UA128549C2 - Антитіло до ctla-4 та його застосування - Google Patents

Антитіло до ctla-4 та його застосування Download PDF

Info

Publication number
UA128549C2
UA128549C2 UAA202202688A UAA202202688A UA128549C2 UA 128549 C2 UA128549 C2 UA 128549C2 UA A202202688 A UAA202202688 A UA A202202688A UA A202202688 A UAA202202688 A UA A202202688A UA 128549 C2 UA128549 C2 UA 128549C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
amino acid
acid sequence
sti
zeo
Prior art date
Application number
UAA202202688A
Other languages
English (en)
Inventor
Хітосі Катада
Хитоси КАТАДА
Канако Тацумі
Канако ТАЦУМИ
Ютака Мацуда
Сюн Сімідзу
Сюн СИМИДЗУ
Масакі Камімура
Масаки Камимура
Ясунорі Коморі
Ясунори Комори
Юдзі Хорі
Юдзи ХОРИ
Томоюкі Ігава
Томоюки ИГАВА
Хірокі Кавауті
Хироки Каваути
Хіроакі Сусуму
Хироаки Сусуму
Original Assignee
Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся
Чугаи Сейяку Кабусики Кайся
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся, Чугаи Сейяку Кабусики Кайся filed Critical Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся
Publication of UA128549C2 publication Critical patent/UA128549C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Винахід належить до антитіл до CTLA-4 та фармацевтичних складів, що їх містять.

Description

Винахід належить до антитіл до СТІ А-4 та фармацевтичних складів, що їх містять.
Галузь техніки
Даний винахід стосується антитіл до СТІ А-4 та способів використання даних антитіл.
Рівень техніки
Клітини, які мутували внаслідок мутації генів і подібного в живих організмах, контролюються та усуваються системою імунного нагляду. Однак тривале збереження надмірних імунних відповідей може стати шкідливим також і для власного організму, як у випадку пошкодження нормальних тканин внаслідок дії аутоїмунітету. Відповідно, імунна система забезпечена механізмом негативного зворотного зв'язку (імунні контрольні точки) для пригнічення імунних реакцій після активації (див., наприклад, МРІ 1). Вважається, що імунні контрольні точки відіграють важливу роль у підтримці гомеостазу в імунній системі. З іншого боку, виявляється, що деякі пухлини використовують імунні контрольні точки для імунної втечі. У даний час ведуться широкомасштабні дослідження імуносупресивної функції, здійснюваної за допомогою молекул, що являють собою основні імунні контрольні точки - молекули асоційованого з цитотоксичними Т-лімфоцитами антигена 4 (СТІ А-4), молекули запрограмованої загибелі клітин 1 (РО-1) та ліганда 1 молекули запрограмованої загибелі клітин (РО-Ї 1).
СТІ А-4 являє собою глікопротеїн, що належить до надродини імуноглобулінів, ген якого був клонований з бібліотеки кКДНК клонів Т-клітин-кілерів, одержаних з мишей, в 1987 році (див., наприклад, МРІ. 2). Т-клітинна імунна відповідь, як відомо, пригнічується за допомогою СТІ А-4.
У 1996 році було показано, що ефект, що полягає у регресії пухлини, спостерігався у разі введення антитіла до СТІ А-4 мишам з раком, що узгоджувалося з ідеєю про те, що сприяння активації Т-клітин шляхом пригнічення функції СТГ А-4 приводить до регресії раку (див., наприклад, МРІ. 3). Оцінка ефективності антитіл до СТІ А-4 у людини проводиться з 2000 року, а моноклональне антитіло до людського СТІ А-4 (іпілімумаб) в 2011 році було схвалене
Управлінням з харчових продуктів і медикаментів США (БЕОА) як перше в світі імуностимулювальне терапевтичне антитіло. Також було одержано багато моноклональних антитіл до СТІ А-4, відмінних від іпілімумабу (див., наприклад, РТ. 1, 2, З і 4), та проводяться роботи з їх розробки як лікарських засобів. Такі лікарські засоби, які інгібують забезпечувану імунними контрольними точками зупинку імуносупресивного механізму, забезпечуючи таким чином підвищення імунореактивності, називаються інгібіторами імунних контрольних точок.
З іншого боку, раніше було відомо, що серед Т-клітин деякі клітини мають імуносупресивну функцію, і у 1995 році вони були ідентифіковані як СО25- та СО4-позитивні Т-клітини та названі регуляторними Т-клітинами (див., наприклад, МРІ 4). У 2003 році був ідентифікований ген
Еохр3, який є головним геном, що специфічно експресується в регуляторних Т-клітинах та регулює їх розвиток і функцію. Бохр3 регулює експресію різних асоційованих з імунною відповіддю генів, таких як фактор транскрипції. Зокрема, Еохр3 залучений до конституційної експресії СТІ А-4 в регуляторних Т-клітинах, та вважається, що він відіграє важливу роль у забезпеченні імуносупресивної функції регуляторних Т-клітин (див., наприклад, МРІ. 5).
Вважається, що інфільтрація пухлинної тканини регуляторними Т-клітинами призводить до ослаблення або інгібування механізму імунного нагляду, спрямованого проти пухлини. Дійсно, було виявлено, що за багатьох карцином людини наявна збільшена кількість регуляторних Т- клітин (див., наприклад, МРІ б), і було показано, що локальна інфільтрація пухлини регуляторними Т-клітинами може стати поганим прогностичним фактором ракового пацієнта. навпаки, якщо регуляторні Т-клітини можуть бути видалені з пухлинних тканин або може бути зменшена їх кількість в пухлинних тканинах, очікується, що це приведе до посилення протипухлинного імунітету. На даний час розвиток імунотерапії раку, спрямованої на регуляторні Т-клітини, інтенсивно прогресує.
Введення антитіла до СТІ А-4, іпілімумабу, забезпечує посилення протипухлинного імунітету, але, як було показано, обумовлює розвиток аутоїмунних захворювань, оскільки забезпечує системне посилення імунореактивності. В одному клінічному випробуванні небажані явища спостерігали у 60 95 пацієнтів, яким вводили іпілімумаб, і багато з них являли собою аутоїмунні захворювання, асоційовані зі шкірою або шлунково-кишковим трактом. Також в іншому клінічному випробуванні було показано, що приблизно у половини пацієнтів, яким вводили іпілімумаб, розвинулися подібні аутоїмунні захворювання. Для пригнічення таких побічних ефектів у деяких випадках пацієнту, якому вводять іпілімумаб, вводять імуносупресивний засіб. Необхідною є розробка нового лікарського засобу, який може забезпечувати збереження протипухлинних імунних відповідей з одночасним пригніченням таких побічних ефектів інгібіторів імунних контрольних точок.
Цитотоксичні ефекторні функції антитіл дос, - активність, що являє собою антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АЮБСС), активність, що являє собою комплементзалежну 60 цитотоксичність (СОС), та активність, що являє собою антитілозалежний клітинний фагоцитоз
(АОСР), - привертають увагу як перспективні засоби для одержання протипухлинних ефектів антитіл (див., наприклад, МРІ. 7 та 8). Ці ефекторні функції індукуються зв'язуванням Ес-ділянки антитіл Їдо з рецепторами антитіл (ЕсуК), присутніми на поверхні ефекторних клітин, таких як природні клітини-кілери та макрофаги, або з різними компонентами системи комплемента. До цього часу проведено багато досліджень варіантів Ес-ділянки та одержано варіанти з різними властивостями, як, наприклад, Есук-зв'язувальною активністю, що є вищою, ніж у дикого типу (див., наприклад, РТІ 5 і 6, МРІ 9 ї 10). Більше того, показано, що Ес-ділянка антитіл зв'язується з ЕсукК у співвідношенні 1:11 і розпізнає ЕсукК асиметрично в нижніх шарнірних ділянках та ділянках СН2 (див., наприклад, МРІ 11). На основі цього також були представлені способи оптимізації взаємодії з ЕсукК шляхом введення різних варіантів змінення у два поліпептидні ланцюги, що утворюють Ес-ділянку антитіла, та одержання асиметричних варіантів Ес-ділянки (див., наприклад, РТІ 7,8,91 10).
