TWI277652B - Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens - Google Patents

Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens Download PDF

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TWI277652B
TWI277652B TW089127378A TW89127378A TWI277652B TW I277652 B TWI277652 B TW I277652B TW 089127378 A TW089127378 A TW 089127378A TW 89127378 A TW89127378 A TW 89127378A TW I277652 B TWI277652 B TW I277652B
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Description

1277652 五、發明說明（1) 政府補助 政府對屬於國立健康部之國立癌症局計劃編號R 0 1 C A 7 1 7 1 6的本發明具有某些權利。 發明範疇 本發明係關於自生物組織樣品中純化RNA，DNA及蛋白質 之方法。 背景 測定 要的， 可測定 法。 例如 酵素， 苷磷酸 的路徑 酶為化 組織中基因表現程度對精確診斷人體疾病是相當重 且逐漸-地用於決定病患治療過程。藥學基因學方法 出病患似有反應之特定藥劑，並開發出新治療方 ，胸脊酸合成酶 其可將去氧尿苷 (dTMP )，並且 (強斯頓（John 學治療藥劑的標 5-氟尿嘧啶（5-FU)， 單一噤劑，其主 乳癌的 胸嘴σ定 在原 ，1 995 曼（Le 含量減少，最後 發性腫瘤（強斯 )及移轉（福祿 ichmann)等人 (TS )為DNA生合成時不可或缺的 磷酸（dUMP )還原曱基化成去氧胸 是細胞内哺°定核脊酸唯一重新合成 ston)等人·，1 9 95 )。胸脊酸合成 的物，最常使用者為抗葉酸藥劑 5 - F U為最有效治療結腸，頭及頸與 要作用是抑制T S活性，致使細胞内 導致細胞死亡。 頓等人，1 9 9 5 ;林吉（Lenz )等人 吉（Farrugia)等人，1997 ;林許 ，1 9 9 7 )之臨床腫瘤樣品發現T S的
第4頁 1277652 ____________ 五、發明I兒日月⑵ 表現相當的不同，例如，在結直腸癌中，腫瘤組織@ 與正常腸胃黏膜組織之TS表現比例範圍自2至1 0 (阿德蘭 (Ardalan)及蔡格（Zang) ，1 9 96 ) ° 胸苔酸合成酶在腫瘤抗性的發展過程中亦有臨床上的重 要性，研究證明贅生細胞暴露於5 _ F u後’顯示T s蛋白急速 的誘發，且TS酵素含量增加（絲皮爾（Spears )等人’
1 9 8 2 ;絲瓦恩（Swa i η )等人，1 9 8 9 )。腫瘤對細胞毒性 藥劑（例如5 _ F U )反應後急速過度表現TS在氟尿嘧啶抗性 發展過程可能扮演重要的角色。先前的研究已證明TSf白 的含量與5-FU療效成正比，換言之，蛋白質與RNA表現成 正比（捷克曼（Jackman)等人，1985)，且TS的表現在 結直腸癌與乳癌是個強而有利的預測標記（捷克曼等人， 1985 ;何立可許（Horikoshi )等人，1992 )。 在進展性移轉疾病中，可預期具高含量TS mRNA (以 RT-PCR定量）及高度TS蛋白表現之結直腸癌（強斯頓等人 ，1995 ;福祿吉等人，1997，Lei chm a η 等人，1 9 9 7 )，胃 癌（Lenz等人，1995 ;亞歷山大等人，1995)，及頭與頸 癌（強斯頓等人’1997)患者對以氣哺咬為基礎之療法呈 現較差的反應。當TS表現低時，可能是對藥劑有反應者或 無反應者，f但若TS含量高於平均值之病患則通常係為無反 應者，假若與其他分子特性（諸如二氫嘴淀去氫酶（DPD) 及胸苷磷酸酶（TP )表現，複製錯誤正向（RER+ )狀態 (奇晴司（Kitchens)及貝格（Berger)1997)，及p 53 狀態（Lenz等人，1997 ) —起評斷，則可進一步增強以過
1277652 五、發明說明（3) 〜 度表現的預測價值。目前自人體腫瘤表現TS研究推滴丨， 測人體腫瘤中TS表現反應及結果可於將來提供病患^Ts = 關療法的優點。 ~ # 直至目前，包括這些TS表現之定量組織基因表現研 限於自冷凍組織中萃取出RNA之反轉錄聚合酶鏈結反廉 w (R T - P C R ) ’然而’大多數病理樣品並非為冷；東組織，
是以福馬林固定，及以石臘包埋（FFPE )，以便作為組镞 分析及原樣保存之用◊利用免疫組織化學染色法監^ ^白 表現程度可半定量，並間接方式監視此類固定化及包埋樣 品中之基因表現程度。因為石臘包埋樣品是廣泛使用之·方 式，故快速及可靠的自此類樣品中分離核酸（特別是rna) 之方法是必須的。 目前有一些自生物樣品中純化RNA的技術，但這些技術 均非為自FFPE樣品中分離RNA的可靠技術，例如周姆塞斯 基（(：11〇11^271131^).(美國專利申請案5,346,994號）揭示 利用酚及異硫氰酸胍之液相分離技術自組織中純化R N A的 方法，生物樣品置於酚及異硫氰酸胍之液態溶液中均質化 ’而後將均質物與氣仿混合，經過離心作用後，均質物分 散至有機相’雙相界面及水相中，蛋白質在有機相， 在雙相界面f，而R N A在水相，自水相中將R N A沉殿出來，此 方法並不是自福馬林固定石服包埋組織樣品分離r N A之可 靠方法。 其他已知分離RNA的技術主要是利用胍鹽或酚萃取作用 ’例如山姆布魯克（Sambrook)，J·等人，（1989)7.3-
