TR201901382T4 - Serin proteaz varyantlarını içeren bileşimler ve yöntemler. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, serin proteaz varyantları, daha spesifik olarak bunlardan üretilen subtilisin varyantlarını sağlar. Spesifik olarak mevcut buluş, bir referans proteaz ile karşılaştırıldığında bir veya daha fazla sübstitüsyona sahip serin proteaz varyantlarını, daha spesifik olarak subtilisin varyantlarını sağlar. Ek olarak mevcut buluş, bu serin proteaz varyantlarını, daha spesifik olarak subtilisin varyantlarını içeren bileşimleri sağlar. Bazı düzenlemelerde mevcut buluş, bu serin proteaz varyantlarının, daha spesifik olarak subtilisin varyantlarının en az birini içeren temizlik bileşimlerini sağlar.

Description

TARIFNAME SERIN PROTEAZ VARYANTLARINI IÇEREN BILESIMLER VE YÖNTEMLER BULUS SAHASI Mevcut bulus, serin proteaz varyantlarini saglar. Spesifik olarak mevcut bulus, referans serin proteaz ile karsilastirildiginda bir veya birkaç sübstitüsyona sahip serin proteaz varyantlarini saglar. Ayrica mevcut bulus, bu serin proteaz varyantlarini içeren bilesimleri saglar. Bazi düzenlemelerde mevcut bulus, bu serin proteaz varyantlarindan, daha spesifik olarak subtilisin varyantlarindan en az birini içeren BULUSUN ALT YAPISI Serin proteazlarin endüstriyel enzimler tekniginde uzun süredir bilinmesine ragmen belirli durumlar ve kullanimlar için uygun gelistirilmis proteazlara gereksinim vardir. WO yikama performansi içeren özelliklerinde parent subtilaza göre degisiklikler sergileyen yeni diger subtilaz varyantlari ile ilgilidir. BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus, istem 1'de tanimlandigi üzere izole bir subtilisin varyanti saglar. Bazi düzenlemelerde, istemlerde tanimlandigi üzer izole subtilisin varyanti, SEQ ID NO:2,de gösterilen amino asit dizisini içeren söz konusu Baci'llus /entus subtilisin GG36 proteaz ile en az %90 amino asit özdesligine sahiptir. varyantini kodlayan bir nükleik asit saglar. Bazi düzenlemelerde mevcut bulus, bulusa ait subtilisin varyantinin üretilmesine yönelik bir ifade vektörü, konakçi hücre ve yöntem saglar, bunun kosulu söz konusu vektör, hücre veya yöntemin istemlerde tanimlanan sekilde olmasidir. Bazi düzenlemelerde mevcut bulus, istemlerde tanimlanan sekilde bir varyanti veya varyanti kodlayan nükleik asitleri saglar, burada varyantin toplam net yükü, Bacillus 3, - 4, veya -5"tir. Bazi düzenlemelerde mevcut bulus, istemlerde tanimlandigi üzere en az bir varyanta sahip bir bilesim saglar, burada söz konusu bilesim bir kumas ve ev bakim ürünü degildir. Bazi düzenlemelerde mevcut bulus istemlerde tanimlana sekilde bir temizleme yöntemi saglar. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, BPN' (SEQ ID No:1) ve GGSö'yi (SEQ ID No:2) içeren olgun referans proteazlarin hizalamasini saglar. Her soguk su proteaz varyanti da dahil burada açiklanan her proteaz varyantinin, daha spesifik olarak subtilisin varyantlarinin her amino asit pozisyonu, Bacillus amy/oliquefaciens subtilisin proteaz BPN' amino asit dizisi ile proteaz varyanti amino asit dizisinin hizalanmasi yoluyla belirlendigi üzere Sekil 1'de gösterildigi sekilde Baci/Ius amy/o/iquefaciens subtilisin proteaz BPN' (SEQ göre numaralandirilir. Dolayisiyla aksi belirtilmedikçe sübstitüsyon pozisyonlari BPN' ile iliskili olarak verilir. BULUSUN AÇIKLAMASI Mevcut bulus, serin proteaz varyantlari, daha spesifik olarak subtilisin varyantlari saglar. Spesifik olarak mevcut bulus, referans serin proteazlar ile karsilastirildiginda bir veya daha fazla sübstitüsyona sahip serin proteaz varyantlari, daha spesifik olarak subtilisin varyantlari saglar. Ek olarak mevcut bulus, bu serin proteaz varyantlarini, daha spesifik olarak subtilisin varyantlarini içeren bilesimleri saglar. Bazi düzenlemelerde mevcut bulus, bu serin proteaz varyantlarinin, daha spesifik olarak subtilisin varyantlarinin en az birini içeren temizlik bilesimlerini saglar. Tanimlar Aksi belirtilmedikçe mevcut bulusun uygulamasi, teknikte uzman kisinin bilgisi dahilinde olan moleküler biyoloji, protein mühendisligi, mikrobiyoloji ve rekombinant DNA'da yaygin olarak kullanilan klasik teknikleri içerir. Bu tür teknikler teknikte uzman kisilerce bilinir ve teknikte uzman kisilerce iyi bilinen birçok metin ve referans çalismada açiklanir. Burada aksi belirtilmedikçe burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel terimler, bu bulusun ait oldugu teknikte uzman kisi tarafindan yaygin olarak anlasilanla ayni anlama sahiptir. Teknikte uzman kisilerce birçok teknik sözlük bilinmektedir. Burada açiklananlara benzer veya esdeger olan her türlü yöntemin ve materyalin mevcut bulus uygulamasinda kullanilmasina ragmen bazi uygun yöntemler ve materyaller burada açiklanir. Buna bagli olarak hemen asagida tanimlanan terimler, bir bütün olarak Spesifikasyona referans ile tamamen açiklanmaktadir. Ayni zamanda burada kullanildigi üzere "bir," tek" ve "bu" tekil terimleri, baglam aksini net sekilde belirtmedikçe çogul referansi da içerir. Sayisal araliklar, araligi belirleyen sayilari da içerir. Aksi belirtilmedikçe sirasiyla nükleik asitler, 5' ila 3' yönünde soldan saga yazilir; amino asit dizileri, amino ila karboksi yönünde soldan saga yazilir. Bu bulusun, bunlarin teknikte uzman kisilerce kullanilan baglama bagli olarak degismesi nedeniyle açiklanan özel yöntem, protokol ve reaktifler ile sinirlandirilmadigi anlasilacaktir. Mevcut bulusun uygulamasi aksi belirtilmedikçe, tümünün teknikte uzman kisilerce bilindigi protein saflastirmasi, moleküler biyoloji, mikrobiyoloji, rekombinant DNA teknikleri ve protein dizilemesine iliskin klasik teknikleri kullanir. Ayrica, burada verilen basliklar, tarifnamenin bir bütün olarak referans alinmasi suretiyle bulusun çesitli açilari veya düzenlemeleri için bir sinirlama degildir. Dolayisiyla, asagidaki paragraflarda tanimlanan terimler, tarifname bir bütün olarak referans alindiginda daha ayrintili olarak tanimlanir. Öte yandan, birtakim terimlerin tanimlari bulusun anlasilmasini kolaylastirmak için asagida verilmektedir. Burada kullanildigi üzere "proteaz" ve "proteinaz" terimleri diger proteinleri parçalama becerisine sahip bir enzim proteindir. Bir proteaz, proteini olusturan bir peptit veya polipeptit zincirinde amino asitleri birbirine baglayan peptit baglarinin hidrolizi üzerinden protein katabolizmasini baslatan proteolizi yürütme becerisine sahiptir. Bir proteazin bir protein sindirici enzim olarak sergiledigi bu aktivite "proteolitik aktivite" olarak refere edilir. Proteolitik aktivitenin ölçülmesine yönelik iyi bilinen birçok prosedür mevcuttur (Bakiniz örnegin, Kalisz, "Microbial Proteinases," In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, (1988)). Proteolitik aktivite örnegin ilgili proteazin bir ticari substrati hidrolize etme becerisini analiz eden karsilastirma analizleri araciligiyla belirlenebilir. Proteaz veya proteolitik aktivite analizinde faydali temsili substratlar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla di-metil kazein (Sigma C-9801), bovin kollajen (Sigma C-9879), bovin elastin (Sigma E-1625) ve bovin keratini (ICN Biomedical 902111) kapsar. Bu substratlarin kullanildigi kolorimetri analizleri ilgili ayristirma esnasinda toplanan fraksiyonlar için aktif enzim konsantrasyonunu kullanima sahiptir. Bu analiz, çözünür sentetik süksiniI-alanin-aIanin-prolin-fenilalanin- p-nitroanilid (suc-AAPF-pNA) substrati enzim tarafindan hidrolize edilirken p-nitroanilin salim hizini ölçer. Hidroliz reaksiyonunda sari rengin olusma hizi bir spektrofotometrede 410 nm'de ölçülür ve aktif enzim konsantrasyonu ile orantilidir. Ayrica, toplam protein konsantrasyonunu belirlemek için 280 nanometrede (nm) sogurum ölçümleri kullanilabilir. Aktif enzim/toplam protein orani enzim safligini verir. Burada kullanildigi haliyle, "subtilisin" terimi, MEROPS - The Peptidase Database (Bakiniz Rawlings vd., MEROPS: the peptidase database, Nucl. Acids Res. 34 ailesinin herhangi bir üyesini ifade eder. Bu referansta açiklandigi üzere, peptidaz ailesi 38, serin endopeptidaz subtilisini ve homologlarini kapsar (Rawlings and Barrett, peptidazlarin en büyük ikinci ailesidir. S8 ailesinin birkaç üyesi için tersiyer yapilar belirlenmistir. Tipik bir 88 protein yapisi, iki sarmal tabakasinin arasinda bir yedi iplikli ß yapragi olmak üzere üç tabakadan olusur. Subtilisin (808.001), SB (SB) klani için tip yapisidir. Farkli yapilarina ragmen, subtilisinin ve kimotripsinin (801.001) aktif bölgelerinin örtüsmesi, benzerligin iraksak evrim yerine yakinsak evrimden kaynaklandigini gösterir. Burada kullanildigi üzere "proteaz varyanti , varyant proteaz , varyant serin proteaz", fonksiyonlari bakimindan referans proteaz (dogal sus subtilisin proteazi olabilen) ile benzer olan ancak amino asit dizilerinde bunlari dogal sus proteaz veya varyant proteazin derive edildigi herhangi bir baslangiç referans proteazdan (yani, "parent" proteaz) farkli olmalarini saglayan mutasyonlara sahip olan proteazlara iliskin olarak kullanilir. Bazi düzenlemelerde mevcut bulus, "GG36 varyantlarini" (veya "GG36 subtilisin varyantlarini") saglar, burada mutasyonlar, SEQ lD NO:2'de verilen olgun GGSö dizisinde bulunur. Ancak referans proteazin, belirli herhangi bir amino asit dizisi ile sinirlandirilmasi amaçlanmaz. Ayrica terimin, parent proteaz dizisinin, SEQ ID NO:2,deki amino asit dizisi ile en az %90, en az %95, en az %96, en az %97, en az amaçlanir. Burada açiklandigi üzere "soguk su proteaz varyanti" terimi, bir proteaz varyanti, daha spesifik olarak bir parent proteazinin subtilisin varyantlarini ifade eder, burada B. /entus subtilisin GG36 proteazi, SEQ ID NO:2'ye ait amino asit dizisine sahiptir, burada söz konusu proteaz varyanti, daha spesifik olarak subtilisin varyantlari asagidaki karakteristiklerin bir veya daha fazlasina sahiptir: a) en az 1.1, en az 1.2, en az 1.3, en , 1.1 ila yaklasik 8, veya hatta 1.1 ila yaklasik 5 olan bir Test Yöntemi 2 performans yaklasik 5 olan bir Test Yöntemi 3 performans indeksi; 0) en az 1.0, en az 1.1, en az 8, veya hatta 1.0 ila yaklasik 5 olan bir Test Yöntemi 6 performans indeksi; ve/veya, e) bir Test Yöntemi 7 performans Indeksi. Test Yöntemi 2, Test Yöntemi 3, Test Yöntemi 4, Test Yöntemi 6, ve Test Yöntemi 7, "Test Yöntemleri" baslikli Örnek 1 bölümünde altta açik bir sekilde açiklanir. Ek olarak terimin bir parent proteazin varyantlarini kapsamani tasarlanir burada parent proteaz dizisi, SEQ ID NO:2'nin amino asit dizisine az %99, veya %100 özdestir. Mevcut bulusun bazi düzenlemelerinde parent proteaz (yani, "referans" veya KANNASE®, LIQUINASE®, LIQUINASE ULTRA®, SAVINASE ULTRA®, OVOZYME®, (Novozymes A/S tarafindan): MAXACAL®, PROPERASE®, PURAFECT®, FN3®, FN4® and PURAFECT OXP®, PURAFASTTM, PURAFECT® PRIME, PURAMAX® (Danisco US, Genencor Division) markalari ile satilan proteazlar ve Henkel/ Kemira'dan temin edilenler diger bir deyisle BLAP (asagidaki mutasyonlara S ve BLAP X (S3T + V4I + V de dahil ticari olarak temin edilebilir bir proteazdir. Burada kullanildigi üzere "varyant polipeptit" terimi, parent veya referans polipeptidin (bunlarla sinirli olmamak üzere dogal sus polipeptitler de dahil) amino asit dizisinden en az bir amino asit kalintisi bakimindan farklilik gösteren bir amino asit dizisini içeren polipeptide refere eder. Burada kullanildigi haliyle "BaCII/us cinsi", ilgili teknigin uzmanlarinca bilindigi üzere, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla B. subti/is, B. Ii'cheniformis, B. Ientus, B. brevis, B. stearothermophi'lus, B. alkalophilus, B. amy/oliquefaciens, B. clausii', B. halodurans, B. megateri'um, B. coagulans, B. Circulans, B. Iautus ve B. Thuringi'ensis de dahil olmak Üzere Bacillus cinsine ait tüm türleri kapsar. Baci'llus cinsinin taksonomik düzenlemesinin devam ettigi anlasilmalidir. Dolayisiyla bu cinsin, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, artik "Geobaci/lus stearothermophi'lus" olarak adlandirilan B. stearothermophilus gibi organizmalar da dahil olmak üzere yeniden siniflandirilan türleri kapsamasi amaçlanmaktadir. Oksijen varliginda dirençli endosporlarin üretimi Bacillus cinsinin belirleyici bir özelligi olarak düsünülür, ancak bu karakteristik son zamanlarda adlandirilan AIisi'k/obaci'llus, Amphi'bacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibaci//us, Fi/obaci'llus, Gracilibaci/Ius, Halobaci//us, PaenibaciI/us, Sa/ibaci/Ius, ThermobaciI/us, Ureibaci/Ius ve Virgibaci//us için de geçerlidir. Burada birbirlerinin yerine kullanilan "polinükleotit" ve "nükleik asit" terimleri, bir zincirde kovalent olarak bagli nükleotit monomerlerinin herhangi bir uzunluktaki bir polimerini ifade eder. Deoksiribonükleotitler içeren bir polinükleotit olan DNA (deoksiribonükleik asit) ve bir ribonükleotit polimeri olan RNA (ribonükleik asit), farkli biyolojik fonksiyonlara sahip polinükleotitlerin veya nükleik asitlerin örnekleridir. Polinükleotitler veya nükleik asitler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, tek, çift veya üç iplikli bir DNA, genomik DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA hibriti veya pürin ve pirimidin bazlarina ya da dogal, kimyasal olarak degistirilmis, biyokimyasal olarak degistirilmis, dogal olmayan veya türetilmis diger nükleotit bazlarina sahip bir polimeri kapsar. Polinükleotitlerin sinirlandirici olmayan örnekleri sunlardir: genler, gen fragmanlar, kromozomal fragmanlar, ifade edilmis dizi isareti (isaretleri) (EST (EST'Ier)), eksonlar, intronlar, mesajci RNA (mRNA), transfer RNA'si (tRNA), ribozomal RNA (rRNA), ribozimler, komplementer DNA (cDNA), rekombinant polinükleotitler, dallanmis polinükleotitler, plazmitler, vektörler, herhangi bir diziye sahip izole edilmis DNA, herhangi bir diziye sahip izole edilmis RNA, nükleik asit problari ve primerler. Bazi düzenlemelerde polinükleotitler, degistirilmis nükleotitler, örnegin metillenmis nükleotitler ve nükleotit analoglari, urasil, baska sekerler ve baglanti gruplari, örnegin flororiboz ve tioat ve nükleotit dallari içerir. Belirli bir düzenlemede, bir nükleotit dizisi, nükleotit harici bilesenler ile kesintiye ugrar. Burada kullanildigi üzere "mutasyon" terimi, baslangiç amino asit veya nükleik asit dizisinde yapilan degisikliklere refere eder. Bu terimin, sübstitüsyonlar, insersiyonlar ve delesyonlari kapsamasi amaçlanir. Burada kullanildigi haliyle "vektör" terimi, nükleik asidi (asitleri) veya polinükleotidi (polinükleotitleri) bir hedef hücrenin veya dokunun içine yerlestirmek veya aktarmak için kullanilan bir nükleik asit konstraktini veya polinükleotit konstraktini ifade eder. Bir vektör tipik olarak yabanci DNA'nin baska bir hücreye veya dokuya yerlestirilmesi için kullanilir. Bir vektör genel olarak bir transgen olan bir DNA dizisine ve vektörün olarak eklentinin hedef hücrede veya dokuda izole edilmesini, çogaltilmasini veya ifade edilmesini saglamak üzere genetik bilgiyi, örnegin yerlestirilen transgeni, bir hedef hücreye veya dokuya aktaracak sekilde islev görür. Vektörler plazmitler, klonlama vektörleri, bakteriyofajlar, virüsler (örnegin viral vektör), kozmitler, ifade vektörleri, mekik vektörleri, kasetler ve benzerlerini kapsar. Bir vektör tipik olarak bir replikasyon orijini, bir çoklu klonlama bölgesi ve bir seçilebilir belirteç içerir. Bir vektörü bir hedef hücreye yerlestirme islemi genelde transfeksiyon olarak adlandirilir. Bir hücrenin bir viral vektör ile transfeksiyonu genelde transdüksiyon olarak adlandirilir. Burada DNA dizisinin uygun bir konakçida ifade edilmesini saglayabilen uygun bir prodiziye (örnegin sekretuar, sinyal peptit dizisi vs.) operatif sekilde bagli bir varyant proteazi kodlayan bir DNA dizisine sahip bir vektör açiklanir. Burada kullanildigi haliyle, "ifade kaseti", "ifade plazmidi" veya "ifade vektörü" terimi, ilgili bir nükleik asidin (örnegin bir yabanci nükleik asidin veya transgenin) bir hedef hücrede ifadesi için rekombinant olarak veya sentetik olarak üretilen bir nükleik asit konstraktini veya vektörünü ifade eder. Ilgili nükleik asit tipik olarak ilgili bir proteini ifade eder. Bir ifade vektörü veya ifade kaseti tipik olarak yabanci nükleik asidin ifadesini kontrol eden veya destekleyen bir promotör nükleotit dizine sahiptir. Ifade vektörü veya kaseti ayrica tipik olarak belirli bir nükleik asidin bir hedef hücrede transkripsiyonunu saglayan diger belirli nükleik asit unsurlari içerir. Bir rekombinant ifade kaseti bir plazmitin, kromozomun, mitokondriyal DNA'nin, plastit DNA'nin, virüsün veya nükleik asit fragmaninin içine dahil edilebilir. Bazi ifade vektörleri, heterolog DNA fragmanlarini bir konakçi hücreye dahil etme ve burada ifade etme becerisine sahiptir. Birçok prokaryotik ve ökaryotik ifade vektörü piyasadan temin edilebilir. Uygun ifade vektörlerinin seçimi ilgili teknigin uzmanlarinin bilgisi dahilindedir. Bir proteinin ifade vektörüne dahil edilen bir nükleik asit dizisinden ifade edilmesine yönelik uygun ifade vektörlerinin seçimi ilgili teknigin uzmanlarinin bilgisi dahilindedir. Bir DNA konstrakti, bir hedef hücrenin veya dokunun içine yerlestirilebilecek yapay olarak üretilmis bir nükleik asit segmentidir. Bir DNA konstrakti tipik olarak bir vektöre alt klonlanmis ilgili bir proteini kodlayan bir nükleotit dizisine sahip bir DNA eklentisi içerir. Vektör, bakterilerde büyüme için bakteriyel direnç genlerine ve ilgili proteinin bir organizmada ifadesi için bir promotöre sahip olabilir. DNA in vitro olarak PCR veya ilgili teknigin uzmanlarinca bilinen uygun baska bir teknik (teknikler) ile üretilebilir. Bazi düzenlemelerde DNA konstrakti, ilgili bir nükleik asit dizisini içerir. Bazi düzenlemelerde dizi, kontrol unsurlari (örnegin promotörler vs.) gibi ilave unsurlara operatif sekilde baglanir. DNA konstrakti ilaveten bir seçilebilir belirteç içerebilir ve ilaveten homoloji kutulari ile çevrili bir gelen dizi içerebilir. Konstrakt, uçlara eklenmis homolog olmayan baska diziler (örnegin dolgu dizileri veya komsu diziler) içerebilir. Bazi düzenlemelerde dizinin uçlari, DNA konstraktinin kapali bir halka olusturmasini saglayacak sekilde kapatilir. Ilgili alanda iyi bilinen tekniklerle DNA konstraktina dahil edilen ilgili nükleik asit dizisi bir yabanil tip, mutant veya degistirilmis nükleik asit olabilir. Bazi düzenlemelerde DNA konstrakti, konakçi hücre kromozomu ile homolog olan bir veya daha fazla nükleik asit dizisi içerir. Diger düzenlemelerde DNA konstrakti, homolog olmayan bir veya daha fazla nükleotit dizisi içerir. DNA konstrakti in vitro olarak birlestirildiginde örnegin 1) heterolog dizilerin bir konakçi hücrede arzu edilen bir hedef diziye yerlestirilmesi ve/veya 2) konakçi hücre kromozomundaki bir bölgenin mutasyona ugratilmasi (yani bir endojen dizinin bir heterolog dizi ile ikame edilmesi): 3) hedef genlerin eksiltilmesi ve/veya 4) bir replikasyon plazmitinin konakçiya yerlestirilmesi için kullanilabilir. Burada "DNA konstrakti" ve "ifade kaseti" birbirlerinin yerine kullanilir. Burada kullanildigi haliyle, bir "plazmit", kromozomal DNA'dan bagimsiz olarak replikasyona ugrayabilen bir ekstrakromozomal DNA molekülünü ifade eder. Bir plazmit çift ipliklidir (ds) ve dairesel olabilir ve genelde bir klonlama vektörü olarak kullanilir. Burada bir nükleik asit dizisinin bir hücreye dahil edilmesi baglaminda kullanildigi haliyle, "dahil etmek" terimi, nükleik asit dizisinin hücrenin içine aktarilmasi için uygun herhangi bir yöntemi ifade eder. Dahil etme için kullanilan bu tip yöntemler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, protoplast füzyonu, transfeksiyon, transformasyon, elektroporasyon, konjügasyon ve transdüksiyonu kapsar (bkz. örnegin Ferrari vd., Transformasyon, bir hücrede genetik materyalin (örnegin DNA) alimindan, genomik katilimindan ve ifadesinden kaynaklanan genetik degisikligi ifade eder. Burada kullanildigi haliyle, bir nükleik asit, baska bir nükleik asit dizisi ile fonksiyonel bir iliski içerisinde bulundugu durumlarda bu nükleik asit dizisine "operatif sekilde baglidir". Örnegin bir promotör veya hizlandirici, bir nükleotit kodlayici dizinin transkripsiyonunu sagladigi sürece bu kodlayici diziye operatif sekilde baglidir. Bir ribozom baglanma bölgesi, bir kodlayici dizinin translasyonunu kolaylastiracak sekilde konumlandirildiginda bu kodlayici diziye operatif sekilde bagli olabilir. "Operatif sekilde bagli" DNA dizileri tipik olarak bitisiktir. Ancak hizlandiricilarin bitisik olmasi gerekmez. Baglanma, uygun restriksiyon bölgelerinde Iigasyon yoluyla gerçeklestirilir. Bu tip bölgelerin bulunmadigi durumlarda, konvansiyonel uygulamalar dogrultusunda sentetik oligonükleotit adaptörler veya baglantilar kullanilabilir. Burada kullanildigi haliyle "gen" terimi, bir polipeptidi kodlayan ve kodlayici bölgelerin önünde ve arkasinda bölgeler ve ayrica ayri kodlayici segmentlerin (eksonlar) arasinda ara diziler (intronlar) içeren bir polinükleotidi (örnegin bir DNA segmentini) ifade eder. Burada kullanildigi haliyle, bir hücre ile baglantili olarak kullanilan "rekombinant" terimi tipik olarak hücrenin bir heterolog nükleik asit dizisi dahil edilerek degistirildigini veya hücrenin bu sekilde degistirilen bir hücreden türetildigini ifade eder. Örnegin bir rekombinant hücre, hücrenin naif (rekombinant olmayan) formunda özdes formda bulunmayan bir gen içerebilir ya da bir rekombinant hücre, hücrenin naif formunda bulunan ve ancak degistirildikten sonra hücrenin içine yeniden yerlestirilen bir naif gen içerebilir. Bir rekombinant hücre, nükleik asit hücreden uzaklastirilmadan degistirilen hücreye endojen bir nükleik asit içerebilir; bu tip degisiklikler gen ikamesi, bölgeye özgü mutasyon ve alanin uzmanlarinca bilinen ilgili teknikler ile elde edilenleri kapsar. Rekombinant DNA teknolojisi, rekombinant DNA'nin in vitro olarak üretimine ve rekombinant DNA'nin bir rekombinant polipeptit olusturmak üzere ifade edilebilecegi veya çogaltilabilecegi hücrelere aktarilmasina yönelik teknikleri içerir. Polinükleotitler veya nükleik asitler ile birlikte kullanilan "rekombinasyon", "rekombine olmak" ve polinükleotit ipliginin veya fragmaninin yeni bir polinükleotit veya nükleik asit olusturmak üzere birlestirilmesini ifade eder. Rekombinant polinükleotit veya nükleik asit bazi durumlarda bir kimera olarak adlandirilir. Bir nükleik asit veya polipeptit, yapay veya genetik olarak degistirilmis oldugunda ya da yapay veya genetik olarak degistirilmis bir proteinden veya nükleik asitten türetildiginde "rekombinant" olarak nitelendirilir. Burada kullanildigi haliyle, nükleik asit veya gen "amplifikasyonu" terimi, spesifik DNA dizilerinin are orantisiz düzeyde replikasyona ugramasini ve böylece amplifikasyona ugrayan nükleik asidin veya genin baslangiçta genomda mevcut olandan daha yüksek bir kopya sayisinda bulunmasini saglayan bir süreci ifade eder. Bazi düzenlemelerde, hücrelerin bir ilaç (örnegin inhibe edilebilir bir enzimin bir inhibitörü) varliginda büyütülerek seleksiyona ugratilmasi, ilacin varliginda büyüme içine gerekli gen ürününü kodlayan endojen genin amplifikasyonuna ve/veya bu nükleik asidi veya gen ürününü veya her ikisini kodlayan ekzojen dizilerin (yani giris dizilerinin) amplifikasyonuna neden olur. durumudur. Spesifik olmayan sablon replikasyonunun (yani sablona bagimli olan ancak spesifik bir sablona bagimli olmayan replikasyon) tersidir. Sablon spesifisitesi burada replikasyonun dogrulugundan (yani dogru polinükleotit dizisinin sentezi) ve nükleotit (ribo- veya deoksirib0-) spesifisitesinden ayrilir. Sablon spesifisitesi siklikla "hedef" spesifisitesi cinsinden ifade edilir. Hedef diziler, diger nükleik asitlerden ayiklanmasi istenen "hedeflerdir". Amplifikasyon teknikleri öncelikli olarak bu ayiklama islemi için tasarlanmistir. Burada kullanildigi haliyle, "primer" teriminden kasit, bir saflastirilmis restriksiyon kesiminde oldugu gibi dogal yoldan meydana gelen ya da sentetik olarak üretilen, bir nükleik asit ipliginin komplementeri olan bir primer uzama ürününün sentezinin uyarildigi sartlar altinda (yani nükleotitlerin ve DNA polimeraz gibi bir uyarici ajanin varliginda ve uygun bir sicaklik ve pH seviyesinde) sentez baslangiç noktasi olarak islev görme kapasitesine sahip olan bir oligonükleotittir (nükleotit kalintilarinin bir polimeridir). Bir primer, maksimum amplifikasyon verimine yönelik olarak tercihen tek ipliklidir, ancak alternatif olarak çift iplikli de olabilir. Primer, çift iplikli olmasi halinde, uzama ürünlerini hazirlamak için kullanilmadan önce ipliklerini ayirmak için muamele edilir. Bazi düzenlemelerde primer, bir oligodeoksiribonükleotittir. Primer, uyarici ajanin varliginda uzama ürünlerinin sentezini uyarmak için yeterince uzun olmalidir. Bir primerin tam uzunlugu sicaklik, primer kaynagi ve yöntemin kullanim sekli de dahil olmak üzere çesitli faktörlere bagli olarak degisir. Burada kullanildigi haliyle "prob" terimi, bir saflastirilmis restriksiyon kesiminde oldugu gibi dogal yoldan meydana gelip gelmediginden ya da sentetik olarak, rekombinant olarak veya PCR amplifikasyonu ile üretilmis olup olmadigindan bagimsiz olarak genelde ilgili baska bir oligonükleotit ile hibritlesme kapasitesine sahip olan bir oligonükleotidi ifade eder. Bir prob tek iplikli veya çift iplikli olabilir. Problar, belirli gen dizilerinin tayini, belirlenmesi ve izolasyonunda faydalidir. Mevcut bulusta kullanilan herhangi bir probun, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla enzim tabanli (örnegin ELISA ve ayrica enzim tabanli histokimya analizleri), floresan, radyoaktif ve Iüminesan sistemler de dahil olmak üzere herhangi bir saptama sisteminde saptanabilmesini saglayan herhangi bir "raportör molekül" ile isaretlenmesi öngörülmektedir. Mevcut bulusun belirli herhangi bir saptama sistemi veya isareti ile sinirli olmamasi amaçlanir. Burada kullanildigi haliyle, polimeraz zincir reaksiyonu ile baglantili olarak kullanildiginda "hedef" terimi, polimeraz zincir reaksiyonu için kullanilan primerlerin baglandigi nükleik asit bölgesini ifade eder. Dolayisiyla "hedefin" diger nükleik asit dizilerinden ayiklanmasi amaçlanir. Bir nükleotit "segmenti", bir nükleik asidin, hedef nükleik asit dizisinin içinde kalan bir bölgesidir. Burada kullanildigi haliyle, "polimeraz zincir reaksiyonu" (PCR) terimi, U.S. Patent No. DNA karisiminda bir hedef dizinin bir segmentinin konsantrasyonunu klonlama veya saflastirma olmadan artirmaya yönelik yöntemleri içerir. Hedef dizinin amplifikasyonuna yönelik bu proses ilgili teknikte iyi bilinir. Burada kullanildigi haliyle, "amplifikasyon reaktifleri" terimi, primerler, nükleik asit sablonu ve amplifikasyon enzimi disinda amplifikasyon için gerekli olan reaktifleri (Örnegin deoksiribonükleotit trifosfatlar, tampon vs.) ifade eder. Amplifikasyon reaktifleri tipik olarak diger reaksiyon bilesenleri ile birlikte bir reaksiyon kabinin (test tüpü, mikrogöz vs.) içine yerlestirilir. Burada kullanildigi haliyle, "restriksiyon endonükleazi" veya "restriksiyon enzimi" terimi, çift iplikli veya tek iplikli DNA'yi at veya near restriksiyon bölgesi olarak bilinen spesifik bir nükleotit dizisinde veya bu dizinin yakininda kesime ugratabilen bir enzimi (örnegin bakteriyel enzim) ifade eder. Restriksiyon bölgesini içeren nükleotit dizisi belirli bir restriksiyon endonükleazi veya restriksiyon enzimi tarafindan taninir ve kesime ugratilir ve çogu kez DNA fragmanlarinin eklendigi bölgedir. Bir restriksiyon bölgesi, bir ifade vektörünün veya DNA konstraktinin içine yerlestirilebilir. dizilerine sahip bölgede iki DNA molekülü veya eslesmis kromozom arasinda paylasilmasini ifade eder. Bazi düzenlemelerde kromozomal entegrasyon, homolog rekombinasyondur. Bir nükleik asidin veya polinükleotidin, naif durumunda veya ilgili teknigin uzmanlarinca bilinen yöntemlerle manipüle edildiginde, bir polipeptidi veya bir fragmanini üretmek üzere transkripsiyona ve/veya translasyona ugrayabildigi durumlarda bu polipeptidi söylenir. Ilgili teknikte bilindigi üzere bir DNA dizisi, bir RNA dizisi üretmek üzere bir RNA polimeraz tarafindan transkripsiyona ugratilabilir, öte yandan bir RNA dizisi, bir DNA dizisi üretmek üzere ters transkriptaz tarafindan ters transkripsiyona ugratilabilir. uygun bir konakçiyi ifade eder. Ilgili DNA dizisi konakçi susta veya konakçi hücrede ilgili bir proteini ifade edebilir. Bir "protein" veya "polipeptit", amino asit kalintilarinin polimerik dizisini içerir. "Protein" ve "polipeptit" terimleri burada birbirinin yerine kullanilir. Bu tarifnamede Biyokimya Bilimsel Isimlendirme Müsterek Komisyonu (JCBN) ile uyumlu olarak tanimlanan amino asitlere yönelik tek ve 3 harfli kod kullanilir. Tek harf (X). yirmi amino asitten herhangi birine refere eder. Ayni zamanda bir polipeptidin, genetik kodun dejenerasyonu nedeniyle birden fazla nükleotid dizisi ile kodlanabildigi anlasilir. Mutasyonlar, parent amino aside yönelik tek harfli kod, akabinde gelen üç veya iki haneli pozisyon numarasi ve sonrasinda gelen varyant amino aside yönelik tek harfli kod ile isimlendirilir. Örnegin glisinin (G) 97. pozisyonda serin (8) olarak mutasyona ugratilmasi, "60878" veya i'G87S" olarak temsil edilir. Birçok mutasyon, mutasyonlar arasina eklenmesi ile kod "Z" kullanilir. Parent diziye göre bir insersiyon için tek harfli kod "Z", pozisyon numarasinin sol tarafindadir. Delesyon için tek harfli kod "Z", pozisyon numarasinin sag tarafindadir. Insersiyonlar için pozisyon numarasi, eklenen amino asitten(asitlerden) önceki pozisyon numarasi arti her amino asit için 0.01"dir. Örnegin 87 ve 88 pozisyonlari arasina alanin (A), serin (S) ve tirozin (Y) olmak üzere üç amino yukaridaki tüm mutasyonlarin ve 100. pozisyondaki delesyonun kombinasyonu Bir "prodizi" veya "propeptit dizisi", proteazin sekresyonu için gerekli olan sinyal peptit Prodizinin veya propeptit dizisinin kesimi, olgun bir aktif proteaz ile sonuçlanir. sekresyonuna veya dogrudan tasinimina katilabilen bir amino asit kalinti dizisini ifade eder. Sinyal dizisi tipik olarak öncül veya olgun protein dizisinin N terminal kisminda yer alir. Sinyal dizisi endojen veya ekzojen olabilir. Bir temsili ekzojen sinyal dizisi, Bacillus subtilis kökenli subtilisin sinyal dizisinin ilk yedi amino asit kalintisini, Bacillus /entus (ATCC 21536) kökenli subtilisin sinyal dizisinin geriye kalanina kaynasik halde içerir. Normalde olgun proteinde bir sinyal dizisi mevcut degildir. Bir sinyal dizisi tipik olarak protein tasindiktan sonra bir sinyal peptidazi tarafindan proteinden kesilir. edilecek genin sinyal dizisine kaynastirilmis olan sinyal dizilerini ifade eder. Bazi düzenlemelerde sentetik diziler kullanilir. Bir proteinin, polipeptidin veya peptidin i'olgun" formu, proteinin, polipeptidin veya peptidin sinyal peptit dizisini ve propeptit dizini içermeyen fonksiyonel formunu ifade Bir proteinin veya peptidin "öncül" formu, proteinin amino veya karbonil terminusuna operatif sekilde bagli bir prodiziye sahip bir olgun formunu ifade eder. Öncül ayrica prodizinin amino terminusuna operatif sekilde bagli bir "sinyal" dizisine sahip olabilir. Öncül ayrica post-translasyonel aktiviteye dahil olan ilave polinükleotitlere (örnegin bir proteinin veya peptidin olgun formunu birakmak üzere kesilen polinükleotitlere) sahip olabilir. Bir amino asit dizisi veya nükleik asit dizisi ile baglantili olarak kullanilan "yabanil tip" terimi, amino asit dizisinin veya nükleik asit dizisinin naif veya dogal yoldan meydana gelen bir dizi oldugunu Ifade eder. Burada kullanildigi haliyle "dogal yoldan meydana gelen" terimi, dogada bulunan (yani, rekombinant yöntemler ile manipüle edilmemis olan) herhangi bir seye (örnegin proteinler, amino asitler veya nükleik asit dizileri) Burada kullanildigi üzere "dogal yoldan meydana gelmeyen" terimi, dogada bulunmayan herhangi bir seye (örnegin laboratuvarda üretilen rekombinant nükleik asitler) refere eder. Burada amino asit kalinti pozisyonlari ile baglantili olarak kullanildigi haliyle, "karsilik gelen" veya "karsilik gelir" veya "karsilik gelmek" terimi, bir proteinde veya peptitte numaralandirilan pozisyonda yer alan bir amino asit kalintisini ya da bir proteinde veya peptitte numaralandirilmis bir kalinti ile analog, homolog veya esdeger bir amino asit kalintisini ifade eder. Burada kullanildigi haliyle, "karsilik gelen bölge" genel olarak ilgili proteinler veya bir referans protein boyunca bir analog pozisyonu ifade eder. üretilen veya üretilebilen bir proteazin yani sira, bu sustan izole edilen bir DNA dizisi proteazi da ifade eder. Terim ilaveten sentetik ve/veya cDNA kökenli bir DNA dizisi tarafindan kodlanan ve ilgili proteazin belirleyici karakteristiklerine sahip olan bir proteazi ifade eder. Örnek olarak, "Bacillus kökenli proteazlar", Baci'llus tarafindan dogal olarak üretilen proteolitik aktiviteye sahip enzimleri ve ayrica Bacillus kaynaklari tarafindan üretilenlere benzeyen ve ancak genetik mühendislik teknikleri araciligiyla serin proteazlari kodlayan bir nükleik asit ile transformasyona ugratilmis Bacillus harici organizmalar tarafindan üretilen serin proteazlari ifade eder. Iki nükleik asit veya polipeptit dizisi baglaminda "özdes" terimi, asagidaki dizi karsilastirma veya analiz algoritmalarindan biri ile ölçüldügü üzere maksimum benzerlik için hizalandiginda iki dizide ayni olan kalintilari ifade eder. Burada kullanildigi haliyle "homolog genler", farkli, ancak genel olarak alakali türlerden elde edilen ve birbirlerine karsilik gelen ve birbirleriyle özdes veya çok benzer olan bir çift geni ifade eder. Terim, türlesme (yani yeni türlerin gelisimi) sonucunda