TR201809165T4 - Tümörlerde diferansiyel olarak ifade edilen gen ürünleri ve bunların kullanımı. - Google Patents

Tümörlerde diferansiyel olarak ifade edilen gen ürünleri ve bunların kullanımı. Download PDF

Info

Publication number
TR201809165T4
TR201809165T4 TR2018/09165T TR201809165T TR201809165T4 TR 201809165 T4 TR201809165 T4 TR 201809165T4 TR 2018/09165 T TR2018/09165 T TR 2018/09165T TR 201809165 T TR201809165 T TR 201809165T TR 201809165 T4 TR201809165 T4 TR 201809165T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
tumor
cells
antibody
cell
specific
Prior art date
Application number
TR2018/09165T
Other languages
English (en)
Inventor
Tureci Ozlem
Sahin Ugur
Koslowski Michael
Fritz Stefan
Geppert Harald-Gerhard
Original Assignee
Astellas Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Astellas Pharma Inc filed Critical Astellas Pharma Inc
Publication of TR201809165T4 publication Critical patent/TR201809165T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K6/00—Preparations for dentistry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y406/00—Phosphorus-oxygen lyases (4.6)
    • C12Y406/01—Phosphorus-oxygen lyases (4.6.1)
    • C12Y406/01002—Guanylate cyclase (4.6.1.2)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/57595—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving intracellular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

Buluşa göre, tümörle bağlantılı olarak ifadelendirilen gen ürünleri ve bunlara yönelik olarak kodlama yapan nükleik asitler tanımlanmıştır. Mevcut buluş, tümörle bağlantılı olarak ifadelendirilen bu gen ürünlerinin aberan olarak ifadelendirildiği hastalıkların tedavisi ve tanısı ile ilgilidir. Buluş, bunun yanı sıra tümörle bağlantılı olarak ifadelendirilen protein, polipeptit ve peptitler ile bunlara yönelik olarak kodlama yapan nükleik asitlerle ilgilidir.

Description

TARIFNAME TÜMÖRLERDE DIFERANSIYEL OLARAK IFADE EDILEN GEN Artan disiplinler arasi yaklasimlara ve klasik terapi usullerinin tüm olanaklariyla kullaniliyor olmasina karsin kanser hastaliklari halâ ölüm nedenleri siralamasinda basi çekmektedir. Yakin geçmiste ortaya konan terapötik yaklasimlarda, rekombinan tümör asilari ve antikor terapisi gibi diger spesifik önlemlerin uygulamaya konmasiyla hastanin bagisiklik sisteminin uygulanan terapötik yaklasim ile bütünlestirilmesi amaçlanmaktadir. Bu tür bir stratejinin basarisi, hastalarin bagisiklik sistemindeki etkin güçlerin disaridan müdahaleyle kuvvetlendirilmesi ve bu suretle tümöre spesifik veya tümör ile baglantili antijenlerin, diger bir deyisle epitoplann bagisiklik sistemi tarafindan taninmasinin saglanmasina baglidir. Tümör hücrelerinin yapisi, biyolojik olarak kötücül olmayan asil hücrelerin yapisindan oldukça farklidir. Bu farkliliklar, tümör olusumu sirasinda meydana gelen genetik degisikliklerden kaynaklanir ve kanser hücrelerinde birçok degisime yol açarken gerek niteliksel gerekse niceliksel açidan degisime ugramis moleküler yapilarin olusmasina da neden olur. Spesifik olarak tümörle baglantili bir sekilde bagisiklik sisteminde ortaya çikan bu tür yapilarin tümörü tasiyan konakçi tarafindan taninmasi durumu, tümörle baglantili antijen olarak tanimlanmaktadir. Tümörle baglantili antijenlerin taninmasinda islevsel olarak birbiriyle baglantili iki birimden olusan özel hücresel ve hümoral mekanizmalar kullanilir: Bir taraftan CD4Jr ve CD8+ T lenfositleri, Sinif ll veya Sinif l MHC (Temel Doku Uygunlugni Bileseni) molekülleri üzerinde gösterilen isleme tabi tutulmus antijenleri tanirken lenfositleri, devridaim yapan ve dogrudan isleme tabi tutulmamis antijenlere baglanan antikor molekülleri üretir. Tümörle baglantili antijenlerin klinik terapisi açisindan potansiyel önemi, ur yapisindaki hücrelerin üzerindeki antijenlerin bagisiklik sistemi tarafindan taninmasinin sitotoksik Effekton mekanizmalarini tetiklemesi ve T yardimci hücrelerin mevcudiyeti durumunda kanser hücrelerinin bertaraf 01341-P-0009 edilmesine olanak vermesiyle kendini gösterinektedir (Pardoll, Nat. Med. 4:525- 31, 1998). Buna göre tümör immünolojisi biliminin temel amaci, bu tür yapilarin moleküler açidan tanimlanmasidir. Bu antijenlerin moleküler yapisi, uzun süre gizemini korumustur. Ancak ilgili klonlama tekniklerinin gelistirilmesi sonucundadir ki sitotoksik T lenfositlerin (CTL) hedef yapilarinin prob olarak deyisle devridaim yapan otoantikorlar ile (Sahin et al., Curr. Opin. Immunol. antijenler üzerinde sistematik bir sekilde gösterilmesi mümkün olmustur. Bu islemde cDNA tanimlama bankalari, zinde tüinör dokusu üzerinde üretilmis ve uygun sistemler içinde protein olarak rekombinan yapida ifade edilmistir. Ilgili antijenlerin klonlanmasi için hastalardan izole edilmis bagisiklik efektörleri, yani tümöre özel lizis örnegi veya devridaim yapan antikorlar kullanilmistir. Son yillarda bu tür yaklasimlarla birçok neoplazi vakasinda antijen tanimlamasi yapilmistir. Aslinda yukarida tanimlanan klasik yöntemlerde hastalardan alinan, kural olarak ileri derecede kanserli bagisiklik efektörleri (devridaim yapan otoantikorlar veya CTL klonlari) prob olarak kullanilir. Bazi arastirma sonuçlari, tümörlerin T hücrelerinin tolerize edilmesi ve acze düsmelerine neden olabilecegini ve hastaligin seyri sirasinda bagisiklik efektör dagarcigi içindeki etkili bagisiklik tepkisi vermelerini saglayabileccek spesifik özelliklerin kayboldugunu göstermistir. Hastalar üzerinde yapilan güncel arastirmalarda henüz su ana kadar tespit edilen ve kullanilan tümörle baglantili antijenlerin gerçek etkisi ile ilgili kesin bir kanit elde edileineinistir. Buna göre anlik bagisiklik tepkilerini tetikleyen proteinlerin yanlis hedef yapisi olmasi ihtimali de mümkündür. Mevcut bulusun amaci, hedef yapilarin kanser hastaliklarinin tani ve tedavisinde kullanilmasinin saglanmasidir. 01341-P-0009 Bu amaç, bulus uyarinca patent isteinleri kapsaminda yerine getirilmektedir. Bulusa göre, tümörle baglantili olarak ifade edilen antijenlerin ve bunun için kodlanan nükleik asitlerin tanininasi ve hazir hale getirilmesi amacina yönelik bir strateji izlenmistir. Bu strateji, organlara spesifik olarak, örnegin sadece kalin bagirsak, akciger veya böbrek dokusuna spesifik olarak ifade edilen belirli genlerin ilgili organlarda ayni zamanda tümör hücrelerinden ve bunun yani sira diger dokulardaki tümör hücrelerinde ektopik ve izinsiz olarak tekrar canlandirilmasi olgusu üzerine bina edilmektedir. Öncelikle veri madenciligi yoluyla organa spesifik tüin taninan genlerin mümkün oldugunca eksiksiz bir listesi düzenlenir ve bunlar daha sonra spesifik RT-PCR yöntemi vasitasiyla yapilan ifade analizleri yoluyla çesitli tümörler içinde anormal etkinlestirrneye tabi tutulmamalari açisindan degerlendirilir. Veri madenciligi, tümörle baglantili genlerin tespit edilmesi için uygulanan taninmis bir yöntemdir. Geleneksel stratejilerde kural olarak normal doku bankalarinin transkriptomlari elektronik olarak tümörlü doku bankalarindan çikarilir, bu islem sonunda kalan genlerin tümöre spesifik oldugu varsayilir (Schmitt et al., Nucleic Acids Res. 27: 4251-60, Bulusa göre, çok daha basarili oldugu kanitlanmis olan konsept, veri madenciliginin organa spesifik tüm genlerin elektronik çikarimi için kullanimi ve daha sonra bunlarin tümörlerde ifade edilmesi konusunda degerlendirmeye tabi tutulmasina dayanmaktadir. Mevcut ögreti, bu sekilde bir yönüyle dokuya spesifik ve tümörlerde diferansiyel olarak ifade edilmis genlerin taninmasina yönelik bir strateji ile ilgilidir. Bu strateji, kamu dizi bankalarindaki ("i'n silico ortamda") veri madenciligi ve onu takip eden degerlendirine amaçli deneysel laboratuar arastirmalarini ("Wet bench arastirma") kombine eden bir stratejidir. Iki degisik biyoenforrnatik senaryo üzerine kurulu kombine bir strateji, bulusa 01341-P-0009 göre yeni tüinör genlerinin taninmasina olanak saglamistir. Bunlar, bugüne kadar sadece organa spesifik olarak siniflandirilmistir. Bu genlerin aberan olarak tümör genlerinde aktive edilebildigi bilgisi, bunlara islevsel çikariinlara olanak veren yeni bir nitelik özgülemeyi mümkün kilmaktadir. Tümörle baglantili bu genlerin ve bunlarla kodlanan gen ürünlerinin taninmasi ve kullanima hazir hale getirilmesi, imunojen bir etkiden bagimsiz olarak meydana gelmistir. 117, 119 ve 138 olan gruptan, onun bir bölümünden veya türevinden seçilmis bir nükleik asit dizilimini kapsayan nükleik asitten, (b): (a) paragrafindaki nükleik asit ile baglayici kosullar altinda melezlestirilen bir nükleik asitten, (0): (a) ve (b) paragrafindaki nükleik asitlerle iliskili olarak dejenere edilen bir nükleik asitten ve (d): (a), (b) ve (c) paragrafindaki nükleik asitleri tamamlayici nitelikte olan bir nükleik asitten meydana gelen gruptan seçilen bir nükleik asit tarafindan kodlanan bir aminoasit dizisi göstermektedir. Tercih edilen bir uygulama usulünde tümörle 138 diziliinden olusan bir gruptan seçilmis bir nükleik asit ile kodlanmis olan amino asit dizilimi göstermektedir. Bir baska tercih edilen uygulama tarzinda ise dizilimden olusan bir gruptan, onun bir kismi veya türevinden seçilmis bir amino asit dizilimi göstermektedir. Mevcut açiklama, genel olarak açiklamaya uygun olarak tanimlanan tümörle baglantili antijenlerin veya bunlarin bir kisminin veya türevlerinin veya bunun için kodlanmis nükleik asitlerin veya kodlayan nükleik asitlere karsi yöneltilmis nükleik asitlerin veya tümörle baglantili tanimlanan antijenlere veya bunlarin bir kismina veya türevlerine karsi yöneltilmis nükleik asitlerin tedavi ve tani için kullanimini içermektedir. Bu kullanim, tani, tedavi ve süreç kontrolü için tek tek antijenleri kapsadigi gibi, bu antijenlerden olusan kombinasyonlari, islevsel 01341-P-0009 kisimlari, nükleik asitleri, antikorlari ve baska ögeleri de kapsayabilir ve kullanim biçimi olarak diger tümörle baglantili gen ve antijenlerle kombinasyon da yapilabilir. Tedavi ve/veya tani için tercih edilen hastaliklar, açiklama uyarinca tümörle baglantili tanimlanan antijenlerden biri veya birkaçiyla ilgili selektif ifadelendirme veya anormal ifadelendirme bulunan hastaliklardir. Açiklama, tümör hücrelerine bagli olarak ifadelendirilen nükleik asit ve gen ürünlerini de kapsamaktadir. Mevcut teknik ögreti, ayrica gen ürünlerini, diger bir deyisle bilinen genlerin degistirilmis birlestirimi (baglanti degiskenleri) veya alternatif açik okuma çerçeveleri kullanilarak yapilan degistirilmis aktarimi yoluyla olusan nükleik asitleri ve proteinleri, yani peptitleri de kapsamaktadir. Bu kapsamda dizilim protokolünün SEQ ID NO: 3-5 olan dizilimlerden olusan gruptan seçilen nükleik asitler açiga çikar. Bildirimi yapilan ögreti, bu kapsamda bunun disinda, dizilim protokolünün SEQ ID NO: 10 ve 12-14 dizilimlerinden olusan gruptan seçilmis amino asit dizilimini içeren protein veya peptitleri de kapsamaktadir. Açiklamada yer alan baglanti degiskenleri, tümör hastaliklarinin tani ve tedavisinde kullanilabilir Özelliktedir. Mevcut ögreti, özellikle dizilim protokolünün SEQ ID NO: 10 uyarinca, bulus uyarinca tanimlanan alternatif açik okuma tarama örüntüsü ile kodlanan ve yukarida tanimlanan protein diziliminden (SEQ ID No:9) proteinin N ucunda 85 ilave amino asitle farklilasan bir aminoasit dizilimini de kapsamaktadir. Baglanti degiskenlerinin olusumu, asagidaki örneklerde görüldügü gibi çok çesitli mekanizmalarin olusumuna bagli olabilmektedir: 01341-P-0009 . degisken transkripsiyon baslatma noktalarinin kullanimi, . ilave ekson kullanimi, . münferit veya birkaç eksonun tamamen veya parça parça birlestirilmesi, . degisime ugratiliriis birlestiriin düzenleyici dizilerin mutasyonu (yeni verici/alici dizilimlerin silinmesi veya yaratilmasi), . intron dizilimlerinin tamamlanmamis eliminasyonu. Bir genin degisime ugratilmis birlestirimi, degistirilmis transkript diziliinine (baglanti degiskenine) yol açar. Bir baglanti degiskeninin kendi degistirilmis dizilim kisminda aktarilmasi durumunda özgün yapisindan yapi ve islev olarak önemli ölçüde farklilik gösterebilen degisime ugramis bir protein ortaya çikar. Tümörle baglantili baglanti degiskenlerinde tümörle baglantili transkriptler ve tümörle baglantili proteinler/antijenler ortaya çikabilmektedir. Bunlar, gerek tüinör hücrelerinin kaniti gerekse tümörlerin terapötik hedeflenmesine yönelik moleküler isaretleyici olarak kullanilabilir. Tümör hücrelerinin örnegin kan, serum, ilik, balgam, brons lavaji, vücut salgilari ve doku biyopsilerinde tespiti, bulusa göre örnegin nükleik asitlerin baglanti degiskenlerine özgü oligonükleotitlerle PCR amplifikasyonu vasitasiyla ekstrasyonu yoluyla yapilabilmektedir. Tümörle baglantili olan ve en azindan biri baglayici kosullar altinda baglanti degiskeni bölgesine baglanmis olan primer çiftler, özellikle oligonükleit olarak uygundur. Açiklama uyarinca örneklerde bu amaçla tanimlanan oligonükleitler, özellikle dizilim protokolünde SEQ ID NO: 34-36, 39, 40 ve 107-110 olan diziden seçilen bir dizilim gösteren veya kapsayan kapsayan oligonükleitler uygundur. Kanit olarak dizilime bagli tüm tespit sistemleri uygundur. Bunlar arasinda PCR yöntemi yani sira örnegin gençip / mikro dizilim sistemleri, Northem-Blotlama, RNA koruma ölçümleri (RDA) Vb. bulunmaktadir. Tespit isleminin en az bir baglanti degiskenine spesifik nükleik asit dizilimli spesifik melezlestirme islemine dayandirilmasi, tüm tespit sistemlerinin ortak yanidir. Tümör hücrelerinin tespiti, baglanti degiskeni üzerinden kodlanan spesifik bir epitopu taniyabilen antikorlar üzerinden de yapilabilmektedir. Antikor 01341-P-0009 üretimi için bu baglanti degiskenine özgü olan peptitler bagisiklik kazandirmak için kullanilabilir. Bildirimi yapilan ögreti, bu bakimdan özellikle dizilim dizilim gösteren veya kapsayan peptitleri ve buna karsi yönlendirilmis spesifik antikorlari kapsamaktadir. Tümör hücrelerinin tespiti, tümöre spesifik degistirilmis glikosilasyon degiskenlerini taniyan antikorlarla da yapilabilir. Bu tür antikorlarin olusturulmasi için tümör hücrelerinde ve saglikli hücrelerde glikosilasyona bagli olarak ayirt edilen peptit bölgeleri de kullanilabilir. Açiklama, bu bakimdan özellikle dizilim protokolünün SEQ ID NO: 17-19, 111- ve buna karsi yönlendirilen spesifik antikorlari kapsamaktadir. Asparagin, N baglantili seker kalintilarinin endojen deglikosilasyonu yoluyla aspartik aside dönüstürülür. Bu nedenle bulusa göre burada tanimlanan proteinler, tümöre spesifik dizilim degisikligine ugramis olabilir ve bu sekilde baska biyokimyasal ve antikor baglanimi özellikleri gösterebilir. Bildirimi yapilan ögreti, bu bakimdan özellikle dizilim protokolünün SEQ ID NO. 146-150 dizisinden seçilen bir dizilim gösteren veya kapsayan peptitleri ve bunlara karsi yönlendirilmis spesifik antikorlari kapsamaktadir. Bagisiklastirma için gen ürününün tercihen saglikli hücrelerde olusan degiskenine/degiskenlerine belirgin epitop farkliliklari gösteren amino asitler özellikle uygundur. Bu meyanda tümör hücrelerinin antikorlarla kanitlanmasi, hastadan izole edilen bir prob veya intravenöz yoldan uygulanan antikorlarla yapilan görüntüleme ile yapilabilir. Yeni veya degistirilmis epitop gösteren baglanti degiskenleri, tanisal amaçli kullanilabilmelerinin yaninda bagisiklik terapisi için de cazip hedef` olusturmaktadir. Epitoplar, terapötik olarak etkili monoklonal antikorlarin veya T lenfositlerin hedeflendirilmesinde kullanilabilir. Pasif` bagisiklik terapisinde baglanti degiskenlerine spesifik epitoplari taniyan antikorlar veya T lenfositler, adoptif olarak transfer edilebilir. Antikorlarin olusturulmasi, diger antijenlerde oldugu gibi bu epitoplari içeren polipeptitleri kullanarak standart teknolojilerle de (hayvanlarin bagisiklastirilmasi, rekombinan antikorlarin izolasyonuna yönelik lavaj stratejileri) yapilabilir. 01341-P-0009 Alternatif olarak bu epitoplari içeren oligopeptit ve polipeptitleri kodlayan nükleik asitler de bagisiklastirina için kullanilabilir. Epitopa özgü T lenfositlerin in vitro ve in vivo ortamlarda olusturulmasina yönelik çesitli teknikler bilinmektedir ve ayrintili bir sekilde tanimlanmistir (örnegin Kessler JH, et al. 2001, Sahin et al., 1997 karsilastiriniz) ve ayni zamanda baglanti degiskenlerine spesifik epitoplar içeren oligopeptit veya polipeptitlerin veya bunlari kodlayan nükleik asitlerin kullanimina dayanir. Baglanti degiskenlerine özgü epitoplar içeren oligopeptit veya polipeptitler veya bu polipeptitleri kodlayan nükleik asitler, farmasötik anlamda etkili maddeler olarak aktif bagisiklik tedavisinde (asilama, asi terapisi) kullanilabilir. Mevcut durumda normal ve tümörlü dokularda ikincil modifikasyonlarinin cins ve miktari ile farklilik gösteren proteinler de tanimlanmaktadir (Örnegin Durand & Çalismasi 56: 5309-18). Protein modifikasyonlarinin analizi, Western blotlama teknigi ile yapilabilir.Özellik1e kDa büyüklügü nispeten fazla olan glikosilasyonlar, SDS- PAGE yönteminde çözülen hedef proteinde daha büyük bir toplam kitle olusmasina yol açar. Spesifik O ve N glikosidik baglantilarin kaniti için proteolizatlar mahiyetinin degistirilmesi öncesinde SDS vasitasiyla 0 veya N glikosilatlari ile inkübasyona tabi tutulur (PNgase, Endoglykosidase F, Endoglykosidase H, Roche Diagnostics gibi üreticilerin verilerine dayanarak). Takiben Western blotlama uygulanir. Bir hedef proteinin boyutunun küçültülmesi isleminde glikosidazla inkübasyondan sonra spesifik bir glikosilasyon kanitlanabilir ve bu yolla bir modifikasyonun tümör özelligi de analiz edilebilir. Tümör hücrelerinde ve saglikli hücrelerde diferansiyel olarak glikosile olan protein alanlari özellikle ilginçtir. Ancak bu tür glikosilasyon farkliliklari, su ana kadar (örnegin Mucl gibi) çok az sayida hücre yüzeyi proteinleri için tanimlanmistir. 01341-P-0009 Bulusa göre, Claudin-18 için tümörlerde diferansiyel bir glikosilasyonun varligi kanitlanmistir. Sindirim sistemi kanseri, pankreas kanseri, yemek borusu tümörleri, prostat tümörleri ve akciger tümörleri, Claudin-lS'in daha az glikosile olmus bir biçimini ihtiva etmektedir. Saglikli dokulardaki glikosilasyon, tüinör hücreleri üzerinde glikosilasyon olinamasi nedeniyle açikta kalmis olan Claudin- 18'in protein epitoplarini maskelemektedir. Bulusa göre, buna uygun sekilde bu alanlara baglanan ligand ve antikorlar seçilebilmektedir. Bulus uyarinca bu tür ligand ve antikorlar, saglikli hücreler üzerindeki epitoplar glikosilasyon sonucu maskelenmis oldugu için bu hücrelerin üzerindeki Claudin-l 8'e baglanmazlar. Bunun sonucunda, diferansiyel glikosilasyon, yukarida tümörle baglantili baglanti degiskenlerinden türetilen protein epitoplari için yapilan tanimlamaya benzer olarak normal hücrelerin ve tümör hücrelerinin tani ve tedavi amaciyla ayirt edilmesinde kullanilabilir. Açiklama, bir yönüyle açiklamaya göre tanimlanan tümörle baglantili antijenleri taniyan ve tercihen açiklamaya göre tanimlanan tümörle baglantili antijenin ifadesini veya anormal ifadesini gösteren hücreler için seçilmis olan bir araciyi kapsayan farmasötik bir bilesimle ilgilidir. Bu araci, belirli uygulama usulleriyle hücre ölümü endüksiyonu, hücrenin büyümesinin azaltilmasi, hücre membraninin hasara ugramasi veya sitokinlerin sekresyonunda etkili olabilmekte ve tercihen tümörü engelleyici bir faaliyet göstermektedir. Araci, uygulama usullerinden birinde selektif olarak tümörle baglantili antijen için kodlama yapan nükleik asitle melezlestirilen antisens bie nükleik asittir. Araci, bir diger uygulama usulünde selektif olarak tümörle baglantili antijene baglanan bir antikor, özellikle tümörle baglantili antijene baglanan kompleman olarak aktive edilen veya toksine konjuge bir antikordur. Araci, bir baska uygulama usulünde her seferinde selektif olarak degisik tümörle baglantili antijenleri taniyan birçok maddeyi kapsamaktadir ki burada tüinörle baglantili antijenlerden en az biri, açiklamaya uygun olarak tanimlanmis tümörle baglantili antijendir. Tanimanin dogrudan faaliyetin 01341-P-0009 engellenmesi veya antijenin ifadelendirilmesi yoluyla olmasi gerekmez. Açiklamasi yapilan teknik ögretinin bu bakis açisinda selektif olarak tümör üzerine sinirli antijen, tercihen etkileyici mekanizmalarin bu spesifik bölgeye dogru çekilmesi için isaretleme islevi görmektedir. Araci, tercih edilen bir uygulama usulünde antijeni HLA molekül üzerinde taniyan ve bu tür isaretlenmis hücreleri çözen sitotoksik bir T lenfosittir. Araci, bir diger uygulama usulünde selektif` i olarak tümörle baglantili antijene baglanan ve yapay etkileyici mekanizmalari bu hücreye dogru çeken bir antikordur. Araci, bir baska uygulama usulünde spesifik olarak bu antijeni taniyan diger hücrelerin etkileyici mekanizmalarini güçlendiren bir T yardimci lenfosittir. Açiklamasi yapilan ögreti, bir yönüyle bulusa uygun olarak tanimlanan bir tümörle baglantili antijenin ifadesini veya faaliyetini engelleyen bir araciyi ihtiva eden farmasötik bir bilesimle ilgilidir. Bu araci, tercih edilen bir uygulama usulünde seçimli olarak tümörle baglantili antijen için kodlama yapan nükleik asitle melezlestirilen antisens bir nükleik asittir. Araci, Araci, baska uygulama usulünde seçimli olarak tümörle baglantili antij ene baglanan bir antikordur. Araci, bir diger uygulama usulünde her seferinde seelektif olarak farkli tümörle baglantili antijenlerin ifade veya faaliyetini engelleyen birçok maddeyi kapsamaktadir ki burada tümörle baglantili antijenlerden en az birisi, açiklamaya uygun tanimlanmis tümörle baglantili bir antijendir. Açiklamasi yapilan ögreti, bunlarin yaninda verildiginde selektif` olarak açiklamaya göre tanimlanmis tümörle baglantili antijende HLA molekülü ile peptit epitop arasindaki komplekslerin miktarini artiran bir araci içeren farmasötik bir bilesimle ilgilidir. Bu araci, bir uygulama usulünde (i) tümörle baglantili antijen veya onun bir kismindan, (ii) tümörle baglantili antijen veya onun bir kismi için kodlama yapan bir nükleik asitten (iii) tümörle baglantili antijen veya onun bir kismini ifadelendiren bir konakçi hücreden