第6頁 1277652 五、發明說明（4) 一 7· 24及歐斯貝爾（Ausubel )，F 4·4·7中所述。然而，這些已知方 ( 1 9 9 4 ) 4.0.3 - 中分離RNA時，並不能產生重 石臘包埋組織樣品 對研究腫瘤組織中基因表現而/ ^的結果。 離技術特別是有需要的，某/、/_自石臘包埋組織中分 可顯示^特定治療的成功與否'二文體或酵素的表現程度 、正疋罝TS基因表現研究偈限於 經由免疫組織化學染色方法可丰j =凍組織之RT-PCR，而 樣病理物質中之TS蛋白表現，因1置監測固定於玻璃片原 分離RNA的技術，測定此樣品 為雙限於原樣病理物質—中 未可行。 —_ I因表現量的定量技術尚 摘要 本發明一個主旨是提供自生物 DNA或蛋白質之可靠·方法，本發物明且亦織樣品中分離出MA， 組織中分離出R N A，D N A或蛋白曾砧^ 供自包埋於石蠟之 方法。 、'簡單’有效及重複性之 本發明所提供自生物組織樣品 樣品置於約50至約100。(：含有效濃产fNA的方法，係將 agent )溶劑中，約5至約12〇分鐘，壞劑（chaotropic ，該破壞劑為胍鹽化合物，而後自中一個具體實例中 如可以氣仿萃取作用回收RNA而後自該溶液中回收RNA，例 在^ Ϊ ΐ明一個方法中，RNA係自原樣病理樣品中分離， 體實例中’石蠟包埋樣品首先要進行去石蠟作用
第7頁 1277652 五、發明說明（5) ------: 佳：壤化的樣品樣較 脫水，合適的低碳數醇類包括甲醇，乙醇，丙J，及丁醇 。在：個ί體實例中，以濃度漸減之低碳數醇類溶液連續 清洗去石蠟化樣品，以進行脫水，在另一= 中嘖 樣品可同時進行去石蠟化及脫水。 /、 利用5械化，：”均質方法，將去石蠟化樣品均 質化爸i:,具體m ’脫水樣品置於含有破壞劑諸如 硫代氰酸脈（亦以異硫氰酸胍之名販售）之溶液中均質 化0 〜 均質化樣品-於破壞性溶液（内含有效
Ki:50;:1 二νΛ—個具體實例中，破壞^ 鹽化合物，較佳的破壞劑為硫代氰酸胍。 而後，例如，利用酚氣仿萃取作用， /刀子大小筛選層析法自溶液中回收rna離交換層析法或 而後’利用萃取作用，電泳，爲祕 適工之，術進_步純化RNA /層析法，沉殿作用或其他 術 庫 ，包括：ί ί : ί ί 應用於一些分子生物學的技 。，用逢機引子進仃之反轉錄作用，以提供。^ 矛j用反轉餘 RNa可剛定福彔作用聚合酶鏈結反應（RT_pcr )，純化之 。利用適當馬林固定石蠟包埋組織樣品中基因表現程度 現程度，a Mr引子’以本發明方法可測定任何a表 疋量RT-PCR技術可比較在相同樣品中，石喂包埋
$ 8頁 1277652 五、發明說明（6) (經由免疫組織化學）組織中蛋白質表現程度及基因表現 程度（利用RT-PCR )。 … 本發明方法可廣泛應用於組織及腫瘤類型與標的基因上 ，因此可用以評估治療方法，以作為各式癌症的診斷工具 ，包括乳癌，頭與頸部癌症，食道癌，結直腸癌，及其他 癌症。本發明方法特別佳的基因為胸苷酸合成酶基因。本 發明方法可重複性定量在FFPE組織中TS基因表現（與冷凍 組織比較）。 圖形簡要說明 圖1顯示不-同加熱時間時冷-肌動蛋白及TS表現程度，這 些數據顯示沒有加熱步驟時，自石臘中萃取的RNA量最 〇 圖2顯示利用95 °C處理0至40分鐘萃取之RNA進行定量PCR ，在正常組織（N ) ·或結直腸癌病患的腫瘤組織（T )中所 測定之/5 -肌動蛋白及T S表現程度，這些數據推測3 0分鐘 為最佳的加熱時間。 圖3顯示溫度與時間對/3-肌動蛋白RNA的產量及分離DNA 的效果，這些數據顯示較長的加熱時間（介於6 0至1 2 0分 鐘間）時，RNA會進行分解作用，同時會使產生DNA PCR訊 號之污染D N A含量增加。柱狀圖為所示的不同時間點及溫 度時三次的實驗的數值。 圖4顯示不同加熱溶液對分離R N A產量的效果，這些數據 顯示溶液中的破壞成分（此例為異硫氰酸胍（G I T C ))為
第9頁 1277652 五、發明說明（7) RNA萃取溶液中所必要的成分，缺乏該成分，則萃取RNA的 產量至少低1 〇倍。 圖5比較在不同6種細胞株經石臘包埋（白色柱狀圖）及 冷凍細胞沉澱物（黑色柱狀圖）的相對TS基因表現程度’ 這些數據顯示石臘萃取RNA分析法$可靠地反應出新鮮冷 凍組織中基因表現數值。 圖6係比較福馬林因定及石臘包埋或冷凍之正常或腫瘤 結直腸及腫瘤食道癌組織中TS基因表現量。 圖7測定對5-FU/LV有反應病患（先前與以基因表現考關 者）之石臘組織中TS/召-肌動蛋白比例。
圖8顯示在-同一病患中，原發性結腸癌及一年後復發肝 移轉之FFPE樣品中，四種惡性標滤基因的表現程度（TS ; 胸苷磷酸酶（TP );環氧酶-2(C0X_2);及血管内皮生長 因子（VEGF))，這些數據顯示一如預測，四種惡性標諸 中的三種在移轉腫瘤組織中有上升的趨勢。 詳細說明 本發明方法係關於自生物樣品中純tRNA，在一個具體 實例中’樣品為石蠟包埋樣品，且該方法涉及包埋樣品的 去石堪作用？，去石蠟組織在破壞溶液（含有有效含量之胍 鹽化合物）中岣質，及在溫度約5 〇至i 〇 〇 t間，加埶均質 組織約5分鐘至約12〇分鐘。與未加熱的樣品比較起'來，此馨 加熱步驟可使自樣品所增幅CJ)NAi增加至丨〇〇〇倍。 因為冷凍腫瘤組織並不廣泛的適用，通常在手術後，各