ayrilan genleri (örnegin ortolog genleri) ve ayrica genetik duplikasyon sonucunda ayrilan genleri (örnegin paralog genler) kapsar. Burada kullanildigi haliyle "homoloji", dizi benzerligini veya özdesligini ifade eder, burada özdeslik tercih edilir. Homoloji, ilgili alanda bilinen standart tekniklerle belirlenebilir (bkz. örnegin Smith ve Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); Needleman ve Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970); Pearson ve Lipman, Proc. Natl. BESTFIT, FASTA ve TFASTA gibi yazilim programlari (Genetics Computer Grup, algoritma örnegi PILEUP'dir. PILEUP, progresif ikili hizalamalardan faydalanarak bir ilgili diziler grubundan çoklu dizi hizalamasi üretir. Ayrica, hizalamayi üretmek için kullanilan kümelenme iliskilerini gösteren bir agaç grafigi de olusturabilir. PILEUP; bildirilen progresif hizalama yönteminin sadelestirilmis halini kullanir. Yöntem, Higgins ve Sharp tarafindan tarif edilen yönteme benzer (Bakiniz Higgins ve Sharp, CABIOS 0.10'luk bir varsayilan bosluk uzunluk agirligi ve agirliklandirilmis uç bosluklari kapsar. Baska bir faydali algoritma örnegi, Altschul vd. tarafindan tarif edilen BLAST programidir. WU-BLAST-2, birçogu varsayilan degerlere ayarli olan birtakim tarama parametreleri kullanir. Ayarlanabilir parametrelere su degerler verilir: örtüsme araligi = 1, örtüsme kesri = 0.125, sözcük esigi (T) = 11. HSP S ve HSP 82 parametreleri dinamik degerlerdir ve belirli dizinin bilesimine ve ilgili dizinin taratildigi spesifik veritabaninin bilesimine bagli olarak programin kendisi tarafindan belirlenir. Ancak degerler hassasiyeti artiracak sekilde ayarlanabilir. Bir referans dizi ile ilgili bir test dizisi arasindaki dizi özdeslik yüzdesi ilgili teknigin uzmanlarinca kolayca belirlenebilir. Polinükleotit veya polipeptit dizileri arasindaki özdeslik yüzdesi, dizi bilgisinin moleküller arasinda dizileri hizalayarak dogrudan karsilastirilmasi ve özdesligin ilgili teknikte bilinen yöntemlerle saptanmasi yoluyla belirlenebilir. Dizi benzerliginin belirlenmesi için uygun bir algoritma örnegi BLAST gerçeklestirmeye yönelik yazilimlar, National Center for Biotechnology information üzerinden kamuya açilmistir. Bu algoritma, ilk olarak, yüksek skor veren dizi çiftlerinin (HSP'Ier), sorgu dizisinde bulunan W uzunlugundaki kisa sözcüklerin belirlenmesi yoluyla tespit edilmesini içerir, bu sözcükler ise, bir veritabani dizisinde ayni uzunluktaki bir sözcük ile hizalandigi zaman bir pozitif degerli esik skoru (T) ile eslesir veya bir dereceye kadar uyum gösterir. Bu ilk komsu sözcük eslesmeleri, bunlari kapsayan daha uzun HSP'leri bulmak için baslangiç noktasi olarak islev görür. Sözcük eslesmeleri, karsilastirilan iki sekansin her biri boyunca her iki yönde kümülatif hizalama skorunun yükseltilebilecegi kadar genisletilir. Sözcük eslesmelerinin uzatilmasi, kümülatif hizalanma skoru elde edilen maksimum degere göre X miktari kadar düstügünde; kümülatif skor sifira veya altina düstügünde ya da sekanslardan herhangi birinin ucuna ulasildiginda durdurulur. W, T ve X ile gösterilen BLAST algoritma parametreleri hizalamanin hassasiyetini ve hizini belirler. BLAST programinda varsayilan olarak sözcük uzunlugu (W) = 11, BLOSUM62 skorlama matrisi hizalamalari (B) = 50 (bakiniz Henikoff ve Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA kullanilir. BLAST algoritmasi akabinde iki dizi arasindaki benzerligin istatistiksel analizini yapar (Bakiniz, örnegin Karlin ve Altschul, yukarida yer almaktadir). BLAST algoritmasi ile saglanan bir benzerlik ölçütü, iki nükleotit veya amino asit sekansi arasindaki bir eslesmenin sans eseri meydana gelme olasiligini gösteren en düsük toplam olasiligidir (P(N)). Örnegin bir nükleik asidin, test nükleik asidi ile bulus konusu bir serin proteaz nükleik asidi arasindaki karsilastirmada en düsük toplam olasiligi yaklasik 0.1'den düsük, daha çok tercih edildigi haliyle yaklasik 0.01'den düsük ve en çok tercih edildigi haliyle yaklasik 0.001'den düsük ise, bir serin proteaz nükleik asidine benzer oldugu kabul edilir. Test nükleik asidi bir serin proteaz polipeptidini kodladiginda, karsilastirmanin yaklasik 0.5'ten ve daha çok tercih edildigi haliyle yaklasik 0.2'den düsük bir en küçük toplam olasiligi ile sonuçlanmasi halinde belirli bir serin proteaz nükleik asidine benzer oldugu kabul edilir. Iki veya daha fazla nükleik asit veya polipeptit dizisi baglaminda kullanilan "özdes" veya "özdeslik" yüzdesi, bir dizi karsilastirma algoritmasi kullanilarak veya gözle incelenerek belirlendigi üzere, maksimum benzerlik için karsilastirildigi veya hizalandigi zaman ayni olan ya da sirasiyla ayni nükleik asit kalintilarinin veya amino asit kalintilarinin belirlenmis bir yüzdesini sergileyen iki veya daha fazla sekansi ifade eder. Bir hedef amino asit dizisi ile bir referans (yani sorgu) amino asit dizisi arasindaki veya "amino asit dizisi özdeslik yüzdesi (%)", hedef amino asit dizisinin, diziler optimal düzeyde hizalandiginda bir karsilastirma uzunlugu boyunca sorgu amino asit dizisi ile belirli bir yüzde oraninda (yani amino asit bazinda) özdes oldugu anlamina gelir. Dolayisiyla, iki amino asit dizisi baglaminda %80 oraninda amino asit dizisi özdesligi veya %80 oraninda özdeslik, optimal düzeyde hizalanmis iki amino asit dizisinde amino asit kalintilarinin %80'inin özdes oldugu anlamina gelir. Bir hedef nükleik asit dizisi ile bir referans (yani sorgu) nükleik asit dizisi arasindaki "dizi özdeslik yüzdesi" veya "özdeslik yüzdesi (%)" veya "dizi özdeslik yüzdesi (%)" veya düzeyde hizalandiginda bir karsilastirma uzunlugu boyunca sorgu dizisi ile belirli bir yüzde oraninda (yani nükleotit bazinda) özdes oldugu anlamina gelir. Dolayisiyla, iki nükleik asit dizisi baglaminda %80 oraninda nükleotit dizisi özdesligi veya %80 oraninda özdeslik, optimal düzeyde hizalanmis iki nükleik asit dizisinde nükleotit kalintilarinin %80'inin özdes Oldugu anlamina gelir. Bazi düzenlemelerde, bir hedef dizi ile bir sorgu dizisi arasindaki "dizi özdeslik yüzdesi" veya "dizi özdeslik %'si" veya "özdeslik %'si", iki dizinin optimal düzeyde hizalanmasi ve optimal düzeyde hizalanmis iki dizinin karsilastirma uzunlugu boyunca karsilastirilmasi yoluyla hesaplanabilir. Optimal hizalamada her iki dizide de özdes kalintilarin gözlemlendigi pozisyonlarin sayisi belirlenir ve böylece eslesen pozisyonlarin sayisi elde edilir, akabinde eslesen pozisyonlarin sayisi, karsilastirma uzunlugundaki (aksi belirtilmedikçe, sorgu dizinin uzunlugudur) pozisyonlarin toplam sayisina bölünür. Elde edilen sayi, hedef dizi ile sorgu dizisi arasindaki dizi özdeslik yüzdesini vermek üzere 100 ile çarpilir. yüksek özdeslik yüzdesi skorunu verecek sekilde hizalanmasini ifade eder. Örnegin iki protein dizisi arasinda optimal hizalama, dizilerin, her bir dizide maksimum sayida özdes amino asit kalintisinin hizalanmasini saglayacak sekilde manüel olarak hizalanmasi ya da burada tarif edilen veya ilgili teknikte bilinen yazilim programlarinin veya prosedürlerin kullanilmasi suretiyle basarilabilir. Iki nükleik asit dizisi arasinda optimal hizalama, dizilerin, her bir dizide maksimum sayida özdes nükleotit kalintisinin hizalanmasini saglayacak sekilde manüel olarak hizalanmasi ya da burada tarif edilen veya ilgili teknikte bilinen yazilim programlarinin veya prosedürlerin kullanilmasi suretiyle basarilabilir. Bazi düzenlemelerde, iki polipeptit dizisi için olasi en yüksek benzerlik skorunu elde etmek üzere tanimli parametreler, örnegin belirli bir amino asit sübstitüsyon matrisi, bosluk ceza puani (bosluk açma ceza puani olarak da anilir) ve bosluk uzatma ceza puani ile hizalandiklarinda bu dizi çifti "optimal düzeyde hizalanmis" sayilir. Polipeptit dizisi hizalama algoritmalarinda (örnegin BLASTP) varsayilan skorlama sübstitüsyon matrisi olarak çogu kez BLOSUM62 skorlama matrisi kullanilir (Bakiniz Henikoff ve Henikoff, yukarida yer almaktadir). Bosluk açma ceza puani, hizali dizilerden birine tek bir amino asit boslugunun yerlestirilmesi için gereklidir, bosluk uzatma ceza puani ise bosluktaki her bir kalinti pozisyonu için gereklidir. Kullanilan örnek hizalama parametreleri sunlaridir: BLOSUM62 skorlama matrisi, bosluk açma ceza puani = 11 ve bosluk uzatma ceza puani = 1. Hizalama skoru, her bir dizide hizalamanin basladigi ve bittigi amino asit pozisyonlari (örnegin hizalama penceresi) ve istege bagli olarak olasi en yüksek benzerlik skorunu elde etmek üzere dizilerden birine veya ikisine bir boslugun veya çok sayida boslugun yerlestirilmesi ile tanimlanir. Iki veya daha fazla dizi arasindaki optimal hizalama, görsel inceleme yoluyla manüel olarak ya da bir bilgisayar yardimiyla, örnegin bunlarla sinirli olmamak kaydiyla amino asit dizileri için BLASTP programi ve nükleik asit dizileri için BLASTN programi ile bkz. ayrica National Center for Biotechnology Information (NCBI) website). Ilgili bir polipeptidin, bir referans polipeptidin amino asit dizisi ile en az yaklasik %70, en yaklasik %99 veya en az yaklasik %995 oraninda dizi özdesligi sergileyen bir amino asit dizisine sahip oldugu durumlarda ilgili polipeptidin referans polipeptit ile "büyük ölçüde özdes" oldugu söylenebilir. Bu tip iki polipeptit arasindaki özdeslik yüzdesi, optimal düzeyde hizalanmis iki polipeptit dizisinin incelenmesi suretiyle manüel olarak ya da standart parametrelerin kullanildigi yazilim programlari veya algoritmalari (örnegin BLAST, ALIGN, CLUSTAL) ile belirlenebilir. Iki polipeptidin büyük ölçüde özdes oldugunun bir göstergesi, birinci polipeptidin immünolojik olarak ikinci polipeptit ile çapraz reaksiyona girmesidir. Tipik olarak, konzervatif amino asit sübstitüsyonlari bakimindan farkli olan polipeptitler immünolojik olarak çapraz reaksiyona girer. Dolayisiyla bir polipeptit ile ikinci bir polipeptit, örnegin iki peptidin sadece bir konzervatif amino asit sübstitüsyonu veya bir veya daha fazla konzervatif amino asit sübstitüsyonu bakimindan farkli oldugu durumlarda büyük ölçüde özdestir. Ilgili bir nükleik asidin, bir referans nükleik asidin nükleotit dizisi ile en az yaklasik %70, yaklasik %99 veya en az yaklasik %995 oraninda dizi özdesligi sergileyen bir nükleotit dizisine sahip oldugu durumlarda ilgili nükleik asidin referans nükleik asit ile "büyük ölçüde özdes" oldugu söylenebilir. Bu tip iki nükleik asit arasindaki özdeslik yüzdesi, optimal düzeyde hizalanmis iki nükleik asit dizisinin incelenmesi suretiyle manüel olarak ya da standart parametrelerin kullanildigi yazilim programlari veya algoritmalari (örnegin BLAST, ALlGN, CLUSTAL) ile belirlenebilir. Iki nükleik asit dizisinin büyük ölçüde özdes oldugunun bir göstergesi, iki nükleik asit molekülünün kesinlik kosullari altinda (örnegin orta ila yüksek kesinlik araliginda) hibritlesmesidir. Bir nükleik asit veya polinükleotit, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla örnegin diger proteinler, nükleik asitler, hücreler ve benzerleri de dahil diger bilesenlerden kismen veya tamamen ayrildigi durumlarda "izole edilmis" sayilir. Benzer bir sekilde, bir polipeptit, protein veya peptit, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla örnegin diger proteinler, nükleik asitler, hücreler ve benzerleri de dahil diger bilesenlerden kismen veya tamamen ayrildiginda "izole edilmis" sayilir. Mol esasinda, izole edilmis bir tür bir bilesimde diger türlerden daha bol miktarda bulunur. Örnegin izole edilmis bir tür, mevcut tüm makromoleküler türlerin en az yaklasik %50 yaklasik %70, yaklasik %80, düzeyine kadar saflastirilir (yani bilesimde kirletici türler konvansiyonel saptama yöntemleriyle saptanamaz). Saflik ve homojenlik, ilgili alanda iyi bilinen birtakim tekniklerle, örnegin bir protein veya nükleik asit numunesinin agaroz veya poliakrilamid jel elektroforezine tabi tutulmasi ve akabinde boyama ile görüntülenmesi yoluyla belirlenebilir. Arzu edildigi takdirde, materyalin saflastirilmasi için yüksek ayristirma kapasiteli bir teknik, örnegin yüksek performansli sivi kromatografisi (HPLC) veya benzer bir yöntem kullanilabilir. Nükleik asitler veya polipeptitler için geçerli olan "saflastirilmis" terimi genel olarak ilgili alanda iyi bilinen analiz teknikleri ile belirlendigi üzere diger bilesenlerden büyük ölçüde arindirilmis olan bir nükleik asidi veya polipeptidi ifade eder (örnegin bir saflastirilmis polipeptit veya polinükleotit, bir elektroforetik jelde, kromatografik ayristirma ürününde ve/veya yogunluk asamali santrifüje tabi tutulan bir ortamda ayri bir bant/katman olusturur). Örnegin bir elektroforetik jelde esasen tek bir bant veren bir nükleik asit veya polipeptit "saflastirilmis" sayilir. Bir saflastirilmis nükleik asit veya polipeptit, en az yaklasik %50 oraninda ve genellikle en az yaklasik %75, yaklasik %80, yaklasik %85, mol esasinda agirlikça yüzde cinsinden). Iliskili bir anlamda ayrica bulusa ait bir veya daha fazla polipeptit veya polinükleotid gibi bulusa ait bir veya daha fazla moleküle yönelik bilesimlerin zenginlestirilme yöntemleri açiklanir. Bir bilesim, bir saflastirma veya zenginlestirme tekniginin uygulanmasindan sonra molekül konsantrasyonunda önemli bir artis oldugunda bir molekül için zenginlestirilir. Bulusun büyük ölçüde saf bir polipeptidi veya polinükleotidi (örnegin bulusun bir varyant proteazini kodlayan büyük ölçüde saf varyant proteaz veya polinükleotit) tipik olarak belirli bir bilesimde tüm makromoleküler türleri agirlikça (mol esasinda) en az yaklasik %55, yaklasik %60, yaklasik %99, yaklasik %995 veya daha yüksek oranda içerecektir. Iliskili bir anlamda ayrica bulusa ait bir veya daha fazla polipeptit (örnegin bulusa ait bir veya daha fazla varyant proteaz) veya bulusa ait bir veya daha fazla nükleik asit (örnegin bulusa ait bir veya daha fazla varyant proteazi kodlayan bir veya daha fazla nükleik asit) gibi bulusa ait bir veya daha fazla moleküle yönelik bilesimlerin zenginlestirilmesi yöntemleri açiklanir. Bir bilesim, bir saflastirma veya zenginlestirme tekniginin uygulanmasindan sonra molekül konsantrasyonunda önemli bir artis oldugunda bir molekül için zenginlestirilir. Büyük ölçüde saf bir polipeptit veya polinükleotid tipik olarak belirli bir bilesimde agirlikça en az yaklasik %55, yaklasik Burada kullanildigi haliyle, "kombinatoryal mutagenez", bir referans nükleik asit dizisinin nükleik asit varyantlarinin kütüphanelerinin üretildigi yöntemleri ifade eder. Bu kütüphanelerde varyantlar, önceden belirlenmis bir mutasyonlar kümesinden seçilen bir veya birkaç mutasyon içerir. Yöntemler ayrica önceden belirlenmis mutasyonlar kümesinin bir elemani olmayan rastgele mutasyonlarin dahil edilmesine yönelik yollar saglar. Bu yöntemlerin bazilari, U.S. Patent No. 6,582,914'te belirtilen yöntemleri kapsar. Bu tip bazi kombinatoryal mutagenez yöntemleri, piyasadan temin edilebilen kitlerde (örnegin QUIKCHANGE® Çoklu Bölgeye Yönlendirilmis Mutagenez Kiti (Stratagene), PCR füzyonu/uzatma PCR'si) yapilandirilan yöntemleri içerir ve/veya Burada kullanildigi haliyle, bir varyant proteaz ile baglantili olarak kullanilan tip veya dogal yoldan meydana gelen proteaza) kiyasla iyilestirilmis veya artirilmis yikama veya temizleme performansina ve/veya istege bagli olarak yikama veya temizleme performansinin korunmasi kaydiyla iyilestirilmis veya artirilmis stabiliteye sahip bir varyant proteazi ifade eder. Bir varyant proteazin iyilestirilmis özellikleri, iyilestirilmis yikama veya temizleme performansini ve/veya iyilestirilmis stabiliteyi kapsayabilir. Bulus, istem 1'de tanimlandigi üzere artmis yikama performansi sergileyen varyant proteazlarini saglar. Burada kullanildigi haliyle, "fonksiyonel analiz" terimi, bir proteinin aktivitesini gösteren bir analizi ifade eder. Bazi düzenlemelerde terirn, bir proteinin mutat kapasitesinde islev görme becerisi için analiz edildigi analiz sistemlerini ifade eder. Örnegin, enzimler söz konusu oldugunda bir fonksiyonel analiz, enzimin bir reaksiyonu katalizleme etkinligini belirlemeyi içerir. Burada kullanildigi haliyle "hedef özellik", degistirilecek olan baslangiç geninin özelligini ifade eder. Mevcut bulusun belirli herhangi bir hedef özellik ile sinirli olmamasi amaçlanir. Ancak bazi düzenlemelerde hedef özellik bir gen ürününün stabilitesidir (örnegin denatürasyona, proteolize veya diger yikici faktörlere karsi direncidir), baska düzenlemelerde ise bir üretim konakçisinda üretim düzeyi degistirilir. Bir nükleik asit baglaminda "özellik" terimi veya bu terimin dilbilgisel esdegerleri, burada kullanildigi haliyle, bir nükleik asidin seçilebilen veya saptanabilen herhangi bir karakteristigini veya özelligini ifade eder. Bu özellikler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, bir polipeptide baglanmayi saglayan bir özellik, belirli bir nükleik asidi içeren bir hücrenin kazandigi bir özellik, gen transkripsiyonunu saglayan bir özellik (örnegin promotör gücü, promotör tanima, promotör regülasyonu, hizlandirici fonksiyonu), RNA islemlerini gerçeklestiren bir özellik (örnegin RNA splaysi, RNA stabilitesi, RNA konformasyonu ve post-transkripsiyonel modifikasyon), translasyonu saglayan bir özelligi (örnegin mRNA düzeyi, mRNA regülasyonu, mRNA'nin ribozomal proteinlere baglanmasi, post-translasyonel modifikasyon) kapsar. Örnegin bir nükleik asitte bir transkripsiyon faktörü, polimeraz, regülatör faktör ve benzerlerine yönelik bir baglanma bölgesi, arzu edilen karakteristikleri elde etmek veya istenmeyen karakteristikleri belirlemek için degistirilebilir. Bir polipeptit (proteinler dahil) baglaminda "özellik" terimi veya bu terimin dilbilgisel esdegerleri, burada kullanildigi haliyle, bir polipeptidin seçilebilen veya saptanabilen herhangi bir karakteristigini veya özelligini ifade eder. Bu özellikler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla oksidatif stabilite, substrat spesifisitesi, katalitik aktivite, enzimatik aktivite, termal stabilite, alkali stabilitesi, pH aktivite profili, proteolitik yikima karsi direnç, KM, kcat, kcat/kM orani, protein katlanmasi, bir immün yaniti uyarma, bir Iiganda baglanma becerisi, bir reseptöre baglanma becerisi, salgilanma becerisi, bir hücrenin yüzeyinde sunulma becerisi, oligomerlesme becerisi, sinyal iletme becerisi, hücre proliferasyonunu uyarma becerisi, hücre proliferasyonunu inhibe etme becerisi, apoptozu uyarma becerisi, fosforilasyon veya glikosilasyon ile degisme becerisi ve/veya hastaligi tedavi etmek becerisi ve benzerlerini kapsar. Burada kullanildigi haliyle "tarama" terimi ilgili alandaki mutat anlamina sahiptir. Örnek bir tarama prosesinde, bir mutant nükleik asit veya bundan kodlanan varyant polipeptit saglanir ve sirasiyla mutant nükleik asidin veya varyant polipeptidin bir özelligi degerlendirilir veya belirlenir. Mutant nükleik asidin veya varyant polipeptidin belirlenen özelligi, sirasiyla karsilik gelen öncül (ana) nükleik asidin bir özelligi ya da karsilik gelen ana polipeptidin özelligi ile karsilastirilabilir. Degistirilmis bir özellige sahip bir nükleik asidin veya proteinin elde edilmesine yönelik tarama prosedürünün, mutant nükleik asidin üretiminin modifikasyonunu kolaylastirmasi amaçlanan baslangiç materyalinin özelligine bagli oldugu ilgili teknigin uzmanlarina asikar gelecektir. Belirli herhangi bir özellige yönelik tarama yöntemleri ilgili teknikte genel olarak tarif edilmektedir. Örnegin baglanma, pH, spesifisite ve benzerleri mutasyondan önce ve sonra ölçülebilir, burada bir degisim, degisiklige isaret eder. Taramalar tercihen yüksek verimli bir sekilde gerçeklestirilir ve bunlarla sinirli olmamak kaydiyla çipler, faj sunumu ve çoklu substratlar ve/veya belirteçlerin kullanildigi analizler de dahil olmak üzere çok sayida numunenin eszamanli olarak ta ran masin I kapsa r. Burada kullanildigi haliyle bir tarama prosesi, ilgili varyantlarin bir varyant popülasyonundan zenginlestirildigi bir veya daha fazla seleksiyon adimini kapsar. Bu tarifnamenin örnekleri, konakçi organizmaya bir büyüme avantaji kazandiran varyantlarin seleksiyonunu ve ayrica faj sunumunu ya da herhangi bir diger sunum yöntemini içerir, burada varyantlar bir varyant popülasyonundan baglanma veya katalitik özelliklerine göre yakalanabilir. Burada açiklandigi üzere, bir varyant kütüphanesi strese (örnegin isi. denatürasyon ve benzeri) maruz birakilir ve akabinde hala saglam olan varyantlar bir taramada belirlenir veya seleksiyon yöntemiyle zenginlestirilir. Terimin uygun herhangi bir seleksiyon yöntemini kapsamasi amaçlanir. Aslinda mevcut bulusun belirli herhangi bir tarama yöntemi ile sinirli olmamasi amaçlanmaktadir. Burada birbirlerinin yerine kullanilan "degistirilmis nükleik asit dizisi" ve "degistirilmis gen" terimleri, dogal yoldan meydana gelen (yani yabanil tip) nükleik asit dizisinde bir açiklandigi üzere, degistirilmis nükleik asit dizisinin ifade ürünü, bir budanmis proteindir (örnegin degisikligin dizide bir eksilme veya kesinti oldugu durumlarda). Burada açiklandigi üzere budanmis protein biyolojik aktivitesini korur. Burada açiklandigi üzere, degistirilmis nükleik asit dizisinin ifade ürünü bir uzamis proteindir (örnegin nükleik asit dizisine bir ekleme içeren degisiklikler). Burada açiklandigi üzere, nükleik asit dizisine bir nükleotit eklenmesi bir budanmis protein ile sonuçlanir (örnegin ekleme bir durdurma kodonunun olusmasina yol açtiginda). Dolayisiyla bir ekleme. ifade ürünü olarak bir budanmis protein veya bir uzamis protein ile sonuçlanabilir. Bir "mutant" nükleik asit dizisi tipik olarak bir konakçi hücrenin yabanil tip dizisinde en az bir kodonda bir degisiklik içeren bir nükleik asit dizisini ifade eder, burada mutant nükleik asit dizisinin ifade ürünü, yabanil tip proteine kiyasla degistirilmis bir amino asit dizisine sahip bir proteindir. Ifade ürünü degistirilmis bir fonksiyonel kapasiteye (örnegin artmis enzimatik aktiviteye) sahip olabilir. Burada kullanildigi haliyle, "substrat spesifisitesinde degisiklik" ifadesi, bir enzimin substrat spesifisitesindeki degisimleri ifade eder. Burada açiklandigi üzere, substrat spesifisitesinde bir degisim, enzim mutasyonlarindan veya reaksiyon kosullarinin degismesinden kaynaklandigi üzere belirli bir substrata yönelik kcat ve/veya Km degerlerinde bir degisim olarak tanimlanir. Bir enzimin substrat spesifisitesi, farkli substratlar ile sergiledigi katalitik etkinliklerin karsilastirilmasi yoluyla saptanir. Bu saptamalar özellikle mutant enzimlerin etkinligi degerlendirilirken kullanilir, çünkü genel olarak ilgili substratlar için daha yüksek kom/Krn oranlari sergileyen varyant enzimlerin üretilmesi arzu edilir. Ancak mevcut bulusun belirli herhangi bir substrat bilesimi veya substrat spesifisitesi ile sinirli olmamasi amaçlanir. Burada kullanildigi haliyle "yüzey özelligi", elektrostatik yük ve ayrica bir proteinin yüzeyinde gözlemlenen hidrofobiklik ve hidrofiliklik gibi özellikler ile baglantili olarak kullanilir. Burada kullanildigi üzere "net yük" terimi, bir molekülde bulunan tüm yüklerin toplami olarak tanimlanir. "Net yük degisimleri", parent protein molekülünde parent molekülünkinden farki olan net yüke sahip (yani varyant, parent molekülünki ile ayni olmayan net yüke sahiptir) bir varyanti saglamak amaciyla yapilir. Örnegin nötral bir amino asidin negatif yüklü amino asit ile veya pozitif yüklü amino asidin nötral amino asit ile sübstitüsyonu, parent moleküle göre -1 olan net yük ile sonuçlanir. Pozitif yüklü bir amino asidin negatif yüklü amino asit ile sübstitüsyonu, parent moleküle göre -2 olan net yük ile sonuçlanir. Nötral amino asidin pozitif yüklü amino asit ile veya negatif yüklü amino asidin nötral amino asit ile sübstitüsyonu, parent moleküle göre +1 olan net yük ile sonuçlanir. Negatif yüklü amino asidin pozitif yüklü amino asit ile sübstitüsyonu, parent moleküle göre +2 olan net yük ile sonuçlanir. Parent proteinin net yükü ayni zamanda, yüklü amino asitlerin delesyonu ve/veya insersiyonu ile degistirilebilir. proteolitik, hidrolitik, temizleyici veya baska tip prosesler, degistirilmis sicakliklara maruziyet esnasinda geçerli kosullar altinda belirli bir süre boyunca belirli sicakliklara maruz kaldiktan sonra enzimatik aktivitenin belirli bir miktarini koruyan proteazlari ifade eder. "Degistirilmis sicakliklar", yüksek veya düsük sicakliklari kapsar. Bazi düzenlemelerde proteazlar, belirli bir süre boyunca, örnegin en az yaklasik 60 dakika, boyunca degistirilmis sicakliklara maruz kaldiktan sonra proteolitik aktivitenin en az veya yaklasik %99'unu korur. Bir yükseltgen, selatlayici, termal ve/veya pH stabil proteaz baglaminda "artmis stabilite", diger proteazlara (örnegin subtilisin proteazlar) ve/veya yabanil tip enzimlere kiyasla proteolitik aktivitenin zaman içerisinde daha yüksek düzeyde korundugunu ifade eder. Bir yükseltgen, selatlayici, termal ve/veya pH stabil proteaz baglaminda "azalmis stabilite", diger proteazlara (örnegin subtilisin proteazlar) ve/veya yabanil tip enzimlere kiyasla proteolitik aktivitenin zaman içerisinde daha düsük düzeyde korundugunu ifade prosesler esnasinda geçerli kosullar altinda bir varyant proteaz veya referans proteaz ile saglanan temizlik performansini ifade eder. Bazi düzenlemelerde, bir varyant proteaz veya referans proteazin temizlik performansi, bir esya veya yüzey üzerinde çesitli bir veya daha fazla enzime duyarli Iekenin (örnegin yemek, çim, kan, mürekkep, süt, yag ve/veya yumurta proteininden kaynaklanan bir Iekenin) temizlenmesine yönelik çesitli analizler ile belirlenebilir. Bir varyant veya referans proteazin temizlik performansi, esya veya yüzey üzerindeki Iekenin bir standart yikama kosuluna (kosullarina) maruz birakilmasi ve Iekenin çikma düzeyini çesitli kromatografik, spektrofotometrik veya diger nicel metodolojilerle degerlendirilmesi yoluyla belirlenebilir. Örnek temizlik analizleri ve yöntemleri, teknikte bilinir ve bunlarla sinirli asagida verilen Örneklere dahil edilen temizlik analizlerini ve yöntemlerini kapsar. Bir varyant proteazin veya referans proteazin "etkili temizlik miktari", spesifik bir temizlik bilesiminde arzu edilen düzeyde enzimatik aktivite saglayan proteaz miktarini ifade eder. Bu etkili miktarlar ilgili teknigin uzmanlarinca kolay bir sekilde belirlenebilir ve kullanilan belirli proteaz, temizlik uygulamasi, temizlik bilesiminin spesifik bilesimi ve sivi veya kati (örnegin granül, tablet, çubuk) bir bilesimin gerekli olup olmadigi gibi birtakim faktörlere bagli olarak degisir. bilesimine dahil edilen herhangi bir sivi, kati veya gaz materyali ifade eder. Burada açiklandigi üzere mevcut bulusun temizlik bilesimleri, bir veya daha fazla ek temizlik materyali içerebilir. Her bir ek temizlik materyali tipik olarak temizlik bilesiminin belirli tipine ve formuna (örnegin sivi, granül, toz, çubuk, macun, sprey, tablet, jel, köpük veya baska bir bilesim) göre seçilir. Tercih edildigi haliyle, her bir ek temizlik materyali bilesimde kullanilan proteaz enzimi ile uyumludur. Temizlik aktivitesi baglaminda "artmis performans", standart bir yikama çevriminden ve/veya çok sayida yikama çevriminden sonra mutat degerlendirme yoluyla belirlendigi üzere, yumurta, süt, çim, mürekkep, yag ve/veya kan lekesi gibi belirli enzime duyarli Temizlik aktivitesi baglaminda "azalmis performans", standart bir yikama çevriminden sonra mutat degerlendirme yoluyla belirlendigi üzere, yumurta, süt, çim veya kan lekesi gibi belirli enzime duyarli Iekelerde enzim ile azalmis veya daha düsük bir temizlik aktivitesini ifade eder. Bulusun bir varyant proteazinin temizlik aktivitesi baglaminda "karsilastirilabilir performans", bunlarla sinirli olmamak kaydiyla örnegin OPTIMASETM proteazi (Genencor), PURAFECTTM proteaz ürünleri (Genencor), SAVINASET'V' proteazi (Novozymes), BPN' varyantlari (bkz. örnegin U.S. Patent No. Re 34,606), RELASETM, DURAZYMET'V', EVERLASETM, KANNASET'V' proteazi (Novozymes), MAXACALT'V', MAXAPEMT'V', PROPERASETM proteazlari (Genencor; bkz. ayrica U.S. Patent No. Re 97/07770'da tarif edilenler) de dahil olmak üzere bir karsilastirma proteazinin veya referans proteazin (örnegin piyasadan temin edilebilen proteazlar) temizlik aktivitesinin yaklasik %97, en az yaklasik %98, en az yaklasik %99, en az yaklasik %99.5'ini ifade eder. Temizlik performansi, mevcut bulusun varyant proteazlari ile referans subtilisin proteazlarinin, standart yikama çevrimi kosullarindan sonra mutat spektrofotometri veya analiz metodolojileri ile belirlendigi üzere, çim, kan veya süt lekesi gibi enzime duyarli lekeler ile ilgili çesitli temizlik analizlerinde karsilastirilmasi yoluyla belirlenebilir. gelir. Burada kullanildigi üzere "kumas ve ev bakim ürünü" veya "kumas ve ev tipi bakim ürünü" terimi, genel olarak satildiklari formda kullanilmasi veya tüketilmesi amaçlanan ve kumaslar, sert yüzeyler ve diger her türlü yüzeyin islenmesine yönelik olan ürünleri ve cansiz yüzeylerin bakimina ve temizlenmesine yönelik temizleme sistemlerinin yani sira kumas parlatici ürünler ve spesifik olarak kumas bakimi ve korunmasi için tasarlanmis diger ürünler ve hava temizleyicileri ve koku dagitma sistemleri de dahil hava bakim ürünleri, araba bakimi, evcil hayvan bakimi, çiftlik hayvani bakimi, kisisel bakim, mücevher bakimi, bulasik yikama, kumas parlatma (yumusatma ve temizleme de dahil), çamasir deterjani, çamasir ve parlatici ve/veya bakim, ön isleme temizlik bilesenleri, sert yüzey temizleme ve/veya döseme ve klozet temizleyicileri, cam temizleyicileri ve/veya islemleri, karo temizleyicileri ve/veya islemleri, seramik temizleyicileri ve/veya islemleri ve tüketici veya kurumsal kullanima yönelik diger temizleme ürünlerini içerir. Bazi düzenlemelerde kumas ve ev bakim ürünleri, yaralar ve/veya cilt üzerinde kullanima uygundur. "Kumas ve ev bakim ürünü", tüketici ve kurumsal ürünleri içerir. Burada kullanildigi üzere "kumas disi ve ev bakim ürünleri" terimi, bir kumas ve ev bakim ürünü olabilen son ürünü üretmek üzere diger bilesimlere eklenen bilesimlere Burada kullanildigi üzere "kurumsal temizlik bilesimi" terimi, bunlarla sinirli olmamak üzere okullar, hastaneler, fabrikalar, depolar, sirketler, binalar, restoranlar, ofis kompleksleri ve binalari, isleme ve/veya üretim tesisleri, hayvan hastaneleri, fabrika tarlalari, fabrika çiftlikleri ve benzeri de dahil kurumlarda kullanima uygun ürünlere Burada kullanildigi üzere "temizlik ve/veya islem bilesimi" terimi, aksi belirtilmedikçe esyalarin temizlenmesine ve/veya islenmesine uygun bilesimleri içeren kumas ve ev bakim ürünlerinin bir alt grubudur. Bu tür ürünler, bunlarla sinirli olmamak üzere hava bakimi, örnegin hava temizleyiciler ve koku dagitma sistemleri, araba bakimi, bulasik yikama, kumas parlatma (yumusatma ve/veya temizleme de dahil), çamasir deterjani, çamasir ve parlatici ve/veya bakimi, sert yüzey temizleme ve/veya isleme, örnegin döseme ve klozet temizleyicileri, granüler veya toz formundaki çok amaçli veya "agir is" yikama maddeleri, özellikle temizleme deterjanlari; sivi, jel veya macun formundaki çok amaçli yikama maddeleri, özellikle agir is sivi türler; sivi ince kumas deterjanlari; elde bulasik yikama maddeleri veya hafif is bulasik yikama maddeleri, özellikle yüksek oranda köpüren türdekiler; örnegin evde ve kurumlarda kullanima yönelik makinede bulasik yikama maddeleri, çesitli tablet, granüler, sivi ve parlatici türleri; araba ve hali sampuanlari, banyo temizleyicileri, örnegin klozet temizleyicileri ve temizlik yardimci maddeleri örnegin agartici katki maddeleri ve "leke çikarici çubuk" veya ön islem türleri, substrat yüklü ürünler örnegin kurutucu eklenmis levhalar da dahil kumaslarin, sert yüzeylerin ve kumas ve ev bakimi alaninda diger yüzeylerin islenmesine yönelik ürünleri içerir. Burada kullanildigi haliyle, bulusun "temizlik bilesimi" veya "temizlik formülasyonu", bir bilesigi (örnegin istenmeyen bir bilesigi) bunlarla sinirli olmamak kaydiyla örnegin bir kumas, kumas esya, sofra takimi esyasi, yemek takimi esyasi, Züccaciye esyasi, kontakt lens, baska bir kati substrat, saç (sampuan) (insan veya hayvan saçi dahil), cilt (sabun ve/veya krem), dis (gargaralar, dis macunlari), bir esyanin veya nesnenin yüzeyi (örnegin sert yüzeyler, örnegin bir masa, masa üstü, duvar, mobilya esyasi, zemin, tavan, sofra takimi harici bir esya, yemek takimi harici bir esya ve benzerlerinin sert yüzeyleri), filtreler, membranlar (örnegin bunlarla sinirli olmamak üzere ultrafiltrasyon membranlari da dahil filtrasyon membranlari) ve benzerleri de dahil olmak üzere temizlenecek bir nesneden, esyadan veya yüzeyden çikarmak veya yok etmek için faydali olan bulusun herhangi bir bilesimini ifade eder. Terim, bilesimin proteaz ve bilesimde kullanilan diger enzimler ile uyumlu olmasi kaydiyla, arzu edilen belirli temizlik bilesimi türü ve ürün formu (örnegin sivi, jel, granül, sprey veya diger bir bilesim) için seçilen herhangi bir materyali ve/veya ilave bilesigi kapsar. Temizlik bilesimi materyallerinin spesifik seçimi, temizlenecek yüzey, nesne, esya veya kumas ve kullanim esnasinda temizlik kosullari için arzu edilen bilesim formu dikkate alinarak kolayca yapilabilir. Temizlik bilesimleri ve temizlik formülasyonlari, herhangi bir nesneyi, esyayi ve/veya yüzeyi temizlemek, agartmak, dezenfekte etmek ve/veya sterilize etmek için uygun herhangi bir bilesimi kapsar. Bu tip bilesimler ve formülasyonlar, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, örnegin sivi ve/veya kati bilesimleri, mesela temizlik veya deterjan bilesimleri (örnegin sivi, tablet, jel, çubuk, granül ve/veya kati çamasir yikama veya deterjan bilesimleri ve ince kumas deterjan bilesimleri; Örnegin