TR201904385T4 - Optimize Fc varyantları - Google Patents

Abstract

Buluş, bir Fc bölgesi içeren bir parent polipeptidin bir varyantıyla ilgili olup, varyant söz konusu parent polipeptide kıyasla FcRn?ye artan bağlanma sergiler ve Fc bölgesinde en az bir amino asit modifikasyonu içerir.

Description

TARIFNAME OPTIMIZE FC VARYANTLARI Bulusun Sahasi Mevcut bulus bir FC bölgesi içeren bir parent polipeptidin bir varyantiyla ilgilidir. Söz konusu varyant parent polipeptide kiyasla FcRn'ye artan baglanma sergiler ve Fc bölgesinde en az bir amino asit modifikasyonu içerir. Ilqili Teknigin Açiklamasi Monoklonal antikorlar, kanser, otoimmün hastaliklari, kronik enflamatuar hastaliklar organ nakli reddi, enfeksiyöz hastaliklar ve kardiyovasküler hastaliklar dahil olmak üzere çesitli durumlarin tedavi edilmesi için terapötikler olarak kullanilmaktadir. Halihazirda, piyasada onaylanmis yirminin üzerinde ve klinik gelisimde dört yüzden fazla monoklonal antikor veya monoklonal antikor fragmani ürünleri bulunmaktadir. Böyle bir kabul görmeye ve vaade ragmen, antikorlarin yapisal ve fonksiyonel özelliklerinin optimizasyonu için kayda deger bir ihtiyaç devam etmektedir. Monoklonal antikorlarin terapide kullanimindaki kritik hususlarin biri, kan dolasimindaki devamliliklaridir. Antikor klirensi hizi terapinin etkililigini dogrudan etkiler ve dolayisiyla ilaç verilisinin sikligi ve miktari hastada advers etkilere neden olabilir ve ayrica tibbi maliyetleri arttirabilir. immünoglobülin sinifidir. IgG homeostazinin mekanizmasi, anneden fetüse veya kemirgenlerdeki yeni doganlara pasif bagisikligin aktarilmasiyla ilgili çalismalar yoluyla çalismalarda, Brambell, lgG'nin materno-fötal aktarimi için bir reseptör oldugunu ve lgG'nin materno-fötal aktariminda ve IgG'nin katabolizmasinda yer alan mekanizmanin ya ayni veya en azindan çok yakindan ilgili oldugunu dogru olarak kabul etmistir Çalismalar IgG'nin kutuplanmis hücreler içerisinde ve boyunca tasinmasina Fc bölgesinin, neonatal Fc reseptörü (FcRn) isimli yüksek-afiniteli bir Fc-reseptörüne baglanmasinin aracilik ettigini bulmustur. FcRn, majör histokompatibilite kompleksi sinif I moleküllerinin a-zincirinin hücre disi alanlarina yapisal homolojiye sahip bir transmembran oi-zinciri ve ßz-mikroglobütinden (ßzm) olusan bir çözünür hafif zincir içeren bir heterodimerdir (Simister and Mostov, 1989, Cold Spring Harb Symp Quant Biol.:54 Pt 1:571-80). Insanlarda, FcRn plasental hücrelerde, intestinal, böbrek ve bronsiyal epitelyal hücrelerinde, endotelyal hücrelerde ve ince bagirsak makrofajlari, monositler ve monosit-türevi dentritik hücreler gibi hematopoetik hücrelerde eksprese 6,0-6,5'da etkili baglanmayla ve pH 7,0-7,5'ta salinmayla iki ana Iigandi olan IgG ve Katabolizmadan IgG korumasi için önerilen mekanizma, IgG'Ierin özgül-olmayan pinositoz ile düsük pH'nin FcRnyye baglanmayi tesvik ettigi endotelyal hücrelerin endozomlarinin içine özümsenmesidir (Ghetie and Ward, 1997, Nat. Biotechnol.,15 : 637-40). Bagli IgG-FcRn kompleksleri hücre yüzeyine geri dönüstürülür ve kandaki dolasimina geri dönerek hücre disi sivinin nötr pH'inda ayrilir. FcRn'ye baglanmayan için konsantrasyon-bagimli katabolizma mekanizmasina göre, düsük serum IgG konsantrasyonlarinda, reseptör endositozlanmis tüm IgG'yi baglayabilir ve uzun bir IgG yari-ömrü saglayarak bunu dolasima geri gönderir. Aksine, yüksek IgG konsantrasyonlarinda, reseptör IgG tarafindan doyurulur ve lgG'nin ana bir kesitinin bagi reseptör tarafindan kesilir ve bagsiz IgG'nin daha hizli bir katabolizmasini saglayarak bozunmak üzere hareket eder. Fare lgG'lerinin Fc bölgesinde çesitli alana-özgü mutajenez deneyleri, IgG ile FcRn arasindaki etkilesimde yer alan belirli kritik amino asit kalintilarinin tanimlanmasina yol numaralandirmasina göre, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological histidinin insan ve kemirgen IgG'Ierinde oldukça korunmus oldugunu bulmustur ve bu da bunlarin IgG-FcRn baglanmasindaki önemini öne sürmektedir. Bu amino asit kalintilari CH2-CH3 alanlari ara yüzünde yer alir ve bu kalintilara fonksiyonel alanin eslestirilmesi siçan Fc'si ile komplekslenen siçan FcRn'sinin X-isini kristolagrafik 252 konumunu, 254 konumunu ve 256 konumunu rastgele mutajenize etmistir. Bir mutant fare FcRn'si için, dogal-susunkine kiyasla üç buçuk kat daha yüksek bir afinite ve sirasiyla iki fare susunda yaklasik %23 veya %65 daha uzun bir yari-ömür göstermistir. konumunda, 310 konumunda veya 435 konumunda amino asit ikameleriyle mutajenize etmistir. Mutant FC-mentese fragmanlarinin dogal-sus IgG1 Fc-mentese fragmanina kiyasla farelerde indirgenmis serum yari-ömürlerine sahip oldugunu bulmustur ve lle253, His310 ve His435'in, IgG'nin serum yari-ömrünün düzenlenmesinde merkez bir rol oynadigi sonucuna ulasmistir. bölgesindeki 253 konumunda tek bir amino asit ikamesinin farelerde klirensi hizlandirdigini ve kati tümörlerin immünosintigrafisini gelistirdigini göstermistir. bölgesindeki kalintilari degistirmek için alanin tarama mutajenezini kullanmis ve daha sonra insan FcRn'sine baglanmayi tayin etmistir. Alanine degistirildiginde FcRn'ye Baglanmada daha az telaffuz edilen indirgeme göstermis diger konumlar asagidaki alanine degistirildiginde FcRn baglanmasinda bir gelisme sergilemistir; bunlar arasinda 8424 ve N434'tür. Birçok diger amino asit konumu FcRn baglanmasinda hafif bir K447). En çok telaffuz edilen katilabilirligin, FcRn'ye gelismis baglanmaya sahip kombinasyon varyantlari için oldugu bulunmustur. pH 6,0'da, E380A/N434A varyanti natif IgG1'e iyi baglanma göstermistir. Buna T307A'nin eklenmesi, natif IgG1'e göre baglanmada 12-kat bir gelismeyle sonuçlanmistir. mentese-Fc fragmani faj görüntüleme kütüphanelerinin rastgele mutajenezini ve FcRn kompleksi stabilitesinde ana gelismeler, Fc-FcRn ara yüzü boyunca bir bantta yer ikamelerinde meydana gelir. Insan FcRn'sine en yüksek afiniteye sahip varyant, edilmis ve dogal-sus IgG1'e göre afinitede 57-katlik bir artis sergilemistir. baglanmasini, sirasiyla yaklasik 3 ve 7-kat arttiran iki mutasyon olan T250Q ve M428L'yi tarif etmistir. Kombinasyon halinde, bu iki mutasyon lgG2'nin 28-kat artan bir baglanma kapasitesini indüklemistir. Farmakokinetik çalismalar için makaklara enjekte yaklasik 2-kat daha uzun yari-ömürler göstermistir. solunum sinsisyal virüsü IgG1'ini tarif etmistir. Bu mutasyonlar pH 7,4'te etkili salima olanak saglarken insan FcRn'sine baglanmayi pH 6,0'da yaklasik 10-kat arttirir insan IgG1'inin in vi'vo davranisi, sinomolgus maymununda serum yarim-Ömrünü dogal-sus IgG1'e kiyasla neredeyse 4-kat bir artis sergilemistir. Ek olarak, çesitli yayinlar, yari-ömürleri ya moleküllerin içine bir FcRn-baglayici korunan ancak diger FC reseptörleri için afiniteleri fazlasiyla indirgenmis olan antikorlarla kaynastirilmasiyla (WO 99/43713) veya antikorlarin FcRn baglayici edilen fizyolojik olarak aktif moleküllerin elde edilmesi için yöntemler tarif etmektedir. U.S. Pat. No. 6.165.745, antikoru kodlayan DNA segmentinin içine bir mutasyon ekleyerek azalan bir biyolojik yari-ömre sahip bir antikor üretmenin bir yöntemini konumunda bir amino asit ikamesi içerir. PCT Yayini No. WO 00/42072, degistirilmis FcRn baglanma afinitesine sahip bir varyant Fc bölgesi içeren bir polipeptit açiklamakta olup polipeptit, Fc bölgesinin 238, 447 amino asit konumlarinin herhangi birinde veya daha fazlasinda bir amino asit modifikasyonu içermekte olup, burada Fo bölgesindeki kalintilarin numaralandirilmasi EU endeksininkidir (Kabat et al., a.g.e.). PCT Yayini No. WO 02/060919 A2, bir dogal-sus IgG sabit alanina göre bir veya daha fazla amino asit modifikasyonu içeren bir IgG sabit alani içeren bir modifiye IgG açiklamakta olup, burada modifiye IgG, dogal-sus IgG sabit alanina sahip bir lgG'nin yari-ömrüne kiyasla artan bir yari-ömre sahiptir ve burada bir veya daha fazla amino konumlarinin birinde veya daha fazlasindadir. Teknikte yeni optimize Fc varyantlari için halen bir ihtiyaç bulunmaktadir. Bulusun kisa açiklamasi Ekli istemler tarafindan tanimlandigi üzere mevcut bulus, bir parent polipeptidin optimize edilmis özelliklere sahip bir varyantini saglamaktadir. Optimize özelliklere FcRniye, karsilik gelen parent polipeptitten daha yüksek baglanma özelligi dahildir. Bir baska uygulamada, ekli istemler tarafindan tanimlandigi üzere bulus, bulusun varyantini içeren farmasötik bir bilesim saglamaktadir. Bir baska uygulamada, ekli istemler tarafindan tanimlandigi üzere bulus, bulusun varyantini kodlayan bir izole nükleik asit saglamaktadir. Bir baska uygulamada, ekli istemler tarafindan tanimlandigi üzere bulus, yukarida tarif edilen nükleik asidi içeren bir vektör saglamaktadir. Bir baska uygulamada, ekli istemler tarafindan tanimlandigi üzere bulus, yukarida tarif edilen bir vektör ihtiva eden bir konak hücre saglamaktadir. Bir baska uygulamada, ekli istemler tarafindan tanimlandigi üzere bulus, bir polipeptidi varyanti üretmek için, yukarida tarif edilen konak hücrenin kültürlenmesini, böylece nükleik asidin eksprese edilmesini içeren bir yöntem saglamaktadir. Bir baska uygulamada, bulusun bir varyantini içeren bir ilaç saglanmaktadir. Bir baska uygulamada, ekli istemler tarafindan tanimlandigi üzere bulus, bulusun bir varyantinin bir ilacin üretilmesi için kullanilmasini saglamaktadir. Bir baska uygulamada, FC optimize varyantlarinin tanimlanmasi için bir yöntem saglanmaktadir. Sekillerin kisa açiklamasi Sekil 1, bir insan IgG1 agir zincirinden (F türetilen 226-447 (Kabatlta oldugu gibi EU endeksi) amino asit kalintilarini kodlayan insan Fc geninin içine klonlanmis oldugu fajmid vektörü pMG58', göstermektedir. CVDE: VMA1-türevi endonükleazin C-terminal parçasi, VMA: koful ATPaz alt birimi (VMA), CPIII: faj M13'ün kapsit proteini plll'ün (veya p3) C-terminal parçasi Sekil 2, kati evrede (2A) ve solüsyonda (28) F0 varyantlari seçimi için kullanilan yöntemleri göstermektedir. FoRn-biyotu biyotinlenmis FcRn'yi ifade etmektedir ve FcRn-p3, FcRn-p3 füzyon proteinini ifade etmektedir. Fc-faji. kapsidi üzerinde bir Fc varyantini eksprese eden bakteriyofaj M13"tür. Kati evre seçimindei immüno-plakalarin kuyucuklari FcRn-p3 füzyon proteiniyle (FC-Rn-p3) veya nötravidin ve ardindan FcRn- biyotuyla kaplanir. Sekil 3, seçilen Fc varyantlari üzerinde gerçeklestirilen faj-ELISA tayininin prensibini göstermektedir. Fc-faj, kapsidi üzerinde bir Fc varyanti eksprese eden bir bakteriyofaj M131tür. FcRn-p3, immüno-plakalarin kuyucuklari üzerine kaplanan FcRn-p3 füzyon proteinidir. Anti-M13, ELISA saptamasi için Yaban turpu peroksidazina (HRP) kaynastirilan fare anti-M13 antikorunu ifade etmektedir. Sekil 4, F0 lgG1`in her bir amino asit konumu için söz konusu konumda bir modifikasyon içeren mutantlarin yüzdesini temsil eden bir histogrami göstermektedir. X-koordinati: mutasyona ugratilmis konumun Kabat'ta oldugu gibi EU endeksine göre amino asit sayisi. Y-koordinati: mutasyona ugratilmis konumu ihtiva eden Fc varyantlarinin yüzdesi. Sekil 5a, FC varyantlarinin FcRn'ye baglanma afinitesini ölçmek için tahsis edilen ELISA tayininin prensibini göstermektedir. FcRn-p3, immüno-plakalarin kuyucuklari üzerine kaplanan bir FcRn-p3 füzyon proteinidir. Fc, ELISA saptamasi için V5 etiketi içeren bir Fc varyantidir. Anti-V5, HRP'ye kaynastirilmis bir anti-V5 antikorudur. Antikor, ELISA saptamasi için kullanilir. Sekil 5b, IV.1.a'daki Örnek 1'de tarif edildigi üzere gerçeklestirilen ELISA tayini tarafindan elde edilen dogal-sus FC (yuvarlaklar) ve Fc-H varyanti (kareler) için doz- etki egrisini göstermektedir. X-koordinati: Fc polipeptidinin konsantrasyonu. Y- koordinati: Fc polipeptidine bagli FcRninin yüzdesi. Sekil 50, IV.1.a'daki Örnek 1'de tarif edildigi üzere gerçeklestirilen ELISA tayini tarafindan elde edilen dogal-sus FC (yuvarlaklar) ve S3A_07 varyanti (kareler) için doz- etki egrisini göstermektedir. X-koordinati: Fc polipeptidinin konsantrasyonu. Y- koordinati: Fc polipeptidine bagli FcRn'nin yüzdesi. Sekil 5d, lV.1.a'daki Örnek 1'de tarif edildigi üzere gerçeklestirilen ELISA tayini tarafindan elde edilen dogal-sus FC (yuvarlaklar) ve SSA_41 varyanti (kareler) için doz- etki egrisini göstermektedir. X-koordinati: FC polipeptidinin konsantrasyonu. Y- koordinati: Fc polipeptidine bagli FcRn'nin yüzdesi. Sekil 6, (Kabat'ta oldugu gibi EU endeksine göre) 216-447 konumlarini ifade eden natif insan Ith dizilerinin insan IgGZ'sinin (SEQ ID NO:14), insan lgG3'ünün (SEQ ID NO:15) ve insan IgG4"ünün (SEQ ID NO:16) karsilik gelen dizileriyle hizalanmalarini göstermektedir. IgG1 dizileri G ve G1m3 allotipini (SEO ID NO:13) ifade etmektedir. IgG1'in "alt mentese-CH2-CH3" alani 216 Sekil 7, FC varyantinin FcRn'ye farkli pH'Iarda baglanma afinitesini göstermek için gerçeklestirilmis olan ELISA tayinlerinin sonuçlarini göstermektedir (daha fazla ayrinti için bakiniz Örnek 2, kisim IV.2). Histogram her bir varyant için, pH=6'da (siyah çubuklar), pH=6,5,ta (beyaz çubuklar) veya pH=7,4'te (gri çubuklar) gerçeklestirilen ELISA tayini için ölçülen OD450nm degerini temsil etmektedir. OD450nm degeri, FC varyantlarina baglanmis hareketsizlestirilmis FcRn miktariyla koreledir. Sekil 8a, burada tarif edildigi üzere Fc varyantlarini tasiyan rekombinan IgG1 antikorlarinin eksprese edilmesi için kullanilan ekspresyon vektörünün sematik bir haritasini resmetmektedir. Ortaya çikan rekombinan IgG1 antikorlari, CD20 antijeni için baglanma özgüllügüne haizdir. Sekil Sa'da gösterildigi üzere, spesifikasyonda ve örneklerde tarif edilen mutasyonlari tasiyan agir zincir sabit bölgesini kodlayan nükleik asit, HKCD20-Opti-GA vektöründe mevcut Apa1 ve Ascl klonlama alanlarinin arasina sokulur. Sekiller 8b ve 8c, sirasiyla, Indirgeyici olmayan kosullar ve indirgeyici kosullar altinda lgG varyantlarinin SDS-PAGE'ini göstermektedir. (1) dogal-sus FC içeren IgG'yi ifade etmektedir; (2) Fc-H varyantini Içeren IgG'yi ifade etmektedir; (3) CGA_69 varyantini içeren lgG'yi ifade etmektedir; (4) C6A_78 varyantini içeren IgG'yi ifade etmektedir; (5) T5A_74 varyantini içeren IgG'yi ifade etmektedir; (6) CöA_74 varyantini içeren lgG'yi ifade etmektedir; (7) CöA_60 varyantini içeren IgG'yi ifade etmektedir ve (8) CöA_66'yi içereni ifade etmektedir. Sekil 9, lgG varyantlarinin FcRn'ye baglanmasinin karakterize edilmesi için Örnek 2, ("1") ve dogal-sus IgG'nin ("2") lgG varyantlari için doz-etki egrisini göstermektedir. X- koordinati: lgG konsantrasyonu. Y-koordinati: lgG'ye bagli FcRn'nin yüzdesi. Sekil 10, bulusun lgG varyantlari için bunlarin FcleIla'ya afinitelerini karakterize etmek amaciyla ELISA tayini tarafindan elde edilen doz-etki egrilerini göstermektedir. (1) CBA_66 varyanti için elde edilen egriyi ifade etmektedir, (2) Rituximab için elde varyantlari ve dogal-sus lgG için elde edilen egrileri ifade etmektedir. ELISA tayini Örnek 2, IV.1.a kisminda tarif edildigi üzere gerçeklestirilmistir. X-koordinati: lgG konsantrasyonu. Y-koordinati: lgG'ye bagli FcleIla'nin yüzdesi. Sekil 11, çesitli rekombinan IgG'nin Jurkat FcRn"ye baglanmasini resmetmektedir. Sekil 11, Ritixan'nin ve bulusa göre çesitli varyantlarin Jurkat FcRn'ye, yukaridaki Gereç ve Yöntemler Kisminda tarif edildigi üzere belirlenmis olan ve ortalama florisima yogunlugu (MFl) degerleri olarak ifade edilen baglanmasini göstermektedir. Sekil 12, bulusun IgG varyantlari için ADCC tayininde elde edilen doz-etki egrilerini göstermektedir. (1) CGA_66 varyantinin egrisini ifade etmektedir, (2) Rituximab'in egrisini ifade etmektedir ve (3) bulusun LFB-R603, WT-IgG ve IgG varyantlarinin (yani koordinati: IgG konsantrasyonu. Y-koordinati: hücre Iizisinin yüzdesi. Bulusun detayli açiklamasi Basvurunun daha tam olarak anlasilmasi amaciyla, asagida çesitli tanimlamalar ortaya konulmaktadir. Bu tip tanimlamalar gramatik esdegerlerini kapsama amaçlidir. Mevcut spesifikasyon ve istemler boyunca, Fc bölgesindeki kalintilarin numaralandirilmasi, Kabat et al., Sequences of Proteins of lmmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)'deki EU endeksine göre immünoglobülin agir zincirininkidir. "Kabat'ta oldugu üzere EU endeksi", insan IgG1 AB antikorunun kalinti numaralandirilmasini Ifade etmektedir. Burada kullanildigi sekliyle "polipeptit" veya "protein", proteinleri, polipeptitleri, oligopeptitleri ve peptitleri içeren, en az iki esdeger olarak ekli amino asit anlamindadir. Burada kullanildigi sekliyle "amino asit", 20 dogal olusumlu amino asidin biri veya spesifik, tanimli bir konumda mevcut olabilen herhangi bir dogal-olmayan analogu anlamindadir. Dogal olusumlu amino asitler üç harfli kodla veya tek harfli kodla kisaltilabilir: Amino asit Üç harfli kod Tek harfli kod arjinin arg R asparajin asn N Amino asit Üç harfli kod Tek harfli kod aspartik asit asp D asparajin veya aspartik asit asx B sistein cys C glutamik asit glu E glutamin gln Q glutamin veya glutamik asit glx Z glisin giy G histidin his H izolösin ile I metiyonin met M fenilalanin phe F prolin pro p serin ser S treonin thr T triptofan try W tirosin tyr Y valin val V Burada kullanildigi sekliyle "konum", bir proteinin dizisindeki bir Iokasyon anlamindadir. FC bölgesi için, konumlar Kabafta oldugu üzere EU endeksine göre numaralandirilir. Burada "amino asit modifikasyonu", bir polipeptidin amino asit