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經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 _B7_ 五、發明説明（1 ) 本發明是有關以經穩定形式使用，貯存及運送金屬蛋 白酶之方法，且更明白地說是於含有酵素之水溶液中使用 ，運送及保存此酵素之方法。本發明也是有關經穩定的酵 素組成物。 蛋白酶可利用於食品工業及去污劑各種領域中。當蛋 白酶於水溶液或淤漿中使用時，已知由於變性之自主自溶 作用會使其喪失活性（變性如p Η，溫度等）。 近來，已發展出合成二肽甜味劑一阿斯巴甜（天冬醯 苯丙胺酸甲酯）之方法，係使用由（中性）金靥蛋白酶， 如’嗜熱菌蛋白酶# (由Daiwa Chemical Co.產生）所催 化之縮合反應（K. Oyama, Bioindustry, Vol. 2, No. 9 ,pp.5至11，1 985 )。因此，蛋白酶特別是金屬蛋白酶， 在充作工業領域肽之合成酶上變得十分重要。然而這些酵 素並不穩定，係指當酵素於水溶液或淤漿中長期使用或貯 存時。 (金屬）蛋白酶通常以粉末型式上市。粉狀酵素易形 成氣霧劑，且因此有安定性問題，因爲當其粘附至粘膜時 ，會造成喉嚨及眼睛的發炎。也會發生過敏反應。因此近 來基於其處理時之安全性，金屬（蛋白酶）以液體產物或 淤漿形式操作。然而，由於酵素本身之穩定性，此種液體 酵素或酵素淤漿在使用，運送及貯存上必須於低溫下操作 ，因此通常造成較高的費用（在低溫下貯存，降低活性等 )0 再者，當金屬蛋白酶用於N —笮氧羰基一 L —天冬胺 本^張尺度適用中國國家標準（CNS)A4规格（ 210X297公釐）_ ^ - C ---------^------1T------^ (请先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 3ϋ6932 Β7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 五、 發明説明（\ ) 1 I 酸 ( 下 示 稱 爲 Z — A S P Μ ) 及 L — 或 D L — 苯 丙 胺 酸 甲 酯 ( 下 示 稱 爲 % Ρ Μ Μ ) 間 之 偶 合 反 應 時 9 其 爲 產 生 a — L — 天 冬 胺 醯 基 — L 一 苯 丙 胺 酸 甲 酯 ( 下 示 稱 爲 % 阿 斯 1 1 巴 甜 離 或 % A P Μ 錄 ) 之 過 程 除 了 酵 素 之 穩 定 性 問 題 方 請 先 閲 1 I 面 之 外 降 低 活 性 酵 素 濃 度 方 面 也 可 由 酵 素 吸 附 在 加 成 產 讀 背 面 1 I 物 N — 苄 氧 羰 基 天 冬 胺 醯 酸 基 一 苯 丙 胺 酸 甲 酯 ( 下 文 稱 爲 1 1 1 % Z — A S P • Ρ Μ Μ ， 如 % Ζ 一 A Μ Ρ • D Ρ Μ ) 晶 事 項 1 I 再 1 I 體 上 所 致 0 填 寫 本 1 I 於 金 屬 蛋 白 酶 例 中 * 如 % 嗜 熱 菌 蛋 白 酶 Μ 9 產 生 白 熱 頁 1 1 蛋 白 水 解 芽 孢 桿 菌 ( Ba c i 11 U S t he Γ ΙΏ ο ρ r 0 t e ο 1 γ t i c U S R 〇 - 1 I kk 0 ) 9 以 其 溶 液 或 淤 漿 形 式 貯 存 或 使 用 9 已 知 某 濃 度 之 1 I 鈣 離 子 若 不 存 在 時 酵 素 會 快 速 失 活 0 妖 而 於 鈣 離 子 存 在 1 訂 1 例 中 於 管 線 及 桶 中 各 部 份 形 成 碳 酸 鈣 將 會 造 成 鈣 離 子 片 1 1 落 情 形 9 此 通 常 對 酵 素 實 際 使 用 造 成 顯 著 有 害 影 響 0 1 1 本 發 明 欲 達 到 的 巨 的 是 提 供 使 用 9 貯 存 及 運 送 金 屬 蛋 1 I 白 酶 或 類 似 蛋 白 酶 之 方 法 ， 呈 經 穩 定 形 式 -frn·. m 逐 漸 變 多 9 以 線 I 及 提 出 此 種 經 穩 定 之 酵 素 組 成 物 0 1 1 I 本 發 明 進 一 步 要 達 到 的 是 改 進 回 收 比 率 之 方 法 > 其 可 . 