cam, ahsap, seramik ve metal tezgahlara ve pencerelere yönelik olan sert yüzey temizlik bilesimleri ve formülasyonlari; hali temizleyiciler; firin temizleyiciler; kumas temizleyiciler; kumas yumusaticilar; ve tekstil, performans artirici çamasir yikama veya deterjan bilesimleri, ek çamasir yikama bilesimleri ve ön leke çikarici çamasir yikama bilesimleri; bulasik yikama bilesimleri, elde veya manüel bulasik yikama bilesimleri (örnegin "elde" veya Temizlik bilesimleri veya temizlik formülasyonlari, burada kullanildigi haliyle, aksi belirtilmedikçe, granüler veya toz formunda çok amaçli veya agir hizmet tipi yikama maddeleri, özellikle temizlik deterjanlari; sivi, granüler, jel, kati, tablet veya macun formunda çok amaçli yikama maddeleri, özellikle agir hizmet tipi sivi (HDL) deterjan veya agir hizmet tipi toz deterjan (HDD) türleri; sivi ince kumas deterjanlari; bol köpürenler de dahil olmak üzere elde veya manüel bulasik yikama maddeleri; elde veya manüel bulasik yikama, otomatik bulasik yikama ya da sofra takimi veya yemek takimi yikama maddeleri, mesela evsel ve kurumsal kullanima yönelik çesitli tablet, toz, kati, granüler, sivi, jel ve parlatici türleri; sivi temizlik ve dezenfeksiyon maddeleri, örnegin antibakteriyel el yikama türleri, kalip temizlik ürünleri, gargaralar, takma dis temizleyiciler, araba sampuanlari, hali sampuanlari, banyo temizleyiciler; insanlar ve diger hayvanlar için saç sampuanlari ve/veya saç durulama ürünleri; dus jelleri ve köpük banyolari ve metal temizleyiciler ve ayrica yardimci temizlik maddeleri, örnegin agartici katki maddeleri ve "leke giderici roll-on" veya ön islem tiplerini kapsar. Burada açiklandigi üzere granüler bilesimler "kompakt" formdadir; sivi bilesimler "konsantre" formdad ir. Burada kullanildigi haliyle, "kumas temizleme bilesimleri", ek çamasir yikama bilesimleri ve lekeli kumaslarin (örnegin kiyafetler, çamasirlar ve diger tekstil materyalleri) suda bekletilmesi ve/veya ön yikamaya tabi tutulmasinda kullanilmaya uygun bilesimler de dahil olmak üzere elde ve makinede çamasir yikama deterjani bilesimlerini kapsar. Burada kullanildigi haliyle, "kumas harici temizleme bilesimleri", bunlarla sinirli olmamak kaydiyla örnegin elde veya manüel veya otomatik bulasik yikama deterjani bilesimleri, oral temizlik bilesimleri, takma dis temizleme bilesimleri ve kisisel temizlik bilesimleri de dahil olmak üzere tekstil disi (yani kumas disi) yüzey temizleme bilesimlerini kapsar. Burada kullanildigi üzere "kumas ve/veya sert yüzey temizleme ve/veya isleme bilesimi" terimi, aksi belirtilmedikçe granüler veya toz formundaki çok amaçli "agir is" yikama maddeleri, özellikle temizleme deterjanlari; sivi, jel veya macun formundaki çok amaçli yikama maddeleri, özellikle agir ise yönelik sivi türleri; sivi ince kumas deterjanlari; elde bulasik yikama maddeleri veya hafif is bulasik yikama maddeleri, özellikle yüksek oranda köpüren türdekiler; makidene bulasik yikama maddeleri, örnegin evde ve kurumda kullanima yönelik çesitli tablet, granüler, sivi ve parlatici türleri; sivi temizleme ve dezenfekte etme maddeleri, araba veya hali sampuanlari, banyo temizleyicileri, örnegin klozet temizleyicileri; kumas parlatma ürünleri örnegin sivi, kati ve/veya kurutucu levha formunda olabilen yumusatici ve/veya temizleyici ve temizlik yardimci maddeleri örnegin agartici katki maddeleri ve "leke çikarici çubuk" veya ön islem türleri, substrat yüklü ürünler örnegin kurutucu eklenmis levhalari içeren temizlik ve isleme bilesimlerinin bir alt grubudur. Kullanilabilen bu tür ürünlerin tamami, bu ürünler bazi açilarda aköz olmadigi sürece standart, konsantre veya yüksek oranda konsantre formda bulunabilir. Burada kullanildigi haliyle, "deterjan bilesimi" veya "deterjan formülasyonu" terimi, belirli kumas ve/veya kumas disi nesneler veya esyalar da dahil olmak üzere lekeli veya kirli nesnelerin temizlenmesine yönelik bir yikama ortaminda kullanilmasi amaçlanan bir bilesim ile baglantili olarak kullanilir. Mevcut bulusun bu bilesimleri, belirli herhangi bir deterjan bilesimi veya formülasyonu ile sinirli degildir. Aslinda, bazi düzenlemelerde bulusun deterjanlari, bulusun en az bir varyant proteazinin yani sira bir veya daha fazla yüzey aktif, transferaz, hidrolitik enzim, oksido redüktaz, yapici madde (örnegin bir yapici tuz), agartici madde, agartma aktivatörü, çivitleme maddesi, floresan boya, topaklanma inhibitörü, maskeleyici, enzim aktivatörü, antioksidan ve/veya çözündürücü içerir. Bazi durumlarda bir yapici tuz, bir silikat tuzu ile bir fosfat tuzunun bir karisimidir, burada tercihen silikat (örnegin sodyum metasilikat) miktari fosfat (örnegin sodyum tripolifosfat) miktarindan yüksektir. Bulusun bazi bilesimleri, örnegin bunlarla sinirli olmamak kaydiyla temizlik bilesimleri veya deterjan bilesimleri, herhangi birfosfat (örnegin fosfat tuzu veya fosfat yapici madde) içermez. Burada kullanildigi haliyle "agartma" terimi, bir materyalin (örnegin kumas, çamasir, kagit hamuru vs.) veya yüzeyin, materyalin beyazlamasini ve/veya temizlenmesini saglamak üzere yeterli bir süre boyunca ve/veya uygun pH ve/veya sicaklik kosullari altinda muamele edilmesini ifade eder. Agartma için uygun kimyasallarin örnekleri bunlarla sinirli olmamak kaydiyla Örnegin CIOz, H202, perasitler, N02 ve benzerlerini Burada kullanildigi haliyle, bir proteazin (örnegin bulusun bir varyant proteazinin) karsilastirildiginda deterjana ilave temizlik performansi saglayan varyant proteazin yikamaya katkisini ifade eder. Yikama performansi ilgili yikama kosullari altinda karsilastirilir. Bazi test sistemlerinde, deterjan bilesimi, köpük konsantrasyonu, su sertligi, yikama mekanikleri, süre, pH ve/veya sicaklik gibi ilgili diger faktörler, belirli bir pazar diliminde ev uygulamalarina (örnegin elde veya manüel bulasik yikama, otomatik bulasik yikama, sofra takimi temizleme, yemek takimi temizleme, kumas temizleme vs.) yönelik tipik kosulun (kosullarin) taklit edilmesini saglayacak sekilde kontrol edilebilir. bulasik yikama islemlerinde veya çamasir deterjani pazar diliminde kullanilan özellikle yikama sicakligi, süresi, yikama mekanikleri, sud konsantrasyonu, deterjan tipi ve su sertligi gibi kosullari ifade etmek için kullanilir. proteaza kiyasla ilgili yikama kosullari altinda leke gideriminde daha iyi bir nihai sonucun elde edildigini veya ayni nihai sonucu elde etmek için agirlik esasinda daha az miktarda varyant proteaza ihtiyaç duyuldugunu ifade etmek için kullanilir. Burada kullanildigi haliyle, "dezenfekte etme" terimi, kirleticilerin yüzeylerden uzaklastirilmasini ve ayrica ürünlerin yüzeylerindeki mikroplarin inhibe edilmesini veya öldürülmesini ifade eder. Mevcut bulusun belirli herhangi bir yüzey, esya veya giderilecek kirleticiler veya mikroplar ile sinirli olmamasi amaçlanir. Burada temizlik bilesimlerinin "kompakt" formunu en iyi yogunluk ve bilesim açisindan inorganik dolgu tuzunun miktari yansitir. Inorganik dolgu tuzlari, toz formundaki deterjan bilesimlerinin konvansiyonel terkip maddeleridir. Konvansiyonel deterjan bilesimlerinde dolgu tuzlari anlamli miktarlarda ve tipik olarak toplam bilesimin agirligi esasinda yaklasik %17 ila yaklasik %35 oraninda bulunur. Öte yandan, kompakt bilesimlerde dolgu tuzu toplam bilesimin yaklasik %15'ini asmayan miktarlarda bulunur. Bazi düzenlemelerde dolgu tuzu, bilesimin agirligi esasinda yaklasik %10'u veya daha çok tercih edildigi haliyle yaklasik %5'i asmayan miktarlarda bulunur. Burada açiklandigi üzere inorganik dolgu tuzlari, sülfatlarin ve klorürlerin alkali ve toprak alkali metal tuzlarindan seçilir. Belirli bir amino asit dizisinde bir amino asit kalintisinin pozisyonu burada tipik olarak using the numbering of the SEO ID NO:1'de gösterilen B. amy/oliquefaci'ens subtilisin BPN' amino asit dizisinde karsilik gelen amino asit kalintisinin pozisyonunun numarasina göre numaralandirilir. Dolayisiyla, SEQ ID No:1 ile gösterilen B. amy/oiiquefaciens subtilisin BPN' amino asit dizisi, bir referans dizi olarak islev görür. Belirli bir amino asit dizisi, örnegin burada tarif edilen bir varyant proteaz amino asit dizisi burada tarif edildigi üzere bir hizalama algoritmasi kullanilarak BPN' dizisi (SEQ kalintisi ile hizalanan (tercihen optimal düzeyde hizalanan) bir amino asit kalintisi, subtilisin BPN' dizisinde karsilik gelen amino asit kalintisi referans alinarak uygun bir sekilde numaralandirilabilir. Alternatif olarak, subtilisin varyant proteaz dizilerinin amino asit kalinti pozisyonlarinin, GG36 amino asit dizisindeki (SEQ lD No:2) amino asit kalinti pozisyonlarinin asil numaralarina göre ve hizalamadan sonra BPN' dizisinde karsilik gelen amino asit pozisyonlari referans alinmadan numaralandirilmasi halinde, subtilisin varyant proteazi, SEQ lD NO:2`de gösterilen GGSÖ proteazin, bir varyant proteazi olarak tanimlanabilir. Genel olarak, burada kullanilan nomenklatür ve asagida tarif edilen hücre kültürü, moleküler genetik, moleküler biyoloji, nükleik asit kimyasi ve protein kimyasi alanindaki laboratuar prosedürlerinin birçogu ilgili teknigin uzmanlarinca iyi bilinir ve yaygin olarak kullanilir. Rekombinant nükleik asit yöntemleri, nükleik asit sentezi, hücre kültürü yöntemleri ve transgen yerlestirme yöntemlerinin (örnegin, transfeksiyon, elektroporasyon) üretimine ve manipülasyonuna yönelik yöntemler teknikte uzman kisilerce bilinir ve çesitli standart metinlerde açiklanir. Oligonükleotit sentezi ve saflastirma adimlari tipik olarak belirtilen sartlara göre gerçeklestirilir. Teknikler ve prosedürler genel olarak ilgili teknikte iyi bilinen konvansiyonel yöntemlere ve bu dokümanda verilen çesitli genel referanslara göre uygulanir. Bu referanslarda yer alan prosedürlerin ilgili teknigin uzmanlarinca iyi bilindigi kabul edilmektedir ve bunlar okuyucuya faydali olmasi amaciyla sunulmaktadir. Bulusa ait Polipeptitler Mevcut bulus, birlikte "bulusa ait polipeptitler" olarak refere edilebilen yeni polipeptitleri saglar, bunun kosulu söz konusu polipeptitlerin istemlerde tanimlanan sekilde subtilisin varyantlari olmasidir. Bulusa ait polipeptitler izole, rekombinant, büyük ölçüde saf veya dogal olarak meydana gelmeyen varyant bir proteaz polipeptitleri içerir, bunlar enzimatik aktiviteye (örnegin proteolitik aktiviteye) sahip subtilisin varyant polipeptitlerdir ve istem 1de tanimlanan sekildedir. SEQ ID NO:2'ye ait diziye sahip GG36 varyantlari olan bulus polipeptitleri, SEQ ID No:2 dizisine sahip parent GG36 proteaz ile karsilastirildiginda gelismis temizleme performansina sahiptir, bunun kosulu söz konusu varyantlarin istem 1'de tanimlanan sekildedir. Bazi düzenlemelerde bulusa ait polipeptitler, temizleme uygulamalarinda faydalidir ve temizlenmesi gereken bir madde veya bir yüzeyin (örnegin bir madde yüzeyi) temizlenmesi yöntemlerinde faydali olan temizleme bilesimlerine eklenebilir. Burada bir "varyant subtilisin" açiklanir. Burada bir "Baci//us sp. varyant proteaz" açiklanir. Burada bir "Baci'llus sp. varyant subtilisin" açiklanir. Burada bir izole subtilisin varyanti açiklanir. Burada Baci//us /entus subtilisin GG36 proteazin izole subtilisin varyanti açiklanir, burada söz konusu Bacillus lentus subtilisin GG36 proteaz, SEQ ID NO:2'de gösterilen amino asit dizisini içerir. Burada proteolitik aktiviteye sahip izole, rekombinant, büyük ölçüde saf veya dogal olarak meydana gelmeyen varyant bir proteaz açiklanir, bu polipeptit, burada saglanan varyant proteazlari kodlayan amino asit dizileri ile yaklasik en az %80, yaklasik en az özdesligine sahip bir polipeptit dizisini içerir. Yukarida belirtildigi üzere, bulusun varyant proteaz polipeptitleri enzimatik aktivitelere (örnegin proteolitik aktivitelere) sahiptir ve dolayisiyla temizlik uygulamalarinda, örnegin bunlarla sinirli olmamak kaydiyla sofra takimi esyalarinin, yemek takimi esyalarinin, kumaslarin ve sert yüzeylere sahip esyalarin (örnegin bir masa, masa üstü, duvar, mobilya esyasi, zemin, tavan ve benzerlerinin sert yüzeyi) temizlenmesine yönelik yöntemlerde faydalidir. Bulusun bir veya daha fazla varyant proteaz polipeptidini içeren örnek temizlik bilesimleri ilerleye kisimlarda açiklanmaktadir. Bulusun bir varyant proteaz polipeptidinin enzimatik aktivitesi (örnegin proteaz aktivitesi) ilgili teknigin uzmanlarinca iyi bilinen prosedürlere göre kolayca belirlenebilir. Ilerleyen kisimlarda verilen Örnekler, enzimatik aktivite, temizlik performansi ve/veya yikama performansinin degerlendirilmesine yönelik yöntemleri açiklar. Bulusun varyant proteazlarinin Iekelerin (örnegin proteinli bir leke) çikarilmasinda, sert yüzeylerin temizlenmesinde veya çamasir, sofra takimi veya yemek takimi esyasini (esyalari) temizlemedeki performansi, ilgili teknikte iyi bilinen prosedürlere ve/veya Örnekler kisminda tarif edilen prosedürlere göre kolayca belirlenebilir. Bulusun bir polipeptidi, örnegin bu tip degisimlerin polipeptidin enzimatik aktivitesini büyük ölçüde etkilemedigi durumlarda örnegin konzervatif veya konzervatif olmayan bir veya daha fazla amino asit eklemesi, eksilmesi ve/veya sübstitüsyonu gibi çesitli degisikliklere maruz birakilabilir, bunun kosulu söz konusu polipeptidin istem 1'de tanimlanan sekilde bir subilisin varyanti olmasidir. Benzer bir sekilde, bulusun bir nükleik asidi de örnegin bir veya daha fazla kodonda bir veya daha fazla nükleik asidin bir veya daha fazla sübstitüsyonu gibi çesitli degisikliklere maruz birakilabilir. böylece belirli bir kodonun ayni veya farkli bir amino asidi kodlamasi ve sonuç olarak bir sessiz varyasyon (örnegin bir nükleotit dizisindeki mutasyon örnegin kodlanan amino asidin nükleik asit mutasyonundan dolayi degisiklige ugramadigi durumlarda amino asit dizisinde bir sessiz mutasyon ile sonuçlanabilir) veya sessiz olmayan varyasyon, dizide bir veya daha fazla nükleik asidin (veya kodonun) bir veya daha çok kez eksilmesi, diziye bir veya daha fazla nükleik asidin (veya kodonun) bir veya daha çok kez eklenmesi veya katilimi ve/veya dizide bir veya daha fazla nükleik asidin (veya kodonun) bir veya daha çok kez budanmasi saglanabilir. bunun kosulu söz konusu nükleik asidin istemlerde tanimlandigi üzere bir subtilisin varyantini kodlamasidir. Nükleik asit dizisindeki bu tip degisikliklerin birçogu orijinal nükleik asit dizisi tarafindan kodlanan varyant proteaza kiyasla elde edilen kodlanmis varyant proteazin enzimatik aktivitesini esasen degistirmeyebilir. Bulusun bir nükleik asidi ayrica bir ifade sisteminde (örnegin bakteriyel ifade sisteminde) optimum ifadeyi saglayan bir veya daha fazla kodonu dahil etmek üzere degistirilebilir ve ayni zamanda, arzu edildigi takdirde, bahsedilen bir veya daha fazla kodon hala ayni amino asidi (asitleri) kodlayabilir. Burada, burada tarif edilen amino asit sübstitüsyonlarininin yani sira bir veya daha fazla ilave amino asit sübstitüsyona, örnegin konzervatif ve konzervatif olmayan sübstitüsyonlara sahip dizileri içeren, arzu edilen enzimatik aktiviteyi (örnegin proteaz aktivitesi veya temizlik performansi aktivitesi) sergileyen varyant proteaz polipeptitlerini içeren polipeptitlerin bir cinsi açiklanir, burada polipeptit, arzu edilen enzimatik aktiviteyi (örnegin varyant proteazin temizlik aktivitesinde veya performansinda gözlemlendigi üzere proteaz aktivitesi veya subtilisin aktivitesi) sergiler, korur veya yaklasik olarak idame ettirir. Bulusa göre amino asit sübstitüsyonlari bunlarla sinirli olmamak kaydiyla bir veya daha fazla konzervatif olmayan sübstitüsyonu ve/veya bir veya daha fazla konzervatif amino asit sübstitüsyonu kapsayabilir. Bir konzervatif amino asit kalintisi sübstitüsyonu tipik olarak bir fonksiyonel amino asit kalinti sinifina ait bir kalintinin, ayni fonksiyonel sinifin bir üyesi ile ikame edilmesini içerir (fonksiyonel homoloji yüzdesi hesaplanirken özdes amino asit kalintilari fonksiyonel olarak benzer veya korunmus olarak düsünülür). Bir konzervatif amino asit sübstitüsyonu tipik olarak bir amino asit dizisindeki bir amino asidin fonksiyonel olarak benzer bir amino asit ile sübstitüsyonunu kapsar. Örnegin alanin, glisin, serin ve treonin fonksiyonel olarak benzerdir ve dolayisiyla birbirleri için konzervatif amino asit sübstitüsyonu islevine sahip olabilir. Aspartik asit ve glutamik asit birbirleri için konzervatif sübstitüsyon islevine sahip olabilir. Asparagin ve glutamin birbirleri için konzervatif sübstitüsyon islevine sahip olabilir. Arginin, Iizin ve histidin birbirleri için konzervatif sübstitüsyon islevine sahip olabilir. Izolösin, Iösin, metionin ve valin birbirleri için konzervatif sübstitüsyon islevine sahip olabilir. Fenilalanin, tirozin ve triptofan birbirleri için konzervatif sübstitüsyon islevine sahip olabilir. Diger konzervatif amino asit sübstitüsyon gruplari da öngörülebilir. Örnegin amino asitler benzer fonksiyona veya kimyasal yapiya veya bilesime (örnegin asidik, bazik, alifatik, aromatik, kükürt içeren) göre gruplanabilir. Örnegin bir Alifatik gruplama sunlari içerebilir: Glisin (G), Alanin (A), Valin (V), Lösin (L), Izolösin (I). Birbirleri için konzervatif sübstitüsyon olarak düsünülen amino asitleri içeren diger gruplar sunlari kapsar: Aromatik: Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W); Kükürtlü: Metionin (M), Sistein (C); Bazik: Arginin (R), Lizin (K), Histidin (H): Asidik: Aspartik asit (D), Glutamik asit (E): Apolar yüksüz kalintilar, Sistein (C), Metionin (M) ve Prolin (P); Hidrofilik Yüksüz Kalintilar: Serin (S), Treonin (T), Asparagin (N) ve Glutamin (Q). Amino asitlerin ek gruplamalari teknikte uzman kisilerce iyi bilinir ve çesitli standart ders kitaplarinda açiklanir. Burada yukaridaki sübstitüsyon gruplari ile birlikte bir polipeptit dizisinin listesini saglar. Daha konzervatif sübstitüsyonlar, yukarida açiklanan amino asit kalintisi siniflarinda bulunur, bunlar ayni zamanda veya alternatif olarak uygun olabilir. Daha konzervatif olan sübstitüsyonlara yönelik konservasyon gruplari: valin-Iösin-izolösin, fenilalanin- tirozin, Iizin-arjinin, alanin-valin ve asparajin-glutamini içerir. Dolayisiyla örnegin bazi düzenlemelerde bulus, proteolitik aktiviteye sahip izole veya rekombinant varyant proteaz polipeptidini (örnegin varyant subtilisin) saglar, söz konusu varyant proteaz polipeptidi, SEQ ID NO:2,deki amino asit dizisi ile yaklasik en az %90, yaklasik %95, özdesligi içerir. Bir amino asidin bulusun varyant proteazindaki bir baska amino asit ile konzervatif sübstitüsyonunun, varyant proteazin enzimatik aktivitesini veya temizlik performansi aktivitesini önemli ölçüde degistirmesi beklenmez. Elde edilen proteazin enzimatik aktivitesi veya temizlik performansi aktivitesi, standart analizler ve burada açiklanan analizler kullanilarak kolay bir sekilde belirlenebilir. Bulusa ait bir polipeptit dizisinin (örnegin bulusun varyant proteazinin) konzervatif olarak sübstitüe edilmis varyasyonlari, polipeptit dizisindeki amino asitlerin düsük yüzdeli bir kisminin, bazi durumlarda polipeptit dizisindeki amino asitlerin yaklasik düsük bir kisminin veya polipeptit dizisindeki amino asitlerin yaklasik %5, yaklasik %4, yaklasik %3, yaklasik %2 veya yaklasik %1'inden düsük bir kisminin, ayni konzervatif sübstitüsyon grubuna ait konzervatif olarak seçilmis bir amino asit ile sübstitüsyonlarini Burada saglanan Örneklerde ve daha detayli olarak burada baska yerde açiklandigi üzere tarifnamenin polipeptitleri, bilinen subtilisinler de dahil bilinen proteazlar ile karsilastirilabilen temizlik kapasitelerine sahiptir. Örnek niteligindeki bilinen subtilisin proteazlar, bunlarla sinirli olmamak üzere örnegin B. Ientussubtilisin GG36, B. amy/oliquefacienssubtilisin BPN', B. amy/oli'quefaciens subtilisin BPN'-Y217L, and B. c/ausiiPBQ2'yi içerir. Olgun B. Ientus subtilisin GG36 proteininin amino asit dizisi asagidaki gibidir: H\'~\`UTI ;\ÄINNSl'Li\'LUVAI'SAlilÄ'AVKVLü ~\S(JSUS\`SS[.~\Q(J`LEi\v\`-~\UN\(J\H[\':\\`LSL(JSPS l'SAIl lulJAYNÄA I Sl{(i\ l \ \'4-\.-\.\(ii\$('ir\(i.\l.\\ l'v-\R\'A\a\\1~\\(i›-\ I l)()\\.\l{r\.\l SUV( i~\(il.l) KVI'A TSl.(.iS'I'\[.\'(_iS(_}l.\'\"\E.NATR (SEO ID Ntlll Olgun B. amy/o/iquefaciens subtilisin BPN' proteininin amino asit dizisi asagidaki (i`l`}l\l\(i'l`\'i\.\l..\`\SICJ\'l_(_.i\`.i\l`$,-'\Sl.\'i\\'KVM.):\DßSül'jYüV"\(jIE\V.i\l.-\.\.\`MD\'INMSI_(J til'StiSAAl K.~'\A\ l)k›\\ 4~\.\'(i\ \`\ \ AAAUNI (i l XtiSSS l'\(i`i I`(il\'\ i`.\\ IA\'(iA\'[).\S\()|(ASI .\ RVÜPFI D\'\1--\P(,'i\'\|(_)<`l'l P(_'i\'l\'\`(i-\\`\`(_i`l'\'\-l-\.\`Pll\'~\(i~\.~\-\l ll "KIIl'\\\"l`\"l'("›\'ll\'$| li.\' I_I'I'Rl_(iI)Sl"YYCiKül.l\\'()i~\.~\:\Q lSliQ ID .\(l: 1 I Mevcut bulus, istem 1'e göre bir izole subtilisin varyanti saglar. Mevcut bulus, istem 1'de tanimlandigi üzere izole bir subtilisin varyanti saglar, burada subtilisin varyanti Bacillus Ientus subtilisin GG36 proteazin bir proteaz varyantidir, burada söz konusu Bacillus Ientus subtilisin GG36 proteazi SEQ ID NO:2'de gösterilen amino asit dizisini içerir. Mevcut bulus ayrica istem 1'e göre Bacillus Ientus subtilisin GGSB proteazinin izole subtilisin varyantini saglar burada söz konusu subtilisin varyanti, SEQ ID NO:2'de gösterilen amino asit dizisini içeren söz konusu Baci/Ius Ientus subtilisin GG36 proteazi ile en az %90 amino asit özdesligine sahiptir. Mevcut bulus ayrica istem 1'e göre Bacillus Ientus subtilisin GG36 proteazinin izole subtilisin varyantini saglar burada söz konusu subtilisin varyanti, SEO ID NO:2'de gösterilen amino asit dizisini içeren söz konusu Bacillus Ientus subtilisin GGBS proteazi ile en az %95 amino asit özdesligine sahiptir. Mevcut bulus ayrica istem 1'e göre Bacillus Ientus subtilisin GG36 proteazinin izole subtilisin varyantini saglar burada söz konusu subtilisin varyanti, SEQ ID NO:2'de gösterilen amino asit dizisini içeren söz konusu Bacillus Ientus subtilisin GGßö proteazi ile en az %98 amino asit özdesligine sahiptir. Mevcut bulus ayrica istem 1'e göre Bacillus Ientus subtilisin GG36 proteazinin izole subtilisin varyantini saglar burada söz konusu subtilisin varyanti, SEQ ID NO:2'de gösterilen amino asit dizisini içeren söz konusu Baci/Ius Ientus subtilisin GG36 proteazi ile en az %99 amino asit özdesligine sahiptir. Mevcut bulusa ayrica istem 1`e göre izole subtilisin varyantlarinin herhangi birini saglar, burada varyantin toplam net yükü, Bacillus Ientus subtilisin GG36 proteazinin toplam Bazi düzenlemelerde yukarida listelenen izole subtilisin varyantlarinin herhangi biri, düsük iyonik güce veya düsük deterjan konsantrasyonuna sahip bir yikama çözeltisi yapmak üzere suya ekleme için uygun bir deterjan bilesimine eklenebilir. Dolayisiyla bulusun tercih edilen bir açisinda bu varyantlar, iletkenligin yaklasik 0.1 mS/cm ile yaklasik 3 mS/cm, yaklasik 0.3 mS/cm ila yaklasik 2.5 mS/cm veya hatta yaklasik 0.5 mS/cm ila yaklasik 2 mS/cm oldugu bir yikama çözeltisi olusturmak üzere tipik olarak bir yikama makinesinde, elle yikama veya makinede yikama prosesi için suya eklenen bir deterjan bilesimi parçasini olusturacaktir. Düsük iyonik güçte veya düsük deterjan konsantrasyonunda kullanima yönelik tercih edilen varyantlar, liste 9, 14, 15 veya 16,nin herhangi birinde, tercihen liste 14 veya 15'te, en çok tercih edildigi üzere yukaridaki liste 15'teki varyantlardan seçilir. Teoriye bagli kalinmamak üzere istenen net yükü elde etmek üzere yapilan bu mutasyonlarin, düsük iyonik güç kosullari veya düsük deterjan konsantrasyonu içeren yikama çözeltileri için optimal molekül yükünün saglanmasi ile toplam proteaz performansinda artis sagladigina inanilir - sadece bunlar arasindan tercih edilen bazi mutasyonlarin dikkatli kombinasyonu araciligiyla gerçeklesir, böylece tercih edilen proteazlar elde edilebilir. Bazi düzenlemelerde yukarida listelenen izole subtilisin varyantlarinin herhangi biri, yüksek iyonik güce veya yüksek deterjan konsantrasyona sahip bir yikama çözeltisi yapmak üzere suya ekleme için uygun bir deterjan bilesimine eklenebilir. Dolayisiyla bulusun tercih edilen bir açisinda bu varyantlar, iletkenligin yaklasik 3 mS/cm üzerinde ila yaklasik 30 mS/cm, yaklasik 3.5 mS/cm ila yaklasik 20 mS/cm, veya hatta yaklasik 4mS/cm ila yaklasik 10 mS/cm oldugu bir yikama çözeltisi olusturmak üzere tipik olarak bir yikama makinesinde, elle yikama veya makinede yikama prosesi için suya eklenen bir deterjan bilesimi parçasini olusturacaktir. Yüksek iyonik güçte veya yüksek deterjan konsantrasyonunda kullanima yönelik tercih edilen varyantlar, liste 1 veya 17, 18 veya 19'un herhangi birinde, tercihen liste 17 veya 18'de, en çok tercih edildigi üzere yukaridaki liste 17'deki varyantlardan seçilir. Teoriye bagli kalinmamak üzere istenen net yükü elde etmek üzere yapilan bu mutasyonlarin, yüksek iyonik güç kosullari veya yüksek deterjan konsantrasyonu içeren yikama çözeltileri için optimal molekül yükünün saglanmasi ile toplam proteaz performansinda artis sagladigina inanilir- sadece bunlar arasindan tercih edilen bazi mutasyonlarin dikkatli kombinasyonu araciligiyla gerçeklesir, böylece tercih edilen proteazlar elde edilebilir. Tercihen bu proteazlar, iletkenliginin yaklasik 3 mS/cm üzerinde bir deger ila yaklasik mS/cm, yaklasik 3.5 mS/cm ila yaklasik 20 mS/cm veya yaklasik 4mS/cm ila yaklasik 10 mS/cm oldugu bir yikama çözeltisi olusturmak üzere tipik olarak yikama makinesi içinde makinede veya elde yikama prosesinde suya eklenen bir deterjan bilesiminin bir parçasini olusturur. Teoriye bagli kalinmamak üzere istenen net yükü elde etmek üzere yapilan bu mutasyonlarin, yüksek iyonik güç veya yüksek deterjan konsantrasyonu kosullarinda toplam proteaz performansinda artis sagladigina inanilir - sadece bunlar arasindan tercih edilen bazi mutasyonlarin dikkatli kombinasyonu araciligiyla gerçeklesir, böylece tercih edilen proteazlar elde edilebilir. Burada ayrica, asagidaki karakteristiklerden bir veya birkaçina sahip yukarida listelenen izole varyantlari açiklanir: a) en az 1.1, en az 1.2, en az 1.3, en az 1.4, en az yaklasik 8 veya 1.1 ila yaklasik 5 olan Test Yöntemi 2 performans Indeksi; b) en az 1.1, veya 1.0 ila yaklasik 5 olan Test Yöntemi 4 performans Indeksi ve/veya d) en az 1.0, Yöntem 6 performans Indeksi ve/veya e) en az 1.1, en az 1.2, en az 1.3, en az 1.4, en yaklasik 10, veya hatta 1.1 ila yaklasik 7 olan Test Yöntemi 7 performans indeksi. Test Yöntemi 2, Test Yöntemi 3, Test Yöntemi 4, Test Yöntemi 6 ve Test Yöntemi 7, asagidaki "Test Yöntemleri" baslikli Örnek 1 bölümünde açik bir sekilde açiklanir. Bulusun Nükleik Asitleri Bulus, istem 1'de tanimlandigi üzere bulusun polipeptitlerini kodlayan, birlikte "bulusun nükleik asitleri" veya "bulusun polinükleotitleri" olarak adlandirilabilecek izole edilmis, dogal yoldan meydana gelmeyen veya rekombinant nükleik asitler (burada nükleik asitleri, tipik olarak ilgili polipeptidi veya fragmanini kodlayan bir dizi içeren bir plazmit ifade vektörünün ifadesi üzerinden bulusa ait polipeptitlerin rekombinant üretiminde (örnegin ifadesinde) faydalidir. Yukarida ele alindigi üzere polipeptitler, varyant subtilisin polipeptitleri de dahil olmak üzere, temizlige ihtiyaç duyan bir esyanin veya bir yüzeyin (örnegin bir ürünün yüzeyinin) temizlenmesine yönelik temizlik uygulamalarinda ve temizlik bilesimlerinde faydali olan enzimatik aktiviteye (örnegin proteolitik aktiviteye) sahip varyant proteaz polipeptitlerini kapsar. Bazi düzenlemelerde bulus, istem 1'de tanimlandigi üzere herhangi bir polipeptidi rekombinant, büyük ölçüde saf, dogal olarak meydana gelmeyen bir nükleik asit saglar. Mevcut bulus, istem 1'de tanimlandigi üzere nükleik asitleri saglar, burada söz konusu gösterilen amino asit dizisini içeren söz konusu ile en az %85 amino asit özdesligine sahiptir. Mevcut bulus, istem 1'de tanimlandigi üzere nükleik asitleri saglar, burada söz konusu gösterilen amino asit dizisini içeren söz konusu ile en az %90 amino asit özdesligine sahiptir. Mevcut bulus, istem 1'de tanimlandigi üzere nükleik asitleri saglar, burada söz konusu gösterilen amino asit dizisini içeren söz konusu ile en az %95 amino asit özdesligine sahiptir. Mevcut bulus, istem 1'de tanimlandigi üzere nükleik asitleri saglar, burada söz konusu gösterilen amino asit dizisini içeren söz konusu ile en az %98 amino asit özdesligine sahiptir. Mevcut bulus, istem 1'de tanimlandigi üzere nükleik asitleri saglar, burada söz konusu gösterilen amino asit dizisini içeren söz konusu ile en az %99 amino asit özdesligine sahiptir. izole bir subtilisin varyantini kodlayan subtilisin varyanti, SEQ ID NO:2'de Bacillus Ientus subtilisin GGBG proteazi izole bir subtilisin varyantini kodlayan subtilisin varyanti, SEQ ID NO:2'de Bacillus lentus subtilisin GGSö proteazi izole bir subtilisin varyantini kodlayan subtilisin varyanti, SEQ ID NO:2'de Bacillus Ientus subtilisin GG36 proteazi izole bir subtilisin varyantini kodlayan subtilisin varyanti, SEQ ID NO:2'de Bacillus lentus subtilisin GGBB proteazi izole bir subtilisin varyantini kodlayan subtilisin varyanti, SEQ ID NO:2'de Bacillus lentus subtilisin GGSG proteazi Mevcut bulusa ayrica istem 1'de tanimlandigi üzere izole subtilisin varyantlarini kodlayan nükleik asitleri saglar, burada varyantin toplam net yükü, Bacillus -3, -4, veya -5'tir. Burada uygun soguk proteaz varyantlari açiklanir veya subtilisin varyantlari bir parent proteazin varyantlaridir, söz konusu parent proteazin dizisi, SEO ID NO:1'e ait amino asit dizisi ile en az %97, en az %99 veya %100 özdestir, söz konusu proteaz varyanti asagidaki karakteristiklerden bir veya daha fazlasina sahiptir: ile yaklasik 5 olan Test Yöntemi 2 performans indeksi; b) en az 1.1, en az 1.2, Yöntemi 3 performans indeksi; o) en az 1.0, en az 1.1, en az 1.2, en az 1.3, en yaklasik 10, 1.0 ila yaklasik 8, veya hatta 1.0 ile yaklasik 5 olan Test Yöntemi 4 performans indeksi; ve/veya d) en az 1.0, en az 1.1, en az 1.2, en az 1.3, en az yaklasik 10, 1.0 ila yaklasik 8, veya hatta 1.0 ila yaklasik 5 olan Test Yöntemi 6 performans indeksi; ve/veya e) en az 1.1, en az 1.2, en az 1.3, en az 1.4, en az ila yaklasik 10, veya hatta 1.1 ila yaklasik 7 olan Test Yöntemi 7 performans indeksi. Test Yöntemi 2, Test Yöntemi 3, Test Yöntemi 4, Test Yöntemi 6, ve Test Yöntemi 7, "Test Yöntemleri" baslikli Örnek 1 bölümünde altta açik sekilde açiklanir. Burada refere edilen tüm mutasyonlar, Sekil 1'de gösterilen BPN' numaralandirma semasini kullanir. Bazi düzenlemelerde burada refere edilen varyantlar, BPN' numaralandirma semasi kullanilarak SEQ lD NO:2'ye ait amino asit dizisi ile karsilastirilan amino asit dizilerine sahip varyantlara refere Burada açiklandigi üzere yukaridaki yüksek iyonik güçteki soguk su proteaz varyantlari, daha spesifik olarak subtilisin varyantlari iletkenliginin, yaklasik 3 mS/cm üzerindeki bir deger ila yaklasik 30 mS/cm, yaklasik 3.5 mS/cm ila yaklasik 20 mS/cm veya 4mS/cm ila yaklasik 10 mS/cm oldugu, bir çamasir deterjani yikama çözeltisini olusturmak üzere tipik olarak çamasir yikama makinesinde su içinde seyreltilen deterjan bilesiminin bir parçasini olusturur. Soguk su proteaz varyantlarinin, daha spesifik olarak subtilisin varyantlarinin yükü, SEQ ID NO:2'deki amino asit dizisine sahip B. Ientus subtilisin GGSG proteazina göre ifade edilir. Tek bir negatif yük veren amino asitler, D ve E'dir ve tek bir pozitif yük veren amino asitler, R, H ve K'dir. Bir yük degistiren, SEO ID NO:2'ye karsi herhangi bir amino asit degisimi, soguk su proteaz varyantinin yükünü hesaplamak amaciyla kullanilir. Örnegin dogal sus nötral pozisyondan negatif yüklü bir mutasyonun eklenmesi, soguk su proteaz varyantina -1 olan net yük eklerken dogal sus pozitif amino asit kalintisindan (R, H veya K) negatif yüklü bir mutasyonun eklenmesi, -2 olan net yükü ekleyecektir. SEQ ID NO:2'deki amino asit dizisine sahip B. Ientus subtilisin GG36 proteaz dogal susuna karsi soguk su proteaz varyanti için farkli olan tüm amino asit kalintilarindan elde edilen yük degisimlerinin toplami, soguk su proteaz varyantinin yük degisimini verir. Teoriye bagli kalinmamak üzere iletkenligi düsük olan çamasir deterjani solüsyonlarinda kullanilacak soguk su proteazlari için tercih edilen yük araliginin, -5, -4, -3, -2, -1, O, özellikle -2, -1 olduguna; iletkenligi yüksek olan çamasir deterjani solüsyonlarinda kullanilacak soguk Su proteazlari için tercih edilen yük araliginin +5, +4, +3, +2, +1, 0, özellikle +2, +1 olduguna inanilmaktadir. Yükün dogru bir sekilde seçilmesi yoluyla soguk suda temizleme performansinin beklenmedik ölçüde yüksek seviyeleri elde edilebilir. "iletkenligi düsük olan çamasir deterjani solüsyonlari", yaklasik 0.1 mS/cm ila yaklasik 3 mS/cm, yaklasik 0.3 mS/cm ila yaklasik 2.5 mS/cm veya yaklasik 0.5 mS/cm ila yaklasik 2 mS/cm olan bir iletkenlige sahip sekilde tanimlanir. "iletkenligi yüksek olan çamasir deterjani solüsyonlari", yaklasik 3 mS/cm ile yaklasik 30 mS/om, yaklasik 3.5 mS/cm ila yaklasik 20 mS/cm veya yaklasik 4 mS/cm ila yaklasik 10 mS/cm olan iletkenlige sahip sekilde tanimlanir. Yukaridaki örneklerin sinirlayici olmamasi amaçlanir. Mutasyonlar, soguk su performansini optimize etmek üzere kombine edildiginde enzim yükü ayni zamanda diger pozisyonlardaki mutasyonlar ile dengelenebilir. Bazi düzenlemelerde bulus, bulus istem 1'de tanimlandigi üzere izole, rekombinant, büyük ölçüde saf veya dogal olarak meydana gelmeyen varyant proteazi (örnegin varyant subtilisin) saglar, söz konusu varyant proteaz, n fazla 50, en fazla 45, en fazla , en fazla 9, veya en fazla 8 amino asit kalintisi kadar SEQ ID NO:2'de gösterilen amino asit dizisinden farklilasan bir amino asit dizisini içerir, burada amino asit pozisyonlari, Bacillus amy/oliquefaciens