dizisindeki bir degisiklik anlamindadir. Burada "amino asit degisiklikleri" olarak da isimlendirilebilen "amino asit modifikasyonlarina" amino asit ikameleri, bir polipeptit dizisinin sokulmasi ve/veya silinmesi dahildir. Burada "amino asit ikamesi" veya "ikame", bir parent polipeptit dizisindeki belirli bir konumdaki bir amino asidin, bir baska amino asitle degistirilmesi anlamindadir. Örnegin, N434S ikamesi bir varyant polipeptidini, bu durumda, 434 konumundaki asparajinin serin ile degistirildigi bir Fc varyantini ifade etmektedir. Burada kullanildigi sekliyle "amino asit sokulmasi" veya "sokma", bir parent polipeptit dizisindeki belirli bir konumda bir amino asidin ilave edilmesi anlamindadir. Örnegin, Burada kullanildigi sekliyle "amino asit silintisi" veya "silinti", bir parent polipeptit dizisindeki belirli bir konumdaki bir amino asidin silinmesi anlamindadir. Örnegin, sokma E294del, 294 konumundaki glutamik asidin Silinmesini göstermektedir. Örnegin, modifikasyonlarin asagidaki formati tercihen kullanilmaktadir: 4348 veya N434S, 434 konumundaki parent amino asidin, yani asparajinin, serin ile degistirildigi anlamina gelmektedir. Ikamelerin bir kombinasyonu durumunda, tercih edilen format asagidakidir: 315 konumunda ve biri de 434 konumunda olmak üzere üç ikame vardir ve parent polipeptidin 259 konumundaki amino asit, yani valin, izolösinle degistirilir, parent polipeptidin 315 konumundaki amino asit, yani asparajin, aspartik asitle degistirilir ve parent polipeptidin 434 konumundaki amino asit, yani, asparajin, tirosinle degistirilir. Burada kullanildigi sekliyle "degisken bölge", bir immünoglobülinin, sirasiyla kappa, genlerinin herhangi biri tarafindan büyük ölçüde kodlanan bir veya daha fazla lg alani içeren bölgesi anlamindadir. Degisken bölgeler Tamamlayicilik Belirleme Bölgeleri (CDR'ler) ve Çerçeve Bölgeleri (FR) içerir. Burada kullanildigi sekliyle "Fc" veya "Fc bölgesi", birinci sabit bölge immünoglobülin alanini hariç tutarak bir antikorun sabit bölgesini içeren polipeptit anlamindadir. Böylelikle, FC lgA, IgD ve IgG'nin son iki sabit bölge immünoglobülin alanini, IgE ve terminalini ifade etmektedir. IgA ve IgM için, Fc J zinciri içerebilir. IgG için, Pc Cgamma2 ve Cgamma3 (IgGller için sirasiyla CH2 ve CH3 alanlari olan Cy2 ve Cy3) immünoglobülin alanlari ve Cgamma1 (Cy1) ve Cgamma2 (Cy2) arasindaki alt mentese bölgesini içerir. Insan IgG1 agir zincir Fc bölgesi burada, karboksil-ucuna C226 kalintilarini içeriyor olarak tanimlanmakta olup, burada numaralandirma Kabatita oldugu üzere EU endeksine göredir. Insan IgG1'i baglaminda, Kabat'ta oldugu üzere EU endeksine göre düsük mentese 226-236 konumlarini ifade etmektedir, CH2 alani etmektedir. Diger immünoglobülinlerin karsilik gelen Fc bölgesi dizi hizalamalariyla tanimlanabilir. FC, asagida tarif edildigi üzere, izolasyondaki bu bölgeyi veya bir PC polipeptidi baglaminda bu bölgeyi ifade edebilir. Burada kullanildigi sekliyle "Fc polipeptidi", bir Fc bölgesinin tamamini veya bir parçasini içeren bir polipeptit anlamindadir. Fc polipeptitlerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, antikorlar, Fc füzyonlari, izole Fc'ler, Fc-konjugatlari ve F0 fragmanlari dahildir. Fc bölgesi ve (ii) bir immünoglobülinin bir degisken bölgesinden türetilen bir baglayici polipeptit alani içeren herhangi bir polipeptidi ifade etmektedir. Söz konusu baglayici polipeptit alani belirli bir hedef antijeni veya hedef antijenlerin bir grubunu özgül olarak baglayabilir. Bir immünoglobülinin bir degisken bölgesinden türeyen bir baglayici polipeptit alani bir veya daha fazla CDR içerir. Antikorlara, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, tam-boy immünoglobülinler, monoklonal antikorlar, çoklu-özgül antikorlar, en az bir degisken bölge içeren Fc-füzyon proteini, (burada bazen "antikor mimetikleri" olarak ifade edilen) sentetik antikorlar, kimerik antikorlar, insanlastirilmis antikorlar, tamamen Insan antikorlari, antikor-füzyon proteinleri, antikor konjugatlari ve sirasiyla her birinin fragmanlari dahildir. Burada kullanildigi sekliyle "tam-boy antikor" veya "immünoglobülin", degisken ve sabit bölgeler dahil olmak üzere bir antikorun dogal biyolojik formunu olusturan yapi anlamindadir. "Tam boy antikor" monoklonal tam-boy antikorlari, dogal-sus tam-boy antikorlari, kimerik tam-boy antikorlari, insanlastirilmis tam-boy antikorlari kapsar ve liste sinirli degildir. Insanlar ve fareler dahil olmak üzere, birçok memelide, tam-boy antikorlarin yapisi genellikle bir tetramerdir. Söz konusu tetramer iki özdes polipeptit zinciri çifti içermekte olup, her bir çift (tipik olarak yaklasik 25 kDa'lik bir moleküler agirliga sahip) bir "hafif" ve (tipik olarak yaklasik bir "agir" zincire sahiptir. Bazi memelilerde, örnegin develer ve lamalarda, tam-boy antikorlar, her biri FC bölgesine ekli bir degisken alan içeren yalnizca iki agir zincirden olusabilir. Her bir zincirin amino-terminal kismi, birincil olarak antijen taninmasindan sorumlu yaklasik 100 ila 110 veya daha fazla amino asitlik bir degisken bölge içerir. Degisken bölgede, bir antijen-baglama alani olusturmak için agir zincirin ve hafif zincirin V alanlarinin her biri için üç döngü bir araya gelir. Döngülerin her biri, amino asit dizisindeki degisimin en kayda deger oldugu bir tamamlayicilik-belirleme bölgesi (bundan böyle bir "CDR" olarak anilacaktir) olarak ifade edilir. Her bir zincirinin karboksi-terminal kismi, birincil olarak efektörfonksiyonundan sorumlu bir sabit bölge tanimlar. Kabat vd., agir zincirlerin ve hafif zincirlerin degisken bölgelerinin sayisiz birincil dizisini toplamistir. Dizilerin korunma derecesine dayali olarak, münferit birincil dizileri CDR ve çerçeve olarak siniflandirmis ve bunlarin bir listesini yapmistir (bakiniz, Sequences of lmmunological Interest, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E. A. Kabat et al.). Insan immünoglobülinleri durumunda, hafif zincirler kappa ve Iambda hafif zincirleri olarak siniflandirilir. Agir zincirler mu, delta, gamma, alfa veya epsilon olarak siniflandirilir ve antikorun izotipini, sirasiyla, lgM, lgD, lgG, IgA ve IgE olarak tanimlar. lgG, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla IgG1, IgG2, IgG3 ve IgG4 dahil olmak üzere birçok alt sinifa sahiptir. lgM, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, lgM1 ve IgM2 dahil olmak üzere alt siniflara sahiptir. Böylelikle, burada kullanildigi sekliye "izotip", sabit bölgelerinin kimyasal ve antijenik karakteristikleri tarafindan tanimlanan immünoglobülinlerin alt siniflarinin herhangi bir anlamindadir. Bilinen insan immünoglobülin izotiplerin IgG1, lgGZ, lgGS, IgG4, lgA1, lgA2, IgM1, IgM2, lgD ve lgE'dir. Burada kullanildigi sekliyle "lgG", büyük ölçüde bir taninan immünoglobülin gamma geni tarafindan kodlanan antikorlarin sinifina ait bir polipeptit anlamindadir. Insanlarda, lgG IgG1, IgG2, lgG3 ve IgG4 alt siniflarini veya izotiplerini içerir. Farelerde, lgG IgG1, agir zincire sahip iki immünoglobülin zincirinin iki özdes çiftinden olusmakta olup, her bir hafif zincir VL ve CL immünoglobülin alanlarina içerir ve her bir agir zincir VH, Cy1 (diger adi CH1), Cy2 (diger adi CH2) ve Cy3 (diger adi CH3) immünoglobülin alanlarini içerir. Insan lgG1'i baglaminda, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksine göre, "CH1" 118- CH3 alani 341-447 konumlarini ifade etmektedir. lgG agir zinciri ayrica, IgG1 durumunda 221-236 konumlarini ifade eden bir mentese alani da içerir. Burada kullanildigi sekliyle "parent polipeptit" veya "polipeptit parenti", bir varyant olusturmak için büyük ölçüde modifiye edilen modifiye edilmemis bir polipeptit anlamindadir. Söz konusu parent polipeptit bir dogal olusumlu polipeptit, bir dogal olusumlu polipeptidin bir varyanti, bir dogal olusumlu polipeptidin islenmis versiyonu veya bir sentetik polipeptit olabilir. parent polipeptit polipeptidin kendisini veya bunu kodlayan amino asit dizisini ifade edebilir. Mevcut bulus baglaminda, parent polipeptit, dogal-sus Fc bölgeleri, bunlarin fragmanlari ve bunlarin mutantlari grubundan seçilen bir PC bölgesi içerir. Dolayisiyla, parent polipeptit opsiyonel olarak Fc bölgesinde, dogal-sus Fc bölgelerine kiyasla önceden-var olan amino asit modifikasyonlari (yani bir Fc mutanti) içerebilir. Avantajli olarak, parent polipeptit bir antikordur, bir immünoglobülindir, bir FC füzyon polipeptididir, bir FC konjugatidir ve liste sinirli degildir. Dolayisiyla, burada kullanildigi sekliyle "Parent immünoglobin", bir varyant immünoglobülin olusturmak için modifiye edilen immünoglobülin polipeptidi anlamindadir ve burada kullanildigi sekliyle "parent antikor", bir varyant antikor olusturmak için modifiye edilen antikor anlamindadir. üretilen antikorlarin dahil oldugu kaydedilmelidir. Burada kullanildigi sekliyle, "en az bir" terimi "bir veya daha fazla" terimine esittir. Burada kullanildigi sekliyle "varyant polipeptit", "polipeptit varyanti" veya "varyant", bir parent polipeptit dizisinden en az bir amino asit modifikasyonu sayesinde farklilik gösteren bir polipeptit dizisi anlamindadir. Varyant F0 varyantini, Fc polipeptit varyantini, protein varyantini, antikor varyantini, immünoglobülin varyantini, lgG varyantini ifade edebilir ve liste sinirli degildir. Burada kullanildigi sekliyle "immünoglobülin varyanti" veya "varyant immünoglobülin", bir parent immünoglobülin dizisinden en az bir amino asit modifikasyonu sayesinde farklilik gösteren bir immünoglobülin dizisi anlamindadir. Parent polipeptit bir dogal olusumlu veya dogal-sus (WT) polipeptit olabilir veya bir WT polipeptidin modifiye bir versiyonu olabilir. Ilgi konusu parent polipeptitler, yukarida tanimlandigi üzere bir Fc bölgesi içeren polipeptitlerdir. Tercihen bulusun varyanti, bir parent polipeptit dizisinden Fc bölgesinde en az bir amino asit modifikasyonu sayesinde farklilik gösteren bir polipeptit dizisine sahiptir. Dolayisiyla, ilgi konusu bir varyant bir Fc varyanti içerir. Dolayisiyla, burada kullanildigi sekliyle "Fc varyanti" veya "varyant F0", bir parent Fc dizisinden en az bir amino asit modifikasyonu sayesinde farklilik gösteren bir Fc dizisi anlamindadir. Bir FC varyanti bir izole FC bölgesi ve bunun fragmanlari olabilir veya bir antikor, Fc füzyonu ve bunlarin fragmanlari baglaminda var olabilir, liste sinirli degildir. Burada kullanildigi sekliyle "protein varyanti" veya "varyant protein", bir parent proteinden en az bir amino asit modifikasyonu sayesinde farklilik gösteren bir protein anlamindadir. Burada kullanildigi sekliyle "antikor varyanti" veya "varyant antikor", bir parent antikordan en az bir amino asit modifikasyonu sayesinde farklilik gösteren bir antikor anlamindadir. Burada kullanildigi sekliyle "IgG varyanti" veya "varyant IgG", bir parent IgG'den en az bir amino asit modifikasyonu sayesinde farklilik gösteren bir antikor anlamindadir. Tercihen, varyant parent polipeptide kiyasla en az bir amino asit modifikasyonuna, örnegin, yaklasik 1 ila yaklasik 45 arasinda amino asit modifikasyonuna, tercihen yaklasik 1 ila yaklasik 20 amino asit modifikasyonuna ve daha tercihen yaklasik 1 ila yaklasik 10 amino asit modifikasyonuna sahiptir. Buradaki varyant dizisi tercihen parent polipeptit dizisiyle en az yaklasik %80 özdeslige ve en tercihen en az yaklasik %90 özdeslige haiz olacaktir. Burada amaçlandigi üzere, bir referans polipeptitle en az yaklasik %90 amino asit özdesligine sahip belirlenen bir polipeptit, söz konusu referans polipeptitle en az amino asit özdesligine sahiptir. Iki amino asit dizisinin özdeslik yüzdesinin belirlenmesi için, diziler optimal karsilastirma amaciyla hizalanir. Örnegin, optimal hizalama için hem bir birinci hem bir ikinci amino asit dizisine bosluklar eklenebilir ve homolog-olmayan diziler karsilastirma amaciyla yok sayilabilir. Optimal karsilastirma amaciyla, iki amino asit dizisinin özdeslik yüzdesi asagidaki parametrelerle CLUSTAL W (sürüm 1.82) ile elde edilebilir: (1) CPU MODE = CIustaIW mp; (2) ALIGNMENT = « full »; (3) OUTPUT FORMAT = « aln w/numbers »; (4) OUTPUT ORDER = « aligned »; (5) COLOR ALIGNMENT = « no »; (6) KTUP (word size) = « default »; (7) WINDOW LENGTH = « default »; (8) SCORE TYPE = « percent »; (9) TOPDIAG = « default »; (10) PAIRGAP = « default »; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = « none »; (12) MATRIX = « default »; (13) GAP OPEN = « default »; (14) END GAPS = « default »; (15) GAP EXTENSION = « default »; (16) GAP DISTANCES = « default »; (17) TREE TYPE = « cladogram » et (18) TREE GRAP DISTANCES = « hide ». Burada "dogal sus veya WT", allelik varyasyonlar dahil olmak üzere dogada bulunan bir amino asit dizisi veya bir nükleotid dizisi anlamindadir. Bir WT protein, polipeptit, antikor, immünoglobülin, IgG vb., kasitli olarak modifiye edilmemis bir amino asit dizisine veya bir nükleotid dizisine sahiptir. Burada kullanildigi sekliyle "FcRn" veya "neonatal Fc Reseptörü", lg antikoru Fc bölgesini baglayan ve en azindan kismen bir FCRN geni tarafindan kodlanan bir protein anlamindadir. FcRn, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, insanlar, fareler, siçanlar, tavsanlar ve maymunlar dahil olmak üzere herhangi bir organizmadan olabilir. Teknikte bilindigi üzere, fonksiyonel FcRn proteini, siklikla agir zincir ve hafif zincir olarak ifade edilen iki polipeptit içerir. Hafif zincir beta-2-mikroglobülindir ve agir zincir FCRN geni tarafindan kodlandir. Burada aksi belirtilmedigi sürece, FcRn veya FcRn proteini a-zincirinin beta-2 mikroglobülinle kompleksini ifade etmektedir. Insanda, FcRn için kodlama yapan gen FCGRT olarak adlandirilir. Burada kullanildigi sekliyle "artan FcRn baglama", bulusun varyantinin FcRn'ye, parent polipeptide kiyasla, in vivo veya in vitro baglanma afinitesindeki artis anlamindadir. Polipeptit varyantinin bir FcRn'yi baglama yetisi in vitro ELISA ile (Örnek 1 kisim güçlendirilmis bir baglama özelligine sahip varyantlar en siklikla in vivo bir güçlendirilmis serum tutulumuna ve böylelikle artan bir yari-ömre sahiptir. F0 bölgesinin in vivo tutulumunu arttirmak amaciyla, FcRn için baglanma afinitesindeki artis, pH 7,4 civarinda daha düsük afiniteyi muhafaza ederken pH 6 civarinda meydana gelmelidir. Her ne kadar halen inceleme altinda olsa da, Fc bölgelerinin in vivo daha uzun bir yari- ömre sahip olduguna inanilmaktadir, çünkü pH 6'da FcRn'ye baglanma Fc bölgelerinin endozomlarin içine sekestrasyonuna olanak saglar (Ghetie and Ward, 1997 lmmunol geri döndürür. Hazne hücre disi alana açildiginda, neredeyse 7,4 olan daha yüksek pH, FC bölgelerinin kanin içine geri salinmasini indükler. Bu nedenle, FC bölgesindeki, FC bölgelerinin yari-ömrünü in vivo arttiracak olan amino asit modifikasyonlari, Fc bölgesinin daha yüksek pH"ta salinmasina halen olanak saglarken FcRn baglanmasini daha düsük pH'ta ideal sekilde arttiracaktir. Burada kullanildigi sekliyle "in vivo yari-ömür", ilgi konusu bir polipeptidin belirli bir hayvanin dolasimindaki bir biyolojik yari-ömrünü ifade etmektedir ve hayvanin dolasiminda mevcut olan miktarin yarisinin dolasimdan ve/veya hayvandaki diger dokulardan arindirilmasi için gereken süreyle temsil edilir. Mevcut bulus, FC bölgesinin, Fc bölgesinin FcRn için baglanma afinitesini arttiran amino asit modifikasyonlarinin tanimlanmasina dayalidir. Ilgi konusu amino asit modifikasyonlari, rastgele mutajenezle ve söz konusu varyantlarin FcRn için baglama özelliginin ölçülmesiyle iki Fc varyanti kütüphanesinin olusturulmasiyla belirlenmistir. Dolayisiyla, mevcut bulus parent polipeptitlerin, söz konusu parent polipeptitlere kiyasla FcRn'ye artan baglama gösteren bir Fc bölgesi içeren varyantlariyla ilgilidir. Bulusun bir parent polipeptidi, bir Fc bölgesi içeren bir polipeptittir. Söz konusu polipeptit bir tek polipeptit zinciri veya birbirine esdeger olarak bagli olmayan birçok polipeptit zinciri içerebilir. parent polipeptitlere, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, antikorlar, FC füzyon proteinleri, FC konjugatlari, Fc türevi polipeptitler, izole FC ve bunlarin fragmanlari dahildir. Bunun bir sonucu olarak, söz konusu parent polipeptit bir dogal olusumlu polipeptit, bir dogal olusumlu polipeptidin bir varyanti, bir dogal olusumlu polipeptidin islenmis bir versiyonu, bir sentetik polipeptit veya proteinli- olmayan bir fragman içeren bir polipeptit olabilir. Bir dogal olusumlu polipeptidin islenmis bir versiyonu, bir dogal olusumlu gen tarafindan kodlanmayan bir polipeptittir. Örnegin, islenmis polipeptit bir kimerik antikor veya bir insanlastirilmis antikor olabilir. Parent polipeptidin Fc bölgesi tercihen, lgG`Ierin dogal-sus Fc bölgelerinden, bunlarin fragmanlarindan ve mutantlarindan olusan gruptan seçilir. Burada, lgG'nin FC bölgesi Cv2 ve Cv3 alanlari olarak da adlandirilmaktadir). Dogal sus insan lgGilinin "alt mentese"-CH2-CH3 alaninin dizisi, SEQ ID NO: ilin dizisidir. Insan IgGi'i baglaminda, Kabatlta oldugu gibi EU endeksine göre, alt mentese 226-236 konumlarini ifade konumlarini ifade etmektedir. Diger lgG alt-siniflari için analog alanlar, söz konusu lgG alt-siniflarinin agir zincirlerinin veya agir zincir fragmanlarinin insan lgG1*ininkiyle amino asit hizalanmasindan belirlenebilir. FC bölgesinin fragmanlari, bir dogal-sus FC