ve (iv) tümörle baglantili antijenden kaynaklanan peptit epitoplar ile bir MHC molekül arasindaki izole 01341-P-0009 komplekslerden olusan gruptan seçilmis olan bir veya birçok bilesenden olusmaktadir. Araci, bir uygulama usulünde her seferinde selektif olarak, tümörle baglantili antijenlerden en az birinin açiklamaya uygun olarak tanimlanmis tümörle baglantili antijen oldugu durumda, tümörle baglantili farkli antijenlerin MHC molekülleri ve peptit epitoplari arasindaki kompleks miktarlarini artiran çesitli aracilari ihtiva etmektedir. Bunun yani sira açiklamasi yapilan ögreti, (i) açiklamaya göre tanimlanmis tümörle baglantili bir antijen veya onun bir kismindan (ii) açiklamaya göre tanimlanmis tümörle baglantili bir antij en veya onun bir kismi için kodlama yapan bir nükleik asitten, (iii) açiklamaya göre tanimlanmis bir tümörle baglantili antijene veya onun bir kismina baglanan bir antikordan, (iv) spesifik olarak açiklamaya göre tanimlanmis bir tümörle baglantili antijen için kodlama yapan bir nükleik asitle melezlestirilen bir antisens nükleik asitten, (v) açiklamaya göre tanimlanmis bir tümörle baglantili antijeni veya onun bir kismini ifade eden bir konakçi hücreden ve (vi) açiklamaya göre tanimlanmis bir tümörle baglantili antijen veya onun bir kismi ile bir HLA molekül arasindaki izole komplekslerden olusan bir gruptan seçilmis olan bir veya birkaç bileseni içeren parmasötik bir bilesim ile ilgilidir. Açiklamaya göre tanimlanmis tümörle baglantili bir antijen veya onun bir kisini için kodlama yapan bir nükleik asit, parmasötik bilesimde bir ifade vektöründe bulunabilir ve islevsel olarak bir kolaylastirici ile baglantili olabilir. Bir farmasötik bilesimin içeriginde bulunan konakçi hücre, tümörle baglantili bir antijeni veya onun bir kismini tecrit edebilir, yüzeyde ifade edebilir veya ilave olarak tümörle baglantili antijen veya onun bir kismina baglanan bir HLA molekülünü ifade edebilir. Uygulama usullerinden birinde konakçi hücre, HLA molekülünü endojen olarak ifade etmektedir. Konakçi hücre, bir baska uygulama usulünde HLA molekülünü ve/veya tümörle baglantili antijen veya onun bir 01341-P-0009 kismini rekombinan olarak ifade etmektedir. Konakçi hücre, tercihen proliferatif özellikte degildir. Konakçi hücre, tercih edilen bir uygulama usulünde antijen ortaya çikaran bir hücre olup özellikle bir monosit veya bir makrofaj dir. Farmasötik bir bilesimin içeriginde bulunan bir antikor, monoklonal bir antikor olabilir. Antikor, diger uygulama usullerinde kimera özellikli veya insanlastirilmis bir antikordur, dogal bir antikorun bir fragmanidir, veya birlesimsel tekniklerle üretilebilen bir sentetik antikordur. Antikor, tedavi veya tani açisindan yararli bir araci veya madde ile baglanmis olabilir. Farmasötik bir bilesimde bulunan antisens nükleik asit, açiklama geregince tanimlanmis bir tümörle baglantili antijen için kodlama yapan bir nükleik asitten dizilim içerebilir. Diger uygulama usullerinde açiklamaya uygun farmasötik bir bilesim vasitasiyla dogrudan veya bir nükleik asidin ifadelendirilmesiyle olusturulan tümörle baglantili antijen veya onun bir kismi, hücrelerin yüzeyindeki MHC moleküllerine baglanir ki bu baglanma, tercihen sitolitik bir reaksiyonu tetikleyen ve/veya sitokin salinimini tesvik eden bir baglanmadir. Farmasötik bir bilesim, farmasötik açidan uyumlu bir tasiyici ve/veya bir adjuvan içerebilir. Adjuvan; saponin, GM-CSF, CpG nükleotitleri, RNA, bir sitokin veya bir kemokinden seçilmis olabilir. Bir farmasötik bilesim, tercihen bir tümörle baglantili antijenin selektif ifadelendirilmesi veya anorinal ifadelendirilmesi ile kendini gösteren bir hastaligin tedavisi için uygulanir. Hastalik, tercih edilen bir uygulamada kanserdir. Açiklamasi yapilan ögreti, bunun yaninda bir veya birçok tümörle baglantili antijenlerin ifadelendirilmesi veya anormal ifadelendirilmesi ile kendini gösteren 01341-P-0009 bir hastaligin tedavisi, tanisi ve/veya takibine yönelik bir yöntem ile ilgilidir. Tedavi, bir uygulama usulünde farmasötik bir bilesim verilmesini kapsamaktadir. Hastalik, tercihen kanserdir ve "kanser" terimi, bunlarla sinirli olinainak üzere, kan kanseri, erbezi kanseri, melanom, teratom, beyin uru, böbrek, böbreküstü bezi, tiroit bezleri, bagirsak, karaciger, kalin bagirsak, mide, sindirim sistemi, lenf bezi, yemek borusu, kolorektal, pankreas, girtlak, burun, kulak (kulak-burun- bogaz), gögüs, prostat, rahim, yumurtalik ve akciger kanserlerini ve bunlarin metastazlarini kapsamaktadir. Açiklama, bir yönüyle açiklamaya göre tanimlanmis tümörle baglantili bir antijenin ifade edilmesi veya anormal ifade edilmesi ile kendini gösteren bir hastaliga tani konulmasina yönelik bir yöntem ile ilgilidir. Yöntem, bir hastadan izole edilen biyolojik örnekte (i) tümörle baglantili bir antijeni kodlayan bir nükleik asidin veya onun bir kisminin ve/veya (ii) tüinörle baglantili antijenin veya onun bir kisminin ve/veya (iii) tümörle baglantili bir antijen veya onun bir kismina karsi yönlendirilen bir antikorun ve/veya (iv) tümörle baglantili antijen veya onun bir kismi için spesifik olan sitotoksik veya yardimci T lenfositlerin kanitlanmasini kapsamaktadir. Kanit, belirli uygulama usullerinde (i) biyolojik örnegin spesifik olarak tümörle baglantili bir antijen veya onun bir kismi için kodlama yapan bir nükleik aside, tümörle baglantili antijene veya onun bir kismina, antikora veya tümörle baglantili antijen veya onun bir kismi için spesifik olan sitotoksik veya yardimci T lenfositlere baglanan bir araciyla temas ettirilmesini ve (ii) araci ile nükleik asit veya onun bir kismi, tümörle baglantili antijen veya onun bir kismi, antikor veya sitotoksik veya yardiinci T lenfositler arasindaki kompleks olusumunun kanitlaninasini kapsamaktadir. Hastalik, bir uygulama usulünde birçok farkli tümörle baglantili antijenlerin ifadesi veya anormal ifadesi ile kendini göstermektedir ve kanit, birçok farkli tümörle baglantili antijenleri kodlayan birçok nükleik asitin veya onlarin bir kisminin kanitini, birçok farkli tümörle baglantili antijenlerin veya onlarin bir kisminin 01341-P-0009 kanitini, tümörle baglantili birçok farkli antijene veya onlarin bir kismina baglanan birçok antikorun kanitini veya tümörle baglantili birçok antijen için spesifik olan birçok sitotoksik veya yardimci T lenfositlerin kanitlanmasini kapsamaktadir. Bir diger uygulama usulünde hastadan izole edilen biyolojik örnek, kiyaslanabilir normal bir biyolojik örnekle kiyaslamaya tabi tutulur. Açiklanan ögreti, bir baska bakimdan bir hastaligin gerilemesi, gelisme süreci veya ortaya çikisinin belirlenmesine yönelik, açiklamaya göre tanimlanmis tümör baglantili bir antijenin ifadelendirilmesi veya anormal ifadelendirilmesi ile kendini gösteren ve hastalik tanisi almis veya (i) tümörle baglantili antijen için kodlama yapan bir küme antijenden veya onun bir kismindan, (ii) tümörle baglantili bir küme antijen veya onun bir kismindan, (iii) tümörle baglantili antijen veya onun bir kismina baglanan bir küme antikordan ve (iv) tümörle baglantili antijen veya onun bir kismi ile bir MHC molekül arasindaki komplekse spesifik olan bir küme sitolitik T hücresi veya yardimci T hücresinden olusan gruptan seçilen bir veya birkaç parametre itibariyle hastaliga yakalanma süphesi bulunan bir hastadan alinan örnegin gözlemlenmesini içeren bir yöntemi kapsamaktadir. Yöntem, tercihen parametrenin veya parametrelerin alinan birinci ve ikinci bir örnekte belirli zamanlarda belirlenmesini ve bu sekilde her iki örnegin kiyaslanrnasiyla hastaligin gidisatinin tespit edilmesini kapsamaktadir. Hastalik, belirli uygulama usullerinde tümörle baglantili birçok farkli antijenin ifadelendirilmesi veya anormal ifadelendirilmesi ile kendini göstermektedir ve gözlemleme, (i) tümörle baglantili birçok farkli antijen veya onlarin bir kismi için kodlama yapan birçok nükleik asitten olusan bir kümenin ve/veya (ii) tümörle baglantili birçok farkli antijenin veya onlarin bir kisminin oldugu bir kümenin ve/Veya (iii) tümörle baglantili birçok farkli antijene ve bunlarin bir kismina baglanan birçok antikordan olusan bir kümenin ve/veya (iv) tümörle baglantili antijen veya onun bir kismi ile bir MHC molekül arasindaki komplekss spesifik olan bir küme sitolitik T hücresi veya yardimci T hücresinin gözlemlenmesinden olusmaktadir. 01341-P-0009 Bir nükleik asidin veya onun bir kisininin kanitlanmasi veya bir küme nükleik asidin veya onun bir kisminin gözlemlenmesi, bulusa göre spesifik olarak nükleik asit veya onun bir kismiyla melezlestirilen polinükleotit bir sonda ile veya nükleik asit veya onun bir kisminin selektif olarak genisletilmesi ile yapilabilir. Polinükleotit sonda, bir uygulama usulünde nükleik asitten 6-50, özellikle 10-30, -30 veya 20-30 baglantili nükleotitlerden olusan bir dizilimden olusmaktadir. Kanitlanacak tümör baglantili antijen veya onun bir kismi, belirli uygulama usullerinde hücre içinde veya hücre yüzeyinde bulunur. Tümör baglantili bir antijenin veya onun bir kisminin kanitlanmasi veya tümör baglantili bir antijenin veya onun bir kisminin gözlemlenmesi, bulusa göre spesifik olarak tümörle baglantili antijene veya onun bir kismina baglanan bir antikor ile yapilabilir. Diger uygulaina usullerinde kanitlanacak olan tümörle baglantili antijen veya onun bir kismi, bir MHC moleküllü, özellikle bir HLA moleküllü bir komplekste bulunmaktadir. Bir antikorla ilgili kanitlama veya bir küme antikorun gözlemlenmesi, bulusa göre spesifik olarak antikora baglanan bir protein veya peptitle yapilir. Sitolitik T hücreleri veya yardimci T hücrelerinin kanitlanmasi veya bir antijen veya onun bir kismi ile MHC molekülleri arasindaki komplekslere spesifik olan sitolitik T hücresi veya yardimci T hücresi kümelerinin gözlemlenmesi, bulusa göre antijen veya onun bir kismi ile bir MHC molekülü arasindaki kompleksi gösteren bir hücre ile yapilabilir. Kanitlama veya gözlemleme islemi için kullanilan polinükleotit sonda, antikor, protein veya peptit veya hücre, tercihen kanitlanabilir olarak isaretlenir. Kanitlanabilir isaretleyici, belirli uygulama usullerinde bir radyoaktif belirteç veya enzim belirtecidir. T lenfositlerin kanitlanmasi, ilave olarak 01341-P-0009 proliferasyonlarinin, sitokin üretimlerinin ve ayni zamanda MHC ve tümörle baglantili antijen veya onun bir kismiyla tetiklenen spesifik simülasyon ile yapilan sitotoksik faaliyetleri vasitasiyla kanitlanabilir. T lenfositlerle ilgili kanitlama, bunun yaninda rekombinant bir MHC molekülle veya ayni zamanda tümörle baglantili bir veya birkaç antijenden ilgili imünojen fragmanla yüklenen birçok molekülden meydana gelen bir kompleks ile ve spesifik T hücre reseptörünün temas ettirilmesi yoluyla yapilabilir ki bu suretle T lenfositler de tanimlanabilecektir. Açiklamasi yapilan ögreti, bir baska boyutuyla açiklamaya göre tanimlanan tümörle baglantili bir antijenin ifade edilmesi veya anormal ifade edilmesi ile kendini gösteren bir hastaligin tümörle baglantili antijen veya onun bir kismina baglanan bir antikorun verilmesini kapsayan ve terapötik veya taniya yönelik bir araci veya madde ile baglantili tedavisi, tanisi ve takibi ile ilgilidir. Antikor, monoklonal bir antikor olabilir. Antikor, diger uygulama usullerinde kimera özellikli veya insanlastirilmis bir antikordur veya dogal bir antikorun fragmanidir. Açiklamaya göre tanimlanmis tümörle baglantili antijenin ifade edilmesi veya anormal ifade edilmesi ile kendini gösteren bir hastaligin tanisi veya gözlemlenmesine yönelik olarak açiklamasi yapilan yöntemler, bazi uygulama usullerinde disemine tümör hücrelerinin veya tümör metastazlarinin yardimiyla veya vasitasiyla gerçeklesir. Disemine tümör hücrelerinin kanitlanmasi,ömegin kan, serum, ilik, balgam, bronsiyal aspirat ve/veya bronsiyal lavajda yapilabilir. Açiklamasi yapilan ögreti, açiklamaya göre tanimlanmis tümörle baglantili bir antijenin ifade edilmesi veya anormal ifade edilmesi ile kendini gösteren bir hastalik tanisi koninus hastanin tedavisine yönelik (i) hastadan bagisikliga tepkisel hücreleri haiz bir örnek alinmasi, (ii) alinan örnegin tümörle baglantili antijen veya onun bir kismina karsi sitolitik T hücrelerinin üretimini tesvik eden kosullarda tümörle baglantli antij eni veya onun bir kismini ifade eden bir konakçi 01341-P-0009 hücre ile temas ettirilmesi, (iii) sitolitik T hücrelerinin tümörle baglantili antijen veya onun bir kismini ifade eden hücrelerin çözülmesi için uygun olan bir miktarda hastaya verilmesini kapsayan bir yöntemle de ilgilidir. Sunulan ögreti, ayni zamanda sitolitik T hücrelerinin T hücre reseptörlerinin tümörle baglantili antijenlere karsi klonlanmasini ile de ilgilidir. Bu, istenen özelligin elde edilebilmesi ve (iii) sayili yan cümlede açiklandigi gibi hastaya verilebilmesi için diger T hücrelerine de transfer edilebilir. Konakçi hücre, bir uygulama usulünde HLA molekülünü endojen olarak ifade etmektedir. Bir baska uygulama usulünde konakçi hücre, bir HLA molekülünü ve/veya tümörle baglantili antijeni veya onun bir kismini rekombinan olarak ifade etmektedir. Konakçi hücre, tercihen proliferatif degildir. Konakçi hücre, tercih edilen bir uygulama usulünde antijen sunucu bir hücre, özellikle agaç görünümlü bir hücre, bir monosit veya bir makrofajdir. Mevcut açiklama bir diger yönüyle, tümörle baglantili bir antijenin ifadesi veya anormal ifadesiyle kendini gösteren bir hastalik tanisi konmus bir hastanin (i) açiklamaya göre tanimlanmis olan ve hastalikla baglantili olan hücreler tarafindan ifade edilen tümörle baglantili bir antijeni kodlayan nükleik asitlerden birinin tanimlanmasini, (ii) bir konakçi hücrenin nükleik asit veya onun bir kismiyla transfekte edilmesini (iii) transfekte edilen konakçi hücrenin nükleik asidin ifadesi için uygun ortamda üretilmesini (bu islem, yüksek transfeksiyon oraninin saglandigi durumlarda zorunlu degildir) ve (iv) konakçi hücrelerin veya onlardan alinan bir ekstraktin hastanin hastalikla baglantili hücrelerine karsi bagisiklik reaksiyonunu güçlendirmeye yetecek oranda hastaya verilmesini kapsayan tedavi yöntemiyle ilgilidir. Yöntem, bunun yani sira tümörle baglantili bir antijen veya onun bir kisinini temsil eden bir MHC molekülün tanimlaninasini da kapsayabilir ki burada konakçi hücre, MHC inolekülünü ifadelendirir ve tümörle baglantili antijen veya onun bir kisinini temsil eder. Bagisiklik reaksiyonu, B hücresi reaksiyonunu veya T hücresi reaksiyonunu kapsayabilir. T hücreleri reaksiyonu, 01341-P-0009 bunun yani sira tümörle baglantili antijen veya onun bir kismini temsil eden konakçi hücreler için spesifik olan veya hastanin tümörle baglantili antijen veya onun bir kismini ifade eden hücreleri için spesifik olan sitolitik T hücresi ve/veya yardimci T hücresi üretimini de kapsayabilir. Açiklamasi yapilan ögreti, açiklamaya göre tanimlanmis tümörle baglantili antijenin ifadesi veya anormal ifadesiyle kendini gösteren bir hastaligin tedavisi ile ilgili (i) hastadan alinan ve tümörle baglantili antijenin anormal miktarlarini ifade eden hücrelerin tanimlanmasini (ii) hücre örneklerinin izole edilmesini (iii) hücrelerin kültive edilmesini (iv) hücrelerin, hücrelere karsi bagisiklik reaksiyonunu tetikleyemeye uygun miktarda hastaya verilmesini kapsayan bir yöntem ile de ilgilidir. Açiklamaya göre kullanilan konakçi hücreler, tercihen proliferatif olmayan veya proliferatif yapilmayan hücrelerdir. Tümörle baglantili bir antijen ve onun bir kisminin ifadelendirilmesi veya anormal ifadelendirilmesi yoluyla kendisi gösteren hastalik özellikle kanserdir. Mevcut açiklama, bunun yani sira (a) SEQ 1D NO. 3-5 olan bir grubu, onun bir kismini veya türevini kapsayan bir nükleik asit dizilimini içeren bir nükleik asitten (b) yukaridaki (a) cümleciginde belirtilen nükleik asitle baglayici kosullar altinda melezlestirilen bir nükleik asitten (c) yukaridaki (a) veya (b) cümleciklerinde belirtilen nükleik asitlerle iliskilendirilerek dejenere edilen bir nükleik asitten ve (d) yukaridaki (a), (b) veya (0) cümleciklerinde belirtilen nükleik asitlere komplementer olan bir nükleik asitten olusan bir gruptan seçilen bir nükleik asit bir gruptan, onun bir kismindan veya türevinden seçilen bir amino asit dizilimini kapsayan bir protein veya polipeptit için kodlama yapan bir nükleik asitle de 01341-P-0009 Açiklamasi yapilan ögreti, bir diger yönüyle açiklamaya uygun nükleik asitlerin promotör diziliinleriyle de ilgilidir. Bunlar, islevsel olarak bir baska gen ile tercihen bir ifade vektöründe baglanabilir ve bu sekilde ilgili hücrelerde bu genin selektif ifadesini saglamak mümkün olabilir. Bulus, bir baska yönüyle açiklamaya uygun bir nükleik asit içeren rekombinan bir nükleik asit molekülü, özellikle bir DNA veya RNA molekülüdür. Mevcut ögreti, ayni zamanda bildirime uygun bir nükleik asiti kapsayan açiklamaya uygun nükleik asit veya rekombinant nükleik asit molekülü içeren konakçi hücrelerle de ilgilidir. Konakçi hücre, bunun yani sira bir HLA molekülü için kodlama yapan bir nükleik asiti kapsayabilir. Konakçi hücre, bir uygulama usulünde HLA molekülünü endojen olarak ifade eder. Bir diger uygulama usulünde konakçi hücre, HLA molekülünü ve/veya açiklamaya uygun nükleik asidi veya onun bir kismini rekombinan olarak ifade eder. Konakçi hücre, tercihen proliferatif olmayan bir hücredir. Konakçi hücre, tercih edilen bir uygulama usulünde antijen sunan bir hücredir, özellikle agaç biçimli bir hücre, bir monosit veya bir makrofajdir. Açiklamasi yapilan ögreti, bir diger uygulama usulünde açiklama uyarinca tanimlanmis nükleik asitleri melezlestiren ve genetik sonda veya "antisens" molekül olarak kullanilabilen oligo nükleotitlerle ilgilidir. Bildirime uygun tanimlanmis bir nükleik asit veya onun kisimlariyla melezlestirilinis oligo nükleotit primer veya yeterli örnek seklinde olan nükleik asit molekülleri, açiklamaya uygun tanimlanmis nükleik asitle benzer kökenli olan nükleik asitlerin bulunmasinda kullanilabilir. PCR amplifikasyonu ve güney ve kuzey melezlestirme, benzer kökenli nükleik asitlerin tespit edilmesinde kullanilabilir. Melezlestirme, düsük derecede baglayici kosullarda yapilabilir, ancak daha iyi bir melezlestirme orta dereceli baglayici kosullarda, en iyi melezlestirme ise yüksek 01341-P-0009 dereceli baglayici kosullarda gerçeklestirilebilir. Bulusa göre buradaki "baglayici kosullar" terimi, polinükleotitler arasinda spesifik melezlestirmeye olanak saglayan kosullari ifade etmektedir. Açiklama, bir baska yönüyle (a) SEQ ID NO. 3-5 olan bir gruptan, onun bir kismindan veya türevinden olusan bir nükleik asit dizilimi içeren bir nükleik asitten (b) yukaridaki (a) cümleciginde belirtilen nükleik asitle baglayici kosullarda melezlestirilen bir nükleik asitten (c) yukaridaki (a) ve (b) cümleciginde belirtilen nükleik asitlerle ilintili olarak dejenere olan bir nükleik asitten ve (d) yukaridaki (a), (b) ve (c) cümleciklerinde belirtilen nükleik asitlere komplementer olan bir nükleik asitten olusan bir gruptan seçilen bir nükleik asit tarafindan kodlanan bir protein, polipeptit veya peptit ile ilgilidir. Açiklama, gruptan, onun bir kismindan veya türevinden olusan bir amino asit dizilimi içeren bir protein, polipeptit veya peptit ile ilgilidir. Açiklamasi yapilan ögreti, bir baska yönüyle açiklamaya göre tanimlanan tümörle baglantili bir antijenin imunojen fragmani ile ilgilidir. Fragman, tercihen bir insan HLA reseptörüne veya bir insan antikoruna baglanir. Bildirime uygun bir en az 30 veya en az 50 amino asitli bir dizilimi kapsar. kismindan veya türevinden olusan bir gruptan seçilen bir dizilimi gösteren veya kapsayan bir peptit ile ilgilidir. Açiklamasi yapilan ögreti, bir diger yönüyle açiklama geregince tanimlanmis tümörle baglantili bir antijene veya onun bir kismina baglanan bir araci ile ilgilidir. Tercih edilen bir uygulama usulünde bir antikor araci olarak kullanilir. 