UA119320C2 - Активуюча т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула - Google Patents

Активуюча т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула Download PDF

Info

Publication number
UA119320C2
UA119320C2 UAA201509085A UAA201509085A UA119320C2 UA 119320 C2 UA119320 C2 UA 119320C2 UA A201509085 A UAA201509085 A UA A201509085A UA A201509085 A UAA201509085 A UA A201509085A UA 119320 C2 UA119320 C2 UA 119320C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antigen
domain
binding
cell
antibody
Prior art date
Application number
UAA201509085A
Other languages
English (en)
Inventor
Маріна Бакак
Марина Бакак
Томас Хофер
Ральф Хоссе
Ральф Хоссэ
Крістіане Йєгер
Кристианэ Йегер
Крістіан Кляйн
Кристиан КЛЯЙН
Еккехард Мьоснер
Эккехард Мёснер
Пабло Умана
Тіна Вайнцірль
Тина Вайнцирль
Original Assignee
Рош Глікарт Аг
Рош Гликарт Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47748528&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA119320(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Рош Глікарт Аг, Рош Гликарт Аг filed Critical Рош Глікарт Аг
Publication of UA119320C2 publication Critical patent/UA119320C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Винахід стосується активуючої Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка містить перший антигензв’язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Fab, яка має здатність специфічно зв'язуватися з CD3, другий і третій антигензв'язувальні фрагменти, кожний з яких являє собою молекулу Fab, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СЕА, та Fc-домен, що складається з першої й другої субодиниць, які мають здатність до стабільної асоціації, де другий антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці Fab важкого ланцюга з N-кінцем Fab важкого ланцюга першого антигензв'язувального фрагмента, і перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці Fab важкого ланцюга з N-кінцем першої субодиниці Fc-домену, і в якій третій антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці Fab важкого ланцюга з N-кінцем другої субодиниці Fc-домену.

Description

Ес-домен, що складається з першої й другої субодиниць, які мають здатність до стабільної асоціації, де другий антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці Раб важкого ланцюга з М- кінцем Бар важкого ланцюга першого антигензв'язувального фрагмента, і перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці баб важкого ланцюга з М-кінцем першої субодиниці Ес-домену, і в якій третій антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці Рар важкого ланцюга з М-кінцем другої субодиниці Ес-домену.
Галузь техніки, до якої відноситься винахід
Даний винахід в цілому відноситься до біспецифічних антигензв'язувальних молекул, призначених для активації Т-клітин. Крім того, даний винахід відноситься до полінуклеотидів, що кодують зазначені біспецифічні антигензв'язувальні молекули, і до векторів і клітин-хазяїв, що містять зазначені полінуклеотиди. Винахід відноситься також до способів одержання біспецифічних антигензв'язувальних молекул, які запропоновані у винаході, й до способів застосування таких біспецифічних антигензв'язувальних молекул для лікування захворювання.
Передумови створення винаходу
В різних клінічних ситуаціях часто є необхідною вибіркова деструкція індивідуальної клітини або конкретного типу клітин. Наприклад, основною задачею при терапії раку є руйнування саме пухлинних клітин зі зберіганням при цьому в інтактному й неушкодженому стані здорових клітин і тканин.
Перспективним підходом для досягнення цієї мети є індукція імунної відповіді проти пухлини, при якій імунні ефекторні клітини, такі як природні клітини-кілери (МК) або цитотоксичні
Т-лімфоцити (СТІ), атакують і руйнують пухлинні клітини. СТІ. представляють собою найбільш ефективні ефекторні клітини імунної системи, однак вони не можуть активуватися ефекторним механізмом, опосередкованим Ес-доменом канонічних терапевтичних антитіл.
У цьому плані в останні роки збільшився інтерес до біспецифічних антитіл, призначених для зв'язування за допомогою одного "плеча" з поверхневим антигеном на клітині-мішені, а за допомогою другого "плеча" з активувальним інваріантним компонентом комплексу Т-клітинного рецептора (ТОК). Одночасне зв'язування такого антитіла з обома його мішенями повинно приводити до часової взаємодії між клітиною-мішенню і Т-клітиною, викликаючи активацію будь- якої цитотоксичної Т-клітини і наступний лізис клітини-мішені. Таким чином, імунна відповідь переорієнтується до клітин-мішеней і не залежить від презентації пептидного антигену клітиною-мішенню або специфічності Т-клітини, що має місце при нормальній обмеженній ГКГС активації СТІ. В цьому контексті вирішальне значення має те, що СТІ. активуються тільки тоді, коли клітина-мішень презентує їм біспецифічне антитіло, тобто має місце імітація імунологічного синапсу. Найбільш переважними є біспецифічні антитіла, для яких не потрібно попереднє кондиціонування або співстимуляція лімфоцитів для того, щоб викликати ефективний лізис
Зо клітин-мішеней.
Розроблено декілька форматів біспецифічних антитіл і вивчена можливість їх застосування для опосередкованої Т-клітинами імунотерапії. Серед них дуже гарно охарактеризовані так звані молекули ВітТЕ (біспецифічний активатор Т-клітини) і вже встановлена їх певна перспективність у клінічних дослідженнях (див. огляд Мадогзеп апа Вацшегіє, Ехр Сеї!Ї Кез 317, 12011, сс. 255-1260). ВІТЕ представляють собою тандемні молекули 5сЕм, в яких дві молекули 5СЕм злиті за допомогою гнучкого лінкера. Крім того, для активації (задіяння в процес) Т-клітин досліджували біспецифічні формати, включаючи димерні антитіла (діабоді) (Ноїїїдег та інш., Ргої
Епяо 9, 1996, сс. 299-305) і їх похідні, такі як тандемні димерні антитіла (Кірпуапом та інш., У Мої
Вії 293, 1999, сс. 41-66). В останні роки розроблені так звані молекули ОБАКТ (переорієнтувальні антитіла з подвійною афінністю), основані на форматі димерних антитіл, але які відрізняються С-кінцевим дисульфідним містком, який призначений для додаткової стабілізації (Мооге та інш., Віоо4й 117, 2011, сс. 4542-4551). Так звані триомаби (трифункціональні антитіла), які представляють собою повні гібридні мишачі/щурячі Ідсз- молекули і які також в даний час проходять клінічні дослідження, представляють собою молекули більш великого формату (див. огляд беїтеї та інш., Сапсег Тгеаї Кем 36, 2010, сс. 458-467).
Продемонстровано, що різні розроблювані формати мають великий потенціал для імунотерапії, пов'язаний з Т-клітинною переорієнтацією й активацією. Однак задача створення придатних для цього біспецифічних антитіл ніяким чином не є тривіальною, а потребує рішення низки проблем, пов'язаних з вимогами ефективності, токсичності, застосовності й технологічності антитіл.
Невеликі конструкції, такі, наприклад, як молекули ВіТЕ, хоча вони мають здатність ефективно перехресно зв'язувати ефекторні клітини і клітини мішені, мають дуже короткий час напівжиття у сироватці, що потребує їх введення пацієнтам шляхом безперервної інфузії. З іншого боку, Ід-подібні формати, хоча вони мають значні переваги з позицій тривалого часу напівжиття, мають такий недолік як токсичність, асоційнована з нативними ефекторними функціями, які придатні молекулам /дс. Їх імуногенний потенціал являє собою іншу характеристику ІдсС-подібних біспецифічних антитіл, насамперед нелюдського формату, несприятливу з позицій їх успішного терапевтичного застосування. І, насамкінець, основною бо проблемою при звичайному підході до створення біспецифічних антитіл є одержання біспецифічних конструкцій антитіл в достатній для клінічних досліджень кількості і які мають достатню чистоту, ця проблема пов'язана з помилковим спарюванням важких і легких ланцюгів антитіл з різними специфічностями при сумісній експресії, що знижує вихід правильно зібраної конструкції і призводить до одержання низки нефункціональних побічних продуктів, від яких може виявитися важко відокремлювати необхідне біспецифічне антитіло.
З урахуванням труднощів і недоліків, притаманним доступним в даний час біспецифічним антитілам, призначеним для опосередкованої Т-клітинами імунотерапії, зберігається потреба у створенні нових покращених форматів зазначених молекул. У даному винаході запропоновані біспецифічні антигензв'язувальні молекули, створені для активації і переорієнтації Т-клітин, в яких об'єднані висока ефективність і технологічність з низькою токсичністю і переважними фармакокінетичними властивостями.
Коротке викладення суті винаходу
Першим об'єктом даного винаходу є активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить () перший антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Раб, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ, який містить щонайменше одну визначальну комплементарність ділянку (гіперваріабельну ділянку, СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5БЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 5 і 5ЕО ІО МО: 6, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮ МО: 9, 5ЕО І МО: 10; (І) другий антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Раб, яка має здатність специфічно зв'язуватися з антигеном клітини-мішені.
В одному з варіантів здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Бар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ, містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 90, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: ЗЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 32 і 5ЕО ІО МО: 33, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 У», 98 Фо, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: ЗЕО ІЮО МО: 7 і БЕО ІО МО: 31.
Зо В одному з варіантів здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Бар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ, містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 90, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності ФЕО ІЮО МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність яка щонайменше приблизно на 9595, 9695, 97 95, 9895, 995956 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮО МО: 7.
В конкретному варіанті здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з карциноембріональним антигеном (СЕА, СЕАСАМУ5) і містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮО МО: 24, 5ЕБО ІЮО МО: 25 і 5БО ІЮ МО: 26, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІЮ МО: 28, 5ЕО ІЮО МО: 29, ЗЕО ІЮ МО: 30.
В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з СЕА і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Ор, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності «ЕЕ ІЮО МО: 23, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 95, 98 Фо, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності ХЕО ІО МО: 27.
В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з МСОС5Р (С5РОЯ4) і містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ
МО: 14, БЕО ІЮ МО: 15, 5ЕО ІЮО МО: 16, ЗЕО ІЮО МО: 35, 5ЕО ІЮ МО: 37, ЗЕО ІЮ МО: 38 і 5ЕО ІЮ
МО: 40, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: 5ЕО ІЮ МО: 18, 5ЕО ІО МО: 19, 5ЕО ІЮ МО: 20, ЗЕО ІЮО МО: 44, 5ЕО ІЮ МО: 45, 5ЕО ІЮ МО: 48, ЗЕО ІЮ МО: 49 і БЕО ІО МО: 50.
В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з асоційованим з меланомою хондроїтинсульфат протеогліканом (МСО5Р, С5РО4) і містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5БЕО ІЮ МО: 14, 5ЕО ІЮ МО: 15 і 5ЕО ІО
МО: 16, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: 5ЕО ІЮ МО: 18, 5ЕО ІО МО: 19, ії 5ЕО ІЮО МО: 20.
В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з МО5Р і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Ор, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: ФЕО ІЮ МО: 13,
ЗЕО І МО: 34, 5ЕО ІЮО МО: 36, 5ЕО ІЮО МО: 39 ії 5ЕО ІО МО: 41, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 У, 98 У», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: 5ЕО ІЮ
МО: 17, БЕО ІЮ МО: 43, 5ЕО ІЮ МО: 46, ЗЕО ІЮ МО: 47 і БЕО ІЮО МО: 51.
В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з МСО5Р і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Ор, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності «ЕЕ ІЮО МО: 13, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 95, 98 Фо, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності ХЕО ІО МО: 17.
В конкретному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент являє собою одержану в результаті кросинговеру молекулу Раб, в якій обмінені або варіабельні, або константні ділянки легкого ланцюга Раб і важкого ланцюга Раб. В ще більш переважному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент являє собою одержану в результаті кросинговеру молекулу Рарб, в якій обмінені константні ділянки легкого ланцюга Еаб і важкого ланцюга Еар.
В одному з варіантів здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент являє собою канонічну молекулу Раб.
В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу не більше одного антигензв'язувального фрагмента, що має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ, є присутнім в активувальній Т- клітини біспецифічній антигензв'язувальній молекулі (тобто активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула забезпечує одновалентне зв'язування з СОЮЗ).
Зо В іншому варіанті здійснення винаходу зазначена активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула додатково містить третій антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Рар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з антигеном клітини- мішені. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена третя антигензв'язувальна молекула являє собою канонічну молекулу Бар. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена третя антигензв'язувальна молекула ідентична другому антигензв'язувальному фрагменту.
В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула додатково містить третій антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Бар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СЕА, і містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮО МО: 24, 5ЕО ІЮО МО: 25 ії 5ЕО ІЮО МО: 26, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІЮ МО: 28, 5ЕО ІО МО: 29 і ЗЕО ІЮ МО: 30.
В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула додатково містить третій антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Раб, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СЕА, і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 90, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮО МО: 23, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 9595, 9695, 97 95, 9895, 9995 або 100 95
БО ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІО МО: 27.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула додатково містить третій антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Бар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з МСО5Р, і містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 14, 5ЕБО ІЮО МО: 15, 5ЕО ІО МО: 16, 5ЕО ІЮО МО: 35, 5ЕО ІЮО МО: 37,
ЗЕО ІЮ МО: 38 ії ЗЕО ІО МО: 40, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з: БЕО ІЮ
МО: 18, БЕО ІЮО МО: 19, 5ЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО ІО МО: 44, 5ЕО ІЮ МО: 45, 5ЕО ІО МО: 48, 5ЕО Ір
МО: 49 і 5ЕО ІЮ МО: 50.
В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена активувальна Т-клітини біспецифічна бо антигензв'язувальна молекула додатково містить третій антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Бар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з МСО5Р, і містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮО МО: 14, 5ЕО ІЮО МО: 15 ї 5ЕО ІЮО МО: 16, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІЮ МО: 18, 5ЕО ІО МО: 19 і ЗЕО ІЮ МО: 20.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула додатково містить третій антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Бар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з МСО5Р, і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 90, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: ЗЕО ІО МО: 13, 5ЕО ІЮ МО: 34, 5ЕО ІЮ МО: 36, 5ЕО ІЮО МО: 391
ЗЕО ІО МО: 41, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: 5ЕО 10 МО: 17, 5ЕО ІЮ МО: 43, 5ЕО І МО: 46,
ЗЕО ІЮ МО: 47 і ЗЕО ІЮ МО: 51.
В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула додатково містить третій антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Бар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з МСО5Р, і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 13, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність ФЕО ІО МО: 17.
В деяких варіантах здійснення винаходу перший і другий антигензв'язувальні фрагменти активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули злиті один з іншим необов'язково через пептидний лінкер. В одному із зазначених варіантів здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем важкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента. В іншому зазначеному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем важкого ланцюга Раб другого антигензв'язувального фрагмента. В варіантах здійснення винаходу, в яких або (І) другий антигензв'язувальний фрагмент злитий на
С-кінці важкого ланцюга Раб з М-кінцем важкого ланцюга баб першого антигензв'язувального фрагмента, або (Ії) перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга
Зо Ба з М-кінцем важкого ланцюга Бар другого антигензв'язувального фрагмента, додатково легкий ланцюг Бар першого антигензв'язувального фрагмента і легсий ланцюг Раб другого антигензв'язувального фрагмента можуть бути злиті один з іншим необов'язково через пептидний лінкер.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула додатково містить (ІП) Ес-домен, що складається з першої й другої субодиниць, які мають здатність до стабільної асоціації.
В одному з варіантів здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули злитий на С-кінці важкого ланцюга Раб з М-кінцем першої або другої субодиниці Ес-домену. В іншому варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М- кінцем першої або другої субодиниці Ес-домену. В одному з варіантів здійснення винаходу перший і другий антигензв'язувальний фрагмент активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули кожний злитий на С-кінці важкого ланцюга Еар з М-кінцем однієї з субодиниць Ес-домену.
В одному з варіантів здійснення винаходу третій антигензв'язувальний фрагмент злитий на
С-кінці важкого ланцюга Раб з М-кінцем першої або другої субодиниці Ес-домену. В конкретному варіанті здійснення винаходу другий і третій антигензв'язувальний фрагмент активувальної Т- клітини антигензв'язувальної молекули кожний злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М- кінцем однієї з субодиниць Ес-домену, і перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на С- кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем важкого ланцюга Бар другого антигензв'язувального фрагмента. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу перший і третій антигензв'язувальний фрагмент активувальної Т-клітини антигензв'язувальної молекули кожний злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем однієї з субодиниць Ес-домену, а другий антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем важкого ланцюга Раб першого антигензв'язувального фрагмента. Компоненти активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули можна зливати безпосередньо або через прийнятні пептидні лінкери. В одному з варіантів здійснення винаходу перший і третій антигензв'язувальні фрагменти і Ес-домен утворюють частину молекули імуноглобуліну.
В конкретному варіанті здійснення винаходу молекула імуноглобуліну являє собою бо імуноглобулін класу до. В ще більш переважному варіанті здійснення винаходу імуноглобулін являє собою імуноглобулін підкласу Ідс1. В іншому варіанті здійснення винаходу імуноглобулін являє собою імуноглобулін підкласу Ідса.
В конкретному варіанті здійснення винаходу Ес-домен являє собою Ес-домен дос. В конкретному варіанті здійснення винаходу Ес-домен являє собою Ес-домен Ідс:і. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу Ес-домен являє собою Ес-домен Ідса. Ще в одному конкретному варіанті здійснення винаходу Ес-домен являє собою Ес-домен Ідса, який містить амінокислотну заміну 5228Р (нумерація за Кеботом). В конкретному варіанті здійснення винаходу Ес-домен є людським Ес-доменом.
В конкретних варіантах здійснення винаходу Ес-домен містить модифікацію, яка сприяє асоціації першої й другої субодиниць Ес-домену. В зазначеному конкретному варіанті здійснення винаходу амінокислотний залишок в СНЗ-домені першої субодиниці Ес-домену замінюють на амінокислотний залишок, що має більший об'єм бокового ланцюга, створюючи тим самим опуклість в СНЗ-домені першої субодиниці, яка може поміщатися в порожнину в
СНЗ-домені другої субодиниці, а амінокислотний залишок в СНЗ-домені другої субодиниці Ес- домену замінюють на амінокислотний залишок, що має менший об'єм бокового ланцюга, створюючи тим самим порожнину в СНЗ-домені другої субодиниці, в яку може поміщатися опуклість в СНЗ-домені першої субодиниці.
В конкретному варіанті здійснення винаходу Ес-домен має знижену афінність зв'язування з
Ес-рецептором і/або зниженою ефекторною функцією у порівнянні з нативним Ес-доменом дес.
В деяких варіантах здійснення винаходу Ес-домен створюють так, щоб він мав знижену афінність зв'язування з Ес-рецептором і/або знижену ефекторну функцію у порівнянні з не створеним за допомогою інженерії Ес-доменом. В одному з варіантів здійснення винаходу Ес- домен містить одну або декілька амінокислотну(їх) заміну(н), яка(ї) знижує(ють) зв'язування з Ес- рецептором і/або ефекторну функцію. В одному з варіантів здійснення винаходу одна або декілька амінокислотна(їх) заміна(н) в Ес-домені, яка(ї) знижує зв'язування з Ес-рецептором і або ефекторну функцію, знаходиться(яться) в одному або декількох положеннях, вибраних з групи, що містить І 234, І 235 і РЗ329 (нумерація за Кеботом). В конкретних варіантах здійснення винаходу кожна субодиниця Ес-домену містить три амінокислотні заміни, які знижують зв'язування з Ес-рецептором і/або ефекторну функцію, де зазначені амінокислотні заміни представляють собою І234А, 1235А і РЗ290. В одному із зазначених варіантів здійснення винаходу Ес-домен являє собою Есо-домен Ідсі, зокрема Бсо-домен людського Ідс:і. В інших варіантах здійснення винаходу кожна субодиниця Ес-домену містить дві амінокислотні заміни, які знижують зв'язування з Ес-рецептором і/або ефекторну функцію, де зазначені амінокислотні заміни представляють собою І/235Е і РЗ290. В одному із зазначених варіантів здійснення винаходу Ес-домен являє собою Ес-домен Ідса, зокрема, Ес-домен людського Ідся«. В одному з варіантів здійснення винаходу Бс-домен активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули являє собою Ес-домен Ідосзх і містить амінокислотні заміни І 235Е і 5228Р (ЗРІ Е).
В одному з варіантів здійснення винаходу Ес-рецептор являє собою Есу-рецептор. В одному з варіантів здійснення винаходу Ес-рецептор являє собою людський Ес-рецептор. В одному з варіантів здійснення винаходу Ес-рецептор являє собою активувальний Ес-рецептор. В конкретному варіанті здійснення винаходу Ес-рецептор являє собою людський ЕсукКІПа, ЕсукіІ мМабо ЕсукКІШа. В одному з варіантів здійснення винаходу ефекторна функція являє собою антитіло-зумовлену клітинно-залежну цитотоксичність (АОС).
Іншим об'єктом винаходу є виділений полінуклеотид, що кодує активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході, або її фрагмент.
Винахід відноситься також до поліпептидів, які кодуються полінуклеотидами, що запропоновані у винаході. Винахід відноситься також до експресійного вектора, що містить виділений полінуклеотид, запропонований у винаході, і клітини-хазяїна, що містить виділений полінуклеотид або експресійний вектор, запропонований у винаході. В деяких варіантах здійснення клітина-хазяїн являє собою еукаріотичну клітину, зокрема, клітину ссавця.
Іншим об'єктом винаходу є спосіб одержання активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка пропонується у винаході, який полягає у тому, що здійснюють стадії, на яких а) культивують клітину-хазяїна, запропоновану у винаході, в умовах, придатних для експресії активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, і б) виділяють активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу. Винахід відноситься також до активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, одержаної способом, запропонованим у винаході.
Винахід відноситься також до фармацевтичної композиції, що містить активувальну Т- клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході, « фармацевтично прийнятний носій.
Під об'єм винаходу підпадають також способи застосування активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули і фармацевтичної композиції, які запропоновані у винаході Одним з об'єктів винаходу є активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула або фармацевтична композиція, запропонована у винаході, призначена для застосування як лікарського засобу. Одним з об'єктів винаходу є активувальна
Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула або фармацевтична композиція, запропонована у винаході, призначена для застосування при лікуванні захворювання в індивідуума, який цього потребує. В конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання являє собою рак.
Запропоновано також застосування активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка пропонується у винаході, для приготування лікарського засобу для лікування захворювання в індивідуума, який цього потребує; а також спосіб лікування захворювання в індивідуума, який полягає у тому, що вводять зазначеному індивідууму в терапевтично ефективній кількості композицію, яка містить активувальну Т- клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході, уУ фармацевтично прийнятній формі. В конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання являє собою рак. У будь-якому з перерахованих вище варіантів здійснення винаходу індивідуум переважно являє собою ссавця, насамперед людину.
У винаході також запропонований спосіб індукції лізису клітини-мішені, зокрема, пухлинної клітини, який полягає у тому, що приводять у контакт клітину-мішень з активувальною Т-клітини біспецифічною антигензв'язувальною молекулою, яка пропонується у винаході, в присутності Т- клітини, зокрема цитотоксичної Т-клітини.
Короткий опис креслень
На кресленнях показано: на фіг 1 - приклади конфігурацій активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул (ТОВ), які запропоновані у винаході. (А) Ілюстрація молекули
Зо "14-41 Ід Стгоз5тар". (Б) Ілюстрація молекули "2-1 до Сгозвтар". (В) Ілюстрація молекули "241
Ід Сго55тар" з альтернативним порядком розташування компонентів, що являють собою
Сгоз55табр і баб Сінвертована"). (Г) Ілюстрація молекули "14-41 Сто55Мар". (Д) Ілюстрація молекули "2-1 Ід Сго5зетар, зв'язаний легкий ланцюг". (Е) Ілюстрація молекули "1-41 Ід Стго55гтар, зв'язаний легкий ланцюг". (Ж) Ілюстрація молекули "2-1 дос Сгоз5гар, інвертована, зв'язаний легкий ланцюг". (3) Ілюстрація молекули "1-1 Ід Стгоз5іар, інвертована, зв'язаний легкий ланцюг" Чорна крапка: необов'язкова модифікація в Ес-домені, що сприяє гетеродимеризації; на фіг. 2 - порівняльний аналіз первинної структури клонів антитіл до МС5Р з дозрілою афінністю відносно батьківського клону з недозрілою афінністю (М4-3 МІ 2); на фіг 3 - схематичне зображення активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули до МС5Р (ТОСВ-молекула (антитіло) до МСО5Р) (2--1 Стов5тар-Іда
РЗ290 І АГА, інвертована); на фіг. 4 - результати, одержані за допомогою аналізу методом капілярного електрофорезу в присутності ДСН (КЕ-ДСН)У ТСОВ-молекули до МОР (24-41 Стгоз55їар-ІДа РЗ2гОС АГА, інвертована, 560 ІЮО МО: 12, 53, 54 і 55). Електрофореграми представлені у вигляді результатів
ДСН-ПААГ ТОСВ-молекули до МСОС5Р: А) невідновлювальні умови, Б) відновлювальні умови; на фіг. 5 - схематичне зображення ТОВ-молекули до СЕА (2-1 Стозеїар-Ое РЗ2гОС АГА, інвертована); на фіг. б - результати, одержані за допомогою КЕ-ДСН, ТОВ-молекули до СЕА (241
Стоз5е5їар-дос РЗ290 ГАГА, інвертована, ЗЕО ІЮ МО: 22, 56, 57 і 58). Електрофореграми представлені у вигляді результатів ДСН-ПААГ ТОВ-молекули до СЕА: А) невідновлювальні умови, Б) відновлювальні умови; на фіг. 7 - результати аналізу зв'язування ТОВ-молекули до МС5Р (ЗЕО ІЮ МО: 12, 53, 54 і 55) з АЗ75-клітинами (МСЗР") (А) і УиїКаї (СО3:-клітини) (Б). "Неспрямована" ТОВ-молекула": біспецифічне антитіло, яке зв'язується з СОЮЗ, але не з другим антигеном (ЗЕО ІО МО: 59, 60, 61 і 62); на фіг. 8 - результати аналізу Т-клітинного цитолізу клітин-мішеней, індукованого ТСВ- антитілом до МС5Р (ЗЕО ІЮО МО: 12, 53, 54 і 55), одержані на клітинах ліній АЗ75 (високий рівень
МО5Р) (А), МУ-3 (середній рівень МО5Р) (Б), НСТ-116 (низький рівень МО5ЗР) (В) ії І 5180 (МО5Р-негативні) (Г) (Е:Т-10:1, як ефекторні клітини застосовували людські РВМС, тривалість інкубації 24 год.). "Неспрямована" ТОВ-молекула": біспецифічне антитіло, яке зв'язується з СОЮЗ, але не з другим антигеном (ЗЕО ІО МО:59, 60, 61 і 62); на фіг. 9 - результати аналізу підвищувальної регуляції СО25 і СО69 на людських СО8--(А,
Б) і С0а4-- (В, Г)-Т-клітинах після опосередкованого Т-клітинами цитолізу клітин меланоми лінії
МУЗ (Е:/Т-1071, тривалість інкубації 24 год.), яка індукується ТОВ-антитілом до МС5Р (ЗЕО ІЮ
МО: 12, 53, 54 і 55). "Неспрямована" ТОВ-молекула": біспецифічне антитіло, яке зв'язується з
СОЗ3, але не з другим антигеном (ЗЕО ІО МО:59, 60, 61 і 62); на фіг. 10 - результати аналізу секреції І/-2 (А), ІЕМ-у (Б), ТМЕа (В), 1--4 (Г), ІС-10 (Д) і гранзиму В (Е) людськими РВМС після опосередкованого Т-клітинами цитолізу клітин меланоми лінії МУЗ (Е-Т-1071, тривалість інкубації 24 год.), яка індукується ТОВ-антитілом до МСЗР (ЗЕО
ІО МО: 12, 53, 54 і 55). "Неспрямована" ТОВ-молекула": біспецифічне антитіло, яке зв'язується з
СОЗ3, але не з другим антигеном (ЗЕО ІО МО:59, 60, 61 і 62); на фіг. 11 - результати аналізу зв'язування ТОВ-молекули до СЕА (5ЕО ІЮ МО: 22, 56, 57 і 58) з клітинами, що експресують СЕА оаденокарциноми легені лінії АБбБ49 (А) їі з імморталізованими лініями, що експресують СОЗ Т-лімфоцитів людини і мавп-циномолгус (Чигкаї (Б) ії Н5С-Е (В) відповідно); на фіг. 12 - результати аналізу Т-клітинного цитолізу, індукованого ТОВ-молекулою до СЕА (ЗЕБЕО І МО: 22, 56, 57 і 58), клітин лінії НРАНКІЇ (високий рівень СЕА) (А, Д), ВхРО-3 (середній рівень СЕА) (Б, Е), АБРО-1 (низький рівень СЕА) (В, Ж) і НСТ-116 (СЕА-негативні) (Г, 3).
Е:Т-10:1, як ефекторних клітин застосовували людські РВМС, тривалість інкубації 24 год. (А-Г) або 48 год. (Д-3). "Неспрямована" ТОВ-молекула": біспецифічне антитіло, яке зв'язується з СОЮЗ, але не з другим антигеном (ЗЕО ІО МО:59, 60, 61 і 62); на фіг. 13 - результати аналізу проліферації людських СО8:- ії СО4--Т-клітин (А-Г) і підвищувальної регуляції СО25 на людських СО8:- і СО4-Т-клітинах (Д-3) через 5 днів після опосередкованого Т-клітинами цитолізу клітин лінії НРАНІЇ (високий рівень СЕА) (А, Д), ВХхРО-3 (середній рівень СЕА) (Б, Е), АЗРО-1 (низький рівень СЕА) (В, Ж) і НСТ-116 (СЕА-негативні) (Г, 3), індукованого ТСВ-молекулою до СЕА (ЗЕО ІЮ МО: 22, 56, 57 і 58). "Тов ОР47": біспецифічне антитіло, яке зв'язується з СОЮЗ, але не з другим антигеном (5ЕО
ІО МО: 59, 60, 61 і 62);
Зо на фіг. 14 - результати аналізу секреції ІЄМ-у (А), ТМЕа (Б), гранзима В (В), 1-2 (ГУ, 1--6 (Д) і
І--10 (Е) після опосередкованого Т-клітинами цитолізу пухлинних клітин лінії МКМ45 (Е:Т-10:1, тривалість інкубації 48 год.), індукованого молекулою ТОВ до СЕА (5ЕО ІЮ МО: 22, 56, 57 і 58). "Неспрямована" ТОВ-молекула": біспецифічне антитіло, яке зв'язується з СОЮЗ, але не з другим антигеном (5ЕО ІЮ МО: 59, 60, 61 і 62); на фіг. 15 - результати аналізу опосередкованого Т-клітинами цитолізу пухлинних клітин- мішеней І 5180, які експресують СЕА, індукованого ТОВ-молекулою до СЕА (ЗЕО ІЮ МО: 22, 56, 57 і 58) в присутності збільшуваних концентрацій СЕА, що секретується (5СЕА), при оцінюванні через 24 год. (А) або 48 год. (Б) після інкубації з ТОВ-молекулою до СЕА і 5СЕА; на фіг. 16 - результати аналізу опосередкованого Т-клітинами цитолізу клітин лінії Аб549 (аденокарцинома легені), що надекспресують людський СЕА (А549-ПНСЕА), одержані через 21 год. (А, Б) і 40 год. (В, Г) після інкубації з молекулою ТОВ до СЕА (ЗЕО ІО МО: 22, 56, 57 і 58) і людськими РВМС (А, В) або РВМС мавп-циномолгус (Б, Г) як ефекторних клітин; на фіг. 17 - результати аналізу опосередкованого Т-клітинами цитолізу клітинних ліній, що експресують СЕА людських колоректального раку, індукованого ТОВ-молекулою до СЕА (ЗЕО
ІО МО: 22, 56, 57 і 58) при застосуванні в концентрації 0,8 нМ (А), 4 нМ (Б) і 20 нМ (В). (Г) - дані про кореляцію між рівнем експресії СЕА і9о специфічного лізису при застосуванні ТСВ- молекули до СЕА в концентрації 2ОнМ, (Д) - дані про кореляцію між рівнем експресії СЕА і величиною ЕСзо ТСВ-молекули до СЕА; на фіг. 18 - результати оцінювання протипухлинної ефективності іп мімо ТОВ-молекули до
СЕА (5ЕО ІО МО: 22, 56, 57 і 58) при застосуванні сумісної трансплантації клітин карциноми ободової кишки людини лінії Ї5174Т-йис2 з людськими РВМС (співвідношення Е:Т-5:1).
Результати представлені у вигляді середнього значення і СКО (середня квадратична помилка), одержаних для 12 мишей, у яких вимірювали об'єм пухлин за допомогою кронциркуля (А і В) або за допомогою біолюмінесценції (інтегральний потік), Б і Г) в різних оброблювальних групах. (А, Б) - рання стадія лікування, що починається в день 1, (В, Г) відкладене лікування, що починається в день 7. Як негативного контролю застосовували ТСВ-молекулу до МС5Р (5ЕО ІЮ
МО: 12, 53, 54 і 55); на фіг. 19 - результати оцінювання протипухлинної ефективності іп мімо ТОВ-молекули до
СЕА (5ЕО ІО МО: 22, 56, 57 і 58) при застосуванні сумісної трансплантації клітин карциноми 60 ободової кишки людини лінії Ї5174Т-йис2 з людськими РВМС (співвідношення Е:Т-1:1).
Результати представлені у вигляді середнього значення і СКО, одержаних для 10 мишей, у яких вимірювали об'єм пухлин за допомогою кронциркуля (А і В) або за допомогою біолюмінесценції (інтегральний потік, Б і Г) в різних оброблювальних групах. Як негативного контролю застосовували ТСВ-молекулу до МС5Р (ЗЕО ІО МО: 12, 53, 54 і 55); на фіг. 20 - результати оцінювання ефективності іп мімо мишачизованої (що містить ділянки мишачого антитіла) ТСВ-молекули до СЕА, одержані на ортотопічної моделі пухлини Рапсо2-
ПиСЕА, створеної на імунокомпетентних трансгенних мишах лінії пиСОЗє/пиСЕА; на фіг. 21 - дані про термостабільність ТОВ-молекули до СЕА. Аналіз на основі динамічного розсіяння світла, виміряні при зміні температури від 25 до 75 "С зі швидкістю 0,05 "С/хв.
Дублікат позначений сірим кольором; на фіг. 22 - дані про термостабільність ТОВ-молекули до МОЗР. Аналіз на основі динамічного розсіяння світла, виміряні при зміні температури від 25 до 75 "С зі швидкістю 0,05 "б/хв. Дублікат позначений сірим кольором; на фіг. 23 - результати аналізу опосередкованого Т-клітинами цитолізу, індукованого ТСВ- антитілом до МС5Р (5ЕО ІЮО МО: 12, 53, 54 і 55) їі ТСВ-антитілом до МСО5Р "1-1 Стоз5Маб", пухлинних клітин-мішеней: (А) АЗ75 (високий рівень МС5Р), (Б) ММУ-3 (середній рівень МСО5Р) і (В) НСТ-116 (низький рівень МОР). (Г) 15180 (МО5Р-негативна лінія пухлинних клітин) застосовували як негативного контролю. Цитоліз пухлинних клітин оцінювали через 24 год. (А-Г) і 48 год. (Д-3) після інкубації клітин-мішеней з антитілами і ефекторними клітинами (людські
РВМС); на фіг. 24 - результати аналізу підвищувальної регуляції СО25 і СО69 на людських СО8-- і бра--Т-клітинах після Т-клітинного цитолізу пухлинних клітин, що експресують МСЗР (АЗ75, А-Г і МУ-3, Д-3), зумовленого ТСВ-антитілом до МС5Р (ЗЕО ІО МО: 12, 53, 54 і 55) і ТСВ-антитілом до МСО5Р "1-41 Сто55Маб"; на фіг. 25 - результати, одержані за допомогою КЕ-ДСН, для антитіла ТОВ ОРА7 5 ("241
Стоз55тар-Ідс РЗ290 ГАГА, інвертована" - "неспрямована" ТСОВ-молекула", БЕО ІО МО: 59, 60, 61 і 62), яка містить ОРА7 5 як незв'язувальне антитіло і гуманізоване СН2527 як антитіло до
СО3. Електрофореграми представлені у вигляді результатів ДСН-ПААГ ТОВ-молекули ОРА7 се: А) невідновлювальні умови, Б) відновлювальні умови.
Докладний опис винаходу
Визначення
Поняття, застосовні в даному описі, мають значення, загальноприйнятні в даній галузі, якщо нижче спеціально не зазначене інше.
В контексті даного опису поняття "антигензв'язувальний фрагмент" у найбільш широкому смислі відноситься до молекули, яка специфічно зв'язується з антигенною детермінантою.
Прикладами антигензв'язувальних фрагментів є імуноглобуліни та їх похідні, наприклад, фрагменти.
Поняття "біспецифічна" означає, що антигензв'язувальна молекула має здатність специфічно зв'язуватися щонайменше з двома різними антигенними детермінантами. Як правило, біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить два антигензв'язувальних сайти, кожний з яких є специфічним у відношенні різних антигенних детермінант. В деяких варіантах здійснення винаходу біспецифічна антигензв'язувальна молекула має здатність одночасно зв'язуватися з двома антигенними детермінантами, насамперед з двома антигенними детермінантами, які експресуються на двох різних клітинах.
В контексті даного опису поняття "валентність" означає наявність певної кількості антигензв'язувальних сайтів в антигензв'язувальній молекулі. Так, поняття "одновалентне зв'язування з антигеном" означає наявність одного (і не більше одного) специфічного у відношенні антигену антигензв'язувального сайти в антигензв'язувальній молекулі.
Поняття "антигензв'язувальний сайт" відноситься до сайту, тобто одного або декільком амінокислотним залишкам антигензв'язувальної молекули, які забезпечують взаємодію з антигеном. Наприклад, антигензв'язувальний сайт антитіла містить амінокислотні залишки з гіперваріабельних ділянок (що визначають комплементарність ділянок) (СОК). Нативна молекула імуноглобуліну має два антигензв'язувальних сайти, молекула Раб, як правило, має один антигензв'язувальний сайт.
В контексті даного опису поняття "антигензв'язувальний фрагмент" відноситься до поліпептидної молекули, яка специфічно зв'язується з антигенною детермінантою. В одному з варіантів здійснення винаходу антигензв'язувальний фрагмент має здатність спрямовувати субстанцію, до якої він приєднаний (наприклад, другий антигензв'язувальний фрагмент), до сайту-мішені, наприклад, до специфічного типу пухлинної клітини або строми пухлини, що несе бо антигенну детермінанту. В іншому варіанті здійснення винаходу антигензв'язувальний фрагмент має здатність активувати передачу сигналів через його антиген-мішень, наприклад, антиген комплексу Т-клітинного рецептора. Антигензв'язувальні фрагменти містять антитіла і їх фрагменти, що додатково описано нижче. Переважні антигензв'язувальні фрагменти містять антигензв'язувальний домен антитіла, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла і варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла. В деяких варіантах здійснення винаходу антигензв'язувальні фрагменти можуть містити константні ділянки антитіла, що додатково описано нижче і відомо в даній ділянці. Придатні константні ділянки важких ланцюгів містять будь-які з п'яти ізотипів: а, 0, є, у або н. Придатні константні ділянки легких ланцюгів містять будь-які з двох ізотипів: к і А.
В контексті даного опису поняття "антигенна детермінанта" є синонімом понять "антиген" і "епітоп" і відноситься до сайту (наприклад, ділянки, що складається з суміжних амінокислот, або конформаційної конфігурації, що складається з різних областей несуміжних амінокислот) на поліпептидній макромолекулі, 3 кою зв'язується антигензв'язувальний фрагмент з утворенням комплексу антигензв'язувальний фрагмент-антиген. Придатні антигенні детермінанти можуть бути присутніми, наприклад, на поверхні пухлинних клітин, на поверхні інфікованих вірусом клітин, на поверхні інших хворих клітин, на поверхні імунних клітин, клітин, що знаходяться у вільному стані в сироватці крові і/або у позаклітинному матриксі (ЕСМ). В контексті даного опису білки, що відносяться до антигенів (наприклад, МС5Р, СЕА, СОЗ), якщо не зазначене інше, можуть представляти собою будь-які нативні форми білків з будь-якого застосовного як джерела хребетної тварини, включаючи ссавців, таких як примати (наприклад, люди) і гризуни (наприклад, миші й щури). В конкретному варіанті здійснення винаходу антиген являє собою людський білок. В контексті даного опису при посиланні на конкретний білок мають на увазі "повнорозмірний", непроцесований білок, а також будь- яку форму білка, одержану в результаті процесингу в клітині. Під поняття підпадають також варіанти білка, що зустрічаються в природних умовах, наприклад, сплайсингові варіанти або алельні варіанти.
Прикладами людських білків, придатних як антигени, є (але, не обмежуючись тільки ними): асоційований з меланомою хондроїтинсульфат-протеоглікан (МС5Р), відомий також як хондроїтинсульфат- протеоглікан 4 (С5РО4, ОпіРгої Ме О6ИМКІ (версія 70), МСВІ БеЗед Ме МР 0018882); карциноембріональний антиген (СЕА), відомий також як споріднений молекулі клітинної адгезії 5 карциноембріональний антиген (СЕАСАМ5, ОпіРгої Ме РОб7З31 (версія 119), МСВІ РБеїбед Ме
МР 004354.2); і СОЗ, насамперед епсилон-субодиниця СОЗ (див. ОпіРгої Ме РО7766 (версія 130), МОВІ
Веїбед Ме МР 0007241, в ЗЕО ІЮ МО: 103 представлена людська послідовність; або ОпіРргої Ме 0951 15 (версія 49), МСВІ СепВапк Ме ВАВ71849.1, в БЕО ІЮ МО: 104 представлена послідовність мавп циномолгус (яванський макак-крабоїд) (Масаса гїазсісціагіз!). В деяких варіантах здійснення винаходу активувальна Т- клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, запропонована у винаході, зв'язується з епітопом
СОЗ або антигену клітини-мішені, який є консервативним для СОЗ або антигену-мішені з різних видів. В деяких варіантах здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, запропонована у винаході, зв'язується з СЮОЗ і СЕАСАМУ5, але не зв'язується з СЕАСАМІ або СЕАСАМб. Поняття "специфічно зв'язується" означає, що зв'язування є вибірковим у відношенні антигена і його можна відрізняти від небажаних або неспецифічних взаємодій. Здатність антигензв'язувального фрагмента зв'язуватися зі специфічною антигенною детермінантою, можна визначати за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗБА) або інших методик, відомих спеціалісту в даній галузі техніки, наприклад, за допомогою методики на основі поверхневого плазмонного резонансу (проводячи аналіз за допомогою пристрою ВіАсоге) (ГіЦеріай та інш., сіІусо У 17, 2000, сс. 323- 329), і традиційних аналізів зв'язування (Нееїеу, Епдосг Кез 28, 2002, сс. 217-229). В одному з варіантів здійснення винаходу рівень зв'язування антигензв'язувального фрагмента з неспорідненим білком складає менше ніж приблизно 1095 від рівня зв'язування антигензв'язувального фрагмента з антигеном, при вимірюванні, наприклад, за допомогою 5РЕ.
В деяких варіантах здійснення винаходу антигензв'язувальний фрагмент, який зв'язується з антигеном, або антигензв'язувальна молекула, яка містить антигензв'язувальний фрагмент, характеризується величиною константи дисоціації (Ко), яка складає «1 мкМ, «100 нМ, «10 нм, «1 НМ, «0,1 НМ, «0,01 нМ або «0,001 нМ (наприклад, 108 М або менше, наприклад, від 109 М до 1073 М, наприклад, від 1079 М до 10-13 М).
Поняття "афінність" відноситься до сумарної сили всіх нековалентних взаємодій між індивідуальним сайтом зв'язування молекули (наприклад, рецептора) і її партнера зі зв'язування (наприклад, ліганду). Якщо не зазначене інше, то в контексті даного опису поняття "афінність зв'язування" відноситься до притаманній компонентам зв'язувальної пари (наприклад, антигензв'язувального фрагменту і антигену або рецептору і ліганду) афінності зв'язування, що відбиває взаємодію за типом 1:1. Афінність молекули Х до її партнера ХУ можна, як правило, 60 характеризувати за допомогою константи дисоціації (Ко), яка являє собою відношення констант швидкості реакції дисоціації й асоціації (Кок і Коп відповідно). Так, еквівалентні афінності можуть відповідати різним константам швидкості, якщо співвідношення констант швидкості залишається там самим. Афінність можна оцінювати загальноприйнятними методами, відомими в даній галузі, включаючи представлені в даному описі методи. Конкретним методом вимірювання афінності є метод поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК).
Поняття "знижене зв'язування (знижена здатність до зв'язування)", наприклад, знижена здатність до зв'язування з Ес-рецептором, відноситься до зниження афінності відносно відповідної взаємодії, виміряної, наприклад, за допомогою 5РК. Для ясності слід пояснити, що поняття охоплює також зниження афінності до нуля (або нижче межі виявлення аналітичного метода), тобто повну елімінацію взаємодії. І, навпаки, "підвищене зв'язування (підвищена здатність до зв'язування)" відноситься до підвищення афінності зв'язування відносно відповідної взаємодії.
Поняття "Т-клітинна активація (активація Т-клітин)" в контексті даного опису відноситься до однієї або декільком клітинним відповідям Т-лімфоциту, зокрема, цитотоксичного Т-лімфоциту, вибраним з: проліферації, диференціації секреції цитокінів, вивільнення цитотоксичних ефекторних молекул, цитотоксичної активності і експресії маркерів активації. Біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т-клітини, запропоновані у винаході, мають здатність індукувати Т-клітинну активацію.
Прийнятні аналізи оцінювання Т-клітинної активації, відомі в даній галузі, представлені в даному описі.
Поняття "антиген клітини-мішені" в контексті даного опису відноситься до антигенної детермінанти, яка є присутньою на поверхні клітини-мішені, наприклад, клітини в пухлини, такої як ракова клітина або клітина строми пухлини.
В контексті даного опису поняття "перший" і "другий" відносно антигензв'язувальних фрагментів тощо застосовують з метою зручності розрізнення, коли є присутнім більше одного типу кожного з фрагментів. Застосування цих понять не має на увазі їх конкретний порядок або орієнтацію в активувальній Т-клітини біспецифічній антигензв'язувальній молекулі, якщо спеціально не зазначене інше.
Поняття "молекула Рар" відноситься до білка, що складається з МН і СНІ-домену важкого ланцюга ("важкий ланцюг Раб") і МІ. і СІ -домену легкого ланцюга ("легкий ланцюг Рар") імуноглобуліну.
Під поняттям "злиті" мають на увазі, що компоненти (наприклад, молекула Раб і субодиниця
Ес-домену) поєднані пептидними зв'язками, або безпосередньо, або за допомогою одного або декількох пептидних лінкерів.
В контексті даного опису поняття "одноланцюгова" відноситься до молекули, що містить амінокислотні мономери, зв'язані лінійно за допомогою пептидних зв'язків. В деяких варіантах здійснення винаходу антигензв'язувальний фрагмент являє собою одноланцюгову молекулу Раб, тобто молекулу Раб, в якій легкий ланцюг Рар і важкий ланцюг Бар поєднані за допомогою пептидного лінкера з утворенням одного пептидного ланцюга. В конкретному зазначеному варіанті здійснення винаходу С-кінець легкого ланцюга Рар поєднаний з М-кінцем важкого ланцюга Рар в одноланцюговій молекулі Раб.
Під одержаною в результаті кросинговеру молекулою Бар (яку позначають також як "Сто55Тар") мають на увазі молекулу Раб, в якій або варіабельні ділянки, або константні ділянки важкого і легкого ланцюга Рар обмінені одна на іншу, тобто одержана в результаті кросинговеру молекула Бар містить пептидний ланцюг, що складається з варіабельної ділянки легкого ланцюга і константної ділянки важкого ланцюга, і пептидний ланцюг, що складається з варіабельної ділянки важкого ланцюга і константної ділянки легкого ланцюга. Для простоти розуміння, слід відзначити, що в одержаній в результаті кросинговеру молекулі Раб, в якій обмінені варіабельні ділянки легкого ланцюга Раб і важкого ланцюга Бар, пептидний ланцюг, який містить константну область важкого ланцюга, позначають в контексті даного опису як "важкий ланцюг" одержаної в результаті кросинговеру молекули Рар. И, навпаки, в одержаній в результаті кросинговеру молекулі Раб, в якій обмінені константні ділянки легкого ланцюга Раб і важкого ланцюга Рар, пептидний ланцюг, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, позначають в контексті даного опису як "важкий ланцюг" одержаної в результаті кросинговеру молекули Еаб.
На противагу до цього, під "канонічною" молекулою Рар мають на увазі молекулу Рар, яка має її природній формат, тобто яка містить важкий ланцюг, що складається з варіабельної і константної областей важкого ланцюга (МН-СНІ), і легкий ланцюг, що складається з варіабельної і константної областей легкого ланцюга (МІ -СІ.).
Поняття "молекула імуноглобуліну" відноситься до білка, що має структуру антитіла, яке зустрічається в природних умовах. Наприклад, імуноглобуліни класу (до представляють собою гетеротетрамерні глікопротеїни з молекулярною масою приблизно 150000 Да, що складаються з двох легких ланцюгів і двох важких ланцюгів, зв'язаних дисульфідними містками. У напрямку від
М-кінця до С-кінця кожний важкий ланцюг містить варіабельну ділянку (МН), яку називають бо також варіабельним важким доменом або варіабельним доменом важкого ланцюга, за яким розташовані три константних домени (СНІ, СН2 ії СНЗ), які називають також константною ділянкою важкого ланцюга. Аналогічно до цього, у напрямку від М-кінця до С-кінця кожна легкий ланцюг містить варіабельну ділянку (МІ), яку називають також варіабельним легким доменом або варіабельним доменом легкого ланцюга, за яким розташований константний домен легкого ланцюга (СІ), який називають також константною ділянкою легкого ланцюга. Важкий ланцюг імуноглобуліну може відноситися до одного з п'яти типів, позначених як а (ІдА), б (ДО), є (9Е), у (с) або н (І9М), деякі з яких додатково підрозділяють на підтипи, наприклад, у: (ІДС), уг (ІДС), уз (ІДСз), ул (Ід4с4), сп (ДА) і а» (ІДАг). Легкий ланцюг імуноглобуліну може відноситися до одного з двох типів, позначених як каппа (к) і лямбда (Х), на основі амінокислотної послідовності її константного домену. Імуноглобулін, як правило, складається з двох молекул Раб і Ес-домену, які поєднані через шарнірну область імуноглобуліну.
В контексті даного опису поняття "антитіло" застосовують у його найбільш широкому сенсі, і воно відноситься до різних структур антитіл, включаючи (але, не обмежуючись тільки ними) моноклональні антитіла, поліклональні антитіла і фрагменти антитіл, за умови, що вони мають потрібну антигензв'язувальну активність.
Поняття "фрагмент антитіла" відноситься до молекули, яка відрізняється від інтактного антитіла, яка містить частину інтактного антитіла, яка має здатність зв'язуватися з антигеном, з яким зв'язується інтактне антитіло. Прикладами фрагментів антитіл є (але, не обмежуючись тільки ними) Ем, Бар, Рар', Баб'-ЗН, К(аб)г, димерні антитіла, лінійні антитіла, одноланцюгові молекули антитіл (наприклад, 5сЕм) і однодоменні антитіла. Огляд деяких фрагментів антитіл див., наприклад, у Ниазоп та інш., Маї Меа 9, 2003, сс. 129-134. Огляд 5сЕм-фрагментів див., наприклад, у РІійсСКІпип в: Тпе РпапгтасоїЇоду ої Мопосіопаї! Апііродієв, т. 113, під ред. Козепригу і
Мооге, вид-во Зргіпдег-Мегпіад, Мемж/ МогкК, 1994, сс. 269-315; див. також УМО 93/16185; ії О5 МоМо 5571894 і 5587458. Обговорення Рар- і Е(аб)2-фрагментів, що містять залишки епітопу, що зв'язується з рецептором рятування, і які мають подовжений час напівжиття іп мімо, див. в О5 Мо 5869046. Димерні антитіла (діабоді) представляють собою фрагменти антитіл з двома антигензв'язувальними сайтами, які можуть бути двохвалентними або біспецифічними (див., наприклад, ЕР 404097; МО 1993/01161; Ниазоп та інш., Маї Меа 9, 2003, сс. 129-134; і НоїІйпдег та інш., Ргос Май Асай сі ОБА 90, 1993, сс. 6444-6448. Тримерні (триабоді) і тетрамерні (тетрабоді) антитіла описані також у Нидзоп та інш., Маї Меа 9, 2003, сс. 129-134. Однодоменні антитіла представляють собою фрагменти антитіл, які містять весь або частину варіабельного домену важкого ланцюга або весь або частину варіабельного домену легкого ланцюга антитіла.
В деяких варіантах здійснення винаходу однодоменне антитіло являє собою людське однодоменне антитіло (фірма ботапіїв5, Іпс., УМактат М.А.; див., наприклад, О5 Мо 6248516 В1).
Фрагменти антитіл можна створювати за допомогою різних методик, включаючи (але, не обмежуючись тільки ними) протеолітичне розщеплення інтактного антитіла, а також одержувати із застосуванням рекомбінантних клітин-хазяїв (наприклад, Е. соїї або фага), як зазначено в даному описі.
Поняття "антигензв'язувальний домен" відноситься до частини антитіла, яка містить область, яка специфічно зв'язується і є комплементарною частині антигену або повному антигену. Антигензв'язувальний домен може представляти собою, наприклад, один або декілька варіабельних доменів антитіла (які називають також варіабельними областями антитіла).
Переважно антигензв'язувальний домен містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ) антитіла і варіабельну ділянку важкого ланцюга (УН) антитіла.
Поняття "варіабельна область" або "варіабельний домен" відноситься до домену важкого або легкого ланцюга антитіла, який приймає участь у зв'язуванні антитіла з антигеном.
Варіабельні домени важкого ланцюга і легкого ланцюга (МН і МІ. відповідно) нативного антитіла, як правило, мають схожі структури, при цьому кожний домен містить чотири консервативних каркасних ділянки (ЕК) і три гіперваріабельних ділянки (НУК) (див., наприклад, Кіпаї та інш.,
Кибу Іттипоіоду, б-ое вид., вид-во М.Н. Егеетап апа Со., 2007, з. 91). Одного МН- або МІ - домену може бути достатньо для забезпечення специфічності зв'язування антигену.
Поняття "гіперваріабельна ділянка" або "НМА" в контексті даного опису відноситься до кожної з ділянок варіабельного домену антитіла, послідовності яких є гіперваріабельними, і/або які утворюють структури у вигляді петель ("іперваріабельні петлі"). Як правило, нативні чотирьохланцюгові антитіла містять шість НМЕ; три в МН (НІ, Н2, НЗ)ітри вм (11,12, 3).
НМЕК, як правило, містять амінокислотні залишки з гіперваріабельних петель і/або з "визначальних комплементарність ділянок" (СОК), останні відрізняються найбільш вираженою варіабельністю послідовності і/або беруть участь у розпізнаванні антигенів. Крім СОКІ1, наявного в МН, СОК, як правило, містять амінокислотні залишки, які утворюють гіперваріабельні петлі. Поняття "гіперваріабельні ділянки" (НМ) відноситься також до "визначальних комплементарність ділянок" (СОК), і в контексті даного опису ці поняття застосовують бо взаємозаміно відносно положень варіабельної ділянки, які формують антигензв'язувальні ділянки. Ця конкретная область описана у Кабраї та інш., 0.5. Оері. ої Неайй апа Нитап
Зегмісез5, "Зедиепсез ої Ргоїеїп5 ої Іттипоїіодісаї! Іпіеге5і", 1983 і у Споїпіа та інш., У. Мої. Віої. 196, 1987, сс. 901-917, причому ці визначення відносяться до перекривальних амінокислотних залишків або піднаборів амінокислотних залишків при їх порівнянні один з іншим. Однак в контексті даного опису мають на увазі можливість застосування будь-якого визначення СОК антитіла або його варіантів. Відповідні амінокислотні залишки, з яких складаються СОК, як вони визначені в кожній з процитованих вище посилань, представлені у порівнянні нижче в таблиці А.
Точні номери залишків, які утворюють конкретний СОК, можуть варіюватися залежно від послідовності й розміру СОК. Спеціалісти в даній галузі техніки на основі даних при амінокислотну послідовність варіабельної ділянки антитіла легко можуть визначати, які залишки входять до конкретного СОК.
Таблиця
А. Визначення СОВ' 11111111 Кебот///// | 0 Хота | Ам 1! Нумерація всіх залишків, які входять в СОЕ в таблиці А дана відповідно до номенклатури, запропонованої Кеботом із співавторами (див. нижче). 2 Позначення "АБМ" з великою буквою "р", застосовне в таблиці А, відноситься до СОК, як вони визначені програмою для моделювання антитіл "АБМ" компанії ОхТога МоїІесшаг сгоир.
Кебот із співавторами запропонували також систему нумерації (номенклатуру) послідовностей варіабельних ділянок, яку можна застосовувати для будь-якого антитіла.
Спеціаліст в даній галузі стандартної підготовки може однозначно застосовувати цю систему "нумерації за Кеботом" до будь-якої послідовності варіабельної ділянки, не маючи ніяких експериментальних даних, крім відомостей про саму послідовність. В контексті даного опису поняття "нумерація за Кеботом" відноситься до системи нумерації, описаної у Кабаї та інш., "зедцепсе ої Ргоїеїп5 ої Іттипо!одісаї! Іпіеге5і", вид-во Ш.5. Юері. ої Неакп апа Нитап зЗегмісев, 1983. Якщо не зазначене інше, то посилання на нумерацію положень конкретних амінокислотних залишків у варіабельній ділянці антитіла надані згідно з системою нумерації за
Кеботом.
Нумерація поліпептидних послідовностей в "Переліку послідовностей" не являє собою нумерацію згідно з системою Кебота. Однак в компетенції звичайного спеціаліста в даній галузі техніки є переведення нумерації послідовностей в "Переліку послідовностей" в нумерацію за
Кеботом. "Каркасні ділянки" або "ЕК"-ділянки представляють собою ділянки варіабельних доменів, які відрізняються від залишків гіперваріабельних ділянок (НМА). ЕК варіабельного домену, як правило, представлені чотирма ЕК-доменами: ЕК, ЕК2, ЕКЗ їі ЕК4. Таким чином, послідовності
НМР і ЕЕ, як правило, розташовані в МН (або МІ) в наступному порядку: ЕК1-Н1(І1)-ЕВ2-НА(І2)-
Енпз-НЗ(І-3)-еНа.
Поняття "клас" антитіла або імуноглобуліну відноситься до типу константного домену або константної ділянки, що входить у важкий ланцюг. Існує п'ять основних класів антитіл: ІдА, дО,
ІДЕ, дос ії ДМ, а деякі з них можна додатково підрозділити на підкласи (ізотипи), наприклад,
Ідс, Ід», Ідсз, ІдСз4, ІдАї і ДА». Константні домени важких ланцюгів, що відповідають різним класам імуноглобулінів, позначають як а, б, є, у і и відповідно.
В контексті даного опису поняття "Рс-домен" або "Рс-область" відноситься до С-кінцевої ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну, яка містить щонайменше частину константної ділянки.
Поняття відноситься до нативної послідовності Ес-областей і варіантів Есо-областей. Хоча примежові послідовності Ес-ділянки у важкому ланцюзі їдСсС можуть трохи варіюватися, як правило, Ес-область важкого ланцюга людського до простягається від Субз226 або від Рго230 до карбоксильного кінця важкого ланцюга. Однак С-кінцевий лізин (І уз447) Ес-ділянки може або бути присутнім, або відсутнім. Якщо спеціально не зазначене інше, то нумерація амінокислотних залишків в Ес-ділянці або константній ділянці відповідає системі ЕО-нумерації (яку називають також ЕОМО-індексом), описаній у КабБраї та інш., Зедцепсеб5 ої Ргоїеіп5 ої
Ітітипоїодіса! Іпіегеві, 5-е вид., вид-во Рирієс Неайй Зегмісе, Маїййопа! Інбійшев ої Неайци,
Веїпезаа, МО, 1991. Поняття "субодиниця" ЕРс-домену в контексті даного опису відноситься до одного з двох поліпептидів, що утворюють димерний Ес-домен, тобто до поліпептиду, який містить С-кінцеві константні ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну, що мають здатність до стабільної самоасоціації. Наприклад, субодиниця Ес-домену дО містить константний домен
СН?2 Ід і СНЗ Ід. "Модифікація, що посилює асоціацію першої й другої субодиниць Ес-домену" являє собою маніпуляцію з пептидним каркасом або пост-трансляційні модифікації субодиниці Ес-домену, які зменшують або перешкоджають асоціації поліпептиду, що містить субодиницю Ес-домену, з ідентичним поліпептидом з утворенням гомодимера. В контексті даного опису модифікація, що посилює асоціацію, охоплює насамперед різні модифікації, здійснювані з кожною 3 двох субодиниць Ес-домену, призначених для асоціації (наприклад, першої й другої субодиниць Ес- домену), при цьому, модифікації доповнюють один іншого таким чином, щоб посилювати асоціацію двох субодиниць Ес-домену. Наприклад, модифікація, що посилює асоціацію, може змінювати структуру або заряд однієї або обох субодиниць Ес-домену таким чином, щоб покращувати їх асоціацію стерично або електростатично відповідно. Так, (гетеро)удимеризація має місце між поліпептидом, який містить першу субодиницю Ес-домену, і поліпептидом, який містить другу субодиницю Ес-домену, які можуть бути неідентичними, оскільки додаткові компоненти, злиті з кожною із субодиниць (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти), не є однаковими. В деяких варіантах здійснення винаходу модифікація, що посилює асоціацію, являє собою амінокислотну мутацію в Ес-домені, зокрема, амінокислотну заміну. В конкретному варіанті здійснення винаходу модифікація, що посилює асоціацію, являє собою індивідуальну амінокислотну мутацію, зокрема, амінокислотну заміну, в кожній з двох субодиниць Ес-домену.
Поняття "ефекторні функції", застосовне в даному описі, відноситься до видів біологічної активності, притаманних Ес-ділянці антитіла, які варіюються залежно від ізотипу антитіла.
Прикладами ефекторних функцій антитіла є: здатність зв'язуватися з С14 і комплементзалежна
Зо цитотоксичність (СОС), здатність зв'язуватися з Ес-рецептором, антитіло-зумовлена клітинно- залежна цитотоксичність (АОСС), антитіло-зумовлений клітинно-залежний фагоцитоз (АОСР), секреція цитокінів, опосередковане імунним комплексом поглинання антигену антигенпрезентувальними клітинами, знижувальна регуляція рецепторів клітинної поверхні (наприклад, В-клітинного рецептора); і активація В-клітин.
В контексті даного опису мають на увазі, що поняття "конструювання, сконструйований, інженерія" містять будь-яку маніпуляцію з пептидним каркасом або пост-трансляційні модифікації наявного в природних умовах або рекомбінантного поліпептиду або його фрагмента. Інженерія охоплює модифікації амінокислотної послідовності, схеми глікозилювання або групи бічних ланцюгів індивідуальних амінокислот, а також комбінації зазначених підходів.
В контексті даного опису мають на увазі, що поняття "амінокислотна мутація" відноситься до амінокислотних замін, делецій, інсерцій і модифікацій. Можна застосовувати будь-яку комбінацію заміни, делеції, інсерції і модифікації для створення кінцевої конструкції за умови, що кінцева конструкція має необхідні характеристики, наприклад, знижену здатність зв'язуватися з Ес-рецептором або підвищеною асоціацією з іншим пептидом. Амінокислотна послідовність з делеціями й інсерціями охоплює аміно- і/або карбоксикінцеві делеції й інсерції амінокислот. Конкретними амінокислотними мутаціями є амінокислотні заміни. Для зміни, наприклад, характеристик зв'язування Ес-ділянки, найбільш переважними є неконсервативні амінокислотні заміни, тобто заміна однієї амінокислоти на іншу амінокислоту, що має інші структурні і/або хімічні властивості. Амінокислотні заміни містять заміну на амінокислоти, які не зустрічаються у природних умовах або на похідні двадцяти стандартних амінокислот, що зустрічаються в природних умовах (наприклад, на 4-гідроксипролін, З-метилгістидин, орнітин, гомосерин, 5-гідроксилізин). Амінокислотні мутації можна створювати за допомогою генетичних або хімічних методів, добре відомих в даній галузі. Генетичні методи можуть містити сайтспрямований мутагенез, ПЦР, синтез генів тощо. Мають на увазі, що можна застосовувати також методи зміни бічної групи амінокислоти, які відрізняються від методів генної інженерії, такі як хімічна модифікація. Для позначення однієї й самої амінокислотної мутації можна застосовувати різні позначення. Наприклад, заміну проліну в положенні 329 Ес-домену на гліцин можна позначати як 3290, 5329, Сзго, Р3З290 або Рго32901у.
В контексті даного опису поняття "поліпептид" відноситься до молекули, що складається з бо мономерів (амінокислот), лінійно зв'язаних амідними зв'язками (які позначають також як пептидні зв'язки). Поняття "поліпептид" відноситься до будь-якого ланцюга, що складається з двох або більшої кількості амінокислот, і не має на увазі, що продукт має конкретну довжину.
Так, пептиди, дипептиди, трипептиди, олігопептиди, "білок", "амінокислотний ланцюг" або будь- яке інше прийняте поняття, що відноситься до ланцюга, що складається з двох або більшої кількості амінокислот, всі підпадають під визначення "поліпептид", і поняття "поліпептид" можна застосовувати замість або взаємозаміно з будь-яким із зазначених понять. Мають на увазі також, що поняття "поліпептид" відноситься в продуктів, які несуть пост-експресійні модифікації поліпептиду, включаючи (але, не обмежуючись тільки ними) глікозилювання, ацетилювання, фосфорилювання, амідування, дериватизацію із застосуванням відомих захисних/блокувальних груп, протеолітичне розщеплення або модифікацію за допомогою амінокислот, які не зустрічаються в природних умовах. Поліпептид можна одержувати з наявного в природних умовах біологічного джерела або можна одержувати за допомогою технології рекомбінантної
ДНК, і його не обов'язково транслювати зі створеної нуклеотидної послідовності. Його можна створювати будь-яким шляхом, включаючи хімічний синтез. Поліпептид, запропонований у винаході, може складатися приблизно з З або більше, 5 або більше, 10 або більше, 20 або більше, 25 або більше, 50 або більше, 75 або більше, 100 або більше, 200 або більше, 500 або більше, 1000 або більше або 2000 або більше амінокислот. Поліпептиди можуть иметь різную трехмерную структуру, хоча вони необов'язково повинні мати зазначену структуру. Поліпептиди з визначеною тривимірною структурою позначають як поліпептиди, що мають укладання, а поліпептиди, які не мають визначеної тривимірної структури, але які можуть легше адаптуватися до більшої кількості різних конформацій, позначають як поліпептиди, не що мають укладання.
Під "виділеним" поліпептидом або його варіантом, або похідним мають на увазі поліпептид, який не знаходиться в його природному оточенні. При цьому не потрібна наявність будь-якого або конкретного рівня очищення. Наприклад, виділений поліпептид можна видаляти з його нативного або природного оточення. Одержані шляхом рекомбінації поліпептиди і білки, що експресуються в клітинах-хазяях, розглядають як виділені для цілей даного винаходу, якщо вони представляють собою нативні або рекомбінантні поліпептиди, які відокремлені, фракціоновані або частково або повністю очищені за допомогою будь-якого прийнятного метода. "Процент (95) ідентичності амінокислотної послідовності" відносно поліпептидної референс- послідовності визначають як процент амінокислотних залишків в послідовності-кандидаті, які ідентичні амінокислотним залишків в поліпептидній референс-послідовності, після вирівнювання послідовностей і інтродукції при необхідності отворів для досягнення максимального процента ідентичності послідовностей, і при цьому будь-які консервативні заміни не враховують при оцінюванні ідентичності послідовностей. Порівняльний аналіз для визначення процента ідентичності амінокислотних послідовностей можна здійснювати різними шляхами, які знаходяться в компетенції спеціаліста в даній галузі техніки, наприклад, із застосуванням публічно доступних комп'ютерних програм, таких як програма ВІ А5Т, ВІ А5Т-2,
АСОМ або Меадаїїдп (ОМАЗТАК). Спеціалісти в даній галузі техніки можуть визначати відповідні параметри для вирівнювання послідовностей, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання по всій довжині порівнюваних послідовностей. Однак для цілей даного винаходу величину 95 ідентичності амінокислотних послідовностей одержують із застосуванням призначеної для порівняння послідовностей комп'ютерної програми АСІСМ-2.
Призначена для порівняння послідовностей комп'ютерна програма АГІСМ-2 розроблена фірмою
Сепепіесп, Іпс., і вихідний код розміщений на зберігання разом з документацією для користувача в Ш.5. Соругідпі ОйПісе, УмазПпіпаїоп О0.С., 20559, де він зареєстрований під реєстраційним номером О.5. Соругідчйї Кедізігайоп Ме ТХО510087. Програма АГІСМ-2 являє собою публічно доступну програму фірми Сепепіесі, Іпс., Південний Сан-Франциско, шт.
