TARIFNAME GELISTIRILMIS SÜT PIHTILASTIRMA NITELIKLERINE SAHIP KIMOZIN VARYANTLARI TEKNIK ALAN Mevcut bulus, gelistirilmis süt pihtilastirma niteliklerine sahip kimozin varyantlari ile ilgilidir. ÖNCEKI TEKNIK Kimozin ve pepsin gibi süt pihtilastirma enzimleri ile sütün enzimatik koagülasyonu, peynir imalatindaki en önemli proseslerden biridir. Enzimatik süt koagülasyonu iki asamali bir prosestir: bir proteolitik enzim, kimozin veya pepsinin, K-kazeine saldirdigi, bunun, kazein misel yapisinin yari dengeli bir durumu ile sonuçlandigi bir birinci asama ve bunun ardindan sütün koagüle edildigi ve bir koagülum olusturdugu bir ikinci asama. pihtilastirrna enzimleri, genis bir peptidaz sinifina ait aspartik proteazlardir. Gastrik mukozal hücrelerde üretildiginde, kimozin ve pepsin, sirasiyla enzimatik olarak inaktif pre-prokimozin ve pre-pepsinojen olarak meydana gelmektedir. Kimozin salgilandiginda, bir N-terminal peptit fragmenti olan pre-fragment (sinyal peptidi), bir pro-fragmenti kapsayan prokimozinin verilmesi için bölünmektedir. Prokimozin, enzimin büyük oranda inaktif bir formu olup, bununla birlikte, pro-fragmentin otokatalitik olarak giderilmesi vasitasiyla asidik kosullar altinda aktif kimozine aktive olmaktadir. Bu aktivasyon, uygun pH kosullari altinda gastrik lümende in vivo olarak veya asidik kosullar altinda in vitro olarak meydana gelmektedir. 24946.42 Sigirin, yani, Bos taurus7un yapisal ve islevsel özellikleri olan pre-prokimozin, prokiinozin ve kimozin, kapsamli sekilde arastirilmistir. Sigir pre-prokimozin molekülünün pre-kismi, 16 aa kalintilarini içerrnektedir ve karsilik gelen prokimozinin pro-kismi ise 42 aa kalintisi degerindeki bir uzunluga sahiptir. Aktif sigir kimozini, 323 aa içermekte olup, her ikisi de aktif olan iki formun, yani A ve B°nin bir karisimidir. Kimozin, sigirlar, develer, keçi cinsleri, bufalolar, koyunlar, domuzlar, insanlar, maymunlar ve siçanlar gibi memeli türlerinde dogal olarak üretilmektedir. Sigir kimozini, birkaç yil boyunca, süt endüstrisine yönelik ticari olarak mevcut olmustur. W002/3 numarali doküman, deve kimozininin rekoinbinant üretimini açiklamaktadir. Hemen asagida listelenen referanslar, mevcut baglamda, kimozin mutantlarini açiklayan referanslar olarak görülebilir: - Suzuki ve meslektaslari: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 ve Asp304 in chymosin, Protein Engineering, cilt 4, Ocak 1990, sayfa 69-71; - Suzuki ve meslektaslari: Alteration of catalytic properties of chymosin by site- - van den Brink ve meslektaslari: Increased production of chymosin by - Pitts ve meslektaslari: Expression and characterisation of chymosin pH Optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, cilt 28, Mart 1993, sayfa 69-83; - M.G. Williams ve meslektaslari: Mutagenesis, biochemical characterization 24946.42 and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein - Strop ve meslektaslari: Engineering enzyme subsite specifîcity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG res01ution of Vallllphe site mutated calf chymosin, Biochemistry, cilt 29, Ekim 1990, - Supannee ve meslektaslari: Site-specific mutations of calf chymosin B Which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, cilt 62, Haziran 1998, sayfa 133-139; - Zhang ve meslektas1ari: Functional implications of disulfide bond, Cys45- CysSO, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, cilt 1343, WO sigir kimozin varyantini açiklamaktadir. referansli makaleler, örnegin koyun kimozin sekansi gibi bilinen yaban tipi (ana polipeptit) kimozin sekanslari ile ilgilidir. Yukarida bahsi geçen önceki teknik referanslarindan hiç birisi, burada, asagida açiklanan/istenen kimozin mutantlari/varvantlarindan hiç birini dogrudan ve açik bir sekilde aciklamamaktadir. BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus ile çözülecek olan problem, gelistirilmis süt pihtilastirma niteliklerine sahip kimozin varyantlarinin saglanmasidir. Buradaki çalisma örneklerinde tartisildigi üzere - mevcut bulus sahipleri, birkaç 24946.42 gelistirilmis deve (bakiniz buradaki Örnek 6) ve sigir (bakiniz buradaki Örnek 7) kimozin varyanti tanimlamislardir. Deve ve sigir varyantlarinin karsilastirmali bir analizine dayanarak - mevcut bulus sahipleri, bu pozisyonlardan bir veya daha fazlasinda bir varyantin meydana getirilmesi vasitasiyla, gelistirilmis bir kimozin vaiyantinin elde edilebilmesi bakimindan burada önemli olan birkaç baska amino asit pozisyonu tanimlamislardir (bakiniz buradaki Örnek 8). Teknikte bilindigi üzere - farkli memeli türlerinden (örnegin sigirlar, develer, koyunlar, domuzlar veya siçanlar gibi) elde edilen farkli dogal, yaban tipi kimozin polipeptit sekanslari, görece yüksek sekans benzerligine/özdesligine sahiptir. Buradaki sekil lide, bu, buradaki ilgili farkli kimozin sekanslarinin bir hizalamasi ile örneklenmektedir. Bu görece yakin sekans iliskisinin isiginda - farkli dogal yaban tip kimozinlerin 3D yapilarinin da görece benzer oldugu düsünülmektedir. Mevcut baglamda - dogal olarak elde edilmis bir yaban tipi kimozin (sigir kimozini veya deve kimozini gibi), bir ana polipeptidin - yani mevcut bulusun bir varyant kimozin polipeptidinin üretilmesi için bir alterasyonun gerçeklestirildigi bir ana polipeptidin bir örnegi olabilmektedir. Teoriyle sinirli kalmaksizin - bu pozisyonlardan biri veya daha fazlasinda bir varyantin meydana getirilmesi vasitasiyla, genel olarak gelistirilmis bir kimozin varyantinin elde edilebilmesi bakimindan (örnegin bir gelistirilmis sigir, deve, koyun, domuz veya siçan kimozin varyanti) -burada tartisilan kimozinle iliskili amino asit pozisyonlarinm, burada uygun olan, ilgili herhangi bir kimozin enziminde genel bir öneme sahip oldugu düsünülmektedir (örnegin sigirlar, develer, koyunlar, domuzlar, siçanlar ve benzerinin kimozinleri). 