1 1 由 遏 止 酵 素 在 反 應 產 物 晶 體 上 再 吸 附 而 成 ( 晶 體 Z — 1 L A S P ( D ) Ρ Μ ) 0 1 1 依 據 本 發 明 Ν — 經 保 護 胺 基 酸 ( 下 文 稱 爲 % 1 I N P A A /ψ ) 之 存 在 或 加 入 對 於 避 免 金 屬 蛋 白 酶 之 失 去 活 1 I 性 而 Η 是 有 效 的 尤 其 是 可 顯 著 地 改 善 酵 素 之 熱 穩 定 性 及 1 1 貯 存 穗 定 性 0 特 別 地 9 頃 發 現 N — 苄 氧 羰 基 一 胺 基 酸 ( 下 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公嫠）-5 - 經濟部中央揉準局負工消費合作社印裂 A7 __B7 五、發明説明（3 ) 文稱爲％NZAA")之作用是値得注意的。此外，依據 本發明，經由NPAA之存在或加入，即使在過量鈣離子 不存在下，金屬蛋白酶酵素仍可顯著地被穩定。因此本發 明目的可達成，其中在含有蛋白酶之水溶液或淤漿中存在 或加入N-經保護之胺基酸。 此外，在淤漿存在下由於搅拌使金屬蛋白酶酵素失去 活性，也可因NPAA之存在或加入而顯著地抑制住，此 爲另一特色。 再者，依據本發明金屬蛋白酶可顯著地被穩定，且當 用於Z— As p及PM間之偶合反應中時，由於NPAA 之存在酵素之回收率顯著地改善。 特言之，本發明在NPAA存在下可有益地用於貯存 或處理金屬蛋白酶溶液或淤漿，或在胺基酸之酵素偶合中 利用此穩定效應，尤其在阿斯巴甜之製備中。依據本發明 ，金靥蛋白酶之貯存穩定性及回收率可因少量N P AA而 顯著地改進。因此，在貯存中這些酵素活性的減低極小， 如此不但長期使用或貯存此酵素變爲可能，也可達到金屬 蛋白酶回收率之改進。在操作昂貴酵素時此點尤具經濟益 處。 下文中本發明將詳細說明。 欲爲本發明方法處理之金屬蛋白酶並未特別界定，但 如嗜熱菌蛋白酶一類之（中性）蛋白酶尤其可有效地影響 。至於金饜蛋白酶，參考可見如，由蛋白水解芽孢桿菌（ B. proteolyticus)，或嗜熱脂肪芽孢桿菌（B. stearo- 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐）-6 _ ~ C ----------^------1T------0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本) A7 B7 五、發明説明（4 ) thermophilus)所產生者，或由其基因在其他宿主中表現 而產生。可用於本發明之酵素溶液或淤漿，可爲含有許多 不純物之粗製者，或經純化之形式。 欲用於本發明方法中，充作穩定添加物之NPAA可 呈塩形式，如NPAA之鈉塩或呈NPAA晶體形式。若 欲求時也可使用含有各種NPAA之溶液或淤漿，或含各 種NPAA之混合物。總之，NPAA並未特別界定。由 N P AA造成之影響並不因存在有有機物質，如其他的胺 基酸或無機物質而什麼都更糟。 在NPAA中之AA可爲所有天然的L —胺基酸，D —胺基酸也可：AA之酸基也可呈酯基型式，如笮基酯。 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 (竣先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 至於N PAA之N —經保護，適合的有如：苄氧羰基 (Z )，第三丁氧羰基（BOC)，甲醯基（F)，對位 —甲氧基苄氧羰基（pMZ)。特別的頃發現，苄氧羰基 保護之胺基酸（ZAA)可呈現極佳的穩定效應。在 NPAA存在時酵素保留百分率應高至9 0 %以上，而不 存在時，約3 2 %，在5 0 °C條件下貯存5小時。 