UA122146C2

UA122146C2 - Гібридний білок

Info

Publication number: UA122146C2
Application number: UAA201710105A
Authority: UA
Inventors: Дейвід Брюс Болдуін; Дэйвид Брюс Болдуин; Джон Майкл Білз; Джон Майкл Билз; Джонатан Уеслі Дей; Джонатан Уесли Дэй; Крейг Дуейн Дікінсон; Крэйг Дуэйн Дикинсон; Ендрю Ігор Коритко; Эндрю Игор Коритко; Грегорі Алан Лазар; Грегори Алан ЛАЗАР
Original assignee: Елі Ліллі Енд Компані; Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 2015-05-07
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2020-09-25
Also published as: CN107531806B; SI3292141T1; EA201792199A1; CO2017011301A2; KR102059736B1; PH12017502025B1; JP6591562B2; TW201712029A; ES2799099T3; PT3292141T; US20160324932A1; US9855318B2; US20180177851A1; KR20170134614A; NZ736470A; SV2017005548A; TWI656132B; MX388594B; CA2981102A1; BR112017020502A2

Abstract

Винахід стосується гібридного білка, що містить агоніст рецепторів інсуліну, що має загальну формулу Z1-Z2-Z3, де Z1 являє собою аналог ланцюга В інсуліну, Z2 являє собою перший пептидний лінкер, що містить від 5 до 10 амінокислот, причому щонайменше 5 з цих амінокислот являють собою залишки G; і Z3 являє собою аналог ланцюга А інсуліну та другий пептидний лінкер, який має від 10 до 25 амінокислот, причому щонайменше 50 % цих амінокислот є залишками G; а також Fc-ділянку людського IgG; де С-кінцевий залишок агоніста рецепторів інсуліну є безпосередньо злитим з N-кінцевим залишком другого пептидного лінкера і С-кінцевий залишок другого пептидного лінкера є безпосередньо злитим з N-кінцевим залишком Fc-ділянки IgG.

Description

Цей винахід стосується гібридних білків для використання при лікуванні діабету. Більш конкретно, цей винахід стосується гібридних білків, що містять агоніст рецепторів інсуліну, злитий з ЕРс-ділянкою людського ДО пептидним лінкером, і використання таких білків при лікуванні діабету. Гібридні білки за цим винаходом мають тривалий часовий профіль дії і є придатними для забезпечення довготривалого базального контролю глюкози та пригнічення виходу глюкози з печінки.

Цукровий діабет являє собою хронічний розлад, який характеризується гіперглікемією, що є наслідком вад у секреції інсуліну, у дії інсуліну або у них обох. Цукровий діабет 1 типу характеризується малою інсуліновою секреторною продуктивністю або повною її відсутністю, і пацієнти з цукровим діабетом 1 типу потребують інсуліну для виживання. Цукровий діабет 2 типу характеризується підвищеним вмістом глюкози в крові внаслідок порушення секреції інсуліну, інсулінорезистентності, надлишку виходу глюкози з печінки та/або внесків від усіх вищезазначених факторів. Щонайменше у однієї третини пацієнтів із цукровим діабетом 2 типу захворювання прогресує до безумовної потреби в терапії інсуліном.

Для досягнення нормального рівня вмісту глюкози в крові бажаним є максимально можливе відтворення інсулінозамісною терапією клінічної картини ендогенної секреції інсуліну у здорових осіб. Щоденна фізіологічна потреба у інсуліні коливається і може бути розподілена на дві фази: (а) прандіальну фазу (у відповідь на прийняття їжи), яка потребує швидкого введення (ударної дози) інсуліну для ліквідації викиду глюкози, пов'язаного з прийняттям їжи, і (Б) фазу між прийняттями їжи, яка потребує пролонговано підтримуваної (базальної) кількості інсуліну для регулювання виходу глюкози з печінки для підтримання оптимального рівня глюкози в крові натщесерце.

Оскільки пацієнти з цукровим діабетом 1 типу продукують незначну кількість або взагалі не продукують інсуліну, ефективна інсулінотерапія діабетиків 1 типу звичайно залучає використання двох типів екзогенного інсуліну, що вводиться: швидкодіючого прандіального інсуліну, який вводиться ін'єкціями ударних доз, і тривалодіючого базального інсуліну, який вводять один раз або двічі на день для контролю рівня глюкози в крові між прийомами їжі.

Лікування пацієнтів із діабетом 2 типу зазвичай починається з призначення зниження маси тіла, фізичних вправ та діабетичної дієти, але коли ці заходи виявляються неспроможними

Зо контролювати підвищений вміст цукру в крові, може виникнути необхідність у пероральних лікарських засобах та фармакотерапії, заснованої на інкретинах, наприклад, введенні антагоністів рецепторів глюкагоноподібного пептиду-1 (СІ Р-1) та/або інгібіторів дипептидилпептидази 4 (ОРР-4), які забезпечують підвищені рівні інкретинів. Якщо цих лікарських засобів все ще недостатньо, розглядається можливість лікування інсуліном. Пацієнти 35 з діабетом 2 типу, захворювання яких допрогресувало до того, що необхідна інсулінотерапія, зазвичай розпочинають з одноразової щоденної ін'єкції тривалодіючого базального інсуліну, хоча у деяких випадках при необхідності можуть бути включені ін'єкції швидкодіючих прандіальних інсулінів.

На цей час доступними є базальні інсуліни декількох типів. Інсулін гларгін (іп5ицїїп діагдіпе), 40 який продається під товарним знаком ГАМТИ5-, містить інсулін модифікованої структури, в якій аспарагін в положенні 21 в ланцюзі А інсуліну є замінений на гліцин, а до С-кінця ланцюга В додані два залишки аргініну. Інсулін детемір (іпзиїїп аесетіг), який продається під товарним знаком ГЕМЕМІВ-, містить інсулін модифікованої структури, в якій треонін у положенні 30 ланцюга В був видалений, а лізин у положенні 29 ланцюга В був приєднаний через ковалентний 45 зв'язок атому вуглецю у положенні 14 міристоїлової жирної кислоти до є-аміногрупи лізину у положенні 29 ланцюга В. Інсулін деглюдек (іпзцйїп Чедіцдес), доступний у Європі та Японії під товарним знаком ТРЕЗ5ІВА", містить інсулін модифікованої структури, в якій треонін у положенні ланцюга В був видалений, а є-аміногрупа лізину в положенні 29 ланцюга В є ковалентно приєднаною до гексадекандіоєвої кислоти через лінкер, у-І - глутаминову кислоту. Всі ці інсуліни призначають для введення один раз на день.

Лікувальні схеми, що передбачають щоденні ін'єкції за існуючою інсуліновою терапією, можуть бути складними та болючими при введенні, і можуть призвести до небажаних побічних ефектів, таких як гіпоглікемія та збільшення маси тіла. Тому багато пацієнтів, що страждають на діабет, не хочуть або неспроможні виконувати приписи лікаря, або нездатні дотримуватися інсулінотерапії, необхідної для забезпечення точного контролю рівня глюкози в крові. Поганий глікемічний контроль підвищує ризик розвитку у пацієнта серйозних ускладнень, пов'язаних з діабетом, у тому числі серцевих захворювань, інсульту, пошкодження нервів, ампутації нижніх кінцівок, втрати зору та захворювання нирок. У цей час проводяться дослідження для виявлення засобів інсуліну з більш тривалою дією, які, завдяки цьому, вимагатимуть меншої бо кількості ін'єкцій, ніж доступні зараз продукти інсуліну, для поліпшення прийнятності та комплаєнтності.

У СМ103509118 описані білки з ланцюгом В людського інсуліну та ланцюгом А людського інсуліну, об'єднаними зв'язувальною послідовністю С-пептиду довжиною від 4 амінокислот до 50 амінокислот, і з ланцюгом А інсуліну, приєднаним безпосередньо, без додаткового лінкера, до Ес-фрагмента імуноглобуліну, й стверджується, що випробування на мишах показує, що тривалість напіввиведення таких білків іп мімо становить приблизно З дні. У КК101324828 описані аналоги проінсуліну, пов'язані з ЕРсо-ділянками імуноглобуліну через непептидильні лінкери, і стверджується, що такі білюи забезпечують збільшений період напіввиведення з сироватки крові у порівнянні з існуючими терапевтичними засобами. У цій публікації відзначають, що непептидильні лінксери демонструють поліпшення в порівнянні з пептидними лінкерами, та стверджують, що гібридні білки, в яких використовуються пептидні лінкери, не можуть збільшити період напіввиведення активного лікарського засобу в крові, оскільки пептидні лінкери легко розщеплюються ферментами в організмі.

Незважаючи на вищенаведені розкриття та/або будь-які інші публікації, автори цього винаходу подолали численні перешкоди для виявлення гібридних білків, що містять агоністи рецепторів інсуліну, пептидні лінкери та Ес-ділянки людського Ід, які задовольняють існуючій потребі у продукті, який знижує рівні глюкози, зі збільшеною тривалістю дії, достатньою для менш частого введення доз, порівняно з доступними на цей час інсуліновими продуктами, включаючи дозування не частіше, ніж раз на тиждень. Наприклад, для досягнення бажаного тривалішого часового профілю дії, було необхідно сконструювати гібридні білки з ослабленою активністю для уникнення швидкого опосередкованого рецепторами кліренсу, основного шляху кліренсу інсуліну, але які все ще б мали достатню активність для забезпечення достатнього зниження рівня глюкози. Далі, для зведення до мінімального рівня ниркового кліренсу, іншого основного шляху кліренсу інсуліну, та регулювання периферичної експозиції через гідродинамічну парацелюлярну дифузію з обмеженням за розміром, необхідно було сконструювати гібридні білки, які були б достатньо великими і які не мали б агоніста рецепторів інсуліну, який протеолітично розщеплюється на Ес-ділянці людського Ідс після введення, оскільки наслідком такого розщеплення буде швидший за бажаний нирковий кліренс агоніста рецепторів інсуліну, навіть якщо Ес-ділянка людського (9 залишиться у системі кровообігу.

Зо Крім того, Ес-ділянки дС розвинули здатність до самоасоціації з утворенням стабільних димерів, і, коли такий димер утворюється з двох гібридних білків, кожен з яких містить компонент інсуліну, злитий з Ес-ділянкою Ідс, два згадані компоненти інсуліну опиняються в безпосередній близькості між собою, що надає можливість здійснення самоасоціації або димеризації цих компонентів інсуліну, яка опосередкована через ділянки самоасоціації ланцюгу

В інсуліну. Такі димери інсуліну є неактивними, тому необхідно було сконструювати гібридні білки з послабленою самоасоціацією складових агоністів рецепторів інсуліну. Були подолані численні додаткові перешкоди для створення гібридного білка, придатного для виробництва для продажу та створення композиції у формі терапевтичного засобу. Цим винаходом запропоновані гібридні білки, які мають пролонговану дію у порівнянні з існуючими терапевтичними засобами інсуліну, що дозволяє здійснювати менш часті ін'єкції у порівнянні з існуючими продуктами інсуліну, в тому числі до одного разу на тиждень, тим самим зменшуючи складність та біль, пов'язані з існуючими схемами лікування, що включають більш часті ін'єкції.

Гібридні білки за цим винаходом мають плаский фармакокінетичний профіль і обмежену периферичну експозицію, наслідком чого є низька добова несталість та мінімальна частота виникнення явища гіпоглікемії, у тому числі у разі надання в комбінації з додатковим лікарським протидіабетичним засобом, наприклад, терапевтичним засобом з групи інкретинів. Гібридні білки за цим винаходом також можуть забезпечувати пролонговану тривалість дії, не спричинюючи збільшення маси тіла.

Цим винаходом запропонований гібридний білок, що містить: а) агоніст рецепторів інсуліну, що має загальну формулу 21-22-2з, де ї) 71 являє собою аналог ланцюга В інсуліну, який містить амінокислотну послідовність:

ХІХгХзОНІ СОЗНІ МЕАЇ ХА МСС ЕВИЕХ»УХ ХХХ», де Хі являє собою КЕ, О або А; Хо являє собою У або 0; Хз являє собою М, К, О, о, О, А або

Е; Ха являє собою Е, У, О або Н; Хо являє собою Н або Е; Хв являє собою с, Т, 5, Н, М або є відсутнім; Х? являє собою с, Е, Р, К, р, 5, Н або є відсутнім; Хв являє собою Сб, Е,К, Р, ОО, 0, Н або є відсутнім; Хо являє собою 0, Т, 5, Е, К, А або є відсутнім, за умови, що аналог ланцюга В інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положенні Ха, Х5, Хв, Х7, Хв або Хо (послідовність ЗЕО

ІО МО: 1); 60 її) 72 являє собою перший пептидний лінкер, що містить від 5 амінокислот до 10 амінокислот,

де щонайменше 5 амінокислот зі згаданих амінокислот являють собою залишки о; і ії) 7з являє собою аналог ланцюга А інсуліну, який містить амінокислотну послідовність:

СІМЕОССТ5ХІС5І ХгОЇ ЕМУСХ»зХ», де Хі: являє собою Т або І; Хг2 являє собою ОЮ, У, 0 або Е; Хз являє собою 0, М, 5 або А; і Хі

Б являє собою будь-яку природну амінокислоту або є відсутнім, за умови, що, якщо Хз являє собою М, то Ха має бути амінокислотою, відмінною від С або М (послідовність ЗЕО ІЮО МО: 2); р) другий пептидний лінкер; і с) Ес-ділянку людського дО; де С-кінцевий залишок агоніста рецепторів інсуліну є безпосередньо злитим з М-кінцевим залишком другого пептидного лінкера, і С-кінцевий залишок другого пептидного лінкера є безпосередньо злитим з М-кінцевим залишком Ес-ділянки до.

Цим винаходом також запропонований гібридний білок, який складається 3: а) одного з агоністів рецепторів інсуліну, що має загальну формулу 211-22-73, де ї) 71 являє собою аналог ланцюга В інсуліну, який має амінокислотну послідовність:

ХІХгХзЗОНІ СОЗНІ МЕАЇ ХА МСОЕВИОИЕХУХ ХХХ», де Хі являє собою КЕ, О або А; Хо являє собою У або 0; Хз являє собою М, К, О, о, О, А або

Е; Ха являє собою Е, У, О або Н; Хо являє собою Н або Е; Хв являє собою с, Т, 5, Н, М або є відсутнім; Х? являє собою с, Е, Р, К, 0, 5, Н або є відсутнім; Хв являє собою б, Е,К, Р, ОО, 0, Н або є відсутнім; Хо являє собою 0, Т, 5, Е, К, А або є відсутнім, за умови, що аналог ланцюга В інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положенні Ха, Х5, Хв, Х7, Хв або Хо (послідовність ЗЕО

ІО МО: 1); її) 722 являє собою перший пептидний лінкер, що містить від 5 амінокислот до 10 амінокислот, де щонайменше 5 амінокислот зі згаданих амінокислот являють собою залишки о; і ії) 7з являє собою аналог ланцюга А інсуліну, що має амінокислотну послідовність:

СІМЕОССТ5ХІС5І ХгОЇ ЕМУСХ»зХ», де Хі: являє собою Т або І; Хг2 являє собою ОЮ, У, 0 або Е; Хз являє собою 0, М, 5 або А; і Хі являє собою будь-яку природну амінокислоту або є відсутнім, за умови, що, якщо Хз являє собою М, то Ха має бути амінокислотою, відмінною від с чи М (послідовність ЖЕО ІЮ МО: 2);

Зо р) другого пептидного лінкера; і с) Ес-ділянки людського до; де С-кінцевий залишок агоніста рецепторів інсуліну є безпосередньо злитим з М-кінцевим залишком другого пептидного лінкера, а С-кінцевий залишок другого пептидного лінкера є безпосередньо злитим з М-кінцевим залишком Ес-ділянки до.

Цим винаходом також запропонована фармацевтична композиція, яка містить гібридний білок за цим винаходом та щонайменше один фармацевтично прийнятний наповнювач.

Цим винаходом також запропонований спосіб лікування пацієнта з цукровим діабетом, ожирінням, дисліпідемією або метаболічним синдромом, що включає введення пацієнту, який потребує цього, терапевтично ефективної кількості гібридного білка за цим винаходом. Цим винаходом також запропонований спосіб лікування або профілактики захворювання, пов'язаного із діабетом, вибраного з групи, яка складається з захворювання серця, інсульту, нефропатії, ретинопатії та захворювання нирок, який включає введення пацієнту, який потребує цього, терапевтично ефективної кількості гібридного білка за цим винаходом.

Цим винаходом також запропонований гібридний білок за цим винаходом для застосування в терапії.

Цим винаходом також запропоноване використання гібридного білка за цим винаходом у виробництві лікарського засобу.

Цим винаходом також запропоновані полінуклеотиди, які кодують гібридний білок за цим винаходом.

Цим винаходом також запропонований спосіб одержання гібридного білка за цим винаходом, і згаданий спосіб включає етапи: 1. культивування клітини-хазяїна ссавця, яка містить полінуклеотид, який кодує гібридний білок за цим винаходом, в умовах, за яких згаданий гібридний білок експресується; і 2. виділення гібридного білка зі згаданої клітини-хазяїна.

Цим винаходом також запропонований гібридний білок, одержаний за способом, описаним вище.

Фігура 1. На Фіг. 1 представлені фармакодинамічні дані для наведених для пояснення гібридних білків за цим винаходом в моделях діабету на пацюках, які були оброблені стрептозотоцином (5172). бо Фігура 2. На Фіг. 2 представлено схематичне зображення конфігурації білків, розкриття яких наведено в цьому описі. Слід зазначити, що конкретні форми (наприклад, овали, напівкола і т.Іін.), використані на схемах на Фіг. 2, не призначені для опису або характеризування, і не можуть використовуватись для тлумачення значення чи структури окремих компонентів гібридних білків за цим винаходом.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положенні Ха або Хо послідовності ЗЕО ІЮО МО: 1, і щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положенні Хв, Х7, Хв або Хо послідовності ЖЕО ІЮ МО: 1.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить щонайменше дві модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положенні Хв, Х7, Хв або Хо послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положеннях Хв, Х7, Хв та Хо послідовності БЕО ІЮО МО: 1.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну має амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО: 1, де кожне з положень Хе-Хе являє собою о.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положенні Ха та Хо послідовності 560 ІЮ МО: 1.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну має послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, де: Хі являє собою Е; Хо являє собою У; Хз являє собою М або 0; Ха являє собою

Е; Хо являє собою Н.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у кожному з положень Ха, Х5, Хв, Х7, Хв та Хе послідовності БЕО ІЮО МО: 1.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить послідовність ЗЕО ІЮО МО: 1, де: Хі являє собою Е; Хо являє собою У; Хз являє собою М або 0;

Ха являє собою Е; Хо являє собою НН; і кожне з положень Хв-Хо являє собою о.

Зо В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга А інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у положенні Х: або Х2 послідовності 5ЕО ІЮО МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга А інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у обох положеннях Хі та Хо послідовності ФЕО ІЮ МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга А інсуліну має послідовність

ЗЕО ІЮО МО: 2, де Х: являє собою І або Т; Хо являє собою 0; Хз являє собою о; і Ха є відсутнім.

ЗЕО ІЮ МО: 2, де Хз являє собою М і де Ха являє собою амінокислоту, відмінну від С, М, 5, М, Ї. або Р.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положенні Ха або Хо послідовності ЗЕО ІЮО МО: 1, і щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положенні Хв, Х7, Хв або Хо послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1; і аналог ланцюга А інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у положенні Х: або Х2 послідовності 5ЕО ІЮО МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить щонайменше дві модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули

БО людського інсуліну, у положеннях Хв, Х7, Хв або Хо послідовності ФЕО ІЮ МО: 1; і аналог ланцюга

А інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у положенні Х: або Хг послідовності БЕО ІЮО МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положеннях Хв, Х7, Хв та Хо послідовності «ЕО ІЮ МО: 1; і аналог ланцюга А інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у положенні Х: або Х2 послідовності 5ЕО ІЮО МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1, де кожне з положень Хв-Хо являє собою 0; і аналог ланцюга А бо інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у положенні Х: або Хг послідовності БЕО ІЮО МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положеннях Ха та Х5 послідовності БЕО ІО МО: 1; і аналог ланцюга А інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у положенні Х: або Х2 послідовності 5ЕО ІЮО МО: 2.

Ха являє собою Е; Х5 являє собою Н; і аналог ланцюга А інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у положенні Х: або Х2 послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, в кожному з положень Ха, Х5, Хв, Х7, Хв та Хо послідовності «ЕО ІЮ МО: 1; ї аналог ланцюга А інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у положенні Х: або Хо послідовності ХЕО ІЮ МО: 2.

Е; Х5 являє собою Н; і кожне з положень Хв-Хо являє собою 50; і аналог ланцюга А інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у положенні Х: або Х2 послідовності 5ЕО ІЮО МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положенні Ха або Хо послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1, і щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положенні Хв, Х7, Хв або Хо послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1; і аналог ланцюга А інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у обох положеннях Х': та Х2 послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить

Зо щонайменше дві модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положеннях Хв, Х7, Хв або Хо послідовності ФЕО ІЮ МО: 1; і аналог ланцюга

А інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у обох положеннях Хі та Хг2 послідовності БЕО ІО МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положеннях Хв, Х7, Хв та Хо послідовності «ЕО ІЮ МО: 1; і аналог ланцюга А інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у обох положеннях Х': та Х2 послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1, де кожне з положень Хе-Хо являє собою 0; і аналог ланцюга А інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у обох положеннях Хі та Хг2 послідовності БЕО ІЮ МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положеннях Ха та Х5 послідовності БЕО ІО МО: 1; і аналог ланцюга А інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у обох положеннях Хі та Хо послідовності ФЕО ІЮ МО: 2.

Ха являє собою Е; Хо являє собою Н; і аналог ланцюга А інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у обох положеннях Х: та Х2 послідовності зЕО ІЮ МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, в кожному з положень Ха, Х5, Хв, Х7, Хв та Хо послідовності «ЕО ІЮ МО: 1; ї аналог ланцюга А інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у обох положеннях Х: та Хг2 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну має послідовність

ЗЕО ІО МО: 1, де: Хі являє собою Е; Хо являє собою У; Хз являє собою М або 0; Ха являє собою 60 Е; Х5 являє собою Н; і кожне з положень Хв-Хо являє собою 50; і аналог ланцюга А інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, У обох положеннях Х': та Х2 послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положенні Ха або Хо послідовності ЗЕО ІЮО МО: 1, і щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положенні Хв, Х7, Хв або Хо послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1; і аналог ланцюга А інсуліну має послідовність 5ЕО ІЮ МО: 2, де: Хі являє собою І або Т; Х2 являє собою 0; ХЗ3 являє собою

С; і Ха є відсутнім.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить щонайменше дві модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положеннях Хв, Х7, Хв або Хо послідовності ФЕО ІЮ МО: 1; і аналог ланцюга

А інсуліну має послідовність зЗЕО ІЮ МО: 2, де: Хі являє собою І або Т; Хо являє собою 0; Хз являє собою 0; і Ха є відсутнім.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положеннях Хв, Х7, Хв та Хо послідовності «ЕО ІЮ МО: 1; і аналог ланцюга А інсуліну має послідовність 560 ІЮ МО: 2, де: Хі являє собою І або Т; Х2 являє собою 0; Хз являє собою

С; і Ха є відсутнім.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну має послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, де кожне з положень Хе-Хео являє собою с, де: Хі являє собою І або Т; Хо являє собою 0; Хз являє собою 0; і Ха є відсутнім.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положеннях Ха та Х5 послідовності ХЕО ІЮ МО: 1; і аналог ланцюга А інсуліну має послідовність ХЕО ІЮ МО: 2, де: Хі являє собою І або Т; Х2 являє собою 0; Хз являє собою 0; і

Ха є відсутнім.

Ко) Ха являє собою Е; Хо являє собою НН; і аналог ланцюга А інсуліну має послідовність 5ЕО ІЮ МО: 2, де: Хі: являє собою і або Т; Х2 являє собою 0; Хз являє собою 0; і Ха є відсутнім.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу аналог ланцюга В інсуліну містить модифікації, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у кожному з положень Ха, Х5, Хв, Х7, Хв та Хо послідовності «ЕС ІЮ МО: 1; ії аналог ланцюга А інсуліну має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2, де: Х: являє собою Іі або Т; Хо являє собою р; Хз являє собою 0; і Ха є відсутнім.

Е; Х5 являє собою Н; і кожне з положень Хв-Хо являє собою 0; і аналог ланцюга А інсуліну має послідовність ХЕО ІЮ МО: 2, де: Хі являє собою І або Т; Х2 являє собою 0; Хз являє собою 0; і

Ха є відсутнім.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу перший пептидний лінкер (22) містить амінокислотну послідовність: Хі(4Х2(((0(О, де Хі являє собою С або є відсутнім; і Х» являє собою с, 5 або є відсутнім (послідовність ЗЕО ІЮО МО: 3).

