Tarifnameye göre tercih edilen selatlayici gruplar, asagidaki formüle (II) sahip olanlari Yukaridaki formülde (II), :0 kismi piridin halkasinin herhangi bir karbonuna baglanan bir keto-grubunu temsil eder, -OH piridin halkasinin herhangi bir atomuna baglanan bir hidroksi kismi temsil eder ve -RL hidroksipiridinori kismini genel oktadentat Iigandini olusturmak üzere diger kompleks yapici kisimlara baglayan baglayici bir kismi temsil eder. Burada açiklanan herhangi bir baglayici kisim, tüm topolojilerin metil, etil, propil, bütil, pentil ve/veya hekzil gruplari dahil olmak üzere C1 ila C8 alkil, alkenil veya alkinil grubu dahil olmak üzere C1 ila C8 hidrokarbili gibi kisa hidrokarbil gruplari dahil olmak üzere RL olarak uygundur. RL bir karbon veya nitrojen atomu gibi piridin halkasinin herhangi bir atomunda formülün (ll) halkasi ile birlesebilir. RL gruplari, akabinde diger bir selatlayici kisma, diger bir baglayici kisma ve/veya (burada açiklandigi üzere) bir halka veya diger bir kalip gibi merkezi bir atoma veya gruba direkt olarak baglanabilir. Baglayicilar, selatlayici gruplar ve istege bagli kalip kisimlar uygun bir oktadentat Tercih edilen bir düzenlemede, formülün (II) -OH ve :O kisimlari, piridin halkasinin hidroksipiridinon deriveleri oldukça uygundur. Tarifnamenin bir açisinda, burada OH grubu veya RL baglayici kismi piridin halkasinin nitrojenin üzerinde bulunur, RN grubu genel olarak bulunmayacaktir. Bulusa göre, RN mevcuttur ve sübstitüeli veya sübstitüeli olmayan hidrokarbil gruplari, özellikle burada belirtilen kisa hidrokarbil gruplarindan Seçilir. Tercih edilen bir düzenlemede, en az bir 3,2- hidroksipiridinon kismi, oktadentat Iigand yapisinda mevcuttur. Bu, burada belirtilen çesitli sübstitüent kisimlarin herhangi biri tarafindan açik bir sekilde sübstitüe edilebilir. Her bir formül (II) kismi iki potansiyel olarak kompleks yapici oksijene sahiptir, mevcut tarifnamenin bir açisi, en az 2, tercihen en az 3 ve en çok tercihen 4 bagimsiz olarak seçilen formüle (l) ait kismi içeren oktadentat bir ligandi saglar. Her birformül (Il) kismi, bagimsiz bir sübstitüsyon modeline sahip olabilir, ancak tercih edilen bir açida, en az bir kisim bir 3,2-hidroksipiridinon kismidir. Ligand, (burada açiklandigi üzere uygun olarak sübstitüe edilen) 2, 3 veya 4 3,2- hidroksipiridinon kisimlarini Içerebilir. Oktadentat Iiganddaki her bir formül (I veya II) kismi, burada tartisildigi üzere ve herhangi bir uygun topolojide herhangi bir uygun baglayici grup tarafindan Iigandin geri kalani ile birlestirilebilir. Örnegin, formülün (I) dört grubu lineer bir Iigand olusturmak üzere bunlarin baglayici gruplari ile bir omurgaya birlestirilebilir veya lineer veya siklik olabilen bir "oligomer" tipi yapi olusturmak üzere baglayici gruplar ile köprülenebilir. Alternatif olarak, formülün (l ve/veya II) Iigand kisimlari, her biri bir baglayici (örnegin, birlestirilebilir. Baglayici (RL) kisimlar, bir amin, amid, ester, eter, tiyo-eter veya disülfid bagi dahil olmak üzere herhangi bir uygun saglam fonksiyonellik ile diger selatlayici gruplar, bir omurga, kalip, birlestirici kisim veya diger bir baglayici ile yalnizca karbon- karbon baglari yoluyla birlestirilebilir veya birbirine baglanabilir. Mevcut bulusa göre bir "yildiz" düzenlemesi, asagidaki formülde (III) belirtilir: Burada, tüm gruplar ve pozisyonlar istemlerde belirtilir. "T" bir karbon atomu, (burada yukarida açiklananlardan herhangi biri gibi) hidrokarbil zincir, (heterosiklik halkalar dahil olmak üzere) alifatik veya aromatik halka veya kaynasmis halka sistemi gibi bir kalip grubudur. En temel kalip, akabinde bunlarin baglayici gruplari ile her bir selatlayici kisma baglanabilen tek bir karbon olabilir. Etil veya propil gibi daha uzun zincirler, kalibin her bir ucuna baglanan iki selatlayici kisim ile esit olarak uygulanabilir. Açikça, herhangi bir uygun saglam baglanti, karbon-karbon baglari, ester, eter, amin, amid, tiyo-eter veya disülfid baglari dahil olmak üzere kalibin ve baglayici kisimlarin birlestirilmesinde kullanilabilir. Formülün (III) yapisinda, gruplar (RN ve RL) ayni grup olabilir, böylece selatlayici kisimlar piridin halkasinin nitrojen atomu yoluyla kaliba (T) baglanir. Bu, asagidaki tipin (IIIb) yapilarini saglar: Açik bir sekilde, formülün (II III, IIIb, IV ve IVb) yapilarinda, baska bir sekilde sübstitüe edilmeyen (örnegin, bir baglayici veya birlestirici kisim yoluyla) piridin halkasinin (halkalarinin) bu pozisyonlari, uygun olarak Formüldeki (I) R1 ila Rs'e yönelik açiklanan sübstitüentleri tasiyabilir. Özellikle, metil, etil veya propil gruplari gibi küçük alkil sübstitüentleri herhangi bir pozisyonda bulunabilir. Oktadentat Iigand, ilaveten yukarida açiklandigi üzere en az bir baglayici kisim içerecektir. Bu örnegin, burada belirtilenlerin herhangi biri dahil olmak üzere herhangi bir uygun yapi olabilir ve hedefleyici kisim ile bitecektir, spesifik bir baglayici veya fonksiyonel bir grup bu tür bir hedefleyici kisma veya spesifik baglayiciya baglanabilir. Birlestirme kismi, formülde (III) belirtildigi üzere a), b) ve/veya c) noktalarinda oldugu gibi baglayici, kalip veya selatlayici kismin herhangi bir uygun noktasina baglanabilir. Birlestirici kismin baglanmasi, karbon-karbon baglari, ester, eter, amin, amid, tiyo-eter veya disülfid baglari gibi herhangi bir uygun saglam baglanti ile yapilabilir. Benzer bir sekilde, hedefleyici kisma herhangi bir bu tür baglantiyi olusturabilen gruplar birlestirici kismin fonksiyonel ucu için uygundur ve bu kisim hedefleyici kisma baglandiginda bu tür gruplar ile bitecektir. Mevcut bulusa göre alternatif bir "omurga" tipi yapi, asagidaki Formülde (IV) belirtilir: Burada tüm gruplar ve pozisyonlar