RS68145B1 - Proteini koji vezuju serumski albumin - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid, protein, konstrukt, jedinjenje ili drugu hemijsku celinu koja obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz SEQ ID NO: 3-11 i jedne ili više drugih aminokiselinskih sekvenci, domena, vezivnih jedinica ili drugih delova ili hemijskih celina, na pogodan način međusobno povezanih direktno ili indirektno preko jednog ili više pogodnih linkera ili spejsera.

[0005] Ostali aspekti, otelotvorenja, prednosti i primene pronalaska postaće jasni iz daljeg opisa u ovom dokumentu.

[0007] Ukoliko bilo koji termini nisu specifično definisani u ovom dokumentu, ti termini imaju značenje koje im je dato u WO 2009/068627 ili WO 06/122787. Ukoliko bilo koji termini koji se ovde koriste nisu specifično definisani u ovom dokumentu ili u WO 2009/068627/WO 06/122787, tada oni imaju svoje uobičajeno značenje u struci, za koje se, na primer, upućuje na standardne priručnike.

[0009] Aminokiselinske sekvence koje su sposobne da vezuju humani serumski albumin i njihove primene u polipeptidnim konstruktima u cilju povećanja poluvremena eliminacije terapijski relevantnih proteina i polipeptida poznate su u struci.

[0011] Na primer, WO 04/041865 od strane podnosioca prijave opisuje nanotela usmerena protiv serumskog albumina (a naročito protiv humanog serumskog albumina) koja mogu biti povezana sa drugim proteinima (kao što su jedno ili više drugih nanotela usmerenih protiv željenog cilja) u cilju povećanja poluvremena eliminacije navedenog proteina.

[0013] [0006] Međunarodna prijava WO 06/122787 opisuje određeni broj nanotela protiv (humanog) serumskog albumina. Ova nanotela uključuju nanotelo pod nazivom Alb-1 (SEQ ID NO: 52 u WO 06/122787) i njegove humanizovane varijante, kao što je Alb-8 (SEQ ID NO: 62 u WO 06/122787). [Nanobody<®>i Nanobodies<®>su robne marke kompanije Ablynx N. V.], Ponovo, oni se mogu koristiti za produženje poluvremena eliminacije terapijskih proteina i polipeptida i drugih terapijskih celina ili delova.

[0015] Na dan prvog podnošenja predmetne prijave, upotreba nanotela protiv (humanog) serumskog albumina za produženje poluvremena eliminacije terapijskih delova kao što su nanotela potvrđena je putem kliničkih ispitivanja. Na primer, bezbednost, podnošljivost, imunogenost i farmakokinetika (PK) ALX-0141, proteinskog konstrukta koji obuhvata dva nanotela protiv RANK-L i jedno nanotelo protiv humanog serumskog albumina, potvrđeni su u fazi I kliničkih ispitivanja (podaci koje je predstavio Ablynx N.V.27. maja 2011. godine na Godišnjem evropskom kongresu reumatologije (EULAR) u Londonu). Takođe, brojne objavljene patentne prijave kompanije Ablynx N.V. daju primere konstrukata sa povećanim poluvremenom eliminacije koji obuhvataju jedno ili više nanotela protiv terapijskog cilja i jedno ili više nanotela protiv serumskog albumina (kao što je Alb-8). Na primer, upućuje se na WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164, WO 2009/068627 i WO 2009/147248.

[0017] WO 2008/043821 otkriva aminokiselinske sekvence koje se vezuju za serumske proteine na način koji je suštinski nezavisan od pH vrednosti, jedinjenja koja ih obuhvataju i njihovu upotrebu. WO 2010/108937 otkriva fuzije i konjugate lekova. WO 2008/096158 otkriva ligand. WO 2009/007427 otkriva nova antitela koja inhibiraju dimerizaciju c-Met i njihove primene. WO 2007/ 126799 otkriva kompozicije i metode primene za antitela na c-Met. WO 2006/015371 otkriva humanizovane anti-cMet antagoniste. WO 2012/042026 otkriva biološke materijale povezane sa c-Met.

[0019] Predmetni pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.

[0021] Iako je utvrđeno da upotreba nanotela protiv (humanog) serumskog albumina (kao što su ona opisana u WO 04/041865 i WO 06/122787, a naročito humanizovane varijante Alb-1 opisane u WO 06/122787) pruža dobru i široko primenljivu metodologiju za produženje poluvremena eliminacije nanotela i drugih terapijskih delova i celina, to ne znači da stručnjak u ovoj oblasti ne bi imao koristi od toga da mu za tu svrhu na raspolaganju budu dodatno poboljšana nanotela protiv humanog serumskog albumina.

[0022] Predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji obuhvata ili se sastoji od takvog poboljšanog nanotela koje je usmereno protiv humanog serumskog albumina, a koje se ovde takođe naziva „sekvence slične Alb-23“ ili „varijante Alb-23“, videti SEQ ID NO: 3 do 11, kao i proteine, jedinjenja i druge (proteinske) konstrukte ili druge hemijske celine koje ih obuhvataju (kao što je dalje opisano u ovom dokumentu).

[0024] Prednosti koje poboljšano nanotelo iz SEQ ID NO: 1 i njegove varijante mogu pružiti u odnosu na nanotela opisana u WO 04/041865 i WO 06/122787 postaće jasne iz daljeg opisa u ovom dokumentu. Na primer i bez ograničenja, ove prednosti mogu uključivati

[0026] ● poboljšanu stabilnost (kao što je poboljšana termička stabilnost određena merenjem Tm); i/ili

[0028] ● i/ili poboljšanu stabilnost pri skladištenju, kao što je na primer mereno u SEC eksperimentu opisanom u primeru 5; i/ili

[0030] ● smanjenu tendenciju ka formiranju dimera pod određenim uslovima formulacije (na primer, pri visokim koncentracijama u određenim vodenim puferima za formulaciju -videti ponovo, na primer, primer 5).

[0032] Osim toga, utvrđeno je da su poboljšano nanotelo iz SEQ ID NO: 1 i njegove varijante naročito pogodni za produženje poluvremena eliminacije pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina koji sadrže više od jednog disulfidnog mosta, kao što su VHH i nanotela koja pripadaju „VHH-1 klasi“ (koja, kao što je dalje opisano u ovom dokumentu, mogu obuhvatati dva ili čak tri disulfidna mosta). Na primer i bez ograničenja, utvrđeno je da polipeptidi koji obuhvataju jedno ili više terapijskih VHH/nanotela iz VHH-1 klase i nanotelo Alb-23 (ili varijantu Alb-23) mogu imati bolje nivoe ekspresije u određenim domaćinima ili ćelijama domaćinima (i/ili druga povoljna svojstva kada je reč o ekspresiji, prečišćavanju i/ili proizvodnji/izradi uopšte) od odgovarajućih polipeptida koji sadrže nanotelo koje vezuje serumski albumin prema WO 06/122787, kao što je „Alb-8“ (SEQ ID NO: 62 u WO 06/122787), umesto aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 1. Ponovo, ovo će postati jasno iz daljeg opisa i eksperimentalnog dela u ovom dokumentu.

[0034] Ove i druge prednosti, kao i različiti aspekti, otelotvorenja, primene i upotrebe pronalaska, postaće jasni iz daljeg opisa u ovom dokumentu.

[0035] Poznato je da se pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina, kao što su nanotela, VHH, (pojedinačna) antitela domena, dAb, IgNAR domeni i mikro-tela (kao što je na primer opisano u WO 00/29004), mogu eksprimirati u određenom broju ćelija domaćina i organizama domaćina, kao što su bakterijske ćelije poput E. coli, sojevi kvasca poput Pichia i Saccharomyces, i različite sisarske ćelije ili ćelijske linije. Na primer, upućuje se na EP 0656 946 i EP 0698 097, kao i na različite objavljene patentne prijave kompanije Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164, WO 2009/068627 ili WO 2009/147248.

[0037] Slično tome, poznato je da kada se jedan ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina koji su usmereni protiv terapijskog cilja povežu sa nanotelom koje je usmereno protiv (humanog) serumskog albumina (kao što su ona opisana u WO 04/041865 i WO 06/122787) kako bi se obezbedio konstrukt koji ima povećano poluvreme eliminacije (tj. u poređenju sa samim terapijskim domenom/domenima), rezultujući polipeptidi i konstrukti se takođe mogu eksprimirati u određenom broju ćelija domaćina i organizama domaćina, kao što su bakterijske ćelije poput E. coli, sojevi kvasca poput Pichia i Saccharomyces, i različite sisarske ćelije ili ćelijske linije. Ponovo se upućuje na WO 04/041865, WO 06/122787, na WO 2010/056550 i na različite ovde pomenute objavljene patentne prijave kompanije Ablynx N.V.

[0039] Takođe je opšte poznato da sva VHH i nanotela sadrže najmanje jedan disulfidni most, između cisteinskog ostatka na poziciji 22 i cisteinskog ostatka na poziciji 92 (numerisanje prema Kabatu, videti patentne prijave kompanije Ablynx N.V.).