Каліфорнія, або її можна компілювати з вихідного коду. Програму АГІМ-2 можна компілювати для застосування в операційній системі ОМІХ, включаючи цифрову версію ОМІХ М4.00. В програмі АГІСМ-2 всі параметри для порівняння послідовностей є заданими і не повинні змінюватися. В ситуаціях, коли АЇЇОМ-2 застосовують для порівняння амінокислотних послідовностей, 95 ідентичності амінокислотних послідовностей даної амінокислотної послідовності А відносно або у порівнянні з даною амінокислотною послідовністю Б (яку іншими словами можна позначати як дана амінокислотна послідовність А, яка має або відрізняється певним 95 ідентичності амінокислотної послідовності відносно або у порівнянні з даною амінокислотною послідовністю Б), розраховують наступним чином: 100 х частка Х/У,
де Х означає кількість амінокислотних залишків, оцінених програмою порівняльного аналізу послідовностей АЇЇСМ-2 як ідентичні збіги при порівняльному аналізі послідовностей А і Б за допомогою зазначеної програми, і де У означає загальну кількість амінокислотних залишків в Б.
Повинно бути очевидним, що, коли довжина амінокислотної послідовності А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності Б, то 95 ідентичності амінокислотної послідовності А відносно амінокислотної послідовності Б не повинний бути рівним 9о ідентичності амінокислотної послідовності Б відносно амінокислотної послідовності А. Якщо спеціально не зазначене інше, то в контексті даного опису всі величини 95 ідентичності амінокислотних послідовностей одержують згідно з процедурою, описаною в останньому з попередніх параграфів, за допомогою комп'ютерної програми АГІСМ-2.
Поняття "полінуклеотид" відноситься до виділеної молекули нуклеїнової кислоти або конструкції, наприклад, матричної РНК (мРНК), РНК вірусного походження або плазмідної ДНК (пДНК). Полінуклеотид може містити звичайний фосфодіефірний зв'язок або нетрадиційний зв'язок (наприклад, амідний зв'язок, такий, який є присутнім в пептидних нуклеїнових кислотах (ПНК)). Поняття "молекула нуклеїнової кислоти" відноситься до будь-якого одного або декількох сегментів нуклеїнової кислоти, наприклад, фрагментів ДНК або РНК, що присутні в полінуклеотиді.
Під "виділеною" молекулою нуклеїнової кислоти або полінуклеотидом мають на увазі молекулу нуклеїнової кислоти, тобто ДНК або РНК, яка відокремлена від її нативного оточення.
Наприклад, рекомбінантний полінуклеотид, що кодує вхідний у вектор поліпептид, розглядають як виділений для цілей даного винаходу. Іншими прикладами виділеного полінуклеотиду є рекомбінантні полінуклеотиди, присутні в гетерологиїічних клітинах-хазяях, або очищенні (частково або повністю) полінуклеотиди, що знаходяться в розчині. Виділений полінуклеотид охоплює молекулу полінуклеотиду, що входить в клітини, які в нормі містять молекулу полінуклеотиду, але молекула полінуклеотиду є присутньою поза хромосомою або має локалізацію в хромосомі, що відрізняється від її локалізації в хромосомі в природних умовах.
Виділені молекули РНК містять одержані іп мімо або іп міго РНК-транскрипти, запропоновані в даному винаході, а також форми з позитивним і негативним ланцюгом і дволанцюгові форми.
Виділені полінуклеотиди або нуклеїнові кислоти, запропоновані в даному винаході, містять також зазначені молекули, одержані за допомогою синтезу. Крім того, полінуклеотид або нуклеїнова кислота може представляти собою або може містити регуляторний елемент, такий як промотор, сайт зв'язування рибосом або термінатор транскрипції.
Під нуклеїновою кислотою або полінуклеотидом, що мають нуклеотидну послідовність, яка наприклад, на 9595 "ідентична" нуклеотидній референс-послідовності, що пропонується в даному винаході, мають на увазі, що нуклеотидна послідовність полінуклеотиду ідентична референс-послідовності за винятком того, що полінуклеотидна послідовність може містити аж до 5 точкових мутацій на кожні 100 нуклеотидів нуклеотидної референс-послідовності. Іншими словами, для одержання полінуклеотиду, що має нуклеотидну послідовність, яка ідентична щонайменше на 9595 нуклеотидній референос-послідовності, аж до 55905 нуклеотидів в референс-послідовності можна виймати шляхом делеції або замінювати на інший нуклеотид, або аж до 5 95 нуклеотидів від загальної кількості нуклеотидів в референс-послідовності можна вбудовувати в референс-послідовність. Ці зміни референс-послідовності можуть мати місце в положеннях на 5'- або 3"-кінці нуклеотидної референс-послідовності або в іншому положенні між цими кінцевими положеннями, і їх вбудовують або індивідуально між залишками в референс- послідовності, або їх вбудовують в референс-послідовність у вигляді однієї або декількох суміжних груп. На практиці питання про те, чи є ідентичною конкретна полінуклеотидна послідовність щонайменше на 80 95, 85 9», 90 Фо, 95 Ув, 96 90, 97 У», 98 95 або 99 95 нуклеотидній послідовності, що пропонується в даному винаході, можна вирішувати, як правило, із застосуванням відомих комп'ютерних програм, наприклад, зазначених вище для поліпептидів (наприклад, АГІСМ-2).
Поняття "касета експресії" відноситься до полінуклеотиду, одержаного за допомогою рекомбінації або синтезу, який містить серії специфічних нуклеотидних елементів, які забезпечують транскрипцію конкретної нуклеїнової кислоти в клітині-мішені. Рекомбінантну касету експресії можна вбудовувати в плазміду, хромосому, мітохондріальну ДНК, пластидну
ДНК, вірус або фрагмент нуклеїнової кислоти. Як правило, рекомбінантна касета експресії, що являє собою частину експресійного вектора, охоплює серед інших послідовностей нуклеотидну послідовність, яка підлягає транскрипції і промотор. В деяких варіантах здійснення винаходу касета експресії, запропонована у винаході, містить полінуклеотидні послідовності, які кодують біспецифічні антигензв'язувальні молекули, запропоновані у винаході, або їх фрагменти.
Поняття "вектор" або "експресійний вектор" є синонімом поняття "експресійна конструкція" і відноситься до молекули ДНК, яку застосовують для інтродукції і забезпечення експресії конкретного гена, з якою він функціонально зв'язаний в клітині-мішені. Поняття охоплює вектор, що являє собою структуру нуклеїнової кислоти, здатну до самореплікування, а також вектор, вбудований в геном клітини-хазяїна, в яку він інтродукований. Експресійний вектор, що пропонується в даному винаході, містить касету експресії. Експресійні вектори дозволяють здійснювати транскрипцію стабільної МРНК у великих кількостях. Коли експресійний вектор знаходиться всередині клітини-мішені, то молекула рибонуклеїнової кислоти або білок, який кодується геном, продукується в результаті клітинного механізму транскрипції і/або трансляції.
В одному з варіантів здійснення винаходу експресійний вектор, запропонований у винаході, містить касету експресії, яка охоплює полінуклеотидні послідовності, які кодують біспецифічні антигензв'язувальні молекули, запропоновані у винаході, або їх фрагменти.
В контексті даного опису поняття "клітина-хазяїн", "клітинна лінія-хазяїн" і "клітинна культура-хазяїн" застосовують взаємозаміно, і вони відносяться до клітин, в які інтродукована екзогенна нуклеїнова кислота, включаючи потомство зазначених клітин. До клітин-хазяїв відносяться "трансформанти" і "трансформовані клітини", які містять первинні трансформовані клітини, а також потомство, виведене з них, незалежно від кількості пересівань. Потомство може не бути суворо ідентичним батьківській клітині за складом нуклеїнових кислот, а може нести мутації. Під дане поняття підпадає мутантне потомство, яке має таку ж функцію або біологічну активність, що і відібрана шляхом скринінгу або селекції вихідна трансформована клітина. Клітина-хазяїн являє собою будь-який тип клітинної системи, яку можна застосовувати для створення біспецифічних антигензв'язувальних молекул, що пропонуються в даному винаході. Клітини-хазяї містять культивовані клітини, наприклад, культивовані клітини ссавців, такі як (але, не обмежуючись тільки ними) СНО-клітини, ВНК-клітини, М5О0-клітини, ЗР2/0- клітини, клітини мієломи лінії МО, клітини мишачої мієломи лінії РЗ х 63, РЕК-клітини, РЕК.Сб- клітини або клітини гібридоми, клітини дріжджів, клітини комах і клітини рослин, але також клітини, що знаходяться в трансгенній тварині, трансгенній рослині або в культивованій рослинній або тваринній тканині. "Активувальний Ес-рецептор" являє собою Ес-рецептор, який після взаємодії з Ес-доменом
Зо антитіла здійснює процес передачі сигналів, які стимулюють клітину, яка несе рецептор здійснювати ефекторні функції. Людські активувальні Ес-рецептори містять ЕсуКШа (СО16а),
ЕсукІ (2064), ЕсукПа (СО32) і сок (СО89).
Антитіло-зумовлена клітинно-залежна цитотоксичність (АЮСС) являє собою імунний механізм, що призводить до лізису сенсибілізованих антитілом клітин-мішеней імунними ефекторними клітинами. Клітини-мішені представляють собою клітини, з якими антитіла або їх похідні, які містять Ес-область, специфічно зв'язуються, як правило, через область білка, яка є
М-кінцевою відносно Ес-ділянки. В контексті даного опису поняття "знижена АОСС" відноситься або до зниження кількості лізованих в даний момент часу клітин-мішеней при даній концентрації антитіла в середовищі, що оточує клітини-мішені, шляхом зазначеного вище механізму АОСС, ілабо до підвищення концентрації антитіла в середовищі, що оточує клітини-мішені, необхідному для досягнення лізису даної кількості клітин-мішеней в даний час за допомогою механізму
АрСС. Зниження АЮСсС-активності визначають відносно АЮСС, опосередкованої таким же антитілом, яке одержано за допомогою такого же типу клітин-хазяїв із застосуванням однакових стандартних методів одержання, очищення, приготування композицій і зберігання (які відомі спеціалістам в даній галузі техніки), але яке не піддавали інженерії. Наприклад, зниження
АрСС, опосередкованої антитілом, яке містить в його Ес-домені амінокислотну заміну, яка знижує АЮСС, визначають відносно АЮСС, опосередкованої таким самим антитілом без зазначеної амінокислотної заміни в Ес-домені. Прийнятні аналізи оцінювання АЮСС добре відомі в даній галузі техніки (див., наприклад, публікацію РСТ УМО 2006/082515 або заявку на патент РСТ РСТ/ЕР2012/055393).
Поняття "ефективні кількість" агента відноситься до кількості, необхідної для забезпечення фізіологічної зміни в клітині або тканині, в яку її вводять.
Поняття "терапевтично ефективна кількість" агента, наприклад, фармацевтичної композиції, відноситься до кількості, ефективної при застосуванні в дозах і протягом періодів часу, необхідних для досягнення потрібного терапевтичного або профілактичного результату.
Терапевтично ефективна кількість агента, наприклад, елімінує, знижує, уповільнює, мінімізує або попереджує небажані явища захворювання. "Індивідуум"' або "суб'єкт" являє собою ссавця. Ссавці представляють собою (але, не обмежуючись тільки ними) свійських тварин (наприклад, корови, вівці, кішки, собаки і коні),
приматів (наприклад, люди і примати крім людини, такі як мавпи), кроликів і гризунів (наприклад, миші і щури). Переважно індивідуум або суб'єкт являє собою людину.
Поняття "фармацевтична композиція" відноситься до препарату, який знаходиться в такій формі, що він забезпечує біологічну активність діючої речовини, яка входить до його складу, яка повинна мати ефективність, і який не містить додаткових компонентів, які мають неприйнятну токсичність для індивідуума, якому слід вводити композицію. "Фармацевтично прийнятний носій" відноситься до інгредієнта в фармацевтичній композиції, який відрізняється від діючої речовини, який є нетоксичним для індивідуума. Фармацевтично прийнятні носії містять (але, не обмежуючись тільки ними) буфер, ексципієнт, стабілізатор або консервант.
В контексті даного опису поняття "лікування" (і його граматичні варіації, такі як "лікувати" або "процес лікування") відноситься до клінічного втручання з метою зміни природного перебігу хвороби в індивідуума, який підлягає лікуванню, і його можна здійснювати або для профілактики або в процесі розвитку клінічної патології. Необхідними діями лікування є (але, не обмежуючись тільки ними) попереджують виникнення або рецидив хвороби, полегшення симптомів, зменшення будь-яких прямих або непрямих патологічних наслідків хвороби, попередження метастазів, зниження швидкості розвитку хвороби, полегшення або тимчасове ослаблення хворобливого стану і ремісія або покращення прогнозу. В деяких варіантах здійснення винаходу біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т-клітини, запропоновані у винаході, застосовують для задержки розвитку хвороби або уповільнення прогресування хвороби.
Поняття "листівка-вкладиш в упаковку" в контексті даного опису відноситься до інструкцій, які звичайно поміщають в упаковки терапевтичних продуктів, що надходять у продаж, які містять інформацію про показання, застосування, дозу, шляхи введення, комбінованої терапії, протипоказання і/або мерах обережності при застосуванні зазначених терапевтичних продуктів.
Докладний опис варіантів здійснення винаходу
Першим об'єктом даного винаходу є активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить (Ї перший антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Рар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ, і який містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5БЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5 і ЗЕО ІО МО: 6, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІО МО: 8, 5ЕО
ІО МО: 9, БЕО І МО: 10; (І) другий антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу ЕРар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з антигеном клітини-мішені.
В одному з варіантів здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 90, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: ЗЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 32 і 5ЕО ІО МО: 33, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 У», 98 Фо, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: ЗЕО ІЮО МО: 7 і БЕО ІО МО: 31.
В одному з варіантів здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 90, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності ФЕО ІЮО МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 9595, 9695, 97 95, 9895, 9995 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮО МО: 7.
В конкретному варіанті здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з СЕА і містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з ЗЕО ІО МО: 24, 5ЕО ІЮО МО: 25 і ЗЕО
ІО МО: 26, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: БЕО ІЮ МО: 28, 5ЕО ІЮ
МО: 29, 5ЕО ІЮ МО: 30.
В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з СЕА і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Ор, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮО МО: 23, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 95, 98 Фо, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності ХЕО ІО МО: 27.
В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з МОС5Р і містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 14, 5ЕО ІЮ МО: 15, 5ЕО ІО МО: 16, 5ЕО І МО: 35, 5ЕО І МО: 37, 5ЗЕО ІЮО МО: 38 і 5ЕО ІЮ МО: 40, ї щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: 5ЕО ІЮ МО: 18, 5ЕО ІО МО: 19, 5ЕО
ІО МО: 20, 5ЕО ІЮ МО: 44, 5ЕО ІЮО МО: 45, 5ЕО ІЮ МО: 48, 5ЕО ІЮ МО: 49 ї БЕО ІО МО: 50.
В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з МСО5Р і містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮО МО: 14, 5ЕО ІО МО: і 5ЕО ІЮ МО: 16, і щонайменше одну СОЕ. легкого ланцюга, вибрану з групи: 5ЕО ІЮ МО: 18,
ЗЕО ІЮ МО: 19, і ЗЕО ІО МО: 20.
В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з МО5Р і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Ор, 15 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: ФЕО ІЮ МО: 13,
ЗЕО ІО МО: 34, 5ЕО ІЮО МО: 36, 5ЕО ІЮ МО: 39 і 5ЕО ІО МО: 41, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 У, 98 У», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: 5ЕО ІЮ
МО: 17, БЕО ІЮ МО: 43, 5ЕО ІЮ МО: 46, ЗЕО ІЮ МО: 47 і БЕО ІЮО МО: 51.
В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з МСО5Р і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Ор, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності «ЕЕ ІЮО МО: 13, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 95, 98 Фо, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності ХЕО ІО МО: 17.
Одним з варіантів здійснення даного винаходу є активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить ( перший антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу ЕРар, яка має
Зо здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ, і який містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5 і ЗЕО ІО МО: 6, і щонайменше одну СОЕ. легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІО МО: 8, ЗЕО
ІО МО: 9, БЕО І МО: 10; (І) другий антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу ЕРар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СЕА, яка містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮО МО: 24, 5ЕО ІЮ МО: 25 і 5ЕО ІЮО МО: 26, і щонайменше одну СОЕ. легкого ланцюга, вибрану з групи: 5ЕО ІЮ МО: 28,
ЗЕО ІЮ МО: 29 і ЗЕО ІЮ МО: 30.
Одним з варіантів здійснення даного винаходу є активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить (Ї перший антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Рар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СОЮЗ, яка містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 9о, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Фо, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІО МО: 7, (І) другий антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу ЕРар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СЕА, яка містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 9о, 98 9,
БО 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності «ЕО ІЮО МО: 23, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Фо, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮО МО: 27.
Одним з варіантів здійснення даного винаходу є активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить () перший антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Раб, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ, і який містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5 і ЗЕО ІО МО: 6, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІО МО: 8, 5ЕО
ІО МО: 9, БЕО І МО: 10;
(І) другий антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу ЕРар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з МС5Р, яка містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 14, 5ЕО ІЮ МО: 15 і 5ЕО ІЮ МО: 16, і щонайменше одну СОЕ. легкого ланцюга, вибрану з групи: 5ЕО ІЮ МО: 18,
ЗБОЮ МО: 19 і 5ЕО ІЮ МО: 20.
Одним з варіантів здійснення даного винаходу є активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить (Ї перший антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Рар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СОЮЗ, яка містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 9о, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Фо, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІО МО: 7, (І) другий антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу ЕРар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з МОС5Р, яка містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Ор, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності «ЕЕ ІЮО МО: 13, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 95, 98 Фо, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності ХЕО ІО МО: 17.
В конкретному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент являє собою одержану в результаті кросинговеру молекулу Раб, в якій або варіабельні ділянки, або константні ділянки легкого ланцюга Раб і важкого ланцюга Раб обмінені.
В одному з варіантів здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент являє собою канонічну молекулу Раб.
В конкретному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент являє собою одержану в результаті кросинговеру молекулу Раб, в якій константні ділянки легкого ланцюга Раб і важкого ланцюга Раб обмінені, а другий антигензв'язувальний фрагмент являє собою канонічну молекулу Бар. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу перший і другий антигензв'язувальний фрагмент злиті один з іншим, необов'язково через пептидний лінкер.
В конкретних варіантах здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить також Ес-домен, що складається з першої й другої субодиниць, які мають здатність до стабільної асоціації.
В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу не більше одного антигензв'язувального фрагмента, що має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ, є присутнім в активувальній Т- клітини біспецифічній антигензв'язувальній молекулі (тобто активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула відрізняється одновалентним зв'язуванням з СОЗ).
Формати активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул
Компоненти активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули можна зливати один з іншим в різних конфігураціях. Приклади конфігурацій представлені на фіг. 1, З і 5.
В конкретних варіантах здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить Ес-домен, що складається з першої й другої субодиниць, які мають здатність до стабільної асоціації. В деяких варіантах здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Раб з М-кінцем першої або другої субодиниці Ес-домену.
В одному із зазначених варіантів здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем важкого ланцюга Бар другого антигензв'язувального фрагмента. В конкретному зазначеному варіанті здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула практично складається з першого і другого антигензв'язувальних фрагментів, Ес-домену, що складається з першої й другої субодиниць, і необов'язково одного або декількох пептидних лінкерів, в якій перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем важкого ланцюга Бар другого антигензв'язувального фрагмента, а другий антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем першої або другої субодиниці Ес- домену. Необов'язково легкий ланцюг Бар першого антигензв'язувального фрагмента і легкий ланцюг Бар другого антигензв'язувального фрагмента можуть додатково бути злиті один з іншим.
В іншому зазначеному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Раб з М-кінцем першої або другої субодиниці Ес-домену. В конкретному зазначеному варіанті здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула практично складається з першого і другого антигензв'язувального фрагмента, Ес-домену, що складається з першої й другої субодиниць, і необов'язково одного або декількох пептидних лінкерів, в якій перший і другий антигензв'язувальні фрагменти кожний злитий на С-кінці важкого ланцюга Еар з М-кінцем однієї з субодиниць Ес-домену.
В інших варіантах здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на
С-кінці важкого ланцюга Раб з М-кінцем першої або другої субодиниці Ес-домену.
В зазначеному конкретному варіанті здійснення винаходу другий антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем важкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента. В конкретному зазначеному варіанті здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула практично складається з першого і другого антигензв'язувальних фрагментів, Рсе-домену, що складається з першої й другої субодиниць, і необов'язково одного або декількох пептидних лінкерів, в якій другий антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем важкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента, а перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем першої або другої субодиниці Ес- домену. Необов'язково легкий ланцюг Раб першого антигензв'язувального фрагмента і легкий ланцюг Бар другого антигензв'язувального фрагмента можуть додатково бути злиті один з іншим.
Антигензв'язувальні фрагменти можуть бути злиті з Ес-доменом або один з іншим безпосередньо або через пептидний лінкер, який містить одну або декілька амінокислот, як правило, приблизно 2-20 амінокислот. Пептидні лінкери відомі в даній галузі техніки і представлені в даному описі. Прийнятні неімуногенні пептидні лінкери містять, наприклад, пептидні лінкери (45), (ЗСі4)п, (С45)п або с4(ЗСі4)п. "п" означає звичайно число від 1 до 10, як правило, від 2 до 4. Найбільш прийнятним пептидним лінкером для злиття легких ланцюгів Бар першого і другого антигензв'язувального фрагмента один з іншим є ((145)2». Прикладом пептидного лінкера, придатного для поєднання важких ланцюгів Бар першого і другого антигензв'язувального фрагмента, є ЕРКЗСО(О)-((145)2 (ЗЕО ІЮ МО: 105 і 106). крім того, лінкери можуть містити шарнірну область імуноглобуліну (або її частину). Зокрема, коли антигензв'язувальний фрагмент злитий з М-кінцем субодиниці Ес-домену, то він може бути злитий через шарнірну область імуноглобуліну або її частину з застосуванням додаткового пептидного лінкера або без нього.
Активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, один антигензв'язувальний фрагмент якої має здатність специфічно зв'язуватися з антигеном клітини-мішені (наприклад, як продемонстровано на фіг. ЛА, 1Г, 1Е або 13), можна застосовувати, зокрема в випадках, в яких можна очікувати інтерналізацію антигену клітини- мішені після зв'язування антигензв'язувального фрагмента, що має високу афінність. В таких випадках наявність більше одного антигензв'язувального фрагмента, специфічного у відношенні антигену клітини-мішені, може підвищувати інтерналізацію антигену клітини-мішені, знижуючи тим самим його доступність.
Однак в багатьох інших випадках є доцільним одержувати активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, яка містить два або більшу кількість антигензв'язувальних фрагментів, специфічних у відношенні антигену клітини-мішені (наприклад, як продемонстровано на фіг. 1Б, 18, 1Д або 1Ж), наприклад, для оптимізації спрямованого переносу до сайту-мішені або для забезпечення перехресного зшивання антигенів клітини-мішені.
Таким чином, в деяких варіантах здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, запропонована у винаході, додатково містить третій антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Раб, яка має здатність специфічно зв'язуватися з антигеном клітини-мішені. В одному з варіантів здійснення винаходу третій антигензв'язувальний фрагмент являє собою молекулу канонічного Раб. В одному з варіантів здійснення винаходу третій антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з тим же антигеном клітини-мішені, що і другий антигензв'язувальний фрагмент. В конкретному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ, а другий і третій антигензв'язувальні фрагменти мають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном клітини-мішені. В конкретному варіанті здійснення винаходу другий і третій антигензв'язувальні фрагменти є ідентичними (тобто вони містять однакові амінокислотні послідовності).
В конкретному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ, а другий і третій антигензв'язувальні фрагменти мають здатність специфічно зв'язуватися СЕА, при цьому другий і третій антигензв'язувальні фрагменти містять щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5ЕБО ІЮО МО: 24, 5ЕБЕО ІО МО: 25 і 5ЕО ІЮ МО: 26, і щонайменше одну СОЕ. легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІЮ МО: 28, 5ЕО ІЮО МО: 29 і ЗЕО
ІО МО: 30.
В конкретному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ і містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 5 і ЗЕО
ІО МО: 6, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО І МО: 9 ЗБОЮ МО: 10; а другий і третій антигензв'язувальні фрагменти мають здатність специфічно зв'язуватися з СЕА, при цьому другий і третій антигензв'язувальні фрагменти містять щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮО МО: 24, 5ЕО ІЮО МО: 25 ії 5ЕО ІЮО МО: 26, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІЮ МО: 28, 5ЕО ІО МО: 29 і ЗЕО ІЮ МО: 30.
В конкретному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з СОЮЗ і містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 5 і ЗЕО
ІО МО: 6, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: 5ЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО І МО: 9 ЗБОЮ МО: 10; а другий і третій антигензв'язувальні фрагменти мають здатність специфічно зв'язуватися з СЕА, при цьому другий і третій антигензв'язувальні фрагменти містять щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮО МО: 24, 5ЕО ІЮО МО: 25 ії 5ЕО ІЮО МО: 26, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІЮ МО: 28, 5ЕО ІО МО: 29 і ЗЕО ІЮ МО: 30.
В конкретному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 9о, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: 5ЕО ІО МО: 3, 5ЕО І
МО: 32 ії 5ЕО ІЮО МО: 33, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 9595, 9695, 97 95, 9895, 9995 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: БЕО ІЮ МО: 7 і ЗЕО ІЮО МО: 31, а
З5 другий і третій антигензв'язувальні фрагменти мають здатність специфічно зв'язуватися з СЕА, при цьому другий і третій антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІО МО: 23, ії варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 90, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 27.
В конкретному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 9о, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮО МО: 7, а другий і третій антигензв'язувальні фрагменти мають здатність специфічно зв'язуватися з СЕА, при цьому другий і третій антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІО МО: 23, ії варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 90, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 27.
В одному з варіантів здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ, а другий і третій антигензв'язувальні фрагменти мають здатність специфічно зв'язуватися з МСОС5Р, при цьому другий і третій антигензв'язувальні фрагменти містять щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 14, 5ЕО ІЮО МО: 15, 5ЕО ІО МО: 16, 5ЕО ІО МО: 60 35, ЗЕО ІЮО МО: 37, 5ЕО ІЮО МО: 38 ії 5ЕО ІЮО МО: 40, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга,
вибрану з групи: БЕО ІЮ МО: 18, 5ЕО ІЮ МО: 19, 5ЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО ІО МО: 44, 5ЕО ІЮО МО: 45,
ЗЕО ІЮ МО: 48, ЗЕО ІЮО МО: 49 і БЕО ІЮ МО: 50.
В іншому варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ і містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 4, ЗЕО ІЮО МО: 5 і 5ЕО
ІО МО: 6, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 9, ЗЕО ІЮО МО: 10; а другий і третій антигензв'язувальні фрагменти мають здатність специфічно зв'язуватися з МС5Р, при цьому другий і третій антигензв'язувальні фрагменти містять щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 14, 5ЕО ІЮ МО: 15, 5ЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІО МО: 35, 5ЕО ІЮО МО: 37,
ЗЕО ІЮО МО: 38 і ЗЕО І МО: 40, і щонайменше одну СОЕК легкого ланцюга, вибрану з групи: БЕО
ІО МО: 18, БЕО ІО МО: 19, БО І МО: 20, 5ЕО ІО МО: 44, 5ЕО ІЮ МО: 45, 5ЕО ІЮ МО: 48, 5ЕО
ІО МО: 49 і ЗЕО ІЮ МО: 50.
В одному з варіантів здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з СОЮЗ і містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 5 і ЗЕО
ІО МО: 6, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: 5ЕО ІЮО МО: 8, ЗЕО ІЮ МО: 9, ЗЕО ІЮО МО: 10; а другий і третій антигензв'язувальні фрагменти мають здатність специфічно зв'язуватися з МС5Р, при цьому другий і третій антигензв'язувальні фрагменти містять щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮО МО: 14, 5ЕО ІЮО МО: 15 ї 5ЕО ІЮО МО: 16, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІЮ МО: 18, 5ЕО ІО МО: 19 і ЗЕО ІЮ МО: 20.
В одному з варіантів здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 9о, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: 5ЕО ІО МО: 3, 5ЕО І
МО: 32 ії 5ЕО ІЮО МО: 33, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 9595, 9695, 97 95, 9895, 9995 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: БЕО ІЮ МО: 7 і ЗЕО ІЮО МО: 31, а
З0 другий і третій антигензв'язувальні фрагменти мають здатність специфічно зв'язуватися з
МСО5Р, при цьому другий і третій антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 96, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: БЕО ІО МО: 13, 5ЕБО ІЮО МО: 34, 5БО ІЮО МО: 36, 5БО ІО МО: 39 ії 5ЕО ІЮО МО. 41, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 90, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: ЗЕО ІЮО МО: 17, 5ЕО ІЮ МО: 43, 5ЕО ІЮ МО: 46, 5ЕО ІЮО МО: 47 і
ЗЕО ІЮО МО: 51.
В одному з варіантів здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 9о, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮО МО: 7, а другий і третій антигензв'язувальні фрагменти мають здатність специфічно зв'язуватися з
МСО5Р, при цьому другий і третій антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Фо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності ФЕО ІЮ МО: 13, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 90, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 17.
В одному з варіантів здійснення винаходу третій антигензв'язувальний фрагмент злитий на
С-кінці важкого ланцюга Рар з М-кінцем першої або другої субодиниці Ес-домену. В більше конкретному варіанті здійснення винаходу другий і третій антигензв'язувальний фрагмент кожний злитий на С-кінці важкого ланцюга Раб з М-кінцем однієї з субодиниць Ес-домену, а перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем важкого ланцюга Бар другого антигензв'язувального фрагмента. Необов'язково легкий ланцюг
Бар першого антигензв'язувального фрагмента і легкий ланцюг Бар другого антигензв'язувального фрагмента можуть бути додатково злиті один з іншим.
Другий і третій антигензв'язувальний фрагмент можуть бути злиті з Ес-доменом безпосередньо або через пептидний лінкер. В конкретному варіанті здійснення винаходу другий і третій антигензв'язувальний фрагмент кожний злитий з Ес-доменом через шарнірну область імуноглобуліну. В конкретному варіанті здійснення винаходу шарнірна область імуноглобуліну являє собою шарнірну область людського Ідбїі. В одному з варіантів здійснення винаходу другий і третій антигензв'язувальний фрагмент і Ес-домен представляють собою частину молекули імуноглобуліну. В конкретному варіанті здійснення винаходу молекула імуноглобуліну являє собою імуноглобулін класу до. В ще більше конкретному варіанті здійснення винаходу імуноглобулін являє собою імуноглобулін підкласу досі. В іншому варіанті здійснення винаходу імуноглобулін являє собою імуноглобулін підкласу дб. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу імуноглобулін являє собою людський імуноглобулін. В інших варіантах здійснення винаходу імуноглобулін являє собою химерний імуноглобулін або гуманізований імуноглобулін. В одному з варіантів здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула практично складається з молекули імуноглобуліну, яка має здатність специфічно зв'язуватися 3 антигеном клітини-мішені, і антигензв'язувального фрагмента, що має здатність специфічно зв'язуватися з СОЮЗ, в якій антигензв'язувальний фрагмент являє собою молекулу Бар, насамперед одержану в результаті кросинговеру молекулу Раб, злиту з М-кінцем одного з важких ланцюгів імуноглобуліну, необов'язково через пептидний лінкер.
В конкретному варіанті здійснення винаходу перший і третій антигензв'язувальний фрагмент кожний злитий на С-кінці важкого ланцюга Раб з М-кінцем однієї з субодиниць Ес-домену, а другий антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем важкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента. В конкретному зазначеному варіанті здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула практично складається з першого, другого і третього антигензв'язувальних фрагментів, Ес-домену, що складається з першої й другої субодиниць, і необов'язково одного або декількох пептидних лінкерів, в якій другий антигензв'язувальний фрагмент злитий на С- кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем важкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента, і перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Раб з
Зо М-кінцем першої субодиниці Ес-домену, і в якій третій антигензв'язувальний фрагмент злитий на
С-кінці важкого ланцюга Раб з М-кінцем другої субодиниці Ес-домену. Необов'язково легкий ланцюг Бар першого антигензв'язувального фрагмента і легкий ланцюг Бар другого антигензв'язувального фрагмента можуть додатково бути злиті один з іншим.
Одним з варіантів здійснення даного винаходу є активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить (Ї перший антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Рар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СОЮЗ, яка містить гіперваріабельну ділянку (СОК) 1 важкого ланцюга, що має ЗЕО ІО МО: 4, СОК 2 важкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮ МО: 5, СОК З важкого ланцюга, що має ЗЕО ІЮ МО: 6, СОК 1 легкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮ МО: 8, СОК 2 легкого ланцюга, що має ЗЕО ІО МО: 9, і СОК 3 легкого ланцюга, що має ЗЕО ІЮ МО: 10, в якій перший антигензв'язувальний фрагмент являє собою одержану в результаті кросинговеру молекулу
Еар, в якій або варіабельні, або константні ділянки, насамперед константні ділянки легкого ланцюга Раб і важкого ланцюга Раб, обмінені; (ІЇ) другий і третій антигензв'язувальні фрагменти, кожний з який являє собою молекулу Раб, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СЕА, яка містить СОК 1 важкого ланцюга, що має
ЗЕО ІО МО: 24, СОК 2 важкого ланцюга, що має БЕО ІЮ МО: 25, СОК З важкого ланцюга, що має ЗЕО ІЮ МО: 26, СОМ 1 легкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮО МО: 28, СОК 2 легкого ланцюга, що має 5ЗЕО ІЮО МО: 29, і СОКЗ легкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮ МО: 30.
Одним з варіантів здійснення даного винаходу є активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить (Ї перший антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Рар, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СОЮЗ, яка містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 9о, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Фо, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності зЗЕО ІО МО: 7, в якій перший антигензв'язувальний фрагмент являє собою одержану в результаті кросинговеру молекулу Раб, в якій або варіабельні, або константні ділянки, насамперед константні ділянки легкого ланцюга Раб і важкого ланцюга Раб, обмінені;
(ІЇ) другий і третій антигензв'язувальні фрагменти, кожний з яких являє собою молекулу Раб, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СЕА, яка містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІО МО: 23, ії варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 90, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 27.
Одним з варіантів здійснення даного винаходу є активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить () перший антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Раб, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СОЮЗ, яка містить гіперваріабельну ділянку (СОК) 1 важкого ланцюга, що має ЗЕО ІО МО: 4, СОК 2 важкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮ МО: 5, СОК З важкого ланцюга, що має ЗЕО ІЮ МО: 6, СОК 1 легкого ланцюга, що має ЗЕО ІЮ МО: 8, СОК 2 легкого ланцюга, що має ЗЕО ІО МО: 9, і СОК 3 легкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮО МО: 10, в якій перший антигензв'язувальний фрагмент являє собою одержану в результаті кросинговеру молекулу
Еаб, в якій або варіабельні, або константні ділянки, насамперед константні ділянки легкого ланцюга Раб і важкого ланцюга Раб, обмінені; (ІЇ) другий і третій антигензв'язувальні фрагменти, кожний з яких являє собою молекулу Раб, яка має здатність специфічно зв'язуватися з МС5Р, яка містить СОК 1 важкого ланцюга, що має
ЗЕО ІО МО: 14, СОК 2 важкого ланцюга, що має ЗЕО ІЮ МО: 15, СОК З важкого ланцюга, що має ЗЕО ІЮО МО: 16, СОМ 1 легкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮ МО: 18, СОК 2 легкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮО МО: 19, і СОКЗ легкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮО МО: 20.
Одним з варіантів здійснення даного винаходу є активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить () перший антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Раб, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ, яка містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 9о, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95,
Зо 96 95, 97 Фо, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності зЗЕО ІО МО: 7, в якій перший антигензв'язувальний фрагмент являє собою одержану в результаті кросинговеру молекулу Раб, в якій або варіабельні, або константні ділянки, насамперед константні ділянки легкого ланцюга Раб і важкого ланцюга Раб, обмінені; (ІЇ) другий і третій антигензв'язувальні фрагменти, кожний з яких являє собою молекулу Раб, яка має здатність специфічно зв'язуватися з МСЗ5Р, яка варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Ор, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності «ЕЕ ІЮО МО: 13, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 95, 98 Фо, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності ХЕО ІО МО: 17.
Активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, зазначена у будь- якому з чотирьох наведених вище варіантів здійснення винаходу, може додатково містити (ІП)
Ес-домен, що складається з першої й другої субодиниць, які мають здатність до стабільної асоціації, в якій другий антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Раб з
М-кінцем важкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента, і перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці важкого ланцюга Бар з М-кінцем першої субодиниці Ес-домену, і в якій третій антигензв'язувальний домен злитий на С-кінці важкого ланцюга Раб з М-кінцем другої субодиниці Ес-домену.
В деяких активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекулах, які запропоновані у винаході, легсий ланцюг Раб першого антигензв'язувального фрагмента і легкий ланцюг Раб другого антигензв'язувального фрагмента злиті один з іншим, необов'язково через пептидний лінкер. Залежно від конфігурації першого і другого антигензв'язувальних фрагментів легкий ланцюг Бар першого антигензв'язувального фрагмента може бути злита на її
С-кінці з М-кінцем легкого ланцюга Раб другого антигензв'язувального фрагмента, або легкий ланцюг Раб другого антигензв'язувального фрагмента може бути злита на її С-кінці з М-кінцем легкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента. Злиття легких ланцюгів Бар першого і другого антигензв'язувальних фрагментів додатково зменшує помилкове спарювання невідповідних важких і легких ланцюгів Раб, а також знижує кількість плазмід, необхідних для експресії деяких активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, які бо запропоновані у винаході.
В деяких варіантах здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить поліпептид, в якому варіабельна ділянка легкого ланцюга
Еаб першого антигензв'язувального фрагмента поєднана карбоксикінцевим пептидним зв'язком з константною ділянкою важкого ланцюга Раб першого антигензв'язувального фрагмента (тобто перший антигензв'язувальний фрагмент містить одержаний в результаті кросинговеру важкий ланцюг Рар, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга замінена варіабельною ділянкою легкого ланцюга), яка у свою чергу поєднана карбоксикінцевим пептидним зв'язком з субодиницею Ес-домену (М((1-СНІ(3-СН2г-СНЗ(-СНЯ)), і поліпептид, в якому важкий ланцюг Бар другого антигензв'язувального фрагмента поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з субодиницею Ес-домену (МН(2а-СНІ(2-СН2-СНЗ(-СНА)). В деяких варіантах здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула додатково містить поліпептид, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента поєднана карбоксикінцевим пептидним зв'язком з константною ділянкою легкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента (МН/()-СіІ(), і поліпептид легкого ланцюга Бар другого антигензв'язувального фрагмента (МІ /2-СІ(2г). В деяких варіантах здійснення винаходу поліпептиди ковалентно зв'язані, наприклад, за допомогою дисульфідного зв'язку.
В альтернативних варіантах здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить поліпептид, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга Раб першого антигензв'язувального фрагмента поєднана карбоксикінцевим пептидним зв'язком з константною ділянкою легкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента (тобто перший антигензв'язувальний фрагмент містить одержаний в результаті кросинговеру важкий ланцюг ар, в якому константна ділянка важкого ланцюга замінена варіабельною ділянкою легкого ланцюга), який в свою чергу поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з субодиницею Ес-домену (МН(д)-СІ «3-СН2-СНЗ(-СНЯ)), і поліпептид, в якому важкий ланцюг Рар другого антигензв'язувального фрагмента поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з субодиницею Ес-домену (МН(2-СНІ (2-СН2-СНЗ(-СНАЯ)). В деяких варіантах здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула додатково містить поліпептид, в якому варіабельна ділянка легкого ланцюга Раб першого
Зо антигензв'язувального фрагмента поєднана карбоксикінцневим пептидним зв'язком з константною ділянкою важкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента (М((1-
СНІ), і поліпептид легкого ланцюга Раб другого антигензв'язувального фрагмента (МІ (2-СІ (23).
В деяких варіантах здійснення винаходу поліпептиди ковалентно зв'язані, наприклад, за допомогою дисульфідного зв'язку.
В деяких варіантах здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить поліпептид, в якому варіабельна ділянка легкого ланцюга
Еаб першого антигензв'язувального фрагмента поєднана карбоксикінцевим пептидним зв'язком з константною ділянкою важкого ланцюга Раб першого антигензв'язувального фрагмента (тобто перший антигензв'язувальний фрагмент містить одержаний в результаті кросинговеру важкий ланцюг Рар, в якому константна ділянка важкого ланцюга замінена варіабельною ділянкою легкого ланцюга), який в свою чергу поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з важкого ланцюгом Бар другого антигензв'язувального фрагмента, який в свою чергу поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з субодиницею Ес-домену (МІ(3-СНІ1(-МНеа-СНІ1(2-СН2-
СНЗ(-СН4)). В інших варіантах здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить поліпептид, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга Раб першого антигензв'язувального фрагмента поєднана карбоксикінцевим пептидним зв'язком з константною ділянкою легкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента (тобто перший антигензв'язувальний фрагмент містить одержаний в результаті кросинговеру важкий ланцюг ар, в якому константна ділянка важкого ланцюга замінена константною ділянкою легкого ланцюга), який в свою чергу поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з важким ланцюгом Раб другого антигензв'язувального фрагмента, який в свою чергу поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з субодиницею Ес-домену (МН|(1-
Суо-МНе-СНІеа-СнН2г-СНЗ(-СНЯ)). В наступних варіантах здійснення винаходу активувальна Т- клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить поліпептид, в якому важкий ланцюг
Еар другого антигензв'язувального фрагмента поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з варіабельною ділянкою легкого ланцюга Раб першого антигензв'язувального фрагмента, який в свою чергу поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з константною ділянкою важкого ланцюга Раб першого антигензв'язувального фрагмента (тобто перший антигензв'язувальний фрагмент містить одержаний в результаті кросинговеру важкий ланцюг Бар, в якому бо варіабельна ділянка важкого ланцюга замінена на варіабельну ділянку легкого ланцюга), який в свою чергу поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з субодиницею Ес-домену (МН(/2)-
СНІТ2г-МуоО-СНІоА-СН2г-СНЗ(-СН4)). В інших варіантах здійснення винаходу активувальна Т- клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить поліпептид, в якому важкий ланцюг
Еаь другого антигензв'язувального фрагмента поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з варіабельною ділянкою важкого ланцюга Раб першого антигензв'язувального фрагмента, який в свою чергу поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з константною ділянкою легкого ланцюга Раб першого антигензв'язувального фрагмента (тобто перший антигензв'язувальний фрагмент містить одержаний в результаті кросинговеру важкий ланцюг Раб, в якому константна ділянка важкого ланцюга замінена на константну область легкого ланцюга), який в свою чергу поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з субодиницею Ес-домену (МНіг)-СНІ (2-МН()-
Сі -СнН2г-СнЗ(-СНна)).
В деяких із зазначених варіантів здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула додатково містить поліпептид одержаної в результаті кросинговеру легкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга Баб першого антигензв'язувального фрагмента поєднана карбоксикінцевим пептидним зв'язком з константною ділянкою легкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента (МН()-СіІ(1)), і поліпептид легкого ланцюга Бар другого антигензв'язувального фрагмента (МІ (2-СІ2)). В інших зазначених варіантах здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула додатково містить поліпептид одержаної в результаті кросинговеру легкого ланцюга ар, в якій варіабельна ділянка легкого ланцюга Раб першого антигензв'язувального фрагмента поєднана карбоксикінцевим пептидним зв'язком з константною ділянкою важкого ланцюга Гаю першого антигензв'язувального фрагмента (МІ1)-СНІ()), і поліпептид легкого ланцюга ЕРар другого антигензв'язувального фрагментау (МІ(2-СІ2)). В наступних зазначених варіантах здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула додатково містить поліпептид, в якому варіабельна ділянка легкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента поєднана карбоксикінцевим пептидним зв'язком з константною ділянкою важкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента, який в свою чергу поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з поліпептидом легкого ланцюга
Зо Бар другого антигензв'язувального фрагмента (МІ (3-СНІ1(3-МЦг-СіІ (2), поліпептид, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента поєднана карбоксикінцевим пептидним зв'язком з константною ділянкою легкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента, який в свою чергу поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з поліпептидом легкого ланцюга Бар другого антигензв'язувального фрагмента (МН/(1о-
Суо-МуЦг-СІ|(2г)), поліпептид, в якому поліпептид легкого ланцюга Бар другого антигензв'язувального фрагмента поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з варіабельною ділянкою легкого ланцюга Раб першого антигензв'язувального фрагмента, який в свою чергу поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з константною ділянкою важкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента (Мі2)-СІЦ2г-МЦ-СНІ (у), або поліпептид, в якому поліпептид легкого ланцюга Раб другого антигензв'язувального фрагмента поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з варіабельною ділянкою важкого ланцюга Гаю першого антигензв'язувального фрагмента, який в свою чергу поєднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з константною ділянкою легкого ланцюга Бар першого антигензв'язувального фрагмента (М-г-СЦе- МН()-СЦіа)).
Активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула згідно з зазначеними варіантами здійснення винаходу може містити також (І) поліпептид субодиниці Ес-домену (СН2-
СНЗ(-СНЯ)) або (Ії) поліпептид, в якому важкий ланцюг Раб третього антигензв'язувального фрагмента поєднана карбоксикінцевим пептидним зв'язком з субодиницею Ес-домену (МН|з)-
СНІ з-АСН2-СНЗ(-СНЯ)), і поліпептид легкого ланцюга Раб третього антигензв'язувального фрагмента (МІз3-СІ(з3у). В деяких варіантах здійснення винаходу поліпептиди ковалентно зв'язані, наприклад, за допомогою дисульфідного зв'язку.
Згідно з будь-яким зазначеним вище варіантам здійснення винаходу компоненти активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент, Ес-домен) можуть бути злиті безпосередньо або через різні лінкери, зокрема, пептидні лінкери, які містять одну або декілька амінокислот, як правило, приблизно 2-20 амінокислот, які представлені в даному описі або відомі в даній галузі техніки.
Прийнятні неімуногенні пептидні лінкери містять, наприклад, пептидні лінкери (045), (Од), (Са5)п або С4(5С4)п, в яких п звичайно означає число від 1 до 10, як правило, від 2 до 4.
Ес-домен
Ес-домен активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули складається з пари поліпептидних ланцюгів, що містять домени важкого ланцюга молекули імуноглобуліну. Наприклад, Ес-домен молекули імуноглобуліну з (940) являє собою димер, кожна з субодиниць якого містить константні домени СН2 і СНЗ важкого ланцюга дос. Две субодиниці Ес-домену мають здатність до стабільної асоціації один з іншим. В одному з варіантів здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, запропонована у винаході, містить не більше одного Ес-домену.
В одному з варіантів здійснення Ес-домен активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули являє собою Ес-домен до. В конкретному варіанті здійснення винаходу Ес-домен являє собою Ес-домен ІдсСі. В іншому варіанті здійснення винаходу Ес- домен являє собою Ес-домен Ідб4. В більше конкретному варіанті здійснення винаходу Ес- домен являє собою Ес-домен дб, який містить амінокислотну заміну в положенні 5228 (нумерація за Кеботом), зокрема, амінокислотну заміну 5228Р. Ета амінокислотна заміна знижує обмін іп мімо в ЕРар-плече антитіл у вигляді дб (див. Зіирепгацсп та інш., ЮОгид
Меїароїїзт апа Оізрозйіоп 38, 2010, сс. 84-91). В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу Ес-домен є людським. Наведена як приклад послідовність Ес-ділянки людського Ідсі представлена в 5ЕО ІЮ МО: 107.
Модифікації Ес-домену, що посилюють гетеродимеризацію
Активувальні Т-клітини біспецифічні антигензв'язувальні молекули, запропоновані у винаході, містять різні антигензв'язувальні фрагменти, злиті з однією або з іншою з двох субодиниць Ес-домену, при цьому дві субодиниці Ес-домену, як правило, містяться в двох неідентичних поліпептидних ланцюгах. Рекомбінантна сумісна експресія цих поліпептидів і наступна димеризація приводить до декількох можливих комбінацій двох поліпептидів. Для підвищення виходу й чистоти активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул при їх одержанні методами рекомбінації є доцільним інтродукувати в Ес-домен активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули модифікацію, яка посилює асоціацію необхідних поліпептидів.
Таким чином, в конкретних варіантах здійснення винаходу Ес-домен активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка пропонується у винаході, містить
Зо модифікацію, яка посилює асоціацію першої й другої субодиниць Ес-домену. Сайт найбільш сильного білок-білкового взаємодії двох субодиниць Ес-домену людського ЇдДсС знаходиться в
СНЗ-домені Рс-домену. Таким чином, в одному з варіантів здійснення винаходу зазначена модифікація знаходиться в СНЗ-домені Ес-домену.
В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена модифікація являє собою так звану модифікацію типу "Кпоб-іп-поЇїе" (типу "виступ-западина"), яка охоплює модифікацію, що призводить до утворення "виступу" в одній з двох субодиниць Ес-домену і до утворення "западини" в іншій одній з двох субодиниць Ес-домену.
Технологія "Кпор-іпіо-поЇе" описана, наприклад, в ОБ Мо 5731168; 05 Мо 7695936; у Кіддул"ау та інш., Ргої Епод 9, 1996, сс. 617-621 і Сапег, У Іттипої! Меїйй 248, 2001, сс. 7-15. В цілому, метод охоплює інтродукцію опуклості ("виступ") на поверхні розділення першого поліпептиду і відповідної порожнини ("западина") в поверхні розділення другого поліпептиду, в результаті опуклість може поміщатися в порожнину, посилюючи тим самим утворення гетеродимера і перешкоджаючи утворенню гомодимера. Опуклості конструюють шляхом заміни амінокислот з невеликими бічними ланцюгами на поверхні розділення першого поліпептиду на амінокислоти з більше крупними бічними ланцюгами (наприклад, на тирозин або триптофан). Компенсувальні порожнини ідентичного або схожого з випуклостями розміру конструюють в поверхні розділення другого поліпептиду шляхом заміни амінокислот з крупними бічними ланцюгами на амінокислоти з менш крупними бічними ланцюгами (наприклад, аланін або треонін).
Таким чином, в конкретному варіанті здійснення винаходу в СНЗ-домені першої субодиниці
Ес-домену активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули амінокислотний залишок замінений амінокислотним залишком, який має більший об'єм бокового ланцюга, що приводить до утворення опуклості в СНЗ-домені першої субодиниці, яка може поміщатися в порожнину в СНЗ-домені другої субодиниці, і в СНЗ-домені другої субодиниці Ес- домену амінокислотний залишок замінений амінокислотним залишком, який має менший об'єм бокового ланцюга, що приводить до утворення порожнини в СНЗ-домені другої субодиниці, в яку може поміщатися опуклість в СНЗ-домені першої субодиниці.
Опуклість і порожнину можна створювати шляхом зміни нуклеїнових кислот, що кодують поліпептиди, наприклад, за допомогою сайтспрямованого мутагенезу або шляхом пептидного синтезу.
В конкретному варіанті здійснення винаходу в СНЗ-домені першої субодиниці Ес-домену залишок треоніну в положенні 366 замінений залишком триптофану (Т366УМ), і в СНЗ-домені другої субодиниці Ес-домену залишок тирозину в положенні 407 замінений залишком валіну (у407М). В одному з варіантів здійснення винаходу у другій субьєдиниці Ес-домену додатково залишок треоніну в положенні 366 замінений залишком серину (13665) і залишок лейцину в положенні 368 замінений залишком аланіну (І З3685А).
В наступному варіанті здійснення винаходу в першої субьединице Ес-домену додатково залишок серину в положенні 354 замінений залишком цистеїну (5354) і у другій субодиниці Ес- домену додатково залишок тирозину в положенні 349 замінений залишком цистеїну (У349С).
Інтродукція цих двох залишків цистеїну приводить до утворення дисульфідного містка між двома субодиницями Ес-домену, що додатково стабілізує димер (Сагіег, У Іттипої МеїШйод5 248, 2001, сс. 7-15).
В конкретному варіанті здійснення винаходу антигензв'язувальний фрагмент, який має здатність зв'язуватися з СОЮЗ, злитий (необов'язково через антигензв'язувальний фрагмент, який має здатність зв'язуватися з антигеном клітини-мішені) з першою субодиницею Ес-домену (яка містить модифікацію, яка приводить до утворення "виступа"). Якщо не вдаватись у будь-яку теорію, злиття антигензв'язувального фрагмента, який має здатність зв'язуватися з СОЗ, з що містить "виступ" субодиницею Рсо-домену повинно (додатково) мінімізувати утворення антигензв'язувальних молекул, що містять два антигензв'язувальних фрагменти, які мають здатність зв'язуватися з СОЗ (стеричне "зіткнення" двох поліпептидів, що містять "виступ".
В альтернативному варіанті здійснення винаходу модифікація, що посилює асоціацію першої й другої субодиниці Ес-домену, являє собою модифікацію, що опосередковує визначувані електростатичною дією впливи, наприклад, описані в публікації РСТ УМО 2009/089004. В цілому, зазначений метод охоплює заміну одного або декількох амінокислотних залишків на поверхні розділення двох субодиниць Ес-домену на зарядженні амінокислотні залишки, в результаті чого утворення гомодимера стає електростатично невигідним, а гетеродимеризація стає електростатично вигідною.
Модифікації Ес-домену, що приводять до зниження зв'язування з Ес-рецептором і/або ефекторної функції
Зо Ес-домен надає активувальній Т-клітини біспецифічній антигензв'язувальній молекулі переважні фармакокінетичні властивості, включаючи тривалий час напівжиття в сироватці, що забезпечує гарне накопичення в тканині-мішені й переважне співвідношення розподілу в тканині-крові. Однак в той самий час він може приводити до небажаної спрямованості активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули до клітин, які експресують Ес-рецептори, а не до переважних клітин, що несуть антиген. крім того, сумісна активація шляхів передачі сигналів Ес-рецептора може приводити до вивільнення цитокінів, що в поєднанні з активувальними Т-клітини властивостями і тривалим часом напівжиття антигензв'язувальної молекули, приводить до надлишкової активації цитокінових рецепторів і значних побічних дій при системному введенні. Активація (що несуть Ес-рецептор) імунних клітин, відмінних від Т-клітин, може навіть знижувати ефективність активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули з причини можливої деструкції Т-клітин, наприклад, МК-клітинами.
Таким чином, згідно з конкретним варіантам здійснення винаходу Ес-домен активувальної Т- клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка пропонується у винаході, має знижену афінність зв'язування з Ес-рецептором і/або зниженою ефекторною функцією у порівнянні з нативним Ео-доменом Ідсі. В одному із зазначених варіантів здійснення винаходу
Ес-домен (або активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить зазначений Ес-домен) характеризується афінністю зв'язування, яка складає менше ніж 50 9бо, переважно менше ніж 20 95, більше переважно менше ніж 10 95 і найбільш переважно менше ніж 5 95 від афінності зв'язування з Ес-рецептором нативного Ес-домену до: (або активувальної
Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, що містить зазначений нативний Ес- домен Ідсі), або ефекторною функцією, яка складає менше ніж 50 95, переважно менше ніж 20 95, більше переважно менше ніж 10 95 і найбільш переважно менше ніж 5 95 від ефекторної функції нативного Ес-домену ЇдсСі (або активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, що містить зазначений нативний Ес-домен Ідс1). В одному з варіантів здійснення винаходу Ес-домен (або активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить зазначений Ес-домен) практично не зв'язується з Ес- рецептором і/або не індукує ефекторну функцію. В конкретному варіанті здійснення винаходу
Ес-рецептор являє собою Есу-рецептор. В одному з варіантів здійснення винаходу Ес-рецептор бо являє собою людський Ес-рецептор. В одному з варіантів здійснення винаходу Ес-рецептор являє собою активувальний Ес-рецептор. В конкретному варіанті здійснення винаходу Ес- рецептор являє собою активувальний людський Есу-рецептор, більше конкретно людський
ЕсукШа, Есук!І або ЕсукКіІІа, найбільш переважно людський ЕсукКІШа. В одному з варіантів здійснення винаходу ефекторна функція являє собою одну або декілька функцій, вибраних з групи, що містить СОС, АОСС, АОСР і секрецію цитокінів. В конкретному варіанті здійснення винаходу ефекторна функція являє собою АОС. В одному з варіантів здійснення винаходу Ес- домен характеризується практично такою ж самою афінністю зв'язування з неонатальним Ес- рецептором (БсоКп), що і нативний Ес-домен Ідсб1ї. Практично таке ж зв'язування з ЕсКп досягається, коли Рсо-домен (або активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить зазначений Ес-домен), характеризується афінністю зв'язування, яка складає більше ніж приблизно 70 95, переважно більше ніж приблизно 80 95, більше переважно більше ніж приблизно 9095, від афінності зв'язування нативного Ес-домену |дс:ї (або активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, який містить нативний Ес домен Ідсі) з ЕсКп.
Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу Ес-домен конструюють так, щоб він мав знижену афінність зв'язування з Ес-рецептором і/або знижену ефекторну функцію у порівнянні з
Ес-доменом, який не піддавали інженерії. В конкретних варіантах здійснення винаходу Ес-домен активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули містить одну або декілька амінокислотних мутацій, які знижують афінність зв'язування Ес-домену з Есо-рецептором і/або ефекторну функцію. Як правило, одна або декілька однакових амінокислотних мутацій є присутніми в кожній з двох субодиниць Ес-домену. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначені амінокислотні мутації знижують афінність зв'язування Ес-домену з Ес-рецептором щонайменше в 2 рази, щонайменше в 5 раз або щонайменше в 10 раз. Згідно з варіантам здійснення винаходу, в яких має місце більше однієї амінокислотної мутації, які знижують афінність зв'язування Ес-домену з Ес-рецептором, комбінація зазначених амінокислотних мутацій може знижувати афінність зв'язування Ес-домену з Ес-рецептором щонайменше в 10 разів, щонайменше в 20 разів або щонайменше в 50 разів. В одному з варіантів здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить сконструйований Ес-домен, характеризується афінністю зв'язування, яка складає менше ніж 20 95, зокрема, менше ніж 10 95, більше переважно менше ніж 5 95 від афінності зв'язування з
Ес-рецептором, характерної для активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, що містить Ес-домен, який не піддавали інженерії. В конкретному варіанті здійснення винаходу Ес-рецептор являє собою Есу-рецептор. В деяких варіантах здійснення винаходу Ес- рецептор являє собою людський Ес-рецептор. В деяких варіантах здійснення винаходу Ес- рецептор являє собою активувальний Ес-рецептор. В конкретному варіанті здійснення винаходу
Ес-рецептор являє собою активувальний людський Ес-рецептор, більше конкретно людський
ЕсукШа, Есукі!І або ЕсукКПа, найбільш переважно людський ЕсукКШа. Переважно уменшаєтся зв'язування з кожним з цих рецепторів. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу знижується також афінність зв'язування з компонентом системи комплементу, зокрема, афінність зв'язування з С1д. Згідно з одному з варіантів здійснення винаходу не знижується афінність зв'язування з неонатальним Ес-рецептором (БсКп). Практично таке ж саме зв'язування з сКп, тобто зберігання афінності зв'язування Ес-домену з зазначеним рецептором, досягається, коли Ес-домен (або активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить зазначений Ес-домен) характеризується афінністю зв'язування з ЕсКп, яка складає більше ніж приблизно 70 95 від афінності зв'язування з ЕсКп форми ЕРс-домену, яку не піддавали інженерії (або активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, що містить форму Ес-домену, яку не піддавали інженерії). Ес- домен або біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т-клітини, запропоновані у винаході, які містять зазначений Ес-домен, можуть характеризуватися афінністю, яка складає більше ніж приблизно 80 95 і навіть більше ніж приблизно 90 95 від зазначеної вище афінності. В деяких варіантах здійснення винаходу Ес-домен активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули створюють так, щоб він мав знижену ефекторну функцію у порівнянні з Рс-доменом, який не піддавали інженерії. Знижена ефекторна функція може представляти собою (але, не обмежуючись тільки ними) знижену одну або декілька з наступних функцій: знижена комплемент-залежна цитотоксичність (СОС), знижена антитіло-зумовлена клітинно-залежна цитотоксичність (АОСС), понижений антитіло-зумовлений клітинно-залежний фагоцитоз (АОСР), знижена секреція цитокінів, знижене опосередковане імунним комплексом поглинання антигену антигенпрезентувальними клітинами, знижене зв'язування з МК-клітинами, знижене зв'язування з макрофагами, знижене зв'язування з моноцитами, знижене зв'язування з бо поліморфоядерними клітинами, знижена безпосередня передача сигналу, що індукує апоптоз,
знижене перехресне зшивання зв'язаних з мішенню антитіл, знижене дозрівання дендритних клітин або знижене Т-клітинне примірування. В одному з варіантів здійснення винаходу знижена ефекторна функція являє собою одну або декілька функцій, вибраних з групи, що містить знижену СОС, знижену АОСС, знижений АЮОСР і знижену секрецію цитокінів. В конкретному варіанті здійснення винаходу знижена ефекторна функція являє собою знижену АЮСС. В одному з варіантів здійснення винаходу знижена АЮОСС складає менше 20 95 від АОСС, яка індукується не підданим інженерії Ес-доменом (або активувальною Т-клітини біспецифічною антигензв'язувальною молекулою, що містить не підданий інженерії Ес-домен).
В одному з варіантів здійснення винаходу амінокислотна мутація, яка знижує афінність зв'язування Ес-домену з Ес-рецептором і/або ефекторну функцію, являє собою амінокислотну заміну. В одному з варіантів здійснення винаходу Ес-домен містить амінокислотну заміну в положенні, вибраному з Е233, 1234, 1235, М297, РЗ31 і РЗ29. В більш конкретному варіанті здійснення винаходу Ес-домен містить амінокислотну заміну в положенні, вибраному з 1234,
Ї235 і РЗ29. В деяких варіантах здійснення винаходу Ес-домен містить амінокислотні заміни
Ї234А і І235А. В одному із зазначених варіантів здійснення винаходу Ес-домен являє собою Ес- домен Ідсі, зокрема, Ес-домен людського Ідс:1ї. В одному з варіантів здійснення винаходу Ес- домен містить амінокислотну заміну в положенні РЗ29. В більше конкретному варіанті здійснення винаходу амінокислотна заміна являє собою РЗ329А або РЗ3290, насамперед РЗ3290.
В одному з варіантів здійснення винаходу Ес-домен містить амінокислотну заміну в положенні
РЗ329 і додаткову амінокислотну заміну в положенні, вибраному з Е233, І 234, 1235, М297 і РЗ331.
В більше конкретному варіанті здійснення винаходу додаткова амінокислотна заміна являє собою Е23З3Р, 1234А, 1І235А, 1235Е, М297А, М297О0 або РЗ315. В конкретних варіантах здійснення винаходу Ес-домен містить амінокислотні заміни в положеннях РЗ329, 1234 і 1235. В більше конкретних варіантах здійснення винаходу Ес-домен містить амінокислотні мутації
Ї234А, І1235А і РЗ290 ("РЗ290 І АГА"). В одному із зазначених варіантів здійснення винаходу
Ес-домен являє собою Бо-домен дсїі, зокрема БЕсо-домен людського /Ідс:ї. Комбінація амінокислотних замін "3295 ГАГА" практично повністю елімінує зв'язування з Есу-рецептором (а також комплементом) Ес-домену людського Їдбі, що описано в заявці на патент РСТ
РСТ/ЕР2012/055393, яка повністю включена в даний опис як посилання. В РСТ/ЕР2012/055393
Зо описані також методи одержання зазначених мутантних Ес-доменів, методи вивчення їх властивостей, таких як зв'язування з Ес-рецептором або ефекторні функції.
Антитіла підкласу Си мають зниженою афінність до зв'язування з Ес-рецепторами і зниженими ефекторними функціями у порівнянні з антитілами підкласу ІдсСі. Таким чином, в деяких варіантах здійснення винаходу Ес-домен активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, які запропоновані у винаході, являє собою Ес-домен Ідса, зокрема Ес-домен людського дб. В одному з варіантів здійснення винаходу Ес-домен Ідса містить амінокислотні заміни в положенні 5228, конкретно амінокислотну заміну 5228Р. Для додаткового зниження афінності зв'язування з Ес-рецептором і/або його ефекторною функції в одному з варіантів здійснення винаходу Ес-домен Ід(Стя містить амінокислотну заміну в положенні І 235, зокрема, амінокислотну заміну І 235Е. В іншому варіанті здійснення винаходу
Ес-домен ІдСа містить амінокислотну заміну в положенні РЗ329, зокрема, амінокислотну заміну
РЗ296. В конкретному варіанті здійснення винаходу Ес-домен ІдсСа містить амінокислотні заміни в положеннях 5228, 1235 і РЗ29, зокрема, амінокислотні заміни 5228Р, 1235Е і РЗ296.
Зазначені мутанти ЕРс-домену ІдСі4 і їх особливості зв'язування з Есу-рецептором описані в заявці на патент РСТ РСТ/ЕР2012/055393, яка повністю включена в даний опис як посилання.
В конкретному варіанті здійснення винаходу Ес-домен, що характеризується зниженою афінністю зв'язування з Ес-рецептором і/або зниженою ефекторною функцією у порівнянні з нативним Ес-доменом Ідс:, являє собою Ес-домен людського Ідс:, який містить амінокислотні заміни Г234А, І235А і необов'язково РЗ329б, або ЕРсо-домен людського Ідса, який містить амінокислотні заміни 5228Р, І 235Е і необов'язково РЗ290.
В деяких варіантах здійснення винаходу елімінували М-глікозилювання Ес-домену. В одному із зазначених варіантів здійснення винаходу Ес-домен містить амінокислотну мутацію в положенні М297, зокрема, амінокислотну заміну аспарагіну на аланін (М297А) або аспарагінову кислоту (М2970).
Окрім Ес-доменів, описаних вище і в заявці на патент РСТ РСТ/ЕР2012/055393, Ес-домени зі зниженою здатністю зв'язуватися з Ес-рецептором і/або ефекторною функцією містять також Ес- домени з заміною одного або декількох залишків 238, 265, 269, 270, 297, 327 і 329 в Ес-домені (05 Мо 637056). До зазначених мутантів Ес відносяться мутанти Ес з замінами в двох або більшій кількості з амінокислотних положень 265, 269, 270, 297 і 327, включаючи так званий бо мутант Ес-домену "САМА" з заміною залишків 265 і 297 на аланін (05 Мо 7332581).
Зо
Мутантні Ес-домени можна одержувати шляхом амінокислотної делеції, заміни, інсерції або модифікації з застосуванням генетичних або хімічних методів, добре відомих в даній галузі.
Генетичні методи можуть містити сайтспрямований мутагенез кодувальної ДНК послідовності,
ПЦР, синтез генів тощо. Правильність нуклеотидних замін можна підтверджувати, наприклад, секвенуванням.
Зв'язування з Ес-рецепторами можна легко визначати, наприклад, за допомогою ЕГІ5А або поверхневого плазмонного резонансу (5РЕ) з застосуванням стандартного обладнання, такого як пристрій ВіАсоге (фірма СЕ НеаїїБсаге), й із застосуванням таких Ес-рецепторів, які можна одержувати методом рекомбінантної експресії. Прийнятний зазначений аналіз зв'язування представлений в даному описі. Альтернативно до цього, афінність зв'язування Ес-доменів або активувальних клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, що містять Ес-домен, з Ес- рецепторами можна оцінювати з застосуванням клітинних ліній, для яких відомо, що вони експресують конкретні Ес-рецептори, такі як людські МК-клітини, що експресують ЕсуШа- рецептор.
Ефекторну функцію Ес-домену або активувальної /Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, що містить Ес-домен, можна оцінювати методами, відомими в даній ділянці. Прийнятний аналіз для оцінювання АОСС представлений в даному описі. Інші приклади аналізів іп міо, призначених для оцінювання АЮОСсС-активності молекули, яка представляє інтерес описані в 5 Мо 5500362; у НеїЇбігот та інш., Ргос Маї! Асай сі О5А 83, 1986, сс. 7059-7063 і Неїївігот та інш., Ргос Май! Асай сі О5А 82, 1985, сс. 1499-1502; 005 Мо 5821337; у Вгиддетапп та інш., У Ехр Мей 166, 1987, сс. 1351-1361. Альтернативно до цього, можна застосовувати методи, основані на нерадіоактивному аналізі (див., наприклад, АСТІ "М - нерадіоактивний аналіз цитотоксичності за допомогою проточної цитометрії (фірма
СеїПЧесппоїіоду, пс. Маунтин-Вью, шт. Калифорния); і СуїТох 962 - нерадіоактивний аналіз цитотоксичності (фірма Рготеда, Медісон, шт. Вісконсин)). Прийнятними ефекторними клітинами для таких аналізів є мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМС) і природні клітини-кілери (МК). В альтернативному або додатковому варіанті АОСС-активність молекули, яка представляє інтерес можна оцінювати іп мімо, наприклад, із застосуванням створених на тваринах моделей, описаних у Сіупез та інш., Ргос Маї! Асай 5сі О5А 95, 1998, сс. 652-656.
