RU2249363C2

RU2249363C2 - Композиция для иммунизации растений

Info

Publication number: RU2249363C2
Application number: RU98123118/13A
Authority: RU
Inventors: Эгон МЁЗИНГЕР (DE); Эгон МЁЗИНГЕР
Original assignee: Новартис Аг
Priority date: 1996-05-28
Filing date: 1997-05-27
Publication date: 2005-04-10
Also published as: DK0949866T3; WO1997045018A1; CN1146323C; PL187842B1; IL126266A; GB9611089D0; CU22775A3; AU2962597A; HUP9902922A2; AU717292B2; JP2001503733A; CA2249444A1; ZA974689B; PL329408A1; US6326016B2; IL126266A0; US20010014324A1; ATE217758T1; HUP9902922A3; EP0949866A1

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и касается иммунизации растений, в частности композиций и способов индуцирования у растений устойчивости к фитопатогенным организмам, таким как фитопатогенные грибы. Агент, предназначенный для индуцирования у растений устойчивости к фитопатогенным микроорганизмам, представляет собой экстракт из биомассы нефитопатогенных микроорганизмов. Способ получения агента включает следующие стадии: а) ресуспендирование от 50 г до 200 г (сухой вес) биомассы нефитопатогенных микроорганизмов в 1 л неорганического или органического растворителя, б) перемешивание при комнатной температуре в течение 1-12 ч, в) инкубацию, г) ресуспендирование, д) охлаждение до комнатной температуры при выстаивании и е) необязательно фильтрацию. Изобретение позволяет индуцировать у растений устойчивость к фитопатогенным микроорганизмам. 5 с. и 7 з.п. ф-лы, 5 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к иммунизации растений, в частности к композициям и способам индуцирования у растений устойчивости к фитопатогенным организмам, таким как фитопатогенные грибы.

Предпосылки создания изобретения

Различные исследования показали, что чувствительность растений к определенным болезням не коррелирует с отсутствием генетического потенциала, обусловливающего механизмы устойчивости к этим болезням. Известно, что устойчивость может быть индуцирована у растений, кажущихся чувствительными, путем инокуляции авирулентными формами фитопатогенов, гиповирулентными фитопатогенами или путем ограниченной инокуляции фитопатогенами. Полученная в результате индуцированная устойчивость является стабильной и обычно неспецифической в отношении патогена.

Эта защитная система представляет собой сложное взаимодействие случаев раннего распознавания патогена, вызывающих сигналы, которые распространяются от места инокуляции внутри- и межклеточно по всему растению. Эти сигналы запускают серии индуцируемых защитных реакций, направленных на блокирование или даже на уничтожение внедряющегося патогена. Многие защитные реакции контролируются на уровне транскрипции гена.

Распознавание патогена происходит в наиболее близком к поверхности растения месте. Продукты, образующиеся в результате разложения клеточной оболочки атакующим патогеном ("извлекающие" глюкан патогены), а также фрагменты растительной клетки, образующиеся в результате атаки ("извлекающие" олигогалактуронид патогены), являются одними из наиболее хорошо изученных сигналов тревоги. Вторичные сигналы распространяются от места атаки по всему растению. Наиболее известным соединением в этой цепи сигналов является салициловая кислота, но в качестве сигналов, индуцирующих защитные реакции, также были описаны электрические сигналы.

Защитные реакции, которые активируются при поступлении сигналов тревоги, представляют собой широкий спектр химической, биохимической и механической защиты. У однодольных растений часто наблюдается укрепление клеточной оболочки путем отложения каллюса напротив места, в которое патоген пытается проникнуть. У дву- и однодольных растений наблюдается индукция гидролитических ферментов (например, хитиназ с лизозимной активностью, β-1,3-глюканаз, протеаз). Растения также могут реагировать путем локального синтеза сильно увеличенных концентраций токсичных вторичных метаболитов, так называемых фитоалексинов, которые могут уничтожить внедряющийся микроорганизм. Одной из наиболее ранних реакций атакованной растительной клетки является генерация активных кислородных радикалов, что часто является началом полного уничтожения ограниченного числа клеток вокруг пораженного места.

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно изобретению неожиданно было установлено, что экстракт биомассы микроорганизмов, которые в норме не вызывают болезней ни у каких растений (нефитопатогенные микроорганизмы), может использоваться для индуцирования у растений устойчивости к фитопатогенным микроорганизмам.

Таким образом, изобретение относится к агенту, предназначенному для индуцирования у растений устойчивости к фитопатогенным микроорганизмам, где такой агент (алее в настоящем описании называемый как "агент по изобретению") представляет собой экстракт биомассы нефитопатогенных микроорганизмов, процесс получения которого предусматривает:

а) ресуспендирование от 50 г до 200 г (сухой вес) биомассы нефитопатогенных микроорганизмов в 1 л неорганического или органического растворителя,

б) перемешивание при комнатной температуре в течение 1-12 ч,

в) инкубацию,

г) ресуспендирование,

д) охлаждение до комнатной температуры при выстаивании и

е) необязательно фильтрацию.

Изобретение также относится к сельскохозяйственным композициям, включающим агент, полученный с помощью вышеописанного процесса, в сочетании с приемлемыми с сельскохозяйственной точки зрения носителями (разбавителями) и необязательно с одним или несколькими пестицидами, предназначенными для защиты растений и способными индуцировать у растений устойчивость к фитопатогенным микроорганизмам.

Настоящее изобретение также относится к экстракту Penicillium chrysogenum, способному индуцировать у растений устойчивость к фитопатогенным микроорганизмам.

Изобретение также относится к способу индуцирования у растений устойчивости к фитопатогенным микроорганизмам путем обработки растения, почвы или семян агентом по изобретению. Агент может применяться индивидуально, т.е. без включения в препаративную форму, или в форме сельскохозяйственной композиции.

Изобретение также относится к способу получения агента, предназначенного для индуцирования у растений устойчивости к фитопатогенным микроорганизмам, где такой агент представляет собой экстракт биомассы нефитопатогенных микроорганизмов, полученный путем:

а) ресуспендирования от 50 г до 200 г (сухой вес) биомассы нефитопатогенных микроорганизмов в 1 л неорганического или органического растворителя,

б) перемешивания при комнатной температуре в течение 1-12 ч,

в) инкубации,

г) ресуспендирования,

д) охлаждения до комнатной температуры при выстаивании и

е) необязательно фильтрации.

