ES2799099T3

ES2799099T3 - Proteínas de fusión

Info

Publication number: ES2799099T3
Application number: ES16721605T
Authority: ES
Inventors: David Bruce Baldwin; John Michael Beals; Jonathan Wesley Day; Craig Duane Dickinson; Andrew Ihor Korytko; Gregory Alan Lazar
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2015-05-07
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2020-12-14
Anticipated expiration: 2036-04-28
Also published as: LT3292141T; DOP2017000258A; CR20170469A; US11253574B2; CY1122929T1; MY183025A; CN107531806A; JP2018515088A; SI3292141T1; HRP20200503T1; PE20180507A1; CN107531806B; NZ736470A; US20200390865A1; BR112017020502A2; CA2981102A1; AR105616A1; US20220211818A1; TWI656132B; US9855318B2

Abstract

Una proteína de fusión que comprende: a) un agonista del receptor de insulina que tiene la fórmula general Z1-Z2-Z3, en la que: i) Z1 es un análogo de la cadena B de insulina, que comprende la secuencia de aminoácidos: X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9 en la que X1 es F, Q o A; X2 es V o G; X3 es N, K, D, G, Q, A o E; X4 es E, Y, Q o H; X5 es H o F; X6 es G, T, S, H, V o está ausente; X7 es G, E, P, K, D, S, H o está ausente; X8 es G, E, K, P, Q, D, H o está ausente; X9 es G, T, S, E, K, A o está ausente, a condición de que el análogo de la cadena B de insulina incluya al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X4, X5, X6, X7, X8, o X9 (SEQ ID NO: 1); ii) Z2 es un primer enlazador peptídico que comprende de 5 a 10 aminoácidos, en el que al menos de dichos aminoácidos son restos G; y iii) Z3 es un análogo de la cadena A de insulina que comprende la secuencia de aminoácidos: GIVEQCCTSX1CSLX2QLENYCX3X4 en la que X1 es T o I; X2 es D, Y, Q o E; X3 es G, N, S o A; y X4 es cualquier aminoácido natural, o está ausente, a condición de que si X3 es N, entonces X4 debe ser un aminoácido distinto de G o N (SEQ ID NO: 2); b) un segundo enlazador peptídico que tiene entre 10 y 25 aminoácidos, en el que al menos el 50 % de dichos aminoácidos son restos G; y c) una región Fc de IgG humana; en la que el resto C-terminal del agonista del receptor de insulina esta fusionado directamente con el resto Nterminal del segundo enlazador peptídico, y el resto C-terminal del segundo enlazador peptídico esta fusionado directamente con el resto N-terminal de la región Fc de IgG humana.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión

La presente invención se refiere a proteínas de fusión para uso en el tratamiento de la diabetes. Más particularmente, la invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden un agonista del receptor de insulina fusionado a una región Fc de IgG humana con un enlazador peptídico, y al uso de tales proteínas en el tratamiento de la diabetes. Las proteínas de fusión de la presente invención tienen un perfil de acción de tiempo extendido y son útiles para proporcionar un control de glucosa basal prolongado y la supresión de la producción de glucosa hepática. La diabetes mellitus es un trastorno crónico caracterizado por hiperglucemia resultante de defectos en la secreción de insulina, acción de la insulina, o ambos. La diabetes mellitus tipo 1 se caracteriza por una capacidad secretora de insulina escasa o nula, y los pacientes con diabetes mellitus tipo 1 requieren insulina para sobrevivir. La diabetes mellitus tipo 2 se caracteriza por niveles elevados de glucosa en sangre como resultado de la secreción de insulina alterada, resistencia a la insulina, producción excesiva de glucosa hepática y/o contribuciones de todo lo anterior. En al menos un tercio de los pacientes con diabetes mellitus tipo 2, la enfermedad avanza hasta un requisito absoluto para la terapia con insulina.

Para alcanzar la glucemia normal, se desea que la terapia de reemplazo de insulina sea paralela, lo más estrechamente posible, al patrón de secreción de insulina endógena en individuos normales. La demanda fisiológica diaria de insulina fluctúa y se puede separar en dos fases: (a) la fase del momento de la comida que requiere un pulso (bolo) de insulina para eliminar el aumento de glucosa en sangre relacionado con las comidas, y (b) la fase entre comidas que requiere una cantidad sostenida (basal) de insulina para regular la producción de glucosa hepática para mantener una glucosa sanguínea en ayunas óptima.

Debido a que los pacientes con diabetes tipo 1 producen poca o ninguna insulina, la terapia de insulina efectiva para los diabéticos tipo 1 generalmente implica el uso de dos tipos de insulina administrada de manera exógena: una insulina de acción rápida, en el momento de las comidas, proporcionada por inyecciones en bolo, y una insulina basal, de acción prolongada, administrada una o dos veces al día para controlar los niveles de glucosa en sangre entre comidas. El tratamiento de pacientes con diabetes tipo 2 generalmente comienza con la pérdida de peso prescrita, el ejercicio y una dieta para diabéticos, pero cuando estas medidas no controlan los niveles elevados de azúcar en la sangre, pueden ser necesarios medicamentos orales y la terapia basada en incretina, tal como la administración de agonistas del receptor del péptido-1 similar al glucagón (GLP-1) y/o inhibidores de la dipeptidil peptidasa 4 (DPP-4) que pueden aumentar los niveles de incretina. Cuando estos medicamentos aun son insuficientes, se considera el tratamiento con insulina. Los pacientes con diabetes tipo 2 cuya enfermedad ha progresado hasta el punto de que se requiere terapia con insulina generalmente comienzan con una inyección diaria única de insulina basal de acción prolongada, aunque pueden incluirse algunas inyecciones de insulina de acción rápida, según sea necesario, en algunos casos.

Varios tipos de insulinas basales están disponibles actualmente. La insulina glargina, vendida bajo el nombre comercial LANTUS®, comprende una estructura de insulina modificada en la cual la asparagina en la posición 21 en la cadena A de la insulina se reemplaza con glicina, y se agregan dos argininas al extremo C de la cadena B. La insulina detemir, vendida bajo el nombre comercial LEVEMIR®, comprende una estructura de insulina modificada en la que se ha eliminado la treonina en la posición 30 de la cadena B y la lisina en la posición 29 de la cadena B se ha derivado a través del enlace covalente de un, ácido graso miristoilo de 14 carbonos al grupo £-amina de lisina en B29. La insulina degludec, disponible en Europa y Japón con el nombre comercial TRESIBA®, comprende una estructura de insulina modificada en la que se ha eliminado la treonina en la posición 30 de la cadena B, y el grupo £-amino de la lisina en la posición 29 de la cadena B se derivada covalentemente con ácido hexadecanodioico a través de un enlazador de ácido Y-L-glutámico. Todas estas insulinas están indicadas para la administración una vez al día.

Los regímenes de tratamiento que implican inyecciones diarias de terapias de insulina existentes pueden ser complicados y dolorosos de administrar y pueden provocar efectos secundarios no deseados, tales como hipoglucemia y aumento de peso. Por lo tanto, muchos pacientes diabéticos no quieren o no pueden cumplir, o son incapaces de cumplir, con la terapia de insulina necesaria para mantener un control estricto de los niveles de glucosa en sangre. El control glucémico deficiente aumenta el riesgo de un paciente de desarrollar complicaciones graves relacionadas con la diabetes, que incluyen enfermedades cardíacas, derrames cerebrales, daño a los nervios, amputación de miembros inferiores, pérdida de visión y enfermedad renal. Se están realizando investigaciones para identificar productos de insulina con mayor duración de acción; por lo tanto, requerirán menos inyecciones que los productos de insulina disponibles actualmente para mejorar la aceptación y el cumplimiento. El documento CN103509118 describe proteínas con una cadena B de insulina humana y una cadena A de insulina humana unidas por una secuencia de conexión a péptido C de 4 a 50 aminoácidos, y con la cadena A de insulina unida directamente, sin un enlazador adicional, a un fragmento Fc de inmunoglobulina, y afirma que las pruebas en ratones muestran que dichas proteínas tienen una vida media in vivo de hasta 3 días. El documento KR101324828 describe análogos de proinsulina unidos a regiones Fc de inmunoglobulina mediante el uso de enlazadores no peptidilo, y afirma que tales proteínas proporcionan una vida media en suero incrementada sobre las terapias existentes. La publicación afirma que los enlazadores no peptidilo representan una mejora con respecto a los enlazadores peptídicos, afirmando que las proteínas de fusión que usan enlazadores peptídicos no pueden aumentar la vida media de un medicamento activo en la sangre porque los enlazadores peptídicos son seccionados fácilmente por las enzimas en el cuerpo.

A pesar de las revelaciones anteriores, y/o en cualquier otra publicación, los presentes inventores superaron múltiples obstáculos para descubrir proteínas de fusión que comprenden agonistas del receptor de insulina, enlazadores de péptidos y regiones IgG Fc humanas que satisfacen la necesidad continua de un producto reductor de glucosa con una mayor duración de la acción, suficiente para una dosificación menos frecuente que los productos de insulina disponibles actualmente, incluida la dosificación con poca frecuencia como una vez por semana. Por ejemplo, para lograr el perfil de acción de tiempo prolongado deseado, fue necesario diseñar proteínas de fusión con potencia atenuada para evitar el aclaramiento mediado por el receptor rápido, una ruta principal de aclaramiento de insulina, pero que todavía tiene potencia suficiente para proporcionar suficiente reducción de glucosa. Además, para minimizar la eliminación renal, la otra ruta principal del aclaramiento de insulina, y regular la exposición periférica a través de la difusión paracelular hidrodinámica de tamaño limitado, las proteínas de fusión tuvieron que ser diseñadas para que fueran lo suficientemente grandes y que no tuvieran el agonista del receptor de insulina escindido proteolíticamente de la región Fc de IgG humana después de administrarse, ya que dicha escisión daría como resultado un aclaramiento renal más rápido de lo deseado del agonista del receptor de insulina incluso si la región Fc de IgG humana permaneciera en circulación. Además, los dominios IgG Fc han evolucionado para autoasociarse para formar dímeros estables, y cuando dicho dímero se forma a partir de dos proteínas de fusión, cada una de las cuales comprende una unidad estructural de insulina fusionada con una región IgG Fc, las dos unidades estructurales de insulina se acercan entre sí, permitiendo la autoasociación, o dimerización, de las unidades estructurales de insulina, mediada a través de las regiones de autoasociación de la cadena B de la insulina. Tales dímeros de insulina están inactivos, por lo que las proteínas de fusión con autoasociación reducida de las unidades estructurales agonistas del receptor de insulina tuvieron que ser modificadas genéticamente. Se superaron múltiples desafíos adicionales para crear una proteína de fusión adecuada para la fabricación y formulación comercial como terapéutica. La presente invención proporciona proteínas de fusión que tienen una duración de acción prolongada en comparación con los tratamientos de insulina existentes, lo que permite inyecciones menos frecuentes que los productos de insulina existentes, incluso hasta una vez por semana, reduciendo así la complejidad y el dolor asociados con los regímenes de tratamiento existentes que implican inyecciones más frecuentes. Las proteínas de fusión de la presente invención tienen un perfil farmacocinético plano y una exposición periférica restringida, lo que da como resultado una baja variabilidad diaria y una incidencia mínima de hipoglucemia, incluso cuando se proporciona en combinación con un medicamento adicional para la diabetes, como una terapia basada en incretina. Las proteínas de fusión de la presente invención también pueden proporcionar una duración de acción prolongada sin causar aumento de peso.

La presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende:

a) un agonista del receptor de insulina que tiene la fórmula general Z¹-Z²-Z³, en la que

i) Z¹es un análogo de la cadena B de insulina, que comprende la secuencia de aminoácidos: X¹X²X³QHLCGSHLVEALX⁴LVCGERGFX⁵YX⁶X⁷X⁸X⁹

en la que X¹es F, Q o A; X²es V o G; X³es N, K, D, G, Q, A o E; X⁴es E, Y, Q o H; X⁵es H o F; X⁶es G, T, S, H, V o está ausente; X⁷es G, E, P, K, D, S, H o está ausente; X⁸es G, E, K, P, Q, D, H o está ausente; X⁹es G, T, S, E, K, A o está ausente, a condición de que el análogo de la cadena B de insulina incluya al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸o X⁹(SEQ ID NO: 1);

ii) Z²es un primer enlazador peptídico que comprende de 5 a 10 aminoácidos, en el que al menos 5 de dichos aminoácidos son restos G; y

iii) Z³es un análogo de la cadena A de insulina que comprende la secuencia de aminoácidos: GIVEQCCTSX¹CSLX²QLENYCX³X⁴

X¹es T o I; X²es D, Y, Q o E; X³es G, N, S o A; y X⁴es cualquier aminoácido natural, o está ausente, a condición de que si X³es N, entonces X⁴debe ser un aminoácido distinto de G o N (SEQ ID NO: 2);

a) un segundo enlazador peptídico que tiene entre 10 y 25 aminoácidos, en el que al menos el 50 % de dichos aminoácidos son restos G; y

b) una región Fc de IgG humana;

en la que el resto C-terminal del agonista del receptor de insulina se fusiona directamente con el resto N-terminal del segundo enlazador peptídico, y el resto C-terminal del segundo enlazador peptídico se fusiona directamente con el resto N-terminal de la región IgG Fc.

La presente invención también proporciona una proteína de fusión que consiste en:

i) Z¹es un análogo de la cadena B de insulina, que tiene la secuencia de aminoácidos:

X¹X²X³QHLCGSHLVEALX⁴LVCGERGFX⁵YX⁶X⁷X⁸X⁹

en la que X¹es F, Q o A; X²es V o G; X³es N, K, D, G, Q, A o E; X⁴es E, Y, Q o H;

X⁵es H o F; X⁶es G, T, S, H, V o está ausente; X⁷es G, E, P, K, D, S, H o está ausente; X⁸es G, E, K, P, Q, D, H o está ausente; X⁹es G, T, S, E, K, A o está ausente, a condición de que el análogo de la cadena B de insulina incluya al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸o X⁹(SEQ ID NO: 1);

iii) Z³es un análogo de la cadena A de insulina que tiene la secuencia de aminoácidos: GIVEQCCTSX¹CSLX²QLENYCX³X⁴

b) un segundo enlazador peptídico que tiene entre 10 y 25 aminoácidos, en el que al menos el 50 % de dichos aminoácidos son restos G; y

c) una región Fc de IgG humana;

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de la presente invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona una proteína de fusión de la presente invención para usar en el tratamiento de diabetes mellitus, obesidad, dislipidemia o síndrome metabólico. La presente invención también proporciona una proteína de fusión de la presente invención para su uso en el tratamiento o prevención de una afección relacionada con la diabetes seleccionada del grupo que consiste en enfermedad cardíaca, accidente cerebrovascular, nefropatía, retinopatía y enfermedad renal.