В деяких варіантах здійснення цього винаходу агоніст рецепторів інсуліну, тобто 271-22-73, гібридного білка, описаного вище, містить амінокислотну послідовність:

ХІХгХзОНІ СОЗНІ МЕАЇ ХА УСИЕВИЕХ»УХвХХвХоХ ох паса мМЕОССТОХ 251 ХізОЇ ЕМ

УСХ ах 5, де Хі являє собою КЕ, О або А; Хо являє собою У або 0; Хз являє собою М, К, О, о, О, А або

БО Е; Ха являє собою Е, У, О або Н; Хо являє собою Н або Е; Хв являє собою с, Т, 5, Н, М або є відсутнім; Х? являє собою с, Е, Р, К, р, 5, Н або є відсутнім; Хв являє собою Сб, Е,К, Р, ОО, 0, Н або є відсутнім; Хо являє собою с, Т, 5, Е, К, А або є відсутнім; Хіо являє собою С або є відсутнім; Хії являє собою с, 5 або є відсутнім; Х:і2 являє собою Т або І; Хіз являє собою 0, У,

О або Е; Х:« являє собою б, М, 5 або А; і Хі5 являє собою будь-яку природну амінокислоту або є відсутнім, за умови, що щонайменше одне з положень Ха, Х5, Хв, Х7, Хв або Хо має бути іншою амінокислотою, аніж та, яка знаходиться, відповідно, у положенні Вчє, В25, В27, Вгв, Вго або Взо ланцюга В молекули людського інсуліну, і, крім того, за умови, що, якщо Х:« являє собою М, тоді

Хі5 має бути амінокислотою, відмінною від с або М (послідовність БЕО ІЮ МО: 4).

В деяких варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, агоніст рецепторів 60 інсуліну, тобто 21-22-72з, гібридного білка, описаного вище, має таку амінокислотну послідовність:

ЕММОНІ Са5НІ МЕАІ ЕЇ УСаЕНОЕєНУСсССЯСВвИаС,СИСИИІМЕОССТОТОБ5І СОЇ ЕМУССИ (послідовність БЕО ІЮ МО: 5).

В деяких варіантах здійснення цього винаходу другий пептидний лінкер являє собою пептид, що має від 10 амінокислот до 25 амінокислот, причому щонайменше 50 95 згаданих амінокислот являють собою залишки б. В деяких варіантах здійснення цього винаходу другий пептидний лінкер являє собою пептид, що містить амінокислотну послідовність (5000 Х|», де Х являє собою О, Е або 5; і де п становить 2-5. В деяких варіантах здійснення цього винаходу другий пептидний лінкер містить амінокислотну послідовність: авсахасааахааваахХхзаасхХахХ»5Хв, де Хі являє собою О або Е; Х?2 являє собою О або Е; Хз являє собою О або Е; Х4 являє собою с, Е, О або є відсутнім; Хх; являє собою с або є відсутнім; і Хв являє собою о або є відсутнім (послідовність ФЕО ІЮ МО: б).

В деяких варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, другий пептидний лінкер має амінокислотну послідовність: асавОоваввОоввовОосоооо (послідовність ЗЕО ІЮО МО: 7).

В деяких варіантах здійснення цього винаходу Ес-ділянка людського дО містить фрагменти з одного важкого ланцюга антитіла Ідс. На схемі (А) Фіг. 2 представлено схематичне зображення гібридного білка, що містить таку ділянку до. В інших варіантах здійснення цього винаходу Ес-ділянка людського ідо містить фрагменти з двох важких ланцюгів антитіла до. На схемі (В) Фіг. 2 представлено схематичне зображення гібридного білка, що містить таку ділянку ща.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу Ес-ділянка (4 людини являє собою Ес- ділянку з антитіла Ідс1, Ідс2 або Ідсаі.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу Ес-ділянка (4 людини являє собою Ес- ділянку з антитіла ІдДО1, що містить таку амінокислотну послідовність:

СРРОРАРЕЇГ І ааРБМУХ ХгРРКРКОТІ МІЗВТРЕМТОХЗУХа:ОМЗНЕОРЕМКЕММУ УМВОМЕМНМА

КТКРАЕЕОУХ5ЗТУВММ5МІ ТМ НОМ МЕОКЕМКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРАЕРОМУТІ РРБ

ВОЕСТКМОМ5І ТОЇ УКаЕМРООІАМЕМ ЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ О5ООБЕРІ М5КІ ТМОКЗАМОСО

ММЕ5СО5ММНЕАЇ НМНУТОКОІ 5І 5РОаХв,

Ко) де Хі являє собою РЕ, О або Е; Хо являє собою РЕ, О або Е; Хз являє собою М або Т; Ха являє собою М або Т; Хо являє собою М, 0 або ОС); і Хє являє собою К або є відсутнім. (послідовність

ЗЕО ІЮО МО: 8).

В деяких варіантах здійснення цього винаходу Ес-ділянка дос містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 8 і додатково містить деякі або всі амінокислоти, які можуть бути знайдені в послідовності Ес ЇдДС1 дикого типу на М-кінцевому боці залишку С у положенні 1 в послідовності зЕО ІЮ МО: 8.

Переважно Ес-ділянка людського до походить з антитіла Ідса2 або з антитіла Іде.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу Ес-ділянка людського ЇДО являє собою Ес- ділянку з антитіла Ідо4, що містить таку амінокислотну послідовність:

РСРРСОРАРЕААДСИаРБУХЇ Х"РРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСХзЗУХа:О М5ОБЄО РЕМОЄММУ ММВОаМЕМН

МАКТКРАЕЕОЕХ5ЗТУВММ5МІ ТМ НОМ МЕОКЕМКСКУ5МКИїЇ РОБІЕКТІЗКАКИОРВЕРОМУТІ Р

РБОЕЕМТКМОМ5І ТС УКОЕМРБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ ОБООБЗБЕРІ М5ХвІ ТОЮ КкЗАМО

ЕСММЕБСОММНЕАІ НМНУТОКОБІ 5І 51 СХ», де Хі являє собою РЕ, О або Е; Хо являє собою РЕ, О або Е; Хз являє собою М або Т; Ха являє собою М або Т; Хо являє собою М, О або 0; Хв являє собою К або К; Х7 являє собою К або є відсутнім. (послідовність ЗЕО ІЮ МО: 9).

В деяких варіантах здійснення цього винаходу Ес-ділянка дос містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 9 і додатково містить деякі або всі амінокислоти, які можуть бути знайдені в послідовності Ес Ід024 дикого типу на М-кінцевому боці залишку С у положенні 1 в послідовності БЕО ІЮ МО: 9. В деяких варіантах здійснення цього винаходу Ес-ділянка дос людини містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 9, де Хі являє собою Е; Хо являє собою Е; Хз являє собою М; Х4 являє собою М; Х5 являє собою М; Хв являє собою ЕК; і Х7 є відсутнім.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу Ес-ділянка людського ЇДО являє собою Ес- ділянку з антитіла Ід052, що має таку амінокислотну послідовність:

ЕСРРСОРАРРУДОРБУХІЇ Х"РРКРКОТІ МІЗАВТРЕМТОХЗМУХа:ОМЗНЕОРЕМОЄМУ УМО МЕМНМА

КТКРАЕЕОЕХ55ТЕНУММІ ТУМНОМІ МЕОКЕМУКСКУ5МКИї РАРІЕКТІЗКТКОаОРАЕРОММТІ РРБ

ВЕЕМТКМОМ5І ТС МКЕЕМРООІАМЕМ ЕЄМСОРЕММУКТТРРМІ О5РОаБЕРІ М5КІ ТМОКЗАМООС

ММЕ5ЗСО5ММНЕАЇ НМНУТОКОІ 5І 5РОХв, 60 де Хі являє собою РЕ, О або Е; Хо являє собою РЕ, О або Е; Хз являє собою М або Т; Ха являє собою М або Т; Хо являє собою М, 0 або ОС); і Хє являє собою К або є відсутнім. (послідовність

ЗЕОІО МО: 10).

В деяких варіантах здійснення цього винаходу Ес-ділянка дос містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО: 10 ії додатково містить деякі або всі амінокислоти, які можуть бути знайдені в послідовності Ес ЇдД052 дикого типу на М-кінцевому боці залишку Е у положенні 1 в послідовності ЗЕО ІЮ МО: 10. В деяких варіантах здійснення цього винаходу Ес-ділянка людського ДО містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 10, де Хі являє собою Е; Х2 являє собою Е; Хз являє собою У; Ха являє собою У; Хо являє собою М; і Хе є відсутнім.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу гібридний білок містить амінокислотну послідовність:

ХІХгХзЗОНІ СО5НІ МЕАЇ Ха МСОЕНОЕХ5УХвХ?ХвХоХ вах папа МЕОССТОХ 25 ХізОЇ ЕМ

УбХ«аха,ваахвасаахтавааХхваацахХ1оХгоХгіХ2СРРОРАРХ»2зХгаАХ25РОМБ ЕРРКРКОТ

ІГМІЗАВТРЕМТСУУМОМ5ХгЕОРЕМОЄММ УМВОМ ЕМНМАКТКРАЕЕЄОЕМОТ Х27АММ ЗМІ ТУХга НОМУ

І МаКкЕМКСКМУЗМКИаї РХгоХзо ЕКТІЗКХа КООРВЕРОМУТІ РРУХзгЕЕМТКМОМ5І ТС МКОЕМРБОЇІ

АМЕМЖЕБМСООРЕММУКТТРРХззі О5ОСБЕРІ У5ХзаЇ ТМОКЗАМОХзамММЕЗСО5УМНЕАЇ НМНУТОК 9І 5І 5Хзва, де Хі являє собою КЕ, О або А; Хо являє собою У або 0; Хз являє собою М, К, О, о, О, А або

Е; Ха являє собою Е, У, О або Н; Хо являє собою Н або Е; Хв являє собою с, Т, 5, Н, М або є відсутнім; Х? являє собою с, Е, Р, К, р, 5, Н або є відсутнім; Хв являє собою Сб, Е,К, Р, ОО, 0, Н або є відсутнім; Хо являє собою б, Т, 5, Е, К, А або є відсутнім, за умови, що щонайменше одне з положень Ха, Х5, Хв, Х7, Хв або Хо є амінокислотою, відмінною від тієї, яка є присутньою, відповідно, у положенні Вів, В25, В27, Вгв, Вго або Взо ланцюга В людського інсуліну; Хто являє собою С або є відсутнім; Хі: являє собою с, 5 або є відсутнім; Хі2 являє собою Т або І; Хіз являє собою 0, У, О або Е; Х:« являє собою с, М, 5 або А; Хі5 являє собою будь-яку природну амінокислоту або є відсутнім, за умови, що, якщо Хі являє собою М, то Хі5 має бути амінокислотою, відмінною від С чи М; Хіє являє собою О або Е; Х:і7 являє собою О або Е; Хв являє собою С або Е; Хіо являє собою с, Е, 0 або є відсутнім; Хго являє собою о або є відсутнім; Хгі являє собою с або є відсутнім; Хгг2 являє собою Е або Р; Хгз являє собою Е або Р;

Хга являє собою А або У; Хо5 являє собою с або є відсутнім; Хв являє собою О або Н; Хг27 являє

Ко) собою У або Е; Хгв являє собою Г. або У; Хго являє собою 5 або А; Хзо являє собою 5 або Р; Хзі являє собою А або Т; Хзг являє собою СО або Е; Хзз являє собою М або М; Хза являє собою Е або

К; Хз5 являє собою Е або с); і Хзє являє собою І або Р (послідовність зЗЕО ІЮ МО: 11).

В деяких варіантах здійснення цим винаходом запропонований гібридний білок, вибраний із групи, яку складають послідовності ФЕО ІЮ МО: 12, 5ЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІО МО: 17, 5ЕО ІЮ МО: 18, ЗЕО ІО МО: 19, 5ЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО ІЮ МО: 21, 5ЕО ІЮО МО: 22, 5ЕО ІЮ МО: 23 та 5ЕО ІЮ МО: 24.

У варіанті здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, гібридний білок має амінокислотну послідовність: 12 о 30 а й 5 ктмонІсевноУкаікусвняинУ осв ссівозосівОсстатоВ у ЕМ сОсо з Я за 100 115 В

ОСОБ ОпОро СОС посВсввсРАРеУАаРВУКСЕвРКЕКоТи МІСТУ 130 138 154 160 170 185

НЕБЕЕУЦЕМИУУЮСУЮУНЯАКТКРНЕЩОКМЕТКВКУ ВТ НОМУ КУВНКИ

150 2 ща ий 238 9

БЕВРІБКТІВКІКООРЕЕРОТТЬРЕВЕКМТКМОУВ СО КОКУ М ВУВНКаНСОе ай ей ЕТО Ва шо

ЕВМНУКТЕРЕМООВОСВЕКОУ КИТИ СМУЕЗСВУМНЕАЬНМНХ ТОК ВрРО

ІБ І ОВО; 12.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу гібридні білки за цим винаходом наявні у формі димеру. Схематичне зображення такого димеру наведено на схемі (С) на Фіг. 2. В деяких варіантах здійснення цього винаходу димер являє собою гомодимер, в якому амінокислотні послідовності двох гібридних білків, які утворюють димер, однакові. В деяких варіантах здійснення цього винаходу димер являє собою гетеродимер, в якому амінокислотні послідовності двох гібридних білків, які утворюють димер, відрізняються.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу фармацевтична композиція за цим винаходом містить гібридний білок за цим винаходом, буферний засіб, поверхнево-активну речовину та ізотонічний засіб. В деяких варіантах здійснення цього винаходу згаданим буферним засобом є лимонна кислота та/або цитрат, поверхнево-активною речовиною є полісорбат 80, а ізотонічним засобом є маніт. В деяких варіантах здійснення цього винаходу рн композиції коливається у межах від приблизно 5,5 до приблизно 8,0. В деяких варіантах здійснення цього винаходу рН коливається у межах від приблизно 6,0 до приблизно 7,4. В деяких варіантах здійснення цього винаходу рН коливається у межах від приблизно 6,0 до 6,75.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу фармацевтична композиція також містить додатковий активний інгредієнт. В деяких варіантах здійснення цього винаходу додатковим активним інгредієнтом є терапевтичний засіб з групи інкретинів. В деяких варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, терапевтичним засобом з групи інкретенів є агоніст

СІ Р-1К. Переважно агоніст СІ Р-1Е являє собою дулаглютид (ашадішіае).

В деяких варіантах здійснення цього винаходу спосіб за цим винаходом включає введення терапевтично ефективної кількості гібридного білка один раз на день. В деяких варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, терапевтично ефективну кількість гібридного білка вводять один раз на тиждень. В деяких варіантах здійснення цього винаходу терапевтично ефективну кількість гібридного білка вводять один раз на місяць. В деяких варіантах здійснення цим винаходом запропонований спосіб лікування пацієнта з цукровим діабетом при одночасному зниженні ризику гіпоглікемії талабо збільшення маси тіла, який включає введення пацієнту терапевтично ефективної кількості гібридного білка за цим винаходом.

Цим винаходом також запропонований спосіб лікування пацієнта з цукровим діабетом, ожирінням, дисліпідемією та/або метаболічним синдромом, який включає введення терапевтично ефективної кількості гібридного білка за цим винаходом в комбінації з додатковим активним інгредієнтом. Гібридний білок і додатковий активний інгредієнт у таких варіантах здійснення цього винаходу можна вводити одночасно, послідовно або в єдиній комбінованій композиції. В деяких варіантах здійснення цього винаходу додатковим активним інгредієнтом є терапевтичний засіб з групи інкретинів. В деяких варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, терапевтичним засіб з групи інкретинів є агоніст СІ Р-1К. Переважно агоніст

СІ Р-14К являє собою дулаглютид. В деяких варіантах здійснення цього винаходу комбінацію вводять один раз на добу. В деяких варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, комбінацію вводять один раз на тиждень. В деяких варіантах здійснення цього винаходу комбінацію вводять один раз на місяць.

В деяких варіантах здійснення цим винаходом запропонований гібридний білок за цим винаходом для застосування при лікуванні цукрового діабету, ожиріння, дисліпідемії або метаболічного синдрому. В деяких варіантах здійснення цим винаходом запропонований гібридний білок за цим винаходом для застосування при лікуванні або при профілактиці захворювання, пов'язаного з діабетом, вибраного з групи, яка складається з захворювання серця, інсульту, нефропатії, ретинопатії та захворювання нирок. В деяких варіантах здійснення цим винаходом запропонований гібридний білок за цим винаходом для застосування при лікуванні пацієнта з цукровим діабетом при одночасному зниженні ризику гіпоглікемії та/або збільшення маси тіла, що включає введення пацієнту гібридного білка за цим винаходом. В деяких варіантах здійснення цього винаходу гібридний білок за цим винаходом запропонований для використання одночасно, роздільно або послідовно в комбінації з іншим активним інгредієнтом. В деяких варіантах здійснення цього винаходу додатковим активним інгредієнтом є терапевтичний засіб з групи інкретинів. В деяких варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, терапевтичним засобом на основі інкретинів є агоніст СІ Р-1В.

В деяких варіантах здійснення цим винаходом запропоноване використання гібридного білка за цим винаходом у виробництві лікарського засобу для лікування цукрового діабету, ожиріння, дисліпідемії або метаболічного синдрому. В деяких варіантах здійснення цим винаходом запропоноване використання гібридного білка за цим винаходом у виробництві лікарського засобу для лікування або профілактики захворювання, пов'язаного з діабетом, вибраного з групи, яка складається з захворювання серця, інсульту, нефропатії, ретинопатії та захворювання нирок. В деяких варіантах здійснення цим винаходом запропоноване використання гібридного білка за цим винаходом у виробництві лікарського засобу для лікування цукрового діабету при одночасному зниженні ризику гіпоглікемії та/або збільшення маси тіла, що включає введення пацієнту гібридного білка за цим винаходом. В деяких варіантах здійснення цим винаходом запропоноване використання гібридного білка за цим винаходом у виробництві лікарського засобу для лікування цукрового діабету, ожиріння, дисліпідемії або метаболічного синдрому, причому цей лікарський засіб має вводитись одночасно, роздільно або послідовно у комбінації з іншим активним інгредієнтом. бо У разі вживання у цьому описі, термін "агоніст рецепторів інсуліну" означає білок, який зв'язується з рецептором інсуліну та активує його з наслідковим зниженням рівня глюкози в крові та/або пригніченням виходу глюкози з печінки, характеристик, які можна перевірити та визначити, використовуючи відомі методи, наприклад, такі методи, які показані в дослідженнях, описаних нижче.

Агоніст рецепторів інсуліну, що входить до складу гібридного білка за цим винаходом, містить аналог ланцюга В інсуліну та аналог ланцюга А інсуліну. У разі вживання в даному описі, терміни "ланцюг А інсуліну" та "ланцюг В інсуліну" означають ланцюги А і В молекули людського інсуліну (САБ Мо 11061-68-0), нативні послідовності дикого типу яких є добре відомими. Ланцюг А людського інсуліну складається з 21 амінокислоти, які позначаються в цій галузі як А1-Агі, що мають таку послідовність:

СІМЕОССТ5ІСБІ МОГ ЕМУСМ (послідовність 5ЕО ІЮО МО: 13).

Ланцюг В людського інсуліну складається з 30 амінокислот, які позначаються в цій галузі як

Ві-Взо, що мають таку послідовність:

ЕММОНІ СОЗНІ МЕАЇ МІ МССЕКСЕРЕУТРКТ (послідовність 5ЕО ІЮО МО: 14).

У молекулі людського інсуліну ланцюг А і В ланцюг об'єднуються двома дисульфідними зв'язками, СузА7-СузВ7 та СузА20-Су5В19. Ланцюг А має внутрішньоланцюговий дисульфідний зв'язок на СузАб-СузА11.

Для досягнення бажаного тривалого часового профілю дії, агоніст рецепторів інсуліну гібридного білка за цим винаходом має залишатись у системі кровообігу та бути здатним взаємодіяти з рецепторами інсуліну протягом тривалого періоду часу. Для того, щоб гібридні білки за цим винаходом залишалися в системі кровообігу протягом бажаного періоду часу, виведення згаданих гібридних білків з організму має бути ослабленим. Двома основними шляхами виведення інсуліну є нирковий кліренс та кліренс, опосередкований рецепторами інсуліну. Дивись Ідіевзіах Р, еї аІ. Оіабеїте5 ОБрез. Меїар. 2008;:10:811-823. Для зведення ниркового кліренсу до мінімального рівня потрібна молекула, гідродинамічний розмір якої щонайменше є наближеним до розміру сироваткового альбуміну людини, і такий гідродинамічний розмір забезпечений в гібридних білках за цим винаходом Ес-ділянкою людського до. Що стосується кліренсу, опосередкованого рецепторами, гібридний білок не може бути настільки активним на рецепторі інсуліну, що це призводить до більш швидкого кліренсу, опосередкованого

Ко) рецепторами, аніж бажаний, але гібридний білок має, однак, бути достатньо активним для забезпечення достатнього контролю глюкози в дозах, які є наявними у продажу. Таким чином, активність гібридного білка має бути ретельно збалансована, і структура гібридного білка за цим винаходом надає можливість досягнення такого балансу.

Молекули інсуліну мають тенденцію до самоасоціації в димери та гексамери. Були запропоновані численні ролі для еволюційно збережених тенденцій інсуліну до самоасоціації, зокрема: (1) хімічна та термічна стабілізація молекул під час внутрішньоклітинного зберігання у вакуолях; (2) захист мономерного інсуліну від утворення волокон іп мімо; (3) заміна для стабілізації та фолдингу за допомогою шаперонів під час внутрішньоклітинної експресії; та/або (4) необхідність для спрямованої секреторної міграції. Однак, активна форма інсуліну є мономером.

Тенденція молекул інсуліну до самоасоціації та неактівність таких самоасоційованих молекул є актуальною для цього винаходу, оскільки Ес-ділянки людського дО також схильні до самоасоціації з утворенням димерів, які зазвичай пов'язуються ковалентно через дисульфідні зв'язки в шарнірній ділянці, і такі димери утворюються з Ес-ділянок людського до у гібридних білках за цим винаходом. В результаті димеризації Ес-ділянок людського Ідс, "плечі" двох агоністів рецепторів інсуліну опиняються в безпосередній близькості одне від одного і, таким чином, існують при відносно високій локальній концентрації. У випадку людського інсуліну, така тісна близькість буде сприяти самоасоціації або димеризації компонентів інсуліну, що впливає на активність молекул. На схемі (0) на Фіг. 2 наведено схематичне зображення Ес-димеру гібридного білка з оплечами компонентів інсуліну, які стали самоасоційованими або димеризованими. Тенденція молекул інсуліну до самоасоціації також може призвести до самоасоціації або димеризації компонентів інсуліну з більш ніж одного Ес-димерного гібридного білка; на схемі (Е) Фіг. 2 представлено схематичне зображення димеру двох Ес-димерних гібридних білків з самоасоційованими або димеризованими компонентами інсуліну. Крім того, компоненти інсуліну більш ніж двох Ес-димерних гібридних білків можуть також самоасоціюватись, так щоб утворити, наприклад, тример, що складається з трьох димерів, або навіть агрегатів більш високого порядку, що складаються з більш ніж трьох димерів.

Однак, агоніст рецепторів інсуліну, що входить до складу гібридного білка за даним винаходом, має знижену тенденцію до самоасоціації або димеризації, і, таким чином, димери 60 гібридних білків, що складаються з гібридних білків за цим винаходом, мають схильність до надання переваги структурі, зображеній на схемі (С) на Фіг. 2, на відміну від структури, зображеної на схемі (0) та схемі (Е) на Фіг. 2. Таким чином, оскільки цей винахід пропонує димер двох гібридних білків, "плече" агоніста рецепторів інсуліну кожного гібридного білка в димері зберігає переважно мономерний стан, як показано, наприклад, на схемі (С) на Фіг. 2 і, таким чином, є більш здатним до взаємодії з рецептором інсуліну.