24946.42 Burada tartisildigi üzere, - ilgili bir ana kimozin polipeptitin amino asit pozisyonunun belirlenmesine yönelik bir referans sekansi olarak (örnegin deve, koyun, sigir Vb), burada, kamusal olarak bilinen sigir kimozini B preprokimozin sekansi kullanilmaktadir (Genkbank erisim numarasi P00794 - burada SEKANS KIMLIK NUMARASI:1 olarak açiklanmaktadir). SEKANS KIMLIK NUMARASIzliin sigir kimozin B preprokimozini, burada alternatif olarak, Sigir (Bos bovis) kimozini B veya basitçe sigir kimozini olarak adlandirilabilmektedir. Sekans ayrica buradaki Sekil 1`de de gösterilmektedir. Bir baska ilgili kimozin sekansi, açikça bilinen, buradaki SEKANS KIMLIK NUMARASI:2"nin Cameli'us dromedarius kimozinidir. Burada alternatif olarak deve kimozini olarak da adlandirilabilmektedir. Sekans ayrica buradaki Sekil 1°de de gösterilmektedir. Mevcut baglamda, SEKANS KIMLIK NUMARASIzl°in (sigir kimozini) matür polipeptidi ile en az %65 sekans özdesligine sahip olan bir ana kimozin polipeptidinin (örnegin koyun veya siçandan), burada açiklanan amino asit pozisyonlarindan herhangi birinde bir varyantin meydana getirilmesi vasitasiyla gelistirilmesi bakimindan örnegin sigir veya deve kimozini ile yeterli sekilde, yapisal olarak iliskili oldugu düsünülebilmektedir. Bu baglamda, bulusun bir birinci yönü, istem lae göre bir izole kimozin polipeptit varyantinin meydana getirilmesine yönelik bir yöntem ile ilgilidir. Teknikte bilindigi üzere - teknikte uzman kisiler, yaygin genel bilgiye dayanarak, kimozin ve kimozin varyantlarini turin sekilde üretebilmekte ve saflastirabilmektedir. Bir baska ifadeyle, ilgili kimozin aktivitesine sahip ilgili ana polipeptide (örnegin 24946.42 sigirlardan, develerden, koyunlardan, domuzlardan veya siçanlardan) sahip oldugunda, teknikte uzman bir kisi için, bu tür bir ilgili ana kimozinin bir varyantini meydana getirmesi rutin bir istir. Burada tartisildigi üzere - buradaki çalisma örneklerinde, ana polipeptit olarak SEKANS KIMLIK NUMARASIzlîn polipeptidi (Sigir) kullanilarak varyantlar meydana getirilmistir - bu tür varyantlar, burada, sigir kimozin varyantlari olarak adlandirilabilmektedir. Burada tartisildigi üzere - buradaki çalisma örneklerinde, ana polipeptit olarak SEKANS KIMLIK NUMARASI:2"nin polipeptidi (deve kimozini) kullanilarak varyantlar meydana getirilmistir - bu tür varyantlar, burada, deve kimozin varyanti olarak adlandirilabilmektedir. Bu baglamda, bulusun bir ikinci yönü, istem 5`e göre bir izole kimozin polipeptit varyanti ile ilgilidir. Burada açiklandigi üzere bir izole kimozin polipeptit varyanti teknige göre - örnegin ilgili bir besin veya yem ürününün meydana getirilmesi için (örnegin bir peynir ürünü olabilen ilgili bir süt bazli ürün gibi) kullanilabilmektedir. Bu baglamda, bulusun bir üçüncü yönü, bir gida veya yem ürününün meydana getirilmesine yönelik bir yöntem ile ilgili olup, bu, gida veya yem içerik maddelerine, burada açiklandigi üzere izole kimozin polipeptit varyantinin etkili bir miktarinin ilave edilmesini ve gida veya yem ürününün elde edilmesi için ilave imalat adimlarinin gerçeklestirilmesini içeiinektedir. Mevcut bulusun yapilandirmalari, yalnizca öriiek olarak asagida açiklanmaktadir. TANIMLAR 24946.42 Buradaki ilgili terimlerin tüm tanimlari, ilgili teknik baglamla iliskili olarak uzman kisi tarafindan anlasildigi gibidir. bir özgüllüge sahiptir ve kazeinin kappa-zincirinde bir tek 105-Ser-Phe-l-Met-Ala- 108 baginin bölünmesi vasitasiyla sütü pihtilastirrnaktadir. Teknikte kullanilan üzere bir kimozin enziminin kimozin aktivitesi ile ilgilidir. Uzman kisi, burada ilgili kimozin aktivitesinin nasil belirlendigini bilmektedir. Buradaki çalisma Örnegi 45te, alternatif olarak pihtilastirma aktivitesi veya süt pihtilastirma aktivitesi olarak adlandirilan - spesifik kimozin aktivitesinin belirlenmesine yönelik bir standart yöntemin bir örnegi saglanmaktadir. Buradaki çalisma Örnegi 5'te, proteolitik aktivitenin belirlenmesine yönelik bir standart yöntemin bir örnegi saglanmaktadir. Teknikte bilindigi üzere - buradaki ilgili, söz gelimi C/P orani, proteolitik aktivite (P) ile spesifik pihtilastirma aktivitesinin (C) bölünmesi ile belirlenmektedir. Teknikte bilindigi üzere - daha yüksek bir C/P orani, genel olarak, spesifik olmayan protein bozunmasindan dolayi örnegin peynir imalati sirasinda protein kaybinin azaldigini, yani peynir veriminin artirildigini ve matürasyon sirasinda peynirdeki aci tat gelisiminin azaldigini göstermektedir. gelmektedir. Bir yönde, varyant, SDS PAGE ile belirlendigi üzere, en az %1 saf, örnegin en az %5 saf, en az %10 saf, en az %20 saf, en az %40 saf, en az %60 saf, 24946.42 en az %80 saf ve en az %90 saftir. fosforilasyon, ve benzeri gibi translasyon ve herhangi bir post-translasyon modifikasyonunun ardindan nihai formundaki bir peptit anlamina gelmektedir. Mevcut baglamda, buradaki ilgili bir matür kimozin polipeptidi, - pre-kismi ve/veya pro-kismi sekanslarinin olmadigi aktif kimozin polipeptit sekansi olarak görülebilmektedir. Bir matür polipeptidin buradaki ilgili örnekleri, örnegin, SEKANS KIMLIK NUMARASlzlain amino asit pozisyonu 59 ila amino asit pozisyonu 381 arasi olan SEKANS KIMLIK NUMARASH matür polipeptidi (sigir kimozini) veya SEKANS KIMLIK NUMARASI:2,nin amino asit pozisyonu 59 ila amino asit pozisyonu 381 arasi olan SEKANS KIMLIK NUMARASI:2 matür polipeptididir (deve kimozini). enzim varyantlarinin üretilmesi için bir alterasyonun gerçeklestirildigi bir polipeptit anlamina gelmektedir. Ana kaynak, dogal olarak meydana gelen (yaban tipi) bir polipeptit veya bunun bir varyanti olabilmektedir. sekansi arasindaki iliski ile ilgilidir. Mevcut bulusun amaçlarina yönelik olarak, iki amino asit sekansi arasindaki sekans özdesligi derecesi, tercihen versiyon 3.0.0 veya daha sonraki bir versiyonda olan, EMBOSS pakedinin (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice ve meslektaslari, 2000, Trends Genet. 