01341-P-0009 Antikor, diger uygulama usullerinde kimera özellikli, insanilestirilmis veya kombine tekniklerle üretilmis bir antikordur veya antikorun bir fragmanidir. Açiklama, bunun yaninda seçmeli olarak (i) açiklamaya göre tanimlanmis tümörle baglantili bir antijen veya onun bir kisminin kompleksine ve (ii) açiklamaya göre tanimlanmis bir tümörle baglantili bir antijene veya onun bir kismina baglanan bir MHC molekülüne baglanan bir antikor ile ilgilidir ki burada antikor sadece (i) veya (ii) kapsaminda baglanma yapmaz. Antikor, monoklonal bir antikor olabilir. Antikor, diger uygulama usullerinde kimera özellikli veya insanlastirilmis bir antikordur veya dogal bir antikorun bir fragmanidir. Mevcut açiklama, özellikle bir araci, özellikle de spesifik olarak SEQ ID NO: 17- diziyi haiz bir gruptan, onun bir kismindan veya bir türevinden seçilen bir dizilimi gösteren veya kapsayan bir peptite baglanan bir antikorla ilgilidir. Bulus, Claudin-18 konusunda spesifik olarak Claudin-18'in bir degiskenine baglanan bir araci, özellikle bir antikorla ilgilidir. Araci, özellikle antikor, bir uygulama usulünde spesifik olarak Claudin degiskenine baglanir. Araci, özellikle antikor, bir baska uygulama usulünde ise spesifik olarak Claudin degiskenine baglanir. Bu tür spesifik antikorlar, örnegin 4 numarali Ömekte tanimlanan peptitlere bagisiklik kazandirilmasi yoluyla elde edilebilir. Bulus, Claudin 18 ile ilgili olarak bunun yani sira belirli aracilarla, özellikle spesifik olarak Claudin l8A2'nin belirli bir glikosilasyon örnegi gösteren bir biçimine baglanan antikorlarla ilgilidir. Araci, özellikle antikor, bir uygulama usulünde spesifik olarak Claudin 18A2'nin bir veya birkaç muhtemel glikosilasyon noktasinda glikosile olmamis bir biçimine baglanir. Bir diger uygulama usulünde ise araci, Özellikle antikor, Claudin 18A2'nin bir veya birkaç muhtemel glikosilasyon noktasinda glikosile olmus bir biçimine baglanir. Bu tür 01341-P-0009 141, 146 ve 205 amino asit pozisyonlarindan olusan bir gruptan seçilmis olan bir veya birkaç pozisyon ile ilgilidir. Bu tür bir glikosilasyon, bunun yani sira tercihen bir N glikosilasyon ile ilgilidir. Claudin 18'in bir degiskeni, diger bir deyisle bir baska biçimi için spesifik bir araci, özellikle Claudin l8'in bir degiskeni, diger bir deyisle bir baska biçimi için spesifik bir antikor, bu baglamda aracin, yani antikorun spesifik olarak yönlendigi degiskene, diger bir deyisle degisik biçime diger degisken veya degisik biçimlere oldugundan daha güçlü bir sekilde baglandigi anlamina gelmektedir. Bir araci, özellikle bir antikor, birinci bir degiskene veya degisik birinci bir degisik biçime veya birinci epitopa, ikinci bir degiskene veya degisik ikinci biçime veya ikinci epitopa baglandigi çözünme sabitesinden daha düsük bir çözünme sabitesi (KD) ile baglandiginda, birinci degiskene veya degisik birinci biçime veya birinci epitopa ikinci degiskene veya degisik ikinci biçime veya ikinci epitopa oranla daha kuvvetli bir sekilde baglanir. Aracin, özellikle antikorun spesifik olarak baglandigi degisken veya degisik biçim için olan çözünme sabitesi (KD), tercihen aracin, özellikle antikorun Spesifik olarak baglanmadigi degisken veya degisik biçim için olan çözünme sabitesinden (KD) 10 kat, tercihen 20 kat , daha tercihli 1000 kattan daha küçüktür. Araci, özellikle antikor, tercihen araci, özellikle antikora spesifik olmayan degiskene veya degisik biçime veya epitopa baglanmaz veya esas olarak baglanmaz. Yukarida tanimlanan ve Claudin 18'in bir degiskenine veya degisik biçimine spesifik olarak baglanan aracilar, özellikle antikorlar ve onlarin burada tanimlanan türevleri, bulusa göre bilesim ve yöntemlerde kullanim için de öngörülmüstür. Bulus, bunun yani sira açiklamaya göre tanimlanmis tümörle baglantili bir antijen veya onun bir kismina baglanan açiklamaya uygun araci veya bildiriine uygun bir 01341-P-0009 antikor ile bir terapötik veya taniya yönelik bir araci veya madde arasindaki bir konjugat ile ilgilidir. Terapötik veya taniya yönelik araci, bir uygulama usulünde bir toksindir. Açiklamasi yapilan ögreti, bir baska yönüyle açiklamaya göre tanimlanmis bir tümörle baglantili antijenin ifadesi veya anormal ifadesinin kanitlanmasina yönelik olan ve (i) tümörle baglantili antijeni veya onun bir kismini kodlayan bir nükleik asidin (ii) tümörle baglantili antijenin veya onun bir kisminin, (iii) tümörle baglantili antijene veya onun bir kismina baglanan antikorlarin ve/veya (iv) tümörle baglantili antijen veya onun bir kismi ile bir MHC molekülü arasindaki komplekse spesifik olan T hücrelerinin kanitlanmasina yönelik araci kapsayan bir donati ile ilgilidir. Nükleik asitlerin veya onlarin bir kisminin kanitina yönelik aracilar, bir uygulama usulünde nükleik asitlerin seçimlik veya 20-30 nükleik asit nükleotidi içeren bir dizilimi kapsayan nükleik asit molekülleridir. Bulusun Ayrintili Tanimi Mevcut bulusta tümör hücrelerinde selektif olarak ifade edilen veya aberan olarak ifade edilen ve tümörle baglantili antijenleri temsil eden genler tanimlanmaktadir. Açiklama uyarinca bu genler ve/veya bunlarin gen ürünleri ve/veya onlarin türevleri ve/veya kisimlari, terapötik yaklasimlar için tercih edilen hedef yapilardir. Terapötik yaklasimlar, kavramsal anlamda selektif olarak ifade edilen tümörle baglantili gen ürününün faaliyetini baskilama amacina yönelik olabilir. Bu yaklasim, seçilen ilgili aberan ifadenin fonksiyonel olarak tümör patojenetik anlamda önemli olmasi ve buna karsi olan engellemenin ilgili hücrelere selektif olarak hasar verilmesi yoluyla olusturulmasi durumunda mantikli bir yaklasimdir. Diger terapötik konseptler, tümörle baglantili antijenleri, hücrelere zarar verme 01341-P-0009 potansiyeli olan etkileyici mekanizmalarin selektif olarak tümör hücrelerine dogru çekilmesi için kullanilan isaretleme olarak kabul etmektedir. Burada hedef molekülün kendisinin ve üstlendigi rolün tümör olusumundaki islevi, tamamen önemsizdir. Açiklamaya göre bir nükleik asidin "türevi" terimi, nükleik asitte tek tek veya çoklu olarak nükleotid ikamesi, çikarimi veya ilavesi bulundugu anlamina gelmektedir. "Türev" terimi, bunun disinda bir nükleik asidin nükleotid bazda, sekerde veya fosfatta türevlendirilmesini de kapsamaktadir. "Türev" terimi, bunun yani sira dogada bulunmayan nükleotitleri ve nükleotit benzesiklerini içeren nükleik asitleri de kapsar. Bir nükleik asit, açiklamaya göre tercihen dezoksiribo nükleik asit (DNA) veya ribonükleik asittir (RNA). Nükleik asitler, bulus kapsaminda genomik DNA, cDNA, mRNA, rekombinan olarak üretilmis ve kimyasal olarak sentetize edilmis molekülleri kapsamaktadir. Bir nükleik asit, açiklama kapsaminda tek dizili veya çift dizili ve dogrusal veya ortak degerlikli daire seklinde kapali molekül seklinde bulunabilir. Açiklamaya uygun olarak tanimlanmis nükleik asitler, tercihen izole nükleik asitlerdir. "Izole nükleik asit" terimi, bulusa göre nükleik asidin bir (i) in vitro ortamda, örnegin polimeraz zincirleme reaksiyonu (PCR) yoluyla amplitiye edilmis oldugu, (ii) rekombinan olarak klonlama vasitasiyla üretilmis oldugu, (iii) örnegin bölme ve jel elektroferöz ayirma yoluyla saflastirilmis oldugu, veya (iv) örnegin kimyasal bilesimlerle sentetize edilmis oldugu anlamina gelmektedir. Izole edilmis bir nükleik asit, rekombinan DNA teknikleri kullanilarak yapilacak bir manipülasyon islemi için kullanima sunulan bir nükleik asittir. Bir nükleik asidin diger bir nükleik aside "komplementer" olmasi, ancak her iki dizilimin birbiriyle melezlenebilmesi ve stabil çift yönlü bir yapi olusturabilmeleri 01341-P-0009 durumunda mümkün olabilir ki bu durumda melezlemenin tercihen polinükleotitler arasinda spesifik bir melezlenineye olanak veren kosullar (baglayici kosullar) altinda olusan bir melezleme olmasi tercih edilmektedir. Baglayici kosullar, Örnegin Moleküler Klonlama: Laboratuar El Kitabi (Molecular Clom'ng: A Laboratory Handbook), J. Sambrook et al., 2. Baski, Cold Spring Harbor Laboratory Press Yayini, Cold Spring Harbor, New York, 1989 veya Moleküler Biyolojide Güncel Protokoller (Current Protocols in Molecular Bi'ology) EM. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., New York gibi çalismalarda tanimlanmistir ve örnegin melezleme tampon maddesinde 65°C derecede melezleme islemini kapsamaktadir (3,5 x SSC, % 0,02 fikol, % 0,02 Sitrat, pH 7'dir. DNA'nin tasindigi membran, melezleme isleminden sonra örnek olarak oda sicakliginda 2 x SSC içinde ve sonra 0,] - 0,5 x SSC / 0,1 x SDS içinde 68°C dereceye kadar olan sicaklikta yikanir. Komplementer nükleik asitler, bulusa göre nükleotit kimliginin en az % 40'ini, özellikle en az % SO'sini, en az % 60'1n1, en az % 70'ini, en az % 80'ini, en az % 90'ini ve tercihen en az % 95'ini, en az % 98'ini veya en az % 99'unu göstermektedir. Tümörle baglantili antijenler için kodlama yapan nükleik asitler, açiklamaya göre tek baslarina veya diger nükleik asitlerle, özellikle heterolog nükleik asitlerle kombinasyon halinde bulunabilir. Tercih edilen uygulama usullerinde bir nükleik asit, islevsel olarak ifade kontrol dizilimleriyle veya nükleik asitlere nazaran heterolog veya homolog durumda olabilen düzenleyici dizilimlerle baglanti içinde bulunur. Kodlayan bir dizilim ve düzenleyici bir dizilim, ancak kodlayan diziliinin ifadesinin veya transkripsiyonunun düzenleyici dizilimin kontrolü veya etkisi altinda oldugu bir durumda birbirleriyle ortak degerlikli olarak baglantili olmalari durumunda "islevsel" olarak birbirleriyle baglantili olmus demektir. Kodlama 01341-P-0009 yapan diziliinin islevsel bir proteine aktarilmasi gerekiyorsa düzenleyici dizilimin endüksiyonu, düzenleyici bir diziliinin kodlayan dizilimle islevsel baglantisinda, kodlayan dizilimde okuma çerçevesi kaymasina veya kodlayan dizilimde istenen protein veya peptide aktarilmasi konusunda güçsüzlüge neden olmaksizin kodlayan dizilimin transkripsiyonuna yol açar. denetleyen kolaylastirici, gelistirici unsurlari veya diger kontrol unsurlarini kapsamaktadir. Belirli uygulama usullerinde ifade kontrol dizilimleri düzenlenebilir. Düzenleyici dizilimlerin kesin yapisi, türe veya hücre tipine bagli olarak degiskenlik göstermekle birlikte genel olarak TATA kutusu, capping dizilimi, CAAT dizilimi ve benzerleri gibi kopyalama veya aktarim isleminin baslangicinda katilim göstermeyen 5' kopyalanmamis ve 5' aktarilmamis dizilimi kapsamaktadir. Özellikle 5' kopyalanmamis düzenleyici dizilimler, islevsel olarak baglanan genin transkripsiyonel kontrolü amaçli bir kolaylastirici dizilimi içeren bir kolaylastirici bölgeyi kapsamaktadir. Düzenleyici dizilimler, gelistirici dizilimleri veya akis yukari konumlu etkinlestirici dizilimleri de kapsayabilir. Yani sonuç olarak bir taraftan burada tanimlanan tümörle baglantili antijenler, istenildigi kadar çesitli ifade kontrol dizilimleri ve kolaylastiricilar ile kombine edilebilmektedir. Ancak diger taraftan burada taniinlanan tümörle baglantili gen ürünlerini de istenildigi kadar çesitli genlerle kombine etmek mümkün olmaktadir. Bu durum, kolaylastiricilardan seçimlik faaliyetlerde yararlanilmasina olanak vermektedir. Bulusa göre, bir nükleik asit, bunun yaninda, nükleik asit tarafindan kodlanan proteinin veya polipeptidin konakçi hücreden segresyonunu denetleyen bir polipeptit için kodlama yapan diger bir nükleik asitle baglanti içinde bulunabilir. Bir nükleik asit, kodlanan protein veya polipeptidin konakçi hücrenin hücre membrani üzerinde baglanmasina veya bu hücrenin belirli organellerinde 01341-P-0009 bölümlere ayrilmasina yol açan bir polipeptit için kodlama yapan bir nükleik asitle de birlikte bulunabilir. Baglanti, benzer sekilde bir haberci geni veya herhangi bir "etiketi" temsil eden bir nükleik asitle de olabilir. Tercih edilen bir uygulama usulünde rekombinan DNA molekülü, gerektiginde bir nükleik asidin, örnegin açiklamaya uygun tümörle baglantili antijeni kodlayan bir nükleik asidin ifadesini kodlayan bir kolaylastirici ile denetleyen bir vektördür. örnegin prokaryot ve/Veya ökaryot hücrelerin içine sokulmasini ve gerektiginde bir genom içine entegre edilmesini mümkün kilan her türlü nükleik asit araci tasitini kapsamaktadir. Bu tür vektörler, tercihen hücre içinde kopyalanir ve/veya ifade edilir. Araci bir tasit, örnegin elektroporasyonda, mikro projektil bombalamada, lipozomal ilaç verme yönteminde, agro bakteriler yardimiyla yapilan transferde veya DNA veya RNA virüsleri üzerinden yapilan insersiyonda kullanim için uyarlanabilir. Vektörler, plazmid, fajmid veya virüs genomlarini Açiklama geregince tanimlanan bir tümörle baglantili bir antijeni kodlayan nükleik asitler, konakçi hücrelerin transkfeksiyonu için kullanilabilir. Nükleik asit terimiyle rekombinan DNA'lar oldugu gibi RNA'lar da kastedilmektedir. Rekombinan RNA, in vitro ortamda yapilan transkripsiyon yoluyla DNA matrisinden üretilebilir. Bunun yani sira aplikasyondan önce stabilize edici dizilimler, capping ve poli adenilasyon yoluyla modifiye edilebilir. dönüstürülebilir veya transfekte edilebilir nitelikte olan her bir hücreyi kapsamaktadir. "Konakçi hücre" terimi, bulusa göre prokaryotik (örnegin E. Coli) veya ökaryotik hücreleri (örnegin agaç biçimli hücreleri, B hücreleri, CHO hücreleri, COS hücreleri, K562 hücreleri, maya hücreleri ve böcek hücreleri) kapsamaktadir. Insan, fare, siçan, domuz, keçi, primat gibi memelilerin hücreleri 01341-P-0009 özellikle tercih edilir. Hücreler, çok çesitli doku tiplerinden alinmis olabilir ve primer hücre ve hücre dizilerini kapsar. Spesifik örnekler, keratinosit, periferik kan lökositleri, kemik iligi kök hücreleri ve embriyonik kök hücrelerini kapsar. Konakçi hücre, diger uygulama usullerinde antijen sunan bir hücre, özellikle agaç seklinde olan bir hücre, bir monosit veya makrofajdir. Bir nükleik asit, konakçi hücrede bir tek veya birçok kopya halinde bulunabilir ve bir uygulama usulünde konakçi hücre içinde ifade edilir. RNA veya RNA ve protein üretimini kapsamaktadir. Terim, ayni zamanda nükleik asitlerin kismen ifadelendirilmesini de kapsamaktadir. Ifadelendirme, ayrica kisa süreli veya duragan gerçeklesebilir. Memeli hücrelerinde tercih edilen ifadelendirme sistemleri, G418'e karsi direnç gösteren (ve böylece duragan olarak transfekte edilen hücre dizilerinin seçimini olanakli kilan) ve bir gen gibi seçilebilir bir isaretçi ve sitomegalo virüsün (CMV) kolaylastirici gelistirici dizilimlerini içeren pcDNA sistemlerini kapsamaktadir. Açiklama kapsaminda bir HLA molekülünün bir tümörle baglantili antijen veya onun bir kismini sundugu durumlarda ifadelendirme vektörü, HLA molekülü için kodlayan bir nükleik asidi de kapsayabilir. HLA molekülü için kodlayan nükleik asit dizilimi, tümörle baglantili antijen veya onun bir kismi için kodlayan nükleik asit ile ayni ifadelendirme vektöründe bulunabilir veya her iki nükleik asit degisik ifadelendirine vektöründe yer alabilir. Her iki ifadelendirme vektörü, bu son durumda bir hücre içine kotransfekte edilebilir. Bir konakçi hücrenin ne tümörle baglantili antijeni veya onun bir kismini ne de HLA molekülü ifade etmemesi durumunda onun için kodlayan her iki nükleik asit, ya ayni ifadelendirme vektöründe ya da ayri ifadelendirme vektörlerinde hücre içine transfekte edilir. Hücrenin HLA molekülü önceden ifade etmis olmasi durumunda sadece tümörle 01341-P-0009 baglantili antijeni veya onun bir kismini kodlayan nükleik asit dizilimi, hücre içine transfekte edilebilir. Açiklamaya göre tümörle baglantili bir antijeni kodlayan bir nükleik asidin amplifikasyonuna yönelik donatilar kapsama alinmistir. Bu tür donatilar, örnegin tümörle baglantili antijenleri kodlayan nükleik asitlere melezlestirilen birkaç amplifikasyon primerlerini de kapsamaktadir. Primerler, tercihen birbirine bagli olan ve priiner dimer olusumunu önleme açisindan üst üste olmayan 6-50, dizilimi kapsamaktadir. Primerlerden biri, tümörle baglantili antijeni kodlayan bir nükleik asit yumaginda hibritlesir ve diger primer, tümörle baglantili antijeni kodlayan nükleik asidin amplifiye edilmesine olanak taniyan bir düzen içinde komplementer yumakta hibritlesir. düzenlenmesi, özellikle ifadelendirilmesinin azaltilmasi amaçli olarak kullanilabilir. "Antisens molekül" veya "antisens nükleik asit" terimi, bulusa göre oligoribo nükleotid, oligo deoksiribo nükleotid, modifiye edilmis oligoribo nükleotid veya modifiye edilmis oligo deoksiribo nükleotid olan ve fizyolojik kosullarda belirli bir geni içeren bir DNA'ya veya bu genin mRNA'sina bu genin transkripsiyonunu ve/veya bu inRNA'nin aktarimini bastiracak oranda hibridize olan bir oligonükleotittir. Bir "antisens molekül", açiklamaya göre dogal kolaylastiricisi açisindan ters yönelimde bir nükleik asit veya onun bir kismini içeren bir yapidir. Bir nükleik asidin veya onun bir parçasinin antisens transkripti, dogal olarak var olan ve enzimi nitelendiren bir mRNA ile bir dupleks olusturabilir ve bu sekilde mRNA'nin aktif enzim içine yigilmasini veya aktarimini engelleyebilir. Bir diger olasilik ise nükleik asidin inaktive edilmesine yönelik olarak ribozom kullanimidir. Tercih edilen antisens oligo nükleotitler, 01341-P-0009 nükleotidi içeren bir dizilim gösteren ve tercihen hedef nükleik aside veya onun bir kismina tamamen komplementer yapida olanlardir. Antisens oligo nükleotit, tercih edilen uygulama usullerinde bir N uçlu veya 5' akima karsi konumlanmis nokta ile aktarim, kopyalama veya kolaylastirici nokta ile oluyormus gibi hibride olur. Diger uygulama usullerinde antisens nükleotit 3' aktarim olmamis bölge veya mRNA uç birlestirme noktasiyla hibride olur. Oligo nükleotit bir uygulama usulünde ribo nükleotit, dezoksiribo nükleotit veya bunlarin bir kombinasyonundan olusur. Bu kapsamda nükleotitin 5' ucu ve bir diger nükleotitin 3' ucu, fosfodisteraz bir bag ile birbiriyle baglanir. Bu nükleotitler, alisilagelmis yöntemlerle sentetize edilebilir veya rekombinan olarak üretilebilir, Oligonükleotit, tercih edilen uygulama usullerinde "modifiye edilmis" bir oligonükleotittir. Oligonükleotit, bu kapsamda stabilitesini ve terapötik etkisini yükseltmek için, hedefe baglanma konusundaki yeteneginde hiçbir azalma olmaksizin çok çesitli sekillerde modifiye olabilir. "Modifiye oligonükleotit" terimi, bulusa göre (i) en az iki nükleotitinin nükleotit için sentetik bir bag ile (diger bir deyisle fosfodisteraz olmayan bir nükleotit içi bag ile) birbiriyle baglandigi ve/Veya (ii) normal durumda nükleik asitlerde bulunmayan bir kimyasal grubun kovalen olarak oligonükleotitle baglanmis oldugu oligonükleotit anlamina gelmektedir. Tercih edilen oligonükleotit baglar; fosforotioat, alkilo fosfonat, fosforoditioat, fosfat esteri, alkilo fosfonotioat, fosfor amidatlar, karbamatlar, karbonatlar, fosfat triesteri, asetamidatlar, karboksimetil esteri ve peptitlerdir. seker ihtiva eden oligonükleotit anlamina gelmektedir. i'Modifiye oligonükleotitler", örnegin kovalen olarak düsük molekül agirlikli, 3' 01341-P-0009 pozisyonunda hidroksil grubu ve 5' pozsiyonunda fosfat grubu olmayan organik gruplarla baglanmis olan seker artiklari ihtiva eden oligonükleotitleri kapsamaktadir. Modifiye oligonükleotitler, örnek olarak 2' O alkillestirilmis riboz artiklari veya riboz yerine arabinoz gibi baska bir seker ihtiva edebilir. Açiklamaya göre tanimlanan proteinler ve polipeptitler, tercihen izole durumda olanlardir. "Izole protein" veya "izole polipeptit" terimleri, dogal ortamlarindan ayrilmis protein veya polipeptitleri tanimlayan terimlerdir. Izole bir protein veya polipeptit, büyük ölçüde arindirilmis bir durumda bulunabilir. "Büyük ölçüde arindirilmis" terimi, dogada veya in vivo ortamda bulundugu diger maddelerden büyük ölçüde bagimsiz oldugu durumu ifade etmektedir. Bu tür protein ve polipeptitler, örnegin antikor üretiminde, imünolojik veya tanisal incelemelerde veya terapötik uygulamalarda kullanilir. Açiklamaya göre tanimlanmis protein ve polipeptitler, doku veya hücre homojenati gibi biyolojik örneklerden izole edilebilir ve birçok prokaryotik veya ökaryotik ifadelendirme sistemlerinde rekombinan olarak ifade edilebilir. Bir proteinin veya polipeptitin veya bir amino asit diziliminin "türevleri", bu bulus kapsamindaki anlam dahilinde amino asit ekleme degiskenlerini, amino asit silme degiskenlerini ve/veya amino asit substitüsyon degiskenlerini kapsamaktadir. Amino asit insersiyon degiskenleri, amino ve/veya karboksi uçlu füzyonlari ile belirli bir amino asit dizilimindeki tek veya birçok amino asidin insersiyonlarini kapsar. lnsersiyonlu amino asit dizilim degiskenlerinde bir veya birçok amino asit kalintisi, sonuçta ortaya çikan ürünün uygun bir sekilde taranmasi ile rastlantisal bir insersiyon da inüinkün olinasina karsin, bir amino asit diziliininde önceden belirlenmis bir noktaya yerlestirilir. Amino asit silme degiskenleri, dizilimden bir veya birkaç amino asidin uzaklastirilmasi ile karakterizedir. Amino asit substitüsyon degiskenleri, en azindan bir kalintinin dizilimden uzaklastirilmasi ve 01341-P-0009 onun yerine bir baska kalintinin yerlestirilmesi ile kendini gösterir. Modifikasyonlar, tercihen amino asit dizilimindeki homolog protein veya polipeptitler arasinda korunmamis olan pozisyonlarda bulunur. Amino asitler, tercihen hidrofobisite, hidroIilisite, elektro negatiflik, yan zincir oylumu veya benzeri diger tür özelliklerle ikame edilir (koruyucu substitüsyon). Koruyucu substitüsyonlar, örnegin bir amino asidin, diger bir amino asitle, asagida ayni grupta substitüe edilen amino asit olarak belirtilen amino asitlerle degisimi ile 1. Küçük alifatik, polar olmayan veya hafif derecede polar olan kalintilar: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly) Negatif yüklenmis kalintilar ve bunlarin amitleri: Asn, Asp, Glu, Gln Pozitif yüklenmis kalintilar: His, Arg, Lys Büyük alifatik, polar olmayan kalintilar: Met, Leu, Ile, Val (Cys) Büyük aromatik kalintilar: Phe, Tyr, Trp. Üç kalinti, protein mimarisindeki önemli rolleri nedeniyle parantez içine alinmistir. Gly, yan zinciri olmayan yegane kalinti olup bu özelligiyle zincire esneklik saglar. Pro, zinciri güçlü bir sekilde daraltan olaganüstü bir geometriye sahiptir. Cys, bir disülfit köprüsü kurabilir. Yukarida tanimlanan amino asit degiskenleri, bilinen peptit sentezleme teknikleriyle, örnegin Kati Faz Sentesi (Solid Phase Synthesis, Merrif'ield, 1964) ile veya benzer tekniklerle veya rekombinan DNA manipülasyonu vasitasiyla kolayca üretilebilir. Bilinen veya kismen bilinen dizilime sahip DNA'larda Önceden belirlenmis noktalarda substitüsyon mütasyonlari yerlestirmek için kullanilan teknikler, iyi bilinmektedir ve örnegin Ml3 mutajenezini kapsar. DNA dizilimlerinin substitüsyon, insersiyon veya delesyon ile protein üretimine yönelik olarak manipüle edilmesi konusu, örnegin Sambrock et al. (1989) tarafindan yapilan arastirmada ayrintili bir sekilde açiklanmistir. 