У гібридних білках за цим винаходом аналог ланцюга В інсуліну агоніста рецепторів інсуліну містить одну або декілька модифікацій амінокислотної послідовності ланцюга В інсуліну людини. Зокрема, для зменшення схильності агоністів рецепторів інсуліну, які входять до складу гібридних білків за цим винаходом, до самоасоціації або димеризації, аналог ланцюга В інсуліну містить одну або декілька модифікацій, порівняно з ланцюгом В молекули людського інсуліну, у положеннях Віє, Вг5 або Вг7-зо, які представлені в послідовності ЗЕО І МО: 1 як положення Ха, Х5 та Хв-о, відповідно. Наприклад: Ха (яке відповідає Віє в ланцюзі В молекули людського інсуліну) може бути змінене на Е, ОО або Н; Х5 (яке відповідає Вг5 в ланцюзі В молекули людського інсуліну) може бути змінене на Н; Хє (яке відповідає Вг27 у ланцюзі В молекули людського інсуліну) може бути видалене або змінене на с, 5, Н або У; Х;7 (яке відповідає Вгв в ланцюзі В молекули людського інсуліну) може бути видалене або змінене на 5,

Е, К, 0, 5 або Н; Хв (яке відповідає Вго в ланцюзі В молекули людського інсуліну) може бути видалене або змінене на с, Е, Р, 0, О або Н; і Хе (яке відповідає Взо в ланцюзі В молекули людського інсуліну) може бути видалене або змінене на б, 5, Е або К. Окрім зниження схильності агоністів рецепторів інсуліну, які входять до складу гібридних білків за цим винаходом, до самоасоціації, модифікації положень Вів і Вг5 на аналогу ланцюга В інсуліну - Ха та Хо послідовності ЗЕО ІЮО МО: 1, відповідно, - також можуть бути здійснені для регулювання активності, поліпшення експресії, підвищення хімічної та/або фізичної стійкості, поліпшення легкості, з якою гібридні білюим можуть вводитись до складу композицій з іншими широко використовуваними наповнювачами та/(або для усунення деамідування. Аналог ланцюга В інсуліну може також включати додаткові модифікації з цих причин. Посилаючись на змінні в послідовності 5ЕО ІЮ МО: 1, такі додаткові модифікації охоплюють таке: зміну Хі (яке відповідає

В: в ланцюзі В молекули людського інсуліну) на 0 або А; зміну Хг (яке відповідає В: у ланцюзі В молекули людського інсуліну) на С; та/або зміну Хз (яке відповідає Вз у ланцюзі В молекули

Зо людського інсуліну) на К, О або 0.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, аналог ланцюга В інсуліну містить більш ніж одну модифікацію амінокислотної послідовності ланцюга В людського інсуліну у положеннях Ха, Х5 та Хво послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1. У варіанті здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, Х« являє собою Е, а Хо являє собою Н. В деяких варіантах здійснення амінокислотну послідовність Хве-Хо послідовності «ЕО ІЮ МО: 1 вибирають з групи, яка складається з: СОСЕ5, 50505, 50505, ЗОБЕС, ОО, 55Е5, 55055, ООЕЕ, ОСОБ, СОЕК, ссакКк, тРОа5, ТО, НОаЕ5, СНЕ5, СОаН5, аСаЕН, Насіт, СНО, сОсСсНн, паро, МОЕ5, ТЕЕТ,

ТКРТ, ТС, ТРОС, ЕРКТ, ТОКТ, ТРОБ5, ЕССО5, БСЕ5, ЕЕЕ5, ЕРЕ5, ЕРЕР та 5000. У варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, послідовністю цих чотирьох амінокислот є 50505, ОсОО або ТЕЕТ. Особлива перевага віддається варіантам здійснення цього винаходу, де Ха являє собою Е, Хо являє собою Н, а Хв.о являє собою (000.

Слід зазначити, що, незважаючи на те, що Хв-Хо послідовності зБЕО ІЮ МО: 1, описані вище як такі, що містять С-кінцеву ділянку аналога (7) ланцюга В інсуліну, ці амінокислоти не є критичними для активності гібридних білків на інсуліновому рецепторі, і, отже, альтернативно можуть розглядатись як подовжувальний сегмент першого пептидного лінкера (22). Наприклад, у контексті послідовності зБЕО ІО МО: 4, Хв-Хо можна розглядати як частину аналога ланцюга В інсуліну, або першого пептидного лінкера у такому агоністі рецепторів інсуліну.

У гібридних білків за цим винаходом аналог ланцюга А інсуліну в агоністі рецепторів інсуліну, що входить до складу гібридних білків за цим винаходом, може містити одну або декілька модифікацій амінокислотної послідовності ланцюга А інсуліну людини, призначеної(-их) для підвищення хімічної і фізичної стійкості, регулювання активності та/або поліпшення експресії. Посилаючись на змінні в послідовності зХЕО ІЮ МО: 2, ці модифікації містять таке: зміну Хі (яке відповідає Ато в ланцюзі А молекули людського інсуліну) на Т; зміну Х2 (яке відповідає Аї« у ланцюзі А молекули людського інсуліну) на 0, О або Е; та/або зміну Хз (яке відповідає Агі у ланцюзі А молекули людського інсуліну) на б, З або А. У варіанті здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, Хі являє собою Т, Х2 являє собою 0, а Хз являє собою 0.

Крім того, для уникнення деамідування, а також хімічного та/або протеолітичного розщеплення, якщо амінокислотою в положенні 21 в аналогу ланцюга А інсуліну в агоністі 60 рецепторів інсуліну, тобто Хз в послідовності ЗЕО ІО МО: 2, є М - амінокислота, яка є присутньою у відповідному положенні в молекулі людського інсуліну, - за нею на С-кінцевій стороні не мають зараз же йти деякі амінокислоти, такі як З або М, або, в деяких варіантах здійснення цього винаходу, Р, 5, М або І. Дивись, наприклад, Міазак у, Іопезси К., МАБ5. 2011

Мау-уУип;3(3):253-63. Егадтепіайоп ої Мопосіопаї! Апіїбодіє5. Слід зазначити, що, незважаючи на те, що ця вимога вказується щодо першого гібридного білка, описаного вище, з урахуванням варіантів для положень Ха та Х5 в послідовності БЕО ІЮ МО: 2, які стосуються аналога ланцюга

А інсуліну, вона не є критичною для негліцинового залишку після залишку аспарагіну в положенні 21 в аналогу ланцюга А інсуліну, яке вважається частиною агоніста рецепторів інсуліну, на відміну від другого пептидного лінкера. Наприклад, з урахуванням послідовності

ЗЕО ІО МО: 11, залишок, що відповідає положенню 21 в аналогу ланцюга А, представлений положенням Ха, а наступна амінокислота Х:і5 може розглядатись як частина агоніста рецепторів інсуліну, або другого пептидного лінкера.

Як описано вище, в гібридних білках за цим винаходом С-кінцевий залишок аналога ланцюга

В інсуліну безпосередньо зливається з М-кінцевим залишком першого пептидного лінкера, а С- кінцевий залишок першого пептидного лінкера безпосередньо зливається з М-кінцевим залишком аналога ланцюга В інсуліну. Перший пептидний лінкер має забезпечити достатню гнучкість для аналогів ланцюга А і ланцюга В інсуліну для одержання структури, необхідної для зв'язування з рецептором інсуліну, але не має бути довгим настільки, щоб неналежним чином заважати цьому зв'язуванню. Довжину і склад першого пептидного лінкера можна регулювати з метою регулювання активності та/або експресії гібридних білків. В деяких варіантах здійснення цього винаходу перший пептидний лінкер має довжину від 5 амінокислот до 10 амінокислот, щонайменше 5 амінокислот з яких є залишками с. В деяких варіантах здійснення цього винаходу амінокислотну послідовність першого пептидного лінкера вибирають з групи, яка складається з: сООоОсООб, Зоо, Ебоооб, СЕСООб, СОЕСОоб, СООЕСб, БОООЕО, ссвациає, касссос, скассоа, сакацсо, ссаскас, асздака, сссзак, насчаас, сЧчцассо, санаса, сазана, сасана, сассасзан, сасацА, ссссоав, засаса, асвгасас,са5ациа, со5ОоСОК, во5ОоОООо та СО5ОО0. В деяких варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, послідовність першого пептидного лінкера містить послідовність ЗЕО ІЮО МО: 3. Найбільшу перевагу віддають, послідовності першого пептидного

Ко) лінкера, яка являє собою послідовність (35050500 (послідовність 5ЕО ІЮ МО: 15). Агоніст рецепторів інсуліну, що входить до складу гібридних білків за цим винаходом, також містить дисульфідні зв'язки, які знаходять в молекулі людського інсуліну, як описано вище, а саме, два дисульфідні зв'язки, що з'єднують аналоги ланцюга А і ланцюга В на СузА7-СузВ7 та СузАг0О-

Су5В19, а також внутрішньоланцюговий дисульфідний зв'язок в аналогу ланцюга А інсуліну на СузАб-СувзАї11.

Як описано вище, С-кінцевий залишок агоніста рецепторів інсуліну, що входить до складу гібридних білків за цим винаходом, зливається з М-кінцевим залишком другого пептидного лінкера, а С-кінцевий залишок другого пептидного лінкера безпосередньо зливається з М- кінцевим залишком Ес-ділянки. Перевага віддається тому, що другий пептидний лінкер має бути збагачений гліцином для забезпечення достатньої конформаційної гнучкості. Довжина другого пептидного лінкера переважно є меншою за 30 амінокислот. В деяких варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, другий пептидний лінкер має довжину від 10 амінокислот до 25 амінокислот, причому щонайменше 50 95 цих амінокислот є залишками гліцину. Другий пептидний лінкер, якому віддають перевагу, містить послідовність (000Х 15) п, де Хі5 являє собою О, Е або 5 і п-2-5. Більшу перевагу віддають другому пептидному лінкеру, який має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 6. Найбільшу перевагу віддають другому пептидному лінкеру, який має амінокислотну послідовність СОСООСООСОоовОвоооОвоооо (ЗЕО ІО МО: 7).

У значенні, вживаному у цьому описі, термін "Гс-ділянка людського Іде" має значення, яке зазвичай надається цьому терміну у галузі імунології. Зокрема, цей термін означає фрагмент людського антитіла дО, який одержують видаленням двох антигензв'язувальних ділянок (Рар- фрагментів) з антитіла. Зокрема, Ес-ділянка містить домени СН2 та СНЗ константної ділянки антитіла, а також може включати частину або всю шарнірну ділянку.

Як описано вище, в деяких варіантах здійснення гібридного білка за цим винаходом Ес- ділянка людського ІДС містить фрагменти константної ділянки з одного важкого ланцюга антитіла (дО, схематичне зображення якого наведено на схемі (А) Фіг. 2, і в інших варіантах здійснення цього винаходу Ес-ділянка людського до містить фрагменти константних ділянок з двох важких ланцюгів антитіла (до, схематичне зображення яких наведено на схемі (В) Фіг. 2. В цьому варіанті здійснення цього винаходу константні ділянки двох важких ланцюгів пов'язані між 60 собою через нековалентні взаємодії та дисульфідні зв'язки.

Існує чотири підкласи дос (01, 02, 3 і 4), кожен з яких має різні структури та біологічні функції, відомі як ефекторні функції. Ці ефекторні функції загалом опосередковуються через взаємодію з Ес рецептором (Есук) або зв'язуванням фактора комплементу С1д. Зв'язування з

ЕсСуУК може призвести до антитілозалежного клітинноопосередкованого цитолізу, тоді як зв'язування з факторами комплементу може призвести до лізису клітин, опосередкованого комплементом. Структури і властивості Ес-ділянок підкласів дО відомі в цій галузі. Гібридні білки за цим винаходом можуть містити Ес-ділянки з будь-якого з підкласів (дО, хоча 2 та 54 мають нижчу активність зв'язування рецепторів та ефекторної функції, аніж антитіла 1 та 3, і тому їм надається перевага.

У значенні, вживаному у цьому описі, термін "ЕГс-ділянка людського ДС" охоплює також варіанти таких фрагментів антитіл, які були модифіковані, подовжені та/або укорочені, наприклад, для зміни властивостей або характеристик, таких як функції зв'язування комплементу та/або Рс-рецептора, ефекторні функції, утворення дисульфідних зв'язків, глікозилювання, антитілозалежна клітинно-опосередкована цитотоксичність (АОСС), технологічність та/або стабільність. Наприклад, Ес-ділянки людського дос гібридних білків за цим винаходом можуть бути модифіковані для зменшення або видалення М-зв'язаного сайту глікозилювання, що зменшить афінність зв'язування С14 та цитотоксичність, і що може сприяти імуногенності, вплинути на конформаційну стабільність і швидкість кліренсу іп мімо та/або модифікувати ефекторні функції. Ес-ділянки людського дО гібридних білків за цим винаходом також можуть мати частково або повністю видалену шарнірну ділянку для спрощення димеризації Ес-ділянок, опосередкованої дисульфідними зв'язками. Інші приклади змін охоплюють фосфорилювання, сульфатування, ацилювання, глікозилювання, метилування, ацетилювання, амідування та/або модифікації що надають можливість продукування гетеродимерних молекул. Способи модифікації структур та властивостей Ес-ділянок підкласів людського до відомі в цій галузі.

Незалежно від остаточної структури гібридного білка, Ес-ділянка людського Їдс має служити для подовження часу напіввиведення агоніста рецепторів інсуліну у плазмі іп мімо. При одержанні гетерологічних Ес-гібридних білків, де Ес-ділянка використовується задля її здатності подовжувати час напіввиведення, важливо мінімізувати будь-яку ефекторну функцію. Крім того,

Зо гібридний агоніст рецепторів інсуліну має зберігати здатність зв'язуватись з та активувати рецептор інсуліну для зниження рівня глюкози в крові та/або пригнічення виходу глюкози з печінки, тобто характеристик, які можна перевірити та виміряти, використовуючи відомі методи, такі як показані в дослідженнях, описаних нижче. Тривалий час напіввиведення гібридних білків за цим винаходом можна продемонструвати, використовуючи, наприклад, способи, описані нижче.

Однією з Ес-ділянок людського Ідс, якій віддають перевагу, є Ес-ділянка Ідс4, яка модифікована для подальшого зменшення ефекторної функції і сприяння утворенню гомодимерів та яка має частину шарнірної ділянки, яка видалена, як в послідовності БЕО ІЮО МО: 9, де Хі являє собою Е; Хо являє собою Е; Хз являє собою У; Х4« являє собою У; Хо являє собою

М; Хв являє собою БЕ; і Х7 є відсутнім.

Іншою Ес-ділянкою людського дО, якій віддають перевагу, є Ес-ділянка Ідс2, має частину шарнірної ділянки, яка видалена, як у послідовності 5ЕО ІЮ МО: 10, де Хі являє собою ЕК; Хо являє собою Е; Хз являє собою У; Ха являє собою У; Хо являє собою М; і Хе є відсутнім.

Слід зазначити, що, незважаючи на те, що амінокислотні послідовності згаданих вище Ес- ділянок людського Ід, яким віддають перевагу, мають частини шарнірних ділянок, які видалені, для спрощення димеризації, опосередкованої дисульфідом, і ці шарнірні ділянки в деяких варіантах здійснення цього винаходу можуть бути присутніми. Наприклад, Ес-ділянка Ідс2 дикого типу містить послідовність з шести амінокислот (ЕККССМ) на своїй М-кінцевій ділянці, і хоча ці амінокислоти не згадуються в послідовності Ес-ділянки Ідс2, представленій в послідовності ЗЕО ОО МО: 10, припускається, що Ес-ділянка людського дес, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в послідовності зЕО ІЮО МО: 10, може також містити частину або всю послідовність з шести амінокислот (ЕККССМ) на своїй М-кінцевій ділянці.

Аналогічно, Ес-ділянка людського Ідс, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в послідовності 5ЕО ІЮ МО: 9, може також містити частину або всі шість амінокислот, які знаходяться на М-кінцевій ділянці Ес-ділянки Ідс4, а саме: Е5КУСР. Аналогічно, Ес-ділянка людського дО, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в послідовності ЗЕО ІЮ

МО: 8, може також містити частину або всі десять амінокислот, які знаходяться на М-кінцевій ділянці Ес-ділянки ІдсС1, а саме: ЕРКЗСОКТНТ. Крім того, чітке визначення того, яка амінокислота являє собою С-кінцеву ділянку другого пептидного лінкера і яка амінокислота бо являє собою М-кінцеву ділянку Ес-ділянки людського ЇдС, не є критичним для структури або функції гібридного білка за цим винаходом. Наприклад, в контексті послідовності ФБЕО ІЮ МО: 11, залишки, що відповідають положенням Хт1о-Хг22, можуть бути описані, як С-кінцева ділянка другого пептидного лінкера, або як М-кінцевий подовжувальний сегмент Ес-ділянки людського ща.

Як описано вище, даний винахід також стосується полінуклеотидів, які кодують будь-який з гібридних білків за цим винаходом. Полінуклеотиди, які кодують описані вище гібридні білки, можуть бути у формі РНК або ДНК, яка охоплює кКДНК та синтетичну ДНК, і яка може бути дволанцюговою або одноланцюговою. Кодувальні послідовності, які кодують білки за цим винаходом, можуть відрізнятися внаслідок надлишковості або виродженості генетичного коду.

Полінуклеотиди, які кодують гібридні білки за цим винаходом, можуть містити таке: лише кодувальну послідовність для білків, кодувальну послідовність для білків та додаткову кодувальну послідовність, таку як лідерна або секреторна послідовність чи пробілкову послідовність; кодувальну послідовність для білків та некодувальну послідовність, таку як інтрони або некодувальну послідовність 5' та/або 3' кодувальної послідовності для білків. Отже, термін "полінуклеотид, що кодує білок", охоплює полінуклеотид, який може включати не лише кодувальну послідовність для білків, але також полінуклеотид, який містить додаткову кодувальну та/або некодувальну послідовність.

Полінуклеотиди за цим винаходом будуть експресуватись у клітині-хазяїні після того, як послідовності будуть функціонально зв'язані з послідовністю, яка контролює експресію.

Експресійні вектори зазвичай реплікуються в організмах-хазяях як епісоми або як невід'ємна частина хромосомної ДНК хазяїна. Зазвичай експресійні вектори містять селекційні маркери, які дозволяють виявляти клітини, трансформовані бажаними послідовностями ДНК.

Гібридні білки за цим винаходом можуть легко продукуватись в клітинах ссавців, таких як клітини СНО, МБО, НЕК293, ВНК або СО5; в бактеріальних клітинах, таких як Е.соїї, Васійи5 5,!Бій5 або Рхейдотопах Пиогезсепсе; в клітинах комах або в клітинах грибів чи дріжджів, які культивують, використовуючи методи, відомі в цій галузі. Однак клітини комах, дріжджів або клітини інших грибів продукують нелюдські М-глікани, тому білки з М-зв'язаними сайтами глікозилювання, продуковані у таких клітинах, можуть спричинювати імуногенні реакції, якщо їх введуть пацієнтам. Тому продукування в таких клітинах вимагає ліквідації М-зв'язаних сайтів

Зо глікозилювання та/або генно-інженерного конструювання клітин для продукування людських М- гліканів, використовуючи методи, відомі в цій галузі. Дивись, наприклад, Натійоп 5, 6ї аї.,

Ргодисійїоп ої сотріех питап діусоргоїєїп5 іп увазі, 301 Зсієпсе (5637): 1244-6 (Айцдиві 2003).

Перевагу віддають продукуванню в клітинах ссавців, і переважною клітиною-хазяїном ссавців є клітинна лінія СНОКІТ5ЗУ, що містить систему експресії глутамінсинтетази (55) (дивись патент

США Мо 5,122,464).

Вектори, що містять полінуклеотидні послідовності, які становлять інтерес (наприклад, гібридні білки та послідовності, що контролюють експресію), можуть бути перенесені в клітину- хазяїна добре відомими методами, які змінюються залежно від типу клітини-хазяїна. Наприклад, трансформацію за допомогою обробки хлоридом кальцію зазвичай використовують для прокаріотичних клітин, тоді як обробка фосфатом кальцію або електропорація може використовуватись для інших клітин-хазяїв.

Можна застосовувати різні способи очищення білків, і такі способи відомі в цій галузі та описані, наприклад, в Юецї5спег, Меїйоаз5 іп Епгутоїіоду 182: 83-89 (1990) апа бсорез, Ргоївіп

Ритпісацйіоп: Ргіпсірієз апа Ргасіїсе, Зга Едйоп, Зргіпдег, М.М. (1994).

Як описано вище, гібридний білок за цим винаходом в деяких варіантах здійснення цього винаходу продукується як димер. У такому димері Ес-ділянки людського дсС зв'язуються між собою через нековалентні взаємодії та дисульфідні зв'язки. Схематичне зображення такого димеру наведено на схемі (С) фіг. 2. Коли амінокислотні послідовності двох гібридних білків, що складають такий димер, - наприклад, Гібридний Білок А та Гібридний Білок В в димері, зображеному на схемі (С) Фіг. 2, - однакові, такий димер у цьому описі називають "гомодимером". Як зазначалося вище, перевага віддається експресії гібридних білків за цим винаходом в клітинах ссавців, і наслідком експресії в таких клітинах є гомодимери. Гібридні білки в таких гомодимерах зв'язуються через нековалентні взаємодії та міжмолекулярні дисульфідні зв'язки на Ес-ділянці. Наприклад, білок, продукований геном, який кодує гібридний білок послідовності 5БЕО ОО МО: 12, буде гомодимером, ковалентно зв'язаним через міжланцюгові дисульфідні зв'язки, а саме С80-С80 і С83-С83.

Коли амінокислотні послідовності двох гібридних білків, що складають димер, - наприклад,

Гібридний Білок А та Гібридний Білок В в димері, зображеному на схемі (С) Фіг. 2, - різні, такий димер у цьому документі називають "гетеродимером". Такий гетеродімер можна одержати

Ге) методами, відомими в цій галузі. Дивись, наприклад, І ем/із5 5.М., еї а!., Маї. Віоїесппої. З32(2):191-

8 (2014); Сапег, 9. Іттипої. Меїйпосдв5, 248(1-2):7-15 (2001); Віддмжау, у. В. еї аї., Ргоїєїп Епод. 9(7):617-2 (1996).

Посилання у цьому описі на фармацевтичні композиції, що містять гібридний білок, охоплюють фармацевтичні композиції, які містять гомодимер такого злитого білка та/або які містять гетеродимер, де однією з ланок згаданого гетеродимеру є такий гібридний білок.

Аналогічно, посилання у цьому описі на способи, що включають введення гібридного білка, охоплюють способи, що включають введення гомодимеру такого злитого білка та/або введення гетеродимеру, де однією із ланок згаданого гетеродимеру є такий гібридний білок. Подібним же чином, посилання на гібридний білок для застосування в терапії та/або гібридний білок для використання у виробництві лікарського засобу охоплює гомодимер такого гібридного білка та/або гетеродімер, де однією із ланок вказаного гетеродимеру є такий гібридний білок, для застосування в терапії та/або використання у виробництві лікарського засобу.

Термін "курс лікування" або "лікування" у значенні, вживаному у цьому описі, означає надання допомоги та здійснення догляду за пацієнтом, який страждає на діабет або гіперглікемію, або інший стан, у разі якого показано введення інсуліну для боротьби з або полегшення симптомів та ускладнень цих станів. Лікування включає введення гібридних білків за цим винаходом для запобігання або затримування виникнення симптомів або ускладнень, полегшення симптомів або ускладнень, або усунення згаданого захворювання, стану або розладу. Пацієнт, якого піддають лікуванню, є ссавцем і, за варіантом, якому віддають перевагу, людиною.

Термін "запобігати" або "запобігання" у значенні, вживаному у цьому описі, означає зменшення ризику або захворюваності, або усунення чи уповільнення прогресування одного або декількох стану(-ів), симптому(-ів), ускладнення(-ень) або розладу(с-ів).

Гібридні білки за цим винаходом можуть бути використані для лікування суб'єктів з різноманітними захворюваннями та станами. До їх числа належать суб'єкти з гіперглікемією, інсулінозалежним діабетом, а також суб'єкти, які не мають інсулінозалежного діабету, у тому числі суб'єкти, що не одержували лікування, а також пацієнти, які лікувались призначеними для перорального застосування лікарськими засобами, такими як сульфонілсечовина, метформін, тіазолідиндіон, такий як піоглітазон, інгібітор са-глюкозидази, такий як акарбоза, та/або

Зо неінсуліновими ін'єкційними засобами, включаючи терапевтичні засоби з групи інкретинів, такі як інгібітори ЮРР-4 та агоністи СІ Р-1К. Гібридні білки за цим винаходом можуть бути використані для регулювання рівня глюкози в крові у таких пацієнтів, і можуть лікувати стани або ускладнення, які виникають унаслідок недостатнього контролю глюкози в крові, такі як ретинопатія, невропатія чи хвороба нирок.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу гібридний білок за цим винаходом вводять щодня, через день, двічі на тиждень, тричі на тиждень, один раз на тиждень, двічі на місяць або один раз на місяць. У варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, тривалість дії є достатньо довгою щоб дозволити введення лікарського засобу один раз на тиждень. Навіть для таких молекул довготривалої дії, фахівцям в цій галузі буде зрозуміло, що ефективний контроль глюкози може також забезпечуватись поступовим накопиченням дози лікарського засобу з довготривалим фармакокінетичним профілем із застосуванням схеми лікування з більш частим введенням лікарського засобу, таким як один раз щодня. Дивись, наприклад,

Неїзе Т апа Мепеоднпіпі І Р, 20 Епдостг. Ргасі. р/5-83 (2014).

В деяких варіантах здійснення цього винаходу гібридний білок за цим винаходом вводять у комбінації з додатковим активним інгредієнтом, таким як інсулін або аналог інсуліну, терапевтичний засіб з групи інкретинів або протидіабетичний лікарський засіб для перорального застосування, такий як сульфонілсечовина, метформін, тіазолідиндіон, такий як піоглітазон, або інгібітор с-глюкозидази, такий як акарбоза.