Бажано, щоб за введення терапевтичного антитіла в живий організм його антиген-мішень специфічно експресувався тільки в місцях ураження. У багатьох випадках, однак, той самий антиген експресується і в неуражених ділянках, нормальних тканинах, і це може обумовлювати виникнення побічних ефектів, які є небажаними в плані терапії. Наприклад, хоча антитіло до пухлинного антигена може проявляти цитотоксичну активність щодо пухлинних клітин шляхом
АОрСС тощо, якщо той самий антиген також експресується в нормальних тканинах, антитіло може також пошкоджувати нормальні клітини. Для вирішення вищевказаної проблеми була розроблена технологія, яка грунтується на факті, що в тканині-мішені (наприклад, пухлинній тканині) присутня велика кількість певної сполуки, і яка грунтується на створенні антигензв'язувальної молекули, антигензв'язувальна активність якої змінюється в залежності від концентрації сполуки (див., наприклад, РТІ. 11).
Список літературних джерел
Патентна література
ІРТІ 11 УО 2000/037504
ІРТІ 21 УМО 2001/014424
ІРТІ ЗІ УМО 2012/120125
ІРТІ 41 УМО 2016/196237
Зо ІРТІ 510 2000/042072
ІРТІ 6 УМО 2006/019447
ІРТІ Я УМО 2012/058768
ІРТІ 810 2012/125850
ІРТІ 91 УО 2013/002362
ІРТІ 101 МО 2014/104165
ІРТ 111 МО 2013/180200
Непатентна література
ІМРІ. 11 Рагасії, Маї Нем Сапсег (2012) 12: 252-264
ІМР'. 2) Вгипеї еї а)ї., Маїшиге (1987) 328: 267-270
ІМРІ. З| І єасйі єї а)ї., Зсіеєпсе (1996) 271: 1734-1736
ІМРІ. 4 Закадисні еї а!., У Іттипої! (1995) 155: 1151-1164
ІМРІ. 5) ТаКапабвнпі еї а)ї., У Ехр Меа (2000) 192: 303-310
ІМРІ. 6) Мізпікама 4 ЗаКадисні, Іпї У Сапсег (2010) 127: 759-767
ІМРІ. 7| Сіупез вї аї., Ргос Маї! Асаа 5сі ) 5 А (1998) 95: 652-656
ІМРІ. 8) Сіупез вї аї., Маї Меа (2000) 6: 443-446
ІМРІ 9| І алаг єї а!., Ргос Маї! Асаа 5сі 0 5 А (2006) 103: 4005-4010
ІМРІ. 10) Спи еї а!., Мої Іттипої (2008) 45: 3926-3933
ІМРІ. 11) Радаєм вї аї!., У Віої Спет (2001) 276: 16469-16477
Суть винаходу
Технічна задача
У даному винаході представлені антитіла до СТІ А-4 та способів використання даних антитіл. Даний винахід також стосується поліпептидів, що містять варіант Ес-ділянки, та способів одержання поліпептидів.
Вирішення задачі
Більш конкретно, у даному винаході представлені наведені нижче пункти |11| - (47.
МІ Антитіло до СТІА-4, яке характеризується СТІ А-4-зв'язувальною активністю, яка залежить від концентрації аденозинвмісної сполуки, де антитіло має щонайменше одну ознаку, вибрану з наведених нижче (а) -- (і): (а) зв'язувальна активність у присутності 100 мкМ аденозинвмісної сполуки вдвічі або 60 більше перевищує таку за відсутності аденозинвмісної сполуки;
(Б) значення КО в присутності 100 мкМ аденозинвмісної сполуки становить 5 х 107 М або менше; (с) значення КО за відсутності аденозинвмісної сполуки становить 1 х 10 М або більше; (4) утворення потрійного комплексу з аденозинвмісною сполукою та СТІ А-4; (е) зв'язування з ділянкою від амінокислоти в положенні 97 до амінокислоти в положенні 106 людського СТІ А-4 (позаклітинний домен, 5ЕО ІЮ МО: 28); (І) конкуренція з АВАМОО04 (МН, 5ЕО ІО МО: 10; та МІ, 5ЕО ІО МО: 11) за зв'язування з СТІ А- 4; (9) зв'язування з тим самим епітопом, що й зв'язуваний АВАМО04 (УН, 5ЕО ІО МО: 10; та МІ,
ЗЕО ІЮО МО: 11); (п) демонстрація цитотоксичної активності щодо клітини, що експресує СТІ А-4; та (і) зв'язування з СТІ А-4, одержаними від людини та миші. (2) Антитіло за пунктом |1|, де антитіло являє собою моноклональне антитіло.
ІЗ) Антитіло за пунктом || або (2, де антитіло являє собою людське антитіло, гуманізоване антитіло або химерне антитіло.
І4) Антитіло за будь-яким із пунктів (11 - (3), де антитіло являє собою фрагмент антитіла, що зв'язується з СТІ А-4.
ІБ) Антитіло за будь-яким із пунктів (1) - І4), де антитіло містить: (а) НМАК-НІ (5ЕО І МО: 223), що містить амінокислотну послідовність 5Х:ТММ, де Хі являє собою Н, А, К або К; (б)
НМВ-Н2 (5ЕО І МО: 224), що містить амінокислотну послідовність 5І5ЗХ1 х г25Х3МІиМАХаБУХОИ, де Хі являє собою 5 або Т, Хг2 являє собою К або 0, Хз являє собою с або Н, Ха являє собою 0,
Е або Е, та Хо являє собою К або ЕК; та (с) НМК-НЗ (ЗЕО ІО МО: 225), що містить амінокислотну послідовність УОХІВЕОМІ МУРОМ, де Хі являє собою К або А.
ІЄЇ Антитіло за пунктом |5і|, яке додатково містить: (а) НМАК-Г1 (5ЕО ІО МО: 226), що містить амінокислотну послідовність ХХ» ХзМОарУХА х 5МХв, де Хі являє собою Т, О, О або Е, Хо являє собою Т або Р, Хз являє собою О або С, Ха являє собою М або Т, Хо являє собою У або
ММ, та Хв являє собою З або Н; (Б) НУВ-І2 (5ЕБЕО ІО МО: 227), що містить амінокислотну послідовність ХіТХ2 х зКРХа, де Хі являє собою Е, Е або У, Х2 являє собою 5 або І, Хз являє собою К або 5, та Ха. являє собою 5, Е або К; та (с) НМК-ІЗ (ЗЕО ІЮ МО: 228), що містить
Зо амінокислотну послідовність Х. ГТУААРІ СРХ», де Хі являє собою 5 або СО), та Х? являє собою М або Т.
І Антитіло за пунктом (5), яке додатково містить: варіабельний домен важкого ланцюга
ЕК, що містить амінокислотну послідовність під будь-яким із «ЕО ІЮО МО: 229-232; ЕК2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ОО МО: 233; ЕКЗ, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ІЮО МО: 234; та ЕК4, що містить амінокислотну послідовність під зЕО І
МО: 235.
ІВ) Антитіло за пунктом |б6Ї, що додатково містить варіабельний домен легкого ланцюга ЕК, що містить амінокислотну послідовність під будь-яким із ФБЕО ІЮ МО: 236-238; ЕК2, що містить амінокислотну послідовність під будь-яким із 5ЕО ІО МО: 240 та 241; ЕКЗ, що містить амінокислотну послідовність під будь-яким із ЗЕО ІЮ МО: 242-244; та ЕК4, що містить амінокислотну послідовність під будь-яким із ЗЕО ІЮО МО: 245 та 246.
ІФ| Антитіло за будь-яким із пунктів (1| - (4), що містить: (а) послідовність МН, яка характеризується щонайменше 95595 ідентичністю послідовності 3 амінокислотною послідовністю під будь-яким із 5ЕО І МО: 83-86, 98 та 135-141; (р) послідовність МІ, яка характеризується щонайменше 95595 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю під будь-яким із зЗЕО ІЮ МО: 88-95, 97, 99, 134 та 144-149; або (с) послідовність
МН, що містить амінокислотну послідовність під будь-яким із БЕО ІЮ МО: 83-86, 98 та 135-141, та послідовність МІ, що містить амінокислотну послідовність під будь-яким із БЕО ІЮ МО: 88-95, 97, 99, 134 та 144-149. 19) Антитіло за будь-яким із пунктів (1) - (ЗІ) та (5) - ІЗ), яке являє собою повнорозмірне антитіло ЇДО1.
М! Антитіло за пунктом (|10)Ї, де Ес-ділянка являє собою варіант Ес-ділянки, що характеризується наявністю змінення (варіантів змінення) амінокислоти, та де варіант Ес- ділянки характеризується посиленою активністю зв'язування з щонайменше одним рецептором
Есу, вибраним із групи, що складається з ЕсуКіа, ЕсуКіІІа, ЕсукіІїЬ та ЕсукІШа, порівняно з нативною Ес-ділянкою.