16: 276-277) Needle programinda uygulanan Needleman-Wunsch algoritmasi belirlenmektedir. Kullanilan opsiyonel parametreler, 10 degerindeki açik bosluk kaybi, 0.5 degerindeki bosluk uzanti kaybi ve EBLOSUM62 (BLOSUM62lnin EMBOSS versiyonu) ikame inatrisidir. Needle etiketli "en uzun özdesligin" 24946.42 çiktisi (-kisa olmayan opsiyonu kullanilarak elde edilmektedir) yüzde özdeslik olarak kullanilmaktadir ve su sekilde hesaplanmaktadir: (Özdes Kalintilar x 100)/(Hiza Uzunlugu - Hizadaki Bosluklarin Toplam Sayisi) Mevcut bulusun amaçlarina yönelik olarak, iki deoksiribonükleotit sekansi arasindaki sekans özdesligi derecesi, tercihen versiyon 3.0.0 veya daha sonraki bir versiyonda olan, EMBOSS pakedinin (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice ve meslektaslari, 2000, supra) Needle programinda uygulanan Needleman-Wunsch algoritmasi (Needleman ve Wunsch, 1970 supra) kullanilarak belirlenmektedir. Kullanilan opsiyonel parametreler, 10 degerindeki açik bosluk kaybi, 0.5 degerindeki bosluk uzanti kaybi ve EDNAFULL (NCBI NUC ikame matrisidir. Needle etiketli "en uzun özdesligin" çiktisi (-k1sa olmayan opsiyonu kullanilarak elde edilinektedir) yüzde özdeslik olarak kullanilmaktadir ve su sekilde hesaplanmaktadir: (Özdes Deoksiribonükleotitler x 100)/(Hiza Uzunlugu - Hizadaki Bosluklarin Toplam Sayisi) ikame, bir ekleme ve/veya koparak eksilme içeren kimozin aktivitesine sahip bir peptit anlainina gelmektedir. Bir ikame, bir pozisyonda bulunan bir ainino asidin farkli bir amino asit ile degistirilmesi anlamina gelmektedir; bir koparak eksilme, bir pozisyonda bulunan bir amino asidin çikarilmasi anlamina gelmektedir; ve bir ekleme ise bir pozisyonda bulunan bir amino asidin bitisigine 1-3 amino asidin ilave edilmesi anlamina gelmektedir. Amino asit, dogal veya dogal olmayan amino asitler olabilmektedir - örnegin, D- 24946.42 alanin,in örnegin belirli D-izomerleri (veya D-formlari) ile ikame, teorik olarak mümkün olabilmektedir. veya sigir) gibi dogal olarak meydana gelen bir organizma tarafindan eksprese edilen bir kimozin anlamina gelmektedir. SEKILLER Sekil 1: Buradaki ilgili farkli kimozin sekanslarinin bir hizasi. Gösterilen kimozinidir ve gösterilen ""Camelus_dromedarius" ise buradaki SEKANS KIMLIK NUMARASI:29nin deve kimozinidir. Burada açiklandigi üzere referans sekansi olarak SEKANS KIMLIK NUMARASI:1 ,in sigir kimozinini kullanilarak, örnegin, sigir kimozininin pozisyon lOada "V"ye sahip oldugu ve deve kimozinin ise ayni pozisyon 10,da "A"ya sahip oldugu görülebilmektedir. Örnegin ayrica, sigir/Siçanin pozisyon 352,de "Q"ya sahip oldugu ve Deve/C._bactrianus,un ise ayni pozisyon 352,de "E"ye sahip oldugu da görülebilmektedir. Sekil 1°de gösterilen kimozin sekanslariyla iliskili olarak - koyun, sigir SEKANS KIMLIK NUMARASI:1 ile %94.5 sekans özdesligine sahiptir; C._bactrianus, sigir SEKANS KIMLIK NUMARASI:1 ile %832 sekans özdesligine sahiptir; Camelus_dromedarius (SEKANS KIMLIK NUMARASI:2"nin deve kimozini), sigir SEKANS KIMLIK NUMARASI:1 ile %84 sekans özdesligine sahiptir; domuz, sigir SEKANS KIMLIK NUMARASI:1 ile %803 sekans özdesligine sahiptir; ve siçan ise sigir SEKANS KIMLIK NUMARASI:1 ile %71.9 sekans özdesligine sahiptir. Mevcut baglamda uzman kisi tarafindan anlasilacagi üzere - örnegin koyun, C._bactrianus, deve, domuz veya siçan kimozininin matür polipeptit sekanslarinin SEKANS KIMLIK NUMARASlzlsin matür polipeptidi (sigir kimozini - yani 24946.42 SEKANS KIMLIK NUMARASIzl°in amino asit pozisyonlari 59 ila 381) ile ilgili sekans özdesligi yüzdeleri, yukarida bahsi geçen sekans özdesligi yüzdeleri ile görece benzerdir. Sekil 2: Sigir kimozininin 3D yapisi - 3D yapi kamusal olarak erisilebilirdir. Amino asit pozisyonlari 296 ve 294,ün sigir Kimozininde mevcut oldugu bir Örnek gösterilmektedir. BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Yukarida tartisildigi üzere - buradaki ilgili bir kimozin polipeptidin (örnegin deve, koyun, sigir vb.) amino asit pozisyonlarinin belirlenmesine yönelik bir referans sekansi olarak, burada, SEKANS KIMLIK NUMARASl:l olarak açiklanan, kamusal olarak bilinen sigir kimozini sekansi kullanilmaktadir. Mevcut bulusun amaçlarina yönelik olarak, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1 ,de (sigir kimozini) açiklanan polipeptit, bir baska kimozin polipeptidindeki karsilik gelen amino asit kalintisinin belirlenmesi için kullanilmaktadir Bir baska kimozin polipeptidinin amino asit sekansi, SEKANS KIMLIK NUMARASIzl'de açiklanan polipeptit ile hizalanmaktadir ve bu hizaya dayanarak, SEKANS KIMLIK NUMARASITde açiklanan polipeptitteki herhangi bir amino asit kalintisina karsilik gelen amino asit pozisyonu sayisi, buradaki çalisma Örnegi 1*de açiklanan ClustalW algoritmasi kullanilarak belirlenmektedir. Bir baska kimozin polipeptidindeki karsilik gelen amino asit kalintisinin tanimlanmasi, tercihen versiyon 3.0.0 veya daha sonraki bir versiyonda olan EMBOSS pakedinin (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software programinda uygulanan Needleman-Wunsch algoritmasi (Needleman ve Wunsch, 24946.42 Yukaridaki iyi bilinen bilgisayar programlarina dayanarak - uzman kisi için, buradaki ilgili bir kimozin polipeptidinin amino asit pozisyonunu (örnegin deve, koyun, sigir, vb) belirlemesi rutin bir istir. Buradaki sekil 1,de, bir hizanin bir örnegi gösterilmektedir. Yalnizca bir örnek olarak -sekil l,de, örnegin, burada kullanilan SEKANS KIMLIK NUMARASI:1 sigir referansinin, pozisyonda 50,de bir "G"ye sahip oldugu ve ""Camelusýdromedarius'hn ise (burada SEKANS KIMLIK NUMARASlz2) bu pozisyon 505de bir "A"ya sahip oldugu görülebilmektedir. Varvantlarin terimlendirilmesi Mevcut bulusa ait varyantlar açiklanirken, asagida açiklanan terimlendirine referans kolayligi için uyarlanmaktadir. Kabul edilen IUPAC tek harfli veya üç harfli amino asit kisaltmalari kullanilmaktadir. Asagidaki "terimlendirme" bölümünde açiklanan spesifik varyantlar, burada, mevcut