IL-6 u prisustvu ili odsustvu IL-6R.

[0429] Primer 8: IgG2 IL-6 antitela

[0430] 018 je reformatiran u okvir humanog IgG2 izotipa kako bi se smanjilo vezivanje za FcγR i smanjio ADCC u poređenju sa IgG1 formatiranim antitelima korišćenjem metoda poznatih u struci. Pored toga, očekuje se da će reformatiranje 018 u format pune dužine, npr. IgG2, smanjiti brzinu klirensa iz staklastog tela zbog veće veličine molekula.

[0431] Izgradnja/prečišćavanje anti-IL6 IgG2 antitela

[0432] Da bi se konstruisala humana IgG2 antitela koristeći anti-IL-6 sekvence opisane iznad, humani IgG2 konstantni domen je PCR-om pojačan iz cDNK sa NheI i MluI restrikcionim mestima na N- i C-terminalnim krajevima, respektivno. Proizvod PCR-a je prečišćen, digestiran sa NheI i MluI restrikcionim enzimima, a zatim ligiran u pTT5 vektor koji sadrži anti-IL6 varijabilni domen, tj. SEQ ID NO:1 (videti iznad). To je dalo sekvencu teškog lanca IgG2 pune dužine. Za dobijanje lakog lanca korišćeni su plazmidi koji sadrže laki lanac pune dužine koji sadrži sekvencu 018.

[0433] Da bi se dodatno smanjilo vezivanje za FcRn i time smanjilo recikliranje IL-6a, napravljene su tačkaste mutacije u teškom lancu. Mutacije su napravljene QuikChange® mutagenezom (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Plazmidi teškog i lakog lanca su kotransfektovani korišćenjem poli(etilenimina) (PEI) u 100 ml prelaznih kultura HEK293-6E ćelija i kultivisani kako bi se omogućila ekspresija za oko pet dana. Ovo je generisalo antitela koja sadrže anti-IL-6 mesto II vezujući deo i IgG2 strukturu. Takve strukture koje sadrže 018 CDR-e se ovde nazivaju 018IgG2 ili 029. Tačkaste mutacije su napravljene na ostacima I253 Molekul IgG2 je dobro izražen i blokira IL-6 u ćelijskim testovima sa blago poboljšanom potentnošću u poređenju sa 020Fab.

[0434] 029 zrele sekvence (CDR-i su podvučeni)

[0435] 029 teški lanac

[0438]

[0440] (SEQ ID NO:11)

[0441] 029 laki lanac

[0444]

[0446] Izmenjeno vezivanje za FcRn

[0447] IL-6 može imati određene pozitivne sistemske efekte. Stoga je prednost konstruisanja IL-6a ta da ima dobro zadržavanje u staklastom telu, ali ima ograničen sistemski poluživot. Smanjenje ili eliminacija vezivanja za FcRn treba da smanji sistemsku akumulaciju bilo kog leka koji dospeva u cirkulaciju, čime se poboljšava bezbednost IL-6a.

[0448] Shodno tome, pošto promet posredovan FcRn-om može da poveća efluks antitela iz oka, 020 IgG2 je dalje modifikovan kako bi se ablatiralo vezivanje za FcRn uvođenjem Fc mutacija na ostacima I254, H311 ili H436 (videti SEQ ID NO:23) numeracijom prema Martin et al., Molecular Cell, 7:4, 867-877 (2001)). Mutirana mesta su prikazana podebljanim slovima u SEQ ID NO:23; I254 je mutirao u A ili R, H311 je mutirao u A ili E, H311 je mutirao u N sa D 313 mutiranim u T, a H436 je mutirao u A (numeracija počinje nakon vodeće sekvence, koja je podvučena u SEQ ID NO:23. Antagonisti IL-6 koji sadrže takve sekvence nazivaju se 018IgG2m.

[0449] Anti-IL-6 teški lanac (IgG2) (običan font: VH; kurzivni font: CH) (bez vodeće sekvence) koja pokazuje mesta mutacije (podebljanim slovima)

[0450]

[0452] Anti-IL-6 teški lanac (IgG2) (običan font: VH; kurzivni font: CH) sa vodećom sekvencom (podvučeno) koja pokazuje mesta mutacije (podebljanim slovima)

[0455]

[0457] Shodno tome, neka otelotvorenja uključuju antitelo koje ima sekvencu teškog lanca prikazanu u SEQ ID NO:23 sa mutacijama na I254 (npr. A ili R), H311 (mutirano u A ili E), H436 (mutirano u A) ili D313 (mutirano u T) sa H311 mutiranim u N.

[0458] SEQ ID NO:25 stoga obezbeđuje sekvencu koja, kada je mutirana u I133 (npr. I133A ili I133R), H190 (npr. H190A ili H190E), H315 (npr. H315A) ili D192 sa H190 (npr. D192T sa H190N) može da se koristi u antitelima, njihovim fragmentima ili derivatima za proizvodnju polipeptida koji ima smanjeno Fc vezivanje pri niskom pH, npr. pH 5,5 ili lizosomski pH i/ili polipeptida koji ima smanjen sistemski poluživot u poređenju sa matičnim ili drugim referentnim molekulom koji ne uključuje sekvencu.

[0461]

[0462] Anti-IL-6 laki lanac (IgG2) (običan font: VK; kurzivni font: CK)

[0465]

[0467] Primer 9: Stabilnost formulacije

[0468] Stabilnost Fab fragmenta anti-IL-6/IgG1 (koji sadrži domen IgG1CH1) testirana je određivanjem T<m>inicijalno u PBS-u, a zatim u nizu pufera i pomoćnih supstanci korišćenjem diferencijalne skenirajuće fluorimetrije. Utvrđeno je da je citratni pufer, pH 5,5 povećao T<m>na više od 80°C. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, IL-6a je obezbeđen u citratnom puferu i u nekim slučajevima ima T<m>od najmanje 80°C.

[0469] Agregacija je testirana pomoću SEC-MALS i nije primećena agregacija pri 20 mg/ml u fiziološkom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS).

[0470] Primer 10: Antitela osetljiva na pH za poboljšanu farmakokinetiku

[0471] IL-6 može imati određene pozitivne sistemske efekte. Stoga je prednost konstruisanja IL-6a ta da ima dobro zadržavanje u staklastom telu, ali ima ograničen sistemski poluživot. Smanjenje ili eliminacija vezivanja za FcRn treba da smanji sistemsku akumulaciju bilo kog leka koji dospeva u cirkulaciju, čime se poboljšava bezbednost IL-6a. Shodno tome, pošto promet posredovan FcRn-om može da poveća efluks antitela iz oka, 020 IgG2 je dalje modifikovan kako bi se ablatiralo vezivanje za FcRn uvođenjem Fc mutacija na ostacima I253, H310 ili H435 (numeracijom prema Martin et al. (Molecular Cell, 7:4,867-877 (2001))). Takva antitela se ovde nazivaju IL-6pH antitela ili anti-IL-6pH i dalje su opisana u nastavku.