Термін "терапія, заснована на інкретинах" охоплює будь-яке лікування, яке включає введення або стимулює, дозволяє, покращує та/або імітує дію групи метаболічних гормонів, відомих як інкретини, до якої входить Сі Р-1 та шлунковий інгібувальний пептид (СР). Доступні на цей час терапевтичні засоби з групи інкретинів охоплюють інгібітори ОРР-4 та агоністи СІ рР- 18. "Інгібітор ОРР-4" являє собою сполуку, яка блокує фермент ОРР-4, який відповідає за деградацію інкретинів. Доступні на цей час інгібітори ОРР-4 охоплюють ситагліптин (5йадіїріїп) (Чапиміа") та лінагліптин (Іїпадіїріїп) (Тгадіепа?). "Агоніст (ЗІ Р-1К" визначається як сполука, що містить амінокислотну послідовність нативного людського СІ Р-1 (послідовність ЗЕО ІЮ МО: 25), аналог СІ Р-1, похідну СІ Р-1 або гібридний білок СІ Р-1, яка підтримує активність на рецепторі СІ Р-1. Активність СІ Р-1К може бо бути визначена способами, відомими в цій галузі включаючи експерименти іп мімо та дослідження іп міо, які визначають активність зв'язування рецептора СІ Р-1 або активацію рецептора, наприклад, дослідження, що використовують клітини панкреатичних острівців або клітини інсуліноми, як описано в ЕР 619,322 та патенті США Мо 5,120,712, відповідно. Аналог

СІ Р-1 являє собою молекулу, яка має модифікацію, в тому числі заміну, делецію, інверсію або додання однієї або декількох амінокислоти(-от), порівняно з амінокислотною послідовністю нативного людського СІ Р-1 (послідовність 5ЕО ІЮО МО: 25). Похідна СІ Р-1 являє собою молекулу, що має амінокислотну послідовність нативного людського СІ Р-1 (послідовність «ЕС

ІО МО: 25) або аналогу СГ Р-1, однак додатково має щонайменше одну хімічну модифікацію однієї або декількох з його бічних груп амінокислотних залишків, с-атомів вуглецю, кінцевої аміногрупи або кінцевої карбоксильної групи. Гібридний білок С|Р-1 являє собою гетерологічний білок, до складу якого входить СІ Р-1, аналог Сі Р-1 або похідна СІ Р-1 та будь- який другий поліпептид. Доступні на цей час агоністи СІ Р-1К охоплюють ексенатид (ехепайаеє) (Вуейа" і Вудигеоп"), ліраглутид (Ігадішіде) (Місо7а"), албіглутид (аїбідішіде) (Тапгеит") і дулаглутид (ашадішіає) (Тгиїїсйу"), структури яких відомі в цій галузі. Дивись, наприклад, патент

США Мо 5,424,286 (ексенатид); патент США Мо 6,268,343 (ліраглутид); заявка на патент США Мо 2014044717 (албіглутид); і патент США Мо 7,452,966 (дулаглутид).

У варіантах здійснення цього винаходу, де гібридний білок за цим винаходом запропонований у комбінації з додатковим активним інгредієнтом, згаданий гібридний білок та додатковий активний інгредієнт можуть бути введені одночасно, послідовно або в одній комбінованій композиції.

Гібридні білки за цим винаходом є ефективними при лікуванні згаданих захворювань та станів шляхом введення пацієнту, який потребує цього, терапевтично ефективної кількості гібридного білка за цим винаходом. У значенні, вживаному у цьому описі, фраза "терапевтично ефективна кількість" означає таку кількість гібридного білка за цим винаходом, яка є достатньою для регулювання рівня глюкози в крові у пацієнта без створення неприйнятних побічних ефектів. Терапевтично ефективна кількість гібридного білка, призначена суб'єкту, буде залежати від типу та тяжкості захворювання та від особливостей суб'єкта, наприклад, загального стану здоров'я, віку, статі, маси тіла та толерантності до лікарських засобів.

Фахівець зможе визначити відповідні дози залежно від цих та інших чинників. В деяких

Зо варіантах здійснення цього винаходу терапевтично ефективна кількість гібридного білка за цим винаходом при введенні один раз на тиждень коливається від приблизно 0,01 нмоль/кг до приблизно 100 нмоль/кг. Більшу перевагу віддають терапевтично ефективній кількості гібридного білка за цим винаходом, яка при введенні один раз на тиждень коливається від приблизно 1 нмоль/г до приблизно 50 нмоль/кг. Більшу перевагу віддають терапевтично ефективній кількості гібридного білка за цим винаходом, яка при введенні один раз на тиждень, коливається від приблизно 16 нмоль/кг до приблизно 25 нмоль/кг. В деяких варіантах здійснення цього винаходу терапевтично ефективна кількість гібридного білка за цим винаходом при введенні один раз на тиждень коливається від приблизно 1 мг до приблизно 200 мг. Більшу перевагу віддають терапевтично ефективній кількості гібридного білка за цим винаходом, яка при введенні один раз на тиждень коливається від приблизно 25 мг до приблизно 175 мг. Більшу перевагу віддають терапевтично ефективній кількості гібридного білка за цим винаходом, яка при введенні один раз на тиждень коливається від приблизно 100 мг до приблизно 160 мг.

Спеціалістам в цій галузі буде зрозуміло, що, коли гібридний білок за цим винаходом вводять в комбінації з іншим активним інгредієнтом, таким як агоніст СІ Р-1К, доза може бути скоригована так, що активність двох об'єднаних лікарських засобів виявиться достатньою для регулювання рівня глюкози в крові у пацієнта. Отже, кількість гібридного білка, яку необхідно вводити для регулювання рівня глюкози в крові у таких комбінаціях, може бути меншою, ніж було б необхідним, якби гібридний білок був застосований як монотерапія. Наприклад, коли гіоридний білок за цим винаходом запропонований в комбінації з агоністом СІ Р-1К, кількість гібридного білка, яка має бути надана у дозі, яку вводять один раз на тиждень, може бути зменшена до 50 95 у порівнянні з кількістю такого самого гібридного білка для використання як монотерапії у таких дозах як дози, описані в попередньому абзаці.

Переважно введення терапевтично ефективної кількості гібридного білка за цим винаходом у деяких варіантах здійснення цього винаходу забезпечить ефективне регулювання глюкози з одночасним зниженням ризику гіпоглікемії та/або збільшення маси тіла у порівнянні з існуючими лікарськими засобами. Частота виникнення гіпоглікемії зумовлена терапією діабету, яка пригнічує рецептори інсуліну, може бути зведена до мінімуму уникненням швидкого збільшення концентрації терапевтичного засобу після введення. Гібридні білюи за цим винаходом мають бо тривалий часовий профіль дії без швидкого збільшення концентрації після введення.

Крім того, у варіантах здійснення цього винаходу, за якими гібридні білки за цим винаходом введені в комбінації з іншим активним інгредієнтом, зокрема, агоністом СІ Р-1К, активність гібридних білків за цим винаходом, спрямована переважно на печінку, також може зменшити ризик виникнення гіпоглікемії при регулюванні рівнів глюкози. Оскільки гібридний білок за цим винаходом може легко отримати доступ до печінки через фенестрований ендотелій синусоїдних капілярів, згадана молекула може контролювати вихід глюкози з печінки, при незначній, у разі її наявності, активності на периферії, тоді як агоніст ЗІ Р-1К сприяє глюкозозалежній секреції ендогенного інсуліну з підшлункової залози, який здатний легко проникати на периферію для регулювання засвоєння глюкози в м'язах та жировій клітчатці.

Гібридні білки за цим винаходом вводять парентерально, інтраназальним шляхом або шляхом легеневої аспірації. Перевагу віддають парентеральному введенню, яке може включати, наприклад, системне введення, таке як введення шляхом внутрішньом'язової, внутрішньовенної, підшкірної або внутрішньоочеревинної ін'єкції.

Гібридні білки можуть бути введені суб'єкту у складі фармацевтичної композиції, яка містить гібридний білок за цим винаходом та щонайменше один фармацевтично прийнятний наповнювач. Такі фармацевтичні композиції є типові, хоча і необов'язково, для парентерального застосування, і можуть бути одержані будь-якими різними способами, із використанням звичайних наповнювачів для призначених для парентерального введення продуктів, які є добре відомими в цій галузі. Дивись, наприклад, НКетіпдіюоп: те 5сієпсе апа Ргасіїсе ої Рнаптасу (0.8.

Теоу, Едіюг, 21: Єдайоп, Іірріпсой, УМіПат»ь 8 УМІКіп5, 2006). Як описано вище, гібридний білок за цим винаходом є гомодимером, коли він експресується клітинами ссавців. Тому, у разі використання в цьому описі, термін "композиція, що містить гібридний білок" охоплює композицію, яка містить гомодимер гібридного білка. В деяких варіантах здійснення цього винаходу фармацевтична композиція за цим винаходом охоплює композицію з гібридним білком за цим винаходом, наявним в концентрації щонайменше 1 мг/мл, щонайменше 2 мг/мл, щонайменше 5 мг/мл, щонайменше 10 мг/мл, щонайменше 20 мг/мл, щонайменше 25 мг/мл, щонайменше 30 мг/мл, щонайменше 35 мг/мл, щонайменше 50 мг/мл, щонайменше 55 мг/мл, щонайменше 60 мг/мл, щонайменше 65 мг/мл, щонайменше 75 мг/мл, щонайменше 100 мг/мл або більше. У варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, гібридний білок

Зо наявний у концентрації 10-100 мг/мл. У варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають більшу перевагу, гібридний білок наявний у концентрації 15-75 мг/мл, і у варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають найбільшу перевагу, гібридний білок наявний у концентрації 20- 65 мг/мл.

Термін "наповнювач" означає будь-яку речовину, додану до згаданої композиції, відмінну від гібридного білка або будь-якого(будь-яких) іншого(-их) додаткового(-их) активного(-их) інгредієнтас-ів). Приклади таких наповнювачів, які можуть бути використані в композиціях за цим винаходом, охоплюють буферні засоби, поверхнево-активні речовини, ізотонічні засоби та консерванти.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу композиція за цим винаходом містить один або декілька буферних засобів для контролювання рН композиції. "Буферний засіб" являє собою речовину, яка протистоїть змінам рН через дію компонентів кон'югату кислоти з основою, що входить до його складу. В деяких варіантах здійснення цього винаходу композиція за цим винаходом має рН від приблизно 5,5 до приблизно 8,0, переважно від приблизно 6,0 до приблизно 7,4, за варіантом здійснення цього винаходу, якому віддають більшу перевагу, у межах від приблизно 6,0 до 6,75. Буферні засоби, придатні для контролювання рН композицій за цим винаходом в потрібному діапазоні, охоплюють, але не обмежуються ними, такі засоби як фосфат, ацетат, цитрат або їх кислоти, аргінін, ТРИС та гістидинові буфери, а також їх комбінації "ТРИС" означає 2-аміно-2-гідроксиметил-1,3-пропандіол та будь-яку його фармакологічно прийнятну сіль. Вільна основа та хлористоводнева сіль (тобто ТРИС-НСЇ) є двома поширеними формами ТРИС. ТРИС також відомий в цій галузі як триметилоламінометан, трометамін та трис(гідроксиметил)амінометан. Буферними засобами у складі композицій за цим винаходом, яким віддається перевага, є цитрат або лимонна кислота та фосфат.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу композиції за цим винаходом містять один або декілька ізотонічних засобів для мінімізації болю під час ін'єкції через набряк або розрив клітин. "Ізотонічним засобом" є сполука, яка є фізіологічно стерпною і надає відповідну ізотонічність композиції для запобігання сумарного потоку води через клітинні мембрани, які контактують з введеною фармацевтичною композицією. Відомі ізотонічні засоби охоплюють гліцерин, солі, такі як хлорид натрію, і моносахариди, у тому числі, але не обмежуючись ними, маніт, декстрозу та лактозу. Ізотонічним(-и) засобом(-ами), якому(яким) віддають перевагу, є бо маніт і хлорид натрію.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу композиції за цим винаходом містять поверхнево-активну речовину. "Поверхнево-активна речовина" являє собою речовину, що знижує поверхневий натяг рідини. Приклади поверхнево-активних речовин, "які використовуються в фармацевтичних композиціях і які можуть бути використані в деяких композиціях за цим винаходом, включають полісорбат 20, полісорбат 80, поліетиленгліколі (наприклад, ПЕГ 400, ПЕГ 3000, ТКІТОМ Х-100), поліетиленглікольалкілові ефіри (наприклад,

ВК), поліпропіленгліколі, блок-сополімери (наприклад, полоксамер, РІШКОМІС 68, полоксамер 407, РІШКОМІС Е127; ТЕТКОМІС5), сорбітаналкілові складні ефіри (наприклад,

ЗРАМ), поліетоксильовану рицинову олію (наприклад, КО ГІРНОК, СКЕМОРНОК) і трегалозу.

Фармацевтичні композиції за цим винаходом також можуть містити консервант. Термін "консервант" означає сполуку, додану до фармацевтичної композиції, щоб вона діяла як протимікробний засіб в композиціях багаторазового використання та/або в титрованих композиціях. Серед консервантів, відомих в цій галузі як ефективні і прийнятні для парентеральних композицій, є бензалконію хлорид, бензетоній, хлоргексидин, фенол, м-крезол, бензиловий спирт, метил- або пропілпарабен, хлорбутанол, о-крезол, п-крезол, хлоркрезол, фенілмеркурійнітрат, тимеросал, бензойна кислота та їх різні суміші. Фенольний консервант охоплює сполуки фенолу, м-крезолу, о-крезолу, п-крезолу, хлорокрезолу, метилапарабену та їх сумішей. У разі необхідності у консерванті, консервантом, який використовують в композиціях за цим винаходом, є переважно фенольний консервант, переважно м-крезол або фенол.

Як відомо, деякі фенольні консерванти, такі як фенол та м-крезол, зв'язуються з інсуліном та гексамерами інсуліну і тим самим стабілізують конформаційні зміни, що збільшують або фізичну, або хімічну стабільність чи обидві. Однак у композиціях, що містять інші білки, такі консерванти можуть сприяти утворенню білкових агрегатів або високомолекулярних полімерів (НММУР). Дивись, наприклад, Маа У.Р. апа Нзи С.С., Іпї У Рпапгт 140: 155-168 (1996); Егапев5оп

У., еї аІ., Рпагт. Нев., 14: 606-612 (1997); ат Х.М., єї аЇ., Рпагт. Нев., 14: 725-729 (1997);

Веттвеїіе ВІ г, єї а)І., Рнапт Нез 15: 200-208. (1998); Тніпитапдаїати В., єї аї., У Рнагт 5сі 95: 1480-1497 (2006). Такі білкові агрегати в терапевтичних композиціях є небажаним через їх тенденцію до індукування імунної відповіді.

В деяких варіантах здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, амінокислотну послідовність гібридного білка за цим винаходом оптимізують для підвищення фізичної стійкості згаданого гібридного білка у композиціях, які також містять фенольний консервант. Наприклад, автори цього винаходу неочікувано виявили, що наявність мутації амінокислот у положенні 10 в аналогу ланцюга А інсуліну (змінне Х: в аналогу ланцюга А інсуліну, наведене в послідовності

ЗЕБЕО ІЮ МО: 2) зменшує накопичення агрегатів гібридного білка у присутності фенольних консервантів, як показано в наведених нижче дослідженнях стабільності.

Цей винахід додатково проілюстрований наведеними далі прикладами, які не можна тлумачити як обмежувальні.

Експресія та очищення гібридних білків

Гібридні білюи за цим винаходом продукуються у експресійній системі, яка являє собою клітини ссавців, з використанням клітинної ліні СНО з нокаутованим геном (55090) глутамінсинтетази (035). Нокаут гену 55 дозволяє посилити жорсткість селекції усуненням фонової активності ендогенної 55, що дозволяє вижити низько- або непродуктивним клітинам за умов селекції. Гени, що кодують гібридні білки, субклонуються в експресійній плазміді, яка містить глютамінсинтетазу (55). Послідовність КДНК, яка кодує гібридні білки, зливають в межах рамки зчитування з кодуючою послідовністю сигнального пептиду, який посилює секрецію гібридного білка в культуральне середовище клітин. Експресія стимулюється цитомегаловірусним (СММУ) промотором. Клітини СНО КО стабільно трансфекують, використовуючи електропорацію та відповідну кількість рекомбінантної експресійної плазміди.

Трансфековані клітини піддають змішаній селекції у середовищах, які не містять глутаміну.

Трансфековані пули висівають з низькою густиною для забезпечення близького до клонального росту стабільно експресуючих клітин. Еталонні лунки перевіряють на експресію гібридного білка і масштабують в суспензійних культурах на безсироваткових середовищах, які використовуються для продукування.

Гібридні білки, секретовані в середовище, можуть бути очищені афінною хроматографією з використанням сорбентів на основі іммобілізованого протеїна А з подальшим гель- хроматографуванням за розміром молекул за стандартними методами хроматографії. Стисло, гібридні білюи з очищених середовищ захоплюються моноклональним антитіллом Маб зеїесі

Ргоївіп А (СЕ), збалансованим за допомогою забуференого фосфатом фізіологічного розчину, рН 7,4. Після етапу промивання забуференим фосфатом фізіологічним розчином, рН 7,4, бо гіоридні білюи елююють 10мМ розчином лимонної кислоти, рН 3,0. Фракції, що містять гібридний білок, об'єднують, і нейтралізують додаванням 1/10 об'єму 1М Трис, рН 8,0. Розчинні агрегати та мультимери можуть бути ефективно видалені звичайними методами, в тому числі гель- хроматографією за розміром молекул, гідрофобною хроматографією або іонообмінною хроматографією. Фракції, що містять мономерний гібридний білок (ковалентно зв'язаний гомодимер), як визначено гель-хроматографією за розміром молекул, об'єднують, фільтрують з додержанням стерильних умов, і зберігають.

Нижче показані амінокислотні послідовності наведених як приклади гібридних білків за цим винаходом:

Приклад 1: 20 за 4б 50 во кУМОНЬСОоВНЬМЕАТЬКІУСОКВОКНУОСОВБОВООбОСІ ВОСТІ КВУ СОВО та ВУ за 110 о 155 виро сосОосОосоБосскСсеРСРАРрРУДОВЕУКВЕРеКРКОТІМІЗВТОЕУТСУТМ У 130 140 ї50 160 175 зва

НЕВВЕУСЕВНУССУКУНМНАКТЕРНЕКОКМУТКЕУУВУСТУУНОВМ ВОКЕУКСКУВНКО

139 226 210 220 ЕЗО 249

ІВАБІБКТІЗКТКООРНЕРОУХТЬРРЕРЕЕНТКМОУВСТСЬУКОВУРОВІВУЮЧЕЗНОЮЕ ай 25 27 ка 290

ЕНВУКІТРЕРМІОВОВаРЕУВКІТУрКВВИООоМУРВсВУМНЕВОНННУТОКА Я В РО 10 ЗЕ ОТО МО:

Приклад 2: зо 20 зо 48 а Ко

ЕУМСНІССВНЬУЕАСУБУССЕЕСУКУТНЕТООСО СТУ ВОСТІ ОКИС

70 80 зо 190 ца і38

ПОСОСсОВОпОКаКаКсвеСВВСТАРЕВАВОРЕУКЬЕЕРКРКОТОМІВЕТРЕУТСУУУНУ 130 14й 155 зва 170 159

ХОБОРЕТОУМЕУЧОСЕУНМАКТКРАКЕОЯ КОТУ ВУ НУЮТЬ КОКУКСКУ ЗМК

180 209 210 т2о 238 а

ОІРББІВКТІШКАКООБВВРОУУТІЬРРВОКЕМТКМОУБЕТСЬУКОКХРЕПІАУКНЕВНОЇ

250 зо 270 гва го

РЕМІУКТТЕРТрОВООВЕК,УВКОТУЮКиВКОКОКУКВСКУМНЕВЬКНЮМУТОКОЬОЬЗЬО

ІВЖО Ж ОМО: 16)

Приклад 3: ій 29 зо 48 54 Бо

ТУВОНССОНІТКАСЕТУСОКВОРНУ ОО ВО СОСІУЮОССТВІСВМОСЬВНУСОСО та во зо 160 119 122

ОБОООСООСОВОЗОСОООВСЕРОБАРНАЛОСЕВУРЬТРРЕРКОТІМІДВТВЦУТСУЧУ

БТБОБОРЕЧО МНТУ ВНАКТКРЕКЕОУМОКУКУУ ВУ ЮТТЬНОИЬНОКвуЮСЕМ В ї20 2050 18 250 230 248

МЕСОРОСІЖКТІВКАКООРАВТО ЕТО ВВОКУКТКВОУВЬСЬУКОКУРАОТАЧЕНЕВМ

250 ке РУ 28 за З

СОРЕНЕУКТТРРЧІОЕОсВКУРОТВАС КУПКИ ОТОВУВСВУМНЕЮАІНИНя ТОК 16

ІЕС ХВ ОВО:

Приклад 4:

15 що зо 4 50 во

РУМОННСОВНЕУВАІ І УССЕВОУНУ сосок овеовІУВОСОТВІ ВІСЬ ровов 7а ве зр 100 110 128

ЕТО ОВ ЗОСОКСЕРСРАВРУАВРІУКЬУВЕКРКО ТІМ ЗАТЕ СУ УУВУВНІ

138 145 156 180 178 182

ПеЕУОКМиуУ ОКУ НМАКТКРАЕКОКНИТЕ ВУ УВУ УНОрМЬВОКЕУКСКУВикосьЬЕ 150 лов 219 225 ява 248

АРІЕКТІВКТВООРКЕРОУУТЬРЕВНЕКМТКМОУВІТСЬУКОЕХ РОСТУ ВНЕНМООРЕХ

250 тва то 28 290

МУКТТРЕМЕОЖОСВЕКрУЗКЕТУЄКаНИСОСИУНСВУМНЕАСНЕНЖ ТОКІО Ве іЗжО ІВ ОМО:1ВІ

Приклад 5: 10 за зо 20 о ва

УМОВІ СОН У КАБЕТ УСС ВВ ПО ЕВ У СО

7о во зо 108 155 125

СОЦІО ОО СЕС ЕКАРЕАЛОСРЕУКМЕРЕКРЕМКМІВВІ ВЕТО УУ

130 140 ї5о з 150 186 шУЗОКсЕКУСМНу су вУВМАКТКЕКЕЕОКМаКуВУ УТ НОВНЬКОВКУ Кс 185 а 215 КУ 230 зво

МЮЗІРЯЗІЕКТІВКАКООРВЕРОУХТІРЕЗОКЕМТКВОУВТСЬУЮУКУ РОВІ КНВЯМ чО З 2то ВО а З

ЗОРЕММУКТТВРУКИоВрОВЕКЬ ТУ КшОКОМУКВСВУМи БАБИН ТОК иВ ма . іо ж моні)

Приклад 6: 30 за Зо 40 во «6 вЕпОоЧІСссаНоУ ВАК УСС НУВОСОсВИОО КОСТІВ ООриМУ соц 7а ва Зо її ма 120

БОС СОО ОЕСР АВРОАСРІУКОКОРЕРКОТЬМІЧВТРКУТСУУВУВНЕ

330 132 150 160 178 189

ПРЕЧОЖМИХТОСУКУНИАКІКУВЕЕСКВОТЕВУУУ МКУ НОМ ОКЕтЕСсКУ НЕСЕ та 2по 210 «га 25 249

АРІЕКТІЗКЕТКООРВЕВОУЖТІОКРНВЕЕНТКВОУВЬСМУКОВУВВОХАЧЕИЕВМОСРЕМ з5а зо ато ї8о з5й

МЕКТІРЕМЕОВОсаВКККУВККУСКаНВОСНУ ВС УМНЕАЬНМН ОВ ЬВ Ве іБКО Ір оБО:21)

Приклад 7:

15 25 зо 16 а ща

АОЕСЦНЕСЧОНІХ АСВ сВО ОО ВІ ЕОССТВІСВІЮСЕВХСоцох за за за її 310 120

БОСОЧОООСОВОВОВОКСВОСРАРЕУАОВОУКЬКВРКрКОТЬМІШВТРЕуУТСУМУрУВНЕ 138 ї4й ї50 165 ї7а їі8а

ОРЕМОКМНИХУОВУКУНКАКУКРНЕВСЕМОКЕНУВУ ЕМО ОМСМОКБУКСКУОНЕСЬЕ їі зай 210 22о 230 249

АРІБКТІВКТКОСРАЕРОМТ КУ КВБРЕЕМТКИШУВМІСЬУКОКУкЗрІАУВКЕОМОеВИ 25а зво 279 288 250

МІКТТЕРМІПВОСнРКІ ХК КУЮКаККООсНУКВСВ НЕД ЬНеНУ ТОКІО ве сяЖе Хо о:

Приклад 8: 16 20 зо 42 50 5

ЕУКОНІССВНІТЕАЬЕСУССКАСЕНУТЕКТООВОООВсІУ ВОСТІ рОгЕНУСоСО

КЕ во зо ме мо 122

ОпОООпОсдосооосососЕСВРСРАРРУАСВЕУЕМЕРРЕВКОТІ МІВ РЕКС ОУВ то во зо 305 112 159

НЕВРЕУСЕКИУУРОХЕУННАКТКРНЕКОГМЕТЕВУУВУЮТУНОВНІНОКЕТКСКИМЕО

7 че ча КВ 112 122

ІТАРІЕКТІЕКТКСОРВЕРОУУТЬРЕВЕВМТКНОУВКІСЬМЕВЕРЕСХАТКНЕВМОСЕ то що зо 150 мо 122

БиЩУКЕТЕРМІОЯрОВКРІтВКОТУВКЕНМОСМУКВСсвУМНЕВННУТОКВІ За КО і5БО Іо щО:223

Приклад 9: 20 зо 40 мо БО

ЕУМОНІСОЕНІУЕАБЕБУССЕВЕКЕЖТЕКТОСОВОВсСІЧКОССТВІСВЬХУОЬЕВУСоСО то во за 100 112 120

ЗБОСОСВОСОСВОСпОВБСВРСРАВРУАОРНУРЬЕРЕРКОТОМІЯВКРЕУТСУМ ВИ 130 145 158 1860 179 180

БОРЕУОЕКУУУПТОУЕНМАКТЕРЕБЕОЕКОТЕВУУВУ ТУУНОСНЬНОКЕХКСКУВИиКОЇ іза тоб 218 г2о 239 240

РАРІЖКТІЗКТКООРВЕРОУХТЬРРЗКЕЕМТКМОУЛЬТСТУКОВУРОВІАУКНЕВНООВВ

25 то та 280 343

КЕХКтТРРМООаПОБЕК,ІВКоТУрКеВиОюєМУКЗОВУМНЕАСЬНиНУКОКя:ОВЕО

ІЕО Іо: 23і 10

Приклад 10: 10 28 Зі 40 за о

КТООНЬСОЯНОУВАЬКОУСОВККНу ОО КОВО ОЦЕнУСЮВ та во р ме 1185 320

ОООБООИСООпОООЕСРРОРАВБУВОВОУКОКТРЕВКИТІВІВНТРЕУТСУЧУЮрИВ іза 148 150 1683 175 185 нЕПРЕЮЧОКМНУУЮОТЕТИМАКТКРВКВОКНОТи КУТУ НОМ КУКСКУВНКО 1985 7ва 2 зо 3 250

ІВАБІБШКТІЗЕТКООРАКРОТУТЬРВВЕЕМТКВОУВТСІУКОРЕВВОІАУКНВВОЄ а25а 260 278 во зо

ЕММУКТІТВРНОЗЛОВККЬуаКІ Топ Канн У СУМНА МУХ ТОК га

ЕФ ТО МО:24,

Активність Іп Міго

Партії досліджуваних сполук прикладів 1-3, прикладу 5 і прикладу 9 готують у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (РВ5, рН 7,4) або 10 мМ цитратному буфері (рН 6,5), |і зберігають при температурі 4 "С. Біосинтетичний людський інсулін (компанія Еїї І Шу апа

Сотрапу) готують у 0,01н розчині НСІ, і зберігають у вигляді заморожених аліквот, або готують у вигляді суміші, що містить м-крезол, цинк, хлорид натрію та ТРИС-буфер (рН 7,3), з концентрацією 100 одиниць/мл, і зберігають при температурі 4 "С.