bulusun ilgili varyantlari olmayabilmektedir -yani bu "terimlendirme" bölümü, burada kullanilan ilgili terimlendirmenin açiklanmasina yöneliktir. Ikameler. Bir amino asit ikamesi için asagidaki terimlendirme kullanilmaktadir: Orijinal amino asit, pozisyon, ikameli amino asit. Bu baglamda, pozisyon 226,da treoninin alanin ile teorik bir ikamesi, "Thr226Ala" veya "T226A" olarak tanimlanmaktadir. Çoklu mutasyonlar, örnegin "Gly205Arg + Ser411Phe" veya"G205R + S411F" gibi toplama isaretleri ("+") ile ayrilmakta olup, bunlar sirasiyla pozisyonlar 205 ve 4119de glisinin (G) arjinin (R) ile ve serinin (S) fenilalanin (F) ile ikamelerini temsil etmektedir. Örnegin "226A" olarak tanimlanan bir ikame, pozisyon 226lda bir ana amino asidin (örnegin T, Q, S veya 24946.42 bir baska ana amino asit) alanin ile bir ikamesine isaret etmektedir. Koparak Eksi'lmeler. Bir amino asit koparak eksilinesi için, asagidaki terimlendirme kullanilmaktadir: Orijinal amino asit, pozisyon, *. Bu baglamda, pozisyon 195'te glisinin koparak eksilmesi, "Gly195*" veya "G195*" olarak tanimlanmaktadir. Çoklu koparak eksilmeler, örnegin "Gly195* + Ser4ll*" veya"Gl95* + S41 1*" gibi toplama isaretleri ("+") ile ayrilmaktadir. Eklemeler. Bir amino asit eklemesi için, asagidaki terimlendirme kullanilmaktadir: Orijinal amino asit, pozisyon, orijinal amino asit, eklenen amino asit. Bu baglamda, pozisyon 195,te glisinden sonra lisinin eklenmesi, bir eklemesi, [Orijinal amino asit, pozisyon, orijinal amino asit, eklenen amino asit #1, eklenen amino asit #2; vb] olarak tanimlanmaktadir. Örnegin pozisyon 195 ,te glisinden sonra lisin ve alaninin eklenmesi, "Glyl95GlyLysAla" veya"G l 95GKA" olarak gösterilmektedir. Bu tür durumlarda, eklenen amino asit kalintilari, eklenen amino asit kalintilarinin önüne gelen amino asit kalintisinin pozisyon numarasina küçük harflerin ilave edilmesiyle numaralandirilmaktadir. Dolayisiyla yukaridaki örnekte sekans su sekilde olabilmektedir: Ana: Vagant: Çoklu alteraszonlar. Çoklu alterasyonlar içeren varyantlar, örnegin ayrilmakta olup, bunlar, sirasiyla pozisyonlar 170 ve 195,te, arjinin ve glisin için tirozin ve glutamik asidin bir ikamesini temsil etmektedir. 24946.42 Farkli ikameler. Bir pozisyonda farkli ikamelerin gerçeklestirilebilmesi durumunda, farkli ikameler, örnegin "Arg170Tyr,Glu" veya"R170Y,E" gibi bir Virgül ile ayrilmakta olup, bu, pozisyon 170"te arjinin tirozin veya glutamik asit ile bir ikamesini temsil etmektedir. Dolayisiyla, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" veya"Y167G,A + R170G,A" asagidaki varyantlari tanimlamaktadir: ; ve "Tyr167Ala+Arg170Ala". Bir izole kimozin polipeptit varyantinin meydana getirilmesine yönelik bir yöntem Yukarida tartisildigi üzere -teknikte bilindigi üzere, teknikte uzman kisiler, yaygin genel bilgiye dayanarak, kimozin ve kimozin varyantlarini rutin sekilde üretebilmekte ve saflastirabilmektedir. Bir baska ifadeyle, ilgili kimozin aktivitesine sahip ilgili ana polipeptide (örnegin sigirlardan, develerden, koyunlardan, domuzlardan veya siçanlardan) sahip oldugunda, teknikte uzman bir kisi için, bu tür bir ilgili ana kimozinin bir varyantini meydana getirmesi rutin bir istir. Bir kimozinin (varyant veya ana) üretilmesi ve izole edilmesine yönelik uygun bir yöntemin bir örnegi, örnegin W002/3 dokümaninda açiklandigi üzere, iyi bilinen, örnegin fungal rekombinant ekspresyonu/üretimine dayali teknoloji ile gerçeklestirilebilmektedir. Ayrica, kimozin aktivitesine sahip bir ana polipeptitteki bir veya daha fazla pozisyonda alterasyonlarin gerçeklestirilmesi uzman kisi için bir rutindir, burada alterasyon, en az bir amino asit pozisyonunda bir ikame, bir koparak eksilme veya bir ekleme içermektedir. Uzman kisi tarafindan bilindigi üzere - bu, örnegin, söz gelimi bölgesel 24946.42 yönlendirilmis mutajenez ve rekombinant ekspresyon/üretim bazli teknoloji ile gerçeklestirilebilmektedir. Ayrica, buradaki ilgili bir ana polipeptidin (örnegin deve veya sigir yaban tipi kimozin) ve/veya buradaki ilgili bir varyantin kimozin aktivitesine sahip olup olmadiginin belirlenmesi de uzman kisi için bir rutindir. Teknikte bilindigi üzere - kimozin aktivitesi, söz gelimi C/P orani ile belirlenebilmekte olup, bu spesifik pihtilastirma aktivitesinin (C) proteolitik aktiviteye (P) bölünmesiyle belirlenmektedir. Teknikte bilindigi üzere - daha yüksek bir C/P orani, genel olarak, spesifik olmayan protein bozunmasindan dolayi örnegin peynir imalati sirasinda protein kaybinin azaldigini, yani peynir veriminin aitirildigini ve matürasyon sirasinda peynirdeki aci tat gelisiminin azaldigini göstermektedir. Buradaki çalisma örnegi 4,te, spesifik pihtilastirma aktivitesinin (C) belirlenmesine yönelik uygun bir yöntem açiklanmaktadir ve buradaki çalisma örnegi Site ise proteolitik aktivitenin (P) belirlenmesine yönelik uygun bir yöntem açiklanmaktadir. Burada açiklandigi üzere bir izole kimozin polipeptit varyanti bir varyanttir, burada varyant, buradaki SEKANS KIMLIK NUMARASI:27nin matür polipeptidini içeren deve kimozininin C/P oranina kiyasla daha yüksek bir C/P orani veren bir kimozin aktivitesine sahiptir. Daha tercihen, burada açiklandigi üzere bir izole kimozin polipeptit varyanti bir varyanttir, burada varyant asagidakilere sahiptir - buradaki SEKANS KIMLIK NUMARASI:1"in matür polipeptidini içeren sigir kimozininin C/P oranina kiyasla daha yüksek bir C/P orani veren bir 24946.42 kimozin aktivitesine; ve - buradaki SEKANS KIMLIK NUMARASI:2`nin matür polipeptidini içeren deve kimozininin C/P oranina kiyasla daha yüksek bir C/P orani veren bir kimozin aktivitesine. Yukarida tartisildigi üzere - buradaki ilgili bir kimozin polipeptidin (örnegin deve, koyun, sigir vb.) amino asit pozisyonlarinin belirlenmesine yönelik bir referans sekansi olarak, burada, SEKANS KIMLIK NUMARASI:1 olarak açiklanan, kamusal olarak bilinen sigir kimozini sekansi kullanilmaktadir. Yukarida tartisildigi üzere - örnegin burada açiklanan bilgisayar sekans hizalama programlarina dayanarak - buradaki ilgili kimozin polipeptidinin (örnegin deve, koyun, sigir, Vb) ilgili amino asit pozisyonunun belirlenmesi uzman kisi için rutin kimozini) ile en az %65 sekans özdesligine sahiptir" teriminin, burada bunun ilgili bir varyantinin meydana getirilmesi için kullanilan ana kimozin polipeptidine yönelik bir sekans bazli sinirlama ile ilgili oldugu anlasilabilmektedir. Bir baska ifadeyle - matür Sigir kimozini ile en az %65 sekans özdesligine sahip olan bir matür ana kimozin polipeptidinin (örnegin koyun veya domuz), burada uygun olmasi için örnegin Sigir veya Deve kimozini ile yeterli sekilde yapisal olarak özdes olduguna inanilmaktadir - yani, mevcut baglamda, SEKANS KIMLIK NUMARASIzllin (sigir kimozini) matür polipeptidi ile en az %65 sekans özdesligine sahip olan bir matür ana kimozin polipeptidinin (örnegin koyun veya siçandan), burada açiklanan herhangi bir amino asit pozisyonunda bir varyantin meydana getirilmesi vasitasiyla gelistirilebilmesi için örnegin sigir veya deve kimozini ile yeterli sekilde yapisal olarak iliskili oldugu düsünülebilmektedir. 24946.42 SEKANS KIMLIK NUMARASIz2°nin deve kimozin polipeptidi, SEKANS KIMLIK NUMARASI:1,in sigir polipeptidi ile %84 sekans özdesligine sahiptir (yani pre ve pro sekanslarini kapsayan, pozisyon 1 ila 381 arasindaki tam SEKANS KIMLIK NUMARASI:1) Mevcut baglamda uzman kisi tarafindan anlasildigi üzere - burada kimozin aktivitesine sahip uygun bir ana polipeptit, halihazirda, örnegin karsilik gelen bir yaban tipi kimozininin örnegin bir varyanti olabilmektedir. Örnegin, SEKANS KIMLIK NUMARASIzTnin yaban tipi deve kimozin polipeptidine kiyasla örnegin 5-10 alterasyona (örnegin ikame) sahip bir deve kimozin varyanti, hala, SEKANS KIMLIK NUMARASlzlîn (Sigir) matür polipeptidi ile en az %65 sekans özdesligine sahip olan bir ana polipeptit olacaktir. Bir baska ifadeyle, burada ilgili bir izole kimozin polipeptit varyanti, örnegin buradaki birinci yöne ait pozisyonlardan farkli bir pozisyonda alterasyonlar (örnegin ikameler) içerebilmektedir. Buradaki sekil llde gösterilen kimozin sekanslariyla iliskili olarak - koyun, sigir SEKANS KIMLIK NUMARASI:1 ile %945 sekans özdesligine sahiptir; C._bactrianus, sigir SEKANS KIMLIK NUMARASLI ile %832 sekans özdesligine sahiptir; domuz, sigir SEKANS KIMLIK NUMARASI:1 ile %803 sekans özdesligine sahiptir ve siçan ise sigir SEKANS KIMLIK NUMARASI:1 ile %719 sekans özdesligine sahiptir. Mevcut baglamda uzman kisi tarafindan anlasilacagi üzere - örnegin matür koyun, C._bactrianus, deve, domuz veya siçan kimozininin, SEKANS KIMLIK NUMARASlzlsin matür polipeptidi (sigir kimozini - yani SEKANS KIMLIK NUMARASI:1"in amino asit pozisyonlari 59 ila 381) ile ilgili sekans özdesligi yüzdeleri, yukarida bahsi geçen sekans özdesligi yüzdeleri ile görece benzerdir. 24946.42 Tercih edilen varyantlar: Yukaridaki tartisildigi üzere - örnegin birinci yön bir izole kimozin polipeptit varyanti ile ilgilidir, burada alterasyon, herhangi bir pozisyon 134"e karsilik gelen en az bir amino asit pozisyonunda bir ikame, bir koparak eksilme veya bir ekleme içermektedir. En az bir alterasyonun bir ikame olmasi tercih edilebilmektedir - yani, burada uygun olan, tercih edilen bir yapilandirma, bir izole kimozin polipeptit varyanti ile ilgilidir, burada alterasyon, herhangi bir pozisyon 1349e karsilik gelen en az bir amino asit pozisyonunda bir ikame içermektedir. Tercihen, ikame 134Q,dur. Tercihen, ikame H134Q,dur. Tercih edilen bir yapilandirmada, ikame sunlardir: Kimozin aktivitesine sahip, tercih edilen ana polipeptit: Yalnizca bir örnek olarak - burada uygun olan bir ilgili ana polipeptit, örnegin sigir kimozini A olabilmektedir - teknikte bilindigi üzere, sigir kimozini A, buradaki SEKANS KIMLIK NUMARASIzlün sigir kimozini Baye kiyasla yalnizca bir amino asit farkliligina sahip olabilmektedir. 24946.42 Yukarida tartisildigi üzere - buradaki çalisma örneklerinde, ana polipeptit olarak SEKANS KIMLIK NUMARASIzlîn polipeptidi (Sigir) kullanilarak varyantlar meydana getirilmistir - bu tür varyantlar, burada, sigir kimozin varyantlari olarak adlandirilabilmektedir. Mevcut baglamda uzman kisi tarafindan anlasildigi üzere - burada kimozin aktivitesine sahip ilgili bir ana polipeptit, halihazirda, örnegin karsilik gelen bir yaban tipi kimozininin örnegin bir varyanti olabilmektedir. Örnegin, SEKANS KIMLIK NUMARASIzlhin matür yaban tipi sigir kiinozin polipeptidine kiyasla örnegin 5-10 alterasyona (örnegin ikame) sahip bir sigir kimozin varyanti, hala, SEKANS KIMLIK NUMARASlzlîn (Sigir kimozini) matür polipeptidi ile en az %95 sekans özdesligine sahip olan bir ana polipeptit olacaktir. SEKANS KIMLIK NUMARAS[:l,in (Sigir) matür polipeptidi 323 amino asit uzunlugundadir - bu baglamda, SEKANS KIMLIK NUMARASIzlîn matür yaban tipi sigir kimozin polipeptidine kiyasla örnegin 25 amino asit ikainesine sahip bir sigir kimozini varyanti, SEKANS KIMLIK NUMARASIzlain (Sigir kimozini) matür polipeptidi ile en az %95 sekans özdesligine sahip bir ana polipeptit olmayacaktir. Bir baska ifadeyle ve genel olarak - burada ilgili bir izole kimozin polipeptit varyanti, örnegin buradaki birinci yöne ait pozisyonlardan farkli pozisyonlarda alterasyonlar (örnegin ikameler) içerebilmektedir. Yukarida tartisildigi üzere - buradaki çalisma örneklerinde, ana polipeptit olarak SEKANS KIMLIK NUMARASIz27nin polipeptidi (Deve) kullanilarak varyantlar meydana getirilmistir - bu tür varyantlar, burada, deve kimozin varyanti olarak adlandirilabilmektedir. 