NPAA之實例，可提及的有N —笮氧羰基—L 一天冬胺 酸（也稱爲Z— Asp)，其中胺基酸是L 一天冬胺酸， N_苄氧羰基一L_穀胺酸（下文稱爲Z_G 1 u )，其 中胺基酸是L —穀胺酸，N —苄氧羰基一 L 一苯丙胺酸（ 下文稱爲Z — Phe)，其中胺基酸是苯丙胺酸，及N_ 笮氧羰基甘胺酸（下文稱爲Z-G 1 y )其中胺基酸是甘 胺酸。 本紙张尺度適用中國國家標率（CNS ) A4规格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 A7 B7_ 五、發明説明（5 ) 若系統中無過置的鈣離子，在NPAA缺乏下，於 4 OX及5小時貯存條件下酵素保留百分率爲約4 4%° 然而在相同系統中，加入NPAA，則金屬蛋白酶之失活 會被顯著地抑制。特言之，當加NPAA至系統中，幾乎 不發生蛋白酶之失活作用。結果顯示，金屬蛋白酶溶液在 貯存中極爲穩定，或可用於室溫以上歷長時期，此因 NPAA之存在之故。因此，加入NPAA在昂貴酵素之 處理及操作上極具經濟利益。依據本發明，即使在過量鈣 離子不存在下，金屬蛋白酶在處理操作中也十分穗定。因 此，本發明在避免因鈣離子造成之麻煩上，如片落，也極 具好處。 應注意到，在J P — A— 6 2 2 6 9 8 9中提及充作 去污劑之鹼蛋白酶之穩定化作用，係加入特異量之可逆的 抑制劑如抑糜蛋白酶素或Z — Ph e。然而本發明已觀察 到，添加NPAA至其他蛋白酶，如木瓜蛋白酶，胰凝乳 蛋白酶或枯草桿菌素（全部均非金屬蛋白酶），其依技藝 之陳述可用於酵素性APM-合成中，對於酵素並不會造 成任何顯著的穩定化作用。 再者，當金屬蛋白酶用於Z— As p及PM間之偶合 反應時，由於酵素水溶液或淤漿中存在有NPAA，則降 低的酵素回收率可有極大改善。 依據本發明，存在於金屬蛋白酶水溶液或淤漿中以供 酵素貯存及運送之N P AA之莫耳濃度，因爲該酵素之 3 0倍以上，較好是5 0倍以上。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 一 C 裝 訂 線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 306932 ____B7 五、發明説明（6 ) 另一方面，當金屬蛋白酶用於Z — A s p及PM間之 (靖先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 偶合反應，且以Z — As p爲NPAA時，則於偶合反應 之後存在於水溶液或淤漿中之Z _A s p莫耳澳度應爲該 酵素的5 0 0倍以上，且較好是1 0 0 0倍以上。一般而 言此表示Z— As p之濃度應爲1 5毫莫耳/升以上，較 好是3 0毫莫耳/升以上。 於Z— A s p及PM間之偶合反應中，當酵素水溶液 或淤漿中存在之Z - As p濃度於偶合反應後爲5 0毫莫 耳/升（爲酵素濃度之1 7 2 4倍莫耳濃度），則酵素之 回收率約爲9 0%。 另一方面，當偶合反應後Z _A s p在酵素水溶液或 淤漿中之濃度爲1 0毫莫耳/升（酵素濃度的3 4 5倍莫 耳濃度），則酵素之回收率僅約50%。 如上述，由於酵素水溶液或淤漿中NPAA之存在， 金屬蛋白酶可被顯著地穗定，且當酵素用於Z — A s p及 PM間之偶合反應時，由於NPAA存在於該酵素之水溶 液或淤漿中，則酵素之回收率也可顯著地改進。 經濟部中央標準局貝工消費合作衽印製 於產製阿斯巴甜之偶合反應中使用金屬蛋白酶，若N —經保護之胺基酸，如Z - A s p之莫耳澳度維持在酵素 的5 0 0倍以上時，則其產製也可有大的改進，此係於偶 合反應之中及/或在最後階段，將N —經保護的胺基酸加 至偶合反應系之中。 接下來，本發明經由實例將更詳細說明，然而實例僅 爲說明不欲限制本發明之範圍。 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4规格（210X297公釐） A7 B7 五、發明説明（7 ) 窗例1 5克粉狀Thermoase (粗製的嗜熱菌蛋白酶，爲Dai-wa Chemical Co.之商品名；純度約2 0%)懸浮於含有 CaC52-2H2〇(6. 8毫莫耳/升）之1升水中（