01341-P-0009 Protein, polipeptit veya peptitlerin "türevleri", karbonhidrat, lipit ve/veya proteinler, polipeptitler veya peptitler gibi enzimle baglantili olan her türlü proteinin tekli veya çoklu subsititüsyonlarini, delesyonlarini ve/veya adisyonlarini da kapsar. "Türev" terimi bunun yani sira protein, polipeptit ve peptitlerin islevsel tüm kimyasal esdegerlerini de kapsayan bir terimdir. Tümörle baglantili bir antijenin bir kismi veya fragmani, içinden çiktigi polipeptitin islevsel özelliklerini gösterir. Bu tür islevsel özellikler, antikorlarla karsilikli etkilesimi, diger polipeptit veya proteinlerle karsilikli etkilesimi, nükleik asitlerin seçmeli olarak baglanmasini ve bir enzimatik faaliyeti kapsamaktadir. Önemli bir özellik, HLA ile bir kompleks olusturarak gerektiginde bir bagisikli reaksiyonu üretme yetenegidir. Bu bagisiklik reaksiyonu, sitotoksik veya T yardimci hücrelerden ilseri gelen bir reaksiyon olabilir. Tümörle baglantili bir antijenin bulusa uygun bir kismi veya fragmani, tercihen tümörle baglantili antijenden kaynaklanan en az 6, özellikle en az 8, en az 10, en az 12, en az 15, en az 20, en az 30 veya en az 50 birbirini takip eden amino asitten olusan bir dizilimi Tümörle baglantili antijen için kodlayan nükleik asidin bir kismi veya fragmani, açiklamaya göre nükleik asidin en azindan tümörle baglantili antijen için ve/veya tümörle baglantili antijenin bir kismi veya bir fragmani için yukarida açiklandigi gibi kodlama yapan kismi ile ilgilidir. Tümörle baglantili antijenler için kodlayan genlerin izolasyonu ve tanimlanmasi, bir veya birkaç tümörle baglantili antijenin ifadelendirilmesi yoluyla kendini gösteren bir hastaligin tanilanmasini olanakli kilar. Bu yöntemler, tümörle baglantili bir antijen için kodlayan bir veya birkaç nükleik asidin belirlenmesini ve/veya kodlanan tümörle baglantili antijenin ve/veya ondan türetilen peptitlerin belirlenmesini kapsar. Nükleik asitlerin belirlenmesi, polimeraz zincirleme reaksiyon veya isaretlenmis bir sonda ile melezlestirme dahil alisilagelmis 01341-P-0009 yöntemlerle yapilabilir. Tümörle baglantili antijenlerin veya onlardan türetilen peptitlerin belirlenmesi, hastanin özel antikorlu serumlarinin antijen ve/Veya peptitlerin taninmasina yönelik olarak taranmasi yoluyla yapilabilir. Bu, ayni zamanda hastanin T hücrelerinin ilgili tümörle baglantili antijenin özelliklerine yönelik taranmasiyla da gerçeklestirilebilir. Mevcut ögreti, antikorlar ve tümörle baglantili antijenlerin hücresel baglanti partnerleri dahil olinak üzere burada tanimlanan tümörle baglantili antijenlere baglanan proteinlerin izolasyonunu da mümkün kilar. Mevcut ögretide belirli uygulama usullerinde tümörle baglantili antijenlerden türetilen "dominant negatif' polipeptitler de kullanima sunulur. Dominant nitelikli negatif bir polipeptit, bir proteinin, hücresel mekanizma ile karsilikli etkilesim iliskisi dahilinde, hücresel mekanizma ile kendi etkilesimi içinden aktif bir proteini baskilayan veya aktif bir proteinle yaristirarak aktif proteinin etkisinin azalmasina yol açan aktif olmayan bir degiskenidir. Örnegin bir ligandi baglayan, ancak ligand baglanimina reaksiyon olarak hiçbir sinyal üretmeyen dominant nitelikli bir negatif reseptör, ligandin biyolojik etkisini azaltabilir. Benzer sekilde normal olarak hedef proteinler ile karsilikli etkilesim içinde olan, ancak hedef proteinleri fosforile etmeyen dominant nitelikli katalitik aktif olmayan bir kinaz, hücresel sinyalle etki içinde hedef proteinlerin fosforilasyonunu azaltabilir. Benzer sekilde bir genin kontrol bölgesindeki promotör noktaya baglanan, ancak genin transkripsiyonunu yükseltmeyen dominant negatif bir transkripsiyon faktörü, normal bir transkripsiyon faktörünün etkisini promotör baglanti noktalarini istila ederek transkripsiyonu yükseltmeksizin azaltabilir. Dominant negatif bir polipeptidin bir hücre içinde ifadelendirilmesi, aktif proteinlerin islevinin azaltilmasi ile sonuçlanir. Uzman, bir proteinin dominant negatif degiskenlerini örnegin geleneksel mutajenez yöntemleriyle ve degisken polipeptitin dominant negatif etkisini degerlendirerek üretebilir. 01341-P-0009 Açiklanan Ögreti, tümörle baglantili antijenlere baglanan polipeptit gibi maddeleri de kapsamaktadir. Bu tür baglanma maddeleri, örnegin tüinörle baglantili antijenlerin ve baglanti maddeleriyle birlikte tümörle baglantili antijenlerin komplekslerinin kanitlanmasina yönelik uygulanan tarama testleri ile tümörle baglantili antij enlerin veya onlarin komplekslerinin baglanti partnerleri ile birlikte saflastirilmasinda kullanilabilir. Bu tür maddeler, tümörle baglantili antijenlerin aktivitesinin, örnegin bu tür antijenlerin baglanmasi yoluyla, bastirilmasinda da kullanilabilir. Bu nedenle selektif olarak tümörle baglantili antijenlere baglanma becerisi gösteren antikor veya antikor fragmanlari, açiklama kapsamindaki baglama maddeleridir. Antikorlar, geleneksel usullerle üretilen poliklonal ve monoklonal antikorlari kapsamaktadir. Bu tür antikorlar, proteinleri dogal durumlarinda ve/veya denatüre olduklari Spesifik olarak hedef proteine baglanan spesifik antikorlar içeren antiserumlar, çesitli standart yöntemlerle üretilebilir. Kiyaslama için örnek çalismalar: Practical Approach)", Yazarlari: Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19- 963722-9, "Antikorlari Laboratuar El kitabi (Antiboa'ies: A Laboratory Manual)" Kullanmak: Laboratuar El Kitabi: Tasinabilir NO Protokolü (Using Antibodies.' A Laboratory Manual: Portable Protocol N0)" Yazarlari: Edward Harlow, David proteinlerini dogal sekillerinde taniyan affine ve spesifik antikorlar üretmek de 01341-P-0009 116, 2000). Bu, öncelikle terapötik uygulamalarda kullanilma durumunda olan antikorlar için oldugu kadar ayni zamanda birçok tanisal uygulama için de önemlidir. Bu amaçla tüm proteinle, hücre disi kismi dizilimlerle ve hedef molekülünü fizyolojik katli formda ifade eden hücrelerle bagisiklik kazandirilabilir. Monoklonal antikorlar, geleneksel olarak hibridoma teknolojisiyle üretilebilir (Teknik ayrintilar için bkz: Monoklonal Antikorlar: Pratik bir Yaklasim (Monoclonal Antibodies: A Practical Approach)", Yazarlari: Philip Shepherd, (Antibodies: A Laboratory Manual)" Yazarlari: Ed Harlow, David Lane ISBN: Protokolü (Using Antibodi'es: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO)" Antikorun kendi epitopuna baglanmasinda antikor molekülünün sadece küçük bir parçasinin, yani paratopun rol oynadigi bilinmektedir (kiyaslayiniz Clark, W.R. (1986), Modern Immünolojinin Deneysel Temelleri (The Experimental Foundation.? of Modern Immunology), Wiley & Sons, Inc., NeW York; Roitt, I. (1991), `Temel Immünoloji (Essential Immunology), 7. Baski, Blackwell Bilimsel Yayincilik, Oxford). Örnegin pFc' ve F0 bölgeleri, kompleman kaskadinin etkileyicileridir, ancak antijen baglaniminda bir rolleri yoktur. Bünyesinden pFc' bölgesinin enzimatik olarak ayrilmis oldugu veya pFc' bölgesi olmaksizin üretilmis olan, F(ab')2 fragmani olarak tanimlanan bir antikor, eksiksiz bir antikorun her iki antijen baglanma noktalarini tasir. Benzer sekilde bünyesinden Fe bölgesinin enzimatik olarak ayrilmis oldugu veya Fc bölgesi olmaksizin üretilmis olan, Fab fraginani olarak tanimlanan bir antikor, saglam bir antikor molekülünün antijen baglanim noktasini tasir. Bunun yani sira Fab fragmanlari, bir antikorun kovalen bagli hafif zincirinden ve antikorun F d olarak tanimlanmis 01341-P-0009 agir zincirinin bir kismindan olusur. Fd fragmanlari, antikor özelliginin ana belirleyicileridir (tek bir Fd fragmani, antikorun özelligini degistirmeksizin, 10 adede kadar farkli hafif zincirle iliskilendirilebilir) ve Fd fragmanlari, izolasyon durumunda epitopa baglanma yetenegini kaybetinez. Antikorun antijen baglayan kisminda dogrudan antijenin epitopu ile karsilikli etkilesime giren tümleyici-belirleyici bölgeler (CDR'ler) ve paratoplarin tersiyer yapilarini koruyan iskele bölgeleri (FR'ler) bulunur. Hem agir zincirin Fd fragmaninda hem de IgG immünglobüllerin hafif zincirinde ayri ayri üç tümleyici- belirleyici bölge ile bölümlenen (CDRl'den CDR3'e kadar) dört iskele bölgesi (FRl'den FR4'e) bulunur. CDR'ler ve özellikle CDR3 bölgeleri ve daha da fazlasiyla agir zincirin CDR3 bölgesi, büyük ölçüde antikor spesifisitesinden sorumludur. Bir memelinin antikorlarinin CDR olmayan bölgelerinin esit veya degisik bir spesifiteye sahip antikorlarin benzer bölgeleriyle ikame edilebildikleri ve bu sirada ilk antikorun epitop spesifisitesinin degismeden kaldigi bilinmektedir. Bu durum, islevsel antikor üretimi için insan disindaki canlilardan alinan CDR'lerin kovalen olarak insani FR ve/Veya Fc/pFc' bölgeleriyle iliskilendirildigi B hücreleri izole edilir ve hücreler monoklonal hale getirilir. Bunu takiben izole edilmis B hücrelerinin arta kalani, antikor spesifisitesi açisindan analiz edilir. Akabinde hibridoina teknolojisinin aksine antikorun degisken bölgesi, tek PCR hücresiyle amplifiye edilir ve uygun bir vektör içine klonlanir. Bu sekilde monoklonal antikor kazanimi hizlandirilir (de Wildt et al. lmmünolojik Yöntemler WO 92/04381 numarali patentte bir baska örnek olarak insanlastirilmis RSV 01341-P-0009 antikorlarinin, fareden alinan FR bölgelerinin en az bir kisininin insandan alinan FR bölgeleri ile ikame yoluyla fareden üretilmesi ve kullanimi tanimlanmaktadir. Antijene baglaniin yetenekli saglam antikorlarin fragmanlari dahil bu tür antikorlar, siklikla "kimera" antikor olarak tanimlanmaktadir. Açiklama uyarinca antikorlarin F(ab')2, Fab, FV und Fd fragmanlari, ve/Veya FC ve/veya FR ve/veya CDRl ve/veya CDR2 ve/veya hafif Zincirli CDR3 bölgelerinin homolog insan kaynakli veya insan kaynakli olinayan dizilimlerle ikame edildigi kimera antikorlar, FR ve/veya CDRl ve/veya CDR2 ve/veya hafif Zincirli CDR3 bölgelerinin homolog insan kaynakli veya insan kaynakli olmayan dizilimlerle ikame edildigi kimera nitelikli F(ab')2 fragman antikorlar, FR ve/veya CDRl ve/veya CDR2 ve/veya hafif Zincirli CDR3 bölgelerinin homolog insan kaynakli veya insan kaynakli olmayan dizilimlerle kimera nitelikli Fab fragman antikorlar ve FR ve/veya CDRl ve/veya CDR2 bölgelerinin homolog insan kaynakli veya insan kaynakli olmayan dizilimlerle ikame edildigi kiinera nitelikli Fd fragman antikorlar da kullanima sunulmaktadir. Tek Zincirli antikor olarak tanimlananlar da açiklama uyarinca kapsama dahil edilmistir. Spesifik olarak tümörle baglantili antijenlere baglanan polipeptitler de açiklama kapsamindadir. Bu tür polipeptit baglama maddeleri, örnegin çözelti içinde basit bir sekilde hareketsizlestirilmis formda veya faj gösterimli kütüphane olarak üretilebilen dejenere edilmis peptit kütüphaneleri yoluyla da kullanima hazir hale getirilebilir. Bir veya birkaç amino asitli birlesimsel peptit kütüphanelerini de üretmek mümkündür. Kütüphaneler, bunun yani sira peptoidlerden veya peptidik olmayan sentetik kalintilardan da üretilebilir. Faj gösterimi, bulusa uygun baglama peptitlerinin tanimlanmasinda özellikle etkili olabilir. Bu islemde örnegin (örnek olarak ml3, fd veya lamda faj kullanmak suretiyle) 4 ila yaklasik 80 amino asit kalintisindan olusan bir uzunlukta eklentiler gösteren bir faj kütüphanesi üretilir. Daha sonra ise tümörle baglantili antijenlere 01341-P-0009 baglanan eklentileri tasiyan fajlar seçilir. Bu süreç, tümörle baglantili antijenlere baglanan fajlarin geri seçimi seklinde muhtelif döngülerde tekrarlanabilir. Tekrarlanan döngüler, belirli dizilimleri tasiyan fajlarin zenginlesmesine yol açar. Ifade edilen polipeptit dizilimlerinin taninmasi için DNA dizilimlerinin analizi yapilabilir. Dizilimin tümörle baglantili antijene baglanan en küçük lineer kismi belirlenebilir. Maya "ikili hibrit sistemi", tümöre bagli antijenlere baglanan polipeptitlerin tanimlanmasinda da kullanilabilir. Bulusa göre tanimlanan tümörle baglantili antijenler veya onlarin fragmanlari, tümörle baglantili antijenlerin peptit baglanma partnerlerinin tanimlanmasi ve seçilmesi için faj gösterim kütüphaneleri dahil peptit kütüphanelerinin taranmasi için kullanilabilir. Bu tür moleküller, örnek olarak tarama incelemeleri, saflastirma protokolleri, tümörle baglantili antijenin isleviyle yapilacak bir girisim veya uzmanlar tarafindan bilinen diger amaçlar için kullanilabilir. Yukarida tanimlanan antikor ve diger baglanti molekülleri, örnegin tümörle baglantili antijeni ifade eden dokularin tanimlanmasi için kullanilabilir. Antikorlar, ayrica tümörle baglantili antijenleri ifadelendiren hücre ve dokularin gösterimine yönelik olarak tani amaçli kullanilan Spesifik maddelerle de eslestirilebilir. Antikorlari bunun yani sira terapötik anlamda yararli maddelerle de eslestirmek mümkündür. Tanisal amaçli kullanilan maddeler, bunlarla sinirli olmamak üzere, baryum sülfat, iosetamik asitleri, iopan asitleri, kalsiyum ipodat, sodyum diyatrizoat, meglumin diyatrizoat, metrizamid, sodyum tiropanoat ile ve indiyum 111 gibi gama emitörleri, manyetik çekirdek rezonansinda kullanilan flüorin ve gadolinyum gibi nüklitleri içeren radyolojik tani maddelerini kapsamaktadir. "Terapötik anlamda yararli madde terimi,, bulus kapsaminda anti kanserojen maddeler, radyoaktif iyot ihtiva eden baglantilar, toksinler, sitostatik veya sitolitik ilaç maddeleri vs. dahil istege göre bir veya birkaç tümörle baglantili antijeni ifadelendiren hücreye tasinan her türlü terapötik molekülü ifade etmektedir. Anti kanserojen maddeler, örnek olarak aminoglutetimid, azatioprin, 01341-P-0009 bleomisin sulfat, busulfan, carinustine, klorambusil, sisplatin, siklofosfamid, siklosporin, sitarabidin, dacarbazin, daktinomisin, daunoiubin, doksorubisin, taksol, etoposide, tlouorouracil, interferon alfa, lomustin, mercaptopurin, metotreksat, mitotan, prokarbazin HCl, tioguanin, vinblastin sülfat ve Vinkristin sülfat gibi maddelerdir. Diger antikanserojen maddeler, örnegin Goodman ve Gilman: Terapi Biliminin Farmalojik Temeli (Goodman and Gilman's The Pharmacologi'cal Basi's of T herapeuti'cs) 8. Baski, 1990, McGraW-Hill, Inc., adli eserde, özellikle bu eserin 52. bölümünde [Antineoplastik Ajanlar (Antineoplaszi'c Agents (Yazarlar: Paul Calabresi ve Bruce A. Chabner)] tanimlanmistir. Toksinler, sekerci boyasi bitkisinden antiviral protein, kolera toksini, pertussis toksini, risin, gelonin, abrin, difteri eksotoksini veya pseudo monas eksotoksin olabilir. Toksin kalintilari, kobalt 60 gibi yüksek enerji yayan radyo nüklitler de olabilir. hayvan, özellikle inek, at, domuz, koyun, keçi, köpek, kedi gibi memeli hayvanlar veya fare ve siçan gibi kemirgen hayvanlari ifade etmektedir. Hasta, özellikle tercih edilen bir uygulama usulünde insandir. veya anormal ifadelendirildigi her türlü patolojik durumu ifade etmektedir. saglikli bir bireydeki duruma kiyasla degistirildigi, tercihen artirildigi anlamina gelmektedir. Ifadelendirmenin artirilmasi, en az % 10, özellikle en az % 20, en az usulünde tümörle baglantili antijen, sadece hasta bireyin dokusunda ifadelendirilirken saglikli bireydeki ifadelendirilme baskilanir. Bu tür bir hastaliga örnek kanserdir ve "kanser" terimi, bulus kapsaminda kan kanseri, erbezi kanseri, melanom, teratom, beyin uru, böbrek, böbreküstü bezi, tiroit bezleri, bagirsak, karaciger, kalin bagirsak, mide, sindirim sistemi, lenf bezi, yemek borusu, 01341-P-0009 kolorektal, pankreas, girtlak, burun, kulak (kulak-burun-bogaz), gögüs, prostat, rahim, yumurtalik ve akciger kanserlerini ve bunlarin metastazlarini kapsamaktadir. Biyolojik bir örnek, bulusa göre doku ve/veya hücre örnegi olabilir ve kullanim için burada tanimlanan çok çesitli, örnegin punch biyopsi dahil doku biyopsisi, ve kandan, bronsial aspirat, balgam, ürin, diski veya diger vücut sivilarindan alim gibi yöntemlerle alisilagelmis sekilde elde edilebilir. (örnegin B hücresi, T yardimci hücre veya sitolitik T hücresi) içine olgunlasabilen bir hücredir. Immünreaktif hücreler, CD34+ hematopoietik kök hücrelerini, olgunlasmamis ve olgunlasmis T hücrelerini ve olgunlasmamis ve olgunlasmis B hücrelerini kapsar. Tümörle baglantili antijenleri taniyan sitolitik veya yardimci T hücrelerinin üretilmesi isteniyorsa immünreaktif hücre, sitolitik hücrelerin ve yardimci T hücrelerinin üretim, farklilasma ve/veya seleksiyonunu kolaylastiran kosullarda tümörle baglantili bir antijeni ifadeleyen bir hücreyle temas ettirilir. T hücre öncülerinin bir antijenle karsi karsiya getirilmesi durumunda sitolitik T hücre olarak farklilasmasi, bagisiklik sisteminin klonal seleksiyonuna benzer bir Bazi terapötik yöntemler, hastanin bagisiklik sisteminin, bir veya birkaç tümöre bagli antijen sunan kanser hücreleri gibi antijen sunan hücrelerinin çözülmesine yol açan reaksiyonuna dayanir. Burada örnegin bir tümörle baglantili antijen ve bir MHC molekülü kompleksi için spesifik olan otolog sitotoksik T lenfozitleri, hücre anormalitesi olan bir hastaya verilir. Bu tür sitotoksik T lenfozitlerinin in vitro ortamda üretilmesi bilinmektedir. T hücrelerinin farklilastirilmasi ile ilintili yöntemle ilgili bir örnek, WO-A-9633265 patentte bulunmaktadir. Genellikle hastadan kan hücreleri gibi hücrelerle ilgili bir örnek alinir ve hücreler, bir kompleks sunan ve sitotoksik T lenfositlerin (örnegin agaç biçimli hücrelerin) 01341-P-0009 çogalmasini tetikleyebilen bir hücreyle temas ettirilir. Hedef hücre, bir COS hücresi gibi transfekte edilmis bir hücre olabilir. Transfekte edilmis bu hücreler, yüzeylerinde istenen kompleksi sunarlar ve sitotoksik T lenfositlerle temas ettirilmeleri durumunda çogalmalarini tesvik eder. Klonal genisletilmis otolog sitotoksik T lenfositleri, daha sonra hastaya verilir. Antijene spesifik sitotoksik T lenfositlerinin seleksiyonuna yönelik bir baska yöntemde MHC sinif 1 molekül peptit komplekslerinin florojen tetramerleri, sitotoksik T lenfositlerinin spesifik klonlarinin kaniti için kullanilir (Altman et al., ßz mikroglobulin ve sinif 1 moleküle baglanan bir peptit antijeninin varliginda katlamaya tabi tutulur. Bunlar, MHC/peptit komplekslerinin saflastirilmasindan sonra biyotin ile isaretlenir. Tetramerler, biyotinlenmis peptit MHC komplekslerinin isaretlenmis avidin (örnegin fikoeritrin) 421 molar orani dahilinde olusturulur. Tetramerler, daha sonra periferik kan veya lenf bogumlari gibi sitotoksik T lenfositleri ile temas ettirilir. Tetramerler, peptit antijen/MHC sinif I kompleksini taniyan sitotoksik lenfositlere baglanir. Tetramerlere baglanan hücreler, florisil güdümlemeli hücre tasnifi yoluyla reaktif sitotoksik T lenfositlerin izolasyonu için tasnif edilebilir. Izole edilen sitotoksik T lenfositler, daha sonra in vitro ortamda çogaltilabilir. Adoptif transfer olarak tanimlanan bir terapötik yöntemde (Greenberg, J. kompleksi sunan hücreler (örnegin agaç biçimli hücreler), tedavi edilen hastanin sitotoksik T lenfositleri ile kombine edilir, bu sayede spesifik sitotoksik T lenfositlerin çogalmasi saglanir. Çogaltilan sitotoksik T lenfositleri, daha sonra spesifik kompleks sunan belirli anormal hücrelerle karakterize olan bir hücresel 01341-P-0009 anomali gösteren bir hastaya verilir. Sitotoksik T lenfositler, daha sonra anormal hücreleri parçalar, bu sayede arzu edilen terapötik etki elde edilir. Bir hastanin T hücre dagarcigindan bu tür bir spesifik komplekse karsi, siklikla sadece düsük dereceli afin T hücreleri çogalir, çünkü yüksek dereceli afin olanlar tolerans gelisiminde imha edilir. T hücre reseptörlerinin transferi, burada bir alternatif olabilir. Bunun için ayni sekilde arzu edilen kompleksi sunan (örnegin agaç biçimli) hücreler, saglikli kisilerin veya diger bir türün (örnegin farenin) sitotoksik T lenfositleri ile kombine edilir. Bu, T lenfositlerin spesifik kompleksle o ana kadar hiçbir temasta bulunmamis bir bagisçi organizmadan kaynaklanmasi durumunda yüksek afin nitelikteki sitotoksik T lenfositlerin çogalmasina yol açar. Çogaltilan bu spesifik T lenfositlerin yüksek afin T hücre reseptörü, klonlanir. Bunlar, yüksek afin T hücre reseptörlerinin baska bir türden klonlanmis olmasi durumunda degisik ölçülerde insanilestirilir. Daha sonra bu tür T hücre reseptörleri, gen transferi yoluyla, örnegin retroviral vektörlerle istenildigi kadar hastanin T hücrelerine transdüksiyon yoluyla verilir. Adoptif transfer, daha sonra bu genetik olarak degistirilmis T lenfositler ile yapilir (Stanislawski et al., Nat Yukarida açiklanan terapötik yaklasimlar, hastanin en azindan bazi anormal hücrelerinin tümörle baglantili antijen ve bir HLA molekülü kompleksini sunmasi durumundan yola çikmaktadir. Bu tür hücrelerin tanimlanmasi, kendi içinde bilinen bir yolla yapilir. Kompleks sunan hücreler tanimlandiginda hastadan alinan ve sitotoksik T lenfositi içeren bir örnekle kombine edilebilir. Kompleks sunan hücrelerin sitotoksik hücreler tarafindan çözülmesi durumunda tümörle baglantili bir antijen sunumu oldugu kabul edilebilir. Adoptif transfer, bulus uyarinca uygulanan tek terapi sekli degildir. Sitotoksik T lenfositleri, in vivo ortamda kendi içinde bilinen yöntemle de üretilebilir. Bir yöntemde kompleksi ifadelendiren proliferatif olmayan hücreler kullanilir. Bu 01341-P-0009 yöntemde kullanilan hücreler, normalde kompleksi ifadelendiren isinlanmis hücreler veya kompleksin sunumu için gerekli olan bir veya her iki genle transfekte olan olan hücreler olacaktir (diger bir deyisle antijen peptit ve sunucu HLA molekülü). Çesitli hücre tipleri kullanilabilir. Bunun yani sira ilgili bir grni veya her iki geni tasiyan vektörler de kullanilabilir. Viral veya bakteriyel vektörler özellikle tercih edilir. Örnegin bir tümörle baglantili antijen veya onun bir kismi için kodlayan nükleik asitler, islevsel olarak tümörle baglantili geni veya onun bir fragmaninin ifadesini belirli dokularda veya hücre tiplerinde denetleyen kolaylastirici ve gelistirici dizilimlerle iliskilendirilebilir. Nükleik asit bir ifadelendirme vektörü içine yerlestirilebilir. Ifade vektörleri, içlerine eksojen nükleik asit insersiyonunun mümkün oldugu modifiye edilmemis ekstra kromozal nükleik asitler, plazmitler veya viral genomlar olabilir. Tümörle baglantili bir antijen için kodlama yapan nükleik asitler, retroviral bir genom içine de yerlestirilebilirler ki bu suretle nükleik asidin hedef doku veya hedef hücrenin genomu içine entegrasyonu saglanir. Bu sistemlerde vaksinia Virüsü, poks virüs, herpes simpleks virüs, retro virüs veya adeno virüs gibi bir mikro organizma ilgili geni tasir ve konakçi hücreleri de fakto olarak "enfekte" eder. Bir diger tercih edilen form, tümörle baglantili antijenin rekombinan RNA olarak yerlestirilmesidir. Bunlar, örnegin liposomal transfer veya elektro porasyon yoluyla hücrelere yerlestirilebilir. Sonuçta olusan hücreler, ilgili kompleksi sunar ve daha sonra çogalan otolog sitotoksik T lenfositler tarafindan taninirlar. Benzer bir etki, antijen sunan hücrelere i'n vi'vo ortamda bir yerlestirme gerçeklestirebilmek için tümörle baglantili antijen veya onun bir fragmaninin bir adjuvan ile kombinasyonu yoluyla elde edilebilir. Tümörle baglantili antijen veya onun bir fragmani, protein, DNA (örnegin bir vektörün içinde) veya RNA olarak sunulmus olabilir. Tümörle baglantili antijen, HLA molekül için peptit partner elde etmek için isleme tabi tutulurken diger taraftan onun bir fragmani, baska bir isleme tabi tutmaya gerek olmaksizin sunulabilir. Bu