24946.42 Bu baglamda, tercih edilen bir yapilandirmada - ana polipeptit, SEKANS KIMLIK NUMARASIz2°nin (Deve kimozini) matür polipeptidi ile en az %95 sekans özdesligine sahiptir ve daha tercihen ana polipeptit, SEKANS KIMLIK NUMARASI:2"nin (Deve kimozini) matür polipeptidi ile en az %97 sekans özdesligine sahiptir. Ana polipeptidin, SEKANS KIMLIK NUMARASI:27nin (Deve kimozini) matür polipeptidi olmasi tercih edilebilmektedir. Mevcut baglamda uzman kisi tarafindan anlasildigi üzere - SEKANS KIMLIK NUMARASI:2"nin (Deve) matür polipeptidi ile en az %90 sekans özdesligine sahip bir ana polipeptit, buradaki birinci yöne ait nokta (ii),nin sekans özdesligi gerekliligine dayanarak hala SEKANS KIMLIK NUMARASH (Sigir) içerisindedir - yani, SEKANS KIMLIK NUMARASlzlîn (sigir kimozini) matür polipeptidi ile en az %65 sekans Özdesligine sahip bir ana polipeptit olacaktir. Sigir kimozininin bir izole varyanti: Yukarida tartisildigi üzere - buradaki çalisma örneklerinde, ana polipeptit olarak SEKANS KIMLIK NUMARASITin (Sigir) polipeptidi kullanilarak varyantlar meydana getirilmistir - bu tür varyantlar burada sigir kimozin varyantlari olarak adlandirilabilmektedir. Deve kimozininin bir izole varyanti: Yukarida tartisildigi üzere - buradaki çalisma örneklerinde, ana polipeptit olarak SEKANS KIMLIK NUMARASI:2"nin polipeptidi (deve kimozini) kullanilarak varyantlar meydana getirilmistir - bu tür varyantlar, burada, deve kimozin varyanti olarak adlandirilabilmektedir. Yukarida tartisildigi üzere - bu baglamda ikinci yön, istem 5"e göre bir izole kimozin polipeptit varyanti ile ilgilidir. 24946.42 Yukarida açiklanan tanimlar ve tercih edilen yapilandirmalar bu yön için de geçerlidir. Tercihen, burada açiklandigi üzere bir izole deve kimozin polipeptit varyanti bir varyanttir, burada varyant, SEKANS KIMLIK NUMARASI:2"nin matür polipeptidini içeren deve kimozininin C/P oranina kiyasla daha yüksek bir C/P orani veren bir kimozin aktivitesine sahiptir. Tercih edilen bir yapilandirmada - ana polipeptit, SEKANS KIMLIK NUMARASI:2"nin (deve kimozini) matür polipeptidi ile en az %92 sekans özdesligine sahiptir, daha tercihen ana polipeptit, SEKANS KIMLIK NUMARASlz2"nin (deve kiinozini) matür polipeptidi ile en az %95 sekans özdesligine sahiptir ve daha tercihen ana polipeptit, SEKANS KIMLIK NUMARASIz2°nin (deve kimozini) matür polipeptidi ile en az %97 sekans özdesligine sahiptir. Mevcut baglamda, uzman kisi tarafindan anlasildigi üzere - bir izole kimozin varyanti, yukarida verilenlerden farkli amino asit pozisyonlarinda alterasyonlar (örnegin ikameler) içerebilmektedir. Örnegin, SEKANS KIMLIK NUMARASI:2"nin yaban tipi deve kimozin polipeptidine kiyasla örnegin 5-10 alterasyona (örnegin ikame) sahip bir deve kimozin varyanti, hala, SEKANS KIMLIK NUMARASI:27nin (deve kimozini) matür polipeptidi ile en az %95 sekans özdesligine sahip olan bir ana polipeptit olacaktir. Izole deve kimozin varyantinin, SEKANS KIMLIK NUMARASI:2"nin (deve kimozini) matür polipeptidine kiyasla 307dan az amino asit alterasyonu (örnegin ikame) içerinesi tercih edilebilmektedir veya izole deve kimozin varyantinin, SEKANS KIMLIK NUMARASIz23nin (deve kimozini) matür polipeptidine kiyasla 20,den az ainino asit alterasyonu (örnegin ikame) içermesi tercih 24946.42 edilebilmektedir veya izole deve kimozini varyantinin, SEKANS KIMLIK NUMARASI:2"nin (deve kimozini) matür polipeptidine kiyasla 10,dan az amino asit alterasyonu (örnegin ikame) içermesi tercih edilebilmektedir veya izole deve kimozin varyantmin, SEKANS KIMLIK NUMARASI:2°nin (deve kimozini) matür polipeptidine kiyasla 57ten az amino asit alterasyonu (örnegin ikame) içermesi tercih edilebilmektedir. Mevcut baglamda uzman kisi tarafindan anlasildigi üzere - yukaridaki nokta (iii)'ün "izole varyant polipeptit, SEKANS KIMLIK NUMARASI:2"nin (deve kimozini) matür polipeptidi ile %lOO°den az sekans özdesligine sahiptir" terimi, burada açiklanan izole deve kimozini varyantinin, elbette ki, SEKANS KIMLIK NUMARASlz2"nin kamusal olarak bilinen deve kimozinine %100 özdes olan bir polipeptit sekansina sahip olmamasi ile ilgilidir. Tercih edilen bir yapilandirma, bir izole deve kiinozin polipeptit varyanti ile ilgilidir, burada alterasyon, herhangi bir pozisyon 134,e karsilik gelen en az bir amino asit pozisyonunda bir ikame, bir koparak eksilme veya bir ekleme içennektedir. En az bir alterasyonun bir ikame olmasi tercih edilebilmektedir - yani, buradaki tercih edilen ilgili yapilandirma, bir izole kimozin polipeptit varyanti ile ilgilidir, burada alterasyon, herhangi bir pozisyon 134°e karsilik gelen en az bir amino asit pozisyonunda bir ikame içermektedir. Tercihen, ikame 134Q7dur. Tercihen, ikame H 1 34Q"dur. Tercih edilen bir yapilandirmada, ikame sunlardir: Hl34Q + L2801+ G309W; 24946.42 Bir süt bazli ürünün meydana getirilmesine yönelik yöntem Yukarida tartisildigi üzere - burada açiklandigi üzere bir izole kimozin polipeptit varyanti teknige göre, örnegin ilgili bir süt bazli ürünün (örnegin bir peynir ürünü gibi) meydana getirilmesi için kullanilabilmektedir. Yukarida tartisildigi üzere - bulusun bir yönü, bir gida veya bir yem ürününün meydana getirilmesine yönelik bir yöntem ile ilgili olup, bu, gida veya yem içerik maddelerine burada açiklandigi üzere izole kimozin polipeptit varyantinin etkili bir miktarinin ilave edilmesini ve gida veya yem ürününün elde edilmesi için ilave imalat adimlarinin gerçeklestirilmesini içermektedir. Tercihen, gida veya yem ürünü bir süt bazli üründür ve burada yöntem, süte, burada açiklandigi üzere izole kimozin polipeptit varyantimn etkili bir miktarinin ilave edilmesini ve süt bazli ürünün elde edilmesi için ilave imalat adimlarinin gerçeklestirilmesini içermektedir. Süt, örnegin soya sütü, koyun sütü, keçi sütü, bufalo sütü, öküz sütü, lama sütü, deve sütü veya inek sütü olabilmektedir. Süt bazli ürün örnegin bir fermente süt ürünü, bir kuark veya bir peynir olabilmektedir. ÖRNEKLER ÖRNEK 1: kimozin protein sekanslari ve varvant sekanslarin hizalanmasi ve numaralandirilmasi 24946.42 Kimozin protein sekanslari, EBI (EBI, aletler, çoklu sekans hizalamasi, CLUSTALW", http://Www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) tarafindan