bölgesinden, tercihen bir dogal-sus IgG'nin polipeptitler olarak tanimlanmaktadir. Söz konusu fragmanlar FcRn için, Örnek 1 kisim lV.1'de tarif edilen SPR tayinine göre 1 mikroM*den daha düsük bir ayrisma sabitine sahiptir. Yukarida belirtildigi üzere, parent polipeptit bir dogal-sus Fc mutanti, yani söz konusu Fc mutantinin FcRn için, Örnek 1 kisim IV.1'de tarif edilen SPR tayinine göre 1 mikroM'den daha düsük bir ayrisma sabitine sahip olmasi ve bir dogal-sus FC bölgesi olmamasi sartiyla ilaveler, sokmalar ve/veya ikameler gibi önceden-var olan amino asit modifikasyonlarini çoktan içeren bir Fc bölgesi içerebilir. Burada kullanildigi sekliyle "varyant polipeptit" veya "varyant", bir parent polipeptitten en az bir amino asit modifikasyonu sayesinde farklilik gösteren bir polipeptit dizisi anlamindadir. Mevcut bulusa göre varyant polipeptit, karsilik gelen parent polipeptide kiyasla FcRn,ye artan bir baglanma gösterir. Diger bir deyisle, varyantin FcRn için afinitesi, parent polipeptidinkinden daha yüksektir. Bu tip varyantlar, bulusa göre optimize edilen varya ntlardir. Söz konusu polipeptitlerin FcRn için afinitesi, önceki teknigin iyi-bilinen yöntemleriyle degerlendirilebilir. Örnegin, teknikte uzman bir kisi ayrisma sabitini (Kd), mevcut basvurunun Örnek 1 kisim IV.1.b'sinde örneklendigi üzere Yüzey Plazmon Rezonansi (SPR) deneylerini kullanarak belirleyebilir. Varyant karsilik gelen parentinden 1,1-kat daha düsük bir Kd'ye sahipse, bu durumda söz konusu varyant açiklamaya göre bir optimize varyanttir. Bir alternatif olarak, teknikte uzman bir kisi uygun bir ELISA tayini gerçeklestirebilir. Uygun bir ELISA tayini, varyantin ve parentin FcRn`ye baglanma gücünün Örnek 1'de örneklendigi üzere karsilastirilmasina olanak saglar. Varyant ve parent polipeptit için saptanan spesifik sinyaller karsilastirilir. Varyant, spesifik sinyali parent polipeptidinkinden en az 1,2-kat daha güçlü, daha tercihen en az 3,2-kat daha güçlüyse (yani, en azindan çift amino asit modifikasyonu T250Q/M428L'ye sahip FC varyanti kadar iyiyse) açiklamanin optimize bir varyantidir. Uygun ELlSA tayinleri, mevcut basvurunun Örnek 1'inde resmedilmektedir. Baglanma afinitesi tam-boy polipeptitlerin degerlendirilmesiyle (bakiniz Örnek 2 kisim III) veya bunlarin izole Fc bölgelerinin degerlendirilmesiyle (bakiniz Örnek 1 kisim IV) vasat bir sekilde belirlenebilir. Açiklamaya göre, ilgi konusu polipeptit varyantlari, parent polipeptide kiyasla FC bölgesinde en az bir amino asit modifikasyonu içerir. Amino asit modifikasyonlari amino asit sokmalarindan, silintilerinden ve ikamelerinden olusan gruptan seçilir. Basvuru sahipleri, parent polipeptidine kiyasla FcRn'ye artan baglanmaya sahip bir polipeptit varyanti elde etmek amaciyla, en az bir amino asit modifikasyonunun, söz konumunda eklenmesi gerektigini göstermis olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir. Burada, "Kabat'ta oldugu gibi EU endeksi", insan IgG1 EU antikorunun kalinti numaralandirilmasini ifade etmektedir. Örnegin, diger Fc bölgelerinin analog konumlari, söz konusu FC bölgelerinin, SEQ ID NO:1'in polipeptidini içeren insan IgG1 agir zincir fragmaniyla amino asit dizisi hizalanmasindan belirlenebilir. Örnekleme amaciyla, Sekil 6, "alt mentese-CH2-CH3" alani içeren insan IgG1, IgG2, lgG3 ve lgG4 agir zincir fragmanlarinin dizi hizalanmasini göstermektedir. Burada kullanildigi sekliyle "en az bir amino asit modifikasyonu", "bir veya daha fazla modifikasyon" anlamindadir. FC bölgesinde 20'den fazla amino asit modifikasyonunun eklenmesinin biyolojik aktivitelerini sert sekilde harap edebilecegi degerlendirilmektedir. Dolayisiyla, polipeptit varyanti tercihen, yukarida anilan listeden seçilen konumlarda, 1 ila 20 arasinda ve daha tercihen 1 ila 10 arasinda amino asit modifikasyonlarina sahiptir. Burada kullanildigi sekliyle "1 ila 20 arasinda amino asit modifikasyonu", 1, 2, modifikasyonunu kapsamaktadir. Söz konusu polipeptit varyanti dizisi tercihen, parent polipeptit dizisiyle en az yaklasik %90 özdeslige haizdir. Burada amaçlandigi üzere, bir referans polipeptitle en az yaklasik %90 amino asit özdesligine sahip önceden belirlenmis bir polipeptit, söz konusu referans polipeptitle en amino asit özdesligine haizdir. Mevcut açiklamanin, FcRn için en yüksek baglanma afinitesi gösteren Fc varyantlari genellikle birden fazla amino asit modifikasyonu içerir. Örnek Il'de tarif edilen faj ELISA tayininden elde edilen sonuçlar, birden fazla amino asit modifikasyonu içeren optimize varyantlarin, dogal-sus Fciden yaklasik 3,2-kat ila 30-kat arasinda daha yüksek bir spesifik sinyale (bakiniz Tablo 2 ve Tablo 3) sahip olabilirken tek bir nokta amino asit modifikasyonuna sahip varyantlarin (bakiniz Tablo 1)dogaI-sus Fc'den yaklasik 1,2-kat ila 3,5-kat arasinda daha güçlü bir sinyale sahip olabildigini göstermektedir. Tablo 3'te resmedildigi üzere, optimize varyantin sinyali Fc-H'ninkinden yaklasik 1-kat ila yaklasik -kat arasinda daha güçlü olabilir ve bu da Fc varyantinin T250Q/M428L çift amino asit modifikasyonuna sahip oldugunu ifade etmektedir. Dolayisiyla, spesifik bir uygulamada, söz konusu varyant, söz konusu parent 445, 446 ve 447'sinden olusan listeden seçilen en az iki amino asit modifikasyonu içermekte olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir. Mevcut basvurunun Tablo 5'inde tarif edildigi üzere, FcRn için en yüksek baglanma afinitesi sergileyen FC varyantlari 3 ila 6 amino asit modifikasyonuna sahip olabilir. Dolayisiyla, bir diger uygulamada, açiklamanin varyant polipeptitleri, söz konusu parent içerebilmekte olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir. Amino asit modifikasyonlari tercihen silintilerin ve ikamelerin grubundan seçilir. FcRn için yüksek baglanma afinitesi sergileyen Fc varyantlari büyük ihtimalle söz konusu amino asit konumlarinda en az bir amino asit modifikasyonu içerir. Belirli uygulamalarda, açiklamaya göre polipeptit varyanti, parent polipeptide kiyasla Fc ve 434'ünden olusan gruptan seçilen amino asit konumlarinda en az bir amino asit modifikasyonu içermekte olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat"ta oldugu gibi EU endeksininkidir. Yukaridaki kilit konumlar arasinda, FoRn için en güçlü baglanmayi sergileyen FC en sik mutasyOna ugratilan konumlar oldugunu göstermistir. Dolayisiyla, bir baska uygulamada, en az bir modifikasyon parent polipeptide kiyasla Fc bölgesinin 230, 264, 434'ünden olusan gruptan seçilen bir konumda meydana gelmekte olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksinin kidir. Yukarida belirtildigi üzere, en az iki amino asit modifikasyonunun eklenmesi, FC parente kiyasla FC varyantinin FcRn için baglanma afinitesini belirgin sekilde güçlendirebilir. Dolayisiyla, farkli bir uygulamada, polipeptit varyanti en az iki amino asit modifikasyonu içermekte olup, söz konusu en az iki amino asit modifikasyonu asagidakileri içerir: parent polipeptide kiyasla FC bölgesinin 434iünden olusan gruptan seçilen bir amino asit konumunda bir modifikasyon en az bir modifikasyon olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir ve modifikasyon (i)'in modifikasyon (ii) ile ayni amino asit konumunda Örnegin, söz konusu sarta göre, amino asit modifikasyonu (i) 434 konumunda meydana gelirse, en az bir amino asit modifikasyonu (ii), 434 konumu hariç (ii)'de anilan listenin herhangi bir konumunda meydana gelebilir. Bir baska uygulamada, polipeptit varyanti en az iki amino asit modifikasyonu içermekte olup, söz konusu en az iki amino asit modifikasyonu asagidakileri içerir: Fc bölgesinin konumunda bir modifikasyon ve en az bir modifikasyon olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir ve modifikasyon (i),in modifikasyon (ii) ile ayni amino asit konumunda Ek bir uygulamada, söz konusu varyant en az iki amino asit modifikasyonu içermekte olup, söz konusu en az iki amino asit modifikasyonu asagidakileri içerir: Fc bölgesinin asit modifikasyonu ve ve 434iünden olusan gruptan seçilen bir konumda en az bir amino asit modifikasyonu olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir ve modifikasyon (i)'in modifikasyon (ii) ile ayni amino asit konumunda Bir baska ek uygulamada, söz konusu varyant, asagidakileri içeren en az iki amino asit modifikasyonu içerir: Fc bölgesinin (i) 378 ve 434'ünden olusan gruptan seçilen bir konumda bir amino asit modifikasyonu ve ve 4347ünde olusan gruptan seçilen bir konumda en az bir amino asit modifikasyonu olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir ve modifikasyon (i)'in modifikasyon (ii) ile ayni amino asit konumunda Farkli bir uygulamada, polipeptit varyanti Fc bölgesinde en az üç amino asit modifikasyonu içerir. Dolayisiyla, söz konusu en az üç amino asit modifikasyonu asagidakileri içerebilir: parent polipeptide kiyasla Fc bölgesinin 434'ünden olusan gruptan seçilen iki amino asit konumunda iki modifikasyon ve en az bir modifikasyon olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir ve modifikasyon (i)'in modifikasyon (ii) ile ayni amino asit konumunda Farkli bir uygulamada, polipeptit varyanti en az üç amino asit modifikasyonu içermekte olup, söz konusu en az üç amino asit modifikasyonu asagidakileri içerir: Fc bölgesinin konumunda bir modifikasyon; ve 434'ünden olusan gruptan seçilen bir amino asit konumunda bir modifikasyon ve 445, 446 ve 447'sinden olusan gruptan seçilen bir amino asit konumunda en az bir modifikasyon olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir ve modifikasyon (i), modifikasyon (ii) ve modifikasyon (iii)'ün eszamanli olarak ayni amino asit konumlarinda meydana gelmemesi sartiyladir. Diger uygulamalarda, polipeptit varyanti en az üç amino asit modifikasyonu içermekte olup, söz konusu en az üç amino asit modifikasyonu asagidakileri içerir: F0 bölgesinin (i) 378 ve 434'ünden olusan gruptan seçilen bir amino asit konumunda bir modifikasyon; ve 434'ünden olusan gruptan seçilen bir amino asit konumunda bir modifikasyon ve 445, 446 ve 447'sinden olusan gruptan seçilen bir amino asit konumunda en az bir modifikasyon olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir ve modifikasyon (i), modifikasyon (ii) ve modifikasyon (iii)'ün eszamanli olarak ayni amino asit konumlarinda meydana gelmemesi sartiyladir. Mevcut bulusun önceden anilan tüm uygulamalarinda, amino asit modifikasyonlari tercihen, amino asit ikamelerinden ve silintilerinden olusan gruptan seçilir. Bulusun bir diger amaci, bir parent polipeptidin, söz konusu parent polipeptide kiyasla FcRn'ye artan baglanma sergileyen bir FC bölgesi ve parent polipeptide kiyasla Fc gruptan seçilen FC bölgesinde en az bir amino asit modifikasyonu içeren bir varyantiyla ilgili olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir. Farkli bir uygulamada, söz konusu polipeptit, parent polipeptide kiyasla, FC bölgesinin içermekte olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir. Terichen, söz konusu varyant, parent polipeptide kiyasla yukaridaki Iistelerden seçilen 1 ila 20 arasinda, daha tercihen 1 ila 10 arasinda amino asit modifikasyonuna sahiptir. Bazi uygulamalarda, söz konusu varyant, parent polipeptide kiyasla Fc bölgesinin ila 6 arasinda amino asit modifikasyonu içermekte olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir. Farkli bir uygulamada, söz konusu polipeptit, parent polipeptide kiyasla Fo bölgesinin asit modifikasyonu içermekte olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir. Yukaridaki listelerin bazi amino asit modifikasyonlari kilit modifikasyonlardir. Diger bir deyisle, FcRn'ye yüksek baglanma afinitesi gösteren Fc varyantlari büyük ihtimalle, söz konusu kilit modifikasyonlardan seçilen en az bir amino asit modifikasyonu içerir. Dolayisiyla, söz konusu polipeptit varyanti, söz konusu parent polipeptide kiyasla Fc gruptan seçilen en az bir modifikasyon içerebilmekte olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat"ta oldugu gibi EU endeksininkidir. Bir baska uygulamada, söz konusu polipeptit varyanti, söz konusu parent polipeptide Seçilen en az bir amino asit modifikasyonu içerebilmekte olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir. Bir diger uygulamada, söz konusu polipeptit varyanti, söz konusu parent polipeptide bir amino asit modifikasyonu içerebilmekte olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabatita oldugu gibi EU endeksininkidir. Yukarida belirtildigi üzere, en az iki amino asit modifikasyonunun eklenmesi, parentlere kiyasla Fc varyantlarinin FcRnlye baglanmasini belirgin bir sekilde güçlendirebilir. Söz Farkli bir uygulamada, söz konusu polipeptit varyanti en az iki amino asit modifikasyonu içermekte olup, söz konusu en az iki amino asit modifikasyonu asagidakileri içerir: parent polipeptide kiyasla Fc bölgesinin olusan gruptan seçilen bir modifikasyon ve 445, 446 ve 447'sinden olusan gruptan seçilen bir amino asit konumunda en az bir amino asit modifikasyonu olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir ve modifikasyon (i)'in modifikasyon (ii) ile ayni amino asit konumunda Bir diger uygulamada, söz konusu varyant en az iki amino asit modifikasyonu içermekte olup, söz konusu en az iki modifikasyonu asagidakileri içerir: Fc bölgesinin modifikasyonu ve ve 434'ünden olusan gruptan seçilen bir amino asit konumunda en az bir amino asit modifikasyonu olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir ve modifikasyon (i)'in modifikasyon (ii) ile ayni amino asit konumunda Bir baska uygulamada, söz konusu varyant en az iki amino asit modifikasyonu içermekte olup, söz konusu en az iki modifikasyonu asagidakileri içerir: Fc bölgesinin modifikasyonu ve en az bir amino asit modifikasyonu olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir ve modifikasyon (i)'in modifikasyon (ii) ile ayni amino asit konumunda Dolayisiyla, bulusun bir diger amaci bir parent polipeptidin, söz konusu parent polipeptide kiyasla FcRn'ye artan baglanma sergileyen ve istem 1ie göre Fc bölgesindeki amino asit modifikasyonlarinin en az bir kombinasyonunu içeren bir Fc bölgesi içeren bir varyantiyla ilgilidir. Modifikasyonlarin en az bir kombinasyonu asagidakilerden olusan gruptan seçilir: FC bölgesinin ve 315D/434Y'si olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir. modifikasyon içerebilmekte olup. burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat"ta oldugu gibi EU endeksininkidir. Bir baska uygulamada, mevcut açiklamaya göre bir varyant asagidakileri içerir: parent polipeptide kiyasla Fc bölgesinin 315D/434Y'sinden olusan gruptan seçilen amino asit modifikasyonlarinin en az bir kombinasyonu ve olusan gruptan seçilen en az bir amino asit modifikasyonu olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir ve modifikasyon (i)'in modifikasyon (ii) ile ayni amino asit konumunda ve 315D/434Ylsinden olusan gruptan seçilen amino asit modifikasyonlarinin en az bir kombinasyonunu içermekte olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir. asit modifikasyonu içerebilmekte olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabatita oldugu gibi EU endeksininkidir. Bir baska uygulamada, mevcut açiklamaya göre bir varyant asagidakileri içerir: parent polipeptide kiyasla Fc bölgesinin amino asit modifikasyonlarinin en az bir kombinasyonu ve olusan gruptan seçilen en az bir amino asit modifikasyonu olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir ve modifikasyon (i)'in modifikasyon (ii) ile ayni amino asit konumunda modifikasyonlarin en az bir amino asit kombinasyonunu içermekte olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir. modifikasyon içerebilmekte olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabatita oldugu gibi EU endeksininkidir. Bir baska uygulamada, mevcut açiklamaya göre bir varyant asagidakileri içerir: parent polipeptide kiyasla FC bölgesinin olusan gruptan seçilen amino asit modifikasyonlarinin en az bir kombinasyonu ve olusan gruptan seçilen en az bir amino asit modifikasyonu olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir ve modifikasyon (i)'in modifikasyon (ii) ile ayni amino asit konumunda modifikasyonlarin en az bir amino asit kombinasyonunu içermekte olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat"ta oldugu gibi EU endeksininkidir. modifikasyon içerebilmekte olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir. Bir baska uygulamada, mevcut açiklamaya göre bir varyant asagidakileri içerir: parent polipeptide kiyasla Fc bölgesinin olusan gruptan seçilen amino asit modifikasyonlarinin en az bir kombinasyonu ve olusan gruptan seçilen en az bir amino asit modifikasyonu olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat'ta oldugu gibi EU endeksininkidir ve modifikasyon (i)'in modifikasyon (ii) ile ayni amino asit konumunda Önceden anilan tüm uygulamalarda, söz konusu varyant parent polipeptide kiyasla tercihen 1 ila 20 arasinda, daha tercihen 1 ila 10 arasinda amino asit modifikasyonuna sahiptir. Farkli bir uygulamada, söz konusu varya nt, FC bölgesinin modifikasyonlarinin bir kombinasyonunu Içermekte olup, burada Fc bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabat`ta oldugu gibi EU endeksininkidir. Baska uygulamada, söz konusu varyant, 256N/378V/434Y, gruptan seçilen amino asit modifikasyonlarinin bir kombinasyonunu içerir. Mevcut