sonuncu durum, özellikle bunlarin HLA inolekülüne baglanabildigi duruinu ifade etmektedir. Tüm antijenin 01341-P-0009 i'n vivo ortamda agaç biçimli bir hücre tarafindan isleme tabi tutuldugu verme biçimleri, burada ayni zamanda yardimci T hücrelerinde de tepki olusma ihtimali nedeniyle tercih edilir. Etkili bir bagisiklik tepkisi, bunlara ihtiyaç duyar (Ossendorp et al., Immunol Lett. 74:75-9, 2000; Ossendorp et al., J. Exp. Med. hastaya örnegin intradermal enjeksiyon yoluyla zerk edilebilir. Ancak enjeksiyon, intranodal yolla bir lenf bogumuna da yapilabilir (Maloy et al., Proc Natl Acad içine alimi kolaylastiran ayiraçlarin kombinasyonu yoluyla da yapilabilir. Tercih edilen tümörle baglantili antijenler, alojen kanser anti serumlariyla veya birçok kanser hastasinin T hücreleriyle reaksiyon gösterenlerdir. Ancak öncesinde kendilerine karsi anlik bagisiklik tepkisi olmayanlar, özellikle ilginçtir. Bunlara karsi kanitlanabilir sekilde dis etkiyle tümörleri çözen bagisiklik etkisi Açiklamaya göre tanimlanan farmasötik bilesimler, bagisiklik kazandirinaya yönelik asi olarak da kullanilabilir. "Bagisiklastirma" veya "asilama" terimleri açiklamaya göre bir antijene karsi bagisiklik reaksiyonunun artirilmasi veya aktive edilmesini ifade etmektedir. Hayvan modelleri, kansere karsi bagisiklik kazandiran bir etkinin test edilmesi amacina yönelik olarak tümörle baglantili bir antijen veya onun için kodlama yapan bir nükleik asitten yararlanilarak kullanilabilir. Örnegin insandan alinan kanser hücreleri, bir tümör olusturmak için bir fareye yerlestirilebilir ve tümörle baglantili antijen için kodlayan bir veya birkaç nükleik asit zerk edilebilir. Kanser hücreleri üzerindeki etki (örnegin tümörün büyüklügünde meydana gelen azalma), nükleik asitlerle yapilan bagisikligin bir ölçüsü olarak alinabilir. Bir veya birkaç tümörle baglantili antijen veya onlarin uyarici fragmanlari, 01341-P-0009 bagisiklik kazandirma ainaçli bir bilesigin bir parçasi olarak bir veya birkaç adjuvan bagisiklik reaksiyonunu baslatmak veya bagisiklik reaksiyonunu artirmak için zerk edilebilir. Adjuvan, antijen içine yerlestirilen veya bununla birlikte zerk edilen ve bagisiklik reaksiyonunu güçlendiren bir maddedir. Adjuvan inaddeler, antijen dagarciklarinin (hücre disi veya makrofaj olarak) düzenlenmesi, makrofajlarin aktivasyonu ve/veya belirli lenfositlerin uyarilmasi yoluyla bagisiklik reaksiyonunu güçlendirilebilirler. Adjuvan maddeler, bilinen maddeler olup bunlarla sinirli olmainak kaydiyla monofosforil lipid A (MPL, SmithKline Beecham), QSZ] (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO gibi saponinleri, tam olmayan Freund adjuvan, tam Freund adjuvan, E vitamini, Montanid, Alaun, CpG oligo nükleitler(kiyaslayiniz Kreig et al., Doga (Nature) yaglardan elde edilen farkli yag/su emülsiyonlarini kapsamaktadir. Peptitler, tercihen DQS21/MPL içeren bir karisim ile zerk edilir. DSQ21'in MPL'ye orani, yaklasik 1:1'dir. Insana verilme amaçli DQS21 ve MPL, genel olarak yaklasik 1 ug ila yaklasik 100 u g araliginda asi for'rnülasyonu olarak mevcuttur. Hastanin bagisiklik reaksiyonunu uyaran diger maddeleri de vermek mümkündür. Örnegin sikotinler, lenfositler üzerindeki düzenleyici özellikleri nedeniyle asilamada kullanilabilir. Bu tür sikotinler, örnegin asilarin koruyucu etkilerini güçlendirdigi kanitlanmis olan interleukin l2(lL 12) (kiyaslayiniz Science Bagisiklik reaksiyonunu güçlendiren ve bu nedenle asilama isleminde kullanilabilme niteliginde olan bir dizi baglanti vardir. Bu baglantilar, protein veya nükleik asit olarak hazir hale getirilen kostimülan molekülleri kapsamaktadir. Bu tür kostimülan moleküller, örnegin agaç biçimli hücreler (DC) üzerine ifade edilen ve T hücreleri üzerine ifade edilen CD28 molekülleri ile 01341-P-0009 karsilikli etkilesiin içinde olan B7-l ve B gibi moleküllerdir. Bu karsilikli iletisim, antijen/MHC/TCR tarafindan stimüle edilen (sinyal 1) T hücre için bir kostimülasyonu (sinyal 2) saglar ki bunun neticesinde T hücrenin çogalimi ve efektör islevi güçlendirilir. B7, ayni zamanda CTLA4 (CD152) T hücreleri ile de karsilikli etkilesime girer ve CTLA4 ve B7 ligandlarinin dahil edildigi arastirmalar, B7 ile CTL-A4 arasindaki karsilikli etkilesimin tümöre karsi bagisikligi ve CTL çogalimini güçlendirebildigini (1998)). B7, T hücreleri için etkili antijen sunucu hücre (APC) olmamalari için tipik olarak tüinör hücrelerine ifadelendirilmez. B7 ifadelendirmesinin baslatilmasi, tüinör hücrelerinin sitotoksik T lenfositlerinin çogalimini ve etkileyici nitelikli bir islevin tetiklenmesini mümkün kilar. B7/IL-6/IL-12 kombinasyonunun kostimülasyonu bunun da daha güçlü bir T hücre faaliyetine neden oldugunu göstermistir Sitotoksik T lenfositlerinin tam bir aktivasyonu ve tam bir etkileyici fonksiyon, T yardimci hücreleri üzerindeki CD 40 ligandlarinin ve agaç biçimli hücreler tarafindan ifade edilen DC40 molekülü arasindaki karsilikli etkilesim yoluyla T yardimci hücrelerin katilimini gerektirir (Ridge et al., Nature 3932474 (1998)). Bu kostimülasyon sinyalinin mekanizmasi, muhtemelen B7 ve baglantili lL-6 / lL-l2 üretiminin agaç biçimli hücreler (antijen sunucu hücreler) yoluyla artirimi ile ilgilidir. CD40 /CD40 L karsilikli etkilesimi, bu sekilde sinyal l(antijen/MHC-TCR) karsilikli etkilesimi ve sinyal 2 (B7-CD28) karsilikli etkilesimini tamamlar. Agaç biçimli hücrelerin uyarilmasi için anti CD40 antikorlarinin kullanimi, 01341-P-0009 beklentiye uygun sekilde dogrudan normal olarak iltihapli reaksiyon alaninin disinda bulunan veya uzman olmayan antijen sunucu hücreler (tümör hücreleri) tarafindan sunulan tümör antijenlere karsi reaksiyonu güçlendirir. Bu durumlarda T yardimci ve B7 kostiinüle edici sinyaller saglaninaz. Bu mekanizma, antijen darbeli agaç biçimli hücrelere dayali terapilerle baglantili olarak kullanilmaz. Açiklamaya göre nükleik asitlerin, polipeptit veya peptitlerin verilmesi de öngöiülmektedir. Poliepetit ve peptitlerin verilmesi, kendi içinde bilinen yollarla yapilir. Bir uygulama usulünde nükleik asitlerin verilmesi ex vi'vo yöntemle, yani hastadan hücrelerin alinmasi, tümörle baglantili bir antijen yerlestirilmesi için hücrelerin genetik olarak degistirilmesi ve degistirilmis hücrelerin tekrar hastaya verilmesi suretiyle yapilir. Bu, genel olarak bir genin islevsel bir kopyasinin hastanin hücrelerine in vitro ortamda yerlestirilmesi ve genetik olarak degistirilmis hücrelerin tekrar hastaya verilmesini kapsar. Genin islevsel kopyasi, genin genetik olarak degistirilmis hücrelerde ifadelendirilmesine olanak taniyan düzenleyici unsurlarin islevsel kontrolü altindadir. Transfeksiyon ve transdüksiyon ile ilgili yöntemler uzmanlarca bilinmektedir. Açiklama kapsaminda nükleik asitlerin in vivo ortamda virüs ve hedef denetimli liposomlar gibi vektörler kullanilarak verilmesi de öngörülmektedir. Tercih edilen bir uygulama usulünde adeno virüsleri, adeno baglantili virüsler, vaksinya virüsü ve atenüe poks virüsleri, semliki forest virüsü, retro virüsler, sindbis Virüsü ve Ty virüs benzeri partiküller dahil poks virüslerinden olusan gruptan seçilen Viral bir vektör, tümörle baglantili bir antijen için kodlayan bir nükleik asidin verilmesinde kullanilir. Adeno virüsleri ve retro virüsler, özellikle tercih edilir. Retro virüsler, genellikle replikasyonu yetersiz (yani enfeksiyöz partikül üretim yetenegi olinayan) virüslerdir. Açiklamaya göre nükleik asitlerin in vitro veya i'n vivo ortamda hücre içine yerlestirilmesine yönelik olarak çesitli yöntemler kullanilabilir. Bu tür yöntemler, 01341-P-0009 nükleik asit CaPO4 çökeltilerinin transfeksiyonunu, DEAE ile baglantili olan nükleik asitlerin transfeksiyonunu, ilgili nükleik asitleri tasiyan yukarida belirtilen virüslerin transfekte veya enfekte edilmesini, liposom araciligiyla yapilan transfeksiyonlari ve benzeri yöntemleri kapsar. Belirli uygulama usullerinde nükleik asidin belirli hücrelere yönlendirilmesi tercih edilir. Bu tür uygulama usullerinde bir nükleik asidin bir hücreye (örnegin bir retro virüs veya bir liposoma) verilmesinde kullanilan bir tasiyici, bagli bir hedef denetleme molekülüne sahip olabilir. Örnegin bir molekül, hedef hücrede yüzey zari proteini için spesifik olan bir antikor veya hedef hücredeki bir reseptörün ligandi gibi nükleik asit tasiyiciya yerlestirilebilir veya ona baglanabilir. Tercih edilen antikorlar, selektif olarak tümörle baglantili bir antijeni baglayan antikorlari kapsar. Nükleik asidin liposom vasitasiyla verilmesinin istenmesi durumunda endositozla baglantili olan yüzey zari proteinini baglayan proteinler, hedefli bir yönlendirme veya alimi inümkün kilmak için lipozom formülasyonuna yerlestirilir. Bu tür proteinler, belirli bir hücre tipi için spesifik olan kapsid proteinlerini veya onlarin fragmanlarini, internalize edilen proteinlere karsi antikorlari, hücre içi bir noktayi tetikleyen proteinleri ve benzeri proteinleri Açiklamaya uygun terapötik bilesimler, farmasötik açidan uygun preparasyonlar seklinde zerk edilebilir. Bu tür preparasyonlar, genel olarak tuz, tampon maddeler, koruyucu maddeler, tasiyicilar, adjuvan maddeler, CpG ve sikotinler gibi bütünleyici bagisiklik artirici maddelerin uygun farmasötik derisimlerini ve gerektiginde diger terapötik aracilari kapsayabilir. Terapötik aracilar, enjeksiyon veya infuzyon dahil bilinen tüm yollarla verilebilir. Aracilarin verilmesi, örnegin oral, intravenöz, intraperitoneal, intramüsküler, subkütan veya transderinal yollarla yapilabilir. Antikorlarin terapötik amaçla verilmesi için tercih edilen yol,akciger aerosolüdür. Antisens nükleik asitlerin verilmesi ise tercihen intravenöz yolla yavas bir sekilde yapilir. 01341-P-0009 Bilesimler, etkili miktarlarda verilir. "Etkili miktar", tek basina veya çesitli dozlarda istenen reaksiyonu veya istenen etkiyi yaratabilen miktardir. Kendini bir veya birkaç tümörle baglantili antijenin ifadelendirilmesiyle gösteren belirli hastaliklarda veya belirli durumlarda arzu edilen reaksiyon, hastaligin ilerleyisinin baskilanmasidir. Bu reaksiyon, hastaligin ilerleyisinin yavaslatilmasi ve özellikle hastaligin ilerleyisinin kesintiye ugratilmasini kapsar. Bir hastaligin veya bir durumun tedavisinde ulasilmak istenen reaksiyon, hastaligin veya durumun ortaya çikisinin geciktirilinesi veya önlenmesi de olabilir. Bulusa uygun bilesimin etkili miktari, tedavi edilen durum, hastaligin agirlik derecesi, yas, psikolojik durum, boy ve agirlik dahil hastayla ilgili bireysel parametreler, tedavinin süresi, (eger varsa) eslik eden terapinin niteligi, spesifik ilaç verme yolu ve benzer unsurlara da bagli olacaktir. Farmasötik bilesimler, tercihen steril ve istenen reaksiyon veya istenen etkinin yaratilabilmesi için terapötik açidan etkili maddenin etkili bir miktarini içeren bilesimlerdir. Verilen bilesimlerin dozajlari, verilme usulü, hastanin durumu, arzu edilen verilme süresi vb. gibi parametrelere de bagli olabilir. Hastaya verilen baslangiç dozajinda elde edilen reaksiyonun yetersiz olmasi durumunda daha yüksek dozlar (veya bir baska, daha güçlü yerlesimli verilis yoluyla elde edilen etkili daha yüksek dozlar) uygulanabilir. Tedavi veya bagisiklik reaksiyonu yaratilmasi veya artirilmasi için genel olarak tümörle baglantili antijenin lng ila 1 mg arasindaki dozlari, tercihen 10 ng ila 100 ug arasindaki dozlari formüle edilir ve verilir. Tümörle baglantili antijenler için kodlayan nükleik asitlerin (DNA ve RNA) verilmesi isteniyorsa l ng ila 0,1 mg arasindaki dozlar formüle edilerek verilir. 01341-P-0009 Farmasötik bilesimler, genellikle farmasötik olarak uygun miktarlarda ve farmasötik açidan uygun bilesimlerde verilir. "Farmasötik olarak uygun" terimi, farmasötik bilesimin aktif unsuruyla karsilikli etkilesime girmeyen toksik olmayan bir maddeyi ifade etmektedir. Bu tür preparasyonlar, genel olarak tuz, tampon maddeleri, koruyucu maddeler, tasiyicilar ve gerektigi durumlarda diger terapötik etken maddeleri kapsayabilir. Tuzlar, tibbi bir kullanimda farmasötik olarak uygun olmalidir. Ancak farmasötik olarak uygun olmayan tuzlar, farmasötik uygun tuz üretiminde kullanilabilir ve bu, bulus kapsaminda olan bir konudur. Bu tür farmakolojik ve farmasötik olarak uygun tuzlar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, hidrojen klorür asidi, bromlu hidrojen asidi, kükürt asidi, potasyum nitrat, fosfor, dikardon asidi, sirke asidi, salisilik asit, sitrik asit, formik asit, malonik asit, suksinik asit ve benzeri asitlerden elde edilen tuzlari kapsar. Farmasötik olarak uygun tuzlar, sodyum tuzu, kalyum tuzu veya kalsiyum tuzu gibi alkalik metal veya alkalik maden tuzu olarak da üretilebilir. Bulusa uygun farmasötik bir bilesim, farmasötik olarak uygun bir tasiyiciyi içerebilir. "Farmasötik olarak uygun tasiyici" terimi, bulusa göre insanlara verilmeye uygun dolgu maddeleri, inceltici maddeler veya kapsül seklinde maddeleri ifade etmektedir. "Tasiyici" terimi, aktif bilesenin kullanimini kolaylastirmak için kombine edildigi dogal veya sentetik yapili organik veya inorganik bir bileseni ifade etmektedir. Farmasötik bilesimlerdeki bilesenler, o ölçüde alisilagelmis maddelerdir ki istenilen farmasötik etkiyi önemli ölçüde engelleyen bir etkilesim meydana getirmezler. Farmasötik bilesiinler, tuzda sirke asidi, tuzda sitrik asit, tuzda bor asidi ve tuzda fosfor asidi gibi uygun tampon maddelerini içerebilir. Farmasötik bilesimler, gerektigi durumlarda benzalkonyum klorür, klor butanol, paraben ve timerosal gibi uygun koruyucu maddeleri de içerebilir. 01341-P-0009 Farmasötik bilesimler, genel olarak bir örnek doz seklinde sunulur ve bilesim bazinda bilinen sekilde üretilir. Farmasötik bilesimler, açiklamaya göre Örnegin kapsül, tablet, agizda eriyen pastil, süspansiyon, surup, içecek veya einülsiyon olarak sunulabilir. Parenteral yoldan verilme için uygun olan bilesimler, genel olarak tercihen alicinin kaniyla izotonik olan etkin maddenin steril sulu veya sulu olmayan bir preparasyonudur. Uygun tasiyicilar ve çözücü maddeler, örnegin ringer çözeltisi ve izotonik sodyum klorürdür. Genel olarak bunlara ilaveten çözelti veya süspansiyon araci olarak steril, fikse edilmis yaglar kullanilir. Mevcut bulus, asagida sadece açiklama amaçli olarak verilmis olan ve konuyu sinirlandirici olarak anlasilmamasi gereken sekil ve örneklerde ayrintili olarak açiklanmistir. Konunun uzmani kisiler, açiklama ve örneklerden yola çikarak kolayca daha baska uygulama usulleri ortaya koyabilirler. Sekiller: Sekil 1. Claudin-18A2.1-Mide ve yemek borusunda ve mide ve pankreas tümörlerinde ifadesi Claudin- yapilan RT-PCR analizi, bulusa göre 8/10 mide tümörü biyopsilerinde ve 3/6 pankreas tümörü biyopsilerinde çok belirgin bir sekilde Claudin18A2.1 ifadesini göstermistir. Ayrica mide ve yemek borusundaki normal dokularda da belirgin bir ifadelendirmenin varligi kanitlanmistir. Buna karsilik yumurtalik ve yumurtalik tümörlerinde herhangi bir ifadelendirme tespit edilmemistir. 01341-P-0009 Sekil 2. Claudin18 konformasyonlarinin sematik gösterimi Claudin 18A2 polipeptidi, bulusa göre hücre üzerinde iki konforrnasyon halinde bulunur. Protein, l. konformasyonda 4 trans membran domain (TM) ile birlikte bulunur ve hücre disinda konumlu iki ayri domain gösterir. 2. konformasyonda ise her iki orta hirofob alani (h-fob), trans membran domain fonksiyonunu yerine getirmez. Bu konformasyonda bu özellik sayesinde 1. konformasyona kiyasla hücre disinda ilave peptit bölgeleri bulunur. Bunun yani sira bu konformasyon sonucunda 116. pozisyonda ilave bir glikosilasyon noktasi (daha kalin ok) ortaya çikar. Öngörülen tüm glikosilasyon domainleri seklin alt kisminda gösterilmistir. Ex 1: hücre disi domain 1, Ex 2: hücre disi domain 2, TM: Trans membran domainleri, H fob: hücre disi hidrofob bölge. Sekil 3. Claudin18'in Nicel Ifadelendirilmesi, Degisken Al Claudin 18A1, akciger ve mide dokulari disinda hiçbir normal dokuda tespit edilmemektedir. Claudin 18A1, birçok tümörlü dokuda dikkate deger ölçüde ifadelendirilir. Mide, akciger, pankreas ve yemek borusu tümörlerinde özellikle dikkate deger bir ifadeiendiime görülmektedir. Sekil 4. Claudin 18'in Nice] Ifadelendirilmesi, Degisken A2 Claudin18A2 mide dokulari disinda hiçbir normal dokuda tespit edilmemektedir. Claudin18A2 birçok tümörlü dokuda, özellikle mide, akciger, pankreas ve yemek borusunda ifadelendirilir. 01341-P-0009 Sekil 5. Claudin 18A2'ye spesifik antikorlarin (hücre disi domainler) kullanimi A: Claudin 18A2 pozitif mide tümörü hücrelerinin (SNU 16, metanol ile fikslenmis) bir peptitin (SEQ 1D NO: 17) bagisiklastirilmasi ile üretilen bir antikorla boyanmasi. Hücre/hücre karsilikli etkilesim alanlarinda özellikle çok belirgin bir sekilde membran boyasi ortaya çikmaktadir. Protein, fokal membran alanlarinda bir araya toplanmaktadir. B, C, D: Claudin 18A2 GFP içinde transfekte edilen 293T hücrelerinin kolokalizasyon analizi ile antikorun spesifisitesinin kanitlanmasi. B: GFP flüör isima; C: Anti C1audin18A2; D: Bindirme. Sekil 6. Claudin18A2'ye spesifik antikorlarin (hücre disi domainler) kullanimi Claudin bir peptitin (SEQ ID NO: 113, N uçta konumlu hücre disi domainler) bagisiklandirilmasi ile üretilen bir antikorla membran boyamasi. Karsi boyama için E kadherine karsi yönlendirilmis olan monoklonal bir antikor kullanilmistir. A: Claudin18A2 antikorlari; B: Anti E Kadherin karsit boyama; C: Bindirme. Sekil 7. Antikorlarin claudin 18'in C uçlu hücre disi domainlerine karsi kullanimi peptitin (SEQ 1D NO: 116, C uçlu hücre disi domainler) bagisiklastirilmasi ile üretilen bir antikorla membran boyamasi. Karsi boyama için E kadherine karsi yönlendirilmis olan monoklonal bir antikor kullanilmistir (sagdaki sekiller). 01341-P-0009 Sekil 8. Claudin 18A1'e spesifik antikorlarin kullanimi Üstte: Mide tümörü hücrelerinin (SNU 16; claudin 18A2 pozitif) Claudin 18A1`e spesifik bir peptitin (SEQ ID NO: 115) bagisiklastirilmasi ile üretilen bir antikor ile zayiftan boyama ile eksik boyama arasinda boyanmasi. A: Anti E Kadherin; B: Anti Claudinl 8A1; C: Bindirme. Altta: Claudin 18A1 GFP içinde transfekte edilen 293T hücrelerinin kolokalizasyon analizi ile antikor spesitisitesinin kanitlanmasi A: GFP tlüör isiina; B: AntiClaudinlSAl; C: Bindirme. Sekil 9. Claudin 18A2'nin Western blot testinde kanitlanmasi Claudin 18A2 spesifik antikor ile çesitli saglikli dokulardan alinan lizatlarla western blotlama, SEQ ID NO. 17 olan epitopa karsi yönlendirilmis durumda. 1: Mide; 2: Testis; 3: Deri; 4: Gögüs; 5: Karaciger; 6: Kolon; 7: Akciger; 8: Böbrek; 9: lenf bogumu normal dokulari. Sekil 10. Mide ve mide tümörleri ile çesitli tümör hücresi dizilerinden alinan örnekler ile Claudin 18A2'nin western blot testi. Mide ve mide tümörleri lizatlari (AB) ve tümör hücresi dizileri (C,D), blotlamaya tabi tutularak Claudin 18A2'ye spesifik bir antikor ile SEQ lD NO. 17 olan epitopa karsi test edildi. Mide tümörleri, Claudin 18A2'nin daha az glikozile olmus bir formunu göstermektedir. Mide lizatlarinin PNGase F ile islenmesi, düsük glikolize bir formun olusmasi ile sonuçlanmaktadir. A: 1: Normal mide dokusu #A; 2: Mide tümörü #A; 3: Normal mide dokusu #B; 4: Mide tümörü #B 01341-P-0009 B: 1: Normal mide dokusu #A; 2: Normal mide dokusu #B; 3: Normal mide dokusu #B + PNGase F; 4: Mide tümörü #C; 5: Mide tümörü #D; 6: Mide tümörü #D + PNGase F SNU-l; 6: SNU-16; 7: EF027; 8: TOV-llZD; 9: OVCAR. Tümör hücre dizilerinin Claudin 18A2'nin deglikosile degiskesini ifadelendirdigi göz önünde bulundurulmalidir. D: Claudin 18A2'ye spesifik antikorlarla test edilen hücre dizilerinden çesitli örnekler için western blot verilerinin çizelge seklinde özeti. Sekil 11. Claudin 18'in akciger tümörlerinde ifadelendirilmesi Sekil 30'a uygun olarak akciger tümörlerinde düsük glikosile Claudin 18A2 degiskeleri kanitlanmistir. 1: Normal mide dokulari; 2: Mide tümörleri; 3-9: Akciger tümörleri. Sekil 12. Claudin 18'in Claudin 18A2'ye spesifik antikorlarla normal dokularda immünhistokimyasal analizi Mide inukozasinda sadece farklilasmis epitelial hücreleri, bezelerin açikliginda ve tabaninda boyanir. Claudin 18A2'nin mide kök hücrelerinde varligi kanitlanmamistir. Tarafimizca incelenen tüm diger normal dokular da, örnek olarak böbrek, akciger ve kolon için gösterildigi gibi, bu geni ifade etmemektedir. Sekil 13. Claudin 18A2'ye spesifik poliklonal antiserumunun immünhistolojik sonuçlari A: Akciger tümörü dokularinin spesifik boyanmasina örnekler. Claudin 18Al degiskesini ifadelendiren normal akciger dokusunun claudin 01341-P-0009 18A2'ye spesifik antiserum tarafindan taninmadigi göz önünde bulundurulmalidir. B: Yemek borusu tümörlerinin spesifik tümör boyamasi ile ilgili örnekler. Çevredeki saglikli hücrelerin boyanmadigi göz önünde bulundurulmalidir. C: Mide tümörü epitelyumlarinin spesifik tümör boyamasi ile ilgili örnekler. Burada da çevredeki saglikli hücreler boyanmaz. D: Claudin 18A2'ye spesifik antikorlarla immünhistokimyasal boya verilerinin örnek niteliginde çizelgeli özeti. AdenoCa: Adeno karsinom; SCC: Yassi epitel karsinomu; RCC: Böbrek karsinomu. Sekil 14. Dizilimler Burada atif yapilan dizilimler gösterilmistir. Sekil 15. Claudin 18A2'nin hücre disi alanlarinin arastirilmasi EXl (= hücre disi domainler 1), EX2 (=hücre disi domainler 2) veya D3 (= domainler 3) domainlerinden birinde ayri ayri bir isaretleyici dizilim (myo veya HA-Tag) tasiyan 3 yapi üretildi (yukarida). Bunlar, hücre dizilerine transfekte edildi ve arkasindan bu isaretleyici diziliinlere karsi yönlendirilen bir antikorun perrneabilite edilmemis hücrelere baglanip baglanmadigi test edildi. Bu, proteinin ilgili alaninin topolojik açidan hücre disinda olmasini gerektirir. Akisli hücre ölçümünde molekülün her üç alaninin antikorlar için ulasilabilir oldugu görüldü Sekil 16. Claudin 18A2 membran topolojisi Verilerimize göre claudin l8A2, her iki iç hidrofob domainlerinin entegral olmayan biçimde hücre membranlari arasindan geçtigi 2. konformasyonda bulunabilir. Bu sekilde bu inolekülün daha büyük olan alanlari, hücre disi 01341-P-0009 alanlardir. Burada verilerimize göre normal mide dokusunda glikosile olan, ancak tümörlerde olmayan glikosilasyon domainleri de bulunmaktadir. Bu suretle sadece tümör dokusuna spesifik epitoplar olusur. Sekil '17. Claudin 18'in hücre disi lokalizasyonunun tespitine yönelik FACS Sekilde claudin 18Al, claudin 18A2 ve Mock'un tam uzunlugu ve claudin 18A2'nin parçalariyla transfekte edilmis permeabilite olmayan hücrelerde yapilan akisli hücre ölçümü analizleri görülmektedir. mABl ve mAB2 antikorlarinin spesifik olarak hücre yüzeyindeki claudin 18A2 (sol sütun) ve hücre disi 2. domaini (Ex2, 3. sütun) tanidiklari, bu sirada da claudin 18A1 (2. sütun) ve negatif kontrolün (son sütun) negatif oldugu fark edilmektedir. mABl antikoru, mAB2'nin aksine, spesifik olarak 1. hücre disi domaine (Ex l, 4. sütun) baglanir. Örnekler: Gereç ve Yöntemler dayanan ve laboratuar ortaminda deneysel islemlerin simüle edilebildigi yöntemlere atif` yapmaktadir. Tüm diger terim ve süreler, açikça baska bir sekilde tanimlanmadigi sürece, uzmanlar tarafindan anlasildigi biçimde kullanilir. Anilan teknik ve yöntemler, kendi içinde bilinen sekilde uygulanir ve örnegin Sambrook et al., Moleküler Klonlama : Laboratuar El Kitabi (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), 2. Baski (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press yayini, Cold Spring Harbor, N. Y çalismasinda tanimlanmistir. Donati ve ayiraç içeren tüm yöntemler, üreticinin verilerine göre uygulanir. 