Афінність гібридних білків визначають за допомогою дослідження зв'язування рецепторів, яке здійснюють на мембранах МІ, одержаних зі стабільно трансфекованих клітин лінії 293ЕВМА (клітини нирок людського ембріону 293НЕК, що експресують ЕВМА-1), що надекспресують ізоформу А рецептора людського інсуліну (ПІК-А) або ізоформу В рецептора людського інсуліну (ПІВ-В), що містить мітку (епітоп С9) на С-кінці. Афінність зв'язування визначають дослідженням конкурентного зв'язування радіоліганду, яке здійснюють в стаціонарному стані, використовуючи рекомбінантний людський (3-1 25І|-йодотирозил-А")-інсулін. Значення для досліджуваних зразків розраховують як відсоток відносно активності неміченого людського інсуліну. Значення ІСво визначають за допомогою 4-параметричного логістичного нелінійного регресійного аналізу (ХІРЇї версії 4,0, ІЮВ5). При необхідності верхні та нижні параметри кривої встановлюють, відповідно, на 100 або 0.

Константу афінності (Кі) обчислюють зі значення ІСво на основі рівняння Кі-ІСво/(1-О/Ка), де

О дорівнює концентрації радіоліганду, що використовується в експерименті, і Ка дорівнює константі афінності радіоліганда з його спорідненим рецептором у стані рівноваги, яка визначається за результатами дослідження насичувального зв'язування (пІК-А-0,205 нМ; пПІК-

В-0,251 нМ). Наведені значення К; показані як геометричне середнє ї- середня квадратична помилка середнього (ЗЕМ) з кількістю повторних визначень, позначених "п" (Таблиця 1).

Наведені для пояснення гібридні білки мають спорідненість як до ПІБ-А, так і до ПІК-В. У порівнянні з людським інсуліном, наведені для пояснення гібридні білюи демонструють знижену спорідненість до ПІК-А та ПІБ-В (Таблиця 1).

Таблиця 1 нин т У ПОТ За: ЗО

Значення К;- геометричне середнє; ЗЕМ - середня квадратична помилка середнього; п - кількість спостережень.

Дослідження Іп Мімо

Зо Дослідження на моделі діабету на пацюках, оброблених стрептозотоцином (512)

Дію гібридних білків досліджують на моделі діабету, яку представляють пацюки, оброблені стрептозотоцином. Пацюків-самців лінії 5ргадие-Оаулеу (маса тіла 400-425 г) наркотизують ізофлураном, і здійснюють одноразову ін'єкцію 7апозаг? (517, Мо за каталогом 89256, компанія

Тема Рагепієга! Медісіпе5, 40 мг/кг ІМ (внутрішньовенно)). Пацюків використовують в дослідженнях через З дні після ін'єкції 7апозаг"; в цих дослідженнях використовують тільки неголодувавших тварин з рівнем глюкози в крові від 400 мг/дл до 550 мг/дл.

Пацюків розподіляють на групи для забезпечення порівнянної розбіжності рівнів глюкози в крові та маси тіла, після чого рандомізують. Рівні глюкози в крові визначають глюкометром

АссиспескК Аміма (компанія Коспе). Пацюкам, призначеним для обробки 517, здійснюють одну підшкірну (ЗС) ін'єкцію у дозі 30 нмоль/кг.

Зразки крові для визначення рівнів глюкози відбирають з хвостової вени. Впродовж експерименту тварини мають вільний доступ до їжі та води. Дані щодо рівнів глюкози в крові представлені на Фіг. 1. Дані, представлені на Фіг. 1, являють собою середнє - ЗЕМ (п-6б для

Прикладів 1 та 8, п-З для інших прикладів). Дані щодо рівнів глюкози в крові в часових точках протягом початкового періоду годування (від 0 год. до 24 год.) збирають, але не включають в дані, наведені на Фіг. 1, для полегшення візуального сприйняття. Як показано на Фіг. 1, кожна зі сполук Прикладів 1-10 забезпечує зниження рівня глюкози протягом тривалого періоду часу.

Фармакокінетичні властивості сполук Прикладу 1, Прикладів 3-6 та Прикладів 9-10 також визначаються після підшкірного (5С) введення пацюкам, обробленим 517, так, як описано вище. Дані визначають з використанням твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІБА) рецепторів інсуліну, який вимагає присутності інсуліну, здатного зв'язувати рецептор інсуліну.

При проведенні твердофазного імуноферментного аналізу рецепторів інсуліну для захоплення використовують рецептор людського інсуліну (компанія К 5 О БЗузіет»5, Мо за каталогом: 1544-

ІВ/СЕ аа28-944). Цей рецептор людського інсуліну іммобілізують на планшеті Іттипіоп 4 НВХ мишачим антитілом проти бх НіхзТад (компанія Момадеп, Мо за каталогом: 70796). Стандартну криву для гібридного білка одержують розведенням зразків у 10095 пацючій плазмі з антикоагулянтом КЗ ЕОТА, і детектуванням за допомогою кон'югату мишачого антитіла проти

Ес-ділянки людського ДО з пероксидазою хрона (компанія ЗоціпегпВіоїесі, Мо за каталогом: 9040-05). Всі концентрації сполук Прикладів 3-6 та Прикладів 9-10 в часовій точці 336 год. знаходяться у межах від 22,1-9,8 мг/мл до 1498-4690 мг/мл. У Таблиці 2 показані концентрації сполуки Прикладу 1 з перебігом часу, а в Таблиці З показані фармакокінетичні параметри після некомпартментного аналізу даних для сполуки Прикладу 1. Дані підтверджують тривалу біодоступність для гібридних білків за цим винаходом.

Таблиця 2 61111111111111звБанмяй 7 96111111 876бх2028...77771

Дані являють собою середнє та середнє квадратичне відхилення п-3.

Таблиця З

Дані представлені як середнє та середнє квадратичне відхилення п-3. Скорочення: АОСо-оо - площа під кривою від 0 до нескінченності, Стах - максимальна концентрація, Ттах - час при максимальній концентрації, СІ. - кліренс, Е - біодоступність, 11/2 - період напіввиведення.

Еуглікемічний клемп-тест на здорових пацюках

Еуглікемічний клемп-тест на пацюках-самцях лінії Зргадне-Оаулеу виконують для розуміння загального впливу іп мімо сполуки Прикладу 1 на утилізацію глюкози та визначення активності сполуки Прикладу 1 у печінці у порівнянні з її активністю у периферичних тканинах. Введення

Зо ударної дози/здійснення безперервної інфузії 3--Н-глюкози розпочинають на щурах з постійним катетером, які голодували протягом ночі, для визначення продукування ендогенної глюкози (ЕСР) за основних умов. Потім розпочинають введення ударної дози/здійснення безперервної внутрішньовенної інфузії досліджуваного матеріалу - 7 нмоль/кг (ударна доза)| і 1 нмоль/кг/год.

Ішвидкість безперервної інфузії| - або введення еталона для порівняння (інсулін ліспро) - (без ударної дози| і 0,75 мОд/кг/хв |Шшвидкість безперервної інфузії| - і внутрішньовенну інфузію змінної кількості 2095 глюкози з періодичним коригуванням для підтримання концентрації глюкози в крові на рівні 100-110 мг/дл. Ударну дозу/швидкість інфузії підбирають для досягнення порівнянних показників швидкості інфузії глюкози (СІК) та порівнянних показників пригнічення ЕОР за умов проведення еуглікемічного клемп-тесту в кожній групі. Для інгібування секреції ендогенного інсуліну вводять соматостатин. У ході експерименту відбирають проби артеріальної крові для моніторингу гематокриту, інсуліну у плазмі крові та вільних жирних кислот, С-пептиду та ЕОР, основного і при проведенні клемп-тесту. Наприкінці експерименту вводять 2-(1-С|деоксиглюкозу для визначення поглинання глюкози тканинами при встановившихся концентраціях глюкози. За цих підібраних умов периферичну активність досліджуваного матеріалу та еталонів для порівняння аналізують як поглинання глюкози в камбаловидному м'язі, так і пригнічення рівня вільних жирних кислот (ЕРА) у плазмі крові. Всі дані аналізують за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу з апостеріорним аналізом

Даннета, використовуючи дані з групи з інсуліном ліспро як еталоном для перевірочного порівняння.

Ударна та інфузійна дози сполуки Прикладу 1 протягом клемп-тесту забезпечують стійку концентрацію в плазмі на рівні 274-457 нМ. Як показано в Таблиці 4, обидві групи тварин на певному етапі експерименту досягають порівнянної швидкості інфузії глюкози. Середній рівень глюкози в крові в групі, яка одержує сполуку Прикладу 1, є дещо більшим аніж в групі, яка одержує інсулін ліспро. Обидві групи мають аналогічні показники продукування ендогенної глюкози на вихідному рівні та під час проведення клемп-тесту (Таблиця 4). Крім того, відсоткова зміна від основного ЕОР у групі, яка одержує сполуку Прикладу 1, є порівнянною з контрольної групою, яка одержує інсулін ліспро (Таблиця 4). Для оцінки периферичної активності за еквівалентних умов клемп-тесту, визначають пригнічення рівня ЕЕБА в плазмі крові та поглинання глюкози в м'язах. Інсулін ліспро у ході клемп-тесту призвів до зниження рівнів ЕРА у плазмі крові, чого не спостерігалось у разі сполуки Прикладу 1 (Таблиця 4). Крім того, інфузія сполуки Прикладу 1, порівняно з інсуліном ліспро, призводить до 33 96 зниження поглинання глюкози в камбаловидному м'язі (Таблиця 4). Ці дані разом вказують на те, що сполука

Прикладу 1 демонструє зменшену периферичну активність порівняно з інсуліном ліспро.

Таблиця 4 11111111 Інсулін ліспро | Сполука Прикладу 1 11111111 |Протягомклемп-тесту | 3607:0241 | 350950160

Значення представлені як середнє - ЗЕМ 13 тварин для інсуліну ліспро та 17 тварин для

Зо сполуки Прикладу 1. Кд - метаболічний індекс глюкози. Статистичний аналіз був проведений за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу з подальшим апостеріорним аналізом

Даннета. 7 - Значно відрізняється від інсуліну ліспро (р «0,05).

Ефективність іп мімо в організмі мавп-крабоїдів

Фармакокінетичні (РК) параметри сполуки Прикладу 1 оцінюють на мавпах-крабоїдах після однієї внутрішньовенної дози (1,5 нмоль/кг) та однієї підшкірної дози (З нмоль/кг). Зразки плазми крові для аналізу фармакокінетичних параметрів відбирають у трьох тварин/групу протягом З тижнів. Для аналізу фармакокінетичних параметрів використовують два аналізи: твердофазний імуноферментний аналіз (Е!Г І5А) рецепторів інсуліну та загальний до Ес ЕГІЗА. При проведенні твердофазного імуноферментного аналізу рецепторів інсуліну для захоплення використовують рецептор людського інсуліну (компанія К 5 ОО Зузіет5, Мо за каталогом: 1544-ІК/СЕ). Цей рецептор людського інсуліну іммобілізують на планшеті Іттипіоп 4 НВХ мишачим антитілом проти НіхТад (компанія Момадеп, Ме за каталогом: 70796). Стандартну криву для сполуки

Прикладу 1 одержують розведенням зразків у 100 95 плазмі макак-крабоїдів (антикоагулянтом був КЗ ЕОТА) і детектуванням за допомогою кон'югату мишачого антитіла проти Ес-ділянки людського дО з пероксидазою хрона (компанія ЗоцїПпегпВіоїесі, Мо за каталогом: 9040-05). При проведенні загального ІД ЕГІЗА як реагент захоплення використовують анти-людське Ідс2 антитіло (Абсат ар1933). Сполуку Прикладу 1 розбавляють у 100 95 плазмі макак-крабоїдів; ідентифікуюче антитіло таке саме, як і у твердофазному імуноферментному аналізі рецепторів інсуліну. Результати обох аналізів представлені в Таблиці 5, а відповідні фармакокінетичні параметри представлені в Таблиці 6. Сполука Прикладу 1 показує повну біодоступність у мавп, і аналіз активного інсуліну та загальний аналіз Ес дають аналогічні результати.

Таблиця 5

Фармакокінетичні параметри сполуки Прикладу 1 у звичайних макак-крабоїдів 0000 Етпввюютьовню | зей мс 1717761 726:0119,.7 | гав! | б8вноє | гбоів 77796111 173426 | 544589 | 159525 | 7035390ЩЦГ

Дані представлені як середнє та середнє квадратичне відхилення для п-3. Скорочення:

ІМевнутрішньовенне введення; 5О-середнє квадратичне відхилення; МС-не обчислювалось

Фармакокінетичні параметри, одержані за некомпартментним аналізом даних в Таблиці 5.

Таблиця 6

ПИ пи поз появ

Ттах(од) 77777770 71148324. | 0 | 6428

АШсСо-їп - площа під кривою від 0 до нескінченності, Стах - максимальна концентрація (для внутрішньовенного введення Стах є екстрапольованою концентрацією на момент часу 0), Ттах - час при максимальній концентрації, Сі - кліренс, ЕЕ - біодоступність, 11/2 - період напіввиведення, Ув5 - стаціонарний об'єм розподілу, МА - не застосовується.

Стабільність

Композиція сполуки Прикладу 1 (65 мг/мл, без консерванту)

Сполуку Прикладу 1 з концентрацією 65 мг/мл у 10 мМ цитраті вводять до складу композиції, яка містить розчин маніту з концентрацією 46,4 мг/мл, 0,02 95 полісорбату 80, рН 6,5, |і зберігається при температурі 30"С. Зразки досліджують на відсотковий вміст високомолекулярних полімерів гель-хроматографією за розміром молекул (ЗЕС) через 0 тижнів, 2 тижні і 4 тижні, ін'єктуючи 1 мкл зразка з концентрацією 65 мг/мл. Аналітичну ЕС здійснюють із застосуванням системи Адіїепі 1100, оснащеної колоною Т5Каде! ЗирегеуУуЗ000 (компанія

То5оп Віозсіепсе), елююючи рухомою фазою (50 мМ розчин фосфату натрію, 300 мМ розчин масі, рН 7,0) зі швидкістю 0,4 мл/хв протягом 15 хв. Піки виявляють при оптичній густині 280 нм, і хроматограми аналізують із застосуванням програми СПпетбіайоп. Відсотковий вміст високомолекулярних полімерів в нульовій часовій точці становить 1,13 95, у двотижневій часовій точці він становить 1,68 95, і у чотиритижневій часовій точці він становить 1,74 95. Ці результати підтверджують стійкість сполуки Прикладу 1 при концентрації 65 мг/мл з мінімальним збільшенням вмісту розчинного агрегату через 4 тижні при температурі 30 "С.

Композиції сполук Прикладу 1 і Прикладу З з концентрацією 1 мг/мл з консервантом і без консерванту

Сполуки Прикладу 1 і Прикладу З готують у вигляді розчину з концентрацією 1 мг/мл у 10 мМ цитраті, рН 6,5, у присутності або за відсутності 30 мМ розчину м-крезолу, і зберігають при температурі 30 "С. Зразки досліджують на відсотковий вміст високомолекулярних полімерів гель-хроматографією за розміром молекул (ЗЕС) у нульовій часовій точці і через 2 тижні, ін'єктуючи 10 мкл зразка з концентрацією 1 мг/мл. Аналітичну 5ЕС здійснюють із застосуванням системи Адпйепі 1100, оснащеної колоною Т5Кає! зЗ0005УУх1 (компанія Тозоп Віозсіепсе), елююючи рухомою фазою (РВ5-350 мМ розчин Масі, рН 7,4) зі швидкістю 0,5 мл/хв протягом 35 хв або 45 хв для зразків за відсутності або у присутності м-крезолу, відповідно. Піки виявляють при оптичній густині 214 нм, а хроматограми аналізують із застосуванням програми

СПпетейайоп. У разі сполуки Прикладу 3, з і без м-крезолу, відсотковий вміст високомолекулярних полімерів в нульовій часовій точці становить 0,2 95 і 3,06 95, відповідно.

Відсотковий вміст високомолекулярних полімерів через 2 тижні з та без м-крезолу становив 0,2 95 та 1,73 95, відповідно. Ці результати свідчать про негайне збільшення розчинного агрегату після додання м-крезолу до сполуки Прикладу З в нульовій часовій точці. Для сполуки Прикладу 1, у присутності та за відсутності м-крезолу, відсотковий вміст високомолекулярних полімерів в нульовій часовій точці становить 0,16 95 і 0,1595, відповідно. Відсотковий вміст високомолекулярних полімерів через 2 тижні за відсутності та у присутності м-крезолу становив 01895 та 0,31 95, відповідно. Ці результати свідчать про стабільність, у присутності консерванта, сполуки Прикладу 1, яка містить заміну амінокислоти в положенні 10 в аналогу

Зо ланцюга А інсуліну (змінне Хі в послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2, 7з у першому гібридному білку, описаному вище) у залишку Т, порівняно зі сполукою Прикладу 3, яка містить нативний залишок

Ї в цьому положенні, але яка по-іншому містить таку саму амінокислотну послідовність агоніста рецепторів інсуліну, що і сполука Прикладу 1.

Послідовності

ЗЕО ІО МО:1 - Аналог ланцюга В інсуліну

Е; Ха являє собою Е, У, О або Н; Хо являє собою Н або Е; Хв являє собою с, Т, 5, Н, М або є відсутнім; Х? являє собою с, Е, Р, К, р, 5, Н або є відсутнім; Хв являє собою Сб, Е,К, Р, ОО, 0, Н або є відсутнім; Хо являє собою 0, Т, 5, Е, К, А або є відсутнім, за умови, що аналог ланцюга В інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положенні Ха, Х5, Хв, Х7, Хв або Хо

ЗЕО ІЮ МО:С2 - Аналог ланцюга А інсуліну

СІМЕОССТ5ХІС5І ХгОЇ ЕМУСХ»зХ», де Хі: являє собою Т або І; Хг2 являє собою ОЮ, У, 0 або Е; Хз являє собою 0, М, 5 або А; і Хі являє собою будь-яку природну амінокислоту або є відсутнім, за умови, що, якщо Хз являє собою М, тоді Ха має бути амінокислотою, відмінною від с чи М

ЗЕО ІЮО МО:З - Перший пептидний лінкер хХіахХгоооо, де Х: являє собою б або є відсутнім; і Хг являє собою б, 5 або є відсутнім

ЗЕО І МО:4 - Агоніст рецепторів інсуліну

Е; Ха являє собою Е, У, О або Н; Хо являє собою Н або Е; Хв являє собою с, Т, 5, Н, М або є відсутнім; Х? являє собою с, Е, Р, К, р, 5, Н або є відсутнім; Хв являє собою Сб, Е,К, Р, ОО, 0, Н або є відсутнім; Хо являє собою с, Т, 5, Е, К, А або є відсутнім; Хіо являє собою С або є відсутнім; Хії являє собою с, 5 або є відсутнім; Х:і2 являє собою Т або І; Хіз являє собою 0, У,

О або Е; Х:« являє собою б, М, 5 або А; і Хі5 являє собою будь-яку природну амінокислоту або є відсутнім, за умови, що щонайменше одне з положень Ха, Х5, Хв, Х7, Хв або Хо має бути іншою 60 амінокислотою, ніж та, яка знаходиться, відповідно, у положенні Вів, В25, Вг27, Вгв, Вго або Взо ланцюга В молекули людського інсуліну, і, крім того, за умови, що, якщо Х:« являє собою М, тоді

Хі5 має бути амінокислотою, відмінною від с чи М

ЗЕО ІЮ МО:5 - Агоніст рецепторів інсуліну

ЕММОНІ Са5НІ МЕАІ ЕЇ УСаЕНОЕєНУСсССЯСВвИаС,СИСИИІМЕОССТОТОБ5І СОЇ ЕМУССИ

ЗЕО ІЮ МО:6 - Другий пептидний лінкер авсахасааахааваахХхзаасхХахХ»5Хв, де Хі являє собою О або Е; Х?2 являє собою О або Е; Хз являє собою О або Е; Х4 являє собою с, Е, О або є відсутнім; Хх; являє собою с або є відсутнім; і Хв являє собою о або є відсутнім

ЗЕО ІЮ МО:7 - Другий пептидний лінкер асаосасасосававарасоса

ЗЕО ІО МО:8 - Рсо-ділянка людського ЇДО

СРРОРАРЕГЇ ОРБМХЇ ХгРРКРКОТІ МІЗАВТРЕМТСХЗМУХА:ОМЗНЕОРЕМКЕММУ УВО МЕМНМА

КТКРВЕЕОМХ5ОТУВУМБМІ ТМ НОМ МЕОКЕУКСКМЗМКАГГ РАРІЕКТІЗКАКООРАВЕРОММТІ РРБ

ВОЕСТКМОМ5І ТОЇ УКОЕМРБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ О5рИБЕРІ КІ ТМОКЗАМмООС

ММЕ5СО5ММНЕАЇ НМНУТОКОІ 5І 5РОХв, де Хі являє собою РЕ, О або Е; Хо являє собою РЕ, О або Е; Хз являє собою М або Т; Ха являє собою У або Т; Хо являє собою М, 0 або С); і Хв являє собою К або є відсутнім

ЗЕО ІО МО:9 - Рео-ділянка людського ЇДО

РСОРРСОРАРЕААСОРБУХІЇ ХгРРКРКОТІ МІЗВТРЕМТСОХЗзУХа:О М5ОЕОРЕМОЄММУ ММВИаМЕМН

МАКТКРАЕЕОЕХ5ЗТУАМУБМІ ТМ НОМ МЕКЕМКСКМУ5МКИаї РОБІЕКТІЗКАКООРВЕРОМУТІ Р

ЕЯСМУЕ5С5ММНЕАЇ НМНУТОКОІ 51 5І ах», де Хі являє собою РЕ, О або Е; Хо являє собою РЕ, О або Е; Хз являє собою М або Т; Ха являє собою У або Т; Хо являє собою М, О або 0); і Хв являє собою ЕК або К; Х7 являє собою К або є відсутнім