istemlerde belirtildigi gibidir ve "R3" ilaveten burada belirtilen baglayici kisimlarin herhangi biri ile tipik olarak benzer yapiya ve fonksiyona sahip olacak olan bir omurga kismidir ve bu yüzden baglayici bir kismin herhangi bir tanimi baglama göre uygun oldugunda omurga kismina uygulamak üzere alinmalidir. Uygun omurga kisimlari, selatlayici kisimlarin bunlarin baglayici gruplari yoluyla baglanmasi üzerine bir iskele olusturacaktir. Genellikle, üç veya dört omurga kismi gereklidir. Tipik olarak, lineer bir omurgaya yönelik üç veya omurganin siklize edilmesi halinde dört olacaktir. Özellikle, tercih edilen omurga kisimlari istege bagli olarak bir veya her iki uçta bir heteroatoma veya fonksiyonel bir kisma sahip (burada açiklananlar gibi) kisa hidrokarbon Zincirlerini içerir. Amin ve amid gruplari, bu açidan özellikle uygundur. Birlestirici kisim, formülde (IV) belirtildigi üzere a), b) ve/veya c') noktalarinda oldugu gibi baglayici, omurga veya selatlayici kismin herhangi bir uygun noktasina baglanabilir. Birlestirici kismin baglanmasi, karbon-karbon baglari, ester, eter, amin, amid, tiyo-eter veya disülfid baglari gibi herhangi bir uygun saglam baglanti ile yapilabilir. Benzer bir sekilde, hedefleyici kisma herhangi bir bu tür baglantiyi olusturabilen gruplar, birlestirici kismin fonksiyonel ucuna yönelik uygundur ve bu kisim hedefleyici kisma baglandiginda bu tür gruplar ile bitecektir. Formülde (III) oldugu üzere, formülün (IV) yapisinda, gruplar (RN ve RL) ayni grup olabilir, böylece selatlayici kisimlar piridin halkasinin nitrojen atomu yoluyla Omurgaya (R5) baglanir. Bu, asagidaki tipin (IVb) yapilarini saglar: Amid baglayici gruplari ile bir omurgaya baglanan iki 1,2 ve iki 3,2-HOPO selatlayici kisma sahip "omurga" tipi bir oktadentat Iigandin bir örnegi, asagidaki formül (V) olabilir: r' 1› f" r] r'- 1 p] r' Her biri etil amid gruplari ile sirasiyla etil ve propil diamine baglanan dört 3,2-HOPO selatlayici kisma sahip olan örnek niteligindeki "kalipli" oktadentat Iigandlar, asagidaki formüller (VI ve VII) olabilir: Yukaridaki formüllerde, 3,2-HOPO kisimlarinin serbest nitrojenlerinin, metil gruplari ile sübstitüe edildigi dikkate alinacaktir ve metil veya etil gibi küçük hidrokarbil gruplari bu pozisyonda tercih edilir (Formülde (I) R1 veya formülde (Il) RN). HOPO halkasindaki nitrojen ile amin siklana baglanan dört 3,2-HOPO selatlayici kisma sahip örnek niteligindeki bir "kalipli" oktadentat Iigand (referans), asagidaki formül (VIII) olabilir: VIIIYukarida belirtildigi üzere, oktadentat Iigand tipik olarak Iigandin geri kalani ile herhangi bir noktada birlesebilen bir birlestirici kisim içerecektir. Bu düzenlemeye göre. birlestirici kismi bitiren fonksiyonlu bir kisim ile örnek niteligindeki bir bilesik, asagidaki yapidir /lâv' 'H lwl Han Referans ayrica Gordon AEV et al, Rational design of sequestering agents for 7379-7383'e yapilir. Bulus ayrica eklenen Sekiller ile gösterilir, burada: Sekil 1 - Oda sicakliginda 15 dakika sonra DMSO (teorik oran 23) içinde 232Th4"'(HN03) ve 1 mg/mL ALG-DD-NCS reaksiyon karisiminin kromatogramini miktarlari mevcuttur ve serbest ALG-DD-NCS Iigandin izine (tR = 5.36) rastlanmamistir. Sekil 2 - kütle spektrumunu gösterir. Sekil 3 - Oda sicakliginda 15 dakika sonra DMSO (teorik oran 223) içinde Fe3*(HN03) ve 1 mg/mL ALG-DD-NCS reaksiyon karisiminin kromatogramini gösterir. Fe-ALG-DD- NCS (tR = 5.81 dakika; m/z 11535) kompleksinin önemli miktarlari mevcuttur ve serbest ALG-DD-NCS Iigandinin izine (tR = 5.36 dakika) rastlanmamistir. Sekil 4 - Fe-ALG-DD-NCS kompleksinin (m/z 1153.3002) kütle spektrumunu gösterir. Sekil 5 - Oda sicakliginda 15 dakika sonra DMSO (teorik oran ve 1 mg/mL ALG-DD-NCS reaksiyon karisiminin kromatogramini gösterir. In-ALG-DD-NCS (tR = 5.95 dakika; m/z 12125) kompleksinin önemli miktarlari mevcuttur ve serbest ALG-DD-NCS Iigandinin izine (tR = 5.36 dakika) rastlanmamistir. Sekil 6 - In-ALG-DD-NCS kompleksinin (m/z 1212.2666) kütle spektrumunu gösterir. Sekil 7 - Oda sicakliginda 10 dakika sonra asetat-tamponun içinde. pH 5.5, (teorik oran 13). kompleksinin ve serbest ALG1005-38 Iigand (tR = 3.20) kalintilarinin önemli bir miktari mevcuttur. Sekil 8 - kütle spektrumunu gösterir. Sekil 9 - Oda sicakliginda 10 dakika sonra asetat-tamponun içinde, pH 5.5, F83+(HN03) ve 1 mg/mL ALG1005-38 reaksiyon karisiminin kromatogramini gösterir (teorik oran ve serbest ALG1005-38 Sekil 11 - Oda sicakliginda 10 dakika sonra asetat-tamponun içinde, pH ve 1 mg/mL ALG1005-38 reaksiyon karisiminin kromatogramini gösterir (teorik oran kompleksinin önemli miktarlarini ve sadece Serbest ALG1005-38 Iigandinin (tR = 3.21) izleri mevcuttur. Sekil 13 - Oda sicakliginda 10 dakika sonra asetat-tamponun içinde, pH ve 1 mg/mL ALG1005-38 reaksiyon karisiminin kromatogramini gösterir (teorik oran kompleksinin ve serbest ALG1005-38 Sekil 15- Oda sicakliginda 15 dakika sonra ve 1 mg/mL Bb-1-HOPO-1- DEBN (teorik oran 2:3) reaksiyon karisiminin kromatogramini gösterir. 