RS67748B1 - Analozi inkretina i njihove upotrebe - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] Ovo obelodanjivanje se odnosi na analoge inkretina koji imaju aktivnost na svakom od receptora insulinotropnog polipeptida zavisnog od glukoze (GIP), peptida-1 nalik glukagonu (GLP-1) i glukagona. Ovde opisani analozi inkretina imaju strukturne karakteristike koje obezbeđuju uravnoteženu aktivnost i imaju produženo trajanje delovanja na svakom od ovih receptora. Takvi analozi inkretina mogu da budu korisni za tretiranje poremećaja kao što je dijabetes melitus tipa 2 (engl. type 2 diabetes mellitus, T2DM), dislipidemija, metabolički sindrom, nealkoholna bolest masne jetre (engl. non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD), nealkoholni steatohepatitis (engl. non-alcoholic steatohepatitis, NASH) i/ili gojaznost.

[0005] Tokom proteklih više decenija, prevalenca dijabetesa je nastavila rasti. T2DM je najčešći oblik dijabetesa i odgovoran je za oko 90% svih slučajeva dijabetesa. T2DM je karakterisan visokim stepenom glukoze u krvi uzrokovanim insulinskom rezistencijom. Trenutni standard nege za T2DM uključuje promenu ishrane i vežbanje, kao i tretman oralnim lekovima i lekovima koji smanjuju glukozu koji se ubrizgavaju, uključujući terapije zasnovane na inkretinu, kao što su agonisti receptora GLP-1.

[0007] GLP-1 je peptid od 36 aminokiselina, čiji se glavni biološki aktivni fragment proizvodi kao peptid sa 30 aminokiselina, C-terminalni amidovani peptid (GLP-17-36; SEQ ID NO:2) koji stimulira sekreciju insulina zavisnu od glukoze i koji sprečava hiperglicemiju kod dijabetičara. Za tretiranje T2DM-a su trenutno dostupni razni analozi GLP-1, uključujući dulaglutid, eksenatid i liraglutid. Mnogi agonisti receptora GLP-1 koji su trenutno na tržištu su, međutim, dozno ograničeni zbog gastrointestinalnih nuspojava, kao što su mučnina i povraćanje. Kada je tretman oralnim lekovima i terapijama zasnovanim na inkretinu nedovoljan, razmatra se insulin. Uprkos dostupnim opcijama za tretman, značajan broj osoba koje primaju odobrene terapije ne postiže ciljeve kontrole glikemije (pogledajte, npr., Casagrande i sar., (2013) Diabetes Care 36:2271–2279).

[0008] Nekontrolisani dijabetes može dovesti do jednog ili više stanja koja utiču na morbiditet i mortalitet takvih osoba. Jedan od glavnih faktora rizika za T2DM je gojaznost i većina osoba sa T2DM-om (~90%) ima prekomernu telesnu težinu ili je gojazno. Dokumentovano je da će smanjenje količine masnog tkiva u telu dovesti do poboljšanja u komorbiditetima povezanim sa gojaznošću, uključujući hiperglikemiju i kardiovaskularne događaje. Stoga su za bolje upravljanje bolešću potrebne terapije efektivne za kontrolu glukoze i smanjenje težine.

[0010] U tom pogledu, nove terapije koje se istražuju uključuju jedinjenja koja imaju ne samo aktivnost na receptoru GLP-1, nego i aktivnost na jednom ili više drugih receptora, kao što su receptori GIP-a i/ili glukagona. Zapravo, za određena jedinjenja je opisano da imaju trostruku agonističku aktivnost (tj., aktivnost na svakom od receptora GIP-a, GLP-1, i glukagona). Na primer, Međunarodna publikacija patentne prijave br. WO 2015/067716 opisuje analoge glukagona koji imaju trostruku agonističku aktivnost. Slično tome, Međunarodna patentna prijava br. WO 2016/198624 opisuje da analozi ekstendina-4, koji je i sam analog GLP-1, imaju trostruku agonističku aktivnost. Isto tako, Međunarodne patentne prijave br. WO 2014/049610 i WO 2017/116204 opisuju razne analoge koji imaju trostruku agonističku aktivnost. Štaviše, Međunarodna patentna prijava br. WO 2017/153375 opisuje koagoniste glukagona i GLP-1 za koje je takođe navedeno da imaju GIP aktivnost.

[0012] Ipak, preostaje potreba za tretmanima, posebno za T2DM, koja su u stanju da obezbede efektivnu kontrolu glukoze, uz koristi gubitka težine i povoljan profil nuspojava. Takođe postoji potreba za terapeutskim agensima dostupnim za upotrebu sa dovoljno produženim trajanjem delovanja da bi omogućili neučestalo doziranje, kao što je jednom dnevno, triput nedeljno, dvaput nedeljno ili jednom nedeljno.

[0014] Ovde opisani analozi inkretina nastoje ispuniti prethodno navedene potrebe. Shodno tome, ovo obelodanjivanje opisuje analoge inkretina sa aktivnošću na svakom od receptora GIP-a, GLP-1 i glukagona. Povoljno, ovde opisani analozi inkretina imaju uravnoteženu aktivnost koja omogućuje primenjivanje doza koje obezbeđuju dovoljnu aktivnost na svakom receptoru da bi obezbedili koristi agonizma tog receptora uz istovremeno izbegavanje neželjenih nuspojava povezanih s previše aktivnosti. Štaviše, ovde opisani analozi inkretina imaju produženo trajanje delovanja na svakom od receptora GIP-a, GLP-1, i glukagona, što omogućava neučestalo doziranje kao što je jednom dnevno, triput nedeljno, dvaput nedeljno ili jednom nedeljno. Na ovaj način, analozi inkretina dovode do poboljšane kontrole glukoze, metaboličkih koristi kao što je smanjenje telesne težine i/ili poboljšana telesna kompozicija, lipidnih koristi kao što je smanjenje proprotein konvertaze subtilisin/keksin tipa 9 (engl. proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9), i/ili drugih koristi kao što je povećanje koštane mase ili formiranje kosti ili smanjenje resorpcije kosti. Ovo obelodanjivanje takođe opisuje efektivne tretmane za druge poremećaje i stanja, uključujući gojaznost, NAFLD, NASH, dislipidemiju, i/ili metabolički poremećaj.

[0016] Predmetni pronalazak obezbeđuje analog inkretina koji ima formulu odabranu između SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, i SEQ ID NO:25, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0018] U nekim otelotvorenjima pronalaska, analog inkretina ima formulu odabranu između SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21 i SEQ ID NO:23, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0020] U nekim otelotvorenjima pronalaska, analog inkretina ima formulu SEQ ID NO:17.

[0022] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje analog inkretina koji ima formulu:

[0023]

[0026] (SEQ ID NO: 17), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0028] U jednom otelotvorenju obelodanjivanja, obezbeđen je analog inkretina koji uključuje formulu:

[0030] YX2QGTFTSDYSIX13LDKX17AX19X20AFIEYLLX28X29GPSSX34APPPS, pri čemu je X2 Aib, X13 je L ili αMeL, X17 je bilo koja aminokiselina sa funkcionalnom grupom dostupnom za konjugaciju, i funkcionalna grupa je konjugirana sa C16–C22 masnom kiselinom, X19 je Q ili A, X20 je Aib, αMeK, Q ili H, X28 je E ili A, X29 je G ili Aib, X34 je G ili Aib (SEQ ID NO:5), i C-terminalna aminokiselina je opciono amidovana, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0032] U drugom otelotvorenju obelodanjivanja, obezbeđen je postupak za tretiranje bolesti kao što je dislipidemija, bolest masne jetre, metabolički sindrom, NASH, gojaznost i T2DM. Takvi postupci mogu da uključuju najmanje korak primenjivanja na pojedinca kom je to potrebno efektivne količine ovde opisanog analoga inkretina. U nekim slučajevima, bolest je bolest masne jetre, gojaznost, NASH ili T2DM.

[0034] U drugom otelotvorenju pronalaska, analog inkretina kako je ovde opisan je obezbeđen za upotrebu u terapiji. Na primer, analog inkretina kako je ovde opisan je obezbeđen za upotrebu u tretiranju bolesti kao što je dislipidemija, bolest masne jetre, metabolički sindrom, NASH, gojaznost i T2DM. U nekim slučajevima, bolest je bolest masne jetre, gojaznost, NASH ili T2DM.