subtilisin BPN' amino asit dizisi ile varyant proteaz amino asit dizisinin hizalanmasi ile belirlendigi üzere SEQ ID NO:1'de gösterilen Basi/!us amy/oliquefaciens subtilisin BPN' amino asit dizisindeki karsilik gelen amino asit pozisyonlarinin numaralandirmasina göre numaralandirilir. Bulusun nükleik asitleri, uygun herhangi bir sentez, manipülasyon ve/veya izolasyon teknigi veya bunlarin kombinasyonlari ile üretilebilir. Örnegin bulusun bir polinükleotidi, standart nükleik asit sentezi teknikleri, örnegin ilgili teknigin uzmanlarinca iyi bilinen kati faz sentezi teknikleri ile üretilebilir. Bu tip tekniklerde tipik olarak 50 veya daha fazla nükleotit bazi içeren fragmanlar sentezlenir ve akabinde esasen arzu edilen herhangi bir kesintisiz nükleik asit dizisini meydana getirmek üzere birlestirilir (örnegin enzimatik veya kimyasal Iigasyon yöntemleri veya polimeraz aracili rekombinasyon yöntemleriyle). Bulusun nükleik asitlerinin sentezi ayrica, klasik fosforamidit yöntemine örnegin otomatik sentez yöntemlerinde tipik olarak uygulandigi üzere Matthes vd. bununla sinirli olmamak üzere kimyasal sentez de dahil teknikte bilinen uygun herhangi bir yöntem ile kolaylastirilabilir (veya alternatif olarak basarilabilir). Bulusun nükleik asitleri ayrica bir otomatik DNA sentezleyici ile üretilebilir. Özellestirilmis nükleik asitler çesitli ticari kaynaklardan siparis edilebilir (örnegin, The Midland Certified Reagent Company, the Great American Gene Company, Operon Technologies Inc. ve DNA2.0). Nükleik asitlerin sentezine yönelik diger teknikler ve ilgili ilkeler teknikte bilinir (Bakiniz örnegin, Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323 [1984]; ve Itakura et al., Science Yukarida belirtildigi üzere nükleik asitlerin modifikasyonunda faydali rekombinant DNA teknikleri ilgili alanda iyi bilinir. Örnegin restriksiyon endonükleaz kesimi, Iigasyon, ters transkripsiyon ve CDNA üretimi ve polimeraz zincir reaksiyonu (örnegin PCR) gibi teknikler ilgili teknigin uzmanlarinca bilinmektedir ve kolayca kullanilabilir. Bulusun nükleotitleri ayrica CDNA kütüphanelerinin (örnegin burada tarif edilenler de dahil olmak üzere ilgili alanda yaygin olarak kullanilan mutagenez teknikleri ile üretilen cDNA kütüphaneleri) bulusun bir varyant proteaz polipeptidini (polipeptitlerini) kodlayan polinükleotitler ile hibritlesebilen veya bunlari PCR'de amplifiye edebilen bir veya daha fazla oligonükleotit probu kullanilarak taranmasi yoluyla elde edilebilir. CDNA klonlarinin taranmasina ve izolasyonuna yönelik prosedürler ve PCR amplifikasyon prosedürleri ilgili teknigin uzmanlarinca iyi bilinir ve teknikte uzman kisilerce bilinen standart referanslarda açiklanir. Bulusun bazi nükleik asitleri, dogal yoldan meydana gelen bir polinükleotit omurgasinin (örnegin bir enzimi veya ana proteazi kodlayan bir polinükleotit omurgasinin) örnegin bilinen bir mutagenez prosedürüne (örnegin bölgeye yönlendirilmis mutagenez, bölge doygunlastirma mutagenezi ve in vitro rekombinasyon) göre degistirilmesi yoluyla elde edilebilir. Bulusun Degistirilmis Varyant Proteazlarinin Yapim Yöntemleri Bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, örnegin bölge doygunlastirma mutagenezi, tarama mutagenezi, ekleme mutagenezi, eksiltme mutagenezi, rastgele mutagenez, bölgeye yönlendirilmis mutagenez ve yönlendirilmis evrim ve ayrica çesitli diger rekombinasyon yaklasimlari da dahil olmak üzere, bulusun varyant proteazlarini kodlayan bulusun degistirilmis polinükleotitlerini üretmek için uygun çesitli yöntemler ilgili teknikte bilinir. Degistirilmis polinükleotitlerin ve proteinlerin (örnegin varyant proteazlar) yapimina yönelik yöntemler, DNA karma metodolojileri, genlerin homolog olmayan ve/veya eklemeleri dahil etmek için oligonükleotitlerin kullanimina dayanan yöntemleri Bulusun Varyant Proteazlarinin Üretimine yönelik Vektörler, Hücreler ve Yöntemler Burada, burada tarif edilen bulusun en az bir polinükleotidini (örnegin burada tarif edilen bulusun bir varyant proteazini kodlayan bir polinükleotit) içeren izole edilmis veya rekombinant vektörler, bulusun en az bir nükleik asidini veya polinükleotidini içeren izole edilmis veya rekombinant ifade vektörleri veya ifade kasetleri, bulusun en az bir nükleik asidini veya polinükleotidini içeren izole edilmis, büyük ölçüde saf veya rekombinant DNA konstraktlari, bulusun en az bir polinükleotidini içeren izole edilmis veya rekombinant hücreler, bulusun en az bir polinükleotidini içeren hücreleri ihtiva eden hücre kültürleri, bulusun en az bir nükleik asidini veya polinükleotidini içeren hücre kültürleri ve bu tip vektörlerin, nükleik asitlerin, ifade vektörlerinin, ifade kasetlerinin, DNA konstraktlarinin, hücrelerin, hücre kültürlerinin veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu veya karisiminin bir veya daha fazlasini içeren bilesimler açiklanir. Burada bulusun en az bir nükleik asidini veya polinükleotidini içeren bulusun en az bir vektörünü (örnegin ifade vektörü veya DNA konstrakti) ihtiva eden rekombinant hücreler açiklanir. Bu tip bazi rekombinant hücreler, böylesi en az bir vektör ile transformasyona veya transfeksiyona ugratilir. Bu tip hücreler genelde konakçi hücre olarak adlandirilir. Bu tip bazi hücreler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla Bacillus sp. hücreleri, mesela B. subtilis hücreleri de dahil olmak üzere bakteri hücrelerini kapsar. Bulus ayrica bulusun en az bir varyant proteazini içeren rekombinant hücreler (örnegin rekombinant konakçi hücreler) saglar. Burada, bulusun bir nükleik asidini veya polinükleotidini içeren bir vektör açiklanir. Burada açiklandigi üzere vektör, bulusun bir varyant proteazini kodlayan bulusun bir polinükleotit dizisinin, etkili gen ifadesi için gerekli bir nükleik asit segmentine veya ilave nükleik asit segmentlerine (örnegin bulusun bir varyant proteazini kodlayan bulusun polinükleotidine operatif sekilde bagli bir promotör) operatif sekilde baglandigi bir ifade vektörü veya ifade kasetidir. Bir vektör, bir transkripsiyon terminatörüne ve/veya bir seleksiyon genine, örnegin plazmit ile enfekte edilmis konakçi hücrelerin antimikrobiyal içeren ortamlarda büyüme yoluyla sürekli kültürel idamesini saglayan bir antibiyotik direnç genine sahip olabilir. Bir ifade vektörü, plazmitten veya viral DNA'dan türetilebilir ya da alternatif düzenlemelerde her ikisine ait ögeler içerir. Temsili vektörler, bunlarla sinirli olmamak Chapter 3, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons [1990]; suitable replicating plasmids for B. subtilis include those Iisted on p.92; See also,Perego, Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis, in Sonenshein et al., [eds.] Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry. Physiology and Molecular Genetics, American Society for Microbiology, Ilgili bir proteinin (örnegin varyant proteaz) bir hücrede ifadesi ve üretimi için hücre, proteazin ifadesi için uygun kosullar altinda, degistirilmis proteazi kodlayan bir polinükleotidin en az bir kopyasini ve tercihen çok sayida kopyasini içeren en az bir ifade vektörü ile transformasyona ugratilir. Mevcut bulusun bazi düzenlemelerinde, varyant proteazi kodlayan bir polinükleotit dizisi (ve ayrica vektöre dahil edilen diger diziler) konakçi hücrenin genomuna entegre edilir, diger düzenlemelerde ise varyant proteazi kodlayan bir polinükleotit dizisini içeren bir plazmit vektörü, hücrenin içinde bir otonom ekstrakromozomal öge olarak kalir. Bulus, hem ekstrakromozomal nükleik asit ögelerini hem de konakçi hücre genomuna entegre edilen gelen nükleotit dizilerini kapsar. Burada tarif edilen vektörler, bulusun varyant proteazlarinin üretimi için faydalidir. Burada açiklandigi üzere varyant proteazi kodlayan bir polinükleotit konstrakti, varyant proteazi kodlayan polinükleotidin bakteri kromozomuna entegrasyonunu ve istege bagli olarak amplifikasyonunu saglayan bir entegrasyon vektöründe bulunur. Entegrasyona yönelik bölgelerin örnekleri ilgili teknigin uzmanlarinca iyi bilinir. Bazi düzenlemelerde, bulusun bir varyant proteazini kodlayan bir polinükleotidin transkripsiyonu, seçilen öncül proteaz için yabanil tip promotör olan bir promotör ile saglanir. Burada açiklandigi üzere promotör, öncül proteaz için heterologtur, ancak konakçi hücrede fonksiyoneldir. Daha özel bir ifadeyle, bakteriyel konakçi hücrelerde kullanimi uygun promotörlerin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, örnegin amyE, amyQ, amyL, pstS, sacB, pSPAC, pAprE, pVeg, pHpall promotörlerini ve B. stearothermophilus maltojenik amilaz geni, B. amy/o/iquefaci'ens (BAN) amilaz geni, B. subtilis alkali proteaz geni, B. clausii' alkali proteaz geni, B. pumi'lis ksilosidaz geni, B. thuringiensis cryIIIA geni ve B. Iicheniformis alfa-amilaz geninin promotörünü kapsar. Ilave promotörler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, A4 promotörünü ve ayrica faj Lambda PR veya PL promotörlerini ve E. coli Iac, trp veya tac promotörlerini kapsar. Mevcut bulusun varyant proteazlari, bakteriler ve mantarlar da dahil olmak üzere uygun herhangi bir Gram-pozitif mikroorganizmanin konakçi hücrelerinde üretilebilir. Örnegin bazi düzenlemelerde varyant proteaz mantar ve/veya bakteriyel kökenli konakçi hücrelerde üretilir. Bazi düzenlemelerde konakçi hücreler Bacillus sp., Streptomyces sp., Escherichia sp. veya Aspergillus sp. kökenlidir. Bazi düzenlemelerde varyant proteazlar, Bacillus sp. konakçi hücreleri tarafindan üretilir. Bulusun varyant proteazlarinin üretiminde kullanima sahip Bacillus sp. konakçi hücrelerinin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla B. licheni'formis, B. Ientus, B. subti'lis, B. amy/oliquefaciens, B. Ientus, B. brevis, B. stearothermophi'lus, B. alkalophi'lus, B. coagulans, B. Circulans, B. pumiI/s, B. thuringiensis, B. c/ausi'i ve B. megaterium ve ayrica Bacillus cinsine ait diger organizmalari kapsar. Bazi düzenlemelerde, varyant proteazlarin üretimi için B. subtilis konakçi hücreleri kullanilir. U.S. Patent No. ,264,366 ve 4,, bulusun varyant proteazlarini üretmek için kullanilabilecek çesitli Bacillus konakçi suslarini açiklar, ancak diger uygun suslar da kullanilabilir. Bulusun varyant proteazlarini üretmek için kullanilabilecek birtakim endüstriyel bakteri suslari, rekombinant olmayan (yani yabanil tip) Bacillus sp. suslarini ve ayrica dogal yoldan meydana gelen suslarin ve/veya rekombinant suslarin varyantlarini kapsar. Bazi düzenlemelerde konakçi sus bir rekombinant sustur, burada ilgili bir polipeptidi kodlayan bir polinükleotit konakçinin içine dahil edilmistir. Bazi düzenlemelerde konakçi sus bir B. subtili's konakçi susudur ve özellikle bir rekombinant Baci'l/us subti/i's konakçi susudur. Bunlarla sinirli olmamak kaydiyla örnegin , 168 ve PEP 211 susu da dahil olmak üzere çesitli B. subtilis suslari bilinmektedir (bkz. Bazi düzenlemelerde Bacillus konakçi hücresi, degU, degS, degR ve degQ genlerinin en az birinde bir mutasyon veya eksilme içeren bir Baci//us sp. hücresidir. Mutasyon tercihen bir degU genindedir ve mutasyon daha çok tercih edildigi haliyle degU(Hy)32 mutasyonuna sahip bir BaCiI/us subtilis susudur. Bazi düzenlemelerde Baci'llus da opp operonunun diger genlerinde bir mutasyon veya eksilme içerir (bkz. örnegin ile ayni fenotipe yol açan opp operonundaki herhangi bir mutasyonun, bulusun degistirilmis Baci'llus susunun bazi düzenlemelerinde kullanima sahip olmasi öngörülmektedir. Bazi düzenlemelerde bu mutasyonlar tek basina bulunur, diger düzenlemelerde mutasyon kombinasyonlari mevcuttur. Bazi düzenlemelerde, bulusun bir varyant proteazini üretmek için kullanilabilecek bir degistirilmis Bacillus konakçi hücre susu, yukarida belirtilen genlerin bir veya daha fazlasinda halihazirda bir mutasyon içeren bir Baci/lus konakçi susudur. Ayrica, endojen proteaz genlerinde mutasyon (mutasyonlar) ve/veya eksilmeler içeren Bacil/us sp. konakçi hücreleri de kullanima sahiptir. Bazi düzenlemelerde Baci'llus konakçi hücresi, aprE ve nprE genlerinde bir eksilme içerir. Diger düzenlemelerde, Bacillus sp. konakçi hücresi 5 proteaz geninde bir eksilme içerir, diger düzenlemelerde ise Bacillus sp. konakçi hücresi 9 proteaz geninde bir eksilme içerir (bkz. örnegin U.S. Patent Basvurusu Yayin Konakçi hücreler, ilgili teknikte bilinen uygun herhangi bir yönteme göre bulusun en az bir varyant proteazini kodlayan en az bir nükleik asit ile ile transformasyona ugratilir. Nükleik asit, bir vektöre dahil edilip edilmedigine veya plazmit DNA'sinin varligi olmadan kullanilip kullanilmadigina bagli olarak genelde bir mikroorganizmanin, bazi düzenlemelerde tercihen bir E. coli hücresinin veya bir kompetan Bacillus hücresinin içine dahil edilir. Bir nükleik asidin (örnegin DNA) Bacillus hücrelerine veya E. COII hücrelerine plazmit DNA konstraktlari veya vektörler kullanilarak dahil edilmesine ve bu tip hücrelerin bu plazmit DNA konstraktlari veya vektörler ile transformasyona ugratilmasina yönelik yöntemler iyi bilinir. Burada açiklandigi üzere plazmitler akabinde E. coli hücrelerinden izole edilir ve Bacillus hücreleri bunlarla transformasyona ugratilir. Ancak, E. coli gibi müdahaleci mikroorganizmalarin kullanilmasi gerekli degildir ve bazi düzenlemelerde bir DNA konstrakti veya vektör bir Bacillus konakçisina dogrudan dahil Ilgili teknigin uzmanlari, bulusun nükleik asit veya polinükleotit dizilerinin Bacillus hücrelerine dahil edilmesine yönelik uygun yöntemlerin oldukça farkindadir (bkz. örnegin Ferrari vd., "Genetics," in Harwood vd. (eds.), Bacillus, Plenum Publishing (; Smith vd., Appl. Env. konkresyonu da dahil olmak üzere transformasyon, transdüksiyon ve protoplast füzyonu gibi yöntemler iyi bilinmektedir ve mevcut bulusta kullanilmaya uygundur. Transformasyon yöntemleri, mevcut bulusun bir varyant proteazini kodlayan bir nükleik asidi içeren bir DNA konstraktinin veya vektörün bir konakçi hücreye dahil edilmesi için kullanilir. Ilgili teknikte Bacillus hücrelerini transformasyona ugratmaya yönelik olarak bilinen yöntemler, bir donör plazmitin kismen homolog bir yerlesik plazmit ihtiva eden kompetan hücrelere alimini içeren plazmit belirteç kurtarma transformasyonu gibi kromozomal transformasyonu taklit eden bir süreçte yerlesik "yardimci" plazmitin homolog bölgesiyle birlesir. Burada açiklandigi üzere, yaygin olarak kullanilan yöntemlere ek olarak, konakçi hücreler dogrudan bulusun bir varyant proteazini kodlayan bir nükleik asidi içeren bir DNA konstrakti veya vektör ile transformasyona ugratilir (yani konakçi hücreye dahil edilmeden önce DNA konstraktini veya vektörü amplifiye etmek veya aksi takdirde isleme tabi tutmak için bir ara hücre kullanilmaz). Bulusun DNA konstraktinin veya vektörünün konakçi hücreye dahil edilmesi, bir nükleik asit dizisini (örnegin DNA dizisini) bir plazmite veya vektöre yerlestirilmeksizin bir konakçi hücreye dahil etmeye yönelik olarak ilgili teknikte bilinen fiziksel ve kimyasal yöntemleri içerir. Bu tip yöntemler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla kalsiyum klorür presipitasyonu, elektroporasyon, çiplak DNA, lipozomlar ve benzerlerini kapsar. Burada açiklandigi üzere, DNA konstraktlari veya vektör, plazmitin içine yerlestirilmeden bir plazmit ile birlikte transformasyona ugratilir. Burada açiklandigi üzere, ilgili teknikte bilinen yöntemlere göre degistirilmis Baci'llus susundan bir seçici belirteç eksiltilir (bkz. Stahl Burada açiklandigi üzere, mevcut bulusun transformasyona ugratilmis hücreleri konvansiyonel besi ortamlarinda kültürlenir. Sicaklik, pH ve benzeri uygun spesifik kültür kosullari ilgili teknigin uzmanlarinca bilinir ve bilimsel literatürde açiklanir. Bazi düzenlemelerde bulus, bulusun en az bir varyant proteazini veya en az bir nükleik asidini içeren bir kültür (örnegin hücre kültürü) saglar. Burada, bulusun en az bir nükleik asidini, vektörünü veya DNA konstraktini içeren bilesimler açiklanir. Burada açiklandigi üzere, bulusun en az bir varyant proteazini kodlayan en az bir polinükleotit dizisi ile transformasyona ugratilmis konakçi hücreler uygun bir besi ortaminda mevcut proteazin ifadesini saglayan kosullar altinda kültürlenir, akabinde elde edilen proteaz kültürden geri kazanilir. Hücreleri kültürlemek için kullanilan ortam, konakçi hücreleri büyütmek için uygun olan herhangi bir konvansiyonel ortami, örnegin uygun takviye maddelerini içeren minimal veya kompleks ortamlari kapsar. Uygun ortamlar ticari tedarikçilerden temin edilebilir ya da yayimlanmis (Bakiniz örnegin Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu kataloglari) tariflere göre hazirlanabilir. Burada açiklandigi üzere, hücreler tarafindan üretilen proteaz, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla örnegin konakçi hücrelerin ortamdan santrifüj veya filtreleme yoluyla ayrilmasi, süpernatanin veya filtreleme ürününün proteinli bilesenlerinin bir tuz (örnegin amonyum sülfat) yardimiyla çökeltilmesi, kromatografik saflastirma (örnegin iyon degistirme, jel filtreleme, afinite vs.) de dahil olmak üzere konvansiyonel prosedürlere göre kültür ortamindan geri kazanilir. Varyant proteazin geri kazanilmasina veya saflastirilmasina yönelik uygun herhangi bir yöntem mevcut bulusta kullanilabilir. Burada açiklandigi üzere, bir rekombinant konakçi hücre tarafindan üretilen bir varyant proteaz kültür ortamina salgilanir. Çözünür proteinlerin saflastirilmasini kolaylastirmak için saflastirmayi destekleyici bir domeni kodlayan bir nükleik asit dizisi kullanilabilir. Bir varyant proteazi kodlayan bir polinükleotit dizisini içeren bir vektör veya DNA konstrakti, ilaveten, varyant proteazin saflastirilmasini kolaylastirmak üzere saflastirmayi destekleyici bir domeni kodlayan bir nükleik asit dizisine sahip olabilir destekleyici domenler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, örnegin sabitlenmis metaller üzerinde saflastirma saglayan histidin-triptofan modülleri (Porath J., Protein Expr. Purif. saflastirma saglayan protein A domenlerini ve FLAGS uzatma/afinite" saflastirma sisteminde kullanilan domeni (örnegin Immunex Corp., Seattle, WA'dan temin edilen protein A domenleri) kapsar. Saflastirma domeni ile heterolog proteinin arasina Faktör XA veya enterokinaz (örnegin lnvitrogen, San Diego, CA'dan temin edilen diziler) gibi bir kesilebilir baglanti dizisinin yerlestirilmesi de saflastirmayi kolaylastirmak için kullanilabilir. Bir enzimin, örnegin bulusun bir varyant proteazinin enzimatik aktivitesini saptamaya ve ölçmeye yönelik analizler iyi bilinir. Proteazlarin, örnegin bulusun varyant proteazlarinin aktivitesini saptamaya veya ölçmeye yönelik çesitli analizler de ilgili teknigin uzmanlarinca bilinir. Daha özel bir ifadeyle, proteaz aktivitesini ölçmeye yönelik olarak, 280 nm'de sogurum olarak veya teknikte uzman kisilerce iyi bilinen Folin yöntemine göre kolorimetrik olarak ölçüldügü üzere asitte çözünebilen peptitlerin kazeinden veya hemoglobinden salimini esas alan analizler mevcuttur. Diger örnek analizler, kromojenik substratlarin çözünürlestirilmesini içerir (bkz. örnegin Ward, kaydiyla süksinil-AIa-AIa-Pro-Phe-para nitroanilid analizini (suc-AAPF-pNA) ve 2,4,6- trinitrobenzen sülfonat sodyum tuzu analizini (TNBS analizi) kapsar. Ilgili teknigin uzmanlarinca bilinen çesitli ilave referanslar uygun yöntemleri saglar (Wells vd., Bir olgun proteazin (örnegin bulusun olgun varyant proteazlarinin) bir konakçi hücrede üretim düzeyini saptamak için çesitli yöntemler kullanilabilir. Bu tip yöntemler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, örnegin proteaza spesifik poliklonal veya monoklonal antikorlarin kullanildigi yöntemleri kapsar. Örnek yöntemler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, örnegin enzime bagli immünsorban analizleri (ELISA), radyo immün analizler (RIA), floresan immün analizler (FIA) ve floresans ile aktiflesen hücre siniflandirmasini (FACS) kapsar. Bu ve diger analizler ilgili teknikte iyi bilinir (bkz. örnegin Maddox vd., J. Burada bulusun bir olgun varyant proteazinin yapimina veya üretimine yönelik yöntemler açiklanir. Bir olgun varyant proteaz, bir sinyal peptidine veya bir propeptit dizisine sahip degildir. Bazi yöntemler, bulusun bir varyant proteazinin bir Baci'llus sp. hücresi gibi (örnegin Baci'llus sp. hücresi) bir rekombinant bakteriyel konakçi hücrede yapimini veya üretimini içerir. Bazi düzenlemelerde bulus, bulusun bir varyant proteazinin üretimine yönelik bir yöntem saglar, yöntem, varyant proteazin üretimini destekleyen kosullar altinda bulusun bir varyant proteazini kodlayan bir nükleik aside sahip bir rekombinant ifade vektörünü içeren bir rekombinant konakçi hücrenin kültürlenmesini içerir. Bu tip bazi yöntemler, ilaveten, varyant proteazin kültürden geri kazanilmasini içerir. Burada, bulusun bir varyant proteazinin üretimine yönelik yöntemler açiklanir, yöntemler, (a) bulusun bir varyant proteazini kodlayan bir nükleik aside sahip bir rekombinant ifade vektörünün bir hücre popülasyonuna (örnegin bakteri hücreleri, örnegin B. subtilis hücreleri) dahil edilmesini ve (b) hücrelerin bir kültür ortaminda ifade vektörü tarafindan kodlanan varyant proteazin üretimini destekleyen kosullar altinda kültürlenmesini içerir. Bu tip bazi yöntemler, ilaveten, (c) varyant proteazin hücrelerden veya kültür ortamindan izole edilmesini içerir. Kumas ve ev bakim ürünleri Bazi düzenlemelerde mevcut bulusa ait proteaz varyantlari, daha spesifik olarak subtilisin varyantlari yardimci bir materyal ve bir proteaz varyanti içeren bilesimlerde kullanilabilir, burada bilesim bir kumas ve ev bakim ürünüdür. Mevcut bulus ayrica istem 1'de tanimlandigi üzere yukaridaki izole subtilisin varyantlarinin herhangi birini saglar, burada subtilisin varyanti Bacil/us Ientus subtilisin GG36 proteazin bir proteaz varyantidir, burada söz konusu Bacillus Ientus subtilisin GG36 proteazi SEQ ID NO:2'de gösterilen amino asit dizisini içerir. Bazi düzenlemelerde kumas ve ev bakim ürünü bilesimleri, istem 1'de tanimlandigi üzere izole subtilisin varyantlarinin herhangi birini içerir, burada varyantin toplam net yükü, Baci/Ius Ientus subtilisin GG36 proteazinin toplam net yüküne göre 0, +1, +2, +3, Burada açiklandigi üzere kumas ve ev bakim ürünü bilesimlerinin subtilisin varyanti, ticari olarak temin edilebilir parent bir subtilisinden türetilir (örnegin SAVINASE®, POLARZYME®, KANNASE®, LIQUINASE®, LIQUINASE ULTRA®, SAVINASE ULTRA®, veya OVOZYME® (Novozymes A/S tarafindan): MAXACAL®, PROPERASE®, PURAFECT®, FN3®, FN4® ve PURAFECT OXP®, PURAFASTTM, PURAFECT® PRIME, veya PURAMAX® (Genencor International tarafindan) ve BLAP olarak adlandirilan Henkel/ Kemira'dan temin edilebilenler (buradan sonra BLAP olarak Bazi düzenlemelerde kumas ve ev bakim ürün bilesimleri, istem 1'de tanimlandigi üzere en az bir proteaz varyanti içerir, burada varyant proteazi by en fazla 50, en fazla , en fazla 9, veya en fazla 8 amino asit kalintisi ile SEQ ID NO:2'de gösterilen amino asit dizisinden farklilasan bir amino asit dizisini içerir, burada amini asit pozisyonlari Bacillus amy/oliquefaciens subtilisin BPN' amino dizisi ile varyant proteaz amino asit dizisinin hizalanmasi ile belirlendigi üzere SEQ ID NO:1`de gösterilen Bacil/us amy/oliquefacienssubtilisin BPN' amino asit dizisinde karsilik gelen amino asit pozisyonlarinin numaralandirmasina göre numaralandirilir. Temizlik evlveya Islem Bilesimleri Burada açiklandigi üzere, kumas ve ev bakim ürünü gibi temizlik ve/veya islem bilesimini içeren tüketici ürünü, en az bir proteaz varyanti, özellikle bir subtilisin varyanti ve en az bir yardimci materyal içerir. Burada açiklandigi üzere bu yardimci maddeler, örnegin parfümler, renklendiriciler, boyalar veya benzeri ile oldugu durumdaki gibi temizlik bilesiminin estetigini modifiye etmek üzere veya temizlenecek alt katman islemine yönelik olarak temizleme performansina yardim etmek veya bunu arttirmak üzere eklenir. Bu tür yardimci maddelerin, mevcut bulusa ait varyant proteazlarina ilave oldugu anlasilir. Bu ek bilesenlerin hassas yapisi ve bunlarin eklenme seviyeleri, bilesimin fiziksel formuna ve bunun için kullanilacak temizleme isleminin yapisina bagli olacaktir. Temizleme ve/veya islem yardimci materyalleri, bunlarla sinirli olmamak üzere asagidakileri içeren listeden bir veya daha fazlasindan seçilebilir: sürfaktanlar, yapici maddeler, agarticilar, agartma aktivatörleri, agartma katalizörleri, diger enzimler, enzim stabilize edici sistemler, selantlar, toprak salgilama polimerleri, boya transfer ajanlari, dagiticilar, köpük baskilayicilar, boyalar, parfümler, renklendiriciler, dolgu maddesi tuzlari, hidrotroplar, foto aktivatörler, floresan maddeler, kumas sartlandiricilar, kumas yumusaticilar, hidrolize olabilen yüzey aktifler, koruyucular, koruyucular, antioksidanlar, çekmeyi önleyici maddeler, burusma önleyici maddeler, germisitler, fungusitler, renk benekleri, gümüs bakim maddesi, kararma önleyici ve/veya korozyon önleyici maddeler, alkalilik kaynaklari, çözündürücü maddeler, tasiyicilar, yardimci islem maddeleri, pigmentler ve pH kontrol ajanlari, bir parfüm içeren bir enkapsülat, bir renklendirme ajani, sürfaktanlar, yapici maddeler, selatlayici ajanlari, boya transferini inhibe edici ajanlar, dagiticilar, ek enzimler, enzim stabilizörleri, katalitik materyaller, agartma aktivatörleri, hidrojen peroksit, hidrojen peroksit kaynaklari, önceden olusturulmus preasitler, polimerik dagitma ajanlari, killi toprak uzaklastirma/yeniden birikmeyi önleyici ajanlar, parlaticilar, köpük baskilayicilar, boyalar, parfümler, yapi elastiklestirici ajanlar, kumas yumusaticilari, hidrotroplar, solventler ve karisimlari (Bakiniz örnegin U.S. Patent No. 6,101). Temizlik ve/veya islem yardimci materyallerinin temizlik bilesimlerinde mevcut bulusa ait varyant proteazlar ile uyumlu oldugu düzenlemelerde proteaz(lar) ve temizlige yardimci materyallerin iki bilesenin kombinasyonu uygun olana kadar ayri (diger bir ifadeyle birbiri ile temas içinde olmayan) tutulmasina yönelik uygun yöntemler kullanilir. Bu tür ayrima yöntemleri teknikte bilinen uygun herhangi bir yöntemi (örnegin jelkaplar, kapsülleme, tabletler, fiziksel ayirma vb.) içerir. Burada açiklandigi üzere kumas ve ev bakim ürünü gibi temizlik ve/veya islem bilesimi en az bir proteaz varyanti içerir ayrica subtilisinler (EC 34.21.62): tripsin benzeri veya kemotripsin benzeri proteazlar; metalloproteazlar ve karisimlarindan seçilen en az bir ek immüno esdeger olmayan proteaz içerir. Burada açiklandigi üzere kumas ve ev bakim ürünü gibi temizlik ve/veya islem bilesimi, en az bir proteaz varyanti içerir ayrica asagidakilerden seçilen en az bir ek immüno esdeger olmayan proteaz içerir: B. subti/is, B. amy/oli'quefaciens, B. pumilus ve B. gibsonifden türetilen subtilisinler (EC 3.4.21.62); Cellulomonas'dan türetilen tripsin proteazlari ve/veya kemotripsin proteazlari; Bacillus amy/oli'quefaciens'dan türetilen metalloproteazlar ve karisimlari. Burada açiklandigi üzere kumas ve ev bakim ürünü gibi temizlik ve/veya islem bilesimi, en az bir proteaz varyanti içerir ayrica, hemiselülazlar, peroksidazlar, proteazlar, selülazlar, sellobiyoz, dehidrojenazlar, ksiloglukanazlar, ksilanazlar, Iipazlar, fosfolipazlar, esterazlar, kutinazlar, pektinazlar, mannanazlar, pektat liyazlar, keratinazlar, redüktazlar, oksidazlar, fenoloksidazlar, Iipoksijenazlar, ligninazlar, pullulanazlar, tannazlar, pentozanazlar, Iikenazlar, glukanazlar, arabinozidazlar, hiyaluronidazlar, kondroitinazlar, lakkazlar, amilazlar ve karisimlarindan seçilen en az bir ek enzimi içerir. Burada açiklandigi üzere kumas ve ev bakim ürünü gibi temizlik ve/veya islem bilesimi, en az bir proteaz varyanti içerir ayrica, ilk yikama Iipazlari; alfa-amilazlar; bakteriyel temizleme selülazlari ve karisimlarindan seçilen en az bir ek enzimi içerir. Burada açiklandigi üzere kumas ve ev bakim ürünü gibi temizlik ve/veya islem bilesimi, en az bir proteaz varyanti içerir ayrica, asagidakilerden en az birini içerir: parfüm mikro kapsülünü içeren parfümü içeren enkapsülant; bazik, asit, hidrofobik, direkt ve polimerik boyalar ve 550 nm ila 650 nm'lik pik absorpsiyon dalga boyuna sahip boya konjugatlari ve karisimlarindan seçilen bir materyali içeren renk maddesi; anyonik temizleyici sürfaktanlar, iyonik olmayan temizleyici sürfaktan, katyonik temizleyici sürfaktanlar, zwitter iyonik temizleyici sürfaktanlar ve amfoterik temizleyici sürfaktanlar ve karisimlarindan seçilen bir materyali içeren temizleyici bir sürfaktan; zeolitler, fosfatlar ve karisimlarindan seçilen bir materyali içeren gelistirici madde; sodyum silikat, potasyum silikat ve karisimlarindan seçilen bir materyali içeren silikat tuzu; soguk suda çözünür parlaticilar ve karisimlarindan seçilen bir materyali içeren parlatici; maleat/akrilat rastgele polimeri veya poliakrilat homopolimeri ve karisimlarindan seçilen bir materyali içeren karboksilat polimeri; tereftalat ko-polimerleri ve karisimlarindan Seçilen bir materyali içeren kir çikarma polimeri; alkil selüloz, alkil alkoksialkil selüloz, karboksialkil selüloz, alkil karboksialkil selüloz ve karisimlarindan seçilen bir materyali içeren selülozik polimer; iminyum katyonlari, iminyum poliiyonlari; iminyum zwitter iyonlari; modifiye aminler; modifiye amin oksitler; N-sülfonil iminler; N-fosfonil iminler; N-asil iminler; tiyadiazol dioksitler; perfloroiminler; siklik seker ketonlari ve karisimlarindan seçilen bir materyali içeren agartma katalizörü; dodekanoil oksibenzen sülfonat, dekanoil oksibenzen sülfonat, dekanoil oksibenzoik asit veya tuzlari, 3,5,5- trimetil hekzanoiloksibenzen sülfonat, tetraasetil etilen diamin (TAED), nonanoiloksibenzen sülfonat (NOBS) ve karisimlarindan seçilen bir materyali içeren agartma aktivatörü; inorganik perhidrat tuzlari, örnegin alkali metal tuzlari örnegin perboratin sodyum tuzlari (genellikle mono- veya tetra-hidrat), perkarbonat, persülfat, perfosfat, persilikat tuzlari ve karisimlarindan seçilen bir materyali içeren hidrojen peroksit kaynagi; DTPA (dietilen triamin pentaasetik asit), HEDP (hidroksietan difosfonik asit), DTPMP (dietilen triamin penta(metilen fosfonik asit)), etilendiamindisüksinik asit (EDDS), 1,2-dihidroksibenzen-3,5-disülfonik asit disodyum tuzu hidrati, söz konusu selantlarin deriveleri ve karisimlarindan seçilen bir materyali içeren bir selant. Burada açiklandigi üzere kumas ve ev bakim ürünü gibi temizlik ve/veya islem bilesimi, en az bir proteaz varyanti içerir, boyalar; en az bir katyonik-bazik boya ve smektit kil içeren boya-kil konjugatlari ve karisimlarindan olusan gruptan seçilen bir kumas Burada açiklandigi üzere kumas ve ev bakim ürünü gibi temizlik ve/veya islem bilesimi, en az bir proteaz varyanti içerir, küçük moleküllü boyalar ve polimerik boyalar ve istege bagli olarak smektit kil ile karisimlarindan seçilen en az bir kumas renklendirme maddesi içerir. Burada açiklandigi üzere kumas ve ev bakim ürünü gibi temizleme ve/veya islem bilesimi tek veya çok bölmeli birim dozlari halinde saglanan en az bir proteaz varyanti içerir. Bazi düzenlemelerde bilesim, çok bölmeli bir birim dozdur, burada proteaz varyanti herhangi bir hidrojen peroksit ve/veya selant ve/veya ek enzim kaynagindan farkli bir bölmededir. Burada açiklandigi üzere kumas ve ev bakim ürünü gibi temizlik ve/veya islem bilesimi, en az bir proteaz varyantini içerir, asagidaki bilesenlerden birini veya birkaçini (toplam bilesim agirligina göre) içerir: agirlikça yaklasik %0.0005 ila agirlikça yaklasik %0.1, ila agirlikça yaklasik %003 söz konusu soguk su proteaz varyanti ve asagidakilerden bir veya birkaçi: agirlikça yaklasik %0.00003 ila agirlikça yaklasik %0.1 kumas renklendirme maddesi; agirlikça yaklasik %0.001 ila agirlikça yaklasik %5 parfüm kapsülleri; agirlikça yaklasik %0.001 ila agirlikça yaklasik %1 soguk suda çözünür parlatici; agirlikça yaklasik %0.00003 ila agirlikça %yaklasik 0.1 agartma katalizörleri; agirlikça yaklasik %0.00003 ila agirlikça yaklasik %0.1 ilk yikama Iipazlari; agirlikça yaklasik %0.00003 ila agirlikça yaklasik %0.1 bakteriyel temizleme selülazlari ve/veya agirlikça yaklasik %0.05 ila agirlikça yaklasik %20 Guerbet iyonik olmayan sürfaktanlari. Burada açiklandigi üzere kumas ve ev bakim ürünü gibi temizlik ve/veya islem bilesimi bir sivi çamasir deterjani, bir bulasik yikama deterjanidir. Kumas ve ev bakim ürünü gibi temizlik ve/veya islem bilesiminin sivi veya akti dahil uygun herhangi bir formda saglanmasi tasarlanir. Kumas ve ev bakim ürünü gibi bir temizlik ve/veya islem bilesimi, özellikle sivi bir formda oldugunda bir birim doz poset formunda olabilir ve tipik olarak kumas ve ev bakim ürünü gibi bir temizlik ve/veya islemi bilesimi en azindan kismen veya hatta tamamen suda çözünür bir poset ile çevrelenir. Ek olarak en az bir varyanti içeren kumas ve ev bakim ürünü gibi bir temizlik ve/veya islem bilesimi, kumas ve ev bakim ürünü gibi bir temizlik ve/veya islem bilesimi yukarida detayli sekilde açiklanan parametreler ve/veya karakteristiklerin herhangi bir kombinasyonuna sahip olabilir. Aksi belirtilmedikçe, burada verilen tüm bilesen veya bilesim düzeyleri bu bilesenin veya bilesimin aktif düzeyine atif yapar ve piyasadan temin edilebilen kaynaklarda mevcut olabilen safsizliklari, örnegin kalinti solventleri veya yan ürünleri kapsamaz. Enzim bilesen agirliklari toplam aktif proteini esas alir. Tüm yüzdeler ve oranlar aksi belirtilmedikçe agirlik esasinda hesaplanir. Tüm yüzdeler ve oranlar aksi belirtilmedikçe toplam bilesime göre hesaplanir. Örnek olarak verilen deterjan bilesimlerinde enzim düzeyleri toplam bilesimin agirligi esasinda