第10頁 1277652 五、發明說明（8) 種類型的腫瘤均是以石蠟包埋，因而必須採取大量事後研 究TS表現及化學療法措施。 除此之外，該技術可應用於任何廣泛各式腫瘤且沒有標 的基因的限制，此意指未來可製備族群腫瘤的“基因表現 圖譜”，藉此測定個人病患樣品中各式會影響臨床症狀及 對各式化學療劑有反應基因之表現程度。FFPE樣品所測得 自動真正-時間PCR可作為個人腫瘤之治療標的。 組織樣品 利用本發明方法可自任何生物樣品中分離出Μα，生物 樣品常以固定—劑固定之，主要使用者為醛類固定劑，諸如_ 福馬林（甲醛）及戊二醛。亦可利用其他固定技術諸如醇 類ί心入法（貝替福羅（Battifora)及可皮斯其（K〇pinski) ，J •組織化學細胞化學（1 9 8 6 ) 3 4 : 1 0 9 5 ) ^定組織樣品 ，所用的樣品亦可包埋於石臘中，利用本發明方法亦可從 石臘包埋生物樣品中分離RNA，在一個具體實例中/ ,樣品 經福馬林固定，並以石臘包埋。 樣品的去石臘作用 去石臘作嘀係將石臘包埋樣品上的石臘塊去除，已知有 些去石服作用的技術’本發明可使用任何適^的技術， 本發明較佳的方法是利用有機溶劑清洗以溶解石臘，此種_ 溶劑可有效去除組織樣品上的石臘而不會影孿 合適的溶劑選自苯，甲苯，乙基苯，二甲笨：R:A/合離物，
第11頁 I277652 五、發明說明（9) ί ^明方法所用較佳者為二甲笨溶劑，本發明方法所用的 檀溶劑或組合溶劑較佳為高純度，通常大於9 9%。 石=有機，劑強力混合清洗後，再以離心方法處理可去除 ，’樣品離心的速度為足以使組織沉澱於試管底部為限 劑的ί ί丨、0，〇 〇 〇至約2 〇，0 0 0 g。離心作用後，丟棄有機溶 ，並可$液’熟知組織學技藝者知曉所用有機溶劑的體積 去除較夕據樣品大小及欲除石峨量所需清洗之次數，若需 約1 〇次t的石峨’則需要清洗較多次，通常樣品清洗1至 言，所田而較佳是介於約2至約4次，以10微米組織樣品而 本發^的有機溶劑體積通常約5 0 〇微升。 —
，此種j ί ΐ亦可使用其他技藝者所熟知的去除石蠟方法 1995)。、包括直接溶解法（貝娜吉（Banerjee)等人， 壤後樣品較佳進 度之低碳數醇類 是較佳的低碳數 包括甲醇，異丙 方式是將樣品強 具體實例中，醇 清'洗約3至5次， (例如，依序為1 具體實例中，利 因公司，山羅曼 以漸減濃 言，乙醇 的醇類， 〇 另一藉 個較佳的 水溶液， 於約1 0 % 在另一個 (生物基 水作用。 行脫水作用，較佳脫水的方法係 水溶液進行逐步清洗，以脫水而 ^類’本發明亦可使用其他適當 醇及C1-C5範圍之其他相似醇類 力混以醇類溶液，並離心。在一 類濃度逐步自約100%減至70%的 其。中每步溶液濃度的改變通常少 0 0 % ’ 9 5 %，9 0 %，8 0 %，7 0 % )。 用一種化學藥劑，諸如EZ-DEWAX 恩’CA)可同時進行去石蠟及脫
第12頁 1277652 五、發明說明（10) 均質作用 _ 利用任何標準機械化，音波或其他適當的技術可將去石 壤脫水的樣品均質化，組織均質化作用較佳係根據標準步 驟以機械化組織均質器完成，本發明可使用一些市售的均 質器’包括Ultra-Turrax均質器（IKA-瓦克斯公司，威明 頓 ’NC) ;Tissumizer (Tekmar-Dohrmann ，辛辛那提， 0H);及Polytron (Brinkmann ，Westbury ，NY) 〇 在 個具體實例中，樣品於破壞劑下進行均質化，選用 破壞劑可使石蠟包埋中所純化之RNA有效濃度约為不含'破 壞劑時所分離-時1 〇倍，破壞劑包括：胍鹽化合物，脲，甲 酿胺’碘化鉀，異氰酸鉀，及相似的化合物，本發明較佳 的破壞劑為胍鹽化合物，諸如異硫氰酸胍（亦以硫代氣酸 脈之名販售）及脈氣化氫。可使用許多陰離子反離子，熟 知技藝者利用此種適當陰離子可製備許多胍鹽，本發明戶^ 用的脈鹽溶液通常的濃度範圍為約i至約5M，較佳者 ，假若RNA已存於溶液中，胍鹽溶液為較高的濃度，: 樣品中最終的濃度約1至約5 Μ，胍溶液較佳以適當此 緩衝劑（諸如Tr i s-Cl )緩衝至pH約3至約6，較&者生化 破壞溶液中%亦寸含有還原劑，諸如二硫蘇糖醇（D 約4， 召一巯醇（BME)，破壞溶液中亦可含有RNAse抑生h)及 1剌劑。 將樣品置於破壞溶液中 加熱 ，於溫度約6 0。(：至約1 〇 Q。 0 下，
第13頁 1277652 五、發明說明（11) 加 中 ， 理 樣
熱約5分鐘至約2小時，另一種方式是樣品置於破壞溶液 ，於溫度約50 °C至約lOOt：下，加熱約5分鐘至約2小時 選用加熱時間主要係所純化的RNA含量至少為未埶處 樣品所純化含量約10…在一個較佳的以:列; σ口在溫度約7 5至約1 〇 〇 C下，加熱約2 〇分鐘，更佳者， 品於約9 5 °C下加熱3 0至6 0分鐘。 RNA回收 藉由可產生RNA至少為破壞溶液一個成分之適當技術， 於力:熱，於破壞溶液中回收RNA。以有機溶劑的萃取作一用 ，氯仿萃取作—用，酚-氯仿萃取作用，乙醇，異丙醇或任 何其他低碳數醇類之沉澱作用，層析法（包括離子交換層 析法、，分子大小篩選層析法，矽膠層析法及逆相層析法） 或電泳法（包括聚丙醯胺膠電泳法及瓊脂膠電泳法）等所 熟知之技藝自破壞溶液中回收RNA，較佳係以酚-氯仿萃取 作用自破壞溶液回收RNA。 在回收RNA後，可視情況進一步純化㈣人，進一步純化作 用所產生的RNA實質上沒有DNA或蛋白質的污染，前述用以 回收RNA的任何技術均可用以進一步的純化，較佳係以低 碳數醇類（轉別是乙醇或異丙醇）進行沉澱作用，以進行 RNA的純化，沉澱作用較佳係於載劑（諸如肝糖）存在下 進行，以助沉澱作用。 DNA及蛋白質回收
第14頁 1277652 五、發明說明（12) 本發明方法亦可自組織樣品中純化DNA或蛋白質，將樣 品與有機溶劑（諸如氣仿）混合之後，並經離心作用後， 溶液可分三相，分別為下層的有機相，雙相界面，及上層 的水相。利用適當之破壞藥劑（特別是胍鹽化合物），樣 品中的生物成分會分散至此三相中，上層的水相含有RNA ，而界面相含有DNA，而有機相則含有蛋白質。熟知技藝 者會了解本發明方法適合用以回收DNA及蛋白質^目' 與含^ RNA的相，本發明方法可增進dnA的回收率。
純化RNA