І12| Виділена нуклеїнова кислота, що кодує антитіло за будь-яким із пунктів (11 - (111.
П1ЗІ Клітина-хазяїн, що містить нуклеїнову кислоту за пунктом 121.
І14Ї Спосіб одержання антитіла, де спосіб включає культивування клітини-хазяїна за 60 пунктом (13) таким чином, щоб одержати антитіло.
И5Ї Фармацевтичний склад, що містить антитіло за будь-яким із пунктів (1) - (11) та фармацевтично прийнятний носій.
П16Ї Фармацевтичний склад за пунктом (15), де антитіло являє собою імунокон'югат. 7 Фармацевтичний склад за пунктом (|15)| або (16ЄЇ де фармацевтичний склад застосовується в комбінації з щонайменше одним засобом, вибраним із групи, що складається з інгібіторів імунних контрольних точок, інгібіторів ЕСЕК, інгібіторів НЕКЗ2 та хіміотерапевтичних засобів. 181 Фармацевтичний склад за будь-яким із пунктів (15) - (17), де фармацевтичний склад призначений для використання у лікуванні пухлини.
І19| Фармацевтичний склад за пунктом |18), де пухлина являє собою солідну пухлину, яка інфільтрується регуляторними Т-клітинами (Тгед).
І20| Фармацевтичний склад за будь-яким із пунктів (15) - (17), де фармацевтичний склад призначений для використання у пошкодженні клітини. (21| Фармацевтичний склад за будь-яким із пунктів (15) - (17), де фармацевтичний склад призначений для використання у пошкодженні Тгед-клітини. (22) Фармацевтичний склад за пунктом (20)Ї, де пошкодження клітини обумовлено АЮСС- активністю, СОС-активністю або АОСР активністю.
І23)Ї Фармацевтичний склад за пунктом (20) або (211), де імунітет активується пошкодженням
Тгед-клітини. (24 Фармацевтичний склад за будь-яким із пунктів (15) - (17), де фармацевтичний склад призначений для використання у активації імунітету. (25) Фармацевтичний склад за пунктом (241, де активація імунітету являє собою активацію Т- клітини.
І26| Фармацевтичний склад за пунктом (24) або (25), де в пухлинній тканині активується імунітет. (27| Фармацевтичний склад за будь-яким із пунктів (241 - (261, де рівень активації імунітету в непухлинних тканинах є нижчим порівняно з таким у разі фармацевтичного складу, що містить контрольне антитіло до СТІ А-4. (28| Фармацевтичний склад за будь-яким із пунктів (24) - (27), де рівень побічного ефекту є нижчим порівняно з таким у разі фармацевтичного складу, що містить контрольне антитіло до
СТІ А-4.
І29| Фармацевтичний склад за будь-яким із пунктів (24) - (28), де контрольне антитіло до
СТІ А-4 являє собою антитіло до СТІ А-4, яке не має СТІ А-4-зв'язувальної активності, що залежить від концентрації аденозинвмісної сполуки.
ІЗОЇ Фармацевтичний склад за пунктом |29|), де побічний ефект являє собою аутоімунне захворювання.
ІЗ1ТЇ Фармацевтичний склад за будь-яким із пунктів (181, (19) та (261 - ІЗОЇ, де пухлина являє собою рак молочної залози або рак печінки.
ІЗ2Ї Поліпептид, який містить варіант Ес-ділянки, що характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот у вихідній Ес-ділянці, де вихідна Ес-ділянка складається з двох поліпептидних ланцюгів, та де варіант Ес-ділянки характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в наступних положеннях: () положення 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307 та 326 відповідно до нумерації ЕЄО в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки; та (ї) положення 236, 250, 270, 298, 307, 326 та 334 відповідно до нумерації ЄЮ в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
ЇЗЗ| Поліпептид за пунктом І|З2), де варіант Ес-ділянки додатково характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 332 відповідно до нумерації ЕО в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
ІЇЗ4Ї Поліпептид за пунктом ІЗ2| або |З33), де варіант Ес-ділянки додатково характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 332 відповідно до нумерації ЄЮ в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
ЇЗ5|Ї Поліпептид за будь-яким із пунктів (32| - ІЗ4Ї), де варіант Ес-ділянки додатково характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 330 відповідно до нумерації БЮ в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
ЇЗЄЇ Поліпептид за будь-яким із пунктів (32)| - ІЗ5), де варіант Ес-ділянки додатково характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 356 відповідно до нумерації БЮ в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
ЇЗ7| Поліпептид за будь-яким із пунктів (32| - ІЗбЄЇ, де варіант Ес-ділянки додатково характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 366 відповідно до нумерації БЮ в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
ЇЗ8| Поліпептид за будь-яким із пунктів ІЗ2Ї - (37), де варіант Ес-ділянки додатково характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 439 відповідно до нумерації ЄЮ в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
ЇЗ9|Ї Поліпептид за будь-яким із пунктів (32)| - ІЗ8)Ї, де варіант Ес-ділянки додатково характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в положеннях 366, 368 та 407 відповідно до нумерації БО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
Ї4ОЇ Поліпептид за будь-яким із пунктів (32) - |ІЗ9), що характеризується наявністю щонайменше одного змінення амінокислоти, вибраного з наступних варіантів змінення амінокислот: () Туг або Ре в положенні 234, СіІп в положенні 235, Тгр в положенні 236, Меї в положенні 239, Ма! в положенні 250, Авр в положенні 268, Си в положенні 270, АІа в положенні 298, Рго в положенні 307, Азр в положенні 326, Сім в положенні 332, Суз в положенні 349, І уз в положенні 356 та Тгр в положенні 366 відповідно до нумерації ЕЮО в першому поліпептиді вихідної Ес- ділянки; та (ії) АІа в положенні 236, Ма! в положенні 250, Сім в положенні 270, Аа в положенні 298, Рго в положенні 307, Ар в положенні 326, Меї або І уз в положенні 330, Азр або Си в положенні 332,
Сі в положенні 334, Суз в положенні 356, б5ег в положенні 366, АІа в положенні 368, Маї в положенні 407 та Сі в положенні 439 відповідно до нумерації ЄЮ в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
Ї41| Поліпептид за будь-яким із пунктів (32)| - |І40Ї, де варіант Ес-ділянки додатково характеризується наявністю будь-якої з наведених нижче варіантів змінення амінокислот (а) - (4) в першому поліпептиді та/або другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки: (а) АІа в положенні 434 відповідно до нумерації ЕО; (Б) Аіа в положенні 434, Тиг в положенні 436, Агуд в положенні 438 та Си в положенні 440 відповідно до нумерації ЕО; (с) Геи в положенні 428, Аа в положенні 434, Тпг в положенні 436, Агу в положенні 438 та
Сім в положенні 440 відповідно до нумерації ЕМ; та (4) Геи в положенні 428, АІа в положенні 434, Агуд в положенні 438 та Сім в положенні 440 відповідно до нумерації ЕО.
І42)Ї Поліпептид за будь-яким із пунктів |З21 - (41, де активність зв'язування із щонайменше одним рецептором Есу, вибраним із групи, що складається з ЕсукКІа, ЕсукКПа, ЕсукКіїЬ та
ЕсукШа, посилюється у варіанті Ес-ділянки порівняно з такою у вихідній Ес-ділянці.
І43Ї Поліпептид за пунктом |42), де активність зв'язування із ЕсукКІїа та ЕсукШа є посиленою у разі варіанта Ес-ділянки порівняно з такою у разі вихідної Ес-ділянки.
Ї44| Поліпептид за будь-яким із пунктів ІЗ2| - І43)Ї, де селективність між активувальним рецептором Есу та інгібувальним рецептором Есу є поліпшеною у разі варіанта Ес-ділянки порівняно з такою у разі вихідної Ес-ділянки.
І45) Поліпептид за пунктом (44), де активувальний рецептор Есу являє собою щонайменше один рецептор Есу, вибраний з групи, що складається з ЕсуКіа, ЕсуКПа та ЕсукШа, та де інгібувальний рецептор Есу являє собою ЕсукІ!/рБ.
І46Ї Поліпептид за будь-яким із пунктів ІЗ21 - 145), де поліпептид, що містить варіант Ес- ділянки являє собою антитіло.