[0472] Generisanje antitela sa vezivanjem osetljivim na pH

[0473] PKa histidina je oko 6,0 i histidini umetnuti na mesta vezivanja mogu poremetiti vezivanje nakon protonacije bočnog lanca pri niskom pH. Koristeći antitelo koje cilja na mesto II anti-IL-6 kao što je ovde opisano, generisana je biblioteka koja sadrži varijante CDR-a bogate histidinom od 018 i biblioteka je pregledana na vezivanje osetljivo na pH pomoću prikaza kvasca. Biblioteka koja je generisana bila je kombinatorna biblioteka sa CDR-ima kodiranim degenerisanim kodonima tako da je svaki ostatak ili ostatak divljeg tipa (tj. isti kao u matičnom antitelu) ili histidinski ostatak. Pregledanje je izvršeno naizmeničnim sortiranjem radi visokog vezivanja pri fiziološkom pH (7,4) i niskog vezivanja pri endosomskom pH (5,5).

[0474] Identifikovan je mutant izabran iz kvasca koji je imao relativno visoko vezivanje na pH 7,4 (jednovalentni Kd od 407 pM za mutant u poređenju sa 192 pM za matični molekul) i relativno nisko vezivanje na pH 5,5 (jednovalentni Kd od 2,362 nM za mutant u poređenju sa 195 pM za matični). To predstavlja približno 5,8 puta promenu afiniteta pri pH 5,5. Ovaj mutant je sadržao više mutacija histidina u lakom lancu CDR1. Dakle, mutant je pokazao slično vezivanje za matični molekul pri pH 7,4, i značajan gubitak afiniteta pri pH 5,5. Ovo zapažanje je verifikovano korišćenjem ELISA, FACS i SPR analize metodama poznatim u struci.

[0475] Ovi podaci pokazuju da se može stvoriti IL-6a zasnovan na antitelima koja imaju karakteristike anti-IL-6 ciljanog mesta II IL-6 koje se može koristiti za inhibiciju i cis i trans aktivnosti IL-6 i imaju povećanu farmakokinetiku u poređenju sa matičnim antitelima ili drugim antitelima koja imaju Fc domen divljeg tipa, na šta je bar delimično uticano izmenjenim vezivanjem na pH 5,5.

[0476] Primer 11: Efikasnost lokalne blokade IL-6 u mišjem modelu laserske horoidalne neovaskularizacije (CNV)

[0477] Da bi se utvrdilo da li lokalna blokada IL-6 može biti efikasna za lečenje bolesti oka, npr. dijabetičkog makularnog edema (DME) ili vlažnog AMD-a, lokalno je primenjeno anti-IL-6 monoklonsko antitelo u modelnom sistemu za horoidalnu neovaskularizaciju. U ovom primeru.je korišćen laserski indukovani CNV model kao što je opisano u Saishin et al. Journal of Cellular Physiology, 195:241–248 (2003). Laserski indukovani CNV model reprodukuje mnoge patološke procese koji su u osnovi dijabetičkog makularnog edema (DME), uključujući upalu i angiogenezu.

[0478] Monoklonsko anti-mišje IL-6 antitelo (MP5-20F3, koje je pacovsko IgG1 izotipsko antitelo kupljeno od Bio X Cell, kataloški broj BE0046) primenjeno je ispitnoj grupi intravitrealnom (IVT) injekcijom. Kontrolne grupe su primile intravitrealnu injekciju VEGF blokade ili intravitrealnu injekciju anti-HRP izotipskog kontrolnog antitela (pacovski IgG1 protiv peroksidaze rena, klon HRPN, kupljen od BioXCell; kataloški broj BE0088). Za sve grupe antitela, 20 µg proteina u zapremini od 1 µL je injektovano u ispitno oko, dok je kontralateralno oko ostavljeno nelečeno kao dalja kontrola.

[0479] Miševi su eutanazirani 7. dana nakon što su laserski i horoidalni ravni nosači obojeni lektinom Griffonia Simplicifolia (GSA) za merenje površine lezije. Sl. 4 prikazuje rezultate. Grupa tretirana anti-IL-6 antitelima pokazala je statistički značajno smanjenje neovaskularizacije u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom antitelima (p<0,05). U proseku, grupa tretirana anti-IL-6 antitelima takođe je pokazala smanjenu neovaskularizaciju u poređenju sa pozitivnom kontrolom tretiranom anti-VEGF antitelima.

[0480] Ovi podaci pokazuju da IL-6a, npr. monoklonsko anti-IL-6 antitelo, primenjeno IVT injekcijom, može značajno smanjiti neovaskularizaciju u CNV modelu miša. Rezultati dalje ukazuju na to da anti-IL-6 antitelo može da proizvede smanjenje neovaskularizacije barem jednako veliko, a možda i veće, od anti-VEGF antitela. Ovi podaci ukazuju na to da je lokalna inhibicija IL-6 korisna za lečenje bolesti oka kao što su bolesti koje uključuju vaskularno curenje, npr. vlažni AMD ili makularni edem, npr. dijabetički makularni edem.

[0481] Primer 12: Razvoj poboljšanog IL-6 antitela

[0482] Generisane su varijante antitela EBI-029. Da bi se bolje okarakterisao doprinos mutacija A28V, S30P, I51T i S55G, specifične kombinacije su uvedene u vektor prikaza Fab EBI-029 divljeg tipa i izmereno je vezivanje. Rezultati su prikazani na sl. 5. Nakon noćne kompeticije sa 2 µM IL-6, svi mutanti su imali značajno veće nivoe biotinilisanog IL-6 koji su ostali na površini ćelije u odnosu na prikaz u poređenju sa Fab EBI-029 divljeg tipa. Redosled vezivanja od najvišeg do najnižeg afiniteta bio je A28V/S30P/I51T/S55G > A28V/I51T/S55G > S30P/I51T/S55G > I51T/S55G > wt. Četvorostruka mutacija A28V/S30P/I51T/S55G se ovde takođe naziva EBI-030.

[0483] Sekvence EBI-030 su prikazane u nastavku.

[0484] CDR sekvence 030:

[0487]

[0489] Sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 030 (mutacije u odnosu na 029 prikazane su podebljano):

[0492]

[0494] Sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 030:

[0497]

[0499] (SEQ ID NO:38)

[0500] Polipeptidna sekvenca teškog lanca 030 Fab (IgG1) (CDR-i su podvučeni, mutacije u odnosu na 029 prikazane su podebljano):

[0501]

[0503] U otelotvorenjima, DKTHT sekvenca (SEQ ID NO:30) na karboksi terminalnom kraju SEQ ID NO:39 nije uključena u Fab sekvencu.

[0504] Sekvenca nukleinske kiseline teškog lanca 030 Fab:

[0507]

[0509] (SEQ ID NO:40)

[0510] 030 se takođe može proizvesti kao polipeptidna sekvenca teškog lanca IgG2 Fab:

[0513]

[0515] (SEQ ID NO: 54)

[0516] Primer 13: Ekspresija i prečišćavanje varijanti Fab fragmenata

[0517] Umeci VH domena koji sadrže sledeće kombinacije mutanata, A28V/I51T/S55G, S30P/I51T/S55G i A28V/S30P/I51T/S55G (EBI-030), generisani su iz vektora prikaza kvasca dvostrukom digestijom sa BamHI-HF/NheI-HF. Umeci su prečišćeni elektroforezom na 1%-tnom agaroznom gelu i ligirani u vektor ekspresije sisara izveden iz pTT5 koji sadrži vodeću sekvencu, humani IgG1 CH1 domen i C-terminalnu His oznaku. Transformanti su izabrani na LB-Amp, miniprepirani, a umeci potvrđeni sekvenciranjem. Tranzijantne transfekcije su izvršene u HEK-6E ćelijama (Canadian Research Council) za svaki mutirani Fab teški lanac uparen sa lakim lancem divljeg tipa EBI-029 (ovde izložen kao SEQ ID NO:12) koristeći PEI kao reagens za transfekciju. Divlji tip Fab EBI-029 je takođe eksprimiran kao kontrola (divlji tip Fab teškog lanca je ovde izložen kao SEQ ID NO:24). Supernatanti su uzeti nakon 5 dana i eksprimirani Fab prečišćeni afinitetnom hromatografijom korišćenjem Ni-NTA agaroze (Life Technologies). Prečišćeni protein je puferski razmenjen u PBS-u, pH 7,4 u nekoliko ciklusa koncentracije/razblaživanja, pri čemu su koncentracija i čistoća proteina utvrđeni Apsorbancom 280 i SDS-PAGE.