La invención también proporciona una proteína de fusión de la presente invención para uso en terapia.

La presente invención también proporciona el uso de una proteína de fusión de la presente invención en la fabricación de un medicamento.

La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de la presente invención.

En el presente documento también se proporciona un proceso para producir una proteína de fusión de la presente invención, dicho proceso comprende los pasos de:

1. cultivar una célula huésped de mamífero que comprende un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de la presente invención en condiciones tales que se exprese dicha proteína de fusión; y

2. recuperar de dicha célula huésped una proteína de fusión;

También se proporciona en el presente documento una proteína de fusión producida por el proceso descrito anteriormente.

Figura 1. La Figura 1 proporciona datos farmacodinámicos para proteínas de fusión de ejemplo de la presente invención en un modelo de diabetes de rata tratada con estreptozotocina (STZ).

Figura 2. La Figura 2 proporciona un diagrama esquemático de configuraciones de proteínas descritas en este documento. Cabe señalar que las formas particulares (por ejemplo, óvalos, semicírculos, etc.) utilizadas en los diagramas de la Figura 2 no están destinadas a describir o caracterizar, y no deben utilizarse para interpretar el significado o la estructura de los componentes individuales de las proteínas de fusión de la presente invención.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁴o X⁵de SEQ ID NO: 1, y al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁶, X⁷, X⁸o X^gde la SEQ ID NO: 1.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye al menos dos modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁶, X⁷, X^ao X^gde la SEQ ID NO: 1.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁶, X⁷, X^ay X^gde la SEQ ID NO: 1.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en la que X⁶-X^gson cada uno G.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁴y X⁵de SEQ ID NO: 1.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, en la que: X¹es F; X²es V; X³es N o D; X⁴es E; X⁵es H.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye la modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en cada una de las posiciones X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X^ay X^gde la SEQ ID NO: 1.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, en la que: X¹es F; X²es V; X³es N o D; X⁴es E; X⁵es H; y X⁶-X^gson cada uno G.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena A de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana en X¹o X²de la SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena A de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana tanto en X¹como en X²de SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena A de insulina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, en la que: X¹es I o T; X²es D; X³es G; y X⁴está ausente.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena A de insulina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, en la que X³es N y en la que X⁴es un aminoácido distinto de G, N, S, V L o P.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁴o X⁵de SEQ ID NO: 1, y al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁶, X⁷, X^ao X^gde SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana en X¹o X²de la SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye al menos dos modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁶, X⁷, X^ao X^gde SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana en X¹o X²de la ^sE^qID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁶, X⁷, X^ay X^gde la SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana en X¹o X²de la s Eq ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en la que X⁶-X^gson cada uno G; y el análogo de la cadena A de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana en X¹o X²de la SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁴y X⁵de SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana en X¹o X²de la SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, en la que: X ⁱes F; X²es V; X³es N o D; X⁴es E; X⁵es H; y el análogo de la cadena A de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana en X¹o X²de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye la modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en cada una de las posiciones X⁴, X⁸, X⁶, X⁷, X^ay X^gde la SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana en X ⁱo X²de la SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, en la que: X ⁱes F; X²es V; X³es N o D; X⁴es E; X⁵es H; y X⁶-X^gson cada uno G; y el análogo de la cadena A de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana en X ⁱo X²de la SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁴o X⁵de SEQ ID NO: 1, y al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁶, X⁷, X^ao X^gde SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana tanto en X¹como en X²de SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye al menos dos modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁶, X⁷, X^ao X^gde la SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana tanto en X¹como en X²de SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁶, X⁷, X^ay X^gde la SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana tanto en X¹como en X²de SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en la que X⁶-X^gson cada uno G; y el análogo de la cadena A de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana tanto en X¹como en X²de SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁴y X⁵de SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana tanto en X¹como en X²de S^eQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, en la que: X¹es F; X²es V; X³es N o D; X⁴es E; X⁵es H; y el análogo de la cadena A de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana tanto en X¹como en X²de SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye la modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en cada una de las posiciones X⁴, X⁵, X^a, X⁷, X^ay X^gde la SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana tanto en X¹como en X²de SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, en la que: X¹es F; X²es V; X³es N o D; X⁴es E; X⁵es H; y X⁶-X^gson cada uno G; y el análogo de la cadena A de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana tanto en X¹como en X²de SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁴o X⁵de SEQ ID NO: 1, y al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X^a, X⁷, X^ao X^gde SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, en la que: X¹es I o T; X²es D; X³es G; y X⁴está ausente.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye al menos dos modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X^a, X⁷, X^ao X^gde SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, en la que: X¹es I o T; X2 es D; X³es G; y X⁴está ausente.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X^a, X⁷, X^ay X^gde la SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, en la que: X¹es I o T; X²es D; X³es G; y X⁴está ausente.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en la que X⁶-X⁹son cada uno G; y el análogo de la cadena A de insulina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2 en la que: X¹es I o T; X²es D; X³es G; y X⁴está ausente.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁴y X⁵de SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, en la que: X¹es I o T; X2 es D; X³es G; y X⁴está ausente.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, en la que: X¹es F; X²es V; X³es N o D; X⁴es E; X⁵es H; y el análogo de la cadena A de insulina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, en la que: X¹es I o T; X²es D; X³es G; y X⁴está ausente.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina incluye la modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en cada una de las posiciones X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸y X⁹de la SEQ ID NO: 1; y el análogo de la cadena A de insulina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, en la que: X¹es I o T; X²es D; X³es G; y X⁴está ausente.

En ciertas realizaciones, el análogo de la cadena B de insulina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, en la que: X¹es F; X²es V; X³es N o D; X⁴es E; X⁵es H; y X⁶-X⁹son cada uno G; y el análogo de la cadena A de insulina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, en la que: X¹es I o T; X²es D; X³es G; y X⁴está ausente.

En ciertas realizaciones, el primer enlazador peptídico (Z²) comprende la secuencia de aminoácidos: X¹GX²GGGG, en la que X¹es G o está ausente; y X²es G, S o está ausente (SEQ ID NO: 3).

En ciertas realizaciones, el agonista del receptor de insulina, es decir, Z¹-Z²-Z³en la proteína de fusión descrita anteriormente, comprende la secuencia de aminoácidos:

X¹X²X³QHLCGSHLVEALX⁴LVCGERGFX⁵YX⁶X⁷X⁸X⁹X¹⁰GX¹¹GGGGGIVEQCCTSX¹²CSLX¹³QLENYCX¹⁴X¹⁵en la que X¹es F, Q o A; X²es V o G; X³es N, K, D, G, Q, A o E; X⁴es E, Y, Q o H; X⁵es H o F; X^aes G, T, S, H, V o está ausente; X⁷es G, E, P, K, D, S, H o está ausente; X⁸es G, E, K, P, Q, D, H o está ausente; X⁹es G, T, S, E, K, A o está ausente; X¹⁰es G o está ausente; X¹¹es G, S o está ausente; X¹²es T o I; X¹³es D, Y, Q o E; X¹⁴es G, N, S o A; y X¹⁵es cualquier aminoácido natural, o está ausente, a condición de que al menos uno de X⁴, X⁵, X^a, X⁷, X⁸o X⁹deba ser un aminoácido diferente al encontrado, respectivamente, en la posición B¹⁶, B²⁵, B²⁷, B²⁸, B²⁹o B³⁰de la cadena B de una molécula de insulina humana, y además a condición de que si X¹⁴sea N, entonces X¹⁵debe ser un aminoácido distinto de G o N (SEQ ID NO: 4).

En ciertas realizaciones preferidas, el agonista del receptor de insulina, es decir, Z¹-Z²-Z³en la proteína de fusión descrita anteriormente tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCG (SEQ ID NO: 5).

En las proteínas de fusión de la presente invención, el segundo enlazador peptídico es un péptido que tiene entre 10 y 25 aminoácidos, en el que al menos el 50 % de dichos aminoácidos son restos G. En ciertas realizaciones, el segundo enlazador peptídico es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos [GGGGX]ⁿ, en la que X es Q, E o S; y en la que ⁿes 2-5. En ciertas realizaciones, el segundo enlazador peptídico comprende la secuencia de aminoácidos: GGGGX¹GGGGX²GGGGX³GGGGX⁴X⁵X⁶

en la que X¹es Q o E; X²es Q o E; X³es Q o E; X⁴es G, E, Q o está ausente; X⁵es G o está ausente; y X⁶es G o está ausente (SEQ ID NO: 6).

En ciertas realizaciones preferidas, el segundo enlazador peptídico tiene la secuencia de aminoácidos:

GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO: 7).

En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG humana comprende fragmentos de una cadena pesada de un anticuerpo IgG. Un diagrama esquemático de una proteína de fusión que comprende dicha región IgG se proporciona en el diagrama (A) en la Figura 2. En otras realizaciones, la región Fc de IgG humana comprende fragmentos de dos cadenas pesadas de un anticuerpo IgG. Un diagrama esquemático de una proteína de fusión que comprende dicha región IgG se proporciona en el diagrama (B) en la Figura 2.

En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG humana es una región Fc de un anticuerpo IgG1, IgG2 o IgG4.

En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG humana es una región Fc de un anticuerpo IgG1 que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

CPPCPAPELLGGPS'VXi LX2PFKPKDTLMISRTPEVTCX3VX4DVSHEDPE'VKFNWY

VDGVEVHNAKTKPREEQYX5 STYR W S V L T V L H Q D WLNGKE YKCKV SNKALPA

PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNrQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ

PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKJLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGXe

en la que Xi es F, Q o E; X2 es F, Q o E; X3 es V o T; X4 es V o T; X5 es N, D o Q; y X6 es K o está ausente. (SEQ ID NO: 8)

En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y además comprende algunos o todos los aminoácidos que se encontrarían en una secuencia Fc de IgG1 de tipo salvaje en el lado N-terminal del resto C en la posición 1 en SEQ ID NO: 8.

Preferentemente, la región Fc de IgG humana es de un anticuerpo IgG2 o IgG4.

En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG humana es una región Fc de un anticuerpo IgG4 que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

PC PPC PA PEA A G G PSV X lL X 2PPK PK D T LM ISR T PEV T C X 3V X 4D V SQ ED PEV Q FN W

Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F X 5 S T Y R W S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P

SSIEK TISK A K G Q PR EPQ V Y TLPPSQ EEM TK N Q V SLTC LV K G FY PSD IA V EW ESN G

q p e n n y k t t p p v l d s d g s f f l y s x 6l t v d k s r w q e g n v f s c s v m h e a l h n h y t q

K S L S L S L G X 7

en la que X1 es F, Q o E; X2 F, Q o E; X3 es V o T; X4 es V o T; X5 es N, D o Q; X6 es R o K; X7 es K o está ausente. (SEQ ID NO: 9)

En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y además comprende algunos o todos los aminoácidos que se encontrarían en una secuencia Fc de IgG4 de tipo salvaje en el lado N-terminal del resto C en la posición 1 en SEQ ID NO: 9. En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, en la que X1 es F; X2 es F; X3 es V; X4 es V; X5 es N; X6 es R; y X7 está ausente.

En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG humana es una región Fc de un anticuerpo IgG2 que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

E C P F C P A P P V A G F S V X ';L X 2F P K P K D T L M IS R T P E V T C X 3 V X 4 D V S H E D P E V Q F N W Y

W G V E V H N A K T K P R E E Q F X s S T P R W S V L T V V H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P A

P IE K 'r iS K T K G Q P E E ;P Q V Y T Í .P P S R E E M T K N Q V S l .'T '0.,V K G F Y P S D IA V E W E S N G Q

F E N N Y K 'IT P P M L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G M V F S C S V M H E A L JiN H Y T Q K

S L S L S P G X s

en la que X1 es F, Q o E; X2 es F, Q o E; X3 es V o T; X4 es V o T; X5 es N, D o Q; y X6 es K o está ausente. (SEQ ID NO: 10)

En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y además comprende algunos o todos los aminoácidos que se encontrarían en una secuencia Fc de IgG2 de tipo salvaje en el lado N-terminal del resto E en la posición 1 en SEQ ID NO: 10. En ciertas realizaciones, la región Fc de IgG humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, en la que X1 es F; X2 es F; X3 es V; X4 es V; X5 es N; y X6 está ausente.

En ciertas realizaciones, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos:

X1X2X 3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5Y X 6X7X 8X 9X 10GXHGGGGGIVEQCCTSX12CSL X13QLENYCX14X 15GGGGX16GGGGX17GGGGX18GGGGX19X 20X21X 22CPPCPAPX23X24AGX

25P S VFLFPPKPKD TLM IS R TP EVTC VW D VSX 26EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE

QFNSTX27R W SV LT V X 28HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPX29X30IE K T IS K X 31KGQPREPQ

V Y T LPPSX 32EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPX33LDSDGSF FLYSX34LTVDKSRWQX35GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSX36G

en la que X¹es F, Q o A; X²es V o G; X³es N, K, D, G, Q, A o E; X⁴es E, Y, Q o H; X⁵es H o F; X^aes G, T, S, H, V o está ausente; X⁷es G, E, P, K, D, S, H o está ausente; X⁸es G, E, K, P, Q, D, H o está ausente; X^ges G, T, S, E,

K, A o está ausente, a condición de que al menos uno de X⁴, X⁵, X^a, X⁷, X⁸o X^gsea un aminoácido distinto del que está presente, respectivamente, en la posición B^{i a}, B²⁵, B²⁷, B²⁸, B²⁹o B³⁰de una cadena B de insulina humana; X¹⁰es G o está ausente; X¹¹es G, S o está ausente; X¹²es T o I; X¹³es D, Y, Q o E; X¹⁴es G, N, S o A; X¹⁵es cualquier aminoácido natural, o está ausente, a condición de que si X¹⁴es N, entonces X¹⁵debe ser un aminoácido distinto de

G o N; X^1aes Q o E; X¹⁷es Q o E; X¹⁸es Q o E; X^1ges G, E, Q o está ausente; X²⁰es G o está ausente; X²¹es G o está ausente; X²²es E o P; X²³es E o P; X²⁴es A o V; X²⁵es G o está ausente; X^2aes Q o H; X²⁷es Y o F; X²⁸es L o V; X²⁹es S o A; X³⁰es S o P; X³¹es A o T; X³²es Q o R; X³³es V o M; X³⁴es R o K; X³⁵(SEQ ID NO: 11).

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una proteína de fusión seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ

ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24.