[0041] Iako većina VHH sadrži samo ovaj jedan disulfidni most, takođe je poznato da neka VHH sadrže ukupno dva (ili u izuzetnim slučajevima tri) disulfidna mosta. Na primer, klasa VHH i nanotela koja se naziva „tip VHH-1“ ili „VHH-1 klasa“ obično ima drugi disulfidni most između cisteinskog ostatka na poziciji 50 (prvi aminokiselinski ostatak CDR2) i cisteinskog ostatka prisutnog u CDR3 (takva VHH i nanotela takođe često imaju sekvencni motiv EREG na pozicijama 44 do 47). Takođe, neka VHH izvedena iz kamila ponekad imaju disulfidne mostove između cisteinskog ostatka prisutnog u CDR1 i cisteinskog ostatka prisutnog u CDR3.

[0042] Neki neograničavajući primeri takvih nanotela tipa VHH-1 (dati samo kao ilustracija; druge sekvence tipa VHH-1 protiv drugih ciljeva mogu se naći u nekim od ostalih patentnih prijava kompanije Ablynx N.V.) su sekvence P23ILPMP37D5 (SEQ ID NO: 2490) i P12ILPMP80F10 (SEQ ID NO: 1954) iz WO 2009/068627; sekvence PMP30A2 (SEQ ID NO: 419), PMP31 C5 (SEQ ID NO: 413) i PMP30G11 (SEQ ID NO: 416) iz WO 2008/020079; i sekvence RSVPMP5A2 (SEQ ID NO: 262), RSVPMP5B2 (SEQ ID NO: 263) i RSVPMP5C3 (SEQ ID NO: 264) iz WO 2009/147248.

[0044] Neobjavljene američke prijave 61/388,172 (podneta 30. septembra 2010. godine pod naslovom „Biological materials related to c-Met“) i US 61/451,869 (podneta 11. marta 2011. godine pod naslovom „Biological materials related to c-Met“), obe dodeljene kompaniji Ablynx N.V., opisuju VHH i nanotela koja su usmerena protiv terapijskog cilja c-Met; a neka od ovih VHH i nanotela (kao što su 4E09, SEQ ID NO: 26 u US 61/451,869 i SEQ ID NO: 12 u ovom dokumentu, i neke od varijanti 4E09 opisanih u US 61/451,869) takođe pripadaju VHH-1 klasi.

[0046] US 61/388,172 i US 61/451,869 takođe opisuju da se takva nanotela tipa VHH-1 mogu povezati sa nanotelom protiv humanog serumskog albumina u cilju povećanja njegovog poluvremena eliminacije (nanotelo protiv humanog serumskog albumina korišćeno u US 61/388,172 i US 61/451,869 naziva se „Alb-11“ i dato je u SEQ ID NO: 5 u US 61/451,869. Alb-11 ima istu aminokiselinsku sekvencu kao Alb-8, što je SEQ ID NO: 62 u WO 06/122787). Primer takvog polipeptida koji obuhvata Alb-11 i 4E09 dat je u SEQ ID NO: 9 prijave US 61/451,869.

[0048] [0022] Iako se VHH/nanotela tipa VHH-1 (ili opštije, VHH/nanotela koja sadrže dva ili tri disulfidna mosta), kao i polipeptidi i drugi proteinski konstrukti koji ih obuhvataju (uključujući takve polipeptide koji dalje obuhvataju najmanje jedno nanotelo protiv serumskog albumina u cilju obezbeđivanja povećanog poluvremena eliminacije), mogu eksprimirati u bilo kom pogodnom domaćinu ili organizmu domaćinu, utvrđeno je da nivoi ekspresije koji se dobijaju za takva VHH, nanotela, polipeptide ili konstrukte mogu biti značajno niži od nivoa ekspresije koji se dobijaju za slična/uporediva VHH, nanotela, polipeptide ili konstrukte koji sadrže VHH ili nanotela koja ne pripadaju VHH-1 klasi (ili opštije, koji sadrže VHH/nanotela sa samo jednim disulfidnim mostom). Na primer i bez ograničenja, dok se nivoi ekspresije od 0,8 g/l ili više (kao što je 1 g/l ili više) mogu rutinski postići u sistemu Pichia za polipeptide koji obuhvataju Alb-8 i jedno ili više terapijskih nanotela koja nisu tipa VHH-1 (videti ponovo neke od objavljenih patentnih prijava kompanije Ablynx N.V.), utvrđeno je da je teško postići nivoe ekspresije veće od 0,5 g/l za polipeptide koji obuhvataju anti-c-Met nanotelo tipa VHH-14E09 (SEQ ID NO: 26 u US 61/451,869 i SEQ ID NO: 12 u ovom dokumentu) ili njegovu humanizovanu varijantu i Alb-8 (videti Eksperimentalni deo u nastavku). Iznenađujuće, sada je utvrđeno da kada se nanotelo iz SEQ ID NO: 1 koristi u takvim polipeptidima (tj. umesto Alb-8), mogu se dobiti značajno viši nivoi ekspresije (videti Eksperimentalni deo u nastavku).

[0050] Kao što je pomenuto, u prvom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptide koji obuhvataju varijante aminokiselinske sekvence koja je usmerena protiv (humanog) serumskog albumina, koja se suštinski sastoji od ili jeste sledeća aminokiselinska sekvenca:

[0052]

[0055] Ova aminokiselinska sekvenca se u ovom dokumentu takođe naziva „Alb-23“.

[0057] Alb-23 je humanizovana verzija aminokiselinske sekvence „Alb-1“ (SEQ ID NO: 52 iz WO 06/122787, koja se u WO 06/122787 takođe naziva „PMP6A6“). Varijante Alb-23 prema pronalazku navedene su u SEQ ID NO: 3-11.

[0059] Radi praktičnosti, slika 1 prikazuje poravnanje Alb-23 sa Alb-1 i humanizovanim verzijama Alb-1 otkrivenim u tabeli III dokumenta WO 06/122787 (nazvanim „Alb-3“ do „Alb-10“ u WO 06/122787, videti takođe SEQ ID NO: 57 do 64 dokumenta WO 06/122787). Aminokiselinska sekvenca Alb-1 je:

[0061]

[0064] [0027] U gore navedenoj sekvenci, glavne razlike između Alb-1 i Alb-23 naznačene su masnim slovima i podvučeno. To su (uz numerisanje prema Kabatu, videti na primer tabele A-5 do A-8 dokumenta WO 2008/020079; i pri čemu svako slovo označava aminokiselinski ostatak u skladu sa standardnim jednoslovnim kodom za aminokiseline, za šta se upućuje na tabelu A-2 dokumenta WO 2008/020079): pozicija 5: V u L; pozicija 16: N u G; pozicije 44 i 45: EP u GP; pozicije 74 do 76: AKT u SKN; pozicija 83: K u R.

[0066] Stoga se, u daljem aspektu, predmetni pronalazak odnosi na aminokiselinsku sekvencu koja je varijanta sekvence Alb-1 (SEQ ID NO: 2), koja varijanta obuhvata:

[0067] (i) aminokiselinski motiv GP na pozicijama 44 i 45;

[0068] (ii) aminokiselinski motiv SKN na pozicijama 74 do 76;

[0069] (iii) CDR1 koji je aminokiselinska sekvenca SFGMS (SEQ ID NO: 29);

[0070] (iv) CDR2 koji je aminokiselinska sekvenca SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 30); (v) CDR3 koji je aminokiselinska sekvenca GGSLSR (SEQ ID NO: 31);

[0071] i koja poželjno takođe obuhvata

[0072] (vi) G na poziciji 16;

[0073] i u kojoj je poželjno (ali bez ograničenja):

[0074] (vii) pozicija 83 R (ali opciono može biti i K);

[0075] i koja dalje obuhvata (tj. pored gore pomenutih razlika u aminokiselinama na pozicijama 16, 44 i 45, 74 do 76 i 83, pri čemu su razlike u aminokiselinama na pozicijama 16 i 83 opcione ali poželjne) između 1 i 7, kao što je između 1 i 5 daljih „razlika u aminokiselinama“ (kao što je definisano u WO 2008/020079) u odnosu na sekvencu datu u SEQ ID NO: 2, što mogu biti, na primer, jedna ili više humanizujućih supstitucija (kao što je definisano u WO 2008/020079; videti na primer ponovo tabele A-5 do A-8) i/ili druge supstitucije (pri čemu su neograničavajući primeri takvih humanizujućih ili drugih supstitucija: pozicija 1: A u E, pozicija 14: P u A, ili pozicija 108: Q u L). Q u L).

[0077] Slično tome, predmetni pronalazak se odnosi na aminokiselinsku sekvencu koja je varijanta sekvence Alb-23 (SEQ ID NO: 1), koja varijanta obuhvata:

[0078] (i) aminokiselinski motiv GP na pozicijama 44 i 45;

[0079] (ii) aminokiselinski motiv SKN na pozicijama 74 do 76;

[0080] (iii) CDR1 koji je aminokiselinska sekvenca SFGMS (SEQ ID NO: 29);

[0081] (iv) CDR2 koji je aminokiselinska sekvenca SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 30); (v) CDR3 koji je aminokiselinska sekvenca GGSLSR (SEQ ID NO: 31);

[0082] i koja poželjno takođe obuhvata

[0083] (vi) G na poziciji 16;

[0084] i u kojoj je poželjno (ali bez ograničenja):

[0085] (vii) pozicija 83 R (ali opciono može biti i K);

[0086] i koja dalje obuhvata između 1 i 7, kao što je između 1 i 5 daljih „razlika u aminokiselinama“ (kao što je definisano u WO 2008/020079) u odnosu na sekvencu datu u SEQ ID NO: 1, što mogu biti, na primer, jedna ili više humanizujućih supstitucija (kao što je definisano u WO 2008/020079; videti na primer ponovo tabele A-5 do A-8) i/ili druge supstitucije (pri čemu su neograničavajući primeri takvih humanizujućih ili drugih supstitucija: pozicija 1: A u E, pozicija 14: P u A, ili pozicija 108: Q u L).