[0518] Primer 14: Varijantna antitela pokazala su poboljšano vezivanje koje je procenjeno korišćenjem površinske plazmonske rezonance

[0519] Afiniteti Fab molekula varijante 029 za IL-6 mereni su površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) na Reichert SR7000Dc spektrometru. Humani IL-6 pri 20 µg/ml u 10 mM natrijum acetata, pH 4,5, imobilizovan je na karboksimetil dekstran čipu od 500 kDa putem standardnog aminskog spajanja. Serijska razblaženja svakog Fab molekula u 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,3, injektovana su na 25°C pri brzini protoka od 25 µL/min. Nakon 4 minuta, opterećenje je zaustavljeno i izmerena je disocijacija protočnim puferom (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,3) u trajanju od 5 minuta. Tragovi senzograma se slabo uklapaju u model vezivanja 1:1, potencijalno zbog mešovitih orijentacija IL-6 na čipu ili nespecifičnog vezivanja antitela. Umesto toga, krive su se uklapale u 2 vrste (vrste sa niskim i visokim afinitetom, označene kao „niski afinitet“ i „visoki afinitet“ u tabeli 3) koje se uklapaju korišćenjem softvera TraceDrawer gde su kal, kd1 i KD1 brzina asocijacije, brzina disocijacije i konstanta ravnotežnog vezivanja za vrste sa niskim afinitetom, a ka2, kd2 i KD2 su brzina asocijacije, brzina disocijacije i konstanta ravnotežnog vezivanja za vrste sa visokim afinitetom. Svi mutirani Fab imali su značajno sporiju disocijaciju u poređenju sa Fab EBI-029 divljeg tipa sa sledećim redosledom ranga od najvišeg do najnižeg afiniteta -A28V/S30P/I51T/S55G (EBI-030) > S30P/I51T/S55G > A28V/I51T/S55G > WT (EBI-029).

[0520] Tabela 3: SPR rezultati za mutirana antitela

[0522]

[0523]

[0524]

[0525] Nizak afinitet Visok afinitet

[0526] Primer 15: Varijantna antitela pokazala su poboljšanu antagonističku potentnost u HEK-Blue™ IL6 reporterskim ćelijama

[0527] HEK-Blue™ IL6 reporterska ćelijska linija (Invivogen) korišćena je za upoređivanje potentnosti inhibicije signalizacije IL6 između različitih mutiranih Fab fragmenata EBI-029. HEK-Blue™ IL6 ćelije su modifikovana HEK293 linija koja stabilno eksprimira IL-6R gen i sadrži izlučeni reporterski gen alkalne fosfataze pod kontrolom minimalnog promotera IFNꞵ spojenog na četiri STAT3 mesta vezivanja. Da bi se izmerio antagonizam IL6, 10 µL od 400 pM humanog IL-6 (R&D Systems 206-IL-010/CF) je pomešano sa 10 µL svake Fab varijante u nizu koncentracija na mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića i inkubirano na sobnoj temperaturi 30 minuta. HEK-Blue™ IL6 ćelije u log fazi su tripsinizovane i resuspendovane u medijumu za analizu (DMEM, 4,5 g/l glukoze, 10% toplotno inaktiviranog FBS-a, 2 mM L-glutamina, Pen-Step) na 280.000 ćelija/ml.180 µL ćelijske suspenzije je dodato u svaki bunarčić smeše IL-6/Fab da bi se konačna koncentracija IL-6 dovela na 20 pM. Ćelije su inkubirane na 37°C/5%-tnom CO<2>tokom 20 sati.20 µL supernatanta iz svakog bunarčića je zatim pomešano sa 180 µL Quanti-Blue™ reagensa (Invivogen) i inkubirano na 37°C tokom 40 minuta pre merenja apsorbancije na 650 nM na čitaču mikrotitarskih ploča SpectraMax M5. Pozadinski signal iz bunarčića bez IL-6 je oduzet, a zatim podeljen sa IL-6 tretiranim ćelijama bez inhibitora da bi se dobila frakciona signalna vrednost. Svi mutanti su pokazali značajno veću potentnost u poređenju sa Fab EBI-029 divljeg tipa sa redosledom antagonističke potentnosti na sledeći način:

[0528] A28V/S30P/I51T/S55G (EBI-030) > A28V/I51T/S55G > S30P/I51T/S55G > WT (EBI-029). Ovi rezultati su prikazani na sl.6.

[0529] Primer 16: Varijantna antitela pokazala su poboljšanu antagonističku potentnost u testu proliferacije T1165

[0530] Ćelije T1165.85.2.1 (R&D Systems) su ćelijska linija mišjeg plazmocitoma koja se proliferira kao odgovor na mišji, pacovski ili humani IL-6. Da bi se izmerio antagonizam EBI-029 Fab mutanata, 25 µL od 2 ng/ml humanog IL-6 (R&D Systems 206-IL-010/CF) je pomešano sa 25 µL svake Fab varijante u nizu koncentracija na mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića i inkubirano na sobnoj temperaturi 30 minuta. Ćelije T1165 u log fazi su peletirane i resuspendovane u medijumu za analizu (90% RPMI 1640, 10% FBS-a, 2 mM L-glutamin, Pen-Strep) na 2´105 ćelija/ml.50 µL ćelijske suspenzije je dodato u svaki bunarčić smeše IL 6/Fab da bi se konačna koncentracija IL-6 dovela na 0,5 ng/ml. Ćelije su inkubirane na 37oC/5%-tnom CO2 tokom 72 sata. 100 µL Cell-Titer Glo® reagensa (Promega) je dodato u svaki bunarčić i inkubirano na sobnoj temperaturi 10 minuta. Luminescencija je izmerena na čitaču mikrotitarskih ploča SpectraMax M5. Svi mutanti su pokazali značajno veću potentnost u poređenju sa Fab EBI-029 divljeg tipa bez merljive signalizacije IL-6 u nizu testiranih koncentracija Fab (videti sl. 7).

[0531] Primer 17: Poređenje svojstava varijantnih antitela sličnih lekovima Termička stabilnost svake varijante Fab određena je diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom (DSF). 2 µL proteina pri 2,5 ili 5 mg/ml pomešano je sa 18 µL PBS-a i 2 µL 50´ Sypro Orange na BioRad mikrotitarskoj ploči za PCR sa 96 bunarčića. Mikrotitarska ploča je pokrenuta u BioRad CFX96 RT-PCR sistemu sa linearnim porastom temperature od 25°C i 95°C i fluorescencijom merenom tokom vremena. T<m>je izračunat kao najniža tačka prvog izvoda krive topljenja. Sve varijante su imale izmerene vrednosti T<m>između 76 i 78°C, u skladu sa izmerenim T<m>Fab EBI-029 divljeg tipa na 76°C.