利用本發明-方法純化之RN A適合各式目的及分子生物步 驟，包括（但不侷限於）：反轉錄作用製成cDNA ;製備放 射性，螢光性或其他用於分析基因片段與寡核苷酸及相似 物之標記cDNA ;以丙醯胺或瓊脂膠電泳；利用層析法（例 如離子交換，矽膠i逆相，或分手大小篩選層析法）純化 作用；以核酸探針之雜交作用；及利用機械化，音波或其 他方法之片段作用。 實例 / 物質及方法 這些物質及方法為下列實例所通用。 樣品製備。人類細胞株SKI，H157，A431，HT29， HCC298及HH30已於前文說明。利用胰蛋白酶作用處理單層 細胞以收集細胞，並以3 0 0 0 r pm的離心速度離心5分鐘沉
第15頁 1277652 五、發明說明（13) 澱細胞，細胞沉殿物冷凍於-7 〇 °c下，或以、-小時，而後以石臘包埋。 一偈馬林固定24 所獲取之代表腫瘤組織係於手術時取下，、 病理實驗室常用之步驟將其固定於福馬林並包二二2=f ，利用microtome切取截面組織（5微米）。 々、石臘中 RNA分離。自石臘包埋組織中分離RNA的步 個5微米石臘化組織切片置於小離心管中，哪-如下。將一 1 5分鐘兩次，進行去石臘作用◊用梯度漸一甲笨清洗 (100%，95%，80%及70%)連續清洗組織進杆辰度之醇類 之沉澱物懸浮於含有〇 · 5 %肌胺酸及2 〇 m μ二访― ’所J导 之4Μ異硫氰酸孤中，將懸浮液均質化，醇（DTT) 約9 5 °C達0至6 0分鐘；〇加熱時間點為每個樣α : ^約5 0至 加入醋酸納（ΡΗ4.0 )至〇·2Μ，用酚/氣仿萃111 取制組° 以異丙醇及10毫克肝糖進行沉澱作用，離心取用1液，並 ( 1 3 0 0 0 rpm，4°C Μ5分鐘），用1毫升75%之乙醇清洗 RNA沉澱物兩次，而後將沉澱物懸浮於不含RNase之水中。 反轉錄作用（RT )。加熱後，利用逢機六核苷引子將所 有的RNA轉化成cDNA，冷凍組織的RT條件已於先文說明 (合立可許等人’1992)。每個樣品的控制组盔反轉錄酶 (No-RT )- ..... 利用Perkin Elmer Cetus 7700 PCR 機器（Taqman)測 定ts及冷一肌動蛋白基因表現的真正一時間pwCR定量作用。 利用前述（Heid等人，1996 ;Eads等人，1999)所述之螢 光偵測方法為基礎，以真正-時間PCR進行訊息RNA的定量
第16頁 1277652 五、發明說明（14) 實驗。以前述的方法製備cDNA。以帶有5’-螢光報告染劑 (6FAM )及3’ -終止染劑（TAMRA )之探針分別增幅有意之 cDNA及參考cDNA，TAQ聚合酶的5’-外核酸酶活性會切割探 針，並釋放出報告分子，利用ABI Prism Sequence Detection System (Taqman)偵測螢光。當其超越螢光偵 測閾值時，PCR增幅作用產生的螢光訊息與所產生的PCR產 物成正比，當螢光訊息超越PCR反應對數相的閾值時之循、 環數值為初期模板之濃度，以有意基因及參考基因的閾值 循環數為基礎測定相對之基因表現，參考基因的應用係避 免直接定量RNA，因其為主要的錯誤來源。 引子及探針序列如下：TS ·· SEQ ID NO : 1 : GGC CTC φ GGT GTG CCT ΤΤ ； SEQ ID NO ： 2 ： AAC ATC GCC AGC TAC GCC CTG C ； SEQ ID NO ： 3 ： GAT GTG CGC AAT CAT GTA CGT。yS-肌動蛋白：SEQ ID NO :4 :TGA GCG CGG CTA CAG CTT ； SEQ ID NO : 5 ： ACC ACC ACG GCC GAG CGG ； SEQ ID NO :6 :TCC TTA ATG TCA CGC ACG ATT T 。以真 正-時間PCR實驗而言，如前討論，報告寡核苷（SEq ID NOS : 2及5 )以6FAM標記5，端，以TAMRA標記3，端。 進行每次PCR時’均需包括“無反轉錄酶，，（NRT或 No-RT )的控制組，此反應的目的係為修正任何源自殘餘 基因體DNA污染所導致之背景增幅作用，因此，丁3及泠-肌 動蛋白的整體含量計算為rT數值減數值（RT-NRT)。Λ 統計分析。以無母數平均值比較法測定分別以冷凍組織 及FFPE處理之腫瘤樣品之TS差異是否有意義或無意義。
第17頁 1277652 五、發明說明（15) 實例1 . 一般RNA分離步驟 利用下列的一般步驟萃取石臘包埋組織中的R N A。 A.切片的去石臘作用及脫水作用 (1 ) 將大約為1 0微米的切片置於1 . 5毫升塑膠離心試管 中
升二曱苯，室溫下（大約20至25 °C 強 (2)加入6 0 0 1 力混搖約1 0分鐘。 _ (3 ) 室溫下，以桌上型離心機最大轉速（約logo ， 0 0 0 g ) 將樣品 離心約 7 分鐘。 (4) 重複步驟2及3，直至大部分的石臘溶解，通常視原 樣品中所含石1含量需2次或多次。 (5 ) 與低碳數醇類強力混搖，較佳為1 0 0 %乙醇（約6 0 0 微升），混搖3分鐘·，以去除二曱苯溶液。 (6) 將離心管以步驟（3 )方式離心約7分鐘，將上清液 移入另一試管並丟棄，沉澱物為白色。 (7) 以更多稀釋乙醇溶液連續重複步驟5及6，首先約 95%乙醇，而後約80%，最後為約70%乙醇。 (8 ) 室溫下，將離心管以步驟（3 )方式離心約7分鐘， 丟棄上清液，讓沉澱物於室溫下乾燥約5分鐘。
B.以酚-氯仿分離RNA (1) 加入包括0.5 %肌胺酸之400微升異硫氰酸胍溶液及8 微升1 Μ二硫蘇醇。