232Th-Bb-1- HOPO-1-DEBN (tr = 3.52) kompleksinin önemli miktarlari mevcuttur. Üst iz: m/z 12225 olan kütle kromatogrami. Alt iz: 330 nm`de UV. Sekil 16- kütle spektrumunu gösterir. Sekil 17- bozunma ile düzeltilen 227Th-aktivitesi (cpm) olarak gösterilen 0-7. günde SK- OV-3 hücre pelletlerine baglanan 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab ve serbest 227Th'nin edilen SK-OV-3 hücrelerine yönelik normalize lüminesans degerleri gösterir. hücrelerinin klonojenik bir analizini gösterir (Ortalama ± SD; n = 3). hücrelerinin klonojenik bir analizini gösterir. (Ortalama ± SD; n = 3) Sekil 21 - 24 saat ve 4 gün boyunca biyolojik dagilimdan sonra SK-OV-3 ksenogreftleri ile BaIb/c çiplak farelerde organlara dagilimini gösterir. (Ortalama ± SD; n = 5) Bulus bu noktada asagidaki Örnekler ile açiklanacaktir. Örneklerde örnek verilen tüm bilesikler (örnekler 12, 13 ve 15 haricinde), (tercih edilen ara ürünler ve öncüler dahil olmak üzere) bulusun tercih edilen düzenlemelerini olusturur ve tek basina veya baglama göre uygun oldugu yerde herhangi bir açida herhangi bir kombinasyon halinde kullanilabilir. Bu yüzden, örnegin, Örnek 2'ye ait bilesikler 2 ila 4, Örnek 3,e ait bilesik 10 ve Örnek 4'e ait bilesik 7'nin her biri veya hepsi, bunlara ait çesitli tiplerin tercih edilen düzenlemelerini olusturur. Örnek 1 -Saf toryum-227*nin izolasyonu bozunmasi yoluyla üretilmistir. Toryum-227, anyon degisim kromatografisi ile 8 M HNOa solüsyonunun içinde bir Aktinyum-227 bozunma karisimindan seçici olarak gözcük, nitrat form) içeren bir kolon kullanilmistir. Aktinyum-227'den sonra, Radyum- 223 ve yavrulari kolondan ayrilmistir, Toryum-227 12 M HCI ile kolondan özütlenmistir. T0ryum-227'yi içeren eluat, kurumak üzere buharlastirilmistir ve kalinti 0.01 M HCI içinde tekrardan süspanse edilmistir. Örnek 2- ALG-DD-NCS Sentezi HNf IIN O NHBO: .. 3',- ` / '\ . i4 `F' \ __- 3-benzil0ksi-1-metiI-4-(2-tiyoksotiyazolidin-1-iI)karboniI-2(1H)-piridinon (Raymond, K.; mmol) ve DMAP (5 mg), diklorometan (80 mL) içinde bir [5-Amino-6-((2-amino-etiI)-{2- sentezlenen) (0.204 9, 0.505 mmol) solüsyonuna eklenmistir. Bu karisim, bir gece oda sicakliginda karistirilmistir ve akabinde kurumak üzere buharlastirilmistir. Kalinti diklorometanin içinde çözünmüstür ve bir flas silika jel kolonun üzerine yüklenmistir ve diklorometanin içinde bir %2-8 metanol gradyani ile ayristirilmistir. Uygun fraksiyonlar, toplanmistir ve soluk bej kalin yag olarak ALG-001 (1) (~0.4 g) vermek üzere kurumak üzere buharlastirilmistir. MS (ESI, pos): m/z1369 [M+H]*, m/z 1391 [M+Na]* sicakliginda 40-45 psi altinda hidrojenize edilmistir. Döner buharlastirma islemini takiben filtrasyon sarap kirmizisi rengine sahip kalin yag olarak ALG-DEBN (2) (~260 mg, asetik asit izleri ile) vermistir. MS (ESI, pos): m/z1007 [M+H]*, m/z 1029 [M+Na]+ ALG-DEBN (2) (70 mg), ortam sicakliginda 211 MeOH/diklorometanin (15 mL) içinde çözünmüstür. Akabinde, 0.5 9 temizlenmis Amberlyst-15 reçine eklenmistir ve karisim bir gece yavasça karistirilmistir. Reçine akabinde filtrasyon ile ayrilmistir ve hekzan (10 mL), tetrahidrofuran (10 mL) ve metanol (10 mL) ile sirasiyla yikanmistir. Bu amin-bagli reçine, 4 M amonyak metanolik solüsyonuna (20 mL) transfer edilmistir ve 50 dakika yavasça karistirilmistir. Tetrahidrofuran (10mL), korumasiz ürünlerin tümünü çözmek üzere eklenmistir. Reçine akabinde filtrasyon yoluyla uzaklastirilmistir ve solüsyon ALG-DEBN-DEBOC (3) (37 mg) vererek buharlastirilmistir. MS (ESl, pos): m/z 909 [M+H]*, m/z 931 [M+Na]+ süspansiyonu, kloroform ( solüsyonu ile reakte edilmistir. Reaktanlar, MS analizine yönelik bir numune alinirken 30 dakika oda sicakliginda karistirilmistir. Beklenen kütleye (1100) karsilik gelen pikler, gözlenmistir. Yaklasik olarak 95 mg`lik açik kahverengi bir kati, vakum altinda uçucularin uzaklastirilmasindan sonra izole edilmistir. Açik kahverengi kati, asetonitrilin içinde süspanse edilmistir ve karisim 15 dakika reflüks altinda isitilmistir. Karisim oda sicakligina sogutulmustur, akabinde 26 mg ALG-DD-NCS (4) kahverengi kati olarak filtrasyon yoluyla izole edilmistir. Örnek 3 - Simetrik 3,2-HOPO içeren bir selatörün sentezi. . oi-i OMs l 80 HD / s MsO / \ / \ 2 NO 3 NO: 4 NO BOUHN "V N' " 'N 6 `NHBoic ` i 'l HN &0 H.." * '~ HM 'O Q: ,14 ,xJ Q` ,lL_ __i A 08"? ~' "V H *L 0 UHri A (JF'nU r^v M". (1 (JFln "CT/für, `nl-AA."/N al H' - .ý'ffo-U (J.-_._,r,..4L\-}v__,^` N xx?.. .\ '-. N.-^...›l,,.__-.L-›.`Ff_(J içn ' `s`(1 ag** JÖ'(3 B ;NV 'nun 9 /N`Tr OF'ri Sodyum hidrit (mineral yagin içinde %60 dagilim ile 60.1 9. 1.5 mol, 5 esdeger). bir sisenin içinde yüklenmistir ve tetrahidrofuran (1 L) eklenmistir. Dimetil malonat ( 1.5 saat damlatilarak eklenmistir; reaksiyon karisiminin sicakligi + 10°C'nin altinda tutulmustur. Reaksiyon karisimi akabinde tetrahidrofuran ( içinde bir 4-nitr0benzil bromid (65.0 9, 0.3 mol, 1 esdeger) solüsyonu, yukarida-hazirlanan karisima siddetli çalkalama altinda 30 dakika boyunca yavasça eklenmistir. 0°C'de 30 dakika karistirmadan sonra, reaksiyon karisimi tuzlu su (1 L doymus NaCI solüsyonu) içine dökülmüstür ve beyaz bir çökelti vererek bir gece ortam sicakliginda karistirmaya birakilmistir. Karisim akabinde metil teri-bütil eter ile seyreltilmistir ve çökelti filtrelenmistir ve sicak etanolün içinde çözünmüstür. Etanolik karisim filtrelenmistir ve filtrat 24.8 9 (%31) dimetil (4-nitrobenzil)propanedioatin (1) beyaz, kristalin bir kati olarak çökeldigi küçük bir hacme konsantre edilmistir. LC Safligi: %90 (254 nm) MS (APCI pos) m/z 285.1 [M+NH4]+ Bilesik 1 (24.8 9, 92.7 mmol), tetrahidrofuran ( içinde çözünmüstür ve boran- dimetil sülfid kompleksine ( eklenmistir. Reaksiyon karisimi, 24 saat reflükse edilmistir ve akabinde bir gece ortam sicakliginda kalmasina izin verilmistir. Metanol ( içine dökülmüstür ve etil asetat ile özütlenmistir. Kombine organik ekstraktlar, Na2804 üzerinde kurutulmustur ve vakum ile konsantre edilmistir. Kalinti, metanol ile birlikte- 1,3-diol (2) vererek flas kromatografi ile saflastirilmistir. LC Safligi: %92 (254 nm) Bilesik 2 (10.0 9, 47.3 mmol), diklorometan ( içinde çözünmüstür ve trietilamin ( eklenmistir. Reaksiyon karisimi, bir buz-banyosunda sogutulmustur ve metansülfonil klorid ( parçalar halinde eklenmistir. Nihai karisimin bir gece ortam sicakligina ulasmasina izin verilmistir. Ilave trietilamin ( akabinde eklenmistir ve karistirma dakika devam etmistir. Reaksiyon