[0532] Da bi se izmerila agregacija, uzorci su procenjeni tehnikom SEC-MALS koristeći Agilent 1260 HPLC u kombinaciji sa Wyatt miniDawn TREOS instrumentom za rasipanje svetlosti i Wyatt Optilab rEX instrumentom za indeks refrakcije. Injektovano je 20 – 100 µg proteina i pokrenuto pri brzini protoka od 1 ml/min. Sve varijante su imale molekularne težine između 45000 i 52000 Da mereno rasipanjem svetlosti, u skladu sa Fab EBI-029 divljeg tipa.

[0533] Ovi rezultati ukazuju na to da se EBI-030 ponaša slično dobro u poređenju sa EBI-029 u pogledu svojstava sličnih lekovima.

[0534] Primer 18: Proizvodnja EBI-029 i EBI-030 IgG2 antitela pune dužine i IgG2 antitela sa mutiranim Fc domenima

[0535] Reformatiranje EBI-029 i EBI-030 u IgG2 i IgG2 mutiranog Fc

[0536] Varijabilni domeni teškog lanca EBI-029 i EBI-030, uključujući vodeću sekvencu ; SEQ ID NO:49) su PCR pojačani iz Fab vektora korišćenjem prajmera koji su uveli N-terminalno EcoRI mesto i C-terminalno Nhel mesto. PCR proizvodi su prečišćeni na 1%-tnom agaroznom gelu i dvostruko digestirani sa EcoRI-HF i NheI-HF. pTT5 osnovnim vektorima koji sadrže sekvencu teškog lanca IgG2 divljeg tipa ili varijantu IgG2 domena sa mutacijom H311A (H311 odgovara numeraciji u SEQ ID NO:41; ovo odgovara H310 u numeraciji predviđenoj u Martin et al., Molecular Cell, 7:4, 867-877 (2001)) su slično digestirani EcoRI-FH/NheI-HF i prečišćeni na 1%-tnom agaroznom gelu. Umeci su ligirani u digestiranu osnovu pomoću enzima Quikligase (New England Biolabs), transformisani u TOP10 ćelije (Life Technologies) i izabrani na LB-Amp. Klonovi su miniprepirani i sekvencirani za potvrđivanje umetka. Mutacija H311A je izabrana da smanji afinitet vezivanja Fc za FcRn kako bi se smanjila sistemska akumulacija molekula koji izlaze iz očnog tkiva.

[0537] Ekspresija i prečišćavanje IgG2 varijanti tranzijentnom transfekcijom

[0538] EBI-029 IgG2, EBI-029 IgG2-H311A, EBI-030 IgG2 i EBI-030 IgG2-H311A su ekspriimirani tranzijentnom transfekcijom u HEK-6E ćelijama. pTT5 vektori koji sadrže svaki teški lanac su ko-transfekovani sa EBI-029 LC plazmidom koristeći PEI kao reagens za transfekciju. Supernatanti su uzeti nakon 5 dana i eksprimirani molekuli IgG2 prečišćeni afinitetnom hromatografijom pomoću agaroze proteina-A. Prečišćeni protein je puferski razmenjen u PBS-u, pH 7,4 u nekoliko ciklusa koncentracije/razblaživanja, pri čemu su koncentracija i čistoća proteina utvrđeni Apsorbancom 280 i SDS-PAGE.

[0539] Stabilna proizvodnja CHO grupe

[0540] Stabilne CHO grupe koje proizvode EBI-029 IgG2, EBI-030 IgG2 ili EBI-030 IgG2-H311A generisani su korišćenjem kompleta Freedom CHO-S (Life Technologies) u skladu sa uputstvima proizvođača. Ukratko, svaki teški lanac je kloniran standardnom digestijom/ligacijom u pCHO 1.0 vektor u kombinaciji sa EBI-029 LC. Konstrukti su transfektovani u CHO-S ćelije koristeći Freestyle MAX reagens i stabilne grupe izabrane sa rastućim koncentracijama puromicina i MTX-a. Nakon dva kruga selekcije, grupe su pregledane za proizvodnju antitela analitičkom hromatografijom na proteinu A i izabrani su najviši proizvođači za skaliranje i subkloniranje.

[0541] Sekvence su predstavljene u nastavku.

[0542] Polipeptidna sekvenca teškog lanca 030 (u IgG2 okviru, CDR-i su podvučeni):

[0545]

[0547] (SEQ ID NO: 41)

[0548] Polipeptidna sekvenca lakog lanca 030 (u IgG2 okviru, CDR-i su podvučeni):

[0550] Sekvenca nukleinske kiseline teškog lanca 030:

[0551]

[0553] SEQ ID NO: 43

[0554] Sekvenca nukleinske kiseline lakog lanca 030:

[0555]

[0557] Polipeptidna sekvenca teškog lanca 030 sa mutacijom H311A (311a je podebljano i CDR-i su podvučeni), koja se ovde takođe naziva polipeptidna sekvenca teškog lanca 031:

[0559]

[0561] (SEQ ID NO:47)

[0562] Sekvenca nukleinske kiseline teškog lanca 031:

[0563]

[0565] (SEQ ID NO:48)

[0566] Primer 19: Poređenje potentnosti između EBI-030 i EBI-029 IgG2 u HEK-Blue-IL6 testu

[0567] HEK-Blue™ IL6 reporterska ćelijska linija (Invivogen) korišćena je za poređenje potentnosti inhibicije signalizacije IL6 između EBI-029 i EBI-030 IgG2 antitela. Upoređena su tri proteinska preparata prečišćena iz HEK-6E ćelija – EBI-029 IgG2, EBI-030 IgG2 i EBI-030 IgG2-H311A (takođe se nazivaju 031 ili EBI-031), zajedno sa preparatom EBI-030 IgG2 proizvedenim u stabilnoj CHO grupi. Pored toga, kao kontrola je uključen tocilizumab, odobreno anti-IL6R antitelo. Da bi se izmerio antagonizam IL6, humani IL-6 (R&D Systems 206-IL-010/CF) pri 400 pM pomešan je sa različitim koncentracijama svakog antitela na mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića i inkubiran na sobnoj temperaturi 30 minuta. HEK-Blue™ IL6 ćelije u log fazi su tripsinizovane i resuspendovane u medijumu za analizu (DMEM, 4,5 g/l glukoze, 10% toplotno inaktiviranog FBS-a, 2 mM L-glutamina, Pen-Step) na 280.000 ćelija/ml. 180 µL ćelijske suspenzije je dodato u svaki bunarčić smeše IL-6/Fab da bi se konačna koncentracija IL-6 dovela na 20 pM. Ćelije su inkubirane na 37°C/5%-tnom CO<2>tokom 20 sati.20 µL supernatanta iz svakog bunarčića je zatim pomešano sa 180 µL Quanti-BlueTM reagensa (Invivogen) i inkubirano na 37°C tokom 40 minuta pre merenja apsorbancije na 650 nM na čitaču mikrotitarskih ploča SpectraMax M5.