En una realización preferida, la proteína de fusión tiene la secuencia de aminoácidos:

10 20 30 40 50 50 FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGG

70 80 90 100 110 12 0 GGQGGGGQGGGGQGGGGGECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS

130 1 40 150 1 60 170 18 0

WLNGKEYKCKVSNKG

230 240

F YPSDIAVEWE SNGQP

250 2 60 270 280 290

ENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(SEQ ID N O : 12 ) .

En ciertas realizaciones, las proteínas de fusión de la presente invención están presentes en forma de un dímero. Se proporciona un diagrama esquemático de dicho dímero en el diagrama (C) en la Figura 2. En ciertas realizaciones, el dímero es un homodímero, en el que las secuencias de aminoácidos de las dos proteínas de fusión que hacen el dímero son las mismas. En ciertas realizaciones, el dímero es un heterodímero, en el que las secuencias de aminoácidos de las dos proteínas de fusión que forman el dímero son diferentes.

En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica de la presente invención comprende una proteína de fusión de la presente invención, un agente tamponador, un tensioactivo y un agente de isotonicidad. En ciertas realizaciones, el agente tamponador es ácido cítrico y/o citrato, el tensioactivo es polisorbato 80 y el agente de isotonicidad es manitol. En ciertas realizaciones, el pH de la composición varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,0. En ciertas realizaciones, el pH varía de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,4. En ciertas realizaciones, el pH varía de aproximadamente 6,0 a 6,75.

En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un ingrediente activo adicional. En ciertas realizaciones, el ingrediente activo adicional es una terapia basada en incretina. En ciertas realizaciones preferidas, la terapia basada en incretina es un agonista de GLP-1R. Preferiblemente, el agonista de GLP-1R es dulaglutida.

En ciertas realizaciones, el uso terapéutico de la presente invención comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión una vez al día. En realizaciones preferidas, se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión una vez por semana. En ciertas realizaciones, una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión se administra una vez al mes. En ciertas realizaciones, la

g

presente invención proporciona una proteína de fusión de la presente invención para usar en el tratamiento de la diabetes mellitus mientras se reduce el riesgo de hipoglucemia y/o aumento de peso.

La presente invención también proporciona una proteína de fusión de la presente invención para uso en el tratamiento de diabetes mellitus, obesidad, dislipidemia y/o síndrome metabólico en combinación con un ingrediente activo adicional. La proteína de fusión y el ingrediente activo adicional en tales realizaciones pueden administrarse simultáneamente, secuencialmente o en una sola formulación combinada. En ciertas realizaciones, el ingrediente activo adicional es una terapia basada en incretina. En ciertas realizaciones preferidas, la terapia basada en incretina es un agonista de GLP-1R. Preferiblemente, el agonista de GLP-1R es dulaglutida. En ciertas realizaciones, la combinación se administra una vez al día. En ciertas realizaciones preferidas, la combinación se administra una vez por semana. En ciertas realizaciones, la combinación se administra una vez al mes.

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una proteína de fusión de la presente invención para uso en el tratamiento de diabetes mellitus, obesidad, dislipidemia o síndrome metabólico. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una proteína de fusión de la presente invención para usar en el tratamiento o prevención de una afección relacionada con la diabetes seleccionada del grupo que consiste en enfermedad cardíaca, accidente cerebrovascular, nefropatía, retinopatía y enfermedad renal. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una proteína de fusión de la presente invención para usar en el tratamiento de un paciente con diabetes mellitus mientras reduce el riesgo de hipoglucemia y/o aumento de peso, que comprende administrar al paciente una proteína de fusión de la presente invención. En ciertas realizaciones, la proteína de fusión de la presente invención se proporciona para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con otro ingrediente activo. En ciertas realizaciones, el ingrediente activo adicional es una terapia basada en incretina. En ciertas realizaciones preferidas, la terapia basada en incretina es un agonista de GLP-1R.

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona el uso de una proteína de fusión de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de diabetes mellitus, obesidad, dislipidemia o síndrome metabólico. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona el uso de una proteína de fusión de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una afección relacionada con diabetes seleccionada del grupo que consiste en enfermedad cardíaca, accidente cerebrovascular, nefropatía, retinopatía, y enfermedad renal. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona el uso de una proteína de fusión de la presente invención en la fabricación de un medicamento para tratar la diabetes mellitus mientras se reduce el riesgo de hipoglucemia y/o aumento de peso, que comprende administrar al paciente una proteína de fusión del presente invención. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona el uso de una proteína de fusión de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de diabetes mellitus, obesidad, dislipidemia o síndrome metabólico, en el que el medicamento debe administrarse simultáneamente, por separado o secuencialmente en combinación con otro ingrediente activo.

Cuando se usa en el presente documento, el término "agonista del receptor de insulina" se refiere a una proteína que se une a y activa el receptor de insulina, lo que da como resultado una disminución de los niveles de glucosa en sangre y/o la supresión de la producción de glucosa hepática, características que pueden analizarse y medirse utilizando técnicas conocidas, como las que se muestran en los estudios que se describen a continuación.

La porción agonista del receptor de insulina de las proteínas de fusión de la presente invención incluye un análogo de una cadena B de insulina y un análogo de una cadena A de insulina. Cuando se usan en el presente documento, los términos "cadena A de insulina" y "cadena B de insulina" se refieren a las cadenas A y B de la molécula de insulina humana (CAS No. 11061-68-0), cuyas secuencias nativas de tipo salvaje son bien conocidas. La cadena A de insulina humana consta de 21 aminoácidos, denominados en la técnica A¹-A²¹, que tienen la siguiente secuencia: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 13).

La cadena B de insulina humana consta de 30 aminoácidos, denominados en la técnica B¹-B³⁰, que tienen la siguiente secuencia:

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 14).

En una molécula de insulina humana, las cadenas A y B están unidas por dos enlaces disulfuro, CysA7-CysB7 y CysA20-CysB19. La cadena Atiene un enlace disulfuro intracadena en CysA6-CysA11.

Para lograr el perfil de acción de tiempo extendido deseado, el agonista del receptor de insulina de la proteína de fusión de la presente invención debe permanecer en circulación y ser capaz de interactuar con el receptor de insulina, durante un período de tiempo prolongado. Para que las proteínas de fusión de la presente invención permanezcan en circulación durante el período de tiempo deseado, se debe atenuar la eliminación de las proteínas de fusión. Las dos rutas principales de eliminación de insulina son el aclaramiento renal y el aclaramiento mediado por el receptor de insulina. Véase Iglesias P, et al. Diabetes Obes. Metab. 2008; 10: 811-823. Para minimizar la eliminación renal, se necesita una molécula con un tamaño hidrodinámico de al menos aproximadamente el tamaño de la albúmina sérica humana, y dicho tamaño hidrodinámico se proporciona en las proteínas de fusión de la presente invención por la región Fc de IgG humana. En cuanto al aclaramiento mediado por el receptor, la proteína de fusión no puede ser tan potente en el receptor de insulina que dé como resultado un aclaramiento mediado por el receptor más rápido de lo deseado, pero la proteína de fusión debe ser lo suficientemente potente, sin embargo, para proporcionar suficiente control de glucosa a dosis que son comercialmente factibles Por lo tanto, la potencia de la proteína de fusión debe ser cuidadosamente equilibrada, y la estructura de la proteína de fusión de la presente invención le permite lograr dicho equilibrio.

Las moléculas de insulina tienden a autoasociarse en dímeros y hexámeros. Se han propuesto numerosas funciones para las tendencias de autoasociación conservadas evolutivamente de la insulina, que incluyen: (1) estabilización química y térmica de la molécula durante el almacenamiento intracelular de la vacuola; (2) protección de la insulina monomérica contra la fibrilación in vivo; (3) sustitución de estabilización asistida por chaperona y plegamiento durante la expresión intracelular; y/o (4) esenciales para el tráfico secreto. La forma activa de insulina, sin embargo, es el monómero.

La tendencia de las moléculas de insulina a autoasociarse, y la inactividad de tales moléculas autoasociadas, es relevante para la presente invención, porque las regiones Fc de IgG humana también tienden a autoasociarse para formar dímeros, típicamente asociados covalentemente a través de disulfuro se unen en la región de la bisagra, y dichos dímeros se forman a partir de las regiones Fc de IgG humana en las proteínas de fusión de la presente invención. Como resultado de la dimerización de las regiones Fc de IgG humana, los dos "brazos" agonistas del receptor de insulina están muy cerca uno del otro, y por lo tanto existen a una concentración local relativamente alta. En el caso de la insulina humana, dicha proximidad tendería a favorecer la autoasociación o dimerización de las unidades estructurales de insulina, afectando la actividad de las moléculas. En el diagrama (D) de la Figura 2 se proporciona un diagrama esquemático de un dímero de proteína de fusión Fc con brazos de unidad estructural de insulina que se han autoasociado o dimerizado. La tendencia de las moléculas de insulina a autoasociarse también podría conducir a la autoasociación, o dimerización, de unidades estructurales de insulina de más de un dímero de proteína de fusión Fc; en el diagrama (E) de la Figura 2 se proporciona un diagrama esquemático de un dímero de dos dímeros de proteína de fusión Fc con unidades estructurales de insulina autoasociadas o dimerizadas. Además, las unidades estructurales de insulina en más de dos dímeros de proteína de fusión Fc también podrían autoasociarse de tal manera para formar, por ejemplo, un trímero compuesto por tres dímeros, o incluso agregados de orden superior compuestos por más de tres dímeros.

La porción agonista del receptor de insulina de la proteína de fusión de la presente invención, sin embargo, tiene una tendencia reducida a autoasociarse o dimerizarse, y por lo tanto los dímeros de proteínas de fusión compuestos por proteínas de fusión de la presente invención tienden a favorecer la estructura representada en diagrama (C) de la figura 2, en oposición a las estructuras representadas en los diagramas (D) y (E) de la figura 2. Por lo tanto, mientras la presente invención proporciona un dímero de dos proteínas de fusión, el "brazo" agonista del receptor de insulina de cada proteína de fusión en el dímero mantiene un estado predominantemente monomérico, como se representa, por ejemplo, en el diagrama (C) de la Figura 1, y por lo tanto es más capaz de interactuar con el receptor de insulina.

En las proteínas de fusión de la presente invención, el análogo de la cadena B de insulina en el agonista del receptor de insulina incluye una o más modificaciones a la secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana. En particular, para reducir la propensión de las porciones agonistas del receptor de insulina a autoasociarse o dimerizarse, el análogo de la cadena B de la insulina incluye una o más modificaciones de la cadena B de una molécula de insulina humana en las posiciones B-^ia, B²⁵o B^27-30, que se representan en SEQ ID NO: 1 como posiciones X⁴, X⁵y X^6-9, respectivamente. Por ejemplo: X⁴(que corresponde con B^iaen la cadena B de una molécula de insulina humana) puede modificarse a E, Q o H; X⁵(que corresponde con B²⁵en la cadena B de una molécula de insulina humana) puede modificarse a H; X^a(que corresponde con B²⁷en la cadena B de una molécula de insulina humana) puede eliminarse o modificarse a G, S, H o V; X⁷(que corresponde con B²³en la cadena B de una molécula de insulina humana) se puede eliminar o modificar a G, E, K, D, S o H; X⁸(que corresponde con B²⁹en la cadena B de una molécula de insulina humana) puede eliminarse o modificarse a G, E, P, Q, D o H; y X⁹(que corresponde con B³⁰en la cadena B de una molécula de insulina humana) puede eliminarse o modificarse a G, S, E o K. Además de reducir la propensión de las porciones agonistas del receptor de insulina a autoasociarse, modificaciones a las posiciones B^iay B²⁵en el análogo de la cadena B de insulina -X⁴y X⁵de SEQ ID NO: 1, respectivamente- también se puede hacer para ajustar la potencia, mejorar la expresión, mejorar la estabilidad química y/o física, mejorar la facilidad con la que las proteínas de fusión pueden formularse con otros excipientes de uso común y/o eliminar la desamidación. El análogo de la cadena B de la insulina también puede incluir modificaciones adicionales por estos motivos. Con referencia a las variables en SEQ ID NO: 1, tales modificaciones adicionales incluyen lo siguiente: modificación de X¹(que corresponde con B¹en la cadena B de una molécula de insulina humana) a Q o A; modificación de X²(que corresponde con B²en la cadena B de una molécula de insulina humana) a G; y/o modificación de X³(que corresponde con B³en la cadena B de una molécula de insulina humana) a K, D o G.

En ciertas realizaciones preferidas, el análogo de la cadena B de insulina incluye más de una modificación a la secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana en las posiciones X⁴, X⁵y X^a-9de la SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, X⁴es E y X⁵es H. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de X^a-X⁹de SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo que consiste en: GGES, GGGS, GGDS, GGEG, GGGG, SSES, SSGS, GGEE, GGGE, GGEK, GGGK, TPGS, TGGS, HGES, GHES, GGHS, GGEH, HGGS, GHGS, GGGH, GGDD, VGES, TEET, TKPT, GGGG, TGGG, TPGG, EPKT, TDKT, TPGS, EGT, EGES, EEES, EPES, EPEP y GGDD. En realizaciones preferidas, la secuencia de estos cuatro aminoácidos es GGGS, GGGG o TEET. En realizaciones particularmente preferidas, X⁴es E, X⁵es H y X^{6 -g}es GGGG.

Debe observarse que, mientras que X⁶-X⁹de la SEQ ID NO: 1 se describe anteriormente como que comprende el extremo C-terminal del análogo de la cadena B de insulina (Z¹), estos aminoácidos no son críticos para la actividad de las proteínas de fusión en el receptor de insulina y, por lo tanto, pueden considerarse alternativamente una extensión del primer péptido enlazador (Z²). Por ejemplo, en el contexto de la SEQ ID NO: 4, X⁶-X⁹puede considerarse parte del análogo de la cadena B de insulina o el primer enlazador peptídico en ese agonista del receptor de insulina.

En las proteínas de fusión de la presente invención, el análogo de la cadena A de insulina en la porción agonista del receptor de insulina puede incluir una o más modificaciones a la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana destinada a mejorar la estabilidad química y física, ajustar la potencia y/o mejorar la expresión. Con referencia a las variables en SEQ ID NO: 2, estas modificaciones incluyen lo siguiente: modificación de X¹(que corresponde con A¹⁰en la cadena A de una molécula de insulina humana) a T; modificación de X²(que corresponde con A¹⁴en la cadena A de una molécula de insulina humana) a D, Q o E; y/o modificación de X³(que corresponde con A²¹en la cadena A de una molécula de insulina humana) a G, S o A. En una realización preferida, X¹es T, X²es D y X³es G.