[0036] U nekim otelotvorenjima pronalaska, analog inkretina ili farmaceutska kompozicija kako je ovde opisana je obezbeđena za upotrebu u tretmanu dijabetesa melitusa tipa II.

[0037] U nekim otelotvorenjima pronalaska, analog inkretina ili farmaceutska kompozicija kako je ovde opisana je obezbeđena za upotrebu u tretmanu gojaznosti.

[0039] U drugom otelotvorenju obelodanjivanja, analog inkretina kako je ovde opisan je obezbeđen za upotrebu u proizvodnji leka za tretiranje dislipidemije, bolesti masne jetre, metaboličkog sindroma, NASH-a, gojaznosti i T2DM-a. U nekim slučajevima, bolest je bolest masne jetre, gojaznost, NASH ili T2DM.

[0041] U drugom otelotvorenju pronalaska, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja uključuje analog inkretina kako je ovde opisan i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent.

[0043] Osim ako je definisano drugačije, svi ovde korišćeni tehnički i naučni izrazi imaju isto značenje kako ga uobičajeno razume osoba sa znanjem u predmetnoj oblasti na koju se pronalazak odnosi. Iako se bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu koristiti u praktikovanju ili testiranju analoga inkretina, farmaceutskih kompozicija i postupaka, ovde su opisani poželjni postupci i materijali.

[0045] Štaviše, referisanje na element u jednini ne isključuje mogućnost da je prisutno više od jednog elementa, osim ako kontekst jasno zahteva da postoji jedan i samo jedan element. Pridev „jedan“ stoga obično znači „najmanje jedan“.

[0047] GIP je peptid od 42 aminokiseline (SEQ ID NO:4) i inkretin, koji igra fiziološku ulogu u homeostazi glukoze stimulišući lučenje insulina iz beta ćelija pankreasa u prisustvu glukoze.

[0049] GLP-1 je peptid od 36 aminokiselina (SEQ ID NO:2) i takođe je inkretin, koji stimuliše sekreciju inkretina zavisnu od glukoze i za koji se pokazalo da sprečava hiperglikemiju kod dijabetičara.

[0051] Glukagon je peptid od 29 aminokiselina (SEQ ID NO:1) koji pomaže u održavanju glukoze u krvi i vezivanja sa i aktivaciji receptora glukagona na hepatocitima, što uzrokuje da jetra ispusti glukozu – uskladištenu u obliku glikogena – kroz proces koji se naziva glikogenolizom.

[0052] Oksintomodulin (OXM) je peptid od 37 aminokiselina koji uključuje ne samo sekvencu glukagona od 29 aminokiselina, već i oktapeptid karboksidni terminalni produžetak (SEQ ID NO:3) koji aktivira i receptor glukagona i receptor GLP-1, sa blago većom snagom za receptor glukagona u odnosu na receptor GLP-1.

[0054] Dodatno uz T2DM, za inkretine i njihove analoge koji imaju aktivnost na jednom ili više od receptora GIP-a, GLP-1, i/ili glukagona je opisano da imaju potencijal za terapeutsku vrednost u određenom broju drugih stanja, bolesti ili poremećaja, uključujući, na primer, gojaznost, NAFLD i NASH, dislipidemiju, metabolički sindrom, poremećaje povezane sa kostima, Alchajmerovu bolest i Parkinsonovu bolest. Pogledajte, npr., Jall i sar. (2017) Mol. Metab.6:440– 446; Carbone i sar. (2016) J. Gastroenterol. Hepatol. 31:23–31; Finan i sar. (2016) Trends Mol. Med.22:359–376; Choi i sar. (2017) Potent body weight loss and efficacy in a NASH animal model by a novel long-acting GLP-1/Glucagon/GIP triple-agonist (HM15211), ADA Poster 1139-P; Ding (2008) J. Bone Miner. Res. 23:536–543; Tai i sar. (2018) Brain Res.1678:64–74; Müller i sar. (2017) Physiol. Rev. 97:721–766; Finan i sar. (2013) Sci. Transl. Med.5:209; Hölscher (2014) Biochem. Soc. Trans.42:593–600.

[0056] Kako se ovde koristi, „oko“ znači unutar statistički značajnog raspona jedne ili više vrednosti kao što je, na primer, navedene koncentracije, molekularne težine, pH vrednosti, identičnosti sekvence, vremenskog okvira, temperature ili zapremine. Takva vrednost ili raspon može da bude unutar reda veličine tipično unutar 20%, tipičnije unutar 10%, i još tipičnije unutar 5% date vrednosti ili raspona. Dopustiva varijacija obuhvaćena izrazom „oko“ će zavisiti od konkretnog sistema koji se istražuje i stručnjak u predmetnoj oblasti je može lako proceniti.

[0058] Kako se ovde koristi, i u referisanju na jedan ili više od receptora GIP-a, GLP-1 ili glukagona , „aktivnost“, „aktivirati“, „aktiviranje“ i tome slično znači kapacitet jedinjenja, kao što su ovde opisani analozi inkretina, da se vezuju sa i indukuju odgovor na receptoru/receptorima, mereno korišćenjem testova poznatih u predmetnoj oblasti, kao što su in vitro testovi opisani u nastavku.

[0060] Kako se ovde koristi, „aminokiselina sa funkcionalnom grupom dostupnom za konjugaciju“ označava bilo koju prirodnu ili neprirodnu aminokiselinu sa funkcionalnom grupom koja se može konjugovati sa masnom kiselinom posredstvom, na primer, linkera. Primeri takvih funkcionalnih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, alkinilne, alkenilne, amino, azido, bromo, karboksilne, hloro, jodo i tiolne grupe. Primeri prirodnih aminokiselina koje uključuju takve funkcionalne grupe uključuju K (amino), C (tiol), E (karboksil) i D (karboksil).

[0062] Kako se ovde koristi,

masna kiselina“ označava karboksilnu kiselinu koja ima između 16 i 22 atoma ugljenika. U jednom otelotvorenju, C16– C22 masna kiselina pogodna za upotrebu ovde može biti zasićena monokiselina ili zasićena dikiselina. Kako se ovde koristi, „zasićena“ označava da masna kiselina ne sadrži dvostruke ili trostruke veze ugljenik-ugljenik.

[0064] Kako se ovde koristi, „efektivna količina“ označava količinu, koncentraciju ili dozu jednog ili više ovde opisanih analoga inkretina, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja, po jednokratnoj ili višestrukoj primeni doze na pojedinca kom je to potrebno, pruža željeni efekat kod takvog pojedinca u sklopu dijagnoze ili tretmana. Efektivnu količinu stručnjak u predmetnoj oblasti može lako odrediti kroz upotrebu poznatih tehnika i praćenjem rezultata dobijenih pod analognim okolnostima. U određivanju efektivne količine za pojedinca, uzimaju se u obzir brojni faktori, uključujući, ali ne ograničavajući se na: vrstu sisara; njegovu veličinu, starost i uopšteno zdravlje; specifičnu vrstu uključene bolesti ili poremećaja; stepen ili uključenost ili težinu bolesti ili poremećaja; reakciju pojedinačnog pacijenta; određeni analog inkretina koji se primenjuje; način primene; karakteristike biološke raspoloživosti primenjenog preparata; izabrani režim doziranja; upotrebu popratnih lekova; i druge relevantne okolnosti.

[0066] Kako se ovde koristi, „sa produženim trajanjem delovanja“ označava da se afinitet vezivanja i aktivnost analoga inkretina nastavlja tokom vremenskog perioda većeg od urođenih humanih GIP, GLP-1 i glukagon peptida, što omogućuje najmanje toliko neučestalo doziranje koliko je jednom dnevno ili čak triput nedeljno, dvaput nedeljno ili jednom nedeljno. Profil delovanja tokom vremena analoga inkretina može da se izmeri korišćenjem poznatih farmakokinetičkih testnih postupaka kao što su oni korišćeni u primerima u nastavku.