01341-P-0009 Tümörle baglantili yeni genlerin tespitinde veri madenciligine dayali strateji Iki in silico strateji, yani gen bankasi tanitici sözcük arastirmasi ve cDNAx profilleyici kombine edilmistir. ENTREZ arastirmasi ve NCBI Edinim Sistemler (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez) kullanilarak gen bankasinda belirli dokularda spesifik ifadelendirilmis olarak not düsülmüs aday genler aranmistir (Wheeler et al., Nükleik Asit Arastirmasi (Nuclei'c Acids Research) 28:10-14, 2000). Örnegin "colon-specific gene", " stomach--pecific gene" veya "kidney specific gene" gibi anahtar sözcüklerle yapilan sorgulamada veri bankasindan aday genler veri bankalarindaki bilgilerin bir kismiyla sinirli tutulmus, organizma için "homo sapiens" ve molekül türü içinse "mRNA" sinirlamalari altinda sorgulama yapilmistir. GOI genlerin listesi düzenlenerek ayni dizilim için farkli tanimlamalar tespit edilmis ve bu tür fazlalik bilgiler düzeltilmistir. Anahtar sözcük arastirmasi sonucunda bulunan tüm aday genler, bir kez daha incelenmistir. eNorthem yöntemi, bir GOI geninin diziliminin veri bankasinda bir EST etiketine (expressed sequence tag/tanimlanmis dizilim etiketi) karsi (http://WWW.ncbi.n1m.nih.g0V/BLAST). Girisi yapilan her bir GOl genine homolog olarak denk gelen her bir EST etiketi doku kaynak tespiti açisindan incelenir ve bu sekilde tüm EST etiketlerinin toplam miktari üzerinden GOI geninin doku dagilimi için geçici bir tahmin ortaya konur. Sadece organ spesifik olmayan normal dokulardan kaynaklanan EST etiketlerine homolog karsiligi olmayan GOI genleri daha genis incelemeye alinmistir. Bu degerlendirmede 01341-P-0009 kamusal domain alanlarinda hatali notlandirilmis cDNA bankalarinin oldugu da (www.fau.edu/cmbb/publications/cancergenesö.htm). Ikinci data madenciligi yönteini olarak NCBI Kanser Genomu Anatomisi Projesinin cDNA x profil tanimlayicisi kullanilmistir (http://cgap.nci.nihgov/Tissues/xProtiler) (Hillier et Bu, veri bankalarinda dosyalanmis transkriptom havuzlarinin mantiksal operatörler kullanilarak birbirleriyle olan iliski bazinda düzenlenmesine olanak verir. Örnegin Havuz A tanimli bir havuz tanimlanarak kolon kaynakli olarak üretilen tüm ifadelendirme kütüphaneleri, karisik kütüphaneler disarida birakilarak buraya eklenmistir. Havuz B tanimli diger bir havuza ise kolon kaynakli olanlar hariç olmak üzere normal doku kaynakli olarak üretilen tüm cDNA kütüphaneleri eklenmistir. Tüm cDNA bankalari, genel olarak üretiminde esas alinan yöntemden bagimsiz olarak kullanilmis, ancak büyüklük olarak sadece 1000 olanlar uygun görülmüstür. B Havuzu, BUT NOT operatör vasitasiyla dijital olarak A Havuzundan çikarilmistir. Bu sekilde bulunan GOI genleri seti, ayni zamanda e-Northern arastirmasina da tabi tutulmus ve ayrica bir emniyet unsuru olarak literatür arastirmasi yapilmistir. Bu kombine veri madenciligi islemi, kamusal domain alaninda bulunan 13.000 tam uzunluktaki genin yaklasik tamamini kapsamakta ve bunlarin içinden potansiyel organ spesifik ifadelendirmeli olanlarin ön belirlemesini yapmaktadir. Tüm diger genler, önce spesifik RT PCR ile normal dokularda degerlendirilmistir. Organ spesifik olmayan normal dokularda ifadelendirilmis olarak görünen tüm GOI genler, hatali pozitif olarak degerlendirilerek devam eden incelemelerde dikkate alinmamistir. Kalanlar büyük bir panoda çesitli tümör dokularina yönelik olarak incelenmistir. Burada asagida gösterilen antijenler, tümör hücrelerinde aktive edilmis olarak görülmüstür. 01341-P-0009 RNA çikarimi, poly-d(T) astarli cDNA üretimi ve konvansiyonel RT PCR Tüm RNA, kaotrofem amil olarak guanidyum isotiosiyanat kullanilarak natif doku materyalinden çikarilmistir (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 1621156-9, 1987) RNA, fenolik asitle çikarim ve isopropanol ile çökeltim sonrasinda DEPC ile isleme tabi tutulmus suda çözülmüstür. yoluyla ve üreticinin taliinatlari dogrultusunda birinci yumak cDNA sentezi uygulanmistir. Primer olarak dT(18) oligonükleotit kullanilmistir. cDNA'nin bütünlügü ve kalitesi, p53 amplifikasyonu yoluyla 30 çevrim PCR (sens CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG, antisens CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG, melezleme isisi 67°C) dahilinde kontrol edilmistir. Bir dizi normal doku ve tümör antitelerinden birinci yumak cDNA arsivi olusturulmustur. Ifadelendirme arastirmasi için bu CDNA'lardan 0,5 ul kadar bir miktar, 30 u] reaksiyon karisiminda GOl spesifik primerlerle (asagiya bakiniz) ve 1 U HotStarTaq DNA Polimeraz (qiagen) ile amplifiye edilmistir. Reaksiyon karisimi, her seferinde 0,3 mM dNTP, her bir primerden her biri için 0,3 uM ve 3 ul 10 x reaksiyon tamponundan olusmustur. Primerler, 2 ayri ekson üzerinde olacak sekilde seçilmis ve hatali pozitif sonuçlarin nedeni olarak kontamine edici genomik DNA tarafindan olusturulan parazitin bertaraf` edilmesi, matris olarak revers olarak kopyalanmamis DNA'lar vasitasiyla teyit edilmistir. 95°C derecede 15 dakika sonra HotStarTaq DNA Polimerazinin aktivasyonuna yönelik olarak 35 çevrim PCR uygulanmistir (1 dakika 94°C, 1 dakika ayri ayri melezleme isisi, 2 dakika 72°C ve sonuçta 72°C derecede 6 dakika boyunca elongasyon). 01341-P-0009 Bu reaksiyondan 20ul, etidyuin bromür ile boyanmis agarose jel içinde çözülmüs ve analiz edilmistir. Asagida belirtilen primerler, belirlenmis melezleme isilarinda ilgili antijenlerle ilintili ifadelendirme analizi için kullanilmistir. Claudin-18Al !64°Ci Sens: 5'-GAGGCAGAGTTCAGGCTTCACCGA-3' (SEQ ID NO: 109) Antisens: 5'-TGTTGGCTTTGGCAGAGTCC-3' (SEQ ID NO: 110) Claudin-18A2 !68°C) Sensl: 5'-GGTTCGTGGTTTCACTGATTGGGATTGC-3' (SEQ ID NO: 39) Antisens l: 5'-CGGCTTTGTAGTTGGTTTCTTCTGGTG- (SEQ ID NO: 40) SensZ: 5' -TGTTTTCAACTACCAGGGGC-3' (SEQ ID NO: AntisensZ: 5' -TGTTGGCTTTGGCAGAGTCC-3' (SEQ ID NO: Random hexamer astarli cDNA üretimi ve niceliksel reel zamanli PCR Muhtelif genlerin ifadelendirilmesi, reel zamanli PCR ile niceliksel olarak ölçülmüstür. Bu islemde SYBR yesil olan PCR ürünleri, ekleyen roportör boya olarak belirlenmistir. SYBR yesilin ropoitör florisili, çözelti içinde bastirilmis ve boya maddesi, ancak çift sarmalli DNA fragmanina baglanim sonrasinda aktif hale gelmistir. Her bir PCR çevriminden sonra SYBR yesil florisilin GOI spesifik primerlerle spesifik olarak amplifiye edilmesi sonucu artmasi, niceliksel ölçüm için kullanilmistir. Hedef geninin niceliksel ölçümle ifadelendirilmesi, kosulsuz 01341-P-0009 veya bir kontrol geninin incelenecek olan dokularda sürekli ifadelendirilmesi yoluyla ifadelendirilmesi ile bagintili olarak gerçeklesir. Ifadelendirme, örneklerin referans gen olarak 185 RNA'ya karsi norrnalizasyonu sonrasinda AA-Ct yöntemi kullanilarak (PE Bio sistemler, ABD) tespit edilmistir. Reaksiyonlar, çitfli karisimlarda uygulanmis ve üçlü kopya dahilinde belirlenmistir. Üretici talimatlari dogrultusunda QuantiTect SYBR-Green PCR Kiti (Qiagen, Hilden) kullanilmistir. cDNA'nin sentezi, üreticinin talimatlari dogrultusunda hexamer primer kullanilarak High Capacity cDNA Archive Kiti (PE Bio sistemler, ABD) ile yapilmistir. 5 al inceltilmis CDNA, her seferinde PCR için 25 ul toplam hacimde yerlestirilmistir: sens primer 300nM, antisens primer 300nM; baslangiç saniye; 40 çevrim. Kullanilan primerlerin dizilimleri, ilgili örneklerde gösterilmistir. Klonlama ve dizi analizi Tani uzunluklu genlerin veya gen fragmanlarinin klonlanmasi, alisilagelmis yöntemlerle yapilmistir. Dizinin tespiti için ilgili antijenler proof reading polimeraz pfu (Stratagene) yoluyla amplifiye edilmistir. Fragmanlarin üreticinin talimatlari dogrultusunda TOPO TA vektöründe klonlanmasi için PCR'nin sona ermesini takiben HotStarTaq DNA polimerazi yoluyla amplikonun uçlarina adenosin baglanmistir. Dizileme için ticari hizmet alinmistir. Dizilimler, alisilagelmis prediksiyon programlari ve algoritmalari yardimiyla analiz edilmistir. Western blotlama Hücre kültürü ile elde edilen hücreler (hedef genin endojen olarak ifadelendirilmesi veya hedef proteinin hedef proteini kodlayan ifade vektörünün transfekyionu sonrasinda sentezi) veya içeriginde hedef proteinin bulunabildigi 01341-P-0009 doku örnekleri, % l'lik SDS çözeltisinde çözülür. SDS, bu sirada lizatin içerigindeki proteinleri denatüre eder. Deneysel bir karisimdaki lizatlar, arzu edilen protein büyüklügüne bagli olarak % 8-15'lik denatüre edici poliakrilamid jelinde (% l SDS içerikli) büyüklüklerine göre elektroforetik olarak çözülürler (SDS poliakrilamid gel elektroforezi, SDS PAGE). Bunu takiben proteinler yari kum elektro blotlama yöntemiyle (biorad) istenen proteinin kanitlama isleminin yapilabilecegi nitroselülöz membrana (Schleicher & Schüll) transfer edilir. Membran, bunun için öncelikle (örnegin süt tozu ile) bloke edilir ve akabinde spesifik antikor ile 1:20-lz200 inceltilme dahilinde (antikorun spefisitesine göre) 60 dakika süreyle inkübasyona tabi tutulur. Membran, bir yikama asamasindan sonra bir isaretçi ile (örnegin peroksidaz veya alkalik fosfataz gibi enzimlerle) birlestirilmis ve birinci antikoru taniyan ikinci bir antikor ile inkübasyona tabi tutulur. Hedef protein, bunu takiben bir diger yikama asamasinda boya veya kemiluminesansi reaksiyonu ile membran üzerinde görünür hale getirilir (örnegin ECL, Amersham Bioscience). Sonuç, uygun bir kamera ile fotografi çekilerek belgelenir. Protein modifikasyonlarinin analizi, kural olarak western blotlama ile yapilir. Kural olarak birkaç kDa büyüklügünde olan glikosilasyonlar, SDS-PAGE yönteminde çözülen hedef proteinlerinin daha büyük toplam hacim almasina yol açar. Spesifik N ve O glikosidik baglantilarin kanitlanmasi için doku veya hücre protein lizatlari, 0 veya N glikosidazli SDS islemiyle denatürasyondan önce inkübasyona tabi tutulur (Ilgili üreticinin verileri dogrultusunda, örnegin PNgase, Endoglikosidaz F, Endoglikosidaz H, Roche Diagnostics). Takiben yukarida tanimlandigi gibi western blotlama yapilir. Hedef proteinin büyüklügünün azaltilmasi durumunda bu sekilde inkübasyondan sonra bir glikosidazla spesifik bir glikosilasyon kanitlanabilir ve bu yolla modifikasyonun tüinör spesifisitesi de analiz edilebilir. Algoritma ve prediksiyon programlariyla glikosile amino asitlerin kesin konumu önceden tahmin edilebilir. 01341-P-0009 Immün flüör isima Burada yerlesik hücre dizilerinin hücreleri kullanilir ki bunlar, ya hedef proteinleri endojen olarak sentezleyen (RNA kaniti RT PCR`de veya protein kaniti western blotlama ile) veya IF'den önce plazinid DNA ile transfekte edilmis olanlardir. Hücre dizilerinin transfeksiyonuna yönelik olarak çok çesitli yöntem (örnegin elektroporasyon, lipozom dayali transfeksiyon, kalsiyum fosfat presipitasyonu) bilinmekte ve etkili bir sekilde uygulanmaktadir (örnegin Lemoine et al. Methods modifiye edilmemis proteini kodlayabilir veya çesitli amino asit isaretleyicilerini hedef proteinle baglayabilir. En önemli isaretleyiciler, örnegin çok çesitli diferansiyel florisil saçan sekillerde bulunan yesil florisilli protein ("green fluorescent protein" (GFP)) ve yüksek afin ve spesifik antikorlar için yararlanilan 6-12 amino asitli kisa peptit dizilimleridir. Hedef proteinleri sentezleyen hücreler, paraformaldehit, saponin veya metanol ile fikse edilir. Akabinde hücreler gerekirse inkübasyon yoluyla temizleyicilerle (örnegin % 0,2 Triton X 100 ile) penneabilite edilir. Hücreler, fiksasyon/penneabilitasyon isleminden sonra hedef proteine veya baglanmis bir isaretçiye karsi yönlendirilen primer bir antikorla inkübe edilir. Katki maddesi, bir yikama asamasindan sonra florisil saçan bir isaretçiyle (örnegin Iluorescin, texas red, dako) birlesmis ve ilk antikora baglanan ikinci bir antikorla inkübe edilir. Takiben bu sekilde isaretlenmis hücreler gliserinle katmanlastirilir ve florisil mikroskop yardimiyla üreticinin talimatlari dogrultusunda analiz edilir. Bu sirada, kullanilan maddelere bagimli olarak spesifik uyarma yoluyla spesifik florisil emisyonlari saglanir. Analizle kural olarak hedef proteinin kesin konumu belirlenir ki burada hedef proteine ilave olarak antikor kalitesi ve hedef proteinin çiftli boyama ile teyit edilmesi amaciyla konumlari mevcut literatürde tanimlanmis olan bagli ainino asit isaretçileri veya diger isaretçi proteinler de boyanir. Dogrudan uyarilabilen ve kendiliginden florisil veren, dolayisiyla kanitlanmalari için herhangi bir antikor gerektirmeyen GF P ve degiskeleri, istisnai durum teskil etmektedir. 01341-P-0009 Immün histokimyasi miktarinin tahmin edilmesi (2) tümörlü ve saglikli dokularda hedef geni sentetize eden hücre miktarinin analiz edilmesi ve/veya (3) bir dokuda (tümör, saglikli hücre) hedef proteinin kanitlanabilir oldugu hücre tipinin tanimlanmasi konularinda yardimci olan bir yöntemdir. Münferit antikorlara göre çesitli protokollerin kullanilmasi gerekir (örnegin Tanisal Imun Histokimyasi (Di'agnosti'c Immunohistochemi'stiy) Yazari: David J., Antijen Erisim Yöntemleri: Isik ve Elektron Mikroskobu Için ("Mi'croscopy, kullanilan bir yöntemdir. Bu yöntemin amaci, islevsel olarak saglam olan bir doku birligindeki proteinin konumunun belirlenmesidir. IHC) özellikle (1) tümörlü ve normal dokularda hedef protein miktarinin tahmin edilmesi (2) tümörlü ve saglikli dokularda hedef geni sentetize eden hücre miktarinin analiz edilmesi ve/veya (3) bir dokuda (tümör, saglikli hücre) hedef proteinin kanitlanabilir oldugu hücre tipinin tanimlanmasi konularinda yardimci olan bir yöntemdir. Hedef gendeki protein miktarlari, alternatif olarak dokunun imunoflorisili yardimiyla dijital kamera ve uygun yazilimla (örnegin Tillvision, Till-photonics, Almanya) ölçülebilir. Ilgili teknoloji hakkinda birçok yayin yapilmistir, bu nedenle boyama ve mikroskopi ile ilgili ayrintilar, örnegin Tanisal Immün Histokimyasi (Diagnostic Immunohz'stochemistry) Yazari: David J., MD Dabbs ISBN: Yöntemleri: Isik ve Elektron Mikroskobu Için ("Mi'croscopy, Microscope" (ISBN:O306467704) gibi kaynaklarda bulunabilir. Antikorlarin 01341-P-0009 özellikleri nedeniyle etkili bir sonuca ulasabilmek için çesitli protokollerin kullanilmasi gerektigi göz önünde tutulmalidir (asagida bir örnek tanimlaninistir). referans olarak kiyaslanabilir saglikli dokular kullanilir. Hedef genin varliginin RT PCR analizleri yoluyla bilindigi hücre dizilerinden de negatif ve pozitif kontrol olarak yaralanilabilir. Her zaman bir arka plan kontrolü de yapilmalidir. Fikse edilmis dokular (örnegin aldehit içeren maddeler, formaldehit, paraforrnaldehitte veya alkol içeren çözeltilerde) veya 1-10 um arasindaki soklanarak dondurulmus doku parçalari, cam bir tasiyici üzerine alinir. Parafine gömülü örnekler, örnegin ksilol ile deparafine edilir. Örnekler, TBS-T ile yikanir ve serum içinde bloke edilir. Bunu takiben birinci antikor ile 1-18 saat süre için kural olarak affinite saflastirilmasma tabi tutulmus antikorlarin kullanildigi inkübasyon islemi yapilir (Inceltme: l:2 ila 1:2000). Bir yikama asamasindan sonra alkalik bir fosfataz (alternatif olarak: örnegin perkosidaz) ile birlesen ve birinci antikora karsi yönlendirilen ikinci antikorla yaklasik 30-60 dakika süreli bir inkübasyon yapilir. Takiben, baglanan enzim tarafindan yerleri degistirilen renk alt katmanlari kullanilarak bir renk reaksiyonu olusturulur (örnegin kanitlanmasina yönelik olarak imunojenin önceden verilmesi yoluyla rekabete tabi kilinmis olur. Bagisiklik kazandirma (Bu kaynaklara da bkz. Monoklonal Antikorlar: Pratik Bir Yaklasim (Monoclonal Antibodi'es: A Practical Approach) Yazari: Philip Shepherd, Christopher Dean 01341-P-0009 Kullanmak: Laboratuar El Kitabi: Tasinabilir Protokol NO) Yazari: Edward Asagida antikor üretim süreci kisaca açiklanmistir, Ayrintilar anilan yayinlarda bulunabilir. Öncelikle hayvanlara (örnegin tavsana) hedef proteinin ilk enjeksiyonu ile birinci bagisiklik kazandirilir. Belirli bir zaman süresi içinde (bir önceki bagisiklastirma isleminden sonra yaklasik 2-4 hafta içinde) yapilan ikinci ve üçüncü bagisiklastirma islemiyle hayvanin imunojene karsi bagisiklik tepkisi güçlendirilir. Belirlenmis farkli sürelerde hayvanlardan tekrar kan alinir (1. kanlanma 4 hafta sonra, akabinde yaklasik 2 haftada bir toplam 5 kan alimi) ve bunlardan bagisiklik serumu elde edilir. Hayvanlarin bagisiklastirilmasinda kural olarak yaygin olarak uygulanan 4 yöntem kullanilir, ancak baska yöntemler de mevcuttur. Bu baglamda hedef protein için spesifik olan peptitlerle, proteinin tamamiyla veya proteinin deneysel yolla veya prediksiyon programlariyla tanimlanabilen hücre disi kismi dizilimleriyle bagisiklastinna yapilabilir. (1) Birinci durumda KLH genine (keyhole limpet hemosiyanin) eslenik peptitler (uzunluk: 8-12 aminoasit) standartlastirilmis bir in vitro yöntemle sentetize edilir ve bu peptitler bagisiklastirma için kullanilir. Kural olarak -1000 ug/bagisiklastirma konsentrasyonu ile 3 bagisiklastirma yapilir. Bagisiklastirina bu konuda hizmet veren kisilere de yaptirilabilir. (2) Bagisiklastirma, alternatif olarak rekombinan proteinlerle de yapilabilir. Bunun için hedef genin klonlanan DNA'si bir ifadelendirme vektörüne klonlanir ve hedef protein, ilgili üreticinin (örnegin Roche Diagnostics, lnvitrogen, Clontech, Qiagen) kosullarina benzesik olarak örnegin in vitro ortamda hücresiz, bakterilerde (örnegin E. Coli), mayada (örnegin B. S. pombe), böcek hücrelerinde veya memeli hücrelerinde sentezlemeye tabi tutulur. Sistemlerden birinde yapilan sentezlemeden 01341-P-0009 sonra kural olarak standartlastirilmis kromotografik yöntemler kullanilarak hedef protein saflastirilir. Bu sirada moleküler bir çapa üzerinden saflastirmada yardimci madde olarak hizmet gören proteinler de bagisiklastirma isleminde kullanilabilir (örnegin His-Tag, Qiagen; F LAG- Tag, Roche Diagnostics; Gst-füzyon proteinleri). Örnek olarak Moleküler Biyolojide Güncel Protokoller (Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience çalismasinda birçok protokol mevcuttur. (3) Istenen proteini endojen olarak sentetize eden bir hücre dizisinin bulunmasi durumunda bu hücre dizisi de spesifik antiserumun üretilmesinde kullanilabilir. Bagisiklastirma, bu islemde her seferinde yaklasik 1-5 x 107 hücre ile 1-3 enjeksiyonla yapilir. (4) Bagisiklastirma, DNA enjeksiyonu vasitasiyla da yapilabilir (DNA bagisiklastmnasi). Bu amaçla hedef dizilimin güçlü bir ökaryotik destekleyicinin (örnegin CMV destekleyicisinin) kontrolü altinda olmasi için hedef gen öncelikle bir ifadelendirine vektörüne klonlanir. Takiben 5- 100 ug DNA, imunojen olarak bir "gen tabancasi" ile bir organizmada (örnegin fare, tavsan) yogun bir sekilde kanayan kilcal bölgeye transfer edilir. Transfer edilen DNA hayvanin hücrelerinden alinir, hedef gen ifadelendirilir ve hayvan sonuçta hedef gene karsi bir bagisiklik tepkisi Poliklonal serum veya antikorlarin kalite kontrolü Spesifisitenin kanitlanmasina yönelik en uygun testler, akabinde western blotlama ile kombine edilen hücre kültürü bazli testlerdir (farkli uygulamalar örnegin Protein Kimyasinda Güncel Protokoller ("Current Protocols in Proteinchemistry"), John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience çalismasinda bulunabilir). Kanit için güçlü bir ökaryotik destekleyicinin (örnegin 01341-P-0009 sitomegalovirüs destekleyicisinin) kontrolü altinda bulunan hücreler bir cDNA ile hedef protein için transfekte edilir. Hücre dizilerinin DNA ile transfeksiyonuna yönelik olarak çok çesitli yöntemler (örnegin elektroporasyon, liposom bazli transfeksiyon, kalsiyum fosfat presipitasyon) bilinmekte ve yaygin olarak Anternatif olarak hedef genini endojen olarak ifadelendiren hücre dizileri de kullanilabilir (kaniti hedef gene spesifik RT PCR ile). Deneyde ideal durumda, kontrol amaçli olarak takip eden western blotlama isleminde analiz edilen antikorun spesifisitesinin kanitlanabilmesi için homolog genler de birlikte transfekte edilir. Hedef proteini içerme olasiligi olan hücre kültürü veya doku örnegi kaynakli hücreler, müteakiben yapilan western blotlama isleminde % l'lik SDS çözeltisinde çözülür ve bu sirada proteinler denatüre edilir. Lizatlar, % 8-15'lik denatüre edici poliakrilamid jellerinde (% 1 SDS içerikli) elektrotbrik olarak büyüklüklerine göre ayrilir (SDS-Poli akrilamid jel elektroforazi, SDS-PAGE). Proteinler, bunu takiben muhtelif blotlaina yöntemlerinden biri kullanilarak (örnegin yari kuru elektro blotlama; biorad) Spesifik bir membrana transfer edilir (örnegin nitrosellülöz, Schleicher & Schüll). Istenilen protein, bu membran üzerinde görünür hale