Подробное описание изобретения

В контексте настоящего описания под "растениями" обычно понимают культивируемые растения, которые выращивают/применяют для получения урожая. Целевыми растениями, подлежащими защите путем интродукции устойчивости, в объеме настоящего изобретения являются, например, следующие виды растений: зерновые (пшеница, ячмень, рожь, овес, рис, сорго и родственные культуры); свекольные (сахарная свекла и кормовая свекла); косточковые, семечковые и ягодные культуры (яблони, груши, сливы, персики, миндаль, вишни, земляника, малина и ежевика), бобовые растения (бобы, чечевица, горох и соя), масличные культуры (рапс, горчица, мак, маслины, подсолнечниковые, кокос, клещевина, какао-бобы и арахис), огуречные растения (огурец, тыква и дыня), волокнистые растения (хлопчатник, лен, конопля и джут), цитрусовые культуры (апельсины, лимоны, грейпфруты и мандарины), овощные культуры (шпинат, салат, спаржа, капустные, морковь, луки, томаты, картофель, сладкий перец), лавровые культуры (авокадо, коричное дерево и камфарное дерево) или такие растения, как кукуруза, табак, орехи, кофе, сахарный тростник, чай, виноград, хмель, бананы и природные каучуконосы, а также декоративные растения, растения лугов и пастбищ (дернообразующие злаки) и насыпей.

Предпочтительные растения, подлежащие защите согласно изобретению, включают пасленовые, такие как томат и картофель, бобы, огурец, перец, табак, арахис и культурные сорта винограда.

Особенно предпочтительными растениями, подлежащими защите согласно изобретению, являются представители сем. пасленовых.

Под "фитопатогенными микроорганизмами" в контексте настоящего описания подразумевают грибы, бактерии и вирусы, которые атакуют растения и вызывают повреждение растения. Агент по изобретению является особенно эффективным в отношении индуцирования устойчивости к фитопатогенным грибам. Такие фитопатогенные грибы включают, например, Phytophtora infestants, Cladosporium fulvum, Plasmopora viticola, Colletotrichum lagenarium, Pseudomonas lachrymans и Puccinia tritici.

При применении агента по изобретению особенно хорошие результаты могут быть достигнуты в отношении защиты пасленовых, таких как томат и картофель, от Phytophtora infestants и Cladosporium fulvum, защиты культурных сортов винограда от Plasmopora viticola и защиты огурцов от Colletotrichum lagenarium и Pseudomonas lachrymans.

Под "нефитопатогенными микроорганизмами" в контексте настоящего описания подразумевают микроорганизмы из таких родов и относящиеся к таким видам, которые не вызывают болезней у растений. Предпочтительно нефитопатогенные микроорганизмы также являются неспецифичными для растений микроорганизмами, т.е. они не произрастают на растениях.

Примерами родов микроорганимов, которые могут применяться согласно изобретению, являются следующие:

- бактерии: Acetobacter, Achromobacter, Actinoplanes, Aerobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Cephalosporium, Clostridium, Corynebacterium, Cryptococcus, Escherichia, Flavobacterium, Gluconobacter, Lactobacillus, Leuconostoc, Methanobacillus, Methanomonas, Methylovibrio, Microbacterium, Micrococcus, Micromonospora, Mycobacterium, Nocardia, Propionibacterium, Protaminobacter, Proteus, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Saccharopolyspora, Sarcina, Sporotrichum, Streptococcus, Streptomyces, Thermomonospora, Thiobacillus, Xanthomonas,

- грибы и дрожжи: Acremonium, Aschersonia, Ashbya, Aspergillus, Aureobasidium, Beaveria, Candida, Claviceps, Clitopilus, Curvularia, Cyclindrocarpon, Eremothecium, Erwinia, Fusarium, Fusidium, Gibberalla, Hansenula, Hirsutella, Klyveromyces, Metarhizium, Mucor, Myocandida, Neocosmospora, Phaecilomyces, Penicillium, Pericularia, Phanerochaete, Phycomyces, Pichia, Pullularia, Rhizopus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sclerotium, Sesquicilliopsis, Streptomyxa, Tolypocladium, Torula, Torulopsis, Trametes, Trichoderma, Trigonopsis.

Примерами особенно предпочтительных видов, которые могут применяться согласно изобретению, являются следующие:

- бактерии: Acetobacter aceti, Acetobacter suboxydans, Acetobacter xylinum, Achromobacter obae, Actinoplanes missouriensis, Aerobacter aerogenes, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter hyalinus, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter simplex, Bacillus acidocaldarius, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amylosolvens, Bacillus brevis, Bacillus caldolyticus, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus moritae, Bacillus polymyxa, Bacillus popiliae, Bacillus pumilis, Bacillus subtilis, Brevibacterium amylolyticum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium butyricum, Corynebacterium gelatinosum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium guanofaciens, Corynebacterium hydrocarboclastus, Corynebacterium petrophilum, Cryptococcus laurentii, Escherichia coli, Flavobacterium aminogenes, Gluconobacter melanogenus, Lactobacillus bulgaris, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus leichmanii, Lactobacillus pentosus, Leuconostoc brevis, Leuconostoc dextranicum, Leuconostoc mesenteroides, Methanobacillus omelianski, Methanobacillus soenhngenii, Methanomonas margaritae, Methanomonas capsulatus, Methanomonas methanica, Methylovibrio soehngenii, Microbacterium ammoniaphilum, Micrococcus glutamicus, Micromonospora carbonaceae, Micromonospora echinospora, Micromonospora inyoensis, Micromonospora olivoasterospora, Micromonospora purpurea, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Nocardia alkanoglutinosa, Nocardia gardneni, Nocardia mediterranei, Nocardia uniformis, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium shermanii, Protaminobacter ruber, Proteus rettgeri, Pseudomonas amyloderamosa, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas dacunhae, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas methylotrophus, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas pyrrocinia, Rhodopseudomonas spheroides, Saccharopolyspora erythraea, Sarcina lutea, Sporotrichum pulverulentum, Streptococcus cremoris, Streptococcus fradiae, Streptococcus lactis, Streptococcus mutants, Streptococcus thermophilus, все виды Streptomyces, Thermomonospora curvata, Thermomonospora fusca, Thiobacillus ferroxidans, Thiobacillus thiooxidans,