[0067] Kako se ovde koristi, „analog inkretina“ označava jedinjenje koje ima strukturne sličnosti sa, ali i višestruke razlike u odnosu na, svaki od GIP-a, GLP-1 i glukagona, posebno humani GIP (SEQ ID NO:4), GLP-1 (SEQ ID NO:2) i glukagon (SEQ ID NO:1). Ovde opisani analozi inkretina uključuju sekvence aminokiselina koje dovode do toga da jedinjenja imaju afinitet prema i aktivnost na svakom od receptora GIP-a, GLP-1 i glukagona (tj., trostruku agonističku aktivnost).

[0069] Kako se ovde koristi, „pojedinac kom je to potrebno“ označava sisara, kao što je čovek, sa stanjem, bolešću, poremećajem ili simptomom koji zahteva tretman ili terapiju, uključujući, na primer, one navedene ovde.

[0071] Kako se ovde koristi, „tretirati“, „tretiranje“ i tome slično označava ograničavanje, usporavanje, zaustavljanje ili poništenje napredovanja ili težine postojećeg stanja, bolesti, poremećaja ili simptoma.

[0073] Kako se ovde koristi, i uz referisanje na analog inkretina, „trostruka agonistička aktivnost“ označava analog inkretina sa aktivnošću na svakom od receptora GLP-a, GLP-1 i glukagona, posebno analog koji ima uravnoteženu i dovoljnu aktivnost na svakom receptoru da obezbedi koristi agonizma tog receptora uz istovremeno izbegavanje neželjenih nuspojava povezanih sa prevelikom aktivnošću. Štaviše, analozi inkretina koji imaju trostruku agonističku aktivnost imaju produženo trajanje delovanja na svakom od receptora GIP-a, GLP-1, i glukagona, što povoljno omogućava neučestalo doziranje kao što je jednom dnevno, triput nedeljno, dvaput nedeljno ili jednom nedeljno.

[0075] Strukturne karakteristike ovde opisanih analoga inkretina dovode do toga da analozi imaju dovoljno aktivnosti na svakom od receptora GIP-a, GLP-1 i glukagona da se dobiju povoljni efekti aktivnosti na svakom receptoru (tj., trostruka agonistička aktivnost), ali ne toliko aktivnosti na bilo kom pojedinačnom receptoru da prevlada nad aktivnošću na druga dva receptora ili dovede do nepoželjnih nuspojava kada se primenjuje pri dozi dovoljnoj da dovede do aktivnosti na sva tri receptora. Neograničavajući primeri takvih strukturnih karakteristika u određenim otelotvorenjima, i uz referisanje na SEQ ID NO:5, uključuju L ili αMeL na poziciji 13, za koji je utvrđeno da doprinosi optimalnoj aktivnosti glukagona i GIP-a; Aib na poziciji 20, za koji je utvrđeno da doprinosi optimalnoj aktivnosti GIP-a; acilaciju na poziciji 17, za koju je utvrđeno da doprinosi optimalnoj aktivnosti glukagona; i Y na poziciji 25, za koji je utvrđeno da doprinosi optimalnoj aktivnosti glukagona i/ili GIP-a. Drugi primeri takvih strukturnih karakteristika uključuju ovde opisane aminokiseline na pozicijama 22, 24 i 28–39, za koje je utvrđeno da doprinose optimalnom vezivanju i snazi na sva tri receptora.

[0077] Strukturne karakteristike ovde opisanih analoga inkretina takođe dovode do toga da analozi imaju mnoga druga povoljna svojstva relevantna za mogućnost njihovog razvoja kao terapijskih tretmana, uključujući za poboljšanje rastvorljivosti analoga u vodenim rastvorima, poboljšanje stabilnosti hemijske i fizičke formulacije, produženje farmakokinetičkog profila, i minimizovanje potencijala za imunogenost. Neograničavajući primeri određenih strukturnih karakteristika koje dovode do takvih svojstava uključuju acilaciju na poziciji 17 sa C20 masnom kiselinom, koja doprinosi optimalnim farmakokinetičkim (PK) profilima i mogućnosti razvoja; Aib, αMeK, Q ili H na poziciji 20, koji doprinose optimalnim PK profilima i mogućnosti razvoja; i aminokiseline na pozicijama 22, 24 i 28–39, koje doprinose optimalnom PK-u, imunogenosti, mogućnosti razvoja i stabilnosti.

[0079] Treba napomenuti da je prethodni spisak strukturnih karakteristika primeran, a ne sveobuhvatan, i da kombinacija povoljnih karakteristika ovde opisanih primernih analoga nije rezultat bilo kakve modifikacije u izolaciji, već se ostvaruje kroz nove kombinacije ovde opisanih strukturnih karakteristika. Dodatno tome, prethodno opisani efekti prethodno navedenih spisaka modifikacija nisu ekskluzivni, pošto mnoge od ovih modifikacija takođe imaju druge efekte važne za karakteristike ovde opisanih jedinjenja, kao što je opisano u nastavku.

[0081] Sekvence aminokiselina ovde opisanih analoga inkretina uključuju aminokiseline koje se nalaze u prirodi, koje se ovde tipično prikazuju korišćenjem jednoslovnih oznaka (npr., L = leucin), kao i alfa-metil supstituisane ostatke prirodnih aminokiselina (npr., α-metil leucin (αMeL) i α-metil lizin (αMeK)), i određene druge neprirodne aminokiseline, kao što je alfa amino izobuterna kiselina (Aib). Strukture ovih aminokiselina su prikazane u nastavku:

[0084] 1

[0085]

[0088] Kao što je napomenuto u prethodnome, ovde opisani analozi inkretina imaju strukturne sličnosti, ali i mnoge strukturne razlike, u odnosu na bilo koji urođeni humani peptid. Na primer, u poređenju sa urođenim humanim GIP-om (SEQ ID NO:4), ovde opisani analozi inkretina uključuju modifikacije na jednoj ili više od pozicija 2, 3, 7, 13, 14, 17, 18–21, 23–25, 28–29 i 30–42. U nekim slučajevima, ovde opisani analozi inkretina uključuju modifikacije aminokiselina urođenog humanog GIP-a (SEQ ID NO:4) na svakoj od pozicija 2, 3, 7, 13, 14, 17, 18, 20, 21, 23–25, 29 i 30–42. U određenim slučajevima, ovde opisani analozi inkretina uključuju sledeće modifikacije aminokiselina: Aib na poziciji 2; Q na poziciji 3; T na poziciji 7; L ili αMeL na poziciji 13; L na poziciji 14; modifikovani K ostatak na poziciji 17 koji je modifikovan kroz konjugaciju sa epsilon-amino grupom K-bočnog lanca sa C16 do C22 masnom kiselinom, opciono kroz upotrebu linkera; A na poziciji 18; A na poziciji 21; I na poziciji 23; E na poziciji 24; Y na poziciji 25; G ili Aib na poziciji 29; i zamenu aminokiselina na pozicijama 30–42 sa aminokiselinskom sekvencom odabranom između GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:26) i GPSS-Aib-APPPS (SEQ ID NO:27) (i skraćenih analoga repa). U pak drugim slučajevima, ovde opisani analozi inkretina takođe uključuju modifikacije na jednom ili više A na poziciji 19; αMeK, Aib ili H na poziciji 20; i E na poziciji 28. U određenim slučajevima, ovde opisani analozi inkretina su amidovani. Dodatno uz ovde opisane promene, ovde opisani analozi inkretina mogu uključivati jednu ili više dodatnih modifikacija aminokiselina, ali uz uslov da analozi ostanu u stanju da se vezuju sa i aktiviraju svaki od receptora GIP-a, GLP-1 i glukagona.

[0089] Kao što je napomenuto u prethodnome, ovde opisani analozi inkretina uključuju deo masne kiseline konjugovan, na primer, posredstvom linkera, sa prirodnom ili neprirodnom aminokiselinom sa funkcionalnom grupom dostupnom za konjugaciju. Takva se konjugacija ponekad naziva acilacijom. U određenim slučajevima, aminokiselina sa funkcionalnom grupom dostupnom za konjugaciju može da bude K, C, E i D. U posebnim slučajevima, aminokiselina sa funkcionalnom grupom dostupnom za konjugaciju je K, pri čemu je konjugacija sa epsilon-amino grupom K bočnog lanca.