ЗЕО ІО МО:10 - Ес-ділянка людського ДО

ЕСРРСОРАРРМАСРБМХЇ ХгРРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСХЗУХа:О М НЕОРЕМОЄЕМУ УМО МЕМНМА

КТКРВЕЕОЕХ55ТЕВУМ5М ТММНОСМІ МЕОКЕМКСКМУ5МКИаї РАРІЕКТІЗКТКООРАВЕРОММТІ РРБ

ВЕЕМТКМОМ5І ТОЇ МКОЕМРОВІАМЕМ ЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ О5ОБО5ЕРІ КІ ТМОКЗвВУМООС

ММЕ5СО5ММНЕАЇ НМНУТОКОІ 5І 5РОаХв, де Хі являє собою РЕ, О або Е; Хо являє собою РЕ, О або Е; Хз являє собою М або Т; Ха являє собою У або Т; Хо являє собою М, О або ОС); і Хв являє собою К або є відсутнім

ЗЕО ІО МО:11 - Гібридний білок

АМЕМЖЕБМСООРЕММУКТТРРХззі Ю5БОБЕРІЇ М5Хз3а4 ТМОКЗАУМОХзаММЕ5СЗУМНЕА НМЯНУТОК 9І 5І 5Хзва, де Хі являє собою КЕ, О або А; Хо являє собою У або 0; Хз являє собою М, К, О, о, О, А або

Е; Ха являє собою Е, У, О або Н; Хо являє собою Н або Е; Хв являє собою с, Т, 5, Н, М або є відсутнім; Х? являє собою с, Е, Р, К, р, 5, Н або є відсутнім; Хв являє собою Сб, Е,К, Р, ОО, 0, Н або є відсутнім; Хо являє собою б, Т, 5, Е, К, А або є відсутнім, за умови, що щонайменше одне з положень Ха, Х5, Хв, Х7, Хв або Хо є амінокислотою, відмінною від тієї, яка є присутньою, відповідно, у положенні Вів, В25, В27, Вгв, Вго або Взо ланцюга В людського інсуліну; Хто являє собою С або є відсутнім; Хі: являє собою с, 5 або є відсутнім; Хі2 являє собою Т або І; Хіз являє собою 0, У, О або Е; Х:« являє собою с, М, 5 або А; Хі5 являє собою будь-яку природну амінокислоту або є відсутнім, за умови, що, якщо Хі являє собою М, то Хі5 має бути

БО амінокислотою, відмінною від С чи М; Хіє являє собою О або Е; Х:і7 являє собою О або Е; Хв являє собою С або Е; Хіо являє собою с, Е, 0 або є відсутнім; Хго являє собою о або є відсутнім; Хгі являє собою с або є відсутнім; Хгг2 являє собою Е або Р; Хгз являє собою Е або Р;

Хга являє собою А або У; Хо5 являє собою с або є відсутнім; Хв являє собою О або Н; Хг27 являє собою У або Е; Хгв являє собою Г. або У; Хго являє собою 5 або А; Хзо являє собою 5 або Р; Хзі являє собою А або Т; Хзг являє собою СО або Е; Хзз являє собою М або М; Хза являє собою Е або

К; Хз5 являє собою Е або с); і Хзє являє собою | або Р

ВЕС МОН С Мредннй білок їа зо за 4 5 во кУМОоНІСаНі Ка ьЕвУсОКАОКн ово УвОоСстагОВОЕн С зо я зо 100 у 129 сао РОВАРВУАСЕВУКВВКЕКОГТІ МІТКУ СУ 130 140 150 160 1705 185

НЕПЕБВЕМИХУрОУБУННАКТКАНЕКОНа КУТУ НОЯ кВ кСсКУ МК 180 о 18 Ей 3 240

ОеАеТЕКТІвКТКООевЕВаУУ ТРЕК МКМОУ ОТУТ АЕНВВНООЕ

Р то ВО о вику тТКрРЦ ОО УВК ОККО АСОМ НЕАВНМН ТОК

БЕОЛОВМОМІ Ланию А людського інсуліну

ЗІУКОССТВІСВ ВУС

КОЛО ВО Ланцює В подевкого інекжінх

ЕСТМОНІССІНОКАМХБУССВВОКЕХТЕКТ

БКОЛО МОЯ - Пере пектин лікер

Осн

ЗЕОЛЮ МО - Гібридний бок із й ЗО 40 зи цО

УВС ноУЕАМУСоЕВВ ЕЕ ТОН ОСТ СЕМ СОС та й ЗО іа 119 128 пессинонесюосоциеикуокисвРСВАРЕВЛВЗВНУКЕКВВеКИІМмІНТевуУ ТУ

ІхО 140 15 їбй та їй

БОБОТБУЦЕМИХУПСУВУННАКТКРВЕБОГВЕТКУУвУвЕ НОЯ КВ Кс 190 М 232 ай 230 240

СБРОБІВКТІВКАКОСЕВЕРСХТОРЕОВЕМЕКНсУВЬ СКС вОрІАУЕНВОВОО

Бо 27а ФО 25

ВБЕНМЖКТТЕРУГОВІВЕКПІВНИТУпКаВОКОоВУКвсиУМикМ ин Таке

ОО МО Себредней білок 18 2 за 44 БО хе

КУМОНЬССВНИУВАЗЕОУСЄСВЕОЕНу Осо УКОССТВІ СОМ СЕМ СО за ей зо МН що 12 висоссо,оасОосОос рос сеРогАСЕААСаРЕМЕБЕКОКРКОТІМІОКТРЕУ ТС УМ і30 145 152 169 179 188

ПУБОБреЕЗовМиуУНаУВУНнАКтТквивОсиМГУВуУУ ТУ НИК КСКУВ їз 00 218 22 230 що

МЕОБеББІВБКТІВКАКВОРЕКРОУХТОвЕООКЕМЕКНОУВЬ СУК аКу вав АУЕНКОМ 250 ЗО 27а -т30 чо Зо

ОеРЕБИМУКТТККУБОСОЗ КУ ВК Турко ВОоВУКОСНуУМНКАСНМНИ ТОКІО

Її

ВЕОЛЮ ОЦІ З Кбрвннй бідою 13 20 КІ о зи ВО

ЕНОНЬСОВНвУЮВАВВЬУССЕВСЕНусООое ОО УСТ ьОС Мох 78 во 5 100 Мо 1529

Осока ЕВИВОваУКЕТеРКРКОГІ МІ ЧЕКУ ТС У Певне 155 145 150 ї150 іа їйй

ПРЕУОКММУУрОУВІНМАКТКРНАКВОКМОТЕВУУСЕУ УВО ВСКУ ВЕК 185 КУ 210 шо 23 40

АРІБКТІБКТКОСРЕЕРОУХТОВРІВЕЕМТКВОТВИТСМУЮВРУ А АЧЕНЕММОМЕ

250 ко 210 Ко «а

МЕТКЕТРЕМІО ОЗ ЕКувНМтУркБВКОЦОсВУКВосБУМНЕВИННМУ ТОК ивиКО

Кк КІ 4 о 5

ЕУМОНЕОСЕНУЕАСКЬУСИВВОК НУ СО С ТОВ та а КІ іо 8 156

СОЦ КЕР АРЕАВІЗКВУМЕКККРКОТОМЕ КЕ ЕУ КУ

1393 15а о 159 та іо

ОУХОВОРЕУСЕВИНЕУ УВУ НИАЕТККВЕЕОЕНУТКУ ТВ УВО КОХ і РУ 210 КО За 240

МКСТРЕЗІБКТІВКАКООККВРЕШУХТЬРРЕШЕЕМТВКИУ ТС УКЕВУУРЕОІАЧЕНЕВАХ

28 шо ато зно За 300

ОУЕН КТУРЕЧЬОКООВКЕБУ ЕВ УВКЕКНИКеМУ СК УМА ОНВНУ ВОВК ЬЕ їй:

БЕО ТВ МОВ - Скірнхний білнк їб 53 Зо 45 50 во

ЕФТООНІСОВНЕУВАВЕБУ СЮ М сов совосЕ УС ВСЕМ КОЮ то о зо 155 118 1230

ОН ОВВСВАБЕАЛОЗВаЧсЕОЕВеиРКгТЕМІ ВТЕКТИ 130 143 ї52 їБа 379 180

ПеВОКОВЕЧаЕМИУУраУЮУНМИАКТКРВЕКО КМ ТУВУУВУ УСНО ЬНОКЕХ СКУ м 208 і ший 230 ща

МКшЕЕЗВІВЕКТІВКВКсОвНЕРООТТЬВРЕЦЕЕМРКМОУВОКСЬМЕОКХВВОТАУКНБЯМ

БО Бо ато вже КК Зо

ООРЕВМУКТТРЕУСООсВУТОУ ВМТ ЮК ВСУ МНЕАСНМНУТОКТЬОЯ о

БО МО - З Збрваєний біла 15 КЕ 30 46 за 80

КОКОН КОВНЬЧеАСЕКУ ОКА НУ КОВО МЕС ССО

ОНОМОМОСООООХОСЕвСвАКРУАЖРИМКМВЕБРЕВОТОМЕХВТЕУ КУМ НЕ ї35 іч 152 160 Уто іч

ОБКУСЕВНУ ЧТ УКУНМАКТКРЕКЕОКМОТЕВУ ВУ НІКИ

185 я 218 га 23 48

АВТЕКТІНКТВООЕАКРОМУТЬКРОКЕКМТКВО У КСТУКОКХЕВОТАУВИКИАНООВЕМ яко Ка РУ гна но

МУКТТЕРМООСОСВЕКБуВКиТУ ЕКО иУ ЕВСЕУМНЕАІНВНУ Тая ВИ за за 5 БО

КУМЦНЬСОВНИХЕАБЕБУССЕВАВНЕТ РКО УСС ТСН ТСеОЄ

КК. во ща ї10о 119 вне

ВИКО ОсеСКВОСРАВЕУВИРЕМУЕЦЕ РКК ВТ РЕСТСУУУ ВУД ї3а 140 155 ї60 179 180

НЕБРЕУСЕННУМОЗУКУННАКТЕРКЕКСІВОТ КВУ СТУК ВОСКУ КИ

198 по 0 хао ЗО 240

БРАБІБКТІЗКТКСОРКЕРОТУТЬРЕВНЕЕМТКМОУВІТСЬУКОКУРЗПІДВЕКВОМИО

У 250 ато що хз

ЕМНЕКТТЕРМОСВОСУК КСВ УЧИВ У КСВ УМНЕА НИ НУК ОКО

КО» МОЯ - ГПібрадний бох 3 ха Ко я о 55 кУМОНХОСОБНІУКАВЕБУССВКОТКЕТЕКТОСОЧООКУ КИТІВ ЬКМ КН та Ім Б 3106 а і25

СОСНОВІ ВОСОмОЕСе СА РЕУДИВНУКЕВРЕРКОТІНІЕВТ РЕК ТСУ УТ ВИ 330 149 150 їКО і7а ї188

ЕОЕЕМОКМИУУТУКУННАКТИРВЕКОКМЕТКВУ ТУ УНК ККУ ЮК

185 Ки 219 жий ЗО х9О

ТАРІЕКТІЗКТКООРВЕРОУЄТЬВРЕВКВМТКМИУ ВТІК ЕВ АУКНВОМЕЕ а Ей 275 що о

МЕЖКТТКРМОПНООшЕРБЖнКиТУ КАВИ УКВСВУМНЕВЕНИНУ ОКХ ВХ 18 о 30 40 зі З

ЕУСОНіСоаНрУ ВАК УССЕВВЕКу ово ЕТ ВОССТВУСВОЮБЕНУСОСО то во Зо о 138 129

ОКО ОО КСРЕСРАКРУАВЕУКОК РКК ЬМІЗВЕРЕУ КУМ

130 150 АБО 1що 170 іо

НЕВРЕУСЕВНУТУОСУКУНМНАКТКРЕЕЕОУМТККНУ СУТ УУНОДВЬНОККУКСКУВНКО

150 200 тів ТВ 23 Ай

ТРАБІБКТІВКТКООРНБРОУХТЬРЕЕКЕВМТКНОУЕЬТСЬУКЕ ОТ АЕН

258 во то го а

ЕНМУКТТЕРМБОЗВОЗЕЕЬТВКОТУЮКЗНИюЮЄСНУКВСсЕУМНЕВНИНУ ТОКІО

ЕС О МО - СР

НАЕСТЕТВИУВНУЬАЕСОВВКЕКІВНЬУКОВО

ПЕРЕЛІК пОСНІДОВНОСТЕЙ «МО» лі Ліляї вид Компані «і2оз ГІБРИДНІ БІНКИ «130 хз «50» БоЄІЗВИТа «1512 8015-05-57 «Іва» й8 «330» Басевкій» зежвісйі 3.5 «гій 1 «їі1з 30 «кій» ВК «акаг цежучна послішавнуєть «вай «2И3з Синзтетачна генно- інженерна конствукція «ки «гії» МІБ5С РЕАТШКЕ «Ей (В... «ві» Хва в положенні їі являє собою Ре, бій збо Віа «ех «223» МІС РЕАТІВЕ «шейг (ЖІ, ік «ваз Хаз в полюженні 5 являє собою Уві або іх «Веб «а2і1» ВІБС БЕАТОКЕ «ее і13..13) «аз Хва в положенні З явдие собою Яви, Мув, БЮ, Му, іп, іа або щіц «ЕЙ чиїх МІБС КБАТОВЕ «ах РР... 16 сті Жаз в положенні 15 явля собою бів, Тук, Сай або нів чи «веї» МІБС КБАТУВЕ «дай (ЕК. «ай» Ха в пойоженні йо ввияє собою біз зо ре «КО» «віх МІС БЕАТОВЕ сЕшх Я 71,.,7) «Уа» Хва в положенні 27 являє собою 0лу, Тк, Бес, Нів, Уві або є відсутнім «веде чаші» МІВС КБАРОКЕ «дев? ЕН, В и» Хав в положенні Б звляє собою спі, ій, Бгео, Буш, Вер, ек, іш збо є відсутнім «а «ийїх МІС ЕБАТЧНЕ чиакк (-8І..ї23і «23» Хва в положенні 23 являє собою сь, 5, Шу, Ехо, Бів,

Вар, Ні збе є відсєтвів чай» МЕ ЕКАТУКЕ «жа» Б0.. (0) «ЗІ» Хиа в положенні 30 ввнляж собою піу, Твк, Зах, Бі, Був,

Аіа або є відсжтнім «ящоз 1

Хаа Ха Хаз бій Нія їх Сув бі бБес Ні Без Уві сім дія Га Хая ї З їз 15 їз Улі Суз бі БЗіз йху бі РБе Хаа Тук Хаа Хва хХва Хай я: 5 КВ «Вій й кхіїх 58 хаіїх РТ кої» ШеЕучна послідовність «ех «ті Синтетична генно-їінженерна єєснотТринція ех хіх МІС ТЕАТУВЕ кам Ор. ЦО | І кгї32 Ха в положенні 10 являє собою тп або її «зго «Зі» МІБС РЕАТИВЕ «сила 134р,..418) «її» Жага в подеженні 10 звияж собою Ар, ТУк, Бі або ву «аа «2215 МІБС ТЕАТОВЕ «Вайт» 125121..2 ча» Хва з подовженні 2) яжлве собою сбіу, АвОб, Бех або від «а» «221» МІБС РЕАТНВЕ «2тйм (383).,(82, «83» Хва в положенні й являє собою бедв'сякуУ преревим амінокислоту айо є відсутні «Ваш» 5 бі хів Уві щі бів св Суб ЗБЕ дек Хза Су йеж івб Хва бів Бе

1 х їз ї5 із Ав ТУух Суя Хаз Хаа

КЕ

«віх «11» 7 сві» БЕБТ «їз» йтучна послідовність «аа «223» Сентетична гпенвозінженерна комструкція «ВИШ хаті» МІЖ. ЕБАТОВЕ хаваж 1. .І кі» Хай в положенні і двляє собою Бі або є відсутнім кеш «айіз МІБС КЕЕАТОКЕ «Яййз 13.3) «223» Хаа зв положенні 3 явлає собою Щіу, Бех абз є відсутнім «300» З

Хая зі Хва пі щі пі Щ

І З

«102 я «Вії» ВВ «ій» РТ «вій йтУзЗна послідовність жк «иа» Севтетична генно«знженеюрна конструкцій «20» «29і5 МІС УКАТОВЕ кавеж (1..1 «223 Хза в положенні їі являє собою Ре, біл або дів «вах «ааїх МІС РЕВТОВЕ каша» (-..(5і «23» Хаа в положенні б ввдяє собою Узі або СТУ «ий» «22їх МЕБСЄ КЕАТОВЕ «ай» (3...) І І «жи» Хав в положенні 3 являв см Ап, уж, дво, З1М, Зіп, віза збе 1 «я «ай МІБС РЕАТОВЕ «ел» 161. (1 кла» Хай вк положенні 16 являє собою Біз, ТК. 515 або Ніє саяО»

кажіз МІС КАТІВ «ис» (я... «тей: жав в положенні З являє собою Пів збз вве «ВО х «вві? МІЗС БЕЖ Е «дош (Тр... ЕІ «23» йаа в положенні 57 являє собою Зіу, ТВ, Бех, нія, Уаї збо є відсутнім це «й2іїз МІБС БЕВТОКЕ «ЕЛ ЯН, (ЖВі «ші» Хаа в положенні ЗХ являє собою СіУ, ім, ЖЖже, Бу, ДЯ, чек, Ні або є відсутнім «АП «гії» МІС КЕАТОВЕ «швш» ЕМ... З ха? жав Б 'повсменні 5 двляє собою бі, біб, Був, ЕКО, іп, аву, Вів абб є відсутнім «пах «ої» МІС РЕАТОВЕ «ЕЕ 301 з Й І «таз» Хаз в подпоженні З являє собою зЗіу, ТВх, Бек, Сій, Пув, іа во « відсутнім «Ех кешіїМ МІС гБАТИВЕ их кі Зх кад 13..131) ка23» Хна в положенні 3) язляє собою біу або є відсутнім «Ещ» каші» МЕБС ТБАТОВЕ «каша (УК... «23 Хаа в положенні 33 являжх собою БіУу, беж збо ж відсутні «аиМУ «ейіх ВМІБО КБАТОКЕ «а» (47... 147 «ві» ЖХва в о попложенмі ЗУ явваяє добою їж або її6 «ах «екі» МІЩС КЕАТУКЕ «шви» (51.83 «ї23» Жва в положенні З) являє собою бр, ТУК, Бій або 635 чаш х «ві» МІБС ЕКАТОКЕ «вах (58... 55 ствах Хав в положенні ЗП являє собою бі, ази, СЕК збо Ві «Я» «Тйї» МІС КЕКАТОВЕ «аа» (Ба... 58

«їх Хаз в положенні ЗУ являє собою будьсякуУ природну знінокислоту або є відсутнім «Зх 8

Ха Хаа Хза бів МНів виз Сув Шіу Зехк Бі Ббецз Узі Біз Аза їв Ха ї В Кі; 15 зез Уві Суз Зі сій йко ці Ве База ТУух хав Хаа Хааз Ха Хаа щі

ФО Ка Зо

Хаа пі Сіу Бі Бі БіуУу їзїв Узі бі: бів Сув Сувє Тс Бех Хав Суз

КІ о 45 ех іже Хай біз беев ім йзв Тух Єжи Хазх Хаз ща 55 «30» 5 «ії» ЗВ «Зір ВВЕ «813» Штучна взолідевніють

Б

«Ії» Синтетична генносінженерна конструкція «нн 5

Ре чаї би Сів Ні ва Сув ЗУ бет Мі рем ав вхо 1 Ті ЗО 1 В 10 15 іч ТВі Суз Сі бі йкз Яіу рве Ніз ТуУх бі бі Бі бБіу пі ЩІУ аа 25 З ех пі Бі ві. 1 Зі ї3За баї біз бій сув без ТВЖ пек ТЕ Сув зв З 5

Бек мес йвор бів Бей біз Аа Тук Су Фіу що 35 «Вій» Б «ії 22 «вій» ВЕТ «813» Штучна послідеавність кеВ «веЗ2 Сентетична генносімженерна конструкція сей «яїх МІС ТБЕКТОВЕ «дай 43Р..) «ваз» Хаз в лодлеженні 5 являє собою бій або щі «вх еї81» МІС РБАТОВЕ «шва (БН..4130) «вай» Хаа в полеженні 10 являє собою зів вк зм

«Ва» іх МЕІБС РЕАТІЖЕ сей 1151...) ча? Мав в положенні 15 явля собою Біб або біз ках «жі МІС КЕБАЛЖЕ ев 20... «шиї» ав в положенні ТО являж собою бі, іш, бій вабе Ф відсутвім кий» «ЙЛВ» МІС КЕЕАТОВЕ «Вих (ХЕ... 23 «тії» Хзз в подоженні 21 являє сойою Бі або відсутнім «Ей «ай» ф2йр.. 2 «33» ЖХаз в положенні 21) являє собою Б)у або є відсьтнім «щі» «ші» МІБС КЕКАТОКЕ ке и ОЗ НЯ «каай» Хай в положенні ЗУ являє собою сіу збо є відсутнім «паз є зі БАЛУ йщіу Ві1У Хаа сі бі зіу сіу хаз 51» бе пі щі Кава БУ 1 5 19 її зі Бі» сіУ хаа хай каз у «віце 7 «Вії» 2 «Вік» КАТ «ії ручна послідсвність «дай» «2832 Сентетизнае генногсівженерна шонетрУКНіЯ «арх 7

Бі щі щіУ піУу Бій біз і уУу 1 іш щі 53 ЕЕ ім ді пай 031 зіу шу лу бі зм сім ві Ззіт іш ів оУ ЗКУ шу АЮ ап т 1 З 10 ї5 і Бу січ Зх ж «Вій» 8 «вії Й «вій» ВЕЖ «еїй2 Штучна песлідовністе «г» «аа» Синтетична генно«інженерня конструкція

«а єаві» МІБЩС БЕВТЦВЕ «вий 151.1 сеї» Хаа в положенні і5 даляє собою Бе, міш внз БІ

Фах «221» МІС РЕАТЦВЕ «вий» ТЕВР.., (18 «237 ЖХва в положенні 38 двлиє собою не, Чіп або щі «ях хі МІС КЕБАТОКЕ «ви» 1871,.,131) «ве» ЖХза в положенні 37 являє собою Узі айо ТВЕ кий «231» МІС РЕАТОВЕ кхивих і38)..138) «Ен» Хаз в положенні 35 являє собою У83і або ТВх кал к«ваїв МІС КЕБАТОВЕ «Іа х і78).. тв «ЯЗ» Ха в положенмі 72 являє собою еп, Ввр оабе сій «вах «алі МЕС КЕБАТОВЕ «ий (222)... 8 «в» Хаа в положенню жи ввів бої У або с відсутнім «00» В

Су жо Рко Сух Ркз Аіз Бко бій Їїею СПевб З3у біу Ркєс Бех Уа хай ї 5 ї0 15 їла Хав Ркз ККЗ Був Ро бух АЮ ТБх Бе Мей їі Бех йгеа Тс хо ки З за 52: Маїі Те Суб Хаз Маї Хай бо уві ех Ні бів дар рт щі Уві 38 за 5 їча ЕНпе двпоТкр о Тук уаі зр о сзу хаі Бо Уаі Ніж зв Азз Був ТНХ ва ей їуз гко дга біб біш бів Тух Хла Хек ТБЕ Тухє Яка Уві Уві Беж Уві 5 то тА що їли ївЕ Уві без Пів бів йлю Тс о йсз йо» о ЗАЖ Муз ба бух фу (ЕВ 85 за з

Пуз чаї бек йзп був Аза Ба Вкго йід Бко 116 Бій Буд Тв бів дежЕ ї10о 105 ї1о їуз Вів уз піт зів Бхо Ак пів Бкс бів Мав жує ТВЖ Бей Ро БЖо 115 129 іх5 ех аку дев о БАМ Мо ТЛХ Буї бак пів Мяі Зак пе їТВк був Бевз о уаії їз 1535 145

Був Бі Ре Туш Еко Бек дво Іі Аїз Узі Біч Тк; зЗіз Звк Ап У 145 158 155 ї15О ій Рез біо Ай дви Ту уз ТВ Твх Рхо Еко Узі їжи дор Бех дер їй 15 біу беж ре БВпе Пец Тук ак Був їм ТВ чаї АжОо був Зек Ака ТКр їн 1585 1980