Thermoase濃度爲〇 . 〇 2 9毫莫耳/升），且加入z — As p直到達到所決定之濃度（2 . 6 2毫莫耳/升或 24_ 7毫莫耳/升，或換言之分別有酵素澳度9〇及 850倍之莫耳濃度），生成溶液之pH値加1N N a OH水溶液使調至5 . 0。於測試酵素保留百分率時 (即，活性酵素浪度），酵素溶液置於2升的可分離燒瓶 中，溫度約7 0 °C及2 4 0 r p m之攬拌控制條件。在固 定間隔時間下取樣，再測出各樣品中留下的酵素含量，利 用HPLC進行（高壓液相層析）。結果示於表1。 (諳•先閲讀背面之注意ί項再填寫本頁) 裝·

、1T

C 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格（ 210X297公釐）— A7 S〇69S2 B7 五、發明説明（8 ) 表1 酵素之保留百分率（％) 時間 (小時） 未加入 Z - A s p (2.62毫莫耳/升） Z - A s p (24.7毫莫耳/升） 0 100 100 100 1 68 91 91 2 53 86 87 3 47 83 87 4 39 80 83 5 35 74 78 7 31 73 74 由上表1知， 酵素於Z _A s p之加入有顯著地穩定 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 實例2 於1 0 0毫升含有0 · 0 2 9毫莫耳/升粉狀Thermo ase (粗製的嗜熱菌蛋白酶，Daiwa Chemical Co.之商品 名，純度約2 0%)，及10毫莫耳/升CaC52之水 ，逐漸加入NPAA直到達決定濃度爲止（1〇毫莫耳/ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4规格（210X297公釐）-u A7 B7 五、發明説明（9 ) 升），並逐漸加入〇 . 1 N N a Ο Η水溶液，p Η値則 控以 度並 溫， Arc , 樣 中取 浴下 水間 於時 置隔 液間 溶定 素固 酵於 之再 備液 製溶 此素 如酵 ο 〇 ο 下 • OC 6 ο 至 7 整在 調制 2 表 下 於 示 果 結 〇 量 含 素 酵 的 下 留 中 品 樣 各 定 決 C L ρ ο Η 中 (靖先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 *1Τ 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐） 12 A7 B7 五、發明説明（10 ) 表2 N-經保護 酵素之保留百分率U) 之胺基酸 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (NPAA) 0小時 2小時 5小時 未加入 100 54 32 Z - A s p 100 89 75 Z-Asp-OBz 1 (* ) 100 101 92 Z-G 1 u 100 101 88 Z-Phe 100 95 85 Z-G 1 y 100 88 68 B 0 C - A s p 100 82 50 BOC-G 1 u 100 89 59 BOC- Phe 100 88 53 BOC-G 1 y 100 76 40 BOC-Cys-SBz 1 (* ) 100 86 55 p Μ Z - A s p 100 78 42 p Μ Z - G 1 u 100 78 40 F-Asp-OBz 1 (') 100 71 48 Γ ) Bz 1 :苄酯 C ---------¢------1T------# (請·先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公嫠）_ 13 Α7 Β7 五、發明説明（11 ) 如上表2所示，酵素加入NPAA可被顯著地穗定性 ，尤其是 NPAA (Z— Asp，Z— Asp — OBz 1 ’Z— Glu，Z_Phe 及 Z— Gly) 〇 實例3 ： 5克粉狀Thermoase溶於含有C a C芡2 — 2 H2〇 (CaCj?2濃度=0 . 6毫莫耳/升）或含Z - As p (Z— Asp澳度=3 0毫莫耳/升）之1升水中，其中 各自的Therm oase澳度爲0 . 0 2 9毫莫耳/升，且生成 溶液之pH値以IN NaOH水溶液調至6. 0。酵素 溶液置2升可分離燒瓶中，並控制在4 0。(：及2 0 0 r P m搅拌下。 在固間隔時間下取樣，並以Η P L C偵測各樣品中留 下的酵素含量。所得結果示於表3中。 ----------^.------1Τ------^ (請先閲讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁) 經濟部中央梂準局負工消費合作杜印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4规格（2丨0乂297公釐）- A7 B7 五、發明説明（l2 ) 表3 時間（小時） 水 酵素保留百分率（¾) C a C 5 2 水溶液 Z-Asp 0 100 100 100 0 . 5 84 100 106 1 73 104 105 2 63 102 101 3 57 104 104 4 52 101 104 5 - 97 104 6 47 98 101 裝 訂 線 (靖先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貞工消費合作社印製 表3的實驗顯示加入Z-Asp與使用0. 6毫莫耳 /升CaCj?2溶液一樣有效；若無過多Ca 2 +則片落情 況少有。 由上表3中可見，由於Z — As p之加入酵素被顯著 地穩定，其爲NPAA之一，即使在無過量鈣離子下亦然 〇 實例4 : 本紙張尺度適用中國國家橾準（〇奶）入4規格（2】0乂297公釐）_15_ A7 306932 B7 五、發明説明（13 ) 加NPAA至1 0 0毫升含有〇 · 0 2 9毫莫耳/升 粉狀Thermoase之水溶液中（無過量的C a )，直到達到 決定濃度爲止（10毫莫耳/升），如同實例2般，酵素 之pH値調至6。將其置水浴中，並控制在4 0°C下。 在固定間隔時間下取樣，且留下的酵素量以HP LC 偵測。所得結果示於下表4下。 (請先Μ讀背面之注意事項存填寫本萸)