bulusun bir diger amaci, parent polipeptitlerine kiyasla FcRn için artan varyantlari saglamak olup, burada FC bölgesindeki amino asitlerin numaralandirilmasi, Kabatlta oldugu gibi EU endeksininkidir. Bazi baska uygulamalarda, parent polipeptidine kiyasla FcRn için artan baglanmaya sahip polipeptit varyanti, gruptan seçilen bir Fc varyanti içerir. Yukarida-belirtilen bulusa göre varyantlarin tümü için, parent polipeptitlerinin Fc bölgesi dogal-sus IgG`Ierin (örnegin "alt mentese-CH-Z-CHS") ve bunlarin fragmanlarinin FC bölgelerinden türetilebilir. Daha tercih edilen bir uygulamada, parent polipeptitlerin Fc bölgesi insan IgG alt siniflarindan, yani IgG1, IgGZ, IgG3 ve IgG4'ten türer. Bir baska tercih edilen uygulamada. parent polipeptitlerin Fc bölgesi, dogal-sus lgG1 Fc bölgesi (SEQ lD:N01), dogal-sus IgGZ Fc bölgesi (SEQ lD:NO2), dogal-sus lgG3 Fc bölgesi (SEO lD:N03) ve dogal-sus IgG4 Fc bölgesinden (SEQ lD:NO4) olusan gruptan seçilir. Bu baglamda, bulusun bir baska amaci, bir lgG1 FC varyanti içeren bir polipeptit olup, burada söz konusu lgG1 Fc varyanti IgG1 Fc'sinin (SEQ ID No:1) dogal-sus dizisine kiyasla en az bir amino asit modifikasyonu içerir ve söz konusu lgG1 Fc varyantinin dizisinin SEO ID No:2, SEQ ID No:3 ve SEQ ID NO:4 olmamasi sartiyla dogal-sus lgG1 Fclsine kiyasla FcRn'ye artan bir baglanma sergiler. Bulusun bir baska amaci, bir IgG2 Fc varyanti içeren bir polipeptit olup, burada söz konusu lgG2 Fc varyanti IgG2 Fc'sinin (SEQ ID No:2) dogal-sus dizisine kiyasla en az bir amino asit modifikasyonu içerir ve söz konusu IgG2 FC varyantinin dizisinin SEQ ID NO:1, SEQ ID No:3 ve SEO ID NO:4 olmamasi sartiyla dogal-sus IgG2 Fc'sine kiyasla FcRn'ye artan bir baglanma sergiler. Bulusun ek bir amaci, bir IgG3 Fc varyanti içeren bir polipeptit olupi burada söz konusu amino asit modifikasyonu içerir ve söz konusu IgGS Fc varyantinin dizisinin SEQ ID No:1, SEQ ID N02 ve SEO ID NO:4 olmamasi sartiyla dogal-sus IgG3 Fc'sine kiyasla FcRn"ye artan bir baglanma sergiler. Bulusun bir baska amaci, bir IgG4 Fc varyanti içeren bir polipeptit olup, burada söz konusu IgG4 Fc varyanti IgG4 Fc'sinin (SEQ ID No:4) dogal-sus dizisine kiyasla en az bir amino asit modifikasyonu içerir ve söz konusu IgG4 Fc varyantinin dizisinin SEQ ID No:1, SEO ID No:3 ve SEO ID No:2 olmamasi sartiyla dogal-sus IgG4 Fc'sine kiyasla FcRn"ye artan bir baglanma sergiler. Tercih edilen uygulamalarda, IgG1, IgG2, lgG3 veya IgG4 FC varyant polipeptitlerinde yer alan en az bir amino asit modifikasyonu, bir FC bölgesi içeren ve karsilik gelen parent polipeptide kiyasla FcRn'ye artan bir baglanmaya sahip bir polipeptidin varyanti genel olarak tanimlanirken bu spesifikasyonda yukarida tarif edilen amino asit modifikasyonlarinin ve amino asit modifikasyonlarinin kombinasyonlarinin grubundan seçilir. Yukarida tarif edildigi üzere, bulusa göre bir varyant, karsilik gelen parent polipeptide kiyasla FcRn`ye artan bir baglanma sergiler. Bir uygulamada, söz konusu varyantin efektör fonksiyonlari ve diger baglanma özellikleri karsilik gelen parentinkine benzerdir. Söz konusu varyant parent polipeptidine kiyasla özellikle FC-gamma reseptörlerine veya C1q`ya baglanmada kayda deger bir degisiklik sergilemez. Bir baska uygulamada, söz konusu varyant, bir veya daha fazla degistirilmis efektör fonksiyonlari ve/veya (FcRn disindaki) Fc Iigandlarina baglanmayla birlikte FcRn'ye Örnek 2'de resmedildigi üzere, bulusun varyanti, polipeptit varyantina kiyasla bir FcvR"ye, özellikle FcleIla'ya degistirilmemis baglanmayla, ADCC (Antikor-Bagimli Hücre-aracili Sitotoksisite) aktivitesiyle ve CDC (Kompleman-Bagimli Sitotoksisite) aktivitesiyle birlikte FcRn'ye artan bir baglanmaya sahip olabilir. Bulusun varyanti ayrica, en azindan parent polipeptidininkine benzer ADCC ve CDC aktiviteleriyle birlikte FcRn'ye artan bir baglanmaya sahip olabilir. Diger bazi durumlarda, bulusun varyanti, polipeptid parentine kiyasla ADCC ve CDC'den seçilen en az bir indirgenmis efektör aktivitesiyle birlikte FcRn'ye artan bir baglanmaya sahip olabilir. ADCC ve CDC aktiviteleri, mevcut spesifikasyonun Örnek 2 IV.2 ve IV.3 kisimlarinda tarif edilenler gibi, önceki teknigin iyi-bilinen yöntemleriyle tayin edilebilir. FcyRiye baglanma, SPR veya ELISA tayini gibi konvansiyonel yöntemlerle tayin edilebilir. Bulusun bir diger amaci, olusan varyantlarin parent polipeptide kiyasla FcRn'ye artan bir baglanmaya sahip olmasi sartiyla opsiyonel olarak önceden anilanlardan farklilik gösteren ilave amino asit modifikasyonlari içeren varyantlar saglamaktir. Dolayisiyla, mevcut bulusun Fc modifikasyonlari, FcRn için Pc afinitesini arttirdigi bilinen diger Fc modifikasyonlariyla birlestirilebilir (bakiniz örnegin, mevcut basvurunun ilgili teknigin tarifine tahsis edilmis kisminda anilan referanslar). Alternatif olarak, Fc modifikasyonlari, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, efektör fonksiyonu veya bir veya daha fazla FC Iigandiyla etkilesimi degistiren modifikasyonlar dahil olmak üzere diger FC modifikasyonlariyla birlestirilebilir. Bunun bir sonucu olarak, bu tip varyantlar parent polipeptide kiyasla FcRn'ye, (FcRn disinda) bir Fc Iigandina degistirilmis bir baglanmayla veya/ve degistirilmis bir efektör fonksiyonuyla birlestirilen artan bir baglanma sergileyebilir. Fc Iigandlarina bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla FcyR'ler (Fcgamma reseptörleri), Clq, CB, mannan baglayan Iektin, mannoz reseptörü, stafilokok protein A, streptokok protein G ve viral FcyR'ler dahildir. Fc Iigandlari ayrica, Fc reseptörlerinin FcgammaR'lere homolog olan bir familyasi olan Fc reseptörü homologlarini da (FCRH) Burada kullanildigi sekliyle "efektör fonksiyon", bir antikor Fc bölgesinin bir Fc reseptörüyle veya Iigandiyla etkilesiminden ortaya çikan bir biyokimyasal veya hücresel olay anlamindadir. Efektör fonksiyonlara, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, ADCC (Antikor-Bagimli Hücre-aracili Sitotoksisite), ADCP (Antikor-Bagimli Hücre-aracili Fagositoz) ve CDC (Kompleman-Bagimli Sitotoksisite) dahildir. Mevcut açiklamanin varyantlari bir Fc bölgesi içeren ve söz konusu polipeptidin parent polipeptidinden FC bölgesindeki en az bir amino asit modifikasyonu veya amino asit modifikasyonlarinin kombinasyonu sayesinde farklilik göstermesi sartiyla parent polipeptidine kiyasla FcRn için artan bir baglanma afinitesi sergileyen herhangi bir polipeptidi kapsar. Ilgi konusu modifikasyonlar ve amino asit modifikasyonlarinin kombinasyonlari, bulusa göre varyantlarin genel özellikleri verilirken yukarida tarif edilenlerdir. Ekli istemler tarafindan tanimlandigi üzere, varyantlara (ve böylelikle parent polipeptitlere), bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, antikorlar, FC füzyon proteinleri. Fc konjugatlari, izole FC ve sirasiyla bunlarin fragmanlari dahildir. Özellikle, varyantlar bir Fc-içeren baglayici protein olabilir. Diger bir deyisle, varyantlar (i) bir FC varyanti ve (ii) belirli bir moleküle özgül olarak baglanabilen bir baglayici polipeptit alani içerir. Bir uygulamada, bulusun polipeptit varyantlari, FC-füzyon protein varyantlarindan ve Fc-konjugat varyantlarindan olusan gruptan seçilir. Fc-füzyon proteini ve Fc- konjugatlari bir partnere bagli bir Fc-bölgesinden olusur. Fc bölgesi partnerine bir aralayici ile veya aralayici olmadan baglanabilir. Mevcut bulusa göre, bir Fc füzyon proteini bir tek gen tarafindan kodlanan bir proteindir ve bir protein, bir polipeptit veya bir Fc bölgesine bagli bir küçük peptit içerir. Bir Fc füzyon proteini opsiyonel olarak bir peptit aralayici içerir. Neredeyse herhangi bir protein veya küçük molekül, bir Fc füzyonu olusturmak için Fc bölgelerine baglanabilir. Protein füzyon partnerlerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, herhangi bir antikorun degisken bölgesi, herhangi bir antikorun bir degisken bölgesinden türetilen bir polipeptit, bir reseptörün hedef-baglayici bölgesi, bir adezyon molekülü, bir ligand, bir enzim, bir sitokin, bir kemokin veya bazi diger protein veya protein alani dahil olabilir. Özellikle Fc-füzyon proteini bir immünoadezin, yani bir heterolog "adezyon" proteinin (yani reseptör, ligand veya enzim) baglayici alanini immünoglobülin sabit alaninin (yani bir Fc bölgesi) bir fragmaniyla birlestiren antikor-benzeri protein olabilir (immünoadezinler hakkinda bir inceleme için bakiniz, Ashkenazi A, Chamow SM. Küçük peptit füzyon protein partnerlerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla Fc füzyonunu terapötik bir hedefe yönlendiren herhangi bir terapötik ajan dahil olabilir. Bu tip hedefler herhangi bir molekül, tercihen hastalikta yer alan bir hücre disi reseptör olabilir. Mevcut bulusa göre, bir FC konjugati bir PC bölgesinin bir konjugat partneriyle kimyasal eslestirilmesinden ortaya çikar. Konjugat partneri proteinli veya proteinli-olmayan olabilir. Eslestirme tepkimesi genellikle Fc bölgesi üzerindeki ve konjugat partner üzerindeki fonksiyonel gruplari kullanir. Konjugatin sentezi için uygun olacak çesitli baglayicilar teknikte bilinmektedir; örnegin, homo- veya hetero-bifonksiyonel baglayicilar iyi bilinmektedir (bakiniz, Pierce Chemical Company katalogu, 2005-2006, çapraz-baglayicilar hakkindaki teknik kisim, sayfalar 321-350). Uygun konjugat partnerlerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, terapötik polipeptitler, etiketler (etiketlerin örnekleri için bakiniz asagisi), ilaçlar, sitotoksik ajanlar, sitotoksik ilaçlar (örnegin, kemoterapötik ajanlar), toksinler ve bu tip toksinlerin aktif fragmanlari dahildir. Uygun toksinlere ve bunlarin karsilik gelen fragmanlarina, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, difteri A zinciri, eksotoksin A zinciri, risin A zinciri, abrin A zinciri, kursin, krotin, fenomisin, enomisin ve benzerleri dahildir. Bir sitotoksik ajan, Fc varyantina dogrudan konjuge edilebilen veya Fc varyantina esdegerli olarak ekli bir selatlayici ajan tarafindan sekestre edilebilen herhangi bir radyonüklit olabilir. Ilave uygulamalarda, konjugat partnerleri, kalikeamisin, auristatinler, geldanamisin, maytansin ve duokarmisinler ve analoglarindan olusan gruptan seçilebilir (ikincisi için, Ilgi konusu bu tip varyantlar düsürülmüs pH'ta (örnegin yaklasik pH 6'da) FcRn'ye artan bir baglanmaya ve daha yüksek pH'ta (örnegin yaklasik pH 7,4'te) büyük ölçüde modifiye edilmemis baglanmaya sahip olabilir. parent polipeptitlere kiyasla artan in vivo yari-ömürler sergileyen Fc-füzyon protein ve Fc-konjugat varyantlari özellikle ilgi konusudun Tercih edilen bir uygulamada, mevcut bulusun polipeptit varyanti, bir parent antikorun bir varyant antikorudur. "Antikor" terimi burada, en genis anlamiyla kullanilmaktadir. Mevcut bulusa göre, "antikor", en azindan (i) bir Fc bölgesi ve (ii) bir immünoglobülinin bir degisken bölgesinden türetilen bir baglayici polipeptit alani içeren herhangi bir polipeptidi ifade etmektedir. Söz konusu baglayici polipeptit alani belirli bir hedef antijeni veya hedef antijenlerin bir grubunu özgül olarak baglayabilir. Bir immünoglobülinin bir degisken bölgesinden türeyen bir baglayici polipeptit alani bir veya daha fazla CDR içerir. Burada, antikorlara, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, tam-boy immünoglobülinler, monoklonal antikorlar, çoklu-özgül antikorlar, en az bir degisken bölge içeren Fc-füzyon proteini, (burada bazen "antikor mimetikleri" olarak ifade edilen) sentetik antikorlar, kimerik antikorlar, insanlastirilmis antikorlar ve tamamen insan antikorlari dahildir. Antikorlar ayrica antikor-füzyon proteinlerini, antikor konjugatlarini ve sirasiyla her birinin fragmanlarini da kapsar. Dolayisiyla bulusun bir varyant antikoru, Fc bölgesinde, parent antikoruna kiyasla FcRn için baglanma afinitesini arttiran, yukarida-anilan en az bir amino asit modifikasyonu veya modifikasyonlarin kombinasyonunu içerir. Düsürülmüs pH'ta (örnegin yaklasik pH 6'de) FcRn'ye artan bir baglanma afinitesi sergileyen ve daha yüksek pH'ta (örnegin yaklasik pH 7,4'te) büyük ölçüde modifiye edilmemis baglanmaya sahip antikor varyantlari özellikle ilgi konusudur. Ayrica, parent polipeptitlere kiyasla artan in vivo yari-ömürlere sahip antikor varyantlari da özellikle ilgi konusudur. Bir uygulamada, bulusun bir varyant antikoru, parent tam-boy antikorlarin varyantlarindan olusan gruptan seçilir. Burada "tam boy antikor", bir antikorun, degisken ve sabit bölgeler dahil olmak üzere dogal biyolojik formunu olusturan yapi anlamindadir. Mevcut bulusun bir tam-boy antikor varyantinin parent polipeptidi bir dogal-sus antikor, bir dogal-sus antikorun (örnegin önceden-var olan modifikasyonlari içeren) bir mutanti, bir dogal-sus antikorun islenmis bir versiyonu (örnegin bir kimerik, bir insanlastirilmis antikor veya bir tamamen insan antikor, bakiniz asagisi) olup liste sinirli degildir. Bir tam-boy antikorun yapisi, bazi immünoglobülinlerin dimerler oldugu tipik olarak iki özdes polipeptit zinciri çiftinden olusmakta olup, her bir çift (tipik olarak yaklasik 25 kDailik bir moleküler agirliga sahip) bir "hafif" ve (tipik olarak yaklasik bir "agir" zincire sahiptir. Tam-boy antikorlarin örnekleri, IgM, IgD, lgG, IgA ve IgE siniflarini kapsayan insan immünoglobülinlerdir. Tercih edilen uygulamalarda, söz konusu tam-boy antikor varyanti, IgG'Ierin varyantlarindan olusan gruptan seçilir. Daha tercih edilen uygulamalarda, söz konusu tam-boy antikor varyanti, söz konusu varyantin söz konusu Fc bölgesi dizisinin SEQ ID No:1, SEQ lD No:2, SEQ ID No:3 ve SEO ID NO:4 olmamasi sartiyla, insan IgG1, lgG2, IgG3 ve IgG4'ünün varyantlarindan olusan gruptan seçilir. Söz konusu lgG varyanti parent IgG'sine kiyasla bir veya daha fazla amino asit modifikasyonu içerir, söz konusu bir veya daha fazla modifikasyon veya amino asit modifikasyonlarinin kombinasyonlari, mevcut spesifikasyonda bir polipeptidin bir Fc bölgesi içeren ve karsilik gelen parent polipeptide kiyasla FcRn'ye artan bir baglanmaya sahip varyantlari tanimlanirken önceden tarif edilenlerdir. Bir baska uygulamada, söz konusu antikor varyanti, bir immünoglobülinin bir degisken alanindan türetilen bir baglayici polipeptit alani içeren Fc-füzyon proteininden olusan gruptan seçilir. (a) bulusun bir FC varyantini ve (b) bir immünoglobülinin bir degisken bölgesinden türetilen asagidaki baglayici polipeptit alanlarinin birini içeren (yani en az bir CDR içeren) antikorlar özellikle ilgi konusudur: (i) VL, VH, CL ve CH1 alanlarindan olusan Fab fragmani, (ii) VH ve CH1 alanlarindan olusan Fd fragmani, (iii) bir tek antikorun VL ve VH alanlarindan olusan Fv fragmani, (iv) izole CDR bölgeleri, (v) iki bagli Fab fragmani içeren bir iki-degerli fragman olan F(ab')2 fragmanlari, (vi) tek zincirli Fv molekülleri (scFv) olup, burada bir VH alani ve bir VL alani, iki alanin bir antijen baglanma alani olusturmak için birlesmesine olanak saglayan bir peptit baglayici tarafindan baglanir, (vii) ikili-özgül tek zincirli Fv ve (viii) "diakorlar" veya sinirli degildir. Bir baska uygulamada, antikor bir minikordur. Minikorlar, bir CH3 alanina birlesik bir scFv içeren minimize edilmis antikor-benzeri proteinlerdir (Hu et al., 1996, Cancer Res. bunun fragmanini da içerebilir. Bir uygulamada, bulusun antikorlari çoklu-özgül antikorlarin ve bilhassa bazen (veya daha fazla) farkli antijene baglanir. Diakorlar teknikte bilinen çesitli yollarla kimyasal olarak hazirlanabilir veya hibridomlardan türetilebilir. Bazi uygulamalarda, antikor varyantlarinin iskele bilesenleri farkli türlerin bir karisimi olabilir. Bu tip antikor varyanti bir kimerik antikor ve/veya bir insanlastirilmis antikor olabilir. Genel olarak, hem "kimerik antikorlar" hem "insanlastirilmis antikorlar", birden fazla türden bölgeleri birlestiren antikorlari ifade etmektedir. Örnegin, "kimerik antikorlar" geleneksel olarak bir insan-olmayan hayvandan, genellikle fareden (veya bazi durumlarda siçandan) degisken bölge(ler) ve bir insandan sabit bölge(ler) içerir. Ekseriyetle, insanlastirilmis antikorlar, insan olmayan immünoglobülinden türetilen minimal dizi ihtiva eden kimerik antikorlardir. Genellikle, insanlastirilmis bir antikorda, CDR"Ier hariç tüm antikor, insan kökenli bir polinükleotid tarafindan kodlanir veya CDRilerinin içi haricinde bir insan antikoruna özdestir. Bazilari veya tamami bir insan- olmayan organizmadan kaynaklanan nükleik asitlerle kodlanan CDR'Ier, özgüllügü greftlenmis CDR'Ier tarafindan belirlenen bir antikor yaratmak için bir insan antikoru degisken bölgesinin beta-tabaka çerçevesinin içine greftlenir. Bu tip antikorlarin olarak ayrica bir immünoglobülin sabit bölgesinin, tipik olarak bir insan immünoglobülininin en azindan bir kismini içerecektir ve böylelikle tipik olarak bir insan F0 bölgesi içerecektir. insanlastirilmis antikorlar ayrica genetigi degistirilmis bir bagisiklik sistemine sahip fareler kullanilarak da olusturulabilir (Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654). Insan-olmayan antikorlarin insanlastirilmasi ve yeniden sekillendirilmesi için çesitli teknikler ve yöntemler teknikte iyi bilinmektedir (Bakiniz Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, . Insanlastirma yöntemlerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Jones et al., 1986, Eng 11:321-8'de