В деяких варіантах здійснення винаходу змінюють зв'язування Ес-домену з компонентом системи комплементу, зокрема з С1д. Таким чином, в деяких варіантах здійснення винаходу, в яких Ес-домен конструюють так, щоб він мав змінену ефекторну функцію, зазначена змінена ефекторна функція охоплює змінену СОС. Можна здійснювати аналізи зв'язування С1д для вирішення питання про те, чи може активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула зв'язуватися з С1д і, як наслідок, чи має вона СОС-активність (див., наприклад, аналізи зв'язування з Сід і СЗс за допомогою ЕГІЗА, описані в УМО 2006/029879 і МО 2005/100402). Для оцінювання активації комплементу можна здійснювати аналіз СОС (див., наприклад, Са?77апо-Запіого та інш., У Іттипої Меїйоадз 202, 1996, з. 163; Стадд та інш., Віоса 101, 2003, сс. 1045-1052 і Стадд і СІеппіє, Віоса 103, 2004, сс. 2738-2743).
Антигензв'язувальні фрагменти
Антигензв'язувальна молекула, запропонована у винаході, є біспецифічною, тобто вона містить щонайменше два антигензв'язувальних фрагменти, що мають здатність специфічно зв'язуватися з двома різними антигенними детермінантами. Згідно з винаходом антигензв'язувальні фрагменти представляють собою молекули Раб (тобто антигензв'язувальні домени, що складаються з важкого і легкого ланцюга, кожна з яких містить варіабельну і константну ділянку). В одному з варіантів здійснення винаходу зазначені молекули Раб є людськими. В іншому варіанті здійснення винаходу зазначені молекули Раб є гуманізованими. В наступному варіанті здійснення винаходу зазначені молекули Раб містять константні ділянки людського важкого і легкого ланцюга.
Щонайменше один з антигензв'язувальних фрагментів являє собою одержану в результаті кросинговеру молекулу Раб. Зазначена модифікація перешкоджає помилковому спарюванню важких і легких ланцюгів з різних молекул Раб, підвищуючи тим самим вихід і чистоту активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка пропонується у винаході, при рекомбінантному одержанні. В конкретній одержаній в результаті кросинговеру молекулі Раб, яку можна застосовувати для створення активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка пропонується у винаході, обмінені константні ділянки легкого ланцюга Бар і важкого ланцюга Бар. В іншій одержаній в результаті кросинговеру молекулі Бар, яку можна застосовувати для створення активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка пропонується у винаході, обмінені варіабельні ділянки бо легкого ланцюга Раб і важкого ланцюга Рар.
В конкретному варіанті здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула має здатність одночасно зв'язуватися з антигеном клітини- мішені, зокрема, антигеном пухлинної клітини, і 3 СОЗ3. В одному з варіантів здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула має здатність до перехресного зшивання Т-клітини і клітини-мішені в результаті одночасного зв'язування з антигеном клітини-мішені і з СО3. В ще більш конкретному варіанті здійснення винаходу зазначене одночасне зв'язування приводить до лізису клітини-мішені, зокрема, пухлинної клітини. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначене одночасне зв'язування приводить до активації Т-клітини. В інших варіантах здійснення винаходу зазначене одночасне зв'язування приводить до клітинної відповіді Т-лімфоциту, насамперед цитотоксичного Т-лімфоциту, вибраного з групи, що містить: проліферацію, диференціювання, секрецію цитокінів, вивільнення цитотоксичних ефекторних молекул, цитотоксичну активність і експресію маркерів активації. В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язування активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули з СОЗ без одночасного зв'язування з антигеном клітини-мішені не приводить до Т-клітинної активації.
В одному з варіантів здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула має здатність переорієнтовувати цитотоксичну активність Т- клітини до клітині-мішені. В конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена переорієнтація не залежить від опосередкованої ГКГС презентації пептидного антигену клітиною-мішенню і/або від специфічності Т-клітини.
Зокрема, згідно з любому з варіантів здійснення винаходу Т-клітина, запропонована у винаході, являє собою цитотоксичну Т-клітину В деяких варіантах здійснення винаходу Т- клітина являє собою с СО4-- або СО8:-Т-клітину, насамперед СО8:-Т-клітину
СОЗ-зв'язувальний фрагмент
Активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, запропонована у винаході, містить щонайменше один антигензв'язувальний фрагмент, який має здатність зв'язуватися з СОЗ (який позначають також в контексті даного опису як "зв'язувальний антиген
СОЗ фрагмент" або "перший антигензв'язувальний фрагмент"). В конкретному варіанті здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула
Зо містить не більше одного антигензв'язувального фрагмента, що має здатність специфічно зв'язуватися з СОЮЗ. В одному з варіантів здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула характеризується одновалентним зв'язуванням з
СО3. Зв'язувальна антиген СОЗ молекула являє собою одержану в результаті кросинговеру молекулу Раб, тобто молекулу Раб, в якій або варіабельні, або константні ділянки важкого і легкого ланцюгів Бар обмінені. У варіантах здійснення винаходу, в яких більше одного антигензв'язувального фрагмента, що має здатність специфічно зв'язуватися з антигеном клітини-мішені, міститься в активувальній Т-клітини біспецифічній антигензв'язувальній молекулі, антигензв'язувальний фрагмент, що має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ, переважно являє собою одержану в результаті кросинговеру молекулу ар, а антигензв'язувальні фрагменти, що мають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном клітини-мішені, представляють собою канонічні молекули Раб.
В конкретному варіанті здійснення винаходу СЮОЗ являє собою людський СОЗ (ЗЕО ІЮ МО: 103) або СОЗ мавп циномолгус (ЗЕО ІЮ МО: 104), найбільш переважно людський СО3. В конкретному варіанті здійснення винаходу зв'язувальний антиген СОЗ фрагмент має перехресну реактивність до (тобто специфічно зв'язується 3...) з СОЗ людини і мавп циномолгус. В деяких варіантах здійснення винаходу перший антигензв'язувальний фрагмент має здатність специфічно зв'язуватися з епсилон-субодиницею СОЗ.
Зв'язувальний антиген СОЗ фрагмент містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 4, БЕО ІЮ МО: 5 і ЗЕО
ІО МО: 6, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 9, БЕО ІЮ МО: 10.
В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язувальний антиген СОЗ фрагмент містить
СОКІ1 важкого ланцюга, що має ЗЕО ІЮ МО: 4, СОК2 важкого ланцюга, що має 5ЕО ІО МО: 5,
СОКЗ важкого ланцюга, що має 5ЕО ІО МО: 6, СОКІ легкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮО МО: 8,
СОКЗ2 легкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮ МО: 9, і СОКЗ легкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮО МО: 10.
В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язувальний антиген СОЗ фрагмент містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 96, 97 Зо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи:
ЗЕО ІЮ МО: 3, 5ЕБЕО ІЮО МО: 32 і 5ЕО ІО МО: 33, і послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: зЗЕО ІЮ МО: 7 і ЗЕО ІЮО МО: 31.
В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язувальний антиген СОЗ фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи:
ЗБЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІО МО: 32 і 5ЕО ІЮ МО: 33, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи: БЕО ІЮ МО: 7 ії БЕО ІЮ МО: 31.
В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язувальний антиген СОЗ фрагмент містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 9», 97 9», 98 90, 99 95 або 100 95 ідентична ЗЕО ІО МО: 3, і послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 7.
В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язувальний антиген СОЗ фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 3, варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 7.
В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язувальний антиген СОЗ фрагмент послідовної варіабельної ділянки важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: З і послідовної варіабельної ділянки легкого ланцюга 5ЕО І МО: 7.
Фрагмент, зв'язувальний антиген клітини-мішені
Активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, запропонована у винаході, містить щонайменше один антигензв'язувальний фрагмент, що має здатність зв'язуватися з антигеном клітини-мішені (позначений також у контексті даного опису як "фрагмент, зв'язувальний антиген клітини-мішені, або "другий", або "третій" антигензв'язувальний фрагмент). В деяких варіантах здійснення винаходу активувальна Т- клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить два антигензв'язувальних фрагмента, які мають здатність зв'язуватися з антигеном клітини-мішені. В конкретному зазначеному варіанті здійснення винаходу кожний з цих антигензв'язувальних фрагментів специфічно зв'язується з однією і тією ж самою антигенною детермінантою. В ще більше конкретному варіанті здійснення винаходу всі зазначені антигензв'язувальні фрагменти є ідентичними. В одному з варіантів здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна
Зо антигензв'язувальна молекула містить молекулу імуноглобуліну, яка має здатність специфічно зв'язуватися 3 антигеном клітини-мішені. В одному з варіантів здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить не більше двох антигензв'язувальних фрагментів, які мають здатність зв'язуватися з антигеном клітини-мішені.
Фрагмент, зв'язувальний антиген клітини-мішені, як правило, являє собою молекулу Еаб, насамперед канонічну молекулу Раб, яка зв'язується з конкретною антигенною детермінантою і має здатність спрямовувати активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу до сайту-мішені, наприклад, до конкретному типу пухлинної клітини, яка несе антигенну детермінанту.
В деяких варіантах здійснення винаходу фрагмент, зв'язувальний антиген клітини-мішені, специфічно зв'язується з антигеном клітинної поверхні. В конкретному варіанті здійснення винаходу фрагмент, зв'язувальний антиген клітини-мішені, специфічно зв'язується з мембрано- проксимальною ділянкою антигену клітинної поверхні. В конкретному зазначеному варіанті здійснення винаходу зазначений антиген клітинної поверхні являє собою карциноембріональний антиген (СЕА) і мембрано-проксимальна ділянка являє собою ВЗ-домен
СЕА (залишки 208-286 5ЕО ІЮО МО: 119). В іншому конкретному зазначеному варіанті здійснення винаходу антиген клітинної поверхні являє собою асоційований з меланомою хондроїтинсульфат-протеоглікан (МС5Р) і мембрано-проксимальна ділянка являє собою 03- домен М5СР (ЗЕО ІЮО МО: 118).
В деяких варіантах здійснення винаходу фрагмент, зв'язувальний антиген клітини-мішені, спрямований проти антигену, асоційованого з патологічним станом, такого як антиген, що презентується пухлинною клітиною або інфікованою вірусом клітиною. Прийнятними антигенами є антигени клітинної поверхні, наприклад (але, не обмежуючись тільки ними), рецептори клітинної поверхні. В конкретних варіантах здійснення винаходу антиген являє собою людський антиген. В конкретному варіанті здійснення винаходу антиген клітини-мішені вибирають з групи, що містить асоційований з меланомою хондроїтинсульфат-протеоглікан (МО5Р) і карциноембріональний антиген (СЕА, СЕАСАМ5).
В конкретних варіантах здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить по менший мере один антигензв'язувальний фрагмент, специфічний у відношенні асоційованого з меланомою хондроїтинсульфат-протеоглікану бо (МО5Р). В одному з варіантів здійснення антигензв'язувальний фрагмент, який є специфічним у відношенні МС5Р, містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 14, 5ЕО ІЮО МО: 15, 5ЕО ІО МО: 16, 5ЕО ІО МО: 35, 5ЕО ІЮО МО: 37, 5ЕО ІО МО: 38 і 5ЕО І МО: 40, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: БЕО ІЮ МО: 18, 5ЕО ІЮ МО: 19, 5ЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО ІО МО: 44, 5ЕО ІЮО МО: 45,
ЗЕО ІЮ МО: 48, ЗЕО ІЮО МО: 49 і БЕО ІЮ МО: 50.
В одному з варіантів здійснення антигензв'язувальний фрагмент, який є специфічним у відношенні МС5Р, містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОК) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5ЕБО ІЮ МО: 14, 5ЕБО ІЮО МО: 15 і 5ЕО ІЮ МО: 16, і щонайменше одну СОЕ. легкого ланцюга, вибрану з групи: БЕО ІЮ МО: 18, 5ЕО ІЮ МО: 19 і ЗЕО
ІО МО: 20.
В одному з варіантів здійснення антигензв'язувальний фрагмент, який є специфічним у відношенні МС5Р, містить СОКТ важкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮ МО: 14, СОК2 важкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮ МО: 15, СОКЗ важкого ланцюга, що має ЗЕО ІО МО: 16, СОКІ1 легкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮ МО: 18, СОК2 легкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮО МО: 19, і СОКЗ легкого ланцюга, що має 5ЕО ІО МО: 20.
В іншому варіанті здійснення антигензв'язувальний фрагмент, який є специфічним у відношенні МС5Р, містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 90, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: ЗЕО ІО МО: 13, 5ЕО ІЮ МО: 34, 5ЕО ІЮ МО: 36, 5ЕО ІЮО МО: 391
ЗЕБЕО ІЮ МО: 41, і послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 90, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з групи: БЕО ІЮ МО: 17, ЗЕО ІЮ МО: 43, 5ЕО ІЮО МО: 46, 5ЕО ІЮ МО: 47 ії БЕО ІЮ МО: 51.
В наступному варіанті здійснення антигензв'язувальний фрагмент, який є специфічним у відношенні МОС5Р, містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи: БЕО ІЮО МО: 13, 5ЕО І МО: 34, 5ЕО І МО: 36, 5ЕО ІЮ МО: 39 і
ЗЕО ІО МО: 41, і містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи: 5ЕО ІЮ МО: 17, 5ЕО ІЮО МО: 43, 5ЕО ІО МО: 46, 5ЕО ІЮ МО: 47 і
ЗЕО ІЮО МО: 51.
В наступному варіанті здійснення антигензв'язувальний фрагмент, який є специфічним у відношенні МС5Р, містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Фо, 98 У», 99 95 або 100 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО:13, і послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 95, 9895, 9995 або 10095 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 17, або їх варіанти, які зберігають функціональність.
В одному з варіантів здійснення антигензв'язувальний фрагмент, який є специфічним у відношенні МСОС5Р, містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 13, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 17.
В одному з варіантів здійснення антигензв'язувальний фрагмент, який є специфічним у відношенні МСОС5Р, містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 13 і послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 17.
В одному з варіантів здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить поліпептидну послідовність, яка щонайменше приблизно на 9595, 9695, 97965, 9895, 995965 або 10095 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 12, поліпептидну послідовність, яка щонайменше приблизно на 9595, 9695, 97 95, 9895, 9995 або 100 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 53, поліпептидну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 У, 98 90, 99 95 або 100 95 ідентична 5ЕО ІЮО МО: 54, і поліпептидну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 9о, 97 о, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична 5ЕО ІЮО МО: 55.
В конкретних варіантах здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить щонайменше один антигензв'язувальний фрагмент, специфічний у відношенні карциноембріонального антигену (СЕА). В одному з варіантів здійснення антигензв'язувальний фрагмент, який є специфічним у відношенні СЕА, містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (СОМ) важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮО МО: 24, 5ЕО ІЮО МО: 25 ії 5ЕО ІЮО МО: 26, і щонайменше одну СОК легкого ланцюга, вибрану з групи: ЗЕО ІЮ МО: 28, 5ЕО ІО МО: 29 і ЗЕО ІЮ МО: 30.
В одному з варіантів здійснення антигензв'язувальний фрагмент, який є специфічним у відношенні СЕА, містить СОКІ важкого ланцюга, що має ЗЕО ІЮ МО: 24, СОК2 важкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮ МО: 25, СОКЗ важкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮ МО: 26, СОМК1 легкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮ МО: 28, СОМК2 легкого ланцюга, що має 5ЕО ІЮО МО: 29, і СОКЗ легкого 60 ланцюга, що має 5ЕО ІО МО: 30.
В іншому варіанті здійснення антигензв'язувальний фрагмент, який є специфічним у відношенні СЕА, містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 У, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична ЗЕО ІЮ МО: 23, і послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична 5ЕО ІО МО: 27, або її варіанти, які зберігають функціональність.
В одному з варіантів здійснення антигензв'язувальний фрагмент, який є специфічним у відношенні СЕА, містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 23, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 27.
В одному з варіантів здійснення антигензв'язувальний фрагмент, який є специфічним у відношенні СЕА, містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 23 і послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 27.
В одному з варіантів здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула містить поліпептидну послідовність, яка щонайменше приблизно на 9595, 9695, 97965, 9895, 995965 або 10095 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 22, поліпептидну послідовність, яка щонайменше приблизно на 9595, 9695, 97 95, 9895, 9995 або 100 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 56, поліпептидну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 У, 98 90, 99 95 або 100 95 ідентична 5ЕО ІЮО МО: 57, і поліпептидну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 9», 96 9, 97 9, 98 У», 99 95 або 100 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 58.
Полінуклеотиди
Винахід відноситься також до виділених полінуклеотидів, які кодують активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, представлені в даному описі, або її фрагмент. В деяких варіантах здійснення винаходу зазначений фрагмент являє собою антигензв'язувальний фрагмент.
Полінуклеотиди, запропоновані у винаході, містять полінуклеотиди, які щонайменше приблизно на 8095, 85 95, 90 95, 9595, 9695, 97 У, 9895, 9995 або 10095 є ідентичними послідовностям, представленим в 5ЕО ІЮ МО: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92,93, 94, 95, 96, 97 і 98, включаючи їх функціональні фрагменти або варіанти.
Зо Полінуклеотиди, що кодують що активують Т-клітини біспецифічні антигензв'язувальні молекули, запропоновані у винаході, можна експресувати у вигляді індивідуального полінуклеотиду, який кодує повну активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, або у вигляді декількох (наприклад, двох або більшої кількості) сумісно експресованих полінуклеотидів. Поліпептиди, які кодуються сумісно експресованими полінуклеотидами, можна поєднувати, наприклад, через дисульфідні зв'язки або іншими шляхами З утворенням функціонально активувальної / Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули. Наприклад, що являє собою легкий ланцюг частину антигензв'язувального фрагмента може кодуватися полінуклеотидом, який відрізняється від полінуклеотиду, що кодує частину активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, що являє собою важкий ланцюг антигензв'язувального фрагмента, субодиницю Ес- домену і необов'язково (частину) іншого антигензв'язувального фрагмента. При сумісній експресії поліпептиди важкого ланцюга повиння зв'язуватися з поліпептидами легкого ланцюга з утворенням антигензв'язувального фрагмента. В іншому прикладі частина активувальної Т- клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка містить одну з двох субодиниць Ес- домену і необов'язково (частину) одного або декількох антигензв'язувальних фрагментів, може кодуватися полінуклеотидом, що відрізняється від полінуклеотиду, який кодує частину активувальної Т-клітини антигензв'язувальної молекули, яка містить другу з двох субодиниць
Ес-домену і необов'язково (частину) антигензв'язувального фрагмента. При сумісній експресії субодиниці Есо-домену повинні зв'язуватися з утворенням Ес-домену.
В деяких варіантах здійснення винаходу виділений полінуклеотид кодує повну представлену в даному описі активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході. В інших варіантах здійснення винаходу виділений полінуклеотид кодує поліпептиди, що містяться в представленій в даному описі активувальній Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекулі, яка пропонується у винаході.
Іншим варіантом здійснення даного винаходу є виділений полінуклеотид, що кодує активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході, або її фрагмент, де полінуклеотид містить послідовність, яка кодує послідовність варіабельної ділянки, представлену в ЗЕО ІО МО: 3, 7, 13, 17, 23, 27, 31, 32, 33, 34, 36, 39, 41, 43, 46, 47 або 51. Іншим варіантом здійснення даного винаходу є виділений полінуклеотид, що кодує бо активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу або її фрагмент, де полінуклеотид містить послідовність, яка кодує поліпептидну послідовність, представлену в
ЗБО ІО МО: 22, 56, 57, 58, 12, 53, 54 і 55. Іншим варіантом здійснення даного винаходу є виділений полінуклеотид, що кодує активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу або її фрагмент, де полінуклеотид містить послідовність, яка щонайменше приблизно на 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 96 9Уо, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентична нуклеотидній послідовності, представленій в ЗЕО ІЮ МО: 63, 64, 65, 66,67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92,93, 94, 95, 96, 97 або 98. Іншим варіантом здійснення даного винаходу є виділений полінуклеотид, що кодує активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу або її фрагмент, де полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МОЗ 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92,93, 94, 95, 96, 97 або 98. Іншим варіантом здійснення даного винаходу є виділений полінуклеотид, що кодує активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу або її фрагмент, де полінуклеотид містить послідовність, яка кодує послідовність варіабельної ділянки, яка щонайменше приблизно на 80 9, 85 95, 90 95, 95 9, 96 95, 97 9», 98 95 або 99 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО
І МО: 3, 7, 13, 17, 23, 27, 31, 32, 33, 34, 36, 39, 41, 43, 46, 47 або 51. Іншим варіантом здійснення даного винаходу є виділений полінуклеотид, що кодує активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу або її фрагмент, де полінуклеотид містить послідовність, яка кодує поліпептидну послідовність, яка щонайменше на 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 96 925, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗХЕО ІЮ МО: 22, 56, 57, 58, 12, 53, 54 або 55. Винахід відноситься до виділеного полінуклеотиду, що кодує активувальну
Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу або її фрагмент, де полінуклеотид містить послідовність, яка кодує послідовність варіабельної ділянки ЗЕО ІЮО МО: 3, 7, 13, 17, 23, 27, 31, 32, 33, 34, 36, 39, 41, 43, 46, 47 або 51 з консервативними амінокислотними замінами. Винахід відноситься також до виділеного полінуклеотиду, що кодує активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу або її фрагмент, де полінуклеотид містить послідовність, яка кодує поліпептидну послідовність 5ЕО 10 МО: 22, 56, 57, 58, 12, 53, 54 або 55 з консервативними амінокислотними замінами.
В деяких варіантах здійснення винаходу полінуклеотид або нуклеїнова кислота являє собою
Зо ДНК. В інших варіантах здійснення винаходу полінуклеотид, що пропонується в даному винаході, являє собою РНК, наприклад, в формі матричної РНК (мРНК). РНК, яка пропонується в даному винаході, може бути одноланцюговою або дволанцюговою.
Методи рекомбінації
Біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т-клітини, запропоновані у винаході, можна одержувати, наприклад, шляхом твердофазного пептидного синтезу (наприклад, твердофазний синтез Меррифілда) або методом рекомбінації. Для рекомбінантного одержання один або декілька полінуклеотидів, що кодують активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу (фрагмент), наприклад, описану вище, виділяють і вбудовують в один або декілька векторів для додаткового клонування і/або експресії в клітині-хазяїні.
Зазначений полінуклеотид можна легко виділяти і секвенувати за допомогою загальноприйнятних процедур. Одним з варіантів здійснення винаходу є вектор, переважно експресійний вектор, який містить один або декілька полінуклеотидів, які запропоновані у винаході. Методи, добре відомі спеціалістам в даній галузі техніки, можна застосовувати для конструювання експресійних векторів, що містять кодувальну послідовність активувальної Т- клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули (фрагмента) наряду з прийнятними сигналами, які контролюють транскрипцію/трансляцію. Ці методи містять технології рекомбінантної ДНК іп міо, методи синтезу і рекомбінації/генетичної рекомбінації іп мімо (див., наприклад, методи, описані у Мапіаїі5 та інш., Мапіаїі5 та інш., МоїІесціаг СІопіпд А Гарогайгу
Мапиаї, вид-во Соїд 5ргіпд Нагрог І арогаїогу, М.У., 1989; ії А,5ибеї та інш., Сигепі Ргоїосої!5 іп
МоїІесшіаг Віоіоду, вид-во ОСгеепе Рибії5піпуд Авзосіаїез апа Уміеу Іпіегесіепсе, М.У., 1989).
Експресійний вектор може представляти собою частину плазміди, вірусу або може представляти собою фрагмент нуклеїнової кислоти. Експресійний вектор охоплює касету експресії в якій полінуклеотид, що кодує активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу (фрагмент) (тобто кодувальну область), клонують (із забезпеченням функціонального зв'язку з промотором і/або іншими елементами, що контролюють транскрипцію або трансляцію. В контексті даного опису "кодувальна ділянка" являє собою частину нуклеїнової кислоти, яка складається з кодонів, що транслюються в амінокислоти. Хоча "стоп-кодон" (ТАС, ТОА або ТАА) не транслюється в амінокислоту, він, у випадку його наявності, може розглядатися як частина кодувальної ділянки, однак будь-які бо фланкувальні послідовності, наприклад, промотори, сайти зв'язування рибосом, термінатори транскрипції, інтрони, 5'- і 3-нетрансльовані ділянки тощо, не є частиною кодувальної ділянки.
Дві або більша кількість кодувальних ділянок можуть бути присутніми в індивідуальній полінуклеотидній конструкції, наприклад, індивідуальному векторі або в окремих полінуклеотидних конструкціях, наприклад, окремих (різних) векторах. крім того, будь-який вектор може містити одну кодувальну ділянку або може містити дві або більшу кількість кодувальних ділянок, наприклад, вектор, що пропонується в даному винаході, може кодувати один або декілька поліпептидів, які пост- або котранляційно розділюються на кінцеві білки за допомогою протеолітичного розщеплення. Крім того, вектор, полінуклеотид або нуклеїнова кислота, що пропонується/запропонована у винаході, може кодувати гетерологічні кодувальні ділянки, або злиті, або не злиті з полінуклеотидом, який кодує активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу (фрагмент), запропоновану у винаході, або її варіант або похідне. Гетерологічні кодувальні ділянки містять (але, не обмежуючись тільки ними) спеціалізовані елементи або мотиви, такі як секреторний сигнальний пептид або гетерологічний функціональний домен. Функціональний зв'язок має місце, коли кодувальна ділянка генного продукту, наприклад поліпептиду, асоційована з однією або декількома регуляторними послідовностями таким чином, щоб експресія генного продукту знаходилась під впливом або контролем регуляторної(их) послідовності(ей). Два ДНК-фрагменти (таких як кодувальна ділянка поліпептиду й асоційований з нею промотор) є "функціонально зв'язаними", якщо індукція промоторної функції приводить до транскрипції мРНК, що кодує потрібний генний продукт, і якщо природа зв'язки між двома ДНК-фрагментами не має впливу на здатність регулювальних експресію послідовностей спрямовувати експресію генного продукту, або не має впливу на здатність ДНК-матриці до транскрипції. Таким чином, промоторна ділянка повинна бути функціонально зв'язана з нуклеїновою кислотою, яка кодує поліпептид, якщо промотор має здатність здійснювати транскрипцію нуклеїнової кислоти. Промотор може представляти собою специфічний для клітини промотор, який забезпечує значну транскрипцію ДНК тільки в попередньо відібраних клітинах. Інші контролювальні транскрипцію елементи, окрім промотору, наприклад, енхансери, оператори, репресори і сигнали термінації транскрипції, можна функціонально зв'язувати з полінуклеотидом для забезпечення специфічної для клітини транскрипції. Прийнятні промотори їі інші контролювальні транскрипцію ділянки представлені в
Зо даному описі. Спеціалістам в даній галузі техніки відомо широка різноманітність контролювальних транскрипцію ділянок. Вони містять (але, не обмежуючись тільки ними) контролювальні транскрипцію ділянки, які функціонують в клітинах хребетних тварин, такі як (але, не обмежуючись тільки ними) сегменти промоторів і енхансерів з цитомегаловірусів (наприклад, негайно-ранній промотор у поєднанні з інтроном-А), мавпячого вірусу 40 (наприклад, ранній промотор) і ретровірусів (таких як вірус саркоми Рауса). Інші контролювальні транскрипцію ділянки містять ділянки, виведенні з генів хребетних тварин, таких як ген актину, білка теплового шоку, бичачого гормону роста і кролячого р-глобину, а також інші послідовності, які можуть контролювати експресію генів в еукаріотичних клітинах. Додаткові прийнятні контролювальні транскрипцію ділянки містять тканиноспецифічні промотори і енхансери, а також індуцибельні промотори (наприклад, промотори, що індукуються тетрациклінами).
Аналогічно до цього, звичайним спеціалістам в даній галузі техніки відомо широка різноманітність контролювальних трансляцію елементів. Вони містять (але, не обмежуючись тільки ними) сайти зв'язування рибосом, кодони ініціації трансляції і термінувальні кодони і елементи, виведенні з вірусних систем (зокрема внутрішній сайт зв'язування (посадки) рибосом або ІКЕ5, який позначають також як СІТЕ-послідовність). Касета експресії може містити також інші характерні структури, такі як сайт ініціації реплікації і/або інтегровані в хромосому елементи, такі як довгі кінцеві повтори (ІТК) ретровірусів, або інвертовані кінцеві повтори (ІТК) аденоасоційованого вірусу (ААМ).
Кодувальні ділянки полінуклеотиду і нуклеїнової кислоти, запропоновані в даному винаході, можуть бути асоційовані з додатковими кодувальними областями, які кодують секреторні або сигнальні пептиди, які спрямовують секрецію поліпептиду, який кодується полінуклеотидом, що пропонується в даному винаході. Наприклад, якщо потрібною є секреція активувальної Т- клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, то ДНК, що кодує сигнальну послідовність, можна поміщати проти ходу транскрипції відносно нуклеїнової кислоти, що кодує активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході, або її фрагмент. Згідно з гіпотезою, що стосується сигналів, білки, які секретуються клітинами ссавців, мають сигнальний пептид або секреторну лідерну послідовність, який/яка відщеплюється від зрілого білка після ініціації експорту зростаючого білкового ланцюга через шершавий ендоплазматичний ретикулум. Звичайним спеціалістам в даній галузі техніки 60 повинно бути очевидно, що поліпептиди, секретируемие клітинами хребетних тварин, як правило, мають сигнальний пептид, злитий з М-кінцем поліпептиду, який відщеплюється від трансльованого поліпептиду з утворенням секретувальної або "зрілої" форми поліпептиду. В деяких варіантах здійснення винаходу застосовують нативний сигнальний пептид, наприклад, сигнальний пептид важкого ланцюга або легкого ланцюга імуноглобуліну або функціональне похідне зазначеної послідовності, яке зберігає здатність забезпечувати секрецію поліпептиду, функціонально зв'язаного з ним. Альтернативно до цього, можна застосовувати гетерологічний сигнальний пептид ссавців або його функціональне похідне. Наприклад, лідерну послідовність дикого типу можна заміняти на лідерну послідовність людського тканинного активатора плазміногену (ТРА) або мишачої р-глюкуронідази. Приклади амінокислотних і полінуклеотидних послідовностей секреторних сигнальних пептидів представлені в ХЕО ІЮ МО: 108-116.
ДНК, що кодує коротку білкову послідовність, яку можна застосовувати для полегшення подальшого очищення (наприклад, сгістидинову мітку), або призначену для мічення активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, можна включати всередину або на кінці полінуклеотиду, що кодує активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу (фрагмент).
Додатковим варіантом здійснення винаходу є клітина-хазяїн, яка містить один або декілька полінуклеотидів, які запропоновані у винаході. Деякими варіантами здійснення винаходу є клітина-хазяїн, яка містить один або декілька векторів, які запропоновані у винаході.
Полінуклеотиди і вектори можуть мати будь-які особливості, індивідуально або у поєднанні, зазначені в даному описі відносно полінуклеотидів і векторів відповідно. В одному з таких варіантів здійснення винаходу клітина-хазяїн містить (наприклад, трансформовану або трансфектовану) вектором, що містить полінуклеотид, який кодує активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході (або її частину). В контексті даного опису поняття "клітина-хазяїн" відноситься до любому типу клітинної системи, яку можна конструювати для одержання активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, які запропоновані у винаході, або їх фрагментів. Клітини-хазяї, придатні для реплікації і для підтримання експресії активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, добре відомі в даній галузі техніки. Такі клітини можна трансфектувати або трансдукувати відповідним чином конкретним експресійним вектором і
Зо можна вирощувати більшу кількість клітин, що містять вектор з метою внесення в ферментери для великомасштабних процесів одержання активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули в достатніх для клінічних застосувань кількостях. Прийнятними клітинами-хазяями є прокаріотичні мікроорганізми, такі як Е. сої, або різні еукаріотичні клітини, такі як клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), клітини комах або т.п. Наприклад, поліпептиди можна одержувати в бактеріях, зокрема, коли відсутня потреба в глікозилюванні.
Після експресії поліпептид можна виділяти з пасти бактеріальних клітин в розчинну фракцію і можна додатково очищувати. Окрім прокаріот, як хазяї для клонування або експресії векторів, які кодують поліпептид, можна застосовувати еукаріотичні мікроорганізми, такі як нитчасті гриби або дріжджі, включаючи штами грибів і дріжджів, шляхи глікозилювання яких були "гуманизовані", що дозволяє одержувати поліпептид з частково або повністю людською схемою глікозилювання (див. СЗегпдго55, Маї. Віоїтесп. 22, 2004, сс. 1409-1414 і | Її та інш., Маї. Віотесі. 24, 2006, сс. 210-215). Клітини-хазяї, які можна застосовувати для експресії (глікозильованих) поліпептидів, одержують також з багатоклітинних організмів (безхребетних і хребетних тварин).
Прикладами клітин безхребетних є клітини комах, а також можна застосовувати клітини рослин.
Були виявлені багаточисленні бакуловірусні штами й відповідні придатні для них як хазяї клітини комах, насамперед для трансфекції клітин бЗродорієга ігидірегда. Як хазяїв можна застосовувати також культури рослинних клітин (див., наприклад, ОЗ МоМо 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 і 6417429 (опис технології Р АМТІВОСІЕ5Б"М для одержання антитіл в трансгенних рослинах). Як хазяї можна застосовувати також клітини хребетних тварин.
Наприклад, можна застосовувати клітинні лінії ссавців, які адаптовані до росту в суспензії.
Іншими прикладами прийнятних ліній клітин-хазяїв ссавців є лінія клітин нирки мавп СМІ1, трансформована за допомогою 5М40 (СО5-7); лінія клітин нирки ембріона людини (293 або клітини лінії 293, субклоновані з метою вирощування в суспензійній культурі, Ссгапат та інш., у.
Сеп. Міго!., 36, 1977, 3. 59); клітини нирки дитинча хом'яка (ВНК); клітини Сертолі миші (ТМА4- клітини, описані, наприклад, у Маїпег, ВіоїЇ. Кергод., 23, 1980, сс. 243-251); клітини нирки мавпи (СМ1); клітини нирки африканської зеленої мартишки (МЕКО-76,); клітини карциноми шейки матки людини (НЕГА); клітини нирки собаки (МОСК); клітини печінки бичачого щура (ВКІ. ЗА); клітини легкого людини (М/138); клітини печінки людини (Нер 02); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562); клітини ТК, описані, наприклад, у Маїнег та інш., Аппаї!5 М.У. Асад. 60 збсі., 383, 1982, сс. 44-68); клітини МКС 5 ї клітини Е54. Іншими цінними лініями клітин-хазяїв ссавців є клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), включаючи апт-СНо-клітини (пацб та інш., Ргос. Маї!. Асад. Зсі. ОА, 77, 1980, з. 4216); і клітинні лінії мієломи, такі як МО, М5О і 5р2/0.
Огляд конкретних ліній клітин-хазяїв ссавців, які можна застосовувати для виробництва білка, див., наприклад, у ХУалакі і УМи, в: Меїподз» іп МоїІесшіаг Віоіоду під ред. В.К.С. Іо, вид-во Нитапа
Ргеб55, Тоїоула, МУ, т. 248, 2003, сс. 255-268. Клітини-хазяї містять культивовані клітини, наприклад, культивовані клітини ссавців, клітини дріжджів, клітини комах, клітини бактерій і клітини рослин (але не обмежуючись тільки ними), а також клітини, що знаходяться в організмі трансгенної тварини, трансгенної рослини або вирощуваної рослинної або тваринної тканини. В одному з варіантів здійснення винаходу клітина-хазяїн являє собою еукаріотичну клітину, переважно клітину ссавця, таку як клітина яєчника китайського хом'ячка (СНО), клітина нирки людського ембріона (НЕК) або лимфоїдна клітина (наприклад, клітина МО, М5О, Зраг0).
В даній галузі відомі стандартні технології для експресії чужорідних генів в цих системах.
Клітини, що експресують поліпептид, який містить або важкий, або легкий ланцюг антигензв'язувального домену, такого як антитіло, можна конструювати таким чином, щоб в них відбувалась експресія інших ланцюгів антитіла, наприклад, таким чином, щоб експресований продукт являв собою антитіло, яке має як важкий, так і легкий ланцюг.
Одним з варіантів здійснення винаходу є спосіб одержання активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка пропонується у винаході, який полягає у тому, що культивують клітину-хазяїна, яка містить полінуклеотид, який кодує активувальну Т- клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, представлену в даному описі, в умовах, придатних для експресії активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, і необов'язково виділяють активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу з клітини-хазяїна (або культурального середовища клітини-хазяїна).
Компоненти активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули генетично зливають один з іншим. Активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу можна створювати так, щоб її компоненти зливати один з іншим безпосередньо або непрямо через лінкерну послідовність. Склад і довжину лінкера можна визначати за допомогою методів, добре відомих в даній галузі, і можна оцінювати ефективність. Приклади лінкерних послідовностей, розташованих між різними компонентами активувальної Т-клітини
Зо біспецифічної антигензв'язувальної молекули, представлені в наведених в даному описі послідовностях. Можна містити також додаткові послідовності для вбудовування сайту розщеплення, якщо потрібно розділення індивідуальних компонентів злиття, наприклад, послідовність, розпізнавану ендопептидазою.
В деяких варіантах здійснення винаходу один або декілька антигензв'язувальних фрагментів активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул містить(ять) щонайменше одну варіабельну ділянку антитіла, яка має здатність зв'язуватися з антигенною детермінантою. Варіабельні ділянки можуть утворювати частину антитіл, які зустрічаються в природних умовах або не зустрічаються в природних умовах або їх фрагментів або можуть бути виведені з них. Методи одержання поліклональних антитіл і моноклональних антитіл добре відомі в даній галузі техніки (див., наприклад, Нагіому і І апе, "Апіїродіє5: а І арогаїогу Мапиаї", вид-во СоїЇа Зргіпд Нагброг І арогаїогу, 1988). Антитіла, які не зустрічаються в природних умовах можна створювати за допомогою твердофазного пептидного синтезу, можна одержувати за допомогою методів рекомбінації (наприклад, описаних в 5 Мо 4186567) або можна одержувати, наприклад, шляхом скринінгу комбінаторних бібліотек, що містять варіабельні ділянки важких ланцюгів і варіабельні ділянки легких ланцюгів (див., наприклад, ОБ Мо 5969108 на ім'я
МеСанйепу).
Будь-які види антитіл, фрагментів антитіл, антигензв'язувальних доменів або варіабельних ділянок тваринного походження можна застосовувати в активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекулах, які запропоновані у винаході. Прикладами антитіл, фрагментів антитіл, антигензв'язувальних доменів або варіабельних ділянок, які можна застосовувати згідно з даним винаходом, є (але, не обмежуючись тільки ними) конструкції, одержані з організму мишей, приматів або людини. Якщо активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула приазначена для застосування на людині, то можна застосовувати химерну форму антитіла, в якій константні ділянки антитіла одержують з людського антитіла. Гуманізовану або повністю людську форму антитіла можна одержувати також за допомогою методів, добре відомих в даній галузі (див., наприклад, ШО Мо 5565332 на ім'я УмМіпіег). Для здійснення гуманізації можна застосовувати різні методи, такі як (але, не обмежуючись тільки ними) (а) трансплантація нелюдських (наприклад, з антитіла-донора) СОВ в людський (наприклад, антитіло-реципієнт) каркасна ділянка і константні ділянки, що бо зберігають або що не зберігають, які мають вирішальне значення залишки каркасної ділянки
(наприклад, залишки, важливі для зберігання гарної антигензв'язувальної афінності або функцій антитіла), (б) трансплантація тільки нелюдських визначальних специфічність ділянок (ЗОК або а-СОК; залишки мають вирішальне значення для взаємодії антитіло-антиген) в людські каркасні і константні ділянки, або (в) трансплантація повних нелюдських варіабельних доменів, але їх "маскування" нагадуваним людський сегментом шляхом заміни поверхневих залишків. Огляд гуманізованих антитіл і методів їх одержання див., наприклад, у АІтадго і Егап5зоп, Егопі Віозсі 13, 12008, сс. 1619-1633, і вони описані також, наприклад, у Кіесптапп та інш., Маїиге 332, 1988, сс. 323-329; Оцееп та інш., Ргос Маї! Асай Зсі ОА 86, 1989, сс. 10029-10033; 05 МоМо 5821337, 7527791, 6982321 і 7087409; допез та інш., Майиге 321, 1986, сб. 522-525; Моїтізоп та інш., Ргос маї! Асай 5зсі 81, 1984, сс. 6851-6855; Моїтізоп і ОЇ, Адм Іттипої 44, 1988, сс. 65-92; Мегппоеуеп та інш., Зсіепсе 239, 1988, сс. 1534-1536; Радіап, Моїес Іттип 313), 1994, сс.169-217; КазПптігі та інш., Меїйподз 36, 2005, сс. 25-34) (опис трансплантації ЗОВ. (а-СОВ)); Радіап, Мої Іттипо! 28, 1991, сс. 489-498 (опис "повторного покриття"); БаІгАсдица та інш., Меїйодз 36, 2005, сс. 43-60 (опис "перестановки ЕК") ії О5Бошгп та інш., Меїпод5 36, 2005, сс. 61-68, і КіткКа та інш., Вг у
Сапсег 83, 2000, сс. 252-260 (опис підходу на основі "цілеспрямованої селекції" для перестановки ЕК). Людські антитіла і людські варіабельні ділянки можна одержувати за допомогою різних методик, відомих в даній ділянці. Людські антитіла описані в цілому, у мап ріЇк і мап де У/пкКеї, Си Оріп Рпаптасої 5, 2001, сс. 368-374 і Ії опрегу, Сит Оріп Іттипої 20, 2008, сс. 450-459. Людські варіабельні ділянки можуть утворювати частину людських моноклональних антитіл або можуть бути одержані з них за допомогою методу гібридом (див., наприклад,
Мопосіопаї! Апііроду Ргодисіоп Тесппіднез апа Арріїсайоп5, вид-во Магсеї! ОеккКег, Іпс., Мем/ МоОгК, 1987, сс. 51-63). Людські антитіла і людські варіабельні діллнки можна одержувати також шляхом введення імуногена трансгенній тварині, яка модифікована таким чином, що може продукувати інтактні людські антитіла або інтактні антитіла з людськими варіабельними областями у відповідь на контрольне зараження антигеном (див., наприклад, І опрего, Маї
Віоїесп 23, 2005, сс. 1117-1125). Людські антитіла і людські варіабельні ділянки можна створювати також шляхом виділення послідовностей варіабельних ділянок ЕРу-клону, відібраних з людських фагових дисплейних бібліотек (див., наприклад, Ноодепроот та інш. в: Меїйоа5 іп
Моїесцшіаг Віоіоду, під ред. О'Вгіеп та інш., вид-во Нитап Ргез5, Тоїоуа, МУ, 178, 2001, сс. 1-37); і
МесСапйепу та інш., Майиге 348, 552-554; Сіаскзоп та інш., Маїиге 352, 1991, сс. 624-628). Фаг, як правило, експонує фрагменти антитіл або у вигляді одноланцюгових Еу- (5сЕм)-фрагментів, або у вигляді Гар-фрагментів.
В деяких варіантах здійснення винаходу антигензв'язувальні фрагменти, придатні для застосування згідно з даним винаходом, створюють так, щоб вони мали підвищену афінність зв'язування, наприклад, за допомогою методів, описаних в публікації заявки на патент США Мо 2004/0132066, повний зміст якої включений в даний опис як посилання. Здатність активувальної
Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка пропонується у винаході, зв'язуватися зі специфічною антигенною детермінантою можна оцінювати кількісно або за допомогою твердофазного ферментного аналізу (ЕГІЗА), або іншими методиками, відомими спеціалісту в даній галузі техніки, наприклад, за допомогою метода резонансу поверхневого плазмону (проводячи аналіз із застосуванням системи ВІАСОКЕ Т100) (І ЩШебіай та інш., СіІусо у 17, 2000, сс. 323-329), і традиційних аналізів зв'язування (НееїіІеу, Епдосг Кез 28, 2002, сс. 217- 229). Аналізи в умовах конкуренції можна застосовувати для ідентификації антитіла, фрагмента антитіла, антигензв'язувального домену або варіабельного домену, що конкурує з референс- антитілом за зв'язування з конкретним антигеном, наприклад, антитіла, яке конкурує з антитілом
МУ за зв'язування з СОЗ3. В деяких варіантах здійснення винаходу зазначене конкурувальне антитіло зв'язується з тим же епітопом (наприклад, лінійним або конформаційним епітопом), з яким зв'язується референс-антитіло. Докладні наведені як приклади методи картування епітопу, з яким зв'язується антитіло, представлені у Моїті5, "Ерйоре Марріпд Ргоїосої!5", в: Меїпоаз5 іп
МоїІесшіаг Віоіоду, вид-во Нитапа Рге55, Тоїожа, МУ, т. 66, 1996. При здійсненні наведеного як прикладу аналізу в умовах конкуренції іммобілізований антиген (наприклад, СОЗ) інкубують в розчині, що містить перше мічене антитіло, яке зв'язується з антигеном (наприклад, антитіло
М9), і вторим неміченим антитілом, яке підлягає тестуванню у відношенні його здатності конкурувати з першим антитілом за зв'язування з антигеном. Друге антитіло може бути присутніми в супернатанті гібридоми. Як контроль іммобілізований антиген інкубують в розчині, що містить перше мічене антитіло, але яке не містить друге немічене антитіло. Після інкубації в умовах, які забезпечують зв'язування першого антитіла з антигеном, надлишок незв'язаного антитіла видаляють і оцінюють кількість мітки, асоційованої з іммобілізованим антигеном. Якщо кількість мітки, асоційованої з іммобілізованим антигеном, суттєво знижено в тестувальному бо зразку у порівнянні з контрольним зразком, то це свідчить про те, що друге антитіло конкурує з першим антитілом за зв'язування з антигеном (див. Нагіом/ і Гапе. Апііродіе5: А І арогафгу
Мапиаї, вид-во Соїа Зргіпд Нагбог І абогаггу, Соїд 5ргіпд Нагбог, МУ, гл. 14, 1988).
Біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т-клітини, одержані за допомогою представлених в даному описі методів, можна очищувати з застосуванням відомих в даній ділянці методик, таких як рідинна хроматографія високого розділення, іонообмінна хроматографія, гель-електрофорез, афінна хроматографія, гель-фільтрація й т. п. Фактичні умови, застосовні для очищення конкретного білка, залежать, зокрема, від таких факторів, як чистий заряд, гідрофобність, гідрофільність тощо, і вони повинні бути очевидними спеціалісту в даній галузі техніки. Для очищення антитіла за допомогою афінної хроматографії можна застосовувати ліганд, рецептор або антиген, з яким зв'язується активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула. Наприклад, для очищення за допомогою афінної хроматографії активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, які запропоновані у винаході, можна застосовувати матрикс з білком А або білком б. Наприклад, послідовне застосування афінної хроматографії на білку А або с і гель-фільтрації можна застосовувати для виділення активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули практично згідно з методу, описаному в розділі "Приклади". Чистоту активувальної Т- клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули можна визначати за допомогою будь- якого з широкої різноманітності добре відомих аналітичних методів, включаючи гель- електрофорез, рідинну хроматографію високого тиску тощо. Наприклад, установлено, що злиті білки, які містять важки ланцюги, які експресували згідно з описаними в розділі "Приклади" методами, є інтактними і правильно зібраними, що продемонстровано за допомогою ДСН-ПААГ у відновлювальних умовах (див., наприклад, фіг. 4). Розділяли три полоси, відповідні приблизно
Мг 25000, Мг 50000 і Мг 75000, які відповідали передбаченим молекулярним масам легкого ланцюга, важкого ланцюга і злитому білку важкий ланцюг/легкий ланцюг активувальної Т- клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули.
Аналізи
Активувальні Т-клітини біспецифічні антигензв'язувальні молекули, представлені в даному описі, можна ідентифікувати, піддавати скринінгу або характеризувати їх фізичні/хімічні властивості і/або види біологічної активності за допомогою різним аналізів, відомих в даній ділянці
Аналізи афінності
Афінність активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули до Ес- рецептору або антигену-мішені можна визначати за допомогою методів, викладених в розділі "Приклади", за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК), застосовуючи стандартну інструментальну базу, наприклад, пристрій ВіАсоге (фірма СЕ Неайсаге), і рецептори або білки-мішені, які можна одержувати за допомогою рекомбінантної експресії.
Альтернативно до цього, зв'язування активувальних // Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул з різними рецепторами або антигенами-мішенями можна оцінювати з застосуванням клітинних ліній, які експресують конкретний рецептор або антиген- мішень, наприклад, за допомогою проточної цитометрії (ЕАС5). Конкретний ілюстративний і наведений як приклад варіант вимірювання афінності зв'язування описаний нижче в розділі "Приклади".
Згідно з одному з варіантів здійснення винаходу величину Ко вимірювали методом поверхневого плазмонного резонансу за допомогою пристрою ВІАСОКЕФ Т100 (фірма СЕ
Неансаге) при 25 70.
Для аналізу взаємодії між Ес-ділянкою і Ес-рецепторами мічений за допомогою Ніб рекомбінантний Ес-рецептор "захоплювали" за допомогою антитіла до Репіа-Нів (фірма Оіадеп), іммобілізованого на СМб5б-чипах, і біспецифічні конструкції застосовували як аналізовані субстанції. В цілому, метод полягав у наступному: біосенсорні чипи з карбоксиметилованого декстрану (СМ5, фірма СЕ Неайвсаге) активували за допомогою гідрохлориду М-етил-М'-(3- диметиламінопропил)ікарбодиіміду (ЕЮОС) і М-гідроксисукциніміду (МН) згідно з інструкціями постачальника. Антитіло до Репіа-Ні5 розводили 10 мМ ацетатом натрію, рН 5,0 до концентрації 40 мкг/мл перед ін'єкцією зі швидкістю потоку 5 мкл/хв для досягнення приблизно 6500 одиниць відповіді (КО) зв'язаного білка. Після ін'єкції ліганду ін'єкєували 1 М етаноламін для блокади непрореагованих груп. Потім здійснювали "захоплення" Ес-рецептора протягом 60 с в концентрації 4 або 10 нМ. Для кінетичних вимірювань ін'єкували чотириразові серійні розведення біспецифічної конструкції (діапазон від 500 до 4000 нМ) в буфере НВ5-ЕР-- (фірма
СЕ Неайсаге, 10 мМ НЕРЕЗ5, 150 мМ Масі, З мМ ЕДТК, 0,05 95 сурфактанту Р20, рН 7,4) при 25 "С зі швидкістю потоку 30 мкл/хв протягом 120 с.
Для визначення афінності до антигену-мішені біспецифічні конструкції "захоплювали" за допомогою специфічного у відношенні людського Бар антитіла (фірма СЕ Неайсаге), яке іммобілізували на поверхні активованого сенсорного СМ5-чипу згідно з методом, описаним для антитіла до Репіа-Ніх. Кінцева кількість зшитого білка складала приблизно 12000 КИ.
Здійснювали "захоплення" біспецифічних конструкцій протягом 90 з в концентрації 300 нм.
Антигени-мішені пропускали через проточні комірки протягом 180 з в діапазоні концентрацій від 250 до 1000 нМ зі швидкістю потоку 30 мкл/хв. Моніторинг дисоціації здійснювали протягом 180 3.
Різницю всіх показників заломлення коректували шляхом віднімання відповіді, одержаної в проточній референос-комірці. Відповідь на стаціонарної стадії застосовували для визначення константи дисоціації (Ко) за допомогою апроксимації нелінійної кривої ізотерми зв'язування
Ленгмюра. Швидкість реакції асоціації (Коп) і реакції дисоціації (Кою розраховували із застосуванням простої моделі зв'язування Ленгмюра 1:1 (програма ВІАСОКЕЄ Т100 Емаїчайкоп зоПмаге, версія 1.1.1) шляхом одночасної апроксимації сенсограм асоціації і дисоціації.
Константу рівноваги реакції дисоціації (Ко) розраховували як співвідношення Кон/Коп (див., наприклад, Спеп та інш., У) Мої Віої 293, 1999, сс. 865-881).
Аналізи активності
Біологічну активність активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, які запропоновані у винаході, можна визначати за допомогою різних аналізів, описаних в розділі "Приклади". Види біологічної активності можуть містити, наприклад, індукцію проліферації Т- клітин, індукцію передачі сигналу в Т-клітинах, індукцію експресії маркерів активації в Т-клітинах, індукцію секреції цитокінів Т-клітинами, індукцію лізису клітин-мішеней, таких як пухлинні клітини, й індукцію регресу пухлини і/або підвищення виживаності.
Композиції, препаративні форми і шляхи введення
Наступним об'єктом винаходу є фармацевтичні композиції, які містять будь-яку з активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, представлених в даному описі, наприклад, призначені для застосування у будь-якому із зазначених нижче терапевтичних способів. В одному з варіантів здійснення винаходу фармацевтична композиція містить будь-яку з активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, представлених в
Зо даному описі, й фармацевтично прийнятний носій. В іншому варіанті здійснення винаходу фармацевтична композиція містить будь-яку з активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, представлених в даному описі, і щонайменше один додатковий терапевтичний засіб, наприклад, зазначений нижче.
Крім того, представлений спосіб одержання активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка пропонується у винаході, в формі, придатної для введення іп мімо, який полягає у тому, що (а) одержують активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході, і (б) поєднують в препаративній формі активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу щонайменше з одним фармацевтично прийнятним носієм, де приготовлений препарат активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули придатний для застосування іп мімо.
Фармацевтичні композиції, запропоновані в даному винаході, містять в терапевтично ефективній кількості одну або декілька активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, яка(ї) розчинена(ї) або диспергирована() у фармацевтично прийнятному носії. Поняття "фармацевтично або фармакологічно прийнятний" відноситься до молекулярних субстанцій та композицій, які, в цілому, є нетоксичними для реципієнтів у застосовних дозах і концентраціях, тобто не викликають шкідливі, алергічні або інші небажані реакції при введенні при необхідності тварині, такій, наприклад, як людина. Готування фармацевтичної композиції, яка містить щонайменше одну активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу і необов'язково додаткову діючу речовину, повинно бути очевидно спеціалістам в даній галузі техніки в світлі даного опису, наприклад, з довідника
Ветіпдюп'5 РНнаптасеціїйса! бсієпсев, 18-е вид., вид-во Маск Ргіпііпд Сотрапу, 1990, включеного в даний опис як посилання. Крім того, очевидно, що препарати, призначені для введення тварині (наприклад, людині), повинні задовольняти вимоги стандартів стерильності, пірогенності й загальної безпеки й чистоти, розроблених відділом біологічних стандартів ЕРА (Управління з контролю за харчовими продуктами й лікарськими засобами) або відповідним уповноваженим органом інших країн. Переважними композиціями є ліофилізовані препаративні форми або водні розчини. В контексті даного опису "фармацевтично прийнятний носій" охоплює будь-які й всі розчинники, буфери, дисперсійні середовища, покриття, поверхнево-активні речовини, антиоксиданти, консерванти (наприклад, антибактеріальні агенти, протигрибкові агенти), агенти 60 для надання ізотонічності, агенти, що уповільнюють абсорбцію, солі, білки, лікарські засоби,
стабілізатори лікарських засобів, полімери, гелі, зв'язувальні речовини, ексципієнти, розпушувачі, замащувачі, підсолоджувальні речовини, коригенти, барвники і подібні матеріали і їх комбінації, які повинні бути відомими звичайному спеціалісту в даній галузі техніки (див., наприклад, Кетіпдіоп'є Рпагтасецшііса! Зсіепсев5, 18-е вид., вид-во Маск Ргіпіпд Сотрапу, 1990, сс. 1289-1329, включений в даний опис як посилання). В терапевтичних або фармацевтичних композиціях можна застосовувати будь-який загальноприйнятний носій, якщо тільки він є сумісним з діючою речовиною.
Композиція може містити різні типи носіїв залежно від того, чи вводять її в твердій, рідкій або аерозольній формі, і від того, чи повинна вона бути стерильною, як в випадку використання таких шляхів введений, як ін'єкція. Біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т- клітини, запропоновані в даному винаході (і будь-який додатковий терапевтичний засіб), можна вводити внутрішньовенно, внутрішньошкірно, внутрішньоартеріально, внутрішньочеревно, всередину ушкодження, всередину черепа, всередину суглоба, всередину передміхурової залози, всередину селезінки, внутрішньоренально, внутрішньоплеврально, внутрішньотрахеально, внутрішньоназально, всередину склоподібного тіла, внутрішньовагінально, внутрішньоректально, всередину пухлини, внутрішньом'язово, внутрішньочеревно, підшкірно, підкон'юнктивально, інтравезикулярно, в слизову оболонку, інтраперикардіально, всередину пуповини, інтраокулярно, перорально, топікально, місцево, шляхом інгаляції (наприклад, аерозольної інгаляції), ін'єкції, інфузії, безперервної інфузії, локалізованої перфузії, що омиває безпосередньо клітини-мішені, через катетер, за допомогою лаважу, у вигляді кремів, в ліпідних композиціях (наприклад, ліпосомах), або за допомогою будь-якого іншого методу або будь-якої комбінації вищезазначених шляхів, відомих звичайному спеціалісту в даній галузі техніки (див., наприклад, Кетіпдіоп'є Рпаппасешіса! Зсіепсе5, 18-е вид., вид-во Маск Ргіпііпд Сотрапу, 1990, включений в даний опис як посилання). Для введення молекул поліпептидів, таких як біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т- клітини, запропоновані у винаході, найбільш часто застосовують парентеральне введення, зокрема, внутрішньовенну ін'єкцію.
Парентеральні композиції містять композиції, створені для введення шляхом ін'єкції, наприклад, підшкірної, внутрішньошкірної всередину ушкодження, внутрішньовенної,
Зо внутрішньоартеріальної, внутрішньом'язової, підоболонкової або внутрішньочеревної ін'єкції.
Для ін'єкції біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т-клітини, запропоновані у винаході, можна вводити в препаративні форми у вигляді водних розчинів, переважно в фізіологічно сумісних буферах, таких як розчин Хенкса, розчин Рінгера або фізіологічний соляний буфер. Розчин може містити призначені для одержання препаративної форми агенти, такі як суспендувальні, стабілізувальні і/або диспергувальні агенти. Альтернативно до цього, біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т-клітини можуть знаходитися в порошкоподібній формі, призначеній для відновлення перед застосуванням прийнятним наповнювачем, наприклад, стерильною водою, не що містить пірогенів. Стерильні розчини для ін'єкцій готують шляхом введення активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, які запропоновані у винаході, в необхідній кількості у відповідний розчинник при необхідності в поєднанні з різними іншими інгредієнтами, наведеними нижче. Стерильність можна легко забезпечити, наприклад, шляхом фільтрації через стерильні фільтрувальні мембрани. Як правило, дисперсії одержують шляхом введення різних стерилізованих діючих речовин в стерильний наповнювач, який містить основне дисперсійне середовище і/або інші інгредієнти. У випадку стерильних порошків для одержання стерильних розчинів для ін'єкцій, суспензій або емульсій переважними методами одержання є вакуумне сушіння або сушіння виморожуванням, які дозволяють одержувати порошок діючої речовини в поєднанні з будь-яким додатковим необхідним інгредієнтом з попередньо стерилізованою фільтрацією рідкого середовищі. При необхідності рідке середовище перед здійсненням ін'єкції повинна бути відповідним чином забуференою і рідкому розріджувачу спочатку надають ізотонічність за допомогою достатньої кількості соляного розчину або глюкози. Композиція повинні бути стабільною в умовах приготування і зберігання і захищена від забруднювальної дії мікроорганізмів, таких як бактерії та гриби. Прийнято підтримувати забруднені ендотоксинами на мінімальному безпечному рівні, наприклад, менше 0,5 нг/мг білка. Придатні фармацевтично прийнятні носії містять (але, не обмежуючись тільки ними): буфери, такі як фосфатний, цитратний і буфери на основі інших органічних кислот; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту і метионін; консерванти (такі як октадецилдиметилбензиламонійхлорид; гексаметонійхлорид; бензалконійхлорид; бензетонійхлорид; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехол, резорцинол; циклогексанол; 3- бо пентанол і мета-крезол); низькомолекулярні (які містять менше приблизно 10 залишків)
поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофильні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінин або лізин; моносахариди, дисахариди й інші вуглеводи, включаючи глюкозу, манозу або декстрини; хелатувальні агенти, такі як ЕДТК; цукри, такі як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; солеутворювальні протиїони, такі як натрій; комплекси з металами (наприклад, комплекси 2п-білок); і/або неіоногенні поверхнево-активні речовини, такі як поліетиленгліколь (ПЕГ). Водні суспензії для ін'єкцій можуть містити сполуки, які підвищують в'язкість суспензії, такі як натрієва сіль карбоксиметилцелюлози, сорбіт, декстран або т.п. Необов'язково суспензія може містити також стабілізатори або агенти, які підвищують розчинність сполук, дозволяє одержувати висококонцентровані розчини. Крім того, суспензії діючих речовин можна одержувати у вигляді відповідних олійних призначених для ін'єкції суспензій. Прийнятні ліпофильні розчинники або наповнювачі містять жирні нелеткі олії, такі як кунжутна олія, або синтетичні ефіри жирних кислот, такі як етилолеати або тригліцериди, або ліпосоми.
Діючі речовини можна заключать в мікрокапсули, наприклад, одержані за допомогою методів коацервації або міжфазної полімеризації, наприклад в гідроксипропілметилцелюлозні або желатинові мікрокапсули і полі(метилметакрилатні) мікрокапсули відповідно, в колоїдні системи введення лікарського засобу (наприклад, в ліпосоми, альбуминові мікросфери, мікроемульсії, наночастинки і нанокапсули) або в макроемульсії. Такі методи описані в
Кетіпдіоп'є Рпагптасешіса! Зсіепсе5, під ред. А. О50І, 1980. Можна готувати препарати з уповільненим вивільненням. Прийнятними прикладами препаратів з уповільненим вивільненням є напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів, що містять поліпептид, такі матриці представляють собою вироби певної форми, наприклад, плівки або мікрокапсули. В конкретному варіанті здійснення винаходу для досягнення пролонгованої абсорбції композиції для ін'єкцій можна застосовувати в композиції агенти, що уповільнюють абсорбцію, такі, наприклад, як моностеарат алюмінію, желатин або їх комбінації.
Окрім описаних вище композицій, біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують
Т-клітини можна готувати також у вигляді препарату в формі депо. Зазначені препаративні форми тривалої дії можна застосовувати шляхом імплантації (наприклад, підшкірної або внутрішньом'язової) або внутрішньом'язової ін'єкції Так, наприклад, біспецифічні
Зо антигензв'язувальні молекули, які активують Т-клітини можна містити в препаративні форми в поєднанні з прийнятними полімерними або гідрофобними матеріалами (наприклад, у вигляді емульсії в прийнятній олії) або іонообмінними смолами, або у вигляді помірно розчинних похідних, наприклад, помірно розчинної солі.
Фармацевтичні композиції, які містять біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т-клітини, запропоновані у винаході, можна готувати за допомогою стандартних процесів змішування, розчинення, емульгування, капсулювання, захоплення або ліофілізації.
Фармацевтичні композиції можна містити в препаративні форми за допомогою стандартного метода із застосуванням одного або декількох фізіологічно прийнятних носіїв, розріджувачів, ексципієнтів або допоміжних речовин, які полегшують обробку білків, з одержанням препаратів, які можна застосовувати в фармацевтичних цілях. Відповідна форма залежить від вибраного шляху введення.
Біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т-клітини можна містити в композиції у вигляді вільної кислоти або вільної основи, в нейтральній формі або в формі солі.
Фармацевтично прийнятні солі представляють собою солі, які практично зберігають біологічну активність вільної кислоти або вільної основи. Вони містять кислотно-адитивні солі, наприклад, солі, утворені з вільними аміногрупами білкової композиції, або утворені з неорганічними кислотами, такими, наприклад, як соляна або фосфорна кислота, або такими органічними кислотами, як оцтова, щавлева, винна або мигдальна кислота. Солі, утворені з вільною карбоксильною групою, можна одержувати також з неорганічних оснований, таких, наприклад, як гідроксиди натрію, калію, амонію, кальцію або заліза; або таких органічних оснований як ізопропіламін, триметиламін, гістидин або прокаїн. Фармацевтичні солі мають тенденцію до більш високої розчинності у водних і інших протонних розчинниках у порівнянні з відповідними формами у вигляді вільних основ.
Способи і композиції для терапевтичного застосування
Будь-яку з активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, представлених в даному описі, можна застосовувати в терапевтичних методах. Біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т-клітини, запропоновані у винаході, можна застосовувати як імунотерапевтичні агенти, наприклад, при лікуванні різних видів раку.
Для застосування в терапевтичних методах біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які бо активують Т-клітини, запропоновані у винаході, можна містити в состав препаративних форм,
дозувати і вводити згідно з належною клінічною практикою. Фактори, які розглядають в цьому контексті, містять конкретне порушення, яке підлягає лікуванню, конкретного ссавця, яке підлягає лікуванню, клінічний стан індивідуального пацієнта, причину захворювання, область введення агента, метод введення, схему введення і інші фактори, відомі медикам, що практикують.
Одним з об'єктів винаходу є біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т- клітини, запропоновані у винаході, призначені для застосування як лікарського засобу.
Наступними об'єктами винаходу є біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т- клітини, запропоновані у винаході, призначені для застосування при лікуванні захворювання.
Неякими варіантами здійснення винаходу є біспецифічні антигензв'язувальні молекули, які активують Т-клітини, запропоновані у винаході, призначені для застосування в способі лікування. Одним з варіантів здійснення винаходу є активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, представлена в даному описі, призначена для застосування при лікуванні захворювання в індивідуума, який цього потребує. Неякими варіантами здійснення винаходу є активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, призначена для застосування в способі лікування індивідуума, який має захворювання, який полягає в тому, що вводять індивідууму в терапевтично ефективній кількості активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу. В деяких варіантах здійснення винаходу захворювання, яке підлягає лікуванню, являє собою проліферативне порушення. В конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання являє собою рак. В деяких варіантах здійснення винаходу спосіб полягає також в тому, що вводять індивідууму в терапевтично ефективній кількості щонайменше одно додатковий терапевтичний засіб, наприклад, протираковий засіб, якщо захворювання, яке підлягає лікуванню, являє собою рак. Додатковими варіантами здійснення винаходу є активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, представлена в даному описі, призначена для застосування з метою індукції лізису клітини- мішені, зокрема пухлинної клітини. Неякими варіантами здійснення винаходу є активувальна Т- клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, призначена для застосування в способі індукції лізису клітини-мішені, зокрема пухлинної клітини, в індивідуума, який полягає в тому, що вводять індивідууму в ефективній кількості активувальну Т-клітини біспецифічну
Зо антигензв'язувальну молекулу для індукції лізису клітини-мішені. "Індивідуум" в контексті будь- якого з зазначених вище варіантів здійснення винаходу являє собою ссавця, переважно людини.
Наступним об'єктом винаходу є застосування активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка пропонується у винаході, для вироблення або приготування лікарського засобу, який призначений для лікування захворювання в індивідуума, який цього потребує. В одному з варіантів здійснення винаходу лікарський засіб призначений для застосування в способі лікування захворювання, який полягає в тому, що вводять індивідууму, який має захворювання, в терапевтично ефективній кількості лікарський засіб. В деяких варіантах здійснення винаходу захворювання, яке підлягає лікуванню, являє собою проліферативне порушення. В конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання являє собою рак. В одному із зазначених варіантів здійснення винаходу спосіб полягає також в тому, що вводять індивідууму в терапевтично ефективній кількості щонайменше один додатковий терапевтичний засіб, наприклад, протираковий засіб, якщо захворювання, яке підлягає лікуванню, являє собою рак. В іншому варіанті здійснення винаходу лікарський засіб призначений для індукції лізису клітини-мішені, зокрема пухлинної клітини. В наступному варіанті здійснення винаходу лікарський засіб призначений для застосування в способі індукції лізису клітини-мішені, зокрема пухлинної клітини, в індивідуума, який полягає в тому, що вводять індивідууму в ефективній кількості лікарський засіб для індукції лізису клітини-мішені. "Індивідуум" в контексті будь-якого з зазначених вище варіантів здійснення винаходу являє собою ссавця, переважно людину.
Наступним об'єктом винаходу є спосіб лікування захворювання в індивідуума. В одному з варіантів здійснення винаходу спосіб полягає в тому, що вводять індивідууму, що має зазначене захворювання, в терапевтично ефективній кількості активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначеному індивідууму вводять композицію, яка містить активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході, у фармацевтично прийнятній формі. В деяких варіантах здійснення винаходу захворювання, яке підлягає лікуванню, являє собою проліферативне порушення. В переважному варіанті здійснення винаходу захворювання являє собою рак. В деяких варіантах здійснення винаходу спосіб бо полягає також в тому, що вводять індивідууму в терапевтично ефективній кількості щонайменше один додатковий терапевтичний засіб, наприклад, протираковий засіб, якщо захворювання, яке підлягає лікуванню, являє собою рак. "Індивідуум" в контексті будь-якого з зазначених вище варіантів здійснення винаходу може представляти собою ссавця, переважно людини.
Наступним об'єктом винаходу є спосіб індукції лізису клітини-мішені, зокрема, пухлинної клітини. В одному з варіантів здійснення винаходу спосіб полягає в тому, що приводять у контакт клітину-«мішень з активувальною Т-клітини біспецифічною антигензв'язувальною молекулою, яка пропонується у винаході, в присутності Т-клітини, зокрема, цитотоксичної Т- клітини. Іншим об'єктом винаходу є спосіб індукції лізису клітини-мішені, зокрема, пухлинної клітини. В одному із зазначених варіантів здійснення винаходу спосіб полягає в тому, що вводять індивідууму в ефективній кількості активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу для індукції лізису клітини-мішені. В одному з варіантів здійснення винаходу "індивідуум" являє собою людини.