[0091] Acilacija ovde opisanih analoga inkretina je na poziciji 17 u SEQ ID NO:5, za koji je utvrđeno da je optimalna lokacija za uključivanje ove strukture. Masna kiselina i, u određenim otelotvorenjima, linker, deluju kao sredstva za vezivanje albumina i obezbeđuju potencijal za generisanje jedinjenja sa dugim delovanjem.

[0093] Ovde opisani analozi inkretina koriste C16–C22 masne kiseline hemijski konjugovane sa funkcionalnom grupom amino kiseline ili putem direktne veze ili putem linkera. Dužina i kompozicija masnih kiselina utiče na vreme poluraspada analoga inkretina, njihovu snagu u in vivo životinjskim modelima, i njihovu rastvorljivost i stabilnost. Konjugacija sa C16–C22 zasićenom masnom monokiselinom ili dikiselinom dovodi do analoga inkretina koji ispoljavaju poželjno vreme poluraspada, poželjnu snagu u in vivo životinjskim modelima, i poželjne karakteristike rastvorljivosti i stabilnosti.

[0095] Primeri zasićenih C16–C22 masne kiseline za upotrebu ovde uključuju, ali nisu ograničeni na, palmitinsku kiselinu (heksadekansku kiselinu)

[0096] (C16 monokiselinu), heksadekandionsku kiselinu (C16 dikiselinu), margarinsku kiselinu (heptadekansku kiselinu) (C17 monokiselinu), heptadekandionsku kiselinu (C17 dikiselinu), stearinsku kiselinu (C18 monokiselinu), oktadekandionsku kiselinu (C18 dikiselinu), nonadeciklinsku kiselinu (nonadekansku kiselinu)

[0097] (C19 monokiselina), nonadekandionsku kiselinu (C19 dikiselinu), arahidinsku kiselinu (eikozanoinsku kiselinu) (C20 monokiselinu), eikozandionsku kiselinu (C20 dikiselinu), heneikozilnu kiselinu (heneikozanoinsku kiselinu)

[0098] (C21 monokiselina), heneikozandionsku kiselinu (C21 dikiselinu), behensku kiselinu (dokozanoinsku kiselinu) (C22 monokiselina), dokozandionsku kiselinu

[0099] (C22 dikiselina), uključujući njihove račvaste i supstituisane derivate.

[0100] U određenim slučajevima, C16–C22 masna kiselina može da bude zasićena C18 monokiselina, zasićena C18 dikiselina, zasićena C19 monokiselina, zasićena C19 dikiselina, zasićena C20 monokiselina, zasićena C20 dikiselina, i njihovi račvasti i supstituisani derivati. U posebnim slučajevima, C16–C22 masna kiselina može da bude stearinska kiselina, arahidinska kiselina i eikozandionska kiselina, posebno arahidinska kiselina.

[0102] U nekim slučajevima, linker može da ima od jedne do četiri aminokiseline, amino polietilen glikol karboksilat, ili njihove smeše. U određenim slučajevima, amino polietilen glikol karboksilat ima sledeću strukturu:

[0104] H-{NH-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]m-O-(CH2)p-CO}n-OH,

[0106] pri čemu je m bilo koji celi broj od 1 do 12, n je bilo koji celi broj od 1 do 12, i p je 1 ili 2.

[0108] U određenim slučajevima, linker može imati jedan ili više (2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil) delova, opciono u kombinaciji sa jednom do četiri aminokiseline.

[0110] U slučajevima u kojima linker uključuje najmanje jednu aminokiselinu, aminokiselina može biti jedan do četiri Glu ili γGlu aminokiselinska ostatka. U nekim slučajevima, linker može da uključuje jedan ili dva Glu ili γGlu aminokiselinska ostatka, uključujući njihove D oblike. Na primer, linker može da uključuje ili jedan ili dva yGlu aminokiselinska ostatka. Alternativno, linker može da uključuje jedan do četiri aminokiselinska ostatka (kao što su, na primer, Glu ili γGlu aminokiseline) korišćene u kombinaciji sa najviše trideset i šest (2-[2-(2-aminoetoksi)-etoksi]-acetil) delova. Specifično, linker može da bude kombinacija jednog do četiri Glu ili γGlu aminokiselinska dela i jednog do četiri (2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil) dela. U drugim slučajevima, linker može da bude kombinacija jednog ili dva γGlu aminokiselinska dela i jednog ili dva (2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil) dela.

[0113] 1

[0114] U jednom specifičnom slučaju, ovde opisani analozi inkretina imaju komponente linkera i masne kiseline sa strukturom prema sledećoj formuli:

[0116] (2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)a-(γGlu)b-CO-(CH2)c-CO2H,

[0118] pri čemu je a 0, 1 ili 2, b je 1 ili 2, i c je 16 ili 18. U jednom posebnom slučaju, a je 2, b je 1, i c je 18, čija je struktura prikazana u nastavku:

[0121]

[0124] U drugom specifičnom slučaju, a je 1, b je 2, i c je 18, čija je struktura prikazana u nastavku:

[0127]

[0130] U drugom specifičnom slučaju, a je 0, b je 2, i c je 18, čija je struktura prikazana u nastavku:

[0131] U drugom specifičnom slučaju, a je 1, b je 1, i c je 18, čija je struktura prikazana u nastavku:

[0134]

[0137] Kao što je prikazano u hemijskim strukturama primera 1–20 u nastavku, delovi linkera-masne kiseline opisani u prethodnome mogu da budu povezani sa epsilon (ε)-amino grupom bočnog lanca (K) lizina.

[0139] Afinitet ovde opisanih analoga inkretina za svaki od receptora GIP-a, GLP-1 i glukagona mogu da budu izmereni korišćenjem tehnika poznatih u predmetnoj oblasti za merenje nivoa vezivanja receptora, uključujući, na primer, one opisane u primerima u nastavku, i obično se izražava kao vrednost konstante inhibicije (Ki). Aktivnost ovde opisanih analoga inkretina na svakom od receptora takođe može da bude izmerena korišćenjem tehnika poznatih u predmetnoj oblasti, uključujući, na primer, in vitro testove aktivnosti opisane u nastavku, i obično se izražava kao vrednost efektivne koncentracije 50 (EC50), koja je koncentracija jedinjenja koja izaziva polumaksimalnu simulaciju u krivulji reakcije na dozu.

[0141] Ovde opisani analozi inkretina mogu da budu formulisani kao farmaceutske kompozicije, koje mogu da budu primenjene parenteralnim putevima (npr., subkutano, intravenski, intraperitonealno, intramuskularno ili transdermalno). Takve farmaceutske kompozicije i tehnike za pripremanje istih su dobro poznate u predmetnoj oblasti. Pogledajte, npr., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Troy, urednik., 21. izdanje, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006). U posebnim slučajevima, analozi inkretina se primenjuju subkutano.

[0143] Ovde opisani analozi inkretina mogu reagovati sa bilo kojim brojem neorganskih i organskih kiselina/baza da formiraju farmaceutski prihvatljive kisele/bazne adicione soli. Farmaceutski prihvatljive soli i uobičajene tehnike za

[0146] 1

[0147] njihovo pripremanje su dobro poznate u predmetnoj oblasti (pogledajte, npr., Stahl i sar., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2. revidirano izdanje (Wiley-VCH, 2011)). Farmaceutski prihvatljive soli za upotrebu ovde uključuju natrijumove, trifluorosirćetne, hlorovodonične, i/ili acetatne soli.

[0149] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje i stoga obuhvata nove intermedijere i postupke sintetiziranja ovde opisanih analoga inkretina, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli. Ovde opisani intermedijeri i analozi inkretina mogu da budu pripremljeni različitim tehnikama poznatim u predmetnoj oblasti. Na primer, postupak u kom se koristi hemijska sinteza je ilustrovan u primerima u nastavku. Specifični koraci sinteze za svaku od opisanih ruta mogu da budu kombinovani na različite načine da bi se pripremili ovde opisani analozi inkretina. Reagensi i početni materijali su lako dostupni stručnjaku u predmetnoj oblasti.