І47| Спосіб одержання поліпептиду, що містить варіант Ес-ділянки, при цьому спосіб включає введення варіантів змінення амінокислот у вихідну Ес-ділянку, де вихідна Ес-ділянка складається з двох поліпептидних ланцюгів, та де варіанти змінення вводять в наступні положення: () положення 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307 та 326 відповідно до нумерації ЕЄО в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки; та (ї) положення 236, 250, 270, 298, 307, 326 та 334 відповідно до нумерації ЄЮ в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
Стислий опис графічних матеріалів
На фіг. 1 показано активність зв'язування антитіла до СТІ А-4, АВАМОО4, з СТІ А-4, при цьому активність зв'язування залежить від концентрації АТФ, АДФ або АМФ, як описано в прикладі 1-9.
На фіг. 2 показано активність зв'язування антитіла до СТІ А-4, АВАМОО4, з клітинами, що експресують СТІ А-4, при цьому активність зв'язування залежить від концентрації АМФ, як 60 описано в прикладі 1-10.
На фіг. З показано АЮСсС-активність антитіла до СТІ А-4, АВАМО04, щодо клітин, що експресують СТІ А-4, в присутності та за відсутності АМФ, як описано в прикладі 1-11.
На фіг. 4 показано схему зв'язування БРаб-фрагмента АВАМО04 та АМФ, як описано в прикладі 2-13. На даній фігурі важкий ланцюг антитіла позначений чорним, легкий ланцюг - сірим, а АМФ - кулестержневою моделлю. Амінокислотні залишки, що забезпечують взаємодію з АМФ, позначені у стержневій моделі. Пунктирні лінії та їх значення вказують на відстань (А) між кожним амінокислотним залишком та АМФ.
На фіг. 5 показано схему зв'язування Еар-фрагмента АВАМО04, АМФ та людського СТІ А4 (нСтТІАЯ4), як описано в прикладі 2-14. На даній фігурі важкий ланцюг антитіла позначений чорним, легкий ланцюг - сірим, СТГ А4 - білим, а АМФ - кулестержневою моделлю.
Амінокислотні залишки ПСТІА4, що містять один або більше відмінних від водню атомів, розташованих на відстані не більше 4,2 А від будь-якої частини антитіла або АМФ, прийняті як епітоп і позначені у стержневій моделі.
На фіг. б показано картування епітопу Раб-фрагмента АВАМО04 в амінокислотній послідовності НЯСТІ А4, як описано в прикладі 2-14. На даній фігурі амінокислотні залишки, позначені чорним, являють собою залишки СТІ А4, що містять один або більше відмінних від водню атомів, розташованих на відстані не більше 4,2 А від будь-якої частини АВАМО04 або
АМФ в кристалічній структурі. Амінокислотні залишки, позначені сірим, демонструють залишки, модель яких не була побудована, оскільки вони були невпорядковані в кристалічній структурі.
Фіг. 7 являє собою накладену фігуру структур антитіла та АМФ, екстрагованих з кристалічних структур Габ-фрагмента АВАМО04 окремо, комплексу Габ-фрагмента АВАМООХЯ і
АМФ та потрійного комплексу Гар-фрагмента АВАМО0О4, АМФ та СТІ А4, як описано в прикладі 2-15. На даній фігурі важкий ланцюг антитіла позначений чорним, легкий ланцюг - сірим, а АМФ - кулестержневою моделлю. Структура Гар-фрагмента АВАМО04 окремо позначена тонкою лінією, структура бінарного комплексу з АМФ - лінією середньої товщини, а структура потрійного комплексу - товстою лінією.
На фіг. 8 показано активність зв'язування антитіла до СТІ А-4, АВАМОО4, та його варіанта 04НО150/041 0072 з СТІ А-4, при цьому активність зв'язування залежить від концентрації АТФ,
АДФ або АМФ, як описано в прикладі 3-2. У позначеннях на даній фігурі МУ/УТ та Н1501 072 вказані як АВАМО04 та 04НО150/041 0072 відповідно.
На фіг. 9 показано нейтралізувальну активність антитіла до СТІ А-4, 5МУ/1077, щодо СТІ А-4, при цьому нейтралізувальна активність залежить від концентрації АТФ, як описано в прикладі 3- б.
На фіг. 10 показано протипухлинний ефект антитіла до СТІ А-4, тМ5-тЕа55 (контрольного антитіла), в моделі на мишах, яким здійснювали трансплантацію лінії клітин ЕМЗА, як описано в прикладі 3-7-4. Антитіло вводили у дозі 0,01 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,25 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг, 30 мг/кг та 100 мг/кг в хвостову вену. Кожна точка представляє середній об'єм пухлини для групи, п-:4.
На фіг. 11 показано протипухлинний ефект антитіла до СТІ А-4, 5М/1208-тРЕа55 (антитіла з перемиканням класу), в моделі на мишах, яким здійснювали трансплантацію лінії клітин ЕМЗА, як описано в прикладі 3-7-4. Антитіло вводили у дозі 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг та 500 мг/кг в хвостову вену. Кожна точка представляє середній об'єм пухлини для групи, п-4.
На фіг. 12 показані зміни у співвідношенні ефекторних Тгед-клітин в пухлині за введення антитіла до СТІ А-4, тМ5-тЕРаб55 (контрольного антитіла), або 5УУ1208-тРа55 (антитіла з перемиканням класу) в моделі на мишах, яким здійснювали трансплантацію лінії клітин ЕМЗА, як описано в прикладі 3-7-7. тМ5-тЕа5»5 вводили у дозі 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг та 100 мг/кг в хвостову вену та 5ММ1208-тРа55 вводили у дозі 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг та 500 мг/кг в хвостову вену. Пухлину збирали через шість днів після введення та оцінювали збільшення або зменшення вмісту ефекторних Тгед за допомогою ЕАС5-аналізу. По осі ординат відкладено співвідношення ефекторних Тгтед (СО4РохРЗ3"КІ АС1) та СО45: клітин. Показано середнє значення для п-3.
На фіг. 13 показані зміни у співвідношенні активованих хелперних Т-клітин в селезінці за введення антитіла до СТІ А-4, тМ5-тЕРаб55 (контрольного антитіла), або ЗУМУ1208-тЕРа55 (антитіла з перемиканням класу) в моделі на мишах, яким здійснювали трансплантацію лінії клітин ЕМЗА, як описано в прикладі 3-7-8. тМ5-тЕа»з5 вводили у дозі 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг та 100 мг/кг в хвостову вену та 5МУ1208-тРа55 вводили у дозі 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг та 500 мг/кг в хвостову вену. Селезінку збирали через шість днів після введення та оцінювали збільшення або зменшення вмісту активованих хелперних Т-клітин за допомогою
ЕАСб-аналізу. По осі ординат відкладено співвідношення активованих хелперних Т-клітин (брая-Рохру3-"СбО53) та СО45: клітин. Показано середнє значення для п-3.
На фіг. 14 показано протипухлинний ефект антитіла до СТІ А-4, 5М/1389-тРа55 (антитіла з перемиканням класу), в моделі на мишах, яким здійснювали трансплантацію лінії клітин Нера1- 6/пОРСЗ, як описано в прикладі 4-3-5. Антитіло вводили у дозі 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг та 100 мг/кг в хвостову вену. Кожна точка представляє середній об'єм пухлини для групи, п-4.
На фіг. 15 показано протипухлинний ефект антитіла до СТІ А-4, НМ5-тРа55 (контрольного антитіла), в моделі на мишах, яким здійснювали трансплантацію лінії клітин Нера1-6/пСРСЗ, як описано в прикладі 4-3-5. Антитіло вводили у дозі 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг та 30 мг/кг в хвостову вену. Кожна точка представляє середній об'єм пухлини для групи, п-4.
На фіг. 16 показані зміни у співвідношенні ефекторних Тгед-клітин в пухлині за введення антитіла до СТІ А-4, ПМ5-тЕа55 (контрольного антитіла), або ЗУУ1389-тЕРаб55 (антитіла з перемиканням класу) в моделі на мишах, яким здійснювали трансплантацію лінії клітин Нера1- б/ЛОРСЗ, як описано в прикладі 4-3-8. НМ5-тЕа55 вводили у дозі 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг та 30 мг/кг та 5М/1389-тЕа55 вводили у дозі 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг та 500 мг/кг в хвостову вену. Пухлину збирали через шість днів після введення та оцінювали збільшення або зменшення вмісту ефекторних Тгед за допомогою РАСзЗ-аналізу. По осі ординат відкладено співвідношення ефекторних Тгед (СО4"РохРЗ3"ССтНо" КІ АС17) та СО45: клітин. Показано середнє значення для п-3.