В деяких варіантах здійснення винаходу захворювання, яке підлягає лікуванню, являє собою проліферативне порушення, переважно рак. Прикладами раку є (але, не обмежуючись тільки ними) рак сечового міхура, рак головного мозку, рак голови і шиї, рак підшлункової залози, рак легені, рак молочної залози, рак яєчника, рак матки, рак шейки матки, рак ендометрію, рак стравоходу, рак ободової кишки, колоректальний рак, ректальний рак, рак шлунку, рак передміхурової залози, рак крові, рак шкіри, плоскоклітинну карцинома, рак кості й рак нирки.
Інші порушення клітинної проліферації, які можна лікувати із застосуванням активувальної Т- клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, що пропонується в даному винаході, містять (але, не обмежуючись тільки ними) неоплазми, локалізовані в: животі, кості, молочній залозі, травній системі, печінці, підшлунковій залозі, очеревині, ендокринних залозах (надниркова, паращитоподібна, гипофіз, яєчка, яєчник, тимус, щитоподібна), ока, голові й шиї, нервовій системі (центральній і периферійній), лімфатичній системі, тазовій області, шкірі, м'якій тканині, селезінці, грудному відділі і сечостатевій системі. Також під об'єм винаходу підпадають передракові стани або ушкодження і метастази раку. В деяких варіантах здійснення винаходу рак вибирають з групи, що містить нирковоклітинний рак, рак шкіри, рак легені, колоректальний рак, рак молочної залози, рак головного мозку, рак голови і шиї. Спеціалісту в даній галузі
Зо техніки повинно бути очевидним, що у багатьох випадках активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула не може забезпечити зцілення, а може тільки мати частковий сприятливий вплив. В деяких варіантах здійснення винаходу фізіологічні зміни, що характеризуються деякою сприятливою дією, розглядають також як терапевтично цінні. Таким чином, в деяких варіантах здійснення винаходу кількість активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка забезпечує фізіологічну зміну, розглядають як "ефективну кількість" або "терапевтично ефективну кількість". Суб'єкт, пацієнт або індивідуум, який потребує лікування, являє собою, як правило, ссавця, більше конкретно людини.
В деяких варіантах здійснення винаходу активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході, вводять в ефективній кількості в клітину. В інших варіантах здійснення винаходу активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході, вводять в терапевтично ефективній кількості індивідууму для лікування хвороби.
Для попередження або лікування захворювання відповідна доза активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка пропонується у винаході (при її застосуванні індивідуально або в поєднанні з одним або декількома іншими додатковими терапевтичними засобами), повинна залежати від типу захворювання, який підлягає лікуванню, шляхи введення, ваги тіла пацієнта, типу активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, важкості й перебігу захворювання, від того, чи вводять активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу в превентивних або терапевтичних цілях, попередніх або здійснюваних одночасно терапевтичних утручань, історії хвороби пацієнта і відповіді на активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу і приписання доктора, що лікує. Спеціаліст- практик, відповідальний за введення, у будь-якому випадку, повинний визначати концентрацію діючоїїих) речовин в композиції і відповідну(и) дозу(и) для індивідуального пацієнта. Різні схеми введення доз містять (але, не обмежуючись тільки ними) однократне введення або декілька введень в різні моменти часу, болюсне введення і пульсувальну інфузію.
Активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу можна вводити пацієнту у вигляді однієї обробки або серій обробок. Залежно від типу і важкості захворювання можлива початкова доза активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули для 60 введення пацієнту, наприклад, з застосуванням одного або декількох індивідуальних введений або за допомогою безперервної інфузії, може складати приблизно від 1 до 15 мг/кг (наприклад, 0,1-10 мг/кг). Типова добова доза може складати від приблизно 1 до 100 мг/кг або більше залежно від зазначених вище факторів. Для повторних введень протягом декількох днів або більш тривалого періоду залежно від стану лікування, як правило, лікування повинно тривати до досягнення потрібного пригнічення наявних симптомів захворювання. Як приклад, доза активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули може складати від приблизно 0,005 до приблизно 10 мг/кг. В іншому прикладе (але, не обмежуючись тільки зазначеним) доза на одне введення може складати від приблизно 1, приблизно 5, приблизно 10, приблизно 50, приблизно 100, приблизно 200, приблизно 350, приблизно 500 мкг/кг ваги тіла, приблизно 1, приблизно 5, приблизно 10, приблизно 50, приблизно 100, приблизно 200, приблизно 350, приблизно 500 до приблизно 1000 мг/кг ваги тіла або більше, і знаходитися у будь-якому зазначеному діапазоні. Як прикладів (але, не обмежуючись тільки ними) зазначеного діапазону значений, можна вводити від приблизно 5 до приблизно 100 мг/кг ваги тіла, від приблизно 5 мкг/кг ваги тіла до приблизно 500 мг/кг ваги тіла тощо з урахуванням зазначених вище рівнів доз. Так, пацієнту можна вводити одну або декілька доз, що складають приблизно 0,5, 2,0, 5,0 або 10 мг/кг (або будь-яку їх комбінацію). Зазначені дози можна вводити з перервами, наприклад, кожного тижня або кожні три тижні (наприклад, таким чином, щоб пацієнт отримував від приблизно двох до приблизно двадцяти або, наприклад, приблизно шість доз активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули). Можна вводити початкову більш високу ударну дозу, після якої застосовувати одну або декілька більш низьких доз. Однак можна застосовувати інші схеми введення доз. Успіх такої терапії легко оцінювати за допомогою стандартних методик і аналізів.
Що активують Т-клітини біспецифічні антигензв'язувальні молекули, запропоновані у винаході, як правило, слід застосовувати в кількості, ефективній для досягнення поставленої мети. При застосуванні для лікування або попередження хворобливого стану активувальні Т- клітини біспецифічні антигензв'язувальні молекули, запропоновані у винаході, або їх фармацевтичні композиції, вводять або застосовують в терапевтично ефективній кількості.
Визначення терапевтично ефективного кількості знаходиться в компетенції спеціалістів в даній галузі, насамперед на тлі представленого докладного опису винаходу.
Зо Для системного введення терапевтично ефективну дозу можна спочатку визначати за допомогою аналізів іп міо, наприклад, аналізів з застосуванням клітинних культур. Потім дозу можна містити в форму для вивчення на тваринних моделях для досягнення концентрації в кровотоку, що знаходиться в діапазоні, який охоплює значення ІСво, визначене на клітинній культурі. Зазначену інформацію можна застосовувати для більш точного визначення доз, які можна застосовувати на людях.
Начальні дози можна оцінювати також, виходячи з даних, одержаних іп мімо, наприклад, на тварин моделях, застосовуючи методики, добре відомі в даній галузі. Звичайний спеціаліст в даній ділянці легко може оптимізувати застосування на людях на основі даних, одержаних на тварин.
Рівень доз і інтервал можна регулювати індивідуально для одержання рівнів в плазмі активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, які є достатніми для підтримання терапевтичної дії. Звичайні дози, призначені для введення пацієнту шляхом ін'єкції, складають від приблизно 0,1 до 50 мг/кг/день, як правило, від приблизно 0,5 до 1 мг/кг/день. Для досягнення терапевтично ефективних рівнів в плазмі можна вводити декілька доз кожного дня.
Рівні в плазмі можна оцінювати, наприклад, за допомогою ЖХ ВР.
В випадках місцевого застосування або вибіркового поглинання ефективна місцева концентрація активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул може не відповідати концентрації в плазмі. Спеціаліст в даній галузі може оптимізувати терапевтично ефективні місцеві дози без надмірних експериментів.
Застосування в терапевтично ефективній дозі активувальних Т-клітини біспецифічних антигензв'язувальних молекул, представлених в даному описі, повинно, як правило, забезпечити терапевтичну користь, не викликаючи суттєвої токсичності. Токсичність і терапевтичну ефективність активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули можна визначати за допомогою стандартних фармацевтичних процедур на культурах клітин або експериментальних тварин. Аналізи на клітинних культурах або опити на тварин можна застосовувати для визначення значений І! Обо (доза, смертельна для 50 9о популяції) і
ЕЮОво (доза, терапевтично ефективна для 50905 популяції). Співвідношення доз, що характеризують токсичні і терапевтичні дії, позначають як терапевтичний індекс, який можна виражати у вигляді співвідношення ІЮО50/ЕЮ»о. Що активують Т-клітини біспецифічні бо антигензв'язувальні молекули, що мають високі терапевтичні індекси, є переважними. В одному з варіантів здійснення винаходу активувальна Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, що пропонується в даному винаході, характеризується високим терапевтичним індексом. Дані, одержані в аналізах з застосуванням клітинних культур і в опитах на тварин, можна застосовувати для визначення діапазону доз, які можна застосовувати на людях. Доза знаходиться переважно в діапазоні концентрацій в кровотоку, які містять ЕЮ5о, що мають невисоку токсичність або не мають токсичності. Доза може варіюватися залежно від різних факторів, наприклад, від застосовної лікарської форми, застосовного шляхи введення, стану індивідуума і т.п. Точну препаративну форму, путь введення і дозу може вибирати індивідуально лікар залежно від стану пацієнта (див., наприклад, Ріпді та інш. в: Те
РПпаптасоїодіса! Ваві5 ої Тпегарешціїс5, гл. 1, 1975, з. 1, публікація повністю включена в даний опис як посилання).
Лікарю пацієнтів, яким вводять що активують Т-клітини біспецифічні антигензв'язувальні молекули, запропоновані у винаході, повинно бути очевидним, як і коли закінчувати, переривати або регулювати введення з причин токсичності, дисфункції органів і т. п. И, навпаки, лікарю повинні бути очевидно, як регулювати лікування в бік застосування більш високих доз, якщо клінічна відповідь є неадекватною (усуваючи токсичність). Величина дози дял введення при лікуванні відповідного порушення повинна варіюватися залежно від важкості стану, який підлягає лікуванню, шляхи введення і т. п. Важкість стану можна, наприклад, оцінювати серед іншого за допомогою стандартних прогностичних методів оцінювання. Крім того, доза і передбачувана частота введення дози повинні також варіюватися залежно від віку, ваги тіла і відповіді індивідуального пацієнта.
Інші засоби і варіанти лікування
Що активують Т-клітини біспецифічні антигензв'язувальні молекули, запропоновані у винаході, при лікуванні можна вводити в поєднанні з одним або декількома іншими засобами.
Наприклад, активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході, можна вводити сумісно щонайменше з одним додатковим терапевтичним засобом.
Поняття "терапевтичний засіб" охоплює будь-який засіб, який вводять для лікування симптому або захворювання в індивідуума, який потребує такого лікування. Зазначений додатковий терапевтичний засіб може представляти собою будь-яку діючу речовину, яку можна
Зо застосовувати при конкретному показанні, що підлягає лікуванню, переважно з додатковими видами активності, які не мають негативної дії один на одного. В деяких варіантах здійснення винаходу додатковий терапевтичний засіб являє собою імуномодулятор, цитостатичний засіб, інгібітор клітинної адгезії, цитотоксичний засіб, активатор клітинного апоптозу або засіб, що підвищує чутливість клітин до індукторів апоптозу. В конкретному варіанті здійснення винаходу додатковий терапевтичний засіб являє собою протираковий засіб, наприклад, агент, що руйнує мікротрубочки, антиметаболіт, інгібітор топоіїзомерази, інтеркалятор ДНК, алкилувальний агент, засіб гормональної терапії, інгібітор кіназ, антагоніст рецептора, активатор апоптозу пухлинних клітин або антиангіогенний засіб.
Зазначені інші засоби можуть бути присутніми в комбінації в кількостях, ефективних для зазначених цілей. Ефективна кількість зазначених інших засобів залежить від кількості застосовної активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, типу порушення або лікування, і інших зазначених вище факторів. Що активують Т-клітини біспецифічні антигензв'язувальні молекули, як правило, застосовують в таких же дозах і з застосуванням зазначених в даному описі шляхів введення, або в дозах, що складають приблизно від 1 до 9995 від зазначених в даному описі доз, або в будь-якій дозі й із застосуванням будь-якого шляхи введення, які згідно з емпіричними/клінічними даними розглядають як прийнятні.
Зазначені вище комбіновані терапії передбачають сумісне введення (коли два або більшу кількість терапевтичних засобів містять в одну і ту же або в окремі композиції) і роздільне введення, в цьому випадку введення активувальної Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка пропонується у винаході, можна здійснювати до, одночасно іМабо після введення додаткового терапевтичного засобу і/або ад'юванту. Активувальні Т- клітини біспецифічні антигензв'язувальні молекули, запропоновані у винаході, можна застосовувати також в поєднанні з променевою терапією.
Вироби
Іншим об'єктом винаходу є виріб, який містить продукти, застосовні для лікування, попередження і/або діагностування зазначених вище нарушений. Виріб являє собою контейнер і етикетку або листівку-вкладиш в упаковку, які розміщені на контейнері або додаються до нього.
Прийнятними контейнерами є, наприклад банки, пляшечки, шприци, пакети для бо внутрішньовенного (ІМ) розчину тощо. Контейнери можна виробляти з різних матеріалів, таких як стекло або пластмаса. Контейнер містить композицію, яка сама по себе або в поєднанні з іншою композицією є ефективною для лікування, попередження і/або діагностування стану, і може мати стерильний порт доступу (наприклад, контейнер може представляти собою пакет для внутрішньовенного розчину або пляшечку, постачену пробкою, яку можна проколювати за допомогою голки для підшкірних ін'єкцій). Щонайменше одна діюча речовина в композиції являє собою активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході. На етикетці або листівці-вкладиші в упаковку зазначено, що композицію застосовують для лікування вибраного стану. Крім того, виріб може містити (а) перший контейнер з наявною в ньому композицією, де композиція містить активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу, запропоновану у винаході; і (б) другий контейнер з наявною в ньому композицією, де композиція містить додатковий цитотоксичний або інше терапевтичний засіб. Згідно з цим варіантом здійснення винаходу виріб може містити листівку-вкладиш в упаковку, яка містить інформацію про те, що композиції можна застосовувати для лікування конкретного стану. В альтернативному або додатковому варіанті виріб може додатково містити другий (або третій) контейнер з фармацевтично прийнятним буфером, таким як бактеріостатична вода для ін'єкцій (БСВИ), забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчин Рінгера і розчин декстрози. Крім того, він може містити інші матеріали, необхідні з комерційної точки зору і з точки зору споживача, зокрема, інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки й шприци.
Приклади
Нижче представлені приклади способів і композицій, які запропоновані у винаході Як повинно бути очевидно, можна втілювати на практиці різні інші варіанти здійснення винаходу в цілому з урахуванням представленого вище опису винаходу
Загальні методи
Методи рекомбінантної ДНК
Для маніпуляцій з ДНК застосовували стандартні методи, описані у затогоок у та інш.,
Моїесшіаг сіопіпуд: А Іарогаїогу тапиаї; вид-во Соїд Зргіпд Нагрог І арогаїогу Ргез5, Соїй 5ргіпд
Нагбог, Мем/ ХогК, 1989 Реагенти для молекулярної біології застосовували згідно з інструкціями виробників Загальну інформацію, що стосується нуклеотидних послідовностей легких і важких
Зо ланцюгів людських імуноглобулінів, див у: Караї Е.А та інш., Зедиепсе5 ої Ргоїеіп5 ої
Іттипоіодісаї! Іпієгеві, 5-е вид., вид-во МІН, публікація М 91-3242, 1991
Секвеновані ДНК
Послідовності ДНК визначали шляхом секвенування двох ланцюгів
Синтез генів
Потрібні сегменти генів або створювали за допомогою ПЦР з застосуванням відповідних матриць, або синтезували на фірмі Сепеагй АС (Регенсбург, Німеччина) з синтетичних олігонуклеотидів і ПЦР-продуктів за допомогою автоматичного синтезу генів. В тих випадках, коли точна генна послідовність не була доступна, створювали олігонуклеотидні праймери на основі послідовностей найближчих гомологів і гени виділяли за допомогою ВІД-ПЦР з РНК, одержаної з відповідної тканини. Сегменти генів, фланковані одиничними сайтами, розпізнаваними рестрикційними ендонуклеазами, клонували в стандартних клонувальних/секвенувальних векторах. Плазмідну ДНК очищали з трансформованих бактерій і визначали концентрацію за допомогою Уф-спектроскопії. Послідовність ДНК субклонованих фрагментів генів підтверджували ДНК-секвенуванням. Створювали сегменти генів з потрібними сайтами рестрикції, що дозволяють субклонувати їх у відповідних експресійних векторах. Все конструкції створювали з 5-кінцевой послідовністю ДНК, що кодує лідерний пептид, який спрямовує секрецію білків в еукаріотичних клітинах. В ЗЕО ІЮ МО: 108-116 представлені приклади лідерних пептидів і що кодують їх полінуклеотидних послідовностей.
Виділення первинних людських пан- Т-клітин з РВМС
Мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМСОС) одержували шляхом центрифугування в градієнті щільності Нісіорадие зі збагачених лімфоцитами препаратів (лейкоцитарні плівки), одержаних з місцевих банків крові або з свіжої крові здорових донорів. В цілому, метод полягав у наступному: кров розводили стерильним ЗФР і обережно нашаровували на градієнт
Нізіорадцие (фірма бідта, Н8В889). Після центрифугування протягом 30 хв при 450 х 9д при кімнатній температурі (відключений гальмівний пристрій), частину плазми, що знаходиться над інтерфазою, що містить РВМС, відкидали. РВМС переносили в нові 50-мілілітрові фальконівські пробірки і пробірки заповнювали ЗФР до повного об'єму 50 мл. Суміш центрифугували при кімнатній температурі протягом 10 хв при 400 х д (включений гальмівний пристрій). Супернатант відкидали і дебрис РВМС відмивали двічі стерильним ЗФР (стадії центрифугування при 4 "С бо протягом 10 хв при 350 х 9). Здійснювали автоматичний підрахунок одержаної популяції РВМС
(пристрій МіСеїІ) і зберігали в середовищі КРМІ1640, що містить 10 95 ЕСЗ5 і 1 95 І -аланіл-і - глутаміну (фірма Віоспгот, КОЗ302) при 37 "С, 5 95 СО» в інкубаторі аж до початку аналізу.
Для одержання фракції, збагаченої Т-клітинами з РВМС, застосовували набір для виділення пан-Т-клітин (Рап Т Се Ізоїайоп Кі І) (фірма Мікепуї Віоїес, Мо 130-091-156) згідно з інструкціями виробника. В цілому, метод полягав у наступному: клітинний дебрис розводили, застосовуючи 40 мкл холодного буфера на 10 мільйонів клітин (ЗФР з 0,5 95 БСА, 2 мМ ЕДТК, простерилізований фільтрацією), й інкубували, застосовуючи 10 мкл коктейлю біотин-антитіло на 10 мільйонів клітин, протягом 10 хв при 4 "С. Додавали 30 мкл холодного буфера і 20 мкл магнітних гранул з антитілом до біотину на 10 мільйонів клітин і суміш інкубували протягом ще хв при 4 "С. Клітини промивали, додаючи буфер в об'ємі, що дорівнює 10-20 об'ємам які були в наявності, і потім здійснювали стадії центрифугування при 300 х д протягом 10 хв. Аж до 100 мільйонів клітин ресуспендували в 500 мкл буфера. Магнітну сепарацію немічених людських пан-Т-клітин здійснювали за допомогою І 5-колонок (фірма Мінепуї Віоїтес, Мо 130-042-401) згідно з інструкціями виробника. Здійснювали автоматичний підрахунок одержаної популяції Т-клітин 15 (пристрій МіСеїЇ) і зберігали їх в середовищі АЇМ-М при 37 "С, 5 95 СО» в інкубаторі аж до початку аналізу (не більше 24 год.).
Виділення первинних людських наївних (нестимульованих) Т-клітин з РВМС
Мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМС) одержували шляхом центрифугування в градієнті щільності Нісіорадцие зі збагачених лімфоцитами препаратів (лейкоцитарні плівки), одержаних з місцевих банків крові або з свіжої крові здорових донорів. Для одержання фракції, збагаченої Т-клітинами з РВМС, застосовували набір для виділення наївних СО8:-Т-клітин (Маїме СО8-Т сеї ізоіїайоп Кі) фірми Мінепуї Віоїес (Ме 130-093-244), згідно з інструкціями виробника, але, пропускаючи останню стадію виділення СЮО8--Т-клітин (див. також опис виділення первинних людських пан- Т-клітин).
Виділення мишачих пан-Т-клітин із спленоцитів
Виділяли селезінки з мишей С57ВІ/б6, переносили їх у С-пробірку СепіемАсС5 (фірма
Мінепуї Віоїесп, Мо 130-093-237), яка містить МАСЗ-буфер (ЗФР я 0,5 95 БСА я 2 ММ ЕДТК), їі розщепляли за допомогою пристрою для дисоціації тканин зепіемАс5 з одержанням суспензії одиничних клітин згідно з інструкціями виробника. Клітинну суспензію пропускали через фільтр для попереднього розділення для видалення недисоційованих частинок тканини. Після центрифугування при 400 х д протягом 4 хв при 4 "С додавали буфер для лізису АСК для лізування еритроцитів (інкубація протягом 5 хв при кімнатній температурі). Залишкові клітини двічі промивали МАСЗ-буфером, підраховували і застосовували для виділення мишачих пан-Т- клітин. Негативну (магнітну) селекцію здійснювали, застосовуючи набір для виділення пан-Т- клітин фірми Мінепуії Віоїес (Мо 130-090-861) згідно з інструкціями виробника. Здійснювали автоматичний підрахунок одержаної популяції Т-клітин (пристрій МіСеїІ) і одразу застосовували для додаткових аналізів.
Виділення первинних РВМС мавп циномолгус з гепаринізованої крові
Мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМС) одержували шляхом центрифугування в градієнті щільності з свіжої крові здорових мавп циномолгус наступним чином: гепаринізовану кров розводили у співвідношенні 1:3 стерильним ЗФР і середовище Іутрпоргер (фірма Ахоп
Гар, Мо 1114545) розводили до 9095 стерильним ЗФР. Два об'єми розведеної крові нашаровували на один об'єм розведеного градієнта щільності й фракцію РВМС розділяли шляхом центрифугування протягом 30 хв при 520 х д без гальмування при кімнатній температурі. Полосу, що відповідає РВМС, переносили у свіжу 50-мілілітрову фальконівську пробірку і промивали стерильним ЗФР шляхом центрифугування протягом 10 хв при 400 х д при 4 "С. Здійснювали одну стадію низькошвидкісного центрифугування для видалення тромбоцитів (15 хв при 150 х 49, 4 "С) і здійснювали автоматичний підрахунок одержаної популяції РВМС (пристрій МіСеїІ) ії одразу застосовували для додаткових аналізів.
Клітини-мішені
Для оцінювання біспецифічних антигензв'язувальних молекул, мішенню яких є МСО5Р, застосовували наступні лінії пухлинних клітин: людська клітинна лінія меланоми М/М266-4 (АТСС Мо СКІ -1676), виведена з метастатичного сайту злоякісної меланоми і яка відрізняється високим рівнем експресії людського МС5Р; людська клітинна лінія меланоми МУ-3 (люб'язно надана Медичним центром Неймегенського університету Радбоду (Кадбоца Опімегейу Міітедеп
Меадіса! Сепіге)), що експресує середні рівні людського МС5Р; людська клітинна лінія злоякісної меланоми (первинна пухлина) АЗ75 (ЕСАСС Мо 88113005), що експресує високі рівні МСО5Р; людська клітинна лінія карциноми ободової кишки НСТ-116 (АТСС Мо ССІ-247), яка не експресує МОЗР; і клітинна лінія аденокарциноми ободової кишки людини європеоїдної бо (кавказоїдної) раси І 5180 (ЕСАСС Мо 87021202), яка не експресує МСОС5Р. 5О0
Для оцінювання біспецифічних антигензв'язувальних молекул, мішенню яких є СЕА, застосовували наступні лінії пухлинних клітин: людська клітинна лінія раку шлунку МКМ45 (05М2 Мо АСС 409), що експресує дуже високі рівні людського СЕА; людська клітинна лінія аденокарциноми підшлункової залози НРАБ-ІЇ (люб'язно надана фірмою Коспе МийШеу), що експресує високі рівні людського СЕА; людська клітинна лінія первинної аденокарциноми підшлункової залози ВХРО-3 (ЕСАСС Мо 93120816), що експресує середні рівні людського СЕА; клітинна лінія аденокарциноми ободової кишки жінки європеоїдної раси І 5-174Т (ЕСАСС Мо 87060401), що експресує середні рівні людського СЕА; людська клітинна лінія аденокарциноми підшлункової залози АБРО-1 (ЕСАСС Мо 96020930), що експресує дуже низькі рівні людського
СЕА; людська клітинна лінія епітеліоїдної карциноми підшлункової залози Рапсо-1 (АТС Мо
СВІ -1469), що експресує (дуже) низькі рівні людського СЕА; людська клітинна лінія карциноми ободової кишки НСТ-116 (АТСС Мо ССІ -247), не що експресує СЕА; людська аденокарциномна клітинна лінія епітеліальної базальної мембрани альвеол А5Б49-пиСЕА, яку стабільно трансфектували в лабораторії заявників для експресії людського СЕА; і мишача клітинна лінія карциноми ободової кишки МОС38-пиСЕА, яка була створена в лабораторії заявників, що стабільно експресує людський СЕА.
Крім того, для оцінювання зв'язування різних біспецифічних конструкцій з людським СОЗ на клітинах застосовували людську лінію клітин Т-клітинного лейкозу (Т-лімфобластний лейкоз)
Уижаї (АТСС Мо ТІВ-152).
Приклад 1
Дозрівання афінності антитіла до МС5Р М4-3/МІ 2
Процедуру дозрівання афінності здійснювали за допомогою олігонуклеотид-спрямованого мутагенезу. Для цієї мети варіант важкого ланцюга Ма4-3 і варіант легкого ланцюга МІ 2 клонували у фагмідному векторі, аналогічно методу, описаному у Ноодепроот (Ноодепроот та інш., Мисіеіс Асій5 Кев5. 19, 1991, сс. 4133-4137). Залишки, які підлягають рандомізації ідентифікували спочатку шляхом створення ЗЮО-моделі антитіла на основі класичного моделювання гомології і наступної ідентифікації доступних для розчинника для залишків гіперваріабельних ділянок (СОМ) важкого і легкого ланцюга. Представлені в таблиці 1 олігонуклеотиди, рандомізовані на основі синтезу тринуклеотидів, придбавали у фірми Еїа
Зо Віоїесн! (Мюнхен, Німеччина). Створювали три незалежні підбібліотеки за допомогою класичної
ПЦР, і вони включали рандомізацію в СОБ-НІ1 в поєднанні з СОБ-Н2, або в СОК-11 в поєднанні з СОК-І2. СОВ-ІЇЗ рандомізували за допомогою іншого підходу. ДНК-фрагменти цих бібліотек клонували у фагміді за допомогою розщеплення рестриктазами і лігування, а потім інтродукували за допомогою електропорації в бактерій штаму ТО1.
Селекція із застосуванням бібліотек
Створені таким чином варіанти антитіл експонували в одновалентному форматі на частинках нитчастого фага у вигляді злиття з продуктом гену ЇЇ фага М13, упакованого в кожну частинку. Експоновані на фазі варіанти потім піддавали скринінгу у відношенні їх біологічної активності (в даному контексті: афінність зв'язування), і кандидатів, що мають покращеним одним або декількома видами активності, застосовували для подальшої розробки. Методи створення фагових дисплейних бібліотек можна почерпнуть у Г ее та інш., У. Мої. Віої. 340, 2004, со. 1073-1093.
Селекцію всіх бібліотек з дозрілою афінністю здійснювали в розчині згідно з наступною процедурою: 1) зв'язування х- 1012 фагмідних частинок з кожної бібліотеки для дозрівання афінності з 100 нМ біотинільованою конструкцією пи-МСО5Р(ОЗ-домен)-амі-піз (ЗЕО ІЮО МО: 118) протягом 0,5 год. в загальному об'ємі 1 мл; 2) іммобілізація біотинільованої конструкції пи-
МО5Р(ОЗ-домен) -амі-пі5 і специфічно зв'язаних фагових частинок шляхом додавання 5,4 х 107 покритих стрептавідином магнітних гранул протягом 10 хв: 3) відмивання гранул з застосуванням 5-10х 1 мл ЗФР/Твин20 і 5-10х 1 мл ЗФР; 4) елюювання фагових частинок шляхом додавання 1 мл 100 мМ ТЕА (триєтиламін) протягом 10 хв їі нейтралізація шляхом додавання 500 мкл 1М Трис/НСІ, рн 7,4 і 5) повторне зараження що знаходяться на експоненціальній фазі росту бактерій Е. соїї ТО1, зараження фагом-хеллером МС5МІ3 і потім осадження за допомогою ПЕГ/Мас!І фагмідних частинок, призначених для застосування в наствпних циклах селекції. Селекції здійснювали з застосуванням приблизно 3-5 циклів з застосуванням або постійних, або знижувальних концентрацій антигену (від 10-77 М до 2х10 М).
В цикле 2, "захоплення" комплексів антиген-фаг здійснювали з застосуванням нейтравідинових планшетів замість стрептавідинових гранул. Специфічне зв'язувальні агенти ідентифікували за допомогою ЕЇІЗА наступним чином: 100 мкл 10 нМ біотинільованої конструкції пи-МС5Р(ОЗ-домен)-амі-піз на лунку застосовували для сенсибілізації покритих бо нейтравідином планшетів. Додавали які містять Бар бактеріальні супернатанти і зв'язування
Еаб-фрагментів виявляли за допомогою їх Ріад-міток, застосовуючи антитіло до Ріад/НКкР як вторинне антитіло. Позитивні за даними ЕГІЗА клони експресували в бактеріях у вигляді розчинних ЕРаб-фрагментів в 9б-лунковому форматі й супернатанти піддавали скринінгу у відношенні кінетичних характеристик з застосуванням експериментального 5РВ-аналізу з застосуванням пристрою РгоївєОп ХРІЕЗб (фірма ВіоКайд). Ідентифікували клони, що експресують Раб-фрагменти, зв'язування яких характеризувалось найбільш високими константами афінності, і секвенували відповідні фагміди.
Таблиця 1 (завжди виключали Сузх і Меї. Крім того, виключали Гуз в тих випадках, коли олігонуклеотид являв собою зворотній праймер)
Важкийланцю! 7777711 сові СГ ни""нІЕЄПВІНИиИиНиИинининининннннннннншш сова ЇЇ нШН:6ІІШНИИИНИННнннннннннншшн
Лекийланцюг! 77 сові ГО
О (40 95), (Е, 0, М, 5, Т, В, 40 95, по 6,7 95 кожного), решта (всього 20 95, по 2,2 95 кожного)
С (40 95), (М, Т, 5,0, М, 0, Е, 40 95, по 5,7 95 кожного), решта (20 95, по 2,5 95 кожного)
М (40 95), (5,1, 2, 0, М, 0, Е, В, 50 95, по 6,3 95 кожного), решта (10 95, по 1,4 925 кожного) ни""'нІЕІЕІТІ ВТЙИККТННКІТИЬЬТТОТООБИТТОТЬТИТЬТЬТЬТИТИТЬТЬТЬТИТТЬТЬТЬТЬТЬНТЬТЬЬТЬТИТИТИТЬЛОТИЬООТЬИТОТВВВИХООИТИОНИТЬТИОИ сова Її 5 (40 95), (М, Т, О, М, 0, Е, І, 40 95, по 5,7 95 кожного), решта (20 95, по 2,2 96 кожного) нию"""ньжиЄНВвннннннннннннншш сов ГО
На фіг. 2 представлений порівняльний аналіз первинної структури клонів антитіла до МСО5Р з дозрілою афінністю і батьківського клону, не який не піддавали процедурі дозрівання афінності (М4-3 МІ2). Рандомізацію важкого ланцюга здійснювали тільки в СОКІ1 і 2.
Рандомізацію легкого ланцюга здійснювали в СОК' і 2, і незалежно в СОКЗ.
В процесі селекції в каркасних ділянках виникало декілька мутацій типу Е71У в клоне 53 або
У87Н в клоне Е10.
Одержання і очищення людського Ідс1
ДНК-послідовності варіабельної ділянки важкого і легкого ланцюга варіантів з дозрілою афінністю субклонували в рамці зчитування або з константної ділянкою важкого ланцюга, або з константної ділянкою легкого ланцюга, попередньо вбудованої у відповідний реципієнтний експресійний вектор ссавців. Експресія антитіла находилась під контролем промотору МРБМУ, і вектор ніс синтетичну сигнальну полі(А)-послідовність на 3'-кінці кожної СО5. крім того, кожний вектор містив ОгіР-послідовність ЕВМ.
Молекулу одержували шляхом сумісної трансфекції клітин НЕК293-ЕВМА експресійними векторами ссавців з застосуванням поліетиленіміну (ПЕЇ). Клітини трансфектували відповідними експресійними векторами в співвідношенні 1:11. Для трансфекції клітини НЕК293 ЕВМА культивували в суспензії і безсироватковому культуральному середовищі СО СНО. Для одержання в 500-мілілітрових струшувальних колбах 400 мільйонів клітин НЕК293 ЕВМА висівали за 24 год. до трансфекції. Для трансфекції клітини центрифугували протягом 5 хв при 210 х д, супернатант заміняли 20 мл попередньо нагрітого середовища СО СНО. Експресійні вектори змішували в 20 мл середовища СО СНО до досягнення кінцевої кількості ДНК, що складає 200 мкг. Після додавання 540 мкл розчину ПЕЇ суміш інтенсивно перемішували протягом 15 з і потім інкубували протягом 10 хв при кімнатній температурі. Потім клітини змішували з розчином ДНК/ПЕЇ, переносили в 500-мілілітрову колбу і інкубували протягом З год. при 37 "С в інкубаторі в атмосфері, що містить 5 95 СО». Після періоду інкубації додавали 160 мл середовища РЕ17 і клітини культивували протягом 24 год. Через один день після трансфекції додавали 1 мМ вальпроєву кислоту і 7 95 Реєа 1 (фірма Гопла). Після культивування протягом 7 днів супернатант збирали для очищення шляхом центрифугування протягом 15 хв при 210 х д, розчин стерилізували фільтрацією (фільтр 0,22 мкм), доповнювали азидом натрію до кінцевої концентрації 0,01 95 (мас./об.), витримували при 4 "С.
Білки, що секретують очищали з супернатантів клітинних культур за допомогою афінної хроматографії на білку А. Супернатант вносили на колонку НіТгар РгоївіпА НР (СУ-5 мл, фірма
СЕ Неайпсаге), урівноважену 40 мл суміші, що містить 20 мМ фосфат натрію, 20 мМ цитрат натрію, 0,5 М хлорид натрію, рН 7,5. Незв'язаний білок видаляли відмиванням, застосовуючи рівний щонайменше 10 об'ємам колонки об'єм суміші, що містить 20 мМ фосфат натрію, 20 мМ
Зо цитрат натрію, 0,5 М хлорид натрію, рН 7,5. Потрібний білок елюювали, застосовуючи градієнт об'ємом, рівним 20 об'ємам колонки, від 20 мМ цитрату натрію, 0,5 М хлориду натрію, рН 7,5 до 20 мМ цитрату натрію, 0,5 М хлориду натрію, рН 2,5. Розчин білка нейтралізували, додаючи 1/10 0,5 М фосфату натрію, рН 8. Потрібний білок концентрували й фільтрували перед внесенням на колонку Ні ода Супердекс 200 (фірма СЕ Неайпсаге), урівноважену розчином, що містять 20
ММ гістидин, 140 мМ хлорид натрію, рН 6,0.
Концентрацію білка в очищених білкових зразках визначали шляхом вимірювання оптичної щільності (ОП) при 280 нм, застосовуючи коефіцієнт молярної екстинкції, розрахований на основі амінокислотної послідовності. Чистоту і молекулярну масу молекул аналізували за допомогою КЕ-ПААГ в присутності відновлювача і без нього. Застосовували систему Саїірег
ГарсСпір ОХ! (фірма Саїїрег І Пйезсіепсе) згідно з інструкціями виробника. Для аналізу застосовували по 2 мкг зразка. Вміст агрегатів в зразках антитіла аналізували, застосовуючи колонку для аналітичної гель-фільтрації Т5Кдеї! 53000 5УМ ХІІ. (фірма То5ой) в рухомому буфері, що містить 25 мМ К»НРО», 125 мМ Масі, 200 мм моногідрохлорид І -аргініну, 0,02 95 (мас./об.)
Мамізз, рН 6,7, при 25 76.
Таблиця 2
Одержання і очистка анти-МОС5Р Ідо з дозрілою афінністю ма-(с1)Мі2(03) | 771439 | 2 .ЮЙ0 11 5 южфкОю 0 17 ло 2 ма-з(сі МіО) | 777595 .2ЮЖЩ | 0 2 Щщ| 0 Дрю ло ома-(с1)Ммі2(с5) | 689 2 щ | 0 | 08 1 щфщ992
Визначення афінності
РгоїеОп-аналіз
Величини Ко вимірювали за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, застосовуючи пристрій РгоїеОп ХРЕЗ6 (фірма ВіоКай) при 25 "С, застосовуючи як "захоплювальне" антитіло антитіло, специфічне у відношенні людського Е(аб"З2-фрагмента (фірма Часкзоп
ІтітипоКезеагсії, Мо 109-005-006), іммобілізованого за допомогою амінного сполучення на СМ5-
чипах, і наступного "захоплення" Еар-фрагментів з бактеріального супернатанта або з препаратів очищених Бар. В цілому, метод полягав у наступному: біосенсорні чипи з карбоксиметилованого декстрану (СМ5, фірма СЕ Неаййсагє) активували за допомогою гідрохлориду М-етил-М'-(З-диметиламінопропил)укарбодиіміду (ЕОС) і М-гідроксисукциніміду (МН) згідно з інструкціям постачальника. "Захоплювальне" антитіло, специфічне у відношенні людського Е(ар")2-фрагмента, розводили 10 мМ ацетатом натрію, рН 5,0 до концентрації 50 мкг/мл перед ін'єкцією зі швидкістю потоку 10 мкг/хв до досягнення аж до приблизно 10000 одиниць відповіді (КО) зшитого "захоплювального" антитіла. Після ін'єкції "захоплювального" антитіла інєкували 1 М етаноламін для блокади непрореагованих груп. Для кінетичних вимірювань ін'єкували Раб з бактеріального супернатанту або очищені Раб зі швидкістю потоку 10 мкл/хв протягом 300 с і давали пройти дисоціації протягом 300 с для стабілізації основного рівня "захоплення". Рівні "захоплення" находились в діапазоні 100-500 КО. На наступній стадії аналіт, що являє собою конструкцію людський МСЗР(ЮЗ-домен)-амі-пі5, ін'єкували або в одній концентрації, або у вигляді серій концентрацій (залежно від афінності клону в діапазоні від 100
НМ до 250 пМ), розведених в НВ5-ЕРж (фірма СЕ Неайпсаге, 10 мМ НЕРЕЗ5, 150 мМ Масі, З мм
ЕДТК, 0,05 95 сурфактанту Р2О, рн 7,4), при 25 "С зі швидкістю потоку 50 мкл/хв. Поверхню сенсорного чипа регенерували шляхом ін'єкції гліцину, рН 1,5 протягом 30 з зі швидкістю 90 мкл/хв з наступною ін'єкцією Маон протягом 20 с з такою ж самою швидкістю. Швидкість реакції асоціації (Копг) і реакції дисоціації (Ко) розраховували із застосуванням простої моделі зв'язування Ленгмюра 1:1 (програма РгоїєОп ХРЕЗб ЕмаїЇнайоп або програма ЗсгиБбрег (Віо одіс)) шляхом одночасної апроксимації сенсограм асоціації і дисоціації. Константу рівноваги реакції дисоціації (Ко) розраховували як співвідношення Кон/Коп. Ці дані застосовували для порівняльного оцінювання афінності зв'язування варіантів з дозрілою афінністю і батьківського антитіла. В таблиці За представлені дані, одержані при здійсненні зазначених аналізів.
С3, Е10, С5 для легкого ланцюга і Об, А7, В7, В8, С1 для важкого ланцюга були вибрані для конверсії у формат людського Ідеї. Оскільки СОКІ і 2 легкого ланцюга рандомізували незалежно від СОКЗ, то одержані СОК об'єднували в процесі Ідо-конверсії.
Афінність Ід0-формату знову вимірювали з застосуванням як антигену людського МС5Р
Зо (ЗЕО ІО МО: 118), а також його гомолога - МСО5Р мавп циномолгус (Супо МС5Р, 5ЕО ІЮ МО: 117).
Метод повністю відповідав описаному для Рар-фрагментів, за виключенням того, що застосовували очищений Ідс, одержаний з організму ссавців.
Таблиця За
Афінність до МСО5Р клонів з дозрілою афінністю: дані, одержані за допомогою Ргоїеоп-аналізу
Людський Людський Супо Людський
Варіант МОР МС5Р 0 МОР о) 00 МОР | Супо МОЗР
ЮС,Ко | 90, Ко 9, Ко І9С, Ко
Порівняльна афінність . . . . зв'язування -
Дані об афінності, одержані за кратність збільшення допомогою Ргоїеоп-аналізу : й відносно батьківського антитіла
Батьківське антитіло 9 9 9
Ма-3/МІ 2 5х10 2х10 2х10 мезо мем) мевімсов)
Продовження Таблиця За ме вовумі мевітумі жавамо 001011 вм» || 401. 28 мевввумі мевстумі? мевстмаєя 1 и | жю»| зв 1 00 мевстмаєю 11 вм» |вкоє| 401. 38 мевдлмова 10 ою | жо» зв 1 00 мевдлмовю 1 вм» | тю»| 871. 28 мевстмоаєю 1 | ам» |зкоє| тю 5 мевллмові 1 | ти |жюо»| зв 1 0
Визначення афінності за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК) з застосуванням Віасоге Т200
Експерименти з застосуванням поверхневого плазмонного резонансу (5РЕ) для визначення афінності і авідності (3 з дозрілою афінністю здійснювали за допомогою пристрою Віасоге
Т200 при 25 "С, застосовуючи як рухомого буфера НВ5-ЕР (0,01 М НЕРЕЗ рН 7,4, 0,15 М Масі,
З ММ ЕДТК, 0,005 95 сурфактанту Р20, фірма Віасоге, Фрейбург/Німеччина).
Для аналізу авідності взаємодії різних анти-МС5Р дб з людським МС5Р-ЮОЗ і МС5Р-ЮЗ мавп циномолгус здійснювали безпосередньо у поєднанні приблизно 9500 резонансних одиниць (КИ) антитіла до пента-Ніз (фірма Оіадеп) на СМ5-чипі при рН 5,0, застосовуючи стандартний набір для амінного сполучення (фірма Віасоге, Фрейбург/Німеччина). Антигени "захоплювали", пропускаючи їх протягом 60 з в концентрації ЗО нМ зі швидкістю 10 мкл/хв відповідно. Ід пропускали через проточну комірку в концентрації 0,0064-100 нМ зі швидкістю потоку 30 мкл/хв протягом 280 с. Моніторинг дисоціації здійснювали протягом 180 с. Різниці всіх показників переломлення коректували шляхом віднімання відповіді, одержаного в проточній референс-комірці. Для цього до пропускали по поверхні з іммобілізованим антитілом до пента-
Ні, але ін'єкували НВЗ-ЕР, а не людський МСОСЗР-ЮЗ або МС5Р-О3З мавп циномолгус.
Для вимірювання афінності Ід "захоплювали" на поверхні сенсорного чипа СМ5 з іммобілізованим антитілом до людської Ес-ділянки. "Захоплений" | зшивали з поверхнею сенсорного чипа шляхом безпосередньої іммобілізації приблизно 9500 резонансних одиниць (КО) при рН 5,0, застосовуючи стандартний набір для амінного сполучення (фірма Віасоге,
Фрейбург/Німеччина). (до "захоплювали", пропускаючи їх протягом 25 з в концентрації 10 нМ зі швидкістю 30 мкл/хв. МС5Р-ЮЗ людини і мавп циномолгус пропускали через проточну комірку протягом 120 з в концентрації 2-500 нМ зі швидкістю потоку 30 мкл/хв. Моніторинг дисоціації здійснювали протягом 60 з. Моніторинг асоціації і дисоціації в випадку концентрацій 166 і 500
НМ здійснювали протягом 1200 і 600 з відповідно. Різницю всіх показників переломлення коректували шляхом віднімання відповіді, одержаного в проточній референос-комірці. Для цього антигени пропускали по поверхні з іммобілізованим антитілом до людської Ес-ділянки, але
Ко) ін'єкували НВ5-ЕР, а не анти-МСО5Р Іда.
Кінетичні константи розраховували за допомогою програми Віасоге Т200 Емаїшайоп (мАА, фірма Віасоге АВ, Уппсала/Швеція) шляхом припасування рівнянь для швидкостей до моделі зв'язування Ленгмюра 1:1 за допомогою чисельного інтегрування.
Більш висока афінність до МС5Р-ЮОЗ3 людини і мавп циномолгус була підтверджена за допомогою вимірювань методом поверхневого плазмонного резонансу з застосуванням Віасоге
Т200 крім того, вимірювання авідності продемонстрували підвищення аж до З-кратного при двовалентному зв'язуванні (Таблиця 36).
Таблиця 36
Афінність й авідність анти-МО5Р ідо до МС5Р-ЮЗ людини і МС5Р 03 мавп циномолгус
Ков нм - 00011111. | Афінність | Авідність | Афінність | Авідність::/ (ма-3 Мі2(батьківської | 86 | 00090 | 114 | бог
Приклад 2
Одержання ТСВ-молекули до МС5Р (244-1 Стоз5тар-ІдОо РЗ3290 ГАГА інвертована), що містить
М4-3(С1) МІ-2(03), як антитіло до МСО5Р і гуманізованого антитіла СН2527 як антитіло до СОЗ
ДНК-послідовності варіабельної ділянки важкого і легкого ланцюга субклонували в рамці зчитування або з константної ділянкою важкого ланцюга, або з константної ділянкою легкого ланцюга, попередньо вбудованої в відповідний реципієнтний експресійний вектор ссавців.
Експресія антитіла находилась під контролем промотору МРБМУ, і вектор ніс синтетичну сигнальну полі(А)-послідовність на 3'-кінці кожної СО. Крім того, кожний вектор містив Огір- послідовність ЕВУМ.
Молекулу одержували шляхом сумісної трансфекції клітин НЕК293-ЕВМА експресійними векторами ссавців з застосуванням поліетиленіміну (ПЕЇ). Клітини трансфектували відповідними експресійними векторами в співвідношенні 12:11 (вектор важкого ланцюга
Ес(западина")": "вектор легкого ланцюга""вектор легкого ланцюга Сго55тар""вектор важкого ланцюга Ес("виступ")-РарсСтозвтарб").
Для трансфекції клітини НЕК293 ЕВМА культивували в суспензії і безсироватковому культуральному середовищі СО СНО. Для одержання в 500-мілілітрових струшувальних колбах 400 мільйонів клітин НЕК293 ЕВМА висівали за 24 год. до трансфекції. Для трансфекції клітини центрифугували протягом 5 хв при 210 х 9, супернатант заміняли 20 мл попередньо нагрітого середовища СО СНО. Експресійні вектори змішували в 20 мл середовища СО СНО до досягнення кінцевої кількості ДНК, що складає 200 мкг. Після додавання 540 мкл розчину ПЕЇ суміш інтенсивно перемішували протягом 15 з і потім інкубували протягом 10 хв при кімнатній температурі. Потім клітини змішували з розчином ДНК/ПЕЇ, переносили в 500-мілілітрову колбу і інкубували протягом З год. при 37 "С в інкубаторі в атмосфері, що містить 5 95 СО». Після періоду інкубації додавали 160 мл середовища Е17 і клітини культивували протягом 24 год.
Через один день після трансфекції додавали 1 мМ вальпроєву кислоту і 7 95 ЕРееа 1 (фірма
Гопла). Після культивування протягом 7 днів супернатант збирали для очищення шляхом центрифугування протягом 15 хв при 210 х 9, розчин стерилізували фільтрацією (фільтр 0,22 мкм), доповнювали азидом натрію до кінцевої концентрації 0,01 95 (мас./0об.), витримували при 4
Коо) "б.
Білки, що секретують очищали з супернатантів клітинних культур за допомогою афінної хроматографії на білку А. Супернатант вносили на колонку НіТгар РгоївіпА НР (СУ-5 мл, фірма
СЕ Неайвйсаге), урівноважену 40 мл суміші, що містить 20мМ фосфат натрію, 20мМ цитрат натрію, 0,5 М хлорид натрію, рН 7,5. Незв'язаний білок видаляли відмиванням, застосовуючи рівний щонайменше 10 об'ємам колонки об'єм суміші, що містить 20 мМ фосфат натрію, 20 мМ цитрат натрію, 0,5 М хлорид натрію, рН 7,5. Потрібний білок елюювали, застосовуючи градієнт об'ємом, рівним 20 об'ємам колонки, від 20 мМ цитрату натрію, 0,5 М хлориду натрію, рН 7,5 до 20 м цитрату натрію, 0,5 М хлориду натрію, рН 2,5. Розчин білка нейтралізували, додаючи 1/10 0,5М фосфату натрію, рН 8. Потрібний білок концентрували і фільтрували перед внесенням на колонку Ніїоадй Супердекс 200 (фірма СЕ НеайпПсаге), урівноважену розчином, що містять 20
ММ гістидин, 140 мМ хлорид натрію, рН 6,0.
Концентрацію білка в очищених білкових зразках визначали шляхом вимірювання оптичної щільності (ОП) при 280 нм, застосовуючи коефіцієнт молярної екстинкції, розрахований на основі амінокислотної послідовності.
Чистоту і молекулярну масу молекул аналізували за допомогою КЕ-ПААГ в присутності відновлювача і без нього. Застосовували систему Саїїрег ГарсСпір СХІ!І (фірма Саїірег
І їезсіепсе) згідно з інструкціями виробника. Для аналізу застосовували по 2 мкг зразка.
Вміст агрегатів в зразках антитіла аналізували, застосовуючи колонку для аналітичної гель- фільтрації Т5Каеєї! (33000 5МУУ ХІ. (фірма То5о!й) в рухомому буфері, що містить 25 мМ КеНРО», 125 мМ Масі, 200 мм моногідрохлорид І -аргініну, 0,02 95 (мас./о06.) Мамі», рН 6,7, при 25 76.
Таблиця 4а
Узагальнення даних про одержання і очищення ТОВ-молекули до МС5Р
Кількість агрегатів
Конструкція Титр Імг/л||Вихід |мг/л|| після 1-ої стадії | НММУ (9Ув| | ПММ |Уе| | Мономери (9 очищення (Об)
ТОВ-молекула до мов б | оба заз | о ем
На фіг. З представлено схематичне зображення ТСВ-молекули до МСО5Р (2--1 Стов5тар-Іда
РЗ290 І АГА інвертована).
На фіг. 4 і в таблиці 46 представлені результати КЕ-ДСН-аналізу ТОВ-молекули до МСО5Р (2-41 Стозетар-Іде РЗ3296 І АГА інвертована) (5ЕО ІО МО: 12, 53, 54 і 55).
Таблиця 46
КЕ-ДСН-аналіз ТСВ-молекули до МС5Р 11111111 Пік. кда | Відповіднийланцюг
ТСВ-молекуладо МСОЗР, невідновлювальніумови(А)| 1 206,47Ї.../ггсссссйсИсИсИЙИЙйЙйЙИЙ20о 111111111111111111012 137,39 |Легкийланцюгписноб27 З 11111111 166,07|Робзападинау./-:/ / 11111114 92 |РоСвистуу.ду///:/:///С:-ЗИЯОЯ
Приклад З
Одержання ТОВ-молекули до СЕА (2-1 Сто55тар-ІЧО РЗ3295 І АГА інвертована), що містить
СНІТАТА 98/99 2Е1 як антитіло до СЕА і гуманізоване антитіло СН2527 як антитіло до СОЗ
ДНК-послідовності варіабельної ділянки важкого і легкого ланцюга субклонували в рамці зчитування або з константної ділянкою важкого ланцюга, або з константної ділянкою легкого ланцюга, попередньо вбудованої в відповідний реципієнтний експресійний вектор ссавців.
Експресія антитіла находилась під контролем промотору МРБМУ, і вектор ніс синтетичну сигнальну полі(А)-послідовність на 3'-кінці кожної СО. Крім того, кожний вектор містив Огір- послідовність ЕВУМ.
Молекулу одержували шляхом сумісної трансфекції клітин НЕК293-ЕВМА експресійними векторами ссавців з застосуванням поліетиленіміну (ПЕЇ). Клітини трансфектували відповідними експресійними векторами в співвідношенні 1:2:1:1 ("вектор важкого ланцюга Ес("западина")": "вектор легкого ланцюга" "вектор легкого ланцюга Стго55тар": "вектор важкого ланцюга
Ес(С"виступ")-РабСтозвтар").
Для трансфекції клітини НЕК293 ЕВМА культивували в суспензії і безсироватковому культуральному середовищі СО СНО. Для одержання в 500-мілілітрових струшувальних колбах 400 мільйонів клітин НЕК293 ЕВМА висівали за 24 год. до трансфекції. Для трансфекції клітини центрифугували протягом 5 хв при 210 х 9, супернатант заміняли 20 мл попередньо нагрітого
Зо середовища СО СНО. Експресійні вектори змішували в 20 мл середовища СО СНО до досягнення кінцевої кількості ДНК, що складає 200 мкг. Після додавання 540 мкл розчину ПЕЇ суміш інтенсивно перемішували протягом 15 з і потім інкубували протягом 10 хв при кімнатній температурі. Потім клітини змішували з розчином ДНК/ПЕЇ, переносили в 500-мілілітрову колбу і інкубували протягом З год. при 37 "С в інкубаторі в атмосфері, що містить 595 СО». Після періоду інкубації додавали 160 мл середовища Е17 і клітини культивували протягом 24 год.
Через один день після трансфекції додавали 1 мМ вальпроєву кислоту і 7 95 ЕРееа 1 (фірма
Гопла). Після культивування протягом 7 днів супернатант збирали для очищення шляхом центрифугування протягом 15 хв при 210 х 9, розчин стерилізували фільтрацією (фільтр 0,22 мкм), доповнювали азидом натрію до кінцевої концентрації 0,01 95 (мас./0об.), витримували при 4 "б.
Білки, що секретують очищали з супернатантів клітинних культур за допомогою афінної хроматографії на білку А. Супернатант вносили на колонку НіТгар РгоївіпА НР (СУ-5 мл, фірма
СЕ Неайпсаге), урівноважену 40 мл суміші, що містить 2 мМ фосфат натрію, 20 мМ цитрат натрію, 0,5 М хлорид натрію, рН 7,5. Незв'язаний білок видаляли відмиванням, застосовуючи рівний щонайменше 10 об'ємам колонки об'єм суміші, що містить 20 мМ фосфат натрію, 20 мМ цитрат натрію, 0,5 М хлорид натрію, рН 7,5. Потрібний білок елюювали, застосовуючи градієнт об'ємом, рівним 20 об'ємам колонки, від 20 мМ цитрату натрію, 0,5 М хлориду натрію, рН 7,5 до 20 м цитрату натрію, 0,5 М хлориду натрію, рН 2,5. Розчин білка нейтралізували, додаючи 1/10 0,5 М фосфату натрію, рН 8. Потрібний білок концентрували і фільтрували перед внесенням на колонку Ніїоадй Супердекс 200 (фірма СЕ НеайпПсаге), урівноважену розчином, що містять 20
ММ гістидин, 140 мМ хлорид натрію, рН 6,0.
Концентрацію білка в очищених білкових зразках визначали шляхом вимірювання оптичної щільності (ОП) при 280 нм, застосовуючи коефіцієнт молярної екстинкції, розрахований на основі амінокислотної послідовності.
Чистоту і молекулярну масу молекул аналізували за допомогою КЕ-ПААГ в присутності відновлювача і без нього. Застосовували систему Саїїрег ГарсСпір СХІ!І (фірма Саїірег
І їезсіепсе) згідно з інструкціями виробника. Для аналізу застосовували по 2 мкг зразка.
Вміст агрегатів в зразках антитіла аналізували, застосовуючи колонку для аналітичної гель- фільтрації Т5Каеєї! (33000 5МУУ ХІ. (фірма То5о!й) в рухомому буфері, що містить 25 мМ КаНРО», 125 мМ Масі, 200 мм моногідрохлорид І -аргініну, 0,02 95 (мас./о06.) Мамі», рН 6,7, при 25 76.
Таблиця 5
Узагальнення даних про одержання й очищення ТСВ-молекули до СЕА (ТОВ-молекуладо СЕА| 66 |0,31| 215 | 81 | 44 | 875
На фіг. 5 представлено схематичне зображення ТСВ-молекули до СЕА (2-1 Сговзвітар-Іда
РЗ290 І АГА інвертована).
На фіг. 6 і в таблиці 6 представлені результати КЕ-ДСН-аналізу ТОВ-молекули до СЕА (2-1
Стоз55тар-Ідо РЗ3290 ГАГА інвертована) (ЗЕО ІО МО: 22, 56, 57 і 58).
Таблиця 6
КЕ-ДСН-аналіз ТСВ-молекули до СЕА 11111111 Пік! кда | Відповіднийланцюгу//--/-:/ ; равильна молекула умови (А) умови (В) 11111111 12 136,31 |ЛегийланцюгсНноба?. -::/ 11111111 16348 |РсСзападинау//:/ /(//СС 11111114 1909 |РссСвистууїд///://///С(
В альтернативному методі очищення ТСВ-молекулу до СЕА "захоплювали" із зібраного і
Зо освітленого ферментаційного супернатанту з застосуванням афінної хроматографії на білку А (Марзеїесі 5иКе). Одержаний з білка А елюат потім піддавали катіонообмінній хроматографії (Рого5 50 Н5Б) і потім фракціонували і аналізували за допомогою ГФ-ЖХВР і капілярного електрофорезу. Які містять продукт фракції об'єднували і піддавали хроматографії на основі гідрофобного взаємодії (бутил-сефароза 4ЕРЕ) при кімнатній температурі, застосовуючи режим зв'язування-елюювання. Потім елюат фракціонували і аналізували за допомогою ГФ-ЖХВР і капілярного електрофорезу. Які містять продукт фракції об'єднували і потім піддавали аніонообмінній хроматографії (дУ-Сефароза ЕР), застосовуючи проточний режим. В матеріалі, одержаному з застосуванням зазначеного метода очищення, вміст мономерів складав 298 95.
Приклад 4
Зв'язування ТОВ-молекули до МСО5Р з клітинами, що експресують МО5Р і СОЗ
Зв'язування ТОВ-молекули до МС5Р тестували із застосуванням експресувальної МС5Р клітинної лінії людської злоякісної меланоми (АЗ75) і експресувальної СОЗ імморталізованої лінії Т-лімфоцитів (Уигка). В цілому, метод полягав у наступному: клітини збирали, підраховували, оцінювали їх життєздатність і ресуспендували з розрахунку 2 х 105 клітин/мл в
ЕАС5-буфере (100 мкл ЗФР, 0,1 95 БСА). 100 мкл клітинної суспензії (що містить 0,2х105 клітин) інкубували в круглодонному 96-лунковому планшеті протягом 30 хв при 4 "С зі збільшуваними концентраціями ТСВ-молекули до МО5Р (2,6 пмМ-200 нМ), промивали двічі холодним ЗФР, 0,1 95
БСА, повторно інкубували протягом ще 30 хв при 4 "С з кон'югованим з РЕ Е(аб")2-фрагментом козячого антилюдського ІдбсС Есу-фрагментспецифічного АйЙіпіРиге як вторинного антитіла (фірма щдаскзоп Іттипо Кезеагсй Гар РЕ Мо 109-116-170), промивали двічі холодним ЗФР, 0,1 95
БСА і негайно аналізували за допомогою БАС5 з застосуванням пристрою БАС5 Сапіої! (програма БАС5 Оіма) шляхом установки дискримінаційного вікна на живі, ОАРІ-негативні клітини. Криві зв'язування одержували за допомогою програми СгарпРааРгізть5 (фіг. 7А, зв'язування з АЗ75-клітинами, ЕС5о-3381 пМ; фіг. 7Б, зв'язування з клітинами лінії дигка|.
Приклад 5
Т-клітинний цитоліз, індукований ТСВ-антитілом до МС5Р
Т-клітинний цитоліз, індукований ТСВ-антитілом до МС5Р, оцінювали, застосовуючи панель пухлинних клітинних ліній, що експресують різні рівні МС5Р (АЗ75 - високий рівень МС5Р, ММУ-3 - середній рівень М5СР, НСТ-116 - низький рівень МС5Р, І 5180-МС5Р-негативна лінія). В цілому, метод полягав у наступному: клітини-мішені збирали за допомогою трипсину/ЕДТК, промивали і висівали з густиною 25000 клітин/лунку, застосовуючи круглодонні 96-луночні планшети. Клітинам давали закріпитися протягом ночі. Мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМС) одержували шляхом центрифугування в градієнті щільності Нізорадне збагачених лімфоцитами препаратів (лейкоцитарні плівки), взятих у здорових донорів. Свіжу кров розводили стерильним ЗФР і нашаровували на градієнт Нізіорадие (фірма Зідта, Мо Н8Вг889).
Після центрифугування (450 х д, 30 хв, кімнатна температура), плазму, яка знаходиться над інтерфазою, що містить РВМС, відкидали і РВМСОС переносили в нову фальконівську пробірку, яку потім заповнювали 50 мл ЗФР. Суміш центрифугували (400 х 9, 10 хв, кімнатна температура), супернатант відкидали і дебрис РВМС промивали двічі стерильним ЗФР (стадії
Зо центрифугування при 350 х 9, 10 хв). Здійснювали автоматичний підрахунок популяції РВМС (пристрій МіСеї|) і зберігали її в середовищі КРМІ1640, що містить 10 95 ЕСЗ5 і 1 95 І -аланіл-і - глутаміну (фірма Віоспгот, КОЗ302) при 37 "С, в атмосфері, що містить 5 95 СО», в інкубаторі для клітин аж до подальшого використання (не більше 24 год.). Для аналізу цитолізу додавали антитіло в зазначених концентраціях (діапазон 1 пМ-10 нМ в трьох повтореннях). РВМС додавали до клітинам-мішеням при кінцевому співвідношенні ефекторних клітин і клітин- мішеней (Е:Т), що дорівнює 10:1. Цитоліз клітин-мішеней оцінювали після інкубації протягом 24 год. при 37 "С, 5 95 СО» шляхом кількісного оцінювання вивільнення ЛДГ в клітинні супернатанти клітин на стадії апоптозу/некрозу (набір для детекції ЛДГ (ОН аеїесіоп Кі), фірма Коспе
Арріїей Зсіепсе, Мо 11 644 793 001). Максимальний лізис клітин-мішеней (- 100 95) був досягнутий шляхом інкубації клітин-мішеней з 1 95 Тритон Х-100. Мінімальний лізис (- 0 95) відповідав сумісної інкубації клітин-мішеней з ефекторними клітинами без біспецифічної конструкції. Результати продемонстрували, що ТСВ-молекула до МО5Р індукувала сильний і специфічний для мішені лізис МОС5Р-позитивних клітин-мішеней, не знищуючи при цьому
МО5Р-негативні клітинні лінії (фіг. 8А-Г). Величини ЕсС»вхо, одержані в аналізі цитолізу, розраховані за допомогою програми СгарпРадРгізт5, представлені в таблиці 7.
Таблиця 7
Величини ЕсСовзо (ПМ), що характеризують опосередкований Т-клітинами цитоліз пухлинних клітин, що експресують МСО5Р, індукований ТСВ-антитілом до МС5Р
Приклад 6
Підвищувальна регуляція СО25 і СО69 на ефекторних СО8:- і СОрА--клітинах після Т- клітинного цитолізу пухлинних клітин, що експресують МО5Р, індукованого ТСВ-антитілом до
МО5Р
Активацію СО8:- ії СО4--Т-клітин після Т-клітинного цитолізу що експресують МСО5Р пухлинних клітин лінії ММ-3, опосередкованого ТСВ-антитілом до МСОС5Р, оцінювали за допомогою ЕАСсСзЗ-аналізу, застосовуючи антитіла, які розпізнають маркери Т-клітинної активації, такі як СО25 (пізній маркер активації) і СО69 (ранній маркер активації). Антитіло і умови аналізу цитолізу відповідали описаним вище (приклад 5), при цьому застосовували такий самий діапазон концентрацій антитіла (1 пМ-10 нМ в трьох повтореннях), співвідношення Е:Т 10:1 і тривалість інкубації, що складала 24 год.
Після інкубації РВМС переносили в круглодонний 96-луночний планшет, центрифугували при 350 х д протягом 5 хв і промивали двічі ЗФР, що містять 0,1 95 БСА. Зафарбовування поверхні у відношенні СО8 (ФИТЦ, антитіло до людського СЮО8, фірма ВО, Мо 555634), СО4 (РЕСУ?7, антитіло до людського СО4, фірма ВО, Мо 557852), СОб69 (РЕ, антитіло до людського
СОб69, фірма Віоїєдепа, Мо 310906) ії СО25 (АРС, антитіло до людського СЮО25, фірма ВО, Мо 555434) здійснювали згідно з рекомендаціями постачальника. Клітини промивали двічі, застосовуючи 150 мкл/лунку ЗФР, що містить 0,1 до БСА, і фіксували протягом 15 хв при 4 "С, застосовуючи 100 мкл/лунку фіксувального буфера (фірма ВО, Мо 554655). Після центрифугування зразки ресуспендували в 200 мкл/лунку ЗФР, 0,1 95 БСА, який містив САРІ для виключення мертвих клітин при ЕБАСзЗ-аналізі. Зразки аналізували за допомогою пристрою фірми ВО ЕБАС5 РЕопезза. Результати свідчили про те, що ТСВ-антитіло до МС5Р індукувало сильну і мішеньспецифічну підвищувальну регуляцію маркерів активації (6025, СО69) на СО8:-
Т-клітинах (фіг. 9А, Б) і С04--Т-клітинах (фіг. 9В, Г) після цитолізу.
Приклад 7
Секреція цитокінів людськими ефекторними клітинами після Т-клітинного цитолізу пухлинних клітин, що експресують МСО5Р, індукованого ТОВ-антитілом до МСО5Р
Секрецію цитокінів людськими РВМС після Т-клітинного цитолізу що експресують МСО5Р пухлинних клітин лінії ММУ-3, індукованого ТСВ-антитілом до МОС5Р, оцінювали за допомогою
ЕАС5-аналізу клітинних супернатантів після аналізу цитолізу.
Застосовували то же антитіло і аналіз цитолізу здійснювали практично згідно з описаному вище методу (приклад 5 і б), застосовуючи співвідношення ЕТ 10:1 і тривалість інкубації 24 год.
Зо В кінці періоду інкубації планшет центрифугували протягом 5 хв при 350 х д, супернатант переносили в новий 96-луночний планшет і зберігали при -20 "С до наступного аналізу. Гранзим
В, ТМЕа, ТЕМ-у, 1--2, 11 -4 і 11-10, які секретують в клітинні супернатанти, визначали за допомогою
СВА-аналізу (цитометричний аналіз з застосуванням набора гранулу ВОФ СВА Нитап 5оїшбріе
Ргоїєїп Ріех 5беї, згідно з інструкціями виробника, застосовуючи пристрій БАС5 Сапіої.
Застосовували наступні набори: набір фірми ВО для СВА-аналізу людського гранзиму В (ВО
СВА Ппитап Сгаплуте В РіІех Зеї, Мо ВО 560304); для людського ТМЕ (ВО СВА ПпПитап Ріех 5еї,
Мо ВО 558273); для людського ІЕМ-у (ВО СВА питап ІЄМ-у Біех Беї, Мо ВО 558269; для людського ІІ -2 (ВО СВА Нитап ІІ -2 Ріех Зеї, Мо ВО 558270; для людського ІІ -4 (ВО СВА питап
І -4 Рієх 5еї, Мо ВО 558272; для людського ІІ -10 (ВО СВА питап 1-10 Рієх 5еї, Мо ВО 558274).
Результати продемонстрували, що ТСВ-антитіло до МО5Р індукувало секрецію 1-2, ТЕМ-у,
ТМЕа, гранзиму В і 11-10 (але не ІІ--4) після цитолізу (фіг. 10А-Е).
В поєднанні ці приклади продемонстрували, що біспецифічне антитіло до МС5Р-СОЗ " характеризувалось гарним зв'язуванням з МС5Р-позитивними АЗ75-клітинами, " індукувало сильний і мішеньспецифічний цитоліз МС5Р-позитивних ліній клітин-мішеней і не індукувало цитоліз МОС5Р-негативних клітинних ліній, " індукувало сильну й мішеньспецифічну підвищувальну регуляцію маркерів активації (СО25, сСОб69) на СО8-- ії СО4--Т-клітинах після цитолізу, " індукувало секрецію 1-2, ІТЕМ-у, ТМЕс, гранзиму В і 1-10 (але не 1-4) при цитолізі.