saglanan ve Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, MCWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson açiklanan ClustaIW algoritmasi kullanilarak hizalanmistir. Çoklu sekans hizalamalarina yönelik ClustalW2 ayarlari, Protein agirlik Matrisi : BLOSUM, BOSLUK açik = 10, BOSLUK UZANTISI= 0,05, BOSLUK MESAFELERI = 8, Uçsuz Bosluklar, YINELEME = yok, NUMITER = 1, KÜMELENME = NJ idi Bir referans sekansi olarak sigin kimozini B preprokiinozin kullanilmistir (Genbank erisim numarasi P00794 - burada SEKANS KIMLIK NUMARASH olarak açiklanmaktadir), burada N-terminal Metiyonin l numarasina sahiptir (MRCL ...... ) ve C-terminal Izolösin ise (...LAKAl protein sekansinda) 381 numarasina sahiptir. Varyantlar, sigir B pre- pro-kimozine karsi hizalanmistir ve kalintilar ise karsilik gelen sigir kiinozin kalintisina göre numaralaridirilmistir. ÖRNEK 2: Kimozin varyantlarinin tasarimi Kimozin varyantlari farkli stratejiler kullanilarak tasarlanmistir. Deve kimozinine isaret edildiginde, buradaki SEKANS KIMLIK NUMARASI:2°nin polipeptidini içeren deve kimozinine isaret edilmektedir. SEKANS KIMLIK NUMARASIz2,nin deve kimozini, bunun deve kimozini varyantlarinin meydana getirilmesi için kullanilan kimozin aktivitesine sahip buradaki ilgili ana polipeptit olarak görülebilmektedir. Sigir kimozinine isaret edildiginde, buradaki SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1 3in polipeptidini içeren sigir kimozinine isaret edilmektedir. 24946.42 SEKANS KIMLIK NUMARASIzl°in sigir kimozini, bunun sigir kimozini varyantlarinin meydana getirilmesi için kullanilan kimozin aktivitesine sahip buradaki ilgili ana polipeptit olarak görülebilmektedir. Deve kimozini varyantlari, sigir kimozini B,ye kiyasla %25 veya daha fazla özdeslige sahip, kamusal olarak bilinen aspartik proteaz sekanslarinin genis bir kümesine ait bir hizalamayan dayanarak tasarlanmistir. Varyasyonlar genel olarak hiper degisken bölgelerde gerçeklestirilmekteyken, muhafaza edilen bölgeler degistirilmemistir. Çoklu varyasyonlar her bir varyant yapisinda gerçeklestirilmekte olup, her bir mutasyonun, çoklu varyant yapilarinda mevcut oldugundan emin olunmustur (sonuçlara dair tartisma için - bakiniz asagidaki örnek 6). Sigir kimozini varyantlari, sigir ve deve kimozininin bir kiyaslainasina dayanarak tasarlanmistir. Sigir kalintilari, örnegin, deve muadili olarak degistirilmistir (sonuçlara dair tartisma için - bakiniz asagidaki örnek 7). ÖRNEK 3: Kimozin varvant enzimi malzemesinin preparasvonu Tüm kimozin varyantlar sentetik genler olarak sentezlenmistir ve esasen pGAMpR-C7ye karsilik gelen bir fungal ekspresyon vektöründe klonlanmistir (W002/ 3 6752A2 numarali dokümanda açiklanmaktadir). Vektörler, E. coli"ye dönüstürülmüstür ve plazmid DNA"si, teknikte uzman kisi tarafindan bilinen standart moleküler biyoloji protokolleri kullanilarak saflastirilmistir. Varyant plazmidleri, bireysel olarak bir Aspergi'llus m'ger susuna dönüstürülmüstür ve protein, esasen W002/36752A2 numarali dokümanda açiklandigi üzere üretilmistir ve standart kromatografi teknikleri kullanilarak saflastirilmistir. 24946.42 Teknikte bilindigi üzere - uzman kisi, yaygin genel bilgisine bagli sekilde, kimozin ve kimozin varyantlarini - örnegin burada açiklanan sigir ve deve kimozin varyantlarini üretebilmekte ve saflastirabilmektedir. ÖRNEK 4: Spesifik kimozin aktivitesinin belirlenmesi 4.1 Pihtilastirma aktivitesinin belirlenmesi Süt pihtilastirma aktivitesi, Uluslararasi Süt Ürünleri federasyonu tarafindan gelistirilen standart yöntem (IDF yöntemi) olan REMCAT yöntemi kullanilarak belirlenmistir Süt pihtilastirma aktivitesi, litre basina 0,5 g degerindeki bir kalsiyum klorür çözeltisi ile düsük isili, düsük yagli süt tozundan (pH ü 6,5) hazirlanan bir standart süt substratinin görünür sekilde topaklanmasi için gereken zamandan belirlenmektedir. Bir peynir mayasi nuinunesinin pihtilasma süresi, bilinen süt pihtilastirma aktivitesine sahip olan ve numune ile lDF Standard llOB bakimindan ayni enzim bilesimine sahip olan bir referans standardi ile karsilastirilmaktadir. Numuneler ve referans standartlari, özdes kimyasal ve fiziksel kosullar altinda ölçülmüstür. Varyant numuneleri, bir 84 mM asetik asit pH 5,5 tamponu kullanilarak yaklasik olarak 3 IMCU/ml"ye ayarlanmistir. Bundan sonra, 200 ;41 enzim, sabit karistirma altinda 32°C ± 1°C"lik bir sabit sicakligi koruyabilen bir su banyosu içerisine koyulan bir cam test tüpü içerisinde ml önceden isitilmis süte (32°C) ilave edilmistir. Bir peynir mayasinin toplam süt-pihtilastirma aktivitesi (dayanimi), formüle göre numune ile ayni enzim bilesimine sahip bir standarda göre ml basina Uluslararasi Süt Pihtilastirma Birimleri (IMCU) cinsinden hesaplanmistir: Sstandardi x Tstandardi x Dnumunesi Dstandardi x Tnumunesi 24946.42 Sstandardi: Peynir mayasina yönelik uluslararasi referans standardinin süt pihtilastirma aktivitesi. Tstandardi: Standart seyrelti için elde edilen, saniye cinsinden pihtilasma süresi. Dnumunesi: Numuneye yönelik seyrelti faktörü Dstandardi: Standarda yönelik seyrelti faktörü Tnumunesi: Enzimin ilave edilmesinden topaklanma süresine kadar, seyreltilmis peynir inayasi numunesi için elde edilen saniye cinsinden pihtilasma süresi 4.2 Toplam protein içeriginin belirlenmesi Toplam protein içerigi, tedarikçilerin talimatlari izlenerek, Therrno Scientifîciten Pierce BCA Protein Tahlil Kiti kullanilarak belirlenmistir. 4.3 spesifik pihtilastirma aktivitesinin hesaplanmasi Spesifik pihtilastirma aktivitesi (IMCU/mg toplam protein), pihtilastirma aktivitesinin (IMCU/ml), toplam protein içerigine (ml basina mg toplam protein) bölünmesiyle belirlenmistir. ÖRNEK 5: Proteolitik aktivitenin belirlenmesi Genel proteolitik aktivite, bir substrat olarak Iloresan isaretli Bodipy-FL kazein kullanilarak ölçülmüstür (EnzChek; Molecular Bioprobes, E6638). pH°a duyarsiz yesil-floresan Bodipy-FL ile agir sekilde isaretlenmis kazein türevleri, konjugat floresaninin neredeyse tamamen sönümlenmesi ile sonuçlanmaktadir. Proteaz katalizörlü hidroliz, floresan Bodipy-FL7yi salmaktadir. Bu yöntem oldukça hassas olup, simdiye kadar bilinen tüm koagülanlar arasinda CHYMAX M en düsük genel proteolitik aktiviteye sahip oldugu için bu hassaslik, bu deney için oldukça önemliydi. 