karisimi, akabinde diklorometan ile seyreltilmistir ve olusturulan çökelti filtrelenmistir. Diklorometan filtrat, doymus aköz NaH003 solüsyonu, 0.5 M aköz HCI ve tuzlu su ile yikanmistir, Na2804 üzerinde kurutulmustur ve ek saflastirma yapilmadan bir sonraki adimda kullanilan turuncu bir yag olarak 14.5 9 (%83) 2-(4-nitrobenzil)propan-1,3-diil dimetansülfonat (3) vererek vakum ile konsantre edilmistir. LC Safligi: %87 (254 nm) MS (APCI pos) m/z 385.3 [M+NH4]* Bilesik 3 (14.5 9, 39.5 mmol), metil etil keton ( içinde çözünmüstür, sodyum isitilmistir. Ortaya çikan beyaz çökelti filtrelenmistir ve metil etil keton ile yikanmistir ve filtrat vakum ile konsantre edilmistir. Ham ürün, metil teri-bütil eterden tritüre edilmistir vererek flas kromatografi ile saflastirilmistir. LC Safligi: %90 (254 nm) Dietilen triamin ( tetrahidrofuran ( içinde çözünmüstür ve buz-banyo içinde sogutulmustur. Tetrahidrofuran ( solüsyonu, akabinde 2.5 saat damlatilarak eklenmistir. Reaksiyon karisimi, bir gece ortam sicakligina ulasmadan önce ilave 1 saat O°C`de karistirilmistir. Reaksiyon karisimi akabinde vakum ile konsantre edilmistir. Kalinti, diklorometan içinde çözünmüstür ve 1 M aköz NaOH ile yikanmistir. Organik faz, Na2804 üzerinde kurutulmustur ve vakum ile konsantre edilmistir. Ham materyal, sari bir viskoz yag olarak 20.0 9 (%66) di-terI-bütil (iminodietan-2,1-diil)biskarbamat (5) vererek flas kromatografisi ile saflastirilmistir. etil morfolin (, kuru tolüen (35 mL) içinde çözünmüstür ve reaksiyon karisimina eklenmistir. Karisim, 5 gün 105°C'de bir basinç reaktöründe inkübe edilmistir. Reaksiyon karisimi, akabinde ortam sicakligina sogutulmustur, etil asetat ile seyreltilmistir ve doymus aköz NaHC03 solüsyonu ile yikanmistir. Kombine organik ekstraktlar, su ve tuzlu su ile yikanmistir, Na2804 üzerinde kurutulmustur ve vakum ile konsantre edilmistir. Ham ürün, sari bir kati köpük olarak 11.4 9 (%70) bilesigi 6 vererek flas kromatografisi ile saflastirilmistir. LC Safligi: %96 (210 nm) 4Boc]+ içinde 9 M bir HCI solüsyonuna eklenmistir. Reaksiyon karisimi, bir gece ortam sicakliginda karistirilmistir ve akabinde bej bir kati olarak bilesige 7 ait 1.9 9 HCI tuzu vererek vakum ile kurumak üzere konsantre edilmistir Bilesige 7 ( on ( içinde bir DBU (2.3 mL, .5 mmol, 6 esdeger) solüsyonu, akabinde 40 dakika yavasça eklenmistir. Karistirma ortam sicakliginda bir gece devam etmistir. Reaksiyon karisimi akabinde diklorometan ile seyreltilmistir ve doymus aköz NaHCOa solüsyonu ile yikanmistir. Kombine organik ekstraktlar su ve yari-doymus tuzlu su ile yikanmistir, akabinde Na2804 üzerinde kurutulmustur ve vakum ile konsantre edilmistir. Ham ürün, ilave saflastirma olmadan bir sonraki adimda kullanilan sari yag olarak 4.0 9 bilesigi 8 elde etmek üzere flas kromatografi ile saflastirilmistir. MS (APCI pos) m/z1347.7 [M+H]* Bilesik 8 (4.0 9, 2.6 mmol), asetik asit (2 (C üzerinde %20 w/w, %50 islatilmis) (800 mg, %10 w/w) eklenmistir. Reaksiyon karisimi, bir gece ortam sicakligindaki 30 bar hidrojen basincinda bir Parr basinç reaktöründe karistirilmistir. Reaksiyon karisimi, akabinde bir Celite® pedi yoluyla filtrelenmistir ve filtrat vakum ile konsantre edilmistir. Ham ürün, bej bir köpüklü kati olarak bilesigi 9 vermek üzere flas kromatografi ile saflastirilmistir. Bilesik 9 (996 mg), asetik asit ( içinde çözünmüstür, akabinde 6 M aköz HCI ( eklenmistir. Reaksiyon karisimi, bir gece 8 bar hidrojen basincinda bir basinç reaktöründe karistirilmistir ve akabinde bir Celite® pedi yoluyla filtrelenmistir. Filtrat vakum ile konsantre edilmistir ve tolüen ve metanol ile birlikte buharlastirilmistir. Kalinti, metanol içinde çözünmüstür ve dietil eterin eklenmesi ile çökelmistir. Olusturulan bej çökelti filtrelenmistir ve bilesige 10 ait 700 mg HCI tuzu, ALG1005-38 vererek bir gece vakum ile kurutulmustur. Örnek 4 - Alternatif simetrik 3,2-HOPO içeren bir selatörün sentezi. XOÄNNNWNÄOk ioÄNA/NWNÄO/k . ()\irN\/\N/\/N\/\N/\/NTUW< HNMNÄO/û içinde bir imidazol (8.0 9, 117 mmol) solüsyonuna eklenmistir. Reaksiyon karisimi, bir saat karistirilmistir. Reaksiyon karisimi, 50mL su ile iki kez yikanmistir, Na2804 üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve vakum ile azaltilmistir. Kalinti, 25mL tolüen içinde çözünmüstür ve tris(2-aminoetil)amin (8.19 9, 56 mmol) eklenmistir. Reaksiyon karisimi, 60°C'de 2 saat karistirilmistir ve vakum ile azaltilmistir. Kalinti 125 mL diklorometan içinde çözünmüstür ve su ile yikanmistir (50mL ile 4 kez), N82804 üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve vakum ile azaltilmistir. Kuru flas kromatografi (%1 trietilamin ile diklorometan içinde %0 - 15 metanol), kalin renksiz bir yag olarak di- %70) vermistir. edilen veri ile uyumlu olmustur. tetrahidrofuran içinde çözünen Bilesik 1 (10.4 9, 30 mmol) eklenmeden önce 10 dakika karistirilmistir. Reaksiyon karisimi 4 saat karistirilmistir ve vakum ile azaltilmistir. Kuru flas kromatografi ile saflastirma (diklorometan içinde %0 - 40 tetrahidrofuran), oldukça viskoz biraz sari bir yag olarak di-tert-bütil (((2-(3-(Cbz- MS (ESI, pos): m/z 574.3[M+Na]+ di-tert-bütil (((2-(3-(Cbz-amino)propanamid0)etil)azanediil)bis(etan-2,1-diil)dikarbamat mol) damlatilarak eklenmistir. Reaksiyon karisimi, ortam sicakliginda bir saat karistirilmistir. Reaksiyon karisimi, renksiz bir katinin çökelmesine yol açarak 100mL eter eklenmeden önce vakum ile yaklasik olarak 1/3 hacme azaltilmistir. Katilar filtrelenmistir, eter ile yikanmistir ve renksiz bir kati olarak benzil (3-((2-(bis(2- ~%100) vererek vakum ile kurutulmustur. MeOD): 726-739 (m, 5H) karistirilmistir. 