На фіг. 17 показані зміни у співвідношенні активованих хелперних Т-клітин в селезінці за введення антитіла до СТІ А-4, ПМ5-тЕРаб55 (контрольного антитіла), або ЗМУ1389-тЕа55 (антитіла з перемиканням класу) в моделі на мишах, яким здійснювали трансплантацію лінії клітин Нера1-6/поРСЗ, як описано в прикладі 4-3-9. ИМ5-тРа55 вводили у дозі 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг та 30 мг/кг та 5М/У1389-тРа55 вводили у дозі 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг та 500 мг/кг в хвостову вену. Селезінку збирали через шість днів після введення та оцінювали збільшення або зменшення вмісту активованих хелперних Т-клітин за допомогою ЕАСзЗ-аналізу.
По осі ординат відкладено співвідношення активованих хелперних Т-клітин (СО4Рохр3СО 5) та СО45: клітин. Показано середнє значення для п-3.
На фіг. 18 показано протипухлинний ефект антитіла до СТІ А-4, 5М/1610-тРа55 (антитіла з перемиканням класу), в моделі на мишах, яким здійснювали трансплантацію лінії клітин Нера1- б6/пОРСЗ, як описано в прикладі 5-4-5. Антитіло вводили у дозі 0,3 мг/кг, 1 мг/кг та З мг/кг в хвостову вену. Кожна точка представляє середній об'єм пухлини для групи, п:5.
На фіг. 19 показано протипухлинний ефект антитіла до СТІ А-4, 5М/1612-тРа55 (антитіла з перемиканням класу), в моделі на мишах, яким здійснювали трансплантацію лінії клітин Нера1- 6/пОРСЗ, як описано в прикладі 5-4-5. Антитіло вводили у дозі 0,3 мг/кг, 1 мг/кг та З мг/кг в хвостову вену. Кожна точка представляє середній об'єм пухлини для групи, п-5.
На фіг. 20 показано протипухлинний ефект антитіла до СТІ А-4, 5М/1615-тРа55 (антитіла з перемиканням класу), в моделі на мишах, яким здійснювали трансплантацію лінії клітин Нера1- 6/пОРСЗ, як описано в прикладі 5-4-5. Антитіло вводили у дозі 0,3 мг/кг, 1 мг/кг та З мг/кг в хвостову вену. Кожна точка представляє середній об'єм пухлини для групи, п-5.
На фіг. 21 показані зміни у співвідношенні ефекторних Тгед-клітин в пухлині за введення антитіла до СТІ А-4, 5М/1610-тЕРаб55, 5М/1612-тРаб55 або 5УМ1615-тЕРа55 (всі з яких є антитілами з перемиканням класу), в моделі на мишах, яким здійснювали трансплантацію лінії клітин Нера1-6/поРСЗ, як описано в прикладі 5-4-8. 5М/1610-тРа55 вводили у дозі 50 мг/кг, 100 мг/кг та 200 мг/кг, ХМ/1612-тРа55 вводили у дозі 50 мг/кг, 100 мг/кг та 200 мг/кг, 5-М/1615-тЕа55 вводили у дозі 50 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг та 400 мг/кг і антитіло негативного контролю, КІ Н- тЕа55, вводили у дозі 400 мг/кг в хвостову вену. Пухлину збирали через шість днів після введення та оцінювали збільшення або зменшення вмісту ефекторних Тгтед за допомогою
ЕАС5-аналізу. По осі ординат відкладено співвідношення ефекторних Тгед (СО0О4-РохР3 СС
КІ ВаИа1) та СО45: клітин. Показано середнє значення для п-3.
На фіг. 22 показані зміни у співвідношенні активованих хелперних Т-клітин в селезінці за
БО введення антитіла до СТІ А-4, 5М/1610-тРа5б5, 5М/1612-тЕРа55 або 5М/1615-тРаб55 (всі з яких є антитілами з перемиканням класу), в моделі на мишах, яким здійснювали трансплантацію лінії клітин Нера1-6/поРСЗ, як описано в прикладі 5-4-9. 5М/1610-тРа55 вводили у дозі 50 мг/кг, 100 мг/кг та 200 мг/кг, ХМ/1612-тРа55 вводили у дозі 50 мг/кг, 100 мг/кг та 200 мг/кг, 5-М/1615-тЕа55 вводили у дозі 50 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг та 400 мг/кг і антитіло негативного контролю, КІ Н- тЕа55, вводили у дозі 400 мг/кг в хвостову вену. Селезінку збирали через шість днів після введення та оцінювали збільшення або зменшення вмісту активованих хелперних Т-клітин за допомогою ЕАС5-аналізу. По осі ординат відкладено співвідношення активованих хелперних Т- клітин (СО4Рохр3-"1СбО57) та СО45: клітин. Показано середнє значення для п-3.
На фіг. 23 показано порівняння іп мйго АЮОСб-активності антитіл, що містять різні змінені 60 константні ділянки з посиленим зв'язуванням з ЕсуК, як описано в прикладі 6-2. У позначеннях на даній фігурі (901 представляє МОХ1001Н-С1т/МОХ1001І-КОМТ, САБОАЦІЕ представляє
МОХТОрІнН-сСАБОАГІЕ/МОХ10011І-КОМТ, АКТб представляє МОХ1001Н-Кп462/МОХ1001 Н-
НІ445/МОХ10011-КОМТ, та АКТ8 представляє МОХ10О001Н-Кп461/МОХ1001 Н-НІ443/МОХ10011 -
КОМТ. У даному випадку Ідс1 являє собою антитіло, що містить контрольну константну ділянку,
САБОАМЦІЕ являє собою антитіло, що містить константну ділянку, описану у посиланні на попередній рівень техніки, а АКТб та АКТ8 являють собою антитіла, що містять змінену константну ділянку, одержані в прикладі 6-1.
На фіг. 24 показано порівняння іп міо АЮСР-активності антитіл, що містять різні змінені константні ділянки з посиленим зв'язуванням з ЕсуК, як описано в прикладі 6-3. У позначеннях на даній фігурі (9061 представляє МОХ10О01Н-СТ т/МОХ1001І-КОМТ, САЗОІЕ представляє
МОХТОр1нН-сСАБОІЕ/МОХ1О01І-КОМТ, АКТб представляє МОХ1001Н-Кп462/МОХ1001 Н-
НІ445/МОХ10011-КОМТ, та АКТ8 представляє МОХ10О001Н-Кп461/МОХ1001 Н-НІ443/МОХ10011 -
КОМТ. У даному випадку Ідс1 являє собою антитіло, що містить контрольну константну ділянку,
САБОІЕ являє собою антитіло, що містить константну ділянку, описану у посиланні на попередній рівень технікию, а АКТб та АКТ8 являють собою антитіла, що містять змінену константну ділянку, одержані в прикладі 6-1.
На фіг. 25 показано іп міо АОСб-активність антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу,
ЗМ/1389-АКТб, що містить змінену константну ділянку, з посиленим зв'язуванням з Есук, як описано в прикладі 6-4.
На фіг. 26 показано іп міо АОСб-активність антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу,
ЗМ1610-АКТб, що містить змінену константну ділянку, з посиленим зв'язуванням з Есук, як описано в прикладі 6-4.
На фіг. 27 показано іп міо АОСб-активність антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу,
ЗМ1612-АКТб6, що містить змінену константну ділянку, з посиленим зв'язуванням з Есук, як описано в прикладі 6-4.
На фіг. 28 показано нейтралізувальну активність антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу,
ЗУУ1389, щодо СТІ А4 (активність, що полягає у припиненні передачі сигналу СТІ А4, дія якого на активацію ефекторних клітин має інгібувальний характер), як описано в прикладі 6-5.
На фіг. 29 показано нейтралізувальну активність антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу,
ЗММ1610, щодо СТІ А (активність, що полягає у припиненні передачі сигналу СТІ А4, дія якого на активацію ефекторних клітин має інгібувальний характер), як описано в прикладі 6-5.
На фіг. 30 показано нейтралізувальну активність антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу,
ЗУУ1612, щодо СТІ А4 (активність, що полягає у припиненні передачі сигналу СТІ А4, дія якого на активацію ефекторних клітин має інгібувальний характер), як описано в прикладі 6-5.
На фіг. 31 показано нейтралізувальну активність антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу,
ЗУУ1615, щодо СТІ А4 (активність, що полягає у припиненні передачі сигналу СТІ А4, дія якого на активацію ефекторних клітин має інгібувальний характер), як описано в прикладі 6-5.
На фіг. 32 показано цитотоксичну активність іп міго антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу, ЗМ/1389-АКТ5-АСТІ, щодо СТІ А4-позитивних регуляторних Т-клітин, як описано в прикладі 6-6.