Además, para evitar la desamidación así como la escisión química y/o proteolítica, si el aminoácido en la posición 21 en el análogo de la cadena A de insulina en el agonista del receptor de insulina, es decir, X³en SEQ ID NO: 2, es un N -el aminoácido que está presente en la posición correspondiente en una molécula de insulina humana- no debe ser seguido inmediatamente en el lado C-terminal por ciertos aminoácidos, como un G o un N, o, en ciertas realizaciones, un P, S, V o L. Véase, por ejemplo, Vlasak J, Ionescu R., MAbs. 2011 mayo-junio; 3(3): 253-63. Fragmentation of Monoclonal Antibodies. Cabe señalar que si bien este requisito se menciona en la primera proteína de fusión descrita anteriormente en el contexto de las opciones para las posiciones X⁴y X⁵en la SEQ ID NO: 2, que pertenece al análogo de la cadena A de insulina, no es crítico para que el resto no glicina que sigue a un resto de asparagina en la posición 21 en el análogo de la cadena A de insulina se considere parte del agonista del receptor de insulina, en oposición al segundo enlazador peptídico. Por ejemplo, en el contexto de la SEQ ID NO: 11, el resto correspondiente a la posición 21 en la porción análoga de la cadena A está representado por X¹⁴, y el siguiente aminoácido, X¹⁵, podría considerarse parte del agonista del receptor de insulina o el segundo enlazador peptídico.

Como se describió anteriormente, en las proteínas de fusión de la presente invención, el resto C-terminal del análogo de la cadena B de insulina se fusiona directamente con el resto N-terminal de un primer enlazador peptídico y el resto C-terminal del primer enlazador peptídico se fusiona directamente con el resto N-terminal del análogo de la cadena B de insulina. El primer enlazador peptídico debe proporcionar suficiente flexibilidad para que los análogos de la cadena A y la cadena B de la insulina alcancen la estructura necesaria para unirse al receptor de insulina, pero no debe ser tan largo que interfiera indebidamente con esa unión. La longitud y la composición del primer enlazador peptídico pueden ajustarse para ajustar la potencia y/o la expresión de las proteínas de fusión. En algunas realizaciones, el primer enlazador peptídico tiene una longitud de 5 a 10 aminoácidos, al menos 5 de los cuales son restos G. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del primer enlazador peptídico se selecciona del grupo que consiste en: GGGGGG, GGGGG, EGGGGG, GEGGGG, GGEGGG, GGGEGG, GGGGEG, GGGGGE, KGGGGG, GKGGGG, GGKGGG, GGGKGG, GGGGKG, GGGGGK, HGGGGG, GHGGGG, GGHGGG, GGGHGG, GGGGHG, GGGGGH, GGGGGA, GGGGGR, SGGGGG, GSGGGG, GGSGGG, GGSGGGK, GGSGGGG y GGSGGG. En ciertas realizaciones preferidas, la secuencia del primer enlazador peptídico comprende la SEQ ID NO: 3. Más preferiblemente, la secuencia del primer enlazador peptídico es GGSGGGG (SEQ ID NO: 15). La porción agonista del receptor de insulina de las proteínas de fusión de la presente invención también incluye los enlaces disulfuro encontrados en una molécula de insulina humana como se describió anteriormente, a saber, dos enlaces disulfuro que unen los análogos de la cadena A de insulina y la cadena B en CysA7-CysB7 y CysA20-CysB19, y un enlace disulfuro intracadena en el análogo de la cadena A de insulina en CysA6-CysA11.

Como se describió anteriormente, el resto C-terminal de la porción agonista del receptor de insulina de las proteínas de fusión de la presente invención se fusiona con el resto N-terminal de un segundo enlazador peptídico, y el resto C-terminal del segundo péptido enlazador se fusiona directamente al resto N-terminal de la porción Fc. Se prefiere que el segundo enlazador peptídico sea rico en glicina, para proporcionar suficiente flexibilidad conformacional. El segundo enlazador peptídico tiene una longitud de entre 10 y 25 aminoácidos, siendo al menos el 50 % de los aminoácidos restos de glicina. Un segundo enlazador peptídico preferido incluye la secuencia (GGGGX¹⁵)ⁿen la que X¹⁵es Q, E o S y n = 2-5. Un segundo enlazador peptídico más preferido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Un segundo enlazador peptídico más preferido tiene la secuencia de aminoácidos GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO: 7).

Como se usa en el presente documento, el término "región Fc de IgG humana" tiene el significado comúnmente dado al término en el campo de la inmunología. Específicamente, este término se refiere a un fragmento de anticuerpo IgG humano que se obtiene eliminando las dos regiones de unión a antígeno (los fragmentos Fab) del anticuerpo. En particular, la región Fc incluye los dominios de la región constante CH2 y CH3 del anticuerpo, y también puede incluir parte o la totalidad de la región bisagra.

Como se describió anteriormente, en ciertas realizaciones de la proteína de fusión de la presente invención, la región Fc de IgG humana comprende fragmentos de la región constante de una cadena pesada de un anticuerpo IgG, cuya representación esquemática se proporciona en el diagrama (A) de la Figura 2, y en otras realizaciones, la región Fc de IgG humana comprende fragmentos de las regiones constantes de dos cadenas pesadas de un anticuerpo IgG, cuya representación esquemática se proporciona en el diagrama (B) de la Figura 2. En esta realización, las regiones constantes de las dos cadenas pesadas están asociadas entre sí a través de interacciones no covalentes y enlaces disulfuro.

Hay cuatro subclases de IgG (G1, G2, G3 y G4), cada una de las cuales tiene diferentes estructuras y funciones biológicas conocidas como funciones efectoras. Estas funciones efectoras generalmente están mediadas por la interacción con el receptor Fc (FcyR) o por el factor de complemento de unión C1q. La unión a FcyR puede conducir a citólisis celular dependiente de anticuerpos, mientras que la unión a factores del complemento puede conducir a la lisis celular mediada por el complemento. Las estructuras y propiedades de las regiones Fc de las subclases de IgG son conocidas en la técnica. Las proteínas de fusión de la presente invención pueden contener regiones Fc de cualquiera de las subclases de IgG, aunque G2 y G4 tienen actividades de unión a receptor y función efectora más bajas que los anticuerpos G1 y G3, y por lo tanto son preferidas.

Cuando se usa en el presente documento, el término región Fc de IgG humana también incluye versiones de dichos fragmentos de anticuerpos que se han modificado, alargado y/o truncado, por ejemplo, para alterar propiedades o características tales como el complemento y/o las funciones de unión al receptor Fc, funciones efectoras, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), capacidad de fabricación y/o estabilidad. Por ejemplo, las regiones Fc de IgG humana de las proteínas de fusión de la presente invención pueden modificarse para reducir o eliminar el sitio de glicosilación unido a N, lo que reducirá la afinidad de unión a C1q y la citotoxicidad, y que puede ayudar en la inmunogenicidad, afectar la estabilidad conformacional y tasa de depuración in vivo, y/o modificar las funciones efectoras. Las regiones Fc de IgG humana de las proteínas de fusión de la presente invención también pueden tener parte o la totalidad de la región bisagra eliminada para simplificar la dimerización de Fc mediada por disulfuro. Otros ejemplos de alteraciones incluyen fosforilación, sulfatación, acilación, glicosilación, metilación, acetilación, amidación y/o modificaciones para permitir la producción de moléculas heterodímeras. Las técnicas para modificar las estructuras y propiedades de las regiones Fc de IgG humana de las subclases de IgG son conocidas en la técnica.

Independientemente de la estructura final de la proteína de fusión, la región Fc de IgG humana debe servir para prolongar la vida media en plasma in vivo del agonista del receptor de insulina. Al preparar proteínas de fusión de Fc heterólogas en las que la porción de Fc se está utilizando por su capacidad para extender la vida media, es importante minimizar cualquier función efectora. Además, el agonista del receptor de insulina fusionado debe seguir siendo capaz de unirse y activar el receptor de insulina para reducir los niveles de glucosa en sangre y/o suprimir la producción de glucosa hepática, características que pueden probarse y medirse utilizando técnicas conocidas, tales como se muestra en los estudios que se describen a continuación. Se puede demostrar una vida media larga en las proteínas de fusión de la presente invención usando, por ejemplo, los procedimientos descritos a continuación.

Una región Fc de IgG humana preferida es una región Fc de IgG4 modificada para reducir aún más la función efectora, promover la formación de homodímeros y tener una porción de la bisagra eliminada, como en la SEQ ID NO: 9 en la que X ⁱes F; X²es F; X³es V; X⁴es V; X⁵es N; X es R; y X⁷está ausente.

Otra región Fc de IgG humana preferida es una región Fc de IgG2 que tiene una porción de la bisagra eliminada, como en la SEQ ID NO: 10 en la que X ⁱes F; X²es F; X³es V; X⁴es V; X⁵es N; y X⁶está ausente.

Debe observarse que, aunque las secuencias de aminoácidos de las regiones Fc de IgG humanas preferidas mencionadas anteriormente tienen partes de las regiones de bisagra eliminadas para simplificar la dimerización mediada por disulfuro, esas regiones de bisagra pueden estar presentes en ciertas realizaciones. Por ejemplo, una región Fc de IgG2 de tipo salvaje incluye la secuencia de seis aminoácidos ERKCCV en su extremo N-terminal, y aunque estos aminoácidos no se recitan en la secuencia de región Fc de IgG2 establecida en SEQ ID NO: 10, se contempla que una región Fc de IgG humana que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10 puede comprender además parte o la totalidad de la secuencia de seis aminoácidos ERKCCV en su extremo N-terminal. De manera similar, una región Fc de IgG humana que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 9 puede comprender además algunos o todos los seis aminoácidos encontrados en el extremo N-terminal de una región Fc de IgG4, a saber, ESKYGP. Del mismo modo, una región Fc de IgG humana que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8 puede comprender además algunos o todos los diez aminoácidos encontrados en el extremo N-terminal de una región Fc de IgG1, a saber: EPKSCDKTHT. Además, la delimitación precisa entre qué aminoácido constituye el extremo C-terminal del segundo enlazador peptídico y qué aminoácido constituye el extremo N-terminal de la región Fc de IgG humana no es crítica para la estructura o función de la proteína de fusión de la proteína presente invención. Por ejemplo, en el contexto de la SEQ ID NO: 11, los restos correspondientes a las posiciones X¹⁹-X²²podrían describirse como el extremo C-terminal del segundo enlazador peptídico o una extensión N-terminal de la región Fc de IgG humana.

Como se describió anteriormente, la presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican cualquiera de las proteínas de fusión de la presente invención. Los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión descritas anteriormente pueden estar en forma de ARN o ADN, que incluye ADNc y ADN sintético, y que pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Las secuencias de codificación que codifican las proteínas de la presente invención pueden variar como resultado de la redundancia o degeneración del código genético.

Los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la presente invención pueden incluir lo siguiente: solo la secuencia de codificación para las proteínas, la secuencia de codificación para las proteínas y la secuencia de codificación adicional, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia proproteína; la secuencia codificante para las proteínas y la secuencia no codificante, como los intrones o la secuencia no codificante 5' y/o 3' de la secuencia codificante para las proteínas. Por lo tanto, el término "polinucleótido que codifica una proteína" abarca un polinucleótido que puede incluir no solo la secuencia codificante para las proteínas sino también un polinucleótido que incluye una secuencia codificante y/o no codificante adicional.

Los polinucleótidos de la presente invención se expresarán en una célula huésped después de que las secuencias se hayan unido operativamente a una secuencia de control de la expresión. Los vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos huéspedes, ya sea como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

Las proteínas de fusión de la presente invención pueden producirse fácilmente en células de mamífero tales como células CHO, NSO, HEK293, BHK o COS; en células bacterianas como E. coli, Bacillus subtilis o Pseudomonas fluorescence; en células de insecto, o en células fúngicas o de levadura, que se cultivan usando técnicas conocidas en el arte. Sin embargo, las células de insectos y levaduras u otras células fúngicas producen N-glucanos no humanos, por lo que las proteínas con glucosilación ligada a N producida en dichas células pueden causar reacciones inmunogénicas si se administran a pacientes. Por lo tanto, la producción en tales células requiere la eliminación de los sitios de glicosilación unidos a N y/o la ingeniería genética de las células para producir N-glicanos humanos usando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Hamilton SR, et al., Production of complex human glycoproteins in yeast, 301 SCIENCE (5637): 1244-6 (agosto de 2003). Se prefiere la producción en células de mamífero, y la célula huésped de mamífero preferida es la línea celular CHOK1 SV que contiene un sistema de expresión de glutamina sintetasa (GS) (véase la Patente de los Estados Unidos No. 5,122,464).

Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés (por ejemplo, las proteínas de fusión y las secuencias de control de expresión) pueden transferirse a la célula huésped mediante procedimientos bien conocidos, que varían según el tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transformación con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para las células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación se pueden usar para otros huéspedes celulares.

Se pueden emplear varios procedimientos de purificación de proteínas y dichos procedimientos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd. Edition, Springer, N,Y. (1994).

Como se describió anteriormente, la proteína de fusión de la presente invención en ciertas realizaciones se produce como un dímero. En dicho dímero, las regiones Fc de IgG humana de las proteínas de fusión se asocian entre sí a través de interacciones no covalentes y enlaces disulfuro. Una representación esquemática de dicho dímero se proporciona en el diagrama (C) de la Figura 2. Cuando las secuencias de aminoácidos de las dos proteínas de fusión que forman dicho dímero, por ejemplo, Proteína de Fusión A y Proteína de Fusión B en el dímero representado en el diagrama (C) de la Figura 2 - son iguales, el dímero se denomina en el presente documento "homodímero". Como se indicó anteriormente, se prefiere la expresión de proteínas de fusión de la presente invención en células de mamífero, y la expresión en tales células da como resultado homodímeros. Las proteínas de fusión en tales homodímeros están asociadas a través de interacciones no covalentes y enlaces disulfuro intermoleculares en la porción Fc. Por ejemplo, la proteína producida por un gen que codifica la proteína de fusión de SEQ ID NO: 12 sería un homodímero unido covalentemente a través de enlaces disulfuro entre cadenas, concretamente C80 a C80 y C83 a C83.

Cuando las secuencias de aminoácidos de dos proteínas de fusión que forman un dímero, por ejemplo, la proteína de fusión A y la proteína de fusión B en el diagrama (C) de la figura 2, son diferentes, el dímero se denomina aquí como un "heterodímero". Tal heterodímero puede prepararse mediante técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Lewis SM, et al. NAT. BIOTECNOL 32(2): 191-8 (2014); Carter, J. IMMUNOL. PROCEDIMIENTOS, 248(1-2): 7-15 (2001); Ridgway, J. B. et al. PROTEÍNA ENG. 9(7): 617-2 (1996).