200mL tuzlu su ve 500mL kloroform eklenmistir, fazlar ayrilmistir ve aköz faz 3 x 100mL kloroform ile özütlenmistir. Kombine organik fazlar, 100mL tuzlu su ile yikanmistir, N82804 üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve vakum ile azaltilmistir. Flas kromatografi (diklorometan içinde %0 - 10 metanol), sari bir kati olarak tetra-tert- bütil (((((2-3-Cbz-aminopropanamid0)etil)azanediil)bis(etan-2,1- vermistir. MS (ESI, pos): m/z 946.7[M+Na]+ 0.17 mol) damlatilarak eklenmistir. Reaksiyon, bir saat ortam sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon karisimi, vakum ile yaklasik olarak 10mL`ye azaltilmistir ve 50mL asetonitril eklenmistir, çökelmeye neden olmustur. Kati filtrelenmistir, asetonitril ile yikanmistir ve renksiz bir kati olarak benzil (3-((2-(bis(2- aminoetil)amino)etil)amino)etil)amino)-3-oksopr0pil)karbamat hepta-hidroklorid (5) (2.88 g, 3.7 mmol, ~%100) vererek vakum ile kurutulmustur. MeOD): 7.47(m, 5H) eklenmistir. Reaksiyon karisimi, bir gece karistirilmistir ve vakum ile azaltilmistir. Flas kromatografi (diklorometan içinde %0 - 10 metanol), açik kahverengi bir kati olarak (, 6.62(d, ivis (ESI, pos): m/z 766.9[M+2Na12+ Bilesik 6, Bb-1-HOPO-1-DEBN'yi (7) vermek üzere Örnek 2'de açiklandigi üzere öncelikli olarak çözünmüstür ve benzil gruplarindan arindirilmistir. Örnek 5 - ALG-DD-NCS ile selgsvon deneyleri Bir reaksiyon solüsyonu, DMSO (Biotech dereceli solvent %998) içinde kati ALG-DD- NCS'nin (Örnek 2"deki 4) 1 mg/mL'ye çözünmesi ile hazirlanmistir. Farkli metaller ile selasyon reaksiyonlari, 1 mg/mL reaksiyon solüsyonunun seçilen metal solüsyonlar ile 32 olan bir Iigand-iIa-metal orani kullanilarak karistirilmasi ile yürütülmüstür. Test için metal iyonlar su unsurlardan gelmistir: 232Th-solüsyonu %2 HN03 (Perkin Elmer Pure Plus), %2 HN03 (Perkin Elmer Pure Plus) içinde Fe3*- solüsyonu ve InCI3 (anhidröz toz %99.999+, Aldrich), 0.01 M HCI içinde çözünmüstür. Reaktiflerin, 5 pL reaksiyon karisiminin analiz için bir LC-MS'nin üzerine enjekte edilmesinden önce oda sicakliginda 15 dakika reakte olmasina izin verilmistir. Sonuçlar, metal-ALG-DD-NCS komplekslerinin 232Th4*, Fe3+ ve in" metallerine yönelik nicel olarak olusturuldugunu göstermistir. LC-MS kromatogramlari ve 232Th-ALG-DD- NCS, Fe-ALG-DD-NCS ve In-ALG-DD-NCS komplekslerinin spektrasi Sekiller 1-6'da gösterilir. LC-MS kosullari asagidaki gibi olmustur: ayirma mobil faz A olarak HzO içinde %0.05 formik asit ve mobil faz B olarak asetonitril içinde %0.05 formik asit kullanilarak yapilmistir. Gradyan bilesimi ve akisi Tablo 3'te gösterilir. Süre (dakika) Akis (mL/dakika) % A % B 2.0 0.6 95 5 9.0 0.8 40 60 9.1 0.8 10 90 .0 0.8 10 90 .1 0.8 95 5 11.4 0.8 95 5 11.5 0.6 95 5 12.0 0.6 95 5 Kütle spektroskopisi analizi, ~ 450-1950 Da`lik bir edinim kütle agirligi, bir molarite ES+, 3.0 kV bir kapiler, 20 V'Iik bir konik voltaji ile 1.000 saniye üzerinde tarama kullanilarak bir Xevo-ToF-1 aletinin üzerinde gerçeklestirilmistir. Örnek 6 - AI_.G1005-38 ile selgsvon denevleri Doymus bir solüsyon, MeOH (LC-MS derecesi) içinde ALG1005-38'in (Örnek 3'te 10) mg/mL'ye çözünmesi ile hazirlanmistir. 10 mg/mL'Iik doymus solüsyon, 1 mg/mL'Iik bir ALG1005-38 reaksiyon solüsyonu elde etmek üzere MeOH ve 1:8:1 oranina sahip 0.5 M NaOAc-tamponu (pH 5.5) ile seyreltilmistir. Farkli metaller ile selasyon reaksiyonlari, 1 mg/mL'Iik reaksiyon karisiminin Örnek 5'te belirtildigi üzere seçilen metaller ile karistirilmasi yoluyla gerçeklestirilmistir ve ek olarak GaCIa (anhidröz M HCI içinde çözünmüstür. Reaktiflerin oda sicakliginda 10 dakika reakte olmasina izin verilmistir. Nihai olarak, reaksiyon karisimlari analiz için bir LC-MS'nin üzerine 5 pL enjekte edilmesinden önce formik asit (%01) ile 10-kez seyreltilmistir. LC-MS ayirmasi ve analizi, koni voltajinin 35 V olmasi haricinde Örnek 5`te açiklandigi üzere gerçeklesti rilmistir. yönelik kayda deger miktarlarda olusturuldugunu göstermistir. LC-MS kromatogramlari komplekslerinin spektrasi. Sekiller 7-14"te gösterilir. Örnek 7 - Sb-1-HOPO-1-gBN ile selasvon denevi Doymus bir solüsyon, DMSO (Biotech dereceli solvent %998) içinde Bb-1-HOPO-1- DEBN`nin (Örnek 4,te yapilan) 1 mg/mL'ye çözünmesi ile hazirlanmistir. Bir seIaSyon deneyi, Örnek 5'te belirtildigi üzere 1 mg/mL solüsyonun 232Th 0.01 M HCl (Perkin Elmer) ile karistirilmasi yoluyla gerçeklestirilmistir. LC-MS ayirma islemi ve analizi, Örnek 67da açiklandigi üzere gerçeklestirilmistir. Sonuçlar, Sekiller 15 ve 16'da beklenen 232Th-Bb-1-HOPO-1-DEBN kompleksinin hizli bir sekilde olusturuldugunu göstermistir. Örnek 8 - ALG-DD-NCStnin trastuzumaba koniugasyonu, koniugatin toryum-227 ile isaretlenmesi ve tutulan hedef baglayicinin dogrulanmasi. Koniugasyon Monoklonal antikor trastuzumabin (Herceptin®, Roche) farmasötik derecesi, kullanilmistir. Antikor, 6.3 mg/mL'Iik bir konsantrasyona %0.9 NaCI içine tampon ile degistirilmistir. ALG-DD-NCS doymus solüsyonu, 1 mg/mL (önemsiz safsizliklar) içeren DMSO içinde hazirlanmistir. DMSO doymus solüsyonu, 6.521 veya daha az olan bir selatör ila antikor oranina karsilik gelen bir antikor solüsyonuna eklenmistir. Bir 0.07 M boraks solüsyonu, bir gece 37°C'de inkübasyonu takiben pH 9'u vermek üzere reaksiyon solüsyonuna eklenmistir. Ortaya çikan konjugat saflastirilmistir ve tampon bir Amicon Ultra-4 (30k MWCO) santrifüj filtre biriminin üzerinde degistirilmistir. 