saf enzim cinsinden ifade edilir ve deterjan terkip maddeleri aksi belirtilmedikçe toplam bilesimin agirligi esasinda ifade edilir. Mevcut bulusun temizlik bilesimleri, örnegin çamasir uygulamalari, sert yüzey temizlemesi, bulasik yikama uygulamalari ve protez disler, dis, saç ve cilt gibi kozmetik uygulamalar için avantajli bir sekilde kullanilir. Ayrica düsük sicaklikli solüsyonlardaki artmis etkinligin özel avantajlari nedeniyle mevcut bulusun enzimleri ideal olarak çamasir uygulamalarina uygundur. Ayrica mevcut bulusun enzimleri, granüler ve sivi bilesimlerinde kullanilir. Mevcut bulusa ait varyant proteazlari ayrica temizlik katki maddesi ürünlerinde kullanilir. Burada açiklandigi üzere düsük sicaklik solüsyonlu temizlik uygulamalari kullanim bulur. Burada açiklandigi üzere mevcut bulus, ek agartma etkinligi istendiginde bir yikama prosesine dahil etme için ideal sekilde uygun olan mevcut bulusa ait en az bir enzimi temizlik katki maddesi ürünlerini saglar. Bu tür örnekler bunlarla sinirli olmamak üzere düsük sicaklik solüsyonlu temizlik uygulamalarini içerir. Burada açiklandigi üzere katki ürünü, en basit formunda bir veya daha fazla proteazdir. Burada açiklandigi üzere katki maddesi, bir temizlik prosesine eklemeden önce dozaj formda paketlenir. Burada açiklandigi üzere katki maddesi, bir temizlik prosesine ekleme için dozaj formda paketlenir burada bir peroksijen kaynagi kullanilir ve artmis agartma etkinligi istenir. Uygun herhangi bir tekli dozaj birim formu, bunlarla sinirli olmamak üzere haplar, tabletler, jelkaplar veya diger tekli dozaj birimleri örnegin önceden ölçülmüs tozlar veya sivilar dahil mevcut bulus ile kullanim bulur. Bazi düzenlemelerde dolgu madde veya tasiyici materyaller, bu tür bilesimlerin hacmini arttirmak üzere dahil edilir. Uygun dolgu maddesi veya tasiyici materyaller bunlarla sinirli olmamak üzere çesitli sülfat, karbonat ve silikat tuzlarini ve ayrica talk, kil ve benzerini içerir. Sivi bilesimler için uygun dolgu maddesi veya tasiyici materyaller bunlarla sinirli olmamak üzere polioller ve dioller dahil su veya düsük moleküler agirlikli primer ve sekonder alkolleri içerir. Bu tür alkollerin örnekleri bunlarla sinirli olmamak üzere metanol, etanol, propanol ve izopropanol içerir. Burada açiklandigi üzere bilesimler, bu tür materyallerin yaklasik %5'i ila yaklasik %90'nini içerir. Asidik dolgu maddeleri, pH degerini azaltmak üzere kullanim bulur. Alternatif olarak burada açiklandigi üzere temizleme katki maddesi asagida tamamen açiklandigi üzere yardimci bilesenleri içerir. Mevcut temizleme bilesimleri ve temizleme katkilari, tek basina veya diger proteazlar ve/veya ek enzimler ile kombinasyon halinde burada saglanan proteaz varyantlarindan, daha spesifik olarak subtilisin varyantlarindan en az birinin etkili miktarini gerektirir. Enzimin gerekli miktari, mevcut bulusun bir veya birkaç proteaz varyantinin, daha spesifik olarak subtilisin varyantinin eklenmesi ile saglanabilir. Tipik olarak mevcut temizlik bilesimleri, yaklasik en az agirlikça yüzde 0.0001, yaklasik agirlikça yüzde mevcut bulusun varyant proteazlarindan en az birini içerir. Buradaki temizlik bilesimleri tipik olarak, aköz temizleme islemlerinde kullanim esnasinda yikama suyu, yaklasik 5.0 ila yaklasik 11.5 veya yaklasik 7.5 ila yaklasik .5 olan bir pH degerine sahip olacak sekilde formüle edilir. Sivi ürün formülasyonlari tipik olarak, yaklasik 3.0 ile yaklasik 9.0 veya yaklasik 3 ile yaklasik 5 olan saf bir pH degerine sahip olacak sekilde formüle edilir. Granüler çamasir ürünleri tipik olarak, yaklasik 9 ila yaklasik 11 olan bir pH degerine sahip olacak sekilde formüle edilir. Önerilen kullanim seviyelerinde pH degerinin kontrol edilmesine yönelik yöntemler, tampon, alkali, asit ve benzerlerinin kullanimini içerir ve teknikte uzman kisilerce iyi Uygun "düsük pH seviyeli temizlik bilesimleri" tipik olarak yaklasik 3 ile yaklasik 5 arasinda bir katkisiz pH seviyesine sahiptir ve tipik olarak bu tip bir pH ortaminda hidrolize olan yüzey aktiflerden yoksundur. Bu tip yüzey aktifler, en az bir etilen oksit grubuna sahip olan ve hatta yaklasik 1 ila yaklasik 16 mol etilen oksit içeren sodyum alkil sülfat yüzey aktifleri kapsar. Bu tip temizlik bilesimleri tipik olarak temizlik bilesiminin yaklasik 3 ila yaklasik 5 arasinda bir katkisiz pH seviyesine sahip olmasini saglamak üzere yeterli miktarda bir pH degistirici, örnegin sodyum hidroksit, monoetanolamin veya hidroklorik asit içerir. Bu tip bilesimler tipik olarak aside dayanikli en az bir enzim içerir. Bazi düzenlemelerde bilesimler sividir, diger düzenlemelerde ise katidir. Bu sivi bilesimlerin pH seviyesi genelde bir katkisiz pH olarak ölçülür. Bu kati bilesimlerin pH seviyesi bahsedilen bilesimin %10'Iuk kati solüsyonu olarak ölçülür, burada solvent olarak damitik su kullanilir. Burada açiklandigi üzere tüm pH ölçümleri aksi belirtilmedikçe 20°C'de yapilir. burada açiklandigi üzere, bulusun varyant proteazinin (proteazlarinin) bir granüler veya sivi bilesimde kullanildigi durumlarda, depolama esnasinda varyant proteazi granüler bilesimin diger bilesenlerinden korumak amaciyla varyant proteazin bir kapsüllenmis partikül formunda olmasi arzu edilebilir. Kapsülleme ayrica temizleme islemi esnasinda varyant proteazin mevcudiyetini kontrol etmeye yönelik bir yöntemdir. Burada açiklandigi üzere kapsülleme varyant proteazin (proteazlarin) ve/veya ilave enzimlerin performansini artirir. Bu baglamda, mevcut bulusun varyant proteazlari ilgili teknikte bilinen uygun herhangi bir kapsülleyici materyal ile kapsüllenir. Burada açiklandigi üzere kapsülleyici materyal tipik olarak mevcut bulusun varyant proteazina (proteazlarina) yönelik katalizörün en azindan bir kismini kapsüller. Kapsülleyici materyal tipik olarak suda çözünebilir ve/veya suda dagilabilir. Burada açiklandigi üzere, kapsülleyici materyal 0°C veya daha yüksek bir cam geçis sicakligina (Tg) sahip olabilir. Cam geçis sicakligi WO 97/11151'de daha ayrintili olarak tarif edilir. Kapsülleyici materyal tipik olarak karbonhidratlar, dogal veya sentetik zamklar, kitin, kitosan, selüloz ve selüloz türevleri, silikatlar, fosfatlar, boratlar, polivinil alkol, polietilen glikol, parafin vakslar ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilir. Bir karbonhidrat olmasi halinde kapsülleyici materyal tipik olarak monosakkaritler, oligosakkaritler, polisakkaritler ve bunlarin kombinasyonlari arasindan seçilir. Burada açiklandigi üzere kapsülleyici materyal bir nisastadir (bkz. örnegin EP O 922 499; US materyal, termoplastikler, akrilonitril, metakrilonitril, poliakrilonitril, polimetakrilonitril ve bunlarin karisimlari gibi plastikten mamul bir mikroküredir; piyasadan temin edilebilen kullanima sahip mikroküreler bunlarla sinirli olmamak kaydiyla EXPANCEL® PM 7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, Q-CEL® ve SPHERICEL® (PQ Corp., Valley Forge, PA) ürünlerini kapsar. Burada açiklandigi üzere mevcut bulusun varyant proteazlari özellikle, bunlarla sinirli olmamak üzere çamasir ve bulasik deterjanlari da dahil temizlik endüstrisinde kullanilir. Bu uygulamalar enzimleri çesitli çevresel streslere sokar. Mevcut bulusun varyant proteazlari, çesitli kosullar altindaki stabiliteleri nedeniyle halihazirda kullanilan birçok enzime göre avantaj saglar. Aslinda, yikamaya dahil olan proteazlarin maruz kaldigi degisken deterjan formülasyonlari, yikama suyu hacimleri, yikama suyu sicakliklari ve yikama süresi uzunluklarini içeren çesitli yikama kosullari mevcuttur. Ayrica, farkli cografi bölgelerde kullanilan deterjan formülasyonlari, yikama suyunda bulunan ilgili bilesenleri farkli konsantrasyonlarda içermektedir. Örnegin Avrupa deterjanlari tipik olarak yikama suyunda yaklasik 4500-5000 milyonda kisim (ppm) deterjan bileseni içerir, Japon deterjanlari ise tipik olarak yikama suyunda yaklasik 667 ppm deterjan bileseni içerir. Kuzey Amerika'da ve özellikle de ABD'de deterjanlar tipik olarak yikama suyunda yaklasik 975 ppm deterjan bileseni içerir. Düsük deterjan konsantrasyonlu bir sistem, yikama suyunda yaklasik 800 ppm'den düsük oranda deterjan bileseni içeren deterjanlari kapsar. Japon deterjanlari genelde düsük deterjan konsantrasyonlu sistemler olarak kabul edilir, çünkü yikama suyunda yaklasik 667 ppm deterjan bileseni içerir. Bir orta deterjan konsantrasyonu, yikama suyunda yaklasik 800 ppm ila yaklasik 2000 ppm arasinda deterjan bileseni içeren deterjanlari kapsar. Kuzey Amerika deterjanlari genelde orta deterjan konsantrasyonlu sistemler olarak kabul edilir, çünkü yikama suyunda yaklasik 975 ppm deterjan bileseni içerir. Brezilya'da yikama suyunda tipik olarak yaklasik 1500 ppm deterjan bileseni bulunur. Yüksek deterjan konsantrasyonlu bir sistem, yikama suyunda yaklasik 2000 ppm'den yüksek oranda deterjan bileseni içeren deterjanlari kapsar. Avrupa deterjanlari genelde yüksek deterjan konsantrasyonlu sistemler olarak kabul edilir, çünkü yikama suyunda yaklasik 4500-5000 ppm deterjan bileseni içerir. Latin Amerika deterjanlari genel olarak bol köpüklü fosfat yapici deterjanlardir ve Latin Amerika'da kullanilan deterjanlarin araligi hem orta hem de yüksek deterjan konsantrasyon düzeylerinin kapsamina girebilir, çünkü yikama suyunda 1500 ppm ila 6000 ppm deterjan bileseni içerir. Yukarida belirtildigi üzere, Brezilya'da tipik olarak yikama suyunda yaklasik 1500 ppm deterjan bileseni bulunur. Ancak diger Latin Amerika ülkeleri ile sinirli olmayan bol köpüklü fosfat yapici deterjan kullanan diger cografyalar, yikama suyunda yaklasik 6000 ppm kadar deterjan bileseni içeren yüksek deterjan konsantrasyonlu sistemlere sahip olabilir. Yukarida anlatilanlar dogrultusunda, dünya genelinde tipik yikama solüsyonlarinda deterjan bilesimlerinin konsantrasyonlarinin yaklasik 800 ppm'den düsük deterjan bilesimi oranlarindan ("düsük deterjan konsantrasyonlu cografyalar") (örnegin ("orta deterjan konsantrasyonlu cografyalar") (örnegin ABD'de yaklasik 975 ppm ve Brezilya'da yaklasik 1500 ppm) ve yaklasik 2000 ppm'den yüksek oranlara ("yüksek deterjan konsantrasyonlu cografyalar") (örnegin Avrupa'da yaklasik 4500 ppm ila yaklasik 5000 ppm ve bol köpüklü fosfat yapici madde kullanilan oografyalarda yaklasik 6000 ppm) kadar degistigi açiktir. Tipik yikama solüsyonlarinin konsantrasyonlari ampirik olarak belirlenir. Örnegin ABD'de tipik bir çamasir makinesi yaklasik 64.4 L yikama solüsyonu hacmine sahiptir. Dolayisiyla, yikama solüsyonunda yaklasik 975 ppm'lik bir deterjan konsantrasyonu elde etmek için 64.4 L yikama solüsyonuna yaklasik 62.79 9 deterjan bilesiminin eklenmesi gerekir. Bu miktar, tüketici tarafindan deterjan ile birlikte verilen ölçü kabi ile ölçülerek yikama suyuna ilave edilen tipik miktardir. Baska bir örnek olarak, farkli cografyalarda farkli yikama sicakliklari kullanilir. Japonya'da kullanilan yikama suyu sicakligi tipik olarak Avrupa'dan düsüktür. Örnegin Kuzey Amerika'da ve Japonya'da yikama suyu sicakligi tipik olarak yaklasik 10 ila yaklasik 30°C arasindadir (örnegin yaklasik 20°C'dir), Avrupa'da yikama suyu sicakligi ise tipik olarak yaklasik 30 ila yaklasik 60°C arasindadir (örnegin yaklasik 40°C'dir). Ancak enerji tasarrufu bakimindan birçok tüketici soguk suda yikamaya geçmektedir. Bunlarin yani sira bazi bölgelerde çamasir ve ayrica bulasik yikama uygulamalarinda tipik olarak soguk su kullanilmaktadir. Bazi düzenlemelerde, mevcut bulusa göre yaklasik 30°C veya yaklasik 15°C ila yaklasik 25°C arasindaki sicakliklarda ve ayrica yaklasik 15°C ila yaklasik 35°C arasindaki tüm diger kombinasyonlar ve 10°C ila 40°C arasindaki tüm diger kombinasyonlarda yikamaya uygun "soguk su deterjanini" kullanir. Baska bir örnek olarak, farkli cografyalar tipik olarak farkli su sertliklerine sahiptir. Su sertligi genellikle birim galonda bulunan karisik CaZ'IMgz* taneleri cinsinden ifade edilir. Sertlik, sudaki kalsiyum (Ca2*) ve magnezyum (Mgz*) miktarinin bir ölçüsüdür. ABD'deki sularin çogu serttir, ancak sertlik derecesi degiskenlik gösterir. Orta derecede içerir (milyonda kisimin tane/ABD galonu birimine dönüstürülmüs hali. ppm degerinin 17.1'e bölünmesi yoluyla elde edilen tane/galon esdegeridir). Su Tane/galon Milyonda kisim Yumusak <1.0 <17 Orta derecede sert 3.5 ila 7.0 60 ila 120 Çok sert 10.5 18O Avrupa su sertligi tipik olarak yaklasik 10.5 (örnegin yaklasik 10.5 ila yaklasik 20.0) tane/galon karisik Ca^°-*/Mg2+ seviyesinden yüksektir (örnegin yaklasik 15 tane/galon karisik Cay/Mg?) Kuzey Amerika su sertligi tipik olarak Japon su sertliginden yüksektir, ancak Avrupa su sertliginden düsüktür. Örnegin Kuzey Amerika su sertligi yaklasik 3 ile yaklasik 10 tane/galon, yaklasik 3 ile yaklasik 8 tane/galon veya yaklasik 6 tane/galon olabilir. Japon su sertligi tipik olarak Kuzey Amerika su sertliginden küçüktür ve genellikle yaklasik 4, örnegin yaklasik 3 tane/galon karisik Ca2*/Mg2+ seviyesinden düsüktür. Dolayisiyla burada, en az bir yikama kosulu kümesinde (örnegin su sicakligi, su sertligi ve/veya deterjan konsantrasyonu) sasirtici yikama performansi sergileyen istem 1'de tanimlanan varyant proteazlar açiklanir. Burada mevcut bulusun varyant proteazlarinin diger subtilisin proteazlari ile yikama performansi bakimindan karsilastirilabilir oldugu açiklanir. Burada mevcut bulusun varyant proteazlarinin, halihazirda piyasadan temin edilebilen subtilisin proteazlara kiyasla daha yüksek bir yikama performansi sergiledigi açiklanir. Burada artmis oksidatif stabilite, artmis termal stabilite, çesitli kosullar altinda artmis temizleme kapasiteleri ve/veya artmis selatlayici stabilitesi sergileyen varyant proteazlar açiklanir. Ayrica, mevcut bulusun varyant proteazlari, deterjan içermeyen temizlik bilesimlerinde tek basina veya yapici maddeler ve stabilizörler ile kombinasyon halinde kullanima sahiptir. Burada açiklandigi üzere temizlik bilesimi, mevcut bulusun en az bir varyant proteazini bilesimin agirligi esasinda yaklasik %0.00001 ila yaklasik %10'Iuk bir düzeyde içeren ve geriye kalaninda (örnegin bilesimin agirligi esasinda yaklasik %99.999 ila yaklasik açiklandigi üzere mevcut bulusun temizlik bilesimleri, bilesimin agirligi esasinda ile yaklasik %2 veya yaklasik %0.005 ila yaklasik %0.5'Iik bir düzeyde içeren ve geriye ihtiva eder. Burada açiklandigi üzere temizlik bilesimleri, temizlik performansi ve/veya kumas bakimi ve/veya bulasik yikama faydalari saglayan bir veya birkaç ek deterjan enzimini içerir. Uygun enzimlerin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere hemiselülazlar, selülazlar, peroksidazlar, proteazlar, ksilanazlar, Iipazlar, fosfolipazlar, esterazlar, kutinazlar, pektinazlar, pektat liyazlar, mannanazlar, keratinazlar, redüktazlar, oksidazlar, fenoloksidazlar, Iipoksijenazlar, ligninazlar, pullulanazlar, tannazlar, pentozanazlar, malanazlar, ß-glukanazlar, arabinozidazlar, hiyaluronidazlar, kondroitinazlar, Iakkazlar ve amilazlar veya her türlü kombinasyonlari veya karisimlarini içerir. Bazi düzenlemelerde amilaz ile birlikte proteaz, Iipaz, kutinaz ve/veya selülaz gibi klasik olarak uygulanabilen enzimleri içeren enzim kombinasyonu Burada saglanan proteaz varyantlarina, daha spesifik olarak subtilisin varyantlarina ek olarak mevcut bulusun bilesimlerinde uygun her türlü proteaz kullanilir. Uygun proteazlar, hayvansal, bitkisel veya mikrobiyal kökenli olanlari içerir. Burada açiklandigi üzere mikrobiyal proteazlar kullanilir. Burada açiklandigi üzere kimyasal veya genetik olarak modifiye edilmis mutantlar dahil edilir. Burada açiklandigi üzere proteaz, bir serin proteaz, tercihen mikrobiyal proteaz veya tripsin benzeri proteazdir. Alkali proteazlarin örnekleri, subtilisinler, özellikle Baci'l/us'tan derive edilenleri (örnegin, subtilisin, Ientus, amy/oliquefaci'ens, subtilisin Carlsberg, subtilisin 309, subtilisin 147 ve subtilisin 168) içerir. Ek örnekler, U.S. Patent No. RE içerir. Ek proteaz örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere tripsin (örnegin domuz veya sigir kökenli) ve WO 89/06270'te açiklanan Fusarium proteazini içerir. Bazi düzenlemelerde mevcut bulusta kullanilan ticari olarak temin edilebilir proteaz enzimleri, bunlarla sinirli olmamak üzere MAXATASE®, MAXACALTM, MAXAPEMTM, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT® OXP, PURAMAXTM, EXCELLASETM ve PURAFASTTM (Genencor): ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYMT'V', POLARZYME®, OVOZYME®, KANNASE®, LIQUANASE®, NEUTRASE®, RELASE® ve ESPERASE® (Novozymes); BLAPT'V' ve BLAPTM varyantlari (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Almanya) ve KAPiyi (B. alkalophilus subtilisin; Kao Corp., Tokyo, Japan) içerir. Çesitli proteazlar açiklanir. Burada açiklandigi üzere bunlarla sinirli olmamak üzere WO 07/044993ite açiklanan nötral metalloproteaz da dahil metalloproteazlar mevcut bulusta kullanilir. Ayrica mevcut bulusta uygun herhangi bir Iipaz kullanilir. Uygun Iipazlar, bunlarla sinirli olmamak üzere bakteriyel veya mantar kökenli olanlari içerir. Kimyasal veya genetik olarak modifiye edilmis mutantlar mevcut bulus tarafindan kapsanir. Faydali Iipazlarin örnekleri, Hum/cola /anuginosa Iipazi (Bakiniz örnegin EP 258 068 ve EP 305 216), Rhizomucor miehei lipazi (Bakiniz örnegin EP 238 023), Candida Iipazi, örnegin C. antarctica Iipazi (örnegin C. antarctica Iipazi A veya B; Bakiniz örnegin EP 214 761), Pseudomonas lipazlari örnegin P. alca/igenes Iipazi ve P. pseudoa/caligeneslipazi (Bakin/z örnegin EP 218 272), P. cepaci'alipazi (Bakiniz fluorescenslipazi, Bacilluslipazi (örnegin, B. subIi/i'slipazi [Dartois et al., Biochem. Ayrica bununla sinirli olmamak üzere Penicillium camemberti'ilipazi oryzae Iipazi da dahil klonlanmis birkaç Iipaz mevcut bulusun bazi düzenlemelerinde kullanilir. Bunlarla sinirli olmamak üzere Pseudomonas mendocina'dan (Bakiniz WO 88/0936?) derive edilen kutinaz ve Fusarium so/ani' pisi (BakinizWO 90/09446) derive dilen kutinaz da dahil kutinazlar gibi lipolitik enzimlerin diger türleri de mevcut bulusun bazi düzenlemelerinde kullanilir. Uygun ek Iipazlar, M1 LIPASETM, LUMA FASTTM ve LIPOMAXTM (Genencor); LIPEX®, LIPOLASE® ve LIPOLASE® ULTRA (Novozymes) ve LIPASE PTM "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Japonya) gibi ticari olarak temin edilebilen Iipazlari içerir. Burada açiklandigi üzere mevcut bulusun temizlik bilesimleri ayrica, bilesimin agirligina göre yaklasik %0.00001 ila yaklasik %10 ek lipaz seviyesinde lipaz içerir ve geri kalan kisim bilesimin agirligina göre yardimci temizlik materyalleridir. Mevcut bulusun diger bazi düzenlemelerinde mevcut bulusun temizlik bilesimleri ayni zamanda bilesimin Burada açiklandigi üzere uygun herhangi bir amilaz mevcut bulusta kullanilir. Bazi düzenlemelerde alkali solüsyonlarda kullanilmaya uygun herhangi bir amilaz (örnegin alfa ve/veya beta) kullanilir. Uygun amilazlar, bunlarla sinirli olmamak üzere bakteriyel veya mantar kökenli olanlari içerir. Bazi düzenlemelere kimyasal veya genetik olarak modifiye edilmis mutantlar dahil edilir. Mevcut bulusta kullanilan amilazlar, bunlarla sinirli olmamak üzere B. /i'cheni'formis'ten (Bakiniz örnegin, GB 1,296,839) elde edilen oi-amilazlari içerir. Mevcut bulusta kullanilan ticari olarak temin edilebilir amilazlar, bunlarla sinirli olmamak üzere DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, STAINZYME ULTRA® ve BANTM (Novozymes) ve POWERASETM, RAPIDASE® ve MAXAMYL® P'yi (Genencor) içerir. Burada açiklandigi üzere mevcut bulusun temizlik bilesimleri ayrica, bilesimin agirligina göre yaklasik %0.00001 ila yaklasik %10 ek amilaz seviyesinde amilazlar içerir ve geri kalan kisim, bilesigin agirligina göre yardimci temizlik materyalleridir. Burada açiklandigi üzere mevcut bulusun temizlik bilesimleri ayni zamanda, bilesimin amilazlar içerir. Burada açiklandigi üzere mevcut bulusun temizlik bilesimlerinde uygun herhangi bir selülaz kullanilir. Uygun selülazlar, bunlarla sinirli olmamak üzere bakteriyel veya mantar kökenli olanlari içerir. Bazi düzenlemelere kimyasal veya genetik olarak modifiye edilmis mutantlar dahil edilir. Uygun selülazlar, bunlarla sinirli olmamak üzere Hum/cola insolens selülazlarini (Bakiniz örnegin, U.S. Patent No. 4.435.307) içerir. Özellikle uygun selülazlar, renk bakim faydalarina sahip selülazlardir (Bakiniz örnegin, EP 0 495 257). Mevcut bulusta kullanilan ticari olarak temin edilebilir Selülazlar, bunlarla sinirli olmamak üzere CELLUZYME®, CAREZYME® (Novozymes) ve KAC-500(B)TM'yi (Kao Corporation) içerir. Burada açiklandigi üzere selülazlar, olgun dogal sus veya varyant selülazlarin parçalari veya fragmanlari olarak eklenir, burada N-terminalin bir parçasi silinir (Bakiniz örnegin U.S. Patent No. 5,874,276). Burada açiklandigi üzere mevcut bulusun temizlik bilesimleri ayrica, bilesimin agirligina göre yaklasik %0.00001 ila yaklasik %10 ek selülaz seviyesinde selülazlar içerir ve geri kalan kisim, bilesimin agirligina göre yardimci temizlik materyalleridir. Burada açiklandigi üzere mevcut bulusun temizlik bilesimleri ayni zamanda, yaklasik %0.0001 yaklasik %0.005 ila yaklasik %05 selülaz seviyesinde selülazlar içerir. Deterjan bilesimlerinde kullanilmaya uygun herhangi bir mannanaz da mevcut bulusta kullanilir. Uygun mannanazlar, bunlarla sinirli olmamak üzere bakteriyel veya mantar kökenli olanlari içerir. Bazi düzenlemelere kimyasal veya genetik olarak modifiye edilmis mutantlar dahil edilir. Mevcut bulusta kullanilan çesitli mannanazlar bilinir No. 6,440,991). Burada açiklandigi üzere mevcut bulusun temizlik bilesimleri ayrica, bilesimin agirligina göre yaklasik %0.00001 ila yaklasik %10 ek mannanaz seviyesinde mannanazlar içerir ve geri kalan kisim. bilesimin agirligina göre yardimci ek materyallerdir. Burada açiklandigi üzere mevcut bulusun temizlik bilesimleri ayni zamanda, bilesimin agirligina göre yaklasik %0.0001 ila yaklasik %10, yaklasik Burada açiklandigi üzere peroksidazlar, mevcut bulusun bilesimlerinde hidrojen peroksit veya bir kaynagi (örnegin perkarbonat, perborat veya persülfat) ile kombinasyon halinde kullanilir. Burada açiklandigi üzere oksidazlar, oksijen ile kombinasyon halinde kullanilir. Enzimlerin her iki türü, tercihen bir gelistirme maddesi kumaslar yikama çözeltisinde birlikte yikandiginda tekstil boyasinin boyali bir kumastan bir baska kumasa transferini önlemek amaciyla) amaciyla kullanilir. Uygun peroksidazlar/oksidazlar, bunlarla sinirli olmamak üzere bitkisel, bakteriyel veya mantar kökenli olanlari içerir. Kimyasal veya genetik olarak modifiye edilmis mutantlar burada açiklanir. Burada açiklandigi üzere mevcut bulusun temizlik bilesimleri ayrica, bilesimin agirligina göre yaklasik %0.00001 ila yaklasik %10 ek peroksidaz ve/veya oksidaz Seviyesinde peroksidaz ve/veya oksidaz enzimlerini içerir ve geri kalan kisim, bilesimin agirligina göre yardimci temizlik materyalleridir. Burada açiklandigi üzere mevcut bulusun temizlik bilesimleri ayni zamanda, bilesimin agirligina göre yaklasik %0.0001 yaklasik %0.005 ila yaklasik %05 peroksidaz ve/veya oksidaz enzimleri seviyesinde peroksidaz ve/veya oksidaz enzimlerini içerir. Burada açiklandigi üzere bunlarla sinirli olmamak üzere perhidrolazlar da dahil (Bakiniz örnegin,WO 05/056782) ek enzimler kullanilir. Ayrica burada açiklandigi üzere yukarida bahsedilen enzimlerin karisimlari, özellikle bir veya birkaç ek proteaz, amilaz, lipaz, mannanaz ve/veya en az bir selülaz burada kapsanir. Aslinda, bu enzimlerin çesitli karisimlarinin mevcut bulusta kullanilmasi öngörülür. Ayni zamanda varyant proteazin(proteazlarin) ve bir veya birkaç ek enzimin degisen seviyelerinin bagimsiz olarak, yaklasik %10'a kadar çikabilen bir aralikta olabilecegi, temizlik bilesiminin geri kalan kisminin yardimci temizlik materyalleri oldugu öngörülür. Yardimci temizlik materyallerinin spesifik seçimi, temizlenecek yüzey, esya veya kumasin ve kullanim esnasinda temizlik kosullarina yönelik istenen bilesim formunun (örnegin yikama deterjani kullanilarak) dikkate alinmasi ile kolay bir sekilde yapilir. Örnek olarak, mevcut bulusun varyant proteazlarinin kullanima sahip oldugu birtakim temizlik bilesimleri asagidaki paragraflarda daha ayrintili olarak tarif edilmektedir. Mevcut bulusun temizlik bilesimlerinin çamasir makinesi yikama yöntemi (yöntemleri) için uygun bilesimler olarak formüle edildigi bazi düzenlemelerde, mevcut bulusun bilesimleri tercihen en az bir yüzey aktif ve en az bir yapici bilesik ve ayrica organik polimerik bilesikler, agartici maddeler, ilave enzimler, köpük baskilayicilar, dagiticilar, kalsiyum sabunu dagiticilari, kir süspansiyonu ve yeniden tortulasmayi önleyici maddeler ve korozyon inhibitörlerinden seçilen bir veya daha fazla ek temizlik materyalini içerir. Bazi düzenlemelerde, çamasir yikama bilesimleri ayrica bir veya daha fazla yumusatici madde (yani ilave ek temizlik materyalleri olarak) içerir. Mevcut bulusun bilesimleri ayrica kati veya sivi formdaki deterjan katki maddesi ürünleri olarak kullanima sahiptir. Bu katki maddesi ürünlerinin konvansiyonel deterjan bilesimlerinin performansini desteklemesi ve/veya pekistirmesi amaçlanir ve bu ürünler temizleme isleminin herhangi bir asamasinda ilave edilebilir. Burada açiklandigi üzere, buradaki çamasir deterjani bilesimlerinin yogunlugu 20°C'de ölçüldügü üzere yaklasik 400 ila yaklasik 1200 g/Iitre arasinda degisir, ayrica açiklandigi üzere ise yaklasik 500 ila yaklasik 950 g/Iitre arasinda degisir. Burada açiklandigi üzere U.S. Patent No. 6,605,458'de açiklananlar gibi çesitli temizlik bilesimleri, mevcut bulusun varyant proteazlari ile kullanilir. Dolayisiyla bazi düzenlemelerde mevcut bulusun en az bir varyant proteazini içeren bilesimler, bir kompakt granüler kumas temizleme bilesimidir, diger düzenlemelerde bilesim, renkli kumaslarin yikanmasi için faydali bir granüler kumas temizleme bilesimidir; diger düzenlemelerde bilesim, yikama kapasitesi boyunca yumusama saglayan bir granüler kumas temizleme bilesimidir, ilave düzenlemelerde bilesim, bir agir hizmet tipi sivi kumas temizleme bilesimidir. Bazi düzenlemelerde, mevcut bulusun en az bir varyant gibi kumas temizleme bilesimleridir. Ayrica, mevcut bulusun varyant proteazlari, Avrupa veya Japon yikama kosullari altinda belirli kullanimlara sahip granüler çamasir deterjani bilesimlerinde kullanilir (bkz. örnegin U.S. Patent No. 6,610,642). Burada açiklandigi üzere mevcut bulus, burada saglanan en az bir varyant proteaz içeren sert yüzey temizleme bilesimlerini saglar. Burada açiklandigi üzere mevcut bulusun en az bir varyant proteazini içeren bilesimler, U.S. Patent No. bilesimidir. Burada, burada saglanan en az bir varyant proteazi içeren bulasik yikama bilesimleri açiklanir. Burada açiklanan mevcut bulusun en az bir varyant proteazini içeren bilesimidir. Burada, burada saglanan en az bir varyant proteazi içeren bulasik yikama bilesimleri açiklanir. Burada açiklanan mevcut bulusun en az bir varyant proteazini bilesimlerini içerir. Yukarida bahsedilen US Patent No. temizlik materyallerinin formülasyonlari ve açiklamalari, burada saglanan varyant proteazlar ile birlikte kullanilir. Mevcut bulusun temizlik bilesimleri, uygun olan herhangi bir formda formüle edilir ve formül yapan kisi tarafindan seçilen herhangi bir proses ile hazirlanir, bunlarin sinirlayici olmayan örnekleri, U.S. Patent No. ve 5,486,303'te açiklanir. Düsük pH degerli bir temizlik bilesimi istendiginde bu bilesimin pH degeri, monoetanolamin gibi bir materyalin veya HCI gibi asidik bir materyalin eklenmesi yoluyla ayarlanir. Burada açiklanan temizlik bilesimleri, bir yerin (örnegin bir yüzey, esya, sofra takimi, veya kumas) temizlenmesinde kullanima sahiptir. Tipik olarak, bir mevcut temizlik bilesiminin düzenlemesi yerin en azindan bir kismina katkisiz veya bir yikama çözeltisinde seyreltilmis formda temas ettirilir ve akabinde yer istege bagli olarak yikanir ve/veya durulanir. Mevcut bulusun amaçlari dogrultusunda "yikama'i islemi bunlarla sinirli olmamak kaydiyla ovalama ve mekanik çalkalamayi kapsar. Bazi düzenlemelerde, temizlik bilesimleri solüsyonda tipik olarak yaklasik 500 ppm ila yaklasik 15000 ppm'lik konsantrasyonlarda kullanilir. Yikama solventinin su oldugu durumlarda su sicakligi tipik olarak yaklasik 5°C ila yaklasik 90°C arasinda degisir ve yerin bir kumas içermesi halinde su:kumas kütle orani tipik olarak yaklasik 1:1 ila yaklasik 30:1 arasindadir. Uygun temizleme ve/veya islem yardimci maddeleri ile ilgili daha fazla detay asagida Kumas Renklendirme Ajanlari. Tiyofen azo boyaya ek olarak ek kumas tonlama boyalarinin eklenmesi tercih edilmemesine ragmen bilesim, bir veya daha fazla ek kumas renklendirme ajanlarini içerebilir. Uygun kumas renklendirme ajanlari boyalar, boya-kil konjugatlari ve pigmentleri içerir. Uygun boyalar poliester ve/veya naylon gibi sentetik dokuma kumaslar üzerindeki birikmeye kiyasla pamuk dokuma kumaslar üzerinde daha fazla birikenleri içerir. Ilave uygun boyalar, pamuga kiyasla poliester ve/veya naylon gibi sentetik lifler üzerinde daha fazla birikenleri içerir. Uygun boyalar küçük moleküllü boyalari ve polimerik boyalari içerir. Uygun küçük moleküllü boyalar, Direkt Mavi, Direkt Kirmizi, Direkt Viyole, Asit Mavi, Asit Kirmizi, Asit Viyole, Bazik Mavi, Bazik Viyole ve Bazik Kirmizi Renk Indeksi (C.I.) siniflandirmalarinda bulunan boyalar veya karisimlarindan olusan gruptan seçilen küçük moleküllü boyalari içerir. Küçük moleküllü boyalarin örnekleri Direkt Viyole 9, Direkt Viyole 35, Direkt Viyole 48, Direkt Viyole 51, Direkt Viyole 66, Direkt Viyole 99, Direkt Mavi 1, Direkt Mavi 71, Direkt Mavi Asit Siyah 1, Bazik Viyole 1, Bazik Viyole 3, Bazik Viyole 4, Bazik Viyole 10, Bazik Bazik Mavi 75, Bazik Mavi 159 Renk Indeksi (Society of Dyers and Colourists, Bradford, UK) numaralarindan olusan gruptan seçilenleri, Asit Viyole 17, Asit Viyole 43, Indeksi (Society of Dyers and Colourists, Bradford, UK) numaralarindan olusan gruptan seçilen küçük moleküllü boyalari içerir. Direkt Viyole küçük moleküllü boyalar tercih edilebilir. Asit Viyole 17, Direkt Mavi 71, Direkt Viyole 51, Direkt Mavi 1, Asit Kirmizi 88, Asit Kirmizi 150, Asit Mavi 29, Asit Mavi 113 ve karisimlarindan olusan gruptan seçilen boyalar tercih edilebilir. Uygun polimerik boyalar, kovalent olarak bagli kromojenleri (boya-polimer konjugatlari) içeren polimerler ve polimer omurgasinda ko-polimerize edilen kromojenler ve karisimlarina sahip polimerlerden olusan gruptan seçilen polimerik boyalari ve Liquitint® (Milliken, Spartanburg, South Carolina, USA) adi altinda satilan kumas- substantif renklendiriciler, en az bir reaktif boyadan olusturulan boya-polimer konjugatlari ve bir hidroksil kismi, bir primer amin kismi, bir sekonder amin kismi, bir tiyol kismi ve karisimlarindan olusan gruptan seçilen bir kismi içeren polimerlerden olusan gruptan seçilen bir polimerden olusan gmptan seçilen polimerik boyalari içerir. Burada açiklandigi üzere uygun polimerik boyalar, Liquitint® (Milliken, Spartanburg, South Carolina, USA) Viyole CT, bir reaktif mavi ile konjuge edilen karboksimetil selüloz (CMC), reaktif viyole veya reaktif kirmizi boya örnegin ürün kodu S-ACMC olan, AZO-CM-SELÜLOZ ürün adi altinda Megazyme, Wicklow, Irlanda tarafindan satilan C.I. Reaktif Mavi 19 ile konjuge edilen CMC, alkoksile trifeniI-metan polimerik renklendiriciler, alkoksile tiyofen polimerik renklendiriciler ve karisimlarindan olusan gruptan seçilen polimerik boyalari içerir. Tercih edilen ek renklendirme boyalari WO 08/8749? A1'de bulunan beyazlatma ajanlarini içerir. Bu beyazlatma ajanlari asagidaki yapi (I) ile karakterize edilebilir: burada R1 ve R2 bagimsiz olarak asagidakilerden seçilebilir: a) [(CH2CR'HO)X(CH2CR"HO)yH], burada R' H, CH3, CH2O(CH2CH2O)ZH ve karisimlarindan olusan gruptan seçilir; burada R" H, CH2O(CH2CH2O)ZH ve karisimlarindan olusan gruptan seçilir; burada x + y 5 5; burada y 2 1; ve burada 2 b) R1 = alkil, aril veya ariI alkil ve R2 = [(CH20R'HO)X(CH2CR"HO)yH] burada R' H, CHa, CH2O(CH2CH2O)ZH ve karisimlarindan olusan gruptan seçilir; burada R" H, CH2O(CH2CH2O)ZH ve karisimlarindan olusan gruptan seçilir; burada x + y 5 10; burada y 2 1; ve burada 2 = 0 ila 5; burada R3 H, (CH2CH2O)2H ve karisimlarindan olusan gruptan seçilir ve burada 2 = 0 ila 10; burada R4 (C1-C13)alkil, aril gruplari ve karisimlarindan olusan gruptan seçilir; ve d) burada R1 ve R2 1 ila 10 alkilen oksit biriminin ilavesini takiben bagimsiz olarak stiren oksit, glisidil metil eter, izobütil glisidil eter, izopropilglisidil eter, t-bütil glisidil eter, 2-etilhekzilglisidil eter ve glisidilhekzadesil eter amino asit ürününden seçilebilir. istem 5'te tanimlandigi üzere bulusa ait bilesime eklenebilen tercih edilen ek bir kumas renklendirme ajani, asagidaki yapi (Il) ile karakterize edilebilir: burada R' H, CH3, CH20(CH2CH20)ZH ve karisimlarindan olusan gruptan seçilir; burada R" H, CH20(CH20H20)2H ve karisimlarindan olusan gruptan seçilir; burada x + y 5 5; burada y 2 1; ve burada 2 = 0 ila 5. Ayrica tercih edilen ek bir renklendirme boyasi, asagidaki yapi (lll) ile karakterize edilebilir: Bu boya tipik olarak ortalama 3-10 EO grubuna, tercihen molekül basina 5 E0 grubuna sahip bilesiklerin bir karisimidir. bir ajan "Solvent Viyole 13"tür. Uygun boya kil konjugatlari en az bir katyonik/bazik boya ve bir smektit kil ve karisimlarini içeren gruptan seçilen boya kil konjugatlarini içerir. Bir diger açida uygun boya kil konjugatlari, C.I. Bazik Sari 1 ila 108, C.I. Bazik Turuncu 1 ila 69, C.I. Bazik ila 14, C.I. Bazik Kahverengi 1 ila 23, CI Bazik Siyah 1 ila 11'den olusan gruptan seçilen en az bir katyonik/bazik boyadan