- грибы и дрожжи: Acremonium chrysogenum, Aschersonia aleyrodis, Ashbya gossypii, Aspergillus awarnori, Aspergillus flavus, Aspergillus itaconicus, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus terreus, Aspergillus wentii, Aureobasidium pullulans, Beauveria bassiana, Beauveria inflatum, Candida flareri, Candida lipolytica, Candida oleophila, Candida periculosa, Candida tropicalis, Candida utilis, Cephalosporium acremonium, Claviceps paspali, Claviceps fusiformis, Clitopilus passeckerianus, Curvularia lunata, Cyclindrocarpon radicicola, Eremothecium ashbyii, Hansenula anomala, Hirsutella thompsonii, Klyveromyces fragilis, Klyveromyces lactis, Metharhizium anisophae, Mucor miehei, Mucor pusillus, Myocandida riboflavina, Neocosmospora vasinfecta, Phaecilomyces varioti, Penicillium chrysogenum, Penicillium camemberti, Penicillium griseofulvum, Penicillium roqueforti, Penicillium patulum, Phanerochaete chrysosporium, Phycomyces blakesleanus, Pichia guilliermondi, Pichia stiptis, Pullularia pullulans, Rhizopus delemar, Rhizopus formosaensi, Rhizopus japanicus, Rhizopus nigricans, Rhizopus niveus, Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces carisbergiensis, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces lipolytica, Schizosaccharomyces pombe, Sclerotium glutanicum, Sesquicilliopsis rosariensis, Streptomyxa affinis, Tolypocladium inflatum, Tolypocladium terricola, Torula cremonis, Torulopsis magnoliae, Torulopsis utilis, Trametes sanguinea, Trigonopsis variabilis.

Нефитопатогенные микроорганизмы предпочтительно представляют собой грибы и дрожжи, прежде всего грибы.

Наиболее предпочтительные виды грибов принадлежат к следующим родам и видам: Acremonium spp., таким как Acremonium chrysogenum, Aspergillus spp., таким как Aspergillus awamori, Aspergillus itaconicus, Aureobasidium spp., таким как Aureobasidium pullulans, Beauveria spp., таким как Beauveria bassiana, Beauveria inflatum, Clitopilus spp., таким как Clitopilus passeckerianius, Mucor spp., таким как Mucor miehei, Mucor pusillus, Neocosmospera spp., такие как Neocosmospera vasinfecta, Phaecilomyces spp., таким как Phaecilomyces varioti, Penicillium spp., таким как Penicillium chrysogenum, Penicillium camemberti, Penicillium citrinum, Penicillium griseofulvum, Penicillium roqueforti, Penicillium urticae, Penicillium patulum, Phanerochaete spp., таким как Phanerochaete chrysosporium, Pullularia spp., таким как Pullularia pullulans, Schizosaccharomyces spp., таким как Schizosaccharomyces pombe, Tolypocladium spp., таким как Tolypocladium inflatum, Tolypocladium terricola, Trametes spp., таким как Trametes sanguinea, Trichoderma spp., таким как Trichoderma koningii, Trichoderma reseei, Trichoderma viride.

Еще более предпочтительные микроорганизмы, которые могут быть использованы в соответствии с изобретением, относятся к родам Penicillium и Cephalosporium, среди которых особенно предпочтительными являются виды Penicillium chrysogenum и Cephalosporium acremonium.

Под "биомассой" в контексте настоящего описания подразумевают высушенные органические отходы производства, получаемые в процессе биотехнологической ферментации, например, при изготовлении фармацевтических препаратов, таких как антибиотики. В процессе сбора продукта влажную микробиологическую биомассу, например фазу, содержащую антибиотик, отделяют фильтрацией из жидкости и сушат, например, в течение 4-6 ч при температуре от +130°С до +150°С. Эти высушенные органические отходы производства могут служить далее исходным материалом для получения агента по изобретению.

Предпочтительно исходным материалом является биомасса гриба (мицелии), полученные из отходов производства процессов биотехнологической ферментации, предпочтительно при ферментации Penicillium chrysogenum и Cephalosporium acremonium.

Предпочтительным примером неорганического растворителя, пригодного для использования в процессе экстракции на стадиях (а) и (г), является вода. Предпочтительными примерами органических растворителей, пригодных для использования в процессе экстракции на стадиях (а) и (г), являются спирты, такие как изопропанол, этанол или метанол.

Обычно применяют концентрации от 50 до 200 г (сухой вес) биомассы нефитопатогенных микроорганизмов на 1 л растворителя. Предпочтительно приблизительно 150 г (сухой вес) биомассы суспендируют в 1 л растворителя.

Суспензия, полученная после стадии (а), обычно имеет значение рН от приблизительно 2,8 до приблизительно 5,6, предпочтительно от приблизительно 3,3 до приблизительно 3,6, и не нуждается в дополнительном регулировании значения рН. Эту суспензию обычно перемешивают при комнатной температуре (от +20°С до +25°С) в течение 1-12 ч (стадия (б)).

Типичными условиями инкубации на стадии (в) являются, например, 1 ч при +120°С, 2 ч при +80°С или 12 ч при +20°С. При этом максимальная температура составляет +120°С, а минимальная температура равна +20°С. При +120°С время инкубации не должно превышать 2 ч и не должно быть меньше 0,5 ч, а при + 20°С минимальное время инкубации должно составлять 8 ч, а максимальное время равно 70 ч. Для специалиста в данной области очевидно, каким образом можно определить минимальный и максимальный период времени инкубации при заданных температурах от +120°С до +20°С. Предпочтительно инкубацию проводят при одновременном нагревании или автоклавировании, например, в течение 1 ч при +120°С (экстракт, полученный в результате такого процесса, далее обозначен как экстракт PEN-A), или в течение 2 ч при +80°С. Экстракт, полученный в результате инкубации в течение 12 ч при +20°С, далее в настоящем описании обозначен как PEN-B.