getirilebilir. Bunun için membran önce hedef proteini taniyan antikorla 60 dakika süreyle inkübe edilir (inceltme: 1:20 - 1:200, antikorun spesifisitesine göre). Membran, bir yikama asamasindan sonra bir isaretçiyle (örnegin peroksidaz veya alkalik fosfataz gibi enzimlerle) birlestirilmis ve birinci antikoru taniyan ikinci bir antikorla inkübe edilir. Hedef protein, bunu takiben boya veya kemilumin esansi reaksiyonu ile membran üzerinde görünür hale getirilir (örnegin ECL, Amersham Bioscience). En ideal durum, hedef proteine yüksek spesifiteli bir antikorun istenen proteinin kendisini tanidigi durumdur. In silico yaklasimla tanimlanmis membran konum belirleme isleminin teyidi için çesitli yöntemler kullanilir. Yukarida tanimlanan antikorlarin kullanimiyla 01341-P-0009 gerçeklestirilen önemli ve yaygin olarak bilenen ve kullanilan bir yöntem, imunofloisil (F1) yöntemidir. Bunun için hedef proteinin sentetize eden (RNA kaniti RT PCR veya protein kaniti western blotlama ile) veya plasmid DNA ile transfekte edilmis olan yerlesik hücre dizilerinin hücreleri kullanilir. Hücre dizilerinin DNA ile transfeksiyonu için birçok yöntem (örnegin elekroporasyon, lipozom bazli transfeksiyon, kalsiyum fosfat presipitasyon) bilinmekte ve yaygin olarak kullanilmaktadir (örnegin Lemoine et al., Methods Mol. Biol. 75: 441-7, 1997). Hücrelere transfekte edilen plasmid, imunoflorisil sirasinda modifiye edilmemis proteini kodlayabilir veya farkli amino asit isaretçilerini hedef proteine baglayabilir. En önemli isaretleyiciler, örnegin çok çesitli diferansiyel florisil veren sekillerde bulunan yesil florisilli protein ("green fluorescent protein" (GFP)), yüksek afin ve spesifik antikorlar için yararlanilan 6-12 amino asitli kisa peptit dizilimler veya sisteinleri üzerinden spesifik florisil maddeleri baglayabilen (invitrojen) kisa Cys-Cys-X-X-Cys-Cys amino asit dizilimidir. Hedef proteini sentetize eden hücreler, örnegin paraformaldehit veya metanol ile fikse edilir. Bunu takiben hücreler gerekirse inkübasyon yoluyla temizleyicilerle (örnegin % 2 triton X 100 ile) permeabilite edilebilir. Hücreler, bunun arkasindan hedef proteine veya birlestirilmis isaretçilerden birine karsi yönlendirilmis olan primer bir antikorla inkübe edilir. Tortu, bir yikama asamasindan sonra florisil özellikli bir isaretleyiciyle (örnegin floresin, Texas Red, Dako) birlesmis olan ve birinci antikoru taniyan ikinci bir antikorla inkübe edilir. Bunu takiben bu sekilde isaretlenmis hücreler gliserin tabakasiyla kaplanir ve üreticinin talimatlari dogrultusunda florisil mikroskop yardimiyla analiz edilir. Bu sirada, kullanilan maddelere bagli olarak spesifik uyarimla florisi] emisyonlari elde edilir. Analizle kural olarak hedef proteinin kesin konumu belirlenir ki burada hedef proteine ilave olarak antikor kalitesi ve hedef proteinin çiftli boyama ile teyit edilmesi amaciyla konumlari mevcut literatürde tanimlanmis olan bagli amino asit isaretçileri veya diger isaretçi proteinler de boyanir. Dogrudan uyarilabilen ve kendiliginden florisil veren, dolayisiyla kanitlanmalari için herhangi bir antikor gerektirmeyen GF P ve degiskenleri, istisnai durum teskil etmektedir. Temizleyici 01341-P-0009 kullanimiyla denetlenebilen membran permeabilitesi, imunoflorisil isleminde bir epitopun hücrenin içinde mi yoksa disinda mi konumlandigina iliskin kanit saglar. Seçilen proteinlerin prediksiyonu, bu sekilde deneysel olarak desteklenebilir. Hücre disi domainlerin kanitlanmasi, alternatif olarak akis sitometrisi yoluyla da yapilabilir. Bunun için hücreler geçirgensiz kosullarda (örnegin PES/sodyum asit/% 2 FCS/SmM EDTA ile) fikse edilir ve akis sitometrisinde üreticinin talimatlari dogrultusunda analiz edilir. Bu yöntemde analiz edilecek antikorlar tarafindan sadece hücre disi epitoplar taninir. Imunoflorisil yönteminden farkli olarak örnegin propidyumiodid veya tripan mavisi kullanilarak ölü ve yasayan hücreler ayirt edilebilir ve bu sekilde hatali pozitif sonuçlar önlenmis olur. Afinite saflastirimi Poliklonal serumlarin saflastirilmasi, peptit antikorlar için tamamiyla veya rekombinan proteinlere karsi yönlendirilen antikorlar da kismi olarak bu konuda hizmet veren firmalara yaptirilmistir. Bunun için her iki durumda ilgili peptit veya rekombinan protein kovalen olarak bir matrise baglanir ve matris, baglanma sonrasinda natif bir tamponla (PBS:fOSfatla tamponlanmis salin) dengelenir ve akabinde ham serumla inkübe edilir. PBS ile yapilan baska bir yikama asamasindan sonra antikor, 100 mM glisin, pH2,7 ile ayristirilmis ve ayristirilan madde, hemen 0 anda 2 M TRIS, pH 8 içinde nötralize edilmistir. Bu sekilde saflastirilan antikorlar, daha sonra western blotlama veya imunoflorisil yöntemiyle hedef proteinlerin spesifik belirlenimi için kullanilabilir. GFP transfektanlarinin elde edilmesi Heterolog olarak ifade edilen tüinörle baglantili antijenlerin imunotlorisil mikroskopla tetkik islemi için antijenlerin tüm ORF'si pGFP-Cl ve pGFP-N3 vektörlerinde (Clontech) klonlanmistir.Lam üzerinde kültive edilen CHO ve 01341-P-0009 kullanilarak üretici firina talimatlari dogrultusunda transfekte edilmis ve 12-14 saat sonra imonuflorisil mikroskopi yoluyla analiz edilmistir. Akis sitometrisi Akis sitometrisiyle yapilan ölçümler, bilinen yöntemlerle yapilmistir (örnegin Robinson (Editor) Akis Sitometri Yöntemleri El Kitabi (Handbook of _flow cytometry methods). Wiley-Liss, New York, 1993). Örnek 1: Claudin 18Al ve Claudin 18A2 baglanti degiskelerinin kanserde diagnostik ve terapötik hedef olarak tanimlanmasi Claudin 18 geni, 4 hidrofob alanla bir yüzey membran molekülünü kodlar. Claudin 18, prediksiyon programlari (TMHMM, TMPred) ve bu fainilyanin birçok üyesi için tanimlanan topolojiye göre hücre disi konumlari (konformasyon 1) Sekil 2'de gösterilen dört trans membran ve bunlarla birlikte iki hücre disi EXl ve EX 2 domaine sahiptir. Her iki hücre disi epitop arasinda konumlanan D3 domainia literatürde Claudin 18 ve bu familyanin diger üyeleri için hücre içi olarak tanimlanmis olup alisilagelmis prediksiyon programlarinda da bu sekilde öngörülür. N ve C uçlari hücre içindedir. Niimi ve çalisma arkadaslari (Mol. Cell. akciger dokusunda (Claudin 18A1) ve mide dokusunda (Claudin 18A2) ifadelendirilmis olarak tanimlanan iki baglanti degiskenini tanimlamistir. Bu degiskenler, N ucunda farklilasmaktadir. Bulusa göre, Claudin baglanti degiskenleri ile bunlarin ayri ayri translasyon ürünlerinin (SEQ ID NO: 16 ve 118) tümörler açisindan hangi derecede isaretleyici ve terapötik hedef yapisi olarak kullanilabilecegi arastirilmistir. Her iki degiskeni birbirinden ayirabilen, A1 spesifik (SEQ ID NO: 01341-P-0009 primer çiftlerin seçildigi niceliksel bir PCR olusturulmustur. A2 baglanti degiskeni, ilaveten ikinci bir primer çift ile konvansiyonel bir PCR'de (SEQ lD NO: 39,40) test edilmistir. Al degiskeninin sadece saglikli akciger dokusunda aktif oldugu belirtilmistir. Ancak, bulusa göre, tarafimizca ulasilan sasirtici bir sonuç, Al degiskeninin mide mukozasinda da aktif oldugunu göstermistir (Sekil 3). Mide ve akciger, öneinli derecede bir faaliyetin görüldügü yegane normal dokulardir. Tüm diger normal dokular, claudin Al için negatif sonuç vermektedir. Tümörlerin incelenmesinde claudin Al'in birçok tümör dokusunda yogun bir sekilde faal oldugu görülmüstür ki bu da sasirtici bir sonuçtur. Özellikle yogun bir ifadelendirme, mide, akciger, pankreas, yemek borusu (sekil 3), kulak-burun- bogaz ve prostat tümörlerinde görülmektedir. Claudin Al'in kulak-burun-bogaz, prostat, pankreas ve yemek borusu tümörlerindeki ifadelendirme düzeyi, bunlara karsilik gelen normal dokulardaki düzeye oranla 100-10.000 kat daha fazladir. Claudin A2 baglanti degiskenlerinin incelenmesi için bu transkriptin amplifikasyonuna spesifik olan oligonükleotitler kullanilmistir (SEQ ID NO: 39, normal doku içinde sadece mide mukozasinda ve çok az miktarda testis dokusunda ifadelendirildigi saptanmistir (sekil 4). Degisken A1 gibi degisken A2'nin de bir çok tümörde faal oldugu tarafimizca saptanmistir (sekil 4). Mide, pankreas, yemek borusu ve karaciger tümörleri bu kapsamdadir. Saglikli akcigerde claudin 18A2'nin faal olduguna iliskin bir kanit bulunmamis olmasina karsin akciger tümörlerinden bir kisminda sasirtici bir sekilde A2 baglanti degiskeninin ifadelendirildigi tespit edilmistir. Tablo 1A. Claudin18A2`nin normal ve tümör dokularinda ifadesi Normal Doku Ifade Beyincik - 01341-P-0009 Kalp kasi Iskelet kasi Döl yatagi iç zari Pankreas Böbrek Karaciger Testis (Erbezleri) Salgi bezi Yumurtalik Döl yatagi Akciger Tiroit bezi Lenf bogumlari Tek çekirdekli periferik kan hücreleri Yemek borusu Tümör tipi Pankreas 01341-P-0009 Yemek borusu Akciger Yumurtalik Döl yatagi iç zari Kulan burun bogaz Böbrek Prostat Incelenmedi Tablo 1B. ClaudinlSAl'in normal ve tümör dokularinda ifadesi Normal doku Beyincik Kalp kasi Döl yatagi iç zari Pankreas Böbrek Karaciger 01341-P-0009 Boyun alti bezi Yumurtalik Döl yatagi Akciger Tiroit bezi Lenf bogumlari Tek çekirdekli periferik kan hücreleri Yemek borusu Tümör tipi Pankreas Yemek borusu Akciger Yumurtalik Döl yatagi iç zari Kulak burun bogaz Böbrek Prostat Incelenmedi Incelenmedi 01341-P-0009 Konvansiyonel PCR yöntemi de bagimsiz kontrol enstrümani olarak niceliksel PCR arastirmasinda alinan sonuçlari teyit edici nitelikte olmustur. Burada baglanti degiskeni A2'nin spesifik amplifikasyonuna olanak veren oligonükleotitler (SEQ 1D NO: 39,40) kullanilmistir. Bulusa göre, mide tümörlerinin çogunun ve test edilen pankreas tümörlerinin yarisinin yogun bir sekilde bu baglanti degiskeninin ifadesini gösterdikleri kanitlanmistir (Sekil 1). Buna karsilik konvansiyonel PCR yöntemiyle diger dokularda bir ifadelendirrne olduguna iliskin bir kanit getirilemeinistir. Özellikle akciger, karaciger, kan, lenf bogumlari, gögüs ve böbrek dokulari gibi önemli normal dokularda herhangi bir ifadelendirrne olmamaktadir (Tablo 1). Burada, bulusa göre, baglanti degiskenleri, üst gastrointestinal sistem, akciger, kulak-burun-bogaz, prostat tümörleri ve bunlarin metastazlari için yüksek derecede spesifik moleküler isaretçiler göstermektedir. Bu moleküler isaretçiler, bulusa göre tümör hücrelerinin kanitlanmasi için kullanilabilir. Tümörlerin tespit edilmesi, bulusa göre, anilan Oligonükleotitlerle birinin baglayici kosullar altinda transkriptin 180 baz çift uzunlugunda olan ve baglanti degiskenlerinden biri (SEQ ID NO: 8) veya digeri (SEQ ID NO: 119) için spesifik olan kismina baglanan primer çiftleri uygundur. Bu gen ürünleri, toksisite baglantili organlarda yoklugunda herhangi bir yan etkinin beklenmedigi, buna karsilik anilan kanser türlerindeki hücrelerde bunlara iyi bir baglanti yapmasi ve hücreye zarar verici ilgili etkileri göstermesi beklenen cazip aktif terapötik hedef yapilardir. Bu verilerin protein düzeyinde teyit edilmesi için claudin spesifik antikorlar veya bagisiklik serumlari, hayvanlarin bagisiklastirilmasi yoluyla üretilmistir. N uçlu hücre disi domain EXl, dizilimde her iki A1 ve A2 baglanti degiskenlerinde (A1 için SEQ ID NO: farklilasmaktadir. C uçlu hücre disi domain EXZ, her iki degisken için benzesiktir 01341-P-0009 (SEQ ID NO: 137). Su ana kadar claudin 18'in hücre disi domainlerine baglanan hiçbir antikor tanimlanmamistir. Su ana kadar spesifik olarak A1 ve A2 degiskenlerini ayirt edebilen hiçbir antikor da tanimlanmis degildir. Bulusa göre, bagisiklastirma için antikor üretimine yönelik olarak spesifik olan Al veya A2 degiskenleri için olan, diger bir deyisle her iki degiskende de bulunan hücre disinda konumlanmis peptit epiptoplar ve protein fragmanlari seçilmistir. Digerleri yaninda asagida belirtilen peptitler de bagisiklastinna amaçli olarak antikor üretimi için seçilmistir: SEQ ID NO: 17: DQWSTQDLYN (N uçlu hücre disi domain, A2 spesifik, baglanti glikosilasyondan bagimsiz) SEQ ID NO: 18: NNPVTAVFNYQ (N uçlu hücre disi domain, A2 spesifik, baglanti esas itibariyle glikosile olmayan forma, N37) SEQ ID NO: 113: STQDLYNNPVTAVF (N uçlu hücre disi domain, A2 spesifik, baglanti sadece glikosile olmayan forma, N37) SEQ ID NO: 114: DMWSTQDLYDNP (N uçlu hücre disi domain, Al spesifik) SEQ ID NO: 115: CRPYFTILGLPA (N uçlu hücre disi domain, esas itibariyle Al için spesifik) SEQ lD NO: 116: TNFWMSTANMYTG (C uçlu hücre disi domain, A1 ve A2'yi tanir) Tarafimizca digerleri yaninda seçimlik olarak baglanti degiskeni claudin 18Al'in N uçlu domainlerini taniyan, ancak A2 degiskenini (sekil 8) tanimayan antikorlar da üretilebilmistir. Bagisiklastirma için her iki baglanti degiskenlerinde benzesik 01341-P-0009 olan C uçlu hücre disi doinainlerde bulunan epitoplari kullanarak her iki degiskeni taniyan antikorlari da üretmeyi basardik (Sekil 7). Örnek olarak SEQ ID NO: 17 ile bagisiklik yapilarak üretilen bir A2'ye spesifik antikorla ilgili veriler gösterilmistir. Spesifik antikor, çesitli fiksasyon kosullarinda imunoflorisil incelemesi için kullanilir. Ilgili protein, RT PCR pozitif ve negatif hücre dizilerinin kiyaslamali boyanmasi ile kanitlanabilir uygun bir miktarda spesifik olarak,digerleri yaninda pozitif olarak tiplendirilinis mide tümörü, yemek borusu tümörü ve pankreas tümörü hücre dizilerinde belirlenebilir durumdadir (Sekil 5). Endojen protein, membran konumlu olup membran üzerinde büyük fokal agregatlar olusturur (Sekil 5). Bu antikorla insan dokularinda iinunohistokimyasal boyama yapilmistir. Bu proteinin seçiinlik doku dagitimi da tarafimizca teyit edilmistir. Çok çesitli normal dokulari kapsayan genis kapsamli bir yelpazede doku incelemesi yapilmis, karaciger, akciger, böbrek ve kolon için açiklandigi gibi hemen hemen hiçbirinde claudin 18A2 proteininin varligi kanitlanamamistir. Bu proteinin sadece normal mide dokusunda aktive oldugunu tespit ettik (Sekil 2). Sasirtici bir sekilde claudin 18'in A2 degiskeninin mide mukozasinin farklilasmis hücrelerinde kanitlanabilir oldugunu, ancak kök hücrelerinde kanitlanabilir olmadigini gördük. Farklilasmis mide mukozasi hücreleri, sürekli yenilenen hücrelerdir. Tüm mide epitelyumu fizyolojik olarak mide kök hücrelerinden kaynakli bir yenilenme ile sürekli olarak ikame edilir. Bu, mide mukozasinin vazgeçilmez hücre popülasyonunu olarak mide kök hücrelerinin, tüm diger saglikli organlarda oldugu gibi, A2 degiskenini tasimadiklarini ve bu nedenle bu hücrelerin spesifik olarak A2 degiskenine yönlendirilinis bir madde tarafindan saldiriya ugrama ihtimalleri olmadigini bulus kapsaminda kanitlamis olmamiz nedeniyle A2 degiskeninin terapötik hedef yapisi olarak kullanilma niteligini destekler. Bir dizi insan tümöründe, özellikle daha önce RT PCR incelemesinde dikkatimizi çeken inide, yemek borusu ve akciger tümörlerinde bu antikor vasitasiyla claudin 18'in A2 degiskeninin varligini kanitladik (Sekil 13). Bulusa göre bu tümörler terapötik yaklasima açiktir. 01341-P-0009 Yukarida tanimlanan antikor, bunun yani sira protein kanitina yönelik olarak western blotlamaya tabi tutulmustur. Protein, beklentiyle uyumlu sekilde, sadece Al degiskeninin aktive oldugu akciger dahil olmak üzere mide disinda baska hiçbir normal dokuda tespit edilmemistir (Sekil 9). Hastalardan alinan mide tümörleri ve bitisik normal mide dokularinin kiyaslamali boyama isleminde sasirtici bir sekilde bu proteinin, Claudin 18A2 tespit edilen tüm mide tümörlerinde daha az kitle agirligina sahip oldugu görülmüstür (Sekil 10, solda). Bir seri deney sonucunda, bulusa göre, normal mide dokusu lizatinin deglikosile edici amil PNGase F ile isleme tabi tutuldugunda bu seviyede bir güruhun olustugu tespit edilmistir (Sekil `10, sagda). Tüm normal mide dokularinda A2 degiskeninin sadece glikosile fonnu kanitlanabiliyorken, ayni A2 incelenen mide tüinörlerinin % 60'indan fazlasinda ve sadece deglikosile formda kanitlanmaktadir. Claudin 18'in A2 degiskeninin normal akcigerde protein seviyesinde tespit edilmemesine karsin daha önce niceliksel RT PCR isleminde de gösterildigi gibi akciger tümörlerinde bulunmaktadir. Burada tespit edilen de sadece deglikosile degiskendir (Sekil 11). Claudin 18'in kendisi, midenin (degisken A2) veya akciger ve midenin (degisken Al) yüksek selektif bir farklilasma antijenidir. Elde ettigimiz veriler, glikosilasyon mekanizmasinda tümörle baglantili meydana gelen degismelerden açikça etkilendigini ve tümörlerde A2 degiskeninin deglikosile olan özel bir formunun olustugunu göstermektedir. PNGase F isleminin sonuçlari Claudin 18A2'nin tümör ve normal dokularda N glikosilasyon özelligi açisindan farklilastigini göstermektedir. Bir epitopun glikosilasyonu, bu epitop için spesifik olan bir antikorun baglanmasini önleyebilir ve mevcut somut durumda böyle bir antikorun normal dokulardaki Claudin 18A2'ye degil de özel olarak kanser hücrelerindeki glisolie olmayan formuna baglanmasini destekliyor olabilir. Bu nokta, özel olarak glikosile olinayan epitoplara baglanan, bulusa göre antikorlarin üretilmesi için 01341-P-0009 imunojen seçiminde dikkate alinmistir. Bulusa göre, Claudin 18A2'de tümör ve normal dokularda farkli glikosile sekilde bulunabilen çesitli bölgeler tespit ettik. Claudin 18A2 için potansiyel glikosilasyon noktalari olarak, digerleri yaninda, bölgeleri tespit ettik (Sekil 2 altta). Bulusa göre, tümör hücreleri ve normal dokular, bu pozisyonlarin birinde veya birkaçinda farkli bir glikosilasyon ile farklilasmaktadir. Bu alanlarin çogu, klasik anlamda glikosilasyon noktalarini temsil etmemekte, ancak nadir durumlarda glikosile de olabilen asparagin, serin ve treonin içermektedir (Prediksiyon, Sekil 2 altta). Claudin 18'in her iki degiskeni, D3 domaininde literatürde ve ilgili yaygin olarak kullanilan prediksiyon algoritmalarinda hücre içi olarak bilinen tek bir glikosilasyon motifine sahiptir. Ancak yapisal olarak Claudin 18'e benzeyen tetraspanin, yani PMP22'de PMP 22'nin hidrofob 2 ve 3 membran domainlerinin tamamiyla hücre inembrani içinden geçmedigi, ancak sadece kismi olarak plazma membranina girdigini kanitlamak mümkün olmustur (Taylor et al., J Neurosc. Res. 62:15-27, 2000). Bu nedenle PMPZZ'de iki dis trans membran domainleri arasindaki tüm alan hücre disinda konumlanmistir. Claudin 18A2 için bu tür bir topoloji olasiligindan yola çikarak bir hipotez olusturduk ve kontrol ettik. Bunun için her birinde EXl, EX2 veya D3 domainlerinden birinde (His veya HA Tag olarak) bir isaretleyici dizilim tasiyan 3 yapi olusturduk (Sekil 15, üstte). Bunlari hücre dizilerinde transfeksiyona tabi tuttuk ve daha sonra bu isaretçi dizilimlere karsi yönlendirilen bir antikorun permeabilite olmayan hücrelere baglanip baglanmadigini test ettik ki bu, proteinin ilgili alaninin topolojik açidan hücre disi olmasini gerektirmektedir. Moleküldeki üç alanin hepsinin akis zitometrisinde hücre disi olarak ölçülmüs olmasi nedeniyle (sekil 15 altta) claudin 18A2`nin iki trans membran domain ve hücre disinda konumlu büyük bir domainli konformasyon içinde bulunabilecegini teyit ettik (Sekil 2, Konformasyon 2). Bu konformasyon, biyokimyasal ve terapötik açidan 01341-P-0009 önemlidir, çünkü terapötik antikorlar (SEQ ID NO: 142,143) için ilave baglanti noktalari içermektedir. Bulusa göre ve tercihen, claudin 18A2'nin glikosile olan ve glikosile olmayan degiskenlerini ayirt edebilen antikorlar üretilebilir. Bunlar, tümör hücrelerine özellikle yüksek spesifitesi olan antikorlardir. Glikosilasyona spesifik antikorlarin üretiminde glikosilasyon domainleri yaninda bu farkli konformasyon opsiyonlarini da dikkate aldik. Claudin 18A2'nin D3 bölgesi protein fragmanlari, tercihen hayvanlarin bagisiklastirilmasi için uygundur, ancak sadece bu isleme münhasir degildir. Iki antikor, mABl ve mABZ, bu konuda örnek olarak gösterilmektedir (Sekil 17). Bu antikorlarin claudin 18'in A1 veya A2 degiskenini ifade eden hücrelere baglanma özelliklerini inceledik. Claudin 18A2'nin hücre yüzeyindeki antikorlar için yaklasilir oldugunu gösterdik. Bulusa göre, bu tür antikorlar, A2 degiskenine spesifik olup A1 degiskenine baglanmamaktadir (Sekil 17). Exl ve Ex2 hücre disi domain alanlarinin içine ayri ayri kisa yabanci dizilimler yerlestirdik (Sekil 43). mABl örnek olarak alinarak antikorun baglanim özelliklerinin bundan etkilenmedigi ve asil epitopun D3 domaininde bulundugu gösterilmistir. Üretilen antikorlar, hem diyagnostik hem de terapötik amaçli olarak kullanilabilmektedir. Burada tanimlananlar gibi olan imuno serumlar (SEQ ID NO: 17 peptite karsi), örnegin western blotlamada diagnostik amaçla kullanilabilir. Bulusa göre, bu bölgelerden en az birini içeren peptitlerle (örnegin peptit SEQ ID NO: bagisiklastirma yoluyla glikosile epitopa hiç baglanmayan antikorlar üretilebilir. Bulusa göre, bu tür antikorlar, spesifik olarak tümör hücreleri üzerindeki deglikosile epitoplara baglanir. Bu pozisyonlardan birinde normal dokulara kiyasla eksik olan glikosilasyon, tümör hücrelerinde endojen ve ikincil bir deglikosilasyona bagli olabilir. Bu tür bir deglikosilasyon, ilgili aminoasidin Asn (N)-› Asp (D) transformasyonu ile 01341-P-0009 baglantilidir. Bu nedenle bu tür tümörle baglantili degismis degiskenlere karsi 141, 146, 205 pozisyonlarindan en az birinde Asp (D) ile ikame edildigi, bulusa göre claudin . Tümör hücrelerine yüksek derecede selektif olmalari nedeniyle bu tür antikorlar, özellikle terapötik amaçlarla kullanilabilir. Üretilen antikorlar, dogrudan kiinera nitelikli veya insanilestirilmis rekombinan antikorlarin kullanimi için de kullanilabilir. Bu, dogrudan tavsanlardan alinan antikorlarla da yapilabilir (bu Nathan S, Elia M, Gout I, Jungbluth AA, Cohen LS, Welt S, Old LJ, Barbas CF 3rd. Terapötik insan antikoru üretimi için yeni bir kaynak olarak tavsan antikor dagarcigi ( "The rabbit anti'body repertoire as a novel sourcefor the generation of therapeuti'c human antibodies"). Bunun için bagisiklastirilmis hayvanlardan lenfosit alinarak muhafaza edilmistir. , asilama veya antijenlere spesifik T lenfositlerin adoptif transferi gibi imunoterapötik yöntemler için de özellikle yararli epitop saglar. TR TR TR TR TR

Claims (1)

1.