Приклад 8
Зв'язування ТОВ-молекули до СЕА з клітинами, що експресують СЕА і СОЗ
Зв'язування ТСВ-молекули до СЕА тестували з застосуванням трансфектованих клітин, що експресують СЕА аденокарциноми легені (А549-пиСЕА) і що експресують СОЗ3 імморталізованих ліній Т-лімфоцитів людини і мавп циномолгус (Уигкаї і НБСО-Е відповідно). Як контролю застосовували "неспрямовану" ТОВ-молекулу (ЗЕО ІЮО МО: 59, 60, 61 ї 62; див. приклад 24). В цілому, метод полягав у наступному: клітини збирали, підраховували, оцінювали їх життєздатність і ресуспендували з розрахунку 2 х 105 клітин/мл в РАС5-буфере (100 мкл ЗФР, 0,1 95 БСА). 100 мкл клітинної суспензії (що містить 0,2х105 клітин) інкубували в круглодонному 9б-лунковому планшеті протягом 30 хв при 4 "С з збільшуваними концентраціями ТСВ-молекули до СЕА (61 пМ-1000 нМ), промивали двічі холодним ЗФР, 0,1 95 БСА, повторно інкубували бо протягом ще 30 хв при 4 "С з кон'югованим з ФИТЦ Е(ар")2-фрагментом козячого антилюдського бо
ІцО Есу-фрагментспецифічного АйЙіпіРиге як вторинного антитіла (фірма ЧУаскбзоп Іттипо
Кезеагсп гар РІТС, Мо 109-096-097), промивали двічі холодним ЗФР, 0,1 95 БСА і негійно аналізували за допомогою ЕБАСЗ з застосуванням пристрою ЕАС5 Сапоїї (програма ЕАСЗ біма) шляхом установки дискримінаційного вікна на живі Рі-негативні клітини. Криві зв'язування одержували за допомогою програми СгарпРаадРгізт5 (фіг. 11А, зв'язування з А549-клітинами (ЕСво 6,6 нМ); на фіг. 11Б, зв'язування з клітинами УигКкаї; фіг. 118, зв'язування з клітинами НЗС-
Е).
Приклад 9
Опосередкований Т-клітинами цитоліз пухлинних клітин-мішеней, що експресують СЕА, індукований ТСВ-антитілом до СЕА
Опосередкований Т-клітинами цитоліз клітин-мішеней, що індукується ТСВ-антитілом до
СЕА, оцінювали з застосуванням людських пухлинних клітин ліній НРАНІЇ (високий рівень СЕА),
ВхРО-3 (середній рівень СЕА) і АБРСОС-1 (низький рівень СЕА). Як негативні контролі застосовували НСТ-116 (СЕА-негативна лінія пухлинних клітин) і "неспрямовану" ТОВ- молекулу. Людські РВМС застосовували як ефекторних клітин і цитоліз оцінювали через 24 год. і 48 год. після інкубації з біспецифічним антитілом. В цілому, метод полягав у наступному: клітини-мішені збирали за допомогою трипсину/ЕДТК, промивали і висівали з густиною 25000 клітин/лунку, застосовуючи круглодонні 9б-луночні планшети. Клітинам давали закріпитися протягом ночі. Мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМС) одержували шляхом центрифугування в градієнті щільності Нізіорадие збагачених лімфоцитами препаратів (лейкоцитарні плівки), взятих у здорових донорів. Свіжу кров розводили стерильним ЗФР і нашаровували на градієнт Ніхторадие (фірма Зідта, Мо Н8889). Після центрифугування (450 х 9, 30 хв, кімнатна температура), плазму, яка знаходиться над інтерфазою, що містить РВМС, відкидали і РВМС переносили в нову фальконівську пробірку, яку потім заповнювали 50 мл
ЗФР. Суміш центрифугували (400 х 9, 10 хв, кімнатна температура), супернатант відкидали і дебрис РВМС промивали двічі стерильним ЗФР (стадії центрифугування при 350 х 49, 10 хв).
Здійснювали автоматичний підрахунок популяції РВМСОС (пристрій МіСеїІ) і зберігали її в середовищі КРМІ1640, що містить 10 95 ЕСЗ і 1 95 І -аланіл-І -глутаміну (фірма Віоспгот, КОЗ302) (37 "С, 595 СО») в інкубаторі для клітин аж до подальшого використання (не більше 24 год.).
Зо Для аналізу цитолізу додавали антитіла в зазначених концентраціях (діапазон б пМ-100 нМ в трьох повтореннях). РВМС додавали до клітинам-мішеням при кінцевому співвідношенні ефекторних клітин і клітин-мішеней (Е:Т) 10:1. Цитоліз клітин-мішеней оцінювали після інкубації протягом 24 год. і 48 год. шляхом кількісного оцінювання вивільнення ЛДГ (лактатдегідрогеназа) в клітинні супернатанти клітин на стадії апоптозу/некрозу (набір для детекції ЛДГ (І ОН аеїесійоп
КО, фірма Коспе Арріїей Зсіепсе, Мо 11 644 793 001). Максимальний лізис клітин-мішеней (- 100 95) був досягнутий шляхом інкубації клітин-мішеней з 1 95 Тритон Х-100. Мінімальний лізис (- 0 95) відповідав сумісної інкубації клітин-мішеней з ефекторними клітинами без біспецифічної конструкції. Результати продемонстрували, що ТОВ-молекула до СЕА індукувала сильний і специфічний для мішені цитоліз СЕА-позитивних клітин-мішеней (фіг. 12А-3). Величини ЕСво, одержані в аналізі цитолізу, розраховані за допомогою програми СгарпРадРгізт»5, представлені в таблиці 8.
Таблиця 8
Кількість копій СЕА-рецептора і величини ЕСбво (ПМ), що характеризують опосередкований Т- клітинами цитоліз пухлинних клітин, що експресують СЕА, індукований ТСВ-антитілом до СЕА
Приклад 10
Проліферація і активація Т-клітин через 5 днів після опосередкованого ТОСВ-молекулою до
СЕА цитолізу пухлинних клітин-мішеней, що експресують СЕА
Активацію і проліферацію Т-клітин оцінювали через 5 днів після опосередкованого ТСВ- молекулою до СЕА цитолізу що експресують СЕА пухлинних клітин-мішеней, таких як НРАНІЇ (високий рівень СЕА), ВхРО-3 (середній рівень СЕА) і АБРО-1 (низький рівень СЕА). Як негативні контролі застосовували НСТ-116 (СЕА-негативна лінія пухлинних клітин) і "неспрямовану" ТСВ-молекулу. Експериментальні умови для аналізу проліферації були такими же, що і описані в прикладе 9, за исключением того, що на лунку круглодонного 96-луночного планшета висівали тільки по 10000 клітин-мішеней. Для оцінювання проліферації Т-клітин свіжовиділені РВМС мітили з застосуванням СЕБЕ (фірма бідта, Мо 1888). В цілому, метод полягав у наступному: маточний розчин СЕЗЕ розводили з одержанням робочого розчину з концентрацією 100 мкМ. 90 х 105 РВМО-клітин ресуспендували в 90 мл попередньо нагрітого
ЗФР і доповнювали 90 мкл робочого розчину СЕБЕ. Клітини негайно перемішували і інкубували протягом 15 хв при 37 "С. К клітинам додавали 10 мл попередньо нагрітого ЕС5 для припинення реакції. Клітини центрифугували протягом 10 хв при 400 9, ресуспендували в 50 мл середовища й інкубували протягом 30 хв при 37 "С. Після інкубації клітини промивали однократно теплим середовищем, підраховували, ресуспендували в середовищі й додавали до клітинам-мішеням для аналізу цитолізу і наступного вимірювання проліферації і активації клітин при ЕТ, що складає 10:1. Проліферацію оцінювали через 5 днів після цитолізу у відношенні СО4- і СО8- позитивних Т-клітин шляхом кількісного оцінювання розведення красителя СЕБЕ. Експресію
СО025 оцінювали з застосуванням таких же субпопуляцій Т-клітин, застосовуючи антитіло до людського СО25. В цілому, метод полягав у наступному: після центрифугування (400 х 4д протягом 4 хв) клітини ресуспендували, промивали БГАС5З-буфером і інкубували з 25 мкл розведеної суміші антитіл до СЮО4/С08/С025 протягом 30 хв при 4 "С (кон'юговане з АРС/Су7 антитіло до людського СО4, Мо 317418, кон'юговане з АРС антитіло до людського СО8, Мо 301014, кон'юговане з РЕ/Су/7 антитіло до людського СО25, Мо 302612). Потім клітини промивали тричі для видалення незв'язаних антитіл і, наприкінці, ресуспендували в 200 мкл
ЕАС5-буфера, що містить йодид пропідію (РІ), для виключення мертвих клітин для ЕАС5- оцінювання. Флуоресценцію вимірювали з застосуванням пристрою фірми ВО БГАС5 Сапіої!.
Результати продемонстрували, що ТСВ-молекула до СЕА індукувала сильну ( мішеньспецифічну проліферацію СО8:- і СО4--Т-клітин (фіг. 1З3А-Г), а також їх активацію, що установлено по підвищувальної регуляції маркера активації СО25 (фіг. 13Д-3).
Приклад 11
Секреція цитокінів людськими ефекторними клітинами після опосередкованого Т-клітинами цитолізу пухлинних клітин, що експресують СЕА, індукованого ТОВ-антитілом до СЕА
Секрецію цитокінів людськими РВМС після опосередкованого Т-клітинами цитолізу що
Зо експресують СЕА пухлинних клітин лінії МКМ45, індукованого ТСВ-антитілом до СЕА, оцінювали за допомогою ЕАСзЗ-аналізу (СВА-набір) клітинних супернатантів після аналізу цитолізу.
Експериментальні умови були ідентичними з описаними в прикладе 9. В кінці періоду інкубації планшет центрифугували протягом 5 хв при 350 х д, супернатант переносили в новий 9б-луночний планшет і зберігали при -20 "С до наступного аналізу. Секретувальні в клітинні суператанти (А) ІРМ-у, (Б) ТМЕа, (В) гранзим В, (Г) 1-2, (Д) 1-6 ї (Е) 1/-10 виявляли, застосовуючи систему ВОФ СВА Нитап Зоїшбіе Ргоїеїп Ріех Зеї, згідно з інструкціями виробника за допомогою пристрою ГАС5З СапіоїІ. Застосовували наступні набори: ВО СВА ПпПитап 1-2 ВО
РіІех 5еї, Мо ВО 558270; ВО СВА питап дгаплуте В ВО Рієх 5еї, Мо ВО 560304; ВО СВА питап
ТМЕ Рієх Зеї, Мо ВО 558273; ВО СВА Ппитап ІЄМ-у Ріех 5еї, Мо ВО 558269; ВО СВА Ппитап 1І-4
Ніех Зеї, Мо ВО 558272; ВО СВА Питап 1-10 Ріех Зеї, Мо ВО 558274.
Результати продемонстрували, що опосередкований ТСВ-антитілом до СЕА цитоліз (але не цитоліз, опосередкований контрольною "неспрямованою" ТСВ-молекулою), індукував секрецію
ІЕМ-у, ТМЕа, гранзиму В, 1-2, 1-6 і 11-10 (фіг. 14А-Е).
Приклад 12
Опосередкований Т-клітинами цитоліз клітин-мішеней в присутності збільшуваних концентрацій СЕА, що секретується (5СЕА)
Оцінювали опосередкований Т-клітинами цитоліз пухлинних клітин-мішеней (15180), що експресують СЕА, індукований ТСВ-антитілом до СЕА, в присутності збільшуваних концентрацій
СЕА, що секретується (5СЕА, 2,5 нг/мл-5 мкг/мл). Людські РВМС застосовували як ефекторних клітин і цитоліз оцінювали через 24 год. і 48 год. після інкубації з біспецифічним антитілом і 5СЕА. В цілому, метод полягав у наступному: клітини-мішені збирали за допомогою трипсину/ЕДТК, промивали і висівали з густиною 25000 клітин/лунку, застосовуючи круглодонні 9б-луночні планшети. Клітинам давали закріпитися протягом ночі. Мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМОС) одержували шляхом центрифугування в градієнті щільності
Ністорадие збагачених лімфоцитами препаратів (лейкоцитарні плівки), взятих у здорових донорів. Свіжу кров розводили стерильним ЗФР і нашаровували на градієнт Ніхорадие (фірма зЗідта, Мо Н8В889). Після центрифугування (450 х 9, 30 хв, кімнатна температура), плазму, яка знаходиться над інтерфазою, що містить РВМС, відкидали і РВМС переносили в нову фальконівську пробірку, яку потім заповнювали 50 мл ЗФР. Суміш центрифугували (400 х 4д, 10 бо хв, кімнатна температура), супернатант відкидали і дебрис РВМС промивали двічі стерильним
ЗФР (стадії центрифугування при 350 х д, 10 хв). Здійснювали автоматичний підрахунок популяції РВМС (пристрій МісСеї|) і зберігали її в середовищі КРМІ1640, що містить 10 95 ЕС5 і 1 96 І -аланіл-І -глутаміну (фірма Віоспгот, КОЗ302) (37 "С, 5 95 СО») в інкубаторі для клітин аж до подальшого використання (не більше 24 год.). Для аналізу цитолізу застосовували ТОСВ- антитіло до СЕА у фіксованій концентрації їнНМ і 5СЕА застосовували в експерименте в діапазоні концентрацій від 2,5 нг до 5 мкг/мл. РВМС додавали до клітинам-мішеням при кінцевому співвідношенні ефекторних клітин і клітин-мішеней (Е:Т) 10:1. Цитоліз клітин-мішеней оцінювали після інкубації протягом 24 год. і 48 год. шляхом кількісного оцінювання вивільнення
ЛДГ (лактатдегідрогеназа) в клітинні супернатанти клітин на стадії апоптозу/некрозу (набір для детекції ЛДГ (СОН аегесійп Кії, фірма Коспе Арріїва 5сієпсе, Мо 11 644 793 001). Максимальний лізис клітин-мішеней (- 100 95) був досягнутий шляхом інкубації клітин-мішеней з 1 95 Тритон Х- 100. Мінімальний лізис (- 0 95) відповідав сумісної інкубації клітин-мішеней з ефекторними клітинами без биспецифічного антитіла. Цитоліз, опосередкований ТСВ-антитілом до СЕА за відсутності 5СЕА, приймали за 10095 і цитоліз, виявлений в присутності збільшуваних концентрацій 5СЕА стандартизували відносно цього параметра. Результати продемонстрували, що 5СЕА мав лише незначний вплив на опосередкований ТСВ-антитілом до СЕА цитоліз що експресують СЕА клітин-мішеней (фіг. 15А, Б). Ніякого впливу на Т-клітинний цитоліз не виявлено при концентраціях 5СЕА аж до 0,2 мкг/мл. При застосуванні 5СЕА в концентраціях, що перевищують 0,2 мкг/мл, виявлено лише слабкий вплив на загальний цитоліз (зниження на 10- 50 об).
Приклад 13
Опосередкований Т-клітинами цитоліз клітин-мішеней з застосуванням РВМС людини і мавп циномолгус як ефекторних клітин
Оцінювали опосередкований Т-клітинами цитоліз клітин лінії А549 (аденокарцинома легені), що надекспресують людський СЕА (А549-ПСЕА), через 21 год. і 40 год. після інкубації з ТСВ- антитілом до СЕА і РВМС людини або РВМС мавп циномолгус як ефекторних клітин. В цілому, метод полягав у наступному: клітини-мішені збирали за допомогою трипсину/ЕДТК, промивали і висівали з густиною 25000 клітин/лунку, застосовуючи круглодонні 9б-луночні планшети.
Клітинам давали закріпитися протягом декількох годин. Мононуклеарні клітини периферійної
Зо крові (РВМС) одержували шляхом центрифугування в градієнті щільності Нізіорадце збагачених лімфоцитами препаратів (лейкоцитарні плівки), взятих у здорових донорів або здорових мавп циномолгусє. В останньому випадку застосовували градієнт щільності 90 95 Нібюорадие-ЗФР.
Свежую кров розводили стерильним ЗФР і нашаровували на градієнт Ніхорадице (фірма Зідта,
Мо Н8г889). Після центрифугування (450 х 49, 30 хв, кімнатна температура для людських РВМС, відповідно 520 х д, 30 хв, кімнатна температура для РВМС мавп циномолгус), плазму, що знаходиться над інтерфазою, що містить РВМС, відкидали і РВМС переносили в нову фальконівську пробірку, яку потім заповнювали 50 мл ЗФР. Суміш центрифугували (400 х д, 10 хв, кімнатна температура), супернатант відкидали і дебрис РВМС промивали двічі стерильним
ЗФР (стадії центрифугування при 350 х 9, 10 хв). Для одержання РВМС мавп циномолгус здійснювали додаткову стадію низькошвидкісного центрифугування при 150 х уд протягом 15 хв.
Здійснювали автоматичний підрахунок популяції РВМСОС (пристрій МіСеїІ) і зберігали її в середовищі КРМІ1640, що містить 10 95 ЕСЗ і 1 95 І -аланіл-І -глутаміну (фірма Віоспгот, КОЗ302) (37 "С, 595 СО») в інкубаторі для клітин аж до подальшого використання (аж до 4 год.). Для аналізу цитолізу додавали антитіла в зазначених концентраціях (діапазон 6 пМ-100 нМ в трьох повтореннях). РВМС додавали до клітинам-мішеням при кінцевому співвідношенні ефекторних клітин і клітин-мішеней Е:Т 10:1. Цитоліз клітин-мішеней оцінювали після інкубації протягом 21 год. і 40 год. шляхом кількісного оцінювання вивільнення ЛДГ (лактатдегідрогеназа) в клітинні супернатанти клітин на стадії апоптозу/некрозу (набір для детекції ЛДГ (ОН аеїесіоп Кі), фірма
Коспе Арріїеа Зсіепсе, Мео11 644 793 001). Максимальний лізис клітин-мішеней (- 100 95) був досягнутий шляхом інкубації клітин-мішеней з 1 95 Тритон Х-100. Мінімальний лізис (- 0 95) відповідав сумісної інкубації клітин-мішеней з ефекторними клітинами без биспецифічного антитіла. Результати продемонстрували, що ТСВ-молекула до СЕА індукувала специфічний для мішені цитоліз СЕА-позитивних клітин-мішеней при застосуванні як ефекторних клітин (РВМС) як клітин людини (фіг. 16А, В), так і клітин мавп циномолгус (фіг. 16Б, Г). Величини ЕСво, одержані при аналізі цитолізу через 40 год., розраховані за допомогою програми
СгарпРадРгізхт5, складали 306 пМ для РВМС людини і 102 пМ для РВМС мавп циномолгус.
Приклад 14
Опосередкований Т-клітинами цитоліз людських клітинних ліній, що експресують СЕА колоректального раку, індукований ТСВ-антитілом до СЕА
Оцінювали опосередкований Т-клітинами цитоліз що експресують СЕА людських клітинних ліній колоректального раку через 48 год. після інкубації з люодськими РВМС і ТОВ-антитілом до
СЕА в концентрації 0,8 нМ, 4 нМ і 20 нМ. В цілому, метод полягав у наступному: РВМС виділяли з лейкоцитів конусів, одержаних з індивідуальних здорових донорів. Клітини розводили ЗФР (1:10) і нашаровували на Іутрпоргер в 50-мілілітрових фальконівских пробірках. Після центрифугування (1800 об/хв протягом 25 хв), шар РВМС відокремлювали від інтерфази і промивали 4 рази ЗФР. РВМС підраховували, заморожували в 10 95 ДМСО в ЕС5 в умовах заморожування з контрольованою швидкістю з розрахунку 40 х 109 клітин/мл і зберігали в жидком азоте аж до подальшого використання. Для аналізу Т-клітинного цитолізу пухлинні клітини висівали в 9б-луночні планшети безпосередньо з заморожених маточних розчинів.
Клітини швидко нагрівали і негайно переносили в попередньо нагріте середовище, центрифугували і ресуспендували у повному середовищі (середовище ОМЕМ, Ісков або ЕРМІ- 1640, все доповнені 10 95 ЕС5 і 1 95 пеніциліну/стрептоміцину) і висівали з густиною 2,5 х 104 клітин/лунку. Потім планшети інкубували при 37 "С у вологій камері в атмосфері 10 95 СО» і наступного дня середовище заміняли на 100 мкл КРМІ, 2 95 ЕС5 з 1 9о глутаміну і 50 мкл ТСВ- молекули до СЕА (діапазон конечних концентрацій від 6,4 до 20000 пМ, стадії титрування 1:5, лунки в двох повтореннях для кожного стану). Для аналізу застосовували свіже відтаювані
РВМС (відтаювання із заморожених пляшок протягом 2 год. від початку аналізу), і 50 мкл (3 х 105) додавали в кожну лунку з одержанням співвідношення: ефекторні клітини:клітини-мішені (Е:Т), рівного 10:11. Додавали Тритон Х100 (50 мкл, 495) до 150 мкл клітин-мішеней з одержанням величин максимального вивільнення. Планшети інкубували при 37 "С протягом 48 год., і визначали цитолітичну активність за допомогою набора для детекції цитотоксичності за допомогою лактатдегідрогенази (І асіозе Оепуагодепазе Суохісйу Оегесійоп Кі) (фірма Коспе) згідно з інструкціями виробника. Процент специфічного клітинного лізису розраховували як вивільнення із зразка - спонтанне вивільнення|/максимальне вивільнення - спонтанне вивільнення) х 100. На фіг. 17А-В продемонстрована кореляція між експресією СЕА (кількість копій рецептора розраховували за допомогою набора ОІРІКІТ, див. нижче) і 95 цитолізу для 31 клітинної лінії колоректального раку (зазначені на осі х). На фіг. 17Г продемонстрована кореляція між експресією СЕА і 95 специфічного лізису при застосуванні ТСВ-антитіла до СЕА в
Зо концентрації 20 нМ (кореляція Спірмена - 0,7289, р «0,0001, п-31), що свідчить про те, що пухлинні клітини, що експонують велику кількість копій СЕА-рецептора (250000), піддавали ефективному лізису при застосуванні ТСВ-антитіла до СЕА, в то час як група клітин, що експонують малу кількість копій СЕА-рецептора («10000), не лізували при застосуванні ТСВ- антитіла до СЕА в таких же експериментальних умовах. На фіг. 17Д продемонстрована кореляція між рівнем експресії СЕА і величиною ЕСво ТОВ-антитіла до СЕА. Хоча кореляція виявилась статистично незначною (коефіцієнт кореляції Спірмена - -0,3994, р-0,1006,
В2-0,1358), на графіку чітко видна тенденція до підвищення активності ТСВ-антитіла до СЕА (тобто більше низькі величини ЕСзо) при застосуванні ліній пухлинних клітин, що експресують велику кількість копій СЕА-рецепторів.
Для аналізу експресії СЕА на поверхні ліній ракових клітин застосовували набір ОК (фірма БакКкосСуїтаїййоп, Глоструп, Данія) для калібрування флуоресцентних сигналів і визначення кількості сайтів зв'язування на клітину. Клітини інкубували на льоді протягом 30 хв з мишачим моноклональним антитілом до людського СЕАСАМ5 (0,5 мкг на 5 х 105 клітин, клон:
СІ-Р8В3-1, 5с-23928, Запіа Сги7), промивали двічі ЗФРІх-БСА 0,195 з наступною інкубацією протягом 45 хв з поліклональним кон'югованим з флуоресцеїінізтіоціанатом козячим антимишачим антитілом, що входить в набір ОйЙКИ. Мертві клітини виключали з аналізу, застосовуючи зафарбовування 4",б-диамидино-2-фенилиндолом (АРІ). Зразки аналізували за допомогою аналізатора СуАп'ї АОР (фірма ВесКтап СошиМег). Одержували все дані про середніх інтенсивностях флуоресценції (МЕ!) після аналізу даних за допомогою програми
Зуттії 4.3. Зазначені МЕ! застосовували для визначення относійного кількості антитілозв'язувальних сайтів на клітинних лініях (результати представлені у вигляді кількості копій СЕА), застосовуючи рівняння, одержане на основі калібрувальної кривої (калібрувальні гранули з набора ОЇНКІЮ.
Лінії клітин колоректального раку, застосовні для аналізів Т-клітинного цитолізу і кількісного оцінювання поверхневої експресії СЕА, висівали з кріофлаконів. Метод, застосовний для підтримання замороженого маточного розчину, описаний у Вгаспйї з співавторами (Вгасн! та інш.,
Вг У Сапсег 103, 2010, сс. 340-346).
Приклад 15
Протипухлинна ефективність іп ммо ТСВ-молекули до СЕА у відношенні лінії людської бо карциноми ободової кишки І5174Т-йис2, сумісно трансплантованою з людськими РВМС
(співвідношення Е:Т 5:1)
Мишам лінії МОЄ (МОБ/ЗПі-зсіалі -2Купиї) (п-12) ін'єктували підшкірно 1х105 клітин І 51741-
Пис2, попередньо змішаних з людськими РВМС в загальному об'ємі 100 мкл в ЗФР, співвідношення Е:Т складало 5:1. Клітини лінії І 5174Т-Пис2 були сконструйовані так, що вони експресували люциферазу, що позволяло здійснювати моніторинг розвитку пухлини на основі біолюмінесценції (ВІЇ) неінвазивним і високочутливим методом. Для оцінювання ранніх і відкладених впливів лікування мишам вводили два рази в тиждень шляхом і.м.-ін'єкцій або 0,5, або 2,5 мг/кг ТСВ-молекули до СЕА, починаючи з дня 1 (рання стадія лікування) або дня 7 (відкладена стадія лікування) після сумісної 5.с.-трансплантації пухлинних клітин/РВМО. Як контроль однієї групи мишей вводили два рази в тиждень шляхом і.м.-ін'єкцій 2,5 мг/кг контрольної ТСВ-молекули, яка мала такий самий формат, що і ТСВ-молекула до СЕА (в даному випадку ТСВ-молекула до МСО5Р, яка служила як "неспрямованого" контролю, оскільки клітини Г5174Т-Пис2 не експресують МО5Р), а додатковій контрольній групі вводили тільки ЗФР (наповнювач), починаючи з дня 1. Об'єм пухлин вимірювали раз в тиждень за допомогою цифрового кронциркуля. крім того, мишам ін'єкували ір. один раз в тиждень ЮО-люциферин і емісію біолюмінісцентного світла живими пухлинними клітинами вимірювали за допомогою пристрою ІМІ5 бресігит (фірма РегКіп Еітег). Обробку продовжували аж до 19 днів після інокуляції пухлинних клітин, що відповідало дню закінчення дослідження. Результати експерименту представлені на фіг. 18А-Г. Результати представлені у вигляді середнього значення і СКО об'ємів пухлин 12 мишей, виміряних кронциркулем (А і В) і виміряних на основі біолюмінесценції (інтегральний потік, Б і Г) в різних досліджуваних групах (А, Б) рання стадія лікування, (В, Г) відкладена стадія лікування).
Приклад 16
Протипухлинна ефективність іп мімо ТОВ-молекули до СЕА у відношенні лінії людськой карциноми ободової кишки 15174Т-Пис2, сумісно трансплантованої з людськими РВМС (співвідношення Е:Т 1:1)
Мишам лінії МОЄ (МОБ/ЗПпі-5сіалі -2Купиї) (п-10) ін'єкували підшкірно 1х105 клітин І 5174Т-
ТПис2 (див. приклад 15), попередньо змішаних з людськими РВМС в загальному об'ємі 100 мкл в
ЗФР, співвідношення Е:Т складало 1:1. Для оцінювання ранніх і відкладених впливів лікування мишам вводили два раза в тиждень шляхом і.м.-ін'єкцій або 2,5 мкг ТСВ-молекули до СЕА, починаючи з дня 1 (рання стадія лікування) або дня 7 (відкладена стадія лікування) після інокуляції пухлинних клітин. Як контроль одній групі мишей вводили два рази в тиждень шляхом і.м.-ін'єкцій 2,5 мг/кг контрольної ТСВ-молекули (див. приклад 15), а додатковій контрольній групі вводили тільки ЗФР (наповнювач), починаючи з дня 1. Об'єм пухлин вимірювали раз в тиждень за допомогою цифрового кронциркуля. крім того, мишам ін'єктували і.р. один раз в тиждень О- люциферин і емісію біолюмінісцентного світла живими пухлинними клітинами вимірювали за допомогою пристрою ІМІ5 Зресігит (фірма Регкіп ЕІтег). Обробку продовжували аж до 23 днів після інокуляції пухлинних клітин, що відповідало дню закінчення дослідження. Результати експерименту представлені на фіг. 19А-Г. Результати представлені у вигляді середнього значення і СКО об'ємів пухлин, виміряних кронциркулем (А) і виміряних на основі біолюмінесценції (Б) в різних досліджуваних групах (п-10).
Приклад 17
Ефективність іп мімо мишачизованої ТСВ-молекули до СЕА у відношенні лінії Рапсо2-пиСЕА, установлена із застосуванням ортотопічної моделі пухлини на імунокомпетентних трансгенних мишах пиСОзЗє/пиСЕА
Трансгенним мишам лінії пиСОЗє/пиСЕА (п-10) вводили шляхом ін'єкції в підшлункову залозу 2 х 105 клітин лінії Рапсо2-пиСЕА в загальному об'ємі 10 мкл в ЗФР. Оскільки мишачі клітини не експресували СЕА, лінії клітин мишачої карциноми підшлункової залози конструювали так, що вони надекспресували людський СЕА як антигену-мішені для ТСВ- молекули до СЕА. Мишам ін'єкували двічі в тиждень і.м. 0,5 мг/кг мишачизованої ТСВ-молекули до СЕА або ЗФР в контрольній групі (наповнювач) і здійснювали моніторинг виживаності. У тварин щоденно контролювали клінічні симптоми і оцінювали небажані явища. Критеріями закінчення дослідження були візуальні признаки захворювання тварин: брудна шерсть, вигнута дугою спина, проблеми з диханням, порушена локомоція. Дані про загальну виживаність представлені на фіг. 20. Результати виражені у вигляді процента тварин, що вижили, в кожний момент часу. Достовірність різниць між групою, що піддавали обробці досліджуваною сполукою, і контрольною групою, яку обробляли ЗФР, порівнювали за допомогою парного І-критерію
Стьюдента (р-0,078).
Приклад 18 бо Визначення афінності ТОВ-молекули до СЕА з СЕА і з СОЗ за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (5РЕ)
Експерименти на основі поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК) здійснювали з застосуванням пристрою Віасоге Т100 при 25 "С, застосовуючи як рухомого буфера НВ5-ЕР (0,01М НЕРЕЗ рН 7,4, 0,15 М МасіІ, 3 мМ ЕДТК, 0,005 95 сурфактанту Р20, фірма Віасоге,
Фрейбург, Німеччина).
Для вимірювання афінності ТОВ-молекулу до СЕА "захоплювали" на поверхні сенсорного чипа СМ5 за допомогою іммобілізованого антитіла до людського баб (фірма СЕ Неаййсаге, Мо 28-9583-25). Застосовний для "захоплення" Ід зшивали з поверхнею сенсорного чипа шляхом безпосередньої іммобілізації приблизно 10000 резонансних одиниць (КОЮ) при рн 5,0, застосовуючи стандартний набір для амінного сполучення (фірма Віасоге, Фрейбург,
Німеччина).
Для аналізу взаємодії з людським СОЗя "стебло"-Бс ("виступ")-Ам/СО36б-"стебель"-
Ес(западина") (5ЕБЕО ІЮ МО: 120 ії 121 відповідно) ТОВ-молекулу до СЕА "захоплювали" протягом 30 з в концентрації 50 нМ при швидкості потоку 10 мкл/хв. СОЗє/СО36 пропускали в концентрації 0,68-500 нМ при швидкості потоку 30 мкл/хв через проточні комірці протягом 360 з.
Моніторинг дисоціації здійснювали протягом 360 з.
Величину Ко, яка характеризує взаємодію між ТСОВ-молекулою до СЕА і рекомбінантним пухлинним антигеном-мішенню, таким як людський МАВА-амі-піх (що містять ВЗ-домен людського СЕА (СЕАСАМУ5), оточений М-, А1- і А2-доменами людського СЕАСАМІ з С-кінцевою міткою амі бпі5 їад; див. ЗЕО ІО МО: 119), визначали шляхом "захоплення" ТСВ-молекули протягом 40 с при швидкості потоку 10 мкл/хв. Антиген пропускали по поверхні проточної комірки протягом 240 з в діапазоні концентрацій від 0,68 до 500 нМ при швидкості потоку 30 мкл/хв. Дисоціацію оцінювали протягом 240 з.
Різниці всіх показань переломлення коректували шляхом віднімання відповіді, одержаного в проточній референос-комірці Для цього варіанта антигени пропускали по поверхні з іммобілізованим антитілом до людського Раб, але на яку ін'єкували НВ5-ЕР, а не СЕА.
Кінетичні константи визначали шляхом чисельного інтегрування за допомогою програми
Віасоге 200 Емаїшайоп (мАА, фірма Віасоге АВ, Уппсала/Швеція) для апроксимації даних з застосуванням уравнений для швидкостей на основі Ленгмюрівської моделі зв'язування (1:1).
Зо Час напівжиття (1/2) взаємодії розраховували, застосовуючи наступну формулу: 11/2--ІП2Кок.
ТОВ-молекула до СЕА зв'язувалась з пухлиною-мішенню і з СОЗє/СО3б в наномолярному діапазоні, при цьому величини Ко складали 62 нМ у відношенні людського МАВА і 75,3 нМ у відношенні людського СЮОЗє/СО36. Час напівжиття одновалентного зв'язування з МАВА складав 5,3 хв, час напівжиття зв'язування з СОЗє/СО036 складав 5,7 хв. Кінетичні параметри узагальнені в таблиці 9.
Таблиця 9
Афінність ТСВ-молекули до СЕА з людським МАВА і людським СОЗє/СО36 (1-25 7С)
Приклад 19
Визначення афінності ТОВ-молекули до М5СР з М5СР і з СОЗ за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК)
Експерименти на основі поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК) здійснювали з застосуванням пристрою Віасоге Т100 при 25 "С, застосовуючи як рухомого буфера НВ5О-ЕР (0,01 М НЕРЕЗ рН 7,4, 0,15 М Масі, З мМ ЕДТК, 0,005 95 сурфактанту Р20, фірма Віасоге,
Фрейбург, Німеччина).
Для вимірювання афінності ТОВ-молекулу до М5СР "захоплювали" на поверхні сенсорного чипа СМ5 за допомогою іммобілізованого антитіла до людського Раб (фірма СЕ Неаййсаге, Мо 28-9583-25). Застосовний для "захоплення" Ід зшивали з поверхнею сенсорного чипа шляхом безпосередньої іммобілізації приблизно 7500 резонансних одиниць (КО) при рн 5,0, застосовуючи стандартний набір для амінного сполучення (фірма Віасоге, Фрейбург,
Німеччина). ТОВ-молекулу до М5СР "захоплювали" протягом 60 з в концентрації 30 нМ при швидкості потоку 10 мкл/хв. МС5Р-ЮЗ людини і мавп циномолгус (див. ХЕО ІЮ МО: 118 ї 117 відповідно) пропускали в концентрації 0,024-50 нМ при швидкості потоку 30 мкл/хв через проточні комірці протягом 90 з. Діапазон концентрацій для конструкції СОЗє "стебло"-Ес
("виступ")-Ам/СО3б-"стебель"-Ес("западина") людини і мавп циномолгус складав 1,17-600 нМ.
Оскільки очікували, що взаємодію з мишачим МОЗР-ЮЗ (5ЕБО ІЮ МО: 122) буде слабким, діапазон концентрацій для цього антигену вибирали між 3,9 ії 500 нМ. При оцінюванні всіх взаємодій моніторинг дисоціації здійснювали протягом 3120 с. Різниці всіх показників переломлення коректували шляхом віднімання відповіді, одержаного в проточній референс- комірці. Для цього варіанта антигени пропускали по поверхні з іммобілізованим антитілом до людського Еаб, але на яку ін'єктували НВ5-ЕР, а не ТСВ-молекулу до МС5Р.
Кінетичні константи визначали шляхом чисельного інтегрування за допомогою програми
Віасоге Т200 Емаїчайоп (мАА, фірма Віасоге АВ, Уппсала/Швеція) для апроксимації даних із застосуванням рівнянь для швидкостей на основі Ленгмюрівської моделі зв'язування (1:1).
Взаємодію ТСВ-молекули до МС5Р з мишачим МО5Р-О3З визначали в стабільному стані. Час напівжиття (Ї//г) взаємодії розраховували, застосовуючи наступну формулу: І /2-Іп2/Кон.
ТОВ-молекула до МОС5Р зв'язувалась з пухлиною-мішенню в пікомолярному діапазоні, при цьому величини Ко складали 0,15 нМ для антигену людини і 0,12 нМ для антигену мавп циномолгус. Зв'язування рекомбінантного СОЗє/СО036 з ТСВ-молекулою до МСо5Р характеризувалось величиною Ко 78 нМ (людський) і 104 нМ (мавпячий). Час напівжиття одновалентного зв'язування з пухлинним антигеном складав аж до 260 хв, і з СоЗесоза складав 2,9 хв. Після того, як антитіло до МС5Р піддавали процедурі дозрівання афінності, виявлене певне зв'язування з рекомбінантним мишачим МС5Р-О3. Величина Ко цього взаємодії находилась в мікромолярному діапазон (1,6 мМ). Кінетичні параметри узагальнені в таблиці 10.
Таблиця 10
Афінність ТОСВ-молекули до МС5Р з МС5Р-ЮЗ людини, мавп циномолгус і мишей і з СОЗє/СО36б людини і мавп циномолгус (1-25 "С) 11111110 Ко п/мер | Кол | беїхв! | Конм) "визначали шляхом вимірювання в стабільному стані.
Приклад 20
Термостабільність ТСВ-молекули до СЕА
Термостабільність ТОВ-молекули до СЕА визначали на основі динамічного розсіяння світла (015). 30 мкг профільтрованого білкового зразка з концентрацією білка 0,5 мг/мл вносили з дублюванням в планшет-рідер типу Юупарго (фірма Уууай Тесппоїоду Согрогайоп; США).
Температуру підвищували з 25 до 75 "С зі швидкістю 0,05 "С/хв, визначаючи радіус і загальну інтенсивність розсіяння. Результати представлені на фіг. 21. Температуру агрегації ТОВ-
Зо молекули до СЕА вимірювали при 55 "С.
Приклад 21
Термостабільність ТСВ-молекули до МС5Р
Термостабільність ТОВ-молекули до МОС5Р визначали на основі динамічного розсіяння світла (01 5). 30 мкг профільтрованого білкового зразка з концентрацією білка 0,5 мг/мл вносили з дублюванням в планшет-рідер типу Юупарго (фірма Умуай Тесппоїоду Согрогайоп; США).
Температуру підвищували з 25 до 75 "С зі швидкістю 0,05 "С/хв, визначаючи радіус і загальну інтенсивність розсіяння. Результати представлені на фіг. 22. Температуру агрегації ТСВ- молекули до МС5Р вимірювали при 55 "С.
Приклад 22
Опосередкований Т-клітинами цитоліз пухлинних клітин-мішеней, що експресують МО5Р, індукований ТСВ-антитілом до МСО5Р і антитілом до МСО5Р 1-1 Стоз5зМар
Опосередкований Т-клітинами цитоліз клітин-мішеней, індукований ТСВ-антитілом до МС5Р і ТОВ-антитілом до МС5Р 14-41 Сто55Маб (активувальне Т-клітини біспецифічне антитіло, що має такі же зв'язувальні СОЗ і МСО5Р послідовності, що і ТСВ-антитіло до МС5Р, молекулярний формат якого представлений на фіг. 1Г), оцінювали з застосуванням пухлинних клітин-мішеней ліній АЗ75 (високий рівень МС5Р), ММУ-3 (середній рівень МО5Р) і НСТ-116 (низький рівень
МСО5Р). Як негативного контролю застосовували клітини лінії 5180 (МО5Р-негативна лінія пухлинних клітин). Цитоліз пухлинних клітин оцінювали через 24 год. і 48 год. після інкубації клітин-мішеней з антитілами і ефекторними клітинами (людські РВМО). В цілому, метод полягав у наступному: клітини-мішені збирали за допомогою трипсину/ЕДТК, промивали і висівали з густиною 25000 клітин/лунку, застосовуючи плоскодонні 96-луночні планшети. Клітинам давали закріпитися протягом ночі. Мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМС) одержували шляхом центрифугування в градієнті щільності Нісїорадне збагачених лімфоцитами препаратів (лейкоцитарні плівки), взятих у здорових донорів. Свіжу кров розводили стерильним ЗФР і нашаровували на градієнт Ніхторадие (фірма Зідта, Мо Н8889). Після центрифугування (450 х 9, 30 хв, кімнатна температура), плазму, яка знаходиться над інтерфазою, що містить РВМС, відкидали і РВМС переносили в нову фальконівську пробірку, яку потім заповнювали 50 мл
ЗФР. Суміш центрифугували (400 х 49, 10 хв, кімнатна температура), супернатант відкидали і дебрис РВМС промивали двічі стерильним ЗФР (стадії центрифугування при 350 х 49, 10 хв).
Здійснювали автоматичний підрахунок популяції РВМСОС (пристрій МіСеїІ) і зберігали її в середовищі КРМІ1640, що містить 10 95 ЕСЗ і 1 95 І -аланіл-І -глутаміну (фірма Віоспгот, КОЗ302) при 37 "С, в атмосфері, що містить 595 СО», в інкубаторі для клітин аж до подальшого використання (не більше 24 год.). Для аналізу цитолізу додавали антитіло в зазначених концентраціях (діапазон 0,01 пМ-10 нМ в трьох повтореннях). РВМС додавали до клітинам- мішеням при кінцевому співвідношенні ефекторних клітин і клітин-мішеней (Е:Т), що дорівнює 10:11. Цитоліз клітин-мішеней оцінювали після інкубації протягом 24 год. і 48 год. шляхом кількісного оцінювання вивільнення ЛДГ в клітинні супернатанти клітин на стадії апоптозу/некрозу (набір для детекції ЛДГ (ІОН аегтесійп Кі), фірма Коспе Арріїед Зсіепсе, Мо 11 644 793 001). Максимальний лізис клітин-мішеней (- 100 95) був досягнутий шляхом інкубації клітин-мішеней з 195 Тритон Х-100. Мінімальний лізис (- 0 95) відповідав сумісної інкубації клітин-мішеней з ефекторними клітинами без біспецифічної конструкції. Результати продемонстрували, що ТСВ-антитіло до МС5Р являлось більше ефективним, ніж ТОВ-антитіло до МО5Р 1-41 Стго55МаБб, оскільки індукувало більш сильний цитоліз МСОС5Р-позитивних клітин- мішеней в обидва моменти часу і мало дію у відношенні всіх пухлинних клітин-мішеней (фіг. 2ЗА-3). Величини ЕСво, одержані в аналізі цитолізу, розраховані за допомогою програми
Зо СгарпРааРгізт5, представлені в таблиці 11.
Таблиця 11
Кількість копій МС5Р-рецептора і величини ЕСзхо (ПМ), що характеризують опосередкований Т- клітинами цитоліз що експресують МО5Р пухлинних клітин, індукований ТСВ-антитілом до МС5Р
АЗІЯ | 7 38705874... | 01777771 17717171717171снв1 (н.в. - не визначали)
Приклад 23
Підвищувальна регуляція СО25 і СО69 на ефекторних СО8:- і СОрА--клітинах після Т- клітинного цитолізу що експресують МО5Р пухлинних клітин, індукованого ТОВ-антитілом до
МС5Р і антитілом до МС5Р 1-41 СтоззМар
Активацію СО8:- ії СО4--Т-клітин після Т-клітинного цитолізу що експресують МСО5Р пухлинних клітин (АЗ75 і ММУ-3), опосередкованого ТСВ-антитілом до МО5Р і антитілом до
МОС5Р 1-1 Стго55Мар, оцінювали за допомогою ЕАСсСзЗ-аналізу, застосовуючи антитіла, які розпізнають маркери Т-клітинної активації, такі як СО25 (пізній маркер активації) і СО69 (ранній маркер активації). Антитіло і умови аналізу цитолізу практично відповідали описаним вище (приклад 22), при цьому застосовували такий самий діапазон концентрацій антитіла (0,01 пмМ-10
НМ в трьох повтореннях), співвідношення ЕТ, рівне 10:1, і тривалість інкубації 48 год.
Після інкубації РВМС переносили в круглодонний 96-луночний планшет, центрифугували при 350 х д протягом 5 хв і промивали двічі ЗФР, що містять 0,1 95 БСА. Фарбування поверхні у відношенні СО8 (ФИТЦ, антитіло до людського СО8, фірма ВО, Мо 555634), СО04 (РЕСсУу?7, антитіло до людського СО4, фірма ВО, Мо 557852), СОб69 (РЕ, антитіло до людського СОб69,
фірма Віоієдепа, Мо 310906) ії СО25 (АРС, антитіло до людського СЮО25, фірма ВО, Мо 555434) здійснювали згідно з рекомендаціям постачальника. Клітини промивали двічі, застосовуючи 150 мкл/лунку ЗФР, що містить 0,1 95 БСА, і фіксували протягом 15 хв при 4 "С, застосовуючи 100 мкл/лунку фіксувального буфера (фірма ВО, Мо 554655). Після центрифугування зразки ресуспендували в 200 мкл/лунку ЗФР, 0,1 95 БСА, який містив САРІ для виключення мертвих клітин при ГАСзЗ-аналізі. Зразки аналізували за допомогою пристрою фірми ВО БАС5 Еогпезза.
Результати продемонстрували, що ТСВ-антитіло до МС5Р індукувало сильну (4 мішеньспецифічну підвищувальну регуляцію маркерів активації (Сб025, СО69) на СО8:-Т- клітинах (фіг. 24А, Б (для АЗ75-клітин) і Д, Е (для ММ-3-клітин) і СО4--Т-клітинах (фіг. 248, Г (для
АЗ75-клітин) і Ж, З (для ММУ-3-клітин) після цитолізу. Аналогічно результатам, одержаним при вивченні цитолізу, активація Т-клітин оказалась більш сильною при застосуванні ТОВ-антитіла до МО5Р, ніж антитіла до МС5Р 1-1 Сто55Маб.
Приклад 24
Одержання ТСВ-молекули ОР47 (5 (241 Сго55тар-ідо РЗ290 ГАГА інвертована - "неспрямована ТСВ-молекула), що містить ОР47 5 як незв'язувальне антитіло і гуманізоване антитіло СН2527 як антитіло до СОЗ "Неспрямовану ТСВ-молекулу" застосовували як контролю в описаних вище експериментах.
Біспецифічне антитіло взаємодіяло з СОЗє, але не зв'язувалось з будь-яким іншим антигеном і тому не могло перехресно зшивати Т-клітини з будь-якими клітинами-мішенями (і відповідно не могло індукувати ніякий цитоліз). Тому зазначену молекулу застосовували як негативного контролю в аналізах для моніторингу будь-якої неспецифічної Т-клітинної активації.
ДНК-послідовності варіабельної ділянки важкого і легкого ланцюга субклонували в рамці зчитування або з константної ділянкою важкого ланцюга, або з константної ділянкою легкого ланцюга, попередньо вбудованої в відповідний реципієнтний експресійний вектор ссавців.
Експресія антитіла находилась під контролем промотору МРБМ, і вектор ніс синтетичну сигнальну полі(А)-послідовність на 3'-кінці кожної СО5. крім того, кожний вектор містив Огір- послідовність ЕВМ.
Молекулу одержували шляхом сумісної трансфекції клітин НЕК293-ЕВМА експресійними векторами ссавців із застосуванням поліетиленіміну (ПЕЇ). Клітини трансфектували
Зо відповідними експресійними векторами в співвідношенні 1:2:1:1 ("вектор важкого ланцюга
Ес(западина")": "вектор легкого ланцюга": "вектор легкого ланцюга Стго55Тар": "вектор важкого ланцюга Ес("виступ")-РарсСтозвтарб").
Для трансфекції клітини НЕК293 ЕВМА культивували в суспензії і безсироватковому культуральному середовищі СО СНО. Для одержання в 500-мілілітрових струшувальних колбах 400 мільйонів клітин НЕК293 ЕВМА висівали за 24 год. до трансфекції. Для трансфекції клітини центрифугували протягом 5 хв при 210 х 9, супернатант заміняли 20 мл попередньо нагрітого середовища СО СНО. Експресійні вектори змішували в 20 мл середовища СО СНО до досягнення кінцевої кількості ДНК, що складає 200 мкг. Після додавання 540 мкл розчину ПЕЇ суміш інтенсивно перемішували протягом 15 з і потім інкубували протягом 10 хв при кімнатній температурі. Потім клітини змішували з розчином ДНК/ПЕЇ, переносили в 500-мілілітрову колбу і інкубували протягом З год. при 37 "С в інкубаторі в атмосфері, що містить 5 95 СО». Після періоду інкубації додавали 160 мл середовища Е17 і клітини культивували протягом 24 год.
Через один день після трансфекції додавали 1 мМ вальпроєву кислоту і 7 95 ЕРееа 1 (фірма
Гопла). Після культивування протягом 7 днів супернатант збирали для очищення шляхом центрифугування протягом 15 хв при 210 х 9, розчин стерилізували фільтрацією (фільтр 0,22 мкм), доповнювали азидом натрію до кінцевої концентрації 0,01 95 (мас./об.) і витримували при 46.
Білки, що секретують очищали з супернатантів клітинних культур за допомогою афінної хроматографії на білку А. Супернатант вносили на колонку НіТгар РгоївіпА НР (СУ-5 мл, фірма
СЕ Неаїсаге), урівноважену 40 мл суміші, що містить 20 мМ фосфат натрію, 20 мМ цитрат натрію, 0,5М хлорид натрію, рН 7,5. Незв'язаний білок видаляли відмиванням, застосовуючи рівний щонайменше 10 об'ємам колонки об'єм суміші, що містить 20 мМ фосфат натрію, 20 мМ цитрат натрію, 0,5 М хлорид натрію, рН 7,5. Потрібний білок елюювали, застосовуючи градієнт об'ємом, рівним 20 об'ємам колонки, від 20 мМ цитрату натрію, 0,5 М хлориду натрію, рН 7,5 до 20 мМ цитрату натрію, 0,5 М хлориду натрію, рН 2,5. Розчин білка нейтралізували, додаючи 1/10 0,5 М фосфату натрію, рН 8. Потрібний білок концентрували і фільтрували перед внесенням на колонку Ні ода Супердекс 200 (фірма СЕ Неайвсаге), урівноважену розчином, що містять 20
ММ гістидин, 140 мМ хлорид натрію, рН 6,0.
Концентрацію білка в очищених білкових зразках визначали шляхом вимірювання оптичної щільності (ОП) при 280 нм, застосовуючи коефіцієнт молярної екстинкції, розрахований на основі амінокислотної послідовності.
Чистоту і молекулярну масу молекул аналізували за допомогою КЕ-ПААГ в присутності відновлювача і без нього. Застосовували систему Саїїрег ГавСпір ОХІ!І (фірма Саїрег
І їезсіепсе) згідно з інструкціями виробника. Для аналізу застосовували по 2 мкг зразка. Вміст агрегатів в зразках антитіла аналізували, застосовуючи колонку для аналітичної гель-фільтрації
ТеКаєї 53000 5МУМ ХІ (фірма То5зо!й) в рухомому буфері, що містить 25 мМ К»НРО», 125 мМ масі, 200 мМ моногідрохлорид І -аргініну, 0,02 95 (мас./об.) МаМз, рН 6,7, при 25 "С.
Таблиця 12
Узагальнення даних про одержання й очищення ТОВ-молекули ОР47 С15 . Титр Вихід Кількість агрегатів після о о о
Конструкція Імг/лі Гмг/лі 1-ої стадії очищення (95) НМУ (95 ЦІ ММ (9е|| Мономер (9
ТОВ-молекула
На фіг. 25 і в таблиці 13 представлені результати КЕ-ДСН-аналізу ТОВ-молекули ОР47 5 (2-41 Стозетар-Ідо РЗ3296 І АГА інвертована), що містить ОР47 5 як антитіло, яке не зв'язується і гуманізоване антитіло СН2527 як антитіло до СОЗ (ЗЕО ІЮ МО: 59, 60, 61 і 62).