olusan gruptan seçilen boya kil konjugatlarini ve Montmorillonit kil, Hektorit kil, Saponit kil ve karisimlarindan olusan gruptan seçilen bir bili içerir. Yine bir diger açida uygun boya kil konjugatlari asagidakilerden olusan gruptan seçilen boya kil konjugatlarini içerir: Montmorillonit Bazik Mavi B7 C.I. 42595 konjugat, Montmorillonit Bazik Mavi Bg C.I. 52015 konjugat, Montmorillonit Bazik Viyole Montmorillonit Bazik Kirmizi R1 C.I. 45160 konjugat, Montmorillonit C.I. Bazik Siyah 2 konjugat, Hektorit Bazik Mavi B7 C.I. 42595 konjugat, Hektorit Bazik Mavi 89 C.I. Siyah 2 konjugat, Saponit Bazik Mavi B7 C.I. 42595 konjugat, Saponit Bazik Mavi 89 Bazik Siyah 2 konjugat ve karisimlari. Uygun pigmentler, flavantron, indantron, 1 ila 4 klorin atomu içeren klorlanmis indantron, pirantron, dikloropirantron, monobromodikIoropiratron, dibromodikloropiratron, tetrabromopiratron, perilen-3,4,9,10-tetrakarboksilik asid diimidden olusan gruptan seçilen pigmentleri içerir, burada imid gruplari sübstitüe edilmeyebilir veya, C1-C3-alkil veya bir fenil veya heterosiklik radikali ile sübstitüe edilebilir ve burada fenil ve heterosiklik radikalleri ek olarak suda çözünmeyen sübstitüentleri, antrapirimidinkarboksilik asit amidleri, violantron, izoviolantron, dioksazin pigmentleri, molekül basina 2 klorin atomu içerebilen bakir ftalosiyanin, polikloro-bakir ftalosiyanin veya molekül basina 14 bromin atomu içeren polibromokloro-bakir ftalosiyanin ve karisimlarini tasir. Pigment Mavisi 15 ila 20, özellikle Pigment Mavisi 15 ve/veya 16 özellikle tercih edilir. Diger uygun pigmentler of Ultramarin Mavi (C.I. Pigment Mavi 29), Ultramarin Viyole (C.I. Pigment Viyole 15) ve karisimlarindan olusan gruptan seçilenleri içerir. Uygun renklendirme ajanlari US 7,208,459 BZ'de daha detayli sekilde açiklanir. Enkapsülantlar. Bilesim bir enkapsülant içerebilir. Bir açida bir enkapsülant, bir iç ve dis yüzeye sahip bir dis katman, bir çekirdek içerir, söz konusu dis katman söz konusu çekirdegi kapsüller. Çekirdek tipik olarak asagidakilerden olusan gruptan seçilen materyali içerebilmesine ragmen herhangi bir çamasir bakim yardimci maddesini içerebilir: parfümler; patlaticilar; boyalar; böcek uzaklastiricilar; silikonlar; vakslar; kokular; vitaminler; kumas yumusatici ajanlar; bir açida cilt bakim ajanlari, parafinler; enzimler; anti-bakteriyel ajanlar; agarticilar; sensatlar ve karisimlari ve söz konusu dis katman, polietilenler; poliamidler; istege bagli olarak diger ko-monomerleri içeren polivinilalkoller; polistirenler; poliizoprenler; polikarbonatlar; poliesterler; poliakrilatlar; aminoplastlardan olusan gruptan seçilen bir materyali içerebilir, bir açida söz konusu aminoplast bir poliüre, poliüretan ve/veya poliüreüretan içerebilir, bir açida söz konusu poliüre polioksimetilenüreve/veya melamin formaldehit; poliolefinler; polisakkaritleri içerebilir; bir açida söz konusu polisakkarit aljinat ve/veya kitosan; jelatin; selak; epoksi reçineleri; vinil polimerler; suda çözünmeyen inoganikler; silikon ve karisimlarini içerebilir. Tercih edilen enkapsülantlar parfüm içerir. Tercih edilen enkapsülantlar, melamin formaldehit ve/veya çapraz bagli melamin formaldehit içerebilen bir dis katman içerir. Tercih edilen enkapsülantlar bir çekirdek materyali ve bir dis katman içerir, söz konusu çekirdek materyali en azindan kismen çevreleyen söz konusu dis katman açiklanir. Söz konusu enkapsülantlarin en az %75'i, %85`I veya hatta %90'ni 0.2 MPa ila 10 MPa arasinda kirilma mukavemetine ve baslangiçtaki toplam enkapsüle faydali ajana dayanan %0 ila %20 veya hatta %10 veya %5'ten daha az bir faydali ajan sizintiya sahip olabilir. söz konusu enkapsülantlarin en az %75`i, %85'i veya hatta veya hatta 15 mikron ila 40 mikron arasinda bir partikül boyutuna sahip olabilenler ve/veya (ii) söz konusu enkapsülantlarin en az %75'i, %85'i veya hatta %90'ninin 30 kalinligina sahip olabilenler tercih edilir. Formaldehit tutucular, örnegin sulu bir kapsül karisiminda enkapsülantlar ile kullanilabilir ve/veya enkapsülantlar bu tür bilesimine eklenmeden önce, sirasinda veya sonrasinda bir bilesime eklenebilir. Uygun kapsüller yapilabilir. Alternatif olarak uygun kapsüller Appleton Papers Inc. of Appleton, Wisconsin USA'dan satin alinabilir. Tercih edilen bir açida bilesim, tercihen enkapsülantlara ek olarak bir yardimci çöktürme maddesi içerebilir. Tercih edilen yardimci çöktürme maddeleri katyonik ve noniyonik polimerlerden olusan gruptan seçilir. Uygun polimerler istege bagli olarak akrilik asit ve akrilamid içeren gruptan seçilen bir veya daha fazla monomer ile katyonik nisastalar, katyonik hidroksietilselüloz, polivinilformaldehit, keçiboynuzu zamki, mannan, ksiloglukanlar, demirhindi zamki, polietilenteraftalat ve dimetilaminoetil metakrilat içeren polimerleri içerir. Parfüm. Bulusa ait tercih edilen bilesimler parfüm içerir. Tipik olarak bilesim, WOO8/87497'de açiklanan gruptan seçilen bir veya daha fazla parfüm ham materyallerini içeren bir parfüm içerir. Ancak bir çamasir bakim bilesiminde faydali herhangi bir parfüm kullanilabilir. Parfümün bulusa ait bilesimlere eklenmesi için tercih edilen bir yöntem, suda çözünür hidroksilik bilesik veya melamin-formaldehit veya modifiye edilmis polivinil alkol içeren enkapsüle bir parfüm partikülü vasitasiyla gerçeklesir. Bir açida enkapsülant (a) bir veya daha fazla suda çözünür hidroksilik bilesigi içeren en azindan kismen suda çözünen kati matriksi, tercihen nisasta ve (b) kati matriks ile kapsüllenen bir parfüm yagi içerir. Ilave bir açida parfüm, bir Schiff bazi olusturmak amaciyla tercihen bir polietilenimin olmak üzere bir poliamin ile önceden kompleks hale getirilebilir. Polimerler. Bilesim bir veya daha fazla polimer içerebilir. Örnekler istege bagli olarak modifiye edilen karboksimetilseüloz, poli(viniI-pirolid0n), poli (etilen glikol), poli(vinil alkol), poli(vinilpiridin-N-0ksit), poli(vinilimidazol), polikarboksilatlar örnegin poliaakrilatlar, maleik/akrilik asit kopolimerler ve laurii metakrilat/akrilik asit ko- polimerleri içerir. Bilesim, asagidaki genel yapiya: bis((C- bis((CzH5O)(C2H4O)n), burada n = 20 ila 30, ve x = 3 ila 8, veya sülfatli veya sülfonlu varyantlarina sahip bilesik gibi bir veya daha fazla amfifilik temizleme polimerlerini içerebilir. Bilesim tercihen kumaslar ve yüzeylerden gres yagi partiküllerini uzaklastiracaklari sekilde dengeli hidrofilik ve hidrofobik özelliklere sahip amfifilik alkoksile gres yagi temizleme polimerlerini içerir. Tercih edilen amfifilik alkoksile gres yagi temizleme polimerleri, bir çekirdek yagi ve bu çekirdek yagiya baglanan birçok alkoksilat grubu içerir. Bunlar tercihen bir iç polietilen oksit blogu ve bir dis polipropilen oksit bloguna sahip alkoksile polialkileniminleri içerebilir. Tipik olarak bunlar, agirlikça %0.005 ila 10, genellikle agirlikça %05 ila 8 olan miktarlarda bulusa ait bilesimlere eklenebilir. Poliakrilatlardan hazirlananlar gibi alkoksile polikarboksilatlar, ek gres yagi uzaklastirma performansi saglamak üzere burada kullanislidir. Bu tür materyaller WO birim basina bir etoksi yari zincirine sahip poliakrilatlari içerir. Yari zincirler, - (CHzCHzO)m(CH2)nCH3formülüne sahiptir burada m, 2-3`tür ve n, 6-12'dir. Yan zincirler, bir "kombinasyonel" polimer tipinde yapi saglamak üzere poliakrilat olarak yaklasik 2000 ila yaklasik 50,000 araligindadir. Bu tür alkoksile polikarboksilatlar, buradaki bilesimin agirlikça yaklasik %0.05'i ila yaklasik %10`nunu içerebilir. Kosüifaktanlarin ve diger yardimci bilesenlerin karisimlari bir amfifilik greft ko-polimeri ile kullanim için özelikle uygundur. Tercih edilen amfifilik greft ko-polimerleri (i) polietilen glikol omurgasi ve (ii) polivinil asetat, polivinil alkol ve karisimlarindan seçilen en az bir pendatif kisim içerir. Tercih edilen bir amfifilik greft ko-polimer BASF'den tedarik edilen Sokalan HP22'dir. Uygun polimerler rastgele greft kopolimerleri, tercihen bir polietilen oksit omurgasi ve çoklu polivinil asetat yan zincirine sahip bir polivinil asetat grefte edilmis polietilen oksit kopolimeri içerir. Polietilen oksit omurgasinin moleküler agirligi tercihen yaklasik 600'dür ve polietilen oksidin polivinil asetata agirlik orani 50 etilen oksit birimi basina yaklasik 40 ila 60 ve en fazla 1 greft noktasidir. Tipik miktarlarda bulusa ait bilesimlere eklenir. Tercihen bilesim, maleat/akrilat rastgele kopolimer veya poliaktilat homopolimer gibi bir veya daha fazla karboksilat polimer olan bir moleküler agirliga sahip bir poliakrilat homopolimerdir. Tipik olarak bunlar, bilesimlere eklenir. Tercihen bilesim, bir veya daha fazla toprak salim polimeri içerir. Örnekler asagidaki Formüllerin (IV), (V) veya (VI) biri ile tanimlanan bir yapiya sahip toprak salim polimerleri içerir: (IV) -[(OCHR1-CHR2)a-O-OC-Ar-CO-]d (V) -[(OCHR3-CHR4)b-O-OC-sAr-CO-]e (vi) -[(OCHR5-CHR6)c-OR7]f 3, b ve c, 1 ila 200idür; d, e ve f, 1 ila 50'dir; Ar, bir 1,4-sübstitüe fenilendir; sAr, 803Me ile 5 pozisyonunda sübstitüe edilen 1,3-sübstitüe edilen fenilendir; Me Li, K, Mg/2, Cat/2, AI/3, amonyum, m0no-, di-, tri-, veya tetraalkilamonyum burada alkil gruplari C1-C13 alkil veya C2-C1o hidroksialkildir, veya karisimlaridir; R1, R2, R3, R4, R5 ve R6, H veya C1-C18 n- veya izo-alkilden bagimsiz olarak seçilir; ve R7 bir lineer veya dallanmis C1-C1g alkil veya bir lineer veya dallanmis 02-030 alkenil veya 5 ila 9 karbon atomu olan bir sikloalkil grubu veya bir Cs-Cgo aril grubu veya bir Cs-Cao arilalkil grubudur. Uygun toprak salim polimerleri, Rhodia tarafindan tedarik edilen RepeI-o-tex SF, SF-2 ve SRP6 dahil RepeI-o-tex polimerleri gibi poliester toprak salim polimerleridir. Diger uygun toprak salim polimerleri, Clariant tarafindan tedarik edilen Texcare SRA100, içerir. Diger uygun toprak salim polimerleri, Sasol tarafindan tedarik edilen Marloquest SL gibi Marloquest polimerleridir. Tercihen bilesim, alkil selüloz, alkil alkoksialkil selüloz, karboksialkil selüloz, alkil karboksialkil selülozdan seçilenler dahil bir veya daha fazla selülozik polimer içerir. Tercih edilen selülozik polimerler karboksimetil selüloz, metil selüloz, metil hidroksietil selüloz, metil karboksimetil selüloz ve karisimlarini içeren gruptan seçilir. Bir açida karboksimetil selüloz 0.5 ila 0.9 arasinda bir karboksimetil sübstitüsyon derecesine ve Enzimler. Tercihen bilesim bir veya daha fazla enzim içerir. Tercih edilen enzimler, temizleme performansi ve/veya kumas bakim faydalari saglar. Uygun enzimlerin örnekleri bunlarla sinirli olmamak üzere hemiselülazlar, peroksidazlar, proteazlar, selülazlar, ksilanazlar, lipazlar, fosfolipazlar, esterazlar, kutinazlar, pektinazlar, mannanazlar, pektat liyazlar. keratinazlar, redüktazlar, oksidazlar, fenoloksidazlar, glukanazlar, arabinozidazlar, hiyaluronidazlar, kondroitinazlar, Iakkazlar ve amilazlar veya karisimlarini içerir. Tipik bir kombinasyon, örnegin amilaz ile baglantili sekilde bir proteaz ve Iipaz içerebilen bir enzim çözeltisidir. Bilesim içinde bulundugunda yukarida açiklanan ek enzimler bilesimin agirliginda yaklasik %0.00001 ila yaklasik %2, yaklasik seviyelerinde bulunabilir. Proteazlar. Tercihen bilesim, bir veya daha fazla proteaz içerir. Uygun proteazlar subtilisinler (EC 3.4.21.62) gibi, nötral veya alkalin mikrobiyal serin proteazlar dahil metalloproteazlar ve serin proteazlari içerir. Uygun proteazlar hayvan, bitkisel veya mikrobiyal kökenli olanlari içerir. Bir açida bu tür uygun proteaz mikrobiyal kökenli olabilir. Uygun proteazlar, yukarida açiklanan uygun proteazlarin kimyasal olarak veya genetik olarak modifiye edilmis mutantlarini içerir. Bir açida uygun proteaz, bir alkalin mikrobiyal proteaz ve/veya bir tripsin tipinde proteaz gibi bir serin proteazi olabilir. Uygun nötral veya alkalin proteaz örnekleri sunlari içerir: ve W009/021867'de açiklanan Baci//us /entus, B. alkalophi'lus, B. subtilis, B. amy/oliquefaciens, Baci'llus pumilus ve Baci'l/us gibsonii gibi Bacil/us'dan türetilenler dahil subtilisinler (EC 3.4.21.62). 05/052146'da açiklanan Cellumonas'dan türetilen kemotripsin proteazlari dahil tripsin (örnegin domuz veya bovin kökenli) gibi tripsin tipi veya kemotripsin tipi proteazlar. (c) WO 07/044993A2ide açiklanan Bacillus amy/oliquefaciens'dan türetilenler dahil metalloproteazlar. Tercih edilen proteazlar, Baci//us gibsonii veya Baci'llus Lentus'dan türetilenleri içerir. Uygun ticari olarak temin edilebilir proteaz enzimleri Novozymes A/S (Danimarka) tarafindan Alcalase®, Savinase®, Primase®, Durazym®, P0Iarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase Ultra®, Savinase Ultra®, Ovozyme®, Neutrase®, Everlase® ve Esperase® ticari adi altinda satilanlari, Genencor International tarafindan Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Properase®, Purafect®. Purafect Prime®, Purafect Ox®, FN3®, FN®, Excellase® ve Purafect OXP® ticari adi altinda satilanlari, Solvay Enzymes taragindan Opticlean® ve Optimase® ticari adi altinda satilanlari, - + V199M + V205I + L217D) olarak adlandirilan Henkel/ Kemira'dan temin edilenleri ve alka/ophi'lus subtilisi'n ) içerir. Amilazlar. Tercihen bilesim bir amilaz içerebilir. Uygun alfa-amilazlar bakteriyel veya mantar kökenli olanlari içerir. Kimyasal olarak veya genetik olarak modifiye edilmis mutantlar (varyantlar) dahil edilir. Tercihen bir alkalin alfa-amilaz, bir Bacillus, Bacillus susundan türetilir. Tercih edilen amilazlar sunlari içerir: varyantlar, özellikle WO 96/23874'te SEQ ID No. 2 olarak listelenen enzime karsi asagidaki pozisyonlarin bir veya daha fazlasinda sübstitüsyonlara sahip olarak listelenen AA560 enzimine karsi asagidaki pozisyonlarda bir veya daha tercihen ayrica D183* ve G184* delesyonlarini içeren. Bacillus SP722'den dogal sus enzim, özellikle 183 ve 184 pozisyonlarinda delesyonlara sahip varyantlar ve WO 00/60060'ta açiklanan varyantlar. (d) Bacillus sp. dogal sus enzim ile en az %95 özdeslik sergileyen varyantlar, özellikle asagidaki mutasyonlar M202, Tercihen söz konusu amilaz bir veya daha fazla M202L, M202V, M202S, M202T mutasyonlarini içerenler özellikle tercih edilir. NO: 1 veya SEQ ID No:2 ile en az %90 özdeslik sergileyenler, Geobaci/Ius Stearophermophilus'dan dogal sus enzim veya bunun kesik versiyonu. Uygun ticari olarak temin edilebilir alfa-amilazlar DURAMYL®, LIQUEZYME®, TERMAMYL®, TERMAMYL ULTRA®, NATALASE®, SUPRAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, FUNGAMYL® and BAN® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Danimarka), KEMZYM® AT 9000 Biozym Biotech Trading GmbH Wehlistrasse 27b A- 1200 Wien Avusturya, RAPIDASE® , PURASTAR®, ENZYSIZE®, OPTISIZE HT PLUS®, POWERASE® and PURASTAR OXAM® (Genencor lnternational Inc., Palo Alto, California) ve KAM® (Kao, 14-10 Nihonbashi Kayabacho, 1-chome, Chuo-ku Tokyo 103-8210, Japonya) içerir. Bir açida uygun amilazlar NATALASE®, STAINZYME® ve STAINZYME PLUS® ve karisimlarini içerir. açiklananlar gibi "birinci döngü Iipazlari" dahil bir veya daha fazla Iipaz içerir. Tercih edilen Iipazlar birinci yikama Iipazlaridir. Bulusa ait bir düzenlemede bilesim, bir birinci yikama Iipazi içerir. Birinci yikama Iipazlari, bir amino asit dizisine sahip bir polipeptittir bu dizi: (a) Humicola ianuginosa susu DSM 4109idan türetilen dogal sus Iipaz ile en az olarak yüklü bir amino asit ile E1 ve Q249'a ait 15A içerisinde üç boyutlu yapi yüzeyinde elektriksel olarak nötral veya negatif olarak yüklü amino asit sübstitüsyonunu içerir ve (c) C-terminalde bir peptit ilavesi içerir ve/veya (d) N-terminalde bir peptit ilavesi içerir ve/veya (e) asagidaki sinirlamalari karsilar: i) söz konusu dogal sus Iipazin E210 pozisyonunda negatif bir amino asit içerir; ii) söz konusu dogal sus Iipazin 90-101 pozisyonuna karsilik gelen bölgede negatif yüklü bir amino asit içerir ve iii) söz konusu dogal sus Iipaza ait N94'e karsilik gelen bir pozisyonda nötral veya negatif bir amino asit içerir ve/veya söz konusu dogal sus Iipazin 90-101 pozisyonlarina karsilik gelen bölgede negatif veya nötral net elektrik yüküne sahiptir. Bir veya daha fazla T231 R ve N233R mutasyonu içeren Thermomyces Ianuginosus'dan dogal sus Iipaz varyantlari tercih edilir. Dogal sus dizi, Swissprot erisim numarasi Swiss-Prot olan 269 amino asittir. Tercih edilen Iipazlar, Lipex® ve Lipolex® ve Lipoclean® ticari adlari altinda satilanlari Endoglukanazlar. Diger tercih edilen enzimler US7,141,40382'de amino asit dizisi SEQ ID NO:2'ye en az %90, %94, %97 ve hatta %99 özdesligi olan bir diziye sahip Bacillus cinsinden bir elemana endojenöz bir bakteriyel polipeptit ve karisimlari dahil endo-beta-1,4-glukanaz aktivitesi (EC. 3.2.1.4) sergileyen mikrobiyal türevli endoglukanazlari içerir. Uygun endoglukanazlar Celluclean® ve Whitezyme® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Danimarka) ticari adlari altinda satilir. Pektat Liyazlar. Diger tercih edilen enzimler Pectawash®, Pectaway®, Xpect® aticari adlari altinda satilan pektat Iiyazlari ve Mannaway® (tümü Novozymes A/S'den, Bagsvaerd, Danimarka), ve Purabrite® (Genencor International Inc., Palo Alto, Kaliforniya) ticari adlari altinda satilan mannazlari içerir. Agartma Ajanlari. Bilesimin bir veya daha fazla ajani içermesi tercih edilebilir. agartma katalizörlerinden baska uygun agartma ajanlari foto agarticilar, agartma aktivatörleri, hidrojen peroksit, hidrojen peroksit kaynagi, önceden olusturulmus perasitler ve karisimlarini içerir. Genellikle bir agartma ajani kullanildiginda mevcut bulusa ait bilesimler söz konusu bilesimin agirliginca yaklasik %0.1 ila yaklasik %50 veya hatta yaklasik %0.1 ila yaklasik %25 agartma ajani veya agartma ajani karisimlarini içerebilir. Uygun agartma ajanlarinin örnekleri sunlari içerir: (1) foto agarticilar örnegin sülfonlu çinko ftalosiyanin sülfonlu alüminyum ftalosiyanin, ksanten boyalar ve karisimlari; (2) önceden olusturulan perasitler: Uygun önceden olusturulmus perasitler bunlarla sinirli olmamak üzere önceden olusturulmus peroksiasitler veya tuzlari, tipik olarak bir perkarboksilik asit ve tuzlari, perkabonik asitler ve tuzlaru, perimidik asitler ve tuzlaru, peroksimonosülfürik asitler ve tuzlari, örnegin Oxone® ve karisimlarindan olusan gruptan seçilen bilesikleri içerir. Uygun örnekler peroksikarboksilik asitleri veya tuzlari veya peroksisülfonik asitler veya tuzlarini içerir. Burada kullanim için uygun tipik peroksikarboksilik asit tuzlari, asagidaki kimyasal formüle karsilik gelen bir kimyasal yapiya sahiptir: burada: R14 alkil, aralkil, sikloalkil, aril veya heterosiklik gruplarindan seçilir; R14 grubu lineer veya dallanmis, sübstitüe veya sübstitüe edilmemis olabilir: perasit hidrofobik oldugunda 6 ila 14 karbon atomuna veya 8 ila 12 karbon atomuna sahiptir ve perasit hidrofilik oldugunda 6`dan daha az karbon atomuna veya hatta 4'ten daha az karbon atomuna sahiptir ve Y, elektrik yük nötralligini elde eden uygun herhangi bir karsi iyondur, tercihen Y hidrojen, sodyum veya potasyumdan seçilir. Tercihen R14 lineer veya dallanmis, sübstitüe edilmis veya sübstitüe edilmemis Ce.9 alkildir. Tercihen peroksiasit veya tuzu peroksihekzanoik asit, peroksiheptanoik asit, peroksioktanoik asit, peroksinonanoik asit, peroksidekanoik asit, herhangi bir tuzu veya herhangi bir kombinasyonundan seçilir. Özellikle tercih edilen peroksiasitler ftalimido-peroksi-alkanoik asitler, özellikle s-ftalimido peroksi hekzanoik asittir (PAP). Tercihen peroksiasit veya tuzu, 30°C ila 60°C araliginda bir erime noktasina sahiptir. Önceden olusturulan peroksiasit veya tuzu ayrica tipik olarak asagidaki kimyasal formüle karsilik gelen bir kimyasal yapiya sahip bir peroksisülfonik asit veya tuzu olabilir: R15-g_0_8 % burada: R15 alkil, aralkil, sikloalkil, aril veya heterosiklik gruplardan seçilir; R15 grubu lineer veya dallanmis, sübstitüe edilmis veya sübstitüe edilmemis olabilir ve Z, elektrik yük nötralligini elde eden uygun herhangi bir karsi iyondur, tercihen Z hidrojen, sodyum veya potasyumdan seçilir. Tercihen R15 lineer veya dallanmis, sübstitüe edilmis veya sübstitüe edilmemis C444, tercihen Ce-14 alkildir. Tercihen bu tür agartma bilesenleri bulus bilesimlerinde %0.01 ila 50, en çok tercih edildigi üzere %0.1 ile %20 miktarinda bulunabilir. (3) hidrojen peroksit kaynaklari, örnegin perborat (genellikle mono- veya tetra- hidrat), perkarbonat, persülfat, perfosfat, persilikat tuzlari ve karisimlari gibi alkali metal tuzlaru dahil inorganik perhidrat tuzlari. Bulusun bir açisinda inorganik perhidrat tuzlari perborat. perkarbonat ve karisimlarindan olusan gruptan seçilir. Kullanildiginda inorganik perhidrat tuzlari tipik olarak kumas ve ev bakim ürünü gibi temizlik ve/veya islem bilesiminin agirlikça %005 ila 40'i veya agirlikça %1 ila 30'u olan miktarlarda bulunur ve tipik olarak kaplanabilen kristalin bir kati olarak kumas ve ev bakim ürünleri gibi bu tür temizleme ve/veya islem bilesimine eklenir. Uygun kaplamalar alkali metal silikat, karbonat veya borat tuzlari veya karisimlari gibi inorganik tuzlari veya suda çözünen veya dagilabilen polimerler, vakslar, yaglar veya yagli sabunlar gibi organik materyalleri içerir; ve (4) R-(C=O)-L formülüne sahip agartma aktivatörleri burada R, bir alkil grubudur, istege bagli olarak dallanmistir, agartma aktivatörü hidrofobik oldugunda 6 ila 14 karbon atomuna veya 8 ila 12 karbon atomuna ve agartma aktivatörü hidrofilik oldugunda 6'dan daha az karbon atomuna veya hatta 4'ten daha az karbon atomuna sahiptir ve L, ayrilma grubudur. Uygun ayrilma grubu örnekleri benzoik asit veya türevleri - özellikle benzen sülfonattir. Uygun agartma aktivatörleri dodekanoil oksibenzen sülfonat, dekanoil oksibenzen sülfonat, dekanoil oksibenzoik asit veya tuzlari, 3,5,5-trimetil hekzanoiloksibenzen sülfonat, tetraasetil etilen diamin (TAED) ve nonanoiloksibenzen sülfonat (NOBS) içerir. Uygun agartma aktivatörleri ayrica WO 98/17767'de açiklanir. Uygun herhangi bir agartma aktivatörü kullanildiginda bulusun bir açisinda söz konusu bilesim NOBS, TAED (5) Agartma Katalizörleri. Mevcut bulusa ait bilesimler ayrica bir peroksiasit ve/veya tuzundan bir oksijen atomunu kabul edebilen ve oksijen atomunu oksidize edilebilir bir substrata transfer edebilen bir veya daha fazla agartma katalizörü içerebilir. Uygun agartma katalizörleri bunlarla sinirli olmamak üzere sunlari içerir: iminyum katyonlari ve poliiyonlar; iminyum zwitterionlar; modifiye edilmis aminler; modifiye edilmis amin oksitler; N-sülfonil iminler; N-fosforil iminler; N-asil iminler; tiyadiazol dioksitlerI perfloroiminler; siklik seker ketonlari ve alfa amino ketonlar ve karisimlari. açiklanan sekildedir. Teoriye bagli kalinmak istenmeksizin bulusçular, yukarida açiklanan sekilde elektrofillik ve hidrofobisitenin kontrol edilmesinin, agartma bileseninin sadece büyük ölçüde daha hidrofobik olan ve oldukça elektrofilik oksidanlar araciligiyla agartmaya duyarli olan, görünür kromoforlar dahil, elektron bakimindan zengin topraklari içeren kumas alanlarina dagitilmasini sagladigini düsünür. Burada açiklandigi üzere agartma katalizörü, asagidaki genel formüle göre bir yapiya sahiptir: burada R13 2-etilhekzil, 2-propilheptil, 2-bütiloktil, 2-pentil0ktil, 2-hekzildesil, n- dodesil, n-tetradesil, n-hekzadesil, n-oktadesil, izo-nonil, izo-desil, izotridesil ve izo- pentadesilden olusan gruptan seçilir; (6) Bilesim tercihen katalitik metal komplekslerini içerebilir. Metal içeren agartma katalizörünün tercih edilen bir türü, bakir, demir, titanyum, rutenyum, tungsten, molibdenum veya manganez katyonlari gibi tanimlanmis katalitik agartma aktiviteye sahip bir geçis metal katyonu, çinko ve alüminyum katyonlari gibi az veya sifir katalitik agartma aktivitesine sahip yardimci bir metal katyonu ve katalitik ve yardimci metal katyonlari, özellikle etilendiaminetetraasetik asit, etilendiaminetetra(metilenfosfonik asit) ve suda çözünen tuzlari için tanimlanmis stabilite sabitlerine sahip bir tecrit edici madde içeren bir katalizör sistemidir. Bu tür katalizörler U.S. 4,430,243'te açiklanir. istenmesi halinde buradaki bilesim, bir manganez bilesigi yoluyla katalize edilebilir. Bu tür bilesikler ve kullanim seviyeleri teknikte iyi bilinir ve örnegin U.S. 5,576,282'de açiklanan manganez bazli katalizörleri içerir. Burada faydali olan kobalt agartma katalizörleri bilinir ve örnegin U.S. 5,597,936; U.S. ,595,967'de ögretilenler gibi bilinen prosedürler ile kolay bir sekilde hazirlanabilir. Buradaki bilesimler ayrica uygun sekilde bispidonlar gibi ligandlarin (WO 05/042532 A1) ev/veya "MRL" olarak kisaltilan makrolisilik sert ligandlarin bir geçis metali kompleksini içerebilir. Pratik bir konu olarak ve sinirlama olmaksizin buradaki bilesimler ve prosesler, aköz yikama ortaminda yüz milyon aktif MRL türü basina en az bir parça sirasini saglamak üzere ayarlanabilir ve tipik olarak yikama çözeltisinde yaklasik 0.005 ppm ila yaklasik 25 ppm, yaklasik 0.05 ppm ila yaklasik 10 ppm, veya hatta yaklasik 0.1 ppm ila yaklasik 5 ppm MRL saglayacaktir. Mevcut geçis metali agartma katalizöründeki uygun geçis metalleri örnegin manganez, demir ve kronyum içerir. Uygun MRL'Ier 5,12-dietiI-1,5,8,12- tetraazabisikl0[6.6.2]hekzadekan içerir. gibi bilinen prosedürler ile kolay bir sekilde hazirlanir. Mevcut oldugunda hidrojen peroksit/perasit ve/veya agartma aktivatörü kaynagi genellikle kumas ve ev bakim ürünü gibi temizlik ve/veya islem bilesimine dayanarak agirlikça yaklasik %01 ila yaklasik 60, agirlikça yaklasik %05 ila yaklasik 40 veya hatta agirlikça yaklasik %0.6 ila yaklasik 10 olan miktarda bilesimde bulunur. Bir veya daha fazla hidrofobik perasitler veya prekürsörleri bir veya daha fazla hidrofilik perasit veya prekürsörü ile kombinasyon halinde kullanilabilir. Tipik olarak hidrojen peroksit kaynagi ve agartma aktivatörü, birlikte eklenecektir. hidrojen peroksit kaynagi ve perasit veya agartma aktivatörünün miktarlari, temin edilebilir oksijenin (peroksit kaynagindan alinan) peraside molar orani 1:1 ila 35:1, veya hatta 2:1 ila 10:1 arasinda olacak sekilde seçilebilir. Sürfaktan. Tercihen bilesim, bir sürfaktan veya sürfaktan sistemi içerir. Sürfaktan noniyonik, aniyonik, katyonik, amfoterik, amfolitik, amfifilik, zwitteriyonik, semi-polar noniyonik sürfaktanlar ve karisimlarindan seçilebilir. Tercih edilen bilesimler, sürfaktanlarin karisimi/sürfaktan sistemi içerir. Tercih edilen sürfaktan sistemleri, en çok tercih edildigi üzere bir ko-sürfaktan, en çok tercihen bir noniyonik ve/veya amfoterik ve/veya zwitteriyonik sürfaktan ile kombinasyon halinde bir veya daha fazla aniyonik sürfaktan içerir. Tercih edilen sürfaktan sistemleri tercihen 90:1 ila 1:90 arasinda agirlik oranlarinda anyonik ve noniyonik sürfaktan içerir. Bazi örneklerde en az 1:1 olan anyonik ila noniyonik sürfaktan agirlik orani tercih edilir. Mevcut oldugunda toplam sürfaktan seviyesi tercihen söz konusu bilesimin agirliginda %01 ila %60, %1 ila %50 veya %5 ila %40 arasindadir. Tercihen bilesim, bir anyonik temizleyici sürfaktan, tercihen sülfat ve/veya sülfonat sürfaktanlari içerir. Tercih edilen örnekler alkil benzen sülfonatlar, alkil sülfatlar ve alkil alkoksile sülfatlari içerir. Tercih edilen sülfonatlar Cin-13 alkil benzen sülfonattir. Uygun alkil benzeri sülfonat (LAS), ticari olarak temin edilebilir lineer alkil benzenin (LAB) sülfonlanmasi ile elde edilebilir; uygun LAB Isochem® ticari adi altinda Sasol tarafindan tedarik edilenler veya Petrelab® ticari adi altinda Petresa tarafindan tedarik edilenler gibi düsük 2-fenil LAB'yi içerir, diger uygun LAB, Hyblene® ticari adi altinda Sasol tarafindan tedarik edilenler gibi yüksek 2-fenil LAB içerir. Uygun anyonik temizleyici bir sürfaktan, HF gibi diger sentez yollari da uygun olabilmesine ragmen DETAL katalize proses ile elde edilen alkil benzen sülfonattir. Bir açida bir LAS magnezyum tuzu kullanilir. Tercih edilen sülfat temizleyici sürfaktanlar, alkil sülfat, tipik olarak 08-18 alkil sülfat veya büyük bir çogunlukla C12 alkil sülfat içerir. Tercih edilen ilave bir alkil sülfat alkil alkoksile sülfat, tercihen bir 08.13 alkil alkoksile sülfattir. Tercihen alkoksilleme grubu bir etoksileme grubudur. Tipik olarak alkil alkoksile sülfat, 0.5 ila 30 veya 20, veya 0.5 ila veya hatta 0.5 ila 3 arasinda ortalama bir etoksilasyon derecesine sahip 08-18 alkil etoksile sülfat özellikle tercih edilir. Alkil sülfat, alkil alkoksile sülfat ve alkil benzen sülfonatlar lineer veya dallanmis, sübstitüe edilmis veya sübstitüe edilmemis olabilir. Sürfaktan dallandiginda tercihen sürfaktan, orta zincirli dallanmis sülfat veya sülfonat sürfaktan içerecektir. Tercihen dallanma gruplari CM alkil gruplari, tipik olarak metil ve/veya etil gruplarini içerir. Tercihen bilesim, noniyonik temizleyici bir sürfaktan içerir. Uygun non-iyonik sürfaktanlar asagidakilerden olusan gruptan seçilir: Cs-C1a alkil etoksilatlar, örnegin, Shell'den NEODOL® non-iyonik sürfaktanlar; Ce-C12 alkil fenol alkoksilatlar burada alkoksilat birimleri etilenoksi birimleri, propilenoksi birimleri veya bir karisimi olabilir; BASF'den Pluronic® gibi etilen oksit/propilen oksit blok polimerler ile C12'Ciß alkol ve zincirli dallanmis alkil alkoksilatlar, tipik olarak 1 ila 30 arasinda ortalama bir alkoksilasyon derecesine sahiptir; alkilpolisakkaritler, bir açida alkilpoliglikosidler; polihidroksi yag asidi amidleri; eter baslikli poli(oksialkile) alkol sürfaktanlar ve karisimlari. Uygun non-iyonik temizleyici sürfaktanlar alkil poliglukosit ve/veya bir alkil alkoksile alkol içerir. Bir açida non-iyonik temizleyici sürfaktanlar alkil alkoksile alkolleri, bir açida (38-18 alkil alkoksile alkol, örnegin 03-13 alkil etoksile alkol içerir, alkil alkoksile alkol 1 ila 80, ortalama bir alkoksilasyon derecesine sahip olabilir. Bir açida alkil alkoksile alkol, 1 ila derecesine sahip bir Cim alkil etoksile alkol olabilir. AIkiI alkoksile alkol lineer veya dallanmis ve sübstitüe edilmis veya sübstitüe edilmemis olabilir. Uygun noniyonik sürfaktanlar, BASF'den Lutensol® ticari adi olanlari içerir. Uygun katyonik temizleyici sürfaktanlar alkil piridinyum bilesikleri, alkil kuaterner amonyum bilesikleri, alkil kuaterner fosfonyum bilesimleri, alkil ternar sülfonyum bilesikleri ve karisimlarini içerir. Uygun katyonik temizleyici sürfaktanlar, asagidaki genel formüle sahip kuaterner amonyum bilesikleridir: burada, R lineer veya dallanmis, sübstitüe edilmis veya sübstitüe edilmemis 06.18alkil veya alkenil kismidir, R1 ve R2 bagimsiz olarak metil veya etil kisimlarindan seçilir, R3 bir hidroksil, hidroksimetil veya bir hidroksietil kismidir, X yük nötralligi saglayan bir anyondur, uygun anyonlar sunlari içerir: halojenürler, örnegin klorid; sülfat ve sülfonat. Uygun katyonik temizleyici sürfaktanlar mono-06.18 alkil mono-hidroksietil di-metil kuaterner amonyum kloridlerdir. Oldukça uygun katyonik temizleyici sürfaktanlar mono- Cg.1o alkil mono-hidroksietil di-metil kuaterner amonyum klorid, mono-010-12alkil mono- hidroksietil di-metil kuaterner amonyum klorid ve mono-010 alkil mono-hidroksietil di- metil kuaterner amonyum kloriddir. Uygun amfoterik/zwitteriyonik sürfaktanlar amin oksitleri ve betainleri içerir. Amin-nötralize anyonik sürfaktanlar - Mevcut bulusa anyonik sürfaktanlar ve yardimci anyonik kosürfaktanlar bir asit formunda bulunabilir ve söz konusu asit formu, mevcut deterjan bilesiminde kullanim için istenen bir sürfaktan tuzunu olusturmak üzere nötralize edilebilir. Nötralizasyona yönelik tipik ajanlar, hidroksitler, örnegin NaOH veya KOH gibi metal karsit iyon bazini içerir. Mevcut bulusa ait anyonik sürfaktanlar ve asit formlarinda yardimci anyonik sürfaktanlar ve kosürfaktanlarin nötralize edilmesine yönelik ayrica tercih edilen ajanlar amonyak, aminler veya alkalolaminleri içerir. Alkanolaminler tercih edilir. Uygun sinirlandirici olmayan örnekler teknikte bilinen monoetanolamin, dietanolamin, trietanolamin ve diger lineer veya dallanmis alkanolaminleri içerir; örnegin oldukça tercih edilen alkanolaminler 2-amino-1-propanol, 1-aminopropanol, monoizopropanolamin, veya 1-amin0-3-propanol içerir. Amin nötralizasyonu, tam veya kismi ölçüde yapilabilir, örnegin anyonik sürfaktan karisiminin parçasi sodyum veya potasyum ile nötralize edilebilir ve anyonik sürfaktan karisiminin parçasi aminler veya alkanolaminler ile nötralize edilebilir. Yapici maddeler. Tercihen bilesim, bir veya daha fazla yapici madde ve bir yapici madde sistemi içerir. Bir yapici madde kullanildiginda bulusa ait bilesim tipik olarak en az %1, %2 ila %60 yapici Içerecektir. Bilesimin örnegin agirlikça %1 ila 10 veya 5 arasinda düsük fosfat tuzu ve/veya zeolit seviyeleri içermesi tercihe dilebilir. Bilesim hatta büyük ölçüde güçlü yapici madde içermeyebilir; büyük Ölçüde güçlü yapici madde içermeme "kasitli olarak eklenen herhangi bir" zeolit ve/veya fosfat olmadigi anlamina gelir. Tipik zeolit yapici maddeler zeolit A, zeolit P ve zeolit MAP içerir. Tipik bir fosfat yapici madde sodyum tri-polifosfattir. Selatlayici Ajan. Tercihen bilesim, selatlayici ajanlar ve/veya kristal büyüme inhibitörü içerir. Uygun moleküller bakir, demir ve/veya manganez selatlayici ajanlari ve karisimlarini içerir. Uygun moleküller aminokarboksilatlar, aminofosfonatlar, süksinatlar, tuzlari ve karisimlarini içerir. Burada kullanima yönelik uygun selatlayicilarin sinirlandirici olmayan örnekleri etilendiamintetrasetatlar, N- (hidroksietil)etilendiamintriasetatlar, nitrilotriasetatlar, etilendiamin tetraproprionatlar, trietilentetraaminhekzasetatlar, dietilentriamin-pentaasetatlar, etanoldiglisinler, etilendiamintetrakis (metilenfosfonatlar), dietilentriamin penta(metilen