[0151] Određeni ovde opisani analozi inkretina su uopšteno efektivni u širokom rasponu doze. Na primer, doze za primenjivanje jednom nedeljno mogu da budu u rasponu od oko 0,01 do oko 30 mg/osobi/nedelji, u rasponu od oko 0,1 do oko 10 mg/osobi/nedelji ili čak u rasponu od oko 0,1 do oko 3 mg/osobi/nedelji. Tako se ovde opisani analozi inkretina mogu dozirati jednom dnevno, triput nedeljno, dvaput nedeljno ili jednom nedeljno, posebno u primeni jednom nedeljno.

[0153] Ovde opisani analozi inkretina mogu da se koriste za tretiranje raznih stanja, poremećaja, bolesti ili simptoma. Posebno su otkriveni postupci za tretiranje T2DM-a u pojedincu, pri čemu takvi postupci uključuju najmanje korak primenjivanja na pojedinca kom je potreban takav tretman efektivne količine ovde opisanog analoga inkretina, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0155] Dodatno tome, otkriveni su postupci za tretiranje gojaznosti u pojedincu, pri čemu takvi postupci uključuju najmanje korak primenjivanja na pojedinca kom je potreban takav tretman efektivne količine ovde opisanog analoga inkretina, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0157] Dodatno tome, otkriveni su postupci za indukovanje neterapeutskog gubitka težine kod pojedinca, pri čemu takvi postupci uključuju najmanje korak primenjivanja na pojedinca kom je potreban takav tretman efektivne količine ovde opisanog analoga inkretina, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0160] 1

[0161] Dodatno tome, otkriveni su postupci za tretiranje metaboličkog sindroma kod pojedinca, pri čemu takvi postupci uključuju najmanje korak primenjivanja na pojedinca kom je takav tretman potreban efektivne količine ovde opisanog analoga inkretina, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0163] Dodatno tome, otkriveni su postupci za tretiranje NASH-a kod pojedinca, pri čemu takvi postupci uključuju najmanje korak primenjivanja na pojedinca kom je takav tretman potreban efektivne količine ovde opisanog inkretina, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0165] Dodatno tome, otkriveni su postupci za tretiranje NAFLD-a kod pojedinca, pri čemu takvi postupci uključuju najmanje korak primenjivanja na pojedinca kom je takav tretman potreban efektivne količine ovde opisanog inkretina, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0167] U ovim postupcima, efektivnost analoga inkretina može da bude procenjena, na primer, uočavanjem značajnog smanjenja glukoze u krvi, uočavanjem značajnog povećanja insulina, uočavanjem značajnog smanjenja HbAlc i/ili uočavanjem značajnog smanjenja telesne težine.

[0169] Alternativno tome, ovde opisani analozi inkretina ili njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu da se koriste za poboljšanje čvrstoće kosti kod pojedinca kom je to potrebno. U nekim slučajevima, pojedinac kom je to potrebno ima hipoostozu ili hipoosteoidozu, ili se oporavlja od frakture kosti, ortotskog zahvata, ugradnje proteze, ugradnje dentalnog implantata, i/ili spinalne fuzije. Ovde opisani analozi inkretina takođe mogu da budu korišćeni za tretiranje drugih poremećaja kao što je Parkinsonova bolest ili Alchajmerova bolest.

[0171] Sinteza peptida

[0173] Primer 1:

[0175] Primer 1 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0177] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-αMeK-AFIEYLLA-Aib-GPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:7).

[0180] 1

[0181] U nastavku je prikaz strukture primera 1 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, αMeL13, K17, αMeK20 i Aib29, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0184]

[0187] Peptidna kičma primera 1 se sintetizuje korišćenjem hemije fluorenilmetiloksikarbonila (Fmoc)/terc-butila (t-Bu) na 12-kanalnom multipleksnom Symphony sintetizatoru peptida (Protein Technologies, Inc., Tuson, Arizona).

[0189] Smola se sastoji od 1% DVB umreženog polistirena (Fmoc-Rink-MBHA smola sa niskom supstitucijom, 100–200 mesh, EMD Millipore) u supstituciji od 0,3–0,4 meq/g. Koriste se standardne zaštitne grupe bočnog lanca. Fmoc-Lys(Mtt)-OH) se koristi za lizin na poziciji 17 i Boc-Tyr(tBu)-OH) se koristi za tirozin na poziciji 1. Fmoc grupe se uklanjaju pre svakog koraka udvajanja (2 × 7 minuta) korišćenjem 20% piperidina u DMF. Sva standardna udvajanja aminokiselina se sprovode tokom 1 časa na primarnom aminu i 3 časa na sekundarnom aminu, korišćenjem jednakog molarnog odnosa Fmoc aminokiseline (0,3 mM), diizopropilkarbodiimida (0,9 mM) i oksima (0,9 mM), pri 9-strukom molarnom višku u odnosu na teoretsko opterećenje peptidom. Izuzeci su udvajanja na Cαmetilovane aminokiseline, koje se udvajaju tokom 3 časa. Nakon završetka sinteze peptidne okosnice, smola se temeljno ispire DCM-om 6 puta da bi se uklonio preostali DMF. Mtt zaštitna grupa na lizinu na poziciji 17 se selektivno uklanja iz peptidne smole korišćenjem dva tretmana 30% heksafluoroizopropanolom (Oakwood Chemicals) u DCM-u (2 × 40-minutni tretman).

[0191] Naknadno vezivanje dela masna kiselina-linker se postiže spajanjem 2-[2-(2-Fmoc-amino-etoksi)-etoksi]-sirćetne kiseline (Fmoc-AEEA-OH,

[0194] 1

[0195] ChemPep, Inc.), Fmoc-glutaminske kiseline α-t-butil estra (Fmoc-Glu-OtBu, Ark Pharm, Inc.), mono-OtBu-eikozandionske kiseline (WuXi AppTec, Šangaj, Kina).

[0196] 3-struki višak reagensa (AA:PyAOP:DIPEA = 1:1:1 mol/mol) se koristi za svako udvajanje koje traje 1 čas.

[0198] Nakon što se sinteza završi, peptidna smola se ispira sa DCM-om, i zatim potpuno osuši na vazduhu. Suva smola se tretira sa 10 ml koktela za cepanje (trifluorosirćetna kiselina:voda:triizopropilsilan, 95:2,5:2,5 zapr./zapr.) tokom 2 časa na sobnoj temperaturi. Smola se filtrira, ispira dva puta sa po 2 ml čistog TFA i kombinovani filtrati se tretiraju sa 5-strukim hladnim dietil etrom (-20 °C) da bi se istaložio sirovi peptid. Suspenzija peptida/etra se zatim centrifugira na 3500 o/min tokom 2 min da bi se formirao čvrsti pelet, supernatant se dekantuje, i čvrsti pelet se podvrgava trituraciji etrom još dva puta i suši in vacuo. Sirovi peptid se rastvara u 20% acetonitrila / 20% sirćetne kiseline / 60% vode i prečišćava upotrebom RP-HPLC na Luna 5 µm fenil-heksil preparativnoj koloni (21 × 250 mm, Phenomenex) sa linearnim gradijentima od 100% acetonitrila i sistemom pufera od 0,1% TFA/vode (30–50% acetonitrila za 60 min). Čistoća peptida se procenjuje upotrebom analitičkog RP-HPLC-a i kriterijumi grupisanja su > 95%. Utvrđeno je da je čistoća glavne grupe primera 198,8%. Naknadna liofilizacija konačne glavne grupe produkta dala je liofilizovanu peptidnu TFA so. Molekularna težina se određuje pomoću LC-MS-a (uočena: M+4H+/4 = 1226,8; Izračunata M+4H+/4 = 1226,9).

[0200] Primer 2:

[0202] Primer 2 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0204] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQHAFIEYLLA-Aib-GPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:6).

[0206] U nastavku je prikaz strukture primera 2 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, αMeL13, K17 i Aib29, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0209] 1

[0210]

[0213] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 2.

[0215] Primer 3:

[0217] Primer 3 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0219] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-αMeK-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:8).

[0221] U nastavku je prikaz strukture primera 3 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, αMeL13, K17, i αMeK20, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0224]

[0227] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 3.