tarif edilen yöntemler dahildir. Insan-olmayan antikor degisken bölgelerinin insanlastirilmasi veya immünojenesitesinin indirgenmesi için diger tarif edildigi üzere yüzey yenileme yöntemleri dahil olabilir. Bir uygulamada, söz konusu antikor varyanti, burada genel hatlariyla verildigi üzere en az bir amino asit modifikasyonuna sahip bir tamamen insan antikorudur. "Tamamen insan antikor" veya "tam insan antikoru", tamamen insan genlerinden kaynaklanan diziler içeren bir antikoru ifade etmektedir. Bazi durumlarda, bu, burada genel hatlariyla verilen modifikasyonlara sahip bir insan kromozomundan türetilen bir antikorun gen dizisine sahip insan antikorlari olabilir. Alternatif olarak, antikorun bilesenleri insan olabilir ancak tek bir genden türetilmis olmayabilir. Böylelikle, örnegin, bir antikordan insan CDR'Ieri, bir veya daha fazla insan antikorundan, iskele dizileri gibi dizilerle birlestirilebilir. Örnegin, çesitli germ hatti dizileri (örnegin yukaridaki insanlastirilmis veya kimerik dizilerde kullanim için) ve ayrica 11/022.289 Seri Numarali U.S. patent basvurusunda genel hatlariyla verildigi üzere bir insan antikoru veya insan iskelesi olusturmak için birlestirilebilir. Belirli uygulamalarda, bulusun antikor varyanti, kimerik IgG'Ierden, insanlastirilmis Antikorlarin esdegerli modifikasyonlari da bu bulusun kapsami dahilinde yer almaktadir ve genellikle, ancak her zaman degil, post-translasyonel olarak yapilir. Bu modifikasyonlara, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, glikosilasyonlar, etiketleme ve konjugasyon dahildir. Dolayisiyla, bazi uygulamalarda, burada açiklanan polipeptit varyantlari, bir veya daha fazla islenmis glikoformlar içermeleri için modifiye edilebilir. Burada kullanildigi sekliyle karbonhidrat bilesimi anlaminda olup, burada söz konusu karbonhidrat bilesimi bir parent polipeptidinkinden kimyasal olarak farklilik gösterir. islenmis glikoformlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, efektör fonksiyonun güçlendirilmesi veya indirgenmesi dahil olmak üzere çesitli amaçlar için faydali olabilir. islenmis glikoformlar varyant dizisinin herhangi bir amino asidine eklenebilir. Tercih edilen bir uygulamada, söz konusu glikoformlar, Fc bölgesinin amino asitlerinde eklidir. islenmis glikoformlar teknikte bilinen çesitli yöntemlerle üretilebilir (Umaria et al., 1999, (Potelligent® technology [Biowa, Inc., Princeton, N.J.]; GlycoMAb® glycosylation engineering technology [Glycart Biotechnology AG, Zürih, Isviçre]). Bu tekniklerin birçogu, FC bölgesine esdeger olarak ekli fukosilatli ve/veya açiortayli oligosakkaritlerin seviyesinin, örnegin antikor varyantini islenmis veya baska sekillerde çesitli organizmalarda veya hücre çizgilerinde (örnegin Leo-13 CHO hücreleri veya siçan hibridom YBZ/O hücreleri) eksprese edilmesiyle, glikosilasyon yolaginda (örnegin, yer alan enzimlerin düzenlenmesiyle veya antikor varyanti eksprese edilmis olduktan sonra karbonhidrat(lar)in modifiye edilmesiyle kontrol edilmesine dayalidir. Alternatif olarak, islenmis glikoform, farkli karbonhidrat veya oligosakkarit içeren antikor varyantini ifade edebilir. Teknikte bilindigi üzere, glikosilasyon örüntüleri hem proteinin (örnegin, asagida müzakere edildigi üzere, belirli glikosilasyon amino asit kalintilarinin varligi veya yoklugu) veya hem proteinin üretildigi konak hücre veya organizmanin dizisine bagli olabilir. Belirli ekspresyon sistemleri asagida müzakere edilmektedir. Polipeptitlerin glikosilasyonu tipik olarak ya N-bagli veya O-baglidir. N-bagli, karbonhidrat bölütünün, bir asparajin kalintisinin yan zincirine eklenmesini ifade etmektedir. X'in prolin hariç herhangi bir amino asit oldugu tri-peptit dizileri asparajin-X- serin ve asparajin-X-treonin, karbonhidrat bölütünün asparajin yan zincire enzimatik eklenmesi için tanima dizileridir. Böylelikle, bu tri-peptit dizilerinin herhangi birinin bir polipeptitteki varligi potansiyel bir glikosilasyon alani yaratir. O-bagli glikosilasyon, her ne kadar 5-hidroksiprolin veya 5-hidr0ksilisin de kullanilabilse de, N-asetilgalaktosamin, galaktoz veya ksiloz sekerlerinin birinin bir hidroksiamino asidine, en yaygin olarak Serin veya treonine eklenmesini ifade etmektedir. Glikosilasyon alanlarinin antikora eklenmesi elverisli bir sekilde amino asit dizisinin, yukarida-tarif edilen tri-peptit dizilerinin birini veya daha fazlasini (N-bagli glikosilasyon alanlari için) ihtiva ettigi sekilde degistirilmesiyle basarilabilir. Degistirme ayrica bir veya daha fazla serin veya treonin kalintisinin baslangiç dizisine (O-bagli glikosilasyon alanlari için) eklenmesiyle veya ikame edilmesiyle de yapilabilir. Kolaylik açisindan, antikor amino asit dizisi tercihen DNA seviyesindeki degisiklikler yoluyla, hedef polipeptidi kodlayan DNA'nin önceden seçili bazlarda, istenen amino asitlerin içine transle olacak kodonlarin üretildigi sekilde mutasyona ugratilmasiyla degistirilir. Antikor üzerindeki karbonhidrat bölütlerinin sayisinin arttirilmasinin bir baska araci, glikositlerin proteine kimyasal veya enzimatik eslestirilmesidir. Bu prosedürler, proteinin, N- ve O-bagli glikosilasyon için glikosilasyon becerilerine sahip bir konak hücrede üretilmesini gerektirmemeleri açisindan avantajlidir. Kullanilan eslestirme moduna bagli olarak, seker(ler) (a) arjinin ve histidine, (b) serbest karboksil gruplarina, (c) sisteininkiler gibi serbest sülfhidril gruplarina, (d) serin, treonin veya hidroksiprolininkiler gibi serbest hidroksil gruplarina, (e) fenilalanin, tirosin veya triptofaninkiler gibi aromatik kalintilara veya (f) glutaminin amid grubuna eklenebilir. Bu CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306'da tarif edilmektedir. Baslangiç antikoru üzerinde mevcut karbonhidrat bölütlerinin yok edilmesi kimyasal olarak veya enzimatik olarak basarilabilir. Kimyasal deglikosilasyon, proteinin triflorometansülfonik asit bilesigine veya esdeger bir bilesige maruz birakilmasini gerektirir. Bu islem, baglayici seker (N-asetilglukosamin veya N-asetilgalaktosamin) hariç sekerlerin birçogunun veya tamaminin yarilmasiyla sonuçlanirken polipeptidi intakt olarak birakir. Kimyasal deglikosilasyon, Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. tarif edilmektedir. Polipeptitler üzerindeki karbonhidrat bölütlerinin enzimatik yarilmasi, endo- ve ekso-glikosidazlarin kullanilmasiyla basarilabilir. Potansiyel glikosilasyon edildigi üzere tunikamisin bilesiginin kullanilmasiyla engellenebilir. Tunikamisin, protein-N-glikosit baglantilarinin olusumunu bloke eder. Bazi uygulamalarda, bulusun antikor varyanti, islenmis glikoformlar içeren kimerik seçilir. Alternatif bir uygulamada, bulusun antikor varyantlarinin esdegerli modifikasyonu, bir veya daha fazla etiketin ilavesini içerir. Bazi durumlarda, bunlar antikor füzyonlari olarak degerlendirilir. "Etiketleme grubu" terimi, herhangi bir saptanabilir etiket anlamina gelmektedir. Bazi uygulamalarda, etiketleme grubu antikora, potansiyel sterik engellemenin indirgenmesi için çesitli uzunluklardaki aralayici kollari vasitasiyla eslestirilir. Proteinlerin etiketlenmesi için çesitli yöntemler teknikte bilinmektedir ve mevcut bulusun gerçeklestirilmesinde kullanilabilir. Genel olarak, etiketler, saptanacaklari tayine veya tani prosedürüne bagli olarak çesitli siniflara ayrilir: a) radyoaktif veya agir izotoplar olabilen izotopik etiketler; b) manyetik etiketler (örnegin, manyetik partiküller); c) redoks aktif bölütler; d) optik boyalar; enzimatik gruplar (örnegin yaban turpu peroksidaz, ß-galaktosidaz, Iusiferaz, alkalin fosfataz); e) biyotinlenmis gruplar ve f) bir ikincil raportör tarafindan taninan önceden belirlenmis polipeptit epitoplari (örnegin, Iösin fermuar çifti dizileri, ikincil antikorlar için baglama alanlari, metal baglama alanlari, epitop etiketleri vb.). Spesifik etiketlere, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, kromoforlar, fosforlar ve floroforlar dahil olmak üzere optik boyalar dahildir, ikincisi birçok durumda spesifiktir. Floroforlar ya florisir "küçük moleküller", florisir veya florisir proteinler olabilir. Bir baska uygulamada, mevcut bulusun antikor varyantlari, yukarida tarif edildigi üzere bir etiketleme grubu olarak kullanilmayan bir proteine veya bir küçük moleküle kaynastirilabilir veya konjuge edilebilir. Neredeyse herhangi bir protein veya küçük molekül bir antikora baglanabilir. Protein füzyon partnerlerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bir reseptörün hedef-baglayici bölge, bir adezyon molekülü, bir Iigand, bir enzim, bir sitokin, bir kemokin veya bazi diger protein veya protein alani dahil olabilir. Küçük moleküllere, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, ilaçlar, sitotoksik ajanlar (örnegin, kemoterapötik ajanlar), toksinler veya bu tip toksinlerin aktif fragmanlari dahildir. Yukarida tarif edildigi üzere, bulusun antikor varyantlari bir hedef antijene veya hedef antijenlerin bir grubuna özgül olarak baglanabilir. Burada kullanildigi sekliyle "hedef antijen", özgül olarak belirli bir antikorun veya immünoglobülinin degisken bölgesi tarafindan baglanan molekül anlamindadir. Bir hedef antijen bir protein, bir karbonhidrat, bir Iipit veya diger kimyasal bilesik olabilir. Uygun antijen seçimi istenen uygulamaya baglidir. Neredeyse, herhangi bir antijen, örnegin bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla RhD antijeni, CD3, CD4, CD19, CD20, ErbB4 (EGFR, HER2/neu, HER3, HER4), VEGF-R1, VEGF-RZ, lGF-Ri, PIGF-R reseptörlerinin ErbB familyasina ait olanlar gibi büyüme faktörü reseptörleri, MHC sinif I ve MHC sinif II molekülleri, örnegin HLA-DR, IL-1R, IL-2R alfa, IL-2R beta ve IL-2R gamma, IL-BR gibi interlökin reseptörleri, Müllerian önleyici madde tip II reseptörü gibi hormon reseptörleri, LDL reseptörü, NKp44L, CXCR4 ve CCR5 gibi kemokin reseptörleri, integrinler, CD2, ICAM, EpCAM gibi adezyon molekülleri içeren membran proteinleri hedeflenebilir. Membran proteinlerine ayrica GD2, GDS, CA125, MUC-1, MUC-16, karsinoembriyonik antijen (CEA), Tn, glikoprotein 72, PSMA, HMW-MAA gibi tümör belirteçleri dahildir. Bulusun antikorlari ayrica, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, sitokinler (örnegin IL-1 beta, lL-2, lL-6, lL-12, lL-23, TGF beta, TNF alfa, IFN gamma), kemokinler, VEGF-A, EGF, PIGF, PDGF, IGF gibi büyüme faktörleri, hormonlar, bakteriyel toksinler ve botulinus toksini gibi diger kökenli toksinler, risin, B. antrasis koruyucu antijen, B. antrasis ölümcül faktörü, B. antrasis ödem faktörü, sigatoksinler 1 ve 2, farkli virüslerden, örnegin patojenik virüslerden viral antijenler, bir FVIII önleyici antikor dahil olmak üzere bir önleyici antikor dahil olmak üzere çözünür proteinleri de hedefleyebilir. Tercih edilen bir uygulamada, mevcut bulusun varyanti CD20'yi hedefleyebilir. Bu durumda, parent polipeptit asagidakilerden seçilebilir: EMABB veya EMA8603 (bakiniz WO (bakiniz örnegin AME-, HumaLYM Thereof" baslikli). Bir baska uygulamada, mevcut bulusun varyanti RhD antijenini hedefleyebilir. Bu durumda, parent polipeptit EMABZ (bakiniz FR 03 12 229), Sym veya MonoRho'dan (ZLB, Zürih) seçilebilir. Parent polipeptit ayrica Avastin® (anti-VEGF), Remicade® (anti-TNF-oi), Erbitux®, Vectibix® (anti-EGFR), Tysabri® (integrinin anti-alfa4 zinciri), Herceptin® (anti- HER2/neu) olabilir ve liste sinirli degildir. Mevcut basvuru ayrica, çesitli iyi-bilinen terapötik olarak ilgili özelliklerden seçilen bir baska optimize özellikle birlikte FcRn'ye artan bir baglanma sergileyen varyantlar da saglamaktadir. Optimize edilebilen en tercih edilen özellik iri vivo yari-ömürdür. Artan bir in vivo yari-ömür sergilemek için, varyant FcRn'ye düsük pH'ta, mesela endozomlarla iliskili pH'ta, örnegin pH 6,0'da artan baglanma afinitesi sergilemeliyken, endozomlarin içine ancak normal salim hizlarinda FcRn'ye artan baglanmaya olanak saglamak için daha yüksek pH'ta, mesela 7,4'te indirgenmis afiniteyi de muhafaza Mol Immunol. 43(9):1462-73). Benzer sekilde, bu tip modüle edilmis FcRn baglanmasina sahip bu varyantlar opsiyonel olarak, modüle edilmis FcyR baglanmasi gibi diger arzu edilen özelliklere sahip olabilir. Ilave bir uygulamada, varyantlar, FcRn baglama profiline ek olarak bir insan aktive edici FcyR'ye, tercihen FcvRllla'ya güçlendirilmis afiniteye haiz olmak için optimize edilir. Farkli bir uygulamada, varyantlar FcRn için artan afiniteye ve bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla Fcle, FcvRlla, Fclelb, Fclelc ve FcyRIllb ve bunlarin allelik varyasyonlari dahil olmak üzere bir insan Fclesine artan veya azalan afiniteye sahip olmak için optimize edilir. Alternatif uygulamalarda, mevcut bulusun varyantlari opsiyonel olarak artan (veya azalan) efektör fonksiyonlarinin yani sira artan bir serum yari-ömrüne sahip olabilir. Özellikle tercih edilen uygulamalarda, bulusun bir varyanti artan ADCC aktivitesine ve/veya bir Fcleye artan baglanmaya ve ayrica polipeptid parentine kiyasla artan serum yari- ömre sahip olabilir. Diger uygulamalarda, bulusun varyanti ayrica, polipeptid parentine kiyasla artan bir CDC aktivitesine sahip olabilir. Varyantlar, çok çesitli ürünlerde kullanilabilir. Bir uygulamada varyant bir terapötik, bir tanisal veya bir arastirma reaktifidir, tercihen bir terapötiktir. FcRn'ye artan baglanma sergilediklerinden, bulusun varyantinin daha uzun in vivo yari- ömürlere, daha kesin olarak parent polipeptitlerinden daha uzun in vivo serum yari- ömürlere sahip olmalari beklenir. Bunun bir sonucu olarak, bu tip varyantlar, parent polipeptit kan dolasimindan çok hizli arindirildiginda parent polipeptit ikameleri olarak veya uzun yari-ömür aktif prensipleri gerektiren kronik veya uzun-vadeli hastaliklarin tedavisinde kullanim için faydali uygulamalara sahiptir. Varyantlar antikorlar grubundan seçildiginde, monoklonal veya poliklonal olan bir antikor bilesiminde kullanilabilir. Tercih edilen bir uygulamada, söz konusu antikor varyantlari, hedef antijeni tasiyan hedef hücreleri, örnegin kanser hücrelerini öldürmek için kullanilir. Farkli bir uygulamada, varyantlar hedef antijenin bloke edilmesi, antagonize veya agonize edilmesi için, örnegin bir sitokin veya sitokin reseptörünün antagonize edilmesi Için, bir bakteri veya bir virüs veya bir toksin, örnegin, bir bakteriyel toksin gibi enfeksiyöz bir ajanin nötrlestirilmesi için kullanilir. Alternatif olarak tercih edilen bir uygulamada, varyantlar hedef antijeni bloke etmek, antagonize veya agonize etmek ve hedef antijeni tasiyan hedef hücreleri öldürmek için kullanilir. Tercih edilen bir uygulamada, bir varyant antikor bir hastaya, bir antikor-iliskili rahatsizligi tedavi etmek için verilir. Mevcut bulusun amaçlari dogrultusunda bir "hasta", insanlari ve diger hayvanlari, tercihen memelileri ve en tercihen insanlari içerir. Burada iyilestirilebilir. Antikor iliskili rahatsizliklara, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, otoimmün hastaliklari, immünolojik hastaliklar, enfeksiyöz hastaliklar, enflamatuar hastaliklar, nörolojik hastaliklar, agri, pülmoner hastaliklar, hematolojik durumlar, fibrotik durumlar ve kanser dahil olmak üzere onkolojik ve neoplastik hastaliklar dahildir. Burada "kanser" ve "kanserli", memelilerde tipik olarak düzensiz hücre büyümesiyle karakterize fizyolojik durumu Ifade etmektedir veya tarif etmektedir. Kanser örneklerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, karsinom, lenfoma, blastom, sarkoma (Iiposarkom dahil), nöroendokrin tümörleri, mezotelyom, scwhannom, menenjiyom, adenokarsinom, melanom ve lösemi ve Ienfoid maligniteler dahildir. Tedavi edilebilecek diger durumlara, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, romatoid artirit, jüvenil romatoid artirit, Crohn hastaligi, ülseratif kolit, Sjorgren hastaligi, multipl skleroz, ankilozan spondilit, astim, alerjiler ve alerjenik durumlar, graft versus host hastaligi ve benzerleri dahildir. BuIUSUn bir diger amaci, söz konusu varyanti içeren farmasötik bilesimler saglamaktir. Söz konusu formülasyonlar, istenen saflik derecesine sahip polipeptit varyantinin liyofilize formülasyonlar veya sulu solüsyonlar formunda opsiyonel fizyolojik olarak kabul edilen farmasötik olarak kabul edilen tasiyici, eksipiyanlar veya stabilizörlerle karistirilmasiyla hazirlanir. (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980). Bu tip farmasötik bilesimler ihtiyaç duyan bir hastanin tedavi edilmesi için kullanilir. Ihtiyaç duyan bir hastanin tedavi edilmesi amaciyla, varyantin terapötik olarak etkili bir dozu verilebilir. Burada "terapötik olarak etkili doz", verilmesine neden olan etkileri saglayan bir doz anlamindadir. Kesin doz tedavi amacina bagli olacaktir ve bilinen teknikler kullanilarak teknikte uzman kisi tarafindan belirlenecektir. Dozajlar vücut agirliginin kilosu basina 0,001 ila 100 mg/kg arasinda degisebilir veya daha büyük olabilir, örnegin vücut agirliginin kilosu basina 0,1, 1,0, 10 veya 50 mg/kg olabilir, 1 ila mg/kg tercih edilmektedir. Teknikte bilindigi üzere, protein degradasyonunun, sistemik karsi lokalize aktarimin ve yeni proteaz sentezinin hizinin, ayrica yas, vücut agirligi, genel saglik, cinsiyet, beslenme, verilis zamani, ilaç etkilesimi ve durumun ciddiyeti ayarlamalari gerekli olabilir ve teknikte