[0568] Rezultati su prikazani na sl.8 i u tabeli 5. EBI-030 (uključujući EBI-030 proizveden u HEK ćelijama sa ili bez mutacije H311A i EBI-030 proizveden u CHO ćelijama) pokazao je značajno poboljšanu potentnost (oko 50 puta smanjenje IC50 i >100 puta smanjenje IC90) u poređenju sa EBI-029. Povećanje potentnosti bilo je veće od povećanja afiniteta izmerenog SPR-om.

[0569] Tabela 5: Vrednosti IC50 i IC90

[0571]

[0573] EBI-031 (takođe se ovde naziva EBI-030 IgG2-H311A) imao je IC50 više od 75 puta manje od EBI-029 i IC90 oko 350 puta manje od EBI-029. EBI-030 proizveden u HEK ćelijama imao je IC50 više od 50 puta manje od EBI-029 i IC90 približno 4000 puta manje od EBI-029.

[0574] Primer 20: Analiza modeliranjem povećane potentnosti na trajanje blokade vitrealnog IL-6

[0575] Uticaj povećane potentnosti na obim i trajanje blokade IL-6 nakon intravitrealne primene simuliran je pomoću farmakokinetičkog modela (sl. 9). Diferencijalne jednačine koje opisuju promene slobodnog antitela (A), slobodnog IL-6 (IL) i kompleksa antitela/IL-6 (AIL) definisane su na sledeći način:

[0576] d/dt(A) = -A*kae – A*IL*k1 AIL*k2

[0577] d/dt(IL) = kpi – IL*kie – A*IL*k1 AIL*k2

[0578] d/dt(AIL) = -AIL*kaie A*IL*k1 – AIL*k2

[0579] gde je kae brzina klirensa slobodnog antitela iz staklastog tela, k1 je brzina asocijacije za vezivanje antitela/IL-6, k2 je brzina disocijacije za kompleks antitela/IL6, kpi je brzina proizvodnje IL-6, kei je brzina klirensa slobodnog IL-6 iz staklastog tela, a kaie je brzina klirensa kompleksa antitela/IL-6 iz staklastog tela. Početne vrednosti parametara i brzine definisane su kao što je prikazano u tabeli 6.

[0580] Tabela 6: Početne vrednosti parametara i brzine

[0583]

[0584]

[0586] A<0>je izračunat na osnovu pretpostavki doze od 50 µL od 50 mg/ml antitela u ljudsko oko sa zapreminom staklastog tela od 5 ml. IL<0>je procenjen na osnovu klinički izmerenih vrednosti za vitrealni IL-6 kod pacijenata sa DME od ~200 pg/ml. k1 je procenjen na osnovu tipičnih brzina asocijacije antitela od 1E5 M<-1>s<-1>, dok je k2 varirao da bi simulirao vrednosti potentnosti u opsegu od 100 pM do 1 pM. kae je izveden iz izmerenih vremena poluraspada vitrealnog klirensa kod zeca od ~ 11 dana skaliranih za 1,8 kao što je prethodno izmereno za ljudski PK. kie je procenjen na vreme poluraspada klirensa od 24 sata, a kpi je izračunat kao IL<0>*kie.

[0587] Simulacije slobodnog antitela i slobodnog IL-6 izvedene su pomoću softvera Berkeley Madonna tokom 300 dana (sl.10). Za merenje trajanja inhibicije izabrana je granična vrednost blokade IL-6 od 95%. Model predviđa da povećanje potentnosti antitela značajno produžava trajanje inhibicije IL-6 u oku sa 130 dana za k2/k1 = 100 pM na 200 dana za k2/k1 = 10 pM na 225 dana za k2/k1 = 1 pM.

[0588] Primer 21: Farmakokinetika IL-6a

[0589] Farmakokinetički (PK) eksperimenti su izvedeni na mužjacima novozelandskih belih zečeva od strane kompanije PharmOptima (Portage, MI). Sve životinje su bile starosti 12-13 meseci i bile su teške 2,61 – 3,42 kg. Upoređeni su sledeći proteini – EBI-029-IgG2 (SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:12), EBI-029-IgG2-H311A (SEQ ID NO:10 i SEQ ID NO:12), EBI-030 (SEQ ID NO:41 i SEQ ID NO:42), EBI-030-IgG2-H311A (SEQ ID NO:47 i SEQ ID NO:42), EBI-029 Fab (SEQ ID NO:24 i SEQ ID NO:12), Eylea® (VEGF blokada) i Tocilizumab (TCZ; anti-IL6R antitelo). Svi proteini su formulisani pri 13,8 mg/ml u PBS-u, pH 7,4. EBI-029-IgG2, EBI-029-IgG2-H311A, EBI-030, EBI-030-IgG2-H311A, EBI-029 Fab i Tocilizumab se ne vezuju za svoje ciljne antigene kod zeca, dok se Eylea® vezuje za zečji VEGF.

[0590] Za ispitivanje intravitrealne PK, 9 životinja je injektovano sa 50 pL ispitnog proizvoda u svako oko. Pre injektovanja, na površinu oka primenjen je lidokain hidrohlorid (2% za injekcije), 0,5% proparakain ili 0,5% tetrakain. Injekcije su izvedene u srednji deo staklastog tela pomoću insulinskog šprica BD 300 µL (31G x 5/16 inča igla) umetnutog kroz dorzotemporalni kvadrant oka. Za ispitivanje sistemske PK, 3 životinje su injektovane sa 100 µL ispitnog proizvoda kroz ušnu venu.

[0591] Serijski uzorci krvi su prikupljeni od 3 životinje u obe grupe, IVT i IV, nakon 0,083, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 240 i 336 sati i razblaženi 1:1 sa rastvorom citrata-fosfata-dekstroze i stavljeni na led. Plazma je uzeta centrifugiranjem ohlađenih uzoraka krvi na 4000 o/min u trajanju od 10 minuta na 4°C i čuvana zamrznuta na -80°C.

[0592] Očna tkiva su uzeta iz oba oka svih životinja u IVT grupi nakon 0,25, 24, 168 i 336 sati od doze. Životinje su eutanazirane intravenskim predoziranjem barbituratom. Za uzimanje očne vodice, odmah nakon eutanazije, ispod rožnjače je ubačen špric sa iglom i očna vodica se polako izvlačila. Očna vodica je prebačena u unapred označenu epruvetu i stavljena na suvi led ili zamrznuta na -80°C. Za uzimanje staklastog humora, uveden je mali rez skalpelom u beonjaču enukleiranog oka i staklasto telo je izvučeno kroz otvor putem šprica. Uzorak je meren preko graduacija na špricu, prebačen u unapred označenu epruvetu i stavljen na suvi led ili zamrznut na -80°C.

[0593] Za uzimanje mrežnjače i horoida uveden je mali rez skalpelom u beonjaču enukleiranog oka, paralelno i kaudalno sa limbusom. Makaze su korišćene za nastavak otvaranja oko jabučice oka, razdvajajući je na dve polovine. Zadnja strana jabučice je bila postavljena tako da je unutrašnjost bila okrenuta nagore. Koristeći nož za škrge, mrežnjača je pažljivo sakupljena iz jabučice. Kada je mrežnjača sakupljena iz jabučice, horoid je sakupljen na sličan način iz preostalog dela jabučice. Oba uzorka, odvojeno, prebačena su u prethodno izmerene i unapred označene Precellys® epruvete, izmerena i stavljena na suvi led ili zamrznuta na -80°C. Tkiva mrežnjače i horoida su desetostruko razblažena u fiziološkom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS), homogenizovana i čuvana na -80°C.

[0594] Koncentracije proteina u svakom tkivu procenjene su ELISA testom. Za EBI-029-IgG2, EBI-029-IgG2-H311A, EBI-030, EBI-030-IgG2-H311A i EBI-029 Fab, Costar mikrotitarske ploče sa pola zapremine obložene su sa 1 µg/ml humanog IL-6 u PBS-u tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Bunarčići su blokirani PBS-om koji sadrži 2% BSA, isprani, a zatim inkubirani sa nizom razblaživanja za svaki uzorak koristeći PBS 5% zečju plazmu 0,05% Tween-20 kao razblaživač. Na svakoj mikrotitarskoj ploči je takođe uključena standardna kriva koja koristi prečišćeni protein. Uzorci su inkubirani na sobnoj temperaturi 60 minuta, a zatim tri puta isprani sa 300 µl PBS-a koji sadrži 0,05% Tween-20. Anti-kapa-HRP (Genway Inc.) razblažen u odnosu 1:10.000 u PBS-u, 1% BSA, 0,05% Tween-20 je zatim dodat u svaki bunarčić i inkubiran 30 minuta. Bunarčići su isprani kao što je gorenavedeno, zatim je dodat supstrat 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) i signal je izmeren na 450 i 550 nm na čitaču mikrotitarskih ploča Spectramax. Koncentracije proteina su izračunate na osnovu standardne krive pomoću softvera Softmax Pro 6. Svaki ELISA test je ponovljen na najmanje 3 nezavisne mikrotitarske ploče i zabeleženo je prosečno vreme poluraspada.

[0595] Za tocilizumab, koncentracije proteina su određene ELISA testom kao što je gore navedeno, osim što je kao reagens za hvatanje korišćen anti-Tocilizumab Fab (BioRad HCA252), a kao antitelo za detekciju korišćen je anti-humani-IgG-Fc-HRP (Sigma A0170). Za merenje slobodnog i ukupnog Eylea® korišćena su dva različita ELISA testa. Za slobodni Eylea®, bunarčići su obloženi rekombinantnim VEGF (R&D Systems) i vezani protein je detektovan sa anti-humanim-IgG-Fc-HRP (Sigma A0170). Za merenje ukupnog Eylea®, za hvatanje je korišćeno anti-humano Fc antitelo (Sigma I2136), a za detekciju je korišćen antihumani IgG-CH2-HRP (BioRad MCA647P). Svaki ELISA test je ponovljen na najmanje 3 nezavisne mikrotitarske ploče i zabeleženo je prosečno vreme poluraspada.

[0596] Sažetak rezultata

[0597] Kod većine životinja, robusno formiranje antitela na injektovani protein primećeno je u vremenskim tačkama nakon 240 i 336 sati. Pošto ovo formiranje antitela može uticati na klirens proteina ili ometati ELISA test, analiza podataka je bila ograničena na vremenske tačke do i uključujući 168 sati. Za intravitrealnu farmakokinetiku, svi IgG2 proteini EBI-029 i EBI-030 su uklonjeni značajno sporije (T<1/2>= 9,3, 9,0, 15,7 i 9,8 dana za EBI-029, EBI-029-H311A, EBI-030 i EBI-030-H311A, respektivno) u poređenju sa Eylea® (T<1/2>= 6,3 dana), Tocilizumabom (T<1/2>= 4,8 dana) ili Fab fragmentom EBI-029 (T<1/2>= 3,9 dana) (sl.11, tabela 7). Slični trendovi su primećeni u mrežnjači, horoidu i vodenoj sredini gde su se EBI-030 i EBI-030-H311A akumulirali na višim nivoima u poređenju sa Eylea® i tocilizumabom (videti sl. 12 i sl.13).

[0598] Svi proteini su detektovani u plazmi nakon IVT primene sa EBI-029, EBI-030 i tocilizumabom koji se akumuliraju na značajno višim nivoima od Eylea® ili EBI-030-H311A (videti sl. 14). Slično tome, Eylea® i EBI-030-H311A su brže očišćeni iz plazme nakon intravenske primene, pri čemu je vreme poluživota EBI-030-H311A približno upola manje od vremena poluživota divljeg tipa IgG2 zbog smanjenog vezivanja za FcRn (tabela 7).

[0599] Tabela 7: Rezultati farmakokinetike

[0600] PK staklastog tela

[0601] Molekul T<1/2>(dana)

[0602] EBI-029 9,3

[0603] EBI-029-H311A 9,0

[0604] EBI-030 15,7

[0605] EBI-030-H311A 9,8

[0606] EBI-029 Fab 3,9

[0607] 6,1 (slobodan), 6,3

[0608] Eylea®

[0609] (ukupno)

[0610] Tocilizumab 4,8

[0612] Sistemska PK nakon intravenske primene

[0613] Molekul T<1/2ꞵ>(sati)

[0614] EBI-029 77

[0615] EBI-030 69

[0616] EBI-030-H311A 33

[0617] Eylea® 37 (slobodan), 42 (ukupno)

[0618] TCZ 50

[0619] Primer 22: Rastvorljivost EBI-031 pri visokim koncentracijama

[0620] Prečišćeni EBI-031 je koncentrovan od 3 mg/ml do 142 mg/ml u PBS-u, pH 7,4, korišćenjem Amikon Ultra-15 centrifugalnog koncentratora. Preparati pre i posle koncentracije procenjeni su za agregaciju pokretanjem na koloni Tosoh G3000SWXL 7,8x30 SEC u kombinaciji sa Wyatt miniDawn TREOS instrumentom za rasipanje svetlosti i Wyatt Optilab rEX instrumentom za indeks refrakcije. Injektovano je 20 µg proteina i pokrenuto pri brzini protoka od 1 ml/min u PBS-u. Maseni udeo za pik pri očekivanoj molekulskoj težini od ~ 150 kDa bio je približno jednak za dve koncentracije (90,9% za 3 mg/ml i 91,3% za pripremu 142 mg/ml), što ukazuje da nije bilo značajnog povećanja agregacije proteina tokom koncentracije. Ovi rezultati pokazuju da se EBI-031 može koncentrisati do 142 mg/ml sa malo merljivom agregacijom (<10% agregacije).

[0621] Primer 23: EBI-031 blokira cis- i trans- signalizaciju IL6

[0622] HEK-Blue™ IL6 reporterska ćelijska linija (Invivogen) korišćena je za poređenje potentnosti EBI-031 i tocilizumaba za blokiranje cis- i trans- signalizacije IL6. Za cissignalizaciju, slobodni IL-6 (konačne koncentracije = 20 pM) je pomešan sa EBI-031 ili tocilizumabom u nizu koncentracija na mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića i inkubiran na sobnoj temperaturi 30 minuta. HEK-Blue™ IL6 ćelije u log fazi su tripsinizovane i resuspendovane u medijumu za analizu (DMEM, 4,5 g/l glukoze, 10% toplotno inaktiviranog FBS-a, 2 mM L-glutamina, Pen-Step), pri čemu je 50.000 ćelija dodato u svaki bunarčić u konačnoj zapremini od 200 pL. Mikrotitarske ploče su inkubirane na 37°C/5%-tnom CO<2>tokom 20 sati.50 µL supernatanta iz svakog bunarčića je zatim pomešano sa 150 µL Quanti-Blue™ reagensa (Invivogen) i inkubirano na 37°C tokom 40 minuta pre merenja apsorbancije na 650 nM na čitaču mikrotitarskih ploča SpectraMax M5. Pozadinski signal iz bunarčića bez IL-6 je oduzet, a zatim podeljen sa IL-6 tretiranim ćelijama bez inhibitora da bi se dobila frakciona signalna vrednost. EBI-031 (IC50 = 14,2 pM) blokira slobodni IL-6 sa >900 puta većom potentnošću u poređenju sa tocilizumabom (IC50 = 12,9 nM) (sl.16A).