[0088] Kao što će stručnjaku biti jasno, varijante opisane u prethodnim stavovima dele sa Alb-23 neke od istih supstitucija aminokiselina (tj. u poređenju sa Alb-1) koje su karakteristične za Alb-23 (takođe u poređenju sa humanizovanim varijantama Alb-1 opisanim u WO 06/122787), te se stoga očekuje da obezbede barem neke ili čak sve prednosti koje su ovde opisane za Alb-23. Iz tih razloga, ove varijante se u ovom dokumentu takođe nazivaju „sekvence slične Alb-23“ ili „varijante Alb-23“.

[0090] U jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, varijanta Alb-23 je takva da, kada se koristi u testu stabilnosti pri skladištenju opisanom u primeru 5 (tj. kao deo konstrukta koji dalje obuhvata IGE045 i 9GS linker), predpik na SE-HPLC za konstrukt koji obuhvata varijantu Alb-23 nakon mesec dana skladištenja na 25°C (pod daljim uslovima navedenim u primeru 5) iznosi manje od 10%, poželjno manje od 5%; i/ili da predpik na SE-HPLC za konstrukt koji obuhvata varijantu Alb-23 nakon mesec dana skladištenja na 40°C (pod daljim uslovima navedenim u primeru 5) iznosi manje od 20%, poželjno manje od 15%. Na primer, upućuje se na uporedne rezultate u tabeli 8.

[0092] Neki neograničavajući primeri sekvenci sličnih Alb-23 dati su u SEQ ID NO: 3 do 11. Varijante iz SEQ ID NO: 6 do 11 (ili druge varijante Alb-23 sa 1 do 3 aminokiselinska ostatka na C-terminusu, koji mogu biti nezavisno izabrani iz prirodnih aminokiselinskih ostataka i mogu, na primer, biti nezavisno izabrani iz A, G, V, L i I) mogu se naročito koristiti kada se nanotelo koje vezuje albumin nalazi na C-terminalnom kraju polipeptida ili proteinskog konstrukta. Poravnanje Alb-23 sa sekvencama iz SEQ ID NO: 6 do 11 dato je na slici 2.

[0093] Alb-23A:

[0095]

[0096] Alb-23B:

[0098]

[0101] Stoga, u jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, pronalazak obezbeđuje proteine ili polipeptide koji se suštinski sastoje od jedne od varijanti Alb-23 definisanih u patentnim zahtevima.

[0102] Kao što je dalje opisano u ovom dokumentu, aminokiselinska sekvenca Alb-23 i dalje ovde opisane varijante Alb-23 mogu se sa prednošću koristiti kao deo, vezivna jedinica ili fuzioni partner u cilju povećanja poluvremena eliminacije terapijskih delova kao što su polipeptidi, proteini, jedinjenja (uključujući, bez ograničenja, male molekule) ili druge terapijske celine.

[0104] Stoga, u drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje polipeptide, proteine, konstrukte, jedinjenja ili druge hemijske celine koje obuhvataju ili se suštinski sastoje od aminokiselinske sekvence jedne od varijanti Alb-23 definisanih u patentnim zahtevima i jedne ili više drugih aminokiselinskih sekvenci, (vezivnih) domena, vezivnih jedinica ili drugih delova ili hemijskih celina.

[0106] Naročito, pronalazak obezbeđuje polipeptide, proteine, konstrukte, jedinjenja ili druge hemijske celine koje obuhvataju aminokiselinsku sekvencu jedne od varijanti Alb-23 definisanih u patentnim zahtevima i jedan ili više (kao što su jedan ili dva) terapijska dela (koji mogu biti isti ili različiti, i mogu, na primer, biti usmereni protiv istog cilja ili različitih ciljeva, a kada su usmereni na isti cilj, mogu biti usmereni na iste ili različite epitope, delove, domene ili subjedinice navedenog cilja), na pogodan način međusobno povezanih direktno ili preko jednog ili više pogodnih linkera ili spejsera. Takvi polipeptidi, proteini ili konstrukti mogu, na primer i bez ograničenja, biti fuzioni protein, kao što je dalje opisano u ovom dokumentu.

[0108] Pronalazak se dalje odnosi na terapijske upotrebe takvih polipeptida, proteina, konstrukata ili jedinjenja i na farmaceutske kompozicije koje obuhvataju takve polipeptide, proteine, konstrukte ili jedinjenja. Svako upućivanje na metodu lečenja koja se sprovodi na čoveku ili životinji treba tumačiti kao upućivanje na supstance i kompozicije za upotrebu u takvim metodama.

[0110] [0038] U jednom aspektu, barem jedan terapijski deo obuhvata ili se suštinski sastoji od terapijskog proteina, polipeptida, jedinjenja, faktora ili druge celine. U poželjnom otelotvorenju, terapijski deo je usmeren protiv željenog antigena ili cilja, sposoban je da se veže za željeni antigen (i naročito sposoban da se specifično veže za željeni antigen) i/ili je sposoban da stupa u interakciju sa željenim ciljem. U drugom otelotvorenju, barem jedan terapijski deo obuhvata ili se suštinski sastoji od terapijskog proteina ili polipeptida. U daljem otelotvorenju, barem jedan terapijski deo obuhvata ili se suštinski sastoji od vezivnog domena ili vezivne jedinice, kao što je imunoglobulin ili imunoglobulinska sekvenca (uključujući, ali ne ograničavajući se na fragment imunoglobulina), kao što je antitelo ili fragment antitela (uključujući, ali ne ograničavajući se na ScFv fragment), ili od drugog pogodnog proteinskog skafolda, kao što su domeni proteina A (kao što su Affibodies<™>), tendamistat, fibronektin, lipokalin, CTLA-4, T-ćelijski receptori, dizajnirani ankirinski ponavljajući domeni, avimeri i PDZ domeni (Binz et al., Nat. Biotech 2005, Vol 23:1257), i vezivni delovi zasnovani na DNK ili RNK uključujući, ali ne ograničavajući se na DNK ili RNK aptamere (Ulrich et al., Comb Chem High Throughput Screen 20069(8):619-32).

[0112] U još jednom aspektu, barem jedan terapijski deo obuhvata ili se suštinski sastoji od varijabilnog domena antitela, kao što je varijabilni domen teškog lanca ili varijabilni domen lakog lanca.

[0114] U poželjnom aspektu, barem jedan terapijski deo obuhvata ili se suštinski sastoji od barem jednog pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina, kao što je antitelo domena, pojedinačno antitelo domena, „dAb“ ili nanotelo (kao što je VHH, humanizovano VHH ili kamelizovano VH) ili IgNAR domen.

[0116] U specifičnom otelotvorenju, barem jedan terapijski deo obuhvata ili se suštinski sastoji od barem jednog monovalentnog nanotela ili bivalentnog, multivalentnog, bispecifičnog ili multispecifičnog konstrukta nanotela.

[0118] Polipeptidi, (fuzioni) proteini, konstrukti ili jedinjenja koji obuhvataju varijantu Alb-23 i jedan ili više terapijskih delova mogu se generalno pripremiti i koristiti kao što je opisano u gore citiranom stanju tehnike (kao što su WO 04/041865 i WO 06/122787), ali sa varijantom Alb-23 umesto delova za povećanje poluvremena eliminacije opisanih u navedenom stanju tehnike.

[0120] Polipeptidi, (fuzioni) proteini, konstrukti ili jedinjenja koji obuhvataju varijantu Alb-23 i jedan ili više terapijskih delova će generalno i poželjno imati povećano poluvreme eliminacije u poređenju sa samim terapijskim delom ili delovima.

[0121] Generalno, konstrukti ili fuzioni proteini opisani u ovom dokumentu poželjno imaju poluvreme eliminacije koje je najmanje 1,5 puta, poželjno najmanje 2 puta, kao što je najmanje 5 puta, na primer najmanje 10 puta ili više od 20 puta veće od poluvremena eliminacije odgovarajućeg terapijskog dela po sebi (mereno bilo kod ljudi ili kod pogodnih životinja, kao što su miš ili makaki majmun).

[0123] Takođe, poželjno je da bilo koji takav fuzioni protein ili konstrukt ima poluvreme eliminacije kod ljudi koje je povećano za više od 1 sata, poželjno više od 2 sata, još poželjnije za više od 6 sati, kao što je za više od 12 sati, u poređenju sa poluvremenom eliminacije odgovarajućeg terapijskog dela po sebi.

[0125] Takođe, poželjno je da bilo koji fuzioni protein ili konstrukt ima poluvreme eliminacije kod ljudi koje je duže od 1 sata, poželjno duže od 2 sata, još poželjnije duže od 6 sati, kao što je duže od 12 sati, i na primer od oko jednog dana, dva dana, jedne nedelje, dve nedelje ili tri nedelje, a poželjno ne duže od 2 meseca, iako je ovo poslednje možda manje kritično.

[0127] Poluvreme eliminacije se generalno može definisati kao vreme potrebno da se koncentracija polipeptida u serumu smanji za 50%, in vivo, na primer usled degradacije liganda i/ili klirensa ili sekvestracije liganda prirodnim mehanizmima. Naročito, poluvreme eliminacije može biti definisano kao u WO 2009/068627.

[0129] Metode za farmakokinetičku analizu i određivanje poluvremena eliminacije poznate su stručnjacima u ovoj oblasti. Detalji se mogu naći u Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists i u Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). Takođe se upućuje na „Pharmacokinetics“, M Gibaldi & D Perron, izdavač Marcel Dekker, 2. revidirano izdanje (1982).

[0131] Kao što je pomenuto, u jednom aspektu, aminokiselinska sekvenca jedne od varijanti Alb-23 definisanih u patentnim zahtevima može se koristiti za povećanje poluvremena eliminacije (jednog ili više) pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina, kao što su antitela domena, pojedinačna antitela domena, „dAb“, VHH ili nanotela (kao što su VHH, humanizovana VHH ili kamelizovana VH, kao što su kamelizovana humana VH).

[0132] Naročito, kao što je ovde pomenuto, aminokiselinska sekvenca jedne od varijanti Alb-23 definisanih u patentnim zahtevima može se sa prednošću koristiti za povećanje poluvremena eliminacije pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina koji obuhvataju dva ili više (kao što su dva ili tri) disulfidna mosta, kao što su VHH/nanotela iz VHH-1 klase.

[0134] Stoga se jedno otelotvorenje pronalaska odnosi na polipeptid, konstrukt ili fuzioni protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu jedne od varijanti Alb-23 definisanih u patentnim zahtevima i jedan ili više (kao što su jedan ili dva) sekvenci pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina, koji su na pogodan način međusobno povezani, bilo direktno ili opciono preko jednog ili više pogodnih linkera ili spejsera. Kao što je ovde pomenuto, svaki takav pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prisutan u takvom polipeptidu, konstruktu ili fuzionom proteinu može nezavisno biti antitelo domena, pojedinačno antitelo domena, „dAb“ ili nanotelo (kao što je VHH, humanizovano VHH ili kamelizovano VH, kao što je kamelizovano humano VH); i prema jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, barem jedan (a do svih) od ovih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina obuhvata dva ili tri disulfidna mosta.

[0136] Poželjno, svaki takav pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina je nanotelo; i prema jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, barem jedno (a do svih) od ovih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina je nanotelo VHH-1 klase.

[0138] Na primer i bez ograničenja, takav konstrukt, fuzioni protein ili polipeptid može obuhvatati:

[0139] ● jednu kopiju jedne od varijanti Alb-23 definisanih u patentnim zahtevima i jednu sekvencu takvog pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina;

[0140] ● jednu kopiju jedne od varijanti Alb-23 definisanih u patentnim zahtevima i dve sekvence takvog pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina (koje mogu biti iste ili različite); ili čak (iako obično nije potrebno i manje je poželjno jer je rezultujući protein veći)

[0141] ● dve kopije varijanti Alb-23 definisanih u patentnim zahtevima (koje mogu biti iste ili različite) i jednu sekvencu takvog pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina; ● dve kopije varijanti Alb-23 definisanih u patentnim zahtevima (koje mogu biti iste ili različite) i dve sekvence takvog pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina (koje mogu biti iste ili različite);

[0143] Neki neograničavajući primeri konstrukata, fuzionih proteina ili polipeptida prema pronalazku mogu se šematski predstaviti na sledeći način, pri čemu „[Alb-23]“ predstavlja jednu od varijanti Alb-23 definisanih u patentnim zahtevima, „[terapijski deo 1]“ i „[terapijski deo 2]“ predstavljaju terapijske delove (koji, kao što je pomenuto, mogu nezavisno biti pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina), „ - “ predstavlja pogodan linker (koji je opcioni), a N-terminus se nalazi na levoj strani, dok je C-terminus na desnoj strani:

[0144] [Alb-23] - [terapijski deo 1]

[0145] [terapijski deo 1] - [Alb-23]

[0146] [Alb-23] - [terapijski deo 1] - [terapijski deo 1]

[0147] [terapijski deo 1] - [terapijski deo 1] - [Alb-23]

[0148] [terapijski deo 1] - [Alb-23] - [terapijski deo 1]

[0149] [Alb-23] - [terapijski deo 1] - [terapijski deo 2]

[0150] [terapijski deo 1] - [terapijski deo 2] - [Alb-23]

[0151] [terapijski deo 1] - [Alb-23] - [terapijski deo 2]

[0153] Kada su u konstruktima ili polipeptidima prema pronalazku prisutna dva ili više različitih terapijskih delova (kao što su dva ili više različitih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina), oni mogu biti isti ili različiti, a kada su različiti, mogu biti usmereni ka istom cilju (na primer, ka istim ili različitim delovima, domenima, subjedinicama ili epitopima navedenog cilja) ili ka različitim ciljevima.

[0155] [0056] Stoga se, u drugom aspektu, pronalazak odnosi na multispecifični (a naročito bispecifični) konstrukt nanotela koji obuhvata jednu od varijanti Alb-23 definisanih u patentnim zahtevima i barem jedno drugo nanotelo (kao što su jedno ili dva druga nanotela, koja mogu biti ista ili različita), pri čemu je navedeno barem jedno drugo nanotelo poželjno usmereno protiv željenog cilja (koji je poželjno terapijski cilj) i/ili drugo nanotelo koje je korisno ili pogodno za terapijske, profilaktičke i/ili dijagnostičke svrhe. Ponovo, varijanta(e) Alb-23 i druga nanotela su na pogodan način međusobno povezani bilo direktno, ili opciono preko jednog ili više pogodnih linkera ili spejsera, a prema jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, barem jedno (a do svih) od drugih nanotela može biti iz VHH-1 klase.

[0157] Za opšti opis multivalentnih i multispecifičnih polipeptida koji sadrže jedno ili više nanotela i njihovu pripremu, takođe se upućuje na Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol.276, 10.

[0158] 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302; kao i na primer na WO 96/34103, WO 99/23221, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0160] Neki drugi primeri određenih multispecifičnih i/ili multivalentnih polipeptida prema pronalazku mogu se naći u ovde pomenutim prijavama kompanije Ablynx N.V. Naročito, za opšti opis multivalentnih i multispecifičnih konstrukata koji obuhvataju barem jedno nanotelo protiv serumskog proteina radi povećanja poluvremena eliminacije, nukleinskih kiselina koje ih kodiraju, kompozicija koje ih obuhvataju, pripreme prethodno navedenog i upotrebe prethodno navedenog, upućuje se na gore pomenute međunarodne prijave WO 04/041865 i WO 06/122787 (varijante Alb-23 definisane u patentnim zahtevima mogu se generalno koristiti analogno nanotelima za produženje poluvremena eliminacije koja su tamo opisana, kao što je Alb-8), kao i na opšti opis i specifične primere takvih konstrukata datih u WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0162] U jednom neograničavajućem otelotvorenju, jedno ili više drugih nanotela prisutnih u takvom polipeptidu ili proteinskom konstruktu mogu biti usmerena protiv c-Met, a naročito mogu biti nanotela tipa I usmerena protiv c-Met. Neki neograničavajući primeri nanotela protiv c-Met koji mogu biti prisutni u takvom polipeptidu ili proteinskom konstruktu mogu se, na primer, naći u ovde pomenutim neobjavljenim američkim prijavama US 61/388,172 i US 61/451,869.

[0164] [0060] Jedno naročito poželjno nanotelo tipa I protiv c-Met koje može biti prisutno u takvom multivalentnom i/ili multispecifičnom polipeptidu (pored varijante Alb-23) je 4E09 (SEQ ID NO: 26 u US 61/451,869 i SEQ ID NO: 12 u ovom dokumentu) ili njegova varijanta. Takva varijanta 4E09 može generalno biti kao što je opisano u US 61/451,869 (i generalno će imati najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, na primer najmanje 90% ili više, kao što je 95% ili više identičnosti sekvence sa 4E09) i poželjno je takva da: (i) se takmiči sa 4E09 za vezivanje za c-Met (u pogodnom testu vezivanja, kao što je AlphaScreen test opisan u primeru 7, ali koristeći 4E09 umesto HGF koji je korišćen u primeru 7); i/ili (ii) se vezuje za isti epitop na c-Met kao i 4E09; i/ili (iii) unakrsno blokira (kao što je definisano u WO 2009/068627) vezivanje 4E09 za c-Met. Takva varijanta 4E09 može, na primer, biti humanizovana i/ili sekvencno optimizovana varijanta 4E09 (kao što je dalje opisano u US 61/451,869). Neki poželjni, ali neograničavajući primeri varijanti 4E09 koje bi mogle biti prisutne u takvim proteinima ili polipeptidima su sledeći, koji su takođe opisani u US 61/451,869: 04E09 (L49S); 04E09 (C50S/C100bG); 04E09 (C22A/C92S); A00790067 = 4E09 (Q108L); A00790068 = 4E09 (A74S, K83R, Q108L); A00790069 = 4E09 (A74S, K83R, G88A, Q108L) i A00790105 = 4E09 (E1D, A74S, K83R, G88A, Q108L), od kojih je potonja naročito poželjna. Aminokiselinske sekvence 4E09 i ovih varijanti date su u SEQ ID NO: 12 do 19.

[0166] Stoga se, u jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, pronalazak odnosi na polipeptid ili proteinski konstrukt koji obuhvata ili se suštinski sastoji od varijante Alb-23 (kao što je definisano u patentnim zahtevima), koja je na pogodan način povezana (direktno ili preko jednog ili više pogodnih linkera) sa jednim ili dva nanotela protiv c-Met. Kao što je pomenuto, prema specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, navedeno jedno ili dva nanotela protiv c-Met obuhvataju dva disulfidna mosta (tj. pripadaju „Klasi I“).

[0168] Naročito, pronalazak se odnosi na polipeptid ili proteinski konstrukt koji obuhvata ili se suštinski sastoji od varijante Alb-23 (kao što je definisano u patentnim zahtevima), koja je na pogodan način povezana (direktno ili preko jednog ili više pogodnih linkera) sa jednim ili dva (i poželjno samo jednim) nanotela protiv c-Met, koja su 4E09 (SEQ ID NO: 12) ili varijanta 4E09 (kao što je ovde opisano i u US 61/451,869), a poželjno humanizovana ili sekvencno optimizovana varijanta 4E09, i još poželjnije A00790105 (SEQ ID NO: 19).

[0170] [0063] Pronalazak se takođe odnosi na nukleotidne sekvence ili nukleinske kiseline koje kodiraju ovde opisane aminokiselinske sekvence, fuzione proteine i konstrukte. Pronalazak dalje uključuje genetičke konstrukte koji uključuju prethodno navedene nukleotidne sekvence ili nukleinske kiseline i jedan ili više elemenata za genetičke konstrukte koji su poznati po sebi. Genetički konstrukt može biti u obliku plazmida ili vektora. Ponovo, takvi konstrukti mogu generalno biti kao što je opisano u objavljenim patentnim prijavama kompanije Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0172] Pronalazak se takođe odnosi na domaćine ili ćelije domaćine koji sadrže takve nukleotidne sekvence ili nukleinske kiseline, i/ili koji eksprimiraju (ili su sposobni da eksprimiraju) ovde opisane aminokiselinske sekvence, fuzione proteine i konstrukte. Ponovo, takve ćelije domaćini mogu generalno biti kao što je opisano u objavljenim patentnim prijavama kompanije Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0174] Pronalazak se takođe odnosi na metodu za pripremu aminokiselinske sekvence, fuzionog proteina ili konstrukta kao što je ovde opisano, koja metoda obuhvata kultivisanje ili održavanje ćelije domaćina kao što je ovde opisano pod uslovima takvim da navedena ćelija domaćin proizvodi ili eksprimira aminokiselinsku sekvencu, fuzioni protein ili konstrukt kao što je ovde opisano, i opciono dalje obuhvata izolovanje tako proizvedene aminokiselinske sekvence, fuzionog proteina ili konstrukta. Ponovo, takve metode se mogu sprovoditi kao što je generalno opisano u objavljenim patentnim prijavama kompanije Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0176] Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata barem jednu aminokiselinsku sekvencu, fuzioni protein ili konstrukt kao što je ovde opisano, i opciono barem jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens. Takvi preparati, nosači, ekscipijensi i razblaživači mogu generalno biti kao što je opisano u objavljenim patentnim prijavama kompanije Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0178] [0067] Međutim, pošto ovde opisane aminokiselinske sekvence, fuzioni proteini ili konstrukti imaju povećano poluvreme eliminacije, oni se poželjno primenjuju u cirkulaciju. Kao takvi, oni se mogu primeniti na bilo koji pogodan način koji omogućava aminokiselinskim sekvencama, fuzionim proteinima ili konstruktima da uđu u cirkulaciju, kao što je intravenski, putem injekcije ili infuzije, ili na bilo koji drugi pogodan način (uključujući oralnu primenu, potkožnu primenu, intramuskularnu primenu, primenu preko kože, intranazalnu primenu, primenu preko pluća, itd.) koji omogućava aminokiselinskim sekvencama, fuzionim proteinima ili konstruktima da uđu u cirkulaciju. Pogodne metode i putevi primene biće jasni stručnjaku, ponovo na primer i iz učenja objavljenih patentnih prijava kompanije Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0180] Stoga se, u drugom aspektu, pronalazak odnosi na prevenciju i/ili lečenje barem jedne bolesti ili poremećaja koji se mogu sprečiti ili lečiti upotrebom fuzionog proteina ili konstrukta kao što je ovde opisano, što obuhvata primenu farmaceutski aktivne količine fuzionog proteina ili konstrukta prema pronalazku i/ili farmaceutske kompozicije koja ga obuhvata subjektu kojem je to potrebno. Bolesti i poremećaji koji se mogu sprečiti ili lečiti upotrebom fuzionog proteina ili konstrukta kao što je ovde opisano generalno će biti isti kao i bolesti i poremećaji koji se mogu sprečiti ili lečiti upotrebom terapijskog dela koji je prisutan u fuzionom proteinu ili konstruktu prema pronalazku.

[0182] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin „prevencija i/ili lečenje“ ne obuhvata samo sprečavanje i/ili lečenje bolesti, već takođe generalno obuhvata sprečavanje pojave bolesti, usporavanje ili preokretanje napredovanja bolesti, sprečavanje ili usporavanje pojave jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, smanjenje i/ili ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, smanjenje težine i/ili trajanja bolesti i/ili bilo kojih simptoma povezanih sa njom i/ili sprečavanje daljeg povećanja težine bolesti i/ili bilo kojih simptoma povezanih sa njom, sprečavanje, smanjenje ili preokretanje bilo kog fiziološkog oštećenja uzrokovanog bolešću, i generalno bilo koju farmakološku radnju koja je korisna za pacijenta koji se leči.

[0184] Subjekt koji se leči može biti bilo koja toplokrvna životinja, ali je naročito sisar, a još specifičnije čovek. Kao što će stručnjaku biti jasno, subjekt koji se leči biće naročito osoba koja pati od bolesti i poremećaja navedenih u ovom dokumentu, ili je pod rizikom od njih.

[0186] U drugom otelotvorenju, pronalazak se odnosi na imunoterapiju, a naročito na pasivnu imunoterapiju, koja obuhvata primenu farmaceutski aktivne količine fuzionog proteina ili konstrukta prema pronalazku, i/ili farmaceutske kompozicije koja ga obuhvata, subjektu koji pati od bolesti i poremećaja navedenih u ovom dokumentu ili je pod rizikom od njih.

[0187] Fuzioni protein ili konstrukt i/ili kompozicije koje ih obuhvataju primenjuju se prema režimu lečenja koji je pogodan za sprečavanje i/ili lečenje bolesti ili poremećaja koji se sprečava ili leči. Kliničar će generalno moći da odredi pogodan režim lečenja, u zavisnosti od faktora kao što su bolest ili poremećaj koji se sprečava ili leči, težina bolesti koja se leči i/ili težina njenih simptoma, specifični polipeptid prema pronalazku koji se koristi, specifični put primene i farmaceutska formulacija ili kompozicija koja se koristi, starost, pol, težina, dijeta, opšte stanje pacijenta i slični faktori koji su dobro poznati kliničaru.

[0189] Generalno, režim lečenja će obuhvatati primenu jednog ili više fuzionih proteina ili konstrukata prema pronalazku, ili jedne ili više kompozicija koje ih obuhvataju, u jednoj ili više farmaceutski efikasnih količina ili doza. Specifičnu količinu (količine) ili doze koje treba primeniti može odrediti kliničar, ponovo na osnovu gore navedenih faktora.

[0191] Generalno, za prevenciju i/ili lečenje ovde pomenutih bolesti i poremećaja i u zavisnosti od specifične bolesti ili poremećaja koji se leči, jačine i/ili poluvremena eliminacije specifičnih fuzionih proteina ili konstrukata koji se koriste, specifičnog puta primene i specifične farmaceutske formulacije ili kompozicije koja se koristi, nanotela i polipeptidi prema pronalazku će se generalno primenjivati u količini između 1 grama i 0,01 mikrograma po kg telesne težine dnevno, poželjno između 0,1 grama i 0,1 mikrograma po kg telesne težine dnevno, kao što je oko 1, 10, 100 ili 1000 mikrograma po kg telesne težine dnevno, bilo kontinuirano (npr. infuzijom), kao pojedinačna dnevna doza ili kao više podeljenih doza tokom dana. Kliničar će generalno moći da odredi pogodnu dnevnu dozu, u zavisnosti od ovde pomenutih faktora. Takođe će biti jasno da u specifičnim slučajevima kliničar može izabrati da odstupi od ovih količina, na primer na osnovu gore navedenih faktora i svoje stručne procene. Generalno, određene smernice o količinama koje treba primeniti mogu se dobiti iz količina koje se obično primenjuju za uporediva konvencionalna antitela ili fragmente antitela protiv istog cilja primenjena suštinski istim putem, uzimajući u obzir, međutim, razlike u afinitetu/avidnosti, efikasnosti, biodistribuciji, poluvremenu eliminacije i sličnim faktorima koji su dobro poznati stručnjaku.

[0193] Obično će se u gore navedenoj medicinskoj upotrebi koristiti jedan polipeptid prema pronalazku. Međutim, u okviru opsega pronalaska je upotreba dva ili više polipeptida prema pronalazku u kombinaciji.