uzman kisiler tarafindan rutin deneylerle belirlenecektir. Bir varyant içeren farmasötik bilesimin verilisi, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, oral olarak, subkütan olarak, intravenöz olarak, parenteral olarak, intranazal olarak, intraortikal olarak, intraoküler olarak, rektal olarak, vajinal olarak, transdermal olarak, topikal olarak (örnegin, jeller, merhemler, Iosyonlar, kremler vb.), intraperitoneal olarak, intramusküler olarak, intrapülmoner olarak dahil olmak üzere çesitli yollarla yapilabilir. Burada tarif edilen terapötik diger terapötiklerle eszamanli olarak verilebilir, yani, burada tarif edilen terapötikler, örnegin, küçük moleküller, diger biyolojikler, radyasyon terapisi, ameliyat vb. dahil olmak üzere diger terapiler veya terapötiklerle es-verilebilir. Mevcut bulusun bir baska amaci, bulusa göre varyantlari kodlayan izole nükleik asitler saglamaktir. En siklikla, parent polipeptidi kodlayan DNA mevcuttur veya elde edilebilir. Dolayisiyla, ilgi konusu varyanti kodlayan DNA, önceki teknikte bilinen çesitli yöntemler sayesinde parent polipeptidi kodlayan DNA'nin degistirilmesiyle üretilebilir. Bu yöntemlere, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, alana-yönelik mutajenez, rastgele mutajenez, PCR mutajenez ve kaset mutajenez dahildir. Amino asit ikameleri tercihen alana-yönelik mutajenezle yapilir (bakiniz, örnegin, Zoller and Smith, 1982, Nucl. Acids Alternatif veya ek olarak, bir polipeptit varyantini kodlayan istenen amino asit dizisi belirlenebilir ve böylelikle önceki teknikte iyi-bilinen yöntemlerle sentetik olarak üretilebilir. Kodlayici nükleik asitleri elde edildiginde, mevcut bulusun varyantlari teknikte bilinen herhangi bir yöntemle yapilabilir. Bir uygulamada, varyant dizileri (örnegin, IgG varyanti dizileri), üye dizileri kodlayan ve daha sonra istenirse konak hücrelerin içine klonlanabilen, eksprese edilebilen ve tayin edilebilen nükleik asitlerin yaratilmasi için kullanilabilir. Bu uygulamalar iyi-bilinen prosedürlerle gerçeklestirilebilir ve kullanilabilen çesitli yöntemler Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3" Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001) ve Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)'da tarif edilmektedir. Varyantlari kodlayan nükleik asitler, proteinin eksprese edilmesi amaciyla bir ekspresyon vektörünün içine katilabilir. Ekspresyon vektörleri tipik olarak, kontrol veya düzenleyici dizilere, seçilebilir belirteçlere, herhangi bir füzyon partnerine ve/veya ilave ögelere uygun sekilde bagli, yani, yerlestirilmis bir protein içerir. Mevcut bulusun varyanti (örnegin IgG varyantlari), varyanti kodlayan nükleik asidi ihtiva eden, nükleik asitle, tercihen bir ekspresyon vektörüyle dönüstürülmüs bir konak hücrenin, proteinin indüklenmesi veya ekspresyonuna neden olunmasi için uygun kosullar altinda kültürlenmesiyle üretilebilir. Bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, memeli hücreleri, bakteriler, böcek hücreleri ve maya dahil olmak üzere çok çesitli uygun konak hücre çizgileri kullanilabilir. Örnegin, kullanilabilen çesitli memeli hücre çizgileri, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonundan elde edilebilen ATCC hücre çizgisi katalogunda tarif edilmektedir. Konak hücreler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, YB2/0 (YB2/3HL.P2.GII.IGAg.20 hücresi, Amerikan Tipi PERCö, CHO hücre çizgileri, özellikle CHO-K-1, CHO-LecIO, CHO-Lecl, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wii-2, Jurkat, Vero, MOIt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, KGH6, UACC-812 ve benzerleri olabilir. Eksojen nükleik asidin konak hücrelerin içine eklenmesi yöntemleri teknikte iyi bilinmektedir ve kullanilan konak hücreyle degisecektir. Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, varyant YB2/0 hücresinde eksprese edilir ve bir anti-CD20 antikoru veya bir anti-RhD antikorudur. Ek olarak, mevcut bulusa göre bir varyant bir transjenik insan-olmayan hayvan veya transjenik bitki tarafindan üretilebilir. Ayrica, bir transjenik insan-olmayan hayvan, istenen bir genin döllenmis bir yumurtanin içine dogrudan enjekte edilmesiyle elde olmayan hayvanlara fare, tavsan, siçan, keçi, inek, sigir veya kanatli ve benzerleri dahildir. Istenen bir gene sahip bir transjenik insan-olmayan hayvan, istenen genin bir embriyonik kök hücresinin içine eklenmesiyle ve hayvanin agregasyon kimera yöntemiyle veya enjeksiyon kimera yöntemiyle hazirlanmasiyla elde edilebilir (Manipu/ating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)). Embriyonik kök hücresinin örneklerine farenin (Evans kanatlinin, sigirin ve benzerlerinin embriyonik kök hücreleri dahildir. Ek olarak, bir transjenik insan-olmayan hayvan ayrica, içine istenen bir genin eklendigi bir çekirdegin enükle edilmis bir yumurtanin içine nakledildigi bir klonal teknik kullanilarak da molekülünü hayvanda olusturmak ve biriktirmek ve daha sonra polipeptit varyantini hayvandan almak için yukaridaki yöntemle hazirlanan bir hayvanin içine eklenmesiyle üretilebilir. Polipeptit varyanti, hayvanin sütünde, yumurtasinda veya benzerlerinde olusturulmak ve biriktirilmek için yapilabilir. Bulusun bir baska amaci, optimize varyantlar olan, yani karsilik gelen bir dogal-sus Fc bölgesine kiyasla bir Fc Iigandi için artan bir baglanmaya sahip Fc varyantlarinin tanimlanmasi için bir yöntem saglamaktir. Söz konusu yöntem asagidaki adimlari (i) FC varyantlarini kodlayan nükleik asitlerin bir grubundan olusan bir nükleik asit kütüphanesi olusturulmasi (ii) FC varyantlarinin, söz konusu kütüphanede yer alan nükleik asitlerin ekspresyonuyla üretilmesi (iii) (ii) adiminda üretilen FC varyantlari arasindan, Fc ligandina baglanabilenlerin seçilmesi (iv) (iii) adiminda seçilen Fc varyantlarinin ve Fc Iigandi için bir F0 kontrolünün baglanma özelliginin ölçülmesi ve (v) söz konusu Fc kontrolüne kiyasla Fc Iigandi için artan bir baglanma sergileyen Fc varyantlarinin seçilmesi Söz konusu nükleik asit kütüphanesinde yer alan nükleik asit dizileri RNA veya DNA olabilir. Tercih edilen bir uygulamada, söz konusu kütüphane, Fc varyantlarini kodlayan DNA dizileri içerir. Fc kontrolü, dogal-sus Fc bölgelerinden ve F0 Iigandi için dogal-sus Fc'ninkine esit veya daha yüksek baglanma özelligine sahip bilinen Fc varyantlarindan olusan gruptan seçilir. Fc Iigandi FcRn ve Fc.gamma reseptörlerinden seçilebilir ve liste sinirli degildir. Bir uygulamada, kütüphanenin, Fc varyantlarini kodlayan nükleik asitleri, dogal-sus PC için kodlama yapan DNA dizisinin degistirilmesiyle üretilebilir. Burada kullanildigi sekliyle, "nükleik asit dizisinin degistirilmesi", nükleotidlerin sokmalari, silintileri veya ikameleri gibi mutasyonlarin belirli bir nükleik asit dizisine eklenmesi anlamindadir. Bu tip mutasyonlar, önceki teknigin iyi-bilinen yöntemleriyle gerçeklestirilebilir. Bu yöntemlere, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, rastgele mutajenez, alana-yönelik mutajenez, PCR mutajenez ve kaset mutajenez dahildir. Tercih edilen bir uygulamada, kütüphane, bir veya daha fazla düsük uygun DNA polimerazinin kullanilmasina dayali rastgele mutajenezle üretilir. Bu tip rastgele mutajenez, PCT basvurusu W00238756'da tarif edilmektedir. Dolayisiyla, kütüphane, mevcut basvurunun örneginin gereç ve yöntemler kisminda tarif edildigi üzere tek bir polimerazla veya polimerazlarin belirlenmis bir kombinasyonuyla üretilen alt- kütüphanelerin karistirilmasiyla olusturulabilir. Bir baska uygulamada, söz konusu nükleik asit kütüphanesi, önceden-optimize edilmis Fc varyantlarini bir havuzu için kodlama yapan DNA dizilerinin, yukarida-belirtilen yöntemlerin biri kullanilarak degistirilmesiyle olusturulur. Tercihen rastgele mutajenez kullanilmaktadir. Önceden-optimize edilmis Fc varyantlari, en az bir amino asit modifikasyonu içeren ve dogal-sus Fc'ye kiyasla Fc Iigandi için artan bir baglanma sergileyen Fc varyantlaridir. Önceden-optimize edilmis Fc varyantlari dogal-sus Fc'ye kiyasla tercihen 1 ila 4 amino asit modifikasyonuna sahiptir. Bu tip önceden-optimize edilmis Fc varyantlari, bir dogal-sus Fc'nin mutasyonuyla üretilen bir kütüphanesin taranmasindan elde edilebilir. Ayrica, önceki teknikte tarif edilen Fc varyantlarini da ifade etmektedirler (örnekler için mevcut bulusun ilgili teknigin tarifine tahsis edilen birinci kismina bakiniz). Önceden-optimize edilmis Fc varyantlarinin havuzu birçok polipeptit, daha tercihen yaklasik 2 ila yaklasik 100 arasinda önceden-optimize edilmis varyant içerir. Önceden-optimize edilmis varyantlardan üretilen kütüphaneler, daha fazla optimize edilmis Fc varyantlarinin seçilmesine olanak saglar. Örnekleme için, mevcut basvurunun, bu tip bir kütüphanesin taranmasindan seçilen en iyi FC varyantlarinin baglanma afinitesini gösteren Tablo 5'ine bakiniz. (ii) adimi, yani Fc varyantlarinin ekspresyonu, önceden tarif edildigi üzere konak hücreler kullanilarak iyi-bilinen yöntemlerle gerçeklestirilebilir. Tercih edilen bir uygulamada, Fc kütüphanesi, standart prosedürler kullanilarak bakteriyofajlarin (iii) adimi, Fc-varyantlari-FC ligand komplekslerinin olusturulmasiyla ve daha sonra bagli Fc varyantlarinin baglanmamis Fc varyantlarindan ayrilmasiyla gerçeklestirilebilir. Bu ayirma adiminin gerçeklestirilmesi amaciyla, Fc Iigandi avantajli olarak bir kati destek üzerinde hareketsizlestirilebilir veya (iii) adiminin islemi esnasinda bir kati destek üzerinde hareketsizlestirilmelidir. Bu tip prosedürlerin örnekleri, mevcut basvurunun Örnek 1'inde tarif edilmektedir. (iii) adimi tercihen, en etkili Fc Iigandlarinin tanimlanmasina olanak saglayan sekilde birçok seçim turu içerir (örnekleme için bakiniz Örnek 2). (iv) adiminda, Fc varyantlarinin Fc Iigandi için baglanma özellikleri, önceki teknigin iyi- bilinen yöntemleriyle degerlendirilebilir. Örnegin, teknikte uzman kisi uygun bir ELISA gerçeklestirebilir. Varyant, özgül sinyali parent Fc'ninkinden en az 1,2-kat daha güçlüyse seçilir. Uygun ELISA tayinleri, mevcut basvurunun örnek II ve örnek lV"ünde örneklendigi üzere izole Fc üzerinde veya faj üzerinde görüntülenen Fc üzerinde gerçeklesti rilebilir. Bir alternatif olarak veya teyit amaciyla, teknikte uzman kisi, mevcut basvurunun örnek ayrisma sabitini belirleyebilir. Varyant, parent Fc'ninkinden 3-kat daha düsük bir ayrisma sabitine sahipse, bu durumda söz konusu varyant (v) adiminda seçilir. Mevcut bulus, herhangi bir sekilde bunlarla sinirli olmaksizin, asagidaki örneklerle ayrintili olarak resmedilmektedir. ÖRNEKLER Fc-DogaI-susa kiyasla FcRn'ye artan baglanmaya sahip Fc varyantlarinin tanimlanmasi ve söz konusu varyantlarin baglanma karakterizasyonu l. Gereç ve Yöntemler l.1. Insan FcRn'sinin ekspresyonu ve saflastirilmasi Bakulovirüs sistemi kullanilarak çözünür insan FcRn'sinin ekspresyonu önceden tarif (Labége, Fransa) tarafindan gerçeklestirildi. Lider peptidi ve hücre disi alanlari (kodonlar 1-290) kodlayan o zinciri cDNA, bir TEV dizisi ve bir 6 x polihistidin etiketiyle etiketlendi. Türev a-zinciri ve [32 mikroglobülin zinciri, sirasiyla P10 ve polihedrin promotörleri altinda pFastBacDuaI içine klonlandi. FcRn'nin biyotinlenmis bir versiyonu (FcRn-biyot), üreticinin protokolüne göre FIuoReporter® Biotin-XX Protein Etiketleme Kiti, F ile kimyasal eslestirmeyle hazirlandi. Ayrica, bakteriyofaj p3 proteininin ve CVDE proteininin (FcRn-p3) amino terminal parçasina kaynastirilan [32 mikroglobülin zinciri ve oi-zinciri ihtiva eden bir füzyon proteini de üretildi. Saf proteinlerin %90'indan fazlasi lgG-Sefaroz ve IMAC saflastirma adimlarindan sonra elde edildi. Bir insan IgG1 agir zincirinden (SEQ n° 1), (Poul MA et al., Eur. J. lmmunol. 25(7): endeksi) kodlayan insan FC geni, yani Fc polipeptidi, standart PCR protokolleri kullanilarak bir BamHI/EcoRI fragmani olarak fajmid vektörü pMG58'in (pMG58_Fc226, Sekil 1) içine klonlandi. Söz konusu vektör Sekil 1'de gösterilmektedir. Çesitli tam olarak randomize kütüphaneler, rastgele mutasyonlari homojen bir sekilde tüm hedef dizi üzerine eklemek için düsük sadakatli insan DNA polimerazlarini (mutazlar) kullanan MUTAGENTM prosedürü (W00238756) kullanilarak olusturuldu. Bu ayri mutazlar (pol ß, pol ri ve pol i), tamamlayici mutasyonla örüntüler yaratmak için farkli kosullarda kullanildi. Bu insan polimerazlari önceden tarif edildigi sekilde (Mondon et 274(2008)) üretildi ve saflastirildi. l.2-a. MutagenTM islemiyle mutajenez Insan Fc geni (FC geni) 5' primeri MG_619: 5'- AGTACTGACTCTACCTAGGATCCTGCCCACCGTGC-3' (SEQ ID N°5) ve 3' primeri kullanilarak çift çogaltildi (BamHI ve EcoRI kisitlama alanlarinin alti çizilidir ve italik karakterler özgül-olmayan kuyruklara karsilik gelmektedir). Sablon olarak 0.6 pg pMG58_F0226 plazmidi (Mut1 kütüphanesi için dogal sus FC veya Mut2 kütüphanesi için FC varyantlari), MG_619 ve MG_621 primerler (her biri 250nM) ve (ayrintilari asagida verilen) uygun çogaltma tamponu ihtiva eden bir karisim 5 dk süreyle 95°C'de islem gördü ve DNA sarmallarinin denatüre edilmesi için hemen 4°C"ye sogutuldu. pol ve %1 (h/h) gliseroldü. pol ri (veya pol n ve pol i) için çogaltma tamponu 25mM Tris HCI pH gliseroldü. Denatüre etme adimindan sonra, Mutajenik çogaltmalar 50pM dATP/dCTP, 100uM dTTP/dGTP ve 1pg pol [3 veya eklenerek gerçeklestirildi. Çogaltma tepkimesi 37°C'de iki saat süreyle gerçeklestirildi. Çogaltma ürünlerinin daha sonra tuzu alindi ve mikrokon kolonlari (Millipore) üzerinde konsantre edildi. Önceden elde edilen çogaltma ürünleri, kuyruk primerlerine sahip seçimli bir PCR yoluyla güçlendirildi. Primerler (MG_619 ve MG_621), mutazlar tarafindan sentezlenen DNA fragmanlarinin özgül güçlendirilmesine olanak saglayacak sekilde sablona tamamlayici-olmayan bir kuyrukla tasarlandi. Çogaltma ürünlerinin bir kesiti, PCR tamponu (20mM Tris-HCI pH , 1,5mM MgCIz, 10pmol 5' ve 3' primerleri, ihtiva eden bir karisima eklendi. PCR döngüleri asagidaki sekildeydi, birinci döngü 2 dk 94°C'de, 10 94°C'de ve 30 sn 75°C'de. Güçlendirilmis çogaltma ürünleri, %1 (ag/h) agaroz jelleri üzerinde saflastirildi, BamHl ve EcoRl kisitlama enzimleriyle sindirildi ve pMGS8 vektörünün içine klonlandi. Ligasyon karisimlari elektro-yetkin E. coli XL1-Blue hücrelerine dönüstürüldü ve müteakiben 100 pg/ml ampisilin ve %1 (ag/h) glukoz ile tamamlanmis kati 2YT vasati (1 ög/I peptonlar, 10g/l maya özütü, Sg/l Nacl, 159/1 agar) üzerine kaplandi. Büyümeden sonra, kütüphanelerin boyutunun kestirilmesi için kolonilerin sayisi belirlendi ve kütüphane basina 96 klon rastgele olarak PCR'ye ve yüksek hacimli DNA dizilemeye tabi tutuldu. Hücreler %15 gliserol içeren 2YT vasatinda kazindi, donduruldu ve - 80°C'de saklandi. Mutajenez ve taramanin birinci turu (MS1) için, dört farkli kütüphane insa edildi. Bir birinci kütüphane dogal sus Fc geni üzerindeki pol ß kullanilarak elde edildi ve 3,2x106 klon ihtiva etti (adi Mut1.1). Bu birinci kütüphanesin DNA'si, sirasiyla pol ß (3,8x106 klon, Mut1.2) ve pol n ve I (3,0x106 klon, Mut1.3) kullanilarak ikinci ve üçüncü kütüphanelerin olusturulmasi için kullanildi. Iki kümülatif çogaltma adimindaki bu strateji mutasyon hizinin arttirilmasini sagladi. Dördüncü kütüphane yalnizca polimeraz ri ile ve dogal sus Fc geni üzerinde olusturuldu (1,0x105 klon, Mut1.4). Son olarak, dört kütüphane, Mutt isimli, 1,1x107 farkli klonu temsil eden son kütüphanesin elde edilmesi için orantili bir sekilde karistirildi. Mutajenez ve taramanin ikinci turu (MS2) için, MS1 esnasinda izole edilmis ve faj- ELISA ile gelismis FcRn-baglanmasina sahip 42 tek ve çift mutantlik bir DNA havuzu kullanilarak iki farkli kütüphane insa edildi. Bir birinci kütüphane pol ß (1,9x107 klon, Mut2.1) kullanilarak ve bir ikinci kütüphane pol n (1x106 klon, Mut2.2) ile elde edildi. Son olarak, Mut2 isimli, 2x107 farkli klonu temsil eden son kütüphanesin elde edilmesi için bu iki kütüphane orantili bir sekilde karistirildi. l. 2. 