100 pL saklanmistir. lsa retleme üzere 1 mg bir ALG-DD-NCS-trastuzumab konjugat sisesine eklenmistir. Bu solüsyon, edilmistir. Eppendorf tüpü kapagi, alüminyum folyoya sarilmistir ve tüp yavasça karistirilarak 15 dakika oda sicakliginda bir termo karistiriciya yerlestirilmistir. Tüp ayrica MF-HzO içinde 10 uL doymus DTPA'nin eklenmesinden sonra 5 dakika oda sicakliginda inkübe edilmistir, geriye kalan serbest toryum-227'nin yakalanmasi amaçlanmistir. Sonuç, serbest radyonüklidlerin (toryum-227 ve yavru nüklidler) ve DTPA-toryum selatinin birçogunu kolonun üzerinde birakarak isaretlenen ALG-DD- NCS-trastuzumab konjugatini uzaklastirmak üzere PBS kullanilarak bir NAP-5 kolonunun üzerinde saflastirilmistir. Kolon ve ayrilan fraksiyonlar, reaksiyon verimlerini ve ürünün spesifik aktivitesini belirlemek üzere bir HPGe-dedektörünün GEM(15) Üzerinde ölçülmüstür. Ürün fraksiyonu, steril olarak filtrelenmistir ve bir gece 4°C'de saklanmistir. Ürün fraksiyonuna yönelik ikinci bir NAP-5 kolon saflastirmasi, kullanimdan önce gerçeklesti rilmistir. Immünoreaktif fraksiyonunun belirlenmesi SK-OV-3 hücreleri (ATCC) standart kosullar altinda kültürlenmistir. Sabitlenen SK-OV- 3 hücreleri, hazirlanmistir ve yüzeyin üzerinde HER2'nin varligini dogrulamak üzere kullanimdan önce akis sitometresi incelenmistir (veri gösterilmemistir). Normal ortam, hücre balonlari kullanilarak 37°C`de bir COz-inkübatörün ve %5 COz'nin içinde gerçeklestirilmistir. Her bir deney, iki kopya halinde gerçeklestirilmistir. Sabitlenen SK-OV-3 hücreleri, PBS içinde süspanse edilmistir ve Eppendorf tüplerine transfer edilmistir (10 milyon hücre/tüp). Konjuge-olmayan trastuzumab (Herceptin®, doymus solüsyondan 10 uL) iki referans tüpe eklenmistir ve engelleyici reaksiyon 30 dakika 37°C'de yapilmistir. Esdeger miktarlari, her bir tüpe eklenmistir, akabinde 2.5 saat 37°C'de inkübe edilmistir. Numuneler PBS ile seyreltilmistir, akabinde santrifüjlenmistir ve üst fazin yarisi yeni Eppendorf tüplerine transfer edilmistir. Tüm tüpler, bir Wizard gama sayacinda 5 dakika ölçülmüstür ve toryum-227'nin miktari, bir 227Th-protokolünün uygulanmasi yoluyla belirlenmistir. 0/28", burada P ve S sirasiyla hücre pelleti ve üst fazda ölçülen aktivitelerdir. Hesaplama, toplam baglanmayi (%) elde etmek üzere engellenmeyen numunelerin ve spesifik olmayan baglanmayi (%) elde etmek üzere engellenen numunelerin üzerinde gerçeklestirilir ve IRF su sekilde hesaplanir: IRF (%) = toplam baglanma (%) - spesifik olmayan baglanma (%). Tablo 4'te özetlenen bu kalite kontrolden elde edilen veriler, 227Th-ALG-DD-NCS- trastuzumabin hedefleyici hücreleri bagladigini gösterir. Tablo 4: Sirasiyla Örnekler 9 ve 10'da ardisik olarak kullanilan 227Th-ALG-DD- NCS-trastuzumab partilerinin (A ve B) üzerinde gerçeklestirilen kalite kontrole yönelik sonuçlar. Verim Geri Spesifik Ortalama Ortalama Ortalama (%)i kazanim aktivite IRF (%)iv toplam spesifik (%)ii (Bq/iig)iii baglanma olmayan (%)iv baglanma i. Verim (%) reaksiyon karisimina yönelik NAP-5 saflastirmasindan sonra hesaplanmistir. ii. Geri kazanim (%) ürün fraksiyonunun yeni bir NAP-5 saflastirmasindan sonra hesaplanmistir. iii. Spesifik aktivite (Bq/ug), reaksiyon karisiminda kullanilan ALG-DD-NCS- trastuzumab (pg) miktarina göre bölünen ürün fraksiyonunda bulunan 227Th (Bq) miktari kullanilarak hesaplanmistir. iv. IRF standart prosedürlere göre tahmin edilir. Örnek 9 - Toryum-227 isaretli ALG-DD-NCS-trastuzumabin in vitro stabilitesi ve etkinlik çalismalari Bag" lanmanin zaman icinde degerlendirmesi SK-OV-S hücrelerine baglanmanin stabilitesi, SK-OV-S hücre pelletleri ile iliskilendirilen 227Th-aktivitesinin miktarinin 7 gün boyunca ölçülmesi yoluyla 227Th-ALG-DD-NCS- trastuzumab yapisina yönelik degerlendirilmistir. Sonuçlar, serbest 227Th ile yapilan inkübasyondan sonra elde edilen veriler ile karsilastirilmistir. Örnek 8'de açiklandigi üzere kültürlenen SK-OV-3 hücreleri, 1 saat inkübasyondan (HPGe-dedektörü GEM(50)) sonra hücre pelletinin üzerinde sirasiyla 77 kBq (%11) ve trastuzumab veya 700 kBq serbest 227Th ile tedavi edilmistir. SK-OV-3 hücreleri üzerindeki 227Th-aktivitesi, Wizard gama sayaci (227Th-protokol) kullanilarak günlük olarak ölçülmüstür. Ölçülen radyoaktivite, bozunmaya yönelik düzeltilmistir. Sekil 17'de sunulan sonuçlar, 1 saat sonra pellet ile geriye kalan aktivitenin yalnizca %20'sinin sonraki 7 gün boyunca kayboldugunu gösterir. Aksine, serbest 227Th ile tedavi edilen hücreler eklenen aktivitenin sadece küçük bir fraksiyonunu baglar ve takip eden 24 saat boyunca bunun büyük bir bölümünü (yaklasik olarak %95) kaybeder. Bu yüzden, serbest 227Th SK-OV-3 hücrelerine spesifik olarak baglanmaz, öte yandan 227Th-ALG- DD-NCS-trastuzumab etkili bir sekilde tutulur. Sitotoksisite degerlendirmesi Tümör hücresi büyümesi üzerindeki etkisi, iki tamamlayici analiz halinde arastirilmistir. Birinci deneyde, hücrelerdeki metabolik aktivite, ATP moleküllerine baglanan parlak bir reaktif kullanilarak ölçülmüstür. Bu yüzden, azalan bir parlaklik sinyali metabolik aktivitenin azaldigini gösterir. Ikinci deneyde, olusturulan kolonilerin sayisi sayilmistir. Parlaklik 9 gün günlük olarak ölçülmüstür ve 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumaba maruz kalmadan kaynaklanan sonuçlar, sirasiyla trastuzumab ve serbest 227Th'ye maruz kalan SK-OV-3 hücrelerinin parlakligi ile karsilastirilmistir. Normal ortamda büyüyen SK-OV-3 hücreleri, kontrol olarak kullanilmistir. balonlarina transfer edilmistir. Bu hücre balonlari asagidaki numune solüsyonlarini hazirlamak üzere kullanilmistir: (1) Normal ortam, (2) 20 ug/mL trastuzumab, (3) 20 kBq/mL 20 kBq/mL serbest 227Th. Balonlar, 1 saat bir COz-inkübatörünün içinde inkübe edilmistir. Üst fazlar atilmistir ve hücreler %025 Tripsin-EDTA solüsyonu ile tripisine tabi tutulmustur, normal ortam ile yikanmistir ve santrifüjlenmistir. Hücre pelletleri, taze normal ortamin içinde süspanse edilmistir ve bir Wizard gama sayacinda (227Th- protokol) ölçülmüstür. Her bir inkübasyon solüsyonu, 7 yeni T25 hücre balonunun içine dagitilmistir ve bir CO:- inkübatörünün içinde inkübe edilmistir. 