Las referencias en el presente documento a composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión incluyen composiciones farmacéuticas que contienen un homodímero de esa proteína de fusión, y/o que contienen un heterodímero, en el que un miembro del heterodímero es esa proteína de fusión. Del mismo modo, las referencias a una proteína de fusión para uso en terapia y/o una proteína de fusión para uso en la fabricación de un medicamento incluyen un homodímero de esa proteína de fusión, y/o un heterodímero en el que un miembro del heterodímero es esa proteína de fusión, para uso en terapia y/o en la fabricación de un medicamento.

El término "tratamiento" o "tratar", como se usa en el presente documento, se refiere al tratamiento y cuidado de un paciente que tiene diabetes o hiperglucemia, u otra afección para la cual la administración de insulina está indicada con el fin de combatir o aliviar síntomas y complicaciones de esas condiciones. El tratamiento incluye administrar proteínas de fusión de la presente invención para prevenir o retrasar la aparición de síntomas o complicaciones, aliviar los síntomas o complicaciones o eliminar la enfermedad, afección o trastorno. El paciente por tratar es un mamífero y, preferiblemente, un ser humano.

El término "evitar" o "prevenir", como se usa en el presente documento, se refiere a reducir el riesgo o incidencia de, o eliminar o ralentizar la progresión de una o más afecciones, síntomas, complicaciones o trastornos.

Las proteínas de fusión de la presente invención pueden usarse para tratar sujetos con una amplia variedad de enfermedades y afecciones. Se incluyen sujetos con hiperglucemia, diabetes insulinodependiente, así como sujetos con diabetes no insulinodependiente, incluidos pacientes sin tratamiento previo, así como sujetos tratados con medicamentos orales, como sulfonilurea, metformina, tiazolidinediona como pioglitazona, el inhibidor de la aglucosidasa como acarbosa, y/o inyectables sin insulina, incluyendo terapias basadas en incretina, tales como inhibidores DPP-4 y agonistas de GLP-1R. Las proteínas de fusión de la presente invención pueden usarse para regular la glucosa en sangre en tales pacientes, y pueden tratar afecciones o complicaciones que resultan de un control insuficiente de la glucosa en sangre tal como retinopatía, neuropatía o enfermedad renal.

En ciertas realizaciones, la proteína de fusión de la presente invención se administra todos los días, día por medio, dos veces por semana, tres veces por semana, una vez por semana, dos veces al mes o una vez al mes. En realizaciones preferidas, la duración de la acción se extiende suficientemente para permitir una dosificación semanal. Sin embargo, incluso para esas moléculas de acción prolongada, los expertos en la materia reconocerán que también se puede proporcionar un control eficaz de la glucosa acumulando gradualmente la dosis de un fármaco con un perfil farmacocinético prolongado utilizando un régimen de tratamiento más frecuente, tal como una vez al día. Véase, por ejemplo, Heise T and Meneghini LF, 20 ENDOCR. PRACTO p75-83 (2014).

En ciertas realizaciones, la proteína de fusión de la presente invención se administra en combinación con un ingrediente activo adicional, tal como insulina o un análogo de insulina, una terapia basada en incretina o un medicamento oral para la diabetes, tal como una sulfonilurea, metformina, tiazolidinediona como la pioglitazona o un inhibidor de la a-glucosidasa como la acarbosa.

El término "terapia basada en incretina" incluye cualquier tratamiento que comprende la administración de, o promueve, permite, mejora y/o simula los efectos de un grupo de hormonas metabólicas conocidas como incretinas, grupo que incluye GLP-1 y péptido inhibitorio gástrico (GIP). Las terapias basadas en incretinas que están disponibles actualmente incluyen inhibidores de DPP-4 y agonistas de GLP-1R.

Un "inhibidor de DPP-4" es un compuesto que bloquea la enzima DPP-4, que es responsable de la degradación de las incretinas. Los inhibidores de DPP-4 disponibles actualmente incluyen sitagliptina (Januvia®) y linagliptina (Tradjenta®).

Un "agonista de GLP-1R" se define como un compuesto que comprende la secuencia de aminoácidos de GLP-1 humano nativo (SEQ ID NO: 25), un análogo de GLP-1, un derivado de GLP-1 o una proteína de fusión GLP-1, que mantiene la actividad en el receptor GLP-1. La actividad de GLP-1R puede medirse mediante procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen el uso de experimentos in vivo y ensayos in vitro que miden la actividad de unión al receptor GLP-1 o la activación del receptor, por ejemplo, ensayos que emplean células de islotes pancreáticos o células de insulinoma, como se describe en e P 619,322 y la Patente de los Estados Unidos No.

5,120,712, respectivamente. Un análogo de GLP-1 es una molécula que tiene una modificación que incluye una o más sustituciones, eliminaciones, inversiones o adiciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de GLP-1 humano nativo (SEQ ID NO: 25). Un derivado de GLP-1 es una molécula que tiene la secuencia de aminoácidos de GLP-1 humano nativo (SEQ ID NO: 25) o de un análogo de GLP-1, pero que además tiene al menos una modificación química de uno o más de sus grupos laterales de aminoácidos, átomos de carbono a, grupo amino terminal o grupo ácido carboxílico terminal. Una proteína de fusión GLP-1 es una proteína heteróloga que comprende GLP-1, un análogo de GLP-1 o una porción derivada de GLP-1 y un segundo polipéptido. Los agonistas de GLP-1R actualmente disponibles incluyen exenatida (Byetta® y Bydureon®), liraglutida (Victoza®), albiglutida (Tanzeum®) y dulaglutida (Trulicity®), cuyas estructuras son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, US 5,424,286 (exenatida); US 6,268,343 (liraglutida); US 2014044717 (albiglutida); y US 7,452,966 (dulaglutida). En realizaciones en las que se proporciona una proteína de fusión de la presente invención en combinación con un ingrediente activo adicional, la proteína de fusión y el ingrediente activo adicional se pueden administrar simultáneamente, secuencialmente o en una sola formulación combinada.

Las proteínas de fusión de la presente invención son efectivas en el tratamiento de tales enfermedades y afecciones administrando a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de la presente invención. Como se usa en el presente documento, la frase "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de una proteína de fusión de la presente invención suficiente para regular la glucosa en sangre en un paciente sin causar efectos secundarios inaceptables. Una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión administrada a un sujeto dependerá del tipo y la gravedad de la enfermedad y de las características del sujeto, como la salud general, la edad, el sexo, el peso corporal y la tolerancia a las drogas. El experto en la materia podrá determinar las dosis apropiadas dependiendo de estos y otros factores. En ciertas realizaciones, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de la presente invención cuando se administra una vez por semana varía de aproximadamente 0,01 nmol/kg a aproximadamente 100 nmol/kg. Más preferiblemente, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de la presente invención cuando se administra una vez por semana varía de aproximadamente 1 nmol/kg a aproximadamente 50 nmol/kg. Más preferiblemente, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de la presente invención cuando se administra una vez por semana varía de aproximadamente 16 nmol/kg a aproximadamente 25 nmol/kg. En ciertas realizaciones, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de la presente invención cuando se administra una vez por semana varía de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 200 mg. Más preferiblemente, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de la presente invención cuando se administra una vez por semana varía de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 175 mg. Más preferiblemente, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de la presente invención cuando se administra una vez a la semana varía de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 160 mg.

Las personas expertas en la técnica entenderán que cuando la proteína de fusión de la presente invención se administra en combinación con otro ingrediente activo, tal como un agonista de GLP-1R, la dosis puede ajustarse para que la actividad de los dos tratamientos combinada es suficiente para regular la glucosa en sangre en un paciente. Por lo tanto, la cantidad de proteína de fusión que debe administrarse para regular los niveles de glucosa en sangre en tales combinaciones puede ser menor de lo que se requeriría si la proteína de fusión se administrara como monoterapia. Por ejemplo, cuando la proteína de fusión de la presente invención se proporciona en combinación con un agonista de GLP-1R, la cantidad de proteína de fusión que se proporcionará en una dosis semanal puede reducirse hasta en un 50 %, en comparación con la cantidad de la misma proteína de fusión para usar como monoterapia, como las dosis descritas en el párrafo anterior.

Preferiblemente, la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión de la presente invención en algunas realizaciones proporcionará un control eficaz de la glucosa al tiempo que reduce el riesgo de hipoglucemia y/o aumento de peso en comparación con los tratamientos existentes. La incidencia de hipoglucemia causada por una terapia de diabetes que agoniza el receptor de insulina puede minimizarse evitando un aumento rápido en la concentración del agente terapéutico después de la administración. Las proteínas de fusión de la presente invención tienen un perfil de acción de tiempo extendido sin un pico rápido de concentración después de la administración.

Además, en realizaciones en las que las proteínas de fusión de la presente invención se proporcionan en combinación con otro ingrediente activo, en particular, un agonista de GLP-1R, la actividad hepatopreferencial de las proteínas de fusión de la presente invención también puede reducir el riesgo de hipoglucemia mientras se controlan los niveles de glucosa. Debido a que la proteína de fusión de la presente invención puede acceder fácilmente al hígado a través del endotelio sinusoide defenestrado, la molécula puede controlar la producción de glucosa hepática, con poca o ninguna actividad en la periferia, mientras que el agonista GLP-1R promueve la secreción dependiente de glucosa de insulina endógena del páncreas que es fácilmente capaz de perfundirse en la periferia para controlar la absorción de glucosa en los músculos y las grasas.

Las proteínas de fusión de la presente invención se administran parenteralmente, por administración nasal o inhalación pulmonar. Se prefiere la administración parenteral, y puede incluir, por ejemplo, administración sistémica, tal como por inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea o intraperitoneal.

Las proteínas de fusión se pueden administrar al sujeto en una composición farmacéutica, que comprende una proteína de fusión de la presente invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones farmacéuticas son típicamente, aunque no necesariamente, de naturaleza parenteral y pueden prepararse mediante cualquiera de una variedad de técnicas que usan excipientes convencionales para productos parenterales, que son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: the Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, editor, 21a edición, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006). Como se describió anteriormente, la proteína de fusión de la presente invención es un homodímero cuando se expresa en células de mamífero. Por lo tanto, cuando se usa en el presente documento, el término "composición que comprende una proteína de fusión" incluye una composición que contiene un homodímero de una proteína de fusión. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención incluye una composición con la proteína de fusión de la presente invención presente en una concentración de al menos 1 mg/ml, al menos 2 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 20 mg/ml, al menos 25 mg/ml, al menos 30 mg/ml, al menos 35 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 55 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 65 mg/ml, al menos 75 mg/ml, al menos 100 mg/ml o más. En realizaciones preferidas, la proteína de fusión está presente en una concentración de 10-100 mg/ml. En realizaciones más preferidas, la proteína de fusión está presente en una concentración de 15-75 mg/ml, y en las realizaciones más preferidas, la proteína de fusión está presente en una concentración de 20-65 mg/ml.

El término "excipiente" significa cualquier sustancia añadida a la composición que no sea la proteína de fusión o cualquier otro ingrediente(s) activo(s) adicional(es). Los ejemplos de tales excipientes que pueden usarse en las composiciones de la presente invención incluyen agentes tamponantes, tensioactivos, agentes de isotonicidad y conservantes.

En ciertas realizaciones, la composición de la presente invención incluye uno o más agentes tamponantes para controlar el pH de la composición. Un "agente tamponante" es una sustancia que resiste los cambios en el pH por la acción de sus componentes conjugados ácido-base. En ciertas realizaciones, la composición de la presente invención tiene un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,0, preferiblemente, entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 7,4, más preferiblemente entre aproximadamente 6,0 y 6,75. Los agentes tamponantes adecuados para controlar el pH de las composiciones de la presente invención en el intervalo deseado incluyen, pero no se limitan a agentes tales como fosfato, acetato, citrato o ácidos de los mismos, tampones de arginina, TRIS e histidina, así como combinaciones del mismo. "TRIS" se refiere a 2-amino-2-hidroximetil-1,3,-propanodiol, y a cualquier sal farmacológicamente aceptable del mismo. La base libre y la forma de hidrocloruro (es decir, TRIS-HCl) son dos formas comunes de TRIS. TRIS también se conoce en la técnica como trimetilol aminometano, trometamina y tris(hidroximetil)aminometano. Los agentes tamponantes preferidos en la composición de la presente invención son citrato o ácido cítrico y fosfato.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención incluyen uno o más agentes de isotonicidad para minimizar el dolor tras la inyección debido a la inflamación celular o la ruptura celular. Un "agente de isotonicidad" es un compuesto que se tolera fisiológicamente e imparte una tonicidad adecuada a una formulación para evitar el flujo neto de agua a través de las membranas celulares que están en contacto con una composición farmacéutica administrada. Los agentes de isotonicidad conocidos incluyen glicerol, sales tales como cloruro de sodio y monosacáridos que incluyen, pero no se limitan a, manitol, dextrosa y lactosa. Los agentes de isotonicidad preferidos son manitol y cloruro de sodio.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención incluyen un tensioactivo. Un "surfactante" es una sustancia que reduce la tensión superficial de un líquido. Los ejemplos de tensioactivos usados en composiciones farmacéuticas y que pueden usarse en ciertas composiciones de la presente invención incluyen polisorbato 20, polisorbato 80, polietilenglicoles (por ejemplo, PEG 400, PEG 3000, TRITON X-100), alquiléteres de polietilenglicol (por ejemplo, BRIJ), polipropilenglicoles, copolímeros de bloque (por ejemplo, Poloxamer, PLURONIC F68; poloxamer 407, ^pL^uRONIC F127; TETRONICS), ésteres de alquil sorbitano (por ejemplo, SPAN), aceite de ricino polietoxilado (por ejemplo, KOLLIPHOR, CREm OpHOR) ytrehalosa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener un conservante. El término "conservante" se refiere a un compuesto agregado a una formulación farmacéutica para actuar como un agente antimicrobiano en composiciones de múltiples usos y/o titulables. Entre los conservantes conocidos en la técnica como eficaces y aceptables en formulaciones parenterales se encuentran cloruro de benzalconio, bencetonio, clorohexidina, fenol, m-cresol, alcohol bencílico, metil o propilparabeno, clorobutanol, o-cresol, p-cresol, clorocresol, nitrato fenilmercúrico, timerosal, ácido benzoico y varias mezclas de los mismos. El conservante fenólico incluye los compuestos fenol, m-cresol, o-cresol, p-cresol, clorocresol, metilparabeno y sus mezclas. Si es necesario un conservante, el conservante usado en las composiciones de la presente invención es preferiblemente un conservante fenólico, preferiblemente m-cresol o fenol.