第18頁 1277652 五、發明說明（16) (2) 而後以組織均質器（ultra-Turrax ，IKA-Works公 司，威名頓，N C )均質樣品約2至3分鐘，期間均質速度由 低速（速度1)轉至高速（速度5)。 (3) 而後將樣品置於約9 5 °C下加熱約5 - 2 0分鐘，在加熱 之前，最好以細針將含有樣品的試管蓋戳洞，另一種方式 是可用塑膠夾或實驗室石臘膜將試管蓋固定。 (4) 而後以pH 4·〇的2M醋酸鈉50微升及600微升酚/氯 仿/異戊醇（1 0 : 1 · 9 3 : 〇 · 〇 3 6 )(新鮮配製，將1 8毫升 酚與3 · 6毫升1 : 4 9異戊醇：氯仿溶液混合而成），強；^混 搖約1 0秒鐘’而後置於冰上約1 5分鐘。
(5 ) 以最-高速度離心該溶液約7分鐘，將上清液（水相） 移入另一個新的試管。 (6)加入1〇微升肝糖及400微升異丙醇，置於—2〇 °C下3〇 分鐘’將R N A >儿；殿出來。 (7 )以桌上型最高速度離心約7分鐘將R N A沉殿；上清液 移入另一容器並丟棄，以約5 0 0微升之70至7 5%乙醇清洗沉 澱物。 (8 )再以最高速離心樣品約7分鐘，上清液丟棄，乾燥 沉澱物，而後將沉澱物溶解於適當的緩衝液，以備進一步 實驗用（例如50 微升5 Tris chloride，pH 8.0)。
實例2 加熱時間 此實例說明加熱時間對RNA產量的效果。
第19頁 1277652 五、發明說明（Π) 如圖1說明’在沉搬作用及反轉錄作用之前，於9 5 °C下 加熱破^溶f I明顯増加Ts及召-肌動蛋白標的物的偵測 效率’备不執行加熱步驟時，並未偵測到TS或沒—肌動蛋 白（0分知時間點），在95加熱2〇分鐘後此兩種轉錄產 物均可摘測到；若持續將加熱時間增加至6 0分鐘，則TS偵 測感度增加3倍’而万―肌動蛋白增加45倍（NRT=無反轉 錄酶控制組’ RT-NRT=相對基因表現總量，即反轉錄酶減 去無反轉錄酶者）3
圖2 "兒明正常（N )及腫瘤（T )組織中/3 -肌動蛋白基因 的RNA表&現程度’樣品置於95下〇至4〇分鐘，對大部务的 樣品而言，，較-佳的加熱時間約3 〇分鐘。 圖3說明當加熱時間長於60分鐘時，RNA的萃取量開始減 少’此f測RNA的熱分解效應，此時DNA的萃取量開始增加 ’這不是我們所要的結果，因為在某些情況下DNA的存在 會產生不必要的PC R·訊號。 實例3 加熱溶液 此實例說明R N A溶液中存有破壞劑對獲取高產量r n A是重 要的’此為利用偵測yS -肌動蛋白基因表現相對測定於各 式溶液中所分離RNA含量之RT-PCR實驗。 根據前述方法處理臨床食道癌F F P E組織樣品，除了開始 時進行去石臘作用後所得之沉澱物溶解或懸浮於4M異硫氰 酸胍（GITC) ，4M異硫氰酸胍+1〇〇 召-巯醇
第20頁 1277652 五、發明說明（18) (GITC + BME) ，4M異硫氰酸胍+20 βΜ二硫蘇糖醇 (GITC + DTT)或 Tris-Cl 緩衝液（10 mM pH 7.5)或 Tris-Cl 緩衝液+20 二硫蘇醇（Tris/Cl+DTT)。而後
將樣品置於95 °C下加熱30分鐘，或不加熱（〇分鐘，95 °C) 。而後T r i s / C 1樣品以4 Μ異硫氰酸胍處理，以R T - P C R測定 R Ν Α量，而以真正時間P C R偵測yS -肌動蛋白。如圖4所示， 當加熱時，含有破壞劑異硫氰酸胍對RNA高回收率非常重 要，而還原劑（諸如DTT或BME)對高回收RNA並非必要。4M 異硫氰酸胍溶液中含有50 mM Tris-HCl (pH 7·5)，25 ιηΜ £0丁八及0.5%肌胺酸。 一 實例4 相同來源的F F Ρ Ε及冷凍組織中基因表現數值之比較 此實例顯示本發明方法提供福馬林固定石蠟包埋樣品的 基因表現數值與冷珠組織所得之數值等同。
六種細胞株樣品經FFPE處理，利用本發明方法（包括於 95 C下加熱30分鐘)進行TS定量。所得之相對TS數值（圖 5 )與利用已知方法自冷凍細胞沉澱物所得之數值比較， 相對TS表現量在冷凍細胞為3·〇-ΐ9·5 (平均= 8·5)，而 FFPE樣品數值為3· 0-25· 0 (平均=9.〇)，統計分析此二 均值差異的Ρ值為0·726 ’此表示以原始rt-PCR方法自冷康 細胞沉澱物所得之TS數值與利用本發明方法自FFΡΕ細^ 澱物所得者並無明顯差異。 ' /JL 不論為福馬林固定及石蠟包埋或為冷凍之腫瘤組織樣品
1277652 五、發明說明（19) 及正常組織樣品，其R N A表現程度亦相同。比較五個正常 組織及6個腫瘤結腸癌組織及4個食道癌腫瘤組織（如前述 石蠟及冷凍組織（FT ))中相對TS基因表現程度，結果如 圖6所示。結果發現冷凍組織樣品之TS量與相同組織經 FFPE處理之樣品所得之TS數值並無明顯差異，此對結腸及 食道組織均為相同的結果（平均F T樣品結腸=3 · 4 6 ,平均 FFPE樣品結腸= 3·06，ρ = 0·395 ;平均FT樣品食道=13.9， 平均 FFPE 樣品食道=15·93，ρ = 0·21)。 比較-反應者及無反應者腫瘤組織中T S量 比較對5-FU/硫克凡靈（Leucovorin) (LV)有反應之 第iv期結腸癌患者之冷凍組織及同質性FFPE樣品的TS含量 。士 RT-PCR數據為基礎，先前的報告顯示在腫瘤冷束組織 為高含量之TS (相對基因表現^4· 0 )，表示其對TS治療 為較差的反應，具有反應腫瘤的特徵是其TS表現程度^氏、。 測定17位病患石蠟切片中TS/点一肌動蛋白比值，經 樣品分析（圖7 )，該等病患對5 — fu/lv的反應與;某 因表現有關。在1 7位病患中，6位已知對TS有反應，而】广 ΐ ίίΓίϊϊ差的反應者。咸已知發現，在同質石蠓纟且織 中之TS結果與亦可預期其對此治療的反 本織 =8 7，平均反應者FFPE = 2.37，ρ = 〇 641丨平^者 者FT = 7· 66，平均無反應者FFPE = 7· 84，ρ = 〇· 537 了反應 冷凍組織中所得之TS量與同質性FFPE組織所得者。之門並