C 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > Α4规格（210Χ297公釐）_

A7 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7 五、發明説明（l4 ) 表4 N-經保護 酵素之保留百分率U) 之胺基酸 (NPAA) 0小時 2小時 5小 未加入 100 54 44 Z - A s p 100 97 95 Z-Asp-OBzl(') 100 94 98 Z-G 1 u 100 101 104 Z-Phe 100 98 103 Z-G 1 y 100 88 89 B 0 C - A s p 100 63 50 BOC-G 1 u 100 89 70 BOC-Phe 100 92 83 BOC-G 1 y 100 89 74 BOC-Cys-SBz 1 Γ ) 100 93 79 p Μ Z - A s p 100 77 60 pMZ-G 1 u 100 89 70 F-Asp-OBz 1 (* ) 100 74 38 Γ ) Bz 1 :笮酯 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）_ 17 _ C 裝 訂 線 (請•先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 __B7_ 五、發明説明（15 ) 如上表4所示，由於加入NPAA酵素可被顯著地穩 OBzl ，Z— Glu，Z — Phe 及 Z— Gly) 0 實例5 : 5克粉狀Thermoase (純度的2 0%)懸浮於7 5 0 克含有0. l%CaCj?2 · 2H2〇 之水中，並置2升 可分離燒瓶中，再加入2 5 0克Celite (由Johns Manvi-11 Corp.，Grade.產生，級數：標準的Super-Cel )，以 形成均勻的淤漿。將其控制在4 0 °C下，且Thermoase濃 度爲0_ 029毫莫耳/升。 此中加入Z —As ρ直到達到決定濃度爲止（3 0毫 莫耳/升），再以IN NaOH水溶液調至pH7. 3 。將其以裝置有馬達之攪拌器，以2 4 0 r pm速率搅祥 ，並在固定間隔下取樣。再以HP LC決定各樣品中酵素 之保留百分率。結果示於下表5中。 C I I II —裝 I I I 訂 I 線 (靖先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾率局貝工消費合作杜印製 本紙張尺度適用中國國家標準（〇奶）八4规格（2丨0乂297公釐）_18 306932 五、發明説明（16 ) A7 B7 表5 時間 酵素之保留百分率（¾) Z-Asp未加 Z-Asp(30毫莫耳/升） 0 100 100 1 85 95 3 70 88 5 60 85 7 55 79 ---------^— {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由上表5知，在淤漿中會受影響及失去活性之酵素， 因爲加入Z— As p被顯著地穗定。 啻例6 : 5 克粉末蛋白酶 TD (Amano Pharmaceutical Co.產 品；由嗜熱脂肪芽孢桿菌之金屬蛋白酶，純度約2 0%) 懸浮於1升含有〇· l%CaCi?2 — 2H2〇 之水中， 蛋白酶TD之濃度爲0_ 029毫莫耳/升。加入Z—