Se sabe que ciertos conservantes fenólicos, como el fenol y el m-cresol, se unen a la insulina y a los hexámeros de insulina y, por lo tanto, estabilizan un cambio conformacional que aumenta la estabilidad física o química, o ambas. Sin embargo, en las composiciones que comprenden otras proteínas, dichos conservantes pueden contribuir a la formación de agregados de proteínas o polímeros de alto peso molecular (HMWP). Véase, por ejemplo, Maa YF and Hsu CC, Int J Pharm 140: 155-168 (1996); Fransson J, et al., Pharm. Res., 14: 606-612 (1997); Lam XM, et al., Pharm. Res., 14: 725-729 (1997); Remmele RL Jr, et al., Pharm Res 15: 200-208. (1998); Thirumangalathu R, et al., J Pharm Sci 95: 1480-1497 (2006). Tales agregados de proteínas en formulaciones terapéuticas son indeseables debido a su tendencia a inducir una respuesta inmune.

En ciertas realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión de la presente invención se optimiza para mejorar la estabilidad física de la proteína de fusión en composiciones que también contienen un conservante fenólico. Por ejemplo, los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que la presencia de una mutación de aminoácidos en la posición 10 en el análogo de la cadena A de insulina (variable X1 en el análogo de la cadena A de insulina mencionada en la SEQ ID NO: 2) reduce acumulación de agregados de la proteína de fusión en presencia de conservantes fenólicos, como se muestra en los estudios de estabilidad a continuación. La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes.

Expresión y purificación de proteínas de fusión

Las proteínas de fusión de la presente invención se producen en un sistema de expresión de células de mamífero usando la línea celular de desactivación de glutamina sintetasa (GS) (GSKO) CHO. La desactivación del gen GS permite una rigurosidad de selección más estricta al eliminar la actividad de fondo GS endógena que puede permitir la supervivencia de células de baja o ninguna productividad en condiciones de selección. Los genes que codifican las proteínas de fusión se subclonan en el plásmido de expresión que contiene glutamina sintetasa (GS). La secuencia de ADNc que codifica las proteínas de fusión se fusiona en marco con la secuencia de codificación de un péptido señal que mejora la secreción de la proteína de fusión en el medio de cultivo celular. La expresión es impulsada por el promotor de citomegalovirus (CMV). Las células CHO GSKO se transfectan de manera estable usando electroporación y la cantidad apropiada de plásmido de expresión recombinante.

Las células transfectadas se someten a una selección masiva en medios libres de glutamina. Los grupos transfectados se colocan en placas a baja densidad para permitir el crecimiento cercano a clonal de células de expresión estables. Los pozos maestros se criban para la expresión de la proteína de fusión y se amplían en cultivos en suspensión sin suero para ser utilizados para la producción.

Las proteínas de fusión secretadas en los medios pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad de proteína A seguida de cromatografía de exclusión por tamaño siguiendo técnicas cromatográficas estándar. En resumen, las proteínas de fusión de los medios clarificados son capturadas por Mab Select Protein A (GE) que se ha equilibrado con solución salina tamponada con fosfato pH 7,4. Después de una etapa de lavado con solución salina tamponada con fosfato pH 7,4, las proteínas de fusión unidas se eluyen con ácido cítrico 10 mM pH 3,0. Las fracciones que contienen proteína de fusión se agrupan y neutralizan agregando 1/10 de volumen de Tris 1M pH 8,0. Los agregados solubles y los multímeros pueden eliminarse eficazmente mediante técnicas comunes, que incluyen la exclusión por tamaño, la interacción hidrófoba o la cromatografía de intercambio iónico. Las fracciones que contienen proteína de fusión monomérica (homodímero unido covalentemente), según se determina por cromatografía de exclusión por tamaño, se agrupan, se filtran estériles y se almacenan.

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión de ejemplo de la presente invención se muestran a continuación:

Ejemplo 1:

10 ¿ u 30 60 B’VTSTQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGI V 'EQCCTSTCSLDQLENYCGGG 70 80 90 100 110 120 GGQGGGGQGGGGQGGGGGECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS

130 14 0 1 50 1 60 1 70 180 HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKG

190 20 0 2 10 2 20 2 30 240 LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP

250 26 0 2 70 28 0 290

ENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(SEQ ID N O : 12 )

Ejemplo 2:

10 20 30 40 5 0 60 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEETGGGGGGGIVEQCCTSICSLYQLENYCGGGG

70 80 90 100 11 0 120 GSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDV

130 140 150 160 17 0 180 SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK

190 200 210 220 23 0 240 GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ

250 260 270 280 29 0

PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

{SEQ ID NO:16)

Ejemplo 3:

10 20 30 40 50 60 FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSICSLDQLENYCGGG

70 80 90 10 0 1 10 1 20 GGQGGGGQGGGGQGGGGQGGPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW

130 14 0 15 0 16 0 1 70 18 0 DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS

19 0 20 0 21 0 22 0 2 30 24 0 NKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

2 50 26 0 27 0 28 0 2 90 3 00 GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS

LG

(SEQ ID N O : 17 )

Ejemplo 4:

10 20 30 40 50 60 FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGSGGGGGIVEQCCTSICSLDQLENYCGGGG

70 80 90 10 0 1 10 1 20 GEGGGGEGGGGEGGGGECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE

13 0 14 0 15 0 16 0 1 70 1 80 DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP

19 0 20 0 21 0 22 0 2 30 24 0 APIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN

250 26 0 27 0 28 0 2 90

NYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

Ejemplo 5:

10 20 3 0 40 50 60 FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGG

70 80 90 1 00 11 0 1 20 GGQGGGGQGGGGQGGGGQGGPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW

130 14 0 1 50 1 60 17 0 1 80 DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS

190 20 0 2 10 2 20 23 0 24 0 NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

2 50 26 0 2 70 2 80 29 0 30 0 GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS

LG

(SEQ ID NO:19)

Ejemplo 6

FVGQHLCGSHLVEALELVCGERGFHY GGGGGGSGGGGGIVEQCCT S I C S LDQLENYCGGG

70 80 9 0 1 00 110 1 20 GGQGGGGQGGGGQGGGGQGGPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWV

13 0 1 40 1 50 1 60 170 1 80 DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS

190 210 2 2 í 2 30 24 ! NKGLPS S I E K T I S KAKGQPREPQVYTLPP S QEEMTKNQVS LTCLVKGFY PSDIAVEWE SN

250 26 0 27 0 28 0 2 90 30 0 GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS

LG

(SEQ ID NO:20)

Ejemplo 7

10 20 3 0 4 0 50 60 AGGQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGSGGGGGIVEQCCTSICSLDQLENYCGGGG

70 80 9 0 1 00 1 10 12 0 GQGGGGQGGGGQGGGGECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE

130 14 0 15 0 1 60 1 70 18 0 DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP

190 20 0 21 0 2 20 2 30 24 0 APIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN

250 26 0 27 0 2 80 2 90

NYKTTPPMLDS DGSFFLYS KLTVDKS RWQQGNVFS C SVMHEALHNHY TQKSL S LS PG

(SEQ ID NO:21)

Ejemplo 8

1 0 2 0 30 40 50 60 FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPKTGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGG

7 0 8 0 90 10 0 11 0 12 0 GGQGGGGQGGGGQGGGGGECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVS

7 0 8 0 90 10 0 11 0 12 0 HE D PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN S T F R W S V L TWHQDWLN GKEYKCKV S NKG

7 0 8 0 90 10 0 11 0 12 0 LPAPIEK TISK TK GQPR EPQV YTLPPSR EEM TKN QV SLTCLV KG FYPSDIA V EW ESNG QP

7 0 ₁₀90 ^{iJ. f y'j U n}110 1 20 ENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK ^{t t} >PG

(SEQ ID NO:22)

Ejemplo 9

10 20 30 40 50 60 FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFFYTEETGGGGGGGIVEQCCTSICSLYQLENYCGGGG

70 80 90 100 11 0 120 GSGGGGSGGGGSGGGGSECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH

130 140 150 160 17 0 180 EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGL

190 200 210 220 23 0 240 PAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE

250 260 270 280 29 0

NNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(SEQ ID NO:23)

Ejemplo 10

10 20 30 4 0 50 6 0 FVGQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGG

70 80 90 100 110 120 GGQGGGGQGGGGQGGGGGECPPCPAPFVAGPSVFLFFPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS

130 140 150 160 170 180 HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKG

190 200 210 220 230 240 LPAPIEKTISKTKGQPR EPQVYTLPPSR EEM TKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNG QP

2 50 260 270 280 290

ENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(SEQ ID NO:24)

Actividad in vitro

Los lotes de prueba de los Ejemplos 1-3, 5 y 9 se preparan en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) o tampón de citrato 10 mM (pH 6,5) y se almacenan a 4°C. La insulina humana biosintética (Eli Lilly and Company) se prepara en HCl 0,01 N y se almacena como alícuotas congeladas, o se prepara en una mezcla formulada que contiene m-cresol, zinc, cloruro de sodio y tampón TRIS (pH 7,3) a 100 unidades/ml y almacenado a 4°C.

Las afinidades de las proteínas de fusión se determinan en ensayos de unión al receptor realizados en membranas P1 preparadas a partir de células 293EBNA transfectadas de forma estable (células de riñón embrionario humano 293HEK que expresan EBNA-1) que sobreexpresan la isoforma A del receptor de insulina humana (hIR-A) o isoforma B del receptor de insulina humana (hIR-B) que contiene una etiqueta de epítopo C9 en el extremo C-terminal. Las afinidades de unión se determinan a partir de un ensayo competitivo de unión de radioligando realizado en estado estacionario usando insulina recombinante humana (3-[¹²⁵I]-yodotirosil-A¹⁴). Los valores para las muestras de prueba se calculan como porcentaje relativo a la actividad de la insulina humana no marcada. Los valores de IC⁵⁰se determinan a partir del análisis de regresión logística no lineal de 4 parámetros (XLFit versión 4,0, IDBS). Si es necesario, los parámetros superior o inferior de la curva se establecen en 100 o 0, respectivamente.

La constante de afinidad (Kⁱ) se calcula a partir del valor IC⁵⁰basado en la ecuación Kⁱ=IC⁵⁰/(1 D/K^d) donde D es igual a la concentración de radioligando usado en el experimento y K^des igual a la afinidad de unión de equilibrio constante del radioligando para su receptor afín determinado a partir del análisis de unión de saturación (hIR-A = 0,205 nM; hIR-B = 0,251 nM). Los valores informados para Kⁱse muestran como media geométrica ± el error estándar de la media (SEM), con el número de determinaciones repetidas indicado por"n" (Tabla 1).

Las proteínas de fusión ejemplificadas tienen afinidad tanto en hIR-A como en hIR-B. En comparación con la insulina humana, las proteínas de fusión ejemplificadas muestran una afinidad de unión reducida a hIR-A y hIR-B (Tabla 1).

Tabla 1:

Estudios In Vivo

Estudios en el modelo de diabetes de rata tratada con estreptozotocina (STZ)

Los efectos de las proteínas de fusión se investigan en el modelo de diabetes de rata tratada con STZ. Se anestesian con isoflurano ratas macho Sprague-Dawley, de 400-425 gramos de peso corporal, y se les administra una inyección única de Zanosar® (artículo STZ # 89256, Teva Parenteral Medicines, 40 mg/kg IV). Las ratas se usan en estudios 3 días después de la inyección de Zanosar®; en estos estudios solo se utilizan animales con glucemia no en ayunas entre 400-550 mg/dL.

Las ratas se distribuyen en grupos para proporcionar una variación comparable en la glucosa en sangre y el peso corporal y luego se aleatorizan. La glucosa en sangre se mide usando el glucómetro Accucheck Aviva (Roche). Las ratas tratadas con STZ reciben una inyección subcutánea (SC) única de una dosis de 30 nmol/kg.

Las muestras de sangre para las mediciones de glucosa se recogen mediante sangrado de cola. Los animales tienen libre acceso a comida y agua durante todo el experimento. Los datos de glucosa en sangre se proporcionan en la Figura 1. Los datos que se muestran en la Figura 1 son medias ± SEM (n=6 para los Ejemplos 1 y 8; n=3 para los ejemplos restantes). Los datos de glucosa en sangre para puntos de tiempo durante el período de alimentación inicial (entre 0 y 24 horas) se recopilan, pero no se incluyen en la Figura 1 para facilitar la representación visual. Como se muestra en la Figura 1, los Ejemplos 1-10 proporcionan cada uno una disminución de glucosa durante un período prolongado de tiempo.

Las propiedades farmacocinéticas de los Ejemplos 1, 3-6 y 9-10 también se caracterizan después de la dosificación subcutánea (SC) en ratas tratadas con STZ como se describe anteriormente. Los datos se generan utilizando un ensayo ELISA de receptor de insulina que requiere la presencia de insulina que sea capaz de unirse al receptor de insulina. El receptor de insulina ELISA utiliza el receptor de insulina humana (R&D Systems #1544-IR/CF aa28-944) como captura. El receptor de insulina humana se une a una placa Immunlon 4 HBX mediante un anticuerpo anti-6x HisTag de ratón (Novagen 70796). La curva estándar de la proteína de fusión y las muestras se diluyen en plasma K3 EDTA de rata al 100 % y se detectan con peroxidasa de rábano picante IgG Fc anti-humana de ratón (SouthernBiotech 9040-05). Las concentraciones de los ejemplos 3-6 y 9-10 a 336 horas están entre 22,1 ± 9,8 mg/ml y 1498 ± 690 mg/ml. La Tabla 3 muestra las concentraciones del Ejemplo 1 a lo largo del tiempo, y la Tabla 4 muestra los parámetros farmacocinéticos después del análisis no compartimental de los datos para el Ejemplo 1. Los datos respaldan una duración prolongada de biodisponibilidad para las proteínas de fusión de la presente invención.

Tabla 3

Tabla 4

Estudio de pinza euglucémica en ratas normales

Se realiza un estudio de pinza euglucémica en ratas macho Sprague-Dawley para comprender la actividad global in vivo del Ejemplo 1 sobre la utilización de glucosa y para determinar la actividad del Ejemplo 1 en el hígado frente a los tejidos periféricos. Se inicia una infusión en bolo/continua de 3-3H-glucosa en ratas con ayuno crónico cateterizado durante la noche para determinar la producción de glucosa endógena (EGP) en condiciones basales. Entonces se realiza una infusión intravenosa en bolo/continua del artículo de prueba -7 nmol/kg [bolo] y 1 nmol/kg/h [tasa continua]- o comparador de insulina lispro -[sin bolo] y 0,75 mU/kg/min [tasa continua]- administrado y se inicia una infusión intravenosa variable de glucosa al 20 % y se ajusta periódicamente para mantener la concentración de glucosa en sangre a 100-110 mg/dL. Las velocidades de bolo/infusión se seleccionan para lograr velocidades de infusión de glucosa (GIR) comparables y una supresión comparable de EGP en condiciones de pinza euglucémica en cada grupo. La somatostatina se administra para inhibir la secreción endógena de insulina. Se obtienen muestras de sangre arterial durante el experimento para controlar el hematocrito, la insulina plasmática y los ácidos grasos libres, el péptido C y el EGP basal y de pinza. Al final del experimento, se administra 2-[1-14C]-desoxiglucosa para medir la absorción de glucosa en los tejidos en concentraciones de glucosa en estado estacionario. En estas condiciones coincidentes, la actividad periférica del artículo de prueba y los comparadores se analiza como la absorción de glucosa en el músculo sóleo y la supresión de los ácidos grasos libres de plasma (FFA). Todos los datos se analizan utilizando un análisis de varianza unidireccional con la prueba post-hoc de Dunnett utilizando el grupo de insulina lispro como el comparador de control.