1277652 五、發明說明（20) 無明顯差異。 實例6 , 原發性結腸癌與肝癌移轉之TS基因表現程度 此實例顯示在相同病患中原發性結腸癌及復發肝癌移轉 之TS分析，及其他基因表現的情況。 圖8顯示相同病患中原發性結腸癌及一年後復發肝癌移 轉（met)之四種基因的表現：TS ;TP ;環氧酶-2(COX - 2) ;及血管内皮生長因子（V E G F )，結果推測原發性腫瘤對 5 -FU療法具有感度（TS = 2. 32 )，移轉腫瘤則較難治療— (TS met 11.58) ，COX-2及VEGF表現程度與已發表的文 獻相關，其在侵略性疾病的表現會增加，且相互調節 (COX-2 原發性=1.35 ;COX-2 met = 5.4 ;VEGF 原發性 =5. 02 ; VEGF met = 14· 4 )。自原發性直腸癌的5微米FFPE 切片及乾燥移轉之FFPE切片中分離RNA，在反應原發性腫 瘤的相對TS基因表現為2 . 3 2，而在移轉疾病則為1 1. 5 8 (圖8 )，此利用本發明之RT-PCR方法測定增加5倍TS表現 量表示次發性疾病對5-FU並無反應，推測另一種治療方法 可能較為適當，諸如CPT-11。 本專利說明書中所列的所有文獻一并併入發明實體參 考。
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Claims (1)

  1. 1277652 案號89127378 丨華^^‘嗜 六、申請專利範圍 1 . 一種自石臘包埋生物組織樣品中回收RNA的方法，其 中該樣品不是體液的液態樣品’其包括： 將樣品去石胤； 將樣品置於包括有效濃度之胍鹽化合物之破壞溶液 中，於溫度約7 5至約1 0 0 °C範圍下，加熱約1 0至約1 2 0分鐘 之時間；及 利用選自萃取、電泳、層析法、沈澱法及其組合所組 成之群之回收技術自該破壞溶液中回收該R N A。 2 ·根據申請專利範圍第1項之方法，另包括於加熱前將 該樣品脫水。 3 ·根據申請專利範圍第1或2項之方法，另包括於加熱前 將該樣品均質化。 4.根據申請專利範圍第3項之方法，其中該RNA之回收係 藉以水不溶性有機溶劑自該破壞溶液中萃取。 5 .根據申請專利範圍第4項之方法，其中該不溶於水有 機溶劑必須含有氯仿。 6 ·根據申請專利範圍第5項之方法，另包括純化該RNA。 7.根據申請專利範圍第6項之方法，其中係以乙醇沉澱 作用純化RNA。 8 ·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該時間期間 係自約1 0至約6 0鐘。 9 ·根據申請專利範圍第8項之方法，其中該時間期間係 自約3 0至約6 0分鐘。 1 0 .根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中溫度係在
    O:\68\68394-951102.ptc 第25頁 1277052案號89127378 年月 曰 修正_ 六、申請專利範圍 約7 5至約9 5 °C之範圍。 1 1 ·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中溫度係在 約8 5至約1 0 0 °C之範圍。 1 2 ·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該時間期 間係自約3 0至約6 0分鐘。 1 3.根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中胍鹽化合 物為脈氫氣酸。 1 4.根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中胍鹽化合 物為異硫氰酸脈。 1 5 ·根據申請專利範圍第1 4項之方法，其中異硫氰酸胍 存在的濃度為約2至約5 Μ。 1 6 ·根據申請專利範圍第1 5項之方法，其中異硫氰酸胍 存在的濃度為約4 Μ。 1 7.根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該破壞溶 液的pH為約3-6。 1 8.根據申請專利範圍第1 7項之方法，其中該破壞溶液 的pH為約4。 1 9.根據申請專利範圍第1 2項之方法，其中該破壞溶液 另包括還原劑。 2 0 .根據申請專利範圍第1 9項之方法，其中該還原劑為 /3 -酼醇。 2 1 .根據申請專利範圍第1 9項之方法，其中該還原劑為 二硫蘇糖醇。 2 2 .根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中RN A係自破
    O:\68\68394-951102.ptc 第26頁 1277052案號89127378 年丨丨月 曰 修正_ 六、申請專利範圍 壞溶液中回收。 23.根據申請專利範圍第22項之方法，其中該RNA係用以 測定基因表現程度。 2 4 ·根據申請專利範圍第2 2項之方法，其中該R N A進一步 進行選自反轉錄、電泳、層析法、與核酸探針雜交及片段 作用所組成之群之步驟。 2 5.根據申請專利範圍第24項之方法，其中該RNA進行反 轉錄，且所製得之c D N A係被標記者。 2 6.根據申請專利範圍第25項之方法，其中該標記cDNA 係用於基因晶片或微陣列分析。 2 7.根據申請專利範圍第22項之方法，其中該RNA進行反 轉錄，且所製得之cDNA係經聚合酶鏈反應放大者。 2 8 .根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該樣品於 約7 5至約1 0 0 °C之溫度範圍下，加熱約3 0至約6 0分鐘之時 間，且RNA係自破壞溶液中回收。 2 9 .