0. FC kütüphanelerinin dizilemeyle kalite kontrolü Önceden olusturulan farkli kütüphanelerin kalitesi, Fc geninin güçlendirilmesi için (5' primeri 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' (SEQ ID NO: 7) ve 3' primeri 5'- TCACGTGCAAAAGCAGCGGC -3' (SEQ ID No:8) ile) hücreler Üzerinde PCR ve yüksek hacimli dizilemeyle (5' primeri 5'- TGATTACGCCAAGCTTGC -3' (SEO ID No:9) ile) tayin edildi. Her bir kütüphanede (Mut1.1 ila Mut1.4 ve Mut2.1 ila Mut2.2) rastgele seçilen 96 klonun dizileri bu sekilde belirlendi. Son olarak, havuzlanan kütüphane Mut1'in 35 klonu ve havuzlanan kütüphane Mut2'nin 86 klonu, seçim isleminden önce son kütüphanesin kalitesinin kontrol edilmesi Için dizilendi. Mutasyona ugratilmis dizilerin modifikasyonlari, önceden tarif edilen (Mondon et al., MiIIeGen'e ait Mutanalyse4Fc yazilimi kullanilarak analiz edildi. Bu analiz, mutasyonlar tüm gen boyunca, herhangi bir "sicak nokta" olmadan rastgele dagitildigini teyit etmistir. Mut1 analizi: Mut1 kütüphanesinin mutasyonlarinin sikligi kilo baz (kb) basina 6,3 mutasyon, yani gen basina 4,2 mutasyondur (666 nt). Bu mutasyonlar arasinda, %81,4 ikamedir, %16,8 silintidir ve %1,8 eklentidir, bu son iki kategori gende çerçeve kaymalari ekler. Yalnizca çerçevedeki diziler ele alindiginda, mutasyon sikligi kb'de 4,0 mutasyon, yani gen basina 2,7 mutasyondur (gen basina 1 ila 6 mutasyona ugratilmis nükleotid). Mutasyon analizi ayrica, kütüphanesin aktif kisminin belirlenmesi için protein seviyesinde de gerçeklestirildi. Son olarak, Mut1 kütüphanesi, %28,6 oraninda dogal sus fragmani (mutasyona ugratilmamis veya sessiz mutasyonlara sahip) eksprese eden klonlar, %40,0 oraninda çerçeve disinda veya bir durdurma kodonuna (eksprese edilmemis) sahip bir dizi ihtiva eden klonlar ve %31,4 oraninda mutasyona ugratilmis bir diziye sahip klonlar (Fc varyantlari) ihtiva eder. Bu son klonlar kütüphanenin, molekül basina ortalama 2,3 mutasyona ugratilmis amino aside sahip 3,5x106 farkli klon içeren aktif kismini temsil etmektedir. Mut2 analizi: Mut2 kütüphanesinin mutasyonlarini sikligi kilo baz (kb) basina 4,5 mutasyon, yani gen basina 3,0 mutasyondu. Bu mutasyonlar arasinda %96,3 ikamedir, mutasyon sikligi kb'de 4,3 mutasyon, yani gen basina 2.9 mutasyondur (gen basina 1 ila 7 mutasyona ugratilmis nükleotid). Protein seviyesinde, Mut2 kütüphanesi, %17,4 oraninda dogal sus fragmani (mutasyona ugratilmamis veya sessiz mutasyonlara sahip) eksprese eden klonlar, %9,3 oraninda çerçeve disinda veya bir durdurma kodonuna (eksprese edilmemis) sahip bir dizi ihtiva eden klonlar ve %73,3 oraninda mutasyona ugratilmis bir diziye sahip klonlar (Fc varyantlari) ihtiva eder. Bu son klonlar kütüphanenin, molekül basina ortalama 1,9 mutasyona ugratilmis amino aside sahip 1,5x107 farkli klon içeren aktif kismini temsil etmektedir. ll. Fc kütüphanelerinin faj görüntüleme ekspresyonu ve FcRn gelistirilmis baglayicilarin seçimi kullanilarak bakteriyofaj M13'ün yüzeyinde eksprese edildi. Mut1 kütüphanesi (pMGöB vektörü) ihtiva eden E. coliXL1-Blue bakterileri, 100ug/ml ampisilin, 15ug/ml tetrasiklin ve %1 (ag/h) glukoz ile tamamlanmis 60ml 2YT içinde, 30°C'de, 230rpm'de ODSOOnm = 0,6'ya ulasilana kadar büyütüldü. Hücreler daha sonra 37°C'de 20 dk süreyle M13 yardimci faj (M13KO7, Biolabs, bakteri/faj orani = 1/3) ile enfekte edildi ve faj-FC üretimi gece boyunca 26°C'de, 230rpm'de IPTG 0,5mM ve kanamisin 30ug/ml ile 2YT/Ampisilin/Glukoz içinde devam ettirildi. Sonraki gün, fajlar standart protokoller kullanilarak PEGBOOO ile çökeltildi, 1ml fosfat tamponu pH6 (sodyum fosfat 100mM, sodyum klorür 50mM pH6,0, P6 Isimli) yeniden süspanse edildi ve XL1-Blue hücrelerinin enfekte edilmesiyle titre edildi. Farkli kosullar kullanilarak üç seçim stratejisi uygulandi (Sekil 2) ve strateji basina 3 ila 8 seçim turu gerçeklestirildi (bakiniz ll.1. Kati evrede seçimler (stratejiler 1 ve 2) (bakiniz Sekil 2A): 0,5 ug nötravidin ve 0,5 pg biyotinlenmis FcRn ile (strateji 1) veya 0.5 ug FcRn-p3 (strateji 2) ile kaplanmis 8 kuyucuklu Maxisorp immüno-plakalar üzerinde inkübe edildi ve PG'da %5 yagsiz süt ile bloke edildi. 2 saat süreyle 37°C'de inkübasyondan sonra,, tamponunda pH7,4 (sodyum fosfat 100mM, sodyum klorür SOmM pH7,4) 2 saat süreyle 37°C`de inkübasyonla ayristirildi. Titrasyondan SOnra, ayristirilan fajlar 10ml katlanarak büyümekte olan XL1-Blue bakterilerinin yeniden enfekte edilmesi için kullanildi ve müteakiben kati 2YT vasat/ampisilinlglukoz üzerine kaplandi. Sonraki gün, hücreler 80°C'de saklandi. ll.2. Sivi evrede seçim (strateji 3) (bakiniz Sekil 23): 1mI P6/%5 yagsiz süt/%0,1 Tween 20 içinde 1 saat süreyle oda sicakliginda düsük çalkalama altinda inkübe edildi. Önceden %5 yagsiz süt ile P6`da bloke edilmis streptavidin kapli manyetik boncuklar (Dynal) daha sonra fajlara 30 dakika süreyle oda sicakliginda eklendi. Faj-boncuk kompleksleri 15 kez bir miknatis kullanilarak (manyetik partikül konsantratörü, Dynal) P6/%0,1 Tween 20 ile yikandi. Fajlar 500 ul süreyle oda sicakliginda inkübasyonla ayristirildi. Boncuklar miknatis kullanilarak çikartildi ve süzüntülerdeki ayristirilmis fajlar toplandi. Titrasyondan sonra, ayristirilan fajlar 10ml katlanarak büyümekte olan XL1-Blue bakterilerinin yeniden enfekte edilmesi için kullanildi ve müteakiben kati 2YT vasat/ampisilin/glukoz üzerine kaplandi. Sonraki gün, hücreler %15 gliserol içeren 2YT vasatinda kazindi, donduruldu ve sonraki seçim turuna kadar -80°C'de saklandi. ll.3. Dizi analizi: Tarama islemleri (MS1 ve MS2) esnasinda, her bir strateji için, 3ncü turdan 8nci tura kadar, (I.2-c'de tarif edildigi üzere) hücreler üzerinde PCR'den sonra 48 ila 96 klon dizilendi. Dizi analizi, seçilen Fc varyantlarinin hizli sekilde analiz edilmesi için dahili olarak gelistirilmis olan MilIeGenle ait AnalyseFc yazilimi kullanilarak gerçeklestirildi. Fc varyantlarina izole edildikleri seçim turuna göre isim verildi (Mut1 taramasi için: strateji 1 için BBA ila BGA, strateji 2 için 83A ila SöA ve strateji 3 için L3A/B ila T8A, Mut2 taramasi için: strateji 1 için C3A ila C8A, strateji 2 için T3A ila T8A ve strateji 3 için M3A/B). (1 ila 96 arasindaki) sayilar, dizileme için PCR plakasi üzerindeki konumlandirmayi ifade etmektedir. Son olarak, tüm seçim islemi esnasinda, Mut1 için 227 farkli mutasyona ugratilmis klon ve Mut2 için 223 farkli mutasyona ugratilmis klon izole edildi. Tüm bu klonlar faj-ELISA tayinleri kullanilarak karakterize edildi. MS1 esnasinda izole edilmis olan gelismis Fc-varyantlarinin dizi analizi, büyük bir sayida klonun benzer mutasyonlari (N ihtiva ettigini gösterdi. Yönlendirilmis mutajenez, iliskili mutasyonlarin etkisini ortaya çikarmak amaciyla bu mutasyonlarin yok edilmesi için gerçeklestirildi. Bu yeni mutantlar, isminin sonuna eklenen bir A veya B ile parental klona dayali olarak isimlendirildi. 61 yeni mutant test edildi. Bu mutantlarin bazilari Tablo 1'de resmedilmektedir. Pozitif olarak degerlendirilen mutantlar, faj ELISA tayininde Fc-WT'ninkinden 1,2 ile 2,6-kat daha yüksek bir özgül sinyale sahiptir (bakiniz asagisi). MSZ'den sonra, birçok yeni mutant, mutantlar, ismin sonuna eklenen bir harfle (A ila G arasinda) parental klona dayali olarak isimlendirildi. 24 yeni mutant test edildi ve Tablo 5'te resmedilmektedir. ll.5. Seçilen varyantlarin faj-ELISA tayinleri (Sekil 3) MS1 ve M82 esnasinda izole edilen varyantlarin faj üzerinde görüntülenen baglanma karakteristikleri pH6,0'da kuyucuklar üzerine kaplanmis FcRn-p3 ile bir ELISA testi kullanilarak belirlendi (Sekil 3). Kisaca, faj-FC varyantlari (paragraf 3'te tarif edildigi kuyucuklu bir plaka üzerinde izole klonlar olarak üretildi (paragraf 3'te tanimlandigi üzere). Gece boyunca 26°C'de üretilen fajlar SOOOg'de 30 dakika santrifüjlemeden sonra süzüntülerde geri kazanildi. Bu süzüntüler dogrudan P6/%5 yagsiz süt/%O,1 kaplanmis ve %5 yagsiz süt ile PG içinde bloke edilmis Maxisorp immüno-plakalar üzerinde test edildi. 2 saat süreyle 37°C'de inkübasyondan sonra, kuyucuklar 3 kez P6/%01 Tween-20 ile yikandi ve bagli fajlar bir HRP anti-Mis antikoruyla (GE Healthcare) saptandi. Bu ELISA testi kullanilarak, MS1 esnasinda seçilen 227 PC varyanti dogal sus Fc (Fc- WT) ve bir pozitif kontrole kiyasla test edildi. (FC-H varyanti isimli) bu pozitif kontrol çift mutant T2500/M428L'dir ve FcRn için gelismis bir afiniteye sahip olarak tarif edilmistir PCR protokolleriyle, mutasyona ugratilmis kodonlari ve kisitlama alanlarini içeren iki uzun oligonükleotidle olusturuldu: 5' primer, 5'- CGGGATCCTGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCT NO:10) ve 3' primeri 5'- GCGAATTCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTG GTTGTGCAGAGCCTCATGCAGCACGGAGCATGAGAAG-3' (SEQ ID NO:11) (BamHI ve EcoRl kisitlama alanlarinin alti çizilidir ve gri karakterler mutasyona ugratilmis kodonlara karsilik gelmektedir). Faj-ELISA tayininde, Fc-H varyanti dogal sus Fc'den, yani Fc-WT'den ortalama 3,2-kat daha güçlü bir özgül sinyale sahiptir (oran varyant/Fc- WT) ve test edilen 227 FC varyanti arasinda, 73 varyant Fc-WT3,2'II bir orana sahiptir ve bu da FcRn'ye FC-H varyantindan daha iyi bir baglanmaya sahip olduklari anlamina gelmektedir (Tablo 2). MS1'den ve bir tek nokta amino asit modifikasyonuna sahip pozitif varyantlar, dogal-sus Fc'den yaklasik 1,2-kat ila 3,5-kat daha güçlü bir özgül sinyale sahiptir (bakiniz Tablo 1). Tablo 1. MS1 sirasinda tanimlanan veya yönlendirilmis mutajenez ile elde edilen tek bir amino asit modiükasyonuna sahip varyantlar. Varyant adi Mutasyonlar Oraanc-WT Varya nt adi 85A_26 B4A_21 S4A_07 L68_31 S4A_01 83A_24 S4A_1 4 S4A_1 2 S5A_47 85A_43 S4A_24 L4A_28 S4A_03 S4A_29 S4A_06 S4A_02 S4A_36 S4A_44 Mutasyonlar P228R/N434S C226G/Q386R/N434Y T307P/N389T/N434Y P2308/N434S P230T/P387S/N434S P230Q/E269D/N434S N276S/A378V/N434S P230T/N434S Q362E/N434Y A378V/N434S P230Q/F241L/V264E A378V/N421T/N434S S375G/M428L/H433P P230Q/T289I/N434S N315D/Q362R/N434Y A378V/N434Y P2278/N434Y Oran/Fc-WT Varya nt adi S6A_48 L5D_1 8 S4A_25 S4A_42 B4A_39 L4A_45 L6A_1 1 S4A_3O B4A_01 B4A_22 S4A_1 7 B4A_03 S4A_05 S4A_1 1 B4A_46 S3A_06 Mutasyonlar C226G/N434S P23OS/M428L N434Y/Q438R/K447E V397M/N434S V264E/N434S V264A/N434Y/G446A E382G/N434S P228L/N297D M428L/H433R V303A/N434S V302A/N389T/N434S N384I/N434Y A378V/ D401 A/ N434Y N389T/N434Y A231 TN397M/N434S G371D/N434Y P230T/A231T/A378V Oran/Fc-WT Varyant adi Mutasyonlar Oran/Fc-WT B4A_13 P228L 3.5 BBA_34 N434Y/S44ON 3.4 Tablo 2: M81 esnasinda seçilen varyantlar MSZ esnasinda seçilen 223 varyant ayni ELISA protokolü kullanilarak ancak Fc-H varyantina ve MS1 esnasinda izole edilen en iyi Fc varyantina (S5A-41) kiyasla test edildi, çünkü Fc-WT sinyaliyle Fc varyantlarinin sinyali arasindaki fark ayni ELISA plakasi üzerinde karsilastirma yapmak için çok büyüktü. Test edilen 223 FC varyanti arasinda, 209 Fc varyanti Fc-H'den daha iyiydi (oran/Fc-H1,1) ve 39 varyant MSi esnasinda izole edilen en iyi Fc varyantindan daha iyiydi. Varyantlarin Fc-WT ile karsilastirilmasi için, varyantlarin oran/Fc-H'sinin MS1 esnasinda belirlenen Fc-H'nin oran/Fc-WT ile (:32) çarpilmasiyla tahmini bir oran/Fc-WT hesaplandi (oran/Fc-WT = 3,2x0ran/Fc-H) (Tablo 3). Varyant adi Mutasyonlar Oran/Fc-H Oran/FWT Varyant adi Mutasyonlar Oraanc-H Oran/FWT Varyant adi Mutasyonlar Oraanc-H Oran/FWT Varyant adi Mutasyonlar Oraanc-H Oran/FWT Varyant adi Mutasyonlar Oraanc-H Oran/FWT Varya nt adi T3A_41 C4A_45 T7A_24 T4A_28 T5A_37 C3A_31 C4A_1 5 C7A_02 C7A_37 C7A_69 C7A_52 T5A_64 C7A_23 C7A_67 T5A_O3 C8A_08 C3A_03 T3A_47 C5A_63 T7A_1 7 T4A_43 M3A_1 8 C3A_1 5 T5A_29 T5A_52 Mutasyonlar V264 E/T307P/A3 78V P230T/A378V E233D/N315D/N434Y D265G/A378V/N434Y S298N/A378V/N434Y V264 E/P396L/N434S N315D/N434Y T307P/A378T/V397M T307 P/A378V/N421 T V264 E/T30 7A/A3 78V N315D/E382V/N434Y Oraanc-H Oran/FWT Varyant adi Mutasyonlar Oraanc-H Oran/FWT Varyant adi Mutasyonlar Oraanc-H Oran/FWT Varya nt adi M3A_1 2 T3A_20 T3A_30 Mutasyonlar V303I/N434Y V264 E/A378VN422A Tablo 3: MS2 varyantlari Oran/Fc-H Oran/FWT 1.1 3.4 1.1 3.4 1.1 3.4 Genel olarak, FcRn için Fc-H'den daha iyi baglanmaya sahip 282 Fc varyanti MS1 ve MSZ islemleri esnasinda izole edildi. bu 282 Fc varyantinin dizilerinin analizi, molekülün tamami üzerinde 115 farkli konumda mutasyonlar içerdigini ortaya çikardi Varyantlarin yüzdesi Modifikasyon G veya Y 8 veya L R veya L 8, T, L, A veya Q T veya V A, E veya M G veya N Varyantlarin yüzdesi Modifikasyon N veya R D veya G N veya E R veya E 8 veya Q silinme G veya N M, A veya K A veya l P, Aveya N 1.10404 Modümasyon V veya T V veya T E veya R R, E veya K Q veya G A veya G Konum Varyantlarin yüzdesi Modifikasyon A378 37.2 V, T veya 8 E380 0.4 Q E382 6.0 V veya G 8383 1.4 R veya N N384 0.7 I veya T G385 0.4 R Q386 2.5 R veya K P387 0.7 S veya T N389 9.2 T, K veya R N390 0.4 S K392 1.1 E veya R T393 0.7 N T394 0.7 A P395 1.4 A veya 8 P396 4.6 8 veya L V397 5.0 A veya M L398 0.4 P D399 0.4 N 8400 0.4 P D401 1.1 A veya G 8403 0.4 T F404 1.8 L 8408 0.4 T T411 0.4 A V412 0.4 A K414 0.4 R Varyantlarin yüzdesi Modifikasyon D veya N K veya G R, K veya E R veya P Y, 8 veya H R veya N F veya P E veya N Tablo 4: MS1 ve MSZ varyantlarinin mutasyonlari Dahasi, 16 konum tercihli olarak mutasyona ugratilir ve kilit konumlar olarak kabul M82'nin, MS1'in en iyi varyantina (85A_41) kiyasla FcRn için daha iyi baglanmaya sahip Fc varyantlari Tablo 5'te gösterilmektedir. Varyant Oran/F Oran/F adi Mutasyonlar c-H rt c-WT Varyant T6A_22 T5A_81 CBALJZ C4A;14 T4A_42 T5A_25 T4A_48 T5A_45 T6A_23 C5A;65 C6A;88 C4A;13 C3A_35 T4A_37 C6A_78 T5A_74 C6A_74 T5A_74F C6A_78 Mutasyonlar V264E/A378V/R416K N434Y Varyant C6A_69 C6A_74 C6A;69 C6A_78 C6A;78 C6A_60 C6A;69 C6A;69 T5A_74 CGALEO C6A_74 T5A_74 Mutasyonlar 9T/N434Y N434Y T256 N/A378V/N434Y N434Y N389T/N434Y N434Y Varyant Oran/F Oran/F Mutasyonlar rt adi c-H c-WT C6A_78 C6A_74 T5A_74 C6A_60 C6A_60 Tablo 5: MSZinin en iyi varyantlari Fc-WT dizisinin yani sira Fc-H varyanti ve MS1 ve MSZ esnasinda izole edilen FC varyantlari pMGSB fajmid vektöründen pMGöZ vektörünün içine, saflastirma için bir C- ucu 6xhis etiketi ve ELISA tayinlerinde saptama için bir V5 etiketiyle çözünür periplazmik ekspresyona izin verecek sekilde, BamHI ve EcoR/ kisitlama alanlari kullanilarak alt klonlandi. Rekombinan FC polipeptitlerinin üretimi HBZ151 E. coli susunda gerçeklestirildi (16 saat süreyle 20°C`de . Saflastirma standart protokoller kullanilarak Ni-NTA üzerinde gerçeklestirildi ve her bir polipeptidin yaklasik 200-500 ug"i elde edildi. baglanma karakterizasyonu kara kterizasyonu lV.1.a. ELISA tayinleri Çözünür bir formatta üretilen Fc varyantlarinin baglanma karakteristikleri pH6,0`da kuyucuklara üzerine kaplanmis FcRn-p3 ile bir ELISA testi kullanilarak Fc-WT ile kiyasla belirlendi. (III'te tarif edildigi üzere) saflastirilmis, PES/%5 yagsiz süt/%01 Tween-20'de seri olarak seyreltilmis Fc varyantlari, önceden kuyucuk basina 0,25ug FoRn-p3 ile kaplanmis ve P6'da %5 yagsiz süt ile bloke edilmis Maxisorp immüno- plakalari üzerinde test edildi. 2 saat süreyle 37°C'de inkübasyondan sonra, hücreler 3 kez P6/%0,1 Tween-20 ile yikandi ve bagli Fc-varyantlari bir HRP anti-V5 antikoruyla (Invitrogen) saptandi (OD450nm ölçümü) (Sekil Sa). ELISA testi, MS1'in en iyi varyanti olan 85A_41 ve Fc-H varyantina esdeger bir varyant olan 83A_07 ve Fc-H varyanti üzerinde gerçeklestirildi. Bu ELISA testleri, Fc-H, 85A_41 ve 83A_07'nin Fc-WT'ye kiyasla FcRn'ye gelismis baglanmaya sahip oldugunu onayladi (Sekil 5b, Sekil 50 ve Sekil 5d). Her bir baglanma egrisi için, FC konsantrasyonunun egrinin %50 doyumunda (E050) ölçümü, FC varyantlarinin Fc-WT'ye kiyasla baglanma özelliklerini karakterize etmek için kullanildi. Bu sekilde elde edilen oranlar, 85A_41'in Fc-H varyantindan daha iyi bir baglayici oldugunu ve SBA_07'nin Fc-H varyantina esdeger oldugunu onayladi lV.1.b. SPR (Yüzey Plazmon Rezonansi) tayinleri Fo varyantlarinin hareketsizlestirilmis FoRn ile etkilesimi bir CM5 sensör çipi (Biacore, GE Healthcare) kullanilarak bir BlAcore X100 cihazi üzerinde gerçeklestirilerek izlendi. Metodoloji önceden Fc-FcRn etkilesimlerinin analiz edilmesi için tarif edilene (Popov S. eslestirme kimyasi kullanilarak sensör çipinin akis hücresi 2'ye eslestirildi. Akis hücreleri 3 dk süreyle 0,1 M N-hidroksisüksinimid ve 0,1 M 3-(N,N-dimetilamino)propil- N-etilkarbodiimidin 1:1 bir karisimiyla 30 ul/dk'lik bir akis hizinda aktive edildi. Rekombinan insan FcRn (10 mM sodyum asetat içinde 5 ug/ml, pH 5,0) akis hücresi 2 arasinda (RU) bir yüzey yogunluguyla sonuçlandir. Yüzeyler 1 M etanolamin-HCI'nin, pH 8,5 3-dakikalik bir enjeksiyonuyla bloke edildi. Akis hücresi 1, FcRn olmadan bir kontrol yüzeyi olarak kullanildi ve örnek akis hücresine benzer sekilde hazirlandi. Bu akis hücresinden veriler örnek verisinden çikartildi. F0 fragmanlari, dengeleme baglama deneylerinde çalistirma tamponu olarak kullanilan Tween-20) içinde seyreltildi. Tüm ölçümler 25°C'de, tipik olarak 1 ila 200 nM arasinda degisen Fc fragmani konsantrasyonlariyla 10 pI/dk'lik bir akis hizinda gerçeklestirildi. Veriler 10 dk süreyle toplandi ve yüzeylerin yeniden olusturulmasi için PBS'nin, %0,05 Tween-20 ihtiva eden pH 8, 1-dk vurumu kullanildi. Sensör-gramlar olusturuldu ve BIAevaIuation yazilimi sürüm 3.1 kullanilarak analiz edildi. Her bir enjeksiyon için gözlemlenen dengeleme RU'su Fc konsantrasyonuna karsi çizildi. Dengeleme Kd degerleri, BIAevaIuation yaziliminda yer alan duragan- durum afinite modeli kullanilarak çizimlerin analiziyle türetildi. Bu sekilde elde edilen Kd oranlari, S5A_41'in Fc-H varyantindan daha iyi bir baglayici oldugunu ve S3A_07`nin Fc-H varyantina esdeger oldugunu onayladi (Tablo 6). lV.1.c. Elde edilen sonuçlarin özeti Asagidaki Tablo 6. (I) fal ELISA, (II) ELISA ve (iii) SPR ile S5A 41, S3A 07 ve FC-H varyantlarinin Fc-WT'ye kiyasla FcRn baglanma karakterizasyonunun göstermektedir. Tüm durumlarda, SSA 41 varvanti FcRn'yi baglamak için Fc-WT"den kayda deger sekilde daha yüksek bir kapasite qösterdi. faj-ELISA Fc-rec-ELISA SPR Fc varyantlari Oraanc-WT Oran/WT Oran/Fc-WT Tablo 6: ELISA ve Yüzey Plazmon Rezonansi (SPR) kullanilarak FC varyantlarinin FcRn baglama karakterizasyonu. Faj-ELISA ve Fc-rec-ELISA için oran Varyanta özgü sinyal bölü Fc-WT özgül sinyalini ifade etmektedir. SPR için oran Fc-WT Kd bölü Varyant Kd'yi ifade etmektedir. karakterizasyonu MSZ'nin çesitli Fc varyantlari yukarida kisim III'te tarif edildigi sekilde üretildi. Her bir varyantin FcRn baglama yetisi, yukarida sirasiyla IV.2.b kisminda ve IV-2.c kisminda tarif edildigi üzere (i) SPR ve (ii) ELISA ile tayin edildi. Çesitli sonuçlar Sekil 7'de gösterilmektedir. Asagidaki Tablo 7, (i) SPR ve (ii) ELISA ile test edilen her bir MSZ varyanti için elde edilen sonuçlari göstermektedir. ELISA-fa] ile elde edilen önceki sonuçlar da gösterilmektedir. ELISA ve SPR tayinleri, tüm Fc varyantlarinin FcRn için dogal-sus Fc'den daha iyi oldugunu göstermistir ve bu da önceden faj-Fc varyantlari üzerinde ELISA tayinleriyle elde edilen sonuçlarla koreledir. MS2 varyantlarinin Kd degerleri pH = 6'da, afinitede Fc-WT'ye kiyasla 1,3 ila 5,8 kat bir artisa karsilik gelen 5,2 ila 22,7 nM arasinda degisti. faj- Fc-rekombinan varyantlari SPR ELISA üzerinde ELISA Klon pH=6'da Ka Oranl Fc- oranlWT E050 (nm) oran/Fc-WT adi (nM) WT faj- Fc-rekombinan varyantlari SPR ELISA üzerinde ELISA Klon pH=6'da Kd Oran/ Fc- oran/WT E050 (nm) oran/Fc-WT adi (nM) WT Tablo 7: ELISA ve Yüzey Plazmon Rezonansi (SPR) kullanilarak Fc varyantlarinin FcRn baglama karakterizasyonu. Faj-ELISA için oran varyanta özgü sinyal bölü Fc-WT özgül sinyalini ifade etmektedir. ELISA için oran Fc-WT EC50 bölü varyant EC50'yi ifade etmektedir. SPR için oran Fc-WT Kd bölü varyant Kd'yi ifade etmektedir. Fc varyantlarinin farkli pH7larda FcRn baglama kapasitesi de ELISA tayiniyle tayin Önceden test edilen her bir PC varyanti için, ELISA tayinleri, ELISA tayinini pH=6`da gerçeklestirirken 0,8 ila 1,0 arasinda degisen bir OD450 nm saglayan bir konsantrasyonda gerçeklestirildi. Deney kosullari önceden IV.1.a kisminda tarif edilenlerdir. Asagidaki Tablo 8, her bir Fc varyantinin ELISA tayinlerinin gerçeklestirilmesi için kullanilan konsantrasyonunu göstermektedir. Fc Konsantrasyonu (nM) C6A_69 1.2 T5A_74 1,2 C6A_60 1,2 FC Konsantrasyonu (nM) 85A_41 2.0 C6A_78 2.5 T5A_78 12.5 T5A_58 50.0 Tablo 8: Her bir FC varyantinin, farkli pH'larda FcRn'ye ayri baglanma afinitelerini göstermek için kullanilan konsantrasyonu. Sekil 7, Her bir varyant için elde edilen ELISA tayinlerinin sonuçlarini göstermektedir. OD450 nm hareketsizlestirilmis FcRn'ye baglanan FC varyantlarinin miktariyla koreledir (bagli FC varyantlarinin HRP anti-V5 antikoruyla saptanmasi). 