As P直到達到決定澳度（1 〇毫莫耳/升），其再以1 N NaOH水溶液調至ΡΗ5· 0。生成的溶液置於2 升可分離燒瓶中，並控制在7 0°C及2 4 0 r pm攪拌下 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（2丨0 X 297公釐）-i 9 線 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 經濟部中央揉準局貝工消費合作社印製 A7 ________B7_ 五、發明説明（Π ) 。在一定間隔下取樣，且以HP LC決定各樣品中留下的 酵素含置，結果示於下表6中。 表6 時間 Z 酵素之保留百分率（¾) -Asp未加 Z-Asp(30毫莫耳/升） 0 100 100 1 84 . 5 97 . 4 2 71.9 95 . 5 3 62 . 9 93.6 4 53 . 4 91.6 5 45.5 92.1 7 36 . 0 86.6 如上表6所見 ，酵素由於Z 一 A s p之加入而顯著地 被穩定。 實例7 9 4 3克Z-As p水溶液（Z— As P之量爲 1 · 0莫耳）及1 2 5 8克DL — PM水溶液（PM之置 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4规格（ 210X297公釐）_ - (靖先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂

C 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 ____ B7_ 五、發明説明（18 ) 爲2 . 〇莫耳）混合，加熱至4 0。(：，且水溶液利用2 5 %N a 0H溶液調p Η値，再以此溶液爲受質溶液。 另外，1. 28 克的 CaC^2— 2Η2〇 及 127 克N a C ί溶於1 2 4 2克純水中，且4 5克Thermoase 溶於此水溶液中，此水溶液充作酵素之水溶液。 受質溶液及水溶液混合於可分離的5升燒瓶中，其再 放置於4 0 °C水浴內，並調整pH至6. 0，再開始Z — A s p及PM間之偶合反應。 丁}^1"111(^56之濃度如先前實例般爲〇.〇2 9毫莫耳 /升。 以1 3 0 r pm之搅拌速率進行混合溶液之撹拌，直 到偶合反應開開始後3 _ 5小時，並以3 0 r pm搅拌速 率進行3 . 5至7小時。 以Z — Asp含量計之Z— Asp · (D) PM之產 率於7小時後爲8 0 · 5 %，且偶合反應後留下的Z —

Asp濃度爲55. 9毫莫耳/升。 偶合反應後回收之Thermoase爲4 1 . 4克，且回收 率約爲9 2 %。 比較實例1 混合9 4 3克的Z— As ρ水溶液（Z —As P之量 爲1 . 0莫耳）及1 5 7 2克DL — PM水溶液（PM含 量爲2. 5莫耳），加溫至4 0 °C，且水溶液由2 5% N a OH溶液調整p Η値後製成，並以此溫度爲受質溶液 本紙張尺度適用中1|困家榡窣（CNS ) Μ说格（210 X 297公釐 )-21- C ---------1------,*τ------^ (靖先閲讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁) 306932 A7 B7_ 五、發明説明（19 ) Ο 另外，1. 28 克 CaC^2-2H2C)及 127 克

NaCJ?溶於1 2 4 2克純水中，4 5克thermoase溶於 此水溶液中，此水溶液並充作酵素之水溶液。 在此比較實例中，較高於實例7之PM量造成偶合後 留下較少的Z — As p。可看出此造成thermoase回收率 顯著地減少。 受質溶液及水溶液混合於5升可分離之燒瓶中，其再 置4 0°C水浴中，並調pH値至6. 0，才開始Z —