fosfonik asit) (DTPMP), etilendiamin disükssinat (EDDS), hidroksietandimetilenfosfonik asit (HEDP), metilglisindiasetik asit (MGDA), dietilentriaminpentaasetik asit (DTPA), tuzlari, ve karisimlarini içerir. Mevcut bulusta kullanima yönelik selatlayicilarin diger sinirlandirici Burada kullanima yönelik diger uygun selatlayici ajanlar ticari DEQUEST serileri ve Monsanto, DuPont, ve Nalco, lnc'den alinan selatlayicilardir. Boya Transfer Inhibitörü (DTI). Bilesim, bir veya daha fazla boya transferini Bulusa ait bir düzenlemede bulusçular sasirtici sekilde belirtilen boyaya ek olarak polimerik boya transferini inhibe edici ajanlar içeren bilesimlerin gelismis performans sagladigini bulmuslardir. Bu durum, bu polimerlerin boya tortulasmasini önlemesi nedeniyle sasirticidir. Uygun boya transfer inhibitörleri bunlarla sinirli olmamak üzere polivinilpirolidon polimerler, poliamin N-oksit polimerler, N-vinilpirolidon ve N- vinilimidazol kopolimerleri, poliviniloksazolidonlar ve polivinilimidazoller veya karisimlarini içerir. Uygun örnekler PVP-K15, PVP-K30, Ashland Aqualon'dan alinan Söz konusu bir bilesimde bulundugunda boya transferini inhibe edici ajanlar, bilesimin hatta yaklasik % 0.1 ila yaklasik %3 olan seviyelerde bulunabilir. Floresan Parlatici. Tercihen bilesim bir veya daha fazla floresan parlatici içerir. Mevcut bulusta faydali olabilen ticari optik parlaticilar, bunlarla sinirli olmamak üzere stilben deriveleri, pirazolin, kumarin, karboksilik asit, metinsiyaninler, dibenzotiyofen- ,5-dioksit, azol, 5- ve 6-üyeli halka heterosikller, ve diger çesitli ajanlari içeren alt gruplar halinde siniflandirilabilir. Özellikle tercih edilen parlaticilar sunlardan seçilir: metiI-N-2 hidroksietil) amino 1,3,5-triazin-2-Il)]amin0}stilben-2-2-disülf0nat, disodyum disodyum 4,4'- bis (2-sulfostyryl) bifenil. Bu tür parlaticilarin diger örnekleri John Wiley Brightening Agents", M. Zahradnik, New York (1982) içerisinde açiklanir. Mevcut bilesimlerde faydali olan optik parlaticilarin spesifik sinirlandirici olmayan örnekleri .8. Tercih edilen bir parlatici asagidaki yapiya sahiptir: Uygun floresan parlatici seviyeleri, agirlikça yaklasik 0.01, yaklasik 0.05, yaklasik 0.1 veya hatta yaklasik 0.2 alt seviyeleri ila agirlikça %05 veya hatta 0.75 üst seviyeleri Bir açida parlatici, bir partikül olusturmak üzere bir kile yüklenebilir. Tercih edilen parlaticilar toplam olarak veya baskin sekilde (tipik olarak agirlikça en az formundadir. Yüksek derecede tercih edilen bir parlatici, tercihen asagidaki yapiya sahip C.I. floresan parlatici 260 içerir: Bu, örnegin 30 veya 25 veya hatta 20°C altinda olan soguk suda iyi derecede çözündügünden özellikle faydali olabilir. Tercihen parlaticilar, en çok tercih edildigi üzere 3 ila 30 mikrometre, 3 mikrometre ila mikrometre veya 3 ila 10 mikrometre arasinda agirlikça ortalama bir primer partikül boyutuna sahip mikronize partikülat formunda bilesime eklenir. Bilesim, beta-kristalin formunda C.l. floresan parlatici 260 içerir ve (i) alfa-kristalin formunda C.I. floresan parlatici 260'in (ii) beta-kristalin formunda C.I. floresan parlatici 260'a agirlik orani en az 0.1 veya en az 0.6 olabilir. BE680847, alfa-kristalin formunda C.l floresan parlatici 260 yapimina yönelik bir proses ile ilgilidir. Silikat Tuzlari. Bilesim tercihen ayrica sodyum veya potasyum silikat gibi silikat tuzlarini içerebilir. Bilesim agirlikça %0 ila agirlikça %10'dan az silikat tuzu, agirlikça agirlikça %4 veya agirlikça %3 veya hatta agirlikça %2 ve tercihen agirlikça %0,in üzerinde veya agirlikça %0.5 veya hatta agirlikça %1 silikat tuzu içerebilir. Uygun bir silikat tuzu sodyum silikattir. Dagiticilar. Bilesim tercihen ayrica dagiticilari içerebilir. Uygun suda çözünebilir organik materyaller homo- veya ko-polimerik asitleri veya tuzlarini içerir, burada polikarboksilik asit, en fazla iki karbon atomu ile birbirinden ayrilan en az iki karboksil radikali içerir. Enzim stabilizörleri. Bilesim tercihen enzim stabilizörleri içerebilir. Herhangi bir klasik enzim stabilizörü örnegin enzimlere bu tür iyonlari saglayan tamamlanmis kumas ve ev bakim ürünlerinde kalsiyum ve/veya magnezyum iyonlarinin suda çözünen kaynaklarinin varligi ile kullanilabilir. Proteaz içeren aköz bilesimler durumunda tersinir bir proteaz inhibitörü, örnegin borat içeren bir boron bilesigi veya tercihen 4-f0rmül fenilboronik asit, fenilboronik asit ve deriveleri veya kalsiyum format, sodyum format ve 1,2-propan diol gibi bilesikler stabiliteyi gelistirmek üzere eklenebilir. Solvent Sistemi. Mevcut bilesimlerdeki solvent sistemi, tek basina su veya su olmaksizin veya tercihen su ile organik solventlerin karisimlarini içeren bir solvent sistemi olabilir. Tercih edilen organik solventler 1,2-propanediol, etanol, gliserol, dipropilen glikol, metil propan diol ve karisimlarini içerir. Diger düsük alkoller, C1-C4 alkanolaminler örnegin monoetanolamin ve trietanolamini kullanilabilir. Solvent sistemleri örnegin bulusun anhidröz kati düzenlemelerinden bulunmayabilir ancak daha tipik olarak yaklasik %0.1 ila yaklasik %98, tercihen en az yaklasik %1 ila yaklasik Bulusun bazi düzenlemelerinde bilesim, yapisal bir sivi formundadir. Bu yapisal sivilar, içsel olarak yapisal olabilir, böylelikle yapi primer bilesenler (örnegin sürfaktan materyal) ile olusturulur ve/veya örnegin kalinlastiricilar olarak kullanim için sekonder bilesenler (örnegin polimerler, kil ve/veya silikat materyal) kullanilarak üç boyutlu matriks yapinin saglanmasi ile distan yapisal olabilir. Bilesim bir yapilandirici, tercihen agirlikça %0.01 ila agirlikça %5, agirlikça %O.1 ila agirlikça %2.0 yapilandirici içerebilir. Uygun yapilandiricilarin örnekleri Yapilandirici tipik olarak digliseritler ve trigliseridler, etilen glikol distearat, mikrokristalin selüloz, selüloz bazli materyaller, mikrofiber selüloz, hidrofobik olarak modifiye edilmis alkali-sisen emülsiyonlar örnegin Poligel W30 (3VSigma), biyopolimerler, ksantan zamki, gellan zamki, hidrojenize kastor yagi, hidrojenize kastor deriveleri örnegin etoksilenmemis deriveleri ve karisimlari, özellikle hidrojenize kastor yagi, hidrojenize kastor yagi deriveleri, mikrofibüler selüloz, hidroksifonksiyonel kristalin materyaller, uzun Zincirli yag alkolleri, 12-hidroksistearik asitler, killer ve karisimlarindan olusan gruptan seçilenlerden olusan gruptan seçilir. Tercih edilen bir yapilandirici, uygun hidroksifonksiyonel kristalin materyalleri detayli sekilde tanimlayan US Patent No. 6,855,680'de açiklanir. Hidrojenize kastor yagi tercih edilir. Faydali yapilandiricilarin sinirlandirici olmayan örnekleri içerir. Bu tür yapilandiricilar, bir görünüm açisi araligina sahip ip seklinde yapilandirma sistemine sahiptir. Diger uygun yapilandiricilar ve Mevcut bulusa ait bilesim, yüksek erime noktali yag bilesigi içerebilir. Burada faydali yüksek etime noktali yag bilesigi, 25°C veya daha yüksek bir erime noktasina sahiptir ve yag alkolleri, yag asitleri, yag alkol deriveleri, yag asidi deriveleri ve karisimlarindan olusan gruptan seçilir. Düsük erime noktali bu tür bilesiklerin bu bölüme dahil edilmesi tasarlanmaz. Yüksek etime noktali bilesiklerin sinirlandirici olmayan örnekleri erime noktali yag asidi tercihen bilesimin agirliginca %0.1 ile %40, tercihen %1 ila kuru saçta yumusaklik ve nemlilik hissi gibi gelistirilmis iyilestirme faylarinin saglanmasi bakimindan %1.5 ila %8 seviyesinde bilesime dahil edilir. Katyonik Polimer. Mevcut bulusa ait bilesimler bir katyonik polimer içerebilir. Bilesimdeki katyonik polimer konsantrasyonlari tipik olarak %005 ila %3, bir diger araligindadir. Uygun katyonik polimerler bilesimin tasarlanan kullanim pH degerinde en az 0.5 meq/gmiik, bir diger düzenlemede en az 0.9 meq/gm'lik, bir diger düzenlemede en az 1.2 meq/gm'lik, yine bir diger düzenlemede en az 1.5 meq/gm'lik, anca bir düzenlemede 7 meq/gm'den daha az ve bir diger düzenlemede 5 meq/gmiden daha az katyonik yük yogunluguna sahip olacaktir, pH degeri genellikle pH 3 ila pH 9, bir düzenlemede pH 4 ile pH 8 arasinda olacaktir. Burada bir polimerin "katyonik yük yogunlugu" polimerdeki pozitif yük sayisinin polimerin moleküler agirligina oranina refere eder. Bu tür uygun katyonik polimerlerin ortalama moleküler agirligi genellikle diger düzenlemede 100,000 ile 3 milyon arasinda olacaktir. Mevcut bulusa ait bilesimlerde kullanima yönelik uygun katyonik polimerler, kuaterner amonyum veya katyonik protonlu amino kisimlari gibi katyonik nitrojen içeren kisimlari içerir. Herhangi bir anyonik karsit iyon, polimerler suda, bilesimde veya bilesimin koaserval fazinda çözünür kaldigi sürece ve karsit iyonlarin fiziksel olarak ve kimyasal olarak bilesimin gerekli bilesenleri ile uyumlu oldugu veya baska sekilde gereksiz yere ürün performansi, stabilitesi veya estetigini bozmadigi sürece katyonik polimerler ile iliskili sekilde kullanilabilir. Bu tür karsit iyonlarin sinirlandirici olmayan örnekleri halojenürleri (örnegin klorid, florid, bromid, iyodid), sülfat ve metilsülfat içerir. Bu tür polimerlerin sinirlandirici olmayan ömekleri CTFA Cosmetic lngredient Dictionary, 3rd edition, edited by Estrin, Crosley, and Haynes, (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, DC. (1982)) içinde açiklanir. Bilesimde kullanima yönelik diger uygun katyonik polimerler polisakkarit polimerler, katyonik guar zamki deriveleri, kuaterner nitrojen içeren selüloz eterler, sentetik polimerler, eterlesmis selüloz kopolimerleri, guar ve nisasta içerir. Kullanildiginda buradaki katyonik polimerler bilesimde çözünürdür veya burada daha Önce açiklanan katyonik polimer ve anyonik, amfoterik ve/veya zwitteriyonik sürfaktan bileseni ile olusturulan bilesimde kompleks koaserval bir fazda çözünürdür. Katyonik polimerin kompleks koaservallari bilesimdeki diger yüklü materyaller ile olusturulabilir. Noniyonik Polimer. Mevcut bulusa ait bilesim, bir sartlandirma ajani olarak noniyonik bir polimer içerebilir. 1000'den daha fazla moleküler agirliga sahip polialkilen glikoller burada faydalidir. Asagidaki genel formüle sahip olanlarfaydalidir: burada R95, H, metil ve karisimlarindan olusan gruptan seçilir. Sartlandirma ajanlari ve özellikle silikonlar bilesime dahil edilebilir. Mevcut bulusa ait bilesimlerde faydali sartlandirma ajanlari tipik olarak emülsifiye edilmis, sivi partikülleri olusturulan sivi suda çözünmeyen, suda dagilabilir, uçucu olmayan, sivi içerir. Bilesimde kullanima yönelik uygun sartlandirma ajanlari, genellikle silikonlar (örnegin silikon yaglar, katyonik silikonlar, silikon zamklar, yüksek refraktif silikonlar ve silikon reçineleri), organik sartlandirma yaglari (örnegin hidrokarbon yaglari, poliolefinler ve yag esterleri) veya kombinasyonlari olarak karakterize edilen sartlandirma ajanlari veya diger sekilde buradaki aköz sürfaktan matriksinde sivi, daginik partikülleri olusturan sartlandirma ajanlaridir. Bu tür sartlandirma ajanlari, bilesimin esas bilesenleri ile fiziksel olarak ve kimyasal olarak uyumlu olmalidir ve baska sekilde ürün stabilitesini, estetigini veya performansini gereksiz sekilde bozmamalidir. Sartlandirma ajaninin bilesimdeki konsantrasyonu, istenilen sartlandirma faylarini saglamak için yeterli olmalidir. Bu tür konsantrasyon, sartlandirma ajani, istenilen sartlandirma performansi, sartlandirma ajani partiküllerinin ortalama boyutu, diger bilesenlerin türü ve konsantrasyonu ve diger benzeri faktörler ile degiskenlik gösterebilir. Silikon sartlandirma ajaninin konsantrasyonu tipik olarak yaklasik %001 ila yaklasik süspanse edici ajanlarin sinirlandirici olmayan örnekleri U.S. Yeni Baski Patent No. 34,584, U.S. Patent No. New York: Academic Press (1968); General Electric Silicone Rubber Product Data Sheets SE 30, SE 33, SE 54 and SE 76; Silicon Compounds, Petrarch Systems, Inc. (1984); and in Encyclopedia of Polimer Science and Engineering, vol. 15, 2d ed., pp Organik Sartlandirma Yagi. Mevcut bulusa ait bilesimler ayrica tek basina veya diger sartlandirma ajanlari, örnegin silikonlar (burada açiklanan) ile kombinasyon halinde sartlandirma ajani olarak yaklasik %005 ila yaklasik %3 en az bir organik sartlandirma yagi içerebilir. Uygun sartlandirma yaglari hidrokarbon yaglari, poliolefinler ve yag esterlerini içerir. Burada bilesimde kullanim için ayrica uygun olanlar Procter & Gamble ajanlaridir. Ayrica burada kullanim için uygun olanlar U.S. Patent No. açiklanan sartlandirma ajanlaridir. Hijyen Ajani. Mevcut bulusa ait bilesimler ayrica bir veya daha fazla çinko risinoleat, timol, kuaterner amonyum tuzlari örnegin Bardac®, polietilenimin (örnegin BASF'den Lupasol®) ve çinko kompleksi, gümüs ve gümüs bilesik, örnegin Ag+ veya nano- gümüs dispersiyonlari yavas bir sekilde salgilamak üzere tasarlananlar gibi hijyen ve/veya kötü koku faydalarini dagitmak üzere bilesenleri içerebilir. Köpük Pekistiriciler. Bilesim, yüksek köpürme istenmesi halinde tercihen köpük pekistiricileri içerebilir. Uygun örnekler tercihen %1-%10 seviyelerinde eklenen C10- amidler, bu tür köpük pekistiricilerin tipik bir sinifini gösterir. Yukarida belirtilen amin oksitler, betainler ve sultainler gibi yüksek köpüklemeye yardimci sürfaktanlar ile bu tür köpük pekistiricilerin kullanimi da avantajlidir. istenmesi halinde suda çözünür magnezyum ve/veya kalsiyum tuzlari örnegin MgCI2, MgSO4, CaCI2, CaSO4 ve benzeri ek köpük saglamak üzere ve yag uzaklastirma performansini arttirmak üzere tipik olarak %0.1-%2 seviyelerinde eklenebilir. Köpük Baskilayicilar. Köpük olusmasinin azaltilmasi veya baskilanmasina yönelik bilesikler, mevcut bulusa ait bilesimlere eklenebilir. Köpük baskilamasi, U.S. Patent No. prosesinde" ve önden yüklemeli yikama makinelerinde özel öneme sahip olabilir. genis çesitlilikte materyal, köpük baskilayicisi olarak kullanilabilir ve köpük baskilayicilari teknikte uzman kisilerce iyi bilinir. Bakiniz örnegin Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Third Edition, Volume 7, pages 430-447 (John Wiley & Sons, çözünür tuzlari, yüksek moleküler agirlikli hidrokarbonlar örnegin parafin, yag asidi esterleri (örnegin yag asidi trigliseritleri), monovalent alkollerin yag asidi esterleri, alifatik C18-C40 ketonlar (örnegin stearon), N-alkile amino triazinler, tercihen yaklasik 100°C"nin altinda erime noktasina sahip mumsu hidrokarbonlar, silikon köpük baskilayicilar ve sekonder alkolleri içerir. Köpük baskilayicilar U.S. Patent No. Otomatik çamasir yikama makinelerinde kullanilacak herhangi bir deterjan bilesimi için köpük, yikama makinesinden tasacak ölçüde olusmamalidir. Köpük baskilayicilar, kullanildiginda tercihen "köpük baskilayici miktarda" bulunur. "Köpük baskilayici miktar" ile bilesimin formülünü yapan kisinin otomatik çamasir yikama makinelerinde kullanim için düsük köpürücü çamasir deterjani ortaya çikarmak üzere köpügü yeterli derecede kontrol edecek bu köpük kontrol etme ajani miktarini seçebildigi ifade edilir. Buradaki bilesimler genellikle %0 ila %10 köpük baskilayici içerecektir. Köpük baskilayicilar olarak kullanildiginda monokarboksilik yag asitleri ve buradaki tuzlar tipik olarak agirlikça %5 kadar miktarda deterjan bilesiminde bulunacaktir. Tercihen %05 ila olarak daha yüksek miktarlar kullanilabilmesine ragmen agirlikça %2.0 olan miktarda deterjan bilesiminde kullanilabilir. Monostearil fosfat köpük baskilayicilar genellikle agirlikça %0.1 ila %2 araliginda bilesim miktarlarinda kullanilir. Hidrokarbon köpük baskilayicilar tipik olarak daha yüksek seviyeler kullanilabilmesine ragmen %001 ila tamamlanmis bilesimlerin agirliginca °/00.2-%3 miktarinda kullanilir. bulusa ait bilesimlere eklenebilir. Parfüm. Tercihen bilesim, tercihen agirlikça %001 ila 3, en çok tercih edildigi üzere agirlikça %01 ila 1 araliginda bir parfüm içerir. birçok uygun parfüm örnegi CFTA Publications tarafindan yayinlanan CTFA (Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association) 1992 International Buyers Guide, ve Schnell Publishing Co. tarafindan yayinlanan OPD 1993 Chemicals Buyers Directory 80th Annual Edition içinde saglanir. Bulusa ait bilesimlerde örnegin dört, bes, alti, yedi veya daha fazla gibi çok sayida parfüm bileseninin bulunmasi normaldir. Parfüm karisimlarinda tercihen agirlikça %15 ila 25 en üst notlardir. En üst notlar Poucher (Journal of the Society of Cosmetic Chemists 6(2):8O [1995]) tarafindan tanimlanir. Tercih edilen en üst notlar rose oksit, turunçgil yagi, Iinalil asetat, Iavanta, Iinalool, dihidromirsenol ve cis-3-hekzan0l içerir. Temizlik Bilesimlerinin Yapim ve Kullanim Prosesleri Mevcut bulus ayrica istem 5'te açiklanan sekilde bir bilesimin yapimina yönelik bir yöntem saglar. Burada açiklandigi üzere, mevcut bulusun temizlik bilesimleri tabletler, kapsüller, saseler, keseler ve çok bölmeli keseler de dahil olmak üzere birim dozaj formunda saglanir. Bazi düzenlemelerde, birim dozaj formu, birçok bölmeli kese (veya baska bir birim dozaj formu) içinde yer alan terkip maddelerinin kontrollü salimini saglayacak sekilde tasarlanir. Uygun birim dozaj ve kontrollü salim formatlari ilgili teknikte bilinir (birim dozaj ve kontrollü salim formatlarinda kullanilmaya uygun materyaller için bkz. 04/111178). Bazi düzenlemelerde, birim dozaj formu, bir suda çözünür film veya suda çözünür kese ile sarilmis tabletler seklinde saglanir. Birim dozlara yönelik çesitli formatlar EP 2 100 947'de verilir ve ilgili teknikte bilinir. Tercih edilen çok bölmeli kesede proteaz varyanti, diger bir proteaz enzimi, birinci yikama lipaz enzimi, selülaz enzimi, amilaz ensimi, agartma bileseni, pH modifiye edici, kumas renklendirme boyasi, optik parlatici ve iyonik olmayan sürfaktan veya karisimlarinin bir veya daha fazlasindan ayri bir bölmededir. Kullanim Yöntemi Burada yukarida listelenen varyantlardan en az birini ve bir yardimci materyali içeren aköz bir çözelti ile yüzeyin temas ettirilmesini içeren, özellikle bir kumas gibi bir yüzeyin islem görmesine yönelik bir yöntem açiklanir. Tipik olarak proteaz varyanti ve yardimci materyal, suya bulusa ait bilesimin eklenmesi ile yikama çözeltisi olusturmak üzere duya eklenir. Bulus yönteminde islem görecek yüzey, bulasik, çamasir, sert yüzeyler, kontakt lensler, vb. gibi temizlemeye yönelik herhangi bir kumas veya ev bakim yüzeyi olabilir. Burada açiklandigi üzere yüzeyin en az bir parçasi, mevcut bulusun temizlik bilesimlerinin en az bir düzenlemesi ile saf formda veya yikama çözeltisinde seyreltilmis olarak temas ettirilir ve akabinde yüzey istege bagli olarak yikanir ve/veya durulanir. Mevcut bulusun amaçlarina yönelik olarak "yikama" bunlarla sinirli olmamak üzere ovalama ve mekanik yikama islemlerini içerir. Bazi düzenlemelerde mevcut bulusun temizlik bilesimleri, solüsyon içinde yaklasik 500 ppm ila yaklasik 15,000 ppm olan konsantrasyonlarda kullanilir. Yikama solventinin su oldugu bazi düzenlemelerde su sicakligi tipik olarak yaklasik 5°C ile yaklasik 90°C araligindadir. Mevcut bulus, istem 7"de tanimlandigi üzere temizlemeye yönelik yöntemleri saglar. Burada temizlenmesi gereken bir esya, nesne veya yüzeyin temizlenmesine yönelik bir yöntem açiklanir, yöntem, mevcut bulusun en az bir varyant subtilisin proteazinin veya mevcut bulusun bir bilesiminin esyayi, nesneyi veya yüzeyi arzu edilen bir dereceye kadar temizlemek için yeterli bir süre boyunca ve/veya uygun veya etkili kosullar altinda nesneye veya yüzeye (veya temizlenmesi istenen nesne veya yüzeyin bir kismina) temas ettirilmesini içerir. Bu tip bazi yöntemler ilaveten esyanin, nesnenin veya yüzeyin su ile durulanmasini içerir. Bu tip bazi yöntemler için temizlik bilesimi bir bulasik yikama deterjani bilesimidir ve temizlenecek esya veya nesne bir sofra takimi esyasi veya yemek takimi esyasidir. Burada kullanildigi üzere "bir sofra takimi esyasi" genel olarak yemek servisinde veya yemek yerken kullanilan bir esyadir. Bir sofra takimi esyasi, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla örnegin bir yemek kabi, tabak, bardak, çanak vs. olabilir. Burada kullanildigi üzere "masa takimi" bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, örnegin yemek kaplari, çatal-biçak takimi, biçaklar, çatallar, kasiklar, çubuklar, Züccaciye, sürahiler, sos kaplari, içecek kaplari, servis esyalari ve benzerlerini kapsayan daha genel bir terimdir. Bir "yemek takimi esyasinin", yemek servisine veya yemek yemeye yönelik bu veya benzeri esyalarin herhangi birini kapsamasi amaçlanir. Bu tip bazi yöntemler için temizlik bilesimi bir otomatik bulasik yikama deterjani bilesimi veya bir elde bulasik yikama deterjani bilesimidir ve temizlenecek esya veya nesne bir sofra takimi veya yemek takimi esyasidir. Bu tip bazi yöntemler için, temizlik bilesimi bir çamasir deterjani bilesimidir (örnegin güçlü bir çamasir deterjani bilesimi veya bir sivi çamasir deterjani bilesimi) ve temizlenecek esya bir kumas esyadir. Diger bazi düzenlemelerde temizlik bilesimi, çamasir ön islem bilesimidir. Temizleme bilesimi sert bir yüzey temizleyici içerebilir. Burada istege bagli olarak temizlenmesi veya yikanmasi gereken bir kumas esyanin sirasiyla temizlenmesine veya yikanmasina yönelik yöntemler açiklanir. Bazi düzenlemelerde yöntemler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla örnegin bir kumas veya çamasir yikama bilesimi de dahil varyant proteazi içeren bir bilesimin ve temizlenmesi gereken bir kumas esyanin veya çamasirin saglanmasini ve bilesimin, kumasi veya çamasiri arzu edilen bir dereceye kadar temizlemek veya yikamak için yeterli veya etkili kosullar altinda kumas esyaya veya çamasira (veya temizlenmesi istenen esyanin bir kismina) temas ettirilmesini içerir. Burada istege bagli olarak temizlenmesi gereken bir nesnenin veya yüzeyin (örnegin sert yüzeyin) temizlenmesine veya yikanmasina yönelik bir yöntem açiklanir, yöntem, temizlenecek veya yikanacak bir nesnenin veya yüzeyin saglanmasini ve bulusun en az bir subtilisin varyantinin veya böylesi en az bir subtilisin varyanti Içeren bulusun bir bilesiminin nesneyi veya yüzeyi arzu edilen bir derecede temizlemek veya yikamak için yeterli bir süre boyunca ve/veya yeterli veya etkili kosullar altinda nesneye veya yüzeye (veya temizlenmesi veya yikanmasi istenen nesnenin veya yüzeyin bir kismina) temas ettirilmesini içerir. Bu tip bilesimler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, örnegin bulusun bir temizlik bilesimini veya deterjan bilesimini (örnegin elde bulasik yikama deterjani bilesimi, elde bulasik yikama temizlik bilesimi, çamasir deterjani veya kumas deterjani veya çamasir veya kumas temizleme bilesimi, sivi çamasir deterjani, sivi çamasir yikama bilesimi, toz çamasir deterjani bilesimi, toz çamasir yikama bilesimi, otomatik bulasik yikama deterjani bilesimi, performans artirici çamasir yikama veya deterjan bilesimi, çamasir yikama katki maddesi ve çamasir ön leke çikarma bilesimi vs.) kapsar. Bazi düzenlemelerde yöntem, özellikle ilave temizleme veya yikama islemlerinin arzu edildigi durumlarda bir veya daha çok kez tekrarlanir. Örnegin yöntem, bazi durumlarda, istege bagli olarak ilaveten nesnenin veya yüzeyin, nesneyi veya yüzeyi arzu edilen derecede temizlemek veya yikamak için yeterli veya etkili bir süre boyunca en az bir varyant proteaz veya bilesim ile temas halinde kalmasini saglamayi içerir. Burada açiklandigi üzere yöntemler ilaveten esyanin veya yüzeyin su ve/veya baska bir sivi ile durulanmasini içerir. Bazi düzenlemelerde yöntemler ilaveten bulusun en az bir varyant proteazinin veya bulusun bir bilesiminin nesneye veya yüzeye tekrar temas ettirilmesini ve nesnenin veya yüzeyin en az bir varyant proteaz veya bilesim ile nesneyi veya yüzeyi arzu edilen derecede temizlemek veya yikamak için yeterli bir süre boyunca temas halinde kalmasinin saglanmasini içerir. Burada açiklandigi üzere temizlik bilesimi bir bulasik yikama deterjani bilesimidir ve temizlenecek esya bir sofra takimi veya yemek takimi esyasidir. Burada açiklandigi üzere temizlik bilesimi bir otomatik bulasik yikama deterjani bilesimi veya bir elde bulasik yikama deterjani bilesimidir ve temizlenecek esya bir sofra takimi veya yemek takimi esyasidir. Burada açiklandigi üzere, temizlik bilesimi bir çamasir yikama deterjani bilesimidir ve temizlenecek esya bir kumas esyadir. Burada açiklandigi üzere ayni zamanda, bir yemek takimi veya sofra takimi esyasinin bir otomatik bulasik yikama makinesinde temizlenmesine yönelik yöntemleri saglar, yöntem, bir otomatik bulasik yikama makinesinin saglanmasini, mevcut bulusun en az bir subtilisin varyantini veya bulusun bir bilesimini içeren bir otomatik bulasik yikama bilesiminin yemek takimi veya sofra takimi esyasini temizlemek için yeterli bir miktarinin makineye yerlestirilmesini (örnegin bilesimin makinede uygun veya saglanan bir deterjan bölmesine veya dagiticiya yerlestirilmesi), bir sofra takimi veya yemek takimi esyasinin makineye yerlestirilmesini ve yemek takimi veya sofra takimi esyasini temizlemek üzere makinenin çalistirilmasini (örnegin üretici firmanin talimatlari dogrultusunda) içerir. Burada açiklandigi üzere yöntemler, burada tarif edildigi üzere bunlarla sinirli olmamak kaydiyla burada açiklanan en az bir subtilisin varyantini içeren herhangi bir otomatik bulasik yikama bilesimini kapsayabilir. Otomatik bulasik yikama bilesiminin kullanilacak miktari üretici firmanin talimatlari veya önerileri dogrultusunda kolayca belirlenebilir ve burada tarif edilenlerin herhangi biri de dahil olmak üzere bulusun en az bir varyant proteazini içeren otomatik bulasik yikama bilesiminin herhangi bir formu (örnegin sivi, toz, kati, jel, tablet vs.) kullanilabilir. Burada, istege bagli olarak temizlenmesi gereken bir yüzeyin, esyanin veya nesnenin temizlenmesine yönelik yöntemler açiklanir, yöntem, katkisiz veya bir yikama çözeltisinde seyreltilmis formda bulunan mevcut bulusun en az bir subtilisin varyantinin veya bulusun bir temizlik bilesiminin. nesneyi veya yüzeyi arzu edilen bir derecede temizlemek veya yikamak için yeterli bir süre boyunca ve/veya yeterli veya etkili kosullar altinda nesneye veya yüzeye (veya temizlenmesi istenen nesnenin veya yüzeyin bir kismina) temas ettirilmesini içerir. Yüzey, esya veya nesne akabinde arzu edildigi takdirde (istege bagli olarak) yikanabilir ve/veya durulanabilir. Mevcut bulusun amaçlari dogrultusunda "yikama" islemi bunlarla sinirli olmamak kaydiyla örnegin ovalama ve mekanik çalkalamayi kapsar. Bazi düzenlemelerde, temizlik bilesimleri solüsyonda (örnegin sulu solüsyon) yaklasik 500 ppm ila yaklasik 15000 ppm'lik konsantrasyonlarda kullanilir. Yikama solventinin su oldugu durumlarda su sicakligi tipik olarak yaklasik 5°C ila yaklasik 90°C arasinda degisir ve yüzey, esya veya nesnenin bir kumas içermesi halinde suzkumas kütle orani tipik olarak yaklasik 121 ila yaklasik 30:1 arasindadir. Burada, bir çamasirin veya kumas esyanin bir çamasir makinesinde temizlenmesine yönelik yöntemler açiklanir, yöntem, bir çamasir makinesinin saglanmasini, bulusun en az bir subtilisin varyantini içeren bir çamasir deterjani bilesiminin çamasiri veya kumas esyayi temizlemek için yeterli bir miktarinin makineye yerlestirilmesini (örnegin bilesimin makinede uygun veya saglanan bir deterjan bölmesine veya dagiticiya yerlestirilmesi), çamasirin veya kumas esyanin makineye yerlestirilmesini ve çamasir veya kumas esyayi esyasini temizlemek üzere makinenin çalistirilmasini (örnegin Üretici firmanin talimatlari dogrultusunda) içerir. Mevcut bulusun yöntemleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla burada saglanan herhangi bir subtilisin varyantindan en az birini içeren herhangi bir çamasir yikama deterjani bilesimini kapsayabilir. Çamasir yikama deterjani bilesiminin kullanilacak miktari üretici firmanin talimatlari veya önerileri dogrultusunda kolayca belirlenebilir ve burada tarif edilenlerin herhangi biri de dahil olmak üzere bulusun en az bir varyant proteazini içeren çamasir yikama deterjani bilesiminin herhangi bir formu (örnegin kati, toz, sivi, tablet, jel vs.) kullanilabilir. Mevcut bulus, talep edilen bulus kapsamini herhangi bir sekilde sinirlanmayan asagidaki örneklerde daha detayli sekilde açiklanir. Asagida yer alan deney açiklamasinda asagidaki kisaltmalar kullanilir: PI (Performans Indeksi), ppm (milyonda bir parça); M (m0lar); mM (milimolar); pM (mikromolar); nM (nanomolar): mol (mol); mmol (milimol); umol (mikromol); nmol (nanomol); gm (gram): mg (miligram); pg (mikrogram); pg (pikogram): L (Iitre); mi ve mL (mililitre): pl ve uL (mikrolitre); cm (santimetre); mm (milimetre); pm (mikrometre); nm (nanometre); U (ünite); V (volt); MW (molekül agirligi); sec (saniye); min(s) (dakika/dakikalar); h(s) ve hr(s) (saat/saatler); °C (Santigrat derece); QS (gerektigi kadar); ND (yapilmamistir); rpm (dakikada devir); GH (Alman sertlik derecesi): HzO (su): dHzO (deiyonize su); HCI (hidroklorik asit); aa (amino asit); bp (baz çifti); kb (kilobaz çifti); kD (kilodalton); cDNA (kopya veya tamamlayici DNA); DNA (deoksiribonükleik asit); ssDNA (tek iplikli DNA); dsDNA (çift iplikli DNA); dNTP (deoksiribonükleotid trifosfat); RNA (ribonükleik asit); MgCI2(magnezyum klorid); NaCI (sodyum klorid); w/v (agirlik ila hacim); v/v (hacim ila hacim); w/w (agirlik ila agirlik); g (yerçekimi); OD (optik yogunluk); ppm (milyonda bir parça); Dulbecco fosfat tamponlu solüsyon (DPBS); SOC (%2 Bacto-Tripton, %05 Bacto Maya Ekstrakti, 10 mM NaCI, ; Terrific Besi Yeri (TB; 12 g/l Bacto- Tripton, 24 g/I gliserol, ; ODzao (280 nm"deki optik yogunluk); ODeoo (600 nm'deki optik yogunluk); A405 (405 nm'deki absorbans); Vmax (enzim katalizli bir reaksiyonun baslangiçtaki maksimum hizi); PAGE (poliakrilamid jel elektroforezi); PBS (fosfat tamponlu salin [150 mM NaCI, 10 mM sodyum fosfat tamponu, pH ; PCR (polimeraz zincir reaksiyonu); RT-PCR (revers transkripsiyon PCR); SDS (sodyum dodesil sülfat); Tris (tris(hidr0ksimetiI)aminometan); HEPES (N-[2- Hidroksietil]piperazin-N-[Z-etansülfonik asit]); HBS (HEPES tamponlu salin); Tris-HCI (tris[Hidroksimetil]aminometan-hidroklorid); Tricine (N-[tris-(hidroksimetil)-metiI]-glisin); CHES (2-(N-sikl0-hekzilamino) etan-sülfonik asit); TAPS (3-{[tris-(hidroksimetiI)-metil]- amino}-propansülfonik asit); CAPS (3-(sikIo-hekziIamino)-propan-sülfonik asit; DMSO (dimetil sülfoksit); DTT (1,4-ditiy0-DL-treitol); SA (sinapinik asit (s,5-dimetoksi-4- hidroksi sinnamik asit); TCA (trikloroasetik asit); Glut ve GSH (indirgenmis glutatyon); GSSG (okside glutatyon); TCEP (Tris[2-karboksietil] fosfin); Ci (Küri); mCi (miIiKüri); pCi (mikroKüri); HPLC (yüksek basinçli sivi kromatografisi); RP-HPLC (revers faz yüksek basinçli sivi kromatografisi); TLC (ince tabaka kromatografisi); MALDI-TOF (matriks destekli lazer dezorpsiyonu/iyonizasyonu-uçus zamani); Ts (tosil); Bn (benzil): Ph (fenil): Ms (mesil): Et (etil), Me (metil); Taq(Thermus aquati'cus DNA polimeraz); Klenow (DNA polimeraz I büyük (Klenow) fragmani); EGTA (etilen glikol- bis(ß-amin0etil eter) N, N, N', N'-tetraasetik asit); EDTA (etilendiamintetrasetik asit); bla (ß-laktamaz veya ampisilin-direnç geni); MJ Research (MJ Research, Reno, NV); Baseclear (Baseclear BV, Inc., Leiden, Hollanda); PerSeptive (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA); ThermoFinnigan (ThermoFinnigan, Sari Jose, CA); Argo (Argo BioAnaIytica, Morris Plains, NJ);Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Almanya): Pall (Pall Corp., East Hills, NY and Bad Kreuznach, almanya): Spectrum (Spectrum Laboratories, Dominguez Rancho, CA); Molecular Structure (Molecular Structure Corp., Woodlands, TX); Accelrys (Accelrys, Inc., San Diego, CA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Kanada): New Brunswick (New Brunswick Scientific, Co., Edison, NJ); CFT (Center for Test Materials, Vlaardingen, Hollanda): P&G ve Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH): GE Healthcare (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Birlesik Krallik): DNA: Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray, Co., Wicklow, Irlanda); Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandiya); Kelco (CP Kelco, Wilmington, DE): Coming (Coming Life Sciences, Corning, NY); (NEN (NEN Life Science Products, Boston, MA): Pharma AS (Pharma AS, Oslo, Norveç): Dynal (Dynal, Oslo, Norveç): Bio-Synthesis (Bio-Synthesis, Lewisville, TX): ATCC (Amerikan Tipi Kültü Koleksiyonu, Rockville, MD); Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand Island, NY); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO): Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ); NCBI (National Center for Biotechnology Information): Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA); BD Biosciences ve/veya Clontech (BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA): Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA); MWG Biotech (MWG Biotech, High Point, NC): Oligos Etc (Oligos Etc. (Difco Laboratories, Detroit, MI): Mediatech (Mediatech, Herndon, VA: Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA): Oxoid (Oxoid Inc., Ogdensburg, NY): Worthington (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ); GIBCO BRL veya Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD): Millipore (Millipore, Billerica, MA): Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., San Diego, CA); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA): Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0): Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL): Takara (Takara Bio Inc. Otsu, Japonya): Roche (Hoffmann-La Roche, Basel, Isviçre); EM Science (EM Science, Gibbstown, NJ); Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA): Biodesign (Biodesign Intl., Saco, Maine): Aptagen (Aptagen, Inc., Herndon, VA): Sorvall (Sorvall brand, from Kendro Laboratory Products, Asheville, NC): Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, CA): R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, MN): Siegfried Handel (Siegfried Handel AG, Zofingen, Isviçre): Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Marsh (Marsh Biosciences, Rochester, NY); Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Almanya): Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT): (Biacore (Biacore, Inc., Piscataway, NJ); PeproTech (PeproTech, Rocky Hill, NJ); SynPep (SynPep, Dublin, CA); New Objective (New Objective brand; Scientific lnstrument Services, Inc., Ringoes, NJ); Waters (Waters, Inc., Milford, MA); Matrix Science (Matrix Science, Boston, MA); Dionex (Dionex, Corp., Sunnyvale, CA); Monsanto (Monsanto Co., St. Louis, MO); Wintershall (Wintershall AG, Kassel, Almanya); BASF (BASF Co., Florham Park, NJ); Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake City, UT): Shell Chemicals (Shell Chemicals, Inc., London, UK); Stepan (Stepan, Northfield, IL); Clariant (Clariant, Sulzbach, Almanya); Industrial Zeolite (Industrial Zeolite Ltd., Grays, Essex, UK); Jungbunzlauer (Jungbunzlauer, Basel, Isviçre); Solvay (Solvay, Brussels, Belgium); 3V Sigma (3V Sigma, Bergamo, Italya); Innospec (Innospec, Ellesmere Port, UK); Thermphos (Thermphos, Vlissiggen-Ost, Hollanda); Ciba Specialty (Ciba Specialty Chemicals, Basel, Isviçre); Dow Coming (Dow Coming, Barry, UK); Enichem (Enichem Iberica, Barcelona, Ispanya); Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG, Buchs, Isviçre); Gist-Brocades (Gist-Brocades, NV, Delft, Hollanda); Dow Coming (Dow Coming Corp., Midland, MI); Mettler-Toledo (Mettler-Toledo Inc, Columbus, OH); RB (Reckitt-Benckiser, Slough, UK); ve Microsoft (Microsoft, Inc., Redmond, WA). Burada kullanildigi haliyle, bazi listelerde, her bir bölge için üç basamakli bir gösterim saglamak amaciyla rakamlarin önüne "O" koyulur (örnegin "001" ile "1" esdegerdir, ayni sekilde "AOO1C" ile "A1C" esdegerdir). Bazi listelerde önde gelen "0" kullanilmaz. Ayrica, burada kullanildigi haliyle "X", herhangi bir amino asidi ifade eder. Burada örnek olarak verilen deterjan bilesimlerinde enzim düzeyleri toplam bilesimin agirligi esasinda saf enzim cinsinden ifade edilir ve deterjan terkip maddeleri aksi belirtilmedikçe toplam bilesimin agirligi esasinda ifade edilir. Kisaltilmis bilesen tanimlari asagidaki anlamlara sahiptir: Kisaltma Bilesen LAS : Lineer sodyum 011-13 alkil benzen sülfonat TAS : Sodyum don yagi alkil sülfat CxyAS : Sodyum Clx - C1y alkil sülfat CxyEz : Ortalama 2 mol etilen oksit ile kondenzasyona ugratilmis agirlikli CxyAEzS Iyonik olmayan Silikat Metasilikat Zeolit A Polikarboksilat Perka rbonat olarak lineer qu - Ciy primer alkol C1y sodyum alkil sülfat. Örneklerde eklenen molekül ismi. Karisik etoksillenmis/propoksillenmis yag alkolü, örnegin Plurafac LF404, 3.8'Iik bir ortalama etoksillenme derecesine ve 46'lik bir ortalama propoksillenme derecesine sahip bir alkoldür alüminosilikat degerine sahip akrilat, maleat, metakrilat ve benzeri karboksillenmis monomerlerin karisimini içeren kopolimer 1-(3,4-dihidr0izokin0linyum)-dekan-2-sülfat Nominal NaBOa.4H20 formülüne sahip sodyum perborat tetrahidrat DETBCHD Parafin Parafin Sülfonat Aldoz oksidaz Galaktoz oksidaz Amilaz dietiltriamin penta (metilen) fosfonat izomeri 2-metiI-1,5-pentan dia min; 1,3-pentandiamin; 1-metil- diaminopropan Mn(ll)TUZU parafin yagi edilmis olan bir parafin yagi veya vaksi pazarlanan oksidaz enzimi Bacillus subtilis içinde ifade edilmis nötr metalloproteazin rekombinant formu (bkz. örnegin WO 07/044993) Basi/!us amyloliquefacients kökenli saflastirilmis nötr metalloproteaz Uygun bir amylolitik enzim, örnegin Genencor tarafindan PURAFECT® Ox markasi altinda pazarlananlar (bkz. WO NATALASE®, TERMAMYL®, FUNGAMYI® ve DURAMYLT'V' markasi altinda pazarlananlar LlPEX®, LIPOLASE®, LIPOLASE® Ultra markasi ve Gist- Selülaz Pectin Liyaz Parlatici 1 Silisyum önleyici Köpük baskilayici Jeffamin® ED-2001 DC3225C Betaine Brocades tarafindan LipomaxTM markasi altinda pazarlananlar CAREZYME®, CELLUZYME® ve/veya ENDOLASE® markasi altinda pazarlananlar PECTAWAY® ve PECTAWASH® markasi altinda pazarlananlar vinilpirrolidon kopolimeri polidimetilsiloksan köpük denetleyici, bahsedilen köpük denetleyicinin bahsedilen dagitici maddeye orani 10:1 ila 100:1 arasinda degisir nisasta Coming) Seker : Sanayi tipi D-glikoz veya gida sinifi seker CFAA : C12-Ci4 alkil N-metil glukamid TPKFA : C12-C14 ile kapali tam kesimli yag asitleri Kil : Genel formülü AI2038I02'XH20 olan bir hidratlanmis alüminyum silikat. Türleri: Kaolinit, montmorillonit, atapulgit, illit, bentonit, halloyisit pH : 20°C'de damitilmis su içinde %1`Iik solüsyon olarak ölçülmüstür. Kuzey Amerika (NA) ve Bati Avrupa (WE) agir hizmet tipi sivi çamasir yikama (HDL) deterjanlari için, piyasadan temin edilebilen deterjanlarda bulunan enzimlerin isil inaktivasyonu, önceden tartilmis sivi deterjanin (bir cam sisede) 2 saatligine 95°C'Iik bir su banyosuna yerlestirilmesi yoluyla gerçeklestirilir. NA ve WE otomatik bulasik yikama (ADW) deterjanlarinin isil inaktivasyonu için inkübasyon süresi 8 saattir. Hem isitilmamis hem de isitilmis deterjanlar, pasiflesme yüzdesini dogru bir sekilde belirlemek amaciyla deterjan çözüldükten sonra 5 dakika içerisinde analiz edilir. Enzim aktivitesi AAPF analiziyle test edilir. deterjanlarin çalisma solüsyonlari, isi ile inaktive edilmis stoklardan yapilir. Su sertligi (örnegin, 6 gpg veya 12 gpg) ve tamponun uygun miktarlari, istenen kosullar ile eslesmek üzere deterjan solüsyonlarina eklenir. Solüsyonlar, siselerin vortekslenmesi veya ters çevrilmesi yoluyla karistirilir. Asagidaki Tablo A, bazi deterjan bilesimleri ile ilgili bilgi saglar. Bazi deneylerde ek ve/veya diger ticari olarak temin edilebilir deterjanlar asagidaki Örneklerde kullanim bulur. Tablo A, kumaslarin yikanmasina uygun bulus ile uyumlu olarak üretilen granüler çamasir deterjani bilesimlerini saglar. Tablo A. Granüler Çamasir Deterjani Bilesimleri ve Bilesenleri Bilesen Deterjan Bilesimleri 1 2 3 4 5 6 Tablo A. Granüler Çamasir Deterjani Bilesimleri ve Bilesenleri Bilesen C11-C12 olan lineer alkilbenzensülfonat Diger sürfaktanlar Fosfat gelistirici(ler) Zeolit Silikat Sodyum Karbonat Poliakrilat (MW 4500) BDA önceden CPKeIco) Celluclean® (15.6mg/g) Soguk Su Proteazi* Stainzyme Plus® (14mg/g) Mannaway 4.0T (4mg/g) Lipex 1OOT (18.6mg/g) Floresan Parlatici(lar) Dietilentriamin pentaasetik asit Agartici(lar) ve Agartma a ktivatörü(a ktivatörleri) Etoksile tiyofen Renklendirme Boyasi5 Direkt Viyole 9 önceden Ciba Deterjan Bilesimleri 1.6 1.2 0.23 0.17 0.23 0.17 0.23 0.17 0.16 0.06 3.2 0.5 0.2 0.2 0.2 0.03 0.2 0.2 0.18 0.16 0.25 0.6 2.09 1.17 Tablo A. Granüler Çamasir Deterjani Bilesimleri ve Bilesenleri Bilesen Deterjan Bilesimleri 1 2 3 4 5 6 Specialty Chemicals Sülfat/Sitrik Asit/ Sodyum Bikarbonat/ Nem/parfüm %100'e tamamlanir 1 Rastgele greft kopolimer, polietilen oksit omurgasina ve birçok polivinil asetat yari zincirine sahip polivinil asetat greftli polietilen oksit kopolimeridir. Polietilen oksit omurgasinin molekül agirligi yaklasik 6000'dir ve polietilen oksit ila polivinil asetat agirlik orani yaklasik 40 ila 60'tir ve 50 etilen oksit birimi basina 1'den fazla olmayan sayida greftleme noktasi bulunur. 2 Polietilenimin (MW = 600) her -NH için 20 etoksilat grubu içerir. 3 Amfifilik alkoksile yag temizleme polimeri, her -NH için 24 etoksilat grubuna ve her -NH için 16 propoksilat grubuna sahip polietilenimindir (MW = 600). 4 Asagidaki yapiya sahip tersinir proteaz inhibitörü: 5Etoksile tiyofen Renklendirme Boyasi, US 7,208,459 B2'de açiklanan gibidir. /OTHVUW HQLH Tablo A'da ürüne eklenen aktif proteinin %'si olarak ifade edilen soguk su proteazi (bu bulusun) haricinde tüm enzim seviyeler, enzim ham materyali %'si olarak ifade edilir. Tablo B, üstten yüklemeli otomatik yikama makineleri (deterjan bilesimler 7-9) ve önden yüklemeli yikama makinelerine (deterjan bilesimler 10-11) uygun granüler çamasir deterjani bilesimlerini saglar. Mevcut bulusun test edilen GG36 proteaz varyanti ve/veya soguk su proteazi bu formülasyonlara ayri olarak eklenir. Tablo B. Granüler Çamasir Deterjani Bilesimleri ve Bilesenleri Bilesen Sürfaktanlar C16-17 Dallanmis alkil sülfat C12-14 alkil sülfat Alifatik zincir uzunlugu C11-C12 olan sodyum lineer alkilbenzensülfonat Sodyum C14/15 alkol etoksi - 3 - sülfat Sodyum C14/15 alkil sülfat Ortalama 7 mol etoksilasyonu olan C14/15 alkol etoksilat mono-Cam alil mono-hidroksietil di-metil kuaterner amonyum klorid Di metil hidroksil etil Iauril amonyum klorid Zeolit A Sodyum Silikat 1.6.oran Sodyum Silikat 2.35.0ran Sitrik Asit Sodyum tripolifosfat Sodyum Karbonat NonanoiloksibenzensüIfonat Oksaziridinyum-bazli agartma pekistirici Tetrasodyum S,S,-etilendiamindisüksinat Dietilentriamin penta (metilen fosfonik asit). heptasodyum tuzu Hidroksietan dimetilen fosfonik asit Etilen diamin tetraasetat Deterjan Bilesimi Tablo B. Granüler Çamasir Deterjani Bilesimleri ve Bilesenleri Bilesen Deterjan Bilesimi 7 8 9 10 11 Sürfaktanlar Sodyum Perkarbonat 7 4.4 15.9 19.1 Tetra Asetil Etilen Diamin 3.3 4.6 Karboksimetil selüloz (örnegin Finnfix BDA Sodyum Akrilik asit /Maleik asit ko-polimeri Sodyum poliakrilat (Sokalan PA3O CL) 4 0.84 Tereftalat polimeri 0.23 Polietilen glikoI/vinil asetat rastgele greft kopolimeri 0.89 0.89 0.91 C.l. Floresan Parlatici 0.1 Köpük baskilayici granül 0.25 0.07 0.04 Hidrofobik olarak modifiye edilmis karboksi metilselüloz(Finnifix®SH-1) 0.019 0.028 Bentonit 8.35 Diger (Boyalar, parfümler, proses yardimcilari, nem ve sodyum sülfat) Denge Denge Denge Denge Denge Tablo 8'de sürfaktan bilesenleri, bunlarla sinirli olmamak üzere BASF (örnegin, LUTENSOL®), Shell Chemicals, Stepan, Huntsman ve Clariant (örnegin, PRAEPAGEN®) da dahil uygun olan herhangi bir tedarikçiden elde edilebilir. Zeolit, karbonat, sodyum bikarbonat ve sodyum seskikarbonat, Solvay gibi kaynaklardan elde edilebilir. Akrilat/maleat kopolimerleri, BASF gibi kaynaklardan elde edilebilir. Karboksimetilselüloz ve hidrofobik olarak modifiye edilmis karboksimetil selüloz, CPKelco gibi kaynaklardan elde edilebilir. C.I. Floresan Parlatici 260, ?N Sigma;'dan elde edilebilir (örnegin, OPTIBLANC®, OPTIBLANC® 2M/G, OPTIBLANC® 2MG/LT Extra veya OPTIBLANC® Ecobright). Tetrasodyum 8,8-etilendiamin disüksinat, edilebilir (örnegin, REPELOTEX SF 2). Ayrica 1-Hidroksietan-1,1-difosfonik asit, Thermphos'tan elde edilebilir. Oksaziridinyum bazli agartma pekistirici asagidaki NATALASE®, TERMAMYL®, STAINZYME PLU8®, CELLUCLEAN® ve MANNAWAY® enzimleri, Novozymes sirketinden elde edilebilir. Çinko ftalosiyanin tetrasülfonat, Ciba Specialty Chemicals sirketinden elde edilebilir (örnegin, TINOLUX® BMC). Köpük baskilayici granül, Dow Corning sirketinden elde edilebilir. Bu deterjan bilesimlerinde rastgele greft kopolimer, polietilen oksit omurgasina ve birçok polivinil asetat yan zincirine sahip polivinil asetat greftli polietilen oksit kopolimeridir. Polietilen oksit omurgasinin molekül agirligi yaklasik 6000'dir ve polietilen oksit ila polivinil asetatin agirlik orani yaklasik 40 ila 60'tir ve her 50 etilen oksit birimi için 1'den fazla olmayan sayida greftleme noktasi bulunur. Tablolar C-E, yikama makinelerine uygun ek granüler deterjan bilesimlerini (deterjanlar 36a-n) saglar. Mevcut bulusun test edilen GG36 proteaz varyanti veya soguk su proteazi, bu formülasyonlara ayri olarak eklenir. Tablo C. Ek Granüler Çamasir Deterjani Bilesimleri ve Bilesenleri Deterjan Bilesimi Sürfaktanlar qu Iyonik olmayan 0.1843 012-14 alkil sülfat Alifatik zincir uzunlugu C11-C12 olan sodyum Ortalama 7 mol etoksilasyonu olan C14/15 alkol etoksilat mono-03-10 alkil mono-hidroksietil di-metil kuaterner amonyum klorid Di metil hidroksil etil Iauril amonyum klorid 0.1803 Bentonit 8.35 Sodyum Silikat 1.6.oran 0.16 Sodyum Silikat 2.35. oran Sitrik Asit 0.0066 Sodyum tripolifosfat 5.06 Tetrasodyum S,S,-etilendiamindisüksinat Dietilentriamin penta (metlen fosfonik asitd), heptasodyum tuzu 0.62 0.62 0.62 Hidroksietan dimetilen fosfonik asit Etilen diamin tetraasetat 0.2701 Sodyum Perkarbonat 7.06 7.06 3.64 Tetra Asetil Etilen Diamin Sodyum Perborat Monohidrat 1.47 Karboksimetil selüloz (örnegin Finnfix BDA Sodyum Akrilik asit/Maleik asit ko-polimeri Tereftalate polimeri Polietilen glikol/vinil asetat rastgele greft kopolimeri 0.89 Fotoagartici- çinko ftalosiyanin tetrasülfonat C.I. Floresan Parlatici 0.0952 Hidrofobik olarak modifiye edilmis karboksi metil selüloz (Finnifix ® SH-1) Bentonit Diger (Boyalar, parfümler, proses yardimcilari, nem ve sodyum sülfat) Denge Denge Denge Denge Denge Tablo D. Ek Granüler Çamasir Deterjani Bilesimleri ve Bilesenleri Deterjan Bilesimi Sürfaktanlar Cm." Dallanmis alkil sülfat C12.14 alkil sülfat Alifatik zincir uzunlugu C11-C12 olan sodyum Sodyum C14/15 alkol etoksi - 3 - sülfat Sodyum 014115 alkil sülfat Ortalama 7 mol etoksilasyonu olan Cm" alkol etoksilat 2.9 Ortalama 3 mol etoksilasyonu olan Cum alkol etoksilat 2.44 Ortalama 7 mol etoksilasyonu olan C14/15 alkol etoksilat 0.97 1.17 0.97 mono-Cs-1oalkil mono-hidroksietil di-metil kuaterner amonyum klorid 0.45 Di metil hidroksil etil Iauril amonyum klorid 0.195 0.45 Sodyum Silikat 2.0. oran 10.1 Sitrik Asit 1.4 1.84 1.0 Sodyum tripolifosfat 5.73 Nonanoiloksibenzensülfonat 1.73 Tetrasodyum S,S,-etilendiamindisüksinat Dietilentriamin penta (metilen fosfonik asit), heptasodyum tuzu 0.327 0.3272 Sodyum Perkarbonat Tetra Asetil Etilen Diamin Sodyum Perborat Monohidrat 5.55 Karboksimetil selüloz (örnegin, Finnfix BDA önceden CPKelco) 0.62 0.21 Sodyum Akrilik asit/Maleik asit ko-polimeri Sodyum poliakrilat (Sokalan PA30 CL) Tereftalat polimer Polietilen glikoI/vinil asetat rastgele greft kopolimeri 0.55 1.40 Fotoagartici- çinko ftalosiyanin tetrasülfonat C.I. Floresan Parlatici 0.1049 Köpük baskilayici granül Hidrofobik olarak modifiye edilmis karboksi metil selüloz (Finnifix ® SH-1) Bentonit Diger (Boyalar, parfümler, proses yardimcilari, nem ve sodyum sülfat) 4.554 0.911 0.1455 Tablo E. Ek Granüler Çamasir Deterjani Bilesimleri ve Bilesenleri Deterjan Bilesimi Bilesen 36k Sürfaktanlar 0.1957 0.6494 0.793 .85 22.5 3.71 5.24 1.07 0.2622 2.00 1.75 0.231 0.8924 0.911 C16-17 Dallanmis alkil sülfat 012-14 alkil sülfat Alifatik zincir uzunlugu C11-C12 olan sodyum Sodyum C14/15 alkil sülfat Ortalama 7 mol etoksilasyonu olan 014,15 alkol etoksilat 1.0 1.0 1.5 1.5 mono-08-10 alkil mono-hidroksietil di-metil kuaterner amonyum klorid Di metil hidroksil etil Iauril amonyum klorid Sodyum Silikat 2.0. oran 0.06 0.06 Sodyum Silikat 2.35. oran Sodyum tripolifosfat Nonanoiloksibenzensuülfonat Dietilentriamin penta (metilen fosfonik asit), heptasodyum tuzu Etilen diamin tetraasetat Sodyum Perborat Monohidrat Karboksimetil selüloz (örnegin, Finnfix BDA Sodyum Akrilik asit/Maleik asit ko-polimeri Polietilen glikoI/vinil asetat rastgele greft Fotoagartici- çinko ftalocsiyanin tetrasülfonat C.I. Floresan Parlatici Hidrofobik olarak modifiye edilmis karboksi metil selüloz (Finnifix ® SH-1) Bentonit Diger (Boyalar, parfümler, proses yardimcilari, nem ve sodyum sülfat) Denge Denge Denge Denge Denge Tablolar C, D, E'deki deterjan bilesimlerine 36a-n yönelik notlar: Sürfaktan bilesenleri, BASF, Ludwigshafen, Almanya (Lutensol®); Shell Chemicals, Londra, UK; Stepan, Northfield, IIlinois, USA; Huntsman, Huntsman, Salt Lake City, Utah, USA; Clariant, Sulzbach, Almanya'dan (Praepagen®) elde edilebilir. Zeolit, Industrial Zeolite (UK) Ltd, Grays, Essex, UK'den elde edilebilir. Sitrik asit ve sodyum sitrat, Jungbunzlauer, Basel, Isviçre'den elde edilebilir. Sodyum perkarbonat, sodyum karbonat, sodyum bikarbonat ve sodyum seskikarbonat, Solvay, Brussels, Belçika'dan elde edilebilir. Akrilat/maleat kopolimerleri, BASF, Ludwigshafen, Almanya'dan elde edilebilir. Karboksimetilselüloz ve hidrofobik olarak modifiye edilmis karboksimetil selüloz, CPKelco, Arnhem, Hollanda'dan elde edilebilir. C.I. Floresan Parlatici 260, Optiblanc® Optiblanc® 2M/G, Optiblanc® 2MG/LT Extra veya Optiblanc® Ecobright olarak 3V Sigma'dan elde edilebilir. Terasodyum S,S-etilendiamin disüksinat, Innospec, Ellesmere Port, UK'den elde edilebilir. Tereftalat ko-polimer, Repelotex SF 2 markasi ile Clariant'dan elde edilebilir. 1- Hidroksietan-1,1-difosfonik asit, Thermphos, VIissingen-Oost, Hollanda'dan elde edilebilir. Oksaziridinyum-bazli agartma pekistirici, asagidaki yaoiya sahiptir, burada R1 = 2- »ilker/`«X MRG? 1 @a /L . Natalase ®, Termamyl ®, Stainzyme Plus®, Celluclean® ve Mannaway ® enzimleri, Novozymes, Bagsvaerd, Danimarkaidan elde edilebilir. Çinko ftalosiyanin tetrasülfonat, Tinolux® BMC olarak Ciba Specialty Chemicals, Basel, Isviçreiden elde edilebilir. Köpük baskilayioi granül, Dow Coming, Barry, UK`den elde edilebilir. Rastgele greft kopolimer, polietilen oksit omurgaya ve birçok polivinil asetat yan zincirine sahip polivinil asetat greftli polietilen oksit kopolimeridir. Polietilen oksit omurganin molekül agirligi yaklasik 6000`dir ve polietilen oksit ila polivinil asetatin agirlik orani yaklasik 40 ila 60'tir ve her 50 etilen oskit birimi için 1'den fazla olmayan sayida greftleme noktasi bulunur. Analizler ve Test Yöntemleri Bu Örnek, mevcut bulusun gelistirilmesinde kullanilan çesitli Test Yöntemlerini ve analizleri açiklar. Saglanan protokollerden her türlü sapma ilgili Örneklerde gösterilir. Analizler, Biomek FX Robot (Beckman Coulter) veya çok kanalli pipet (örnegin, Rainin PipetLite, Mettler-Toledo) ve SpectraMAX MTP Okuyucu (tip 340; Molecular Devices) kullanilarak gerçeklestirilmistir. A. TEST METHODS A. TEST YÖNTEMLERI Test Yöntemi 1 Bir boya veya pigment materyalinin, bulusun amacina yönelik kumas renklendirme maddesi olup olmadiginin tanimlanmasina yönelik bir protokol asagida saglanmaktadir: iki tergotometre kabi, 800 ml Newcastle upon Tyne, UK Sehir Suyu (US galonu basina ~12 grain toplam sertlik, Northumbrian Water, Pity Me, Durham, C0. Durham, UK tarafindan tedarik edilmistir) ile doldurulur. Kaplar, tergotometreye yerlestirilir, deney süresinde su sicakligi 30°C'de kontrol edilir ve çalkalama islemi, 40 rpm'e ayarlanir. Her kaba wfk, Brüggen-Bracht, Almanya tarafindan tedarik edilen 4.89 of eklenir. Iki dakika sonra birinci kaba 2.0 mg aktif renklendirici eklenir. Bir dakika sonra her kaba, 50m x 5cm'lik parçalar halinde kesilmis 50 9 düz pamuk atlet (Warwick Equest, Consett, County Durham, UK tarafindan tedarik edilmistir) eklenir. dakika sonra kaplarin suyu bosaltilir ve tekrar, 3:1 Kalsiyum ila Magnezyum molar orani olan 14.4 Clark Ingiliz Sertlik Derecesinde su sertligine sahip soguk Su (16°C) ile doldurulur. 2 dakikalik durulama sonrasinda kumaslar çikarilir. Ayni islemler kullanilarak adimlar 3-7 üç döngü daha tekrarlanir. Kumaslar toplanir ve iç mekanda 12 saat asarak kurutulur. ) Hunter a (kirmizi-yesil eksen) ve Hunter b (sari-mavi eksen) degerlerini elde etmek üzere D65 aydinlatici ve UVA kesme filtresi olan Hunter Miniscan spektrometresi kullanilarak parçalar analiz edilir. 11)Her kumas grubu için Hunter a ve Hunter b degerlerinin ortalamasi alinir. Analiz edilen renklendirici ile islenmis kumaslarin, renkolarak a ekseninde veya b ekseninde 0.2 üniteden daha fazla ortalama farki göstermesi halinde bulusun amacina yönelik kumas renklendirme maddesi olarak kabul edilir. Test Yöntemi 2 Test Yöntemi 2 için asagida saglanan BMI mikro-numune analizi, granüler deterjan bilesimi 10 (Bakiniz Tablo D, yukarida) kullanilarak gerçeklestirilir. Çamasir deterjani, 129pg olan bir sertlige sahip su içinde çözülür ve 16°C`Iik sicakliga ayarlanir ve ilgili proteaz varyanti enzim eklenir. Proteaz varyanti enzimlerin performansi akabinde açiklanan BMI mikro-numune analizine göre belirlenir. Performans indeksi, proteaz varyanti enzimin performansinin, SEO ID NO:2'nin amino asit dizisine sahip B. lentus GGBB subtilisin enzimininki ile karsilastirilmasi yoluyla belirlenir, tüm durumlarda enzim dozaj araligi, 0.1 -5 ppm"dir. 1.1 veya daha yüksek performans indeksine sahip proteaz varyanti enzimler, soguk su proteazlari olarak incelenir. Test Yöntemi 3 Test Yöntemi 3 için asagida saglanan BMI mikro-numune analizi, granüler çamasir deterjani bilesimi 7 (Bakiniz Tablo D, yukarida) kullanilarak gerçeklestirilir. Çamasir deterjani, @gpg olan sertlige sahip su Içinde çözülür ve 16°C'Iik sicakliga ayarlanir, ilgili GG36 proteaz varyanti enzim eklenir. GGSG proteaz varyanti enzimlerin performansi akabinde açiklanan BMI mikro-numune analizine göre belirlenir. Performans indeksi, GG36 proteaz varyanti enzimin performansinin, SEQ ID NO:2,nin amino asit dizisine sahip B. Ientus GG36 subtilisin enzimininki ile karsilastirilmasi yoluyla belirlenir, tüm durumlarda enzim dozaj araligi, 0.1 - 5 ppm'dir. 1.1 veya daha büyük performans indeksine sahip GG36 proteaz varyanti enzimler, soguk su proteazlari olarak incelenir. Test Yöntemi 4 Test Yöntemi 4 için BMI mikro-numune analizi, granüler çamasir deterjani bilesimi 7 (Bakiniz Tablo D, yukarida) kullanilarak gerçeklestirilir. Çamasir deterjani, ßgpg sertlige sahip su içinde çözülür ve 16°C'Iik sicakliga ayarlanir ve ilgili GGßö proteaz varyanti enzim eklenir. GG36 proteaz varyanti enzimlerin performansi, açiklanan BMI mikro-numune analizine göre belirlenir. Performans indeksi, GG36 proteaz varyanti enzimin performansinin, referans enzim GGSö-A158E ile karsilastirilmasi yoluyla belirlenir, söz konusu GG36- A158E referans enzim, 158. pozisyonda glutamik asidin alanin ile tek bir sübstitüsyonuna (yani, A158E mutasyonu) sahip SEQ ID NO:2'nin B. lentus subtilisin GG36 proteaz amino asit dizisinden olusur, tüm durumlarda enzim dozaj araligi, 0.1 - ppm arasindadir. 1.0 veya daha büyük performans indeksine sahip GGSG proteaz varyanti enzimler, soguk su proteazlari olarak incelenir. Test Yöntemi 6 Test Yöntemi 6 için BMI mikro-numune analizi, Tablo 1-2'deki deterjanlardan 36a-36n biri kullanilarak gerçeklestirilir. Deterjan, Tablo 1-2'de belirtilen sertlige sahip su içinde çözülür ve 16°C'Iik sicakliga ayarlanir. Varyant enzimlerin performansi akabinde, açiklanan BMl mikro-numune analizine göre belirlenir. Performans indeksi, varyant performansinin, SEQ lD NO:2,nin enzimininki ile karsilastirilmasi yoluyla belirlenir, enzim dozaj araligi tüm durumlarda, 0.1 - 5 ppm'dir. 1.1 veya daha büyük performans indeksine sahip enzimler, soguk su proteazlari olarak incelenir. Test Yöntemi 7 Test Yöntemi 7 için BMl mikro-numune analizi, Tablo 1'deki deterjanlardan biri kullanilarak gerçeklestirilir. Deterjan, Tablo 1'de belirtilen sertlige ve tampona sahip su içinde çözülür ve 16°C veya 25°C'Iik bir sicakliga ayarlanir. Varyant enzimlerin performansi akabinde, açiklanan BMI mikro-numune analizine göre belirlenir. Performans indeksi, varyant performansinin, SEQ ID NO:2'nin enzimininki ile karsilastirilmasi yoluyla belirlenir, enzim dozaj araligi tüm durumlarda, 0.1 - 5 ppm'dir. 1.1 veya daha büyük performans indeksine sahip enzimler, soguk su proteazlari olarak incelenir. B. ANALIZLER Protein Içerigi Tayinine yönelik TCA Analizi B. subtilis kültürleri, nemlendirilmis havalandirma ile 250-300 rpmide çalkalanarak 37°C'de 2-3 gün büyütülmüstür. Hücreler, santrifüj ve/veya filtrasyon ile enzim içeren kültür üst fazindan uzaklastirilmistir. Proteaz/protein/enzim konsantrasyonu, TCA çöktürme analizi kullanilarak belirlenmistir. Kültür üst fazindan bir alikuot (20-25 ul), 100 pL/göz 0.25 N HCI içeren 96 gözlü düz tabanli mikrotitre plakaya (MTP: Costar 9017 ortamini baglayan temiz polistiren plaka) transfer edilmistir. "Referans deger" okumasi, 5 saniyelik karistirma sonrasinda 405 nm'de isik saçilma/absorbans ile belirlenmistir. , HCI içeren plakaya eklenmistir ve protein çökmesini kolaylastirmak üzere oda sicakliginda 10 dakika inkübe edilmistir. Bu "test" plakasinin 405 nm`deki isik saçilmasi/absorbansi, 5 saniyelik karistirma sonrasinda belirlenmistir. Numunelerdeki türbidite/isik saçilmasi, kültür üst fazindaki çökebilen toplam protein miktari ile koreledir. Hesaplamalar, bulunan toplam proteinin nispi ölçümünü saglamak amaciyla "referans deger" okumasinin (HCI eklendikten sonra elde edilen) "test" okumasindan (TCA eklenmesinden sonra elde edilen) çikarilmasi ile gerçeklestirilmistir. Protein konsantrasyonu ile bir dönüsüm faktörü iliskili protein çökmesi, bilinen konsantrasyonun GG36 standardi için belirlenmistir. Bu dönüsüm faktörü, çökelme konsantrasyon ile lineer oldugundan tüm varyantlar için kullanilabilir. istenmesi halinde TCA okumalarinin, bilinen spesifik aktivitesi olan klonlarin proteaz analizleri (asagi bakiniz) ile kalibre edilmesi yoluyla standart bir egri olusturulabilir. Ancak TCA sonuçlari, 50 ila 500 milyonda bir parça (ppm) protein (burada 1 ppm, 1 mg/L'ye karsilik gelir) olan protein konsantrasyonu ile Iineerdir ve bu nedenle istenen performansa sahip varyantlarin seçilmesi amaciyla enzim performansina karsi direkt olarak grafiklenebilir. AAPF Proteaz Analizi Serin proteaz varyantlarinin, daha spesifik olarak subtilisin varyantlarinin proteaz aktivitesini belirlemek amaciyla N-süksinil-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenil-p-nitroanilid (suc-AAPF-pNA) hidrolizi ölçülmüstür. Kullanilan reaktif solüsyonlari sunlardir: % içeren 100 mM Tris/HCI, pH 8.6; 1 mM CaCl2 ve DMSO içindeki (Sigma: S- 7388). suc-AAPF-pNA çalisma solüsyonunu hazirlamak amaciyla 1 ml suc-AAPF-pNA stok solüsyonu, 100 ml Tris/Ca tamponuna eklenmistir ve en az 10 saniye iyice karistirilmistir. Analiz, 96 gözlü MTPtnin her gözüne 10 pl seyreltilmis proteaz solüsyonu eklenmesi, hemen akabinde 190 pl 1 mg/ml suc-AAPF-pNA çalisma solüsyonu eklenmesi yoluyla gerçeklestirilmistir. Solüsyonlar 5 saniye karistirilmistir ve kinetik moddaki absorbans degisimi (5 dakikada 25 okuma), 25°C'de MTP okuyucuda 405 nm'de okunmustur. Proteaz aktivitesi, AU olarak ifade edilmistir (aktivite = AOD-min'1 ml'1). 96 gözlü mikrotitre plakalarda (MTP; Coming 3641) 5.5 milimetrelik dairesel çapi olan önceden durulanmis ve delinmis kan, süt ve mürekkep (BMI) boyali mikro-numuneler (EMPA116), Center for Testmaterials BV'den (Vlaardingen, Hollanda) elde edilmistir. Tablo 1'de deterjanlar, Tablo 1'de açiklandigi üzere deterjan bilesimleri 104 ve 105 için sodyum karbonat tamponu içinde uygun sertlik seviyesindeki su (3:1 CazMg. - CaCI2: MgCI2-6H20) ile en az 30 dakika karistirilarak hazirlanmistir. Deterjanlar santrifüjlenmistir ve çökeltiyi uzaklastirmak üzere filtrelenmistir ve 16°C'de gerçeklestirilen analizler için kullanimdan önce 30 dakika buz üzerinde sogutulmustur. Enzim konsantrasyonlari, saflastirilmis GGSG standardina göre 20-50 ppm arasinda degisen istenen sabit konsantrasyona esitlenmistir. Substrat olarak AAPF kullanilarak GG36'nin spesifik aktivitesi, referans degerin çikartildigi TCA degerlerinin ppm cinsinden enzim konsantrasyonuna dönüstürülmesi amaciyla kullanilmistir. Enzim konsantrasyonu ppm cinsinden belirlendiginde istenen stok enzim konsantrasyonunu elde etmek üzere tamponun sabit hacmine ( eklenmek için gerekli olan her varyant hacmini hesaplamak amaciyla basit bir formül kullanilmistir: x= (hedef ppm) (Vb)l(y-hedef ppm) Burada x=enzimin hacmi, y=enzim konsantrasyonu, vb=tamp0n hacmi Versispan 8 kanalli kolu olan Perkin-Elmer Janus robotu, degisken hacimdeki enzimi kaynak plakadan (Axygen TCA enzim konsantrasyonu analizinde kullanilan toplanmis, hasat edilmis varyantlari içeren yari derin gözlü plaka) tampon dolu hedef plakaya iletken uçlar ile dagitmak amaciyla kullanilmistir. Numuneler, pipetle karistirilarak üç kez karistirilmistir. Enzim solüsyonlarinin dogrulugu, dogru dilüzyonlarin yapilmis oldugunu dogrulamak amaciyla dengelenmis plakanin AAPF aktivitesinin ölçülmesi ve bunun, kaynak plakaninki ile karsilastirilmasi yoluyla dogrulanmistir. Dengeleme sonrasinda ~200 pL'lik nihai hacme ulasmak üzere deterjan dolu BMI mikro-numune plakasina 5-15 uL enzim solüsyonu eklenmistir. Bazi durumlarda enzim numuneleri dengelenmemistir ve bunun yerine tümü, 0.1 ila 5 ppm'lik çalisma araligini vermek üzere stok plakadan esit olarak seyreltilmistir. Her analize yönelik ideal hedef konsantrasyonlar, belirli bir deterjan için bu aralik boyunca temizlik aktivitesinin ölçülmesi ile doz yanit egrisinden belirlenmistir. MTP folyo (Bio-Rad) ile kapatilmistir ve 4°C'ye ayarlanmis soguk odada önceden 16°C'ye ayarlanmis iEMS inkübatör/çalkalayicida (Thermo/Labsystems) veya 32°Cide tezgah üzerinde 1400 rpm'de 30 dakika inkübe edilmistir. Inkübasyon sonrasinda transfer edilmistir ve SpectraMax okuyucu kullanilarak 600 nm'de okunmustur. Dogru absorbans Okumalari, kör kontrolün (enzim yok) her degerden çikarilmasi yoluyla elde edilmistir. Performans indeksi (Pl), her varyant için hesaplanmistir. Performans indeksi, varyant enzim temizligi ile olusturulan üst faz absorbansinin sabit bir enzim konsnatrasyonunda GG36 temizlemesi ile olusturulan absorbansa oranidir. PI degerleri, bir varyant absorbansinin belirli bir plakadaki kontrolünkine bölünmesi ile hesaplanmistir. Ayni varyantin çoklu versiyonlarinin bir kütüphane görüntüsünde elde edilmesi halinde bunlarin PI degerlerinin tek bir temsili degeri türevlendirmek üzere ortalamasi alinmistir. 1'den büyük olan (PI1) performans indeksi (Pl), standarda göre (örnegin (3636) bir varyant ile üstün temizlemeyi gösterirken 1 olan PI (Pl=1), standart ile ayni performansi gösteren varyanti tanimlar ve 1'den az (Pl<1) olan PI, standarttan daha kötü performans gösteren varyanti tanimlar. Tablo 1-1: Deterjan Bilesimleri Tablo 1-1: Deterjan Bilesimleri Deterjan Bilesimleri Alifatik zincir uzunlugu C11-C12 olan sodyum lineer alkilbenzensülfonat Sodyum C12.17 alkol etoksi sülfat Ortalama 7 mol etoksilasyonu olan C10-15 alkol etoksilat Zeolit Sodyum Silikat Sitrik Asit Sodyum tripolifosfat Sodyum Karbonat Nonanoiloksibenzensülfonat Oksaziridinyum bazli agartma pekistirici Tetrasodyum 8,8,- etilendiamindisüksinat fosfornik asit), heptasodyum salt (DTPA) Hidroksietan dimetilen fosfonik Etilen diamin tetraasetat Sodyum Perkarbonat Tetra Asetil Etilen Diamin Sodyum Perborat Monohidrat 14.47 11.93 13.47 .21 26.09 17.78 .54 23.28 19.35 23.77 14.11 Tablo 1-1: Deterjan Bilesimleri Deterjan Bilesimleri Finnfix BDA ex CPKeIco) Sodyum akrilik asit/ akrilik- maleik asit kopolimer rastgele graft kopolimer Foto agartma- çinko ftalosiyanin tetrasülfonat Floresan Parlatici Köpük Baskilayici Granül Diger (Boyalar, parfümler, proses yardimcilari, nem ve sodyum sülfat) * (3:1 Ca:Mg) Metinde detayli sekilde açiklanan konsantrasyon. TABLE 1-2: BMI Mikro-numune Analizlerine yönelik Kullanilan Nihai Deterjan, Su Sertligi ve Tampon Konsantrasyonlari Deterjan Nihai Deterjan Nihai Bilesimi Bilesimi (gIL) 2 2.25 3 0.719 4 0.625 0.625 6 7.69 7 7.69 Sertligi* Su Nihai Tampon Sodyum Karbonat Konsantrasyonu Performans Indeksi Performans indeksi, ayni protein konsantrasyonunda varyantin (ölçülen deger) ve standart enzimin (teorik deger) performansini karsilastirir. Ayrica teorik degerler, standart proteazin performans doz yanit egrisinin parametreleri kullanilarak hesaplanabilir. G636"nin Varyantlarinin ve KombinasyOnel Kütüphanelerinin Yapisi Bu Örnek, pHPLT-GGSG B. subtilis ifade plazmidi kullanilarak B. subtili's'de yapilan GG36 varyantlari ve kütüphanelerinin soguk suda temizlenmesini açiklar. Bu B. subtilis ifade plazmidi, asagida gösterilen GG36 ifade kasetini, B. Iicheniformis LAT promotörünü (Plat), bir replikaz geni (reppUB), bir neomisin/kanamisin direnç geni (neo) ve bir bleomisin direnç markörü (bleo) (US Patent No. 6,566,1123de sekil 4) dahil saglanir. GG36'nin DNA dizisi (sinyal dizisi, küçük harflerle, propeptit küçük harf, altti çizi metin halinde ve GG36 olgun dizi büyük harflerle gösterilir) asagida saglanir: mutajenezi (Stratagene) ile olusturulmustur veya bunlar, DNA2.0, Inc. veya GeneArt'ta sentezlenmistir. pHPLT -GG36 plazmidi, GGSG varyant genlerinin klonlanmasi için veya mutajenez reaksiyonlari için kullanilmistir. B.3ubti/i's'te kütüphaneler ve varyantlarin etkili transformasyonu için 1 mikrolitre bagli kütüphane ürünü veya mutajenez reaksiyonu, Bacillus subtilis'e transformasyon için multimerik DNA üretmek üzere üreticinin talimatlarina (GE Healthcare) göre Illustra Templiphi kiti ile yuvarlanan çember amplifikasyonu kullanilarak çogaltilmistir. Yuvarlanan çember amplifikasyonu ürünleri, 100 kat seyreltilmistir ve B. subtili's hücrelerini (genotip: AaprE, AnprE, amyE::xyIRPxyIAoomK-phleo) transforme etmek üzere kullanilmistir. Transformasyon karisiminin bir alikuotu, %1.6 yagsiz Süt ve 10 ug/mL neomisin içeren LB plakalarinda plakalanmistir ve 37°C'de bir gece inkübe edilmistir. Daha sonra halolar ile koloniler, plazmid DNA ekstraksiyonu için 10 pg/mL neomisin içeren 120 pl Luria besi yeri ortaminda inoküle edilmistir (QIAprep Spin Miniprep kit, Qiagen). Ekstrakte edilen plazmidler, istenen mutasyonlarin varligini dogrulamak üzere dizilenmistir. Varyantlar, Örnek 1`de açiklanan sekilde (TCA analizi) B. subtilis hücrelerinde (genotip: AaprE, AnprE, amyE::xlePxyIAcomK-phleo) ifade edilmistir ve ayrica Örnek 1'de açiklanan sekilde BMI mikro-numune temizleme analizi kullanilarak karakterize edilmistir. asagidaki tablolarda deterjan bilesimleri ("Deterjanlar"), yukarida Tablo 1'de gösterilenlere karsilik gelir. Ayrica gösterildigi üzere amino asit pozisyonu BPN' numaralandirmasina göre Iistelenir. TR TR TR TR TR TR TR