[0230] 2

[0231] Primer 4:

[0233] Primer 4 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0235] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLA-Aib-GPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:9).

[0237] U nastavku je prikaz strukture primera 4 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, K17, Aib20 i Aib29, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0240]

[0243] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 4.

[0245] Primer 5:

[0247] Primer 5 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0249] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AAQAFIEYLLE-Aib-GPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO: 10).

[0251] U nastavku je prikaz strukture primera 5 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, αMeL13, K17, i Aib29, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0252]

[0255] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 5.

[0257] Primer 6:

[0259] Primer 6 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0261] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AAQAFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:11).

[0263] U nastavku je prikaz strukture primera 6 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, αMeL13, i K17, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0266]

[0269] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 6.

[0270] Primer 7:

[0272] Primer 7 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0274] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQHAFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO: 12).

[0276] U nastavku je prikaz strukture primera 7 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, αMeL13 i K17, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0279]

[0282] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 7.

[0284] Primer 8:

[0286] Primer 8 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0288] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-αMeK-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO: 13).

[0290] U nastavku je prikaz strukture primera 8 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, K17 i αMeK20, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0293] 2

[0294]

[0297] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 8.

[0299] Primer 9:

[0301] Primer 9 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0303] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((γGlu)2-CO-(CH2)18-CO2H)AQHAFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:14).

[0305] U nastavku je prikaz strukture primera 9 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, αMeL13 i K17, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0308]

[0311] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 9.

[0312] Primer 10:

[0314] Primer 10 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0316] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQHAFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO: 15).

[0318] U nastavku je prikaz strukture primera 10 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, αMeL13 i K17, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0321]

[0324] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 10.

[0326] Primer 11:

[0328] Primer 11 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0330] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:16).

[0332] U nastavku je prikaz strukture primera 11 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, αMeL13, K17 i Aib20, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0335] 2

[0336]

[0339] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 11.

[0341] Primer 12:

[0343] Primer 12 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0345] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:17).

[0347] U nastavku je prikaz strukture primera 12 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, αMeL13, K17 i Aib20, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0350]

[0353] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 12.

[0356] 2

[0357] Primer 13:

[0359] Primer 13 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0361] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLE-Aib-GPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:18).

[0363] U nastavku je prikaz strukture primera 13 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, αMeL13, K17, Aib20 i Aib29, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0366]

[0369] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 13.

[0371] Primer 14:

[0373] Primer 14 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0375] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLE-Aib-GPSS-Aib-APPPS-NH2 (SEQ ID NO: 19).

[0377] U nastavku je prikaz strukture primera 14 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, αMeL13, K17, Aib20, Aib29, i Aib34, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0380] 2

[0381]

[0384] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 14.

[0386] Primer 15:

[0388] Primer 15 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0390] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLA-Aib-GPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:20).

[0392] U nastavku je prikaz strukture primera 15 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, K17, Aib20 i Aib29, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0395]

[0398] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 15.

[0401] 2

[0402] Primer 16:

[0404] Primer 16 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0406] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:21).

[0408] U nastavku je prikaz strukture primera 16 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, K17, i Aib20, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0411]

[0414] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 16.

[0416] Primer 17:

[0418] Primer 17 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0420] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLE-Aib-GPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:22).

[0422] U nastavku je prikaz strukture primera 17 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, K17, Aib20 i Aib29, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0425] 2

[0426]

[0429] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 17.

[0431] Primer 18:

[0433] Primer 18 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0435] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-A-FIEYLLEGGPSSGA-PPPS-NH2 (SEQ ID NO:23).

[0437] U nastavku je prikaz strukture primera 18 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, K17, i Aib20, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0440]

[0443] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 18.

[0444] Primer 19:

[0446] Primer 19 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0448] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)2-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLE-Aib-GPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:24).

[0450] U nastavku je prikaz strukture primera 19 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, K17, Aib20 i Aib29, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0453]

[0456] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 19.

[0458] Primer 20:

[0460] Primer 20 je jedinjenje predstavljeno sledećim opisom:

[0462] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLE-Aib-GPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO:25).

[0464] U nastavku je prikaz strukture primera 20 koji koristi standardne jednoslovne oznake za aminokiseline, uz izuzetak ostataka Aib2, K17, Aib20 i Aib29, za koje su strukture ovih aminokiselinskih ostataka proširene:

[0467] 1

[0468]

[0471] Procesi slični onima opisanim u prethodnome za primer 1 se koriste da se sintetizuje peptidna okosnica, konjuguje deo masna kiselina-linker, proveri čistoća, i potvrdi molekularna težina primera 20.

[0473] In vitro funkcija

[0475] Afinitet vezivanja:

[0477] Konkurentni testovi vezivanja radioliganda se sprovode da bi se utvrdila konstanta ekvilibrijuma disocijacije za primerna jedinjenja i komparativne molekule. Takvi testovi koriste postupke testa blizine scintilacije (engl. scintillation proximity assay, SPA) i membrane pripremljene od transfektovanih HEK293 ćelija sa prekomernom ekspresijom receptora GIP-a (GIPR), receptora GLP-1 (GLP-1R) ili receptora humanog glukagona (GcgR).

[0479] Testovi se izvode u prisustvu bacitracina kao nespecifičnog blokirajućeg agensa za sprečavanje vezivanja acilovanih delova testnih analoga sa proteinskim komponentama korišćenim u standardnim testnim puferima (npr., albuminu).

[0481] Krivulje konkurencije su ucrtane na graf kao procenat specifične inhibicije (y-osa) spram log koncentracije jedinjenja (x-osa) i analizuju korišćenjem nelinearnog regresijskog uklapanja sa četiri parametra sa promenjivim nagibom (ABase ili Genedata). Vrednosti Ki se izračunavaju prema jednačini

[0482] Ki = IC50/(1+(D/Kd)), pri čemu je IC50 koncentracija jedinjenja koja dovodi do 50% inhibicije vezivanja, D je koncentracija liganda korišćenog u testu, i Kd je konstanta ekvilibrijuma disocijacije za receptor i radioligand, utvrđena analize vezivanja do zasićenja (prikazane u Tabeli 1 u nastavku).

[0485] 2

[0486] Tabela 1. Konstante ekvilibrijuma disocijacije (Kd) utvrđene iz analize vezivanja do zasićenja.

[0489]

[0492] Vrednosti Ki primernih analoga i komparativnih molekula su prikazane u Tabeli 2.

[0494] Tabela 2. In Vitro afinitet vezivanja (KL) primera i komparatora za humani GIPR, GLP-1R i GcgR.

[0496]

[0497]

[0500] Kao što se vidi u Tabeli 2, primerni analozi imaju afinitet vezivanja na svakom od receptora GIP-a, GLP-1 i glukagona.

[0502] Funkcionalna aktivnost:

[0504] Funkcionalna aktivnost se utvrđuje u GIP-R- GLP-1R- i GcgR-ispoljavajućim HEK-293 klonalnim ćelijskim linijama. Svaka ćelijska linija koja prekomerno ispoljava receptor se tretira peptidom (krivulja odgovora na koncentraciju (engl. concentration-response curve, CRC) u 20 tačaka, 2,75-struki Labcyte Echo direktni rastvor) u DMEM-u (Gibco kat. br.31053) nadopunjenim sa 1X GlutaMAX<™>(Gibco kat. br.35050), 0,25% FBS (fetalni goveđi serum (engl. fetal bovine serum), Gibco kat. br.26400), 0,05% frakcije V BSA (goveđi serum albumin (engl. bovine serum albumin), Gibco kat. br.15260), 250 µM IBMX i 20 mM HEPES (Gibco kat. br.15630) u 20 µl testne zapremine.

[0506] Nakon 60 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, dobijeno povećanje intracelularnog cAMP-a se kvantitativno određuje korišćenjem testnog kompleta

[0509] 4

[0510] CisBio cAMP Dynamic 2 HTRF (62AM4PEJ). Ukratko, nivoi cAMP unutar ćelije se detektuju dodavanjem cAMP-d2 konjugata u puferu za lizu ćelija praćeno antitelom anti-cAMP-Eu<3+>-Kriptat, takođe u puferu za lizu ćelija. Dobijeni konkurencijski test se inkubira tokom najmanje 60 minuta na sobnoj temperaturi i zatim se detektuje korišćenjem PerkinElmer Envision<®>instrumentom sa ekscitacijom na 320 nm i emisijom na 665 nm i 620 nm. Envision jedinice (emisija na 665 nm/620 nm*10.000) su inverzno proporcionalne količini prisutnog cAMP i pretvorene su u nM cAMP po bunariću korišćenjem cAMP standardne krivulje.