[0623] Da bi se izmerila blokada trans-signalizacije, eksperimenti su izvedeni kao što je gore navedeno, osim korišćenja hiper IL-6 u konačnoj koncentraciji od 200 pM umesto slobodnog IL-6. Hiper IL-6 je genetska fuzija između IL-6 i rastvorljivog IL-6 receptora (Fischer et al., Nature Biotechnology 15:142-145 (1997). EBI-031 je potentno blokirao hiper IL-6 (IC50 = 32 pM), dok tocilizumab nije bio u stanju da značajno inhibira signalizaciju do koncentracije od 1 µM (sl.16B).

[0624] Ovi rezultati pokazuju da EBI-031 vezuje humani IL-6 na mestu II, ili mestu koje kontaktira gp130, sa pM afinitetom i blokira signalizaciju IL-6 i kompleksa IL-6/sIL-6Rα u ćelijskim testovima >900 puta potentnije od tocilizumaba.

[0625] Primer 24: Računske simulacije za suzbijanje signalizacije IL-6 intravitrealnog EBI-031

[0626] Računarske simulacije su izvršene kao što je opisano u primeru 20 da bi se predvidelo koliko dugo intravitrealna primena EBI-031 kod ljudi treba da suzbije 95% signalizacije IL-6. k2 je podešen na 0,12 d-1 tako da k2/k1 = 14 pM kao što je izmereno u testu potentnosti. T1/2 klirensa je podešen na 18 dana na osnovu izmerenog vremena poluživota intravitrealnog klirensa kod zečeva skaliranog za 1,8 za ljude. Svi ostali parametri su opisani u tabeli 6. Model predviđa da bi EBI-031 trebalo da blokira 95% signalizacije IL-6 tokom ~ 150 dana nakon intravitrealne primene (sl. 17). Ovi rezultati modeliranja ukazuju na to da EBI-031 može značajno blokirati signalizaciju IL-6 u oku tokom dužeg vremenskog perioda, npr. do oko 6 meseci.

[0627] Primer 25: Karakterizacija izoformi EBI-031

[0628] EBI-031 je IgG2 antitelo. Kao što je ranije razmotreno, IgG2 antitela postoje u tri različite strukturne izoforme, IgG2-A, IgG2-B i IgG2-A/B izoforme (sl. 18). U ovom primeru izvršeni su eksperimenti za identifikaciju strukturnih izoformi u uzorcima EBI-031.

[0629] RP-HPLC analiza

[0630] Tečni hromatograf visokih performansi sa reverznom fazom (RP-HPLC) korišćen je za razdvajanje različitih strukturnih izoformi EBI-031. Poboljšana analitička RP-HPLC metoda koja je prethodno korišćena za razdvajanje strukturnih izoformi posredovanih disulfidom IgG2 (videti, Dillon et al., Journal of Chromatography A, 2006, 1120:112-120) optimizovan je za razdvajanje EBI-031.

[0631] Uzorci EBI-031 koji sadrže približno 30 µg ubačeni su na kolonu Zorbax 300SB-C8 (150 mm ´ 2,1 mm; 5,0 µm; 300 Å). Temperatura kolone je podešena na 75°C. Mobilna faza A bila je voda koja sadrži 0,1% TFA, a mobilna faza B bila je 55% IPA, 40% ACN, 4,9% vode i 0,1% TFA. Brzina protoka bila je 0,5 mL/min. Kolona je inicijalno ekvilibrisana sa 90% mobilne faze A i 10% mobilne faze B tokom 2 min, nakon čega je usledio 2-minutni postepeni gradijent od 10 do 25% B. Elucija je postignuta sa linearnim gradijentom od 25–32% B tokom 21 min. UV apsorbancija je praćena na 214 nm i/ili 280 nm.

[0632] Da bi se utvrdilo da li je razdvajanje povezano sa disulfidom, uzorci su tretirani sa 5 mM DTT i 10 mM cisteinom na sobnoj temperaturi tokom 2 min, a zatim analizirani RP-HPLC metodom (slika 19). Lečenje DTT-om, koji je potentno redukujuće sredstvo, uzrokuje smanjenje IgG2 antitela, što rezultira eluiranjem u rane pikove (Pik 0 i Pik 1) (slika 19, srednji panel). Tretman cisteinom, koji je blaže redukujuće sredstvo u poređenju sa DTT, pomera i distribuciju izoforme prema ranim pikovima (Pik 0 i Pik 1), mada ne u meri u kojoj se vidi kod uzorka tretiranog DTT-om (slika 19, donji panel).

[0633] Podaci pokazuju da je RP-HPLC metoda razdvojila strukturne izoforme sa različitom disulfidnom povezanošću. Različite strukture disulfidnog vezivanja potvrđene su neredukovanim mapiranjem peptida i analizom masene spektrometrije: rani pik eluiranja (Pik 1) sadrži izoformu IgG2-A/B, a kasni pik eluiranja (Pik 2) sadrži izoformu IgG2-A. Važno je da u uzorku EBI-031 nije otkrivena B izoforma IgG2-B (Pik 0) (slika 19, gornji panel).

[0634] Poređenje različitih uzoraka EBI-031

[0635] Koristeći gore opisanu RP-HPLC analizu, uzorci EBI-031 prikupljeni iz različitih ćelijskih linija koje eksprimiraju EBI-031 analizirani su kako bi se uporedila distribucija izoforme proizvedenih antitela. Uzorci EBI-031 su prikupljeni iz kulture skale od 200L klonske ćelijske linije, kulture skale od 10L iz matične ćelijske linije i stabilno transfektovane grupe ćelija. EBI-031 je prečišćen metodom hromatografije u tri koraka iz klonskih i matičnih ćelijskih linija koje eksprimiraju EBI-031. EBI-031 je prečišćen iz stabilno transficirane grupe ćelija korišćenjem prečišćavanja proteinom A. Uzorci su analizirani gore opisanim metodama.

[0636] Rezultati prikazani na slici 20 pokazuju da su sva tri uzorka EBI-031 sadržala izoforme IgG2-A i IgG2-A/B, ali ne i značajnu količinu IgG2-B. Ovi podaci pokazuju da se IgG2 antitelo EBI-031 proizvodi u manje heterogenoj smeši od drugih IgG2 antitela, bilo da je proizvodnja iz klonske ćelijske linije koja eksprimira EBI-031, matične ćelijske linije koja eksprimira EBI-031 ili iz heterogene ćelijske populacije koja stabilno eksprimira EBI-031. Slika 21 prikazuje raspodelu izoformi iz uzorka EBI-031 iz kulture skale 200L klonske ćelijske linije koja eksprimira EBI-031, npr. gornji panel na slici 20. Izmerene su i površine ispod kriva, a raspodele među izoformama prikazane su u tabeli ispod slike.

[0637] Primer 26: Farmakokinetika u ispitivanjima na primatima

[0638] Farmakokinetika EBI-031 je istražena u ispitivanjima na primatima. Testirana su dva mužjaka afričkih zelenih majmuna. U oko je intravitrealno injektovano 50 µl 50 mg/mL EBI-031. Za uklapanje u krivu korišćen je softver Madonna.

[0639] Podaci iz ispitivanja na primatima su modelirani korišćenjem uklapanja u krivu. Diferencijalne jednačine koje opisuju promene antitela u staklastom telu (A) i antitela izvan staklastog tela, npr. sistemske, (Ap) definisane su na sledeći način:

[0640] d/dt(A) = -A*kae

[0641] d/dt(Ap) = A*kae(Dil) – Ap*kape

[0642] Početne vrednosti parametara i brzine definisane su kao što je prikazano u tabeli ispod: Tabela 8: Početne vrednosti parametara i brzine

[0644]

[0646] Druga razmatranja uključena za uklapanje uključuju: razblaživanje i obe konstante brzine su korišćene za uklapanje. Početni A je bio konstantan (2x50ml 50 mg/mL u 5 mL oka). Rezultati modeliranja kao što je prikazano na sl. 22A, 22B i 23 pokazali su da su konstante brzine eliminacije iz staklastog tela rezultirale poluživotom od 4,6 i 5,7 dana, respektivno za dva majmuna. Izračunato je da je prosečna konstanta brzine eliminacije iz staklastog tela 5,2 dana. Sistemska eliminacija je modelirana kao 1,1 dan, odnosno 0,63 dana (prosečno 0,85 dana). Ovi rezultati pokazuju da je poluživot EBI-031 u staklastom telu bilo značajno duže od sistemskog poluživota kod primata.

[0647] Primer 27: Farmakokinetika EBI-031

[0648] Izvršen je još jedan farmakokinetički (PK) eksperiment, gde je intravitrealno injektovano 50 µl rastvora EBI-031 od 20 mg/mL u oči zečeva. Ispitane vremenske tačke bile su 1, 3, 7 i 14 dana (npr.24, 72, 168 i 336 sati). Za svaku vremensku tačku analizirane su dve životinje (četiri oka). Metode za primenu formulacije EBI-031, uzimanje očnog tkiva i određivanje koncentracije proteina izvršene su kao što je opisano u primeru 21.

[0649] Rezultati su prikazani na slikama 24A-24I. Prilikom analize koncentracije proteina za dane 1-14 u staklastom humoru, utvrđeno je da je poluživot EBI-031 iznosio 8,95 dana (sl.

[0650] 24A). Međutim, snažan odgovor antitela otkriven je 14. dana, što može uticati na ove rezultate. Prilikom analize koncentracije proteina za dane 1-7 u staklastom humoru, utvrđeno je da je poluživot EBI-031 iznosio 18,88 dana.

[0651] EBI-031 je detektovan i u drugim delovima oka nakon intravitrealne injekcije. EBI-031 je takođe prodro u vodeni humor (sl. 24B), horoid (sl. 24C), konjunktivu (sl. 24D), rožnjaču (sl. 24e), cilijarno telo (sl. 24F), sočivo (sl. 24G), mrežnjaču (sl. 24H) i beonjaču (sl. 24I). Koncentracija leka u ovim tkivima bila je jedan do dva reda veličine niža od koncentracija otkrivenih u staklastom telu.

[0652] Ostala otelotvorenja su u okviru sledećih patentnih zahteva.

Claims

1. PATENTNI ZAHTEVI

1. Anti-IL6 antitelo koje sadrži

(a) CDR1 teškog lanca koji sadrži sekvencu

(SEQ ID NO:31), (b) CDR2 teškog lanca koji sadrži sekvencu

(SEQ ID NO:32), (c) CDR3 teškog lanca koji sadrži sekvencu

(SEQ ID NO:33), (d) CDR1 lakog lanca koji sadrži sekvencu

(SEQ ID NO:34), (e) CDR2 lakog lanca koji sadrži sekvencu

(SEQ ID NO: 35), i

(f) CDR3 lakog lanca koji sadrži sekvencu

(SEQ ID NO:36).

2. Anti-IL6 antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:37 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:38, osim što anti-IL6 antitelo ima ukupno 1, 2 ili 3 mutacije, i pri čemu varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinske sekvence

(SEQ ID NO:33) i pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinske sekvence

NO:36).

3. Anti-IL6 antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:41 i sekvencu lakog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:42, osim što antitelo sadrži ukupno 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija u odnosu na SEQ ID NO:41 i/ili SEQ ID NO:42, i pri čemu varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvence

(SEQ ID pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinske sekvence

(SEQ ID

4. Anti-IL6 antitelo prema zahtevu 2, pri čemu 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija smanjuju vezivanje za FcRn.

5. Anti-IL6 antitelo prema zahtevu 2, pri čemu je jedna ili više mutacija na jednom ili više položaja koje odgovaraju H311, D313, I254 ili H436 (numeracija kao u SEQ ID NO:41).

6. Anti-IL6 antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:47 i sekvencu lakog lanca koja je identična sa SEQ ID NO:42, osim što anti-IL6 antitelo sadrži ukupno 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija u odnosu na SEQ ID NO:47 i/ili SEQ ID NO:42 i sadrži aminokiselinske sekvence CDR teškog lanca

(SEQ ID NO:32) i

(SEQ ID NO:33) i aminokiselinske sekvence CDR lakog lanca

(SEQ ID NO:36).

7. Kompozicija koja sadrži anti-IL6 antitelo prema bilo kom od zahteva 1-6 i, opciono, farmaceutski prihvatljiv nosač.

8. Kompozicija prema zahtevu 7, pri čemu kompozicija sadrži najmanje 60, 70, 80, 90, 95 ili 99% izotropi lgG2-A ili lgG2-A/B anti-IL6 antitela, ili njihovu kombinaciju.

9. Kompozicija prema zahtevu 7 ili 8, pri čemu kompozicija sadrži manje od 10%, 5%, 2%, 1% ili 0,5% izotropi lgG2-B anti-IL6 antitela.

10. Anti-IL6 antitelo prema bilo kom od zahteva 1-6 ili kompozicija prema bilo kom od zahteva 6-9, za upotrebu u lečenju bolesti oka koju karakteriše povišen nivo IL-6.

11. Anti-IL6 antitelo prema bilo kom od zahteva 1-6 ili kompozicija prema bilo kom od zahteva 6-9 za upotrebu u lečenju dijabetičkog makularnog edema (DME), dijabetičke retinopatije, sindrom suvog oka (npr. bolesti suvog oka ili sindroma suvog oka), uveitisa, alergijskog konjunktivitisa, starosne degeneracije makule (AMD), proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR), regmatogenog odvajanja mrežnjače (RRD), okluzije retinalne vene (RVO), optičkog neuromijelitisa (NMO), transplantacije rožnjače, abrazije rožnjače ili fizičke povrede oka.

12. Nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira anti-IL6 antitelo prema bilo kom od zahteva 1-6.

13. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 12.

14. Ćelija koja sadrži vektor prema zahtevu 13.