Ресуспендирование на стадии (г) обычно проводят путем встряхивания или смешения суспензии, которая могла быть разделена на твердые и жидкие компоненты на стадии (в).

Стадия (д), как очевидно, является необходимой только тогда, когда температура, применяемая для инкубации, превышает комнатную температуру.

Фильтрацию на стадии (е) обычно проводят с использованием бумажных фильтров и в результате получают прозрачный раствор коричневатого цвета, обычно с запахом, характерным для продуктов ферментации. Стадия фильтрации также может быть проведена в промышленном масштабе путем периодического или непрерывного центрифугирования или с использованием фильтра, работающего под давлением. Стадия фильтрации служит, например, для снижения риска фитотоксичности. Предпочтительно агенты по изобретению получать с использованием стадии фильтрации (е).

После стадии (д) или предпочтительно после стадии фильтрации (е) экстракт обычно сушат таким образом, чтобы его можно было упаковывать и отгружать в порошкообразной форме и чтобы непосредственный потребитель мог его ресуспендировать для конечного применения согласно изобретению. Условия сушки не имеют решающего значения, и могут использоваться любые известные методы, такие как лиофилизация, распылительная сушка или сушка на роторном испарителе.

Изменения в процессе экстракции могут привести к серьезным потерям требуемой активности в отношении защиты растений и/или привести к значительным побочным эффектам экстракта, таким как фитотоксичность,

Агент по изобретению обычно включает в качестве действующих веществ следующие компоненты:

1) разветвленные или неразветвленные олигосахариды со степенью полимеризации от 2 до 30 или более,

2) моносахариды и

3) протеины, гликолротеины и/или липопротеины. Предпочтительно агент по изобретению может содержать:

1) 0,5-8,0 г/л разветвленных или неразветвленных олигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 30, предпочтительно с 1-6 β-звеньями и 1-3 β-звеньями,

2) 0,1-4,0 г/л моносахаридов и

3) 0,1-1,5 г/л протеинов, гликопротеинов и/или липопротеинов.

Мономеры, полученные в результате гидролиза указанных олигосахаридов, главным образом представляют собой маннозу, галактозу и глюкозу в соотношении, например, 1:1:1 (для Penicillium chrysogenum), 2:1:2, 1:1:2 или 2:1:1, а также представляют собой N-ацетилглюкозамин, глюкозамин и хитин.

Наиболее выраженная активность в отношении защиты растений соответствует молекулам с молекулярной массой <3000 Да.

Изобретение также относится к композициям для индуцирования у растений устойчивости к фитопатогенным микроорганизмам, включающим в качестве действующего вещества агент по изобретению в сочетании с приемлемым с сельскохозяйственной точки зрения разбавителем (далее в настоящем описании обозначен как разбавитель) и необязательно с одним или несколькими применяемыми для защиты растений пестицидами. Композиции получают общепринятым методом, например, путем смешения агента по изобретению с разбавителем и необязательно с дополнительными ингредиентами, такими как поверхностно-активными вещества.

Понятие "разбавители" в контексте настоящего описания обозначает жидкий или твердый приемлемый с сельскохозяйственной точки зрения продукт, который может быть добавлен к действующему веществу с целью придания ему более простой или более удобной для применения формы, например для разбавления действующего вещества с целью получения применяемого или требуемого уровня активности. Примерами таких разбавителей является тальк, каолин, диатомовая земля, ксилол или вода.

Особенно предпочтительные препаративные формы, такие как диспергируемые в воде концентраты или смачивающиеся порошки, могут содержать поверхностно-активные вещества, такие как смачивающие и диспергирующие агенты, например продукт конденсации формальдегида и нафталинсульфоната, алкиларилсульфонат, лигнинсульфонат, жирный алкилсульфат, этоксилированный алкилфенол и этоксилированный жирный спирт. Как правило, препаративные формы содержат от 0,01 до 90 мас.% действующего вещества (агента по изобретению и необязательно пестицидов), от 0 до 20% приемлемого с сельскохозяйственной точки зрения поверхностно-активного вещества и от 10 до 99,99% разбавителя (ей). Концентрированные формы композиции, например эмульсионные концентраты, как правило, содержат приблизительно от 2 до 90 маc.%, предпочтительно от 5 до 70 маc.% действующего вещества. Пригодные для применения формы композиции, как правило, содержат от 0,0005 до 10 мас.% активного агента по изобретению в качестве действующего вещества, а обычные суспензии для опрыскивания могут, например, содержать от 0,0005 до 0,05, например 0,001, 0,002 или 0,005 мас.% действующего вещества.

В дополнение к обычным разбавителям и поверхностно-активным веществам агент по изобретению может содержать дополнительные вспомогательные вещества, предназначенные для специальных целей, например стабилизаторы, дезактиваторы (для твердых препаративных форм или носителей с активной поверхностью), прилипатели, улучшающие адгезию к растениям, ингибиторы коррозии, антивспениватели и красители.

Пригодные для растений пестициды, которые могут применяться в сочетании с агентом по изобретению, включают фунгициды, гербициды, бактерициды, инсектициды и т.д. Агент по изобретению предпочтительно применяют в сочетании с фунгицидами, например с серой, хлорталонилом, эупареном, с фунгицидами из класса гуанидина, такими как гуазатин, с дитиокарбаматами, такими как манкоцеб, манеб, зинеб, пропинеб, с трихлорметансульфенилфталимидами и их аналогами, такими как каптан, каптафол и фольпет, бензимидазолами, такими как карбендазим, беномил, азолами, такими как дифеноконазол, ципроконазол, флузилазол, флутриафол, гексаконазол, пропиконазол, пенконазол, тебуконазол, метаконазол, эпоксиконазол, тетраконазол, тритиконазол, пробеназол, трициклазол, флуквинконазол, прохлораз, с морфолинами, такими как фенпропиморф, фенпропидин, диметоморф, или с иными обладающими соответствующей активностью продуктами, такими как фунгициды типа хиноксифена, фамоксиадона, спироксамина, фенгексамида, 2-(2-феноксифенил)-(Е)-2-метоксиимино-N-метилацетамида, [2-(2,5-диметилфеноксиметил)фенил]-(Е)-2-метоксиимино-N-метиламида, (1R,3S/1S,3R)-2,2-дихлор-N-[(R)-1-(4-хлорфенил)этил]-1-этил-3-метилциклопропанкарбоксамида, метоксиакрилатов и метоксииминоакрилатов, как описано для формулы I в WO 97/00011, азоксистробина, крезоксим-метила, цимоксанила, ципродинила, пирохилона, оксадиксила, металаксила или R-металаксила, или таких инсектицидов, как фуратиокарб, или соединений, описанных для формулы I в ЕР-А-0580553, причем предпочтительными являются комбинации с ципроконазолом, пропиконазолом, R-металаксилом или оксадиксилом.