[0512] Količina generisanog cAMP (nM) u svakom bunariću se pretvara u procenat maksimalnog odgovora uočenog ili sa humanim GLP-1(7–36)NH2, humanim Gcg, ili humanim GIP(1-42)NH2. Relativna EC50 vrednost je izvedena nelinearnom regresijskom analizom upotrebom procenta maksimalnog odgovora u odnosu na koncentraciju dodatog peptida, prilagođenu logističkoj jednačini sa četiri parametra.

[0514] Podaci za primerne analoge i hGIP(1-42)NH2, hGLP-1(7-36)NH2 i hGcg su prikazani u Tabeli 3 u nastavku.

[0516] Tabela 3. Funkcionalna snaga cAMP (EC50) za primerne analoge i komparatore u prisustvu FBS-a i BSA.

[0518]

[0519]

[0522] Kao što se vidi u Tabeli 3, u prisustvu FBS-a i BSA, primerni analozi imaju agonističke aktivnosti utvrđene cAMP testovima humanog GIP-R, GLP-1R, i GcgR cAMP-a, koji su manji od urođenih liganda.

[0524] Dodatni set cAMP testova se sprovodi u HEK293 ćelijama koje ispoljavaju receptore humanog GLP-1, GIP, i glukagona. Upotrebom postupaka homogene vremenski razložene fluoroscencije, testovi se sprovode da bi se odredila intrinzična snaga primernih analoga i komparatora izvedenih u prisustvu kazeina (umesto serumskog albumina) kao nespecifičnog blokatora, koji ne stupa u interakciju sa delovima masnih kiselina analiziranih molekula.

[0525] Intracelularni nivoi cAMP se određuju ekstrapolacijom upotrebom standardne krivulje. Krivulje reakcije na dozu jedinjenja se ucrtavaju kao procenat stimulacije normalizovan na minimalne (samo pufer) i maksimalne (maksimalne koncentracije svakog kontrolnog liganda) vrednosti i analiziraju upotrebom nelinearne regresije sa četiri parametra sa promenljivim nagibom (Genedata Screener 13). EC50 je koncentracija jedinjenja koja izaziva polumaksimalnu simulaciju u krivulji reakcije na dozu.

[0527] Podaci su obezbeđeni u nastavku, u Tabeli 4.

[0529] Tabela 4. Funkcionalna aktivacija hGLP-1R, hGIPR, hGcgR u prisustvu 0,1% kazeina.

[0531]

[0532]

[0535] Kao što se vidi u Tabeli 4, primerni analozi stimulišu cAMP iz receptora humanog GIP, GLP-1 i glukagona u prisustvu 0,1% kazeina.

[0537] In vivo ispitivanja

[0539] Farmakokinetika kod mužjaka Sprague Dawley pacova:

[0541] Farmakokinetika primernih analoga se ocenjuje nakon jedne subkutane primene 100 nM/kg na mužjake Sprague Dawley pacova. Uzorci krvi se prikupljaju tokom 120 časova, i dobijene pojedinačne koncentracije u plazmi se koriste za izračunavanje farmakokinetičkih parametara. Koncentracije peptida u plazmi (K3 EDTA) se utvrđuju korišćenjem kvalifikovanog LC/MS postupka koji meri neoštećenu masu analoga. Svaki peptid i jedan analog kao interni standard se ekstrahuju iz 100% plazme specificirane za vrstu korišćenjem metanola sa 0,1% mravlje kiseline. Thermo Q-Exactive, instrument visoke rezolucije, i Thermo Easy Spray PepMap se kombinuju za LC/MS detekciju. Srednje vrednosti farmakokinetičkih parametara su prikazane u Tabeli 5.

[0542] Tabela 5. Srednje vrednosti farmakokinetičkih parametara peptida nakon primene jedne subkutane doze 100 nmol/kg na mužjake Sprague Dawley pacova.

[0544]

[0547] Kao što se vidi u Tabeli 5, primerni analozi pokazuju produžen farmakokinetički profil.

[0549] In vivo efekat na sekreciju insulina kod mužjaka Wistar pacova:

[0551] Intravenski test tolerancije glukoze (ivGTT) kod pacova (mužjaci Wistar) se koriste za procenu insulinotropske snage primernih analoga. GLP-1 RA semaglutid se koristi kao pozitivna kontrola. Pacovi sa hirurški implantiranim kanilama u jugularnoj veni i karotidnoj arteriji (Envigo, Indianapolis, Indijana; 280–320 grama) se smeštaju, jedan po kavezu, u polikarbonatne kaveze sa filterskim poklopcima. Pacovi se drže sa 12-časovnim ciklusom svetlosti i tame na 21 °C i daje im se 2014 Teklad Global ishrana (Envigo, Indianapolis) i dejonizovana voda ad libitum. Pacovi se randomizuju prema telesnoj težini i doziraju sa 1,5 ml/kg subkutano (sc) sa primernim analogom 16 časova pre primene glukoze, a zatim im se uskraćuje hrana. Standardne koncentracije od 211 nM primernih analoga se razblažuju u Tris puferu pH 8,0 na 6,667 nmol/ml, 2,0 nmol/ml, 0,667 nmol/ml, 0,2 nmol/ml; testirane doze su vehikulum, 1, 3 i 10 nmol/kg, i, u nekim slučajevima, 0,3 i 30 nmol/kg. Semaglutid se koristi kao pozitivna kontrola, i njegovi insulinotropni efekti se mere kako u njegovom testu (vehikulum i doze 1, 3, 10 i 30 nmol/kg) tako i u vezi sa svakim ciklusom primernih analoga (doza 10 nmol/kg).

[0553] Uzorak krvi u 0. vremenu se prikuplja u EDTA epruvete nakon čega se primenjuje glukoza (0,5 mg/kg, 5 ml/kg). Uzorci krvi se prikupljaju za nivoe glukoze i insulina u vremenskim tačkama 2, 4, 6, 10, 20, i 30 minuta nakon intravenske primene glukoze. Insulin u plazmi se utvrđuje korišćenjem testa elektrohemiluminescencije (Meso Scale, Gaitersburg, Merilend). Područje ispod krivulje (AUC) insulina se pregleda i upoređuje sa kontrolnom grupom vehikuluma sa n = 6 životinja po grupi.

[0555] Statistička analiza se izvodi korišćenjem JMP sa jednosmernim ANOVA testom praćenim Dunnetovim upoređivanjem sa kontrolnom grupom vehikuluma. Podaci su obezbeđeni u Tabeli 6 u nastavku.

[0557] Tabela 6. Efekat vehikuluma, semaglutida i primernih analoga na sekreciju insulina tokom testa tolerancije intravenske glukoze kod anestetizovanih Wistar pacova.

[0559]

[0563] 4

[0564]

[0567] Kao što se vidi u Tabeli 6, primerni analozi prikazuju povećanja u sekreciji insulina zavisna od doze.

[0569] Ispitivanja kod C57BL/6 miševa sa gojaznošću uzrokovanom ishranom:

[0570] Primerni analozi inkretina, kako su ovde opisani, predlažu se kao tretman ne samo za dijabetes, već i za metabolički sindrom, koji je skup komorbiditeta (dislipidemije, gojaznosti, hepatičke steatoze, itd.) povezanih sa insulinskom rezistencijom i dijabetesom. Da bi se ispitali efekti primernih analoga na parametre kao što su gubitak težine, metabolizam, telesna kompozicija i hepatička steatoza, dozirani su C57BL/6 miševima sa gojaznošću indukovanom ishranom (engl. diet-induced obese, DIO). Ove životinje, iako nemaju dijabetes, pokazuju insulinsku rezistenciju, dislipidemiju i hepatičku steatozu, što su sve karakteristike metaboličkog sindroma, nakon prelaska na visokomasnu prehranu tokom 18 nedelja.