На фіг. 33 показано цитотоксичну активність іп міго антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу, ЗМ/1389-АКТ6-АСТІ, щодо СТІ А4-позитивних регуляторних Т-клітин, як описано в прикладі 6-6.
На фіг. 34 показано цитотоксичну активність іп міго антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу, 5ЗУММ1610-АКТ5-АСТІ, щодо СТІ А4-позитивних регуляторних Т-клітин, як описано в прикладі 6-6.
На фіг. 35 показано цитотоксичну активність іп міго антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу, ЗМ/1610-АКТ6-АСТІ, щодо СТІ А4-позитивних регуляторних Т-клітин, як описано в прикладі 6-6.
Опис варіантів здійснення
Методики та процедури, які описані або на які посилаються в даному документі, як правило, добре зрозумілі та зазвичай використовуються із застосуванням загальноприйнятої методології фахівцями в даній галузі, як, наприклад, широко використовувані методології, описані в наступних літературних джерелах: Затрбгоок еї аї., Моіесшаг Сіопіпд: А І арогаїогу Мапиаї! Зга еайоп (2001) Соїа 5ргіпа Натог І арогаїогу Ргезз5, Соїй 5ргіпу Натбог, М.М.; Ситепі Ргоїосої!5 іп
Моїесшіаг Віоіоду (Е.М. А!йзирбеї, еї аї. едв., (2003)); серія Меїодз іп Еп7утоїіоду (Асадетіс Ргезв,
Іпс.): РСВ 2: А Ргасіїса! Арргоасі (М.У. МасРНегзоп, В.О. Натез апа с... Тауїог едв. (1995)),
Напом апа ІГапе, едз5. (1988) Апіїрбодівєх, А Іарогаїюту Мапиа!ї, апа Апіта! СеїЇ Сийиге (В..
Егезппеу, єа. (1987)); Оіїдописіеоіїіде бупіпезів (М.). Сай, ей. 1984); Меїйод5 іп Моїіесшаг 60 Віоіоду, Нитапа Ргезвз; СеїЇ Віоіоду: А І арогагюгу Моїеросок (У.Е. СеїЇї5, єд., 1998) Асадетіс Ргевв;
Апіта! Сеїї Сийиге (В.І. Егезппеу), еа., 1987); Іпітодисійоп (о СеїЇ апа Тізвие Сийиге (9. Р. Маїпег апа Р.Е. Робетгіз, 1998) Ріепит Ргез5; СеїЇ апа Тіззие Сийшге: І арогаїгу Ргоседигез (А. Ооуїе,
У.В. апнййне, апа 0.03. МемеїЇ, ейд5., 1993-68) У. ММпеу апа опе; НапароокК ої Ехрегітепіаї!
Ітітипоїоду (О.М. МУєїг апа 0.0. ВіасКууеїЇ, еадв.); Сепе ТгапеїТег Месіог5 ог Матітаїїап Сеїїв ().М.
МіПег апа М.Р. Саїпов, едв5., 1987); РСВ: Тне Роїутегазе Спаїіп Веасійп, (Миїїв еї аї., еавз., 1994);
Ситепі Ргоїосої5 іп Іттипоіоду (У.Е. Соїїдап еї а!., едв., 1991); Зноп Ргоїосої!в5 іп Моїесшціаг Віоїоду (УУпеу апа 5опвз, 1999); ІттипобіоІоду (С.А. Удапеулау апа Р. Тгамегв, 1997); Апіїродієв (Р. Ріпси, 1997); Апіїродіеєє: А Ргасіїсаї Арргоасп! (О. Сайу., ед., ІВ Ргез5, 1988-1989); Мопосіопаї
Апіїбодієв: А Ргасіїса! Арргоасі (Р. Зперпега апа с. Овєап, єадв., Охіога Опімегейу Ргевв5, 2000);
Овіпуд Апіїбодієв: А І арогаїогу Мапиа! (Е. Напож апа 0. Гапе, Соїй 5ргіпд Нагог Іарогаїогу
Ргезз5, 1999); Тне Апііродіеєз (М. 7апейі апа 9. О. Сарга, ед5., Наглосд Асадетіс РибіїзНегв, 1995); та Сапсег: Ргіпсіріеє апа Ргасіїсе ої Опсоіоду (М.Т. ОеМмпа еї аї., еадв5., 9У.В. Іірріпсої
Сотрапу, 1993).
Ї. ВИЗНАЧЕННЯ
Якщо не зазначено інше, технічні та наукові терміни, що використовуються в даному документі, мають те саме значення, що зазвичай розуміється фахівцем у галузі, до якої належить даний винахід. 5іпдієїп еї аї!., Оісіопагу ої Містобіоїоду апа Моїіесшіаг Віоіоду 2па еад.,
У. ММпПеу « Зоп5 (Мем/ МоїК, М.У. 1994), та Магсі, Адмапсей Огдапіс Спетівзігу Кеасійопв,
Меспапізтвз апа бігисіште 4 ей., донп Уміеу 5 Зоп5 (Мем МогК, М.У. 1992) забезпечує фахівця в даній галузі загальними рекомендаціями щодо багатьох термінів, застосовуваних в даній заявці.
Всі посилання, цитовані в даному документі, включаючи патентні заявки та публікації, включені в даний документ шляхом посиланням в повному своєму обсязі.
Для цілей інтерпретації даного винаходу застосовуються наступні визначення, і коли це доречно, терміни, що використовуються в однині, також передбачають множину і навпаки. Слід зазначити, що використовувана в даному документі термінологія призначена виключно для опису конкретних варіантів здійснення і не призначена для обмеження. У тому випадку, якщо будь-яке визначення, викладене нижче, суперечить будь-якому документу, включеному в даний документ за допомогою посилання, визначення, наведене нижче, матиме переважну силу. "Акцепторна каркасна ділянка людини" для цілей даного документу являє собою каркасну ділянку, що містить амінокислотну послідовність каркасної ділянки варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) або каркасної ділянки варіабельного домену важкого ланцюга (МН), одержану з каркасної ділянки імуноглобуліну людини або консенсусної каркасної ділянки людини, як визначено нижче. Акцепторна каркасна ділянка людини, "одержана з" каркасної ділянки імуноглобуліну людини або консенсусної каркасної ділянки людини, може містити ту саму її амінокислотну послідовність або може містити зміни амінокислотної послідовності. У деяких варіантах здійснення кількість амінокислотних змін становить 10 або менше, 9 або менше, 8 або менше, 7 або менше, б або менше, 5 або менше, 4 або менше, 3 або менше, або 2 або менше. У деяких варіантах здійснення акцепторна каркасна ділянка М людини має ідентичну послідовність з послідовністю каркасної ділянки МІ імуноглобуліну людини або з послідовністю консенсусної каркасної ділянки людини. "Антитілозалежна клітинно-опосередкована цитотоксичність" або "АЮСС" стосується форми цитотоксичності, за якої секретований імуноглобулін, зв'язаний з Ес-рецепторами (ЕсК), наявними на певних цитотоксичних клітинах (наприклад, МкК-клітинах, нейтрофілах і макрофагах), дає змогу цим цитотоксичним ефекторним клітинам специфічно зв'язуватися з клітиною-мішенню, що несе антиген, і згодом знищувати клітину-мішень цитотоксинами. Основні клітини, завдяки яким відбувається АЮСС, МК-клітини, експресують тільки ЕсумІї, тоді як моноцити експресують ЕсукіІ, ЕсукІ! та ЕсукП. Експресія БСК на гемопоетичних клітинах узагальнена в таблиці З на сторінці 464 в Камеїсн апа Кіпеї, Аппи. Кеу. Іттипої! 9: 457-92 (1991). Для оцінки АОСсС-активності молекули, що становить інтерес, можна здійснити аналіз
АОС іп міїго, такий як аналіз, описаний у патентах США Мо 5500362 або Мо 5821337, або в патенті США Мо 6737056 (Ргезіа). Застосовні ефекторні клітини для таких аналізів включають
РВМС і МК-клітини. Альтернативно або додатково АЮСС-активність молекули, що становить інтерес, можна оцінити іп мімо, наприклад в моделі на тваринах, такій як розкрита в Сіупез еї аї.