TR2018/09165T 2004-05-18 2005-05-18 Tümörlerde diferansiyel olarak ifade edilen gen ürünleri ve bunların kullanımı. TR201809165T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102004024617A DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2004-05-18 Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201809165T4 true TR201809165T4 (tr) 2018-07-23

Family

ID=34968689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/09165T TR201809165T4 (tr) 2004-05-18 2005-05-18 Tümörlerde diferansiyel olarak ifade edilen gen ürünleri ve bunların kullanımı.

Country Status (19)

Country Link
US (4) US9044382B2 (tr)
EP (7) EP2371848B8 (tr)
JP (5) JP5242160B2 (tr)
AU (1) AU2005245593B2 (tr)
CA (2) CA2984563A1 (tr)
CY (4) CY1118271T1 (tr)
DE (1) DE102004024617A1 (tr)
DK (4) DK3401327T3 (tr)
ES (4) ES2675558T3 (tr)
HR (4) HRP20161449T1 (tr)
HU (4) HUE030620T2 (tr)
LT (4) LT1749027T (tr)
ME (2) ME02653B (tr)
PL (4) PL2380903T3 (tr)
PT (4) PT2371848T (tr)
RS (4) RS55357B1 (tr)
SI (4) SI2380903T1 (tr)
TR (1) TR201809165T4 (tr)
WO (1) WO2005113587A2 (tr)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10254601A1 (de) * 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
DE102004024617A1 (de) * 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
AU2016202322B2 (en) * 2005-11-24 2018-03-08 Astellas Pharma Inc. Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
EP2060583A1 (en) * 2007-10-23 2009-05-20 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
AU2010217160C1 (en) * 2009-02-25 2015-07-02 Diagnocure Inc. Method for detecting metastasis of GI cancer
WO2013167153A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
NZ746691A (en) 2012-11-13 2020-08-28 Astellas Pharma Inc Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014146672A1 (en) 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
CN120137056A (zh) 2014-07-17 2025-06-13 恺兴生命科技(上海)有限公司 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
WO2016165762A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
WO2016180468A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes
US12186343B2 (en) 2018-03-09 2025-01-07 Crage Medical Co., Limited Method and composition for treating tumors
BR112021011014A2 (pt) * 2018-12-07 2021-08-31 Zlip Holding Limited Anticorpos anti-claudina e usos destes
EP3917564A4 (en) 2019-02-01 2022-12-21 NovaRock Biotherapeutics, Ltd. ANTI-CLAUDIN-18 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
KR20220111308A (ko) 2019-12-06 2022-08-09 소티오 바이오테크 에이.에스. 인간화 cldn18.2 항체
CN114901365B (zh) 2019-12-23 2025-07-15 斯迪安生物技术公司 肿瘤特异性密蛋白18.2抗体
WO2022122709A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 Sotio Biotech A.S. Antibody-drug conjugates based on humanized cldn18.2 antibodies
EP4267194A1 (en) 2020-12-23 2023-11-01 SOTIO Biotech a.s. Tumor-specific claudin 18.2 antibody-drug conjugates

Family Cites Families (204)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1998A (en) 1841-03-12 Refrigerator
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
ATE243754T1 (de) 1987-05-21 2003-07-15 Micromet Ag Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US6020145A (en) 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
WO1991009974A1 (en) 1989-12-27 1991-07-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce Diagnostic probe for detecting human stomach cancer
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
GB9019812D0 (en) 1990-09-11 1990-10-24 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
US5589579A (en) 1994-07-19 1996-12-31 Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. Gene sequence and probe for a marker of non-small cell lung carinoma
WO2000075316A1 (en) 1999-06-02 2000-12-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
WO2001004311A1 (en) 1999-07-07 2001-01-18 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2000053757A2 (en) 1999-03-08 2000-09-14 Genentech, Inc. Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization
WO2000073454A1 (en) 1999-06-02 2000-12-07 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5677139A (en) 1995-04-21 1997-10-14 President And Fellows Of Harvard College In vitro differentiation of CD34+ progenitor cells into T lymphocytes
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
JP2001501447A (ja) 1996-01-11 2001-02-06 コリクサ コーポレイション 乳癌の処置および診断のための組成物および方法
WO2001049715A2 (en) 2000-01-06 2001-07-12 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
WO2000075327A1 (en) 1999-06-02 2000-12-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
WO2000053756A2 (en) 1999-03-08 2000-09-14 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US7368531B2 (en) * 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
US7411051B2 (en) 1997-03-07 2008-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to HDPPA04 polypeptide
US20070224663A1 (en) 1997-03-07 2007-09-27 Human Genome Sciences, Inc. Human Secreted Proteins
US20020127584A1 (en) 1997-09-18 2002-09-12 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030073129A1 (en) 1998-09-01 2003-04-17 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030022298A1 (en) 1997-09-15 2003-01-30 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20050196832A1 (en) 1997-09-18 2005-09-08 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030008352A1 (en) 1997-09-18 2003-01-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030022293A1 (en) 1997-09-18 2003-01-30 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030166104A1 (en) 1997-09-18 2003-09-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030027272A1 (en) 1997-09-18 2003-02-06 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7160985B2 (en) 1997-10-29 2007-01-09 Genentech, Inc. Pro180 polypeptide
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20030022835A1 (en) 1998-04-29 2003-01-30 Genesis Research And Development Corporation Limited Compositions isolated from skin cells and methods for their use
US20030040471A1 (en) 1998-04-29 2003-02-27 Watson James D. Compositions isolated from skin cells and methods for their use
JP3428441B2 (ja) 1998-05-15 2003-07-22 エーザイ株式会社 タイトジャンクション構成膜蛋白質クローディンファミリー
US7319008B2 (en) 1998-06-02 2008-01-15 Genentech, Inc. Nucleic acid underexpressed in melanoma
US7351543B2 (en) 1998-06-02 2008-04-01 Genentech, Inc. Antibodies to a polypeptide encoded by a nucleic acid underexpressed in melanoma
JP2002517222A (ja) * 1998-06-11 2002-06-18 スミスクライン ビーチャム コーポレーション Ｇｐｒ３５ａ受容体
US7339033B2 (en) 1998-06-26 2008-03-04 Genentech, Inc. Pro1481
WO2000008206A1 (en) 1998-08-04 2000-02-17 Diadexus Llc A novel method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating lung cancer
US20030082626A1 (en) 1998-09-01 2003-05-01 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20050181478A1 (en) 1998-09-01 2005-08-18 Baker Kevin P. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7538086B2 (en) 1998-09-01 2009-05-26 Genentech, Inc. PRO1303 polypeptides
NZ510464A (en) 1998-09-01 2004-05-28 Genentech Inc Further pro polypeptides and sequences thereof
US7038019B2 (en) 1998-09-01 2006-05-02 Genentech, Inc. Antibodies to PRO1410
WO2000015659A2 (en) * 1998-09-16 2000-03-23 Zymogenetics, Inc. Stomach polypeptide zsig28
JP2004507201A (ja) 1998-09-16 2004-03-11 ジェネンテック・インコーポレーテッド 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードしている核酸
AU766279B2 (en) 1998-10-06 2003-10-16 Curagen Corporation Novel secreted proteins and polynucleotides encoding them
US7399834B2 (en) 1998-10-07 2008-07-15 Genentech, Inc. Anti-PRO1558 antibodies
AU1450900A (en) * 1998-10-21 2000-05-08 Arch Development Corporation Methods of treatment of type 2 diabetes
US7026449B2 (en) 1999-01-05 2006-04-11 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7109292B2 (en) 1999-03-08 2006-09-19 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7507404B2 (en) 1999-03-08 2009-03-24 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
ATE329023T1 (de) 1999-03-23 2006-06-15 Genentech Inc Ausgeschiedene und transmembran-polypeptide und dafür kodierende nukleinsäure
WO2000058473A2 (en) 1999-03-31 2000-10-05 Curagen Corporation Nucleic acids including open reading frames encoding polypeptides; 'orfx'
US20080286821A1 (en) 1999-05-14 2008-11-20 Eaton Dan L Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP1185648B1 (en) 1999-06-02 2007-03-21 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
ATE448246T1 (de) 1999-06-15 2009-11-15 Genentech Inc Sekretierte und transmembran-polypeptide sowie nukleinsäuren zu deren kodierung
AU2883700A (en) 1999-06-23 2001-01-09 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP1208202A2 (en) 1999-09-01 2002-05-29 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2001027257A1 (en) 1999-10-14 2001-04-19 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Tumor antigen derived gene-16 (tadg-16): a novel extracellular serine protease and uses thereof
CA2494705A1 (en) 1999-12-01 2001-06-07 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6380362B1 (en) 1999-12-23 2002-04-30 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use
US20030050231A1 (en) 2000-01-31 2003-03-13 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055327A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055326A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
AU2001237958A1 (en) 2000-01-31 2001-08-07 Human Genome Sciences, Inc. 22 human secreted proteins
EP1261711A2 (en) 2000-02-22 2002-12-04 Corixa Corporation Compositions and methods for diagnosis and therapy of malignant mesothelioma
AU6802801A (en) 2000-03-01 2001-09-24 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030165831A1 (en) 2000-03-21 2003-09-04 John Lee Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
EP1803730A1 (en) 2000-04-12 2007-07-04 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2001090357A1 (en) 2000-05-24 2001-11-29 Genesis Research & Development Corporation Limited Compositions isolated from skin cells and methods for their use
US6822082B2 (en) 2000-06-30 2004-11-23 Zymogenetics, Inc. Polynucleotides for mammalian secreted protein, Z1055G2P
CN1468250A (zh) 2000-08-03 2004-01-14 ��ķһ����˹��̹ 在转基因动物中产生人源化抗体
EP1311663B1 (en) 2000-08-15 2007-05-30 Immunex Corporation Claudin polypeptides
AU2001285047A1 (en) 2000-08-16 2002-02-25 Chiron Corporation Human genes and gene expression products
AU2001229509A1 (en) * 2000-08-18 2002-03-04 Human Genome Sciences, Inc. 11 human secreted proteins
EP1328635A2 (en) 2000-08-28 2003-07-23 Diadexus, Inc. Compositions and methods relating to lung specific genes
EP1315743B1 (en) 2000-09-08 2012-11-07 Merck Sharp & Dohme Corp. Mammalian genes; related reagents and methods
US7829276B2 (en) 2000-09-18 2010-11-09 Thomas Jefferson University Methods of using CRCA-1 as a stomach and esophageal cancer marker
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
WO2002061087A2 (en) 2000-12-19 2002-08-08 Lifespan Biosciences, Inc. Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides
AU2002255478A1 (en) 2001-01-10 2002-09-12 Pe Corporation (Ny) Kits, such as nucleic acid arrays, comprising a majority of human exons or transcripts, for detecting expression and other uses thereof
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2440008A1 (en) 2001-01-29 2002-08-29 Phase-1 Molecular Toxicology, Inc. Rat toxicologically relevant genes and uses thereof
CA2439383A1 (en) 2001-02-26 2002-09-06 Arena Pharmaceuticals, Inc. Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors
US20030152939A1 (en) 2001-04-09 2003-08-14 Glennda Smithson Novel secreted proteins and polynucleotides encoding them
US20060084794A1 (en) 2001-04-12 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
JP2003000249A (ja) 2001-05-10 2003-01-07 Daiichi Fine Chemical Co Ltd クローディンによるＭＴ−ＭＭＰｓを介したｐｒｏＭＭＰ−２活性化
US20030108890A1 (en) * 2001-05-30 2003-06-12 Baranova Anna Vjacheslavovna In silico screening for phenotype-associated expressed sequences
WO2003004604A2 (en) 2001-07-06 2003-01-16 Genentech, Inc. Phage displayed pdz domain ligands
AU2002321903A1 (en) 2001-08-03 2003-02-24 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in cells
US20040142325A1 (en) * 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US7202335B2 (en) 2001-12-06 2007-04-10 Genentech, Inc. PRO300 polypeptides
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
TW200304948A (en) * 2002-02-28 2003-10-16 Sankyo Co The marker for the prediction of heart failure condition and the use thereof
CA2379661A1 (en) 2002-03-28 2003-09-28 Kursad Turksen Paracellular drug delivery system
AU2003240495A1 (en) 2002-06-04 2003-12-19 Incyte Corporation Diagnostics markers for lung cancer
SI2345671T1 (sl) 2002-09-27 2016-03-31 Xencor Inc. Optimizirane Fc-variante in postopki za njihovo izdelavo
KR101348472B1 (ko) 2002-10-17 2014-01-07 젠맵 에이/에스 Ｃｄ20에 대한 인간 모노클로날 항체
EP1578365A4 (en) 2002-11-14 2009-09-23 Arbor Vita Corp MOLECULAR INTERACTIONS IN NEURONS
DE10254601A1 (de) * 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
EP1430902A1 (en) 2002-12-20 2004-06-23 Mondobiotech Laboratories Anstalt Pharmaceutical composition of interferon gamma with molecular diagnostics for the improved treatment of asthma bronchiale
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
WO2004063355A2 (en) 2003-01-10 2004-07-29 Protein Design Labs, Inc. Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of matastatic cancer
EP2481814A3 (en) 2003-06-09 2012-10-10 The Regents of the University of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US20060240441A1 (en) 2003-10-03 2006-10-26 Bayer Pharmaceuticals Corporation Gene expression profiles and methods of use
DE10354601B3 (de) 2003-11-21 2005-06-23 Chiropro Gmbh Gelenkprothese für Fingerglieder
WO2005052182A2 (en) 2003-11-26 2005-06-09 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem A method of analyzing plasma membrane protein content of cells
US7858322B2 (en) 2003-12-23 2010-12-28 Nono, Inc. Method of determining inhibition of binding to TRPM7 protein
WO2005076939A2 (en) 2004-02-09 2005-08-25 University Of Kentucky Research Foundation Assay and method for diagnosing and treating alzheimer’s disease
EP1732582A2 (en) 2004-02-26 2006-12-20 Ohio University Diagnosis of hyperinsulinemia and type ii diabetes and protection against same based on genes differentially expressed in muscle cells
US20050255041A1 (en) 2004-05-13 2005-11-17 Arius Research, Inc. Cancerous disease modifying antibodies
DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
ATE427499T1 (de) 2004-05-21 2009-04-15 Inst Systems Biology Zusammensetzungen und verfahren zur quantifizierung von serumglykoproteinen
WO2006023121A1 (en) 2004-07-27 2006-03-02 Ohio University Diagnosis of hyperinsulinemia and type ii diabetes and protection against same based on genes differentially expressed in white adipose tissue (13)
DE102004042822A1 (de) 2004-08-31 2006-03-16 Technische Universität Dresden Verbindungen und Methoden zur Behandlung, Diagnose und Prognose bei Pankreaserkrankungen
FR2876705B1 (fr) 2004-10-19 2008-12-12 Biomerieux Sa Procede pour le diagnostic d'une intolerance a l'aspirine
US20070072175A1 (en) 2005-05-13 2007-03-29 Biogen Idec Ma Inc. Nucleotide array containing polynucleotide probes complementary to, or fragments of, cynomolgus monkey genes and the use thereof
JP2009500611A (ja) 2005-07-01 2009-01-08 アルボー ビータ コーポレーション インフルエンザの診断および治療のための方法および組成物
JP2009504183A (ja) 2005-08-15 2009-02-05 ジェネンテック・インコーポレーテッド 遺伝子破壊、それに関連する組成物および方法
WO2007027867A2 (en) 2005-08-31 2007-03-08 Cell Signaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in carcinoma signaling pathways
DK1934615T3 (da) 2005-09-19 2014-07-14 Janssen Diagnostics Llc Fremgangsmåder og materialer til identificering af oprindelsen af et karcinom med ukendt primær oprindelse
AU2006304605A1 (en) 2005-10-17 2007-04-26 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
US20070264193A1 (en) 2006-03-29 2007-11-15 Genentech, Inc. Diagnostics and treatments for tumors
US20100129929A1 (en) 2006-07-27 2010-05-27 Roberto Polakewicz Tyrosine Phosphorylation Sites
JP5244103B2 (ja) 2006-08-09 2013-07-24 ホームステッド クリニカル コーポレイション 器官特異的蛋白質およびその使用方法
WO2008021115A2 (en) 2006-08-14 2008-02-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Diagnostic tests using gene expression ratios
WO2008082730A2 (en) 2006-09-19 2008-07-10 Novartis Ag Biomarkers of target modulation, efficacy, diagnosis and/or prognosis for raf inhibitors
AU2007306542B2 (en) 2006-10-11 2013-08-01 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Influenza targets
US20090018031A1 (en) 2006-12-07 2009-01-15 Switchgear Genomics Transcriptional regulatory elements of biological pathways tools, and methods
WO2008073919A2 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. Mir-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20100021886A1 (en) 2007-02-01 2010-01-28 Yixin Wang Methods and Materials for Identifying the Origin of a Carcinoma of Unknown Primary Origin
EP1983002A3 (en) 2007-04-19 2009-03-11 Peter Hornbeck Tyrosine phosphorylation sites and antibodies specific for them
EP1997832A1 (en) 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
JP2010529966A (ja) 2007-06-08 2010-09-02 アシュラジェン インコーポレイテッド 治療的介入の標的としてｍｉＲ−３４によって調節される遺伝子および経路
WO2008152822A1 (ja) 2007-06-15 2008-12-18 Medinet Co., Ltd. 医薬
WO2009015050A2 (en) 2007-07-20 2009-01-29 The Gov. Of The U.S.A. As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services Gene expression profile for predicting ovarian cancer patient survival
WO2009035497A2 (en) 2007-08-08 2009-03-19 Savidge Tor C Disease related cysteine modifications and uses thereof
EP2036987A1 (en) 2007-09-17 2009-03-18 Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Molecular markers for tumor cell content in tissue samples
CN101801370B (zh) 2007-09-19 2013-06-12 三得利控股株式会社 含有芝麻素类和花生四烯酸类的组合物
JP2011501662A (ja) 2007-10-12 2011-01-13 ザ・プロウボウスト・フェロウズ・アンド・スカラーズ・オブ・ザ・カレッジ・オブ・ザ・ホリー・アンド・アンデバイデッド・トリニティ・オブ・クイーン・エリザベス・ニア・ダブリン タイト結合を開放するための方法
US8563515B2 (en) 2007-11-19 2013-10-22 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Tight junction protein modulators and uses thereof
US20090304697A1 (en) 2008-06-02 2009-12-10 Nsabp Foundation, Inc. Identification and use of prognostic and predictive markers in cancer treatment
WO2010046889A1 (en) 2008-10-23 2010-04-29 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods for delivery of sirna to bone marrow cells and uses thereof
CN101381524A (zh) 2008-10-24 2009-03-11 南开大学 单层氧化石墨与水溶性高分子增强复合材料
GB0904957D0 (en) 2009-03-23 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Tumour gene profile
WO2010120526A2 (en) 2009-03-31 2010-10-21 Emory University Methods and systems for screening for and diagnosing dna methylation associated with autism spectrum disorders
CN101584860A (zh) 2009-04-27 2009-11-25 西安杰诺瓦生物科技有限公司 重组人Claudin18.2肿瘤疫苗及其制备方法
WO2010141093A2 (en) 2009-06-04 2010-12-09 The University Of Maryland, Baltimore Co-signaling methods for treating cancers
AU2010302955A1 (en) 2009-10-01 2012-05-17 Chipdx Llc System and method for classification of patients
CA2782620A1 (en) 2009-12-01 2011-06-09 Compendia Bioscience, Inc. Classification of cancers
EP2366709A1 (en) 2010-03-16 2011-09-21 BioNTech AG Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-proteins
AU2011229518B2 (en) 2010-03-16 2015-09-24 Biontech Protein Therapeutics Gmbh Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-proteins
US8945847B2 (en) 2010-05-24 2015-02-03 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Methods and kits for ascertaining biosafety of an agent
US9249225B2 (en) * 2010-05-26 2016-02-02 Regents Of The University Of Minnesota Single chain variable fragment anti-CD133 antibodies and uses thereof
CN103119176A (zh) 2010-06-07 2013-05-22 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于预测对白介素-6受体抑制性单克隆抗体药物治疗的响应的基因表达标记
WO2011163627A2 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Integrated Diagnostics, Inc. Organ specific diagnostic panels and methods for identification of organ specific panel proteins
WO2012070014A2 (en) 2010-11-26 2012-05-31 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Identification of novel cell surface markers for pancreatic progenitor cells and definite endodermal cells
JP5319023B2 (ja) 2011-01-12 2013-10-16 森永乳業株式会社 免疫調節作用を有する乳を産生する食餌のスクリーニング法
DE102011005235B4 (de) 2011-03-08 2017-05-24 Sirs-Lab Gmbh Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von Polynucleotiden zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Wirtsantwort eines Patienten
AU2013243954A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
WO2013167153A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2013174403A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014025198A2 (ko) 2012-08-09 2014-02-13 주식회사 한독 Lfa3 변이체 및 상기 변이체 또는 lfa3 cd2 결합영역과 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도
WO2014025199A2 (ko) 2012-08-09 2014-02-13 주식회사 한독 스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도
EP2888391A4 (en) 2012-08-24 2016-09-14 Univ Utah Res Found COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO BLOOD-BASED BIOMARKERS FOR BREAST CANCER
US9856532B2 (en) 2012-09-07 2018-01-02 Institute For Systems Biology Markers and methods for detecting posttraumatic stress disorder (PTSD)
US20140073524A1 (en) 2012-09-07 2014-03-13 Institute For Systems Biology Markers and methods for detecting posttraumatic stress disorder (ptsd)
WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014146672A1 (en) 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005113587A3 (de) 2006-05-18
HRP20181013T1 (hr) 2018-08-24
HRP20161449T1 (hr) 2016-12-16
EP2371848B1 (de) 2018-04-18
CA2563666C (en) 2017-11-14
EP1749027A2 (de) 2007-02-07
LT2371848T (lt) 2018-07-25
HRP20170879T1 (hr) 2017-12-01
PL2380903T3 (pl) 2017-10-31
HUE030620T2 (en) 2017-06-28
JP6218881B2 (ja) 2017-10-25
DE102004024617A1 (de) 2005-12-29
PL3401327T3 (pl) 2021-05-04
LT3401327T (lt) 2021-02-25
EP1749027B1 (de) 2016-08-10
SI3401327T1 (sl) 2021-05-31
EP2371848B8 (de) 2018-06-06
ES2847025T3 (es) 2021-07-30
RS61395B1 (sr) 2021-02-26
JP6223488B2 (ja) 2017-11-01
SI2380903T1 (sl) 2017-08-31
HUE040399T2 (hu) 2019-03-28
SI2371848T1 (sl) 2018-10-30
ME02889B (me) 2018-04-20
EP2383288A2 (de) 2011-11-02
LT2380903T (lt) 2017-07-10
HUE056422T2 (hu) 2022-02-28
PT2371848T (pt) 2018-07-16
EP3401327B1 (de) 2021-01-13
EP2392593A2 (de) 2011-12-07
PT2380903T (pt) 2017-07-12
EP2392593B1 (de) 2018-08-01
CY1118271T1 (el) 2017-06-28
WO2005113587A2 (de) 2005-12-01
CY1123733T1 (el) 2022-05-27
EP3401327A1 (de) 2018-11-14
DK1749027T3 (en) 2016-12-05
JP2008508861A (ja) 2008-03-27
PT1749027T (pt) 2016-11-07
PT3401327T (pt) 2021-02-11
EP2371848A1 (de) 2011-10-05
ES2627962T3 (es) 2017-08-01
CA2563666A1 (en) 2005-12-01
CY1120789T1 (el) 2019-12-11
ES2601149T3 (es) 2017-02-14
EP2371849A1 (de) 2011-10-05
US9775785B2 (en) 2017-10-03
DK2371848T3 (en) 2018-07-23
EP2392593A3 (de) 2012-06-06
JP2016189775A (ja) 2016-11-10
EP2380903B1 (de) 2017-04-05
JP5793133B2 (ja) 2015-10-14
US20170240646A1 (en) 2017-08-24
CA2984563A1 (en) 2005-12-01
AU2005245593B2 (en) 2011-10-20
HRP20210494T1 (hr) 2021-05-14
EP2383288A3 (de) 2012-02-15
LT1749027T (lt) 2016-11-10
US20150315287A1 (en) 2015-11-05
AU2005245593A1 (en) 2005-12-01
RS57437B1 (sr) 2018-09-28
DK3401327T3 (da) 2021-04-06
JP5242160B2 (ja) 2013-07-24
JP2013121346A (ja) 2013-06-20
CY1119233T1 (el) 2018-02-14
US20080166350A1 (en) 2008-07-10
US9044382B2 (en) 2015-06-02
PL1749027T3 (pl) 2017-01-31
ME02653B (me) 2017-06-20
ES2675558T3 (es) 2018-07-11
DK2380903T3 (en) 2017-07-17
JP6080831B2 (ja) 2017-02-15
US20210145700A1 (en) 2021-05-20
EP2380903A1 (de) 2011-10-26
RS56140B1 (sr) 2017-10-31
JP2016185943A (ja) 2016-10-27
HUE035289T2 (en) 2018-05-02
JP2015096504A (ja) 2015-05-21
PL2371848T3 (pl) 2018-12-31
RS55357B1 (sr) 2017-03-31
SI1749027T1 (sl) 2017-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1714150B (zh) 肿瘤内差异表达的基因产物及其应用
TR201809165T4 (tr) Tümörlerde diferansiyel olarak ifade edilen gen ürünleri ve bunların kullanımı.
HK40000286A (en) Gene products differentially expressed in tumors and their uses
HK40000286B (en) Gene products differentially expressed in tumors and their uses
HK1165472A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165479A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165481A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165485A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165470A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165461A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165474A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165477A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165467A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165464A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165462A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165484A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165476A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165463A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165473A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165465A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165482A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165478A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165469A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165468A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same
HK1165475A (en) In tumours differentially expressed gene products and use of the same