Такие комбинации являются особенно эффективными для лечения или предупреждения вспышки фитофтороза (Phytophtora infestants), антракноза (Colletotrichum lagenarium), ржавчины (Puccinia tritici), мильдью (Erysiphe graminis), бактериального вилта (Erwinia tracheiphila) и серой плесени (Pseudomonas lachrymans).

Примерами приемлемых для растений препаративных форм фунгицидов, предназначенных для защиты растений, являются следующие.

а. Препаративная Форма в виде смачивающего порошка

10 частей агента по изобретению в высушенной форме смешивают и измельчают с 4 частями синтетической высокодисперсной двуокиси кремния, 3 частями лаурилсульфата натрия, 7 частями лигнинсульфоната натрия и 66 частями тонкоизмельченного каолина и 10 частями диатомовой земли до тех пор, пока средний размер частицы не составит приблизительно 5 мкм. Образовавшйся смачивающийся порошок разбавляют перед применением водой в качестве жидкости для опрыскивания, которая может применяться для опрыскивания листьев, а также применяться для пропитывания зоны расположения корней.

б. Гранулы

На 94,5 мас.части кварцевого песка в барабанном смесителе распыляют 0,5 мас.части связующего вещества (неионогенного поверхностно-активного вещества) и все компоненты тщательно перемешивают. Затем добавляют 5 мас.частей агента по изобретению в высушенной форме и тщательное смешение продолжают до получения гранулированной препаративной формы с размером частиц в интервале от 0,3 до 0,7 мм (при необходимости гранулы могут быть высушены добавлением 1-5 мас.% талька). Гранулы могут применяться путем внесения в почву вокруг растений, подлежащих обработке.

в. Эмульсионный концентрат

10 мас.частей агента по изобретению смешивают с 10 мас.частями эмульгатора и 80 мас.частями ксилола. Полученный в результате концентрат перед применением разбавляют водой с получением эмульсии требуемой концентрации.

г. Протравливание семян

45 частей агента по изобретению смешивают с 1,5 частями аддукта диамилфенолдекагликолевого эфира/этиленоксида, 2 частями веретенного масла, 51 частью тонкоизмельченного талька и 0,5 частями красителя родамина В. Смесь размалывают в контраплексной мельнице при 10000 об/мин до получения частиц, средний размер которых не превышает 20 мкм. Образовавшийся сухой порошок обладает хорошей прилипаемостью и может применяться для обработки семян, например, путем смешения в течение 2-5 мин в медленно вращающемся сосуде.

Агент по изобретению можно наносить на растения путем опрыскивания поверхности листьев и/или стеблей, его можно применять для обработки почвы путем пропитывания или путем внесения в почву гранул или капсул и его можно наносить на семена в качестве агента для протравливания.

Предпочтительным методом обработки является опрыскивание поверхности листьев и/или стеблей или комбинация перемежающегося опрыскивания поверхности листьев и/или стеблей и обработки почвы путем пропитывания.

Когда агент по настоящему изобретению применяют путем опрыскивания поверхности листьев и стеблей, он также может содержать дополнительные ингредиенты, такие как адъюванты, стабилизаторы, поверхностно-активные вещества и прилипатели, известные в данной области.

При применении композиции для протравливания семян обработку можно проводить в сочетании с адгезивами, или активный агент можно использовать в капсулированной форме, которая может быть получена с помощью известных методов капсулирования.

Применяемое количество агента по изобретению, как правило, составляет от 0,005 до 1,0 г глюкозных эквивалентов на растение или, иными словами, 0,05-2 кг на га и на обработку. Могут требоваться повторные обработки. Глюкозные эквиваленты определяют согласно способу "Anthron" с использованием глюкозы в качестве стандарта [Dische Z. (1962) Color Reactions of Carbohydrates, том "Methods in Carbohydrate Chemistry", (под ред. Whistler R.L., Wolfrom M.L) Academic Press Inc. New York)].

Концентрация, в которой применяют экстракт для индуцирования устойчивости у растений, как правило, составляет от 0,5 до 3,0 г/л глюкозных эквивалентов.

Степень защиты рассчитывают по отношению к контрольным растениям по следующей формуле:

Ниже изобретение поясняется на примерах. Подразумевается, что примеры являются иллюстративными и не ограничивают объем изобретения.

Пример 1: Получение экстракта Penicillium

300 г (сухой вес) отходов мицелия Penicillium chrysogenum, полученных при производстве пенициллина, переносят в стеклянный сосуд типа Duran® объемом 2000 мл, в который добавляют дистиллированную воду до конечного объема 2 л (рН раствора 3,2). Образовавшуюся суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч при 700 об/мин и затем автоклавируют в течение 1 ч при температуре +121°С и давлении 1 бар. После этого горячий сосуд осторожно встряхивают и дают охладиться и выдерживают в течение ночи. Затем все содержимое сосуда фильтруют через бумажные кофейные фильтры 1×10 типа Melitta® и собирают прошедшую через фильтр жидкость, содержащую активный экстракт (далее в настоящем описании обозначен как PEN-экстракт). Содержание сахара (глюкозные эквиваленты) экстрактов определяют согласно способу "Anthron" с использованием глюкозы в качестве стандарта [Dische Z. (1962) Color Reactions of Carbohydrates, том "Methods in Carbohydrate Chemistry" (под ред. Whistler R.L., Wolfrom M.L) Academic Press Inc. New York)].

Обычно PEN-экстракт содержит приблизительно 5 г глюкозных эквивалентов на 1 л и обычно перед нанесением на опытное растение его разбавляют в 2-3 раза.