Таблиця 13
Результати КЕ-ДСН-аналізу ТОВ-молекули ОРА4А7 15 11111111. | Пік | кда | Відповідний ланцюг
ТОВ-молекула ОР47 5, 4 165.22 Молекула з двома відсутніми легкими невідновлювальні умови (А) " ланцюгами 10020 | 181,35 )|Молекула з 1 відсутнім легким ланцюгом пол 190,58 Правильна молекула без М-зв'язаного глікозилювання 11111111. 4 | 198,98
ТОВ молекула ОРА7 О5, 1 27,86 | Легкий ланцюг ОРА7 С5 відновлювальні умови (Б) 11111112 35,74 | Легкий ланцюг писСнН2527 11111113 | 63,57 |РоСзападина» 11111114 119302 |РоСвистут)
Хоча вище винахід описано достатньо докладно за допомогою ілюстрацій і прикладів, наведених для цілей кращого його розуміння, опис і приклади не повинні розглядатися як обмежувальні об'єм винаходу. Всі процитовані в даному описі патентні й наукові публікації повністю включені у нього як посилання.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 РОШ ГЛІКАРТ АГ «1205 БІСПЕЦИФІЧНІ АНТИГЕНЗВ'ЯЗУВАЛЬНІ МОЛЕКУЛИ,
ЩО АКТИВУЮТЬ Т-КЛІТИНИ «1305 31447
Коо) «1505 ЕР 13156686.1 «1515 2013-02-26 «1605 122 «1705 РабепесІпПп, версія 3.5
«2105 1 «2115» 455 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» НС сор3З сн2527 (ун 3-23(12)) «4005 1 бі Маї біп Гей Гей бій бек сіу сбіу б1у Іїецпй Уаі сіп Рго б01у щу 1 5 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а Аза бек б1і1у Рпе ТПг Рпе бек ТПг Туг 20
Аза Меє Авп Тр Уаі Агуд біп Азїа Рго б1у Ппув с1у Гей бій Тер Уаї 25 зек Акд І1е Агуд бек Ппув Туг Авп Авп Туг Аїа ТПг Тук Туг Аза Авр бо зек Уаії Ппув б1у Акд Рпе ТПг І1е 5ег Агуд Авр Авр Бек Пув Авп ОТГ
Зо 65 70 75 80
Тецп Тук Гей сіп Меє Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа Уа1ї! Туг 85 90 95
З5
Тук Сув Уаі1 Акуд Нів біу Авп Рпе сіу Авп бБег Туг Уа1ї бек Тгр РПе 100 105 110 40
Аза Тук Тер біу біп б1у ТПг Гец Уаі ТПг Уаї бек Бек Аїа Бек ТЕПг 115 120 125 45 пув біу Рго Бек Уаі Рібе Рго Гей Аза Рго бек бек Пув бек ТПг 5ег 130 135 140 сбі1у б1у ТПпг Аза Аїа Гей сіу Сув Геш Уаі Ппув Авр Тук Робе Рго бій 50 145 150 155 160
Ркго Уаії ТіК Уаії бек Тер АвБп бек б1і1у А1ї1а Гей ТПг Бек сіу Уа1і1 Нів 165 170 175 55
ТПЕ Рпе Рго Аїа Уаї Гец бСіп бек бек біу Гец Тук бек Гей бек 5бег 180 185 190 60
Уаї Уаї ТПг Уа1ї Рго Бек бек Бек Гей с1іу ТПг сбіп ТПг Тук І1е Сув
195 200 205
АвпоУаі1 Авп о Нів Ггув Рго Бек Авп о ТПг Гуз УМаії Авр Ппув Ппув Уа1 сіц 210 215 220
Ркго Ппув бек Сув Авр Гув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Суб Рго Аїа Рго 225 230 235 240 біш Гешп Гей сіу с1у Рго Бек Уаі Рпе Гей Робе Рго Рго Пув Рго Гу 245 250 255
Авр ТПг Ггец Месє І1е бек Агуд ТПг Рго бі Уа1 ТПг Сув Уаї Уа1ї Уаї 260 265 270
Авр Уаії бек Нів біц Авр Рго біц Уаії Пув Робе АБп Тер Туг Уа1! Авр 275 280 285 сбі1у Маії бій Уаії Нів Авп Аїа Ппув ТПг пув Рго Агд б1іц бій сбіп Туг 290 295 300
АвпобБек ТПг Тут Агуд Уаії Уаї бек Уаії Іецйп ТПг Уаії Гей Нів сбіп Авр 305 310 315 320
Зо
ТЕр гейш Авп о сіу пув біцш Тук Гув Сув Ппув Уа1і Бек Авп Гув Аїа Іей 325 330 335
З5
Рго Аїа Рго І1е біцп Гув ТПг І1е бек ув Аї1а пув с1у біп Рго Агд 340 345 350 бій Рго біп УМаї Тук ТБг Гей Рго Рго Бек Агд Авр бій ІГецй ТПкг Гув 355 3З6о 365
Авпобіп Уаії бек Іецп ТПг Сув Гец Уаії Гуз б1у Рпе Туг Рго Бек Авр 370 375 380
І1їе Аїа Уаї біцш Ткгр бій бек Авп о біу біп Рго бій Ап Авп о Тук Гув 385 390 395 400
ТПЕ ТПЕ Ркго Рго Уаї Гец Авр бек Авр біу бек РПе РіПе Іец Туг 5ег 405 410 415
Тпув Гей ТПг Уаі Авр Гпув Бек Агд Тгр біп біп с1у Авп Уаї Ріре 5ег 420 425 430 (516) Сув бек Уаї Меє Нів сій Аза Гей Нів АБп о Нів Туг ТПг біп Ппув 5ег 435 440 445
Тецп бек Гей бек Рго с1У Гув 450 455 «2105 2 «2115» 215 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» с сор3 сн2527 (У. 7-46(13)) «4005 2 біп А1ї1а Уаї Уаі ТпПг біп бій Рго Бек Гей ТПг Уа1 бек Рго с1у 01У 1 5 10 15
ТПг Уа1 ТПкг Гей ТПг Сув біу Бек бек ТПг бі1у Аї1а Уа1ії ТПг ТпПг 5ег 20 25 30
Авп оТук Аза Авп Тгр Уаі сіп біц пув Рго біу сбіп Аїа Рпе Акд с1Уу
Тецп І1ї1е с1у с1у ТПг Авп пув Агуд Аза Рго сіу ТПг Рго Аїа Агд РБПе
Зо 50 з9 бо зек сіу бек ІТец ІТец б1у сі1у пуб Аїа Аїа Іїей ТПг Гей бек С1у А1а 65 70 75 80
З5 біп Рго бій Авр бій Аїа бій Туг Тук Сув Аїа Гей Тер Тукг бек Авп 85 90 95 40
Тецп Тер Уаії Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гей ТПг Уаі1! Іеєц сС1у сбіп Рго 100 105 110 45 пув Аїа Аїа Рго бек Уа1і ТПг Гей Рібе Рго Рго бек бек бій сій Гей 115 120 125 біп Аза АвБп о Гпув Аза ТПг Ггецй Уаії Сув Гей І1е бек Авр Рпе Туг Рго 130 135 140 сб1у А1ї1а Уаї ТПпг Уаі Аїа Тер пув Аза Авр бек бек Рго Уаї Ктув5 А1а 145 150 155 160 сбі1у Маї бій ТП ТпПг ТБбкг Рго бек Ппув біп бБег Авп АБп Гув Туг Аїа 165 170 175 60
А1їа бек бек Тук Іец бек Гей ТПг Рго б1іц біп Тер Ппув Бек Нів Агд
180 185 190 зек Тук бек Сув біп Маії ТПпг Нів сі сіу Бек ТПг Уаї сбіц пув ТПг 195 200 205
Ууаї Аза Рго ТПг бій Сув бБег 210 215 «2105 З «2115» 125 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» УНН сСр3З сн2527 (ун 3-23(12)) «4005 З бі Маї біп Гей Гей бі бек сіу сіу с1у Гей Уаі1 сіп Рго с1у 01У 1 5 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а Аза бек б1і1у Рпе ТПг Рпе бек ТПг Туг 20 25 30
Зо А1їа Меє Авп Тер Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу Гув сіу Геч сі Тгр Уаї зек Агуд І1е Агд бек Гув Туг Авп АБп Туг Аза ТПг Туг Туг Аїа Авр
З5 50 55 бо зек Уаії Ппув б1у Акд Рпе ТПг І1е 5ег Агуд Авр Авр Бек Пув Авп ОТГ 65 70 75 80 40
Тецп Тук Гей сіп Меє Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа Уа1ї! Туг 85 90 95 45
Тук Сув Уаі1 Акуд Нів біу Авп Рпе сіу Авп бБег Туг Уа1ї бек Тгр РПе 100 105 110
А1їа Тук Тер б1у біп с1іу ТпПК Гецп Уа1і ТБбг Уаї бек 5екг 115 120 125 «2105 4 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» нНСсрв1 ср3 сн2527 (УН 3-23(12))
«4005 4
ТПг Ту Аїа Меє Авп 1 5 «2105 Мм5 «2115 19 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» нНСсрв2 сор3 сн2527 (УНН 3-23(12)) «4005 5
Акуд І1е Агуд бек їгув Тук АБп Авп о Туг Аза ТПг Туг Туг Аїа Авр 5ег 1 5 10 15
Уаї гув Щ1У «2105 6 «2115 14 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність
Зо «2205 «223» нНСсрвЗ3 ср3 сн2527 (УНН 3-23(12)) «4005 6
Нів б1у Авп Рібпе сіу АвБп бек Туг Уа! бек Ткгр Рпбе А1їа Туг 1 5 10 «2105 7 «211» 109 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» УТ сСр3З сн2527 (Мт. 7-46(13)) «4005 7 біп А1ї1а Уаї Уаі ТпПг біп бій Рго Бек Гей ТПг Уа1 бек Рго с1у 01У 1 в) 10 15
ТПг Уа1 ТПкг Гей ТПг Сув біу Бек бек ТПг бі1у Аї1а Уа1ії ТПг ТпПг 5ег 20 25 30
Авп оТуг Аза АвБп о Тгр Уаі біп біц Гпув Рго б1у б1іп Аїа Рпе Агд 0Щ1У 35 40 45 60
Тецп І1ї1е с1у с1у ТПг Авп пув Агуд Аза Рго сіу ТПг Рго Аїа Агд РБПе
50 55 бо зек сіу бек ІТец Іец б1у с1у пуб Аїа Аза їей ТПг Гей бек сС1у Аї1а 65 70 75 80 біп Рго бій Авр бій Аїа бій Туг Тук Сув Аїа Гей Тер Тукг бек Авп 85 90 95
Тецп Тер Уаії Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гей ТПг Уаі1ї Іец 100 105 «2105 8 «2115 14 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» п1Ссрв1 сСр3 сн2527 (У, 7-46(13)) «4005 8 бі1іу бек бек ТПг с1і1у Аїа Уа1 ТПг ТПг бек Авп Туг Аї1а Авп 1 5 10
Зо «2105 39 «2115 7 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» 1Ссрв2 сСор3З сн2527 (У, 7-46(13)) «4005 19 сі1у ТК АБп о Гув Агд Аза Рго 1 5 «2105 10 «2115 9 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» 1Ссрв3З сСр3З сн2527 (У, 7-46(13)) «4005 10
Аза гей Тер Туг Бек АвБп Гей Тгр Уаї 1 5 «2105 11 «2115 442 бо «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність
«223» НС МОС5Р М4-3 (С1)5 «4005 11 біп Маії біп Гей біп бій бек сіу Ркго біу Гец Уаї Гув Рго бек сіп 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гей ТПг Сув ТПг о Уаї бек сіу с1іу Бек І1е ТПг бБег 01Уу 20 25 30
Тук Тук Тер Авп Тер І1е Агуд сбіп Ні Рго с1у Пув с1у Гецп сі Ткгр 35 40 45
ІТІе сі1у Тук І1е ТПг Рпе Авр сіу Бек Авп АвБп Туг Авп Рго бек Іец 50 з9 бо
Ппув век Агуд Уаі ТПг Іїе Бек Агуд Авр ТПг бек Гпув Авп о біп Робе б5ег 65 70 75 80
Тецшп Гпув Гей бек Бек Уаі1 ТПг Аза Аза Ар ТПг Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Зо
Аза Авр Ріпе Авр Туг Тгр б1у біп б1і1у ТПг Гей Уа1і ТПг Уаі1і Бек 5ег 100 105 110
А1їа бек ТПг пув б1іу Рго бек Маі РПпе Рго Іїей Аїа Рго бек бек Тув 115 120 125 зек ТПг бек біу бі1у ТПпг Аза Аїа Іец б1у Сув Гей Уа1і Гпув Авр Туг 130 135 140
Рпе Рго біц Ркго Уаі! ТПг Уаї бек Тгр АБп бек сі1у Аїа Гей ТПг 5ег 145 150 155 160 сбі1у Маї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаі Гей біп бек бек сіу Гец Туг вег 165 170 175
Тецп бек бек Уаі Уа1і ТПг Уа1 Рго Бек Бек бек Гей с1іу ТПг біп Тс 180 185 190
Тук Іїе Сув Авп УМаі! Авп оНів пуб Рго бек Авп ТПг пуб Уаї Авр Тувг 195 200 205 пув Маї бій Рго Ппув Бек Сув Авр ГПув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув (516) 210 215 220
Рго Аїа Рго біц Іецй Іїецп сіу біу Ркго бек Уаі Рпе Гей Рпе Рго Рго 225 230 235 240
Тув Ркго Гпув Авр ТПг Ггеш Меє І1їе Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї Тс Сув 245 250 255
Уаї Уаї Маії Авр Уа1ї бек Нів бій Авр Рго сій Уа! Ппув Роре Авп Ткгр 260 265 270
Тук Уаі1 Авр сіу Уаії біц Уаії Нів Авп Аїа пуб ТПг Гув Рго Агд с1ци 275 280 285 бі біп Тук Авп Бек ТПг Туг Агуд Уаі Уа1і Бек Уа1 Гей ТПг Уаї Іей 290 295 300
Нів біп Авр Тер Гец Авп біу пув сій Тук Ппув Сув КГув Уаї бек Авп 305 310 315 320 пуб Аза тей Рго Аза Рго Іїе сій Ппув ТПг Іїе Бек пув Аїа пув 01У 325 330 335
Зо біп Рго Агкуд бій Рго біп Ма! Тук ТБПг Гей Рго Рго бек Агуд АБр б1ц 340 345 350 теп ТпЕгЕ Гув Авп о біп Уа1! бек Гей ТПг Сув Гей Уа1! пув с1у Рое Туг
З5 355 360 365
Рго бБекг Авр І1е Аї1а Уаії бій Тгр біц бек АБп с1у біп Рго бій Авп 370 375 380
АвпоТук пув ТПг ТБЕ Рго Рго Уаії Іец Авр бек Авр с1іу Бек Рпе РБПе 385 390 395 400
Тецп Тук бек Ппув Гей ТПг Уаі1 Авр Ппув Бек Агд Тер сбіп біп с1у Авп 405 410 415
Уа1 Рре бек Сув бек Уа1! Мес Нів сіц Аза Гей Нів АвБп о Нів Тук ТПг 420 425 430 біп Ггув бек Гей бек Гей бек Рго с1У Гув 435 440 «2105 12 «2115» 214 60 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність
«223» ІС МС5БР МІ2 (03) «4005 12
Авр І1е сіп Месє ТіПг біп бек Рго бек бек ІГецйп бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 1 5 10 15
Авр Акуд Уаї ТПг І1е Тпг Сув Агуд Аїа бек біп с1у І1їе Агд Авп Туг 20 25 30
Тем АвБп оТгр Тук біп біп Гпув Ркго сбіу Ппув Аза Рго ГУу5 Іецй Гей Те 35 40 45
Тук Тук ТПг бек бек Іец Нів бек біу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех 0Щ1У 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг Авр Тук ТПг Іецй ТПг І11е Бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аїа ТПг Тукг Тук Сув біп біп Туг бек Аїа Гей Рго Тгр 85 90 95
Зо
ТПЕ Рпе сіу сіп сіу ТБг Гуз Уа1! сіц І1е гув5 Агд ТПпг Уаі Аза Аза 100 105 110
Рго Бек Уа1і Рібе І1е Рбе Рго Рго бек Авр бій сбіп Гей Ппув бек 01Уу 115 120 125
ТПг Аїа бек Уаї Уаї Сув Іїец Гей Авп Авп Робе Туг Рго Агд сій Аїа 130 135 140 пув Маї біп Тер пув Уаі Авр АвБп Аза Гей біп бек с1у Авп бек біп 145 150 155 160 бі бек Уаії ТП бі біп Авр бек Пув Авр бек ТПг Тукг бек Іец 5ег 165 170 175 зек ТПг Гец ТПг Іец бек Гпув Аза Авр Тук біп Ппув Нів Ппув Уа1 Туг 180 185 190
А1їа Сув сі Ма! ТПг Ні сіп с1іу Гей бек бек Рго Уа1! ТПг ГТув бег 195 200 205
Рпе Авп Агд сбіу б1іц Сув 60 210
«2105 13 «2115 112 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» УН МоО5Р М4-3 (С1) «4005 13 біп Маії біп Гей біп бій бек сіу Ркго біу Гец Уаї Гув Рго бек сіп 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гей ТПг Сув ТПг о Уаї бек сіу с1іу Бек І1е ТПг бБег 01Уу 20 Тук Тук Тер Авп Тер І1е Агуд сбіп Ні Рго с1у Пув с1у Гецп сі Ткгр
ІТІе сі1у Тук І1е ТП Рпре Авр сіу Бек Авп Ап Туг Авп Рго бек Іей 25 50 з9 бо
Ппув век Агуд Уаі ТПг Іїе Бек Агуд Авр ТПг бек Гпув Авп о біп Робе б5ег 65 70 75 80
Зо
Тецшп Гпув Гей бек Бек Уаі1і! ТПг Аза Аза АвБр ТПг Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
З5
Аза Авр Ріпе Авр Туг Тгр б1у біп б1і1у ТПг Гей Уа1і ТПг Уаі1і Бек 5ег 100 105 110 40 «2105 14 «2115 6 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність 45 «2205 «223» НСрВ1 МО5БР М4-3 (С1) «4005 14
Зек б1у Тук Тук Тер Авп 1 5 «2105 15 «2115 16 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 (516) «223» НСРВ2 МО5БР М4-3 (С1)
«4005 15
Тук Іїе ТПкг Рібе Авр біу Бек Авп Авп Тут Авп о Рго бек ТІецп Гпув бБег 1 5 10 15 «2105 16 «2115 З «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» НСРВЗ МСО5БР М4-3 (С1) «4005 16
Рпе Авр Туг 1 «2105 17 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» МІ МС5БР МІ2 (03) «4005 17
Зо
Авр І1е сіп Месє ТіПг біп бек Рго бек бек ІГецйп бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 1 5 10 15
Авр Агуд Уаі ТПг І1е ТПг Сув Акуд Азїа бек біп сб1у І1е Аг9д АвБп Туг 20 25 30
Тец АБп Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аїа Рго пуб Гей Іецй І1е 35 40 45
Тук Тук ТПг бек бек Іец Нів бек біу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех 0Щ1У 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг Авр Тук ТПг Іецй ТПг І11е Бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аїа ТПг Тукг Тук Сув біп біп Туг бек Аїа Гей Рго Тгр 85 90 95
ТПЕ Рпе с1у біп сб1іу ТПг пув УМаї сій І1е Гув 100 105 «2105 18 60 «2115 11 «212» РЕТ
«2135 Штучна послідовність «223» І1СсСОВ1 МС5Р МІ2 (03) «4005 18
Акуд Аза бек біп сбіу І1е Агд Авп Туг ГІец Авп 1 5 10 «2105 19 «2115 7 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» І1СсСО0В2 МС5Р МІ2 (03) «4005 19
Тук ТПг Бек бек Гец Нів 5ег 1 5 «2105 20 «2115 19 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність
Зо «2205 «223» І1СОВЗ МС5Р МІ2 (03) «4005 20
З5 біп бі1іп Ту Бек Аза Гей Рго Тгр ТПг 1 5 40 «2105 21 «2115» 451 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність 45 «2205 «223» НС СЕА СНІАТА 98-99 «4005 21 50 сіп Уаії біп Гецп Уаі сіп бек бі1у Аї1а сіш Уаї пув Гув Рго с1у А1їа 1 5 10 15 зек Уаії Ппув Уаії бек Сув Гув Аїа Бек с1іу Тук ТПг Робе ТПг біц РБе 55 20 25 30 бі1у Меє АвБп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу біп с1іу Гец біц Тгр Меє 60 б1у Тер І1ї1е АвБп ТПг пув ТПг с1іу бі Аїа ТПг Тук Уаї біц бі РБе 50 55 бо пув б1у Акуд Маії ТПг Рбе ТПг ТБг Авр ТБПг бек ТПг бек ТПг Аза Туг 65 70 75 80
Меє бій гей Агуд Бек Гей Агуд бек Авр Авр ТПг Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Акуд Тер Авр Робе Аза Тук Туг Уаі біцш Азї1а Меє Авр Тує Тер 01У 100 105 110 біп б1у ТПг ТпПг оУаї ТПг Уа1 бек Бек Аїа бек ТПг Ппув с1у Рго 5ег 115 120 125
Уаї Рпе Рго гей Аза Рго бек Бек Ппув бек ТПг бек б1у б1у ТПг Аїа 130 135 140
А1їа Ггеч с1у Сув Гецш Маії Ппув Авр Тук Рібе Рго бій Рго Уа1і ТіПг Уаї 145 150 155 160 зек Тер Авп бек біу А1їа Гей ТПг бек бі1у Уаї Нів ТПг Рпе Рго Аї1а
Зо 165 170 175
Уаї Гей сбіп Бек Бек сіу Гей Тук Бек Гей бек бек Уаї Уаі! ТіПг Уаї 180 185 190
З5
Рго Бек бек бек ІГец б1у ТПг біп ТПг Тук Іїе Сув Авп Уа1і Авп Нів 195 200 205
Тув Ркго Бек Авп ТПг Ппув Уа1 Авр Гпув Ппув Уа1! сій Ркго пув бек Сув 210 215 220
Авр Ппув ТПг Нів Тк Суб Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Гей Іеч С1Уу 225 230 235 240 б1у Рко Бек Уаі Рпе Гей Рпе Рго Рго Ппув Рго Пув Авр ТПг Іец Меє 245 250 255
ІТ1е Бек Агд ТПг Рго бій Уаі ТП Сув Уаї Уаії Уаі1і Авр Уа1і! бек Нів 260 265 270 бі Авр Рго сій Уаі Ппув Рпе Авп Тгр Туг Уаі1 Авр сіу Уаї сіц Уаї 275 280 285 60
Нів Авп Аза Ппув ТПг пув Рго Акд бій бі біп Туг Авп бек ТПг Туг
290 295 300
Акуд Уа1 Уаї бек Уаї Іец ТПг Уаї Іец Ні біп Авр Тгр Гей А5Бп 1У 305 310 315 320
Тпув біш Тук Ппув Сув Ппув Уа1 Бек Авп пув Аза Гей Рго Аза Рго І1е 325 330 335 біш ув ТПпг І1їе Бек Ппув Аза Ппув с1іу біп Рго Агд біц Рго Сбіп Уаї 340 345 350
Тук ТпПкЕ Гей Рго Рго Бек Агуд Авр біц ІТецй ТПг Гув Авп біп Уа1 5ег 355 3З6о 365
Тем ТПг Сув Гецп Уаї Ппув біу Рбе Туг Рго Бек Авр І1е Аїа Уаї сі1ц 370 375 380
ТЕр бі Бек Авп сіу біп Рго бій Авп Авп Туг Тув ТПг ТПкг Рго Рго 385 390 395 400
Уаї Гей Авр Бек Авр сіу бек Рпе РпПе Гей Тук бек пув Гей ТПг Уаї 405 410 415
Зо
Авр пув Бек Агд Тгр біп бі1іп б1іу Авп Уа! Рпе бек Сув бек Уа! Меє 420 425 430
З5
Нів біц Аїа Гей Нібв Авп о Нів Тук ТПг біп Ппув бек Тецй бек Іец 5бег 435 440 445
Рго о1У ТГув 450 «2105 22 «2115» 215 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» ІС СЕА 2Р1 «4005 щД 22
Авр І1е сіп Месє ТіПг біп бек Рго бек бек ІГецйп бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 1 в) 10 15
Авр Акуд Уаї ТБПг І1е Тпг Сув пув Аза бек Аїа Аза Уа1і с1і1у ТПг Туг 20 25 30 60
Ууаї Аза Тер Тук біп сбіп пув Рго сіу Пув Аїа Ркго Гув Іеп Гей Ше 35 40 45
Тук Бек Аїа бек Туг Агуд пув Акуд біу Уаї Рго бек Акуд Робе бехг 1У 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е Бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аза ТПг Туг Тук Сув Нів біп Тук Тук ТПг Тук Рго Іец 85 90 95
Рпе ТПг Рре сіу біп б1у ТПпг гув ІТец бій І1ї1е Гпув Агуд ТПг Уа1 Аї1а 100 105 110
Аза Ркго бек Уа! Рпе І1е Рпе Рго Рго бек Авр бій сбіп Гей Ппув б5ег 115 120 125 сіу ТБг АТїа бек Уаії Уа1ї Сув Гей Гей АБп Авп Рпе Туг Рго Агд сі1ц 130 135 140
А1їа пув Уаії біп Тер Гуз Маї Авр АБп Азїа Тецп біп бек с1у Авп б5ег
Зо 145 150 155 160 біп бій бек Уаі ТП біш біп Авр бек Пув Авр бек ТПг Тукг бек Ієей 165 170 175
З5 зек Бек ТПг Іец ТПг ІГецйп бек їув Аза Авр Тук бій Ппув Нів Ппув Уаї 180 185 190
Тук Аїа Сув сій Уаї ТПг Ні сіп сіу Пец бек бек Ркго Уа1і ТПг Гув 195 200 205 зек Рпе Авп Агуд б1у біц Сув 210 215 «2105 23 «211» 121 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» УН СЕА СНІАТА 98-99 «4005 23 біп УМаії біп Гей Уаі біп бек сі1у Аїа біш Уа1 Ппув пув Рго с1у А1а 60 1 в) 10 15 зек Уаії Ппув Уаії бек Сув Гув Аїа бек біу Тук ТПг Рпе ТПг сій Ре 20 25 30 бі1у Меє АвБп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу біп с1іу Гец біц Тгр Меє 35 40 45 с1у Тер І1е АвБп ТПг о пув ТБг біу бій Аза ТПг Туєк Уа1і1 сб1іц сі РБе 50 55 бо пув б1у Акуд Уа1і ТПг Рпе ТПг ТПг Авр о ТПг бек ТПг бек ТПг Аїа Туг 65 70 75 80
Меє бій гей Агуд Бек Гей Агуд Бек Авр Авр ТПг Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Акуд Тер Авр Робе Аза Тук Туг Уаі біцш Аза Меє Авр Тугє Тегр с1У 100 105 110 біп б1у ТПг ТпПг Уа1і ТПг Уа1і бек 5ег 115 120
Зо «2105 124 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» НСОВ1 СЕА СНІАТА 98-99 «4005 24 січ Рбе с1у Меє Авп 1 5 «2105 25 «2115 17 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» НСРВ2 СЕА СНІАТА 98-99 «4005 25
ТЕр Іїе Авп ТПг пув ТПг бі1іу бій Аза ТБПг Ту Уаії бій бій Рпе Гув 1 в) 10 15 сову 60
«2105 26 «2115 12 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» НСРВЗ СЕА СНІАТА 98-99 «4005 26
ТЕр Авр Рпе Аїа Тукг Туг Уаі сій Аїа Меєсє Авр Туг 1 5 10 «2105 27 «211» 108 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» МІ СЕА 2Р1 «4005 Д 27
Авр чІ1е сіп Меє ТПг сбіп бек Рго бек бек ІТецй бек Аза бек Уа1і с1Уу 1 5 10 15
Авр Акуд Уаї ТіПг І1е Тс Сув пув Азїа Бек Аїа Аза Уа1і с1і1у ТПг Туг
Зо 20 25 30
Ууаї Аза Тер Тук біп сбіп пув Рго сіу Пув Аїа Ркго Гув Іеп Гей Ше
З5
Тук Бек АТїа бек Тут Агд їув Агуд сіу Уаі Рго Бек Акд Ріе бег 01Уу бо 40 зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е Бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 45 сі Авр Рпе Аза ТПг Тугк Тук Сув Нів біп Тук Тук ТПг Тук Рго Гей 85 90 95
Рпе ТПг Рре бі1у біп с1у ТПг Гув ІТеп бій І1е Гув 50 100 105 «2105 28 «2115 11 55 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» І1СОВ1 СЕА 2кЕ1 60 «4005 28 пу Аза бек Аза Аїа Уа1 сіу ТПг Тук Уа1 А1а 1 5 10 «2105 29 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» І1СО0В2 СЕА 2кЕ1 «4005 29 зек Аїа бек Туг Агд Гув Агд 1 5 «2105 30 «2115 10 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» ІСОРВЗ СЕА 2кЕ1 «4005 30
Зо Нів біп Тук Тук ТПг Тук Рго Гей Рпе ТЕПг 1 5 10 «2105 31
З5 «2115 111 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 40 «223» УТ сСр3 сн2527 (У 7-43(11)) «4005 31 біп Тпг Уаї Уаі ТпПг біп бій Рго Бек Гей ТПг Уа1 бек Рго с1у 01У 45 1 в) 10 15
ТПг Уа1 ТПкг Ггец ТПг Сув бі1у бек Бек ТПг с1у Аїа Уа1! ТБПг ТіПг 5ег 20 25 30 50
Авп оТуг Аза АвБп о Тгр Уаі біп біп Гпув Рго б1у біп Аза Рго Агд Щ1У 55
Тецп І1ї1е с1у с1у ТПг Ап пув Агуд Азїа Рго біу ТПг Рго А1ї1а Аг РІГе бо (516) зек сіу бек Тейп Гецп сіу сіу пув Аїа Аїа Гей ТПг Гей бек сіу Уаї 65 70 75 80 біп Рго бій Авр бій Аїа бій Тук Тук Сув Аїа Гей Тер Тукг бек Авп 85 90 95
Тецп Тер Уаі Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гей ТПг Уаї Ггец бек 5ег 100 105 110 «2105 32 «2115» 125 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» УНН Ср3 СН2527 (УНсопроА495У93А) «4005 32 бі Маї біп Гей Гей бі бек сіу сіу с1у Гей Уаі1 сіп Рго с1у 01У 1 5 10 15 зек Геп Акуд Гей бек Сув Аїа Аза бек с1у Рпе ТПг Рібе бек ТПгЕ Туг 20 25 30
Аза Меє Авп Тр Уаі Агуд біп Азїа Рго б1у Ппув с1у Гей бій Тер Уаї
Зо 35 40 45 зек Агуд І1е Агд бек Гув Тугк Авп Авп Туг Аза ТПг Туг Туг Аїа Авр 50 55 бо
З5 зек Уаії Ппув б1у Акд Рпе ТПг І1е 5ег Агуд Авр Авр Бек Пув Авп ОТГ 65 70 75 80
Тецп Тук Гей сіп Меє Авзп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа Уа1ї! Туг 85 90 95
Тук Сув Аїа Акуд Нів с1у Авп Рпе сбіу Авп бек Туг Уаї Бек Тер Ріє 100 105 110
А1їа Тук Тер біу біп б1у ТПг Гец Уаі! ТПг Уаї бек 5бег 115 120 125 «2105 33 «2115» 125 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» УН Ср3 СН2527 (УНсопроА495У93АВЗ9АК) 60 «4005 33 бі Маї біп Гей Гей бій бек сіу сбіу б1у Іїецпй Уаі сіп Рго б01у щу 1 5 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а Аза бек б1і1у Рпе ТПг Рпе бек ТПг Туг 20 25 30
А1їа Меє Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу Гпув сіу Геч сі Тгр Уаї 35 40 45 зек Агуд І1е Агд бек Гув Туг Авп АБп Туг Аза ТПг Туг Туг Аїа Авр 50 з9 бо зек Уаії Ппув б1у Акд Рпе ТПг І1е 5ег Агуд Авр Авр Бек Пув Авп ОТГ 65 70 75 80
Тецп Тук Гей сіп Меє Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа Уа1ї! Туг 85 90 95
Тук Сув Аїа Ппув Нів біу Авп Рпе сіу Авп бБег Туг Уа1ї бек Тгр РПе 100 105 110
Зо А1їа Тук Тер б1у біп с1іу ТпПК Гецп Уа1і ТБбг Уаї бек 5екг 115 120 125 «2105 34
З5 «2115 112 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» 40 «223» УнН МоО5Р М4-3 (06) «4005 34 біп Маії біп Гей біп бій бек сіу Ркго біу Гец Уаї Гув Рго бек сіп 45 1 в) 10 15
ТПЕ Гей бек Гей ТПг Сув ТПг о Уаї бек сіу с1іу Бек І1е ТПг бБег 01Уу 20 25 30 50
Тук Тук Тер Авп Тер І1е Агд сіп Нів Рго сбіу Гув б1у Те сі Тгр 55
ІТ1е сі1у Тук І1е ТПг Рпе Авр с1іу Ппув Авп Ап Туг Авп Рго бек Іей бо (516) пув бек Агуд Уаії ТПг І1їе бек Акуд Авр ТПг бек Пув Авп біп Роре 5ег 65 70 75 80
Тецшп Гпув Гей бек Бек Уаі ТПг Аза Аза Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Авр Ріпе Авр Туг Тгр б1у біп б1і1у ТПг Гей Уа1і ТПг Уаі1і Бек 5ег 100 105 110 «2105 35 «2115 15 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» НСРВ2 МО5БР М4-3 (06) «4005 35
ІТІе ТБЕ РрБе Авр б1у Гув АвБп Авп о Тугк Авп о Рго Бек Гей Ппув б5ег 1 5 10 15 «2105 36 «2115 112 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність
Зо «2205 «223» УН МО5Р М4-3 (А7) «4005 36 сіп Уаії біп Геп сіп бій бек б1іу Рго сб1у Гецп Уаії Пув Рго бек сіп 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гей ТПг Сув ТПг Уаї бек біу б1у бек І1е ТПг АвБр 01Уу 20 25 30
Тук Тук Тер Авп Тер І1е Агд сіп Нів Рго сбіу Гув б1у Те сі Тгр 35 40 45
І1е сі1у Тук І1е ТПг Рпре Авр б1у Агд АБп АБп о Туг Авп о Рго бек Іей бо 50
Ппув век Агуд Уаі ТПг Іїе Бек Агуд Авр ТПг бек Гпув Авп о біп Робе б5ег 65 70 75 80 55 Пес Ппув Гей бек бек Уа! ТПг Аза Аза Авр ТБПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Авр Ріпе Авр Туг Тгр б1у біп б1і1у ТПг Гей Уа1і ТПг Уаі1і Бек 5ег 60 100 105 110
«2105 37 «2115 6 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» НСРВ1 МСО5БР М4-3 (А7) «4005 37
Авр с1у Тук Тук Тгр Авп 1 5 «2105 38 «2115 15 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» НСРВ2 МСО5Р М4-3 (А7) «4005 38
ІТІе ТБг Рре Авр б1у Агуд АБп о Авп о Туг Авп Рго бек Гец Гпув вег 1 5 10 15
Зо «2105 39 «2115 112 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» УнН МоО5Р М4-3 (В7) «4005 39 сіп Уаі біп Гецп сіп бій бек сб1у Рго с1іу Геп МУМа1! Ппув Рго бек сіп 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гей ТПг Сув ТПг о Уаї бек сіу с1іу Бек І1е ТПг бБег 01Уу 20 25 30
Тук Тук Тер Авп Тгр І1е Агд сіп Нів Рго сбіу Ппув с1у Гей сій Тгр 35 40 45
ІТІе сі1у Тук І1е ТПг Рпе Авр б1іу І1е АБп АвБп о Туг Авп Рго бек Іец 50 55 бо
Ппув век Агуд Уаі ТПг Іїе Бек Агуд Авр ТПг бек їув АвБп о біп Рпе 5ег 65 70 75 80 (516) Пес Ппув Гей бек бек Уа! ТПг Аза Аза Авр ТПг Аїа Уа1ї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Авр Рпе Авр Туг Тгр б1у біп сіу ТПг Ггеш Уа1 ТПг Уаї бек 5ег 100 105 110 «2105 40 «2115 15 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» НСРВ2 МО5БР М4-3 (87) «4005 40
ІТІе ТБг РрБе Авр б1у І1е АБп АвБп о Туг АвБп о Рго бБег Гец Гпув бег 1 5 10 15 «2105 41 «2115 112 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» УнН МоО5Р М4-3 (В8) «4005 41
Зо біп Маії біп Гей біп бій бек сіу Ркго біу Гец Уаї Гув Рго бек сіп 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гей ТПг Сув ТПг о Уаії бек сі1у сіу бек І1е ТБПг Бех Щ1Уу 20 25 30
Тук Тук Тер Авп Тер І1е Агд сіп Нів Рго сбіу Гув б1у Те сі Тгр 35 40 45
ІТІе сі1у Тук І1е ТПг Рпе Авр б1у Агд АБп АБп о Туг Авп Рго бек Іец 50 55 бо
Ппув век Агуд Уаі ТПг Іїе Бек Агуд Авр ТПг Бек Гпув Авп о біп Рое 5ег 65 70 75 80
Тецшп Гпув Гей бек Бек Уаі1і! ТПг Аза Аза Ар ТПг Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
А1а Авр Рпе Авр Туг Тер с1іу біп с1іу ТБг Гей Уа! ТрПг Уаї бек 5ег 100 105 110 «2105 42 60 «2115 112 «212» РЕТ
«2135 Штучна послідовність «223» УН МС5БР М4А-3 «4005 42 біп Маії біп Гей біп бій бек сіу Ркго біу Гец Уаї Гув Рго бек сіп 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гей ТПг Сув ТПг о Уаї бек сіу с1іу Бек І1е ТПг бБег 01Уу 20 25 30
Тук Тук Тер Авп Тер І1е Агд сіп Нів Рго сбіу Гув б1у Те сі Тгр 35 40 45
Іїе с1у Тук І1їе ТПг Тук Авр сбіу бек Авп Авп о Тук Авп Рго бек Іецй 50 55 бо
Ппув век Агуд Уаі ТПг Іїе Бек Агуд Авр ТПг Бек Гпув Авп о біп Робе 5ег 65 70 75 80
Тецшп Гпув Гей бек Бек Уаі1і! ТПг Аза Аза Ар ТПг Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Зо
Аза Авр Рпе Авр Туг Тгр б1у біп сіу ТПг ІТецйп Уа1ї ТПг Уаї бек 5ег 100 105 110
З5 «2105 43 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» МІ МС5БР МІ2 (ВЕ10) «4005 43
Авр І1е сіп Месє ТіПг біп бек Рго бек бек ІГецйп бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 1 5 10 15
Авр Агуд Уаі ТПг І1е ТПг Сув Агуд Аїа бек Туг сб1у І1е Агуд с1і1у Туг 20 25 30
Тец АБп Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аїа Рго пуб Гей Іецй І1е 35 40 45
Тук Тук ТПг бек бек Іец Нів бек біу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех 0Щ1У 50 55 бо 60 зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1е Бек Бек Гей біп Рго 65 70 75 80 сі Авр Рпе Аза ТПг Тугк Нів Сув біп біп Тук бек ГУув Тецй Рго Тгр 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу сбіп сбіу ТПг Гуз Уаї сбіц І11е Гув 100 105 «2105 44 «2115 11 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» І1СОВ1 МС5Р МІ2 (ВЕ10) «4005 44
Акуд Аза бек Тукг сбіу І1е Агкд сіу Тукг Гей Авп 1 5 10 «2105 45 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» І1СОВЗ МС5Р МІ2 (В10) «4005 45 біп біп Тук Бек Ппув Гей Рго Тгр ТПг 1 5 «2105 46 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» МІ МС5Р МІ2 (10-63) «4005 46
Авр І1е сіп Месє ТіПг біп бек Рго бек бек ІГецйп бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 1 5 10 15
Авр Агуд Уаі ТПг І1е ТПг Сув Агуд Аїа бек Туг сб1у І1е Агуд с1і1у Туг 20 25 30
Тец АБп Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аїа Рго пуб Гей Іецй І1е (516) 35 40 45
Тук Тук ТПг бек бек Іец Нів бек біу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех 0Щ1У 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е Бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 сі Авр Рпе Аза ТПг Тугк Нів Сув біп сбіп Тук бек Аїа Іецй Рго Тгр 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу сбіп сбіу ТПг Гуз Уаї сбіц І11е Гув 100 105 «2105 47 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» МІ МС5БР МІ2 (С5) «4005 47
Авр І1е сіп Месє ТіПг о біп бек Рго Бек Бек Гей бБег Аза бек Уаі с1У 1 5 10 15
Зо
Авр Акуд Уаї ТіПг І1е Тс Сув Агуд Аза бБег Агуд с1іу І1е Акд сіц Туг 20 25 30
З5
Тец АБп Тер Ту біп біп пув Рго сіу Ппув Аїа Ркго Гув Іечп Ге Ше 40 Тук Тук ТпПк с1іу бек Гей Нів бек сіу Уа1і Рго Бек Агд Рпе бек 01Уу бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е Бек Бек Гей сбіп Рго 45 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аїа ТПг Тукг Тук Сув біп біп Тук бек біц Гей Рго Тгр 85 90 95 50
ТПЕ Рпе сіу сбіп сбіу ТПг Гуз Уаї сбіц І11е Гув 100 105 55 «2105 48 «2115 11 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність 60 «220»
«223» І1СсСОВ1 МС5Р МІ2 (с5) «4005 48
Агуд Аїа бек Акгуд б1у Іїе Аг9д бій Тук ТІечй Авп 1 5 10 «2105 149 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» І1СсСОВ2 МС5БР МІ2 (с5) «4005 49
Тук ТпПкг сіу Бек Гец Нів 5ег 1 5 «2105 50 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» І1СОВЗ МС5Р МІ2 (с5)
Зо «4005 50 біп бі1іп Тук Бек бій Гей Рго Тгр ТПг 1 5
З5 «2105 51 «2115 107 «212» РЕТ 40 «2135 Штучна послідовність «2205 «223» МІ МС5БР МІ2 (Сс5-о3) 45 «4005 ч406м51
Авр І1е сіп Месє ТіПг о біп бек Рго Бек Бек Гей бБег Аза бек Уаі с1У 1 5 10 15 50
Авр Акуд Уаї ТіПг І1е Тс Сув Агуд Аза бБег Агуд с1іу І1е Акд сіц Туг 20 25 30 55 Тем АБп оТгр Тук біп біп Ппув Рго сбіу Ппув Аїа Рго Пув Гецп Геч І1е
Тук Тук ТПкг сіу бек Гей Ні бек біу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех 0Щ1У (516) 50 з9 бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е Бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аїа ТПг Тукг Тук Сув біп біп Туг бек Аїа Гей Рго Тгр 85 90 95
ТПЕ Рпе с1у біп сб1іу ТПг пув УМаї сій І1е Гув 100 105 «2105 52 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» МІ МС5БР МІ2 «4005 Д 52
Авр І1е сіп Месє ТіПг біп бек Рго бек бек ІГецйп бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 1 в) 10 15
Авр Акуд Уаї ТПг І1е Тпг Сув Агуд Аїа бек біп с1у І1їе Агд Авп Туг 20 25 30
Зо
Тец АБп Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аїа Ркго пуб Гец Гей Ше
З5
Тук Тук ТПг бек бек Іец Нів бек біу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех 0Щ1У бо 40 Ззек с1іу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Гей ТіПг І1е бек бек Іецйц сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аїа ТПг Тук Тук Сув біп біп Тук Бек Гпув Гей Рго Тгр 45 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу сіп біу ТПг Гуз Уаї сіц І1е Гув 100 105 50 «2105 53 «2115» 214 «212» РЕТ 55 «2135 Штучна послідовність «220» «223» 1с сСр3 СН2527 (Сковетар, УІ1-СНІ1) 60 «4005 53 біп А1ї1а Уаї Уаі ТпПг біп бій Рго Бек Гей ТПг Уа1 бек Рго с1у 01У 1 5 10 15
ТП Маії ТпПК Гей ТПг Сув сіу бек бек ТПК с1у Аїа Уаії ТрПг ТпПкг 5ег 20 25 30
Авп оТуг Аза АвБп о Тгр Уаі біп біц Гпув Рго б1у б1іп Аїа Рпе Агд 0Щ1У 35 40 45
Тецп І1ї1е с1у с1у ТПг Авп пув Агуд Аза Рго сіу ТПг Рго Аїа Агд РБПе 50 55 бо зек сіу бек ІТец Іец б1у с1у пуб Аїа Аза їей ТПг Гей бек сС1у Аї1а 65 70 75 80 біп Рго бій Авр бій Аїа бій Туг Тук Сув Аїа Гей Тер Тукг бек Авп 85 90 95
Тем Тер Маії Рпе сіу с1іу біу ТБг Ппув Гецп ТПг Уаії Гей бек бек А1а 100 105 110 зек ТПг Ппув біу Ркго бек Уа! Рібе Рго Іїецй Азїа Рго Бек Бек Ппув бег
Зо 115 120 125
ТПг Бек сіу сіу ТБг Аза Аза Гей сіу Сув Гец Уаї Гув Авр Тук Ре 130 135 140
З5
Ркго бій Ркго Уаі ТПг Уаї бек Тгр АвБп бек б1у Аза Гей ТПг Бех щу 145 150 155 160
Уаї Нів ТПгЕ Рпе Рго Аза Уаї Гей сіп бек бек с1у Гей Тук Бек Ієец 165 170 175
Ззек бек Уаі Уаї ТПг Уаї Рго бек бек бек ІТец с1у ТПг сіп ТБбг Туг 180 185 190
ІТІе Сув Авп о Уаі Авп оНів пув Рго Бек Авп о ТПг пув Уаї Авр Гув Гу 195 200 205
Ууаї бій Рго Ппув Бек Сув 210 «2105 ч54 «211» 685 «212» РЕТ
Гс10) «2135 Штучна послідовність
«223» МС5Р М4-3 (С1) (УН-СНІ1І) - СОЗ3 СН2527 (Сгковвтар УН-СК) - Ес(«виступ»)
РЗ29СІАТА «4005 54 біп Маії біп Гей біп бій бек с1іу Рго сбіу Гецй Уа1! Ппув Рго бек біп 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гей ТПг Сув ТПг о Уаї бек біу б1у бек І1е ТПг Бех щУу 20 25 30
Тук Тук Тер Авп Тер І1е Агуд сбіп Ні Рго с1у Пув с1у Гецп сі Ткгр 35 40 45
ІТІе сі1у Тук І1е ТП Рре Авр сбіу Бек Авп Авп Туг Авп Рго бек Іей 50 з9 бо
Ппув век Агуд Уаі ТПг Іїе Бек Агуд Авр ТПг бек Гпув Авп о біп Робе б5ег 65 70 75 80
Тецшп Гпув Гей бек Бек Уаі ТПг Аза Аза Ар ТПг Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Зо
Аза Авр Ріпе Авр Туг Тгр б1у біп б1і1у ТПг Гей Уа1і ТПг Уаі1і Бек 5ег 100 105 110
А1їа бек ТПг пув б1у Рго бек Уаії Рпе Рго Тец Аза Рго бек бек Гув 115 120 125 зек ТПг бек біу бі1у ТПпг Аза Аїа Іец б1у Сув Гей Уа1і Гпув Авр Туг 130 135 140
Рпе Рго біц Ркго Уаі ТПг Уаї бек Тгр Авп бек сіу Аїа Гец ТПг 5ег 145 150 155 160 сбі1у Маї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаі Гей біп бек бек сіу Гец Туг вег 165 170 175
Тецп бек бек Уаі Уа1і ТПг Уа1 Ркго бек бек бек Іец б1у ТПг сбіп ТПг 180 185 190
Тук Іїе Сув Авп УМаі! Авп оНів пуб Рго бек Авп ТПг пуб Уаї Авр Тувг 195 200 205 пув Маї бій Рго Ппув Бек Сув Авр біу біу б1у с1у Бек б1у шШ1у щу (516) 210 215 220 бі1у бек бій Уаі сбіп гейш гей сі Бек сбіу сіу с1і1у Гец Уаї сбіп Рго 225 230 235 240 сбі1у б1у бек Гей Агуд Гей бек Сув Аїа Аїа бек сіу Робе ТПг Ріе 5ег 245 250 255
ТП Тук Аїа Меє Авп Тгр Уаі Агуд біп Аза Рго сіу Ппув со1у Геч сі 260 265 270
ТЕр Уа1 бек Агуд І1е Агкд бек Ппув Туг Авп АвБп Туг Аза ТПг Туг Туг 275 280 285
Аза Авр бек Уаії пуб б1у Агкуд Рбе ТПг І1е бек Агуд Авр Авр бек Гув 290 295 300
АвпоТпг Гец Туг Іец біп Меє Авп б5ег Те Агуд Аза бій Авр ТПг Аїа 305 310 315 320
Уаї Тук Тук Сув Уаі1 Акуд Нів сіу Авп Рпе біу Авп бек Тук Уаї 5ег 325 330 335
Зо Тер Рпе Аїа Туг Тгр сб1у біп сб1у ТПг Гей Уа! ТПг Уаї бек бек Аї1а 340 345 350 зек Уаі Аїа Аза Ркго бек Уаі Робе І1е Рпе Рго Рго бБег Авр бій сіп
З5 355 360 365 теп Гпув бек сіу ТПг Аїа бек Уаі Уаії Сув Гей Гей Авп Авп Рое Туг 370 375 380
Рго Агкд біц Аза Гуз УМаї біп Ткр Гуз Маії Авр АБп Аїа Гей сіп б5ег 385 390 395 400 б1у Авп бек сбіп бі бек Уа1і ТПпг бі біп Авр бек Гпув Авр бек ТЕГ 405 410 415
Тук Бек Гей бек бек ТПг Гей ТПг Гей бек Пув Аза АБр Тук січ Тув 420 425 430
Нів Ппув Уа1 Туг Аїа Сув біц Уа1! ТБг Нів біп б1у ІТецй бек бек Рго 435 440 445
Уаї ТПпг Ппув Бек Рпе Авп Агуд біу бій Сув Авр ГПув ТПг Нів ТБПкг Сув 450 455 460 60
Рго Рго Сув Рго Аї1а Рго бій Аїа Аза сб1у б1у Рго Бек Уа1 РПе ГІец 465 470 475 480
Рпе Рго Ркго Пув Рго пуб Авр ТПг Гей Меє І1е бек Агуд ТПг Рго с1ц 485 490 495
Уаї ТПпг Сув Уа1і Уа1 Уа1 Авр Уа1і Бек Нів сій Авр Рго біц Уаї Гув 500 505 510
Рпе Авп Тер Тук Маі Авр сіу Уаі біц Уаї Нів Авп Аїа Ппув ТПкг Гув 515 520 525
Рго Агкд біц біц біп Тук Авп бек ТПг Туг Агуд Уа1і Уаі1і Бек Уаі1ї Іец 530 535 540
ТПг Уаі1 Гей Нів біп Авр Тр Гей Авп біу Гуз біцп Тук Ппув Сув Гув 545 550 555 560
Уаї бек Авп пув Аїа ІТей с1у Аїа Рго Іїе сій Пув ТПг І1е Бек Гув 565 570 575
Аза пув с1у біп Рго Акуд бій Рго біп Уаї Тук ТПг Гей Рго Рго Сув
Зо 580 585 590
Акуд Авр обіц Гец ТБг Губв АвБп обіп Уаї бек ІТец Тер Сув Гей Уа1ї Гув 595 бо 605
З5 б1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаі бій Тер бій бек АБп с1у сіп 610 615 620
Рго біц Авп Авп оТукг Гув ТПг ТБг Рго Рго Уаії Гей Авр 5Бег Ар 1У 625 630 635 640 зек Рпе РібПе Гей Тук бек Ппув Гецп ТПг Уа1і Авр Пув бек Агуд Тгр сіп 645 650 655 біп б1у Авп Уаі РПе бек Сув Бек Уаі Меє Нів сій Аза Гец Нібв Авп бо бе5 670
Нів Тук ТПг сіп Пув бек Іец бек ТІГецй бек Рго с1УуУ Гув 675 68 685 «2105 щМО55 «211» 442 «212» РЕТ
Гс10) «2135 Штучна послідовність
«223» МС5БР М4-3 (С1) (УН-СНІ1І) - Ес(«западина») РЗ?2ОЗСІАТА «4005 5:55 біп Маії біп Гей сбіп бій бек с1у Рго сіу Гей Уаї Гув Рго бек сіп 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гей ТПг Сув ТПг о Уаії бек с1і1у біу Бек Іїе ТПг бек с1Уу 20 25 30
Тук Тук Тер Авп Тгр І1е Агд сіп Нів Рго сіу Ппув с1у Гей сій Тгр 35 40 45
ІТІе сі1у Тук І1е ТПг Рпе Авр біу Бек АвБп Авп Туг Авп Рго бек Іец 50 55 бо
Ппув век Агуд Уаі ТПг Іїе Бек Агуд Авр ТПг бек Тув АБп обіп Рпе 5ег 65 70 75 80
Тецшп Гпув Гей бек Бек Уаі1і! ТПг Аза Аза Ар ТПг Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Зо А1а Авр Рпе Авр Туг Тер сіу сбіп біу ТПг Гецп Уа1і ТБбг Уаї бек 5ег 100 105 110
А1їа бек ТПг Ппув біу Ркго бек Уаі Рібе Рго Іїец Аза Рго Бек Бек Гув
З5 115 120 125 зек ТПг бек біу бі1у ТПпг Аза Аїа Гецп б1у Сув Гей Уа1і Гпув Авр Туг 130 135 140
Рпе Рго біц Ркго Уаі! ТПг Уаї бек Тгр АБп бек сі1у Аїа Гей ТПг 5ег 145 150 155 160 сбі1у Маї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаії Гей біп бек бек сіу Гец Туг вег 165 170 175
Пен бек бек Уаії Уа1і ТБПг Уаї Рко бек бек бек Ге с1і1у ТПг сіп Тіг 180 185 190
Тук Іїе Сув Авп Уаії Авп о Нів Ппув Рго бек Авп о ТПг Гув Уа1ї Авр Гув 195 200 205 пув Маї бій Рго Ппув Бек Сув Авр ГПув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 210 215 220 60
Рго Аїа Рго біц Азїа Аза сіу біу Ркго бек Уаі Рпе Гей Рпе Рго Рго 225 230 235 240
Пув Рго Ппув Авр ТПг Гей Мес І1ї1е бек Агуд ТПг Рго бій Уаї ТПкг Сув 245 250 255
Уаї Уаї Уаі Авр Уа1 бек Нів бій Авр Рго біц Уаії пув Рпе Авп Тгр 260 265 270
Тук Уаі1 Авр сіу Уаії біц Уаії Нів Авп Аїа пуб ТПг Гув Рго Агд с1ци 275 280 285 бі біп Тук Авп Бек ТПг Туг Агуд Уаі Уа1і Бек Уа1 Гей ТПг Уаї Іей 290 295 300
Нів біп Авр Тер Гец Авп біу пув сій Тук Ппув Сув КГув Уаї бек Авп 305 310 315 320 цув Аїа теп с1у Аїа Рго І1е бій Пув ТПг Іїе бек Пув Аїа Гуз Щ1У 325 330 335 біп Рго Агкд бій Рго біп Уа1і Сув ТПг Гей Рго Рго бБег Агд АБр бій
Зо 340 345 350 теп ТпЕгЕ Гув Авп о біп Уа1! бек Гей бек Сув Аїа Уа1 пув с1у Робе Туг 355 3З6о 365
З5
Рго бБекг Авр І1е Аї1а Уаії бій Тгр біц бек АБп с1у біп Рго бій Авп 370 375 380
АвпоТук пув ТПг ТБЕг Рго Рго Уаі! Іец Авр бек Авр с1іу Бек Рпе Ріє 385 390 395 400
Пе Маї бек Ппув Гей ТПг Уаї Авр Гув бек Агд Тер біп біп с1у Авп 405 410 415
Уаї Рпе бек Сув Бек Уа1! Месє Нів сій Аза Гец Нібв АвБп о Нів Тук ТПг 420 425 430 біп Ггув бек Гей бек Гей бек Рго с1У Гув 435 440 «2105 56 «2115» 214 «212» РЕТ
Гс10) «2135 Штучна послідовність
«223» 1с сСр3 СН2527 (Сковвтар, УІ-СНІ1) «4005 МЯ56 біп А1ї1а Уаї Уаі ТпПг біп бій Рго Бек Гей ТПг Уа1 бек Рго с1у 01У 1 5 10 15
ТП Маії ТпПК Гей ТПг Сув сіу бек бек ТПК с1у Аїа Уаії ТрПг ТпПкг 5ег 20 25 30
Авп оТуг Аза АвБп о Тгр Уаі біп біц Гпув Рго б1у б1іп Аїа Рпе Агд 0Щ1У 35 40 45
Тецп І1ї1е с1у с1у ТПг Авп пув Агуд Аза Рго сіу ТПг Рго Аїа Агд РБПе 50 55 бо зек сіу бек ІТец Іец б1у с1у пуб Аїа Аза їей ТПг Гей бек сС1у Аї1а 65 70 75 80 біп Рго бій Авр бій Аїа бій Туг Тук Сув Аїа Гей Тер Тукг бек Авп 85 90 95
Зо Тем Тегр Маії Рпе сіу сіу біу ТБг Ппув Гецп ТПг Уаії Іей бек бек А1їа 100 105 110 зек ТПг Ппув біу Ркго бек Уа! Рібе Рго Іїецй Азїа Рго Бек Бек Ппув бег
З5 115 120 125
ТПг Бек сіу сіу ТБг Аза Аза Гей сіу Сув Іїец Уаї Гув Авр Тук РПе 130 135 140
Ркго бій Ркго Уаі ТПг Уаї бек Тгр АвБп бек б1у Аза Гей ТПг Бех щу 145 150 155 160
Уаї Нів ТПгЕ Рпе Рго Аїа Уаї Гей сіп бек бек біу Іецп Тук бек Іеєецй 165 170 175
Ззек бек Уаі Уаї ТПг Уаї Рго бек бек бек ІТец с1у ТПг сіп ТБбг Туг 180 185 190
ІТІе Сув Авп о Уаі Авп оНів Ппув Рго Бек Авп о ТПг пув Уа1 Авр Гпув Гув 195 200 205
Ууаї бій Рго Ппув Бек Сув 210 60
«2105 557 «211» 694 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» СЕА СНІАТА 98/99 - СОЮЗ СН2527 (Сгове5тар УН-СК) - Ес(«виступ»)
РЗ29СІАТА «4005 57 біп УМаії біп Гей Уаі біп бек сі1у Аїа біш Уа1 Ппув пув Рго с1у А1а 1 5 10 15 зек Уаії Ппув Уаії бек Сув Гув Аїа бек біу Тук ТПг Рпе ТПг сій Ре 20 сіу Меє АБп Тер Уаі Акуд біп Аїа Рго сб1у сбіп с1у Те бій Тер Меє б1у Тер І1ї1е АвБп ТПг пув ТПг с1іу бі Аїа ТПг Тук Уаї біц бі РБе 25 50 55 бо пув б1у Акуд Уа1і ТПг Рпе ТПг ТПг Авр о ТПг бек ТПг бек ТПг Аїа Туг 65 70 75 80
Зо
Меє бій гей Агуд Бек Гей Агуд Бек Авр Авр ТПг Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
З5
Аза Акуд Тер Авр Робе Аза Тук Туг Уаі біцш Азї1а Меє Авр Тує Тер 01У 100 105 110 40 сіп б1іу ТПкг Трпг оУаії ТБг Уаї бек бек А1їа бек ТПг Пув б1і1у Рго 5ег 115 120 125
Уаї Рпе Рго гей Аза Рго бек Бек Ппув бек ТПг бек б1у б1у ТПг Аїа 45 130 135 140
А1їа гей сіу Сув Іец Маії Гпув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уа1і1 ТПг Уаї 145 150 155 160 зек Тер Авп бек біу А1їа Гей ТПг бек бі1у Уаї Нів ТПг Рпе Рго Аї1а 165 170 175
Уаї Гей біп Бек бек сіу Пец Тук бек Гец бег бек Уаі Уа1і ТПг Уаї 180 185 190 (516) Рго бек бек бек Гей с1іу ТПг біп ТПг Тук І1е Суб Авп Уаі1і Авоп Нів 195 200 205
Тув Ркго Бек Авп ТПг Ппув Уа1 Авр Гпув Ппув Уа1 сій Рго Ппув Бек Сув 210 215 220
Авр с1і1у сіу біу біу бек бі1у біу бі1у б1у бек бій Уаі1ї сіп Гей Іец 225 230 235 240 бі бек сбі1у сіу с1у гейш Уаі сбіп Рго сіу сіу бек Іецй Агд Іец 5ег 245 250 255
Сув Аїа Аїа бек с1у РібПе ТПг Рібе бег ТПг Туг Аза Меє Авп Тгр Уаї 260 265 270
Акуд біп Аза Рго сбіу Ппув б1у Гец бій Тгр Уа1і бБег Агд І1е Агд 5ег 275 280 285
Тпув Тук Авп Авп Туг Аїа ТПг Туг Туг Аїа Авр бек Уаї пув с1у Агд 290 295 300
Рпе ТПг І1ї1е Бек Агд Авр Авр Бек Кпув Авп о ТПг Гей Туг Гей біп Меє 305 310 315 320
Зо
АвпобБек Гей Агуд Аїа біцшц Авр ТБПг Аїа Уа1і! Тук Тук Сув Уаі Агуд Нів 325 330 335 с1у Авп Рпе б1іу Авп бек Туг Уаії Бек Тер Рбе Аїа Туг Тер 01у сіп 340 345 350 бі1у ТПпг Гей Уаі ТПг Уа1 бек бек Аза Бек Уаі Аза Аза Ркго бек Уаї 355 3З6о 365
Рпе І1їе Рібе Рго Рго бек Авр сій біп ІТецй Гув Бек с1у ТПг Аїа 5ег 370 375 380
Уаї Уаї Сув Гей гей Авп Авп Рпе Туг Рго Агуд біц Азїа Гув Уаї сіп 385 390 395 400
ТЕр пув Уа1 Авр Авп Аза Іец біп бек біу Авп бек біп бій бек Уаї 405 410 415
ТпЕ бі біп Авр бек ГПув Авр бек ТПг Тук бек Гей бек бек ТПг Іечц 420 425 430
ТПг Ггец бек пув Аза Авр Тук сій пув Нів пув Уаї Тук Аї1а Сув с1и 60 435 440 445
Уаї ТпПгЕ Нів сбіп сіу Гей бек Бек Ркго Уаії ТПг пуб бек Рпе Авп Агд 450 455 460 сі1у б1п Сув Авр Пув ТПкг Нів ТПг о Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій 465 470 475 480
А1ї1а Аїа сіу біу Рго Бек Уаі Ррпе Гей Рібе Рго Рго Ппув Рго Тув Авр 485 490 495
ТПЕ Ггеш Меє Іїе бек Агд ТПг Рго сіц Уаії ТПг Сув Уаї Уаї Уа1ї Авр 500 505 510
Уаї Бек Нів бій Авр Рго сіц Уаі Ппув Рбе Авп Тр Туг Уаі АБвр ШУ 515 520 525
Ууаї біш Уаії Нів Авп Аза пуб ТпПг Гпув Рго Агд біц біц біп Тук Авп 530 535 540 зек ТПг Тут Агд Уаії Уаї бек Уаії Іец ТПпг Уаї Гей Нів сбіп Авр Тгр 545 550 555 560
Зо Тем Авп о с1і1у Ппув бій Тук Ппув Сув Пув Маії Бек Авп Гув Аїа Те 1У 565 570 575
Аза Рго Ії1е біц Гу ТПг І1їе бек їув Аїа Гпув с1у біп Рго Агд сіц
З5 580 585 590
Ркго сбіп Уаї Тук ТПг Гей Рго Рго Суб Агуд Авр сій Гей ТПг Гпув Авп 595 бо 605 біп Маї Бек Гей Тгр Сув Гей Уаі Ппув с1у Рпе Тук Рго бБег АвБр І1е 610 615 620
А1їа Уа1 сіц Тгр біц бек АвБп о біу біп Рго бій Авп Авп Туг Ппув ТПг 625 630 635 640
ТПЕ Рго Рго Уаії Гей Авр Бек Авр сіу бек РіПе РіПе Гей Тук бек Тув 645 650 655
Тецп ТПпг Уаї Авр Ггув Бек Агуд Тгр біп біп с1іу Авп Уаї РПе бек Сув бо бе5 670 зек Уаії Меєсє Ні біцш Аза Гей Ніб Авп о Нів Туг ТПг сіп Ппув Бек Гей 675 68 685 60 зек Гей бек Рго б1у Гу «2105 «558 «211» 451 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» СЕА СНІАТА 98/99 (УН-СН1І) - Ес(«западина») РЗ29СІАТЇА «4005 58 сіп Уаії біп Гецп Уаі сіп бек бі1у Аї1а сіш Уаї пув Гув Рго с1у А1їа 1 5 10 15 зек Уаії Ппув Уаії бек Сув Гув Аїа бек біу Тук ТПг Рпе ТПг сій Ре 20 25 30 бі1у Меє АвБп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу біп с1іу Гец біц Тгр Меє 35 40 45 б1у Тер І1ї1е АвБп ТПг пув ТПг с1іу бі Аїа ТПг Тук Уаї біц бі РБе 50 55 бо
Зо пув б1у Акуд Уа1і ТПг Рпе ТПг ТПг Авр о ТПг бек ТПг бек ТПг Аїа Туг 65 70 75 80
Меє біц Ггецп Агуд бек ІТей Агуд бек Авр Авр ТПг Аїа Уа1! Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Акуд Тер Авр Робе Аза Тук Туг Уаі біцш Азї1а Меє Авр Тує Тер 01У 100 105 110 біп б1у ТПг ТпПг оУаї ТПг Уа1 бек Бек Аїа бек ТПг Ппув с1у Рго 5ег 115 120 125
Уаї Рпе Рго гей Аза Рго бек Бек Ппув бек ТПг бек б1у б1у ТПг Аїа 130 135 140
А1їа гей сіу Сув Іец Маії Гпув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уа1і1 ТПг Уаї 145 150 155 160 зек Тер Авп бек сб1у Аїа Гей ТПг бек сбіу Уаї Ні ТПК Робе Рго А1а 165 170 175
Уаї Гей сбіп Бек Бек сіу Гей Тук Бек Гей бек бек Уаї Уаі! ТіПг Уаї 60 180 185 190
Рго Бек бек бек ІГец б1у ТПг біп ТПг Тук Іїе Сув Авп Уа1і Авп Нів 195 200 205
Тув Ркго Бек Авп ТПг Ппув Уа1 Авр Гпув Ппув Уа1! сій Ркго пув бек Сув 210 215 220
Авр Ппув ТПг Нів Тк Суб Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Аза Аїа с1Уу 225 230 235 240 б1у Рко Бек Уаі Рпе Гей Рпе Рго Рго Ппув Рго Пув Авр ТПг Іец Меє 245 250 255
ІТ1е Бек Агд ТПг Рго бій Уаі ТП Сув Уаї Уаії Уаі1і Авр Уа1і! бек Нів 260 265 270 бі Авр Рго сій Уаії Ппув Рпе Авп Тгр Туг Уаі1 Авр сіу Уаії сіи Уаї 275 280 285
Нів Авп Аза Ппув ТПг пув Рго Акд бій бі біп Туг Авп бек ТПг Туг 290 295 300
Зо Агуд Уаї Уаї бек Уаї Ггецп ТпПкК Уаії Гей Нів біп Авр Тер Гей АБп 01У 305 310 315 320
Тпув біш Тук Ппув Сув Ппув Уа1 Бек Авп пув Аїа Гей сіу Аза Рго І1е
З5 325 330 335 біш ув ТПг І1їе Бек Ппув Аза Ппув с1у біп Рго Акд бій Рго сіп Уаї 340 345 350
Сув ТП Гей Рго Рго Бек Агуд Авр бій Гей ТПг Гпув Авп обіп Уаї 5ег 355 3З6о 365
Тец бек Сув Аїа Уаі Ппув сіу Рпе Туг Рго бБег Авр І1е Аї1а Уа1і сС1и 370 375 380
Тер бій бек Авп біу біп Рго бі Авп Авп Туг Гув ТПг Торг Рго Рго 385 390 395 400
Уаї Гей Авр Бек Авр сіу бек РПе РбПе Іїецй Уаії Бек Ппув Гей ТПг Уаї 405 410 415
Авр Гпув бек Агд Тгр біп бі1іп б1у Авп Уа! Рпе бек Сув Бек Уа1 Меє 420 425 430 60
Нів біц Аїа Гей Нів Авп о Нів Туг ТПг біп пуб бек Тецй бек Іеци 5ег 435 440 445
Рго о1У ТГув 450 «2105 59 «2115» 215 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» ІС рР4А7 с5 «4005 59 біц І1е Уаї Гей ТПг біп бек Ркго сіу ТПг Гей бек Гей бег Рго 01Уу 1 в) 10 15 бі Агкуд Аза ТПг о Гей бек Сув Агуд Аза Бек біп бек Уаї бек бек бег 20 25 30
Тук Ггеш Аїа Тер Тук біп біп пув Рго біу біп Азїа Рго Агд Іецй Іецй
Зо
ІТІе Тук бі1у Аїа бек бек Агуд Аїа ТПг б1у І1е Рго Авр Агд Ропе 5ег бо 35 сіу бек сіу Бек с1у ТБг Авр Рбе ТПг Гей ТПг І1їе бек Агуд Ге сі1ц 65 70 75 80
Рго біц Авр Роре Аза Уаї Тугк Тук Сув біп біп Ту с1іу Бек Бек Рго 40 85 90 95
Тецп ТПпЕ Рпе сіу біп сб1іу ТПкг Ппув Уаі бій Іїе пув Агд ТіПг Уаї А1а 100 105 110 45
Аза Ркго бек Уаі! Рпе І1е Рпе Рго Рго бек Авр бій сбіп Гей Ппув б5ег 115 120 125 50 бі1у ТПпг Азїа бек Уаії Уа1 Сув Гей Гей Авп Авп Ропе Туг Рго Агд бій 130 135 140 55 А1їа Ппув Уаї біп Ткр Ппув Уаі Авр Авп Аза Тей сіп бек с1у Авп 5ег 145 150 155 160 біп бій бек Уаі ТП біш біп Авр бек Пув Авр бек ТПг Тукг бек Ієей 60 165 170 175 зек Бек ТПг Іец ТПг ІГецйп бек їув Аза Авр Тук бій Ппув Нів Ппув Уаї 180 185 190
Тук Аїа Сув сій Уаї ТПг Ні сіп сіу Пец бек бек Ркго Уа1і ТПг Гув 195 200 205 зек Рпе Авп Агуд б1у біц Сув 210 215 «2105 60 «2115» 214 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» 1с сСр3 СН2527 (Сковвтар, УІ-СНІ1) «4005 60 біп А1ї1а Уаї Уаі ТпПг біп бій Рго Бек Гей ТПг Уа1 бек Рго с1у 01У 1 в) 10 15
ТПг Уа1 ТПкг Ггец ТПг Сув бі1у бек бек ТПг с1у Аїа Уа1! ТБПг ТіПг 5ег 20 25 30
Зо
Авп оТуг Аза АвБп о Тгр Уаі біп біц Гпув Рго б1у б1іп Аїа Рпе Агд 0Щ1У
З5
Тецп І1ї1е с1у с1у ТПг Ап пув Агуд Азїа Рго біу ТПг Рго А1ї1а Аг РІГе бо 40 Ззек с1іу бек Тейп Геп сіу сіу пув Аїа Аїа Те ТПг Гей бек Сс1у А1а 65 70 75 80 біп Рго бій Авр бій Аїа бій Тук Тук Сув Аза Іецй Тгр Тук бек Авп 45 85 90 95
Тецп Тер Уаії Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гей ТПг Уа1! Ггец бек бек А1а 100 105 110 50 зек ТПг Ппув біу Ркго бек Уа! Рпе Рго Іїецй Азїа Рго Бек Бек Ппув бег 115 120 125 55
ТПг Бек сіу сіу ТБг Аза Аза Гей сіу Сув Іїец Уаї Гув Авр Тук РПе 130 135 140 (516) Рго бій Ркго УМаї! ТПг Уаї бек Тер Авп бек біу А1ї1а Гей ТПг бек 01Уу 145 150 155 160
Уаї Нів ТПгЕ Рпе Рго Аїа Уаї Гей сіп бек бек біу Іецп Тук бек Іеєецй 165 170 175 зек Бек Уаї Уаії ТПг Уаї Рго бек бек бек Гей с1у ТПг біп ТПг Туг 180 185 190
ІТІе Сув Авп о Уаі Авп оНів Ппув Рго Бек Авп о ТПг пув Уа1 Авр Гпув Гув 195 200 205
Уаї бій Рго Ппув бек Сув 210 «2105 61 «211» 688 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» рР4А-7 сб (УН-АСН1І) - СОВ3 СН2527 (Сковвтар УН-СК) - Ес(«виступ»)
РЗ29СІАТА «4005 61
Зо сі Уаї сбіп Геп Гей бій бек сіу сіу с1у Іїей Уаії сбіп Рго с1у с1Уу 1 5 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а Аза бек б1і1у Рпе ТПг Ропе бек бек Туг
З5 20 25 30
Аза Меє бек Тгр Уаі Агкд біп Аза Рго с1у Ппув с1іу Гец біц Тгр Уаї 40 зек Аїа І1е бек біу бек сіу біу бек ТПг Туг Туг Аїа Авр бек Уаї бо 45 пув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе бек Агуд Авр Авп бек ГПув Ап о ТПг Іец Туг 65 70 75 80 50 Пен біп Мес Авп бек Гей Агуд Аїа біц Авр ТПг Аїа Уа1ї Тук Тук Сув 85 90 95
А1їа пув сіу бек біу Рпе Авр Туг Тгр б1у біп с1у ТПг Геи Уа1 ТЕГ 55 100 105 110
Уаї бек Бек Аїа бек ТПг Ппув сіу Ркго бек Уаі РпПе Рго Іецп Аза Рго 115 120 125 60 зек бек Ппув бек ТПг бек сіу бі1у ТПг Аза Аза Геш с1у Сув Гей Уаї 130 135 140 ув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уаі! ТПг Уаії бек Тер Авп бек с1у Аї1а 145 150 155 160
Тецп ТПг бек сіу Уаі Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уа1і Гей сіп бек бег 01Уу 165 170 175
Тецп Тук бек Гей бек бек Уа1 Уа1і ТПг Уа1і Рго бек бек бек ГІец 01Уу 180 185 190
ТПг біп ТБг Тук І1їе Сув Авп о Уаі Авп Нів Гув Рго бек Авп о ТПг Гув 195 200 205
Уаї Авр Ппув Ппув Уа1 сій Рго Ппув бек Сув Авр біу біу б1у с1у 5бег 210 215 220 сіу біу сб1у сб1іу Бек біц Маї сіп Гей Гецп бій бек сіу сі1у с1у Гей 225 230 235 240
Ууаї біп Рго сіу сіу Бек Ггец Агд Гей бек Сув Аїа А1їа бек с1у РПе
Зо 245 250 255
ТПЕ Рпе бек ТПг Туг Аза Месє Авп Тгр Уаі Агд біп Аза Рго с1УуУ Гув 260 265 270
З5 сб1у Гей бій Тер Уаі Бек Агуд Іїе Агуд Бек Ппув Туг Авп АвБп Туг А1а 275 280 285
ТПг Тук Тук Аза Авр бек Уаі! Ппув с1іу Акд Робе ТПг І1е бек Агд Авр 290 295 300
Авр бек Пув Авп о ТПг Гей Тук Гей сіп Меє Авп бек Гецп Агуд Аїа с1ци 305 310 315 320
Авр ТПг Атїа Уаї Тук Тук Сув Уаі Агд Нів б1у Авп Рпе с1у Авп б5ег 325 330 335
Тук Уа1 Бек Тер Рпе Аїа Туг Тер сіу біп сб1і1у ТПг Іецп Уа1ї ТПг Уаї 340 345 350
Ззек бек Аїа бек Уаі Аза Аза Рго бек Уа1і Рбе І1е РПе Рго Рго 5ег 355 3З6о 365 60
Авр бій біп Гец пуб бек б1у ТБПг Аїа бек Уаії Уаї Сув Гей Гей Авп
370 375 380
АвпоРпе Туг Рго Агд б1іц А1їа пув Уаії біп Тер пув Уаі Авр Авп Аїа 385 390 395 400 теп біп бек с1у Авп Бек біп бій Бек Уаі ТПг сій біп Авр бек Гув 405 410 415
Авр Бек ТПг Тук бек ТІецй бек бек ТПг ІГецй ТПг Гей бек пув Аїа Авр 420 425 430
Тук біц пув Нів Ппув Уаі! Тук Аїа Сув біц УМаї ТПкгЕ Нів сіп с1Уу Іей 435 440 445
Ззек бек Ркго Уаї ТПг Ппув бек Рпе Авзп Акуд б1у біц Сув Авр Тув ТіПг 450 455 460
Нів ТпПг Сув Рго Рго Суб Рго Аїа Рго біш Аїа Аза сіу с1і1у Рго 5ег 465 470 475 480
Уаї Рпе Гей Рпе Рго Рго пуб Рго Пув Авр ТПг Гец Меє І1е б5ег Аг4д 485 490 495
Зо
ТПЕ Рго бій Уа! ТБПг Сув Уаії Уаї Маії Авр Уаії Бек Нів бій Авр Рго 500 505 510
З5 бі Маї Гпув Рпе Авп Тер Туг Уаі Авр сіу Уаі1 сій Уаї Нібв АБп А1а 515 520 525
Пув ТПг Ппув Рго Агд бій бій біп Тук Авп бек ТПг Туг Агуд Уа1ї Уаї1ї 530 535 540 зек Уаії Гпецш ТПг Уаї Іейп Нів біп Авр Тгр Гей АвБп с1у Ппув бій Туг 545 550 555 560
Тпув Сув Кпув Уа1і Бек Авп пув Аза Ггец с1іу Аїа Рго Ії1е сбіц пув ТЕПг 565 570 575
ІТІе бек пув Аїа пув б1у біп Рго Агкд бій Рго сіп Уа1і Тук ТПг Ієец 580 585 590
Рго Рго Сув Агд Авр біп Гей ТПг Гув АвБп обіп Уа1і Бек Гей Тгр Сув 595 бо 605 (516) Тем Маї Ппув с1у Рпе Туг Рго бек Авр І1е Аїа Уаі сій Тгр сій 5ег 610 615 620
Авп осіу біп Рго біц Авп о Авп о Туг Гув ТП ТбПг Рго Рго Уа1і Гей Авр 625 630 635 640 век Авр біу бек РпПе Рпе Гей Тукг бек Гув Гей ТПг Уа1і Авр Ппув б5ег 645 650 655
Акуд Тер біп біп б1у Авп о Уаї Рібе бек Сув бек Уаі Меє Нів сій Аїа 6бво 665 670 ем Нів АвБп о Нів Тук ТПг біп Гуз бек Гей бек Гей бек Рго с1Уу Гув 675 68 685 «2105 562 «211» 445 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» рРА7 се (УН-СН1) - Ес(«западина») РЗ29СІАТА «4005 62 бі Маї біп Гей Гей бі бек сіу сіу с1у Гей Уаі1 сіп Рго с1у 01У
Зо 1 в) 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а Аза бек б1і1у Рпе ТПг Ропе бек бек Туг 20 25 30
З5
Аза Меє бек Тгр Уаі Агуд біп Аїа Рго б1у Ппув с1у Гей бій Тер Уаї 40 зек Аїа І1е бек біу бек сіу біу бек ТПг Туг Туг Аїа Авр бек Уаї бо 45 пув б1у Акуд Рпе ТПг І1їе бек Акуд Авр АБп бек Пув Авп ТПг Гей Туг 65 70 75 80
Тец біп Меє Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТБг АТїа Уаї Тук Тук Сув 50 85 90 95
А1їа пув сіу бек біу Рпе Авр Туг Тгр б1у біп с1у ТПг Геи Уа1 ТЕГ 100 105 110 55
Уаї бек Бек Аїа бек ТПг Ппув сіу Ркго бек Уаі РпПе Рго Іецп Аза Рго 115 120 125 60 зек бек Ппув бек ТПг бек сіу бі1у ТПг Аза Аза Геш с1у Сув Гей Уаї
130 135 140
Тув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уаі ТПг Уа1 Бек Тер Авп бег С1у А1а 145 150 155 160
Тецп ТПг бек сіу Уаі Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уа1і Гей сіп бек бег 01Уу 165 170 175
Тецп Тук бек Гей бек бек Уа1 Уа1і ТПг Уа1і Рго бек бек бек ГІец 01Уу 180 185 190
ТПг біп Тбг Тук І1їе Сув Авп о Уаі Авп Нів Гув Рго Бек Авп о ТПг Гув 195 200 205
Уа1ї1 Авр Ппув Ппув Уаї бій Рго Пув бек Сув Авр Гув ТПг Нів ТіПкг Сув 210 215 220
Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Аїа Аза сб1у б1у Рго Бек Уаї РПе Іей 225 230 235 240
Рпе Рго Ркго пуб Рго Гув Авр ТПг Іец Меє І1е бек Агуд ТПг Рго сіц 245 250 255
Зо
Уаї ТПпг Сув Уаі1і Уа1 Уа1 Авр Уаі Бек Нів сій Авр Рго сій Уа1ї Гув 260 265 270
З5
Рпе Авп Тер Тук Маі Авр сіу Уаі біц Уаї Нів Авп Аїа Ппув ТПкг Гув 275 280 285
Рго Акад бій бій біп Тук Авп бек ТПг Туг Агуд Уаі Уаї бек Уаї Гей 290 295 300
ТПг Уаі1 Гей Нів біп Авр Тр Гей Авп біу Гуз біцп Тук Ппув Сув Гув 305 310 315 320
Уаї Бек Авп Ггув Аїа Гей сіу Аза Рго І1е біцп Гув ТПг І1їе Бек Гув 325 330 335
Аза пув с1у біп Рго Акд бій Рго біп Уаії Сув ТПг Гей Рго Рго 5ег 340 345 350
Акуд Авр о біц Гец ТП Гув Авп обіп Уа1ї Бек Гей бек Сув Аза Уаї Гув 355 3З6о 365 (516) с1у Ррпе Тукг Рго бек Авр І1е Аїа Уаї сбіш Тер сій бек АБп с01у сіп 370 375 380
Рго біц Авп Авп оТукг Гув ТПг ТпПг Рго Рго Уаії Гей Авр 5Бег Ар 01У 385 390 395 400 зек РпПе Рібе Іїец Уаії бек Гпув Тец ТПг Уаії Авр Гпув Бек Агд Тер сіп 405 410 415 біп б1у Авп Уаі РПе бек Сув Бек Уаі Меє Нів сій Аза Гец Нібв Авп 420 425 430
Нів Тук ТпПК біп Ппув бек Гей бек Гей бек Рго біу Гув 435 440 445 «2105 563 «2115» 1365 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» НС сСоЗ сСН2527 (МН 3-23(12)) «4005 63 чаддєдсадс Єдсеєддааєс єддадсодсодода ссддсдсадс ссддсддаєс сссдадассд (216)
Зо адсеЕдсдссуд ссадсоудсеє сасссєсадс асссасуусса Єдаассдоддс дсдссаддсс 120 сссддсааад дсссддаасд ддсдссссдуда ассадаадса адсасаасаа стасдссасс 180
Басвєасдссуд асадсдєдаа доддссддссс ассассадсс дддасдасад саадаасасс 240 седсасссдс адасдаасад сссдсдддсес даддасассуд ссдєдраста Ед Чдедс9о Зоо сасддсаасс Ссддсаасад стасдеЕдеЕсь годе ссдссо ассддддесса дддсасссес 3З6о чЧЕдассдЕдс сасстєдссад сассааддудс ссассудссеЕ Ссссссгддс асссессьсс 420 аадчдадсассеє сеЕдддддсас адсоддсссод ддссдсссдда Ссааддасста сесссссдаа 480 ссддєдасдд Сдссдсддаа сссаддсдсесс сгрдассадсуд дсдесдсасас сеЕссссддсе 540