24946.42 Tahlil, 0.04 mg/ml degerindeki bir nihai substrat konsantrasyonunda arzu edilen pH'a ayarlanan bir 0.2 M fosfat tamponu içerisinde gerçeklestirilmistir. Her ikisi de fosfat tamponu içerisinde hazirlanan 1 ölçek substratin 1 ölçek enzim ile karistirilmasindan önce, tüm enzim varyantlari 50 IMCU/ml'ye nonnalize edilmistir (Örnek 4'e göre). Substrat ve enzim, 60 dakika boyunca, 32°C7de, bir 96-kuyucuklu Nunc Floro mikrotitre plakalari içerisinde karistirilmistir, sizdirmazligi saglanmistir ve inkübe edilmistir. Inkübasyondan sonra, sizdirmazlik kaldirilmistir ve floresan, bir florimetre içerisinde kaydedilmistir. ÖRNEK 6: Deve kimozin varvantlarinin degerlendirilmesi Tüm varyantlar için, spesifik pihtilastirma aktivitesi (toplam proteinin strateji kullanilarak siraya koyulmustur. En düsük spesifik aktiviteye sahip varyant bir puan, ikinci en düsük iki puan almistir, Vb. Ayni siralama stratejisi C/P orani için de gerçeklestirilmistir. Spesifik pihtilastirma aktivitesinin (IMCU/mg) proteolitik aktiviteye bölünmesi vasitasiyla pH 6.5"te C/P orani tüm varyantlar için belirlenmistir. Her iki siralama stratejisi kullanilarak her bir varyanta yönelik toplam puanlar belirlenmistir ve puanlarin toplamina göre bir nihai siralama yapilmistir. Bir referans olarak, bir deve yaban tipi geni ve bir sigir yaban tipi geni de dahil edilmistir. 24946.42 24946.42 Tüm varyantlar çoklu mutasyonlari içerdigi için, pozitif veya negatif bir etkiye sahip olan bireysel amino asit degisimlerinin belirlenmesi amaciyla, siralanan varyantlara ait veriler, istatistik yöntemler ve 3D yapisi analizi kullanilarak daha ayrintili olarak incelenmistir. Bu incelemede, asagidaki Örnek 7°de tartisilan sigir varyantlari da degerlendirilmistir/buraya dâhil edilmistir. Asagidaki mutasyonlar tanimlanmistir: Omurga lobu Görünen lob Yarik içi Omurga Omurga Omurga R 3 7 ..1 9 _ _ Omurga K 7 8 9 '\J _ _ Diger taraftaki flep G 3 D 2 F› - - Flep Yarik Girisi i 3 5 3 K - Yarigin alti Dis taraftaki küçük lob V279M + daha pozitiftir. "-" terimi, bir negatif` amino asit degisimine isaret etmektedir - yani "--", "-"den 24946.42 daha negatiftir. Tablonun sag sütununa ait açiklamalar, sigir kimozininin 3D yapisinda bireysel mutasyonlarin nerede konumlandigi ile ilgilidir. Sigir kimozininin 3D yapisi kamusal olarak erisilebilirdir. Sekil 27de, amino asit pozisyonlari 296 ve 2947ün sigir Kimozininde mevcut oldugu bir örnek gösterilmektedir. ggikarimlar: Yukaridaki sonuçlar, deve kimozinindeki sonraki mutasyonlarin pozitif oldugunu göstermektedir (yani deve yaban tipi kimozinine kiyasla gelismis C/P oranina sahiptir): Hl34Q L28OI D156V v2411 D325M L31 11 G309W G309D V279M ÖRNEK 7: Sigir kimozin varvantlarinin degerlendirilmesi Sigir kimozin varyantlan, yalnizca pH 6.5"teki C/P oranlarina dayanarak de gerlendirilmistir. Mutasyonlar Sigir - Proteolitik/IMCU Pihtilastirma/mg 24946.42 Mutations Bovine- ProteolyticaI/IMCU CIotting/mg C/P 7 DBO7N, DBOQG 56.349 47 Sigir Yok 124.237 157 (3327) Deve Yok 53. Tüm varyantlar çoklu inutasyonlari içerdigi için, pozitif veya negatif bir etkiye sahip olan bireysel amino asit degisimlerinin belirlenmesi amaciyla, siralanan varyantlara ait veriler, istatistik yöntemler ve 3D yapisi analizi kullanilarak daha ayrintili olarak incelenmistir. Bu incelemede, Örnek 6"da tartisilan deve varyantlari da degerlendirilmistir/buraya dâhil edilmistir. Sigir kimozinine yönelik asagidaki pozitif mutasyonlar tanimlanmistir: 24946.42 daha pozitiftir. daha negatiftir. g gikarimlar: Yukaridaki sonuçlar, sigir kimozinindeki sonraki mutasyonlarin pozitif oldugunu göstermektedir (yani sigir yaban tipi kimozinine kiyasla gelismis C/P oranina sahiptir): Q300R H350N K353L Ql4lE ÖRNEK 8: Kimozinde pozitif mutasyonun meydana getirilmesine yönelik pozisyonlar Örnekler 6 ve 7ide açiklanan sonuçlarin karsilastirmali bir degerlendirmesi, asagidaki veriler ile sonuçlanmaktadir. Katalitik yarik bölgesi 279-281 Örnek 7"de gösterildigi üzere, sigir kimozinindeki çift mutasyon K279V ve V281F, C/P orani üzerinde bir negatif etki ile sonuçlanmistir. Deve kimozininde de mutasyon V279K, bir negatif sonuca yol açmistir (örnek 6). Dolayisiyla, pozisyon 281ideki optimal amino asidin bir V oldugu çikarimi yapilmaktadir. Ayrica, devede L2801 mutasyonunun pozitif bir etkisi oldugu da gözlemlenmistir. 24946.42 Küçük lob bölgesi 298-300 Örnek 7`de gösterildigi üzere, sigir kimozinindeki çift mutasyon Q298E ve Q300R, C/P orani üzerinde pozitif bir etkiye sahip olmustur. Katalitik yarik bölgesi 3 50-?) 53 Örnek 7"de gösterildigi üzere, sigir kimozinindeki üçlü mutasyon H350N, Q352E ve K353L, C/P orani üzerinde pozitif bir etkiye sahip olmustur. Deve kimozininde, bir L353Q pozitif bir etkiye sahipken, bir L353K°nin negatif bir etkiye sahip oldugu gözlemlenmistir (örnek 6). Küçük lob bölgesi 307-31 1 Örnek 7,de gösterildigi üzere, sigir kimozinindeki çift mutasyon D307N ve D309G, C/P orani üzerinde negatif bir etkiye sahip olmustur. Deve kimozininde, G309D ve G309W pozitif bir etkiye sahiptir. Bu, sigir kimozinindeki D307N mutasyonunun, negatif etkiden sorumlu oldugunu göstermektedir Deve kimozininde, bir L3llI mutasyonunun, faydali etkilere sahip oldugu gösterilmistir. Omurga bölgesi 134-143 Örnek 7"de gösterildigi üzere, sigir kimozinindeki çift mutasyon Q141E ve Il43F, C/P orani üzerinde pozitif bir etkiye sahip olmustur Deve kimozininde Hl34°ün Q olarak degistirilmesinin, faydali bir etkiye sahip oldugu gösterilmistir TR TR TR TR TR TR TR