Пример 2: Обработка томата для защиты от Phytophtora infestants

Растительный и грибной материал

Растения томата (Lycopersicum esculentum) сорта "Baby F1" выращивают в теплице в состоящем из 120 ямок ложе для семян, в смеси, состоящей из 1/3 песка и 2/3 почвы типа TKS1®, при 25°С при световом режиме 16 ч света/8 ч темноты. Через 14 дней отдельные проростки переносят в цветочные горшки диаметром 10 см и выдерживают в таких же условиях выращивания в течение еще 3 недель.

Штамм Phytophtora infestants культивируют на двояковогнутых срезах картофельного клубня (сорт Bintije, полученный из хозяйства по разведению биологического материала) в закрытых пластиковых планшетах в темноте при температуре от +12°С до +16°С и при 60-80%-ной относительной влажности в течение 6-7 дней.

Суспензию инокулята получают, промывая срезы картофельного клубня, которые наиболее сильно покрыты спорулирующим мицелием Phytophtora infestants, 100 мл охлажденной на льду дистиллированной воды. Мицелярный дебрис удаляют фильтрацией и определяют количество спорангиев в смыве, производя подсчеты с помощью микроскопа в камере для подсчета типа "Neubauer".

Непосредственно перед инокуляцией плотность инокулята доводят до 30-40000 спорангиев в мл.

Обработка

Растения томата на стадии 5 настоящих листьев обрабатывают путем пропитывания почвы и/или опрыскивают PEN-экстрактом за 7 и за 3 дня до инокуляции суспензией спорангиев Phytophtora infestants.

Пропитывание: Растения держат сухими в течение 1 дня до обработки и цветочные горшки помещают в планшеты размером 7×7 см для сбора избытка раствора для смачивания. Наносят 60 мл PEN-экстракта, содержащего 1-2 г глюкозных эквивалентов на 1 л. После обработки растения выдерживают в теплице при комнатной температуре без полива в течение 1 дня.

Опрыскивание: Все растение опрыскивают PEN-экстрактом, содержащим 1-2 г глюкозных эквивалента, до полного увлажнения (приблизительно 10-15 мл на растение) с помощью пневматического пистолета для опрыскивания модели JATO 232 FR с давлением 0,5 бар.

После обработки растения выдерживают в теплице до заражения инокулятом. Контрольные растения с целью имитации обработки опрыскивают дистиллированной водой.

Заражение инокулятом

Обработанные или контрольные растения опрыскивают приблизительно 10 мл охлажденной на льду суспензии спорангиев в вентилируемой камере для инокуляции с использованием пневматического пистолета для опрыскивания модели JATO 232 FR с давлением 0,2 бар, покрывая в основном нижнюю поверхность листьев гомогенным слоем мелких капель.

Сразу после инокуляции растения переносят в плексигласовые ящики и выдерживают в темноте при температуре от +12°С до +16°С и 100%-ной относительной влажности в течение 24 ч. Затем их возвращают в теплицу и выдерживают в стандартных условиях, описанных выше.

Оценка

Через 5-6 дней после инокуляции, когда на контрольных растениях становятся заметными типичные симптомы, степень поражения определяют визуально в виде процента пораженной листовой поверхности пяти нижних листьев опытных растений.

Результаты приведены в таблице Iа. Наилучшие результаты получены при комбинации обработки пропитыванием и опрыскивания.

Таблица Iа Индуцированная защита растений томата от Phytophthora infestants с помощью PEN при обработке пропитыванием и опрыскиванием и при комбинированной обработке пропитыванием/опрыскиванием
Обработка^о	Концентрация PEN	% пораженной листовой поверхности	% защиты
П+О	1,5 г/л, 2,0 г/л	4	91
П+О	1,5 г/л, 1,0 г/л	10	75
П+О	1,5 г/л, 0,5 г/л	23,3	50,1
П+О*	2,0 г/л, 1,5 г/л	8	89
2П	1,5 г/л	40	14,3
1П	1,5 г/л	18,3	60,8
2О	1,5 г/л	10	78,6
1О	1,5 г/л	16,7	64,2
контроль, вода		47
Обработка^о	Концентрация PEN	% пораженной листовой поверхности	% защиты
* контроль, вода		73

Данные представляют собой средние значения, полученные по 4 независимым экспериментам. Средняя ошибка ≤9,5%. "П" обозначает пропитывание, "О" обозначает опрыскивание. ^оПервая обработка за 7 дней до инокуляции, вторая обработка за 3 дня до инокуляции. * Это значение получено в другом эксперименте, и поэтому для него также используется другое контрольное значение, приведенное в последнем ряду таблицы Iа.

Пример 3: Обработка картофеля для защиты от Phytophthora infestants

Аналогично способу, описанному в примере 2, защиту растения от Phytophtora infestants индуцируют в растениях картофеля, выращенных из клубней сорта "Bintje", на стадии 4 листьев. Результаты приведены ниже в таблице Iб. Наилучшие результаты получены при обработке методом опрыскивания.

Таблица Iб Индуцированная защита картофеля от Phytophthora infestants с помощью PEN при обработке опрыскиванием и при комбинированной обработке пропитыванием/опрыскиванием
Обработка *	Концентрация PEN	% пораженной листовой поверхности	% защиты
1П+1О	2 г/л, 2 г/л	10	83
1П+1О	1 г/л, 1 г/л	20	67
2О	3 г/л	7	89
2О	2 г/л	3	95
2О	1г/л	8	86
2О	0,5 г/л	27	56
БМК	500 част./млн	23	61
контроль, вода		61	0

Данные представляют собой средние значения, полученные по 3 независимым экспериментам. Средняя ошибка ≤11%. "П" обозначает пропитывание, "О" обозначает опрыскивание. *Первая обработка за 7 дней до инокуляции, вторая обработка за 3 дня до инокуляции. БМК обозначает бэта-масляную кислоту, которую применяли в качестве стандартного химического индуктора.

Пример 4: Обработка растений бобов против Uromyces appendiculatus

Растительный и грибной материал

По два семени фасоли золотистой (Phaseolus aureus) сорта "Musica" выращивают в цветочных горшках диаметром 8 см в смеси, состоящей из 1/3 песка и 2/3 почвы типа TKS1®, при +25°С при световом режиме 16 ч света/8 ч темноты в течение 16 дней. Для исследования из каждого горшка отбирают один проросток перед раскрытием вторых листьев.