As p及PM間之偶合反應。 以1 3 0 r pm進行混合溶液之搅拌，直到偶合反應 後3 · 5小時爲止，再以3 0 r p m速率進行3 . 5小時 至7小時。 以Z— Asp起始量計，在7天後之Z— Asp·( D)PM產率爲95. 2%，且偶合反應後留下的Z_ A s p浪度爲1 0 . 5毫莫耳/升。 於偶合反應後回收之thermoase爲1 9 · 5克，回收 率爲約4 4 %。 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS > M规格（2丨0><297公釐）_ ---------批衣------，玎------^ (对先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製

Claims (1)

1. A8 B8 C8 D8

   第8 3 1 0 7 6 2 0號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 306932 t、申請專利範圍 附件（A ): 年月3修正 85. 8.27 補充 民國85年彳月修正 1 .—種於使用，保存及運送類似嗜熱菌蛋白酶之（ 中性）金屬蛋白酶時，安定該類似嗜熱菌蛋白酶之（中性 )金屬蛋白酶的方法，其特徵係在於在含有該蛋白酶之水 溶液或淤漿中，存有或加入N -經保護之胺基酸，該N-經保護之胺基酸係選自笮基氧羰基 甲醯一或對一甲氧基笮基氧羰基一 2 .如申請專利範圍第1項之 使用，保存及運送該嗜熱菌蛋白酶 時，該N —經保護之胺基酸是N_ 3 .如申請專利範圍第1或2 於在使用，保存及運送該嗜熱菌蛋 白酶時，該類似嗜熱菌蛋白酶之（ 酶（Thermoase)或蛋白酶TD 。 4 .如申請專利範圍第1至3 特徵係在於在保存及運送該類似嗜 金靨蛋白酶時，該N —經保護之胺 之3 0倍以上。 5 .如申請專利範圍第1至3 特徵係在於在使用該類似嗜熱菌蛋 白酶時，該N -經保護之胺基酸的莫耳濃度爲該酶 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐」 「，裝 訂' ! - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，特丁基氧羰基一， 保護之胺基酸。 方法’其特徵係在於在 之（中性）金屬蛋白酶 笮基氧羰基胺基酸。 項之方法，其特徵係在 白酶之（中性）金屬蛋 中性）金屬蛋白酶是熱 項中任~項之方法，其 熱困蛋白酶之（中性） 基酸的莫耳濃度爲該酶 項中任〜項之方法，其 白酶之（中性）金屬蛋 經濟部中央標芈局員工消費合作社印製 306932 Α8 Β8 C8 D8 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 々、申請專利範圍 5 0 0倍以上。 6 .如申請專利範圍第5項之方法，其特徵係在於在 使用該類似嗜熱菌蛋白酶之（中性）金饜蛋白酶時’該酶 係用於N -經保護之胺基酸與胺基酸酯之偶合反應中。 7 ·如申請專利範圍第6項之方法，其特徵係在於在 使用該類似嗜熱菌蛋白酶之（中性）金屬蛋白酶時，該N 一經保護的胺基酸之莫耳濃度維持在該酶之5 0 G倍以上 ，其係藉由於偶合反應中及/或其最終階段，加入該Ν — 經保護之胺基酸至該偶合反應系統中。 8 .如申請專利範圍第6或7項之方法，其特徵係在 於在使用該類似嗜熱菌蛋白酶之（中性）金屬蛋白酶時， 該酶係用於Ν -笮基氧羰基天冬胺酸與苯丙胺酸甲酯之偶 合反應中。 9 . 一種用於保存或運送類似嗜熱菌蛋白酶之（中性 )金屬蛋白酶的安定水性類似嗜熱菌蛋白酶之（中性）金 屬蛋白酶的組成物，其係包含類似嗜熱菌蛋白酶之（中性 )金屬蛋白酶及Ν -經保護之胺基酸，該Ν -經保護之胺 基酸係與該類似嗜熱菌蛋白酶之（中性）金屬蛋白酶相偶 合，其中該Ν-經保護之胺基酸係選自笮基氧羰基一，特 丁基氧羰基-，甲醯一或對一甲氧基笮基氧羰基—保護之 胺基酸，且該Ν -經保護之胺基酸的莫耳濃度爲該金屬蛋 白酶之3 0倍以上。 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐」 裝 Ί I y (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)