[0194] Polipeptidi prema pronalazku se takođe mogu koristiti u kombinaciji sa jednim ili više daljih farmaceutski aktivnih jedinjenja ili principa, tj. kao kombinovani režim lečenja, koji može ili ne mora dovesti do sinergističkog efekta. Ponovo, kliničar će moći da izabere takva dalja jedinjenja ili principe, kao i pogodan kombinovani režim lečenja, na osnovu gore navedenih faktora i svoje stručne procene.

[0196] Naročito, polipeptidi prema pronalazku se mogu koristiti u kombinaciji sa drugim farmaceutski aktivnim jedinjenjima ili principima koji se koriste ili se mogu koristiti za prevenciju i/ili lečenje bolesti i poremećaja koji se mogu sprečiti ili lečiti fuzionim proteinima ili konstruktima prema pronalazku, a kao rezultat toga može ili ne mora biti postignut sinergistički efekat.

[0198] Efikasnost režima lečenja koji se koristi prema pronalazku može se odrediti i/ili pratiti na bilo koji način poznat po sebi za datu bolest ili poremećaj, što će kliničaru biti jasno. Kliničar će takođe moći, gde je to prikladno i na bazi pojedinačnih slučajeva, da izmeni ili modifikuje određeni režim lečenja, kako bi postigao željeni terapijski efekat, izbegao, ograničio ili smanjio neželjene sporedne efekte, i/ili postigao odgovarajuću ravnotežu između postizanja željenog terapijskog efekta s jedne strane i izbegavanja, ograničavanja ili smanjenja neželjenih sporednih efekata s druge strane.

[0200] Generalno, režim lečenja će se pratiti dok se ne postigne željeni terapijski efekat i/ili onoliko dugo koliko željeni terapijski efekat treba održavati. Ponovo, ovo može odrediti kliničar.

[0202] Subjekt koji se leči može biti bilo koja toplokrvna životinja, naročito sisar, a još specifičnije čovek. Kao što će stručnjaku biti jasno, subjekt koji se leči biće naročito osoba koja pati od bolesti i poremećaja navedenih u ovom dokumentu, ili je pod rizikom od njih.

[0204] Ostali aspekti, otelotvorenja, prednosti i primene pronalaska postaće jasni iz daljeg opisa u ovom dokumentu.

[0205] Pronalazak će sada biti dalje ilustrovan putem neograničavajućeg eksperimentalnog dela i slika, na kojima:

[0206] ● Slika 1 predstavlja poravnanje Alb-23 (SEQ ID NO: 1) sa Alb-1 i različitim humanizovanim varijantama istog opisanim u WO 06/122787;

[0207] ● Slika 2 predstavlja poravnanje Alb-23 (SEQ ID NO: 1) sa nekim od varijanti Alb-23 koje su ovde opisane;

[0208] ● Slika 3 prikazuje različite sekvence na koje se upućuje u ovoj specifikaciji;

[0209] ● Slika 4 prikazuje profil ekspresije koristeći SDS-PAGE analizu A007900009 proizvedenog pomoću klonova Pichia sa niskim (L=1) i visokim (H= više od 1) brojem kopija (CN) ekspresione kasete;

[0210] ● Slika 5 prikazuje profil ekspresije koristeći SDS-PAGE analizu A007900171 proizvedenog pomoću klonova Pichia sa niskim (L=1) i visokim (H= više od 1) brojem kopija (CN) ekspresione kasete;

[0211] ● Slika 6 prikazuje profil ekspresije koristeći SDS-PAGE analizu A007900057 i A007900058 proizvedenih pomoću klonova Pichia sa niskim (L=1) i visokim (H= više od 1) brojem kopija (CN) ekspresione kasete;

[0212] ● Slika 7 prikazuje profil ekspresije koristeći SDS-PAGE analizu varijante A007901219 proizvedene pomoću klonova Pichia sa niskim (L=1) i visokim (H= više od 1) brojem kopija (CN) ekspresione kasete;

[0213] ● Slika 8 prikazuje SDS-PAGE analizu (neredukujući uslovi) uzoraka sa kraja indukcije fermentacije ekspresija u Pichia pastoris za A00700171 i A00701219. Na gel je naneto 5 µL podloge bez ćelija (trake 1-4). Trake 5 do 7 sadrže kontrolno nanotelo naneto u različitim količinama. Leva traka sadrži marker molekulske težine.

[0215] Eksperimentalni deo:

[0217] Primer 1: Profil ekspresije 4E09 u kombinaciji sa Alb11 ili Alb23

[0219] Tabela 1 daje pregled formata zasnovanih na anti-c-Met 4E09 VHH1 gradivnom bloku nanotela (SEQ ID NO: 12) u kombinaciji sa Alb11 i Alb23. Različita nanotela su klonirana u pPiczalpha ekspresioni vektor i transformisana u soj Pichia pastoris X-33 (komercijalno dostupan ekspresioni sistem kompanije Invitrogen/RCT). Klonovi su odabrani na pločama koje sadrže zeocin, a izvršen je qPCR kako bi se klonovi rangirali prema broju njihovih kopija.

[0220] Nivoi ekspresije su upoređivani između klonova sa niskim i visokim brojem kopija u eksperimentima u erlenmajerima na tresilici. Primećena je inverzna korelacija između nivoa ekspresije i broja kopija kod formata koji sadrže Alb11 (slike 4 i 5). Nasuprot tome, uočena je pozitivna korelacija između nivoa ekspresije i broja kopija kod formata koji sadrže nanotelo Alb23 (slike 6 i 7).

[0222] Tabela 1: Pregled 5 formata 4E09 VHH1 gradivnog bloka nanotela ili sekvencno optimizovane verzije fuzionisane preko 9GS ili 35GS linkera sa Alb11 ili Alb23 gradivnim blokom nanotela.

[0224]

[0227] Primer 2: Prinos fermentacije 4E09 u kombinaciji sa Alb11 ili Alb23

[0229] Ekspresija Nanobody<®>A007900171 (4E09 sekvencno optimizovano-9GS-Alb11) i A007901219 (4E09 sekvencno optimizovano-9GS-Alb23) procenjena je korišćenjem Pichia pastoris X33 kao organizma domaćina. Ispitivani su i AOX promotor (promotor indukovan metanolom) i GAP promotor (konstitutivni indukovani promotor).

[0231] Za procese fermentacije korišćena je kompleksna podloga na bazi peptona. Kod fermentacija sa klonom X33 koji koristi AOX promotor, za ekspresiju nanotela korišćen je MeOH. Ukratko, ovaj proces se može podeliti u 3 faze: šaržna faza, prihranjivana šaržna faza glicerolom i faza indukcije metanolom. Tokom šaržne faze i prihranjivane šaržne faze glicerolom, biomasa je podignuta na oko 40% (vlažna težina po zapremini). Zatim je započeta faza adaptacije na MeOH i faza indukcije tokom koje je Nanobody<®>eksprimirano i sekretovano u podlogu.

[0232] Kod fermentacija sa klonom X33 koji koristi GAP promotor, za indukciju ekspresije Nanobody<®>korišćena je glukoza. Ovaj proces se takođe može podeliti u 3 faze: šaržna faza na glicerolu, prihranjivana šaržna faza glukozom uz visoku brzinu prihrane radi podizanja biomase na oko 40% (vlažna težina po zapremini) i druga prihranjivana šaržna faza glukozom pri nižoj brzini prihrane radi dalje indukcije ekspresije/sekrecije Nanobody<®>.

[0234] Sve fermentacije su sprovedene u fermentoru od 2L korišćenjem opreme kompanije Sartorius (Biostat<®>Aplus, Biostat<®>Bplus i Biostat<®>Bplus twin kontroleri, 2 L Univessel<®>reaktori, kontrola preko MFCSwin softvera). Tokom fermentacija praćeni su ili su podrazumevali upravljanje sledeći parametri: rastvoreni kiseonik (DO), pH, penušanje, biomasa (optička gustina na 600 nm (OD<600>) za E. coli i vlažna težina ćelija (WCW) za Pichia pastoris), nivo ekspresije i kvalitet proizvoda. Vrednost (DO) bila je tipično 30% i kontrolisana je putem kaskade mešanja, uz dalju kompenzaciju dodavanjem čistog kiseonika prema potrebi. pH vrednost je praćena putem pH elektrode i prilagođavana dodavanjem amonijaka preko pumpe za bazu. Vršenja su eksterna merenja pH vrednosti kako bi se proverilo funkcionisanje pH elektrode nakon autoklaviranja.

[0236] Tabela 2 daje pregled fermentacionih ciklusa sprovedenih za ekspresiju A007900171 i A007901219 korišćenjem Pichia pastoris kao organizma domaćina.

[0238] Slika 8 prikazuje SDS-PAGE analizu (neredukujući uslovi) uzoraka sa kraja indukcije različitih fermentacija sa Pichia pastoris.

[0240] U tabeli 3 prikazan je pregled različitih fermentacija sa Pichia pastoris sa njihovim odgovarajućim podešavanjima parametara, karakteristikama fermentacije i procenjenim prinosom ekspresije uzoraka sa kraja indukcije na osnovu SDS-PAGE analize.