РМАБ (ОА) 95: 652-656 (1998). "Цитотоксична активність" включає, наприклад, активність, що являє собою антитілозалежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (АЮОСС), як зазначалося вище, активність, що являє собою комплементзалежну цитотоксичність (СОС), як зазначалося нижче, та активність, що являє собою опосередковану Т-клітинами цитотоксичність. СОС-активність означає цитотоксичну активність системи комплемента. З іншого боку, АЮСсС-активність означає 60 активність, за якої антитіло зв'язується з антигеном, присутнім на клітинній поверхні клітини-
мішені, і далі з антитілом зв'язується ефекторна клітина, і як наслідок ефекторна клітина пошкоджує клітину-мішень. Чи має антитіло, що становить інтерес, АОСсС-активність і чи має антитіло, що становить інтерес, СОС-активність, можна виміряти за допомогою відомих способів (наприклад, Сигтепі Ргоїосої5 іп Іттипоіоду, глава 7, Іттипоїодіс зіцаїез іп питапв, під редакцією Соїїдап еї а!. (1993)). "Нейтралізувальна активність" стосується активності антитіла, що полягає в інгібуванні деякої біологічної активності шляхом зв'язування з молекулою, що залучена до біологічної активності. У деяких варіантах здійснення біологічна активність забезпечується зв'язуванням між лігандом і рецептором. У певних варіантах здійснення антитіло інгібує зв'язування між лігандом та рецептором шляхом зв'язування з лігандом або з рецептором. Антитіла, що мають таку нейтралізувальну активність, називаються нейтралізувальними антитілами.
Нейтралізувальну активність певної досліджуваної речовини можна виміряти шляхом порівняння біологічної активності в присутності ліганду між умовами присутності та відсутності досліджуваної речовини.
Термін "антитілозалежний клітинний фагоцитоз" або "АДОСР" означає процес, за якого всі або частина клітин, вкритих антитілом, включається в фагоцитарні імунні клітини (наприклад, макрофаги, нейтрофіли та дендритні клітини), які зв'язуються з Ес-ділянкою імуноглобуліну.
Термін "активність зв'язування" означає силу загальної суми нековалентних взаємодій між одним або більше зв'язувальними сайтами молекули (наприклад, антитіла) та її партнера за зв'язуванням (наприклад, антигена). У даному документі "активність зв'язування" не обмежується лише взаємодією 1:1 між представниками пари зв'язування (наприклад, антитілом та антигеном). Наприклад, якщо для учасників пари зв'язування притаманна одновалентна взаємодія 1:1, зв'язувальну активність називають внутрішньою афінністю зв'язування
Сафінністю"). Якщо учасник пари зв'язування здатний і до одновалентного, і до полівалентного зв'язування, зв'язувальна активність є сумою кожної сили зв'язування. Активність зв'язування молекули Х з її партнером У зазвичай може бути представлена константою дисоціації (КО) або як "зв'язана кількість аналіту на одиницю кількості ліганду". Активність зв'язування можна виміряти загальноприйнятими способами, відомими в даній галузі, у тому числі описаними в даному документі. Конкретні ілюстративні та зразкові варіанти здійснення для вимірювання активності зв'язування описані нижче.
Термін "зріла афінність" антитіла стосуються антитіла з одним або більше варіантами змінення в одній або більше гіперваріабельних ділянках (НМК) порівняно з вихідним антитілом, яке не містять таких варіантів змінення, при цьому такі варіанти змінення забезпечують у результаті поліпшення афінності антитіла щодо антигена.
Терміни "антитіло до СТІ А-4" та "антитіло, яке зв'язується з СТІ А-4", стосуються антитіла, здатного зв'язувати СТІ А-4 з достатньою афінністю, таким чином, що антитіло є застосовним як діагностичний та/або терапевтичний засіб для націлювання на СТІ А-4. В одному варіанті здійснення ступінь зв'язування антитіла до СТІ А-4 з неспорідненим відмінним від СТІ А-4 білком становить менше ніж приблизно 10 95 зв'язування антитіла з СТІ А-4, за вимірювання, наприклад, за допомогою радіоіїмунологічного аналізу (КІА). У певних варіантах здійснення антитіло, що зв'язується з СТІ А-4, має константу дисоціації (КО), що становить 1 мкМ або менше, 100 нМ або менше, 10 нМ або менше, 1 нм або менше, 0,1 нМ або менше, 0,01 нМ або менше, або 0,001 нМ або менше (наприклад, 109 М або менше, наприклад від 1039 М до 10-73 М, наприклад від 10 М до 10-13 М). У певних варіантах здійснення антитіло до СТІ А-4 зв'язується з епітопом СТІ А-4, який є консервативним у СТГ А-4 з різних видів.
Термін "антитіло" у даному документі використовується в його найширшому значенні і охоплює різні структури антитіл, у тому числі без обмеження моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, поліспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла) і фрагменти антитіл, за умов, що вони проявляють необхідну антигензв'язувальна активність. "Фрагмент антитіла" стосується молекули, відмінної від інтактного антитіла, що містить частину інтактного антитіла, яка зв'язує антиген, з яким зв'язується інтактне антитіло. Приклади фрагментів антитіл включають без обмеження Ем, Раб, Бар, Баб'-5Н, Каб)»; діатіла; лінійні антитіла; молекули одноланцюгових антитіл (наприклад, 5сЕм) і поліспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. "Антитіло, що зв'язується з тим самим епітопом", що і еталонне антитіло, стосується антитіла, яке блокує зв'язування еталонного антитіла з його антигеном у конкурентному аналізі, наприклад, на 50 95 або більше, та/або еталонне антитіло блокує зв'язування антитіла з його антигеном у конкурентному аналізі, наприклад, на 50 95 або більше. Зразковий конкурентний аналіз представлено в даному документі.
"Аутоїмунне захворювання" стосується незлоякісного захворювання або порушення, які виникають у власній тканині індивідуума і спрямовані проти неї. Аутоїмунні захворювання в даному документі конкретно не включають злоякісні або ракові захворювання або стани, зокрема не включають В-клітинну лімфому, гострий лімфобластний лейкоз (АГ), хронічний лімфоцитарний лейкоз (СІ), волосатоклітинний лейкоз і хронічний мієлобластний лейкоз.
Приклади аутоїмунних захворювань або порушень включають без обмеження запальні реакції, такі як запальні захворювання шкіри, включаючи псоріаз і дерматит (наприклад, атопічний дерматит); системну склеродермію і склероз; реакції, пов'язані з запальними захворюваннями кишківника (такі як хвороба Крона і виразковий коліт); респіраторний дистрес-синдром (включаючи респіраторний дистрес-синдром дорослих; АКО5); дерматит; менінгіт; енцефаліт; увеїт; коліт; гломерулонефрит; алергічні стани, такі як екзема й астма та інші стани, що включають інфільтрацію Т-клітинами та хронічні запальні реакції; атеросклероз; дефіцит адгезії лейкоцитів; ревматоїдний артрит; системний червоний вовчак (ЗЕ) (в тому числі без обмеження вовчаковий нефрит, вовчак шкіри); цукровий діабет (наприклад, цукровий діабет типу І або інсулінзалежний цукровий діабет); розсіяний склероз; синдром Рейно; аутоїмунний тиреоїдит; тиреоїдит Хашимото; алергічний енцефаломієліт; синдром Шегрена; підлітковий діабет та імунні реакції, асоційовані з гострою і затриманою гіперчутливістю, опосередкованою цитокінами і Т-лімфоцитами, які зазвичай виявляють у разі туберкульозу, саркоїдозу, поліміозиту, грануломатозу та васкуліту; перніціозну анемію (хворобу Аддісона); захворювання, що включають лейкоцитарний діапедез; запальний розлад центральної нервової системи (ЦНС); синдром поліорганної недостатності; гемолітичну анемію (включаючи без обмеження кріоглобулінемію або гемолітичну анемію з позитивним тестом Кумбса); міастенію гравіс; опосередковані комплексом антиген-антитіло захворювання; захворювання з утворенням антитіл до базальної мембрани клубочків; антифосфоліпідний синдром; алергічний неврит; хворобу Грейвса; міастенічний синдром Ламберта-Ітона; бульозний пемфігоїд; пемфігус; аутоїмунні поліендокринопатії; хворобу Рейтера; синдром м'язової скутості; хворобу Бехчета; гігантоклітинний артеріїт; імунокомплексний нефрит; нефропатію ІдА-типу; опосередковані дм полінейропатії; імунну тромбоцитопенічну пурпуру (ІТП) або аутоїмунну тромбоцитопенію.
Терміни "рак" та "раковий" стосуються фізіологічного стану у ссавців, який зазвичай характеризується нерегульованим ростом/проліферацією клітин, або описують такий. Приклади раку включають рак молочної залози та рак печінки.