1. ve 2. günlerde, dört numune solüsyonundan her birine ait bir balondan üst fazlar atilmistir. Hücre pelletleri, 0. günden itibaren hazirlanmistir ve radyoaktivite bir Wizard gama sayacinda ( ölçülmüstür. Tüm numuneler, normal ortamda 4-kat seyreltilmistir ve her bir hücre süspansiyonuna ait 5 x 100 uL, bir View plaka-96'nin 5 gözüne transfer edilmistir. Bes göze, arka plan parlakliginin ölçümlerine yönelik eklenmistir. Nihai olarak, 100 uL Cell Titer-Glo Reaktifi, her bir göze eklenmistir ve solüsyonlar lizizi indüklemek üzere orbital bir çalkalayicida karistirilmistir. Parlaklik sinyalinin 10 dakika oda sicakliginda stabilize olmasina izin verilmistir, akabinde parlaklik LUM-tek program kullanilarak Envision çoklu plaka okuyucu ile üç kez ölçülmüstür. 3. günde, hücreler hazirlanmistir ve 1-2. gün için açiklandigi üzere bir Wizard gama sayaci ve Envision çoklu plaka okuyucu ile ölçümler yapilmistir. Akabinde, her bir hücre süspansiyonu yogun hücre büyümesinden dolayi seyreltilmistir; 3/4 hücre süspansiyonu yeni bir T75 hücre balonuna transfer edilmistir, normal ortam eklenmistir ve bir gece COg-inkübatörünün içinde inkübe edilmistir. 4-9. qünlerin her birinde, dört T75 hücre balonu, %025 Tripsin-EDTA solüsyonu ile tripisine tabi tutulmustur, normal ortam ile yikanmistir ve santrifüjlenmistir. Hücre pelletleri, normal ortamda 4-kat seyreltilmistir ve 100 uL'Iik parçalar alinmistir ve yukaridaki gibi ölçümler gerçeklestirilmistir. Akabinde, hücre süspansiyonlarina ait bir gece COz-inkübatörünün içinde inkübe edilmistir. Sekil 18, normal ortamda (kontrol) büyüyen SK-OV-3 hücrelerine yönelik elde edilen parlaklik degerlerine normalize edilen , trastuzumab ve serbest 227Th ile tedavi edilen SK-OV-3 hücrelerinin üzerinde parlaklik ölçümlerini gösterir. 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab ile tedavi edilen SK-OV-3 hücrelerine yönelik parlaklik sinyalleri, 1. gün ila 9. gün arasinda dereceli olarak azalmistir, öte yandan diger islemler bu süre boyunca neredeyse sabit parlaklik sinyalleri ve büyüme göstermistir. 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab ile tedavi edilen SK-OV-3 hücrelerinin metabolik aktiviteleri, zamanla azalmistir ve dokuzuncu günde neredeyse tüm hücreler ölmüstür. Bu sonuç, 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumabin önemli ve sürdürülebilir bir sitotoksik bir etkisini belirtir. Klonojenik bir analiz, tek hücrelerin potansiyel olarak sitotoksik kosullara maruz kalmasindan sonra hücre koloni büyümesini degerlendirmek üzere gerçeklestirilmistir. SK-OV-3 hücreleri, farkli 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab, trastuzumab veya serbest 227Th konsantrasyonlarinda 1 saat inkübe edilmistir, akabinde koloni büyümesini indüklemek üzere 12 gün inkübasyona tabi tutulmustur. Hücrelerin hazirlanmasi, yukaridaki gibi yapilmistir ve 5 mL normal ortamin içindeki her bir numunede 12000 hücre, bir T25 balonuna transfer edilmistir. Her bir reaktife ait 3 miktarin etkisi, sirasiyla ve trastuzumaba (5, 10 ve 20 ug/mL) (nihai konsantrasyonlar) yönelik incelenmistir. Bir kontrol balonu hazirlanmistir. Tüm 10 T25 hücre balonlari, 1 saat bir C02- inkübatörünün içinde inkübe edilmistir. Üst fazlar atilmistir ve hücreler normal ortam ile yikanmistir, %025 Tripsin-EDTA solüsyonu ile tripisine tabi tutulmustur, normal ortam ile yikanmistir ve santrifüjlenmistir. Hücre pelletler normal ortamda süspanse edilmistir ve on hücre süspansiyonunun her biri, 6 yeni T25 hücre balonuna ayrilmistir; 3 hücre balonlari koloniler görülebilir bir boyuta (yaklasik olarak 50 hücre/koloni) ulasana kadar bir COz-inkübatörünün içinde inkübe edilmistir. 12 gün inkübasyondan sonra, ortam uzaklastirilmistir. Hücreler PBS ile yikanmistir, etanol ile sabitlenmistir, PBS içinde 45°C'de kurutulmustur. Koloniler manuel olarak sayilmistir ve her bir inkübasyon solüsyonundaki ortalama koloni sayisi, grafik olarak çizilmistir. Sekiller 19 ve 20'de gösterilen sonuçlar, 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab ile 1 saatlik inkübasyonun SK-OV-3 hücrelerini etkili bir sekilde öldürdügünü gösterir. Serbest 227Th ile inkübasyon bir parça öldürme etkisine sahip olabilir, çok sayida hücrenin kullanildigi birinci sitotoksisite analizinde görünmez. Trastuzumab ile inkübasyonun hücre büyümesi üzerine herhangi bir negatif etkisi olmamistir. Örnek 10 - Torvum-227 isaretli ALG-DD-NCS-trastuzumabin in vivo olarak tümör hedeflemesi OV-3 ksenogreftlerini tasiyan on tane BaIb/c çiplak farenin yan kuyruk damarina enjekte edilmistir. Bes fare 24 saat sonra ve diger bes tanesi 4 gün sonra öldürülmüstür ve ilgili organlar kesip çikarilmis ve tartilmistir. Tüm numuneler ve %10 lD/g içeren 3 standart solüsyon, bir Wizard gama sayacinda (227Th-protokol) 5 dakika ölçülmüstür. Sonuçlar doku grami basina (% ID/g) enjekte edilen % doz olarak ifade edilmistir. Sekil 21'de gösterilen sonuçlar, 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumabin tümöre spesifik olarak baglandigini destekler. Alim degerleri orta derecelidir, ancak 24 saat ve 4 günlük alim arasinda bir sekilde artmistir (%87 ID/g'den %, öte yandan kandaki konsantrasyon yaklasik %1 ID/g'a düsmüstür. Kafatasi ve kalça kemigindeki alim, ayni zamanda 24 saat ile 4 gün arasinda bir sekilde artmistir, ancak bu degerler genel olarak düsüktür (%2.8-3.2. 