[0242] [0091] Titar i čistoća proizvedenog Nanobody<®>na kraju fermentacije određeni su putem postupka prečišćavanja na proteinu A malih razmera, nakon čega je usledila RP-HPLC analiza. Ukratko, priprema uzorka je zasnovana na afinitetnoj hromatografiji na proteinu A kojom se Nanobody<®>prečišćava iz podloge. Koncentracija proteina u elucionoj frakciji određuje se pomoću UV spektrofotometrije, nakon čega sledi tečna hromatografija visoke rezolucije sa reverznim fazama (RP-HPLC) koja omogućava određivanje titra proizvoda i čistoće/heterogenosti proizvoda. Tabela 4 sumira RPC rezultate.

[0244] Tabela 2: Pregled fermentacionih ciklusa sprovedenih za ekspresiju A007900171 i A007901219 korišćenjem P. pastoris kao organizma domaćina

[0246] ID Konstrukt Soj Promotor Prihranjivana Brzina Indukcija Brzina

[0248]

[0251] Tabela 3: Pregled različitih fermentacija A007900035 sa Pichia pastoris i njihovih odgovarajućih prinosa ekspresije u bistroj podlozi na kraju fermentacije, određenih putem SDS-PAGE analize.

[0253] ID Konstrukt Soj Promotor Vreme WCW na Prinos Prinos sije

[0255]

)

[0257] A1/110511

290 ID Konstrukt Soj Promotor Vreme WCW na Prinos Prinos sije

[0259]

)

[0261]

[0264] Tabela 4: Pregled ukupnog prinosa određenog putem OD280 i RPC analize nakon koraka prečišćavanja na proteinu A, procenta glavnog pika i prinosa netaknutog monomera. Svi prinosi su izraženi u mg/L podloge bez ćelija.

[0266] Ferm. ID Konstrukt Promotor Ukupni Ukupni prinos % Prinos

[0268]

[0269] Primer 3: Prečišćavanje A007900171 i A007901219.

[0271] Oba molekula, A007900171 i A007901219, prečišćena su prema šemi prikazanoj u tabeli 5:

[0273] Tabela 5: Pregled koraka prečišćavanja.

[0276]

[0278] Bistrenje Hydrosart Sartocon slice kaseta, Sartorius) fermentacionog bujona

[0279] Korak 2: HCLC (MEP Hypercel sa elucijom pri pH3,5 Hvatanje proizvoda iz Korak neutralizacija sa 25mM Tris pH8,5) razmena podloge i uklanjanje hvatanja pufera* (Sephadex G25 u 25mM Tris pufer pH8,5) nečistoća

[0281] Korak 3: AIEX (POROS 50HQ ili Q Sepharose HP) u 25 Uklanjanje varijanti Intermedijerni mM Tris pH8,5 povezanih sa korak proizvodom i nečistoća

[0282] Korak 4: OGP tretman za uklanjanje LPS SEC (Superdex Uklanjanje LPS, Završni korak 75) varijanata povezanih sa

[0284]

[0287] Primer 4: Poređenje svojstava Alb-1, Alb-8 (=Alb-11) i Alb-23.

[0289] Određena su i upoređena različita svojstva Alb-1, Alb-8 i Alb-23. Rezultati su prikazani u tabeli 6.

[0291] Takođe, za direktno (side-by-side) poređenje tendencije Alb-8 i Alb-23 ka formiranju dimera, iz Arhenijusovog dijagrama izračunata je kinetika dimerizacije za monovalentni Alb-8 (Ea = 73,0 kcal/mol) i Alb-23 (Ea = 50,8 kcal/mol) na različitim temperaturama u PBS puferu.

[0292] Rezultati su prikazani u tabeli 7 i pokazuju da kod Alb-11 kinetika počinje da raste od sobne temperature naviše, naročito u poređenju sa Alb-23.

[0294] Tabela 6: Poređenje nekih svojstava Alb-1, Alb-8 i Alb-23.

[0296]

[0299] Tabela 7: Direktno poređenje kinetike dimerizacije monovalentnih ALB8/ALB11 i ALB23 u širokom opsegu koncentracija, izračunato iz Arhenijusovog dijagrama (maks. predviđeni % dimera nakon 3 godine pri navedenoj koncentraciji u PBS puferu i navedenoj temperaturi),

[0302]

[0304] dimera dimera dimera dimera dimera dimera

[0306] 5 0.00 0.03 0.01 0.09 0.02 0.17

[0308] 10 0.04 0.15 0.09 0.37 0.18 0.74

[0311] 15

0.31

0.63

0.77

1.60

1.50

3.20

[0312]

[0315] Primer 5: Stabilnost pri skladištenju konstrukata koji obuhvataju Alb-23 u poređenju sa Alb-11.

[0317] Radi poređenja stabilnosti pri skladištenju bispecifičnih konstrukata koji obuhvataju Alb-8, odnosno Alb-23, pripremljena su dva bispecifična konstrukta nanotela koja obuhvataju isto nanotelo protiv IgE (IGE045, SEQ ID NO: 43) povezano sa Alb-23 (IGE045-9GS-ALB23; SEQ ID NO: 41) i Alb-11 (IGE045-9GS-ALB11; SEQ ID NO: 42), formulisana u D-PBS puferu pri koncentraciji od 50 mg/ml i skladištena u plastičnim PCR epruvetama u mraku tokom mesec dana na različitim temperaturama. Nakon toga, količina predpika (koji odgovara formiranju dimera) određena je i upoređena korišćenjem SE-HPLC hromatografije. SE-HPLC analiza je sprovedena korišćenjem BioSep SEC-2000 kolone (Phenomenex) i D-PBS kao mobilne faze pri brzini protoka od 0,2 ml/min. Ubrizgano je 10 µg materijala, a podaci su analizirani pomoću softvera Chromeleon. Rezultati su prikazani u tabeli 8.

[0319] U sličnom eksperimentu upoređena je stabilnost pri skladištenju dva trivalentna bispecifična konstrukta (pri koncentraciji od 50 mg/ml u 20 mM His puferu, pH 6,5, 8% saharoze). Konstrukti su bili OX40L079 (SEQ ID NO: 44), trivalentni bispecifični konstrukt nanotela koji obuhvata Alb-11 i dva nanotela protiv OX40L (videti SEQ ID NO: 229 prijave WO 2011/073180 kompanije Ablynx N.V., podnete 14. decembra 2010. godine), i OX40L089 (SEQ ID NO: 45), odgovarajući konstrukt koji obuhvata ista dva nanotela protiv OX40L, ali sa Alb-23 umesto Alb-11. Rezultati su prikazani u tabeli 8A.

[0320] Tabela 8A: Uporedna stabilnost pri skladištenju konstrukata Alb-23 i Alb-11 (% predpika na SE-HPLC nakon skladištenja tokom navedenog perioda na navedenim temperaturama)

[0322]

[0325]

[0328] U drugom eksperimentu upoređena je stabilnost pri skladištenju i prinos fermentacije četiri različita konstrukta nanotela protiv c-Met (A007901222/SEQ ID NO: 46; A007901256/SEQ ID NO: 47; A007901259/ SEQ ID NO: 48 i A007901260/SEQ ID NO: 49). Od ovih konstrukata, A007901222 sadrži Alb-23 nanotelo koje vezuje albumin (predmetni pronalazak) kao i anti-c-Met nanotelo „tipa VHH-1“ (4E09 - videti ponovo gore navedene američke prijave 61/388,172 i US 61/451,869), dok ostali konstrukti (korišćeni kao uporedne reference) sadrže Alb-11 i anti-c-Met nanotela koja nisu tipa VHH-1. Za detaljniji opis korišćenih konstrukata, upućuje se na uporednu američku prijavu 13/435,567 (Beste et al.) koju je podnosilac podneo 30. marta 2012. godine (što odgovara US8703135).

[0330] Različiti konstrukti nanotela proizvedeni su u Pichia pastoris (videti ponovo US 8703135, US 61/388,172 i US 61/451,869) i pružili su široko uporedive prinose fermentacije (1,03 g/L; 1,43 g/L za A007901256; 0,91 g/L za A007901259 i 1,45 g/L za A007901260), potvrđujući da predmetni pronalazak omogućava obezbeđivanje konstrukata koji obuhvataju nanotela tipa VHH-1 sa prinosima ekspresije koji su uporedivi sa prinosima ekspresije konstrukata koji ne sadrže nanotelo tipa VHH-1.

[0331] Konstrukti nanotela su zatim prečišćeni (> 99% čistoće na SEC i > 90% čistoće na RPC) i inkubirani na -70°C, -20°C, 5°C, 25°C i 40°C pri koncentraciji od oko 15 mg/ml u D-PBS puferu tokom 7,5 nedelja. Uzorci su procenjeni merenjem mutnoće (OD500), RP-HPLC i SE-HPLC hromatografijom. Rezultati su sumirani u tabeli 8B. Stabilnost je bila prihvatljiva za sve testirane uzorke kada su skladišteni na -70°C, -20°C ili 5°C tokom 7,5 nedelja.