Сів іп Бі Ав Узі Вне дек Сув беж Уаії Мет Ні 513 Аза ее Нів 185 2 255

Аза Нів ТеЕ Твк сів був бек жо Зеж бо бак о бко Бі Хай 210 15 ЕВ «5105 з «231ї» и «іх» БВ «Фі3» Джузна посвійовність «ВИП? «аа» Синтетичиз гаеннос-інженернй ковнесетрукція «ай» «ак» МІЩС РЕАТОВЕ «ваз ї3.УуВ «аа: Жаз в іможенні 1? являє собою ЕБе, Фіз або сах «кал кадїх МІС БРЕКТОКЕ «ваше (181..:18) «ЕРіх Хза в о повосженні 198 явля собою Бе, Зі зба сів ка каші» МІС КЕБАТУКЕ киш (З851.. (30 кий» Хав в поязженні ЗИ являє собою Уі збе ТнНЕ «Ех «каЖіх НІМ ТЕАТОВЕ «Ваша (Яр... 80 «ИЙ» Ха в положенні 40 являє собою Хі зе ТВЕ «вах «т2із МІС ЕЕАТИКЕ «ав В. ГЕ) «ий Хав в положенні 15 авляє собою йап, Азр овзбе бів ках ч«виї» ВІБС ЕБАТОВЕ «жа (185)... 3853 І «еиав каз в'ловоженні 155 являє сосою Вк аб Був «ад» «ваші» МІВ КЕАТМНЕ

«Вал (и... 223 «823» хХза в положенні 223 являє собою ув зб в відсутнім «ПІ» З хо Су Бто Бко Сум БкЕО дів Бо бій дів віз (1у Б1У Рхо бек Удї 1 а 13 і: каа їі хва РКО РкЗ цу РЕ з зуб дер їж Бе; Мебс дів Бех Ах ТТ 28 Т5 50

Бхв іш Уві їтвх Суз Хаа Уаі Хва др Уві Щек дів 51із дер ре 03

За я 35

Чаї Сів Рі. йзв о їкро тек Узі дзв бі бТаї бів Уві Ніз взз Аза Був

Бо 53

ТВж Сув Рхо Ага бів «о са ре за бек Тюж Туж йку Узі Мі бек

У 7а Ти ЗО

Уві ве ТВ Хаі їєм Ні біп Бар Тхр Без дзв о СВУ вуз За Тук Був ща За за

Сув бух Уві ех дав Був 1 бе РКО Зах бек Ті Бі уз Жах її 100 м що

Беж Був Віа Був Зіу Зів бо ВхЯ Ба БЕо біл Уві Тук Тк ія КЖо 115 ї80 іх5

Бко бек бів сій зів Мек ТБЖ був дви Бій чаї Зак їв ТБх Сув З їз ї1Я5 158 "зі БУ біт ре Тух ру бек йзр їі Аза чаї зім Тхр Зіц Зет деп їх 150 їізЕ 150

Бі бБіп Бхо біс дви Ав о тТУжк Туя ЗВУ ЗВУ Вко буо» Маії бво Авр бек і65Е 1760 КК:

Авв ові» бех ре ре Їїммі Тух ас Хва іо ТВЕ Уві Ак Гу Беж Ве 150 і85 50

ТЕр бів 910 515 Ав Уві Бпе Зег Сух бек чаї Меї Міз біз біз Фе її ко о

Ні ва Нів Тух ТВ бій БМуб5 бех Тецз Лех їви ех фей біу Хав 216 215 «жо я Хаос ож «гій а «ії» Ей «13» Штучна послідовність сЕййх «тий» Синтетизна геннесінженерна констрУукиав «Ева «22із МІВС РЕДТОВЕ

«ве 1181,.118) книжках Ха в положенні )6 являє собою Рпе, іп або Зі кЕабУ кі МІБС КЕБАТОВЕ кеша БІВ. (8 «тай» Хваа в йпслюженні 158 являє собою Бе, біл або 3 «аа» сиві» ЩІ КЕАКІВЕ «22 137,17 «ті» Хай в 'лонпОоженні Я являє бойсю Уаії або ТВ «а20У кетіх МІС БЕАТСВЕ к«вегх і385Б..35) ка» хва в положенні З являє собзю зі або ТЕ «В свй 47821,.478) «2232 Жавз в положенні 77 ввляє собою вп, вро абе вій «80» 21» МІС ЕКАТЕОКЕ «вав» (028. (83 «33» Хаз з полеюженні 530 аване собою Був або є війсжювме «й» їй

Фів Суз Вксз рРко Су Ро Аіз Бхо Рхо Уа) Аіа Бі Бгто Зеажб За Хаз

І З 10 15 їез Хаз вКо хо Був рРкз дув Авр о ТвВЕ Сев Меї Х3е бех Яка ТвВх РКО 28 | 85 КН бій Чаї ТвЕ буяє хва Уа) Хазв Ар Уві дек Нія із Ав Бк спів ув

З се 5 бій РБе дп Те о Тук Чаї Аз бі Уві бій Уві Ні бяв Аза Був ТЕ

М ак ще

Був рес вха сій біз біз Біде Хав бЗех їТнг Рре вхо Уві Уві ех таї й ЩО з що їви Твж Усі Уві Ніз піз дар Тк окей Ай пі пув Зіз ТК Був Сув що з5 їУ Чаї Вех два іш біу фо Рхо вія Екс її Біб був Тв їі Зв

КЕН 105 115 ув ТВЕ Буз бБіу Біп Бко вЕЗ бів ре ЗіБ Уві Тух ТвК Пи Рко Рез 115 ї2а 125

Зєх Вко піз біз Меє ТЬБх був баз зіва УЗ Бех Без ТВк о Сув їшиа Уві їх 135 155

Буш Біу Бе Тек Ро Зех Авр Ме ла Майї біз Тер бію Явж век О1у 145 150 і515 158 ів Рко 5із Аа Ава Жук Грує Тну ТВБк Рказ Рко Мек їжи Дер йек дер 155 КІ 115 оіУу ех Те Ббе іч Тух йех пуб без їх Уві зв Був цек ку Тхр 135 185 їз щів сів 51 Ав Таї Ре беж Суя бах чаї Мек Вів сьо Аіа бен) Ні ї55 Ка 293

Аза Вів Тух Тих біб Буш Хек рей бек без Яек Бко у Хав ій хі 8 «Ме 11 кіз ВІЗ «ей РЕЖ «213» Штучна послідсввісте «але «Із Синтетична геннозінженерня конструкція сей» «авї» МІШЄ КББАТОВЕ «ших 41)..543ї «ии3» Ха в положенні їі являв себаю не, бій або Вів

КИЙ

«28312 МІВ БЕБАТОВЕ кави» і... «223» Хаз з цопложенні б являє собою таї вбо Я1у «ЖИ» кг» МІС РЕАТОКЕ «ага» І3..1 «223» Жаї в повоженні З являє собою доп, Був. Бар, іУ, БІЛ,

Віз За б15 кеш «вії» МІЗО ЕБАТИОКЕ «їх 165... «вах Мав в подоженні 36 явпляє собою щі, Туж, Зів або Ні «КО» «гаїз МІ5С КЕАТИКЕ «ша БаБР..145 І «223» Хав в положенні 25 являє собою нів аба рБе «Ед «а8ї» МІС КВК «Іо» 4271, Дт «Різ Хва в положенні 27 «вдає собою біху, ТВХ. Бек, МНів, ХВі1 зба є відсьтнім «ха» «їі Мія ЕЖАтТОВЕ ска (08), си» Хава в положенні СБ являє смне Зі, ЗіБ, БЕжО, Цув, Ар, ха, Ні або є відсутнім «но «Ва» МІВ КБАТОВА «22 (395.28 кеї3» Хай в'шноженні ЗЯ явавям себою піУ, іЗ, Буш, Вжо, Пів,

Квр. Нів або є відсечнім «ЕХ «деїх МІС ЕЕАТИКЕ сек Їй01.. 3 «ей ЖХва в положенні Ж двляв собою Зіу, Тс, бек, Біл, Був, піз або є відсхжжнім «ЕІ» «хіх МІС КЕБАТУКЕ сиди Е.І «ВЯЇ» Хаз в положенні Зі являє собою Сі або є відсутнім «Ева «гі» МІВС ЕБАТИВЕ «аеїв 433. 3 «ТІЛ» Хав в положенні 33 являє собою 51іУ, Зв або є відсоштніом «еЕо «щу ІБ ТЕВТОКЕ сла» (АТР, 4 шо «Вії» Хай в о йоложенні 47 являє собою Тих або ів «ЕМ «323» МІС ЕБАТИНЕ «ой (3.51 «823» ЖХаз в положенні Зі являє собою Авр, Тук, БІВ або 518 квадх «ааї» МІС ВКАТУВЕ «вних 1581... 5 І «бах Хаа в положенні 58 являє собою піу, авт, ек збе Віа «ЩО «і» ВІЗ КБАТОВЕ «й (5, . 158) «Ії» Хай в положенні 53 явняє собою будь-яку привОдМи змінокисяоту або ж відсутнім кап» «жі» МІВС БЕАТОКЕ «ВЖйх (541,14 «її Хза в положенні 5 вваде собою Мій ай 513 хе» каві МІС ЕБАТОВЕ хлйа» їБ8р.. (Б «сийаз Хав з повложенні 595 яжшлве собою сАєб аб І ках «281» МІБС РЕАТОВЕ «шах ГО. І7Т4 «їх Хаа в подоженні 4 звляє собою 51 аб ЗВ ках «Ті» МІБС КБАТОКЕ «ше» 179),, 79 «Кі Хаз в положенні 73 авлює себою біу, Бі), іп або є відсутнім екю» скківз МІВ ЕКАТИВЕ свй (ВПР. ще «кий» хХав в положенні 80 ввляж сойою піт вбо « відсутнів «ВВ «2219 ВІЩС УБАТИВЕ кийвх (ЯР... 81 «виї" Жва в'положениі й) являє собою 51У або с відсУФВаАМ ках какіх ВІБС КЕБАЖОВЕ «иа (ЯР... 8 «тей Жаа в положенні БУ дваве собою січ ао РКО «и «03» МІБЄ ЕБАТОНЕ «УІйз ЇЗ0Р,. «33» Хай в подеженні 90 являє собою бій ба вк «вд «2212 МіВс КЕАТНКЕ «ей» 591, «гої» ЖХав в положенмі З1 вваяє собою Вій зле чі

ЕМ сеї» МІС ЕБАТОВЕ «йог їз4а1,.154і «Й» Хав в подоженні 34 являє собою О1у або є відсутнім «их «клі» МІШС КЕАТОВЕ «ай» (зи. КМ «иЕі» ЖХваа в положенні 123 являє собою ій абе Ніз «ех «2тї» МІС КЕЕАТСВЕ «Вій УТ. 57 «Ка Мая в подоженні 157 являє собою Тук або вВКе «Ех «щі» МІБС ГЕАТОКЕ «ши» 1681..115 «235 Хай в 'всзложенні 1665 яванє собою Бей або чаї «ЕЕ»

«Таїіт ВМІБС РЕАТИОВЕ «Іа» ІЗ8УР, БВ «даі» Жаз з зволоженні 187 являє «собою Бех абе Аів ках «айі» МІШС РЕАТОВЕ кика ІВ... ТВ «жеші» Жав в полояжнні 188 являє сойою беж збо Вжко «вах чеі МІС ЕКАКОВЕ «ей» ї195у,. АБ «223» Жвза в положенні 1955 явдяє собою Аїів або ТВХ каВаг «яйі» МІБО РЕАТОВЕ «Ей їФ153. (БЕ «ВЕ» Хва в положенні 515 являє собою біл або Аке «ий х «221» МІЗС КЕБАТОВЕ «ший» (й841..41258) «2232 Хаз в положенні 254 являє собою Маї або Мах «Ей» «231із ВІЯО КЕАТОВЕ «Ж» ів... іа «Биї» ЖХаз в положенні БО ЯяВвИнє собою ККУ айое Бук «ех «їз ВІБС ЖЕАТОВЕ «ЗІР ФЗТБР.. (ЗВ) «823» Хай в псловенні 87 являв сойбсю Бім збе св «ке» каві» МІВ КЕЛКОВЕ «ай» Ор... 302 «ва3х Хаа в положенні 02 являє себе їй або Ро ее

ЖХза Каз Хза с2зіп Віз лем Стук біу бек Ків Бе Узі біз Ава базі Хай 1 і 35 їх їсц маї Суз Бі 51» ду біу Бне Хаае Тук Хая Хзв Кава Ха Кава Іі ак ЕТО

Хава Бі піУу щі щі Зі 18 933 ж53о 030 Суз був Тлх Зех Хаз сбув

З ее «5

Бех їн) хаз бій Гей біо баз Тух Суз Хаа Ха сщіу піу БЩіу у Кай а Мав туК Су . У «А ах 5 сі ві віх Бі Хза біу Бі Б) бу хХаз Біу сіуУу СТУ біу Хаа Хав ва то КК КО

Хав Хва Ся Вко рт Сжв РКО Аза Рез Хаа Хаз Аза зі хХаз Бкз хет

55 що 55

Чаї Бе Бей РБе Кк Кт Був ко Був Ар о Твж їх Меб їів бек Аке тав т 315

Твх Бхо б) Узі Ту Сув Уві тв) Чаї Ар чаї Бек Хва сій Вр бхо 115 ї85 шо сі уі пап Бре дви Тхр Тух Уві бар 0іу УЗА ім Удії Ньв Авт дід 158 135 144

Му ТВХ Був Бк дха біз біб Бі Бе Аша Бех Тик Хза аг аі Уві 145 ї159 ї55 іо

Зех Уві ї-щи Тпх Уві Хва Кіз цій бар Тхр дез Ав спі уз Бій ТУЮ з КИ іт

Муз Суз уз Уві Яех Во Буз ОЗ3Уу їва то Кава аз ї1ів біш був ТВх їі8Е 85 її їіз бек Буз Хла Був 01у Біл ко ку бію Бхо біб Ма1ї Жух Трх ів їз5 й ПУ

Бхко Бко Бех Хва ло бід Ме ТАх буз Азв бію Уві Бек жо ТВжЖ Сув 16 ті 220 їз Уві Бу« Бі Бе Тук Ро Бек Ар Кі» діа Чаї зі Жхв Зі: Бех 825 ЗО 35 ТЯ два о зіу біп орто бій Аа вва Тух Буз ТВх Твж Бко Бо Хаз Би Вер 245 «5 З бет Авр біу щех Рвє бе Бей Тук ет Хея їй Тву Уві Авр був бе що 253 ато

Аха Тхр Бій хаа Сіу вва Та) Еме бек Сує ек чі Ме Ні біб А1в ж «ва КЗ

Гей Ніз ВЗяй Ні Тух ТБк бій Бу бат їз Зшу їй бек Хавз щіш я Кк Зпо сгійх 15 хЕ1їз 795 «Тіз ВВЕ 1і13з Штучна послідовнісую еКеМУ «Х23з Смутетичниа генносінаенеюрна ковострукнія «МН» 38 вМпе Майї дозво сів Ніз Бей Сув пі шШеж Ні Без Узі біз іа їз 019 і З 15 їі ївеи Уві Су ші Біб Яка пі Бе Нівз Тук пі пі бі Бі Біт І1У 2 Кк Зо зех бі сзіу іт щу 1У ї1е Чаї 30 бів Суз Ся ТВХ дек Тв Сув 35 35 45

Зех Бен шо бів рам 510 Ап ТуУК Сув сіУ піу Зі ЩіУ Фу ів у ща же а

Зі Зіж БУ З1ів Зі Зіу (іуУу Бу бів бу зіу біу п01іУу бі сіц Сук 7 та г

Ккз Рез Сув то діа хо жо Узі Бі 51 Рхе Жек таї БВе без ВВЕ 85 0 з5

Ркз Рхта ібн Рка Му дер оТвж іїви Ме їіє бек Ах ТВБк вхо бів Уві 106 їв 119

Ту Су чаї Улі Маї лйеев Хаї Бех Вів піч Ар о бго біз бТаї бак же 115 125 155

Яви їжр о тУух Уаі Вир БІіУу чаї бій Уаі ів два дів Був ТВЖ Був рко

Киев 135 144

АкУ Бі біз Біб ме Ази Же Тих ББбе вхо Уві чаї Бех Уві Спеб ТИХ 145 50 155 150

Уві їзі Ні діє йзр їх Бо Аа Сіу буз біз Тух Був Су Буз Маї 155 1і753 375

Яех Авп муз біу бер Бо Біз Рко їі п3)з бує ТВ жів бек Буз Те іо 155 їй їз ЩШіу піп Рко вто іч Бо пів Уві Тук Тк Сей рко Ро Бек Ака 195 00 ОБ сій біз Мет Тег Був вп о бів баї дек їі Тйх Су їм Маї був Б1У ій 15 220

Бе Тух Рхо Щек Ар їів із Уві СК Жкробіа еж Ап о б3іу Біл Бк

Же 2360 235 248 сів ази аз тує Був ТВ Тс Рго Ро Меїб реб Яр о йек Азр піу Бех «ах Ім 258 вве риє їм Тух беж бух їм ТЮЖ їі Ар вуз Бек Бха Ттр б3п бів зи Кс ак сі ап баі РвВе бек Сув бек уві Меї Віз біз Віа Бем Ні Як Ніх 375 «80 хН тук тВх піп Муз Бек їв дек бен» же ВЕ щіу 230 5 «їі10х «ії» і «ід» РТ «2135 Зм варієпв «ай» 13 бі хів Уві бі) бів Су був Беж бек її був Беж їй Тух 16 З ї х їй ї5 із вам Тук СПуз ви ке «вв їй «іх За «ік ЕТ «еаЗ бово варі «Оп 18 ме Уаї зи Бі» нів бе був зу Беж Віз бен чаї «іц Яіз рео тує ї З їо їЗ їв ЧУІі Ст бе ЗІЗ Ат 35 Бе бе ех БЕ Бек був ТЕ о а Ж «ва 15 «хх 7 кої ВЕЖ «32 Щеучна песладовнмаість «Мах киш минтетична генночінакнеювна конструкція «аж 5 і бі» дек бі бік Зі діу ї 5 «еїйх їв ках ЗО «хі» ВЕЖ «2135 БУучна песвідавніс

ЩИХ

«иа Ким енна Ревне- інасномна кове и «НМ 15

Бве Жаії яп бів ніш 58 Суб щіб бвє ція Бо Уві Бий Вів ем тує ї У ве; 15 їй Уві бує Б3іУ ЗМІ йка 15 ББе бе Ту ЖВвЕе Вів Бім Так ЗБК ЗіЖ го ке З зіжЖ шу З озіт щі іже зві ім ЗіБ сСує бу Тв щех гі су щеж

З я 5 хна тую ія їз біз де Те був Зі Бі і БА піж бек БІ Ж я БЕ за іт ої» век сіуУ СТУ Бі щію дек Ів Бе уз ТК біт Буо РЕб був 85 т ТВ в ко Бхо Сук Бко Віа Рхо дім Ата Аіа бі 01у хо ех Меаї Вле Ге й за як

Бе Рко хо Був рко Бу Дер о Твх Бі Меї ї18 5ег йЕУ ТВЕ БЕЗ сі 130 108 115 їЯві Тс Сув Зві баї Сбаї Влр уві) дат бів бій Вар Рео бій Майї бій 115 1275 125 рве Авп о Тхв Тух Маю Аїр січ чаї піз Уві Нів Ав віз був ТВк Бе 130 313 140 хе Ака біз 16 оо БВе дви Бех Тк Трж ку Мві Уві бек бі Тео 145 150 155 За

Тахо чаі Бей Ні бій Аяр Ткр рей дей біж зма 03 ТУЮ Був Сув Був ї55 17 ТТ5 чаї Бех два Бук біу їв РКО ех бех їі З1ба ук ЖВЕ Хі Бек Був іно 185 ї50

Вів був іх бій Бжс йгу бій Бжхо біз Уві Тух Тк Бен Ркз Рко Бер ії 58 25 сій Біб зо Веб Таж був дзп бій Чаї Бех Бей» ТвЖ бж бер Узі Дуз тіб 215 вхо

Зі Бре Тож Бко Бек Азв ї31е 5із Уві зіз Ткр ші» Бех Ваз п)іу Бій 5-5 ЗИ 235 245

Бжо Віз Аж дав о ТуУук ГБеув ТвВЕ ТВЕх ро Вко Та) їез вро зе Ар ЗУ аз 250 хх ек Ре ре Бей тує беїх Аха їз ТЕ Узі Авр був хек вса ТЕв Зів ай лай о піз біу вв чаї Кйе Бек су Бех Уві Ме чі 5ію дів еє Міз Вей 75 тва 83 піз Тут ТВЕ бів Був Шех Го бек рей Зеї їжи Зіф 290 25 За «10 17 киїіз ЗП кій» ВЕЖ «213» Шеучна конідсжністе ки» «швах бивтестичва генкосівженерна кометрукців «оз 17

Бве Уві Ав сій нів Бео сСує с3іу Бек Вів Без Уаї бій ія фем оз ії а 10 їй їси Уві Куз Зі 5310 Аха пі Бе нів Тух шіу пі» бі пі сі пу

КІ ЖЕ кю

Бех бі щу бі Біу Зі 118 Чаї біб біз без Суз Твк бек Я)е ув 35 чо 45

Бех ї«з йвр сіб їем біз Аве Тук Сув Біт Зі 01 шІУ БІуУ БІВ Оу

МО ре се -і піу 1 вів бі бів бі бі бів бі шіу біуУу ШЕУ За о Біу Шу вх 7 5 во

Вхо Сув вБко Бжо Сук Рхо Аіа бто біч віза із бі5 бі БЕЗ Зек Уді зо Зк ве іїши па Рко Рко Ба бхо уз Авр о Тпх фе Меї Тіє Зех Ака ТК їй 05 110 хо Зіз Уві ТВвжх бух Ма) УзЕК чаї барв Заї Зах біб 03б дв ко 538 115 170 125

УвА За Ме дво оїхр Тук Уаі Азр бу Уві 03б ЗУаії Ніж Вал АХ бує їх ї15 ї4й

Тпх Буз РКО Яка ім бій бів Ре бей Бек їТВжІ Тук да Уаі Чаї Зех 145 155 155 т52 аї їжа Тну Уві Бей Ні Зіп Авр ТЕр Без Авап бі цу Бій Тук ув 155 ї70 ї75

Кут муз чаї йек Азп оПуз біу бец Рко Бек ет І15 в) Був Тк Ї1їв і550 і855 ів

Зех Був Аіа бух піу біп Кко гу біз ко о бБіп Уаі Тук ТБж без Буга

Ма ВО 205

Ро Бек бів шій 210 Ме Тнх уз Ави 5ів Уві бек ем їх Сув Ге 21й 215 а чаї Був О1уУ ЕВе Кух Ро пек Яр обі Аіа Усі б3ю Тв слі беж Дай их -3о ії а бі біз Вк бі АБО ай Ту буз ТЕЖ Ту хо Рке баі Го Азр дет

Ж «55

Аз злу Зех ББе Ре ей Тух Бек АкЯ Бей ТВЕІ Уві дер жа Век Аху

Бо М 87 тхр зі» чі бі Вел о Маії Ре Зек Сувз Хек чаї Меб Ніз іч Вів Ге

Ка ЕВ 25

Ні дви нів тТужЖ їв ОЗ Бу ЖШеж Зав Беж іо ех їж діу 2 298 зва «ЕМ 18 «еїїМ 3 «ійх ВТ «аїа» Штучна послідовність «ех ех динтетична гевнстінжеверна констрУкщів «900» В

ЕБе Узі Взв бай Ніз рей Су біу Бек Ніз ви чаї бБії Аза ев 5 ї 5 10 15 їн Жаї сХув біу Бій Вк Зіх Бі Ніз ТУк щі БіУу зіу йщіу щЩщіу З8Х «о 25 за щі щі» віт жі сі їз« бз3 зів бів Сув бує ТВх Вех Її Сув Бех за 4й 35 їв йЕр бів їв 503 АзО тТУухХ Су б1у бі бі Біу ОЖу б Бі біу

ЗО Ве ва сішж біу біз бі біу біу бі Біз Бі бі Бі1у Б3у Бім Суз Бк вк ве то тв ве

Сув Бхо біз Ру Бгто Чаї Аза спіу Бк: Бек ува Бе ее вве РКО рхе що зо 5

Був Рхо Був Вяр ТВЖ ї4и Мес Ті Бех гу ТВж Ро бів Майї ТвтІ ше 180 105 110 чаї баз чаї дар Уаї Зек Ніж БМ Во Рко біз Уві Бі ВВе зви ТЕр 115 120 125 тТУк Чаї Аве Зі Уві біз У5А Вів Аве Аівз Був ТВ уз Вхо Ако З1а 139 135 145 піз сів бе зв бек ТВх ме бха уаї Маї бек Маї їж; Твх чаї Маї 145 ї50 155 ї59

Ніз піб йзроїкр обем два 51 пух бів Тж Був су був їаі3і цех вк їв5 176 їх уз біу Бей бжхо Азіз вхо 12 бід буз ТВ їі Бех Бу ТВх був Б1У 185 185 139 йіз Бгз вх дЧіз Рко піп Уві Тух Таж без то ко Зех дк бію Бей із5 ОО 205