00450 nm'deki özgül sinyal ne kadar yüksekse, Fc-varyantinin FcRn'ye baglanmasi o kadar yüksek oldu. Sekil 7 net bir sekilde, FC varyantlarinin FcRn ile baglanmasinin pHia göre degistigini göstermektedir. Beklendigi üzere, FC varyantlarinin FcRn'ye pH,74`te baglanmasi, pH 6,0'da baglanmaya kiyasla önemsizdir. Mevcut bulusun Fc varyantlarinin elde edilmesi için eklenen amino asit modifikasyonlarinin FcRn'ye pH 6,0'da baglanmasini Fc-WT'ninkine kiyasla kayda deger sekilde arttirabildigi ancak pH 7,4'te çok düsük kalan baglanmayi kayda deger sekilde modifiye etmeyebildigi sonucuna varilabilir. Fc varyantlarina dayali olarak IgG varyantlarinin üretimi ve söz konusu lgG'nin biyolojik karakterizasyonu. l. lgG varyantlarinin ekspresyonu l.1. Vektör yapilandirmasi çizgisinde bir anti-CD20 özgüllügüyle bir lgG formatinda hazirlandi. Karsilastirma amaciyla, dogal-sus Fc'ye dayali !98 de (lgG-WT) üretildi. YBZ/O hücre çizgisinde üretkenligi maksimize etmek amaciyla, tam boy agir ve hafif zincirlerin cDNA'sinin yani sira varyantlari kodlayan Fc fragmani da Lagim faresi için kodon optimizasyonuyla neo-sentezlendi. Kriptik uç birlestirme alanlari veya kisitlama alanlari gibi istenmeyen özellikleri yok edildi. Kesisme degisken/sabit bölgede yalnizca bir kisitlama alani (Apal) mevcuttu. Bir birinci adimda, dogal-sus agir zincir, CHK622-08 ekspresyon vektöründeki Nhel ve Ascl arasinda klonlandi, YBZ/O'da ekspresyon için optimize edildi ve bu da ara yapi HCD20-Opti-GA ile sonuçlandi. Optimize hafif zincir daha sonra, (burada asagida lgG- WT Isimli) dogal-sus anti-CD20 antikorunun ekspresyonu için nihai yapi HKCD20-Opti- GA ile sonuçlanacak sekilde Spel ve Xbal kisitlama alanlari arasinda klonlandi. Fc varyantlari, HKCDZO-Opti-GA'da mevcut dogal IgG1 FC fragmaninin uygun gale getirilmis versiyonuyla degistirilmesiyle hazirlandi. Bu, Apal ve Ascl kisitlama alanlari Her bir fragman klonlamasi klasik sindirme/ligasyon prosedürleri, önceki bakteriyel dönüstürme ile yapildi. Ekspresyon yapilari enzimatik sindirim arti PCR ile tarandi ve dizilemeyle dogrulandi. |.2. Hücre kültürü üretimi YBZ/O hücre çizgisinin (ATCC, CRL-1662) 5.106 hücresi her bir ekspresyon dogrusallastirilmis vektörle elektropore edildi, daha sonra RPMI 1640 vasati + %5 h/h diyalize FCS (InvitroGen) içinde 25.000 hücre/mL'de seyreltildi ve 24-kuyucuklu plakalarda 1 mL/kuyucuk altinda dagitildi. 3 günlük hücre geri kazanimindan sonra, seçim basinci, 0,5 g/L'de nihai konsantre geneticin (Invitrogen) ve 25 mM nihaide konsantre metotreksat (Sigma) ile, 2 mL/kuyucuk olarak uygulandi. 11 günlük inkübasyondan sonra, direnen hücreler (seçilen lgG MS2 varyantlari ve lgG-WT için kodlama yapan) 8 yapinin her bir için havuzlandi ve 0,9 L hücre süspansiyonu ihtiva eden iki (2) 2 L-silindir sisenin her biri 2 dönüs/dakikada inkübe edilene kadar DMEM vasati + %5 h/h Ultra-düsük lgG FCS (InvitroGen) ile dereceli olarak seyreltildi. Hücrelerin büyümesine ve süzüntü toplanmasi. düsük-hizli santrifüjlemeyle berraklastirma ve Pellicon XL Filtre (Millipore) üzerinde ultra-filtrasyonla hacim indirgeme öncesinde ölmesine izin verildi (4 ila 5 gün). ll. lgG varyantlarinin saflastirilmasi ve karakterizasyonu Konsantre kültür Süzüntüleri bir HiTrap protein A FF kolonunun (GE Healthcare) içine enjekte edildi. Baglanan antikorlar sodyum sitrat tamponuyla, 0,1 M, pH 3,0, ayristirildi ve kesitler ayristirma tamponu ml'si basina 100 pl 1 M Tris pH 7,5 kullanilarak nötrlestirildi. Antikorlari ihtiva eden kesitler havuzlandi ve PBS pH 6,0 içine diyalize edildi ve numuneler steril-filtrelendi (0,22nm) ve 4"C'de depolandi. Saflastirilmis lgG'ler indirgeyici-olmayan ve indirgeyici kosullar altinda SDS-PAGE ile karakterize edildi. Koomassie Mavi-boyali jeller, mutasyonlar ne olursa olsun, IgG'Ierin ve hafif zincir bantlari sergiledigini göstermektedir (Sekil 8b ve Sekil 80). lgG varyantlarinin FcRn'ye baglanma özellikleri üç ayri testle belirlendi: (i) ELISA tayiniyle, (ii) SPR ile ve (iii) florisima-etiketli Rituksimab (bir anti-CD20 lgG) varliginda budanmis bir FcRn eksprese eden Jurkat-hücre çizgisi üzerinde gerçeklestirilen bir rekabetçi baglama tayini. YZB/O'da üretilen lgG varyantlarinin baglama özellikleri pH6,0`da kuyucuklara kaplanan FcRn-p3 ile bir ELISA testi kullanilarak belirlendi. Karsilastirma amaciyla, ELISA tayini lgG-WT üzerinde de gerçeklestirildi. Seri olarak P6/%5 yagsiz süt/%0,1 Tween-20 içinde seyreltilmis saflastirilmis IgG varyantlari, önceden kuyucuk basina 0,1 pg FcRn-p3 ile kaplanan ve P6'da %5 yagsiz süt ile bloke edilen Maxisorp immüno-plakalar üzerinde test edildi. 2 saat süreyle 37°C'de inkübasyondan sonra, kuyucuklar 3 kez P6/%0.1 Tween-20 ile yikandi ve baglanan IgG varyantlari bir HRP Fab'2 keçi anti-insan Fab'2 (Interchim) ile saptandi. Her bir IgG varyanti için, baglanan FcRn yüzdesi IgG-varyantinin konsantrasyonunun kaydina karsilik çizildi. Ortaya çikan her bir baglanma egrisi için, egrinin %50 doyumuyla (EC50) ilgili IgG konsantrasyonu ölçümü belirlendi ve WT-lgG'nin EC- 50'siyle kiyaslandi. ELISA testleri, üretilen IgG varyantlarinin WT-IgG"ye kiyasla FcRn'ye artan bir baglanmaya sahip oldugunu gösterdi. Bu unsur baglama egrileri (bakiniz Sekil 9) ve E050 degerleri tarafindan net sekilde resmedilmektedir. Asagidaki Tablo 9`de resmedildigi üzere, IgG-varyantlarinin EC50'si, dogal-sus edilmektedir. WT 11060 1.0 Tablo 9: Her bir varyantin ELISA baglama egrisinden elde edilen %50 doymada (EC50) konsantrasyon. Oran, WT EC50 bölü varyant ECSO'yi ifade etmektedir. lll.2. SPR ile IgG/FcRn Baglanma Afinite Ölçümleri lll.2.a. Gereç ve yöntem etkilesimi, bir BIAcore X100 cihazi (GE Healthcare) kullanilarak yüzey plazmon rezonansi (SPR) saptamasiyla izlendi. Deney protokolü, Fc varyantlarinin afinitesinin belirlenmesi için kullanilana benzerdi (bakiniz yukaridaki paragraf IV.2.b). Her bir enjeksiyon için gözlemlenen dengeleme RU'su, FC konsantrasyonuna karsi çizildi. Dengeleme Kd degerleri, BIAevaIuation yaziliminda yer alan duragan-durum modeli kullanilarak çizimlerin analiziyle türetildi. Kinetik parametreler 1:2 bir modelle birlesme ve ayrisma evresi verilerinin küresel uydurulmasiyla belirlendi. lll.2.b. SPR sonuçlari lgG-WT'nin insan FcRn için baglanma afinitesi (Kd degerleri) 78,3 nM idi. Tablo 10'da resmedildigi üzere, 6 IgG varyantinin Kd degerleri, FcRn için afinitede pH 6,0'da IgG- WT'ninkine kiyasla 4 ila 7 kat bir artis gösteren sekilde 10,5 ila 18,8 nM arasinda degisti. Kd (nM) Oran WT/varyant WT 78.27 1 T5 A_74 10.55 7 C6 A_74 12.87 6 C6 A_60 13.79 6 06 A_66 15.18 5 Tablo 10: SPR ile elde edilen Kd degerleri. Oran, WT-Kd bölü varyant Kd'yi ifade etmektedir. Kinetik parametrelerin belirlenmesi amaciyla, IgG WT ve varyantlarinin insan FcRn ile etkilesimi için veri kümeleri, BlAevaluation yaziliminda yer alan 1:2 modeliyle uyduruldu. IgG WT ile el edilen egriler1:2 modeliyle uymazken IgG varyanti C6A_66 ve tüm diger varyantlarla elde edilen egriler 122 modeliyle iyi uydu (veriler gösterilmemistir). Asagidaki Tablo 11'de resmedildigi üzere, lgG varyantlarinin WT'ye göre insan FcRn için güçlendirilmis afinitesi baskin sekilde artan birlesme kinetikleri (kon degerleri) tarafindan güdüldü. Böylelikle, varyantlarin kon'u bölü WT-kon'u ifade eden oran, varyantlarin FcRnlye afinitesinde kayda deger bir artisi gösterir sekilde 13 ila 23 arasinda degisti. IgG varyantlarinin WT'ye göre Koff degerleri, birlesmeye kiyasla ayrismanin hafif bir etkisini gösterir sekilde 2 ila 4 arasinda degisti. kon(x105) koif(1/S) KD (nM) Tablo 11: SPR ile belirlenen ayrisma (koff) ve birlesme (kon) hizlari lll.3.a. Gereç ve yöntem Tartas S, Paintaud G, Cartron G, Colombat P, Bardos P, Watier H, Thibault G, Cancer degerlendirilmesi için rekabetçi immünoflorisima tayinleri gerçeklestirildi. Kisaca, IgG WT ve varyantlari PBS pH6 içinde 0,06 ila 2mg/ml arasinda degisen bir nihai konsantrasyonda seyreltildi ve 50 pg/ml'lik bir konsantrasyonda Alexa-konjuge Rituximab (Rituximab etiketli) varliginda Jurkat FcRn (150000 hücre) ile inkübe edildi. dakika sonra, hücreler, Alexa-Rituximab baglanma miktarinin tayin edilmesi amaciyla akis sitometrisiyle analiz edildi. Sonuçlar ortalama florisima yogunlugunun (MFI) bir yüzdesi olarak ifade edildi, %100 tek basina (yani rakip olmadan) Alexa- konjuge Rituximab ile elde edilen ortalama florisima yogunlugunu (MFI) ifade etmektedir ve %0, Jurkat FcRn AIexa-konjuge Rituximab ile inkübe edilmemis oldugunda ölçülen MFI degerini ifade etmektedir. Her bir deney üç kopya olarak yapildi. Kontroller, (i) etiketsiz Rituximab'in veya (ii) IgG-WT'nin inkübasyonunu içerir. Test edilen her bir lgG için, MFI, IgG konsantrasyonunun kaydina karsi çizildi. Test edilen her bir IgG'nin, MFl sinyalinin %50'sinin bir önlenmesini saglayan konsantrasyonu (ICSO) belirlendi. Bu tayinin genel bir tarifi ayrica, FR 2 894 983 olarak yayinlanan Fransiz patent basvurusunda da bulunabilir. lll.3.b. Deney sonuçlari Ritixan'in ve bulusa göre çesitli varyantlarin Jurkat FcRn'ye baglanmasinin yukaridaki Gereçler ve Yöntemler kisminda tarif edildigi ve ortalama florisima yogunlugu (MFI) degerleri olarak Ifade edildigi üzere belirlenmis oldugu Sekil 11'de çesitli sonuçlar gösterilmektedir. Asagidaki Tablo 12'de resmedildigi üzere, bulusun varyantlari için elde edilen IC50, WT-IgG için elde edilenden kayda deger sekilde daha düsüktür. Bulusun IgG varyantlari için IC50ideki azalma, C6A-66 hariç 40 ila 60-kat arasinda oldu. Rituximab NA ;E 1 WT 219 5 C6A_69 4 240 C6A_78 4 275 T5A_74 4 224 C6A_74 5 200 C6A_60 3 234 Tablo 12: FIorisima-etiketli Rituximab varliginda FcRn eksprese eden Jurkat hücreleri üzerinde gerçeklestirilen baglanma rekabet tayini için elde edilen ICSO. "50%RTX=1" degerleri, yine ug/ml olarak ifade edilen lCSO degerlerinden olusur. lll.4. Sonuç lgG varyantlarinin FcRn`ye baglanma özelliklerinin karakterize edilmesi için gerçeklestirilen üç ayri test tutarli sonuçlar saglamistir. Tüm durumlarda, bulusun lgG varyantlari, lgG dogal susunkine kiyasla FcRn'ye kayda deger bir sekilde artan baglanma sergilemistir. karsilastirma lgG varyantlarinin Fcy reseptörlerini baglama yetisi ve bunlarin ADCC ve CDC aktiviteleri, biyolojik fonksiyonlarinin tamamen-karakterize edilmesi amaciyla tayin lV.1.a. ELISA tayini: lgG varyantinin hareketsizlestirilmis rekombinan hFcvRlllA'ya baglanmasi Insan rekombinan FcyRIIIA (F streptavidin ELISA plakalari (Pierce) üzerine kaplandi. Bu inkübasyon süresi esnasinda, IgG-F(ab')2 anti-F(ab')2 kompleksleri tayin tamponunda, 5 ug/ml lgG ve yaban turpu peroksidazla etiketlenmis 2 ug/ml F(ab')2 anti-insan F(ab')2'nin (Jackson Komplekslerin seri seyreltileri plakalara eklendi ve nazikçe çalkalanarak 2 saat süreyle oda sicakliginda inkübe edildi. Plakalarin tayin tamponuyla yikanmasindan sonra, hFcyRIIIA'ya baglanan kompleksler TMB (Pierce) ile saptandi. 450 nm'deki emilim bir plaka okuyucu (Tecan) kullanilarak okundu. Her bir IgG varyanti için, baglanan FcyRIIIA'nin (OD450nm'den elde edilen) yüzdesi, Sekil 10'da gösterildigi üzere, IgG varyantlarinin hFcvRIIIA'ya baglanmasi, hFcyRIIIAyya baglanamayan CGA_66 varyanti hariç, lgG WT'ninkine benzerdir. Dogal katil (NK hücreler) saglikli donörlerin periferik kanindan, Miltenyi firmasi tarafindan gelistirilen negatif tükenme teknigiyle saflastirildi. ADCC testi, NK hücrelerin, anti-CD20 antikorlarinin farkli konsantrasyonlarinin varliginda, CD20 reseptörü eksprese eden Raji çizgisinin hedef hücreleriyle inkübe edilmesini içerir. 16 saatlik inkübasyondan sonra, anti-CD20 antikorlari tarafindan indüklenen sitotoksisite, hücre süzüntülerinde, Iize edilmis hedef hücreler tarafindan salinan Iaktat dehidrojenaz (LDH) adli bir hücre içi enzimin seviyesinin tayin edilmesiyle kromojenik olarak ölçülür. Sonuçlar Sekil 12'de gösterilmektedir. Spesifik Iizis sonuçlari, antikor konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak Iizis yüzdesi olarak ifade edilmektedir. EC50 (maksimum Iizisin %50`sini indükleyen antikor miktari), PRISM yazilimi kullanilarak hesaplandi. Kontrol deneyleri (i) Rituximab, (ii) Yhücrelerinde ve 2004 (de Romeuf C, Dutertre CA, Le Garff-Tavernier M, Foumier N, Gaucher C, Glacet A, Jorieux S, Bihoreau N, Behrens CK, Béliard R, Vieillard V, Cazin B, Bourel D, Prost JF, Teillaud JL, MerIe-Béral H.Chronic lymphocytic Ieukaemia cells are efficiently killed by an anti-CD20 monoclonal antibody selected for improved edilmis olan, ADDC fonksiyonuna sahip oldugu bilinen bir anti-CD20 antikoru olan LFB- R603 içinde üretilmis WT-IgG ile gerçeklestirildi. Asagidaki Tablo 13, her bir varyant için ECSO'yi göstermekte ve IgG varyantlarinin ADCC fonksiyonunu LFB-R603 ve WT-IgG'ninkiyle karsilastirmaktadir. 06A-66 varyanti hariç tüm IgG varyantlari ADCC aktivitesi sergilemektedir. Bu varyant, FcyRIII için çok düsük afinitesiyle tutarli sekilde hiç ADCC aktivitesine sahip degildir. oldugu fark edilmelidir. Diger varyantlar (yani 06A_78 ve T5A_75) IgG-WT'ninkine benzer bir ADCC aktivitesine sahiptir. LFB-RGOS 0,2 1,0 Rituximab 5000 N.A. WT 1.2 6.0 06A_69 0.5 2.3 T5A_74 0.7 3.3 06A_74 0.2 0.9 06A_60 0.3 1 .6 Tablo 13: ACDD tayininden elde edilen E050 (maksimum Iizisin %50'sini indükleyen antikor miktari). Oran, varyant E050 bölü LFB-R603 E050'yi ifade etmektedir. Bu teknikte, Raji çizgisinin hedef CD20+ hücreleri bir kompleman kaynagi olarak bebek tavsan serumu varliginda anti-CDZO antikorlarinin farkli konsantrasyonlariyla (0 ila inkübasyondan sonra, süzüntü Iize edilmis hedef hücreler tarafindan salinan LDH miktari kromojenik olarak ölçülür (Roche Applied Sciences Sitotoksisite Saptama Kiti) ve antikorlarin aracilik ettigi kompleman-bagimli sitotoksisitenin miktar tayini için kullanilir. Sonuçlar Iizisin bir yüzdesi olarak ifade edilir. E050 (maksimum Iizisin kullanilarak hesaplanir. Asagidaki Tablo 14, her bir varyant için elde edilen Emax ve EC50"yi göstermektedir. CDC aktivitesinin seviyesi IgG varyantlarina göre degisir. CöA_78 ve C6A_60, IgG-WT'ninkinden kayda deger sekilde daha yüksek bir CDC aktivitesine sahipken, C6A_69, T5_74 ve C6A_66 düsük CDC aktivitesi sergiler. C6A-74'ün CDC aktivitesi IgG-WT'ninkine benzerdir. Emax (% lizis) EC50 (ng/ml) Rituximab 65.60 419.0 WT 57.32 541 .1 C6A_69 N. A. 5000 T5A_74 N.A. 5000 Tablo 14: CDC tayininden elde edilen E050 (maksimum lizisin %50'sini indükleyen antikor miktari). YZB/O hücre çizgisinde rekombinan olarak Üretilen alti IgG varyanti, (ayni konak hücrede ve ayni kosulda üretilen) IgG-WT'ye kiyasla FcRn reseptörüne artan bir baglanmaya sahiptir. en azindan ayni baglanma afinitesine ve en azindan ayni ADCC aktivitesine sahiptir. Sonuç olarak, bazi yönlerde, bulusa göre amino asit modifikasyonlari, karsilik gelen uygun IgG'ninkine (yani IgG-WT) en azindan benzer bir veya daha fazla Fc efektör aktivitesiyle birlikte FcRn için artan bir baglanmaya sahip IgG varyantlari elde etmeyi Diger yönde, bulusa göre amino asit modifikasyonlari, CDC veya ADCC gibi en az bir azalan Fc efektör aktivitesiyle birlikte FcRn için artan bir baglanmaya sahip IgG varyantlarinin elde edilmesini saglar. Asagidaki Tablo 15, mevcut çalismanin IgG varyantlarini ilgilendiren ana sonuçlari göstermektedir. TR TR TR TR TR TR

Claims (1)

1.