[0333] Tabela 8B: Uporedna stabilnost pri skladištenju različitih anti-c-Met konstrukata nanotela

[0335]

[0337] A007901260 0.5 % HMW; OD500 < 0.005 23.1 % HMW; OD500 = 0.45 (*)

[0340] (

[0342] Primer 6: Određivanje afiniteta korišćenjem površinske plazmonske rezonance

[0344] [0100] Kinetička analiza anti-c-Met fuzionih konstrukata nanotela i albumina A007900171 (SEQ ID NO: 40) i A007901219 (SEQ ID NO: 23) za humani albumin, albumin makaki majmuna i mišji serumski albumin, sprovedena je korišćenjem površinske plazmonske rezonance (SPR) na instrumentu Biacore T100. HBS-EP+ pufer (0,01 M HEPES pufer koji sadrži 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA i 0,05% surfaktanta p20, pH 7,4) korišćen je kao mobilna faza, a eksperimenti su izvedeni na 25 °C. Serumski albumin je hemijski kuplovan na Series S CM5 senzorski čip sa površinom od karboksimetilisanog dekstrana putem manuelnog ciklusa imobilizacije pri brzini protoka od 5 µl/min. Površine su prvo aktivirane sedmominutnim ubrizgavanjem smeše u odnosu 1: 175 mg/ml EDC i 11,5 mg/ml NHS (Biacore komplet za kuplovanje amina). Serumski albumin je ubrizgavan u koncentraciji od 10 µg/ml u 10 mM acetatu pH4,5, dok nije dostignut nivo od 970 RU (protočna ćelija 2), 890 RU (protočna ćelija 3) i 1360 RU (protočna ćelija 4) za humani, cynomolgus i mišji serumski albumin, respektivno. Nakon imobilizacije, površine su deaktivirane sedmominutnim ubrizgavanjem 1M etanolamina pH 8,5. Slepa referentna površina (protočna ćelija 1) aktivirana je i deaktivirana kao što je gore opisano. Pripremljena je serija koncentracija nanotela u HBS-EP+ puferu (tj.0 nM, 1,9nM, 7,8nM, 31,25nM, 125nM, 500nM, 0nM, 7,8nM, 125nM), koje su ubrizgavane tokom 2 min pri brzini od 45 µl/min (putanje protoka 1, 2, 3 i 4), uz omogućenu disocijaciju u mobilnoj fazi tokom 10 min. Između različitih uzoraka, površine su regenerisane regeneracionim puferom 10mM glicin-HCl pH1,5, tokom 100s pri brzini od 45µl/min. Podaci su dvostruko referencirani oduzimanjem krivi na referentnom kanalu i krive ubrizgavanja slepe mobilne faze. Obrađene krive su procenjene prilagođavanjem modela vezivanja 1:1 na krive vezivanja u softveru Biacore T100 Evaluation. Prijavljene su brzine asocijacije (ka), brzine disocijacije (kd) i afiniteti (KD), koji su prikazani u tabeli 9.

[0346] Tabela 9: Određivanje afiniteta nanotela prema serumskom albuminu merenjem površinske plazmonske rezonance (SPR)

[0349]

[0351] k<on>je dato u 105 M<-1>s<-1,>k<off>je dato u 10-3 S<-1,>K<D>je dato u nM (10-9 M)

[0352] * Podaci dobijeni u odvojenom, ali ekvivalentnom eksperimentu

[0354] Primer 7: Vezivanje MET-liganda HGF u AlphaScreen testu.

[0355] Konstrukti nanotela protiv c-MET/serumskog albumina okarakterisani su u kompetitivnom AlphaScreen testu za HGF/c-MET kako bi se procenila njihova potencija i efikasnost blokiranja i uporedila sa referentnim fragmentom antitela (5D5 Fab v2). Serija razblaženja anti-c-MET nanotela i referentnog 5D5 Fab v2, u rasponu od 250 nM do 0,9 pM, prethodno je inkubirana sa 100 pM biotinilovanog hHGF tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Ovoj smeši su dodate akceptorske kuglice konjugovane sa anti-humanim Fc fragmentom i c-MET/Fc (konačna koncentracija 100 pM) i inkubirane tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Zatim su dodate streptavidinske donorske kuglice i smeša je inkubirana još dodatnih sat vremena. Fluorescencija je merena očitavanjem ploča na EnVision Multilabel čitaču ploča korišćenjem ekscitacione talasne dužine od 680 nm i emisione talasne dužine od 520 nm.

[0357] Dva konstrukta efikasno inhibiraju vezivanje HGF za c-MET receptor na dozno-zavisan način. Izračunate vrednosti IC<50>i odgovarajući 95% intervali poverenja prikazani su u tabeli 10. A007900171 i dve serije A007901219 imaju slične vrednosti IC50; njihovi 95% intervali poverenja se preklapaju, što ukazuje na to da razlika nije statistički značajna. Nanotela su pokazala više nego petostruko bolju potenciju u poređenju sa referentnim 5D5 Fab v2.

[0359] Tabela 10: Inhibicija vezivanja HGF za c-MET određena AlphaScreen testom (vrednosti IC50 i 95% intervali poverenja)

[0362]

[0365] Primer 8: Blokiranje fosforilacije MET indukovane putem HGF u liniji ćelija kancera A549

[0367] [0103] Prečišćeni konstrukti nanotela protiv c-MET/serumskog albumina okarakterisani su u testu fosforilacije zavisne od HGF. Serija razblaženja anti-c-MET konstrukata ili anti-c-MET referentnog 5D5 Fab v2, u rasponu od 1 µM do 0,23 nM, ko-inkubirana je sa 1 nM HGF na ćelijama A549 tokom 15 min na 37°C. 1/3 rastvora liziranih ćelija je zatim naneta na MSD ploče za test fosfo c-MET. Dva duplikata sa nivoa ćelijske kulture su objedinjena na MSD nivou. Nakon ispiranja nevezanog materijala, detekciono c-MET antitelo obeleženo sulfomarkerom detektovalo je i fosforilisani i nefosforilisani receptor. Očitavanje je izvršeno pomoću uređaja Sector Imager 2400.

[0369] Dva konstrukta nanotela protiv c-MET/serumskog albumina efikasno inhibiraju fosforilaciju c-MET receptora zavisnu od HGF na dozno-zavisan način. Izračunate vrednosti IC<50>i odgovarajući 95% intervali poverenja prikazani su u tabeli 11. A007900171 i dve serije A007901219 imaju slične vrednosti IC<50>; njihovi 95% intervali poverenja se preklapaju, što ukazuje na to da razlike nisu statistički značajne. Nanotela su pokazala približno dvostruko bolju potenciju u poređenju sa referentnim 5D5 Fab v2. Pored toga, unutar 95% intervala poverenja, dodavanje humanog serumskog albumina stimulisanim ćelijama nije izmenilo vrednosti IC<50>testiranih nanotela.

[0371] Tabela 11: Inhibicija vezivanja HGF za c-MET određena testom fosforilacije c-MET (vrednosti IC50 i 95% intervali poverenja)

[0373]

Claims (12)

1. Patentni zahtevi

1. Polipeptid, protein, konstrukt, jedinjenje ili drugi hemijski entitet koji obuhvata ili se sastoji od sekvence aminokiselina odabrane iz SEQ ID NO: 3-11 i jedne ili više drugih sekvenci aminokiselina, domena, jedinica za vezivanje ili drugih ostataka ili hemijskih entiteta, na odgovarajući način međusobno povezanih bilo direktno ili opciono putem jednog ili više odgovarajućih linkera ili spejsera.

2. Polipeptid, protein, konstrukt, jedinjenje ili drugi hemijski entitet prema patentnom zahtevu 1, u kojem su navedena jedna ili više drugih sekvenci aminokiselina, domena, jedinica za vezivanje ili drugih ostataka ili hemijskih entiteta jedna ili više terapijskih sekvenci aminokiselina, domena, jedinica za vezivanje, ostataka ili entiteta.

3. Polipeptid, protein ili konstrukt prema patentnom zahtevu 1 ili 2, u kojem su jedna ili više drugih sekvenci aminokiselina, domena, jedinica za vezivanje ili drugih ostataka ili hemijskih entiteta jedan ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina.

4. Polipeptid, protein ili konstrukt prema patentnom zahtevu 3, u kojem su jedna ili više drugih sekvenci aminokiselina, domena, jedinica za vezivanje ili drugih ostataka ili hemijskih entiteta jedan ili više VHH, humanizovanih VHH ili kamelizovanih VH.

5. Polipeptid, protein ili konstrukt prema patentnom zahtevu 3 ili 4, u kojem najmanje jedan od pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina obuhvata najmanje dva disulfidna mosta.

6. Polipeptid, protein ili konstrukt prema patentnom zahtevu 3 ili 5, u kojem je najmanje jedan od VHH, humanizovanih VHH, kamelizovanih VH ili pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina VHH klase I.

7. Polipeptid, protein ili konstrukt prema bilo kojem od patentnih zahteva od 3 do 6, u kojem je najmanje jedan od pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina usmeren protiv c-Met.

8. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata najmanje jedan polipeptid, protein, konstrukt ili jedinjenje prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 7, i opciono najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.

9. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 8, za primenu na način koji omogućava polipeptidu, proteinu, konstruktu ili jedinjenju da uđe u cirkulaciju.

10. Nukleotidna sekvenca ili nukleinska kiselina koja kodira polipeptid, protein ili konstrukt prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 7.

11. Ćelija domaćin koja sadrži i sposobna je da eksprimira nukleotidnu sekvencu ili nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 10.

12. In vitro postupak za pripremu polipeptida, proteina ili konstrukta prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 7, koji postupak obuhvata kultivisanje ili održavanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 11 pod uslovima takvim da navedena ćelija domaćin proizvodi ili eksprimira navedeni polipeptid, protein ili konstrukt, i opciono dalje obuhvata izolovanje tako proizvedenog polipeptida, proteina ili konstrukta.