Las dosis de bolo e infusión del Ejemplo 1 dan como resultado una concentración plasmática estable de 274 ± 57 nM en el transcurso del experimento de fijación. Como se muestra en la Tabla 5, ambos grupos de animales logran una GIR comparable durante la fase de sujeción del experimento. La glucosa en sangre promedio en el grupo del Ejemplo 1 es ligeramente más alta que el grupo de insulina lispro. Ambos grupos tienen tasas de EGP basales y fijas similares (Tabla 5). Además, el cambio porcentual del EGP basal en el grupo del Ejemplo 1 es comparable al grupo de control de insulina lispro (Tabla 5). Para evaluar la actividad periférica en condiciones de sujeción equivalentes, se mide la supresión de FFA en plasma y la captación de glucosa muscular. Mientras que la insulina lispro dio como resultado una reducción en los niveles plasmáticos de FFA en el transcurso del experimento de fijación, el Ejemplo 1 no lo hizo. (Tabla 5). Además, la infusión del Ejemplo 1 da como resultado una disminución del 33 % en la absorción de glucosa en el músculo sóleo en comparación con la insulina lispro. (Tabla 5). En conjunto, estos datos indican que el Ejemplo 1 muestra una actividad periférica reducida en comparación con la insulina lispro.

Tabla 5:

Eficacia in vivo en monos Cynomolgus

Los parámetros farmacocinéticos (PK) del Ejemplo 1 se evalúan siguiendo una dosis intravenosa única de 1,5 nmol/kg y una dosis subcutánea única de 3 nmol/kg en monos cynomolgus. Se recogen muestras de plasma para el análisis P^kde tres animales por grupo/ruta, en el transcurso de 3 semanas. Se utilizan dos ensayos para el análisis PK: ELISA de receptor de insulina y ELISA de IgG Fc total. El receptor de insulina ELISA utiliza el receptor de insulina humana (R&D Systems 1544-IR/CF) como captura. El receptor de insulina humana se une a una placa Immunlon 4 HBX mediante un anticuerpo anti-HisTag de ratón (Novagen 70796). En el Ejemplo 1 la curva estándar y las muestras se diluyen en plasma de mono cynomolgus al 100 % (el anticoagulante era K3 EDTA) y se detectan con peroxidasa de rábano picante IgG Fc anti-humana de ratón (SouthernBiotech 9040-05). El ELISA IgG total utiliza la IgG2 antihumana (Abcam ab1933) como reactivo de captura. El Ejemplo 1 se diluye en plasma de mono cynomolgus al 100 % y el anticuerpo de detección es el mismo que en el ELISA del receptor de insulina. Los resultados de ambos ensayos se muestran en la Tabla 6, y los parámetros PK asociados se muestran en la Tabla 7.

El Ejemplo 1 muestra la biodisponibilidad completa en monos, y el ensayo de insulina activa y el ensayo de Fc total dan resultados similares.

Tabla 6. PK del Ejemplo 1 en monos Cynomolgus normales.

Tabla 7. Parámetros PK derivados del análisis no compartimental de datos en la Tabla 6.

Estabilidad

Formulación de 65 mg/ml no conservada del Ejemplo 1

El ejemplo 1 se formula a 65 mg/ml en citrato 10 mM, manitol 46,4 mg/ml, polisorbato 80 al 0,02 %, pH 6,5 y se almacena a 30°C. Las muestras se analizan para determinar el porcentaje de alto peso molecular mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) a las 0, 2 y 4 semanas inyectando 1 pL de la muestra de 65 mg/ml. La SEC analítica se realiza en un sistema Agilent 1100 equipado con una columna TSKgel SuperSW3000 (Tosoh Bioscience) y fosfato de sodio 50 mM, NaCl 300 mM, fase móvil pH 7,0 que fluye a 0,4 ml/min durante 15 minutos. Los picos se detectan a una absorbancia de 280 nm y los cromatogramas se analizan utilizando el software ChemStation. El porcentaje de alto peso molecular en el momento cero es 1,13 %, en el momento dos semanas es 1,68 %, y en el momento cuatro semanas es 1,74 %. Estos resultados apoyan la estabilidad del Ejemplo 1 a una concentración de 65 mg/ml con un crecimiento mínimo de agregado soluble después de 4 semanas a 30°C.

Formulaciones de 1 mg/ml conservadas y no conservadas de los Ejemplos 1 y 3

Los Ejemplos 1 y 3 se formulan a 1 mg/ml en citrato 10 mM, pH 6,5 en presencia o ausencia de m-Cresol 30 mM y se almacenan a 30°C. Las muestras se analizan para determinar el porcentaje de alto peso molecular mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en el tiempo cero y 2 semanas inyectando 10 pL de la muestra de 1 mg/ml. La SEC analítica se realiza en un sistema Agilent 1100 equipado con una columna TSKgel G3000SWxl (Tosoh Bioscience) y PBS NaCl 350 mM, pH 7,4 fase móvil que fluye a 0,5 ml/min durante 35 minutos o 45 minutos para muestras en ausencia o presencia de m-cresol, respectivamente. Los picos se detectan a una absorbancia de 214 nm y los cromatogramas se analizan utilizando el software ChemStation. Para el Ejemplo 3, sin y con m-cresol, el porcentaje de alto peso molecular en el tiempo cero es 0,2 % y 3,06 %, respectivamente. El porcentaje de alto peso molecular a las 2 semanas sin y con m-cresol fue de 0,2 % y 1,73 %, respectivamente. Estos resultados muestran un aumento inmediato en el agregado soluble después de la adición de m-cresol para el Ejemplo 3 en el tiempo cero. Para el Ejemplo 1, en ausencia y presencia de m-cresol, el porcentaje de alto peso molecular en el tiempo cero fue de 0,16 % y 0,15 %, respectivamente. El porcentaje de alto peso molecular a las 2 semanas en ausencia y presencia de m-cresol fue de 0,18 % y 0,31 %, respectivamente. Estos resultados demuestran estabilidad, en presencia de conservante, del Ejemplo 1, que incluye la modificación del aminoácido en la posición 10 en el análogo de la cadena A de insulina (variable X1 en la SEQ ID NO: 2, Z3 en la primera proteína de fusión descrito anteriormente) a un resto T, en relación con el Ejemplo 3, que incluye el resto I nativo en esa posición, pero que de otro modo comprende la misma secuencia de aminoácidos agonista del receptor de insulina que en el Ejemplo 1.

Secuencias

SEQ ID NO:1 - Análogo de la cadena B de insulina

XX ²X³QHLCGSHLVEALX⁴LVCGERGFX⁵YX⁶X⁷X⁸X⁹

en la que X¹es F, Q o A; X²es V o G; X³es N, K, D, G, Q, A o E; X⁴es E, Y, Q o H; X⁵es H o F; X^aes G, T, S, H, V o está ausente; X⁷es G, E, P, K, D, S, H o está ausente; X⁸es G, E, K, P, Q, D, H o está ausente; X⁹es G, T, S, E, K, A o está ausente, a condición de que el análogo de la cadena B de insulina incluya al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸o X⁹ SEQ ID NO:2 - Análogo de la cadena A de insulina

GIVEQCCTSX¹CSLX²QLENYCX³X⁴

X¹es T o I; X²es D, Y, Q o E; X³es G, N, S o A; y X⁴es cualquier aminoácido natural, o está ausente, a condición de que si X³es N, entonces X⁴debe ser un aminoácido distinto de G o N

SEQ ID NO:3 - Primer enlazador peptídico

X¹GX²GGGG, en la que X¹es G o está ausente; y X²es G, S o está ausente

SEQ ID NO:4 - Agonista del receptor de insulina

en la que X¹es F, Q o A; X²es V o G; X³es N, K, D, G, Q, A o E; X⁴es E, Y, Q o H; X⁵es H o F; X^aes G, T, S, H, V o está ausente; X⁷es G, E, P, K, D, S, H o está ausente; X⁸es G, E, K, P, Q, D, H o está ausente; X⁹es G, T, S, E, K, A o está ausente; X¹⁰es G o está ausente; X¹¹es G, S o está ausente; X¹²es T o I; X¹³es D, Y, Q o E; X¹⁴es G, N, S o A; y X¹⁵es cualquier aminoácido natural, o está ausente, a condición de que al menos uno de X⁴, X⁵, X^a, X⁷, X⁸o X⁹deba ser un aminoácido diferente al encontrado, respectivamente, en la posición B^1a, B²⁵, B²⁷, B²⁸, B²⁹o B³⁰de la cadena B de una molécula de insulina humana, y además a condición de que si X¹⁴es N, entonces X¹⁵debe ser un aminoácido distinto de G o N.

SEQ ID NO:5 - Agonista del receptor de insulina FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCG SEQ ID NO:6 - Segundo enlazador peptídico

GGGGX¹GGGGX²GGGGX³GGGGX⁴X⁵X^a

en la que X¹es Q o E; X²es Q o E; X³es Q o E; X⁴es G, E, Q o está ausente; X⁵es G o está ausente; y X^aes G o está ausente

SEQ ID NO:7 - Segundo enlazador peptídico

GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG SEQ ID NO:8 - Región Fc de IgG humana

CP PCPAPELLGGP5VX1LX2PPK PKDTLMISRTPK VTCX3VX4DVSHEDPEVKFN W"V VDGV EV HN AKTKPREEQ YX< STY RW SV LTV LI í QD W LNGKEY KCKVSNKA LPA P1HKTISKAÍCGQPREPQWTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGG PENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRW QQGNVF SC SVMHEALHNHYTQKS LSLSPGX*

en la que X¹es F, Q o E; X²es F, Q o E; X³es V o T; X⁴es V o T; X⁵es N, D o Q; y X^aes K o está ausente SEQ ID NO:9 - Región Fc de IgG humana

PCPPCP A PE A AGGPS Y X ¡ LX2PP KP K D rLMTS RTF líVTCX jVX+D VSQED PE VQFNW

y v d g v e v h n a k t k p r e e q f x 3s t y r w s v l t v l h q d w l n g k e y k c k .v s n k :g l p SSÍEKTISKAKO QPREPQ V YTLPPSQEEMTKNQ VSLTCL VKO F YPSD1A VEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSXsLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSLGX?

en la que Xi es F, Q o E; X2 F, Q o E; X3 es V o T; X4 es V o T; X5 es N, D o Q; X6 es R o K; X7 es K o está ausente SEQ ID NO:10 - Región Fc de IgG humana

ECPPCPAPPVAGPSVX¡! ,X,PPXPKDTLM!SRTFEY T tX 3 VX4DVSi íHDPEVQFNWV VTKj V F-: V H N AKTKPRE EQ FXjSTFRV VSV l .TVV HQDW í ,NGK'.E YKCKV S N ís.GLPA PIEKTiSKTKGQPREPQVYTLPP$REEMTKNQVSLTCLVK.GF YPSDi A VEWESNGQ PENNYKT rPPM L DS DGSFF LY SKLTYÜKSR' WQQGNVFSCS VMM EALIIN HYTQíC SLSLSPGXfi

en la que X1 es F, Q o E; X2 es F, Q o E; X3 es V o T; X4 es V o T; X5 es N, D o Q; y X6 es K o está ausente SEQ ID NO:11 - Región Fc de IgG humana

X: X^X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX5X ,X:;XíX - c.GXi ] GGGGGIVEQCCTSX^CSL Xi3QLENYCX14X-.GGGGXieGGGGX - ;GGGGXiSGGG GXsXzoXíiXazCPPCPAPX2 :,X?4AGX 2 5P SVFLFP PKPKDTLM1 S RT PEVT CVWDVSX? &ED P EVQ FHWYVDGVEVHHAKT K PRSE Q FMST X i,S W S VLTVX 2, H QD WLN GKE Y KC K VS1IKGL PX29 X _ X KT i 3 K X JtK GQPRSPQ VYTLPP S XM EEMT.KNQVS L T C L'VK G F Y P $ DI AVE H E S SFGQP. ENH Y. KTT PPX33 L D S D G 3 F FItYSX341.TV J j SRWQXsfGNVFSC3 VMH EA l. H H HY TQK3 L5 LSX3|;G

en la que X¹es F, Q o A; X²es V o G; X³es N, K, D, G, Q, A o E; X⁴es E, Y, Q o H; X⁵es H o F; X^aes G, T, S, H, V o está ausente; X⁷es G, E, P, K, D, S, H o está ausente; X⁸es G, E, K, P, Q, D, H o está ausente; X^ges G, T, S, E, K, A o está ausente, a condición de que al menos uno de X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸o X^gsea un aminoácido distinto del que está presente, respectivamente, en la posición B^{i a}, B²⁵, B²⁷, B²⁸, B²⁹o B³⁰de una cadena B de insulina humana; X¹⁰es G o está ausente; X¹¹es G, S o está ausente; X¹²es T o I; X¹³es D, Y, Q o E; X¹⁴es G, N, S o A; X¹⁵es cualquier aminoácido natural, o está ausente, a condición de que si X¹⁴es N, entonces X¹⁵debe ser un aminoácido distinto de G o N; X^1aes Q o E; X¹⁷es Q o E; X^es Q o E; X^1ges G, E, Q o está ausente; X²⁰es G o está ausente; X²¹es G o está ausente; X²²es E o P; X²³es E o P; X²⁴es A o V; X²⁵es G o está ausente; X^2aes Q o H; X²⁷es Y o F; X²⁸es L o V; X²⁹es S o A; X³⁰es S o P; X³¹es A o T; X³²es Q o R; X³³es V o M; X³⁴es R o K; X³⁵es E o Q; y X^3aes L o P SEQ ID NO:12 -Proteína de fusión

10 2 0 3 0 4 0 50 60 FVHQHLCGSHLVEAI ! 1VCGERGFHY G GGGGG3ÜGC GGIVE Q C C T S T C S L DQLE N Y C GGG 7 0 80 9 0 IGQ 11 0 1 20