Меї Тк Бу Аза бів чаї Бек їв Твк Су їв Уві Був 915 Рве тТук

Ав 215 а

Бко Зек Др Тіз Аз Уві Бій ТЕр За Бех Аз» О1у Бій Бжо ЗМ два

Кк 30 235 40

Авп оту фев Тв Тв Во Без Меї їмзі зр оХаю зв оці Зес РБе Ве за 25 же їі тТух Бех Був пе) Тах Уаі бар Був Бех Джо Ткр бів бів бі дав зо ке за

Уаї Риє Жех Сув Хек Узі Меб Ні Біз Аів Без Ніш Аа Ні Теж ТУ 215 го 285 сів уз щЖех ей Яеж рев Бех же БІ

Бо 285 кам 8 «ЖІ о «І» В «І бучини поЄпіновність «ВУХ ких бинтетнчна бенносінженернай конетрукція «Ге 18

Ве Уж бан Сів я веб Сх» і Беж ів БеБи зі сів бів ев бум ї 5 а 35 я - Ж КУ

Бен Уві Сує Бі Сл йо бі бе Ніз Ту Шу ЗР Бім Бі БУ у

Б ша КВ

Бек бішж бі; бі КУ У їла Зі суз сії Су Єюфе ТВ Мах ВЖК

Зх о 45

Бек без Яяр бін ї6е ЗО Ав тує був Біб іх Бі» щу БІ бів БЦ

Б ща С і бі щу ів Щі Бі бі Фу бів бі чіу БОР пф вів іу БУ 55 ЕК 5 ща

Бхе Су Вто Бко був Бто дів БК ОО дів дів 63» ЩЕуУ БО ще Уві ще ее ВЕ

Бе бех бе Бе Бк Бай Бже пу зо Ти Бей Бек зів Зеж важке ТВх що 105 о

БЕ пах Уаї ТВх Суб Уві ві Уві Яр Уві бек б бі дяю Кк Зо

ТІ5 153 125

Чаї ів Бе й Їко Тух Ма3і ев сіж Уа бБію Чаї Ні вай БЖ Був 135 135 15

ТКт цеє хо Кв ЗК; Бім ОМА Ре жив беж їТвжЖ Ту дж Таб чаї ех ї25 і 155 КЕ таї без ТВЕ Уві Без Ні 35 йо Тжв Без дев сі бу Ба Тух Був

МВ ІїТ5 суб Був Мзі Чек Ве пуб б1іу б Бжо аж беж ї35 бі іще Твх ТІ їв тах й

Бах мує дій те зуб Бій Бо ву Бра Бко Зій а) Тух ТЕ Баш РКО їі55 ЗНО ОВ то Зежх бін піз біб Меб ЇВ бує йев бл кі ех їх ВЖЕ був Хеи що ЖІ аа

Узі уз Біу Ре Жук хо бех двр 135 Дів Маї ім Тхв Біб Бек Два 25 3 235 240 іт іп рРко бій бВяп ба Тук муз ТВах ТвБЕ Рхо Ро Уві ви дво еї 2485 250 255

Азр щу бах Бне Бе Бей тук Бех йхеа Мез Твжх Уа) Ар пуа беж ДЕЗ

БО 5 То тЕр ів» ЗіЗ біу Ап Уаії РБа Бе Сув Хех баі Меб Мія піч дія Беи ва тва

Ків дз Віз Ту ТВЕ біз Бу дек Без Хек їво Зах ей 013 230 «35 5 «вій» 20 «ії» ЗЕ «12» ВЕ «ші Штучна посдлідевнЕосе «а» «823» Синтеєжизна гкенне-спженерна конструкція «400 50 вве чаї пі б3ю нів їша Суб бі беж ія Бей Узі бів Вів Бей бі ї 5 16 15 тец Уаї Суж пі «ій Ак Б1Уу Бце Нія ТУуюк щіу Зі» Бі Зіу Біу іх

КВ 25 зо

Бех бі бі бі і» піу їі6 Маї біз бів Суз Суз їх бек іє був

ЕН: ях деї івчм Авробів би біо Аа ТУжх Су шіу Бі і бі біу БІВ біУ ща ВЕ ка

Сі ші Бі бів сі бі щіу Щі Бій бі біз сі щіу бів 535 Б ва 73 5 зо

Бо Сув рхо рко Су то Діаз Бхо бій ів іа біу шіу Рко Зах Уа 85 за 25

Бе Їмні Бае о Бко Рко іде Ро Був Ажр о Тлж Тез Меє ЇЗіе Бек жу ТВХ 1090 165 310

Бто зі Уві ТВЕ Стук бві Уві Уві Ар узі Зеїг бів 230 Ав о бо 535 135 129 125 тТаї ціп бне Ве ТЕв Тух Уві др Бі зі Біа Узі Ні йшв дів бух

Іза І135 148

Тбжх був Руо Аха бів біз Біб КВе В5в о бе Твху Тух дко Чаї Уві дв 145 158 158 158

Уві ви Тву Уаї інши Ні Біл Во ТІВ во) Ап Зіу Був 5326 ТУух Був 155 ща 175 ув бує чаї Бех бзоа Муз біу ім вхо Бех Беж сів біз уз ТВЖ ї1і6 їво І85 ї5а

Бех буз йіа був біу бів Рхо ке біз Рко бій Узі) Тук ЖВЖ фев РЕ» 155 аа 255

Рко пек БМ Зі бо Меї ТВБжх Був Ав ші Таб Бек Бех їТБЖж Суз ве гід хів еВ

Узі Був Зіу Кре тТух Бго чес Абр Хі дів Узі бів Тжр бім ех дав таз ЯЗ «38 КН бік вію Ро сії дао Аа) ТУух бує ТВу ТНИХ Рхо Ро та) Бей яю Зевк 4 253 5

Ар віу Беж Ева Ве Гео Тех Звж Ах Бема ТБжх чаї Взр о був Бех бу

Б 255 ато

ТІр Бій бБізч Бі йБи Уві Бе Яехт суб Бек чаї Меї Ніз бій Аїя Тез 275 283 25

Нів Аеп Ні Тук Теж Ша вує йех Пе) бех мч) дек Без Оіу 23 зва зо «гід ді «Фії1х 257 «вій» ВВТ «9355 Дітучзма послідовність «ВО» «883» Синтетична геннозінженерна конструкніяй «8002 я

Віа 53у біуУу бів біз Бей Суз бу Бех Ніз ее Уві см Вів Ме) БА 1 З 10 ї15 їз Уазї Сув сі Біо Бк піУ Бпа нів тТук піу сі зі БУ азу Бех о БЕЗ за

Зі Бі піу Біт Бі їіє чаї біз сів Суя Суб Тнх дех 13е Суз ех 35 За ча їжи дво Біл без біб й5о Тух Суз біу біу Бі ЗЕЖ Ві» бів ві щу

За 55 в

Кіу бЗіх БІБ: бі Бі Бі У бів пі» біт іу Б3і1У 510 Суз Фбро Рез а 7 ко

Су Рг Аза жо ркоз Узі дів сі БЕє Бех чад Бе Хецп рве РКО БК

ВЗ що за

Муз Рхб Мев дер о ТвЕх їм Мет 16 Бек дк Твх Бо біз чаї ТВХ Сув їва 105 115

Узі чЧві Уві дев 81 Бех Ні щпіб Аяр Ро 01з Уві сів Бре дво ТЕ 115 і8о 125

Чук Уа дер Оіу Увї Фіз беії Ніз без йіж бує ТБ Беж Беє дя 5 136 135 т-ва із Ів РАБ ден Яву Тбк бе вка Уа Уві бек баї ее те ові Маї т ї5о 155 ня

Нів сів вар Тир Цеб хее СТУ Був бі Тук Хує Сув мує УВІ Яек дви 185 176 тт ує сту іо БКо Аіж ВЖО лів Біц ув тн Хі дев щує Тьх був ЩУ ї89 185 360 пів то дкч біз бо бін Уаі Бук їТвх (5 вхо Бо Зб ку бін Бім ни що за

Мес тв» Був век бій Мах ек бео Жве бує ва За був БЕЖ вне ТрЕ з Ів 25о

Бра дес Вар їіє йів Уві біз Тур біб бек дев пім ія без ра дви

Яви Тук ув ТВХ ТВжЕ ро вхо Має бе йзб Бех лов біжЖ Як ВБе вне то зва ЗЕ їв Ти Бек Був зни Тк ЖІ ВЕН Ку ек АЖИ ТИВ бів бів бів дев що 255 27о

Таї Ре ож Су Звжх ба3 Меє Ніз 652; йіж у нія лаб Ніж тує ТЕ ів ЗВО 285

Вів тує БЕЖ ї6в йеж Бей Бек бхв Бі

Ж дае свід За сії» аа «3» ВЕК «ІЗ» Швучна послідовність «ІВЯ» Синееонина ренносінженерна конструкція «а» МЕ

Те узі ва бів Вів бе Суб біф Бех ів пез ув) Мі Щі Манх З ; 5 їв їв їве УЗ бує бі біз Вк СК бе нія Тую ТБ Бк Бу Таж БІ ВТ

Яеу біт біт 019 бі Бі їїє Уві Ш3о їв Су Суб ЗЕ ех Таж Сув

Шег пео йяр бій без Біб Аве Тук був Бу ХУ ІК БІ 1 в Бу щи що що чіж Бі У сів БІ бів МУ БУ ЗК Бін 1» БУ ЗЕУ ЗІ бів Суя що т т ща

БЕЗ Рко Сжа РКО Аіз РЕ гг Узі піз спі Бхо Зег Узі Ба Без вла

Зо З

БЕо РКО Гу Бко Був Ар ТВ Бей Мек (іє Хек Аке ТНЖ Рез бів чаї

Ко МП це

Твх Сув Чаї Уві Маї др о бзі беж Нів під дев оРко Зі) тії Зій пе 115 150 125

Ав Тко ТУук Уві Бяв іу ві бій Заї Ні два ліз Бує ЖВх Був Бка ї13а ї35 іч дк зі) Бі бів Кп» Ал Бех Так Ре дка Уаї тві Бек Уа бе Тв 145 150 155 їв чві чаї Віз бів Азр о тТжр їм дво Біу уз «30 ХУ Буз Суд був Уві 1855 170 ї78 дах Ази Був «(іу ве Бус діа ко їіє бів Буг ТБЕ Ї1ї8 беж був ТЕ 185 ї85 іч хв Бі ів Вхо Аке ій ро Біб Чаї ТУЖ ТВ Бем вхо Рко Зак ВКЗ 1855 Ой дБ

ЗБ)» сім Має ТБх був два бій Маії Бех Без ТВх Сук їев Уаї бе БУ 218 І а

Ре Тук Бтхо Бех Азрв Ті Азіа ча) бів Жкр обі Бех бе оспьЬУ бій Ка й 230 235 40

Сіє Аве йекп ТУук рух ТЕЖ ТВ Бо Рхс Меї би йвр Бех Авробіу 59Є 245 25 Ва тре Ре їем Тух Бек Па Ббес ТЕ Уаі Азо Був бек хе Тр зів дів 2 о ав КК піу йзв Маї Вре бек Суз Зеж За) Мей Ні ЗМ) Аіз Без Мі Авт Мі вх Ко 288

Ту ТиВх бАп бух Зак Би беж їво Мак Ркоа ЗДУ 29 295 «вій ЯЗ «1 ЗЕ «віх» РЕЖ «213» Шеучна послідовність кегйУ си» Синтетична генно-інжемерна конструкиья. «Ов 23

ТМе Уві дже піп Кіз Гез сСув ЗІТу Бек Ні без Узі сш Аля бви ід ї ву 15 15 із. таі Су сіб б3іб Аку ші ББе Бе Тук ТвВх ЗІЗ біл ТвВж са КК о 25 30

Зі щу БіУ біу щі1у тів Уві Бі) біб був Су ТБ бек Т15 Су Бех

Ж Сн 45 іїзз Тук Бім іве бін й5г Тух Суз Зі Зі Зі бі ЗР Зех 319» БУ

Б Зв во зі щЩУу ек і пі бі пі пек Бі бі БіУу Біу Зеж зів Су Кке

В 7 7 а хо Су Рхо Діва Бк рез Уві Аза Зі Бхо беж Чаі Бре Мез Бе Бке

Ве за «5

РЕ Був Бка Муз дар ТВвк Бей Меї Ті Бех ака ТвВк бо -щій чаї ТВЕ мя 105 мо

Суз Маї та1ї Уві Вер Уві бЗех Ні Сім ййзю Бжо біз Уві Бій Бе Авв 115 І50 125 тк. Тух Чаї йо зу Уяі бій Уві Ніз Азп Ліз був ТВЕ Був РЕ Ак їй і35 1540

Зіз піз Біб Ре деп бек ТВ Ве Ака Маії Зві Бех Узі їв) Таж тд 145 ї5о 155 їй чаї Ні зів ар Тк ви дя біу Був бів ЖУК Буз Су Буз бай бек ївх Але 175

Азп був Ту рез Ркз АТа Рг Її 03м Пуз ТМЕ зе Бех Був ТБЕ Був 185 145 195 біт бів Вго вк біз Бк біз УЗ Тух ТВБЕ Пец Бко Бо 5еї ха Бу 155 хо 208

Ма Меж ТВХ пз дев бій Уві беж їв ТВжЖ Сув Бей баз БУ БУ рве 21 215 в2а

Туш Рко пек дво» їі Бія Т8і Січ Тхр біз беж йзо біу бік вхо ща

Кс 23 235 230 дев айва ТУук фув Твх ТВЖ хо Ркб Мебє Бем АБр Бес АБр оФіу Зет впе 4 що -55

Ре їі ТУкК бак Був Гей Тнж Чаї Ав Гуз бек Аку Тв бів бій піу ве 5 215

Аза Уаї Бе бех Сув бек чаї Меб Нів зб йія Бе Ні зва нів Тут 275 8 285 тв жів Суа Бах їай Бех баз йеж Кк Бі 280 235 «дійз 24 к2і1їз 558 «вій» нт «аїїз» еУучна послідовність «аа каг3» Синтетична генносіншенерна конструкція «ад» 23

Епе Уугі біу 516 Ні без Су бі бех Нів івк Чаї бій вів ев БИ 3 5 19 15 їжні йві Су пі бів йха міч ВБе Мі Тух пі бі бі Ппіу БЩіуУу бІУ

Ко В З бек ці 5Біу Бі піу йіу їі Маї бі: бів був бул ТБх Бех Так Суб 35 а 45

Бек Без йзв ЗіБ їев бій йза Тук сук БЗіу Бі Бі бі» пі пів БІТУу

Б в «о

Зіу Бі Бі пів пі Зіу зі» Бі й обу Бі іт БіуУ зу За Сук с а "б сх та 15 що го Рхб був Кко аіа Бо Бхо Уві) Аза біт вко Зех Заї Ре їеа Рне

ВЕ За за хо Бкоз уз Бго Буз Ази ТВЕ їецз Меб їі1в йехк Ака ТЕ Бхо зі Уві 105 105 110

ТвЕ Суз Уві Узі Чаї Вер Уві Зек Нів пі авроБко Бі ув) заібй ває 115 1280 125 дази тв ТУ Ма) Ахо 01У Чві Зі МаЕ Ні Ави А18 Був ТВЖ Був ге 13 М35 ї4З ака пів Б5ів сів ББе Вял йех Зах ББе йко Уаії Уві ех МБ їмна ТВ 145 155 155 15 чаї Уві Ні бів др оТкр оре) ява піу бе 3 Тух Був су бут Чаї 155 Кто 175

Жак дви Був сіб їжу КхО Аіа вКО їі9 Бій бу ТВЕ Ті Беж бук ТВЕ 18 185 180

Туз біу бів ко дДку Біш Рез О3п Уаії Тук ТВ ву бо Рко бен Ахц 135 ОО о5

Зі 01) Має Тк Був АапобБій у83і Яеж Бе) ТвВк Суб во Уві Був Бі3уУ

За | 215 429

Бпе Туюк бро бек дзр І1« діа ді бій Ткр бій ше Аза сіу бій вка вав ха 238 240 бі Аа йзп о ТУЮ був ТВО ТІ Рко Рій Бек бе; Азов оБих Авр обу дек 245 5 58

Бйе вве Бреб Тух Зах Муз їжи ТвХх Уві вро муз ЗК Аху Тв 15 бум вк 2543 ат

Сіу Аза Таї Бпе Бех Суз бек Уа) Меї Ніз Біб діз їви Нів Авзб нія та Но 25

ТУК ТнЖ Біп був дех Пай беж Бей бек Вко Біжш 2за 235 «кій 28 «ії» Зі

Еф» РК є1ій» Нохкю азвіпе «а» 25

КНів бів біз сіу ТЕЖ Бре ТвЖ бек Авр Уві Зес Жат Тук Се 53 Фіу 1 5 15 15 сів дів йіа Був Бім Впж ї18 дів Тер ів Уві Був біу Ахо біу -к к зд й ко за

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Гібридний білок, що містить: а) агоніст рецепторів інсуліну, що має загальну формулу 21-22-2з, де ї) 21 являє собою аналог ланцюга В інсуліну, який містить амінокислотну послідовність: ХІХгХзОНІ СОа5НІ МЕАЇ Ха МСОЕНОЕХ5УХ ХХХ», де Х: являє собою КЕ, О або А; Х являє собою М або С; Хз являє собою М, К, О, с, О, А або Е; Хі являє собою Е, М, 0 або Н; Х5 являє собою Н або Е; Хв являє собою о, Т, 5, Н, М або є відсутнім; Х? являє собою с, Е, Р, К, р, 5, Н або є відсутнім; Хв являє собою Сб, Е,К, Р, ОО, 0, Н або є відсутнім; Хо являє собою 0, Т, 5, Е, К, А або є відсутнім, за умови, що аналог ланцюга В інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга В молекули людського інсуліну, у положенні Ха, Х5, Хв, Х7, Хв або Хо (послідовність ЗЕО ІО МО: 1); ї) 72 являє собою перший пептидний лінкер, що містить від 5 до 10 амінокислот, причому щонайменше 5 з цих амінокислот являють собою залишки 6; і ії) 2з являє собою аналог ланцюга А інсуліну, який містить амінокислотну послідовність: СІМЕОССТОХ:С5І ХгОЇ ЕМУСУХ»зХ»а, де Хі являє собою Т або І; Х2 являє собою 0, У, О або Е; Хз являє собою с, М, 5 або А; і Х4 являє собою будь-яку природну амінокислоту або є відсутнім, за умови, що, якщо Хз являє собою М, то Ха має бути амінокислотою, відмінною від С або М (послідовність 5ЕО ІЮ МО: 2); Б) другий пептидний лінкер, який має від 10 до 25 амінокислот, причому щонайменше 50 95 цих амінокислот є залишками 5; і с) Ес-ділянку людського до; де С-кінцевий залишок агоніста рецепторів інсуліну є безпосередньо злитим з М-кінцевим залишком другого пептидного лінкера і С-кінцевий залишок другого пептидного лінкера є безпосередньо злитим з М-кінцевим залишком Ес-ділянки до.

2. Гібридний білок за п. 1, який відрізняється тим, що: аналог ланцюга В інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною Ко) послідовністю ланцюга В людського інсуліну, у положеннях Ха або Хо послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1; ї аналог ланцюга А інсуліну містить щонайменше одну модифікацію, порівняно з амінокислотною послідовністю ланцюга А людського інсуліну, у положенні Хі або Хо послідовності зЕО ІЮ МО: 2.

3. Гібридний білок за будь-яким з п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що: аналог ланцюга В інсуліну містить послідовність 5ЕО ІЮО МО: 1, де Х: являє собою КЕ; Хо являє собою У; Хз являє собою М або 0; Ха являє собою Е; Хо являє собою Н; і аналог ланцюга А інсуліну містить послідовність зЗЕО ІЮ МО: 2, де Хі: являє собою І або Т; Х2 являє собою 0; Хз являє собою о; і Ха є відсутнім.

4. Гібридний білок за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що аналог ланцюга В інсуліну містить послідовність зЗЕО ІЮО МО: 1, де кожне з Хв-Хо являє собою о.

5. Гібридний білок за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що перший пептидний лінкер містить наступну амінокислотну послідовність: хахсаца, де Хі являє собою с або є відсутнім; і Х» являє собою с, 5 або є відсутнім (послідовність ЗЕО ІО МО: 3).

6. Гібридний білок за п. 5, який відрізняється тим, що Х: та Хо послідовності «ЗЕО ІЮ МО: З являють собою с та 5, відповідно.

7. Гібридний білок за будь-яким з пп. 1-6, який відрізняється тим, що агоніст рецепторів інсуліну має таку амінокислотну послідовність: ЕММОНІ Сав5зНІ МЕАІ ЕЇ УСаЕНОЕєНУСИСсСВсасваааааТмЕосСсСстеТоБІ РОЇ ЕМУСС (послідовність БЕО ІЮ МО: 5).

8. Гібридний білок за будь-яким з пп. 1-7, який відрізняється тим, що другий пептидний лінкер містить пептид, який має послідовність (О((Х|р, де Х являє собою 0, Е або 5; і де п становить 2-5.

9. Гібридний білок за будь-яким з пп. 1-8, який відрізняється тим, що другий пептидний лінкер містить таку амінокислотну послідовність: сасахаавахгаавсахзайосхХахХ»Хв, де Хі являє собою О або Е; Хо являє собою О або Е; Хз являє собою О або Е; Ха являє собою 0, Е, О або є відсутнім; Х5 являє собою с або є відсутнім; і Хв являє собою с або є відсутнім 60 (послідовність БЕО ІЮ МО: 6).

10. Гібридний білок за будь-яким з пп. 1-9, який відрізняється тим, що другий пептидний лінкер має таку амінокислотну послідовність: ссвовоссвосвовоссОососооо (послідовність хЕО ІЮ МО: 7).

11. Гібридний білок за будь-яким з пп. 1-10, де Ес-ділянка людського (9 являє собою Ес- ділянку ІДО1, Ідо2 або ІдС4.

12. Гібридний білок за будь-яким з пп. 1-11, який відрізняється тим, що Ес-ділянка людського дО містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 9 та 5ЕО ІО МО: 10.

13. Гібридний білок, який має амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 12.

14. Гомодимер двох гібридних білків за будь-яким з пп. 1-13. -о - з я | і Я М ше о ній ий З ї ! : ж т Тевя шт 1 Е за В нн о и й в-Я ШИ: й | кож ж х вх т ; : й ШИ «5 Ще : ЩІ рови иа Е 5 М | - і і Ди й ра 1 х і щ х і ЕД р ПИ 1 5 що ри жи Ж Я рю ; й Ед ! ооо ре ї І рЕя в - 7 т 7 ; й я 7 й ї ож Сех що ет ти т щ ши ЕС кв Я рай: і Б х г; Її ик | ка не, о а я зв Н ї дя секс Я ах М В У 8 55 155 157 ра РЕЯ 336 Чак Гсжстежснаї СЯ дрюкткх о анакаю я Свряклахя З Прньака 5 тункнац СЯ Врмехнх? соблівнкандВ СУ Крах б 7-3; Пісоютах З

ФІ. ЕТ мекі г В: ремені МО реко СЯ Деусев ; д, Н в ВахиВКх я НН к іксутняу ---ХОКиДКоЙ Кк ТЕ Мертих лем скяхана зу ати - ех К ; Р сНлеев комкхокение Коул го я уАкулік тя Есоцікакок, Н і х ГА и Віхк их Е Елокяиха г з Н сковннка що зевгюютч (у й і ім | що і ши ЕК і шт ши а

У. нд СК І ' ч ' нав і з Н Детей нет Гідра / 1 ЕКІрМаК змен ре ттральих Жіюка З Х ЯН Ж 0 мехаду | бев : Їх : м я ; З вспатютченкія і ; : т у 1 Вружяу я Бех ї 37, : Ф) 1 діхявив ВК є Лк: 5

Зк. РВбихехувкия Єфкок. химЯ недмічниютчься тех, Из Бюхмккамкоа кут ЗМІЇ дасть Ге дІдОМоУ Х Лото ХаЖМжи ДІМ. ВО Гкуманий Брак, ях відоемемтьев тя. яр Гсощілаций двуеюМм» ЦЗ хктить Ко-лемику з 3вох кожхеХ кукі.

С. имер яз оредиих КМ 5 Люкмер дних имя ФКНВІВ. ЖК ПОДІМНКТЬсВ УМ. ДІЮ Об КОУМІВММІМ ІМКУЛЕКУ ЕОХОХКВНОВАУ Я ДОМАЮДУК ую т Зими дкхх пимех приУмма Мощі яма ВИЦДМаМУєтнко пяю. У» ДКхХ мису ЗкжаНЯХ дююсру хх мо сМуиомеМ ФК ДИХ ик вадсЬ ЗЕКх поМмирнІуйннк І ДКУМИу МИМІХХМНІММ У ОВХ Кт ЗКУ.

ФГ.