ЧдЕССсСрасаде ссеЕСаддасе срасеєссссс адсадсдсдд Єдассдсдсс сессадсадс 60
Еєдддсассс адасстасає седсаасудсд аассасаадс ссадсаасас сааддесддас 6бо аачааадеєд адсссаааєс СЕЧдсдасааа асесасасає дсссассуєд сссадсассе 720 чаасеЕсстьдуа доддассуєс адеЕсеЕсссес єЕсСсссссаа аасссаадда сасссесаєд 78о0 аєсеЕсссоддда ссссеЕдадде сасаєдсоадєсд дсддсддасдд Сдадссасда адасссгдад 840
ЧдЕСаадеЕєса асеєддеасає ддасодсодсд даддсдсаса асдссаадас ааадссдс4д4д 900 чаддадсаде асаасадсас деассдсдсд дссадсдссс Ссассудрссе дсассаддас 960 (516) Еддсєдааєд дсаадчадсра саадсдсаад дЕССсСссааса аадсссессс адсссссаєс 1020 чадаааасса ЄсЕсСсааадс сааадддсад ссссдадаас сасаддесдсба сасссгдссс 1080 ссаєсссуддуа аєдадсеєдас саадаассад деЕсадссвда ссеЕдссЕддЕ саааддссєс 1140 баєсссадсду асассодссує ддадсдддад адсааєдддс адссудадаа саастасаад 1200 ассасдссеЕс ссдЕдссдда сессдасдде СссЕссеЕссс Есграсадсаа дсеЕСсассдатєд 1260 часаададса доасддсадса доадддаасдес СЕСЕСаєсддсЕ ссодєдаєдса Едаддсесьд 1320 сасаассасе асасдудсадаа дадссеєсссс сЕдЕСсСЕСсСсдуа деааа 1365 «2105 6564 «2115» 645 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» ІС сСОоЗ СН2527 (МІ, 7-46(13)) «4005 64 саддссдссдуд Єдасссадда асссадсстд асадедеЕсьс седдсддсас сдардассстд (216) асаєдсддса дЕсСстасадуд сдссдЕдасс ассадсаасе асдссаасєд доадсдсаддаа 120 аадсссддсс аддссеєєссад аддассдасс ддсддсасса асаадададс сссгддсасс 180 ссгбдссадає сСсадсддасєс ссосдсрдодда ддаааддссд сссрдасасе дЕСгЕддсдесс 240
Зо садссадаад асдаддссда дсассасрдс дсссрЕдеЕдудє асадсаассє ддадеЕдсес Зоо часоддаддса ссаадсєдас адесссаддІ саасссаадд ссдсссссад сдеєдассстд 3З6о
Есссссссса дсадсдадда аседсаддсс аасааддсса сссеЕддесєд сссдаєсадс 420 часеЕєстасс саддсдссЯає дассодасддсес сддааддссуд асадсадссс сдсдааддсес 480 чдасдєддада ссассасссс садсаадсад адсаасааса адсасдссдс садсадссас 540 седадсссда сссссдадса дсддаададс сасаддессс асадсрдсса ддедасссас 60 чадддсадса ссдеЕддадаа аассудєддсс сссассдадеЕ дсадс 645 «2105 55 «2115 375 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» УНН СОЗ СН2527 (МН 3-23(12)) «4005 65 чададєдсадс гдссоддааєс Сддсоддсодда седдсдсадс ссдодсоддаєс ЕССсдадасьд (216) адсЕдеЕдсс ссадсоддсесЄ сассеЕссадс асссасдсса ЄдаассдддІ дсдссаддсс 120 сссддсааад дсссддаасд ддсдссссдуда ассадаадса адсасаасаа стасдссасс 180 бо
Басвєасдссуд асадсдєдаа доддссддссс ассассадсс дддасдасад саадаасасс 240 седсасссдс адасдаасад сссдсдддсес даддасассуд ссдєдраста Ед Чдедс9о Зоо сасддсаасс Ссддсаасад стасдЕдеЕсеЕ годе дссо ассддддесса дддсасссес 3З6о чЕдассдбєдЕ саєсе 375 «2105 6566 «2115 15 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» НСрВ1 сСоЗ3 сСН2527 (МН 3-23(12)) «4005 66 ассрасдсса Єдаас 15 «2105 67 «2115 57 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» НСрв2 сСоЗ сНн2527 (МН 3-23(12)) «4005 6567
Зо сдчассадаа дсаадсасаа саасрасусс асстассасу ссдасадсдЕ даадчддас 57 «2105 568 «2115 142 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» НСрЕЗ со3 сн2527 (МН 3-23(12)) «4005 68 сасддсаасс Ссддсаасад стасдрсддеєсе гоодеЕсрдсся ас 42 «2105 569 «2115 327 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» У СсСоЗ СН2527 (МІ, 7-46(13)) «4005 69 саддссдссдуд Єдасссадда асссадсстд асадедеЕсьс седдсддсас сдардассстд (216) асаєдеЕддса дЕеЕЄсвасадд сдссуаєЄдасс ассадсаасо асдссаассд ддсдсаддаа 120 аадсссддсс аддссеєєссад аддассдасс ддсддсасса асаадададс сссгддсасс 180 (516) сседссадає ссадсддаєс ЕСсдссдоода ддаааддссу ссссдасасе дссьддсоадсс 240 садссадаад асдаддссда дсассасрдс дсссгЕдсддЕ асадсаассеє дЕдодеЕдес Зоо часддаддса ссаадсєдас адессста 327 «2105 70 «2115 142 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» І1СрВ1 СОЗ СН2527 (МІ 7/-46(13)) «4005 710 часадссєста саддсдссує дассассадс аассасддсса ас 42 «2105 71 «2115 21 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» 1СрВЕ2 СОЗ СН2527 (МІ 7-46(13)) «4005 71 додасассааса адададсссс є 21
Зо «2105 172 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» І1СрЕЗ СОЗ СН2527 (МІ 7/-46(13)) «4005 Д 7Л12 дсссЕдЕдЧє асадсаассе дЕд9д9аЕд 27 «2105 73 «2115» 1326 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» НС МС5Р М4-3 (С1) «4005 73 саддсдсаас Сдсаддааад сддсссрддс сгддеЕсаадс ссадссадас ссрдадсстд (216) ассеЕдсассд ЄдЕССОддсдуд садсаєсасс адсддстаєє аєєддаасьд даєєсоддсад 120 сассссоддса аддоссгдда аєддассодс басаєсасьє Єсдасудссс Саасаастас 180 аассссадсс Єдаадеєссад адедассаєсс адссдддаса ссадсаадаа ссадесссадс 240 седаадссдс ссадсдсдас адссдссдас ассудссурдЕ астасердсдс сдасессдас Зоо бо
Басеєддддсесс адддсасссе ддєсассдсд Сссадсдсса дсассааддд сссаєссддЕс 3З6о
БбЕсссссвдуд сасссессеєс саададсасс сссдддддса садсддессс ддоддседссгд 420
ЧдЕСааддасе асеЕсссссда ассоддсдасд дсЕдссдасдда асссаддсдс сседассадс 480 й чдасдєдсаса ссЕЄсссоддс єЄдЕССсСсасад Єссссаддас ссстасссссо садсадсдаєд 540 чЧЕЧассдєдс ссеЕссадсад сеЕєдддсасс садассстаса сСссдсаасудсє дааєссасаад 60 сссадсааса ссааддеЕдда саадааадсс дадсссааає сЕсСдЕЧдасаа аасссасаса 6бо
Едсссассудє дсссадсасс Єдаасссссод доддддассудє садеЕсеєсссе сессссссса 720 ааасссаадд асасссеєсає даєсеєсссод ассссодадд Ссасаєсдсдає дадсддсддас 78о0 й чЧдЕЧадссасуд аадасссеєда ддеєсаадссс аассддсасда СддасддсдЯає ддаддеєдсає 840 ааєдссаада сааадссодсу ддаддадсад Сасаасадса сдсассдсдЕ ддЕсадсдеЕс 900 сЕсассуєсс сдсассадда сЕддссдаас додсааддадеЕ асаадедсаа ддЕссссаас 960 ааадсссісс садсссссає сдадаааасс асссссааад ссааадддса дссссдадаа 1020 ссасаддесдс асасссодсс сссассссддд даєдадссда ссаадаасса ддесадсстд 1080 7 ассЕдссєдуд ссаааддссе свраєсссадс дасаєсдссу Еддадеддда дадсааєдад 1140 садссудада асаассасаа дассасдессеЕ сссудєдсвдуд асеЕссдасуд сЕссеЕсстес 1200
Зо сЕСвасадса адсссассудє ддасаададс аддєддсадс ададддаасує сЕЄСсєсаєдас 1260
Ессдєдаєдс аєдадудсеся дсасаассас басасдсада ададсесесьс ссеЕдеЕсессд 1320 чаєааа 1326
З5 «2105 174 «211» 642 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» ІС МС5БР МІ2 (03) «4005 74 часаєссада Єдасссадад ссссадсадс ссдадсдсса дсдсдддсда сададедасс (216) аєсассеєдсс доддссадсса доадсасссдда аассасссда ассддсбаєса дсадаадссс 120 чдасааддссс ссаадссдсеЕ даєссассас ассадсадсс сЄдсасадсудд сдєдсссадс 180 сддЕссадсд дсадсддссс сдддсассдас гбасассстрда ссаєтадсес ссрдсадссс 240 чадчдасеєєсєсда ссасстасста седссадсад Сбассссдссс сдссдасбддас сеЕссддссад Зоо 7 чддаасааадд Єддадаєсаа дсодбасддесд дссдсассає ссдссесссає сессссдасса 3З6о
ЕсЕЧдаєдадс адеЕєдаааєс єддаассдсес СсСсодеЕсоЯосЯає дсссдссдаа Саасесстає 420 (516) сссадачадуд ссааадсаса деЕддаадучдаєд даєаасудссс сссаассодда баасесссад 480 чачадедеєса сададсадда садсааддас адсасссаса дссссадсад сасссгдасд 540 седадсааад садассасда дааасасааа деЕстасдссо дсдаадссас ссаєсадддс 60 сЕдадсєсдс ссудєЄсасааа дадсеєссаас адоадчдачадеЕ де 642 «2105 75 «2115» 336 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» УН МС5Р М4-3 (С1) «4005 75 саддсдсаас Сдсаддааад сддсссрддс сгддеЕсаадс ссадссадас ссрдадсстд (216) ассеЕдсассд ЄдЕССОддсдуд садсаєсасс адсоддссасс ассодаассд дасссоддсад 120 сассссддса адддсссдда асддаєсддс гасаєсасесє Есдасуддсес гаасаастас 180 аассссадсс Єдаадеєссад адедассаєсс адссдддаса ссадсаадаа ссадесссадс 240 сЕдаадссдЕ ссадсдеЕдас адссодссдас ассдссуєдЕ астраседсдс сдасессдас Зоо басеЕддддсесс аддодсасссе ддеЕсассубєд єссадс 336
Зо «2105 76 «2115 18 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» НСрРВ1 МС5Р М4-3 (С1) «4005 7176 адсддсвавєє аєєсоддаас 18 «2105 177 «2115 148 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» НСРВ2 МС5Р М4-3 (С1) «4005 77
Басаєсасеє єсдасуддсес гаасаастрас аассссадсс гбдаадесс 48 «2105 78 «2115 9 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 60 «223» НСРВЕЗ МС5Р М4-3 (С1)
«4005 7Я18 рЕСЯдасвас З «2105 79
«2115 321
«2125 ДНК
«2135 Штучна послідовність «2205
«223» У МС5Р МІ2 (53)
«4005 79 часаєссада Єдасссадад ссссадсадс седадсдсса дсдєдддсда сададедасс (216)
аєсасседсс доддссадсса доддсаєссоудда аасрассрда аседдраєса дсадаадссс 120 чдасааддссс ссаадседсеЕ даєстасрас ассадсадсс гдсасадсудд сдєдсстадс 180 сдадсстадсу дсадсдудсес соууадсассдас Сбасассссда ссаєсадсес сссдсадсссе 240 чадчдасеєєсєсд ссасстрастра седссадсад басеЕстдсеЕс гдссудрддас сеЕссддссад Зоо чддаасааадд Єддадаєсаа 9 321
«2105 80
«2115 33
«2125 ДНК «2135 Штучна послідовність
«2205
«223» І1СОРВ1 МС5Р МІ2 (53) «4005 80 сдддссадсс адддсаєссдуд даасстасстгд аас 33
«2105 81 «2115 21
«2125 ДНК
«2135 Штучна послідовність
«2205 «223» І1СО0В2 МС5Р МІ2 (53)
«4005 81 басассадса дссеЕдсасад с 21
«2105 82
«2115 27
«2125 ДНК
«2135 Штучна послідовність
«2205
«223» І1СОРВЗ МС5Р МІ2 (53)
«4005 82 (516) садсадсасеЕ сеЕдсЕсСсдсс деЕддасс 27
«2105 83 «211» 1353 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» НС СЕА СНІАТА 98-99 «4005 83 саддсдсадс сддсдсадсс сддсдссдаа дсдаадааас ссддадссад Єдесдааддаед (216)
Есседсаадд ссадсддсса сассеєєссасс дадеЕссоддса Єдаасєдоаддес ссдасадасе 120 ссаддссаддуд дссеЕсдааєд дчасдоддссду аєсаасасса адассддсда ддссасстас 180 чЧЕддаададе єсаадддсад адедассесс ассасуддаса ссадсассад сассдсесстас 240 аєддааседс ддадсседад аадсдасдас ассдссурдЕ астасердсдс садаєддадасєс Зоо 7 ЕЕСсСдсстраєє асдєддаадс саєддассас єдоаддадссада дсассассЯає дассасаєсе 3З6о адсдстадса ссаадддссс аєсддеЕсьсєс сссседдсас ссєссессаа дадсассесе 420 чаддоадсасад соддссссдодд сеЕдсстдудсєс аадчасстасо Ессссдаасс доаєдасоаєд 480
Есдєддаасе саддсдсссе дассадсуддс дедсасассе ЕсссуддсрдЕ сстасадесс 540
Есаддасеєсе асеЕсссесад садсудєдудед ассудрдссс ссадсадсеє дддсасссад 60 щ асстрасаєсєЕ дсаасудєдаа ссасаадссс адсаасасса аддеддасаа дааадеєдад 6бо сссааасссс дсдасаааас Ссасасасдс ссассдсдсс садсассєда асссссд9д494д 720 чддассдеЕсад ЕсСсСсссссеЕ ссссссаааа сссааддаса сссесаєсдає сеЕсссддасс 78о0 ссєдаддсса сасдсодсддІ доадсддасдсд адссасдаад ассссдаддс саадесссаас 840
Еддсасдєда асоддсдєдда додеєдсаєаає дссаадасаа адссдсддда ддадсадтгас 900 7 аасадсасудє ассдєдеЕдЧдеЕ садсудессес ассудерсстьдс ассаддасьд дседааєддас 960 ааддадсаса адедсааддеЕ сеЕссаасааа дсссесссад сссссаєсда даааассаєс 1020
Ессааадсса аадддсадсс ссдадаасса саддеєдсаса сссгдссссс аєсссоаддває 1080 чадсєдасса адаассаддеЕ садсседасс ЕдссЕддЕса ааддссЕста ссссадсдас 1140 аєсдссодєда адедодадад сааєдддсад ссуддадааса асграсаадас сасдсесессс 1200 7 чЧЕдсєддасе ссдасудсєс сЕссеЕЕсссс гасадсаадс ЕсассдеЕдда саададсадд 1260 бдадсадсадд ддаасуєсьє сеєсаєдсесс десдаєдсаєд аддсеЕсьдса саассастас 1320 асдсадаада дссЕсСЕсСссЕ дЕСЕССЯдддЕ ааа 1353 «2105 84 «211» 645
Гс10) «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність
«223» ГІС СВА 2БЕ1 «4005 84 чаєаєссада Єдасссадес Ессаєрссеєсс сЕдЕСЕдсає сеЕдеЕдоддада сададесасс (216) аєсасеЕєдса аддссадедс доасЕдЕдЧоадЕ асоасаєдеЕсдд соасдоадсаєса дсадааасса 120 чдоадааадсас сеаадссссе даєсстаєссу дсаєсстасс дсааааддададч адесссаєса 180 аддеЕєсадед дсадеддаєс єдоадасадчає єссасессса ссаєсадсад Єссдсаассе 240 чаачаєєєсу саасесаста седеЕсассаа бгаєтсасасся арссеЕстаре сасаєєвєддс Зоо садддсасса адсссдадає саадсдсасуд дсддссдсас сасстдессес сассєссссд 3З6о ссаєсєсдаєд адсадссдаа асссддаасс десссссдссд сдсдсссдсе даасаасесс 420 баєсссадад аддссаааде асадсдоддаад дсддасаасуд сссессааєс доаоадсаасссс 480 саддачдадсд Ссасададса ддасадсаад дасадсассої асадссссад садсасссгд 540 асдсеєдадса аадсадасса сдадааасас ааадестасуд ссрдсдааде сасссаєсад 60 чдассЕдадсеЕ сдсссдеєсас ааададсеєсєс аасададдвач адесаес 645 «2105 85
Зо «2115 363 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205
З5 «223» УН СЕБА СНІАТА 98-99 «4005 85 саддсдсадс сддсдсадсс сддсдссдаа дсдаадааас ссддадссад Єдесдааддаед (216)
Есседсаадд ссадсуддста сасссссасс дадеЕєсддса ЕдаасеєдддЕ ссдасаддсе 120 ссаддссадд дссссдаасд дасдддсессдда ассаасасса адассддсда ддссасстас 180 чЧЕддаададе єсаадддсад адедассесс ассасуддаса ссадсассад сассдсесстас 240 аєддааседс ддадсседад аадсдасдас ассдссурдЕ астасердсдс садаєддадасєс Зоо
ЕЕСсСдсстраєє асдєддаадс саєддассас єдоаддадссада дсассассЯає дассасаєсе 3З6о адес 363 «2105 986 «2115 15 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» НСРВ1 СЕА СНІАТА 98-99 бо «4005 86 чадеЕєсддса Єдаас 15 «2105 87 «2115 51 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» НСРВ2 СЕА СНІАТА 98-99 «4005 87
БЕддаєсааса ссаадассудд сдаддссасс гасдєддаад адесссааддад с зі «2105 88 «2115 36 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» НСРВЕЗ СЕА СНІАТА 98-99 «4005 88
Еддчасеєєсду сссаєтасує ддоаадссаєсдд дастас 36 «2105 89 «2115 324 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» У СЕА 2Б1 «4005 89 чаєаєссада Єдасссадес Ессаєрссеєсс сЕдЕСЕдсає сеЕдеЕдоддада сададесасс (216) аєсасеЕєдса аддссадедс доасЕдЕдЧоадЕ асоасаєдеЕсдд соасдоадсаєса дсадааасса 120 чадааадсас сеаадсеєссе даєстаєєссо дсаєсссасс дсаааадоада адссссаєса 180 аддеЕєсадед дсадеддаєс єдоадасадчає єссасессса ссаєсадсад Єссдсаассе 240 чаачассєєсду саасесаста седссассаа Састасассс аєссеЕссаєє сасуаєсеєддас Зоо садддсасса адсссдадає саад 324 «2105 90 «2115 33 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» І1СОВБ1 СЕА 2Р1 «4005 90 ааддссадед соддсєдсдоад басвгаєдеЕЕ дсд 33 бо
«2105 91 «2115 21 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» І1СО0В2 СЕА 2Р1 «4005 191
Есоддсаєссє ассдсаааад 4 21 «2105 1392 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» І1СОРВЗ СЕА 2Р1 «4005 92 сассаасаєсе асасссаєсс єсвавєесасу 30 «2105 93 «2115 642 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «2205 «2235» ІС сСоЗ СН2527 (Сковвтар, МІ-СНІ1) «4005 193 саддссдссдуд Сдасссадда асссадсссд асадсдсссс ссддсддсас сдєдассстд (216) асаєдеЕддса дЕеЕЄсвасадд сдссуаєЄдасс ассадсаасо асдссаассд ддсдсаддаа 120 аадсссддсс аддссеєєссад аддассдасс ддсддсасса асаадададс сссгддсасс 180 сседссадає ссадсддаєс ЕСсдссдоода ддаааддссу ссссдасасс дЕСЄддсдсс 240 садссадаад асдаддссда дсассасрдс дсссгЕдсддЕ асадсаассеє дЕдодеЕдес Зоо часоддаддса ссаадсєдас адедссдадс адсдссссса ссаааддесс СсссЯсаєсе 3З6о ссеЕссддсессС ссадссссаа досссассест ддаддсассуд седсеЕсссдд ардссесатд 420 аадчаєвтаєє єєссеЕДдадсс єдЕЧасадесд сСсссддааса дсоддадсасс дасссстсодда 480
ЧдЕдсасасеЕс ЕссссуссдЕ дсЕдсадесс сСседдассдЕ асадссеєдад садсодоєдаєд 540 асадедссса дсадсадссе доддсасссад асссрасассс дсаасдсдаа ссасаадссс 60 адсаасасса аддеЕддасаа дааддесддаа сссаадеЕсСья де 642 «2105 194 «2115 2055 «2125 ДНК
Гс10) «2135 Штучна послідовність
«223» МОС5Р М4-3 (С1) (УН-СНІ) - со3 сНн2г527 (Сковвтар УН-СК) -
ЕС(«виступ») РЗ3З29СІАТА «4005 94 саддсдсаас Сдсаддааад сддсссрддс сгддеЕсаадс ссадссадас сссдадсстд (216) ассеЕдсассд ЕЄдЕССЯОдсодд садсаєсасс адсддстаєсс ассддаассд даєсссддсад 120 сассссоддса аддоссгдда аєддассодс басаєсасьє Єсдасудссс Саасаастас 180 аассссадсс Єдаадеєссад адедассаєсс адссдддаса ссадсаадаа ссадесссадс 240 седаадссдс ссадсдсдас адссдссдас ассдссурдЕ астасрдсдс сдасессдас Зоо й Басеєддддсесс адддсасссе ддєсассдсд Сссадсдсса дсасаааддд ссссадсдасєд 3З6о
БбЕсссеЕСсСвбдуд ссссврадсад саададсаса сСссддсддаа садссдссс дддседссес 420
ЧЕдааддасс асссесссда дсссдеЕЧдасс дсдЕССтоода ассстьтдддсудс сседасаадс 480 чдасдєдсаса ссЕсЕссадс саєдссдсад адсадсддес Єдсасессссо дадсадсдаєд 540
ЧдЕСсассдєдс сегадсадсад сседддсасс садассстаса сСссдсаасудс даассасаад 60 7 сссадсааса ссааадсдда саадаадудсд дадсссаада дседедаєда сдодаддадад 6бо
Ессддаддсуд даддаєссда доадєдсадссд ссддааєссд дсддсддасс ддесдсадссо 720
Зо часодаєсеЕс Едчадассдад сЕдсдссдсс адсоддсесса ссеЕєсадсас стасодссаєд 78о0 аасеєдддеєдс дссаддсссс Єддсаааддс ссддаасдду сЄдЕсСссддає садаадсаад 840
Басаасаасе асдссасста срасодссдас адсдсдаадд дссддЕссас саєссадссд4д 900 7 часдасадса адаасасссеє десасссдсад асдаасадсс сдсдддссда ддасассдсс 960 чЧЕдбЕасваєс дЕдЕдсддса сддсаасесвс ддудсаасадсе аєсєдеЕдеЕСсСьсЯ дЕЕсдсстас 1020 бддддссаддуд дсасссєсде дассудєдсса адсудссадсуд Соддссусесс сЕсСсудЕдеЕСЕ 1080 авсеЕвесссс саєссудаєда асадсєдааа адсуддсассу ссеЕСсудєсЯаЕ деЕдесссодсвд 1140 аасаавеєсєес ассссадудда адссааадьд садеддааад Єддаєаасдс асеЕдсадесс 1200 7 чдасаасеєссс аддааєстєдеЕ дасадаасад дассссаадд асадсассса ссссседссс 1260
Ессасссєда саседеЕСстаа ддсєдаєсає дадааасаса аадесвасдс седсдаадес 1320 асссаєссадд дсссдадсес дсссдесаса аачдадсесса асадчодддада чЧчеЕдесдасаад 1380 асссасассє деЕсссссеЕсуд Есседссссє даадсеЕдссд дсудессесс ЕДЕДЕСССТд 1440
БбЕссссссаа адсссаадда сасссєдаєд ассадссдда сссссдаадс дасссдсдагд 1500 7 чЕдЧдЕддаєд ЄдЕсссасда ддассседаа дЕдаадесеєса аєєддеасЯає ддасоодсаєд 1560 чаадедсаса асдссаадас ааадссдсдда даддадсадс асаасадсас дсассдаєдагд 1620 (516) дЕсадсдЕсс Ссассуєссе дсассаддас сддсєдааєд дсааддадса саадесдсаад 1680 дЧдЕСЕСсССсСааса аадсссесдд сдсссссаєсс дадаааасса Ссоссааадс сааадддсад 1740 ссссдадаас сасаддсдсба сасссрдссс ссаєрдссоддда аєдадсердас саадаассад 1800 дЕСадссвєдЕ доасодсссддЕ саааддссєс Сассссадсу асаєсдссоЯє осдадеЕдодад 1860 адсааєдддс адссддадаа саассасаад ассасдсссс ссдсдссдда сессдасддас 1920
ЄссеЕЕсСЕссс сссасадсаа дсеЕсассдед дасаададса ддєЕддсадса ддоддаасдаес 1980 й вЕСЕСаєдсе ссдеЕдаєдса Едаддсесьд сасаассасе асасдсадаа дадссесессс 2040 сЕдЕСЕССЯду дсааа 2055 «2105 195 «211» 1326 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» МС5БР М4-3 (С1) (УН-СНІ1І) - Ес(«западина») РЗ?2ОЗСІАТА «4005 95 саддсдсаає Сдсаддааад сддсссгддс сеЕддЕсаадс ссадссадас ссеЕдадссед (216) ассеЕдсассд ЕЄдЕССЯОдсодд садсаєсасс адсддстаєсс ассддаассд даєсссддсад 120 сассссддса адддсссдда асддаєсддс гасаєсасесє Есдасуддсес гаасаастас 180 щ аассссадсс Єдаадеєссад адедассаєсс адссдддаса ссадсаадаа ссадесссадс 240 седаадссдс ссадсдсдас адссдссдас ассдссдсдс ассассдсдс сддасессдас 300 баседддодсс адддсасссе ддЕсассудєд Сссадсусса дсассааддд ссссессагд 3З6о
БбЕсссссвдуд сссссадсад саададсасс адсддсддса садссдсссс доддседссгд 420
ЧдЕСааддасе асеЕєссссда дсссуаєЄдасс дсдссссдда асадсуддадс ссрдассьсс 480 7 чдасдєдсаса ссЕЄссссоас саєдссдсад адссссддес бдсасадссо дадсадсдаєд 540
ЧдЕСсассдєдс сЕЄсСвадсад сседддсасс садассстаса сСссдсаасудс даассасаад 60 сссадсааса ссааддєдда саадааддед дадсссаада дсєдсдасаа аасссасаса 6бво
ЕдсссассудєЄє дсссадсасс єдаадссдса доаддддассддєс садсесссссо сессссссса 720 ааасссаадд асасссеєсає даєсеєсссод ассссодадд Ссасаєсдсдає дадсддсддас 78о0 7 чЧдЕЧадссасуд аадасссеєда ддеєсаадссс аассддсасда СддасддсдЯає ддаддеєдсає 840 ааєдссаада сааадссдсуд ддаддадсад басаасадса сдрассурдЕ ддесадсєс 900 сЕсассуєсс сдсассадда сЕддссдаас додсааддадеЕ асаадедсаа ддЕссссаас 960 ааадсссісуд дсдсссссає сдадаааасс асссссааад ссааадддса дссссдадаа 1020 ссасаддсдс дсасссодсс сссассссоудд даєдадсерда ссаадаасса ддесадссес 1080 7 Есдєдсдсад Єсаааддссе ссаєсссадс дасаєсдссдя ЕддадеЕддда дадсааєд9ад 1140 садссудада асаассасаа дассасдессеЕ сссудєдсвдуд асеЕссдасуд сЕссеЕсстес 1200 сЕСЧдєдадса адсссассудє ддасаададс аддеєддсадс аддддаасує сеЕссєсаєдс 1260
Ессодєдаєдс аєдаддсеся дсасаассас Сасасусада ададссеєссс ссеЕДдЕСТСсСд 1320 чаєааа 1326 «2105 96 «2115 642 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «2235» ІС сСоЗ СН2527 (Сковвтар, МІ-СНІ1) «4005 96 саддссуєсу Єдасссадда асссадссєд асадедссьс седдсддсас сдеЕдчасссюд (216) асаєдеЕддса дЕеЕЄсвасадд сдссуаєЄдасс ассадсаасо асдссаассд ддсдсаддаа 120 аадсссддсс аддссеєєссад аддассдасс ддсддсасса асаадададс сссгддсасс 180 ссгбдссадає сСсадсддаєсєс сссдссддда ддаааддссуд сссгдасасс дЕссддсдсс 240 садссадаад асдаддссда дсассасрдс дсссгЕдсддЕ асадсаассеє дЕдодеЕдес Зоо
Зо часодаддса ссаадссдас адедсєдадс адсдсеєсєсса ссаааддесс ЕЄЕссСсСаєдєве 3З6о ссеЕссддсессС ссадссссаа дісссассест ддаддсассу седсссссдд асдссессзед 420 аадчаєвтаєє єєссеЕДдадсс єдЕЧасадесд сСсссддааса дсоддадсасс дасссстсодда 480
ЧдЕдсавасеЕє єссссодсеЕдЕ дсеєдсадссс сссддассдс асадсссдад садсодсдаєд 540 асадедссса дсадсадссе доддсасссад асссрасассс дсаасдсдаа ссасаадссс 60 адсаасасса аддеддасаа дааддєддаа сссаадессюе де 642 «2105 397 «2115 2082 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» СЕА СНІАТА 98/99 - СОЮЗ СН2527 (Сгове5тар УН-СК) - Ес(«виступ»)
РЗ3З29СТ1АГА «4005 597 саддсдсадс сддсдсадсс сддсдссдаа дгдаадааас седдсдссад сдєдаадчаєд (216)
Есседсаадд ссадсоудста сасссєсасс дадсссоодса Єдаассдоддс ссдасаддсеес 120 сссддасадд дсссддаасд дасдддссдуа ассаасасса адассддсда ддссасстас 180 чЧЕддаададе Єсаадддсад адедассссс ассассдаса ссадсассад сассдсесстас 240 бо аєддаасеєдс ддадссеєдад аадсдасдас ассдссдсдс ассассдсдс садаєсдддас Зоо
ЕЕСсСдссвасе аєдеддаадс саєддассас сддддссаддад дсассассдусє дассддєсдессе 3З6о адеЕдсвадса сааадддсесс садсуаєдсЕсс ссоссддесс ссадсадсаа дадсасаєссс 420 й чдасоддаасад ссдссседдд сеЕдсссддсс ааддасстасо сссссдадсс сдєсдасадед 480
Есседдаасе сеЕддсдсссЕ дасаадсддс дсдсасассо ссссадссддс дседсададс 540 адсоддсстдс асссеЕссдад садсдєддеЕс ассудсдссста дсЕСсСадссо дддсасссад 60 ассрасаєсєЕ дсаасудєдаа ссасаадссс адсаасасса аддсддасаа чаададєсддваа 6бо сссаададсс дсдаєсддсдд аддсддсессс ддаддсоддад даєссдадде дсадстдстд 720 й чааєсєддсоа дсодасеєдадє дсадсссддс ддасссссда дассдадссд Єдссдссадс 78о0 чдасЕєЄсассе Есадсасстра сдссаєдаас Сдддсдсдсс аддсссстдда саааддсесстд 840 чааєдддЕдс сссддаєсад аадсаадсас аасаастасу ссассстасса содссддасадс 900 чЧЕЧаадддсес додЕссассає садссдддас дасадсаада асассссдса ссгсдсадаєд 960 аасадссеєдс доадссдудадда сассдссдед бастаєсдєд Едсддсасдд саасеЕєссддас 1020 7 аасадсваєд ЄЯдЧЕСсСЕЕдУЄЕ Едссврассдуд додссадддса сссеЕсудбдас сдЕдЕСаадсес 1080 чдсвЕадсуєдд ссдесссссеєс сагдесваєс сЕссссссає ссдаєдааса дсеЕдаааадс 1140
Зо дасассдссс ссудєсооєсооєд єЕСЕДСЄдаас аасеЕсеЕсасс ссадддаадс гааадсосад 1200 гЕддааадедд аєаасдсасе дсадессддс аасесссадд аарсеєдедас адаасаддас 1260
Ессааддаса дсассрасесс ссеЕдеЕссссс асссєдасас ЕдЕСсааддс Едаєтаєдад 1320 7 ааасасааад Єсбасдссвд сдаадссасс сассадддес Єдадсссдсесс сдссасааад 1380 адсЕєсааса доаоддададсд Єдасаадасс сасассєдеЕс ссссеЕрдЕеЕсСс Едссссосдаа 1440 дсЕдсЕдодсу дссссЕсСЕдЕ ЧдсЕССЕдДсесС сссссааадс ссааддасас сседаєдаєс 1500 адссддассс ссдаадеєдас сєдсдєоддЕд дЕддаєдедЕеЕ сссасдадда сссєдаадед 1560 аадеєсааєє додсасодєдда сододсодсддаа дсдсасаасуд ссаадасааа дссдадсдадддад 1620 7 чадсадеаса асадсасуба ссуєдЕддЕеЕсС адсуєссьса ссудєсстдса ссаддассдд 1680 седаасддса аддадсасаа дсдсааддесс сссаасааад сссесддсдс ссссаєсдад 1740 ааааассаєсо ссааадссаа адддсадссс сдадаассас аддедсасас сссдссссса 1800 бдссодддаєд адсеЕдассаа даассаддес адссеЕдеЕдучє дссеЕддЕСаа аддсеєсестає 1860 сссадсдаса Ссдссдсдда дсдддададс аасдддсадс сддадаасаа сграсаадасс 1920 7 асдссеєсссуд ЄдсеЕддасесс сдасуддсесєсс СЕСсСЕсссЕсеЕ асадсаадсе сассуєддас 1980 аададсаддЕ додсадсадду даасдеєссес ссаєдсессдя Єдаєдсаєда ддсЕСЕдсас 2040 (516) аассасваса сдсадаадад ссеЕСЕСсСсСвУ ЄсессСсодуаєба аа 2082
«2105 198 «211» 1353 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» СЕА СНІАТА 98/99 (УН-СН1І) - Ес(«западина») РЗ29СІАТЇА «4005 98 саддсдсадс сддсдсадсс сддсдссдаа дсдаадааас ссддадссад Єдесдааддаед (216)
Есседсаадд ссадсддсва сассеЕссасс дадсссддса СдаассдддІ ссдасаддсс 120 ссаддссаддуд дссеЕсдааєд дасдододседд аєсаасасса адассддсда ддссасстас 180 чЧчЕддаадчаде Єсаадддсад адедассссс ассасдддаса ссадсассад сассдсесстас 240 аєддаасеєдс ддадссеєдад аадсдасдас ассдссдсдс ассассдсдс садаєсдддас Зоо 7 ЕЕСсСдсстраєє асодєддаадс саєддассас сддддссаддад дсассассдусє дассддєсдессе 3З6о адсдстадса ссаадддсесс сеЕСсСсЯдсдЕсс ссссгрддссс ссадсадсаа дадсассадс 420 чдадасоддсасад ссдсеЕСсССсдад сеЕдсстддудеЕсС ааддастасе сссссдадсс соаєсЄдассоатд 480
Есседдааса дсодадсссе дассеЕссддс дсдсасассо сСссссдссдає дссдсададес 540
ЕсЕддссЕдЕ аєадссеєдад садсоасддсс ассдсдсссс ссадсадссо дддсасссад 60 щ асстрасаєсєЕ дсаасуєдаа ссасаадссс адсаасасса аддеддасаа дааддеддвад 6бо сссаададсс дсдасаааас Ссасасаєрдс ссассдрдсс садсассрда адсесдсаддад 720 чддассдеЕсад ЕсСсСсссссее ссссссаааа сссааддаса сссеЕсаєдчає сесссддасс 78о0 сссдаддсса сасдсодсддІ ддсддасудсрд адссасдаад асссрдадде саадеесаас 840
Еддеасодєда асоддсодєдда додєдсасаас дссаадасаа адссдсддда ддадсадгас 900 7 аасадсасудє ассдєдеЕдуЧдє садсодаєссоіс ассдссссдс ассаддассд дседааєсддас 960 ааддадесаса адедсааддеЕ сессаасааа дсссісддсд сссссаєссда даааассаєс 1020
Ессааадсса аадддсадсс ссдадаасса саддедеЕдса сссеЕдссссс аєсссоадває 1080 чадсєдасса адаассаддеЕ садссеєсссуд бдсудсадеса ааддсеЕсєсса Есссадсдас 1140 аєсдссодєдоа адедоддадад сааєдддсад ссддадааса ассасаадас сасдсессссс 1200 7 чЧЕдсєддасе ссдасудсєс сЕссеЕсссесС деЕдадсаадс ЕсассдеЕдда саададсадд 1260 бдадасадсадуд ддаасуєсьє сссаєдсссс дЕДдаєдсаєд аддсеЕссдса саассассас 1320 асдсадаада дссЕсСЕСссЕ дЕСЕССОдДУЯЄ ааа 1353 «2105 199 «211» 645
Гс10) «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність
«223» ІС рР4А7 с5 «4005 99 чаааєсдеєдеЕ Єаасдсадес Єссаддсасс ссдссЕссдЕ сессадддада аададссасс (216) сЕСЕСсСссдса дддссадсса дадсдеЕсадс адсадстасс гадссрддра ссадсадааа 120 ссеЕддссадуд сссссадудсс ссссаєстає ддадсаєсєсса дсадддссас Сдодсаєссса 180 часаддеєєса деЕддсадедуа аєссдддаса дассссассс ссассаєсад садассддад 240 сссбдаадасс ссдсадсдса сСсассдссад садсаєддра дсесассудсе дасдеЕссоддс Зоо й саддддасса аадсддааас сааасдрасуд деЕддсрдсас сасрсеЕдесье сарсессссд 3З6о ссаєсєсдаєд адсадссдаа асссддаасс десссссдссд сдсдсссдсе даасаасесс 420 баєсссадад аддссаааде асадсоддаад деЕддаєаасу сссеЕссааєс доадеаасесс 480 саддададсд Ссасададса ддасадсаад дасадсассо асадссссад садсассстд 540 асдсеєдадса аадсадасса сдадааасас ааадсссасд сссдсдаадс сасссаєсад 60 7 чдассЕдадсеЕ сдсссдеєсас ааачадсссс аасаддддад адсді 645 «2105 100
Зо «211» 642 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220»
З5 «223» 1с сСр3 СН2527 (Сковвтар, УІ-СНІ1) «4005 100 саддссдссдуд Сдасссадда асссадсстд асадедеЕсьс ссддсддсас сдєдассстд (216) асаєдсддса дЕсСстасадуд сдссдЕдасс ассадсаасе асдссаасєд доасдсаддаа 120 аадсссддсс аддссеєєссад аддассдасс ддсддсасса асаадададс сссгддсасс 180 ссгбдссадає сСсадсддасєс ссосдсрдодда ддаааддссд сссрдасасе дЕСгЕддсдесс 240 7 садссадаад асдаддссда дсассасрдс дсссгЕдсддЕ асадсаассеє дЕдодеЕдес Зоо часоддаддса ссаадсєдас адедссдадс адсдссссса ссаааддесс СсссЯсаєсе 3З6о ссЕССдддсссС ссадссссаа дЕССассЕсССЇ додаддсассу сЕдсссесдуа асдссссоовєд 420 аадчаєстаєє єєссеЕДдадсс єдЕеЕЧасадед Єссєддааса дсодадсасе дассеєссода 480
ЧдЕдсавасеЕє єссссодсеЕдЕ дсеєдсадссс сссддассдс асадсссдад садсодсдаєд 540 7 асадедссса дсадсадссе доддсасссад асссрасассс дсаасдсдаа ссасаадссс 60 адсаасасса аддеЕддасаа дааддєддаа сссаадессєе де 642 60 «2105 101
«211» 2064 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» рР4-47 с5 (УН-СН1І) - СОЗ3 СН2527 (СковвІар УН-СК) - Ес(«виступ»)
РЗ29СІАТА «4005 101 чадаєдсаає єЧдЧсСсодчадеЕС Содоаодддадоасєс ЄСгоддсасадс ссдодддоадЕСсС сссдадасесс (216)
ЕссеЕдедсад ссеЕссуддаєє сассеЕссадс адссасдсса сСдадссдддс ссдссаддсе 120 ссадддаадд дассддадсд ддссссадсе аєсадесддра деЕддеЕддсад сасагастас 180 й чдсадасеєссд Єдаадддссд дЕєЄсассаєс сСссададаса ассссаадаа сасдссдсає 240 ссдсадаєда асадсссдад адссдаддас асддссдтає аєстаседесдс даааддсадс Зоо ччаєєсдасс ассдодддсса аддаассстуд дЕСсассуєсєсеЕ сдадесдсвад сасаааддас 3З6о сссадсдсдс сссссссддс сссгадсадс аададсасає седдсддаас адссдссстд 420 чЧдасЕдссЕсд Єдааддаста сЕєЕсСссдад сссдсдассу гєдЕССЕддаа сЕСЕДДСссСс 480 7 сєдасаадсд дсдсдсасас ссссссадсс деЕдсесдсада дсадсддесе драсеєсестд 540 адсадсдєдд Єсассдєдсс бадсадсадс ссдддсассс адасстасає ссдсаасдаєд 60
Зо аассасаадс ссадсаасас сааадеддас аачаадчдсєдуда адсссаачад сєдедчаєсд9с 6бо ччвадчадоадЕ ссодадоадсодд аддаєссдад дсдсадссдс сбддааєссда сддсдоддассгд 720 чЧЕдсадссвд дсодаєсєсе дадассдадс сдсдссдсса дсддссссас сеЕссадсасс 78о0 7 Басдссаєда асеєдддеєдсо ссаддссссо ддсаааддсесс бддаасдддЕ дЕсссддаєс 840 адаадсааде асаасаасвра сдссасстрас гасдссдаса дсдєдааддда ссддессасс 900 ассадссддд асдасадсаа даасассстуд Сасссдсада Єдаасадссо дсддодассдад 960 часассдссд Єдсасваєсд єдеЕдсддсас додасаассссу дсаасадсса ЕДдЕДЕСЕЄСО9Ї 1020
ЕЕєдссвасе доододссаддуд сасссссдбд ассдєдеЕСсаа дсдссадсує ддссдсеЕссс 1080 7 ЕссуєдЕсєва єсеЕЕссссос асссддаєдаа садссдаааа дсддсассдс сессдєссдавд 1140
ЄдЕСЕдсеЕда асаасесеса сссвадоддаа дссааадедс адеддааадеі ддаєсаасдса 1200 сеЕдсадессуд дсаассссса ддааєсеіЧдсд асадаасадуд асессаадда садсасстас 1260
ЕссседЕсСсе ссасссєдас аседеЕсьаад дсєдаєсаєд адааасасаа адеЕстасдсс 1320
Едсдаадеса сссаєсаддд ссеєдадсссду сссдссасаа ададссссаа саддддадад 1380 7 бдєдасаада сссасассвд ЕсссссеЕсудєЄ ссбдссссвд аадсеЕдсьдда сддессеєсе 1440 дЕДЕєсСсвудЄ сссссссааа дсссааддас ассседаєда Есадссудас ссссдаадед 1500 (516) ассЕдсдєдд ЄддеЕддаєдеЕ дссссасдад дасссеЕдаад ЄдаадеЕссаа ЕсСодтасчаєд 1560 часддсуєду аадсдсасаа сдссаадаса аадссдсдудуд аддадсадса саасадсасд 1620 бассудєдеєдуд ссадсуєссю сассудєсссьд сассаддасе доасЕдааєда сааддадеас 1680 аадедсаадд ЕсСсСссаасаа адсссесддс дсссссассу адаааассає сессааадсс 1740 ааадддсадс сссдадаасс асаддсдсбас асссрдсссс сасдссдддаа Єдадседасс 1800 аадаассадд Есадссєдсєд десдсседдЕеЕсС аааддсссєсь аєсссадсда саєсддссдаєд 1860 й чадеЕдодада дсааєдддса дссоддадаас аассасаада ссасдссссс сдсдсгсддас 1920
Ессдасуддесє ссеЕЕсеЕсссе ссасадсаад сеЕсассдєдуч асаададсад деЕддсадсад 1980 чадаасудєсє Єсссаєдсесс судєдаєдсає дадодсЕсСтьдс асаассасса сасдсадаад 2040 адссЕсЕссс бдЕссссудуа гааа 2064 «2105 102 «211» 1335 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» рР4Аї7 65 (УН-СН1І) - Ес(«западина») РЗ29СІАТЇА «4005 102 чададєдсаає ЄЧдЕєЄЧОдЧадеЕсС єдоадоададдс сСсддсасадс ссддддддЕсС сседадасес (216) щ ЕссеЕдедсад ссеЕссуддаєє сассеЕєтсадс адссасдсса сСдадссдддс ссдссаддсе 120 ссадддаадд дассддадсд ддссссадсе аєсадесддра деЕддеЕддсад сасагастас 180 чдсачасесссуд Егдаадддссу дЕєсСассаєс сСссададаса асесссаадаа сасдсеєдсає 240 ссдсадаєда асадсссдад адссдаддас асддссдбає ассассдсдс даааддсадс Зоо ччаєєєдасе асеєддддсса аддаасссод дссассдссо сдадсдссад сассаадддас 3З6о 7 сссессдсдс ссссссоддс ссссадсадс аададсасса дсддсддсас адссдсеЕстд 420 часЕдссЕдд Єсааддаста сеЕєссссдад сссдаєсдасся Сдссссддаа садсододадсс 480 сЕдассеєссуд дсдеЕдсасас сЕСсСсссоусс деЕдседсада дЕЄССдЧдсессЕ дсавгадссед 540 адсадсдєдд Єсассдєдсс єєсСЕадсадс ссдддсассс адасстасає ссдсаасдаєд 60 аассасаадс ссадсаасас сааддсддас аадааддедуд адсссаадад седсдасааа 6бво 7 асеЕсасасає дсссассудєд сссадсассеє даадссдсад ддддассдес адссесссес 720
БЕссссссаа аасссаадда сасссосаєсд ассссссдда ссссгдаддс сасаєсдсдаєд 78о0 чЧЕдЧдЕддасд Єдадссасда адассссдад дЕСсаадеЕсса аседдасасуає одасодсоагд 840 чаддеєдсаєба аєдссаадас ааадссдсдд даддадсадс асаасадсас драссаєдед 900 чЧдЕСсСадсдеєсс Єсассдєссе дсассаддас сддссдаасд дсааддадса саадсдсаад 960 7 дЧдЕСЕСсССсСааса аадсссесдд сдсссссаєсс дадаааасса Ссоссааадс сааадддсад 1020 ссссдадаас сасаддсдсд сасссрдссс ссаєсссоода аєдадсєдас саадаассад 1080 чЧдЕсадссЕсеЕ суєбдсусаде саааддсеєЕес бассссадсу асаєсдссдЯяє дддадеЕдддад 1140 адсааєдддс адссддадаа саассасаад ассасдсссс ссдсдссдда сессдасддас 1200
ЄссЕЕсСЕссс ссдеЕдадсаа дсеЕСсассдед дасаададса ддєЕддсадса ддоддаасаес 1260 вЕСЕСаєдсе ссудеЕдаєсдса Єдаддссссд сасаассасе асасдсадаа дадссеЕсссс 1320 сЕдЕСЕССЯду дсааа 1335 «2105 103 «2115 207 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 103
Меє сіп Бек с1у ТПкг Нів Тер Агуд Уаі1 Гей сіу Пец Сув Іецй Іец 5ег 1 в) 10 15
Ууаї с1у Уаі Тер с1у сбіп Авр б1іу Авп біц біц Меє сС1у б1у І1е ТПг 20 25 30
Зо сбіп Тк Рго Тук Ппув Уа1ї бек І1їе бек с1у ТПг ТпПг Уаї Ії1їе Гей ТЕГ
Сув Ркго біп Туг Рго сіу Бек бій Іїе Гей Тер сіп Нібв АвБп Авр Гув
З5 50 з9 бо
Ап о І1е сі1у б1у Авр б1іцшц Авр Авр Туб5 АБп о І1е сіу бБег Авр бій Авр 65 70 75 80 40
Нів Гей бек Гей пув біц Робе бек біц Гец біц біп бек б1у Тук Туг 85 90 95 45
Уаї Сув Тук Рго Акуд сіу бек Ппув Рго б1п Авр Аза Авп Ропе Тукг Ієец 100 105 110
Тук геп Агуд Аза Акуд Уаії Сув біц Авп Сув Меє бій Мес Авр Уаії! Меє 115 120 125 зек УМаі Аїа ТПг І1е Уаї І1ї1е Уаі АвБр Іїе Сув Ії1е ТПг сіу С1Уу Іей 130 135 140
Тецп Геп Геип Уа1ї Тук Тук Тер Бек Гпув Авп Агуд Пув Аїа їув Аза Гу 145 150 155 160 60
Рго Уаі ТПг Агуд б1у Аї1а с1у Аза сі1у с1у Агд біп Агд б1у біп Авп 165 170 175
Пув бій Агуд Рго Рго Ркго Маі! Ркго АвБп Рго Авр Туг бій Рго І1е Агд 180 185 190 пув б1у біп Агуд Авр Гей Туг бек біу гей Авп біп Агд Агд І1е 195 200 205 «2105 104 «211» 198 «212» РЕТ «2135 Масаса Тавсісціагів «400» 104
Меє біп бек с1у ТБг Агуд Тгр Агуд Уаії Гецп с1у Темп Сув Гей Гей 5ег 1 5 10 15
ІІе с1у Уаї Ткр б1у бі1п Авр б1у АБп бій бій Меє сіу Бек Ії1е ТЕГ 20 25 30 біп ТП Рго Туг біп Уа1 бек Іїе Бек с1іу ТПг ТПг Уаї І1е Гей ТЕПг
Зо
Сув бек біп Нів Гей сіу бек бі Аїа біп Тер сбіп Нібв Авп б1у Гув бо
З5
Авпопув біц Авр бек б1у Авр Агд Тец РпоПе Тецй Рго сій Рпе бек бій 65 70 75 80 40 Меє сбіц сбіп бек с1у Тук Тук Маї Сув Тук Рго Акуд біу Бек Авп Рго 85 90 95 бі Авр Аза бек Нів Нів Гей Тук Гей пув Аїа Акд Уаі Сув бій Авп 45 100 105 110
Сув Меє бій Меє Авр Уаі1 Меє Аза Уаі Аїа ТПг І1їе Уаї І1е Уа1ї Авр 115 120 125 50
ІТ1е Сув І1е ТБПг Іец с1у Гей Іец Іїецй Гей Уа1 Тук Тук Тгр бек Гув 130 135 140 55
Ап Акуд пув Аза їув Аза Гув Рго Уаі ТПг Агкуд сС1у Аза с1у Аїа щЩ1У 145 150 155 160 (516) с1у Акуд біп Агуд с1у біп Авп оГПув біц Агуд Рго Рго Рго Уаї Рго Авп 165 170 175
Рго Авр Туг біц Рго І1е Агуд пув біу біп бі1іп Авр Гей Туг Бех щу 180 185 190
Тец АБп бі1іп Агд Агд Пе 195 «2105 105 «2115 15 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» линкер «4005 105 біц Рко Ппув Бек Сув сбіу сіу сіу сіу Бек сіу сіу сіу сіу б5ег 1 5 10 15 «2105» 106 «2115 15 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність
Зо «2205 «223» линкер «400» 106 бій Рго Ппув бек Сув біу сбіу сбіу сб1у Бек сіу с1у сбіу с1у 5екг 1 5 10 15 «2105 107 «2115 227 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 107
Авр Гпув ТПг Нів ТБг Сув Рго Рго Суб Рго Аї1а Рго сій Гей Геш 01У 1 5 10 15 с1у Рго Бек Маії Рпе Гей Рібе Рго Рго пуб Рго Пув Авр ТПг Гей Меє 20 25 30
ІТ1е Бек Агд ТПг Рго бій Уаі ТП Сув Уаї Уаії Уаі1і Авр Уа1і! бек Нів 35 40 45 бі Авр Рго сій Уаі Ппув Рпе Авп Тгр Туг Уаі1 Авр сіу Уаї сіц Уаї 50 55 бо 60
Нів Авп Аза Ппув ТПг пув Рго Акд бій бі біп Туг Авп бек ТПг Туг 65 70 75 80
Агуд Уаї Уаї бек Уаї Гей ТпПкК Уаї Гей Нів біп Авр Тгр Гей Ап 01Уу 85 90 95
Тпув біш Тук Ппув Сув Ппув Уа1 Бек Авп пув Аза Гей Рго Аза Рго І1е 100 105 110 біш ув ТПпг І1їе Бек Ппув Аза Ппув с1іу біп Рго Агд біц Рго Сбіп Уаї 115 120 125
Тук ТпПкЕ Гей Рго Рго бБег Агд Авр бій Гец ТПг Тубв АБп обіп Уаї 5ег 130 135 140
Тецп ТПпгЕ Сув Гей Уаії Ппув с1іу Рпе Туг Рго Бек Авр Іїе Аза Уа1ї сій 145 150 155 160
Тер бій бек Авп біу біп Рго бі Авп Авп Туг Гув ТПг Торг Рго Рго 165 170 175
Уаї Гей Авр Бек Авр сіу бек Рпе РпПе Гей Тук бек пув Гей ТПг Уаї
Зо 180 185 190
Авр Гпув бек Агд Тгр біп бі1іп б1у Авп Уа! Рпе бек Сув Бек Уа1 Меє 195 200 205
З5
Нів біц Аїа Гец Нів Авп о Нів Тук ТПг біп Гув бек Гей бБег Гец б5ег 210 215 220
Ркго с1у Пув 225 «2105 108 «2115 19 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» лидерний пептид «400» 108
Меє Авр Тер ТпПг Тер Агу ч11е їей Рбе Гецп Уаі Аїа Аї1а Аза ТБг с1Уу 1 5 10 15
А1а Нів 5ег 60
«2105 109 «2115 57 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» лидерний пептид «4005 109 аєддасеєдда сседдадаає ссеЕсСЕСссссдд дсддсадсад ссасаддадс ссасесс 57 «2105 110 «2115 57 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» лидерний пептид «4005 110 аєддасеєдда сседдаддає ссеЕсСЕЕсеЕгд деддсадсад ссасаддадс ссасесс 57 «2105 111 «2115 22 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність
Зо «2205 «223» лидерний пептид «4005 111
З5
Меє Авр Меє Агуд Уаі1 Рго Аїа сіп Гей Гец сіу Іец Іец Іецп Іец Тгр 1 в) 10 15
Рпе Рго сб1у А1їа Агд Сув 20 «2105 112 «2115 66 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» лидерний пептид «4005 112 аєддасаєда доддЕсСсссдс Есадсесстьд ддссеЕсстдс гдсЕСЕдддеЕЕ сссаддедсс (216) ададЕдЧЕе 66 «2105 113 «2115 19 бо «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність
«223» лидерний пептид «4005 113
Меє с1у Тер Бек Сув Іїе Іїе гейш Рпбе Гей Уаі Аза ТПг Аз1а ТПг щу 1 в) 10 15
Уаї Нів 5екг «2105 114 «2115 57 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» лидерний пептид «4005 114 аєдвоадчаєдда дсеЕдсаєсає ссеЕсЕссссдд дсадсаасад стассддедс дсаєсєссс 57 «2105 115 «2115 57 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» лидерний пептид
З5 «4005 115 аєдддсеЕддеЕ сседсаєсає ссЕдеЕсеЕсвд деЕддстассу ссасрддаде дсаєесс 57 «2105 116 «2115 57 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» лидерний пептид «4005 116 аєддадсЕдЧдє ссеЕдсаєсає ссЕдеЕсессвд десодссасад ссассоаддсЯає дсасесе 57 «2105 117 «2115 643 «2125 РЕТ «2135 Масаса Тавсісціагів «4005 117
Тецп бек Гей сі сіу Бек Агкуд ТПг Гей ТПг Уа1 Сув Рго біу бек Уаї 1 в) 10 15 60 біп Рко Гей бек Бек біп ТПг Гей Агуд Аїа бБег бек бек Аї1а сС1у ТПг 20 25 30
Авр Рго сіп Тей Гей Гей Тук Агуд Уаі Уа1і Агуд с1у Рго сіп Іец С1Уу 35 40 45
Акуд гей Ропе Ні Аза біп біп Авр бек ТПг сіу бій Аза Гец Уаї Авп 50 55 бо
Рпе ТБПг біп Аїа біцп УМаї Туг Аїа сб1у АБп І1е Гей Ту бі Нів сіц 65 70 75 80
Меє Рго ТПг бій Рго Рбе Тгр біц Аза Ні Авр ТПг Гей бій Гей сіп 85 90 95
Тецп бек бек Рго Рго Аіїа Агуд Авр Уаі Аїа Аза ТПг Гец Аза Уаї А1а 100 105 110
Уаї Бек Рпе бій Аїа Аза Сув Рго біп Агуд Рго бек Нів ІТецй Тгр Гув 115 120 125
Авпопув с1у Пец Тгр Уаі Рго біц б1у бі1іп Акуд Аза Ггув І1їе ТПг Меє
Зо 130 135 140
Аза Аза Ггец Авр Аза бек АвБп Тец ІТец Аза бек Уаі Рго Бек Рго сіп 145 150 155 160
З5
Акд Гей сіц Нібв Авр Уаії Іейп Робе біп Уаі ТПг біп Рпе Рго бБег Аг4д 165 170 175 бі1у бі1іп Гей Гей Уаі бек бій бій Рго Гей Нів Аїа с1іу біп Рго Нів 180 185 190
Рпе Гей біп бек біп Гей Аїа Аїа сіу біп Гей Уаії Туг Аза Нів 01Уу 195 200 205 сі1у б1у б1у ТПг біп біп Авр с1іу Рпе Нів Рпе Агуд Аза Нів Іец сіп 210 215 220 б1у Рго Аїа сіу Аїа ТПг Уа1і Аза с1у Рго біп ТПг бек біц Аза РБПе 225 230 235 240
Аза І1їе ТБПг Уаії Агд Авр Уаії АвБп біц Агуд Рго Рго сбіп Рго сіп Аїа 245 250 255 60 зек УМаії Рго Іїец Агуд І1е ТПг Агуд біу бек Агуд Аза Рго Іїе бБег Аг4д
260 265 270
А1їа сіп Гец бек Уаії Уа1ї Авр Рго Авр бек Аї1а Рго с1у бій І1е сіц 275 280 285
Тук біц Уа1 сбіп Агуд Азїа Ркго Нів Авп о біу Ррпе Гей бек Гей Уаі Щ1У 290 295 300 сбі1у б1у Ркго сіу Рго Уа1і ТПкг Нів Рпе ТПг сбіп Аза Авр Уаї Авр 5ег 305 310 315 320 б1у Акд Іїеп Аза Рпе Уаі Аза Авп сіу Бек бек Уа1і Аїа сіу Уаї РБПе 325 330 335 сіп Гей бек Меє бек Авр біу Аїа бек Рго Рго Гей Ркго Мес бек Гейц 340 345 350
А1їа Уаі1і Авр І1е Іецй Рго бек Аїа І1е б1іп Уаі сіп Гей сбіп Аза Рго 355 36о0 365
Тец бі Маї Рго сбіп Аїа Гей сіу Агуд Бек бек Гей бек біп сбіп сіп 370 375 380
Зо
Тец Акуд Уаії Уаі Бек Авр Агуд бій бі Рго бій Аза Аза Туг Агд Іей 385 390 395 400
З5
І1е сбіп бі1у Ркго Ппув Тук сі1у Ні Іец Іїецп Уаії с1у с1у Агд Рго Аї1а 405 410 415 зек Аїа РібПе бек сіп Гей сіп І1іе Авр біп с1у сбіц Уаї Уаї Рібе А1а 420 425 430
Рпе ТПг Ап о РБбе бек бек бек Нібв Авр Нів Рпе Агуд Уаі Гей Аїа Гей 435 440 445
Аза Акуд с1іу Уаі АвБп А1їа бек Аза Уаі Уаії АБп І1е ТПг Уаї Агд А1а 450 455 460
Тец Ге Нів Уаі Тгр Аїа сіу с1іу Рго Тер Рго сбіп сіу Аїа ТПг Іей 465 470 475 480
Акуд Гей Авр Рго ТПг І1е Іїецй АвБр Аїа сС1у бій ей Аза Ап Агд Тс 485 490 495 (516) сіу бек Маії Рго Нів Рібе Агуд Гей Тей сбіц с1у Рго Акуд Нів с1у Агд 500 505 510
Уаї Уаі Агкуд Уаі Рго Агуд Аіїа Агу ТПг бій Рго с1іу с1іу Бек біп ГІец 515 520 525 уаї бій біп Рпе ТПкг сіп біп Авр Гей сій Авр б1у Агд Іецп с1Уу ГІецй 530 535 540 бі Маї б1у Акд Рго біц с1у Агуд Аза Рго бек Рго ТПг б1у Авр 5ег 545 550 555 560
Тем ТПг Гец біц Гей Тгр Аїа сбіп сбіу Маії Рго Рго Аїа Уаї А1а 5ег 565 570 575
Тец Авр Рпе Аза ТПг бій Рго Туг Авп Аїа Аза Агуд Ркго Тук Бек Уаї 580 585 590
А1ї1а гей Ггец бек Уаі Рго бій Аїа ТПг Акуд Меє сій Аза с1у Ппув Рго 595 бо 605 біц бек бек ТПг Рго ТПг сіу сій Рго сіу Рго Меє Аза бек бек Рго 610 615 620
Зо
Уаї Рго Аїа Уаі Аза пув сіу с1іу Рбе Гей сіу Робе Іец б1п Аз1а Авп 625 630 635 640
Меє Ріре 5ег «210» 118 «211» 643 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «400» 118
Тецп бек Гей Ппув сіу Бек біп ТПг Гей ТПг Уа1 Сув Рго біу бек Уаї 1 5 10 15 біп Рго Гей бек бек біп ТБПг Гей Агуд Аїа бек бек бБег Аїа с1у ТПг 20 25 30
Авр Ркго біп Гец ІТец ІТец Туг Агд Уаі Уаі Акуд с1у Рго сбіп їеш 0Щ1У 35 40 45
Акуд гей Ропе Ні Аза біп біп Авр бек ТПг сіу бій Аза Гец Уаї Авп 50 55 бо 60
Рпе ТБПг біп Аїа біцп УМаї Туг Аїа сб1у АБп І1е Гей Ту бі Нів сіц 65 70 75 80
Меє Рго Рго сій Рго Робе Тгр біц Аїа Нів Авр ТПг Гей сій Іеч сіп 85 90 95
Тецп бек бек Рго Рго Аіїа Агуд Авр Уаі Аїа Аза ТПг Гец Аза Уаї А1а 100 105 110
Уаї бек Рпе біш Аза Аїа Суб Рго біп Нів Рго бек Нів Іец Тгр Гу 115 120 125
Авпопув с1у Пец Тгр Уаі Рго біц б1у б1п Агуд Аза Агу І1ї1е ТПг Уаї 130 135 140
Аза Аза Ггец Авр Аза бек АБп Гец ІТец Аза бек Уаі Рго Бек Рго сіп 145 150 155 160
Агдуд бек бій Нів Авр УМаії Гей Рпе сіп Уаі! ТПг сіп Рре Рго бег Аг4д 165 170 175 бі1у бі1іп Гей Гей Уаі бек бій бій Рго Гей Нів Аїа с1іу біп Рго Нів
Зо 180 185 190
Рпе Гей біп бек біп Тец Аза Аїа с1і1у біп Іїеп Уаії Ту Аза Нів Щ1Уу 195 200 205
З5 сі1у б1у б1у ТПг біп біп Авр с1іу Рпе Нів Рпе Агуд Аза Нів Іец сіп 210 215 220 б1у Рго Аїа сіу Аза Бек Уаі Аза с1у Рго біп ТПг бек біц Аза РБПе 225 230 235 240
А1ї1а І1е ТПг Уа1і! Агуд Авр Уаі АвБп о біц Акуд Рго Рго біп Рго сбіп А1а 245 250 255 зек Уаії Ркго Іїец Агд ІТецй ТПг Агуд біу бек Агуд Аза Рго Іїе бБег Аг4д 260 265 270
А1їа сіп Гец бек Уаії Уа1ї Авр Рго Авр бек Аї1а Рго с1у бій І1е сіц 275 280 285
Тук біц Уа1 сбіп Агуд Азїа Ркго Нів Авп о біу Ррпе Гей бек Гей Уаі Щ1У 290 295 300 60 сі1у б1у Гей с1іу Рго Уаі ТПг Агуд Рпе ТПг сбіп Аза Авр Уаї Авр 5ег
305 310 315 320 б1у Акд Іїеп Аза Рпе Уаі Аза Авп сіу Бек бек Уа1і Аїа с1у І1е РБПе 325 330 335 біп Гей бек Меє Бек Авр сіу Аїа Бек Рго Рго Гей Рго Мес бек Ієей 340 345 350
А1їа Уаі1і Авр І1е Іецй Рго бек Аїа І1е бій Уаі сіп Гей Агуд Аза Рго 355 36о0 365
Тец бі Маї Рго сбіп Аїа Гей сіу Агуд Бек бек Гей бек біп сбіп сіп 370 375 380
Те Агуд Уаії Уаї бек Авр Агуд бій бій Рго бій Аза Аїа Туг Агд Гей 385 390 395 400
І1е сбіп б1іу Рго біп Тук сі1у Ні Іец Іїецп Уаі с1у с1у Агд Рго ТЕГ 405 410 415 зек Аїа Рбе бек біп Рпе сбіп І1е Авр біп с1у сі Уаі1і Уаі1і Рбе Аї1а 420 425 430
Зо
Рпе ТПг Ап о РБбе бек бек бек Нібв Авр Нів Рпе Агуд Уаі Гей Аїа Гей 435 440 445
З5
Аза Акуд с1іу Уаі Авп А1їа бек Аза Уаі Уаі Авп Уаі ТПг Уа1і Агд А1а 450 455 460
Тем Гей Ні Уаї Тер Аїа сіу с1у Рго Тер Рго сіп сСіу Аїа ТПЕг Гей 465 470 475 480
Акуд Гей Авр Рго ТПг Уаії Іецй Авр Аїа с1у бій Гей Аза Ап Агд Тс 485 490 495 бі1у бек Уаі Рго Агуд Рпе Агд Гей Гей бі с1іу Рго Агуд Нів сб1у Агд 500 505 510
Уаї Уаі Агкуд Уаі Рго Агуд Аіїа Агу ТПг бій Рго с1іу с1іу Бек біп ГІец 515 520 525 уаї бій біп Рпе ТПкг сіп біп Авр Гей сій Авр б1у Агд Іецп с1Уу ГІецй 530 535 540 (516) сі Маї б1у Агд Рго бій б1у Акуд Аза Рго с1у Рго Аї1а с1у Авр 5ег 545 550 555 560
Тецп ТПпг Гей сій Гей Тер Аїа сіп сіу Уаі Рго Рго Аїа Уаї Аїа 5ег 565 570 575
Тец Авр Рпе Аза ТПг бій Рго Туг Авп Аїа Аза Агуд Ркго Тук Бек Уаї 580 585 590
А1ї1а гей Ггец бек Уаі Рго бій Аїа Аза Агуд ТПг сі Аза с1у Ппув Рго 595 бо 605
Сі бек бек ТП Рго ТПг сбіу біц Рго сіу Рго Меєсє Аїа бек бек Рго 610 615 620 бі Ркго Аї1а Уаі Аїа пув сіу с1іу Рпе Гей бек Рпбе Гей біц Аїа Авп 625 630 635 640
Меє Рпе 5ег «2105 119 «211» 428 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» МАВА-ауі-пПів
З5 «4005 119 біп Гей ТПг Тпс обі бек Меє Рго Рпе Авп Уаі Аза сіц с1у пув б1іц 1 5 10 15 40
Уаї Гей гей ге Уа1! Нів Авп Гей Рго біп біп їец Рпе с1у Тук 5бег 20 25 30 45 Тер Тук пув с1у бій Агкуд Маії Авр б1у Авп Акуд біп чІ1е Уаії с1Уу Туг
Аза І1е с1у ТБПг біп біп Аза ТБг Рго б1у Рго Аза АвБп Бек с1у Аг4д 50 з9 бо біц Тс І1е Туг Рго Авп Аза бек Гей Гей Іїе сіп Авп Уаї ТіПг сіп 65 70 75 80
Авп о Авр оТПг біу Роре Тук ТПг їец біп Уаї І1їе Ппув Бек Авр Гей Уаї 85 90 95 60
Авп обіц бі Аза ТБг біу біп Рбе Нів Уаі! Тук Ркго бій Гей Рго Гув
100 105 110
Ркго Бек І1е бек Бек АвБп Авп бБег Авп о Рго Уаі сій Авр Гув Авр Аїа 115 120 125
Меє АзТа Рпе ТПг Сув бій Рго бій ТБг біп Авр Тс Тс Тукє Геч Тгр 130 135 140
ТЕр Іїе Авп Авп о біп бек Тец Рго Уаії бек Рго Агд Іец біп Гец 5ег 145 150 155 160
Авп ос1у Авп Агуд Тс Тецй ТПг Гец ІТец бек Уаі ТПг Агуд Авп Авр Тог 165 170 175 с1у Рго Тук біц Сув бій І1їе біп Авп Рго Уаії бек Аза АвБп Агд 5ег 180 185 190
Авр Ркго Уаії ТіПг Іец Авп о Уаї ТПг Тук б1у Рго Авр ТПг Рго ТПг Те 195 200 205 ек Рго Рго Авр бек бек Тук ІГец бек бі1у А1ї1а Авп Гей Авп Гей б5ег 210 215 220
Зо
Сув Нів Бек Аїа Бек Авп Рго Бек Рго біп Туг бек Тер Агд І1е Авп 225 230 235 240
З5 сб1у І1е Рго сіп сбіп Нів ТПг сіп Уаі гейш Рпе Ії1е Аїа пув І1е ТЕПг 245 250 255
Рго Авп о Авп Авп ос1іу ТПг Тугк Аїа Сув Рібе Уаї бек Авп Гей Аїа ТПг 260 265 270 б1у Акуд АБп Авп обБег Іїе Уа1 Ппув Бек Іїе ТПг Уа1 бек Аїа Іец 5ег 275 280 285
Ркго Уаії Уаї Аїа пуб Рго біп І1е Гу5 Аза бек Ппув ТПг ТПг Уа1 ТЕГ 290 295 300 б1у Авр Гув Авр Бек Уа1і Авп Гей ТПг Сув Бек ТПг Авп Авр ТПг 01У 305 310 315 320
І1е бек І1ї1е Агд Ткгр Рпе Рпе губ Авп обіп бек Гей Рго Бек бек бій 325 330 335 (516) Агкуд Меє пув Тецй бек біп с1у Авп І1їе ТБг Тецй бек Іїе Авп Рго Уаї 340 345 350 пуб Акд бій Авр Аза с1іу ТПг Туг Тер Сув біц Уа1 Рпе АБп Рго Ше 355 3З6о 365 зек Мпув Авп о біп бек Авр Рго І1е Меє ІТецй Авп Уаі Авп Туг Авп Аїа 370 375 380
Тец Ркго біп сій Авп Гей Іїе Авп Уаі Авр Гец біц Уаї Іеп Рпе сіп 385 390 395 400 с1у Рго сбіу Бек с1у Гей АБп Авр І1е Рпбе сбіц Аїа сіп ув І1е сі1ц 405 410 415
Тер Нів бій Аза Агуд Аїа Ні Нів Нів Нів Нів Нів 420 425 «2105 120 «211» 360 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» СОЗе «стебель»-Ес(«виступ»)-АУї
Зо «4005 120 біп Авр б1у АБп бі бі Меє сіу с1у Іїе ТПкг сбіп Тс Ркго Тук Гув 1 5 10 15
З5
Уаї Бек Іїе Бек сіу ТПг ТБПг Уаі1і! Іїе Гец ТБПг Суб Рго біп Туг Рго 20 25 30 40 сбі1у бек бій Іїе Гей Тер біп Нів Авп Авр пув Ап І11е с1і1у сб1у Авр 45 січ Авр Авр Гув Авп о І1е сіу бек Авр біцш Авр Нів ІТецй бек Гей Гув бо бі Рпе бек бій Гей бі біп бек с1іу Тук Тук Уа1 Сув Тук Рго Аг4д 50 65 70 75 80 бі1у бек Ппув Рго бій Авр Аза АвБп Рпе Туг Гей Туг Гей Агд Аїа Агд 85 90 95 55
Уаї Бек бій Авп Сув Уаі Авр біш біп Гей Тук Рпе сіп сіу сіу б5Бег 100 105 110 60
Ркго Ппув бек Аза Авр Гув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго
115 120 125 біш ТГешп Гей сіу с1у Рго Бек Уаі Рпе Гец Робе Рго Рго Пув Рго Гув 130 135 140
Авр ТПг Ггец Месє І1е бек Агуд ТПг Рго бій Уаії ТПг Сув Уа1 Уа1 Уаї 145 150 155 160
Авр Уа1 бек Нів біц Авр Рго бій Уаі Ппув Рпе Авп Тгр Туг Уаії Авр 165 170 175 сі1у Маії бій Уаії Нів Авп Аза Ппув ТПг пув Рго Акд бій біц біп Туг 180 185 190
Авп обБек ТПг Туг Агуд Уаії Уаі бек Уаї Ге ТПг Уаії Гей Нів сіп Авр 195 200 205
ТЕр гейш Авп сіу пув біц Тук пув Сув Мпув Уаії бек АвБп Гув Аїа Гей 210 215 220
Рго Аїа Рго І1е біцш Гув ТПг Іїе Бек Гув Аї1а Ппув с1у біп Рго Агд 225 230 235 240
Зо бі Рко біп Уаії Тук ТПкг Гей Рго Рго Сув Агуд Авр біц Тецй ТПг Гу 245 250 255
З5
Авпобіп Уаї бек Іец Ткгр Сув Гец Уаії Гуз б1у Рпе Туг Рго Бек Авр 260 265 270
І1їе Аїа Уаі! сій Тер бій бек Авп с1у біп Рго бій Ап Авп Тук Гув 275 280 285
ТПЕ ТПЕ Ркго Рго Уаї Гец Авр бек Авр біу бек РПе РіПе Іец Туг 5ег 290 295 300
Тпув Гей ТПг Уаі Авр Гпув Бек Агд Тгр біп біп с1у Авп Уаї Ріре 5ег 305 310 315 320
Сув бек Уаї Меє Нів бій Аїа Гей Нів Авп о Нів Тук ТПг біп Гпув бег 325 330 335
Тецп бек Гей бек Рго сіу Ппув Бек сіу с1і1у Гей Авп Авр І1е Рое б1іц 340 345 350 (516) А1ї1а сбіп пув І1е сб1іц Тер Нів сіц 355 3З6о
«2105 121 «2115 325 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» сСрза «стебель»-Ес («западина») «4005 121
Рпе пув І1е Рго І1е бій бій Іїец б1ц Авр Агуд Уаі Рібе Уаї Авп Сув 1 5 10 15
Авп ОТГ бек І1е ТПг Ткгр Уаї біц с1у Тпг Уаї с1у ТПг Гей Гей б5ег 20
Авр І1е ТБПг Агд Тец Авр Тецйп біу Пув Агд Іїе Гей Авр Рго Агд б1Уу 25 Іїе Тук Акуд Сув АвБп о біу ТПг Авр І1їе Туг Гув Авр Пув сій бек ТПг бо
Ууаї біп Уаї1ї Нів Туг Акуд Месє Сув Агд бек бій біп Гей Тук Рпе сіп
Зо 65 70 75 80 б1у Авр Гув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго біц Іецй Іей 85 90 95
З5 бі1у б1у Ркго Бек Уа1і Рпе Гей Рпбе Рго Рго пуб Рго Гув Авр ТПг Іецй 100 105 110 40
Меє І1їе Бек Агуд ТПг Рго біц Уа1 ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 115 120 125 45 Нів біц Авр Ркго бій Маії Ппув Рпе Авп Тгр Тук Уаі Авр сіу Уаї с1ц 130 135 140
Ууаї Нів Авп Аїа Ппув ТПг пув Рго Акуд бій бі біп Туг Авп бек ТПг 50 145 150 155 160
Тук Агуд Уа1 Уа1ї бек Уаї Іїец ТПг Уаї Ггец Нів біп Авр Тгр Гей Авп 165 170 175 55 с1у гув бій Тук Ппув Сув пув Уаі Бек Авп пув Аїа Гей Рго Аїа Рго 180 185 190 60
І1Іе сіц пув ТБПг І1е бек Гпув Аїа Гув б1у біп Рго Агуд бій Рго сіп
195 200 205
Уаї Сув ТПг Гей Рго Рго Бек Агуд Авр бій Гей ТПг пуб Авп о біп Уаї 210 215 220 зек Гец бек Сув А1їа Уаї Ппув бі1у Рпе Туг Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 225 230 235 240 бі Тер бій бек Авп б1іу біп Рго бій Авп Авп о Тук Гпув ТПг Тк Рго 245 250 255
Ркго Уаії Гец Авр бек Авр біу бек РПе Рпе їецп Уа1ї Бек Ппув Гей ТЕГ 260 265 270
Уа1 Авр пуб бек Агкуд Ткгр біп біп б1у Авп Уа! РпПе бек Сув бек Уаї 275 280 285
Меє Нів бі Аїа Ггецй Нів Авп о Нів Тук ТПг біп Гпув бек ТІецй бек Ієецй 290 295 300 зек Рго біу пуб бек бі1у с1у Тец АБп Авр І1е Рпе біш Аза сіп Гув 305 310 315 320
Зо
І1е сій Тер Нів с1іц 325
З5 «2105 122 «211» 658 «212» РЕТ «2135 Мив шивсип1ив 40 «4005 122
Тецп бек Ге сі с1у ТПг Агуд Ппув Гей ТпПг Уа1 Сув Рго біц бек Уаї 1 5 10 15 45 біп Рко Гей бек Бек біп бек Гей бек Аїа бек бек бек ТПг С1у А1а 20 25 30 50
Авр Рго Агуд Нів Іец Іец Туг Агд Уаі Уаі Акуд с1у Рго сбіп їеш 0Щ1У 55 Агд Гечп Гей Нів Аїа сбіп сіп сіу бек Аїа бій сбіц Уаї Гецп Уа1! Авп бо
Рпе ТБПг біп Аїа біц Маї АвБп Азїа б1у АБп І1е Гей Тук бі Нів сіц (516) 65 70 75 80
Меє бек Бек бій Рго Робе Тгр біш Аза Нів Авр ТПг І1е Сс1у Іец Іецй 85 90 95
Тецп бек бек Рго Рго Аіїа Агуд Авр Геш Аїа Аїа ТПг Ггец Аза Уа1ї! Меє 100 105 110
Уаї бек Рпе Авр Аїа Аза Сув Рго біп Агуд Рго бек Агуд ІТецй Тгр Гув 115 120 125
Авпопув с1у Пец Тгр Маії Рго біц б1у бі1іп Акуд Аїа Гпув І1їе ТПг Уаї 130 135 140
Аза Аїа Ггец Авр Аїа Аза АБп о Гец Іец Аза бек Уаі Рго Аїа Бек сіп 145 150 155 160
Акуд бБег Агуд Нібв Авр Уаі! Іейп Робе біп Уаі ТПг біп Рпе Рго ТПг Аг4д 165 170 175 бі1у бі1іп Гей Гей Уаі Бек бій бій Рго Гей Нів Аза Агуд Агд Рго Туг 180 185 190
Зо Рпе Гей біп бек біц Гей Аїа Аїа сіу біп Гей Уаії Туг Аза Нів 01Уу 195 200 205 сі1у б1у б1у ТП біп біп Авр с1іу Рпе Агуд Рпе Агуд Аза Нів Іец сіп 210 215 220 б1у Ркго ТПг сіу ТПг Бек Уаі1 Аза с1іу Рго біп ТПг бек біц Аза РіГе 225 230 235 240
Уаї Іїе ТпПг Уаі1і Агуд Авр Уаї Авп бій Агуд Рго Рго біп Рго сіп Аїа 245 250 255 зек І1їе Рго Іїец Агд Уаі! ТПг Агуд біу бек Агуд Аза Рго Уаї 5ег Агд 260 265 270
А1ї1а сбіп Гей бек Уаії УМаії Авр Рго Авр бек Аза Рго с1іу сій І1е с1ц 275 280 285
Тук біц Уа1 сбіп Агуд Азїа Рго Нів Авп біу Рбе Гей бег Гей Аїа с1Уу 290 295 300
Авр Авп оТПг біу Ркго Ма! ТПг Ні Роре ТПпг біп Аза Авр Уаі1і Авр Аї1а 305 310 315 320 60 б1у Акд їейп Аза Рпе Уаі Аза Авп сіу бек бек Уаі А1ї1а с1у Уаї1ї РПе 325 330 335 сіп Гей бек Меє бек Авр біу Аїа бек Рго Рго І1їе Ркго Мес бек Гейц 340 345 350
А1їа Уаі1 Авр Уаї Іецй Ркго бек ТПг Іїе бі Уаі1і сіп Гей Агд Аза Рго 355 3З6о 365
Тец бі УМаї Рго сбіп Аїа Гей с1іу Агуд ТПг бек Гей бБег Агд біп сіп 370 375 380
Тец біп Уаї І1їе Бек Авр Агуд бій бій Рго Авр Уаі Аза Туг Агд Іец 385 390 395 400
ТПг біп с1іу Рго Гец Тук біу сбіп Гей Гец Уаії сС1у б1у б1п Рго Аїа 405 410 415 зек Аїа РібПе бек сбіп Гей сіп Уаі! Авр біп б1у Авр Уа1і Уа1 РіПе Уаї 420 425 430
Рпе ТПг Ап о РБбе бек бек бек біп Авр Ні Рпе Ппув Уа1і Уа1 Аїа Гей
Зо 435 440 445
Аза Акуд с1іу Уаі Авп А1ї1а бек Аза ТПг Уаії Авп Уаі ТПг Уа1і сіп Аї1а 450 455 460
З5
Тец Ге Нів Уаі Тгр Аїа сіу с1у Рго Тер Рго сбіп сіу ТПг ТБбгЕ Іей 465 470 475 480
Акуд Гей Авр Рго ТПг Уаії Іецй Авр Аза бек бій Гей Аза АвБп Агд ТЕГ 485 490 495 сіу бек Мес Рго Нів Рібе Агуд Гей Тей Аїа с1у Рго Акд Тук б1у Агд 500 505 510
Уаї Уаі Агку Уа1і Бек сбіп с1іу Агуд ТПг бій бег Агд бек АвБп біп Гей 515 520 525
Ууаї бі Нів Рпе ТПкг сіп Агд Авр Гей сіц біц біу біп Тецп с1Уу Гей 530 535 540 бі Маї сб1у Ппув Рго біц с1іу Агкуд Бек ТПг сіу Рго Аїа с1у АвБр Агд 545 550 555 560 60
Тецп ТПпг Гей сій Гей Тер Аїа пув сіу Уаі Рго Рго Аїа Уаї Аїа Іей
565 570 575
Тец Авр Рпе Аза ТПг бій Рго Туг Нів Аїа Аза Ппув бек Тук бек Уаї 580 585 590
А1ї1а гей Ггец бек Уаі Рго бій Аїа Уаі Агуд ТПг сій ТПг бій ув Рго 595 бо 605 б1у Акуд Бек Уаі Рго ТПг сіу сбіп Рго сбіу біп Аїа Аза бек бек Рго 610 615 620
Уаї Ркго ТПг Аїа Аза пув сіу сіу Уаі1 Авр бі1у Іец АвБп Авр І1е РПе 625 630 635 640 сі Аїа сбіп гу5 Іїе бій Тер Ні5 бій Аза Агуд Аїа Нів Нів Нів Нів 645 650 655
Нів Нів

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Зо
    1. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить: (І) перший антигензв'язувальний фрагмент, який являє собою молекулу Раб, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ, яка містить гіперваріабельну ділянку (СОК) 1 важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 4, СОК 2 важкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 5, СОК З важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 6, СОК 1 легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 8, СОК 2 легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 9 ії СОК З легкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 10, де перший антигензв'язувальний фрагмент являє собою одержану в результаті кросинговеру молекулу Раб, в якій або варіабельні, або константні ділянки, зокрема константні ділянки легкого ланцюга Раб і важкого ланцюга Раб обмінені; (ІЇ) другий і третій антигензв'язувальні фрагменти, кожний з яких являє собою молекулу Раб, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СЕА, яка містить СОВ 1 важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 24, СОВ 2 важкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 25, СОВА 3 важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 26, СОВ 1 легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 28, СОВ 2 легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 29 ії СОВЗ легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 30; (І) Ес-домен, що складається з першої й другої субодиниць, які мають здатність до стабільної асоціації, де другий антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці Гар важкого ланцюга з М- кінцем Бар важкого ланцюга першого антигензв'язувального фрагмента, і перший антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці баб важкого ланцюга з М-кінцем першої субодиниці Ес-домену, і в якій третій антигензв'язувальний фрагмент злитий на С-кінці Рар важкого ланцюга з М-кінцем другої субодиниці Ес-домену.