24 saat), sistemde oldukça az serbest 227Th'nin dolastigini belirtir ve bu nedenle yüksek derecede bir 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab kompleksi stabilitesi önerir. Bu sonuca yönelik diger bir destek, kafatasi ve kalça kemiginde ölçülen aktivitenin bir parçasinin yavru nüklid 223Ra'nin alimi ile olustuguna dair yüksek olasilik ile verilir. Bu 223Rai'nin bir kismi, bir Wizard gama sayacinda 227Th-ölçümlerine yönelik belirtilen geçitli pencerenin içinde tespit edilebilir, böylece kafatasi ve uyluga yönelik hesaplanan % ID/g-degerleri, bu dokularda biriken 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab miktarina göre abartili olabilir. Örnek 11 - Selatlayici bir kismin hazirlanmasi Adim 1) - 1-Metil-3-hidroksi-2(1H)-piridinon: kapakli bir Teflon konteynere yerlestirilir ve bir Parr bombasinin Içinde yaklasik 48-60 saat boyunca 150°C'ye isitilir. Sogutulan bomba açilir ve fazla iyodometan bosaltilir. Ortaya çikan kalin koyu yag sodyum sülfat (64 9, 0.5 mol) ile karistirilir ve soluk kahverengi bir solüsyon olusturmak üzere 300 mL suyun içinde çözünür. Solüsyon, pH 7-8'e nötrlestirilir ve çözünmeyen safsizliklari uzaklastirmak üzere filtrelenir. Filtrat, akabinde metilen klorid (4 X ile özütlenir. Kombine edilen ekstraktlar akabinde kurutulur, bir flas silika jel tamponuna (6 om.x 8 cm) uygulanir ve metilen kloridin içinde Adim 2_-4-Karboksi-1-metil-3-hidroksi-2(1 H)-piridinon (36 9, 0.26 mol) ile karistirilir ve vakum kurutulur. Karisim akabinde kuru karbon dioksit bomba açilir ve ortaya çikan soluk sari kati buzlu suyun Içinde çözünür ve bej bir kristalin ürünü üretmek üzere 6N HCI ile asitlestirilir. Adim 3 - 3-Benziloksi-4-karboksi-1-metil-2(1H)-piridinon formamid (DMF) ( ve anhidröz potasyum karbonat (13.8 9, 0.1 mol) ile karistirilir. Karisim, nitrojen altinda karanlikta 16 saat 75 -80°C'ye isitilir. Ortaya çikan karisim, akabinde filtrelenir ve solvent koyu bir yag vermek üzere buharlastirilir. Yag, bir silika jel tampona (6 cm.x 8 cm) uygulama ile buharlastirilir ve soluk sari, kati bir yag olarak 3-benziloksi-4-benziloksikarboniI-1-metil- 2(1H)-piridinon ile sonuçlanarak metilen klorid içinde %4 metanol ile ayristirilir. Bu, metanol (50 mL) ve 6M bir NaOH solüsyonunun (10 mL) içine alinir ve karisim 4 saat oda sicakliginda karistirilir, akabinde kurumak üzere buharlastirilir. Kalinti su ( içinde çözünür ve beyaz bir kristalin ürünü olarak basliktaki bilesigi (9.3 9 %887) vermek üzere pH 2'ye 6M HCI solüsyonu ile asitlestirilmistir. Adim 4 - 3-benziloksi-1-metiI-4-(2-tiyoksotiyazolidin-1-il)karboniI-2(1 H)-piridinon Kuru diklorometan (50 mL) içinde bir 3-benziIoksi-4-karb0ksi-1-metil-2(1H)-piridinon dimetilaminopiridinin (DMAP) katalitik bir miktarina, N,N'-disiklohekzilkarbodiimid (DCC) ( katilari filtrasyon yoluyla uzaklastirilir. Sari filtrat, akabinde sari bir kati saglamak üzere dönerek buharlastirilir. IzopropanoI-metilen kloridden kristalizasyon, parlak sari kristalin plakalari olarak basliktaki bilesigi (Yapi A, 1.16 9, %80.4) verir. Örnek 12- Formüle (VIII) yönelik Siklik tuzunun hazirlanisi (Yapi 5), asagidaki semaya göre yapilir: i. MÜSLSÜ 1.0, I:i_.N. oda sicakliginda -ni :AV/x' . I CTR"- .- .oda sicakliginda` 4.1. . Reflükse edici asetonitrilin içinde etil akrilat ile sezyum florid (%10 mol) ile destek verilen 1 Michael reaksiyonu, iyi verim ile karsilik gelen esteri 2 vermistir. 2'nin standart kosullar kullanilarak sonraki O-benzilasyonu (KZCOS/asetonitriI/reflüks), akabinde ester kismin (BH3-THF, oda sicakligi) azaltilmasi kromatografiden sonra %90 verim ile alkolü 3 vermistir. Trietilaminin varliginda diklorometan içinde metansülfonik anhidrit ile alkolün 3 muamelesi, 1H NMR spektral analizi ile belirlendigi üzere ara ürün mesilatin 4 (~ %10-15) bir kismi ile birlikte istenilen Siklik tuzunun 5 (~ %85-90) direkt olarak olusmasina yol açmistir. Siklik tuza 5 tamamen dönüsüm, oda sicakliginda kloroform içinde mesilatondan ham ürün karisiminin karistirilmasi ile elde edilebilir. Sicak etil asetat ile triturasyondan sonra. tuz yüksek safliga sahip %92 verim ile soluk beyaz bir kati olarak izole edilmistir. Örnek 13 - Formwn (VIII) bilesiginin hagirlanisi (Referans) tetraazasiklododekan) 1.2 esdegerlerine eklenir ve nitrojen altinda 2 gün 80°C'de isitilir. Reaksiyon akabinde, diklorometan (50 ml) ile seyreltilir ve doymus NaHCOs (50 ml) ile yikanir. Aköz katman bir kez daha diklorometan (25 ml) ile özütlenir. Kombine organik ekstraktlar sodyum sülfat ile kurutulur, solvent vakum ile uzaklastirilir ve asiri N-metilbenzilamin, Vlll'yi vermek üzere vakum ile damitma araciligiyla uzaklastirilir. Örnek 14 - Formülün (IX) bilesiginin hazirlanisi Metilen klorid içinde bir 3-benziloksi-1-metiI-4-(2-tiyoksotiyazolidin-1-iI)karboniI-2(1H)- piridinon solüsyonuna, karsilik gelen fonksiyonlu hale getirilen N,N,N',N'-tetrakis(2- aminoetil)etilendiamin (Yapi B, Z koruyucu bir gruptur) eklenecektir. Dört saat karistirdiktan sonra, karisim filtrelenir ve kurumak üzere alinir. RH: Yapi Li Uygun benzil ile korunan öncü ürün, metilen kloridin içinde propanol ile bir flas silika kolonunun üzerinde reaksiyon karisimindan izole edilecektir. IX yapisina sahip nihai ürün, hidroksil gruplarinin asit ile koruyucu grubun uzaklastirilmasindan sonra mevcut olacaktir. Yapi VIII (referans), teknikte uzman kisilerce standart yöntemler kullanilarak hedefleyici bir moleküle konjuge edilecektir. Örnegin, N-hidroksisüksinimid (NHS) esterin hazirlanmasi ve standart kosullar kullanilarak proteinlere ve peptidlere konjuge edilmesi halinde, ortaya çikan konjuge protein jel filtrasyonu kullanilarak izole edilecektir. Konjuge edilen proteinin toryum-227 isaretlemesi Konjuge edilen proteinin 10 mglmL bir solüsyonu (birlestirici bir kisim yoluyla baglanan oktadentat bir Iiganda sahip), uygun bir tampon solüsyonunda yapilacaktir, örnegin, 0.5 M NaOAc-tamponu (pH 5.5) ve 1 saat 25°C'de saflastirilan toryum-227 ile isaretlenir, akabinde birjel filtrasyon kolonunun üzerinde bir saflastirma adimi gerçeklestirilir. TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR