ES3051832T3

ES3051832T3 - Improved il-6 antibodies

Info

Publication number: ES3051832T3
Application number: ES23189385T
Authority: ES
Inventors: Michael March Schmidt; Alison Tisdale; Eric Steven Furfine; Grigorios Zarbis-Papastoitsis
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-11-07
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2025-12-30
Anticipated expiration: 2035-11-06
Also published as: SI3215530T1; CA2965689C; CL2017001135A1; BR112017008672A2; KR102636726B1; KR102770849B1; FI4268843T3; MA62787B1; EP4268843B1; MX385206B; AU2015342882B2; ES2756275T9; DK3215530T3; EA035199B1; EP4268843A2; AU2015342882A1; US20220169719A1; PL4268843T3; PH12017500809A1; MX2021008663A

Abstract

Se proporcionan anticuerpos mejorados contra IL-6. Se describen sus usos en el tratamiento de enfermedades relacionadas con IL-6, como enfermedades oculares como el edema macular diabético. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCION

[0002] Anticuerpos frente a IL-6 mejorados

[0003] Solicitudes relacionadas

[0004] La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de EE. UU. n.° 62/077.105, presentada el 7 de noviembre de 2014; la solicitud provisional de EE. UU. n.° 62/087.448, presentada el 4 de diciembre de 2014; y la solicitud provisional de EE. UU. n.° 62/247.705, presentada el 28 de octubre de 2015.

[0005] Campo de la invención

[0006] El campo de la invención se refiere a IL-6. Más en particular, el campo se refiere a moduladores de IL-6 y sus usos en el tratamiento de enfermedades tales como enfermedades del ojo.

[0007] Antecedentes

[0008] IL-6 es una citocina pleótropa con papeles informados en inflamación, hematopoyesis, angiogénesis, diferenciación celular y supervivencia neuronal. La presente invención se refiere a anticuerpos frente a IL-6 mejorados y usos de los mismos. Los documentos WO 2014/074905, WO 2007/076927, WO 2008/144763, Kalai (1997) Europ J Biochem 249, 690-700, Finch (2011) J Mol Biol 411, 791-807 y WO 2004/045507 divulgan anticuerpos anti-IL-6 y su uso terapéutico. Los documentos US 6277375 B1, Rudikoff (1982), PNAS 79, 1979-1983, Winkler (2000), J Immunol 165, 4505-4514, Chien (1989) PNAS 86, 5532-5536 y Panka (1993) Mol Immunol 30, 1013-1020 describen la generación y modificación de anticuerpos.

[0009] Sumario

[0010] La divulgación se refiere a anticuerpos frente a IL-6 y fragmentos (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno) o derivados de los mismos, así como ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos frente a IL-6 y fragmentos. La divulgación también se refiere a usos de dichos anticuerpos, fragmentos o derivados. Los anticuerpos y fragmentos o derivados de los mismos se pueden usar, por ejemplo, en el tratamiento de una enfermedad asociada a IL-6. En modos de realización, el anticuerpo, fragmento o derivado del mismo se puede unir (por ejemplo, unir específicamente) a una IL-6, por ejemplo, a una IL-6 humana. En modos de realización, el anticuerpo, fragmento o derivado del mismo se puede unir (por ejemplo, unir específicamente) al sitio II de una IL-6 (por ejemplo, sitio II de IL-6 humana).

[0011] En un aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-l L6 que comprende

[0012] (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia GYVLPNYLIE (SEQ ID NO:31),

[0013] (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia VTTPGGGTIN (SEQ ID NO:32),

[0014] (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia SRWDPLYYYALEY (SEQ ID NO:33), (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia RASES VDNYGIPFMN (SEQ ID NO:34), (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia AASNRGS (SEQ ID NO:35), y

[0015] (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia QQSEEVPLT (SEQ ID NO:36).

[0016] En un aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-IL6 que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:37 y una región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO:38, excepto que el anticuerpo anti-IL6 tiene un total de 1, 2 o 3 mutaciones, y en el que la región variable de la cadena pesada comprende las secuencias de aminoácidos GYVLPNYLIE (SEQ ID NO:31), VTTPGGGTIN (SEQ ID NO:32) y SRWDPLYYYALEY (SEQ ID NO:33) y en el que la región variable de la cadena ligera comprende las secuencias de aminoácidos RASES VDN YGI PFMN (SEQ ID NO:34), AASNRGS (SEQ ID NO:35) y QQSEEVPLT (SEQ ID NO:36).

[0017] En un aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-IL6 que comprende una secuencia de la cadena pesada que es idéntica a SEQ ID NO:41 y una secuencia de la cadena ligera que es idéntica a SEQ ID NO:42, excepto que el anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones totales con respecto a SEQ ID NO:41 y/o SEQ ID NO:42, y en el que la región variable de la cadena pesada comprende las secuencias de aminoácidos GYVLPNYLIE (SEQ ID NO:31), VTTPGGGTIN (SEQ ID NO:32) y SRWDPLYYYALEY (SEQ ID NO:33) y en el que la región variable de la cadena ligera comprende las secuencias de aminoácidos RASESVDNYGIPFMN (SEQ ID NO:34), AASNRGS (SEQ ID NO:35) y QQSEEVPLT (SEQ ID NO:36).

[0018] En un aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-IL6 que comprende una secuencia de la cadena pesada que es idéntica a SEQ ID NO:47 y una secuencia de la cadena ligera que es idéntica a SEQ ID NO:42, excepto que el anticuerpo anti-IL6 comprende 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones totales con respecto a SEQ ID 5 NO:47 y/o SEQ ID NO: 42 y comprende las secuencias de aminoácidos de la CDR de la cadena pesada GYVLPNYLLE (SEQ ID NO:31), VTTPGGGTIN (SEQ ID NO:32) y SRWDPL YYY ALEY (SEQ ID NO:33) y las secuencias de aminoácidos de la CDR de la cadena ligera RASES VDNYGIPFMN (SEQ ID NO:34) AASNRGS (SEQ ID NO:35) y QQSEEVPLT (SEQ ID NO:36).

[0020] 10En un aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende el anticuerpo anti-IL6 y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable, así como al anticuerpo o a la composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad ocular caracterizada por un nivel elevado de IL-6 y/o para su uso en el tratamiento de uno de edema macular diabético (EMD), retinopatía diabética, sequedad ocular (por ejemplo, xeroftalmia o síndrome de ojos secos), conjuntivitis alérgica, uveítis, degeneración macular senil (DMS), retinopatía diabética proliferativa (RDP), desprendimiento de retina regmatógeno (DRR), obstrucción de la vena retiniana (OVR), neuromielitis óptica (NMO), trasplante de córnea, abrasión corneal o lesión física en el ojo.

[0022] En un aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el anticuerpo anti-IL6, un vector que comprende el ácido nucleico y/o una célula que comprende el vector.

[0024] En modos de realización, la CDR3 VH comprende la secuencia de SEQ ID NO:33.

[0026] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene afinidad incrementada por IL-6 humana y/o potencia incrementada. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene afinidad incrementada por IL-6 humana y/o potencia incrementada en comparación con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno idéntico de otro modo) que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende (i) una CDR1 VH que comprende la secuencia de GYX<1>LX<2>NYLIE (SEQ ID NO:45), (ii) una CDR2 VH que comprende la secuencia de VX3TPGX4GTIN (SEQ ID NO:46) y (ii) una CDR3 VH, en el que uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 o todos) de lo siguiente es cierto: X<1>es A, X<2>es S, X3 es I y X<4>es S.

[0028] El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una CDR1 VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:31, una CDR2 VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:32 y, opcionalmente, una CDR3 VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:33.

[0030] En modos de realización, la región variable de la cadena pesada difiere en no más de 3, 2 o 1 aminoácidos de SEQ ID NO:37. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:37. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que consiste en SEQ ID NO:37.

[0032] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia que es al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a SEQ ID NO:39. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia que difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos de SEQ ID NO:39. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende SEQ ID NO:39. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un Fab.

[0034] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia que es al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a SEQ ID NO:54. En modos de realización, el anticuerpo 50 o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia que difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos de SEQ ID NO:54. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende SEQ ID NO:54. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un Fab.

[0036] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un scFv. En modos de realización, el 55 anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende o consiste en la secuencia de scFv

[0039]

[0040]

[0043] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia que es al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a SEQ ID NO:52 o SEQ ID NO:53. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende SEQ ID NO:52 o SEQ ID NO:53. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un scFv.

[0045] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia de la cadena pesada que difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos de SEQ ID NO:41. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:41. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia de la cadena pesada que consiste en SEQ ID NO:41.

[0047] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene afinidad incrementada por IL-6 humana y/o potencia incrementada en comparación con EBI-029 o un fragmento del mismo. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene afinidad incrementada por IL-6 humana y/o potencia incrementada en comparación con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende una CDR1 VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:4, una CDR2 VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:5 y, opcionalmente, una CDR3 VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:6. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene afinidad incrementada por IL-6 humana y/o potencia incrementada en comparación con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende o que consiste en SEQ ID NO:17. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene afinidad incrementada por IL-6 humana y/o potencia incrementada en comparación con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende SEQ ID NO:24. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene afinidad incrementada por IL-6 humana y/o potencia incrementada en comparación con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende una secuencia de la cadena pesada que comprende o que consiste en SEQ ID NO:11.

[0049] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende secuencias de EBI-030 o EBI-031 como se proporciona en la tabla 4. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende dominios de EBI-030 o EBI-031 como se muestra en la fig.15 (por ejemplo, uno o más de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4, CH1, bisagra, CH<2>y CH3 de la secuencia de la cadena pesada y/o FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 y CK de la secuencia de la cadena ligera). En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una cadena pesada y una cadena ligera. En modos de realización, las cadenas pesada y ligera se enlazan por uno o más enlaces disulfuro. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un Fab. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un scFv. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es Fab, Fab', F(ab')<2>, scFv o fragmento Fv.

[0051] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene afinidad incrementada por IL-6 humana y/o potencia incrementada en comparación con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende una o más secuencias correspondientes de EBI-029, o secuencias de un anticuerpo descrito en el documento WO2014/074905. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene afinidad incrementada por IL-6 humana y/o potencia incrementada en comparación con tocilizumab.

[0052] Tabla 4: sumario general de secuencias de EBI-029, EBI-030 y EBI-031

[0053]

[0054]

[0055]

[0057] aa= aminoácido; na= ácido nucleico; HC= cadena pesada; LC= cadena ligera; VH= región variable de la cadena pesada;

[0058] VL= región variable de la cadena ligera

[0059] La afinidad incrementada y/o potencia incrementada se pueden evaluar usando procedimientos descritos en el presente documento y/o procedimientos conocidos en la técnica.

[0060] En modos de realización, la afinidad se evalúa usando resonancia de plasmón superficial (RPS).

[0061] En modos de realización, la afinidad se incrementa en al menos 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3 o 4 veces.

[0062] En modos de realización, la potencia se incrementa. En modos de realización, la potencia se incrementa como se indica por una disminución en la CI50 y/o una disminución en la CI90. En modos de realización, la CI50 disminuye en al menos 5, 10, 20, 30, 40 o 50 veces. En modos de realización, la CI50 disminuye en al menos aproximadamente 50 veces. En modos de realización, la CI90 disminuye en al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 o 500 veces. En modos de realización, la CI90 disminuye en al menos aproximadamente 100 veces.

[0063] En modos de realización, la potencia se evalúa, por ejemplo, usando un ensayo HEK-Blue™ o un ensayo de proliferación de T1165.

[0064] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inhibe la señalización cis-IL-6, por ejemplo, como se evalúa en base al valor CI50 o CI90 obtenido usando un ensayo HEK-Blue™ descrito en el presente documento, por ejemplo, con IL-6 libre 20 μM.

[0065] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene una CI50 de menos de 47 μM y/o una CI90 de menos de 4350 μM. En modos de realización, la CI50 es menor que 47 μM, por ejemplo, menor que 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 μM. En modos de realización, la CI90 es menor que 4350 μM, por ejemplo, menor que 4000, 2000, 1000, 100, 50, 40, 30, 20, 15, 10 o 5 μM. En modos de realización, la CI50 y/o CI90 se evalúa en un ensayo HEK-Blue™ con IL-620 μM.

[0066] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno bloquea la IL-6 libre con mayor potencia en comparación con tocilizumab, por ejemplo, como se evalúa en base a los valores de CI50 obtenidos usando un ensayo HEK-Blue™ con IL-620 μM. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inhibe IL-6 con potencia de más de 900 veces mayor en comparación con tocilizumab. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es EBI-031 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene una CI50 de menos de 15 μM, por ejemplo, una CI50 de 14,2 μM, para la inhibición de IL-6.

[0067] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno bloquea la señalización de trans-IL-6, por ejemplo, como se evalúa usando un ensayo HEK-Blue™ descrito en el presente documento, por ejemplo, con hiper-IL-6200 μM. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inhibe la señalización por hiper-IL-6. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inhibe la señalización por hiper-IL-6 con mayor potencia que tocilizumab, por ejemplo, con potencia de más de 900 veces mayor en comparación con tocilizumab. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inhibe la señalización por hiper-IL-6 con una CI50 de menos de 1 µM. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inhibe la señalización por hiper-IL-6 con una CI50 de menos de 1 nM. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inhibe la señalización por hiper-IL-6 con una CI50 de menos de 100 μM o menos de 50 μM, por ejemplo, con una CI50 de aproximadamente 14-15 μM. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es EBI-031 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0068] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inhibe la señalización de cis-IL-6 y la señalización de trans-IL-6.

[0069] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es eficaz en bloquear la señalización de IL-6 en el ojo durante al menos 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses, por ejemplo, después de administración intravítrea. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno bloquea un 95 % de señalización de IL-6 en el ojo durante al menos 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses, por ejemplo, después de administración intravítrea. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno bloquea un 95 % de señalización de IL-6 en el ojo durante aproximadamente 150 días.

[0070] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene afinidad incrementada por IL-6 humana con respecto a un anticuerpo de control, por ejemplo, con respecto a EBI-029 o un fragmento del mismo. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene afinidad incrementada por IL-6 humana con respecto a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que es de otro modo idéntico, excepto que no comprende dicho uno o más aminoácidos seleccionados de V28, P30, T51 y G55 y en cambio comprende uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) aminoácidos seleccionados de A28, S30, 151 y S55. En modos de realización, la afinidad se incrementa en al menos 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3 o 4 veces. En modos de realización, la afinidad se evalúa usando resonancia de plasmón superficial (RPS).

[0071] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene una potencia incrementada con respecto a un anticuerpo de control, por ejemplo, con respecto a EBI-029 o un fragmento del mismo. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene una potencia incrementada con respecto a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que es de otro modo idéntico, excepto que no comprende dicho uno o más aminoácidos seleccionados de V28, P30, T51 y G55 y en cambio comprende uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) aminoácidos seleccionados de A28, S30, I51 y S55.

[0072] En modos de realización, la potencia se incrementa como se indica por una disminución en la CI50 y/o una disminución en la CI90. En modos de realización, la CI50 disminuye en al menos 5, 10, 20, 30, 40 o 50 veces. En modos de realización, la CI50 disminuye en al menos aproximadamente 50 veces. En modos de realización, la CI90 disminuye en al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 o 500 veces. En modos de realización, la CI90 disminuye en al menos aproximadamente 100 veces.

[0073] En modos de realización, la potencia se evalúa usando un ensayo HEK-Blue™ o un ensayo de proliferación de T1165.

[0074] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene una CI50 de menos de 47 μM y/o una CI90 de menos de 4350 μM. En modos de realización, la CI50 es menor que 47 μM, por ejemplo, menor que 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 μM. En modos de realización, la CI90 es menor que 4350 μM, por ejemplo, menor que 4000, 2000, 1000, 100, 50, 40, 30, 20, 15, 10 o 5 μM. En modos de realización, la CI50 y/o CI90 se evalúa en un ensayo HEK-Blue™ con IL-620 μM.

[0075] En algunos modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende V28, P30, T51 y G55 y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno muestra afinidad mejorada por IL-6 humana y/o potencia mejorada en comparación con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que es de otro modo idéntico excepto que comprende A28, S30, I51 y S55.

[0076] En modos de realización, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito en el presente documento comprende además una región variable de la cadena ligera o fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL.

[0077] En modos de realización, la CDR1 VL comprende la secuencia de SEQ ID NO:34, la CDR2 VL comprende la secuencia de SEQ ID NO:35 y la CDR3 VL comprende la secuencia de SEQ ID NO:36.

[0078] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende además una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO:38 o que difiere de SEQ ID NO:38 en no más de 3, 2 o 1 aminoácidos.

[0079] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende además una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO:38. En modos de realización, la secuencia de la región variable de la cadena ligera consiste en SEQ ID NO:38.

[0080] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende además una secuencia de la cadena ligera que difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos de SEQ ID NO:42.

[0081] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende además una secuencia de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO:42.

[0082] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende además una secuencia de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO:42 o una secuencia que difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos de SEQ ID NO:42. En modos de realización, la secuencia de la cadena ligera consiste en SEQ ID NO:42.

[0083] El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende

[0084] (i) una CDR1 VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:31, una CDR2 VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:32 y una CDR3 VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:33 y

[0085] (ii) una CDR1 VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:34, una CDR1 VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:35 y una CDR3 VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:36.

[0086] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 o fragmento de estos. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo IgG1 o IgG2 o fragmento del mismo. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un Fab de IgG1 o un Fab de IgG2. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo IgG2 o fragmento de unión a antígeno.

[0087] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se modifica para reducir o eliminar la actividad de ADCC.

[0088] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal humanizado o humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0089] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende o consiste en SEQ ID NO:37 y una región variable de la cadena ligera que comprende o consiste en SEQ ID NO:38. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende las regiones variables de la cadena pesada y ligera anteriores, excepto que tiene una mutación, por ejemplo, un total de como máximo 1, 2 o 3 mutaciones. En modos de realización, la(s) mutación/mutaciones no disminuye(n) la afinidad y/o potencia del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.

[0090] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:41 y una secuencia de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO:42. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia de la cadena pesada que consiste en SEQ ID NO:41 y una secuencia de la cadena ligera que consiste en SEQ ID NO:42. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:47 y una secuencia de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO:42. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia de la cadena pesada que es idéntica a SEQ ID NO:41 y una secuencia de la cadena ligera que es idéntica a SEQ ID NO:42, excepto que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones totales con respecto a SEQ ID NO:41 y/o SEQ ID NO:42. En modos de realización, la(s) mutación/mutaciones está(n) en la(s) región/regiones estructural(es). En modos de realización, la mutación no disminuye la afinidad y/o potencia del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno con respecto a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que no comprende dicha mutación.

[0091] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia de la cadena pesada que es idéntica a SEQ ID NO:47 y una secuencia de la cadena ligera que es idéntica a SEQ ID NO:42, excepto que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones totales con respecto a SEQ ID NO:47 y/o SEQ ID NO:42. En modos de realización, la(s) mutación/mutaciones está(n) en la(s) región/regiones estructural(es). En modos de realización, la mutación no disminuye la afinidad y/o potencia del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno con respecto a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que no comprende dicha mutación.

[0092] En un modo de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un Fab.

[0093] En un modo de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un Fab de IgG1.

[0094] En un modo de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un Fab aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:39 y una secuencia de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO:42. En un modo de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un Fab aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada que consiste en SEQ ID NO:39 y una secuencia de la cadena ligera que consiste en SEQ ID NO:42.

[0095] En un modo de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un Fab de IgG2.

[0096] En un modo de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un Fab aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:54 y una secuencia de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO:42. En un modo de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un Fab aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada que consiste en SEQ ID NO:54 y una secuencia de la cadena ligera que consiste en SEQ ID NO:42.

[0097] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia de la cadena pesada que es idéntica a SEQ ID NO:39 y una secuencia de la cadena ligera que es idéntica a SEQ ID NO:42, excepto que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una mutación (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones totales con respecto a SEQ ID NO:39 y/o SEQ ID NO:42). En modos de realización, la(s) mutación/mutaciones está(n) en la(s) región/regiones estructural(es). En modos de realización, la mutación no disminuye la afinidad y/o potencia del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno con respecto a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que no comprende dicha mutación.

[0098] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia de la cadena pesada que es idéntica a SEQ ID NO:54 y una secuencia de la cadena ligera que es idéntica a SEQ ID NO:42, excepto que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una mutación (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones totales con respecto a SEQ ID NO:54 y/o SEQ ID NO:42). En modos de realización, la(s) mutación/mutaciones está(n) en la(s) región/regiones estructural(es). En modos de realización, la mutación no disminuye la afinidad y/o potencia del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno con respecto a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que no comprende dicha mutación.

[0099] En algunos modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se puede unir a al menos uno de R24, K<2>7, Y31, D34, S118 o V121 de IL-6 humana. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se puede unir a R24, K<2>7, Y31, D34, S118 y V121 de IL-6 humana. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se puede unir a al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 de R24, K<2>7, Y31, D34, S118 y V121 de IL-6 humana. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se puede unir (por ejemplo, se puede unir específicamente) al sitio II de una IL-6 humana. En modos de realización, el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir a una IL-6 con una T<f>de 70 °C o mayor.

[0100] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir a una IL-6 con una T<f>de 80 °C o mayor.

[0101] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno del mismo) se une a al menos uno de R24, K<2>7, Y31, D34, S118 y V121 de una IL-6 humana.

[0102] En modos de realización, el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une a al menos dos de R24, K<2>7, Y31, D34, S118 y V121 de una IL-6 humana. En modos de realización, el anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a al menos tres de R24, K<2>7, Y31, D34, S118 y V121 de una IL-6 humana. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a al menos cuatro de R24, K<2>7, Y31, D34, S118 y V121 de una IL-6 humana. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a al menos cinco de R24, K<2>7, Y31, D34, S118 y V121 de una IL-6 humana. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a R24, K<2>7, Y31, D34, S118 y V121 de IL-6 humana.

[0103] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal humanizado. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal humano.

[0104] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno presenta <10 % de agregación a una concentración de 100-150 mg/ml, por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 142 mg/ml en PBS, pH 7,4. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene propiedades farmacocinéticas mejoradas en comparación con otro agente terapéutico, por ejemplo, en comparación con tocilizumab, bevacizumab, ranibizumab y/o Eylea®. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene una retención mejorada en el ojo cuando se administra en el ojo, por ejemplo, por vía intravítrea, por ejemplo, por inyección intravítrea. En modos de realización, la retención mejorada en el ojo se indica por una semivida incrementada en el ojo, por ejemplo, en el vítreo, retina, humor acuoso, coroides y/o esclerótica.

[0105] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene una semivida en el vítreo de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 días. En modos de realización, la semivida en el vítreo es de al menos 10 días. En modos de realización, la semivida en el vítreo se evalúa en un animal, por ejemplo, en un conejo o un mono. En modos de realización, la semivida en el vítreo se evalúa en un ser humano.

[0106] En modos de realización, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito en el presente documento tiene una semivida sistémica reducida (por ejemplo, T<1/2β>menor) y/o un aclaramiento sistémico mejorado, por ejemplo, una semivida sistémica reducida o aclaramiento sistémico más rápido en comparación con el de otro agente terapéutico, por ejemplo, tocilizumab, bevacizumab, ranibizumab y/o aflibercept (Eylea®). En modos de realización, la semivida sistémica (por ejemplo, T<1/2β>) es menor que la de tocilizumab y/o aflibercept (Eylea®). En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende un dominio Fc que comprende una mutación (por ejemplo, en 1, 2, 3 o 4 mutaciones) en una o más posiciones correspondientes a H311, D313, I254 o H436 (numeración como en SEQ ID NO:41). En modos de realización, la mutación se selecciona de uno o más de H311A, H311E, H311N, D313T, I254A, I254R y H436A. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende un dominio Fc que comprende una mutación correspondiente a H311A (numeración como en SEQ ID NO:41). En modos de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En modos de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG2.

[0107] En modos de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1 humana que tiene la secuencia de SEQ ID NO:50 y opcionalmente comprende una mutación en una o más de las posiciones subrayadas: (H90, D92, I33 y H215):

[0110]

[0112] En modos de realización, el dominio Fc de IgG1 comprende una mutación correspondiente a uno o más de H90A, H90E, H90N, D92T, I33A, I33R y H215A (numeración de acuerdo con SEQ ID NO:50).

[0113] En modos de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG2 humana que tiene la secuencia de SEQ ID NO:51 y opcionalmente comprende una mutación en una o más de las posiciones subrayadas (H86, D88, I29 y H211):

[0115]

[0117] En modos de realización, el dominio Fc de IgG2 comprende una mutación correspondiente a uno o más de H86A, H86E, H86N, D88T, I29A, I29R y H211A (numeración de acuerdo con SEQ ID NO:51).

[0118] En modos de realización, la mutación Fc reduce la acumulación sistémica del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, incrementa el aclaramiento o disminuye la semivida, por ejemplo, T<1/2β>) del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. En modos de realización, la acumulación sistémica se reduce en comparación con la de otro agente terapéutico (por ejemplo, tocilizumab, bevacizumab, ranibizumab y/o aflibercept). En modos de realización, la acumulación sistémica se reduce en comparación con la de tocilizumab y/o aflibercept. En modos de realización, la acumulación sistémica se reduce en comparación con la acumulación sistémica de un correspondiente anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que no comprende la mutación. En modos de realización, la acumulación sistémica se evalúa después de la administración intravítrea del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.

[0119] En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un procedimiento para reducir los efectos sistémicos de inhibir una IL-6 en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio Fc mutado como se describe en el presente documento. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede inhibir una actividad de IL-6 y tiene actividad Fc reducida (por ejemplo, unión reducida a FcRn) en comparación con un correspondiente anticuerpo o fragmento del mismo que tiene un dominio Fc natural. En algunos casos, el procedimiento para reducir los efectos sistémicos de inhibir una IL-6 en un sujeto incluye administrar al sujeto un antagonista de IL-6 que comprende un dominio Fc mutado como se describe en el presente documento.

[0120] En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito en el presente documento. En modos de realización, el ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos divulgada en el presente documento. En modos de realización, el ácido nucleico comprende SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:43 o SEQ ID NO:48. En modos de realización, el ácido nucleico codifica una secuencia divulgada en la tabla 4.

[0121] También se proporciona en el presente documento un vector que comprende el ácido nucleico. También se proporciona en el presente documento una célula que comprende el ácido nucleico o el vector.

[0122] En modos de realización, un anticuerpo frente a IL-6 o fragmento de unión a antígeno descrito en el presente documento es para su uso en el tratamiento de un sujeto (por ejemplo, un ser humano) con una enfermedad asociada a IL-6. En modos de realización, la enfermedad es una enfermedad ocular, por ejemplo, una enfermedad ocular caracterizada por un nivel elevado de IL-6, por ejemplo, en el vítreo.

[0123] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para su uso en el tratamiento de un sujeto (por ejemplo, un ser humano) con edema macular diabético (EMD), retinopatía diabética, uveítis, glaucoma, sequedad ocular (por ejemplo, xeroftalmia o síndrome de ojos secos), conjuntivitis alérgica, dolor ocular, desprendimiento de retina regmatógeno (DRR), degeneración macular senil (DMS), retinopatía diabética proliferativa (RDP), oclusión de la vena retiniana (OVR), neuromielitis óptica (NMO), trasplante de córnea, abrasión corneal o lesión física en el ojo. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para su uso en el tratamiento de un sujeto (por ejemplo, un ser humano) con EMD.

[0124] En modos de realización, un anticuerpo frente a IL-6 o fragmento de unión a antígeno descrito en el presente documento es para su uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada a IL-6. En modos de realización, la enfermedad es una enfermedad ocular, por ejemplo, una enfermedad ocular caracterizada por un nivel elevado de IL-6 en el vítreo. En modos de realización, la enfermedad asociada a IL-6 es edema macular diabético (EMD), retinopatía diabética, uveítis, sequedad ocular (por ejemplo, xeroftalmia o síndrome de ojos secos), degeneración macular senil (DMS), retinopatía diabética proliferativa (RDP), desprendimiento de retina regmatógeno (DRR), oclusión de la vena retiniana (OVR), neuromielitis óptica (NMO), trasplante de córnea, abrasión corneal o lesión física en el ojo. En modos de realización, la enfermedad asociada a IL-6 es edema macular diabético. En modos de realización, el medicamento se formula para su suministro en el vítreo del ojo del sujeto (por ejemplo, para inyección intravítrea).

[0125] También se proporciona en el presente documento una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito en el presente documento. En modos de realización, la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

[0126] En modos de realización, la composición es para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada a IL-6. En modos de realización, la enfermedad es una enfermedad ocular, por ejemplo, una enfermedad ocular caracterizada por un nivel elevado de IL-6 en el vítreo. En modos de realización, la composición es para su uso en el tratamiento de edema macular diabético (EMD), retinopatía diabética, uveítis, sequedad ocular (por ejemplo, xeroftalmia o síndrome de ojos secos), degeneración macular senil (DMS), retinopatía diabética proliferativa (RDP), desprendimiento de retina regmatógeno (DRR), oclusión de la vena retiniana (OVR), neuromielitis óptica (NMO), trasplante de córnea, abrasión corneal o lesión física en el ojo.

[0127] Las referencias a procedimientos de tratamiento en los párrafos posteriores de la presente descripción se deben interpretar como referencia a los compuestos, composiciones farmacéuticas o medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento por tratamiento.

[0128] También se proporciona en el presente documento un procedimiento para tratar una enfermedad asociada a IL-6, comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo frente a IL-6 o fragmento descrito en el presente documento. En modos de realización, la enfermedad asociada a IL-6 es una enfermedad ocular, por ejemplo, una enfermedad ocular caracterizada por un nivel elevado de IL-6 en el vítreo. En modos de realización, la enfermedad asociada a IL-6 es edema macular diabético (EMD), retinopatía diabética, uveítis, sequedad ocular (por ejemplo, xeroftalmia o síndrome de ojos secos), degeneración macular senil (DMS), retinopatía diabética proliferativa (RDP), desprendimiento de retina regmatógeno (DRR), oclusión de la vena retiniana (OVR), neuromielitis óptica (NMO), trasplante de córnea, abrasión corneal o lesión física en el ojo. En modos de realización, la enfermedad asociada a IL-6 es edema macular diabético.

[0129] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, o la composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, se suministra en el vítreo del ojo del sujeto (por ejemplo, por inyección intravítrea). En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, o la composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, es para inyección intravítrea.

[0130] En modos de realización, la enfermedad asociada a IL-6 es edema macular diabético y el anticuerpo o fragmento, o la composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, se suministra en el vítreo del ojo del sujeto.

[0131] También se proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno) del mismo (por ejemplo, un anticuerpo frente a IL-6 o fragmento del mismo como se describe en el presente documento), o una composición que comprende dicho anticuerpo o fragmento del mismo, para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada a IL-6 (por ejemplo, para su uso en el tratamiento de un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, que tiene una enfermedad asociada a IL-6).

[0132] En modos de realización, dicha enfermedad es una enfermedad ocular caracterizada por un nivel elevado de IL-6, por ejemplo, en el vítreo. En modos de realización, dicha enfermedad es edema macular diabético (EMD), retinopatía diabética, uveítis, sequedad ocular (por ejemplo, trastorno del sequedad ocular o xeroftalmia), conjuntivitis alérgica, degeneración macular senil (DMS), retinopatía diabética proliferativa (RDP), desprendimiento de retina regmatógeno (DRR), oclusión de la vena retiniana (OVR), neuromielitis óptica (NMO), trasplante de córnea, abrasión corneal o lesión física en el ojo. En modos de realización, dicha enfermedad es EMD. En modos de realización, dicha enfermedad es xeroftalmia. En modos de realización, dicha enfermedad es síndrome de ojos secos. En modos de realización, dicha enfermedad es uveítis. En modos de realización, dicha enfermedad es DMS. En modos de realización, dicha enfermedad es RDP. En modos de realización, dicha enfermedad es trasplante de córnea, abrasión corneal o lesión física en el ojo. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento (por ejemplo, el fragmento de unión a antígeno) del mismo es adecuado para suministro en el vítreo del ojo. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento (por ejemplo, el fragmento de unión a antígeno) del mismo se suministra en el vítreo del ojo.

[0134] También se proporciona en el presente documento un procedimiento para tratar una enfermedad asociada a IL-6, comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto un anticuerpo frente a IL-6 o fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno del mismo), por ejemplo, un anticuerpo frente a IL-6 o fragmento del mismo como se describe en el presente documento. En modos de realización, el anticuerpo frente a IL-6 o fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno del mismo), se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz. En modos de realización, la enfermedad asociada a IL-6 es una enfermedad ocular caracterizada por un nivel elevado de IL-6 en el vítreo. En modos de realización, la enfermedad asociada a IL-6 es edema macular diabético (EMD), retinopatía diabética, uveítis, síndrome de ojos secos, xeroftalmia, degeneración macular senil (DMS), retinopatía diabética proliferativa (RDP), oclusión de la vena retiniana (OVR), neuromielitis óptica (NMO), trasplante de córnea, abrasión corneal o lesión física en el ojo.

[0136] En modos de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, el fragmento de unión a antígeno del mismo), es adecuado para suministro en el vítreo del ojo. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, el fragmento de unión a antígeno del mismo), se suministra en el vítreo del ojo del sujeto. En modos de realización, la enfermedad asociada a IL-6 es edema macular diabético y el anticuerpo o fragmento del mismo se suministra en el vítreo del ojo del sujeto.

[0138] En el presente documento también se proporciona un kit que comprende un anticuerpo frente a IL-6 o composición divulgado en el presente documento y opcionalmente, instrucciones para su uso.

[0140] En el presente documento también se proporciona un recipiente o dispositivo, por ejemplo, un dispositivo de suministro de fármaco, que comprende un anticuerpo frente a IL-6 o composición divulgado en el presente documento. En modos de realización, dicho dispositivo se configura para el suministro del anticuerpo o composición en el ojo, por ejemplo, en el vítreo. En el presente documento también se proporciona un kit que comprende dicho recipiente o dispositivo.

[0142] Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" es sinónimo de inmunoglobulina y SE debe entender como comúnmente conocido en la técnica. El término anticuerpo no se limita por ningún procedimiento particular para producir el anticuerpo. Por ejemplo, el término anticuerpo incluye, entre otros, anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo es un tetrámero, y a menos que se divulgue de otro modo, cada uno se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena ligera y una cadena pesada. El extremo amino de cada cadena comprende una región variable de aproximadamente 100 a 120 o más aminoácidos que desempeñan un papel principal en el reconocimiento de antígeno. La porción carboxiterminal de cada cadena comprende una región constante con un papel principal en la función efectora de anticuerpo. Las clases de cadenas ligeras humanas se denominan cadenas ligeras kappa y lambda. Las clases de cadena pesada son mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo de un anticuerpo. Los isotipos de anticuerpo son IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente tres o más aminoácidos.

[0144] Las regiones variables de cada par de cadena pesada/ligera (VH y VL), respectivamente, forman el sitio de unión a antígeno. En consecuencia, un anticuerpo IgG intacto, por ejemplo, tiene dos sitios de unión. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son iguales.

[0146] Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo presentan la misma estructura general de regiones estructurales (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. La variabilidad reside principalmente en las CDR, que se separan por las regiones estructurales (FR) más altamente conservadas. La asignación de aminoácidos a cada dominio se realiza de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia y Lesk, J Mol Biol 196:901-917 (1987); Chothiaet al., Nature 342:878-883 (1989), que describen procedimientos conocidos en la técnica.

[0148] "Natural" se puede referir al alelo o especie más prevalente hallado en una población o al anticuerpo obtenido de un animal no manipulado, en comparación con un alelo o polimorfismo, o una variante o derivado obtenido por una forma de manipulación, tal como mutagénesis, uso de procedimientos recombinantes, etc., para cambiar un aminoácido de la molécula de unión a antígeno.

[0150] El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de una cadena intacta o de longitud completa o un anticuerpo, en general la región variable o de unión a diana. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')<2>y Fv. Un "fragmento funcional" o "análogo de un anticuerpo anti-sitio II de IL-6" es un fragmento que puede evitar o reducir sustancialmente la capacidad de IL-6 para unirse a un receptor, reducir la capacidad del complejo IL-6/IL-6R para unirse a gp130 o reducir la capacidad del ligando para unirse a gp130 o de iniciar la señalización. Como se usa en el presente documento, "un fragmento de unión a antígeno" o "fragmento funcional" en general es sinónimo de "fragmento de anticuerpo" y se puede referir a fragmentos, tales como Fv, Fab, F(ab')<2>, etc., que pueden evitar o reducir sustancialmente la capacidad de IL-6 para unirse a un receptor, reducir la capacidad del complejo IL-6/IL-6R para unirse a gp130 o para iniciar la señalización.

[0152] Un "derivado" de un anticuerpo es un polipéptido que incluye al menos una CDR de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Típicamente, el derivado se puede unir al sitio II de IL-6.

[0154] "Competir" quiere decir que un primer anticuerpo, o fragmento del mismo, puede competir por la unión con un segundo anticuerpo o un fragmento del mismo, de modo que la unión del primer anticuerpo con su epítopo disminuye de forma detectable en presencia del segundo anticuerpo en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. En algunos casos, el término también se puede referir a la unión del segundo anticuerpo a su epítopo que se reduce de forma detectable en presencia del primer anticuerpo. El mecanismo de dicha competencia puede ser por medio de, en ejemplos no limitantes, impedimento estérico, cambio conformacional, unión a un epítopo común.

[0156] El término "porcentaje de identidad de secuencia" en el contexto de secuencias de ácido nucleico quiere decir los residuos en dos secuencias que son iguales cuando se alinean para correspondencia máxima. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, por ejemplo, al menos aproximadamente 18 nucleótidos, al menos aproximadamente 24 nucleótidos, al menos aproximadamente 28 nucleótidos, al menos aproximadamente 32 nucleótidos, al menos aproximadamente 36 nucleótidos o al menos aproximadamente 48 o más nucleótidos. Se pueden usar algoritmos conocidos en la técnica para medir la identidad de la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias polinucleotídicas se pueden comparar usando FASTA, Gap o Bestfit (Wisconsin Package versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI). FASTA, incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, proporciona alineaciones y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol Biol 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol 266:227-258 (1996); Pearson, J Mol Biol 276:71-84 (1998)). Típicamente, se usan parámetros predeterminados para un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de ácido nucleico se puede determinar usando FASTA con sus parámetros predeterminados (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) o usando Gap con sus parámetros predeterminados como se proporciona en GCG versión 6.1.

[0158] El término "porcentaje de identidad de secuencia" en el contexto de secuencias de aminoácidos quiere decir los residuos en dos secuencias que son iguales cuando se alinean para correspondencia máxima. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser de al menos aproximadamente cinco residuos aminoacídicos, por ejemplo, al menos aproximadamente 20 residuos aminoacídicos, al menos aproximadamente 30 residuos aminoacídicos, al menos aproximadamente 50 residuos aminoacídicos, al menos aproximadamente 100 residuos aminoacídicos, al menos aproximadamente 150 residuos aminoacídicos, o al menos aproximadamente 200 o más residuos aminoacídicos. La identidad de secuencia para polipéptidos se mide típicamente usando un programa informático de análisis de secuencia. Los algoritmos para la determinación del porcentaje de identidad de secuencia son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos se pueden comparar usando FASTA, Gap o Bestfit (Wisconsin Package versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI). El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo las sustituciones aminoacídicas conservadoras. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit", que se pueden usar con parámetros predeterminados como se especifica por los programas para determinar la homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína natural y un análogo de la misma. Véase, por ejemplo, GCG versión 6.1 (Universidad de Wisconsin, Madison, WI). Las secuencias de polipéptidos también se pueden comparar usando FASTA usando parámetros predeterminados o recomendados, véase GCG versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol Biol 132:185-219 (2000)). Otro algoritmo que se puede usar cuando se compara una secuencia con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, por ejemplo, blastp o tblastn, que usa parámetros predeterminados como se suministran con los programas. Véanse, por ejemplo, Altschulet al., J Mol Biol 215:403-410 (1990); Altschulet al., Nucleic Acids Res 25:3389-402 (1997).

[0159] Una proteína o polipéptido es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogéneo" o "sustancialmente purificado" cuando al menos aproximadamente de un 60 a un 75 % de una muestra presenta una sola especie de polipéptido. El polipéptido o proteína puede ser monomérico o multimérico. Un polipéptido o proteína sustancialmente puro puede comprender aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % puro; por ejemplo, un polipéptido o proteína sustancialmente puro es un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % puro. La pureza u homogeneidad de proteína se puede evaluar por cualquier medio apropiado, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteína seguido de visualización de una o más bandas asociadas con la proteína o polipéptido (por ejemplo, tras la tinción del gel), HPLC de exclusión por tamaño, HPLC de intercambio catiónico, electroforesis capilar reducida en SDS, cartografía de péptidos o cartografía de glucanos. Se puede lograr mayor resolución usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, u otros medios de purificación.

[0160] El término "similitud sustancial" cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, quiere decir que cuando se alinea de manera óptima con inserciones o deleciones nucleotídicas apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % y al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases de nucleótidos, por ejemplo, un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia como se mide por cualquier algoritmo conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap.

[0161] Como se aplica a los polipéptidos, el término "identidad sustancial" o "similitud sustancial" quiere decir que dos secuencias de aminoácidos, cuando se alinean de manera óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminados como se suministran con los programas, comparten al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia; por ejemplo, un 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia. En determinados modos de realización, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren en sustituciones aminoacídicas conservadoras.

[0162] "Cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente terapéutico que se administra que mejorará al menos un signo o síntoma de una enfermedad que se está tratando o potenciará o mejorará el/los efecto(s) profiláctico(s) y/o terapéutico(s) de otro tratamiento (por ejemplo, otro agente terapéutico) útil para tratar una enfermedad asociada a IL-6. Se entiende que la cantidad terapéuticamente eficaz se puede administrar en múltiples dosis durante una cantidad limitada de tiempo o como un tratamiento crónico.

[0163] "Tratar", "que trata" y "tratamiento" se refieren a un procedimiento para mejorar uno o más signos o síntomas de una enfermedad.

[0164] Como se usa en el presente documento, el término "enfermedad" incluye enfermedades y trastornos.

[0165] Los rasgos característicos y ventajas adicionales de la invención se describen más en particular a continuación.

[0166] Breve descripción de los dibujos

[0167] La fig.1 es un gráfico que ilustra los resultados de un experimento en el que un anticuerpo anti-IL-6 se administró IVT en un modelo de NVC de rata. El anticuerpo anti-VEGF se administró como control positivo y el control negativo fue vehículo solo. p = 0,0054 el día 15 y p = 0,0005 el día 22 para anti-IL-6 frente al control de vehículo.

[0168] La fig.2 es un gráfico que ilustra los resultados de un experimento de unión que prueba la capacidad del anticuerpo 64 murino para inhibir la unión de IL-6/IL-6R a gp130.

[0169] La fig. 3 A es una gráfica que ilustra un experimento en el que 020 se sometió a prueba para determinar la capacidad para bloquear la señalización de IL-6 en ausencia de un exceso de IL-6Rα soluble. Los experimentos se realizaron en células HEK-Blue-IL-6 con 0,2 ng/ml de IL-6 y 2 µg/ml de IL6Rα.

[0170] La figura 3B es una gráfica que ilustra un experimento en el que se sometió a prueba 020 para determinar la capacidad para bloquear la señalización de IL-6 en presencia de un exceso de IL-6Rα soluble. Los experimentos se realizaron en células HEK-Blue-IL-6 con 0,2 ng/ml de IL-6 y 2 µg/ml de IL6Rα.

[0171] La fig. 4 es un gráfico que ilustra los resultados de un experimento en el que un anticuerpo monoclonal anti-IL-6 ("bloqueo de IL-6") se administró IVT en un modelo de NVC de ratón. Los controles fueron sin tratamiento (ojo contralateral), inyección intravítrea de un anticuerpo anti-VEGF ("bloqueo de VEGF") o inyección intravítrea de un anticuerpo de control de isotipo anti-HRP ("anticuerpo de control").

[0172] La fig. 5 muestra la unión a IL-6, con respecto al anticuerpo natural (EBI-029), en anticuerpos que tienen las siguientes mutaciones (1) I51T/S55G, (2) A28V/I51T/S55G, (3) S30P/I51T,/S55G y (4) A28V/S30P/I51T/S55G (también denominada EBI-030).

[0173] La fig.6 muestra la señalización fraccionaria en células indicadoras HEK-Blue™-IL6 tratadas con IL-6 y uno de los siguientes Fab: (1) WT (EBI-029), (2) A28V/I51T/S55G, (3) S30P/I51T/S55G, (4) A28V/S30P/I51T/S55G (EBI-030).

[0174] La fig.7 muestra la luminiscencia (una medida de proliferación inducida por IL-6) en células T1165.85.2.1 tratadas con IL-6 y uno de los siguientes Fab a la concentración mostrada: (1) WT (EBI-029), (2) A28V/I51T/S55G, (3) S30P/I51T/S55G, (4) A28V/S30P/I51T/S55G (EBI-030).

[0175] La fig. 8 muestra la señalización fraccionaria en células indicadoras HEK-Blue™-IL6 tratadas con IL-620 μM y diversas concentraciones de (1) IgG2 EBI-029 (EBI029) producida en células HEK-6E, (2) IgG2 EBI-030 (EBI030) producida en células HEK-6E, y (3) IgG2-H311A EBI-030 (EBI030 H311A) producida en células HEK-6E; (4) tocilizumab (TOCI), y (5) IgG2 EBI-030 producida en un agrupamiento de CHO estable (EBI-030 CHO).

[0176] La fig.9 representa el modelo farmacocinético descrito en el ejemplo 20.

[0177] La fig.10 representa el efecto de incrementar la potencia de anticuerpo sobre la duración de la inhibición de IL-6 en el ojo, como se simula usando el modelo farmacocinético descrito en el ejemplo 20.

[0178] La fig. 11 muestra la concentración de fármaco de EBI-029, EBI-029-H311A, EBI-030, EBI-030-H311A, Eylea® y tocilizumab (TCZ) en el vítreo con el tiempo después de administración intravítrea.

[0179] La fig.12 muestra la concentración de fármaco de EBI-029, EBI-030, EBI-030-H311A, Eylea® y tocilizumab (TCZ) en la retina con el tiempo después de administración intravítrea.

[0180] La fig.13 muestra la concentración de fármaco de EBI-029, EBI-030, EBI-030-H311A, Eylea® y tocilizumab (TCZ) en el humor acuoso con el tiempo después de administración intravítrea.

[0181] La fig.14 muestra la concentración de fármaco de EBI-029, EBI-030, EBI-030-H311A, Eylea® y tocilizumab (TCZ) en la coroides con el tiempo después de administración intravítrea.

[0182] La fig.15A representa las localizaciones de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4, CH1, bisagra, CH<2>y CH3 en las secuencias de la cadena pesada de EBI-029 (SEQ ID NO:11), EBI-030 (SEQ ID NO:41) y EBI-031 (EBI-031 también se denomina en el presente documento EBI-030-H311A) (SEQ ID NO:47).

[0183] La fig.15B representa las localizaciones de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 y CK en la secuencia de la cadena ligera (EBI-029, EBI-030 y EBI-031 tienen la misma secuencia de la cadena ligera) (SEQ ID NO:12). La fig.16A muestra la señalización fraccionaria en células indicadoras HEK-Blue™-IL-6 tratadas con IL-620 μM y diversas concentraciones de EBI-031 o tocilizumab.

[0184] La fig. 16B muestra la señalización fraccionaria en células indicadoras HEK-Blue™IL-6 tratadas con hiper-IL-6 200 μM y diversas concentraciones de EBI-031 o tocilizumab.

[0185] La fig.17 muestra resultados de simulaciones computacionales descritas en el ejemplo 24.

[0186] La fig. 18 muestra un diagrama esquemático de las tres diferentes isoformas estructurales de anticuerpos IgG2 debido al reordenamiento de disulfuro.

[0187] La fig. 19 muestra cromatogramas de RP-HPLC de muestras de EBI-031: sin tratar (panel superior), DTT 5 mM (panel central), cisteína 10 mM (panel inferior).

[0188] La fig. 20 muestra cromatogramas de RP-HPLC de muestras de EBI-031 recogidas de diferentes líneas celulares de EBI-031: un cultivo a escala de 200 l de una línea celular clonal (panel superior), un cultivo a escala de 10 l de una línea celular original (panel central) y un agrupamiento de células transfectadas de forma estable (panel inferior).

[0189] La fig.21 muestra el cromatograma de RP-HPLC de EBI-031 recogido de un cultivo a escala de 200 l de una línea celular clonal, y designa y cuantifica qué isoformas se representan por cada pico en el cromatograma.

[0190] La fig. 22A es un gráfico que muestra los datos farmacocinéticos de un mono verde africano (K797), como se describe en el ejemplo 26.

[0191] La fig. 22B es un gráfico que muestra los datos farmacocinéticos de un mono verde africano (K679), como se describe en el ejemplo 26.

[0192] La fig.23 es un gráfico que muestra los datos farmacocinéticos de ambos monos verdes africanos (K797 o K679) y curvas de ajuste.

[0193] La figura 24A muestra la concentración de fármaco de EBI-031 en el humor vítreo con el tiempo después de administración intravítrea.

[0194] La fig. 24B muestra la concentración de fármaco de EBI-031 en el humor acuoso con el tiempo después de administración intravítrea.

[0195] La fig. 24C muestra la concentración de fármaco de EBI-031 en la coroides con el tiempo después de administración intravítrea.

[0196] La fig. 24D muestra la concentración de fármaco de EBI-031 en la conjuntiva con el tiempo después de administración intravítrea.

[0197] La fig.24E muestra la concentración de fármaco de EBI-031 en la córnea con el tiempo después de administración intravítrea.

[0198] La fig. 24F muestra la concentración de fármaco de EBI-031 en el cuerpo ciliar del iris con el tiempo después de administración intravítrea.

[0199] La fig. 24G muestra la concentración de fármaco de EBI-031 en el cristalino con el tiempo después de administración intravítrea.

[0200] La fig.24H muestra la concentración de fármaco de EBI-031 en la retina con el tiempo después de administración intravítrea.

[0201] La fig. 24I muestra la concentración de fármaco de EBI-031 en la esclerótica con el tiempo después de administración intravítrea.

[0202] Descripción detallada

[0203] La IL-6 se ha implicado por desempeñar un papel en una serie de enfermedades tales como la artritis reumatoide, y se ha informado de que se regula por incremento significativamente en una serie de enfermedades, incluyendo enfermedades oculares. IL-6 puede actuar por medio de mecanismos tanto cis como trans. En el mecanismo cis, se cree que la IL-6 libre se une al receptor de IL-6 unido a membrana (IL-6R también se denomina IL-6Rα y CD126), y el complejo IL-6/IL-6R a continuación interactúa con gp130 (también denominado CD130, receptor de oncostatina M, IL-6Rbeta y transductor de señal de IL-6), para activar la señalización en la célula que contiene el complejo. En el mecanismo trans, la IL-6 libre se une al receptor de IL-6 soluble (sIL-6R). El complejo IL-6/sIL-6R se puede unir a continuación a gp130 presente en una membrana celular. Una diferencia clave entre estos mecanismos es que más tipos celulares expresan gp130 de los que expresan IL-6R, expresión que es más limitada. Por lo tanto, en enfermedades para las que es deseable inhibir la señalización de IL-6, por ejemplo en aquellas en las que es deseable inhibir ampliamente la señalización de IL-6, es útil inhibir la señalización tanto de cis como de trans-IL-6. Los solicitantes han genomanipulado antagonistas de IL-6, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-6, fragmentos y derivados que pueden inhibir la señalización tanto cis como trans por IL-6. Además, los solicitantes han genomanipulado dichos antagonistas de IL-6 para lograr un aclaramiento sistémico más rápido. Los antagonistas de IL-6, por ejemplo, anticuerpos frente a IL-6 y fragmentos o derivados de los mismos, se describen en el documento WO2014/074905. La presente invención se refiere a anticuerpos frente a IL-6 mejorados y usos de los mismos.

[0204] Como se usa en el presente documento, los términos en singular, incluyendo pero sin limitarse a "un", "una" o "el/la", incluyen el plural, a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.

[0205] Rasgos característicos de los antagonistas de IL-6 (IL-6a)

[0206] En general, un antagonista de IL-6 (IL-6a) descrito en el presente documento se une específicamente al sitio II (sitio 2) de una IL-6 y es útil para el tratamiento de una enfermedad ocular relacionada con IL-6 y determinadas otras enfermedades. Una enfermedad ocular relacionada con IL-6 es una en la que un síntoma indeseable o actividad biológica de la enfermedad se asocia con la expresión o presencia de IL-6. En algunos modos de realización, el IL-6a tiene alta afinidad por IL-6 tanto libre como unida, es relativamente estable en un organismo, puede inhibir la unión a gp130 de una IL-6 unida a un IL-6R (denominado en el presente documento un complejo IL-6/IL-6R o IL-6/IL-6R), y puede tener un efecto terapéutico. En general, el IL-6a es un anticuerpo o se deriva de un anticuerpo. Por ejemplo, un IL-6a es un Fab humanizado de alta afinidad que se puede unir específicamente al sitio II de una IL-6 y bloquea potentemente la señalización tanto de cis- como de trans-IL-6. En otro ejemplo, el IL-6a es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG2.

[0208] En algunos modos de realización, el Fab también se configura como una secuencia genomanipulada con Fc o está en un anticuerpo de longitud completa. En algunos modos de realización, el IL-6a genomanipulado con Fc (por ejemplo, el Fab genomanipulado con Fc) tiene un aclaramiento sistémico más rápido en comparación con un control apropiado, por ejemplo, en comparación con el correspondiente anticuerpo, fragmento o derivado del mismo que no tiene el Fc genomanipulado. Estos y otros rasgos característicos de un IL-6a se describen además en el presente documento.

[0210] Los solicitantes han diseñado antagonistas de IL-6 que se unen selectivamente al sitio II de IL-6 para proporcionar una amplia inhibición de la señalización de IL-6 debido a que dichas moléculas pueden inhibir la unión de gμl30 a IL-6, independientemente de si la IL-6 está libre o unida a IL-6R o sIL-6R de membrana. Además, dirigir el ligando (IL-6) a diferencia del receptor de IL-6 puede evitar el aclaramiento y la toxicidad mediados por el receptor debido a la ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Debido a que la IL-6 desempeña funciones patológicas y protectoras en la enfermedad, el uso de un antagonista de IL-6 (IL-6a) para tratar una enfermedad asociada con una IL-6 incrementada puede mejorar determinados aspectos de una afección, pero también puede provocar efectos adversos significativos, por ejemplo, efectos sistémicos. Esta dualidad de las vías de IL-6 (es decir, la capacidad para tener efectos deseables y/o indeseables) puede hacer que no sea deseable tratar un trastorno asociado a IL-6 con un inhibidor sistémico. En consecuencia, las composiciones y procedimientos proporcionados en el presente documento pueden ser útiles para tratamientos que inhiben al menos una actividad de IL-6, pero no tienen un efecto indebido sobre actividades positivas de IL-6, en parte porque las composiciones se pueden formular para suministro local, por ejemplo, para suministro local en el ojo. Por ejemplo, en determinados aspectos, el IL-6a se diseña para ser de un tamaño adecuado para suministro a un sitio particular. En algunos modos de realización, el IL-6a es un anticuerpo de longitud completa. En algunos modos de realización, el IL-6a se deriva de un anticuerpo y está en un formato que puede tener una residencia más larga en el vítreo del ojo y una fuga sistémica limitada. En algunos modos de realización, el IL-6a es un anticuerpo modificado (por ejemplo, un anticuerpo con un dominio Fc modificado) que tiene una residencia más larga en el vítreo del ojo y/o una fuga sistémica más limitada en comparación con un correspondiente anticuerpo no modificado. En algunos modos de realización, el IL-6a es un anticuerpo IgG2.

[0212] En algunos aspectos, el IL-6a es un IL-6a relativamente pequeño, tal como un fragmento de un anticuerpo u otro derivado de un anticuerpo que es menor que un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un Fab que se deriva de un anticuerpo frente a IL-6. En algunos casos, un IL-6a está en un formato que puede pasar de una parte de un tejido a otra con una cinética incrementada en comparación con un correspondiente anticuerpo frente a IL-6 de longitud completa. En algunos modos de realización, el IL-6a es un Fab que se ha genomanipulado para que ser una molécula más grande, que es más probable que tenga residencia incrementada en la localización a la que se suministró en comparación con el Fab solo, por ejemplo, el IL-6a se dimeriza a través del dominio Fc. En determinados modos de realización, el dominio Fc se ha genomanipulado de modo que el resto Fc ha eliminado o reducido la unión a FcRn que puede reducir la acumulación sistémica en comparación con la misma entidad de unión a IL-6 que incluye un Fc natural. El dominio Fc genomanipulado puede ser, por ejemplo, un dominio IgG1 o un dominio IgG2.

[0214] Típicamente, los antagonistas de IL-6 descritos en el presente documento tienen una afinidad suficientemente alta por su diana, IL-6, para ser eficaces en mejorar al menos un efecto indeseable de IL-6 y son suficientemente estables para ser útiles como agentes terapéuticos.

[0216] En general, la FC de un IL-6a, por ejemplo, un IL-6a adecuado para su uso en el ojo, tiene una semivida suficientemente larga en el sitio de suministro, por ejemplo, el vítreo, para proporcionar un efecto terapéutico. En ejemplos no limitantes, la FC puede ser una semivida de al menos 8 días, 10 días, 14 días, 21 días, 28 días o 30 días.

[0218] Identificación de antagonistas de IL-6 que se unen al sitio II

[0220] En general, se puede usar cualquier procedimiento conocido en la técnica para generar una molécula que se puede unir a una IL-6, por ejemplo, se pueden cribar colecciones de polipéptidos o colecciones moleculares para determinar compuestos candidatos en un ensayo para determinar la capacidad de un polipéptido o compuesto para unirse a IL-6. Una vez que se identifica dicho compuesto candidato, el sitio de unión del compuesto se puede determinar usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede someter a prueba una molécula para determinar la capacidad para unirse a IL-6 natural y la unión en comparación con la capacidad del compuesto para unirse a una IL-6 mutada en el sitio I, sitio II o sitio III. En modos de realización, un IL-6a como se describe en el presente documento conserva la capacidad para unirse a un complejo IL-6/IL-6Rα y a IL-6, y evita la unión de IL-6/IL-6Rα a gp130. En modos de realización, un IL-6a como se describe en el presente documento puede competir con gp130 por la unión al complejo IL-6/IL-6Rα, por ejemplo, por la unión al sitio II de IL-6. Dichas actividades de unión se pueden someter a ensayo usando procedimientos conocidos en la técnica.

[0221] Los candidatos a IL-6a se pueden someter a prueba, por ejemplo, usando un sistema de ensayo HEK-Blue™-IL-6 (InvivoGen, San Diego). Las células HEK-Blue™-IL-6 son células HEK<2>93 que se transfectan de forma estable con IL-6R humano y un gen indicador SEAP inducible por STAT3. En presencia de IL-6, se activa STAT3 y se secreta SEAP. Se evalúa el PAES usando, por ejemplo, QUANTI-Blue™ (InvivoGen, San Diego). La adición de un antagonista de IL-6 a las células evita la secreción o disminuye el nivel de SEAP como resultado de la inhibición de IL-6 unida a receptor tanto libre como soluble.

[0222] K<D>se refiere a la constante de equilibrio de afinidad de unión de una interacción anticuerpo-antígeno particular o interacción fragmento de anticuerpo-antígeno. En modos de realización, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito en el presente documento se une a un antígeno (por ejemplo, IL-6) con una K<D>que es menor que o igual a 250 μM, por ejemplo, menor que o igual a 225 μM, 220 μM, 210 μM, 205 μM, 150 μM, 100 μM, 50 μM, 20 μM, 10 μM o 1 μM. K<D>se puede determinar usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando el sistema BiaCore™.

[0223] k<dis>se refiere a la constante de velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno o complejo fragmento de anticuerpo-antígeno particular. La constante de velocidad de disociación se puede determinar usando resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando el sistema BiaCore™. Una k<dis>relativamente lenta puede contribuir a rasgos característicos deseables de un agente terapéutico, por ejemplo, permitiendo administración menos frecuente del inhibidor a un sujeto que necesita dicho tratamiento.

[0224] Especificidad

[0225] En algunos modos de realización, un IL-6a descrito en el presente documento se une específicamente a una diana, por ejemplo, una IL-6. En general, "unión específica" como se usa en el presente documento indica que una molécula se une preferentemente a una molécula seleccionada y muestra una afinidad de unión mucho menor por una o más de otras moléculas. En modos de realización, la afinidad de unión por otra molécula es 1, 2, 3 o más órdenes de magnitud menor que la afinidad de unión por la diana.

[0226] Como se analizasupra, IL-6 puede estar presente como IL-6 libre y como IL-6 unida a IL-6Rα soluble. Los solicitantes han identificado el sitio II de IL-6 como una diana óptima para un antagonista de IL-6 en comparación con un inhibidor que se une al sitio I de una IL-6. Un inhibidor de sitio I puede inhibir la unión de IL-6 libre a IL-6Rα. Sin embargo, dicho inhibidor no puede evitar la actividad iniciada por los complejos IL-6/IL-6R preexistentes, excepto por el reemplazo limitado por la k<dis>del complejo. Otra alternativa, un inhibidor que se une a un IL-6Rα, es menos adecuado porque puede tener una capacidad limitada para evitar la actividad de IL-6 a menos que esté presente en concentraciones saturantes. Debido a que la cantidad de receptor de IL-6 es en general bastante alta en comparación con la cantidad de IL-6, este enfoque puede requerir la administración de una cantidad indeseablemente grande de una composición que inhibe la actividad de IL-6 uniéndose al receptor. En modos de realización, los antagonistas de IL-6 descritos en el presente documento (por ejemplo, los anticuerpos y fragmentos y derivados de los mismos descritos en el presente documento) pueden bloquear la actividad de IL-6 incluso cuando IL-6 se une a IL-6R. En consecuencia, una ventaja de un IL-6a como se describe en el presente documento es que puede ser necesario administrar relativamente menos de la composición para lograr un efecto terapéutico en comparación con un inhibidor que se dirige a un receptor de IL-6. Se ha informado de que los anticuerpos anti-receptor se aclaran rápidamente por aclaramiento mediado por receptor, lo que limita significativamente su FC y, por lo tanto, requiere dosis más grandes, dosificación más frecuente o ambas. Adicionalmente, los anticuerpos frente a IL-6 tanto anti-receptor como anti-sitio I plantean un problema ya que incrementan significativamente la concentración tisular de IL-6 alterando la vía de aclaramiento mediada por receptor normal del ligando, exponiendo de este modo al sujeto a niveles potencialmente indeseables de IL-6 en un tejido. Además, el uso de un inhibidor dirigido a IL-6Rα puede necesitar la presencia del inhibidor cerca de ambos sitios en los que se busca inhibición y un sitio en el que no es deseable, por ejemplo, tratamiento sistémico. El uso de un IL-6a que se une al sitio II, el sitio al que se une gμl30, permite la inhibición por medio de IL-6 libre, así como IL-6 que se une a un IL-6R, pero aún no ha activado una vía de IL-6 por medio de gμl30. En consecuencia, sin quedar vinculado a ninguna teoría, los antagonistas de IL-6 descritos en el presente documento se diseñan para unirse a ambas formas de IL-6 (soluble y unida a receptor), específicamente los antagonistas de IL-6 se unen al sitio II de IL-6, que es accesible en ambas formas. Las composiciones que contienen un IL-6a como se describe en el presente documento pueden inhibir la señalización tanto cis como trans por IL-6.

[0227] En algunos casos, los compuestos y procedimientos proporcionados en el presente documento se diseñan para proporcionar un bloqueo de IL-6 eficaz suficiente para tratar al menos un signo o síntoma de un trastorno asociado a IL-6, por ejemplo, inhibir la angiogénesis y/o inflamación.

[0228] Los compuestos descritos en el presente documento son útiles para tratar enfermedades oculares caracterizadas por un nivel indeseablemente alto de IL-6, por ejemplo, en el vítreo (véase Yuukiet al., J Diabetes Comμl 15:257 (2001); Funatsuet al., Ophthalmology 110: 1690,(2003); Ohet al., Curr Eye Res 35:1116 (2010); Nomaet al., Eye 22:42 (2008); Kawashimaet al., Jpn J Ophthalmol 51:100 (2007); Kauffmanet al., Invest Ophthalmol Vis Sci 35:900 (1994); Miaoet al., Molec Vis 18:574(2012)).

[0230] En general, un IL-6a como se describe en el presente documento es un potente antagonista de la señalización de IL-6. En algunos modos de realización, un IL-6a descrito en el presente documento tiene una alta afinidad por IL-6, por ejemplo, una CI50 menor que o igual a 100 μM en un ensayo de IL-6 HEK-Blue usando IL-610 μM. La alta afinidad de un IL-6a se puede determinar en base a la K<D>del IL-6a, por ejemplo, una K<D>de menos de o igual a 1 nM, menos de o igual a 500 μM, menos de o igual a 400 μM, menos de o igual a 300 μM, menos de o igual a 240 μM, o menos de o igual a 200 μM.

[0232] Para producir un IL-6a biológico (por ejemplo, una proteína o polipéptido tal como un anticuerpo, fragmento o derivado del mismo) que sea útil para tratar un trastorno asociado con la expresión o actividad de IL-6 incrementada, típicamente es deseable que el IL-6a biológico tenga alta productividad. Por ejemplo, una productividad adecuada es mayor que o igual a 1 g/l (por ejemplo, mayor que o igual a 2 g/l, mayor que o igual a 5 g/l, o mayor que o igual a 10 g/l).

[0234] Para administrar eficazmente un antagonista de IL-6, es necesario que el inhibidor tenga una solubilidad compatible con la concentración a la que se administrará. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo de longitud completa IL-6a, la solubilidad es mayor que o igual a 20 mg/ml, mayor que o igual a 10 mg/ml, mayor que o igual a 5 mg/ml o mayor que o igual a 1 mg/ml.

[0236] Además, para ser un tratamiento viable, el inhibidor debe tener una alta estabilidad a la temperatura corporal de los sitios de suministro y actividad, así como estabilidad de almacenamiento. En modos de realización, el inhibidor tiene una T<f>mayor que o igual a 60 °C (por ejemplo, mayor que o igual a 60 °C, mayor que o igual a 62,5 °C, mayor que o igual a 65 °C, mayor que o igual a 70 °C, mayor que o igual a 73 °C, o mayor que o igual a 75 °C). En modos de realización, el inhibidor tiene una T<aparición>mayor que o igual a 45 °C, por ejemplo, mayor que o igual a 50 °C, mayor que o igual a 51 °C, mayor que o igual a 55 °C, o mayor que o igual a 60 °C. Los procedimientos para determinar la T<f>y la T<aparición>se pueden determinar usando procedimientos conocidos en la técnica.

[0238] Se pueden seleccionar antagonistas que tienen los rasgos característicos deseados de tipos adecuados de moléculas conocidas en la técnica, por ejemplo, anticuerpos, incluyendo fragmentos y derivados de un anticuerpo dirigido al sitio II de IL-6 que en general conserva o mantiene suficientes rasgos característicos del anticuerpo frente a IL-6 original (por ejemplo, propiedades de unión deseadas). Dichos antagonistas incluyen fragmentos F<ab>, scFv, fragmentos F<ab>genomanipulados para incluir un resto Fc y anticuerpos de longitud completa genomanipulados para tener una estructura diferente del anticuerpo dirigido al sitio II de IL-6 original.

[0240] En algunos aspectos, el IL-6a divulgado en el presente documento comprende un sitio de unión a antígeno de anticuerpo humano que puede competir o competir de forma cruzada con un anticuerpo o fragmento del mismo que se puede unir al sitio II de IL-6. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo puede estar compuesto de un dominio VH y un dominio VL divulgados en el presente documento, y los dominios VH y VL comprenden un conjunto de CDR de un anticuerpo de unión a sitio II/IL-6 divulgado en el presente documento.

[0242] Se puede usar cualquier procedimiento adecuado para determinar el dominio y/o epítopo unido por un IL-6a, por ejemplo, mutando diversos sitios en una IL-6. Aquellos sitios en los que las mutaciones evitan o disminuyen la unión del IL-6a y el ligando de IL-6 están implicados directamente en la unión al IL-6a o bien afectan indirectamente al sitio de unión, por ejemplo, afectando a la conformación de la IL-6. Se pueden usar otros procedimientos para determinar los aminoácidos unidos por un IL-6a. Por ejemplo, se puede usar un barrido de unión a péptido, tal como un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) basado en PEPSCAN. En un barrido de unión a péptido de este tipo, se criban sistemáticamente péptidos solapantes cortos derivados del antígeno para determinar su unión a un miembro de unión. Los péptidos se pueden acoplar covalentemente a una superficie de soporte para formar una matriz de péptidos. Los péptidos pueden tener una conformación lineal o restringida. Se puede producir una conformación restringida usando péptidos que tienen un residuo de cisteína (cys) terminal en cada extremo de la secuencia peptídica. Los residuos de cys se pueden acoplar covalentemente directa o indirectamente a una superficie de soporte de modo que el péptido se mantiene en una conformación en bucle. En consecuencia, un péptido usado en el procedimiento puede tener un residuo de cys añadido a cada extremo de una secuencia peptídica correspondiente a un fragmento del antígeno. También se pueden usar péptidos de doble bucle, en los que un residuo de cys se localiza adicionalmente en o cerca de la mitad de la secuencia peptídica. Los residuos de cys se pueden acoplar covalentemente directa o indirectamente a una superficie de soporte de modo que los péptidos forman una conformación de doble bucle, con un bucle a cada lado del residuo de cys central. Los péptidos se pueden generar sintéticamente y, por lo tanto, los residuos de cys se pueden genomanipular en localizaciones deseadas, a pesar de no producirse naturalmente en la secuencia de sitio II de IL-6. Opcionalmente, los péptidos lineales y restringidos se pueden cribar ambos en un ensayo de unión a péptido. Un barrido de unión a péptido puede implicar identificar (por ejemplo, usando un ELISA) un conjunto de péptidos a los que se une el miembro de unión, en el que los péptidos tienen secuencias de aminoácidos correspondientes a fragmentos de un IL-6a (por ejemplo, péptidos que incluyen aproximadamente 5, 10 o 15 residuos contiguos de un IL-6a), y alinear los péptidos para determinar una huella de residuos unidos por el miembro de unión, donde la huella comprende residuos comunes a los péptidos superpuestos. De forma alternativa o adicionalmente, el procedimiento de barrido de unión a péptido se puede usar para identificar péptidos a los que se une el IL-6a con al menos una proporción señal:ruido seleccionada.

[0243] Se pueden usar otros procedimientos conocidos en la técnica para determinar los residuos unidos por un anticuerpo y/o para confirmar los resultados del barrido de unión a péptido, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigida a sitio (por ejemplo, como se describe en el presente documento), intercambio de hidrógeno y deuterio, espectrometría de masas, RMN y cristalografía de rayos X.

[0244] Típicamente, un IL-6a útil como se describe en el presente documento es una molécula de anticuerpo humano, una molécula de anticuerpo humanizado o un fragmento de unión de la misma. En general, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. El origen de dicho anticuerpo puede ser humano, murino, de rata, de camélido, de conejo, ovino, porcino o bovino y se puede generar de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

[0245] En general, un IL-6a comprende al menos las CDR de un anticuerpo que se puede unir específicamente a una IL-6 (por ejemplo, una IL-6 humana), por ejemplo, al sitio II de una IL-6. La estructura para portar una CDR o un conjunto de CDR de la invención puede ser una secuencia de la cadena pesada o ligera de anticuerpo o una porción sustancial de la misma en la que la CDR o conjunto de CDR se localiza en una localización correspondiente a la CDR o conjunto de CDR de dominios variables de anticuerpo VH y VL naturales codificados por genes de inmunoglobulina reordenados. Las estructuras y localizaciones de los dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar por referencia a Kabatet al., 1983 (National Institutes of Health), y actualizaciones de la misma se pueden encontrar en "Kabat" usando cualquier motor de búsqueda en Internet.

[0246] Un IL-6a, como se divulga en el presente documento, es típicamente un anticuerpo que en general comprende un dominio VH y/o dominio VL de anticuerpo. Un dominio VH comprende un conjunto de CDR de la cadena pesada (VHCDR), y un dominio VL comprende un conjunto de CDR de la cadena ligera (VLCDR). Los ejemplos de dichas CDR se proporcionan en el presente documento en los ejemplos. Una molécula de anticuerpo puede comprender un dominio VH de anticuerpo que comprende una VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 y una estructura. De forma alternativa o también puede comprender un dominio VL de anticuerpo que comprende una VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 y una estructura.

[0247] En el presente documento se divulgan antagonistas de IL-6 que comprenden una VHCDR1 y/o VHCDR2 y/o VHCDR3 tales como las divulgadas en el presente documento y/o una VLCDR1 y/o VLCDR2 y/o VLCDR3 tales como las divulgadas en el presente documento. El IL-6a puede comprender una o más CDR de cualquiera de los anticuerpos, fragmentos o derivados descritos en el presente documento. El IL-6a puede comprender un conjunto de VHCDR (por ejemplo, VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3) y, opcionalmente, también puede comprender un conjunto de VLCDR (por ejemplo, VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3). Las CDR se pueden derivar de uno o más anticuerpos, fragmentos o derivados descritos en el presente documento. Por ejemplo, las VLCDR se pueden derivar del mismo anticuerpo o uno diferente que las VHCDR.

[0248] En general, un dominio VH se empareja con un dominio VL para proporcionar un sitio de unión a antígeno de anticuerpo. Por ejemplo, el dominio HC de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 se empareja con el dominio LC de SEQ ID NO:2. En modos de realización, la molécula de anticuerpo, fragmento o derivado de la misma comprende una VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de SEQ ID NO:37. En modos de realización, la molécula de anticuerpo, fragmento o derivado de la misma comprende una VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 que difieren conjuntamente de la VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de SEQ ID NO:37 en no más de 1, no más de 2, no más de 3 aminoácidos.

[0249] La molécula de anticuerpo, fragmento o derivado de la misma puede comprender un dominio VL de SEQ ID NO:38, o (ii) un conjunto de VLCDR (por ejemplo, VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3) del dominio VL. En modos de realización, la molécula de anticuerpo, fragmento o derivado de la misma comprende VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de SEQ ID NO:38. Los algoritmos que se pueden usar para calcular el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos incluyen, por ejemplo, BLAST, FASTA o el algoritmo Smith-Waterman, por ejemplo, empleando parámetros predeterminados.

[0250] Un IL-6a como se describe en el presente documento puede comprender regiones constantes de anticuerpo o partes de las mismas, por ejemplo, regiones constantes de anticuerpo humano o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio VL se puede unir en su extremo C terminal a dominios constantes de la cadena ligera de anticuerpo que incluyen cadenas CK o CL humanas. De forma similar, un IL-6a basado en un dominio VH se puede unir en su extremo C terminal a toda o parte (por ejemplo, un dominio CH1) de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM y cualquiera de las subclases de isotipo, en particular IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En modos de realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se modifica para reducir o eliminar la actividad de ADCC.

[0251] En un modo de realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo IgG2. En un modo de realización, el anticuerpo de la invención comprende una estructura de IgG2, región constante de IgG2 o región Fc de IgG2 como se describe en el presente documento.

[0252] Los anticuerpos IgG2 pueden existir como tres isoformas estructurales principales: IgG2-A, IgG2-B e IgG2-A/B (Wypych J.et al.Journal of Biological Chemistry. 2008, 283:16194-16205). Esta heterogeneidad estructural se debe a diferentes configuraciones de los enlaces disulfuro que enlazan los brazos Fab a la región bisagra de la cadena pesada. En la isoforma IgG2-A, no existen enlaces disulfuro enlazando los brazos Fab a la región bisagra. En la isoforma IgG2-B, ambos brazos Fab tienen enlaces disulfuro enlazando la cadena pesada y ligera a la región bisagra. La isoforma IgG2-A/B es un híbrido entre las isoformas IgG2-A e IgG2-B, teniendo un solo brazo Fab enlaces disulfuro enlazando la cadena pesada y ligera del brazo Fab a la región bisagra. La conversión de un anticuerpo IgG2 entre dos o todas las diferentes isoformas estructurales, también denominada reordenamiento de disulfuro, se produce de forma naturalin vivoein vitropara anticuerpos tanto naturales como recombinantes. Como resultado, las formulaciones de anticuerpos IgG2 en la técnica comprenden una mezcla heterogénea de isoformas IgG2-A, IgG2-B e IgG2-A/B. Las diferentes isoformas de IgG2 pueden tener propiedades funcionales únicas y diferentes, tales como diferencias en estabilidad, agregación, viscosidad, unión a receptor Fc o potencia. La presencia de múltiples isoformas o niveles incrementados de una isoforma particular en una formulación de anticuerpo IgG2 puede afectar negativamente la estabilidad, agregación o potencia.

[0253] La presente invención proporciona un anticuerpo con la ventaja de existir principalmente en la isoforma IgG2-A o IgG2-A/B. El anticuerpo de la presente invención no existe en la isoforma IgG2-B, o no existe en la isoforma IgG2-B durante una cantidad sustancial de tiempo. Por tanto, las composiciones y formulaciones que comprenden el anticuerpo de la invención son menos heterogéneas que otros anticuerpos IgG2 conocidos en la técnica y, por lo tanto, más preferentes para su uso en una aplicación terapéutica.

[0254] Las composiciones que comprenden el anticuerpo de la invención comprenden principalmente isoformas IgG2-A y/o IgG2-A/B del anticuerpo. En un modo de realización, una composición que comprende un anticuerpo descrito en el presente documento comprende al menos un 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de las isoformas de IgG2-A o IgG2-A/B del anticuerpo. En un modo de realización, una composición que comprende un anticuerpo descrito en el presente documento comprende al menos un 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de las isoformas de IgG2-A e IgG2-A/B conjuntamente. En dichos modos de realización, una composición que comprende un anticuerpo descrito en el presente documento no comprende una cantidad sustancial de las isoformas de IgG2-B del anticuerpo. Por ejemplo, la composición comprende menos de un 10 %, 5 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % de las isoformas de IgG2-B del anticuerpo.

[0255] En algunos casos, un anticuerpo de la invención se modifica además usando procedimientos conocidos en la técnica para crear una secuencia que tiene un alotipo específico, por ejemplo, un alotipo que predomina en una población que tiene un origen geográfico particular. En algunos casos, la región constante de la cadena pesada humana se modifica para este propósito.

[0256] Un IL-6a puede ser una molécula de anticuerpo, fragmento de unión de la misma o variante, que tiene una o más CDR, por ejemplo, un conjunto de CDR, dentro de una estructura de anticuerpo. Por ejemplo, una o más CDR o un conjunto de CDR de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento o derivado del mismo como se describe en el presente documento) se pueden injertar en una estructura (por ejemplo, estructura humana) para proporcionar una molécula de anticuerpo. Las regiones estructurales se pueden derivar de secuencias génicas de estirpe germinal humana, o ser de origen no germinal.

[0257] Los residuos estructurales VH y/o VL se pueden modificar como se analiza y ejemplifica en el presente documento, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida a sitio.

[0258] Se pueden realizar cambios aminoacídicos en una o más regiones estructurales y/o una o más CDR derivadas de un anticuerpo IL-6a dirigido al sitio II de IL-6 (denominado en el presente documento un "anticuerpo frente a IL-6 de referencia") usando procedimientos y parámetros conocidos en la técnica. En el presente documento también se incluye un antagonista de IL-6 resultante que conserva la unión al sitio II de una IL-6 (por ejemplo, el sitio II de una IL-6 humana) y típicamente tiene al menos la misma unión o afinidad incrementada en comparación con el anticuerpo frente a IL-6 de referencia. En algunos casos, para mejorar un parámetro tal como la estabilidad, se puede introducir un cambio que da como resultado una disminución en la afinidad de unión del IL-6a derivada en comparación con el IL-6a de referencia (por ejemplo, el anticuerpo de referencia) para crear un IL-6a útil. En algunos modos de realización, por ejemplo, en algunos casos en los que la referencia se refiere a la unión a FcRn o a un parámetro farmacocinético (FC) tal como la semivida en el vítreo o semivida sistémica (por ejemplo, en sangre, plasma, suero, linfa, hígado, riñón, otro tejido o líquido corporal), un anticuerpo de referencia puede ser un anticuerpo que no se une específicamente a una IL-6.

[0259] Un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido IL-6a puede incluir sustituir uno o más residuos aminoacídicos con un aminoácido no natural o no estándar, modificar uno o más residuos aminoacídicos en una forma no natural o no estándar, o insertar uno o más aminoácidos no naturales o no estándar en la secuencia. Los ejemplos de números y localizaciones de alteraciones en secuencias de la invención se describen en otra parte en el presente documento. Los aminoácidos de origen natural incluyen los 20 L-aminoácidos "estándar" identificados como G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E por sus códigos de una sola letra estándar. Los aminoácidos no estándar incluyen cualquier otro residuo que se pueda incorporar en una cadena principal polipeptídica o que resulte de la modificación de un residuo aminoacídico existente. Los aminoácidos no estándar pueden ser naturales o no naturales. Varios aminoácidos no estándar naturales son conocidos en la técnica, tales como 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, 3-metilhistidina y N-acetilserina. Aquellos residuos aminoacídicos que se derivatizan en su posición N-alfa solo se localizarán en el extremo N de una secuencia de aminoácidos. El aminoácido es típicamente un L-aminoácido. En algunos casos, el aminoácido es un D-aminoácido. Por lo tanto, la alteración puede comprender modificar un L-aminoácido en, o reemplazarlo con, un D-aminoácido. Las formas metiladas, acetiladas y/o fosforiladas de aminoácidos también son conocidas, y los aminoácidos en la presente invención se pueden someter a dicha modificación.

[0261] Las secuencias de aminoácidos en dominios de anticuerpo y miembros de unión de la invención pueden comprender aminoácidos no naturales o no estándar como se analiza en el presente documento. Los aminoácidos no estándar (por ejemplo, D-aminoácidos) se pueden incorporar en una secuencia de aminoácidos usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, en la síntesis de la molécula o por modificación o reemplazo posterior a la síntesis de un aminoácido. En algunos casos, se usa un D-aminoácido para incrementar la FC de un IL-6a.

[0263] Las regiones VH o VL novedosas que portan secuencias derivadas de CDR de la invención se pueden generar usando mutagénesis aleatoria de una o más secuencias de ácido nucleico VH y/o VL seleccionadas para generar mutaciones dentro de todo el dominio variable. Por ejemplo, se puede usar PCR propensa a errores (Chaoet al., Nature Protocols, 1:755-768 (2006)). En algunos modos de realización, se realizan una o dos sustituciones aminoacídicas dentro de todo un dominio variable o conjunto de CDR. Se pueden usar otros procedimientos conocidos en la técnica para generar mutaciones, por ejemplo, mutagénesis dirigida a sitio, típicamente en una o más CDR.

[0265] Un procedimiento para producir un anticuerpo IL-6a es alterar un dominio VH tal como los divulgados en el presente documento añadiendo, delecionando, sustituyendo o insertando uno o más aminoácidos. El dominio VH alterado se puede combinar con un dominio VL (por ejemplo, un dominio VL divulgado en el presente documento), que también se puede alterar como se describe en el presente documento y usando procedimientos conocidos en la técnica. Dichas moléculas alteradas se someten a prueba para determinar su capacidad para unirse al sitio II de IL-6 y, opcionalmente, para determinar otras propiedades deseadas, tales como una afinidad incrementada en comparación con una molécula de referencia. En algunos casos, un dominio VH o VL variante puede tener 1, 2, 3, 4 o 5 de dichas alteraciones (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones aminoacídicas).

[0267] En modos de realización, un IL-6a de la invención es un fragmento de un anticuerpo que se une al sitio II de una IL-6 y comprende un sitio de unión a antígeno, por ejemplo, se puede unir al sitio II de una IL-6. Los fragmentos de anticuerpo de la invención se obtienen en general a partir de una molécula de anticuerpo de referencia (original), tal como una molécula de anticuerpo que comprende SEQ ID NO:41 y SEQ ID NO:42. Los fragmentos de anticuerpo se pueden generar usando procedimientos conocidos en la técnica tales como ADN recombinante, escisión enzimática (por ejemplo, usando pepsina o papaína), escisión química de un anticuerpo (por ejemplo, reducción química de puentes disulfuro). Los fragmentos de anticuerpo que comprenden un sitio de unión a antígeno del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, moléculas tales como Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd y región variable estabilizada por disulfuro (dsFv). Se pueden genomanipular varias otras moléculas de anticuerpo que incluyen uno o más sitios de unión a antígeno de anticuerpo, incluyendo, por ejemplo, F(ab')<2>, F(ab)<3>, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos. Los ejemplos de moléculas de anticuerpo y procedimientos para su construcción y uso se describen en Holliger y Hudson, 2005, Nat Biotechnol 23:1126-1136. Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión son un fragmento Fab compuesto de dominios VL, VH, dominio de la cadena ligera constante (CL) y dominio de la cadena pesada constante 1 (CH1); un fragmento Fd compuesto de dominios VH y CH1; un fragmento Fv compuesto de los dominios VL y VH de un solo anticuerpo; un fragmento dAb compuesto de un dominio VH o uno VL; regiones CDR aisladas; un fragmento F(ab')<2>, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados; una molécula Fv monocatenaria (scFv), en la que un dominio VH y un dominio VL se enlazan por un conector peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno; un dímero de Fv monocatenario biespecífico (por ejemplo, como se divulga en el documento WO 1993/011161) y un diacuerpo, que es un fragmento multivalente o multiespecífico construido usando fusión génica (por ejemplo, como se divulga en el documento WO94/13804). Las moléculas de Fv, scFv o diacuerpo se pueden estabilizar por la incorporación de puentes disulfuro enlazando los dominios VH y VL. Los minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 también se pueden usar como IL-6a. Otros fragmentos y derivados de un anticuerpo que se pueden usar como IL-6a incluyen un Fab', que difiere de un fragmento Fab por la adición de unos pocos residuos aminoacídicos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo, y Fab'-SH, que es un fragmento Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes porta(n) un grupo tiol libre.

[0269] En algunos casos, un IL-6a que es un fragmento de anticuerpo se ha modificado químicamente para mejorar o introducir una propiedad deseable, por ejemplo, PEGilación para incrementar la semivida o incorporación.

[0270] Un dAb (anticuerpo de dominio) es un pequeño fragmento de unión a antígeno monomérico de un anticuerpo (la región variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo). Los dAb de VH se producen de forma natural en camélidos (por ejemplo, camellos y llamas) y se pueden producir inmunizando un camélido con un antígeno diana, aislando linfocitos B específicos de antígeno y clonando directamente genes de dAb de linfocitos B individuales. Una IL-6a de la presente invención puede ser un dAb que comprende un dominio VH o VL sustancialmente como se expone en el presente documento, o un dominio VH o VL que comprende un conjunto de CDR sustancialmente como se expone en el presente documento.

[0272] Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos biespecíficos en los que dos regiones variables diferentes se combinan en la misma molécula. Se puede incorporar una Il-6a como parte de un anticuerpo biespecífico preparado usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, preparado químicamente o a partir de hibridomas híbridos. Dicha molécula puede ser un fragmento de anticuerpo biespecífico de un tipo analizado anteriormente. Un ejemplo no limitante de un procedimiento para generar un anticuerpo biespecífico es la tecnología BiTE™ en la que se pueden usar los dominios de unión de dos anticuerpos con diferente especificidad y enlazar directamente por medio de péptidos flexibles cortos. Esto combina dos anticuerpos en una única cadena polipeptídica corta. Se pueden construir diacuerpos y scFv sin una región Fc, usando solo dominios variables, reduciendo potencialmente los efectos de la reacción antiidiotípica. Se pueden construir anticuerpos biespecíficos como IgG completa, como Fab'2 biespecífico, como Fab'PEG, como diacuerpos o también como scFv biespecífico. Además, se pueden enlazar dos anticuerpos biespecíficos usando procedimientos habituales conocidos en la técnica para formar anticuerpos tetravalentes.

[0274] Los diacuerpos biespecíficos, a diferencia de los anticuerpos completos biespecíficos, son útiles, en parte porque se pueden construir y expresar enE. coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos, tales como fragmentos de anticuerpo) de especificidades de unión apropiadas se pueden seleccionar fácilmente usando presentación en fagos (documento WO 1994/13804) de colecciones. Si un brazo del diacuerpo se va a mantener constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida frente al sitio II de IL-6, a continuación se puede preparar una colección donde se varía el otro brazo y se selecciona un anticuerpo de especificidad apropiada.

[0276] Se pueden preparar anticuerpos completos biespecíficos por procedimientos de genomanipulación alternativos como se describe en los documentos WO 1996/27011, WO 1998/50431 y WO 2006/028936.

[0278] En algunos casos, un IL-6a de la invención comprende un sitio de unión a antígeno dentro de una molécula distinta de anticuerpo, por ejemplo, incorporando una o más CDR, por ejemplo, un conjunto de CDR, en un armazón proteínico distinto de anticuerpo, como se analiza además a continuación. En algunos casos, las CDR se incorporan en un armazón distinto de anticuerpo. Un sitio de unión al sitio II de IL-6 se puede proporcionar por una disposición de CDR en armazones proteínicos distintos de anticuerpo, tales como fibronectina o citocromo B, o aleatorizando o mutando residuos aminoacídicos de un bucle dentro de un armazón proteínico para conferir especificidad de unión para un sitio II de IL-6. Los armazones para genomanipular sitios de unión novedosos en proteínas son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los armazones proteínicos para miméticos de anticuerpo se divulgan en el documento WO200034784, que describe proteínas (miméticos de anticuerpo) que incluyen un dominio de tipo III de fibronectina que tiene al menos un bucle aleatorizado. Un armazón adecuado en el que injertar una o más CDR, por ejemplo, un conjunto de HCDR, se puede proporcionar por cualquier miembro de dominio de la superfamilia de genes de inmunoglobulinas . El armazón puede ser una proteína humana o no humana. Una ventaja de un armazón proteínico distinto de anticuerpo es que puede proporcionar un sitio de unión a antígeno en una molécula de armazón que es más pequeña y/o más fácil de fabricar que al menos algunas moléculas de anticuerpo. El tamaño pequeño de un miembro de unión puede conferir propiedades fisiológicas útiles, tales como la capacidad para entrar en células, penetrar profundamente en tejidos o alcanzar dianas dentro de otras estructuras, o para unirse dentro de cavidades proteicas del antígeno diana. Son típicas las proteínas que tienen una cadena principal estable y uno o más bucles variables, en los que la secuencia de aminoácidos del bucle o bucles se muta específica o aleatoriamente para crear un sitio de unión a antígeno que se une al antígeno diana. Dichas proteínas incluyen los dominios de unión a IgG de la proteína A deS. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina (por ejemplo, usando el 10° dominio de fibronectina tipo III), lipocalinas, así como armazones gamma-cristalinos y otros Affilin™ (Scil Proteins, Halle, Alemania). Los ejemplos de otros enfoques incluyen microcuerpos sintéticos basados en ciclotidos, pequeñas proteínas que tienen enlaces disulfuro intramoleculares, microproteínas (por ejemplo, Versabodies™, Amunix Inc., Mountain View, CA) y proteínas de repeticion de anquirina (DARPins, por ejemplo, de Molecular Partners AG, Zurich-Schlieren, Suiza). Dichas proteínas también incluyen dominios proteicos genomanipulados pequeños tales como, por ejemplo, inmunodominios (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE. UU. n.º 2003/082630 y 2003/157561). Los inmunodominios contienen al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo.

[0280] Un IL-6a puede comprender aminoácidos adicionales, por ejemplo, para impartir a la molécula otra característica funcional además de la capacidad para unirse al antígeno.

[0282] En algunos casos, un IL-6a porta un marcador detectable, o se conjuga a una toxina o un resto o enzima dirigido (por ejemplo, por medio de un enlace o conector peptidilo). Por ejemplo, un IL-6a puede comprender un sitio catalítico (por ejemplo, en un dominio enzimático) así como un sitio de unión a antígeno (por ejemplo, un sitio de unión para el sitio II de una IL-6), de modo que el sitio de unión a antígeno se une al antígeno y por tanto, dirige el sitio catalítico a IL-6 o complejo IL-6/IL-6R. El sitio catalítico, en algunos casos, puede inhibir además una función biológica de una IL-6, por ejemplo, por escisión de la IL-6, IL-6R u otra molécula que se asocia con el complejo IL-6a/IL-6.

[0283] En algunos aspectos, la invención incluye un anticuerpo IL-6a que se ha modificado en comparación con un anticuerpo de referencia para alterar, por ejemplo, incrementar, disminuir o eliminar, la función de efecto biológico del IL-6a. En un ejemplo, la región Fc se modifica o el dominio Fc parental se reemplaza con un dominio Fc modificado para alterar la farmacocinética del IL-6a modificado en comparación con el original no modificado. En algunos modos de realización, el IL-6a se genomanipula para tener una estructura de IgG2. En otros modos de realización, el IL-6a está en una estructura IgG1 o IgG2 y tiene un Fc modificado que incrementa la afinidad de unión del IL-6a a pH 6,0 y no altera sustancialmente la afinidad de unión a pH 7,0 en comparación con un IL-6a original u otro de referencia. En modos de realización, el dominio Fc se modifica y el IL-6a tiene una acumulación sistémica reducida, una semivida disminuida y/o un aclaramiento sistémico incrementado en comparación con un IL-6a original u otro de referencia.

[0284] En algunos modos de realización, un anticuerpo IL-6a se modifica para incrementar la fijación del complemento y la citotoxicidad dependiente del complemento. En otros aspectos, el anticuerpo IL-6a se modifica para incrementar la capacidad del anticuerpo en comparación con un anticuerpo de referencia para activar células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC). En algunos casos, los anticuerpos como se divulga en el presente documento se pueden modificar tanto para potenciar su capacidad de activar células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) como para potenciar su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

[0285] En algunos modos de realización, los anticuerpos divulgados en el presente documento se modifican para reducir su capacidad para fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En otros modos de realización, los anticuerpos se modifican para reducir su capacidad para activar células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC). Aún en otros modos de realización, un anticuerpo como se divulga en el presente documento se puede modificar tanto para reducir su capacidad para activar células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) como para reducir su capacidad para fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

[0286] En general, es ventajoso evitar el suministro frecuente de una dosis de un IL-6a, por ejemplo, cuando se suministra por inyección en el ojo. Para facilitar este rasgo característico, en determinados modos de realización, la semivida en el sitio de suministro, por ejemplo, el vítreo, de un IL-6a como se divulga en el presente documento es de al menos 4 días, por ejemplo, al menos 7 días, al menos 9 días, al menos 11 días o al menos 14 días. En determinados modos de realización, la semivida media de un IL-6a es de al menos 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 25 días, 30 días, 40 días, 50 días o 60 días. Los procedimientos para incrementar la semivida de un anticuerpo son conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.º 6.277.375 y las publicaciones internacionales n.<os>WO 1998/23289 y WO 1997/3461. En algunos modos de realización, la semivida de un IL-6a es mayor en el sitio de suministro diana, por ejemplo, el vítreo, que la semivida sistémica, por ejemplo, semivida en sangre, suero, plasma, linfa, hígado, riñón u otro tejido o líquido corporal).

[0287] En otro modo de realización, la invención proporciona un artículo de fabricación que incluye un recipiente. El recipiente incluye una composición que contiene un IL-6a como se divulga en el presente documento, y un prospecto del envase o ficha técnica que indica que la composición se puede usar para tratar un trastorno relacionado con IL-6. Típicamente, la composición es un IL-6a en una composición que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0288] En algunos casos, la invención es un kit que comprende una composición que contiene un IL-6a como se divulga en el presente documento, e instrucciones para administrar la composición a un sujeto que necesita tratamiento. En modos de realización en los que es deseable un IL-6a grande, por ejemplo, para potenciar la retención del IL-6a en o cerca de su sitio de suministro, un resto que incrementa el tamaño pero no afecta significativamente de manera adversa a la función del IL-6a (por ejemplo, afinidad de unión de la IL-6 por IL-6 o complejo IL-6/IL-6R) se puede asociar con el IL-6a. Por ejemplo, un Fab se puede genomanipular para expresarse como polipéptidos individuales que contienen un resto Fab y un resto Fc.

[0289] En modos de realización en los que es deseable un tamaño relativamente pequeño para el IL-6a, se pueden usar fragmentos de un anticuerpo frente a IL-6, por ejemplo, un scFv o un fragmento Fab. Un anticuerpo IgG tiene un tamaño de aproximadamente 150 kD, un Fab es de aproximadamente 50 kD y un scFv es de aproximadamente 25 kD. En algunos modos de realización, un IL-6a como se describe en el presente documento tiene un tamaño de menos de aproximadamente 50 kD. Dicho antagonista puede ser, por ejemplo, menor que o igual a 50 kD y mayor que 10 kD, menor que o igual a 50 kD y mayor que 20 kD, o menor que o igual a 50 kD y mayor que o igual a 25 kD.

[0290] En algunos casos, la estabilidad de un antagonista de IL-6, por ejemplo, un anticuerpo u otro inhibidor que tiene disulfuros, se mejora creando una variante en la que uno o más de los puentes disulfuro son más estables que en la molécula original.

[0291] Otra ventaja de determinadas moléculas de IL-6a descritas en el presente documento puede ser la disponibilidad de moléculas eficaces que tienen un tamaño adecuado para su modo de suministro, sitio de suministro o modo de actividad. Por ejemplo, se puede usar un IL-6a en un formato Fab para una aplicación tópica. Los procedimientos de genomanipular dichas moléculas se describen en el presente documento y son conocidos en la técnica.Indicaciones/Enfermedad asociada a IL-6

[0292] Las enfermedades que se pueden tratar con un IL-6a de la invención incluyen aquellas enfermedades en las que la IL-6 elevada se asocia con el estado de enfermedad o como un requisito previo para el estado de enfermedad. Dichas enfermedades incluyen aquellas en las que la angiogénesis y la inflamación accionadas por IL-6 contribuyen a la patología de la enfermedad. Esto incluye enfermedades en las que la IL-6 se eleva en comparación con los niveles normales, por ejemplo, enfermedades en las que la IL-6 se eleva en el vítreo (tales como, por ejemplo, edema macular diabético, retinopatía diabética y uveítis) o tejidos del ojo. Los ejemplos incluyen determinadas enfermedades oculares incluyendo, sin limitación, sequedad ocular (por ejemplo, xeroftalmia o síndrome de ojos secos), conjuntivitis alérgica, uveítis, degeneración macular senil (DMS), retinopatía diabética proliferativa (RDP), edema macular diabético (EMD), desprendimiento de retina regmatógeno (DRR), oclusión de la vena retiniana (OVR), neuromielitis óptica (NMO). Otros trastornos oculares que se pueden tratar incluyen los provocados por traumatismos tales como trasplante de córnea, abrasión corneal u otra de dicha lesión física en el ojo. En consecuencia, la invención incluye tratar a un sujeto que tiene una enfermedad relacionada con IL-6 con un IL-6a descrita en el presente documento.

[0293] En algunos modos de realización, la enfermedad asociada a IL-6 es una enfermedad inflamatoria. En algunos modos de realización, la enfermedad es glaucoma.

[0294] En algunos modos de realización, la enfermedad es dolor ocular.

[0295] En algunos modos de realización, el tratamiento de un sujeto también incluye determinar si el sujeto tiene una enfermedad asociada a IL-6 y, opcionalmente, si el sujeto es resistente a otros tratamientos inhibidores distintos de IL-6 tales como esteroides o agentes terapéuticos anti-VEGF.

[0296] Un problema con determinados agentes terapéuticos basados en anticuerpos que son eficaces en un locus específico tal como el ojo, por ejemplo en el vítreo, son los efectos adversos que resultan de la administración sistémica. Una solución es proporcionar agentes terapéuticos que se puedan suministrar por vía local a diferencia de sistémica como se ejemplifica por las moléculas descritas en el presente documento. Debido a que algunos agentes terapéuticos que se suministran por vía local, por ejemplo, en el vítreo, aparecerán por vía sistémica, en cierta medida, es ventajoso diseñar una molécula que tenga un recambio sistémico relativamente rápido. Los solicitantes han diseñado ejemplos de anticuerpos frente a IL-6 diseñados para un recambio sistémico rápido, por ejemplo, en comparación con la molécula original o un anticuerpo de referencia. Esto se logró mutando el dominio Fc para modificar la unión a FcRn de la molécula, por ejemplo, para reducir el reciclaje mediado por FcRn del IL-6a.Edema macular diabético(EMD).El edema macular diabético (EMD) implica la oclusión y fuga de los vasos sanguíneos retinianos, provocando agudeza visual reducida y potencialmente ceguera. Los tratamientos estándar para EMD incluyen administración local de esteroides o anticuerpos anti-VEGF. Sin embargo, muchos pacientes no responden a estos tratamientos. La patogénesis del edema macular diabético implica componentes de angiogénesis, inflamación y estrés oxidativo. IL-6 se induce por hipoxia e hiperglucemia y puede incrementar la inflamación vascular, permeabilidad vascular y angiogénesis patológica. IL-6 puede inducir directamente la expresión de VEGF y puede promover la neovascularización coroidea en modelos animales. En pacientes con EMD, los niveles de IL-6 oculares se correlacionan positivamente con grosor macular y gravedad de la enfermedad. Según se informa, los niveles de IL-6 son elevados en pacientes que no responden a tratamiento anti-VEGF mientras que disminuyen en pacientes que responden a anti-VEGF. En consecuencia, la administración de un IL-6a como se describe en el presente documento es útil para el tratamiento de diabéticos en combinación con un agente terapéutico anti-VEGF o como una alternativa al tratamiento anti-VEGF, incluso para pacientes que no responden al tratamiento anti-VEGF. El tratamiento de edema macular con un IL-6a también puede mejorar la seguridad retirando la necesidad de inhibir completamente cualquier mecanismo para inhibir la patología, preservando por tanto algunos de los roles fisiológicos deseados de cada citocina. En consecuencia, el tratamiento con IL-6a local en combinación con la inhibición de VEGF puede disminuir la frecuencia de la dosis y reducir los efectos adversos del tratamiento.

[0297] En EMD existen correlaciones positivas entre los niveles de IL-6 vítrea y tanto la gravedad de la enfermedad como los sujetos que no responden a VEGF. En consecuencia, un IL-6a como se describe en el presente documento se puede usar para tratar sujetos con EMD que no responden a tratamiento con esteroides, tratamiento anti-VEGF o ambos. En algunos casos, se usa un IL-6a en combinación con tratamiento anti-VEGF o tratamiento con esteroides, por ejemplo, para tratar EMD.

[0298] Una IL-6a descrita en el presente documento también se puede usar para tratar trastornos tales como cáncer, por ejemplo, cáncer de próstata, leucemia, mieloma múltiple, enfermedad inflamatoria (tal como enfermedades proliferativas inflamatorias crónicas) y autoinmunitaria, por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad de Castleman (hiperplasia de ganglios linfáticos gigantes o angiofoliculares, hamartoma linfático, hiperplasia de ganglios linfáticos angiofoliculares), artritis idiopática juvenil (incluyendo artritis idiopática juvenil poliarticular y artritis idiopática juvenil sistémica), enfermedad de Still (que engloba artritis idiopática juvenil y enfermedad de Still de aparición en el adulto), enfermedad de Still de aparición en el adulto, amiloidosis amiloide A, polimialgia reumática, sinovitis simétrica seronegativa remitente con edema puntiforme, espondiloartritis, enfermedad de Behçet (incluyendo tratamiento de manifestaciones oculares), ateroesclerosis, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, polimiositis (una miopatía inflamatoria), policondritis recidivante, hemofilia A adquirida, esclerosis múltiple, anemia de inflamación y enfermedad de Crohn.

[0299] Los antagonistas de IL-6 también son útiles para el tratamiento de determinadas enfermedades neurológicas, por ejemplo, depresión y enfermedad de Alzheimer.

[0300] Otras enfermedades que se pueden tratar con un IL-6a descrito en el presente documento incluyen, sin limitación, esclerosis sistémica, arteritis de Takayasu, arteritis de células gigantes, enfermedad injerto contra huésped y síndrome periódico asociado al receptor de TNF (TRAPS).

[0301] Dosificación

[0302] Un anticuerpo frente a IL-6 o fragmento del mismo se puede administrar a un sujeto (por ejemplo, un paciente) que expresa, por ejemplo, niveles anormalmente altos de IL-6. El anticuerpo o fragmento del mismo se puede administrar una vez o se puede administrar múltiples veces. El anticuerpo se puede administrar, por ejemplo, de tres veces al día a una vez cada seis meses o más. La administración puede ser en una pauta tal como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses. El anticuerpo o fragmento del mismo se puede administrar continuamente por medio de una minibomba u otra vía tal como una cápsula de liberación lenta implantable o por una célula encapsulada que produce el anticuerpo o fragmento del mismo. El anticuerpo o fragmento del mismo se puede administrar por medio de una vía mucosa, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, intraocular o intratumoral. El anticuerpo o fragmento del mismo se puede administrar una vez, al menos dos veces o durante al menos el período de tiempo hasta que la afección se trate, palie o cure. El anticuerpo o fragmento del mismo en general se administrará mientras la afección esté presente. El anticuerpo o fragmento del mismo, en general se administrará como parte de una composición farmacéutica como se describe en el presente documento. La dosificación del anticuerpo en general estará en el intervalo de 0,1 a 100 mg/kg, de 0,5 a 50 mg/kg, de 1 a 20 mg/kg y de 1 a 10 mg/kg. La concentración sérica del anticuerpo o fragmento del mismo se puede medir por cualquier procedimiento adecuado. Un rasgo característico de determinados compuestos descritos en el presente documento es que requieren una dosificación relativamente infrecuente, por ejemplo, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, una vez cada cuatro semanas, una vez cada dos semanas, una vez cada 8 semanas, una vez cada 12 semanas, una vez cada 16 semanas, una vez cada 32 semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses o una vez cada seis meses. En algunos casos, el compuesto se administra según sea necesario, determinado, por ejemplo, por la afección de un sujeto. Un rasgo característico de los antagonistas de IL-6 descritos en el presente documento que permite una dosificación relativamente infrecuente es la combinación de alta potencia que se logra, al menos en parte, por una velocidad de disociación lenta una vez unida a una IL-6 y la capacidad para suministrar una concentración relativamente alta del compuesto. En algunos casos, el IL-6a se administra como monoterapia. En otros modos de realización, el IL-6a se administra de forma simultánea con metotrexato u otro fármaco antiartrítico modificador de la enfermedad.

[0303] Generación de anticuerpos

[0304] Un anticuerpo IL-6a o derivado o fragmento del mismo se puede producir usando procedimientos conocidos en la técnica tales como metodología de anticuerpos monoclonales (por ejemplo, véase Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495). También se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales tales como transformación vírica u oncogénica de linfocitos B.

[0305] Los anticuerpos quiméricos o humanizados se pueden preparar en base a la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado usando procedimientos conocidos en la técnica. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de la cadena pesada y ligera se puede obtener de un hibridoma murino de interés y genomanipularse para contener secuencias de inmunoglobulina no murina (por ejemplo, humana) usando técnicas de biología molecular estándar. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas se pueden enlazar a regiones constantes humanas usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 4.816.567). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR murinas se pueden insertar en una estructura humana usando procedimientos conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 5.225.539, y las patentes de EE. UU. n.<os>5.530.101; 5.585.089; 5.693.762; y 6.180.370). En modos de realización, un IL-6a descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-6 o derivado o fragmento del mismo) se puede unir específicamente a IL-6 humana. En modos de realización, el IL-6a se puede unir específicamente al sitio II de IL-6 (por ejemplo, sitio II de IL-6 humana).

[0306] En algunos modos de realización, un anticuerpo IL-6a es un anticuerpo monoclonal humano. Dichos anticuerpos se pueden generar usando ratones transgénicos o transcromosómicos que comprenden porciones de un sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen "ratones con Ig humana" tales como el HuMAb Mouse® y KM Mouse® (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.<os>5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; la patente de EE. UU. n.º 5.545.807; las publicaciones PCT n.<os>: WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962; y la publicación PCT n.º WO 01/14424).

[0307] En otro aspecto, se pueden producir anticuerpos anti-IL-6 humanos usando un ratón que porta secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcomosomas, tal como un ratón que porta un transgén de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana. Dichos ratones se describen en detalle en la publicación PCT n.º WO 02/43478.

[0308] Otros sistemas de animales transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden usar para producir un anticuerpo IL-6a. Por ejemplo, se puede usar un sistema transgénico alternativo denominado Xenomouse<TM>(Abgenix, Inc.); dichos ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.<os>5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584; y 6.162.963. Además, los sistemas de animales transcromosómicos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden usar para producir un anticuerpo IL-6a. Por ejemplo, los ratones que portan tanto un transcromosoma de la cadena pesada humana como un transcromosoma de la cadena ligera humana se describen en Tomizukaet al. (2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:722-727). También se pueden preparar anticuerpos monoclonales humanos usando ratones SCID en los que se han reconstituido células inmunitarias humanas de modo que se puede generar una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunización. Dichos ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.<os>5.476.996 y 5.698.767.

[0309] Colecciones de presentación en fagos

[0310] En algunos casos, se produce un anticuerpo IL-6a o derivado o fragmento del mismo en un procedimiento que implica sintetizar una colección de anticuerpos humanos usando fagos, cribar la colección con una IL-6, por ejemplo, una IL-6 humana, o un fragmento de la misma, aislar fagos que se unen a IL-6 y obtener el anticuerpo a partir del fago.

[0311] El anticuerpo humano recombinante IL-6a también se puede aislar cribando una colección de anticuerpos combinatorios recombinantes. En general, la colección es una colección de presentación en fagos scFv, generada usando ADNc de VL y VH humanos preparados a partir de ARNm aislado de linfocitos B. Los procedimientos para preparar y cribar dichas colecciones son conocidos en la técnica. Los kits para generar colecciones de presentación en fagos están disponibles comercialmente (por ejemplo, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, n.º catálogo 27-9400-01; y the Stratagene SurfZAP<TM>phage display kit, n.º catálogo 240612). Otros procedimientos y reactivos que se pueden usar para generar y cribar colecciones de presentación de anticuerpos son conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 5.223.409; publicaciones PCT n.<os>WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchset al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hayet al., Hum Antibod Hybridomas 3:81-85 (1992); Huseet al., Science 246:1275-1281 (1989); McCaffertyet al., Nature 348:552-554 (1990); Griffithset al., EMBO J 12:725-734 (1993); Hawkinset al., J Mol Biol 226:889-896 (1992); Clacksonet al., Nature 352:624-628 (1991); Gramet al., Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580 (1992); Garradet al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboomet al., Nuc Acid Res 19:4133-4137 (1991); y Barbaset al., Proc Natl Acad Sci USA 88:7978-7982 (1991).

[0312] En un ejemplo para aislar y producir anticuerpos frente a IL-6 humana con las características deseadas, se usa primero un anticuerpo frente a IL-6 humana para seleccionar secuencias de la cadena pesada y ligera humanas que tienen una actividad de unión similar hacia IL-6, usando procedimientos de impresión de epítopos descritos en la publicación PCT n.º WO 93/06213. Las colecciones de anticuerpos usadas en este procedimiento son en general colecciones de scFv preparadas y cribadas como se describe en la publicación PCT n.º WO 92/01047; McCaffertyet al., Nature 348:552-554 (1990); y Griffithset al., EMBO J 12:725-734 (1993),

[0313] Una vez que se seleccionan los dominios VL y VH humanos iniciales, se realizan experimentos de "mezcla y emparejamiento", en los que se criban diferentes pares de los segmentos VL y VH seleccionados inicialmente para determinar la unión a IL-6 para seleccionar combinaciones de pares VLNH preferentes. Para seleccionar rasgos característicos deseables de un IL-6a, los segmentos VL y/o VH de un par seleccionado se pueden mutar aleatoriamente. Esta maduración de afinidadin vitrose puede lograr, por ejemplo, amplificando los dominios VH y VL usando cebadores de PCR complementarios a una CDR de uno o ambos de los dominios VH y VL seleccionados, cebadores que contienen una mezcla aleatoria de las cuatro bases nucleotídicas en determinadas posiciones de modo que los productos de PCR resultantes codifican segmentos VH y VL en los que se han introducido mutaciones aleatorias en VH y/o VL. Dichos segmentos de VH y VL mutados aleatoriamente se pueden volver a cribar para determinar la unión a IL-6, por ejemplo, al sitio II de IL-6.

[0314] Después del cribado y aislamiento de un anticuerpo IL-6a de una colección de expresión de inmunoglobulina recombinante, los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo seleccionado se pueden recuperar del paquete de expresión (por ejemplo, del genoma del fago) y subclonarse en otros vectores de expresión usando técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Dichos anticuerpos se pueden manipular además para producir un fragmento de anticuerpo tal como los descritos en el presente documento.

[0315] Farmacocinética (FC)

[0316] Las pruebas de FC se pueden realizar usando procedimientos descritos en el presente documento y/o procedimientos conocidos en la técnica. Una barrera para las determinaciones que requieren el uso de un animal, por ejemplo, la determinación de FC, es que la IL-6 humana tiene menos de un 50 % de homología con la de algunos animales comúnmente usados para dichas pruebas. Un procedimiento para someter a prueba la FC es, por lo tanto, el uso de un ratón transgénico que expresa IL-6 humana. En algunos modos de realización, se usa un primate no humano para determinar FC.

[0317] En algunos modos de realización, un anticuerpo anti-IL6 se muta para alterar su FC, por ejemplo, alterando la sensibilidad al pH de la unión a FcRn. Un procedimiento para obtener dichas mutaciones se describe en los ejemplos. En consecuencia, en algunos modos de realización, el IL-6a tiene FC sistémica alterada en comparación con un IL-6a original o una molécula de referencia. En algunos casos, la FC no se altera o se mejora en el vítreo. En algunos modos de realización, el IL-6a tiene FC sistémica reducida (por ejemplo, semivida disminuida y/o aclaramiento incrementado, por ejemplo, tal como se somete a ensayo en un líquido circulatorio tal como sangre, plasma, linfa o suero) en comparación con un IL-6a original o una molécula de referencia.

[0318] Modelos para someter a prueba un antagonista de IL-6

[0319] Se pueden someter a prueba antagonistas de IL-6 en modelos de enfermedad para determinar el suministro asociado a IL-6, en particular para determinar la eficacia del tratamiento y los efectos nocivos limitados sobre las propiedades de IL-6 ventajosas. Por ejemplo, la uveítis se puede someter a prueba en un modelo de uveítis autoinmunitaria experimental en ratas o ratones (Caspi, Invest Ophthalmol Vis Sci 52:1873; Agarwalet al., 900:443-69, 2012) usando la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores (IRBP) en la inmunización con adyuvante de Freund (CFA) completa. Otros modelos incluyen los conocidos en la técnica para uveítis inducida por células dendríticas, transferencia adoptiva de linfocitos T efectores cultivados, EAU espontánea en ratones IRBP TCR Tg, uveítis inducida por endotoxinas, uveorretinitis autoinmunitaria (Harutaet al., Invest Ophthalmol Vis Sci 53:3264 (2011); Yoshimuraet al., Rheumatology 48:347–354 (2009)).

[0320] Otros sistemas de modelo que se pueden usar para examinar los efectos de un IL-6a en el tratamiento de la enfermedad asociada a IL-6 son, por ejemplo, un modelo de neovascularización coroidea (NVC) (Izumi-Nagaiet al., Am J Pathol 170:6 (2007); Krzystoliket al., Arch Ophthalmol 120:338 (2002)) y modelos diabéticos tales como los descritos en Kernet al. ((Animal Models Of Diabetic Complications Consortium (P01 DK57733), Update Report (septiembre de 2001 – enero de 2004)). Los modelos animales útiles para someter a prueba un IL-6a en artritis reumatoide son conocidos en la técnica, por ejemplo, véase Asquithet al. (Eur J Immunol 39:2040-4 (2009)) y Kolliaset al. (Ann Rheum Dis 70:1357-62 (2011).

[0321] Los modelos de NVC son representativos, por ejemplo, de las afecciones humanas de DMS y EMD. Los modelos de neovascularización retiniana son útiles, por ejemplo, para estudiar retinopatías isquémicas, por ejemplo, retinopatía diabética o retinopatía del prematuro. Diversos modelos de neovascularización coroidea y retiniana son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Grossniklaus, H.E.et al. Prog Retin Eye Res.2010 Nov;29(6):500-19. doi: 10.1016/j.preteyeres.2010.05.003. Epub 19 de mayo de 2010; Saisin, Yet al. (2003) Journal of Cellular Physiology, 195:241-248; Takahashi, K.et al. (2003) Investigative Ophthalmology & Visual Science, 44(1):409-415; Lima e Silva, R.et al. (2007) FASEB Journal, 21: 3219-3230; Tobeet al. (1998) American Journal of Pathology, 153(5): 1641-1646; Dong, Aet al. (2011) PNAS, 108(35): 14614-14619; Donget al. (2009) J Cell Physiol 219:544-552; Smith, LEet al.1994 Invest Ophthalmol Vis Sci 1994; 35:101-111; Shen, J.et al. (2007) Investigative Ophthalmology & Visual Science, 48(9):4335-4341) y se puede usar para investigar la eficacia de un IL-6a. La neovascularización coroidea (NVC) se puede inducir, por ejemplo, por láser, luz, cirugía o modificaciones genéticas. Los modelos de neovascularización retiniana inducida por oxígeno son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Smith, LEet al.1994 Invest Ophthalmol Vis Sci 1994; 35:101-111; Shen, J.et al. (2007) Investigative Ophthalmology & Visual Science, 48(9):4335-4341.

[0322] También se puede usar un modelo de isquemia/reperfusión. Véase, por ejemplo, Zheng, Let al. Investigative Ophthalmology & Visual Science, vol. 48 n.º 1 pp. 361-367, 2007. Por ejemplo, el día 1, se inserta una aguja de calibre 30 unida a una bolsa de líquido en la córnea de ratones anestesiados y la presión intraocular (PIO) se eleva hasta aproximadamente 120 mmHg para generar isquemia. Después de 30-90 minutos, se retira la aguja, se normaliza la PIO y se produce un reflujo de la circulación retiniana. La expresión de marcadores inflamatorios incluyendo TNF-α e ICAM-1 se puede evaluar por inmunoelectrotransferencia y qPCR el día 2-6. Adicionalmente, la pérdida de células ganglionares se puede evaluar por histología el día 3-14 y la degeneración capilar se mide por técnica de digestión con tripsina el día 10-14. Para estudios terapéuticos, el artículo de prueba (por ejemplo, 1 µl de una concentración apropiada, por ejemplo, 20 mg/ml, de una IL6a) se inyecta por vía intravítrea poco antes o después de la inducción de isquemia.

[0323] Politerapias

[0324] En algunos modos de realización, se administra un IL-6a en combinación con una segunda entidad terapéutica. Por ejemplo, un IL-6a se administra en un régimen de tratamiento que incluye un inhibidor de VEGF tal como, por ejemplo, ranibizumab. En algunos modos de realización, se administra un IL-6a en un régimen de tratamiento que incluye un inhibidor de PDGF tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGF o anticuerpo receptor anti-PDGF (por ejemplo, imatinib). En algunos modos de realización, se administra un IL-6a en combinación con un inhibidor de la vía del complemento, por ejemplo, lampalizumab (inhibidor del factor D) o un inhibidor de C5.

[0325] Suministro de antagonista de IL-6

[0326] Un antagonista o composición de IL-6 descrito en el presente documento se puede suministrar por vía local, en contacto directo con o bien cerca de una célula o tejido que se dirige a la inhibición de IL-6. Los ejemplos no limitantes de dichos procedimientos de suministro incluyen inyección, infusión o implantación de una sustancia que contiene un antagonista de IL-6.

[0327] En modos de realización, el IL-6a o composición se administra por vía intraocular, por ejemplo, por vía intravítrea, por ejemplo, por medio de inyección intravítrea, un inserto oftálmico o suministro genético.

[0328] En algunos modos de realización, la composición de IL-6a se administra como una formulación oftálmica. Los procedimientos pueden comprender la administración de la composición de IL-6a y un portador oftálmicamente aceptable. En algunos modos de realización, la formulación oftálmica es un líquido, semisólido, inserto, película, micropartícula o nanopartícula. La composición de IL-6a se puede administrar, por ejemplo, por vía tópica o por inyección (por ejemplo, inyección intravítrea).

[0329] En algunos modos de realización, la composición de IL-6a se formula para administración intravítrea.

[0330] En algunos modos de realización, la composición de IL-6a se formula para administración tópica, por ejemplo, en el ojo. La formulación tópica puede ser una formulación líquida o semisólida, por ejemplo, una formulación tópica puede incluir una solución acuosa, una suspensión acuosa, una pomada o un gel. Se puede aplicar por vía tópica una formulación de IL-6a oftálmica en la parte frontal del ojo, debajo del párpado superior, en el párpado inferior y en el fondo de saco. Típicamente, la formulación oftálmica es estéril. Una formulación oftálmica de IL-6a puede contener uno o más excipientes farmacéuticos adecuados para la preparación de formulaciones oftálmicas. Los ejemplos de dichos excipientes son agentes conservantes, agentes tamponantes, agentes quelantes, agentes antioxidantes y sales para regular la presión osmótica. Las formulaciones oftálmicas, que incluyen tanto pomadas como suspensiones, típicamente tienen una viscosidad que es adecuada para la vía de administración seleccionada. En algunos modos de realización, la formulación oftálmica tiene una viscosidad de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 30.000 centipoises.

[0331] En algunos modos de realización, la formulación es una formulación líquida que comprende un polímero. Dicho polímero se puede usar para mejorar la biodisponibilidad, elevar la viscosidad o reducir el drenaje del ojo de una formulación líquida. Los polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Waghet al. (Asian J Pharm, 2:12-17, 2008). En ejemplos no limitantes, el polímero es hialuronasa de sodio, quitosano, una ciclodextrina (por ejemplo, hidroxipropil-β-ciclodextrina), ácido poligalactorónico, xiloglucano, goma xantana, goma de gelano, un tiómero, un poli(ortoéster) (por ejemplo, Einmahl, Adv Drug Deliv Rev 53:45-73, 2001), o un polisacárido de semilla de tamarindo (por ejemplo, Ghelardiet al., Antimicrob Agents Chemother 48:3396-3401, 2004).

[0332] En algunos modos de realización, una formulación que comprende una composición de IL-6a para suministro oftálmico puede comprender uno o más de tensioactivos, adyuvantes, tampones, antioxidantes, ajustadores de tonicidad, conservantes (por ejemplo, EDTA, BAK (cloruro de benzalconio), clorito de sodio, perborato de sodio, policuaterio-1), espesantes o modificadores de la viscosidad (por ejemplo, carboximetilcelulosa, hidroximetilcelulosa, poli(alcohol vinílico), polietilenglicol, glicol 400, hidroximetilcelulosa de propilenglicol, hidroxipropil-guar, ácido hialurónico e hidroxipropilcelulosa) y similares. Los aditivos en la formulación pueden incluir, pero no se limitan a, cloruro de sodio, bicarbonato de sodio, ácido sórbico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, aceite de ricino y perborato de sodio.

[0333] En algunos modos de realización, se usa agua purificada o desionizada en la composición. El pH se puede ajustar añadiendo cualquier ácido, base o tampón de ajuste de pH fisiológica y oftálmicamente aceptable dentro del intervalo de aproximadamente 5,0 a 8,5, por ejemplo, pH 7,0, pH 7,3, pH, 7,4 o pH 7,5. Los ejemplos oftálmicamente aceptables de ácidos incluyen acético, bórico, cítrico, láctico, fosfórico, clorhídrico y similares, y los ejemplos de bases incluyen hidróxido de sodio, fosfato de sodio, borato de sodio, citrato de sodio, acetato de sodio, lactato de sodio, trometamina, trishidroximetilamino-metano y similares. Los ejemplos de sales y tampones que se pueden usar en una formulación incluyen citrato/dextrosa, bicarbonato de sodio, cloruro de amonio y mezclas de los ácidos y bases mencionados anteriormente.

[0335] En algunos modos de realización, la presión osmótica de la composición oftálmica puede ser de aproximadamente 10 miliosmolar (mOsM) a aproximadamente 400 mOsM, por ejemplo, de 200 a 400 mOsM, o de 220 a 370 mOsM. En general, la presión osmótica se puede ajustar usando sales o excipientes fisiológica y oftálmicamente aceptables. En algunos modos de realización, el cloruro de sodio se incluye en una formulación, por ejemplo, el cloruro de sodio está presente en una formulación en una concentración que varía de un 0,01 % a un 1 % en peso, o de un 0,05 % a un 0,45 % en peso, en base al peso total de la composición. También se pueden usar cantidades equivalentes de una o más sales constituidas por cationes tales como potasio, amonio y similares y aniones tales como cloruro, citrato, ascorbato, borato, fosfato, bicarbonato, sulfato, tiosulfato, bisulfato, bisulfato de sodio, sulfato de amonio y similares además de o en lugar de cloruro de sodio para lograr osmolalidades dentro del intervalo deseado. En algunos modos de realización, también se usa un glúcido tal como manitol, dextrosa, sorbitol, glucosa y similares para ajustar la osmolalidad.

[0337] En algunos modos de realización, los procedimientos implican formar o suministrar una liberación lenta del agente en contacto con la superficie externa del ojo. Una liberación lenta se refiere a una fuente de agente que no se retira rápidamente por lágrimas u otros mecanismos de aclaramiento del ojo. Esto permite que estén presentes altas concentraciones continuas y mantenidas de agente en el líquido en la superficie externa del ojo por una sola aplicación. En algunos modos de realización, la liberación lenta puede permanecer hasta ocho horas o más. En algunos modos de realización, la formulación de liberación lenta oftálmica incluye, pero no se limita a, suspensiones poliméricas acuosas, pomadas e insertos sólidos.

[0339] En algunos modos de realización, una composición semisólida es una formulación líquida que se incrementa en viscosidad tras la aplicación en el ojo, típicamente debido a la presencia de un polímero en la formulación líquida para la que se produce un incremento en la viscosidad con un cambio en temperatura, pH o concentración de electrolitos. El polímero puede ser, por ejemplo, acetoftalato de celulosa, ácido poliacrílico, goma de gelano, hialuronasa, quitosano, sales de ácido algínico (por ejemplo, alginato de sodio) o un copolímero de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno (por ejemplo, Pluronic®, BASF; poloxámero). En algún modo de realización, el poli(ácido acrílico) es ácido acrílico reticulado (por ejemplo, Carbopol®). En algunos modos de realización, la composición semisólida comprende una mezcla de carbopol y un copolímero de bloques de óxido de etileno y óxido de propileno; una mezcla de metilcelulosa e hidroxietilcelulosa; o una mezcla de polietilenglicol y un copolímero de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno.

[0341] En algunos modos de realización, la formulación oftálmica que contiene IL-6a es una pomada o gel. En algún modo de realización, la formulación oftálmica es un vehículo de suministro a base de aceite. Por ejemplo, la formulación puede comprender una base de petróleo o lanolina a la que se añade la composición de IL-6a (por ejemplo, a de un 0,1 a un 2 %) y excipientes. Las bases comunes pueden incluir, pero no se limitan a, aceite de vaselina, vaselina y combinaciones de los mismos. En algunos modos de realización, la pomada se aplica como una cinta sobre el párpado inferior.

[0343] En algunos casos, la composición oftálmica es un inserto oftálmico. En modos de realización, la composición se administra por vía intravítrea por medio de un inserto oftálmico.

[0345] Por ejemplo, el inserto oftálmico es biológicamente inerte, blando, bioerosionable, viscoelástico, estable a la esterilización después de la exposición a agentes terapéuticos, resistente a las infecciones de las bacterias transmitidas por el aire, bioerosionable, biocompatible y/o viscoelástico. En algunos modos de realización, el inserto comprende una matriz oftálmicamente aceptable, por ejemplo, una matriz polimérica. La matriz es típicamente un polímero y la composición de IL-6a se dispersa dentro de la matriz o se une a la matriz polimérica. En algunos modos de realización, el agente se libera lentamente de la matriz a través de la disolución o hidrólisis de un enlace covalente. En algunos modos de realización, el polímero es bioerosionable (soluble) y la velocidad de disolución del mismo puede controlar la velocidad de liberación del agente dispersado en el mismo. En otra forma, la matriz polimérica es un polímero biodegradable que se descompone tal como por hidrólisis para liberar de este modo el agente unido a la misma o dispersado en la misma. En otros modos de realización, la matriz y el agente se pueden rodear con un recubrimiento polimérico adicional para controlar además la liberación. En algunos modos de realización, el inserto comprende un polímero biodegradable tal como policaprolactona (PCL), un copolímero de etileno/acetato de vinilo (EVA), poli(cianoacrilato de alquilo), poliuretano, un nailon o poli(dl-láctido-co-glicólido) (PLGA), o un copolímero de cualquiera de estos. En algunos casos, el agente se dispersa en el material de matriz o se dispersa entre la composición monomérica usada para preparar el material de matriz antes de la polimerización. En algunos modos de realización, la cantidad de agente es de aproximadamente un 0,1 a aproximadamente un 50 %, o de aproximadamente un 2 a aproximadamente un 20 %. La matriz polimérica biodegradable o bioerosionable se puede usar de modo que el inserto gastado no se tiene que retirar del ojo. A medida que el polímero biodegradable o bioerosionable se degrada o disuelve, el agente se libera.

[0347] En otros modos de realización, el inserto oftálmico comprende un polímero, que incluye, pero no se limita a, los descritos en Wagh,et al., "Polymers used in ocular dosage form and drug delivery systems", Asian J. Pharm., páginas 12-17 (enero de 2008. En algunos modos de realización, el inserto comprende un polímero seleccionado de polivinilpirrolidona (PVP), un polímero o copolímero de acrilato o metacrilato (por ejemplo, la familia de polímeros Eudragit® de Rohm o Degussa), hidroximetilcelulosa, poli(ácido acrílico), dendrímeros de poli(amidoamina), poli(dimetilsiloxano), poli(óxido de etileno), poli(lactida-co-glicolida), poli(2-hidroxietilmetacrilato), poli(alcohol vinílico) o poli(fumarato de propileno). En algunos modos de realización, el inserto comprende Gelfoam®. En algunos modos de realización, el inserto es un conjugado de poli(ácido acrílico) y cisteína de 450 kDa.

[0349] El inserto puede comprender un núcleo que contiene la composición de IL-6a y un tubo exterior (por ejemplo, como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.º 20040009222). En algunos casos, el tubo exterior puede ser permeable, semipermeable o impermeable al fármaco. En algunos modos de realización, el núcleo incluye una matriz polimérica que no tiene un efecto significativo sobre la velocidad de liberación de la composición de IL-6a. En algunos casos, el tubo exterior, la matriz polimérica del núcleo o ambos son bioerosionables. El producto coextrudido se puede segmentar en dispositivos de suministro de fármaco. En algunos modos de realización, el dispositivo no se recubre de modo que se abren los respectivos extremos, o el dispositivo se recubre, por ejemplo, con una capa que es permeable a la composición de IL-6a, semipermeable a la composición de IL-6a o bioerosionable. En determinados modos de realización, la composición de IL-6a y al menos un polímero se mezclan en forma de polvo.

[0351] En algunos modos de realización, la composición oftálmica es una película oftálmica. Los polímeros adecuados para tales películas incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Wagh,et al. (supra). En algunos modos de realización, la película es una lente de contracción blanda, por ejemplo, una lente compuesta de copolímeros de N,N-dietilacrilamida y ácido metacrílico reticulado con dimetacrilato de etilenglicol.

[0353] En determinados modos de realización, el IL-6a está en un inserto que está en una forma tubular, y puede estar segmentado.

[0355] En algunos modos de realización, la composición de IL-6a se formula en una cantidad terapéuticamente eficaz, se recubre o se dispersa en una matriz polimérica, de modo que la composición de IL-6a está en forma granulada o particulada. En algunos modos de realización, la composición de IL-6a se libera de la formulación a medida que el fármaco de los gránulos se disuelve en o dentro de la matriz, se difunde a través de la matriz y se libera en el líquido fisiológico circundante. En algunos modos de realización, la velocidad de liberación se limita principalmente por la velocidad de disolución de la composición de IL-6a de los gránulos/partículas en la matriz; las etapas de difusión a través de la matriz y dispersión en el líquido circundante no son principalmente limitantes de la velocidad de liberación. En determinados modos de realización, la matriz polimérica es no bioerosionable, mientras que en otros modos de realización es bioerosionable. Los ejemplos de matrices poliméricas no bioerosionables se pueden formar a partir de poliuretano, polisilicona, poli(etileno-co-acetato de vinilo) (EVA), poli(alcohol vinílico) y derivados y copolímeros de los mismos. Los ejemplos de matrices poliméricas bioerosionables se pueden formar a partir de polianhídrido, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poliortoéster, polialquilcianoacrilato y derivados y copolímeros de los mismos.

[0357] En algunos casos, la composición de IL-6a se formula en un material colagenoso. Por ejemplo, el inserto puede ser un inserto de fármaco oftálmico soluble (por ejemplo, una película ovalada polimérica que se puede introducir en el saco conjuntival superior para suministro de fármaco; un inserto elíptico tal como OCUSERT® (sistema terapéutico ocular de pilocarpina, desarrollado por Alza Corporation) que está hecho de etileno-acetato de vinilo; Lacrisert®, un inserto en forma de varilla hecho de celulosa; nuevos sistemas de suministro de fármaco oftálmico (NODS), hechos de poli(alcohol vinílico); o insertos tales como los descritos en Fabrizio (Adv Drug Deliv Rev 16: 95-106, 1998). En algunos casos, el inserto comprende colágeno, gelatina o un polímero, en el que el polímero se selecciona de policaprolactona (PCL), un copolímero de etileno/acetato de vinilo (EVA), poli(cianoacrilato de alquilo), poliuretano, un nailon, poli(dl-lactida-co-glicolida) (PLGA) o un copolímero de cualquiera de estos. En algunos casos, el inserto se implanta debajo del párpado superior. En algunos casos, el inserto se implanta en el segmento posterior del ojo, en el espacio coroideo o en la esclerótica. En algunos modos de realización, el inserto se implanta por vía intravítrea o subrretiniana. En algunos modos de realización, el inserto se inyecta por vía subrretiniana. Los procedimientos de administración y las técnicas para su preparación se exponen en Remington's: The Practice of Science of Pharmacy, 20.<a>edición (Lippincott Williams & Wilkins, 2006).

[0359] En otros modos de realización, un inserto que contiene una composición de IL-6a proporciona una liberación mantenida del agente en el vítreo del ojo. Como se usa en el presente documento, "liberación mantenida" quiere decir que la composición libera el agente durante un periodo de tiempo prolongado de una forma controlada. En algunos modos de realización, el inserto libera el agente a una velocidad tal que la concentración de agente acuoso permanece menor que la concentración de agente vítreo durante la liberación. En algunos modos de realización, la concentración de agente acuoso es de aproximadamente 0,002 µg/ml a aproximadamente 0,01 μg/ml o de aproximadamente 0,01 μg/ml, a aproximadamente 0,05 μg/ml, o menos de aproximadamente 0,05 μg/ml. En algunos modos de realización, el agente se libera a una velocidad de aproximadamente 1 μg/día a aproximadamente 50 μg/día, o de aproximadamente 1 μg/día a aproximadamente 10 μg/día. En algunos modos de realización, el inserto comprende además un agente terapéutico adicional, como se detalla anteriormente, por ejemplo, acetónido de fluocinolona (como el que se halla en el inserto oftálmico Retisert®).

[0361] En algunos modos de realización, la composición oftálmica comprende microesferas o nanopartículas. En algún modo de realización, las microesferas comprenden gelatina. En algunos modos de realización, las microesferas se inyectan en el segmento posterior del ojo, en el espacio coroideo, en la esclerótica, por vía intravítrea o subrretiniana. En algunos modos de realización, las microesferas o nanopartículas comprenden un polímero que incluye, pero sin limitarse a, los descritos en Wagh,et al. (Asian J Pharm 2:12-17, 2008). En algunos modos de realización, el polímero es quitosano, un poli(ácido carboxílico) tal como poli(ácido acrílico), partículas de albúmina, ésteres de ácido hialurónico, poli(ácido itacónico), poli(cianoacrilato de butilo), policaprolactona, poli(isobutil)caprolactona, poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) o poli(ácido láctico). En algunos modos de realización, las microesferas o nanopartículas comprenden partículas lipídicas sólidas.

[0363] En algunos modos de realización, una composición de IL-6a comprende una resina de intercambio iónico. En algunos modos de realización, la resina de intercambio iónico es una zeolita inorgánica o una resina orgánica sintética. En algunos modos de realización, la resina de intercambio iónico incluye, pero no se limita a, las descritas en Wagh,et al.,supra. En algunos modos de realización, la resina de intercambio iónico es un poli(ácido acrílico) parcialmente neutralizado.

[0365] Se puede proporcionar una composición de IL-6a en una suspensión polimérica acuosa. En algunos modos de realización, la composición de IL-6a o un agente de suspensión polimérico se suspende en un medio acuoso (por ejemplo, que tiene las propiedades como se describe anteriormente). Los ejemplos de agentes de suspensión poliméricos incluyen, pero no se limitan a, dextranos, polietilenglicoles, polivinilpirrolidona, geles de polisacáridos, Gelrite®, polímeros celulósicos como hidroxipropilmetilcelulosa y polímeros que contienen carboxi tales como polímeros o copolímeros de ácido acrílico, así como otros demulcentes poliméricos. En algunos modos de realización, el agente de suspensión polimérico es un polímero insoluble en agua e hinchable en agua, especialmente un polímero reticulado que contiene carboxi. En algunos modos de realización, el agente de suspensión polimérico comprende de al menos aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 99,9 %, o de aproximadamente un 95 % a aproximadamente un 99,9 %, en peso en base al peso total de monómeros presentes, de uno o más monómeros monoetilénicamente insaturados que contienen carboxi. En algunos modos de realización, el monómero monoetilénicamente insaturado que contiene carboxi incluye ácido acrílico, ácido metacrílico, ácido etacrílico, ácido metilacrílico (ácido crotónico), ácido cis-alfa-metilcrotónico (ácido angélico), ácido trans-a-metilcrotónico (ácido tíglico), ácido α-butilcrotónico, ácido α-fenilacrílico, ácido α-bencilacrílico, ácido α-ciclohexilacrílico, ácido fenilacrílico (ácido cinámico), ácido cumárico (ácido o-hidroxicinámico) y ácido umbelico (ácido p-hidroxicumárico). En algunos modos de realización, el polímero se reticula por un agente de reticulación polifuncional (por ejemplo, un agente de reticulación difuncional). En algunos modos de realización, el agente de reticulación se contiene en una cantidad de desde aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 5 %, o de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 5,0 %, o de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 1 %, en base al peso total de monómeros presentes. En algunos modos de realización, los agentes de reticulación son monómeros de reticulación difuncionales de poliéter no polialquenilo tales como divinilglicol, 2,3-dihidroxihexa-1,5-dieno, 2,5-dimetil-1,5-hexadieno, divinilbenceno, N,N-dialilacrilamida, N,N-dialimetacrilamida; agentes de reticulación de poliéter polialquenilo que contienen dos o más agrupaciones de éter alquenílico por molécula, por ejemplo, agrupaciones de éter alquenílico que contienen grupos H<2>C=C terminales, preparados por eterificación de un poli(alcohol hídrico) que contiene al menos cuatro átomos de carbono y al menos tres grupos hidroxilo con un haluro de alquenilo tal como bromuro de alilo o similares, por ejemplo, polialilsacarosa, polialilpentaeritritol o similares; agentes de reticulación macroméricos no hidrófilos diolefínicos que tienen pesos moleculares de aproximadamente 400 a aproximadamente 8.000, tales como diacrilatos y poliacrilatos insolubles y metacrilatos de dioles y polioles, productos de reacción de diisocianato hidroxialquilacrilato o metacrilato de prepolímeros terminados con isocianato derivados de poliéster dioles, poliéter dioles o polisiloxano dioles con hidroxialquilmetacrilatos y similares.

[0367] En algunos modos de realización, los polímeros reticulados se preparan a partir de un monómero o monómeros monoetilénicamente insaturados que contienen carboxi como el único monómero monoetilénicamente insaturado presente, conjuntamente con un agente o agentes de reticulación. En algunos modos de realización, los polímeros son aquellos en los que hasta aproximadamente un 40 %, y preferentemente de aproximadamente un 0 % a aproximadamente un 20 % en peso, del monómero o monómeros monoetilénicamente insaturados que contienen carboxi se ha reemplazado por uno o más monómero o monómeros monoetilénicamente insaturados que no contienen carboxilo que contienen solo sustituyentes fisiológica y oftálmicamente inocuos, incluyendo ésteres de ácido acrílico y metacrílico tales como metacrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de butilo, acrilato de 2-etilhexilo, metacrilato de octilo, metacrilato de 2-hidroxietilo, acrilato de 3-hidroxipropilo y similares, acetato de vinilo, N-vinilpirrolidona y similares (por ejemplo, Muelleret al. patente de EE. UU. n.º 4.548.990). En algunos modos de realización, los polímeros incluyen policarbofilo (Noveon AA-1), Carbopol® y DuraSite®. En algunos modos de realización, los polímeros reticulados se preparan polimerizando en suspensión o emulsión los monómeros, usando catalizadores de polimerización por radicales libres convencionales, hasta un tamaño de partícula seca de no más de aproximadamente 50 µm de diámetro esférico equivalente. En algunos modos de realización, el tamaño de partícula seca promedio es de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 μm, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 μm de diámetro esférico equivalente. En algunos modos de realización, las partículas de polímero se obtienen moliendo mecánicamente partículas de polímero más grandes. En modos de realización adicionales, dichos polímeros tendrán un peso molecular de aproximadamente 250.000 a aproximadamente 4.000.000, y de 3.000.000.000 a 4.000.000.000. En otros modos de realización, las partículas de polímero reticulado son monodispersas, lo que quiere decir que tienen una distribución de tamaño de partícula tal que al menos aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 % o aproximadamente un 95 % de las partículas están dentro de una banda de μm de distribución de tamaño de partícula principal. En otros modos de realización, el tamaño de partícula monodisperso quiere decir que no hay más de aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 10 % o aproximadamente un 5 % de partículas de un tamaño inferior a 1 µm. En algunos modos de realización, la suspensión polimérica acuosa comprende de aproximadamente un 0,05 a aproximadamente un 1 %, de aproximadamente un 0,1 a aproximadamente un 0,5 % o de aproximadamente un 0,1 a aproximadamente un 0,5 % del agente y de aproximadamente un 0,1 a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 0,5 a aproximadamente un 6,5 %, de aproximadamente un 0,5 a aproximadamente un 2,0 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 1,2 %, de aproximadamente un 0,6 a aproximadamente un 0,9 % o de aproximadamente un 0,6 a aproximadamente un 0,8 % de un agente de suspensión polimérico. Aunque se hace referencia en singular, se debe entender que se pueden usar una o más especies de agente de suspensión polimérico con la cantidad total dentro de los intervalos establecidos. En un modo de realización, la cantidad de partículas de polímero ligeramente reticuladas insolubles, el pH y la presión osmótica se pueden correlacionar entre sí y con el grado de reticulación para dar una composición que tiene una viscosidad en el intervalo de desde aproximadamente 500 a aproximadamente 100.000 centipoises, y preferentemente de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 30.000 o de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 10.000 centipoises, como se mide a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) usando un viscosímetro Brookfield Digital LVT equipado con un husillo número 25 y un adaptador de muestra pequeño 13R a 12 rpm. En algunos modos de realización, la viscosidad es de aproximadamente 10 a aproximadamente 400 centipoises, de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 centipoises o de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 centipoises.

[0369] En algunos modos de realización, las suspensiones poliméricas acuosas se pueden formular de modo que conservan la misma o sustancialmente la misma viscosidad en el ojo que tenían antes de la administración en el ojo. En algunos modos de realización, se pueden formular de modo que existe una gelificación incrementada tras el contacto con el líquido lagrimal. Por ejemplo, cuando una formulación que contiene DuraSite® u otro polímero de tipo poli(ácido acrílico) similar se administra en el ojo a un pH de menos de aproximadamente 6,7, el polímero se puede hinchar tras entrar en contacto con el líquido lagrimal ya que tiene un pH mayor (alrededor de 7). Esta gelificación o incremento en la gelificación puede dar lugar al atrapamiento de las partículas suspendidas, extendiendo de este modo el tiempo de residencia de la composición en el ojo. En algunos modos de realización, el agente se libera lentamente a medida que las partículas suspendidas se disuelven con el tiempo. En algunos modos de realización, esta vía de suministro incrementa la comodidad del paciente e incrementa el tiempo de contacto del agente con los tejidos oculares, incrementando de este modo el grado de absorción de fármaco y la duración de acción de la formulación en el ojo. Los agentes contenidos en estos sistemas de suministro de fármaco se liberarán de los geles a velocidades que dependen de factores tales como el propio fármaco y su forma física, el grado de carga de fármaco y el pH del sistema, así como de cualquier adyuvante de suministro de fármaco, tal como resinas de intercambio iónico compatibles con la superficie ocular, que también pueden estar presentes.

[0370] En algunos modos de realización, se proporciona un antagonista de IL-6 a un sujeto usando suministro genético, por ejemplo, suministro genético local. Dicho suministro puede ser por medio de un sistema de expresión transitorio, un sistema de expresión estable (por ejemplo, integrado) tal como un sistema de suministro lentivírico fabricado por Bluebird Bio (Cambridge, MA) o suministro en un centro productor de células tales como las fabricadas por Neurotech (Cumberland, Rhode Island).

[0372] Todos los rasgos característicos técnicos se pueden combinar individualmente en todas las combinaciones posibles de dichos rasgos característicos.

[0374] Los modos de realización anteriores se deben considerar en todos los aspectos ilustrativos en lugar de limitantes de la invención descrita en el presente documento.

[0376] Ejemplos

[0378] Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran además modos de realización de las invenciones descritas en el presente documento.

[0380] Ejemplo 1: validación del bloqueo de IL-6 local en el modelo de neovascularización coroidea (NVC)Para determinar si el bloqueo de IL-6 local podría ser eficaz para tratar la enfermedad ocular, por ejemplo, edema macular diabético (EMD) o DMS húmeda, se administró por vía local un anticuerpo anti-IL-6 usando un sistema modelo para neovascularización coroidea. Un modelo NVC inducido por láser (eyecro.com/in-vivo/laser-induced-choroidal-neovascularization-cnv/) reproduce muchos de los procesos patológicos subyacentes al EMD, incluyendo inflamación y angiogénesis. Se realizaron estudios en ratas en EyeCRO (Oklahoma City, OK). Seis animales de cada grupo se sometieron a un tratamiento bilateral con láser el día 0 para producir tres lesiones por ojo. Los días 3 y 10, se administraron 3 µg de un anticuerpo anti-IL-6 de rata policlonal (R&D Systems AF506; Minneapolis, MN) al grupo de prueba por inyección intravítrea (IVT), mientras que se administró PBS o un anticuerpo policlonal anti-VEGF (R&D Systems AF564) a los grupos de vehículo y control positivo, respectivamente. Se realizó angiografíain vivolos días 15 y 22 para medir el área de lesión. En ambos días 15 y 22, el grupo tratado con anti-IL-6 tuvo una neovascularización significativamente reducida en comparación con el control con vehículo. No hubo diferencia significativa en la respuesta entre el grupo tratado con anti-IL-6 y el control positivo anti-VEGF. La fig. 1 muestra los resultados de dicho experimento. Estos datos demuestran que una IVT administrada con IL-6a, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL6, puede reducir la neovascularización en un modelo de NVC de rata a niveles similares a los de un control positivo anti-VEGF (p = 0,0054 el día 15 y p = 0,0005 el día 22 para anti-IL-6 frente al control de vehículo).

[0381] Estos datos indican que el bloqueo local de IL-6 puede ser útil para tratar enfermedades oculares tales como enfermedades que implican fuga vascular, por ejemplo, edema macular.

[0382] Ejemplo 2: antagonistas de IL-6 de anticuerpos candidatos

[0383] Los antagonistas de IL-6 de anticuerpos candidatos se desarrollaron usando un proceso que primero implicó inmunizaciones. Las inmunizaciones se realizaron bajo la dirección de los autores de la invención por una organización de investigación por contrato (CRO). A cinco ratones BALB/C se les inyectaron por vía subcutánea 80 µg de IL-6 humana (R&D Systems, n.º cat. 206-IL/CF, Minneapolis, MN) en PBS que contenía NaCl 1 M con adyuvante de Freud. Se realizaron dos refuerzos con 80 µg y 50 µg de IL-6. Se obtuvieron células de bazo del ratón con mayor valor y se fusionaron con células de mieloma P3x763Ag8.653 para formar hibridomas.

[0384] Se cribaron los sobrenadantes de hibridoma para determinar la unión a IL-6 y el antagonismo. Para el ELISA de unión, se recubrieron placas Costar 9018 con 1 µg/ml de IL-6 humana en PBS durante la noche a 4 °C. Los pocillos se bloquearon con PBS que contenía BSA al 2 %, se lavaron y, a continuación, se incubaron con 50 µl de cada sobrenadante de hibridoma diluido 1:2 con PBS que contenía BSA al 2 %. Después de 60 minutos, los pocillos se lavaron tres veces con 300 µl de PBS que contenía Tween-20 al 0,1 %. A continuación, se añadió a cada pocillo anti-HRP de ratón diluido 1:3000 en PBS-BSA y se incubó durante 30 minutos. Se lavaron los pocillos como anteriormente, a continuación se añadió sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) y se midió la señal a 450 y 550 nm. Para los estudios de antagonismo, se incubaron células indicadoras HEK-Blue™-IL6 (InvivoGen, San Diego, CA) con concentraciones crecientes de IL-6 humana en presencia de sobrenadante de hibridoma diluido 1:10. Después de 20-24 horas, se mezclaron 20 µl de sobrenadante con 180 µl de QuantiBlue™ (InvivoGen) y se midió la absorbancia a 655 nm.

[0385] En base a estudios de unión y antagonismo, se seleccionó el hibridoma 64 por los solicitantes como líder y se subclonó en la CRO. El hibridoma 64 (un monoclonal murino) se sometió a prueba además para determinar la capacidad para inhibir la unión del complejo IL-6/IL-6Rα a gp130 usando un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA). El hibridoma 64 a una concentración de 1,5 µg/ml redujo significativamente la unión de un complejo IL-6/IL-6Rα a gp130 inmovilizada por ELISA (fig.2).

[0386] Los subclones se volvieron a cribar y los dominios variables del subclón 64.58 se amplificaron por 5’ RACE PCR y se secuenciaron. Las secuencias de dominio variable de ratón (denominadas m64) son como siguen:

[0387] VH m64 (cadena pesada variable)

[0389]

[0391] VL m64 (cadena ligera variable)

[0394]

[0396] Para crear secuencias humanizadas, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de m64 se injertaron en una estructura de estirpe germinal humana seleccionada por similitud con la secuencia de ratón por un algoritmo computacional. Las secuencias humanizadas (denominadas h64) fueron como siguen (los residuos alterados en comparación con las secuencias de m64 están subrayados) y tienen aproximadamente un 79,5 % de identidad (VH) y un 84,4 % de identidad (VL) con las secuencias murinas:

[0398]

[0400] Las secuencias humanizadas se sintetizaron por DNA2.0 (Menlo Park, CA), a continuación se clonaron en vectores de expresión derivados de pcDNA3.1 como fusiones en línea con los dominios constantes de IgG1 humana. Las IgG se expresaron por transfección transitoria en células Freestyle™-293 (Invitrogen, Grand Island, NY) y se purificaron por cromatografía de proteína A. Tanto en estudios de unión como de antagonismo, la IgG h64 demostró una potencia considerablemente reducida en comparación con su predecesora m64. Por lo tanto, se utilizó la presentación en levaduras para restaurar la afinidad perdida.

[0401] Para llevar a cabo la maduración de afinidad diseñada para restaurar o mejorar la afinidad de la IgG h64 humanizada, las secuencias del anticuerpo h64 se reclonaron para generar una molécula Fab en vectores de levadura derivados de pYC2/CT en los que la cadena FabH se fusionó al scFv anti-FITC 4m5.3 a través de un conector (G4S)<3>(SEQ ID NO:29). A continuación, se generó una colección de variantes de h64 por PCR propensa a errores siguiendo el protocolo de Chaoet al. (2006, Nature Protocols, 1:755-768). Se expresaron variantes de H64 y se capturaron en superficie por levadura marcada con FITC-PEG-NHS, a continuación se incubaron con IL-6 humana biotinilada. Se detectó IL-6 unida con estreptavidina-APC, y las células con la mayor cantidad de IL-6 unida con respecto a la cantidad de Fab presentados se seleccionaron en un separador celular BD FACSAria™. Después de cuatro rondas de selección, se seleccionó y secuenció una población de variantes de mayor afinidad. La secuencia del clon seleccionado por maduración de afinidad (denominada h64-1.4) es como sigue con las mutaciones seleccionadas (es decir, mutadas en comparación con las secuencias de VH y VL h64) en negrita y las CDR están subrayadas. Estos son los dominios variables de 018 (así como las moléculas de IL-6a 020 y 029 descritas a continuación). Cabe destacar que los Fab completos incluyen los dominios CK e CH1 IgG1. En el contexto de esta solicitud, la referencia a una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada o de la cadena ligera "Fab" quiere decir que la secuencia puede ser parte de un Fab funcional que consiste en una secuencia derivada de la cadena ligera y una secuencia derivada de la cadena pesada.

[0402] VH h64-1.4 (018VH)(dominio variable)

[0404]

[0406] HL h64-1.4 (018VL) (dominio variable)

[0409]

[0411] NO:18)

[0412] Los dominios variables de h64-1.4 se reclonaron en el vector de IgG1 humana pcDNA3.1 y se expresaron como una IgG1 de longitud completa en células Freestyle™-HEK<2>93 (Life Technologies). La IgG purificada resultante fue significativamente más potente que el anticuerpo h64 original tanto en estudios de unión como de antagonismo celular. Al someter a prueba la afinidad usando el sistema de levadura, la afinidad se incrementó de 343 μM para la molécula humanizada original a 43 μM. La potencia de antagonista fue aproximadamente un incremento de diez veces como se sometió a ensayo usando el sistema de células HEK-Blue.

[0413] La IgG h64-1.4 se reformateó como un Fab para su uso en indicaciones oculares y otras.

[0414] Adicionalmente, se realizó otra ronda de generación de colecciones y selecciones basadas en levaduras para mejorar además la afinidad. Después de cuatro rondas de selección, hubo un enriquecimiento significativo para una variante de VH con la mutación A79V. Los anticuerpos, variantes y fragmentos de los mismos que comprenden la variante A79V se denominan anticuerpos IL-6a 019, variantes y fragmentos de los mismos.

[0415] Ejemplo 3: selección de formato

[0416] Para investigar formatos adecuados para un antagonista de IL-6 basado en anticuerpo, se sometieron a prueba anticuerpos frente a IL-6 seleccionados como se describesuprapara determinar la expresión transitoria, estabilidad, propiedades de agregación, afinidad de unión y CI50 usando formas Fab,<SC>F<V>(V<H>-V<L>) y<SC>F<V>(V<L>-V<H>) de las secuencias 018.

[0417] Los resultados de estos estudios para una de las moléculas de IL-6a candidatas (secuencias que contienen la región variable 018) se muestran en la tabla 1.

[0418] Tabla 1

[0421]

[0423] Estos datos demuestran un procedimiento para identificar características clave de diversos formatos de un antagonista de IL-6 basado en anticuerpo e ilustran que para antagonistas de IL-6 que contienen las regiones variables 018, el formato 018Fab tiene los rasgos característicos más favorables en la mayoría de las categorías clave, es decir, expresión, estabilidad, agregación y afinidad de unión en comparación con una configuración de scFv. La CI50 del Fab 018 entra dentro de un intervalo razonable para uso terapéutico.

[0424] Ejemplo 4: ejemplos de anticuerpos IL-6a, fragmentos y derivados

[0425] Los solicitantes han identificado las siguientes secuencias usando procedimientos descritos en el presente documento. Las secuencias subrayadas representan las CDR de las cadenas pesada y ligera. Otras secuencias se pueden encontrar a lo largo de la memoria descriptiva.

[0426] Secuencia polipeptídica de la cadena pesada de 018 (longitud completa; f1018HC) en una estructura de IgG1

[0428]

[0430] Secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada de 018 (longitud completa; fl018HC) en una estructura de IgG1

[0432] Secuencia polipeptídica de la cadena pesada de Fab 018 (018FabHC) en una estructura de IgG1. Las CDR están subrayadas

[0433]

[0435] Secuencia polipeptídica de la cadena ligera de longitud completa de 018 (fl018LC). Las CDR están subrayadas

[0436]

[0438]

Q ID NO:2)

[0439] Esta es también la secuencia de la cadena ligera para los antagonistas de IL-6020 y 029

[0440] Secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera de longitud completa de 018 (018LC) en una estructura de IgG1

[0441]

[0443] Cadena pesada de Fab 019 (019FabHC, la misma secuencia que 018FabHC excepto para A79V (negrita/cursiva)

[0444]

[0446] La secuencia de la cadena ligera de anticuerpo 019 (019LC) (polipéptido y ácido nucleico) es la misma que la 018LC

[0447]

[0449] CDR3 de 018LC (CDR3 VL): (SEQ ID NO:9)

[0450]

[0452] Ejemplo 5: cartografía de epítopos y estructuras

[0453] Cartografía de epítopos

[0454] La cartografía de epítopos funcionales se realizó en antagonistas de IL-6 candidatos seleccionados. Se descubrió que un anticuerpo candidato (anticuerpo murino 64) no redujo la unión de IL-6Rα a IL-6 en un ELISA que indica que el anticuerpo candidato no se une al sitio I. Se realizaron experimentos adicionales que demostraron que el anticuerpo 64 murino quimérico redujo la unión del complejo IL-6/IL-6Rα a gp130 en un ELISA que indica que el sitio II o bien el sitio III de IL-6 albergaba el sitio de unión para el anticuerpo. También se descubrió que el anticuerpo 64 murino no bloqueaba significativamente la unión de un anticuerpo de unión al sitio III conocido AH-65 (Immunotech, Marsella, Francia) a IL-6, lo que indica que el anticuerpo candidato se une al sitio II de IL-6. Estos datos demuestran que se pueden generar anticuerpos frente al sitio II y demuestran un procedimiento para identificar dichos anticuerpos.

[0455] Para definir además el epítopo, se generaron mutaciones en IL-6 en levadura como fusiones a 4m5.3 (Boderet al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97, 10701–10705; Chaoet al., 2006, Nat Protoc 1, 755–768). Las mutaciones expresadas fueron en IL-6 humana con las siguientes mutaciones simples o dobles: R24E/D27E, R30E, Y31E, D34R, S118RN121E, W157E, Q159E/T162P, K171E y R179E. Las moléculas de IL-6 mutadas expresadas se usaron en estudios de unión con 018 (Fab). Se observó una afinidad reducida por 018 (Fab) para R24E/K<2>7E, Y31E, D34R y S118RN121R, de las que todas se localizan en el sitio II de IL-6. En consecuencia, la invención descrita en el presente documento incluye un anticuerpo que se une a al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de los aminoácidos en la posición 24, 27, 31, 34, 118 y 121 de IL-6 humana o el sitio equivalente en una IL-6.Definición estructural de un epítopo de sitio II

[0456] Las siguientes distancias se calcularon para definir estructuralmente el sitio II. Los cálculos se basan en la estructura cristalina hexamérica de IL-6/IL-6α/gp130, PDB 1P9M (Boulangeret al., 2003, Science 300: 2101-2104). La hélice 1 de IL-6 pasa entre el sitio I y el sitio II, dando como resultado determinados residuos que están cerca del sitio II pero tienen cadenas laterales que apuntan hacia el sitio I, por ejemplo, R30. D2 y D3 se refieren a dominios extracelulares de IL-6Rα.

[0457] Se determinó que los siguientes aminoácidos de IL-6 están dentro de 5 Å de gp130-D2-D3: L19, R24, K<2>7, Q28, R30, Y31, D34, E110, Q111, R113, A114, M117, S118, V121, Q124, F125 y K128

[0458] Se determinó que los siguientes aminoácidos están dentro de 7 Å de gp130-D2-D3: L19, E23, R24, I25, K<2>7, Q28, I29, R30, Y31, D34, K41, Q102, E109, El 10, Q111, A112, R113, A114, V115, Q116, M117, S118, K120, V121, L122, Q124, F125 y K128.

[0459] En consecuencia, una molécula, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que se puede unir a uno o más de los aminoácidos de IL-6 que están dentro de 5 Å o 7 Å del sitio II puede ser un IL-6a.

[0460] La secuencia de IL-6 humana se proporciona a continuación como referencia (la secuencia subrayada es la secuencia líder). Los aminoácidos dentro de 7 Å de gp130-D2-D3 están en cursiva. La numeración de aminoácidos, por ejemplo, mutaciones usadas para definir epítopos, es sin la secuencia líder:

[0461] IL-6 humana

[0463]

[0465] Los experimentos se realizaron sometiendo a prueba el fragmento Fab del anticuerpo humanizado h64-1.4 y demostraron que podía bloquear la señalización de IL-6 tanto cis como trans, lo que se debe a dirigirse al sitio II. La potencia del fragmento Fab no cambió en presencia del receptor de IL-6 soluble (sIL-6R). Esto está en contraste con una IgG anti-IL-6R que tuvo potencia disminuida en presencia de sIL6R, y que bloquea solo la señalización cis.

[0466] Estos experimentos demuestran que un anticuerpo o fragmento del anticuerpo tal como un fragmento Fab que se dirige al sitio II se puede usar para inhibir la señalización tanto cis como trans de Il-6.

[0467] Ejemplo 6: estudios en primates

[0468] Debido a que las actividades distintas de primate pueden diferir mucho de las de los primates, los antagonistas de IL-6 candidatos típicamente se evalúan además para determinar la FC y otros parámetros usando primates no humanos. La IL-6 humana difiere de la IL-6 de macaco cangrejero y macaco de la India en siete sitios, de los que uno está en el sitio II (aminoácido 28) y es el mismo en el sitio II en la IL-6 de macaco verde africano. Esto parece disminuir la unión de un anticuerpo que comprende secuencias 018 en solo aproximadamente 3-4 veces. La capacidad para unirse a una IL-6 de primate no humano es un rasgo característico útil de un antagonista de IL-6, lo que facilita el desarrollo del candidato como fármaco, por ejemplo, permitiendo pruebas tales como pruebas de toxicología en primates no humanos.

[0469] Como con la mayoría de anticuerpos frente a IL-6, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en el presente documento no reaccionaron de forma cruzada con IL-6 de roedor, conejo o canino debido a la baja homología de secuencia. Sin embargo, en estudios de afinidad, se descubrió que Fab 018 se une a IL-6 de macaco cangrejero y mono verde africano con afinidad aproximadamente humana (tabla 2).

[0470] Tabla 2: afinidad monovalente (Fab 018) para diversas IL-6 de diversas especies

[0472]

[0474] Estos datos demuestran además la capacidad de un IL-6a como se describe en el presente documento para unirse específicamente y la capacidad para desarrollar una molécula que tiene rasgos característicos que permiten las pruebas, por ejemplo, para estudios de toxicología y reproducción, en un animal adecuado.

[0475] Ejemplo 7: incremento en la expresión de un IL-6a

[0476] Para incrementar la expresión de los polipéptidos Fab 018 y Fab 019, se realizaron construcciones introduciendo cinco aminoácidos adicionales (DKTHT (SEQ ID NO:30)) en la cadena pesada en la región CH1/bisagra usando procedimientos conocidos en la técnica. La secuencia de la cadena pesada de 018Fab alterada se muestra a continuación como SEQ ID NO:24. La secuencia de 018 alterada se denomina en el presente documento 020 y la secuencia de 019 alterada se denomina en el presente documento 021. La molécula 020 (la cadena pesada de 020Fab y la cadena ligera de 018Fab) tuvo una expresión mejorada en comparación con el Fab original que tenía cadenas pesada de 018Fab y ligera de 018Fab. La molécula 019 no presentó ninguna diferencia de afinidad significativa en comparación con la molécula 020. La expresión tanto de 020 como de 019 se incrementó en aproximadamente dos veces, respectivamente, y las afinidades no se vieron afectadas por la alteración.

[0477] Cadena pesada de 020 (Fab con DKTHT (SEQ ID NO:30) en el extremo carboxi))

[0479]

[0480] Se midió el antagonismo de IL-6 usando 020Fab en células indicadoras HEK-Blue™-IL-6 (InvivoGen, San Diego, CA). Se incubaron las células en una mezcla de IL-610 μM y concentraciones variables de anticuerpo 020 o bien IL-6Rα (Cell Sciences, Canton, MA), con o sin IL-6Rα 50 nM. Después de 20-24 horas de incubación, se mezclaron 20 µl de sobrenadante de cultivo celular con 180 µl de sustrato QuantiBlue™ (InvivoGen) y se incubaron durante una hora; a continuación se midió la absorbancia a 655 nm. La fig. 3A y la fig. 3B muestran datos de estos experimentos, lo que demuestra la capacidad de 020 para inhibir la actividad de IL-6 en presencia o ausencia de IL-6R.

[0481] Ejemplo 8: anticuerpos frente a IL-6 de IgG2

[0482] Se reformateó 018 en una estructura de isotipo IgG2 humano para reducir la unión a FcγR y reducir la ADCC en comparación con el anticuerpo formateado con IgG1 usando procedimientos conocidos en la técnica. Además, se espera que el reformateo de 018 a un formato de longitud completa, por ejemplo, una IgG2, disminuya la velocidad de aclaramiento del vítreo debido al mayor tamaño de la molécula.

[0483] Construcción/purificación de anticuerpos IgG2 anti-IL6

[0484] Para construir anticuerpos IgG2 humanos usando secuencias anti-IL-6 descritassupra, se amplificó por PCR un dominio constante de IgG2 humano a partir de ADNc con sitios de restricción NheI y MluI en los extremos N y C, respectivamente. El producto de PCR se purificó, se digirió con enzimas de restricción NheI y MluI, y a continuación se ligó en el vector pTT5 que contenía el dominio variable anti-IL6, es decir, SEQ ID NO:1 (véase anteriormente). Esto proporcionó una secuencia de la cadena pesada de IgG2 de longitud completa. Se usaron plásmidos que contenían la cadena ligera de longitud completa que contenía la secuencia de 018 para proporcionar la cadena ligera.

[0485] Para reducir además la unión a FcRn y de este modo reducir el reciclaje del IL-6a, se realizaron mutaciones puntuales en la cadena pesada. Las mutaciones se realizaron por mutagénesis QuikChange® (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Los plásmidos de cadena pesada y ligera se cotransfectaron usando poli(etilenimina) (PEI) en cultivos transitorios de 100 ml de células HEK<2>93-6E y se cultivaron para permitir la expresión durante aproximadamente cinco días. Esto generó anticuerpos que contenían un resto de unión anti-sitio II de anti-IL-6 y estructura de IgG2. Dichas estructuras que contienen CDR 018 se denominan en el presente documento 018IgG2 o 029. Las mutaciones puntuales se realizaron en los residuos I253

[0486] La molécula de IgG2 se expresó bien y bloquea la IL-6 en ensayos celulares con una potencia ligeramente mejorada en comparación con el 020Fab.

[0487] Secuencias maduras de 029 (CDR subrayadas)

[0488] Cadena pesada de 029

[0490]

[0492] Unión a FcRn alterada

[0493] IL-6 puede tener determinados efectos sistémicos positivos. Por lo tanto, es una ventaja genomanipular un IL-6a que tiene una buena retención en el vítreo pero que tiene una semivida sistémica limitada. La reducción o eliminación de la unión a FcRn debería reducir la acumulación sistémica de cualquier fármaco que se escape a la circulación, mejorando de este modo la seguridad de un IL-6a.

[0494] En consecuencia, debido a que el tráfico mediado por FcRn puede incrementar el eflujo de anticuerpos del ojo, la IgG2 020 se modificó además para eliminar la unión a FcRn introduciendo mutaciones de Fc en los residuos I254, H311 o H436 (véase SEQ ID NO:23) numeración de acuerdo con Martinet al., Molecular Cell, 7:4, 867-877 (2001)). Los sitios mutados se muestran en negrita en SEQ ID NO:23; I254 se mutó a A o R, H311 se mutó a A o E, H311 se mutó a N con D 313 mutado a T, y H436 se mutó a A (la numeración comienza después de la secuencia líder, que está subrayada en SEQ ID NO:23. Los antagonistas de IL-6 que contienen dichas secuencias se denominan 018IgG2m.

[0495] Cadena pesada anti-IL-6 (IgG2) (letra normal: VH; letra cursiva: CH) (sin secuencia líder) que muestra los sitios de mutación (negrita)

[0497]

[0499] Cadena pesada anti-IL-6 (IgG2) (letra normal: VH; letra cursiva: CH) con secuencia líder (subrayada) que muestra los sitios de mutación (negrita)

[0501]

[0503] En consecuencia, algunos modos de realización incluyen un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada representada en SEQ ID NO:23 con mutaciones en I254 (por ejemplo, A o R), H311 (mutado a A o E), H436 (mutado a A) o D313 (mutado a T) con H311 mutado a N.

[0504] Por lo tanto, SEQ ID NO:25 proporciona una secuencia que, cuando se muta en I133 (por ejemplo, I133A o I133R), H190 (por ejemplo, H190A o H190E), H315 (por ejemplo, H315A) o D192 con H190 (por ejemplo, D192T con H190N) se puede usar en un anticuerpo, fragmento o derivado del mismo para producir un polipéptido que tiene una unión a Fc reducida a pH bajo, por ejemplo, pH 5,5 o pH lisosómico y/o un polipéptido que tiene una semivida sistémica reducida en comparación con una molécula original u otra de referencia que no incluye la secuencia.

[0505]

[0507] Cadena ligera anti-IL-6 (IgG2) (letra normal: VK; letra cursiva: CK)

[0510]

[0512] Ejemplo 9: estabilidad de formulación

[0513] La estabilidad del fragmento Fab anti-IL-6/IgG1 (que contiene el dominio IgG1CH1) se sometió a prueba determinando la T<f>inicialmente en PBS y a continuación en una gama de tampones y excipientes usando fluorimetría de barrido diferencial. Se descubrió que el tampón citrato, pH 5,5 incrementó la T<f>a más de 80 °C. En consecuencia, en algunos modos de realización, se proporciona un IL-6a en tampón citrato y en algunos casos tiene una T<f>de al menos 80 °C.

[0514] Se sometió a prueba la agregación usando SEC-MALS y no se observó agregación a 20 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS).

[0515] Ejemplo 10: anticuerpos sensibles al pH para FC potenciada

[0516] IL-6 puede tener determinados efectos sistémicos positivos. Por lo tanto, es una ventaja genomanipular un IL-6a que tiene una buena retención en el vítreo pero que tiene una semivida sistémica limitada. La reducción o eliminación de la unión a FcRn debería reducir la acumulación sistémica de cualquier fármaco que se escape a la circulación, mejorando de este modo la seguridad de un IL-6a. En consecuencia, debido a que el tráfico mediado por FcRn puede incrementar el eflujo de anticuerpos del ojo, la IgG2020 se modificó además para eliminar la unión a FcRn introduciendo mutaciones de Fc en los residuos I253, H310 o H435 (numeración de acuerdo con Martinet al. (Molecular Cell, 7:4,867-877 (2001))). Dichos anticuerpos se denominan en el presente documento anticuerpos IL-6pH o anti-IL-6pH y se describen además a continuación.

[0517] Generación de anticuerpos con unión sensible a pH

[0518] El pKa de histidina es de aproximadamente 6,0 y las histidinas insertadas en interfaces de unión pueden interrumpir la unión tras la protonación de la cadena lateral a pH bajo. Usando un anticuerpo dirigido anti-sitio II de IL-6 como se describe en el presente documento, se generó una colección que contenía variantes ricas en histidina de CDR de 018 y se cribó la colección para determinar la unión sensible a pH usando presentación en levaduras. La colección generada fue una colección combinatoria con CDR codificadas por codones degenerados de modo que cada residuo es un residuo natural (es decir, el mismo que en el anticuerpo original) o bien un residuo de histidina. El cribado se realizó alternando la clasificación para una unión alta a pH fisiológico (7,4) y una unión baja a pH endosómico (5,5).

[0519] Se identificó un mutante seleccionado por levadura que tenía una unión relativamente alta a pH 7,4 (Kd monovalente de 407 μM para el mutante en comparación con 192 μM para la molécula original) y una unión relativamente baja a pH 5,5 (Kd monovalente de 2,362 nM para el mutante en comparación con 195 μM para el original). Esto constituye un cambio de aproximadamente 5,8 veces en la afinidad a pH 5,5. Este mutante contenía múltiples mutaciones de histidina en la CDR1 de la cadena ligera. Por tanto, el mutante demostró una unión similar a la molécula original a pH 7,4 y una pérdida significativa de afinidad a pH 5,5. Esta observación se verificó usando análisis ELISA, FACS y RPS por procedimientos conocidos en la técnica.

[0520] Estos datos demuestran que se puede crear un IL-6a que se basa en un anticuerpo que tiene los rasgos característicos de un sitio II dirigido anti-IL-6 de IL-6 que se puede usar para inhibir la actividad tanto cis como trans de IL-6, y tiene FC incrementada en comparación con un anticuerpo original u otro anticuerpo que tiene un dominio Fc natural afectado al menos en parte por la unión alterada a pH 5,5.

[0521] Ejemplo 11: eficacia del bloqueo de IL-6 local en el modelo de neovascularización coroidea (NVC) con láser de ratón

[0522] Para determinar si el bloqueo local de IL-6 podría ser eficaz para tratar una enfermedad ocular, por ejemplo, edema macular diabético (EMD) o DMS húmeda, se administró por vía local un anticuerpo anti-IL-6 monoclonal en un sistema modelo para neovascularización coroidea. El modelo de NVC inducido por láser como se describe en Saishinet al. Journal of Cellular Physiology, 195:241–248 (2003) se empleó en este ejemplo. Un modelo NVC inducido por láser reproduce muchos de los procesos patológicos subyacentes al edema macular diabético (EMD), incluyendo inflamación y angiogénesis.

[0523] Se administró un anticuerpo anti-IL-6 de ratón monoclonal (MP5-20F3, que es un anticuerpo de isotipo IgG1 de rata adquirido de Bio X Cell, número de catálogo BE0046) al grupo de prueba por inyección intravítrea (IVT). Los controles recibieron inyección intravítrea de trampa de VEGF o inyección intravítrea de un anticuerpo de control de isotipo anti-HRP (una IgG1 de rata frente a peroxidasa de rábano picante, clon HRPN, adquirido de BioXCell; número de catálogo BE0088). Para todos los grupos de anticuerpos, se inyectaron 20 µg de proteína en un volumen de 1 µl en el ojo de prueba, mientras que el ojo contralateral se dejó sin tratar como control adicional. Los ratones se sacrificaron el día 7 después de que el láser y las monturas planas coroideas se tiñeran con lectina de Griffonia Simplicifolia (GSA) para medir el área de lesión. La fig.4 muestra los resultados. El grupo tratado con anticuerpo anti-IL-6 mostró una reducción estadísticamente significativa en la neovascularización en comparación con el grupo tratado con anticuerpo de control (p<0,05). De promedio, el grupo tratado con anticuerpo anti-IL-6 también mostró una neovascularización reducida en comparación con el control positivo anti-VEGF.

[0524] Estos datos demuestran que un IL-6a, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-IL-6, administrado por IVT puede reducir significativamente la neovascularización en un modelo de NVC de ratón. Los resultados sugieren además que un anticuerpo anti-IL-6 puede producir una reducción en la neovascularización al menos tan grande, y posiblemente mayor, que un anticuerpo anti-VEGF. Estos datos indican que la inhibición local de IL-6 es útil para tratar enfermedades oculares tales como enfermedades que implican fuga vascular, por ejemplo, DMS húmeda o edema macular, por ejemplo, edema macular diabético.

[0525] Ejemplo 12: desarrollo de un anticuerpo frente a IL-6 mejorado

[0526] Se generaron variantes del anticuerpo EBI-029. Para caracterizar mejor la contribución de las mutaciones A28V, S30P, I51T y S55G, se introdujeron combinaciones específicas en el vector de presentación Fab EBI-029 natural y se midió la unión. Los resultados se muestran en la fig. 5. Después de la competencia durante la noche con IL-6 2 µM, todos los mutantes tenían niveles significativamente mayores de IL-6 biotinilada que permanecían en su superficie celular con respecto a la presentación en comparación con el Fab EBI-029 natural. El orden de rango de unión de la mayor a la menor afinidad fue A28V/S30P/I51T/S55G > A28V/I51T/S55G > S30P/I51T/S55G > I51T/S55G > wt. La mutación cuádruple A28V/S30P/I51T/S55G también se denomina en el presente documento EBI-030.

[0527] Las secuencias de EBI-030 se muestran a continuación.

[0528] Secuencias de CDR 030:

[0530]

[0532] 030 secuencia de la región variable de la cadena pesada (mutaciones relativas a 029 mostradas en negrita): Secuencia de la región variable de la cadena ligera 030:

[0535]

[0537] (SEQ ID NO:38)

[0538] Secuencia polipeptídica de la cadena pesada de Fab 030 (IgG1) (CDR subrayadas, mutaciones con respecto a 029 mostradas en negrita):

[0540]

[0542] En modos de realización, la secuencia DKTHT (SEQ ID NO:30) en el extremo carboxi de SEQ ID NO:39 no se incluye en la secuencia de Fab.

[0543] Secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada de Fab 030:

[0545]

[0547] 030 también se puede producir como una secuencia polipeptídica de la cadena pesada Fab de IgG2:

[0549]

[0551] Ejemplo 13: expresión y purificación de fragmentos Fab variantes

[0552] Los insertos de dominio VH que contienen las siguientes combinaciones mutantes, A28V/I51T/S55G, S30P/I51T/S55G y A28V/S30P/I51T/S55G (EBI-030), se generaron a partir de los vectores de presentación en levaduras por doble digestión con BamHI-HHNheI-HF. Los insertos se purificaron por electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se ligaron en un vector de expresión de mamífero derivado de pTT5 que contenía una secuencia líder, dominio CH1 de IgG1 humana y marca His C terminal. Los transformantes se seleccionaron en LB-Amp, se miniprepararon y los insertos se confirmaron por secuenciación. Se realizaron transfecciones transitorias en células HEK-6E (Canadian Research Council) para cada cadena pesada de Fab mutante emparejada con la cadena ligera de EBI-029 natural (divulgada en el presente documento como SEQ ID NO:12) usando PEI como reactivo de transfección. El Fab EBI-029 natural también se expresó como un control (la cadena pesada de Fab natural se divulga en el presente documento como SEQ ID NO:24). Se obtuvieron sobrenadantes después de 5 días y los Fab expresados se purificaron por cromatografía de afinidad usando agarosa Ni-NTA (Life Technologies). La proteína purificada se intercambió con tampón en PBS, pH 7,4 por varias rondas de concentración/dilución y concentración y pureza de proteínas determinadas por Absorbancia 280 y SDS-PAGE.

[0554] Ejemplo 14: los anticuerpos variantes mostraron unión mejorada como se evalúa usando resonancia de plasmón superficial

[0556] Las afinidades de las moléculas Fab variante 029 para IL-6 se midieron por resonancia de plasmón superficial (RPS) en un espectrómetro Reichert SR7000Dc. Se inmovilizó IL-6 humana a 20 µg/ml en acetato de sodio 10 mM, pH 4,5 en un chip de carboximetildextrano de 500 kDa por medio de acoplamiento de amina estándar. Se inyectaron diluciones en serie de cada molécula de Fab en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3 a 25 °C con un caudal de 25 µl/min. Después de 4 minutos, se detuvo la carga y se midió la disociación por un tampón de migración fluido (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3) durante 5 minutos. Las trazas del sensograma se ajustan mal a un modelo de unión 1:1, potencialmente debido a orientaciones mixtas de IL-6 en el chip o a la unión de anticuerpos no específicos. En cambio, las curvas se ajustaron a un ajuste de 2 especies (especies de baja afinidad y alta afinidad, marcadas como "baja afinidad" y "alta afinidad" en la tabla 3) usando el programa informático TraceDrawer donde ka1, kd1 y KD1 son la velocidad de asociación, velocidad de disociación y constante de unión en equilibrio para las especies de baja afinidad, y ka2, kd2 y KD2 son la velocidad de asociación, velocidad de disociación y constante de unión en equilibrio para las especies de alta afinidad. Todos los Fab mutantes tuvieron una disociación significativamente más lenta en comparación con el Fab EBI-029 wt con el siguiente orden de rango de la mayor a la menor afinidad: A28V/S30P/I51T/S55G (EBI-030) > S30P/I51T/S55G > A28V/I51T/S55G > WT (EBI-029).

[0558] Tabla 3: resultados de RPS para anticuerpos mutantes

[0560]

[0563] Afinidad baja Afinidad alta

[0565] Ejemplo 15: los anticuerpos variantes mostraron una potencia antagonista mejorada en células indicadoras HEK-Blue™-IL6

[0567] Se usó la línea celular indicadora HEK-Blue™-IL6 (Invivogen) para comparar la potencia de la inhibición de la señalización de IL6 entre los diferentes fragmentos Fab EBI-029 mutantes. Las células HEK-Blue™-IL6 son una línea HEK<2>93 modificada que expresa de forma estable el gen IL-6R y que contiene un gen indicador de fosfatasa alcalina secretado bajo el control del promotor mínimo de IFNꞵ fusionado a cuatro sitios de unión a STAT3. Para medir el antagonismo de IL6, se mezclaron 10 µl de IL-6 humana 400 μM (R&D Systems 206-IL-010/CF) con 10 µl de cada variante de Fab en un intervalo de concentraciones en una placa de 96 pocillos y se incubó a TA durante 30 minutos. Se tripsinizaron células HEK-Blue™-IL6 en fase logarítmica y se resuspendieron en medio de ensayo (DMEM, 4,5 g/l de glucosa, FBS termoinactivado al 10 %, L-glutamina 2 mM, Pen-Step) a 280.000 células/ml. Se añadieron 180 µl de suspensión celular a cada pocillo de mezclas de IL-6/Fab para llevar la concentración de IL-6 final hasta 20 μM. Las células se incubaron a 37 °C/CO<2>al 5 %durante 20 horas. A continuación, se mezclaron 20 µl de sobrenadante de cada pocillo con 180 µl de reactivo Quanti-Blue™ (Invivogen) y se incubaron a 37 °C durante 40 minutos antes de medir la absorbancia a 650 nM en un lector de placas SpectraMax M5. La señal de fondo de pocillos sin IL-6 se restó y a continuación se dividió entre células tratadas con IL-6 sin inhibidor para derivar un valor de señalización fraccionaria. Todos los mutantes mostraron una potencia significativamente mayor en comparación con el Fab EBI-029 wt con el orden de clasificación de potencia antagonista como sigue:

[0568] A28V/S30P/I51T/S55G (EBI-030) > A28V/I51T/S55G > S30P/I51T/S55G > WT (EBI-029). Estos resultados se muestran en la fig.6.

[0569] Ejemplo 16: los anticuerpos variantes mostraron una potencia antagonista mejorada en el ensayo de proliferación de T1165

[0570] Las células T1165.85.2.1 (R&D Systems) son una línea celular de plasmacitoma murino que prolifera en respuesta a IL-6 de ratón, rata o humana. Para medir el antagonismo de los mutantes Fab EBI-029, se mezclaron 25 µl de 2 ng/ml de IL-6 humana (R&D Systems 206-IL-010/CF) con 25 µl de cada variante de Fab en un intervalo de concentraciones en una placa de 96 pocillos y se incubó a TA durante 30 minutos. Las células T1165 en fase logarítmica se sedimentaron y se resuspendieron en medios de ensayo (RPMI 1640 al 90 %, FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, Pen-Strep) a 2 ×105 células/ml. Se añadieron 50 µl de suspensión celular a cada pocillo de mezclas de IL-6/Fab para llevar la concentración final de IL-6 a 0,5 ng/ml. Las células se incubaron a 37 °C/CO<2>al 5 % durante 72 horas. Se añadieron 100 µl de reactivo Cell-Titer Glo® (Promega) a cada pocillo y se incubó a TA durante 10 minutos. La luminiscencia se midió en un lector de placas SpectraMax M5. Todos los mutantes mostraron una potencia significativamente mayor en comparación con el Fab EBI-029 wt sin señalización de IL-6 medible en el intervalo de concentraciones de Fab sometidas a prueba (véase la fig.7).

[0571] Ejemplo 17: comparación de propiedades medicamentosas de anticuerpos variantes

[0572] La estabilidad térmica de cada variante de Fab se determinó por fluorimetría de barrido diferencial (DSF). Se mezclaron 2 µl de proteína a 2,5 o 5 mg/ml con 18 µl de PBS y 2 µl de 50 × Sypro Orange en una placa de PCR de 96 pocillos BioRad. La placa se realizó en un sistema de RT-PCR BioRad CFX96 con un incremento de temperatura lineal de 25 °C y 95 °C y se midió la fluorescencia con el tiempo. La T<f>se calculó como el punto más bajo de la primera derivada de la curva de fusión. Todas las variantes habían medido valores de T<f>entre 76 y 78 °C, consecuente con la T<f>medida del Fab EBI-029 wt a 76 °C.

[0573] Para medir la agregación, las muestras se evaluaron por SEC-MALS usando un HPLC Agilent 1260 combinado con un instrumento de dispersión de luz Wyatt miniDawn TREOS y un instrumento de índice de refracción Wyatt Optilab rEX. Se inyectaron 20 – 100 µg de proteína y se realizó a un caudal de 1 ml/min. Todas las variantes tenían pesos moleculares entre 45000 y 52000 Da como se mide por dispersión de luz, consecuente con el Fab EBI-029 natural. Estos resultados indican que EBI-030 se comporta similarmente bien en comparación con EBI-029 en términos de sus propiedades medicamentosas.

[0574] Ejemplo 18: producción de anticuerpos IgG2 EBI-029 y EBI-030 de longitud completa y anticuerpos IgG2 con dominios Fc mutantes

[0575] Reformateo de EBI-029 y EBI-030 a IgG2 e IgG2 Fc mutante

[0576] Los dominios variables de la cadena pesada de EBI-029 y EBI-030 incluyendo la secuencia líder ; SEQ ID NO:49) se amplificaron por PCR a partir de los vectores Fab usando cebadores que introdujeron un sitio EcoRI N terminal y un sitio Nhel C terminal. Los productos de PCR se purificaron en un gel de agarosa al 1 % y se sometieron a doble digestión con vectores de cadena principal basados en EcoRI-HF y NheI-HF. pTT5 que contenían la secuencia de la cadena pesada de IgG2 natural o un dominio de IgG2 variante con una mutación H311A (H311 corresponde a la numeración en SEQ ID NO:41; esto corresponde a H310 en la numeración proporcionada en Martinet al., Molecular Cell, 7:4, 867-877 (2001)) se digirieron de forma similar con EcoRI-FH/NheI-HF y se purificaron en un gel de agarosa al 1 %. Los insertos se ligaron en la cadena principal digerida usando la enzima Quik Ligase (New England Biolabs), se transformaron en células TOP10 (Life Technologies) y se seleccionaron en LB-Amp. Los clones se miniprepararon y secuenciaron para confirmar el inserto. La mutación H311A se seleccionó para reducir la afinidad de unión de Fc por FcRn para reducir la acumulación sistémica de moléculas que escapan del tejido ocular.

[0577] Expresión y purificación de variantes de IgG2 por transfección transitoria

[0578] EBI-029 IgG2, EBI-029 IgG2-H311A, EBI-030 IgG2 y EBI-030 IgG2-H311A se expresaron por transfección transitoria en células HEK-6E. Los vectores pTT5 que contienen cada cadena pesada se cotransfectaron con el plásmido LC EBI-029 usando PEI como reactivo de transfección. Se obtuvieron sobrenadantes después de 5 días y las moléculas de IgG2 expresadas se purificaron por cromatografía de afinidad usando proteína A agarosa. La proteína purificada se intercambió con tampón en PBS, pH 7,4 por varias rondas de concentración/dilución y concentración y pureza de proteínas determinadas por Absorbancia 280 y SDS-PAGE.

[0579] Producción de agrupamiento estable de CHO

[0580] Se generaron agrupamientos de CHO estables que producen EBI-029 IgG2, EBI-030 IgG2 o EBI-030 IgG2-H311A usando el kit Freedom CHO-S (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, cada cadena pesada se clonó por digestión/ligación estándar en el vector pCHO 1.0 en combinación con la LC EBI-029. Las construcciones se transfectaron en células CHO-S usando reactivo Freestyle MAX y agrupamientos estables seleccionados con concentraciones crecientes de Puromicina y MTX. Después de dos rondas de selección, se cribaron los agrupamientos para determinar la producción de anticuerpos por cromatografía de proteína A analítica y se seleccionaron los mayores productores para su ampliación y subclonación.

[0581] Las secuencias se presentan a continuación.

[0582] Secuencia polipeptídica de la cadena pesada de 030 (en estructura de IgG2, CDR subrayadas):

[0584]

[0585] (SEQ ID NO:41)

[0586] Secuencia polipeptídica de la cadena ligera de 030 (en estructura de IgG2, CDR subrayadas):

[0588]

[0589] Secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada de 030:

[0590]

[0592] Secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera de 030:

[0593]

[0594]

[0596] Secuencia polipeptídica de la cadena pesada de 030 con la mutación H311A (311A está en negrita y las CDR están subrayadas), también denominada en el presente documento secuencia polipeptídica de la cadena pesada de031:

[0597]

[0599] Secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada de 031:

[0600]

[0601]

[0603] Ejemplo 19: comparación de la potencia de IgG2 de EBI-030 frente a EBI-029 en el ensayo HEK-Blue-IL6Se usó la línea celular indicadora HEK-Blue™-IL6 (Invivogen) para comparar la potencia de la inhibición de la señalización de IL6 entre los anticuerpos IgG2 EBI-029 y EBI-030. Se compararon tres preparaciones de proteínas purificadas a partir de células HEK-6E: EBI-029 IgG2, EBI-030 IgG2 y EBI-030 IgG2-H311A (también denominado 031 o EBI-031), junto con una preparación de EBI-030 IgG2 producida en un agrupamiento de CHO estable. Adicionalmente, se incluyó como control tocilizumab, un anticuerpo anti-IL6R aprobado. Para medir el antagonismo de IL6, se mezcló IL-6 humana (R&D Systems 206-IL-010/CF) a 400 μM con concentraciones variables de cada anticuerpo en una placa de 96 pocillos y se incubó a TA durante 30 minutos. Se tripsinizaron células HEK-Blue™-IL6 en fase logarítmica y se resuspendieron en medio de ensayo (DMEM, 4,5 g/l de glucosa, FBS termoinactivado al 10 %, L-glutamina 2 mM, Pen-Step) a 280.000 células/ml. Se añadieron 180 µl de suspensión celular a cada pocillo de mezclas de IL-6/Fab para llevar la concentración de IL-6 final hasta 20 μM. Las células se incubaron a 37 °C/CO<2>al 5 %durante 20 horas. A continuación, se mezclaron 20 µl de sobrenadante de cada pocillo con 180 µl de reactivo Quanti-BlueTM (Invivogen) y se incubaron a 37 °C durante 40 minutos antes de medir la absorbancia a 650 nM en un lector de placas SpectraMax M5.

[0604] Los resultados se muestran en la fig.8 y en la tabla 5. EBI-030 (incluyendo EBI-030 producido en células HEK con o sin la mutación H311A y EBI-030 producido en células CHO) mostró una potencia muy mejorada (aproximadamente una disminución de 50 veces en CI50 y una disminución >100 veces en CI90) en comparación con EBI-029. El incremento en potencia fue mayor que el incremento en afinidad medido por RPS.

[0605] Tabla 5: valores de CI50 y CI90

[0607]

[0609] EBI-031 (también denominado en el presente documento EBI-030 IgG2-H311A) tuvo una CI50 más de 75 veces menor que la de EBI-029 y una CI90 aproximadamente 350 veces menor que la de EBI-029. EBI-030 producido en células HEK tuvo una CI50 más de 50 veces menor que la de EBI-029 y una CI90 aproximadamente 4000 veces menor que la de EBI-029.

[0610] Ejemplo 20: análisis de modelado de potencia incrementada en la duración del bloqueo de IL-6 vítreoEl efecto de potencia incrementada en el alcance y la duración del bloqueo de IL-6 después de administración intravítrea se simuló usando un modelo farmacocinético (fig. 9). Las ecuaciones diferenciales que describen los cambios en el anticuerpo libre (A), la IL-6 libre (IL) y el complejo anticuerpo/IL-6 (AIL) se definieron como sigue: d/dt(A) = -A*kae – A*IL*k1 AIL*k2

[0611] d/dt(IL) = kpi – IL*kie – A*IL*k1 AIL*k2

[0612] d/dt(AIL) = -AIL*kaie A*IL*k1 – AIL*k2

[0613] donde kae es la velocidad de aclaramiento de anticuerpo libre del vítreo, k1 es la velocidad de asociación para la unión anticuerpo/IL-6, k2 es la velocidad de disociación para el complejo anticuerpo/IL-6, kpi es la velocidad de producción de IL-6, kei es la velocidad de aclaramiento de IL-6 libre del vítreo y kaie es la velocidad de aclaramiento del complejo anticuerpo/IL-6 del vítreo. Los valores y velocidades de los parámetros iniciales se definieron como se muestra en la tabla 6.

[0614] Tabla 6: valores y velocidades de parámetros iniciales

[0617]

[0619] Se calculó A<0>en base a las suposiciones de una dosis de 50 µl de 50 mg/ml de anticuerpo en un ojo humano con un volumen vítreo de 5 ml. Se estimó IL<0>en base a valores medidos clínicamente para IL-6 vítrea en pacientes con EMD de ~200 μg/ml. Se estimó k1 en base a velocidades de asociación de anticuerpo típicas de 1E5 M<-1>s<-1>, mientras que se varió k2 para simular valores de potencia que variaban de 100 μM a 1 μM. Se derivó kae de semitiempos de aclaramiento vítreo medido en el conejo de ~ 11 días escalado en 1,8 como se midió previamente para la FC humana. Se estimó kie en un semitiempo de aclaramiento de 24 horas, y se calculó kpi como IL<0>*kie. Las simulaciones de anticuerpo libre e IL-6 libre se realizaron usando el programa informático Berkeley Madonna durante una evolución temporal de 300 días (fig. 10). Se seleccionó un límite de bloqueo de IL-6 del 95 % para medir la duración de la inhibición. El modelo predice que el incremento de la potencia del anticuerpo extiende significativamente la duración de la inhibición de IL-6 en el ojo de 130 días para k2/k1 = 100 μM a 200 días para k2/k1 = 10 μM a 225 días para k2/k1 = 1 μM.

[0620] Ejemplo 21: farmacocinética de IL-6a

[0621] Se realizaron experimentos farmacocinéticos (FC) en conejos blancos de Nueva Zelanda machos por PharmOptima (Portage, MI). Todos los animales tenían 12-13 meses de edad y pesaban 2,61 – 3,42 kg. Se compararon las siguientes proteínas: EBI-029-IgG2 (SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12), EBI-029-IgG2-H311A (SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:12), EBI-030 (SEQ ID NO:41 y SEQ ID NO:42), EBI-030-IgG2-H311A (SEQ ID NO:47 y SEQ ID NO:42), EBI-029 Fab (SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:12), Eylea® (trampa de VEGF), and Tocilizumab (TCZ; anticuerpo anti-IL6R). Todas las proteínas se formularon a 13,8 mg/ml en PBS, pH 7,4. EBI-029-IgG2, EBI-029-IgG2-H311A, EBI-030, EBI-030-IgG2-H311A, EBI-029 Fab y tocilizumab no se unen a sus antígenos diana en el conejo, mientras que Eylea® se une a VEGF de conejo.

[0622] Para la investigación de FC intravítrea, a 9 animales se les inyectaron 50 μl de artículo de prueba en cada ojo. Antes de la inyección, se aplicó clorhidrato de lidocaína (inyectable al 2 %), proparacaína al 0,5 % o tetracaína al 0,5 % a la superficie ocular. Se realizaron inyecciones en el vítreo medio con una jeringuilla de insulina BD de 300 µl (aguja DE 31G x 5/16 pulgadas) insertada a través del cuadrante dorsotemporal del ojo. Para la investigación de FC sistémica, a 3 animales se les inyectaron 100 µl de artículo de prueba a través de la vena del oído.

[0623] Se obtuvieron muestras de sangre en serie de 3 animales en los brazos tanto IVT como i.v. a 0,083, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 240 y 336 horas y se diluyeron 1:1 con solución de citrato-fosfato-dextrosa y se colocaron en hielo. Se obtuvo plasma por centrifugación de las muestras de sangre enfriadas a 4000 rpm durante 10 minutos a 4 °C y se almacenó congelado a -80 °C.

[0624] Se obtuvieron tejidos oculares de ambos ojos de todos los animales en el grupo IVT a las 0,25, 24, 168 y 336 horas después de la dosis. Los animales se sacrificaron por medio de sobredosis intravenosa de barbitúricos. Para obtener el humor acuoso, de inmediato después de la eutanasia, se insertó una jeringuilla con aguja debajo de la córnea y se extrajo lentamente el humor acuoso. Se transfirió humor acuoso a un tubo premarcado y se colocó en hielo seco o se congeló a -80 °C. Para obtener humor vítreo, se introdujo un pequeño corte en la esclerótica de un ojo enucleado usando un bisturí y se retiró el vírico a través de la abertura por medio de una jeringuilla. La muestra se midió por medio de las graduaciones en la jeringuilla, se transfirió a un tubo premarcado y se colocó en hielo seco o se congeló a -80 °C.

[0625] Para obtener retina y coroides, se introdujo un pequeño corte con bisturí en la esclerótica de un ojo enucleado, paralelo y caudal al limbo. Se usaron tijeras para continuar la abertura alrededor del globo ocular, separándolo en dos mitades. El globo posterior se situó de modo que el interior estuviera orientado hacia arriba. Usando un cuchillo branquial ("gill knife"), se obtuvo cuidadosamente la retina del globo. Una vez que se obtuvo la retina del globo, se obtuvo la coroides de forma similar del globo restante. Ambas muestras, por separado, se transfirieron a tubos Precellys® previamente pesados y marcados, se pesaron y se colocaron en hielo seco o se congelaron a -80 °C. Los tejidos de la coroides y la retina se diluyeron diez veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se homogeneizaron y se almacenaron a -80 °C.

[0626] Las concentraciones de proteína en cada tejido se evaluaron por ELISA. Para EBI-029-IgG2, EBI-029-IgG2-H311A, EBI-030, EBI-030-IgG2-H311A y EBI-029 Fab, se recubrieron placas de medio volumen Costar con 1 µg/ml de IL-6 humana en PBS durante 1 hora a TA. Los pocillos se bloquearon con PBS que contenía BSA al 2 %, se lavaron y a continuación se incubaron con un intervalo de diluciones para cada muestra usando PBS plasma de conejo al 5 % Tween-20 al 0,05 % como diluyente. También se incluyó una curva estándar usando proteína purificada en cada placa. Se incubaron las muestras a TA durante 60 minutos, después se lavaron tres veces con 300 µl de PBS que contenía Tween-20 al 0,05 %. A continuación, se añadió a cada pocillo anti-kappa-HRP (Genway Inc.) diluido 1:10.000 en PBS, BSA al 1 %, Tween-20 al 0,05 % y se incubó durante 30 minutos. Se lavaron los pocillos como anteriormente, a continuación se añadió sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) y se midió la señal a 450 y 550 nm en un lector de placas Spectramax. Las concentraciones de proteína se calcularon en base a la curva estándar usando el programa informático Softmax Pro 6. Cada ELISA se repitió en al menos 3 placas independientes y se informó el semitiempo promedio.

[0627] Para tocilizumab, las concentraciones de proteína se determinaron por ELISA como anteriormente, excepto que se usó Fab anti-Tocilizumab (BioRad HCA252) como el reactivo de captura y se usó anti-IgG humana-Fc-HRP (Sigma A0170) como el anticuerpo de detección. Se usaron dos ensayos ELISA diferentes para medir Eylea® libre y total. Para Eylea® libre, los pocillos se recubrieron con VEGF recombinante (R&D Systems) y la proteína unida se detectó con anti-IgG humana-Fc-HRP (Sigma A0170). Para medir Eylea® total, se usó anticuerpo anti-Fc humano (Sigma I2136) para la captura y se usó anti-IgG humana-CH<2>-HRP (BioRad MCA647P) para la detección. Cada ELISA se repitió en al menos 3 placas independientes y se informó el semitiempo promedio.

[0628] Sumario de resultados

[0629] En la mayoría de los animales, se observó una formación robusta de anticuerpos frente a la proteína inyectada en los puntos de tiempo de 240 y 336 horas. Debido a que esta formación de anticuerpos puede afectar al aclaramiento de proteínas o interferir con el ELISA, el análisis de datos se limitó a los puntos de tiempo de hasta e incluyendo 168 horas. Para FC intravítrea, todas las proteínas IgG2 EBI-029 y EBI-030 se aclararon significativamente más lentamente (T<1/2>= 9,3, 9,0, 15,7 y 9,8 días para EBI-029, EBI-029-H311A, EBI-030 y EBI-030-H311A, respectivamente) en comparación con Eylea® (T<1/2>= 6,3 días), Tocilizumab (T<1/2>= 4,8 días) o el fragmento Fab EBI-029 (T<1/2>= 3,9 días) (fig.11, tabla 7). Se observaron tendencias similares en la retina, coroides y acuoso donde EBI-030 y EBI-030-H311A se acumularon a niveles mayores en comparación con Eylea® y Tocilizumab (véanse la fig.12 y la fig.13).

[0630] Todas las proteínas fueron detectables en el plasma después de la administración IVT con EBI-029, EBI-030 y tocilizumab acumulándose a niveles significativamente mayores que Eylea® o EBI-030-H311A (véase la fig. 14). De forma similar, Eylea® y EBI-030-H311A se aclararon más rápidamente del plasma después de la administración i.v., con el semitiempo de EBI-030-H311A aproximadamente la mitad del de la IgG2 natural debido a la unión reducida de FcRn (tabla 7).

[0632]

[0634] Ejemplo 22: solubilidad de EBI-031 a altas concentraciones

[0635] Se concentró EBI-031 purificado de 3 mg/ml a 142 mg/ml en PBS, pH 7,4 usando un concentrador de espín Amicon Ultra-15. Las preparaciones previas y posteriores a la concentración se evaluaron para determinar la agregación al realizarse en una columna Tosoh G3000SWXL 7.8X30 SEG combinada con un instrumento de dispersión de luz Wyatt miniDawn TREOS y un instrumento de índice de refracción Wyatt Optilab rEX. Se inyectaron 20 µg de proteína y se realizó a un caudal de 1 ml/min en PBS. La fracción de masa para el pico al peso molecular previsto de ~ 150 kDa fue aproximadamente igual para las dos concentraciones (90,9 % para 3 mg/ml y 91,3 % para 142 mg/ml de preparación), lo que indica que no hubo un incremento significativo en la agregación de proteínas durante la concentración. Estos resultados demuestran que el EBI-031 se puede concentrar hasta 142 mg/ml con poca agregación medible (<10 % de agregación).

[0636] Ejemplo 23: EBI-031 bloquea la señalización cis- y trans-IL6

[0637] Se usó la línea celular indicadora HEK-Blue™-IL6 (Invivogen) para comparar la potencia de EBI-031 y tocilizumab para bloquear la señalización de cis- y trans-IL6. Para la señalización cis, se mezcló IL-6 libre (concentración final = 20 μM) con EBI-031 o tocilizumab en un intervalo de concentraciones en una placa de 96 pocillos y se incubó a TA durante 30 minutos. Se tripsinizaron células HEK-Blue™-IL6 en fase logarítmica y se resuspendieron en medio de ensayo (DMEM, 4,5 g/l de glucosa, FBS termoinactivado al 10 %, L-glutamina 2 mM, Pen-Step) y se añadieron 50.000 células a cada pocillo en un volumen final de 200 µl. Las placas se incubaron a 37 °C/CO<2>al 5 % durante 20 horas. A continuación, se mezclaron 50 µl de sobrenadante de cada pocillo con 150 µl de reactivo Quanti-Blue™ (Invivogen) y se incubaron a 37 °C durante 40 minutos antes de medir la absorbancia a 650 nM en un lector de placas SpectraMax M5. La señal de fondo de pocillos sin IL-6 se restó y a continuación se dividió entre células tratadas con IL-6 sin inhibidor para derivar un valor de señalización fraccionaria. EBI-031 (CI50 = 14,2 μM) bloquea IL-6 libre con una potencia >900 veces mayor en comparación con tocilizumab (CI50 = 12,9 nM) (fig.16A).

[0638] Para medir el bloqueo de la señalización trans, se realizaron experimentos como anteriormente, excepto que se usó hiper-IL-6 a una concentración final de 200 μM en lugar de IL-6 libre. La hiper-IL-6 es una fusión genética entre IL-6 y el receptor de IL-6 soluble (Fischeret al., Nature Biotechnology 15:142-145 (1997). EBI-031 bloqueó potentemente la hiper-IL-6 (CI50 = 32 μM), mientras que tocilizumab no pudo inhibir significativamente la señalización a una concentración de 1 µM (fig.16B).

[0639] Estos resultados muestran que EBI-031 se une a IL-6 humana en el sitio II, o el sitio que entra en contacto con gp130, con afinidad de μM y bloquea la señalización de IL-6 y el complejo IL-6/sIL-6Rα en ensayos celulares >900 veces más potentemente que tocilizumab.

[0640] Ejemplo 24: simulaciones computacionales para la supresión de EBI-031 intravítrea de la señalización de IL-6

[0641] Las simulaciones computacionales se realizaron como se describe en el ejemplo 20 para predecir la cantidad de tiempo que una administración intravítrea de EBI-031 en seres humanos debería suprimir un 95 % de la señalización de IL-6. Se estableció k2 en 0,12 d-1 de modo que k2/k1 = 14 μM como se mide en el ensayo de potencia. El aclaramiento de T1/2 se estableció en 18 días en base al semitiempo de aclaramiento intravítreo medido en conejos escalado en 1,8 para seres humanos. Todos los demás parámetros se describen en la tabla 6. El modelo predice que EBI-031 debería bloquear un 95 % de la señalización de IL-6 durante ~ 150 días después de administración intravítrea (fig. 17). Estos resultados de modelado indican que EBI-031 puede bloquear sustancialmente la señalización de IL-6 en el ojo durante un largo período de tiempo, por ejemplo, hasta aproximadamente 6 meses.

[0642] Ejemplo 25: caracterización de isoformas EBI-031

[0643] EBI-031 es un anticuerpo IgG2. Como se analiza previamente, los anticuerpos IgG2 existen en tres isoformas estructurales diferentes, isoformas IgG2-A, IgG2-B e IgG2-A/B (fig. 18). En este ejemplo, se realizaron experimentos para identificar las isoformas estructurales en muestras de EBI-031.

[0644] Análisis RP-HPLC

[0645] Se usó cromatografía de líquidos de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC) para resolver las diversas isoformas estructurales de EBI-031. Un procedimiento de RP-HPLC analítico potenciado que se ha usado previamente para resolver isoformas estructurales mediadas por disulfuro de IgG2 (véanse, Dillonet al.,Journal of Chromatography A, 2006, 1120:112-120) se optimizó para resolver EBI-031.

[0646] Se cargaron muestras de EBI-031 que contenían aproximadamente 30 µg en una columna Zorbax 300SB-C8 (150 mm, × 2,1 mm, 5,0 µm, 300 Å). La temperatura de la columna se ajustó a 75 °C. La fase móvil A fue agua que contenía TFA al 0,1 %, y la fase móvil B fue IPA al 55 %, ACN al 40 %, agua al 4,9 % y TFA al 0,1 %. El caudal fue de 0,5 ml/min. Se equilibró inicialmente la columna con 90 % de fase móvil A y 10 % de fase móvil B durante 2 min, seguido de un gradiente escalonado de 2 min del 10 al 25 % de B. Se logró la elución con un gradiente lineal del 25-32 % de B durante 21 min. La absorbancia UV se monitorizó a 214 nm y/o 280 nm.

[0647] Para determinar si la resolución estaba relacionada con disulfuro, las muestras se trataron con DTT 5 mM y cisteína 10 mM a temperatura ambiente durante 2 min y a continuación se analizaron en el procedimiento RP-HPLC (figura 19). El tratamiento con DTT, que es un potente agente reductor, provoca la reducción del anticuerpo IgG2, dando como resultado la elución en picos tempranos (pico 0 y pico 1) (figura 19, panel central). El tratamiento con cisteína, que es un agente reductor más suave en comparación con DTT, también cambia la distribución de isoformas hacia los picos tempranos (pico 0 y pico 1), aunque no en la medida observada con la muestra tratada con DTT (figura 19, panel inferior).

[0648] Los datos demuestran que el procedimiento de RP-HPLC resolvió las isoformas estructurales con diferente conectividad de disulfuro. Las diferentes estructuras de enlaces disulfuro se confirmaron por cartografía peptídica no reducida y análisis de espectrometría de masas: el pico de elución temprana (pico 1) contiene la isoforma IgG2-A/B y el pico de elución tardía (pico 2) contiene la isoforma IgG2-A. Es importante destacar que no se detectó isoforma B de IgG2-B (pico 0) en la muestra de EBI-031 (figura 19, panel superior).

[0649] Comparación de diferentes muestras de EBI-031

[0650] Usando el análisis de RP-HPLC descrito anteriormente, se analizaron muestras de EBI-031 recogidas de diferentes líneas celulares que expresan EBI-031 para comparar la distribución de isoformas de los anticuerpos producidos. Se recogieron muestras de EBI-031 de un cultivo a escala de 200 l de una línea celular clonal, un cultivo a escala de 10 l de una línea celular original y un agrupamiento de células transfectadas de forma estable. Se purificó EBI-031 usando un procedimiento de cromatografía de tres etapas a partir de las líneas celulares que expresan EBI-031 clonal y original. Se purificó EBI-031 del agrupamiento de células transfectadas de forma estable usando purificación con proteína A. Las muestras se analizaron por los procedimientos descritos anteriormente. Los resultados mostrados en la figura 20 muestran que las tres muestras de EBI-031 contenían isoformas IgG2-A e IgG2-A/B, pero no una cantidad sustancial de IgG2-B. Estos datos demuestran que el anticuerpo IgG2 EBI-031 se produce en una mezcla menos heterogénea que otros anticuerpos IgG2, ya sea la producción a partir de una línea celular que expresa EBI-031 clonal, una línea celular que expresa EBI-031 original o de una población celular heterogénea que expresa EBI-031 de forma estable. La figura 21 muestra la distribución de las isoformas de la muestra de EBI-031 del cultivo a escala de 200 l de una línea celular que expresa EBI-031 clonal, por ejemplo, el panel superior de la figura 20. También se midieron las áreas bajo las curvas y las distribuciones entre las isoformas se muestran en la tabla debajo de la figura.

[0651] Ejemplo 26: farmacocinética en estudios en primates

[0652] Se investigó la farmacocinética de EBI-031 en estudios en primates. Se sometieron a prueba dos monos verdes africanos machos. Se inyectaron por vía intravítrea 50 µl de 50 mg/ml de EBI-031 en el ojo. Se usó el programa informático Madonna para el ajuste de curva.

[0653] Los datos del estudio en primates se modelaron usando un ajuste de curva. Las ecuaciones diferenciales que describen los cambios en el anticuerpo en el vítreo (A) y el anticuerpo fuera del vítreo, por ejemplo, sistémico, (Ap) se definieron como sigue:

[0654] d/dt(A) = -A*kae

[0655] d/dt(Ap) = A*kae(Dil) – Ap*kape

[0656] Los valores y velocidades de los parámetros iniciales se definen como se muestra en la tabla a continuación: Tabla 8: valores y velocidades de parámetros iniciales

[0658]

[0660] Otras consideraciones incluidas para el ajuste incluyen: la dilución y ambas constantes de velocidad se expresaron para el ajuste. Inicial A se mantuvo constante (2x50 ml de 50 mg/ml en 5 ml de ojo). Los resultados del modelado como se muestra en las figs.22A, 22B y 23 mostraron que las constantes de velocidad de eliminación vítrea dieron como resultado semividas de 4,6 y 5,7 días, respectivamente, para los dos monos. La constante de velocidad de eliminación vítrea promedio se calculó en 5,2 días. La eliminación sistémica se modeló como 1,1 días y 0,63 días (promedio 0,85 días). Estos resultados demuestran que la semivida de EBI-031 en el vítreo fue significativamente más larga que la semivida sistémica en primates.

[0661] Ejemplo 27: farmacocinética de EBI-031

[0662] Se realizó otro experimento farmacocinético (FC), donde se inyectaron 50 µl de una solución de 20 mg/ml de EBI-031 por vía intravítrea en los ojos de conejos. Los puntos de tiempo examinados fueron 1, 3, 7 y 14 días (por ejemplo, 24, 72, 168 y 336 horas). Se analizaron dos animales (cuatro ojos) para cada punto de tiempo. Los procedimientos para administrar la formulación de EBI-031, obtener el tejido ocular y determinar la concentración de proteínas se realizaron como se describe en el ejemplo 21.

[0663] Los resultados se muestran en las figuras 24A-24I. Cuando se analiza la concentración de proteína durante los días 1-14 en el humor vítreo, se determinó que la semivida de EBI-031 fue de 8,95 días (fig.24A). Sin embargo, se detectó una fuerte respuesta de anticuerpos el día 14, lo que puede afectar a estos resultados. Cuando se analizó la concentración de proteína para los días 1-7 en el humor vítreo, se determinó que la semivida de EBI-031 fue de 18,88 días.

[0664] También se detectó EBI-031 en otros compartimentos del ojo después de la inyección intravítrea. EBI-031 también había penetrado en el humor acuoso (fig.24B), la coroides (fig.24C), la conjuntiva (fig.24D), la córnea (fig.24E), el cuerpo ciliar (fig. 24F), el cristalino (fig. 24G), la retina (fig. 24H) y la esclerótica (fig. 24I). La concentración de fármaco en estos tejidos fue de uno a dos órdenes de magnitud menor que las concentraciones detectadas en el vítreo.

[0666] Otros modos de realización están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1 . Un anticuerpo anti-IL6 que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia GYVLPNYLIE (SEQ ID NO:31),

(b) una cDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia VTTPGGGTIN (SEQ ID NO:32),

(c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia SRWDPLYYYALEY (SEQ ID NO:33), (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia RASESVDNYGIPFMN (SEQ ID NO:34),

(e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia AASNRGS (SEQ ID NO:35), y

(f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia QQSEEVPLT (SEQ ID NO:36).

2. Un anticuerpo anti-l L6 que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:37 y una región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO:38, excepto que el anticuerpo anti-IL6 tiene un total de 1, 2 o 3 mutaciones, y en el que la región variable de la cadena pesada comprende las secuencias de aminoácidos GYVLPNYLIE (SEQ ID NO:31), VTTPGGGTIN (SEQ ID NO:32) y SRWDPLYYYALEY (SEQ ID NO:33) y en el que la región variable de la cadena ligera comprende las secuencias de aminoácidos RASESVDNYGIPFMN (SEQ ID NO:34), AASNRGS (SEQ ID NO:35) y QQSEEVPLT (SEQ ID NO:36).

3. Un anticuerpo anti-l L6 que comprende una secuencia de la cadena pesada que es idéntica a SEQ ID NO:41 y una secuencia de la cadena ligera que es idéntica a SEQ ID NO:42, excepto que el anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones totales con respecto a SEQ ID NO:41 y/o SEQ ID NO:42, y en el que la región variable de la cadena pesada comprende las secuencias de aminoácidos GYVLPNYLIE (SEQ ID NO:31), VTTPGGGTIN (SEQ ID NO:32) y SRWDPLYYYALEY (SEQ ID NO:33) y en el que la región variable de la cadena ligera comprende las secuencias de aminoácidos RASESVDNYGIPFMN (SEQ ID NO:34), AASNRGS (SEQ ID NO:35) y QQSEEVPLT (SEQ ID NO:36).

4. El anticuerpo anti-IL6 de la reivindicación 2, en el que la(s) mutación/mutaciones 1, 2, 3, 4 o 5 reduce(n) la unión a FcRn.

5. El anticuerpo anti-l L6 de la reivindicación 2, en el que una o más de las mutaciones están en una o más posiciones correspondientes a H311, D313, I254 o H436 (numeración como en SEQ ID NO:41).

6. Un anticuerpo anti-l L6 que comprende una secuencia de la cadena pesada que es idéntica a SEQ ID NO:47 y una secuencia de la cadena ligera que es idéntica a SEQ ID NO:42, excepto que el anticuerpo anti-IL6 comprende 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones totales con respecto a SEQ ID NO:47 y/o SEQ ID NO: 42 y comprende las secuencias de aminoácidos de la CDR de la cadena pesada GYVLPNYLIE (SEQ ID NO:31), VTTPGGGTIN (SEQ ID NO:32) y SRWDPLYYYALEY (SEQ ID NO:33) y las secuencias de aminoácidos de la CDR de la cadena ligera RASESVDNYGIPFMN (SEQ ID NO:34) AASNRGS (SEQ ID NO:35) y QQSEEVPLT (SEQ ID NO:36).

7. Una composición que comprende el anticuerpo anti-IL6 de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. La composición de la reivindicación 7, en la que la composición comprende al menos un 60, 70, 80, 90, 95 o 99 % de isoformas de IgG2-A o IgG2-A/B del anticuerpo anti-IL6, o una combinación de las mismas.

9. La composición de la reivindicación 7 u 8, en la que la composición comprende menos de un 10 %, 5 %, 2 %, 1 % o 0,5 % de isoformas de IgG2-B del anticuerpo anti-IL6.

10. El anticuerpo anti-l L6 de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición de cualquiera de las reivindicaciones 6-9, para su uso en el tratamiento de una enfermedad ocular caracterizada por un nivel elevado de IL-6.

11. El anticuerpo anti-l L6 de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición de cualquiera de las reivindicaciones 6-9 para su uso en el tratamiento de uno de edema macular diabético (EMD), retinopatía diabética, sequedad ocular (por ejemplo, xeroftalmia o síndrome de ojos secos), conjuntivitis alérgica, uveítis, degeneración macular senil (DMS), retinopatía diabética proliferativa (RDP), desprendimiento de retina regmatógeno (DRR), obstrucción de la vena retiniana (OVR), neuromielitis óptica (NMO), trasplante de córnea, abrasión corneal o lesión

física en el ojo.

12. Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo anti-IL6 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

13. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 12.

14. Una célula que comprende el vector de la reivindicación 13.