Споры штамма Uromyces appendiculatus берут после хранения в криогенных условиях (КРИО) в жидком азоте. Из 1 мг спор получают 1 мл суспензии для инокуляции.

Обработка

Растения фасоли на стадии второго листа или обрабатывают путем пропитывания почвы и/или путем опрыскивания PEN-экстрактом за 7 и за 3 дня до инокуляции суспензией спорангиев Uromyces appendiculatus.

Пропитывание: Растения держат сухими в течение 1 дня до обработки и цветочные горшки помещают в планшеты размером 7×7 см для сбора избытка раствора для пропитывания. В условиях теплицы при комнатной температуре наносят 40 мл PEN-экстракта, содержащего 1-2 г глюкозных эквивалентов на 1 л. После обработки растения выдерживают в теплице в течение 1 дня при температуре +20...+25°С без полива.

Опрыскивание: Все растение опрыскивают PEN-экстрактом, содержащим 1-2 г глюкозных эквивалентов до полного увлажнения с помощью пневматического пистолета для опрыскивания модели JATO 232 FR с давлением 0,5 бар.

После обработки растения выдерживают в теплице до заражения инокулятом. Контрольные растения в качестве имитации обработки опрыскивают дистиллированной водой.

Заражение инокулятом

Обработанные или контрольные растения опрыскивают приблизительно 3 мл суспензии спорангиев в вентилируемой камере для инокуляции с использованием пневматического пистолета для опрыскивания модели JATO 232 FR с давлением 0,2 бар, покрывая нижнюю поверхность листьев гомогенным слоем мелких капель.

Сразу после инокуляции растения переносят в плексигласовые ящики и выдерживают в темноте при температуре +20°C и 60%-ной относительной влажности в течение 24 ч, затем включают свет и растения выдерживают в таких же условиях в течение еще 4 дней. После этого растения возвращают в теплицу и выдерживают в стандартных условиях, описанных выше. Необработанные инокулятом листья удаляют.

Оценка

Через 2 недели после инокуляции, когда на контрольных растениях обнаружена споруляция гриба, степень поражения определяют визуально в виде процента пораженной листовой поверхности обработанных инокулятом листьев. Степень защиты рассчитывают по отношению к контрольным растениям согласно следующей формуле:

Результаты приведены в таблице II. Наилучшие результаты получены при двукратной обработке пропитыванием концентрацией 2 г/л или 0,5 г/л.

Таблица II Индуцированная защита растений фасоли от Uromyces appendiculatus с помощью PEN при обработке пропитыванием и опрыскиванием и при комбинированной обработке пропитыванием/опрыскиванием
Обработка *	Концентрация PEN	% пораженной листовой поверхности	% защиты
2П	2,0 г/л	5	95
2П	1,0 г/л	60	37
2П	0,5 г/л	3	97
1П+1О	2,0 г/л	17	82
1П+1О	1,0 г/л	33	65
1П+1О	0,5 г/л	50	47
2О	2,0 г/л	27	72
2О	1,0 г/л	90	5,3
2О	0,5 г/л	60	37
контроль, вода		87	9

Данные представляют собой средние значения, полученные по 2 независимым экспериментам с использованием в каждом по 4 индивидуальных растения. Средняя ошибка ≤8,5%. "П" обозначает пропитывание, "О" обозначает опрыскивание. *Первая обработка за 7 дней до инокуляции, вторая обработка за 3 дня до инокуляции.

Пример 5: Обработка пшеницы для защиты от Puccinia recondita spp. tritici

Растительный и грибной материал

Десять семян пшеницы (Triticum arvense) сорта "Anna" выращивают в цветочных горшках диаметром 8 см в смеси, состоящей из 1/3 песка и 2/3 почвы типа TKS1® при +25°С при световом режиме 16 ч света/8 ч темноты в течение 7 дней до полного раскрытия первого листа.

Штамм бурой ржавчины Puccinia recondita spp. tritici размножают на этом же сорте пшеницы. Полностью пораженные листья со спорами отрезают и споры распыляют в воду, содержащую 0,05% Tween 20®. Плотность инокулята доводят до 100000 спор/мл.

Обработка

Растения пшеницы на стадии только что раскрывшегося второго листа опрыскивают за 7 и за 3 дня до инокуляции. Все растение опрыскивают PEN-экстрактом, содержащим 1-2 г глюкозных эквивалентов и 0,05% Tween 20 до полного увлажнения с помощью пневматического пистолета для опрыскивания модели JATO 232 FR с давлением 0,5 бар.

Заражение инокулятом

Обработанные или контрольные растения опрыскивают приблизительно 3 мл суспензии спорангиев в вентилируемой камере для инокуляции с использованием пневматического пистолета для опрыскивания модели JATO 232 FR с давлением 0,2 бар, до получения гомогенного слоя мелких капель на всем проростке.

После высыхания капель растения переносят в плексигласовые ящики и выдерживают при температуре +20°C и 60%-ной относительной влажности в течение 24 ч в темноте, затем включают свет и растения выдерживают в таких же условиях в течение еще 4 дней. После этого растения возвращают в теплицу и выдерживают в стандартных условиях, описанных выше.

Оценка

Через 10 дней после инокуляции, когда на контрольных растениях обнаружена споруляция гриба, степень поражения определяют визуально в виде процента пораженной листовой поверхности обработанных инокулятом листьев. Степень защиты рассчитывают по отношению к контрольным растениям согласно следующей формуле:

Результаты приведены в таблице III. Наилучшие результаты получены при обработке фракцией PEN, имеющей молекулярную массу 2-3 кДа, в концентрации 2 г/л.