根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該樣品於 約7 5至約9 5 °C之溫度範圍下，加熱約3 0至約1 2 0分鐘之時 間。 3 0 .根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該樣品於 約9 5 °C之溫度範圍下，加熱約3 0至約6 0分鐘之時間。 3 1 .根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該樣品於 約9 5 °C之溫度範圍下，加熱約1 0至約6 0分鐘之時間。 3 2 .根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該樣品於 約9 5 °C之温度範圍下，加熱約6 0分鐘之時間。
    O:\68\68394-951102.ptc 第27頁 1277052案號89127378 年π月 曰 修正_ 六、申請專利範圍 3 3 .根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該樣品於 約9 5 °C之溫度範圍下，加熱約3 0至約4 0分鐘之時間。 3 4. —種定量測定標的基因表現之方法，其包括： 將經固定石臘包埋生物組織樣品去石臘； 將去石臘樣品脫水； 將脫水樣品與包含異硫氰酸胍及還原劑且pH約為5之 破壞溶液混合； 均質化該樣品，並將樣品與破壞溶液混合物於溫度約 9 5 °C下加熱約3 0分鐘； 利用不溶於水有機溶劑之萃取作用自破壞溶液中萃回 收樣品R N A ; 純化回收的RNA ; 利用反轉錄反應將純化RNA轉化成cDNA ; 在聚合酶鏈結反應溶液進行cDNA之PCR反應，該聚合 酶鏈結反應溶液包括適合增幅至少一段特定序列之募核苷 探針，聚合酶及螢光發光源； 測定PCR反應後螢光強度的變化；及 以螢光強度為基礎，測定存於樣品中特定序列核酸的 含量。 3 5 .根據申請專利範圍第3 4項之方法，其中在破壞溶液 中異硫氰酸胍濃度為3 Μ。 3 6 .根據申請專利範圍第3 5項之方法，其中還原劑包括 二硫蘇糖醇。 3 7.根據申請專利範圍第3 6項之方法，其中不溶於水有
    O:\68\68394-951102.ptc 第28頁 1277052案號89127378 今广年U 月 曰 修正_ 六、申請專利範圍 機溶劑包括氯仿。 3 8 ·根據申請專利範圍第3 7項之方法，其中係利用乙醇 沉澱作用純化回收的Μ A。 3 9 · —種自生物組織樣品中回收R N A之方法，其中該樣品 不是體液的液態樣品，其包括： 將樣品置於包括有效濃度之胍鹽化合物之破壞溶液 中，於溫度約7 5至約1 0 0 °C範圍下，加熱約1 0至約1 2 0分鐘 之時間；及 利用選自萃取、電泳法、層析法、沈澱法及其組合所 組成之群之回收技術自該破壞溶液中回收該R N A。 4 0 ·根據申請專利範圍第3 9項之方法，其另包括於加熱 前將該樣品脫水。 4 1 ·根據申請專利範圍第4 0項之方法’其另包括於加熱 前將該樣品均質化。 42.根據申請專利範圍第41項之方法，其中談RNA之回收 係藉以水不溶性有機溶劑自該破壞溶液中萃取。 4 3 .根據申請專利範圍第4 2項之方法，其中該不溶於水 有機溶劑實質上係由氯仿組成。 4 4.根據申請專利範圍第4 3項之方法，其另包括純化該 RNA ° 4 5 ·根據申請專利範圍第4 4項之方法，其中係以乙醇沉 澱作用純化RNA。 46.根據申請專利範圍第39項回收RNA之方法，其中該時 間期間係自約1 0至約6 0鐘。
    O:\68\68394-951102.ptc 第29頁 1277052案號89127378 年il月 曰 修正_ 六、申請專利範圍 4 7.根據申請專利範圍第46項之方法，其中一該時間期 間係自約3 0至約6 0分鐘。 4 8 ·根據申請專利範圍第3 9項之方法，其中溫度係在約 8 5至約1 0 0 °C之範圍。 4 9.根據申請專利範圍第48項之方法，其中一該時間期 間係自約3 0至約6 0分鐘。 5 0 .根據申請專利範圍第3 9項回收R N A之方法，其中胍鹽 化合物為脈氫氯酸。 5 1 .根據申請專利範圍第3 9項回收R N A之方法，其中胍鹽 化合物為異硫氰酸胍。 5 2.根據申請專利範圍第5 1項之方法，其中異硫氰酸胍 存在的濃度為約2至約5 Μ。 5 3.根據申請專利範圍第5 2項之方法，其中異硫氰酸胍 存在的濃度為約4 Μ。 5 4.根據申請專利範圍第5 1項之方法，其中該破壞溶液 的pH為約3 - 6。 5 5 .根據申請專利範圍第5 4項之方法，其中該破壞溶液 的p Η為約4。 56.根據申請專利範圍第39項回收RNA之方法，其中該破 壞溶液另包括還原劑。 5 7.根據申請專利範圍第56項回收RNA之方法，其中該還 原劑為/3 -巯醇。 58.根據申請專利範圍第56項回收RNA之方法，其中該還 原劑為二硫鍊糖醉。
    O:\68\68394-951102.ptc 第30頁 1277052案號89127378 年U月 曰 修正_ 六、申請專利範圍 5 9.根據申請專利範圍第39項之方法，其中該RNA係用以 測定基因表現程度。 6 0 .根據申請專利範圍第3 9項之方法，其中該沉澱法係 以醇進行。 6 1 ·根據申請專利範圍第6 0項之方法，其中該醇係為乙 醇、異丙醇或其混合物。 6 2 ·根據申請專利範圍第3 9項之方法，其中該層析法係 為離子交換層析法、分子大小篩選層析法、>5夕膠層析法、 逆相層析法或其組合。 6 3.根據申請專利範圍第3 9項之方法，其中該電泳法係 為聚丙醯胺電泳法、瓊脂電泳法或其組合。 6 4 . —種自生物組織樣品中回收Μ A之方法，其中該樣品 不是體液的液態樣品5其包括： 將樣品置於包括有效濃度之胍鹽化合物之破壞溶液 中，於溫度約7 5至約1 0 0 °C範圍下，加熱約1 0至約1 2 0分鐘 之時間；及 自該破壞溶液中回收該R N A，其中自該破壞溶液中回 收之該RNA適用於利用反轉錄聚合酶鏈結合反應（RT-PCR) 放大偵測基因之表現程度。 6 5 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中該沉澱法係以 醇進行。 6 6 .根據申請專利範圍第6 5項之方法，其中該醇係為乙 醇、異丙醇或其混合物。 6 7.根據申請專利範圍第1項之方法，其中該層析法係為