[0572] Specifično, u sledećim ispitivanjima se koriste DIO mužjaci C57BL/6 miševa stari 24 do 25 nedelja koji se drže na kalorično bogatoj ishrani. Miševi su pojedinačno smešteni u klimatizovani prostor (24 °C) sa 12-časovnim ciklusom svetlosti/tame (paljenje svetla u 22:00) i slobodnim pristupom hrani (TD95217) i vodi. Nakon minimalno 2 nedelje privikavanja na prostor, miševi su randomizovani prema njihovoj telesnoj težini, kako bi svaka eksperimentalna grupa životinja imala sličnu telesnu težinu. Telesne težine su u rasponu od 40 do 51 g.

[0574] Sve grupe sadrže 5–6 miševa. Vehikulum, primerni analozi rastvoreni u vehikulumu (40 mM Tris-HCl pri pH 8,0), i semaglutid rastvoren u vehikulumu se primenjuju subkutanim (SC) ubrizgavanjem (10 ml/kg) na ad libitum hranjene DIO miševe 30 do 90 minuta pre početka ciklusa tame svaka 3 dana tokom 15 dana. SC ubrizgavanja se vrše 1., 4., 7., 10. i 13. dana. Telesna težina i unos hrane se mere dnevno tokom celog istraživanja

[0576] Apsolutne promene u telesnoj težini se izračunavaju oduzimanjem telesne težine iste životinje pre prvog ubrizgavanja vehikuluma, analoga ili semaglutida. 0. i 15. dana ukupna masa masti se meri nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) korišćenjem Echo Medical System instrumenta (Hjuston, Teksas). 15. dana se životinje žrtvuju pre perioda tame, te se jetre vade i zamrzavaju. Trigliceridi u jetri, utvrđeni iz homogenata jetri prikupljenih prilikom žrtvovanja, i holesterol u plazmi se meri na Hitachi Modular P kliničkom analizatoru.

[0578] Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM 5–6 životinja u Tabelama 7 i 8 u nastavku. Statistička analiza se izvodi korišćenjem višestrukih merenja ANOVA testa, praćeno Dunnettovim postupkom za višestruka upoređivanja. Značajne razlike su identifikovane na p < 0,05.

[0580] Tabela 7. Promena telesne težine nakon tretmana primernim analozima nakon petnaest dana.

[0582]

[0583]

[0586] 4 Kao što se vidi u Tabeli 7 u prethodnome, primerni analozi pokazuju smanjenja telesne težine zavisna od doze.

[0588] Podaci za metaboličke parametre pri dozi od 3 nmol/kg su obezbeđeni u nastavku, u Tabeli 8.

[0590] Tabela 8. Efekat tretmana sa primernim analozima pri 3 nmol/kg na glukozu u krvi, insulin, holesterol, alanin aminotransferazu (ALT) i trigliceride u jetri nakon petnaest dana tretmana.

[0592]

[0595] Dodatno uz značajan gubitak težine, i kao što se vidi u Tabeli 8, primerni analozi smanjuju glukozu u krvi, insulin u plazmi (kao znak povećane osetljivosti na insulin) i holesterol u plazmi, te poboljšava zdravlje jetre koje se ogleda u smanjenju ALT-a u plazmi i triglicerida u jetri.

[0596] SEQ ID NO:1 – Humani glukagon HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT SEQ ID NO:2 – Humani GLP-1 (7–36) amid HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2

[0597] SEQ ID NO:3 – Humani OXM

[0598] HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA

[0599] SEQ ID NO:4 – Humani GIP

[0600] YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ

[0601] SEQ ID NO:5 – Analog inkretina YX2QGTFTSDYSIX13LDKX17AX19X20AFIEYLLX28X29GPSSX34APPPS pri čemu:

[0602] X2 je Aib,

[0603] X13 je L ili αMeL,

[0604] X17 je bilo koja amino kiselina sa funkcionalnom grupom dostupnom za konjugaciju, i funkcionalna grupa je konjugovana sa C16–C22 masnom kiselinom,

[0605] X19 je Q ili A,

[0606] X20 je Aib, αMeK, Q ili H,

[0607] X28 je E ili A,

[0608] X29 je G ili Aib, i

[0609] X34 je G ili Aib

[0610] SEQ ID NO:6 – Analog inkretina

[0613] 4

[0614] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQHAFIEYLLA-Aib-GPSSGAPPPS-NH2

[0616] SEQ ID NO:7 – Analog inkretina

[0618] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-αMeK-AFIEYLLA-Aib-GPSSGAPPPS-NH2

[0620] SEQ ID NO:8 – Analog inkretina

[0622] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-αMeK-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2

[0624] SEQ ID NO:9 – Analog inkretina

[0626] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLA-Aib-GPSSGAPPPS-NH2

[0628] SEQ ID NO:10 – Analog inkretina

[0630] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)

[0631] CO-(CH2)18-CO2H)AAQAFIEYLLE-Aib-GPSSGAPPPS-NH2

[0634] 4

[0635] SEQ ID NO:11 – Analog inkretina

[0636] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-

[0637] CO-(CH2)18-CO2H)AAQAFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2

[0638] SEQ ID NO:12 – Analog inkretina

[0639] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-

[0640] CO-(CH2)18-CO2H)AQHAFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2

[0641] SEQ ID NO:13 – Analog inkretina

[0642] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-αMeK-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2

[0643] SEQ ID NO:14 – Analog inkretina

[0644] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((YGlu)2-CO-(CH2)18-

[0645] CO2H)AQHAFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2

[0646] SEQ ID NO:15 – Analog inkretina

[0649] 4

[0650] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γYGlu)-

[0651] CO-(CH2)18-CO2H)AQHAFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2

[0653] SEQ ID NO:16 – Analog inkretina

[0655] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2

[0657] SEQ ID NO:17 – Analog inkretina

[0659] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2

[0661] SEQ ID NO:18 – Analog inkretina

[0663] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLE-Aib-GPSSGAPPPS-NH2

[0665] SEQ ID NO:19 – Analog inkretina

[0667] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLE-Aib-GPSS-Aib-APPPS-NH2

[0670] 4

[0671] SEQ ID NO:20 – Analog inkretina

[0672] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLA-Aib-GPSSGAPPPS-NH2

[0673] SEQ ID NO:21 – Analog inkretina

[0674] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2

[0675] SEQ ID NO:22 – Analog inkretina

[0676] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)2-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLE-Aib-GPSSGAPPPS-NH2

[0677] SEQ ID NO:23 – Analog inkretina

[0678] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2

[0679] SEQ ID NO:24 – Analog inkretina

[0682] 4

[0683] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)2-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLE-Aib-GPSSGAPPPS-NH2

[0685] SEQ ID NO:25 – Analog inkretina

[0687] Y-Aib-QGTFTSDYSILLDKK((2-[2-(2-amino-etoksi)-etoksi]-acetil)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLE-Aib-GPSSGAPPPS-NH2

[0689] SEQ ID NO:26 – Veštačka sekvenca

[0691] GPSSGAPPPS

[0692] SEQ ID NO:27 – Veštačka sekvenca

[0694] GPSS-Aib-APPPS

Claims (8)

1. PATENTNI ZAHTEVI

1. Analog inkretina koji ima formulu odabranu između SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, i SEQ ID NO:25, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

2. Analog inkretina prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što analog inkretina ima formulu odabranu između SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21 i SEQ ID NO:23, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

3. Analog inkretina prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačen time što analog inkretina ima formulu SEQ ID NO: 17, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

4. Analog inkretina koji ima formulu:

(SEQ ID NO: 17), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

5. Farmaceutska kompozicija koja sadrži analog inkretina prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent.

6. Analog inkretina prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 4 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 5 za upotrebu u tretiranju bolesti odabrane

između dijabetesa melitusa, dislipidemije, bolesti masne jetre, metaboličkog sindroma, nealkoholnog steatohepatitisa i gojaznosti.

7. Analog inkretina ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, naznačena time što je bolest dijabetes melitus tipa II.

8. Analog inkretina ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, naznačena time što je bolest gojaznost.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5