Таблица III Индуцированная защита растений пшеницы от Puccinia recondita spp. tritici с помощью PEN и фракций PEN с различной молекулярной массой при обработке опрыскиванием
Обработка	Концентрация	% поражения	% защиты
PEN	2,0 г/л	15,9	73,9
PEN	1,0 г/л	42,2	30,9
PEN >30 кДа	4,0 г/л	21,4	65
PEN >10 кДа	2,0 г/л	33,3	45,5
PEN >10 кДа	1,0 г/л	25	59
PEN 2-3 кДа	2,0 г/л	8,9	85,4
PEN 2-3 кДа	1,0 г/л	20	67,3
PEN >300 Да	1,0 г/л	11,1	81,3
PEN >300 Да	0,5 г/л	33,3	45,5
CGA 245704	30 част./млн	31,3	48,8
CGA 245704	60 част./млн	60	20
контроль (состав)		42,9	29,8
контроль (вода)		61,1	0

Данные представляют собой средние значения, полученные по 4 независимым экспериментам. Средняя ошибка ≤10%. CGA 245704, действующее вещество препарата BION®, применяли в качестве стандартного химического индуктора.

Пример 6: Обработка огурцов против Colletotrichum lagenarium и Pseudomonas lachrymans

Растительный и патогенный материал

Растения огурца (Cucumis sativus) сорта "Wisconsin" выращивают в теплице в течение 10 дней в цветочных горшках объемом 40 мл. Colletotrichum lagenarium выращивают в чашках Петри на агаре с растительным соком типа V8 в течение 7 дней при +20°С. Pseudomonas lachrymans выращивают на среде ДДК (дрожжи-декстроза-карбонат кальция) в течение 24 ч при +30°С в колбах Эрленмейера.

Обработка

Раствором для опрыскивания, содержащим 1,5 или 3 г/л глюкозных эквивалента экстракта PEN-A или PEN-B, опрыскивают до полного увлажнения листья, используя специальный колпак для опрыскивания. После обработки все растения инкубируют в теплице при + 22°С в течение 3 или 7 дней. Контрольные растения обрабатывают водой.

Заражение инокулятом

Суспензией спор С. lagenarium (1,2×10⁵ спор/мл) опрыскивают листья растения с помощью брандспойта для опрыскивания типа Velbiss. Растения инкубируют в течение 30 ч при относительной влажности (ОВ) 95% в темноте при +23°С. Затем растения переносят в теплицу с температурой от +22°С до +23°С с нормальной ОВ.

Суспензией Р. lachrymans (10⁸ клеток/мл) опрыскивают листья с помощью брандспойта для опрыскивания типа Velbiss под давлением 2 бара. Перед инокуляцией растения инкубируют при 100% ОВ в течение 4 ч. После инокуляции растения вновь инкубируют в теплице при ОВ 100% и температуре от +23°С до +24°С.

Оценка

Через 6 дней (Р.lachrymans) или 7-8 дней (С.lagenarium) болезнь может быть обнаружена визуально, и в это время оценивают % пораженной листовой поверхности. Результаты обобщены в приведенной ниже таблице.

Обработка до инокуляции за: (дни)	% защитной активности
	PEN-A		PEN-B
	1,5 г/л	3,0 г/л	1,5 г/л	3,0 г/л
Colletotrichum/огурец 3 дн.	96	92	98	96
Colletotrichum/огурец 7 дн.	0	95	0	0
Pseudomonas/огурец 3 дн.	10	10	80	35
Обработка до инокуляции за: (дни)	% защитной активности
	PEN-A		PEN-B
	1,5 г/л	3,0 г/л	1,5 г/л	3,0 г/л
Pseudomonas/огурец 7 дн.	0	20	20	20

Claims

1. Агент, предназначенный для индуцирования у растений устойчивости к фитопатогенным микроорганизмам, где такой агент представляет собой экстракт биомассы, который получен в результате процесса биотехнологической ферментации нефитопатогенных микроорганизмов, за исключением микроорганизмов рода Saccharomyces и процесс получения которого предусматривает:

в) инкубацию,

г) ресуспендирование,

д) охлаждение до комнатной температуры при выстаивании и,

е) необязательно, фильтрацию.

2. Агент по п.1, где биомасса нефитопатогенных микроорганизмов является биомассой гриба, полученной из отходов производства процессов биотехнологической ферментации.

3. Агент по п.1, где нефитопатогенный микроорганизм представляет собой неспецифичный для растения микроорганизм.

4. Агент по любому из предыдущих пунктов, где биомасса получена при ферментации Acremonium spp., Aspergillus spp., Aureobasidium spp., Beauveria spp., Clitopilus spp., Mucor spp., Neocosmospera spp., Phaecilomyces spp., Penicillium spp., Phanerochaete spp., Pullularia spp., Schizosaccharomyces spp., Tolypocladium spp., Trametes spp. и Trichoderma spp.

5. Агент по любому из предыдущих пунктов, где биомасса получена при ферментации Penicillium chrysogenum и Cephalosporium acremonium.

6. Агент по любому из предыдущих пунктов, включающий в качестве активных ингредиентов 1) разветвленные или неразветвленные олигосахариды со степенью полимеризации 2-30, 2) моносахариды и 3) протеины, гликопротеины и/или липопротеины с молекулярной массой <3000 Да.

7. Композиция для индуцирования у растений устойчивости к фитопатогенным микроорганизмам, включающая эффективное количество индуцирующего устойчивость растений агента по любому из предыдущих пунктов в сочетании с приемлемым с сельскохозяйственной точки зрения разбавителем.

8. Композиция по п.7, которая дополнительно содержит один или более пестицидов для защиты растений.

9. Экстракт Penicillium chrysogenum, способный индуцировать у растений устойчивость к фитопатогенным микроорганизмам, полученный с помощью следующего способа:

а) ресуспендирование от 50 г до 200 г (сухой вес) биомассы Penicillium chrysogenum в 1 л неорганического или органического растворителя,

в) инкубацию,

г) ресуспендирование,

е) необязательно фильтрацию.

10. Экстракт по п.9, где экстракт индуцирует устойчивость у растений при применении в концентрации 0,5-3,0 г/л глюкозных эквивалентов.

11. Способ индуцирования устойчивости у растений к фитопатогенным микроорганизмам, предусматривающий обработку растений, почвы или семян эффективным количеством агента по любому из пп.1-6.

12. Способ получения агента, предназначенного для индуцирования у растений устойчивости к фитопатогенным микроорганизмам, где такой агент представляет собой экстракт из биомассы нефитопатогенных микроорганизмов, включающий следующие стадии:

в) инкубацию,

г) ресуспендирование,

е) необязательно, фильтрацию.