G GQG C] 3 GQG G G 5QG C3 GG G EC PPC PA P PVA G P S V F L F P P K PK DT LM I S R T 5 E VT C V W DV S 130 140 - 50 1 60 1 70 18 0 H EDPEVQ FN W Y V i1 GVEV HNAKCKF REEQFNS T F R W SV L T W H QDW! . N GKE Y KCKVS NKG 190 20 C 2 10 22 0 2 30 2-10 1 P A P I EK TI SKTX GQ PREPQV1 TLPPSREEMTKNQV S L T C l V KG FY P 5131 AVE WE EN ÜQ P

2 50 26 0 27 0 2 60 29 0

ENNY KTTPPMLI3S DGSFF I..Y OKI: TV D K S RWQ Q GNVF S C 5 VM HE AL HNH Y T QK S L S L S ? G

SEQ ID NO:13 - Cadena A de insulina humana

GIVEQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO:14 - Cadena B de insulina humana

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT

SEQ ID NO:15 - Primer enlazador peptídico

GGSGGGG

SEQ ID NO:16 - Proteína de fusión

10 20 30 4 0 50 60 EVNQHL C G S HLVEALY LVCGE RGFFY TEE T 3 GGGG G GIVEQCCT SIG S L Y Q L E HYCGGGG 70 80 9 0 10 0 1 X 0 120 GSGGGGSGGGGSE 3 KYGPPCPPCPAPEAAGGP3VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWTOV 13 0 140 1 50 1 60 17 0 1 80 5QE D ? EVQFNWYVDGVEVI iNAK T K PREEQ EN 3 TYRWSVLTVLHQDWLNGKE YK CKVSNK 19 0 20 0 2 10 2 70 23 0 7 40 GLPS S I EKTISKAKGQPREPQVY T LPPSQE SMTKNQVSLTCI /VKGFYP SDIA V EWESNGQ

25 0 2 60 2 70 2 80 29 0

PENM YK. TT P PVL D ,5 DGS F F LY S R LTVDKS RKQEGMV FSC SVMIIEAL [1NHY TQK3 L 3 LS LG

SEQ ID NO:17 - Proteína de fusión

10 20 3 0 40 50 6 0 FVNQH LCGS: 11 jVEAI , E : . V CG ERG F, í \ Y GGGGGG SGGGGGI VEQCC TSIC SLD Q I jEí í Y CG GG

70 80 3 0 10 0 11 0 12 0 GGQG G GGQGGGGQGGGGQGG PC P1 P C A P EA AGG ? S V F , F ? ?: K PKDT LM I S RT P E V T C W V 13 0 14 0 1 50 1 60 17 0 ISO DV SQ E D PEVQENW Y. VDGVEVHHAKT.KPRE EQFNST YR W S V L T V LHQDW l.NGKE YKCKVS 19 0 20 0 2 1 0 22 0 23 0 2 4 0 NKG L P S S I E K T 1 SKAKGQPREPQVYT L P P SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYP S D IAVEWESN

2 50 26 0 2 70 2 80 29 0 3 00 GQ PE N W YKT T P PV L D 3 DG 3 F F L Y S R L 2 VD KS RWQ £ GNVFS G S VK11EAL: IH ] i Y T Q KS L SI, S

SEQ ID NO:18 - Proteína de fusión

10 2 0 3 0 40 50 60 FVNQJ i LCGS1 i I ,VE ftl ■ S : , VC G ERGE í 1Y GGGGG3 GGGGG" V KQ CCT S 1 C S I, DQLS N Y CGGGG 7 0 SO 90 ICO 1 10 1 20 GEG ^{f - jT ' , " '} E ^{r .} ¡ ^{! f} GGGGE GGGGE CP P C PA PP VAGFS V F L F PPKPKD T LMIS RT FE VT C V W D VS HE 1 30 1 40 150 16 0 1 70 ISO D PE'VQ.FNW Y V. D GV EVHNAKTKPREEQ FK 3 T F R W 5 V 11 W B Q DWLN GKE Y KC’KVS N KG1 ?

190 2 00 210 2 20 2 30 24 0 A P I E K r I S K T K G C P R EIP Q V Y T L P P S R E S MT KNQ VS LTC L VK G F Y ? S F 1 A .VE W E SNGQ P E N

2 50 2 60 270 28 0 2 90

3JYKTTPPKLDS DGS FFIi Y S KLTVDKS RWQ1 Q GMV F S C S VM H E ALH NH Y TQ K S LS L S PG

SEQ ID NO:19 - Proteína de fusión

10 2 0 30 4 0 50 60 FVNQH LCGS HEVE A LE1, VCGER.QFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTC3 LDQLENYCGGG 70 BC 9 0 10 0 11 0 1 20 GGQGGGGQGGGGQGGGGQGGPC? PCPAPEAAGGPS V FL FPPK FK D T LM ISR T PEV T C V W 130 1 40 150 16 0 1 70 1 80 DV SQED PEVQFNWYVDGVEVIflteKTKPREEQ FKS T Y R V VS V L T V L E Q E ÍÍL íí GKE Y KCKVS 190 2 00 21 0 22 0 2 30 2 4 Ü M KG L P S S I E K T 1 $ K AK G Q P R E P QV Y T L ? P S G E EMT KMQYSL T C LV K G F Y P 3 DI A V E PÍE 3 M 250 26 0 270 28 0 2 32 302 GQP:ENHYKTTPFVLDSDGS F F L YSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQK S LS LS

ÍJV.J

SEQ ID NO:20 - Proteína de fusión

1 0 20 30 40 ¿ 0 60 ^{FVGQH LCGS: i LVE ALE LVCGERG FHY GGGGGGSGGGGG IVEQCC T S I C} S ^{LI)Q LENYCGGG}7 0 80 30 100 11.0 1 20 GGQGGGGQGGGGQGGGGQGGPC P PC PAPEAAGGPSVFLFP PK PK DTE jMI S R TPEV T C V W 1 30 1 40 150 160 1 70 1 80 DVSQE 0 PE V QFNW Y VDGVEVHNAK1 TK PREEQF^ST Y R W S V L-T VLHQDWLUGRE Y KCKVS 1 90 2 00 210 22 0 2 32 2 42 NKGL P S S lfíK J.M.SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKISIQVSL'I C :¡VKGFY PSD I AVSWESN 2 50 26 0 27 ü 2 S 0 23 2 3 02 GQPENKYKTTPPVLD S DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LS

SEQ ID NO:21 - Proteína de fusión

10 2 0 30 40 50 60 AGGQHLCGSH LV3ALELVC GERGFH Y GGGGGSG GGGG .1VEQCCT S _ C S LDQLEN YC GGGG 70 8 0 90 10 0 11 0 1 20 GQGGGGQGGGGQ GGGG& C P P C P A ? PVAG PSVF L F P P K P K DT;,MY SRT PEVTC W VDVS H Y 13 0 1 40 150 16 0 1 70 1 30 D PE VQ F NW Y VD GV EVH.N.AKTKPRE EQ FN S T F.RW 3 VL T W .H Q D WLM GKE Y KC KV $MKG L P 19 0 2 00 21 0 22 0 2 30 2 40 A P I E K T I 3 K T KG Q PRE PQVY T L P P S R E Y ,M :1 KM QV 5L T C L V K G F Y P S D I AVE ■ W E S NGQPE M

250 2 60 270 28 0 2 90

N Y KT T P PR l I>S O GS F li' 1 j Y S K LT VD K SRíiTQQG N V F 3 C S VMI i E AL I r tí H Y TQXS L 3 L 3 P G

SEQ ID NO:22 - Proteína de fusión

10 2 0 30 40 5 0 60 FVUQHLCGSH12/EALELVCGERGFEY T PKTGGSGGGGGIVEQCCTS T C 3 L DQLEMYCGGG 70 8 0 30 1 0 Ü 1 10 12 0 G G Q GGGG Q G GG 3 QC G GG GEC ? PC PAP PVA G P S V F L F P ? K PKDT L K I S RTF EVT C! V W D V 3

13 0 1 40 15 0 16 0 1 70 18 0 K K11PEVQFNWYV i 3 GV ÜV H N A KT K PREEQFH 3 T F'RVV 5 V i; i W H Q DW LNGK 3 Y KC K V 3 NKG 19 0 2 0 0 21 0 22 0 2 30 2 40 ¡ ;PAP T E KM I SK TKGQPP.F1 i>QVY !'L P P S FtE K NQVST.TCI,VKGKYP £ ]j I AVEWESNGQ!

25 0 2 60 27 0 20 0 2 90

E MNYKI T ? PMLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVF3 C3 VMMEALHNHYGQKS L S L 3 ?G

SEQ ID NO:23 - Proteína de fusión

10 20 30 40 50 60 b VMQH LCGS H LVE AL E LVC G EP GF F Y TE E TGGGGGG G.. VEQC CT S 1 C 3 L YQLE N YC GGGG 70 80 SO 10 0 11 0 120 G 3 GGGGSGGGG3 GGGG3 ECPPC ?A i PVAG i: 8 VF 1,F P PK PKDT LM ISRT PEVTCVW DVSH 13 0 14 0 15 0 16 0 17 0 1.80 EDPE VQ FN W Y VDGVEVH NAKTKP. RE EQFN 5T F R W S V L T W E Q D WL NGKE YKCKVSNKG L 19 0 2 00 21 0 22 0 2 30 2 40 P A P I E K T I S KT K G Q PRE P Q V Y T L P P S RE EMT KMQVSLTC L VK G F Y p 3 DI AVE WE SNGQPF.

2 50 2 60 27 0 2 QG 2 90

MUY KT' T P PK LE S CG S F. FLY S KLT V DKS RWQQGMVF3C 3 VMHEALHNHY TQKS L 3 LS PG

SEQ ID NO:24 - Proteína de fusión

1 0 20 30 40 50 60 F V GQ H L C G5 H L V.E ALE L VCGERG FbJYGG G G G G TGG G G GIV E Q C C T 3 T C 3 L DQ LEMY C GG G 7 0 SO 90 10 0 110 1 20 G GQ GGGGQG GG GQGGGG GEC P F C FA ? P V A G P S VF L F P PK PK DT T.,M I S R T ? EVT C1 V W DV 3

1 30 14 0 1 50 16 0 : 70 1 80 HERPE VQFNWYVD GVEV HNAKT KPREEQFNSTF R W 3 YLTWHQDWLHGKEYKCKVSNKG 1 90 200 21 0 2 20 30 2 40 L PAP 1 E K T I S 2 T K GQ P R E PQ V Y T L P P 3 REEMTK NQV 31, EC i jVK G FY P 3131 AV E WE3 N GQ P

2 50 2 60 2 70 28 C 29 0

ENNY KT T P PMLDS DG3 F F L Y S K L TVDKSRWQQGWV FS CSVMHEALHMHYTQKSL S L S P G

SEQ ID NO:25 -GLP-1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión que comprende:

a) un agonista del receptor de insulina que tiene la fórmula general Z1-Z2-Z3, en la que:

1) Z1 es un análogo de la cadena B de insulina, que comprende la secuencia de aminoácidos:

X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9

en la que X1 es F, Q o A; X2 es V o G; X3 es N, K, D, G, Q, A o E; X4 es E, Y, Q o H; X5 es H o F; X6 es G, T, S, H, V o está ausente; X7 es G, E, P, K, D, S, H o está ausente; X8 es G, E, K, P, Q, D, H o está ausente; X9 es G, T, S, E, K, A o está ausente, a condición de que el análogo de la cadena B de insulina incluya al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de una molécula de insulina humana en X4, X5, Xa, X7, X8, o X9 (SEQ ID NO: 1);

ii) Z2 es un primer enlazador peptídico que comprende de 5 a 10 aminoácidos, en el que al menos 5 de dichos aminoácidos son restos G; y

iii) Z3 es un análogo de la cadena A de insulina que comprende la secuencia de aminoácidos:

GIVEQCCTSX1CSLX2QLENYCX3X4

en la que X1 es T o I; X2 es D, Y, Q o E; X3 es G, N, S o A; y X4 es cualquier aminoácido natural, o está ausente, a condición de que si X3 es N, entonces X4 debe ser un aminoácido distinto de G o N (SEQ ID NO: 2) ;

c) una región Fc de IgG humana;

en la que el resto C-terminal del agonista del receptor de insulina esta fusionado directamente con el resto N-terminal del segundo enlazador peptídico, y el resto C-terminal del segundo enlazador peptídico esta fusionado directamente con el resto N-terminal de la región Fc de IgG humana.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que:

el análogo de la cadena B de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana en X4 o X5 de SEQ ID NO: 1; y

y el análogo de la cadena A de insulina incluye al menos una modificación de la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana en X1 o X2 de la SEQ ID NO: 2.

3. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que:

el análogo de la cadena B de insulina comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, en la que: X1 es F; X2 es V; X3 es N o D; X4 es E; X5 es H; y

el análogo de la cadena A de insulina comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, en la que: X1 es I o T; X2 es D; X3 es G; y X4 está ausente.

4. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el análogo de la cadena B de insulina comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, en la que X6-X9 son cada uno G.

5. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el primer enlazador peptídico comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

X1 GX2GGGG

en la que X1 es G o está ausente; y X2 es G, S o está ausente (SEQ ID NO: 3).

6. La proteína de fusión de la reivindicación 5, en la que X1 y X2 de SEQ ID NO: 3 son G y S, respectivamente.

7. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el agonista del receptor de insulina tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

8. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el segundo enlazador peptídico comprende un péptido que tiene la secuencia [GGGGX]n

en la que X es Q, E o S; y en en la que n es 2-5.

9. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el segundo enlazador peptídico comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

GGGGX1 GGGGX2GGGGX3GGGGX4X5X6

X1 es Q o E

X2 es Q o E

X3 es Q o E

X4 es G, E, Q o está ausente

X5 es G o está ausente; y

X6 es G o está ausente

(SEQ ID NO:6).

10. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que el segundo enlazador peptídico tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO:7).

11. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la región Fc de IgG humana es una región Fc de una IgG1, IgG2 o IgG4.

12. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que la región Fc de IgG humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.

13. Una proteína de fusión que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

14. Un homodímero de dos proteínas de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

15. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o un homodímero de la reivindicación 14, y al menos un excipiente.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, que comprende además citrato, ácido cítrico, polisorbato 80 y manitol.

17. La composición farmacéutica de la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en la que el pH varía de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,75.

18. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 que comprende además dulaglutida.

19. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para su uso en terapia.

20. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para su uso en el tratamiento de diabetes mellitus.

21. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con dulaglutida, en el tratamiento de diabetes mellitus.

22. El homodímero de la reivindicación 14 para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con dulaglutida, en el tratamiento de diabetes mellitus.

23. Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-13.