    2. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, за п. 1, в якій перший антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІО МО: 3, ї варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 905, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮО МО: 7.
    З. Активувуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за п. 1 або 2, в якій другий і третій антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 9, 97 Фо, 98 Фо, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності ФЕО ІЮО МО: 23, і варіабельну ділянку 60 легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності ФЕО ІЮО МО: 27.
    4. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за будь-яким з пп. 1-3, в якій перший антигензв'язувальний фрагмент являє собою одержану в результаті кросинговеру молекулу Раб, в якій константні ділянки легкого ланцюга Раб і важкого ланцюга Раб обмінені і яка містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність ЕС ІО МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 7, в якій кожен із другого і третього антигензв'язувальних фрагментів являє собою звичайну молекулу аб, яка містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність БЕО ІО МО: 23, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮО МО: 27.
    5. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за будь-яким з пп. 1-4, в якій Ес-домен являє собою Ес-домен дос, зокрема Ес-домен Ідс1.
    6. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за будь-яким з пп. 1-5, в якій Ес-домен являє собою людський Ес-домен.
    7. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за будь-яким з пп. 1-6, в якій Ес-домен містить модифікацію, яка посилює асоціацію першої й другої субодиниці Ес- домену.
    8. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за п. 7, в якій в СНЗ-домені першої субодиниці Ес-домену амінокислотний залишок замінений на амінокислотний залишок, що має більший об'єм бокового ланцюга, утворюючи тим самим опуклість в СНЗ-домені першої субодиниці, яка може поміщатися в порожнину в СНЗ-домені другої субодиниці, і в СНЗ-домені другої субодиниці Ес-домену амінокислотний залишок замінений на амінокислотний залишок, що має менший об'єм бокового ланцюга, створюючи тим самим порожнину в СНЗ-домені другої субодиниці, в яку може поміщатися опуклість в СНЗ-домені першої субодиниці.
    9. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за будь-яким одним з пп. 1- 8, в якій в СНЗ-домені першої субодиниці Ес-домену залишок треопіну в положенні 366 замінений залишком триптофану (Т366М), і в СНЗ-домені другої субодиниці Ес-домену залишок тирозину в положенні 407 замінений залишком валіну (У407М); в якій необов'язково: (а) у другій субодиниці Ес-домену додатково залишок треоніну в положенні 366 замінений залишком серину (13665) і залишок лейцину в положенні 368 замінений залишком аланіну Коо) (ІЗ3684А); і/або (б) у першій субодиниці Ес-домену додатково залишок серину в положенні 354 замінений залишком цистеїну (53540) й у другій субодиниці Ес-домену додатково залишок тирозину в положенні 349 замінений залишком цистеїну (у349С) (нумерація БО за Кеботом).
    10. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за будь-яким з пп. 1-9, в якій Ес-домен характеризується зниженою афінністю зв'язування з Ес-рецептором і/або зниженою ефекторною функцією у порівнянні з нативним Ес-доменом ІдС1.
    11. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за будь-яким з пп. 1-10, в якій Рсо-домен містить одну або декілька амінокислотну(их) заміну(ін), яка(ї) знижує(ють) зв'язування з Ес-рецептором і/або ефекторну функцію.
    12. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за п. 11, в якій зазначенакйї) одна або декілька амінокислотна(их) заміна(ін) знаходиться(яться) в одному або декількох положенні(ях), вибраному(их) з групи: І 234, І 235 і РЗ29 (нумерація Є за Кеботом).
    13. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за будь-яким одним з пп. 1-12, в якій кожна субодиниця Ес-домену містить амінокислотні заміни І234А, 1235А і РЗ29О (нумерація ЄШ за Кеботом).
    14. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за будь-яким одним з пп. 10-12, де Ес-рецептор являє собою Есу-рецептор.
    15. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за будь-яким з пп. 10-12, де ефекторна функція являє собою антитіло-зумовлену клітиноопосередковану цитотоксичність (АРСО).
    16. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за будь-яким з пп. 1-14, яка складається з першого, другого та третього антигензв'язувальних фрагментів, ЕРс-домену, та необов'язково одного або декількох пептидних лінкерів.
    17. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула за будь-яким одним з пп. 1-16, яка містить поліпептидну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 90, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична ЗЕО ІО МО: 22, поліпептидну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 95, 98 9о, 99 95 або 100 95 ідентична ЗЕО ІЮ МО: 56, поліпептидну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 95, 97 95, 98 90, 99 95 або 100 95 ідентична ЗЕО ІО МО: 57 і поліпептидну послідовність, яка щонайменше приблизно на 95 95, 96 60 Фо, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична ЗЕО ІЮ МО: 58.
    18. Виділений полінуклеотид або багато полінуклеотидів, що кодує (ють) активувальну Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу за будь-яким з пп. 1-17.
    19. Вектор, зокрема експресійний вектор, який містить полінуклеотид або багато полінуклеотидів за п. 18.
    20. Клітина-хазяїн, яка містить полінуклеотид або багато полінуклеотидів за п. 18 або вектор за п. 19.
    21. Спосіб одержання активуючої Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, яка має здатність специфічно зв'язуватися з СОЗ і СЕА, що включає стадії, на яких: а) культивують клітину-хазяїна за п. 20 в умовах, придатних для експресії активувальної Т- клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули, і б) виділяють активуючу Т-клітини біспецифічну ангигензв'язувальну молекулу.
    22. Активуюча Т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула, одержана способом за п.
    21.
    23. Фармацевтична композиція, яка містить активуючу Т-клітини біспецифічну антигензв'язувальну молекулу за будь-яким з пп. 1-17 або 22 і фармацевтично прийнятний носій.
    24. Застосування активуючої Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули за будь- яким з пп. 1-17 або 22 або фармацевтичної композиції за п. 23 для лікування злоякісного новоутворення в індивідуума, який цього потребує.
    25. Застосування активуючої Т-клітини біспецифічної антигензв'язувальної молекули за будь- яким з пп. 1-17 або 22 для приготування лікарського засобу для лікування злоякісного новоутворення в індивідуума, який цього потребує.
    26. Спосіб лікування злоякісного новоутворення в індивідуума, що включає введення зазначеному індивідууму в терапевтично ефективній кількості композиції, яка містить активуючу Т-клітини біспецифічну антигензв'язуючу молекулу за будь-яким з пп. 1-17 або 22 у фармацевтично прийнятній формі.
    27. Спосіб індукції лізису клітини-мішені, що включає контактування клітини-мішені з активуючою Т-клітини біспецифічною антигензв'язувальною молекулою за будь-яким з пп. 1-17 або 22 в присутності Т-клітини. А чн Б Ун В м бе. ЩІ я шо Ук. я» ун Б ст (ке сні. г сні тов, сні сні КСВ що" че де сив АК г у ща сі | с М сі Іа С А В и я их ги б, КА м г --М шо до Га и - т Фіг. 1
    Я г д схо Е ДЕ» ГПтиткєташе, СНІ ці ГептгодСНи Новин ХНА ввнниий
    Син. МН с ооснтн ВН сс й реч во: Я сі я ж яти тю Її а БО есня а що кун У до ме "Ж й й мя я НИ | Га ТА А каф ж НВК! ГУ х 7 хв. в, ке Ж сто З що дк ун кидав СН С в СНІ мо со т У Ой ча сю дя и з тк Зо гошьоніи и В б Стєсні чи й НОДІНК, Ге ці сроя Н ї х ; М КА РА х НІ І й, ів), и Ми Батьківська ЩО І САХОЕЗОРОІУЕРБОТІ І ТСТУВОВІТВТЛ ЛЕТИ ВОНРІКО ЕМО ТТ УРОЗМИУНРВІКУВУТІЗНЮТУКНОКВ ЕВ УТААРТАМ С АСК МООЄТІТУВЕ БО (БЕОД ІВ МО 34) 5 0.0. Б. Шу їз чинила линии тіні тати тини АТО (БЖ ХЮ МО 38 1 сотні нанні Віті тата нн сто В.В. сазана та ніна тата нина тіні ВТ (БО ЗЮ МО 39) 5 піст анчачинінза але ла ант на лану жанна нон ан ст ЕЕ. Ху снзазалентюа тата а та ванла івана сю тнанитя батьківська Зо 1 БТОМТОЗРЗЕУЗАВККУТІУСТАВОМ ХНМУ: МИХ СЮ ИРОНАРКІ ТУТ ВІ НЕОУР НЕ БОВОВОТВЕТ ТІВ МДРЕБВЕАТУ ХО КО РСТЕСЮТИМВІя БІВ (ЕКО 1» МО 43) З бенананааналанана чан Ми зала ча інаала лента нан ана начала но Виза зала ніна нання св ос5БО ХО ОМО 47) ЕНН у є НИК я сн сВ-З3 ІББО ТВ НО БІ 5 сучки ння В Вина сте Фата интюті титани ючи ді зи ечинттитя
    - ХУ й ку х У МоСеР ТУ
    Фк. - и у і МОР х ще св Есізападина! м Есівистут РІгОІАГА ЩО РЗгЯЗІАЕА .
    Фіг. З А Б Ї нава вааннааааннннй 119 ее чинними б знанню живими 485 пеня 200 пенею Дб ення
    Фіг. 4
    «У ХУ ту с ХУ СЕА Ку їх 7 СЕА ;
    щЬ. ; срз ваговАСА |. у РОСА А Б 119 - зеюмююввввввввв ОВ - земними 48 - зможемо 29 змен гестесссвесссвессввессвввссвввсеє 29 - зимою 105 мах
    Фіг. 6
    - Б0о0о 5 20000 й 40000 8 а 15000 Е ЕСво- зам а Б з0о0о є НУ е 10000 шк Ж 26000 їв дї - о и 5 5 5000 її Ко 19000 Е я - Ф я КУ Ен ши Ея 0 ста нні или стул тн і не г я.
    - і. 2 4 6 КУ В) 2 4 | 5 шк і по концентрації антитіпа (ЯМ) івсаконцентраці антитіла (ПМ тТСВдо Ме5Р г «неспрямована» ТОВ
    Фіг. 7 в 40 я 20 мо 20 І Е І: л хід ек «ліжка - В ВЕ а ЕМ УТ АК лю ек - Ор донна БИ форесе дж «дубі я 5 в 5 в 2о -2 0 2 4 -2 о 2 4 Госаконцентрани антитіла спі іо9д концентрації антитіла ПМ як тСВдоМОо5Р 0 «неспрямована» ТОВ
    Фіг. 8 в Г 40 40 о, аа от є ЗБ ІТ» с І тов ЯМИ тот щ х тот Е сонне в и ВВ он 8 о и п аа г, н їЕ тк т -20 Є ди -2 8 2 4 - З "лиш Госконцентрації антитіла (ПМ год концентрації антитіла (ПМ я ТСВдоМо5Р С) «неспрямована» ТОВ І
    Фіг. 8 А Б 100 700 я - о Ф сі З о Бо 50 : і й маш зе шини ни -2 Но. 2 А -- 0 2 А ісаконнентрації антитіла (ПМ) Годконцентрації антитіла (МО яІСВдоМоСБРЕ 0 «неспрямована» ТОВ
    Фіг. 9 в Г 400 100 б 2 -ет ре в о Ф 50 т 50 й а Гак о о з з 0 -- Бона ост ВК. о еВ со - НЕ 2 й -2 0 2 4 ії од концентрації антитіпа (ПМ їоо концентрацієантитіла (ПМ «СВдо МОР «5 «неспрямована» ТОВ ,
    Фіг. 9 А Б 2000 8000 з0о вово ІЗ 5 Е 000 Е 4000 п 5 - 500 - 2000 0 се ее пд тт НВ, ча КК т сидр то ниття 107 00401 1095 105 402 09 192 492 105 концентрація внтитіта (ПМ) концентрація антитра М) в 5000 - 4000 я ТСВ до МОС5Р: «неспрямована» ТОВ - 2000 о ро. нет Фіг. 10 1025 4095 402 1095 106 концентрація антитіпа (пу
    Г 200 Д 2000 - 106 Е Е Бо 100о у -8 а 5 і: -00 . отут тв тає 402 4609 402 4045 495 160-710 КН 10 о хонцентрація антитіна (пад) канцентрація антитіла (ПМ) Е 28000 «ІСВдо МСОР я «неспрямована» ТОВ Б 15000 ш 0000 Е «5000 0 ни о оумаамни і Я: 406 402 404 105 Фіг. 10 концентрація антитіла п М г; ДБ ою Еск- 88 М В 8- ТСбБдДОо сСЕА ЕЕ З000о Кий є Я товрРА? ОЗ т 20000 ЕІ Бо чзооов ч о 2 4 6 Б іс концентрації антитіла (ПЕ в п - в 1500 5 1500 8 8 В 1009 я 1000 5 5 Ен Ж 5 5 є БО Ки 5О0. Ки а ж Е т 5 ЕЕ: о т о в 10: Км те Б 102 т не іодконцентрані антитля ТИ іїодконцентранії антипля (Мі
    Фіг. 11
    А 700 Б т0о -
    Фіг. 12 В во со 50 и УЖ 1 тв 100 509 9050 71600000 4 МТ "ов 4о0о чароо лооода концентрація антитіна (М) концентрація антитіла (М) В 700 Г
    190. - - -- ТСВдоСЕА йо «неспрямована» ТОВ Е лк з 5О х БО Е г 2 5 З 16 100 ооо 0000 100000 4 то 100 000 10000 100000 концентрація антитіла (М) концентрація антитіла (ПМ) 100 180 Е я д - ТСВдДдоСЕА й «неспрямована» ТОВ Фіг. 12 їй с) 50 т БО е Е Б ле РУ І я в З 1 Кн) чо 1000 70090 100000 1 70 190 1069 зМо0000 159006 концентрація антатіпа іп) концентрація антитіла (ПМ) Ж з00 З 100 5 50 т е - їх пе ва Я «Ж г; їй в 8 ГО ЕЕ є о і 7 Ко 100 оо 10000 100000 1 о 106 1000 йО0бо 100000 концентрація антитіла (п) концентрація антитіпа (ПМ
    Фіг. 13 А 1 В оо є 80 Е 80. еЕ еЕ З - 5 пово ; ї во г 7 в ' в ,7 9 «о я Ше 7 а "7 а 2 Е , Е и А В 20 р Я 20 р ле Ж т - , ЕЕ о - Е о З 1 тю то юо 0000 300900 Б ї та о т000 50000 00006 Е с- Кк концентрація антитіла (п) в концентрація антитіла гпМмі в Г -е ТСбдоСЕАСЮВ») г 180. в 19 - ТОВ да СЕАЦСрЯЮ в ти Ат В - во 5 - ТОВ ОРАТІВ в я - в 3 80 «ее тен ОоРАТІСОАН 9 во Е є 8 бо Я о 5 Е ей 40 в Ж Е мк 2 Е 29 /х в З 4 о. 8 8 -- з 7 106 000 чо000о 700000 1 хо чо обо 40000 100000 концентрація антитіла (ПМ) концентрація антитіла іп) д 9000 Е гвово 8о0о -59 ФІ. 13 - - 15000 щ 7. нн. - бю ' - , м / з 10006 я7 5 4000 а , о , гово 5ОвО и шк п- - ч-й о о ня ЩІ 10 чо0 1000 ч0000 збов00 1 7о 100 500 10000 100000 концентрація антитіла (ПМ) концентрація антитіла іп) Ж 279300 З ТОВ до СЕАСОВН 25в0 - ТОВ до СА СОВ -- СВ до СЕАОа 4880 ї 2059. -- ОВ ПРАХ СОВИ ГГ п тенет ГСВОРАТТ М є р - зво "й опе з 1000 7 ш у а 4 а 7080 у 7 во Ж. до - дя. - « - х сте ви У 580 ДЕ; ний ра ас пвк ЯЙ о а 7 70 790 КІ) 10900 лообо0 1 та 700 1900 13000 00000 концентрація антитіла (п) коннентрація антитіла іпМі
    А 2000 Б во
    - 400 (4 Е 3009 - Е З т Е 200. Ж во г ж І ю что Торо 0000 000000 то 100 т00о 10000 0100000 концентрація антитіла іп) концентрація антитіла (пі) В 20060 15000 І-5 Ж -- ТОВ до СЕА -й- «неспрямована» ТОВ Б 10060 Ф Е х 5000 Гн о Фіг. 14 "0 1900 10000 100000 концентрація антитіла (ЯМ) 8000 ГГ во д Б00о -щ- юю - Кз Є Е Е до с Е - Ф - 50 т 2000 й 8 ще то 1000 т0О00о 0100000 «а 400 000 зп0о8 00400000 концентрація антитіла (п) Е їбоо Е ою ї- в - СВ до СБЕА-й о «неспрямована» ТОВ в 500 о Фіг. 14 то 00 000 0000 708000 концентрація антитіла (ПМ
    А Б ан жо чо Е 5 Е Е І ІЗ в 50 З 5 - - Ф п Б 0 8 1 то 0 опо 0000 1 10 100 1006 19060 2СЕА (нг/мл) ЗСЕА (нем)
    Фіг. 15 До лоб Б 100 8 80 ще 80 . їй Е Фіг. 16 В во є во ї є ше 2 З г, 20 5 20 Е о 0 о 1 то зо що зо000 ло0000 7 10 о 000 0000 10000 концентрація антитіла (ам концентрація антитіла (ПМ) В чео Г. лоб ее ее ш Е 50 Е 50 Е ні 2 Б 1 то тво 900 л0ороб 100000 4 та т0о 090 10000 ч00000 концентрація антитіла (ам) концентрація антитіла (ям)
    А А специфічний лізис 7-- кількість копій СЕА через 48 год. зоооо0о во з Ш до х о 200000 в не А 5 Е ; х КЕ - 5 А 20 8 х 100000 А ї їй А г) ЕЕ А Е - І о А, А А о ЦО з жт-- я овес жвшноюнаКооВшжТтолоОоютт т Дт о ке чен зу с Га ЕЕ ВШ ІБ Я Фіг. 17 ов ЗО« об б ж о 55 бтЕшош і - ІФ) «4 я Б А СПЕЦИФІЧНИЙ пізИиС са КІЛЬКІСТЬ КОПІЙ зооопо через 48 год. СЕА во А А 200000 А а А чо А А А А А А А 2а 100000 А А п чи У о 6) ореаос»вБОгОоМмнорчочЕавОюЮОоЧОЮютиМиом ва влачхеюуювни вповБОдвОогКОоО ЕЕ ШЕ МЕНЕА
    ГЕ. зді Ї і "В 7 яЗя 86 б'т о 88 6 те"57 000 Фіг 17 ГФ) г о в о. А специфічний лізис ся кілЬКІСТЬ КОПІЙ СЕА через 48 год. зВроро А во А А А у чу ч А А хх 200000 уче 40 А Ах А 20 то А А У о о пове тгОовмонооче шт аюти ом ІЕЕ КНУ не хек ЗБЕ таИНа 2-5 ТЕН Фіг. 17 оо ба лоб б т б 58 5 ха»: й о -2 С « о х о г 300000 " " Я - Фіг. 17 о 200000 -
    Е І. 8 рч во 100000 " 5 - о г 7 У Е " - "7 - о о 20 40 во специфічний пізис (1 300000 . т д « ш о 200000-4 Ф ще г: - - Е 1306000-1 9, т Е 72 Е че х б о 5ОВО 18000 15000 ЕСЗО (ПМ
    А 259 -- наповнювач 200 -- ТСВ до СЕА (10 міг, а) Е 150 - ТСВ до СЕА (50 міг, Я) Е 2 ТОВ до МСЗР (50 мкг, 41) шо 100 ш- шо во (2 о о 5 10 15 20 25 дні Б їх Ген 7 дити киш Е дн 85 ою р «ск Б - Е З ще 7 ве в. ЖОюе ча че Фіг. 18 з р-- сддит вадеє а о 5 Кз, 15 2) дні 250 в -- наповнювач - 200 -- ТОВ до СЕА (10 мкг, 7) 2 -- ТОВ до СЕА (50 мг, а7) ЕОе А ТОВ до МС8Р (50 мкг, 41) В оо ее во о о 5 10 15 20 25 г фрафт дні 5 їх а їхібг2 Е Е 8 ро "В Фіг. 18 т їх? 5 їєїрее Е тхіф 5 о 5 Ну 75 20 дні зво А я 200 -- наповнювач В 0 ТСВ до СЕА (50 мкг, 41) Е -- ТОВ до СЕА (50 мкг, 47) Є оо З Тов до МСЗРІ(БО мкг, 31) 5 І о ло 20 зо дні і- КУН БЮ" 409 2 - в са то Б то ж лов я о 5 10 15 20 25 Фіг. 19 дні
    Фіг. 20 100 --ї і. во і, ' во - --. наповнювач
    Є. С. -.. ТСВ до СЕА (08) х ' ЕЗ із 5 ДОДАВАВ хк ' х І що 20 ! Іш--я 0 І 05 ло 5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дні
    ЩЕ що ш ж нин | -ї ПЕ пен нн - що Фдтт т й Ї 0 ня ши я й нн о з шк 2597 89 31 33 35 37 38 41 43 45 47 49 51 53 ББ БУ БО 81 83 ВБ 857 89 71 температура ГО)
    Фіг. 21 Зв Е 2-0
    - . " шо жу з | нини 27 285 31 35 35 37 55 41 45 45 47 45 51 53 55 57 558 5153 858557 69 71 температура СС)
    Фіг. 22
    А во Б во й
    Фіг. 23 - 5 540 Во 40 о Ге - з «' 2 20 Х ЕІ ж 20 - ЕЕ ,/ Шк - х , Е м Ж 0 - Е-Ж - о ще Й, Щи чи в Е 8 3-24 90423457 -4 -23 4 01234 5 Ї од5о концентрації антитіла (ПМ) Годо концентрації антитіла (ПМ) В во ГГ во 2 З -к- МОР 11 СтоззіМаб в 2 : я 40 2 40 - СВдомС5Р іх Нет 5 - З - Е Б 20 дО. 20 в в ши сави сини Ф о - то - Ф б -- -5- - Б ж-1-жЖ 5 -3 -23 4 014234 5 ----0 1 2345 Ї од.о концентрації антитіла (ПМ) Ї вазо концентрації антитіла (ПМ) До Е 90 Фіг. 23 о І5; » 5 4 Во ло е В уд б -Кщ- я / --о- т хо - І 20 ї Ех 20 А 5 5 х - в ! - о До св- Е ---- З КО Е ше 3 -- 4 04 2 34 5 -- -- 4 0 142 345 Ї ва55 концентрації антитіла (ЯМ) | 094о Концентрації антитіла (М) Ж З бо о 50 о - В й Е МОР 1-1 СговзМар в «в я 40 -к- го Ма! 5 | 1 З - -к- тоВдо МОР ЖЕ -їІ- ей ЕЕ 20 и Я 85 20 в / х З , щ 2 Ж 2 5000 д-ж--К- 59 3 2-4 01234 5 - 0-2 -4 012345 І одіо концентрації антитіла (ПМ) Ї вд: концентрації антитіпа (ПМ)
    159 458 - А Б Фіг. 24 б 5 з 100 в 400 І) о р-ні го 5 и7 р т АБО уд гово ит 8 , ще / чаш пра о о о 43 -2 4 а 1234 5 3-2 401234 5 Годо концентрації антитіла (ПМ) | 6в9:о концентрації антитіла (ПМ) в 150 Г 150 -к- МОСБР І Сто Ма я Кл а --к- тсвВдо МОР Ф т оо г 100 о о 7 я я ' во - - , 2оо5о Кк 2 БО у в и в а ре о о -- -4 2012345 -- 4 01 щ2 34 5 Ї бохо концентрації антитіла (пм) Годо концентрації антитіла (ПМ) Д 150 Е 150 я й -- МОР 1-1 Стове Мар з Фіг. 24 о ----СВ до МОР ш -е 100 с 100 - (5) о ра Кя Я о со а 2 во уп А 50 и ве р зе ЖЕ ил ай о - о 3 24 041234 5 3 24 042 34 5 І од3о концентрації антитіла (ПМ) Ї вдо концентрації антитіла (ПМ) Ж 150 З 150 я я є Ф -е 100 г 100 о о и ї їх я й Я 50 тт В 5О АХ зе рі з и юн -Е о - о т 3 -2 4 014234 5 3-2 -4 01234 5 Ї вазо концентрації антитіла (ПМ) І одзо концентрації антитіла (ПМ)
    А Б 1195 крав . 29 - і кььььккнькьккььькьквкьььвьький й Я ееоееееосесоосесоосесессессое
    Фіг. 25
UAA201509085A 2013-02-26 2014-02-24 Активуюча т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула UA119320C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13156686 2013-02-26
PCT/EP2014/053490 WO2014131712A1 (en) 2013-02-26 2014-02-24 Bispecific t cell activating antigen binding molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA119320C2 true UA119320C2 (uk) 2019-06-10

Family

ID=47748528

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201509085A UA119320C2 (uk) 2013-02-26 2014-02-24 Активуюча т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула

Country Status (32)

Country Link
US (13) US10155815B2 (uk)
EP (2) EP2961771B1 (uk)
JP (4) JP6133444B2 (uk)
KR (5) KR20180023035A (uk)
CN (2) CN104936986B (uk)
AR (1) AR094896A1 (uk)
AU (3) AU2014222779B2 (uk)
BR (1) BR112015015824B1 (uk)
CA (1) CA2891493C (uk)
CL (1) CL2015001988A1 (uk)
CR (1) CR20150393A (uk)
DK (1) DK2961771T3 (uk)
EA (2) EA201891502A1 (uk)
ES (1) ES2775207T3 (uk)
HR (1) HRP20200306T1 (uk)
HU (1) HUE047925T2 (uk)
IL (2) IL240045B (uk)
LT (1) LT2961771T (uk)
MA (1) MA38308B1 (uk)
MX (2) MX375359B (uk)
MY (2) MY199162A (uk)
NZ (1) NZ708182A (uk)
PE (1) PE20151410A1 (uk)
PH (1) PH12015501340B1 (uk)
PL (1) PL2961771T3 (uk)
PT (1) PT2961771T (uk)
RS (1) RS59992B1 (uk)
SG (1) SG11201504497TA (uk)
SI (1) SI2961771T1 (uk)
TW (2) TWI534155B (uk)
UA (1) UA119320C2 (uk)
WO (1) WO2014131712A1 (uk)

Families Citing this family (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2657856T3 (es) * 2011-03-02 2018-03-07 Roche Glycart Ag Anticuerpos CEA
EP2747781B1 (en) 2011-08-23 2017-11-15 Roche Glycart AG Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
PL2814587T3 (pl) 2012-02-15 2018-10-31 F.Hoffmann-La Roche Ag Chromatografia powinowactwa oparta na receptorze Fc
US9682143B2 (en) 2012-08-14 2017-06-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
US20150231241A1 (en) 2012-08-14 2015-08-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
WO2014028560A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
WO2014056783A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
WO2014131712A1 (en) * 2013-02-26 2014-09-04 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
JP6499087B2 (ja) 2013-02-26 2019-04-10 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
EP3074025A1 (en) 2013-11-27 2016-10-05 Baylor College Of Medicine Csgp4-specific chimeric antigen receptor for cancer
US9212225B1 (en) 2014-07-01 2015-12-15 Amphivena Therapeutics, Inc. Bispecific CD33 and CD3 binding proteins
RS65573B1 (sr) 2014-08-04 2024-06-28 Hoffmann La Roche Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije
AU2015329966A1 (en) * 2014-10-09 2017-04-27 Engmab Sàrl Bispecific antibodies against CD3epsilon and ROR1 for use in the treatment of ovarian cancer
CA2963692A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Engmab Ag Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1
EP3215528B1 (en) 2014-11-06 2019-08-07 F.Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn-binding and methods of use
US11091547B2 (en) 2014-11-12 2021-08-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-chondroitin sulfate proteoglycan 4 antibodies and uses thereof
MX391388B (es) 2014-11-14 2025-03-21 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de tnf.
EP3221356B1 (en) 2014-11-20 2020-09-02 F.Hoffmann-La Roche Ag T cell activating bispecific antigen binding molecules against folr1 and cd3
FI4141032T3 (fi) 2014-11-20 2024-07-31 Hoffmann La Roche T-solua aktivoivien bispesifisten antigeeniä sitovien molekyylien ja pd-1-akselia sitovien antagonistien yhdistelmähoito
BR112017010513A2 (pt) * 2014-11-20 2018-04-03 F. Hoffmann-La Roche Ag ?cadeias leves comuns e métodos de uso?
EP3029068A1 (en) 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
AR102918A1 (es) 2014-12-05 2017-04-05 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd79b y métodos de uso
US20170369588A1 (en) * 2014-12-23 2017-12-28 Universita' Degli Studi Di Parma Pro-apoptotic anti-ng2/cspg4 antibodies and their uses for disease therapy
EP4190814A1 (en) 2015-05-29 2023-06-07 Amphivena Therapeutics, Inc. Methods of using bispecific cd33 and cd3 binding proteins
EA039859B1 (ru) 2015-07-31 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
HK1254967A1 (zh) * 2015-10-02 2019-08-02 豪夫迈‧罗氏有限公司 结合间皮素和cd3的双特异性t细胞活化性抗原结合分子
JP2018533930A (ja) * 2015-10-02 2018-11-22 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
AU2016329251B2 (en) 2015-10-02 2023-02-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-PD1 antibodies and methods of use
KR20180073561A (ko) * 2015-10-02 2018-07-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항-ceaxcd3 t 세포 활성화 항원 결합 분자
KR102687212B1 (ko) * 2015-10-25 2024-07-19 사노피 Hiv 감염의 예방 또는 치료를 위한 3특이성 및/또는 3가 결합 단백질
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
AU2016368469B2 (en) 2015-12-09 2023-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Type II anti-CD20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
AR107303A1 (es) * 2016-01-08 2018-04-18 Hoffmann La Roche Métodos de tratamiento de cánceres positivos para ace utilizando antagonistas de unión a eje pd-1 y anticuerpos biespecíficos anti-ace / anti-cd3, uso, composición, kit
CA3011942A1 (en) 2016-02-03 2017-08-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Psma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs
LT3433280T (lt) 2016-03-22 2023-07-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Proteazės aktyvuojamos t ląstelei bispecifinės molekulės
EP3443006B1 (en) * 2016-04-13 2023-08-02 Sanofi Trispecific and/or trivalent binding proteins
TN2020000058A1 (en) 2016-04-13 2022-01-06 Sanofi Sa Trispecific and/or trivalent binding proteins
AU2017291262A1 (en) * 2016-06-30 2019-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved adoptive T-cell therapy
TWI781108B (zh) 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
US10882918B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific T cell activating antigen binding molecules
CN117752798A (zh) * 2016-12-19 2024-03-26 豪夫迈·罗氏有限公司 用靶向性4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法
DK3579848T3 (da) 2017-02-08 2025-01-20 Dragonfly Therapeutics Inc Multispecifikke bindende proteiner til aktivering af naturlige dræberceller og terapeutiske anvendelser heraf til behandling af kræft
KR20240060739A (ko) 2017-02-20 2024-05-08 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Her2, nkg2d 및 cd16에 결합하는 단백질
KR20190123299A (ko) * 2017-02-27 2019-10-31 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Caix, ano1, 메소텔린, trop2, cea, 또는 클라우딘-18.2를 표적화하는 다중특이적 결합 단백질
RU2750721C2 (ru) 2017-03-10 2021-07-01 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения мультиспецифических антител
SG11201909154SA (en) 2017-04-05 2019-10-30 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3
CA3061044A1 (en) * 2017-04-26 2018-11-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
EP3409322A1 (en) * 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
KR20250030036A (ko) 2017-06-07 2025-03-05 스파크 테라퓨틱스, 인코포레이티드 개선된 세포 트랜스펙션 및/또는 rAAV 벡터 생산을 위한 증진제
PT3428194T (pt) * 2017-07-14 2021-11-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Molécula de polipéptido com especificidade dupla melhorada
JP7407699B2 (ja) 2017-07-28 2024-01-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗体製剤
US11623963B2 (en) * 2017-10-03 2023-04-11 Merck Patent Gmbh Cysteine engineered antigen-binding molecules
CA3079036A1 (en) * 2017-11-01 2019-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with targeted ox40 agonists
MX2020006125A (es) * 2017-12-14 2020-08-24 Hoffmann La Roche Uso de un anticuerpo biespecifico de cea cd3 y un antagonista de la union al eje de pd-1 en un regimen de dosificacion para tratar el cancer.
EP3502140A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
SG11202007482WA (en) 2018-02-08 2020-09-29 Dragonfly Therapeutics Inc Antibody variable domains targeting the nkg2d receptor
AR115360A1 (es) 2018-02-08 2021-01-13 Genentech Inc Moléculas de unión al antígeno y métodos de uso
SG11202007579TA (en) 2018-02-08 2020-09-29 Dragonfly Therapeutics Inc Combination therapy of cancer involving multi-specific binding proteins that activate natural killer cells
TWI829667B (zh) * 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
JP7353576B2 (ja) 2018-02-20 2023-10-02 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃｄ３３、ｎｋｇ２ｄ、及びｃｄ１６に結合する多重特異性結合タンパク質、ならびにその使用方法
WO2019166453A1 (en) * 2018-03-01 2019-09-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Specificity assay for novel target antigen binding moieties
CA3094235A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Her2-targeting antigen binding molecules comprising 4-1bbl
WO2019204398A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 Invenra Inc. Trivalent trispecific antibody constructs
EP3802599B1 (en) 2018-06-03 2023-12-20 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
EP3833392A4 (en) 2018-08-08 2022-05-18 Dragonfly Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR BINDING CD33, NKG2D AND CD16 AND METHODS OF USE
EA202091888A1 (ru) 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
EP3833385A4 (en) 2018-08-08 2021-12-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. PROTEINS THAT BINDING NKG2D, CD16 AND A TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN
CN118271445A (zh) 2018-12-21 2024-07-02 豪夫迈·罗氏有限公司 与cd3结合的抗体
MX2021007320A (es) 2018-12-21 2021-07-07 Hoffmann La Roche Moleculas agonistas de union al antigeno cd28 que actuan sobre el tumor.
JP7090780B2 (ja) * 2018-12-21 2022-06-24 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ３に結合する抗体
WO2020169698A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Sensitization of cancer cells to tnf by bet inhibition
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
EP3953386A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of cancer using a cea cd3 bispecific antibody and a wnt signaling inhibitor
CA3140287A1 (en) * 2019-06-19 2020-12-24 Johannes Auer Method for the generation of a trivalent antibody expressing cell by targeted integration of multiple expression cassettes in a defined organization
MX2021015648A (es) * 2019-06-19 2022-02-03 Hoffmann La Roche Metodo para la generacion de una celula que expresa un anticuerpo multiespecifico multivalente mediante integracion dirigida de multiples casetes de expresion en una organizacion definida.
KR20220010019A (ko) * 2019-06-19 2022-01-25 에프. 호프만-라 로슈 아게 정의된 조직에서 다중 발현 카세트의 표적화된 통합에 의해 2가 이중특이성 항체 발현 세포를 생성하는 방법
EP3990492A1 (en) 2019-06-27 2022-05-04 F. Hoffmann-La Roche AG Novel icos antibodies and tumor-targeted antigen binding molecules comprising them
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
CN119192386A (zh) 2019-07-31 2024-12-27 豪夫迈·罗氏有限公司 与gprc5d结合的抗体
JP2022543551A (ja) 2019-07-31 2022-10-13 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｇｐｒｃ５ｄに結合する抗体
BR112022004995A2 (pt) 2019-09-18 2022-06-21 Lamkap Bio Alpha AG Anticorpos biespecíficos contra ceacam5 e cd3
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
WO2021154534A1 (en) * 2020-01-28 2021-08-05 Promab Biotechnologies, Inc. Plap-cd3 epsilon bispecific antibodies
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
CN115836088A (zh) 2020-05-06 2023-03-21 蜻蜓疗法股份有限公司 结合nkg2d、cd16和clec12a的蛋白质
CA3177239A1 (en) * 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Protease-activated t cell bispecific antibodies
AR122658A1 (es) 2020-06-19 2022-09-28 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3
TWI852680B (zh) 2020-06-19 2024-08-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與 cd3 及 cd19 結合之抗體
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
MX2022015887A (es) 2020-06-19 2023-01-24 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y folr1.
MX2022015203A (es) 2020-06-19 2023-01-05 Hoffmann La Roche Moleculas de union al dominio fc de activacion inmunitaria.
EP4172203A1 (en) * 2020-06-25 2023-05-03 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-cd3/anti-cd28 bispecific antigen binding molecules
IL298921A (en) 2020-07-10 2023-02-01 Hoffmann La Roche Antibodies that bind to cancer cells and direct radionuclides to said cells
AU2021333577B2 (en) 2020-08-25 2025-09-11 Gilead Sciences, Inc. Multi-specific antigen binding molecules targeting HIV and methods of use
IL300543A (en) 2020-09-24 2023-04-01 Hoffmann La Roche Prevention or reduction of adverse effects associated with a bispecific T-cell antibody
EP4237450A1 (en) 2020-10-30 2023-09-06 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of cancer using a cea cd3 bispecific antibody and a tgfbeta signaling inhibitor
EP4243856A1 (en) 2020-11-10 2023-09-20 F. Hoffmann-La Roche AG Prevention or mitigation of t-cell engaging agent-related adverse effects
CR20230263A (es) 2020-12-17 2023-08-21 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hla-g y uso de estos
HRP20240213T1 (hr) 2020-12-18 2024-04-26 Lamkap Bio Beta Ag Bispecifična antitijela protiv ceacam5 i cd47
JP2024504931A (ja) 2021-01-12 2024-02-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がん細胞に結合し、放射性核種を前記細胞に標的化するスプリット抗体
US20240173442A1 (en) 2021-01-13 2024-05-30 Hoffmann-La Roche Inc. Combination therapy
WO2022187539A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Dragonfly Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer using multi-specific binding proteins that bind nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
EP4304723A1 (en) 2021-03-09 2024-01-17 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugates and fap/4-1bb binding molecules
WO2022228705A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
AR126009A1 (es) 2021-06-02 2023-08-30 Hoffmann La Roche Moléculas agonistas de unión al antígeno cd28 que se dirigen a epcam
KR20240109605A (ko) * 2021-09-13 2024-07-11 산둥심시어 바이오파마슈티칼 씨오., 엘티디. 항-인간 cd3 항체 및 이의 응용
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
EP4490192A1 (en) 2022-03-07 2025-01-15 Novimmune S.A. Cd28 bispecific antibodies for targeted t cell activation
EP4493592A1 (en) 2022-03-14 2025-01-22 LamKap Bio gamma AG Bispecific gpc3xcd28 and gpc3xcd3 antibodies and their combination for targeted killing of gpc3 positive malignant cells
WO2023192876A1 (en) * 2022-03-28 2023-10-05 Reilly Steve E Composition to increase cellular longevity
CN119998319A (zh) 2022-06-16 2025-05-13 拉姆卡普生物测试有限公司 针对ceacam5和cd47的双特异性抗体与针对ceacam5和cd3的双特异性抗体的组合治疗
WO2024088987A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for the treatment of cancer
WO2024115349A1 (en) 2022-11-29 2024-06-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved cancer immunotherapy
KR20250173599A (ko) 2023-03-14 2025-12-10 젠코어 인코포레이티드 항-cd28 조성물
AU2024311339A1 (en) 2023-06-21 2026-01-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with fap-targeted lymphotoxin beta receptor agonists
WO2025181189A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3
WO2026041568A1 (en) 2024-08-20 2026-02-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and dotam

Family Cites Families (144)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4186567A (en) 1977-04-18 1980-02-05 Hitachi Metals, Ltd. Ornament utilizing rare earth-cobalt magnet
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
AU6290090A (en) 1989-08-29 1991-04-08 University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5798100A (en) * 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
JPH11507535A (ja) 1995-06-07 1999-07-06 イムクローン システムズ インコーポレイテッド 腫瘍の成長を抑制する抗体および抗体フラグメント類
US7423125B2 (en) 1995-08-01 2008-09-09 Vegenics Limited Antibodies to VEGF-C
FR2757863B1 (fr) * 1996-12-27 1999-03-26 Inovat Sarl Nouvelles substances a activite biologique, leur procede d'obtention et les compositions en renfermant
DK0979281T3 (da) 1997-05-02 2005-11-21 Genentech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
PT1049787E (pt) 1998-01-23 2005-04-29 Vlaams Interuniv Inst Biotech Derivados de anticorpos multipropositos
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
PT1222292E (pt) 1999-10-04 2005-11-30 Medicago Inc Metodo para regulacao da transcricao de genes exogenos na presenca de azoto
AU2001247616B2 (en) * 2000-04-11 2007-06-14 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
WO2002009573A2 (en) 2000-07-31 2002-02-07 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Prognostic classification of endometrial cancer
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
US7317091B2 (en) * 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
PT1692182E (pt) 2003-11-05 2010-05-13 Roche Glycart Ag Anticorpos de cd20 com uma afinidade de ligação acrescida ao receptor fc e uma função efectora acrescida
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
US7273608B2 (en) 2004-03-11 2007-09-25 City Of Hope Humanized anti-CEA T84.66 antibody and uses thereof
CA2561686C (en) 2004-03-31 2014-12-02 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
PT1737891E (pt) 2004-04-13 2013-04-16 Hoffmann La Roche Anticorpos anti p-selectina
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
AR051836A1 (es) * 2004-11-30 2007-02-14 Centocor Inc Antagonistas de receptor 3 simil toll metodos y usos
ES2755976T3 (es) 2005-02-07 2020-04-24 Roche Glycart Ag Moléculas de unión a antígeno que se unen a EGFR, vectores que las codifican y usos de las mismas
CN101198698B (zh) 2005-03-31 2014-03-19 中外制药株式会社 通过调节多肽缔合制备多肽的方法
ES2417065T3 (es) 2005-04-26 2013-08-05 Trion Pharma Gmbh Combinación de anticuerpos con glucocorticoides para el tratamiento del cáncer
JP2008539753A (ja) 2005-05-09 2008-11-20 グリクアート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 修飾ｆｃ領域およびｆｃ受容体との結合変更を有する抗原結合分子
JP5364870B2 (ja) 2005-08-19 2013-12-11 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
JP5686953B2 (ja) 2005-10-11 2015-03-18 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー 交差種特異的（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を含む組成物および該組成物の使用
CN105709237A (zh) 2005-12-16 2016-06-29 Ibc 医药公司 基于免疫球蛋白的多价生物活性装配体
PT1976880T (pt) * 2005-12-21 2016-09-28 Amgen Res Munich Gmbh Composições farmacêuticas com resistência a cea solúvel
WO2007110205A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
CN105837690A (zh) 2006-06-12 2016-08-10 新兴产品开发西雅图有限公司 具有效应功能的单链多价结合蛋白
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
ES2625798T3 (es) * 2006-10-02 2017-07-20 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Anticuerpos humanos que se unen a CXCR4 y usos de los mismos
AU2007308792B2 (en) 2006-10-27 2013-01-24 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
US20100183615A1 (en) 2007-04-03 2010-07-22 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
CN109456410B (zh) 2007-04-03 2022-01-28 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性CD3-ε结合结构域
SG10201808730VA (en) 2007-04-03 2018-11-29 Amgen Res Munich Gmbh Cross-species-specific binding domain
WO2009070642A1 (en) 2007-11-28 2009-06-04 Medimmune, Llc Protein formulation
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
PE20110926A1 (es) 2008-09-26 2011-12-29 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-egfr/anti-igf-1r
BRPI1014089A2 (pt) 2009-04-02 2016-04-19 Roche Glycart Ag anticorpos multiespecíficos que compreendem anticorpos de comprimento completo e fragmentos fab de cadeia simples
PT2417156E (pt) 2009-04-07 2015-04-29 Roche Glycart Ag Anticorpos trivalentes, biespecíficos
AU2010245011B2 (en) 2009-04-27 2015-09-03 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
AU2010252284A1 (en) * 2009-05-27 2011-11-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
EP2261258A1 (de) 2009-06-08 2010-12-15 Schuler, Gerold MCSP-gerichtete scFv-Antikörperfragmente und deren Verwendung
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
AU2010288469A1 (en) 2009-08-31 2012-03-01 Roche Glycart Ag Affinity-matured humanized anti CEA monoclonal antibodies
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
SI2519543T1 (sl) 2009-12-29 2016-08-31 Emergent Product Development Seattle, Llc Beljakovine, ki se vežejo s heterodimeri in njihova uporaba
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
EP2569337A1 (en) 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
PL2635607T3 (pl) 2010-11-05 2020-05-18 Zymeworks Inc. Projekt stabilnego przeciwciała heterodimerowego z mutacjami w domenie FC
TWI638833B (zh) 2010-11-30 2018-10-21 中外製藥股份有限公司 細胞傷害誘導治療劑
HUE029139T2 (hu) 2011-02-10 2017-02-28 Roche Glycart Ag Mutáns interleukin-2 polipeptidek
ES2657856T3 (es) 2011-03-02 2018-03-07 Roche Glycart Ag Anticuerpos CEA
ES2692268T5 (en) 2011-03-29 2025-02-26 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
WO2012158818A2 (en) * 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
US9587021B2 (en) 2011-05-21 2017-03-07 Macrogenics, Inc. CD3-binding molecules capable of binding to human and non-human CD3
JP2014526886A (ja) * 2011-07-15 2014-10-09 モルフォシス・アー・ゲー マクロファージ遊走阻止因子（ｍｉｆ）とｄ−ドーパクロームトートメラーゼ（ｄ−ｄｔ）に交差反応性がある抗体
US20140242081A1 (en) 2011-07-18 2014-08-28 Micromet Ag Dosing regimens for treatment of cea-expressing cancers
MX2014001736A (es) * 2011-08-17 2014-03-31 Genentech Inc Inhibicion de angiogenesis en tumores refractarios.
BR112014003999A2 (pt) 2011-08-23 2017-06-13 Roche Glycart Ag anticorpo isolado que se liga a um epítopo próximo da membrana de mcsp humano, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, uso do anticorpo, método de tratamento de indivíduos portadores de câncer, método de undução da lise celular em indivíduos e teste imuno-histoquímico de mcsp
TW201326212A (zh) 2011-08-23 2013-07-01 Roche Glycart Ag 抗－ｍｃｓｐ抗體
WO2013026835A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab fragments and methods of use
MY171038A (en) 2011-08-23 2019-09-23 Roche Glycart Ag Bispecific antigen binding molecules
EP2747781B1 (en) 2011-08-23 2017-11-15 Roche Glycart AG Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
US20130078250A1 (en) 2011-08-23 2013-03-28 Oliver Ast Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3321286B1 (en) * 2011-08-23 2021-01-06 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP2578230A1 (en) 2011-10-04 2013-04-10 Trion Pharma Gmbh Removal of Tumor Cells from Intraoperative Autologous Blood Salvage
US10851178B2 (en) * 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
PT2794905T (pt) 2011-12-20 2020-06-30 Medimmune Llc Polipéptidos modificados para estrutura de anticorpos bispecíficos
DK2838918T3 (da) 2012-04-20 2019-08-12 Merus Nv Fremgangsmåder og midler til fremstilling af heterodimere ig-lignende molekyler
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
AR092044A1 (es) 2012-08-07 2015-03-18 Roche Glycart Ag Inmunoterapia mejorada
WO2014028560A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
WO2014056783A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
CA2898100C (en) 2013-01-14 2023-10-10 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US9963513B2 (en) 2013-02-05 2018-05-08 Engmab Sàrl Method for the selection of antibodies against BCMA
JO3529B1 (ar) 2013-02-08 2020-07-05 Amgen Res Munich Gmbh مضاد التصاق خلايا الدم البيض من أجل التخفيف من الاثار السلبية الممكنة الناتجة عن مجالات ارتباط cd3- المحدد
JP6499087B2 (ja) 2013-02-26 2019-04-10 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
WO2014131711A1 (en) * 2013-02-26 2014-09-04 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2014131712A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
JP6501270B2 (ja) 2013-03-14 2019-04-17 ザ カリフォルニア インスティテュート フォー バイオメディカル リサーチ 標的化剤抗体抱合体およびその使用
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
KR20150132332A (ko) 2013-03-15 2015-11-25 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 (넘버 2) 리미티드 저농도 항체 제형
EP2789630A1 (en) 2013-04-09 2014-10-15 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3e and ROR1
EP3004164A1 (en) 2013-05-28 2016-04-13 Numab AG Novel antibodies
MX379030B (es) 2013-12-17 2025-03-10 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd3 y metodos de uso
SG10202002334PA (en) 2013-12-17 2020-05-28 Genentech Inc Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
RS65573B1 (sr) * 2014-08-04 2024-06-28 Hoffmann La Roche Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
CA2951604A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Pablo Umana Combination therapy of tumor-targeted il-2 variant immunocytokines and antibodies against human pd-l1
WO2016036678A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Medimmune, Llc Formulations of bispecific antibodies
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
CA2963692A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Engmab Ag Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1
AU2015329966A1 (en) 2014-10-09 2017-04-27 Engmab Sàrl Bispecific antibodies against CD3epsilon and ROR1 for use in the treatment of ovarian cancer
MX391388B (es) 2014-11-14 2025-03-21 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de tnf.
EP3221356B1 (en) 2014-11-20 2020-09-02 F.Hoffmann-La Roche Ag T cell activating bispecific antigen binding molecules against folr1 and cd3
BR112017010513A2 (pt) 2014-11-20 2018-04-03 F. Hoffmann-La Roche Ag ?cadeias leves comuns e métodos de uso?
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP3029068A1 (en) 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
HK1250997A1 (zh) 2015-05-01 2019-01-18 基因泰克公司 掩蔽抗cd3抗体和使用方法
HRP20231134T1 (hr) 2015-06-16 2024-01-05 F. Hoffmann - La Roche Ag Humanizirana i afinitetno zrela protutijela na fcrh5 i postupci za uporabu
AU2016302881B2 (en) 2015-08-03 2022-09-15 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies against BCMA
HK1254967A1 (zh) 2015-10-02 2019-08-02 豪夫迈‧罗氏有限公司 结合间皮素和cd3的双特异性t细胞活化性抗原结合分子
KR20180073561A (ko) 2015-10-02 2018-07-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항-ceaxcd3 t 세포 활성화 항원 결합 분자
CN108026177B (zh) 2015-10-02 2021-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗cd19xcd3 t细胞活化性抗原结合分子
JP2018533930A (ja) 2015-10-02 2018-11-22 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
WO2017055318A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Cd33xcd3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
AU2016368469B2 (en) 2015-12-09 2023-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Type II anti-CD20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
CR20150393A (es) 2015-08-21
HRP20200306T1 (hr) 2020-06-12
CN110437337A (zh) 2019-11-12
SI2961771T1 (sl) 2020-04-30
ES2775207T3 (es) 2020-07-24
JP2017158565A (ja) 2017-09-14
HUE047925T2 (hu) 2020-05-28
JP2020033376A (ja) 2020-03-05
MX375359B (es) 2025-03-06
TWI638832B (zh) 2018-10-21
US20260125470A1 (en) 2026-05-07
EA201891502A1 (ru) 2018-12-28
JP6133444B2 (ja) 2017-05-24
KR20150109475A (ko) 2015-10-01
NZ708182A (en) 2019-08-30
MY199162A (en) 2023-10-18
US20210101979A1 (en) 2021-04-08
EP3708584A1 (en) 2020-09-16
CN104936986B (zh) 2019-08-09
US20190002564A1 (en) 2019-01-03
US20210253703A1 (en) 2021-08-19
US20180312589A1 (en) 2018-11-01
TWI534155B (zh) 2016-05-21
RS59992B1 (sr) 2020-04-30
JP2021129573A (ja) 2021-09-09
US20210253704A1 (en) 2021-08-19
HK1211300A1 (en) 2016-05-20
US20190177413A1 (en) 2019-06-13
JP6913145B2 (ja) 2021-08-04
AU2020257119B2 (en) 2024-05-09
CA2891493C (en) 2022-03-15
MX2020009692A (es) 2020-10-12
AU2014222779A1 (en) 2015-06-04
MA38308B1 (fr) 2022-09-30
PT2961771T (pt) 2020-02-28
US20200385470A1 (en) 2020-12-10
SG11201504497TA (en) 2015-09-29
PH12015501340B1 (en) 2021-09-24
US20190002565A1 (en) 2019-01-03
PH12015501340A1 (en) 2015-09-02
AU2020257119B9 (en) 2024-05-23
PE20151410A1 (es) 2015-09-18
MY192312A (en) 2022-08-17
JP2016508723A (ja) 2016-03-24
MX2015008920A (es) 2015-10-22
WO2014131712A1 (en) 2014-09-04
US20260116973A1 (en) 2026-04-30
AU2014222779B2 (en) 2018-08-30
EP2961771A1 (en) 2016-01-06
CN110437337B (zh) 2024-07-30
PL2961771T3 (pl) 2020-06-01
KR102282761B1 (ko) 2021-07-30
US20140242079A1 (en) 2014-08-28
IL240045A0 (en) 2015-08-31
KR20200032761A (ko) 2020-03-26
BR112015015824B1 (pt) 2020-09-24
CN104936986A (zh) 2015-09-23
CL2015001988A1 (es) 2015-11-20
KR101833602B1 (ko) 2018-02-28
US10781258B2 (en) 2020-09-22
US10155815B2 (en) 2018-12-18
LT2961771T (lt) 2020-03-10
DK2961771T3 (da) 2020-03-02
KR20230004901A (ko) 2023-01-06
US10781257B2 (en) 2020-09-22
CA2891493A1 (en) 2014-09-04
EP2961771B1 (en) 2020-01-01
EA201500876A1 (ru) 2016-02-29
AR094896A1 (es) 2015-09-09
TW201437227A (zh) 2014-10-01
TW201641513A (zh) 2016-12-01
AU2018271329A1 (en) 2018-12-20
KR20210094673A (ko) 2021-07-29
MA38308A1 (fr) 2018-02-28
IL240045B (en) 2020-11-30
EA031214B1 (ru) 2018-12-28
US20230076791A1 (en) 2023-03-09
AU2020257119A1 (en) 2020-11-19
US20220064296A1 (en) 2022-03-03
KR20180023035A (ko) 2018-03-06
IL271102A (en) 2020-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA124254C2 (uk) Біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка активує t-клітини
ES2973788T3 (es) Construcciones de anticuerpo para CDH19 y CD3
CN105330750B (zh) 一种快速中止car-t细胞杀伤作用的分子刹车及其用途
ES2775207T3 (es) Moléculas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T biespecíficas específicas para CD3 y CEA
JP2021000088A (ja) Ｄｌｌ３及びｃｄ３に結合する二重特異性抗体構築物
EP4653463A2 (en) Antibodies
EA030147B1 (ru) Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
UA126188C2 (uk) Біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка містить домен зв'язування з fap та домен зв'язування з сd40
KR20200023165A (ko) 단일 도메인 항체에 기반한 bcma 키메라 항원 수용체 및 응용
MD3328893T2 (ro) Construcții de anticorpi bispecifici care leagă mezotelina şi CD3
UA125700C2 (uk) Імунокон'югати антитіла до pd-1 з мутантом il-2
UA128717C2 (uk) Поліпшені антигензв'язуючі рецептори
UA125962C2 (uk) Біспецифічна антигензв'язуюча молекула до ox40 та фібробласт-активуючого білка (fap)
WO2017219934A1 (zh) 一种高效稳定表达抗体的杀伤性细胞及其用途
UA122676C2 (uk) Біспецифічна антигензв'язувальна молекула проти folr1 і cd3, що активує t-клітини
CN114891751A (zh) 一种高效稳定表达激活型抗体的car-t细胞及其用途
UA130083C2 (uk) Конструкція, що має sirp-альфа домен або її варіант
MD3411402T2 (ro) Constructe de anticorpi bispecifici BCMA și CD3 de angajare a celulei T
UA124417C2 (uk) БІСПЕЦИФІЧНИЙ КОНСТРУКТ АНТИТІЛА, ЩО ЗВ'ЯЗУЄ EGFRvIII І CD3
UA125717C2 (uk) Конструкція антитіла до flt3 і cd3
JP7437705B2 (ja) 抗ｃｄ３８及び抗ｃｄ１３８キメラ抗原受容体を含むｔ細胞、及びその用途
CN109897114B (zh) 具有自杀基因开关的靶向cd47的工程化免疫细胞
RU2725807C2 (ru) Растворимый универсальный усиливающий adcc синтетический слитный ген, пептидная технология и их применение
JP2022518262A (ja) ナチュラルキラー細胞を刺激するための組成物及び方法
KR20210043623A (ko) Hla-dr에 결합하는 키메라 항원 수용체 및 car-t 세포