    O:\68\68394-951102.ptc 第31頁 1277052案號89127378 〇yc年月 曰 修正_ 六、申請專利範圍 離子交換層析法、分子大小篩選層析法、矽膠層析法、逆 相層析法或其組合。 6 8 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中該電泳法係為 聚丙醯胺電泳法、瓊脂電泳法或其組合。 6 9. —種自經固定石臘包埋生物組織樣品中回收RNA之方 法，其中該樣品不是體液的液態樣品，其包括： 將樣品去石胤； 將樣品置於包括有效濃度之胍鹽化合物之破壞溶液 中，於溫度約7 5至約1 0 0 °C範圍下，加熱約1 0至約1 2 0分鐘 之時間；及 自該破壞溶液中回收該R N A，其中自該破壞溶液中回 收之該RNA適用於利用反轉錄聚合酶鏈結合反應（RT-PCR) 放大偵測基因之表現程度。 7 0 . —種自經固定石臘包埋生物組織樣品中測定胸苷酸 合成酶（TS)表現之方法，其包括： (a )將組織樣品去石臘以獲得去石臘樣品； (b )自去石脱樣品中獲得經分離之in R N A ’其言先將組 織樣品於包括有效濃度之胍鹽化合物之破壞溶液中，於溫 度約7 5至約1 0 0 °C範圍下，加熱約1 0至約1 2 0分鐘，並自該 破壞溶液中回收該m R N A ; (c) 利用可放大TS基因區域之一對募核苷酸引子放大 經分離之mRNA以獲得將放大之樣品；及 (d) 相對於内對照組基因mRNA之量，測定TS mRNA之 量 °
    O:\68\68394-951102.ptc 第32頁 1277652 案號 89127378 修正 六、申請專利範圍 其中該内對照組 7 1 .根據申請專利範圍第70項之方法 基因係為yS -肌動蛋白。 7 2 .根據申請專利範圍第7 0項之方法，其中該組織樣品 係為腫瘤組織。 7 3.根據申請專利範圍第7 2項之方法，其中該腫瘤組織 係獲自結腸癌腫瘤。 7 4.根據申請專利範圍第7 2項之方法，其中該腫瘤組織 係獲自肝臟移轉。 7 5 . —種自經固定石臘包埋生物組織樣品中測定胸苷酸 合成酶（TS)表現程度之方法，其包括： (a )將組織樣品去石臘以獲得去石臘樣品； (b) 自去石臘樣品中獲得經分離之mRNA，其首先將去 石臘組織樣品於包括有效濃度之胍鹽化合物之破壞溶液 中，於溫度約7 5至約1 0 0 °C範圍下加熱，並自該溶液中回 收該mRNA ;及 (c) 相對於内對照組基因mRNA之量，測定TS mRNA之 量 ° 其中該加熱係為 其中該募核苷酸 其中該募核苷酸 其中該加熱係發 7 6 .根據申請專利範圍第7 5項之方法 進行1 0至1 2 0分鐘。 7 7.根據申請專利範圍第75項之方法 引子之一係為SEQ ID NO: 1。 7 8 .根據申請專利範圍第7 5項之方法 引子之一係為SEQ ID NO: 3。 7 9 .根據申請專利範圍第75項之方法
    O:\68\68394-951102.ptc 第33頁 1277052案號89127378 年q 月 曰 修正_ 六、申請專利範圍 生於溫度約7 5至約1 0 0 °C範圍下，進行約1 0至約1 2 0分鐘之 時間。 8 0.根據申請專利範圍第70項之方法，其中該回收mRNA 之方法包括選自以水不溶性有機溶劑萃取法、氯仿萃取 法、酚-氯仿萃取法、醇沉澱法、層析法、分子大小篩選 層析法、石夕膠層析法、逆相層析法及電泳法、聚丙酷胺電 泳法、瓊脂電泳法及其組合所組成之群之方法。 81. 根據申請專利範圍第70項之方法，其中該RNA之回收 係藉以水不溶性有機溶劑自該破壞溶液中萃取。 82. 根據申請專利範圍第70項之方法，其中該TS mRNA量 之測定包括R T - P C R。 8 3.根據申請專利範圍第75項之方法，其中該回收mRN A 之方法包括選自以水不溶性有機溶劑萃取法、氯仿萃取 法、紛-氯仿萃取法、醇沉殿法、層析法、分子大小篩選 層析法、碎膠層析法、逆相層析法及電泳法、聚丙酸胺電 泳法、瓊脂電泳法及其組合所組成之群之方法。 84.根據申請專利範圍第75項之方法，其中該RNA之回收 係藉以水不溶性有機溶劑自該破壞溶液中萃取。 8 5.根據申請專利範圍第75項之方法，其中該TS mRNA量 之測定包括RT-PCR。 8 6 . —種自石臘包埋生物組織樣品中回收R N A的方法，其 中該樣品不是體液的液態樣品，其包括： 將樣品去石臘； 將樣品置於包括有效濃度之破壞溶液’該破壞溶液係
    O:\68\68394-951102.ptc 第34頁 1277052案號89127378 年η月 曰 修正_ 六、申請專利範圍 選自由胍鹽化合物，脲，甲醯胺，碘化鉀，異氰酸鉀，及 相似的化合物所組成之群，於溫度約7 5至約1 0 0 °C範圍 下，加熱約1 0至約1 2 0分鐘之時間；及 利用選自萃取、電泳、層析法、沈殿法及其組合所組 成之群之回收技術自該破壞溶液中回收該R N A。
    O:\68\68394-951102.ptc 第35頁
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