Термін "комплементзалежна цитотоксичність" або "СОС" означає механізм індукції загибелі клітин, в якому ефекторний Ес-домен антитіла, зв'язаний з мішенню, активує ряд ферментативних реакцій, в результаті чого утворюються отвори в мембрані клітини-мішені. Як правило, комплекс антиген-антитіло, що утворюється на клітині-мішені, зв'язується і активує компонент С14 системи комплемента, який в свою чергу активує каскад системи комплементу і приводить до загибелі клітини-мішені. Більше того, активація комплементу може також привести до осадження компонентів системи комплемента на поверхні клітини-мішені, що приводить до зв'язування з рецепторами комплемента (наприклад, СКЗ) на лейкоцитах і тим самим сприяє
АОРСО. "Хіміотерапевтичний засіб" стосується хімічної сполуки, застосовної у лікуванні раку.
Приклади хіміотерапевтичних засобів включають алкілувальні засоби, такі як тіотепа і циклофосфамід (СУТОХАМ (зареєстрована торгова марка)); алкілсульфонати, такі як бусульфан, імпросульфан і піпосульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбоквон, метуредопа та уредопа; етиленіміни і метилолмеламіни, включаючи алтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід і триметиломеламін; ацетогеніни (конкретно булатацин і булатацинон); дельта-9-тетрагідроканабінол (дронабінол, МАКІМОЇГ (зареєстрована торгова марка)); бета-лапахон; лапахол; колхіцини; бетулінову кислоту; камптотецин (включаючи синтетичний аналог топотекан (НУСАМТІМ (зареєстрована торгова марка)), СРТ-11 (іринотекан, САМРТО5АК (зареєстрована торгова марка)), ацетилкамптотецин, скополектин і 9- амінокамптотецин); бріостатин; калістатин; СОС-1065 (включаючи його синтетичні аналоги адозелезин, карцелезин і бізелезин); подофілотоксин; подофілінову кислоту; теніпозид; криптофіцини (зокрема криптофіцин 1 та криптофіцин 8); доластатин; дуокарміцин (включаючи синтетичні аналоги КМ/-2189 і СВ1-ТМ'І1); елеутеробін; панкратистатин; саркодиктиїн; спонгістатин; азотисті іприти, такі як хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорофосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамін, мехлоретаміну оксиду гідрохлорид, мелфалан, новембіхін, фенестерин, преднімустин, трофосфамід, урациловий іприт; нітрозосечовину, таку як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин і ранімустин; антибіотики, такі як енедіїнові антибіотики (наприклад, каліхеаміцин, конкретно каліхеаміцин гамма 11 і каліхеаміцин бо омега І1 (див., наприклад, Місоїаои еї аіЇ., Апдемж. Спет Іпії. Еа. Еподі., 33: 183-186 (1994));
СОРЗ23, пероральний інгібітор альфа-4-інтегрину; динеміцин, включаючи динеміцин А; еспераміцин; а також неокарзиностатин хромофор і пов'язані з ним хромопротеїнові енедіїнові антибіотики-хромофори), аклациномізини, актиноміцин, антраміцин, азазазерин, блеоміцини, кактиноміцин, карубіцин, карміноміцин, карцинофілін, хромоміцини, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, б-діазо-5-оксо-І -сорлейцин, доксорубіцин (включаючи АОКІАМУ СІМ (зареєстрована торгова марка), морфоліно-доксорубіцин, ціаноморфоліно-доксорубіцин, 2- піроліно-доксорубіцин, ліпосомну форму для ін'єкції доксорубіцину НСІ (БОХІ!. (зареєстрована торгова марка)), ліпосомний доксорубіцин ТІ С 0-99 (МУОСЕТ (зареєстрована торгова марка)), пегільований ліпосомний доксорубіцин (САЕЇМХ (зареєстрована торгова марка)) і дезоксидоксорубіцин), епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, такі як мітоміцин С, мікофенолову кислоту, ногаламіцин, олівоміцини, пепломіцин, порфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидин, убенімекс, зиностатин, зорубіцин; антиметаболіти, такі як метотрексат, гемцитабін (СЕМ2АК (зареєстрована торгова марка)), тегафур (ШЕТОКАЇ (зареєстрована торгова марка)), капецитабін (ХЕ ОБА (зареєстрована торгова марка)), епотілон і 5-фторурацил (5-ЕУ); аналоги фолієвої кислоти, такі як диноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурину, такі як рлударабін, б-меркаптопурин, тіаміприн, тіогуанін; аналоги піримідину, такі як анцитабін, азацитидин, б-азауридин, кармофур, цитарабін, дидезоксиуридин, доксифлуридин, еноцитабін, флоксуридин; андрогени, такі як калустерон, дромостанолону пропіонат, епітіостанол, мепітіостан, тестолактон; засоби, що пригнічують функції надниркових залоз, такі як аміноглютетимід, мітотан, трилостан; засоби для поповнення вмісту фолієвої кислоти, такі як фролінова кислота; ацеглатон; альдофосфамідний глікозид; амінолевулінову кислоту; енілурацил; амсакрин; бестрабуцил; бісантрен; едатрексат; дефофамін; демеколцин; діазиквон; елфорнітин; еліптинію ацетат; епотилон; етоглюцид; нітрат галію; гідроксисечовину; лентинан; лонідамін; майтанзиноїди, такі як майтанзин і ансамітоцини; мітогуазон; мітоксантрон; мопідамол; нітраерин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; лозоксантрон; 2-етилгідразид; прокарбазин; РОК (зареєстрована торгова марка) полісахаридний комплекс (Н5 Маїсгаї
Ргодисі5, Юджин, Орегон); разоксан; ризоксин; сизофіран; спірогерманій; тенуазонову кислоту; триазиквон; 2,2",2'-трихлортриетиламін; трихотецени (особливо токсин Т-2, веракурин А, роридин А і ангуїдин); уретан; віндезин (ЕСОІ5ІМЕ (зареєстрована торгова марка)), РІСОЄ5ІМ (зареєстрована торгова марка)); дакарбазин; маномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид ("Ага-С"); тіотепу; таксоїд, наприклад, паклітаксел (ТАХОЇ. (зареєстрована торгова марка)), склад паклітакселу на основі одержаних генноінженерним способом з альбуміну наночастинок (АВКАХАМЕ М) та доцетаксел (ТАХОТЕРЕ (зареєстрована торгова марка)); хлорамбуцил; б-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; засоби на основі платини, такі як цисплатин, оксаліплатин (наприклад, ЕГОХАТІМ (зареєстрована торгова марка)) і карбоплатин; препарати з барвінку, які запобігають полімеризації тубуліну з утворення мікротрубочок, включаючи вінбластин (МЕ ВАМ (зареєстрована торгова марка)), вінкристин (ОМСОМІМ (зареєстрована торгова марка), віндезин (ЕГОІ5ІМЕ (зареєстрована торгова марка),
РІГОЕЗІМ (зареєстрована торгова марка)) та вінорелбін (МАМЕЇ ВІМЕ (зареєстрована торгова марка)); етопозид (МР-16); іфосфамід; мітоксантрон; лейковорин; новантрон; едатрексат; дауноміцин; аміноптерин; ібандронат; інгібітор топоїзомерази КЕ5 2000; дифторметилорнітин (ОМЕО); ретиноїди, такі як ретиноєва кислота, в тому числі бексаротен (ТАКСНВЕТІМ (зареєстрована торгова марка)); бісфосфонати, такі як клодронат (наприклад, ВОМЕРО5З (зареєстрована торгова марка) або О5ТАС (зареєстрована торгова марка)), етидронат (ПІОКОСАЇ (зареєстрована торгова марка), МЕ-58095, золедронову кислоту/золедронат (7ОМЕТА (зареєстрована торгова марка)), алендронат (ГОБАМАХ (зареєстрована торгова марка)), памідронат (АКЕОСІА (зареєстрована торгова марка)), тилудронат (ЗКЕГІЮ (зареєстрована торгова марка)) або ризедронат (АСТОМЕЇ (зареєстрована торгова марка)); троксацитабін (1,3-діоксолановий нуклеозидний аналог цитозину); антисмислові олігонуклеотиди, зокрема ті, що інгібують експресію генів в сигнальних шляхах, залучених в аберантну проліферацію клітин, такі як, наприклад, РКС-альфа, Каї, Н-Ка5 і рецептор епідермального фактора росту (ЕСЕ-К); вакцини, такі як вакцина ТНЕКАТОРЕ (зареєстрована торгова марка) та вакцини на основі генної терапії, наприклад, вакцина АГГОМЕСТІМ (зареєстрована торгова марка), вакцина ГЕОМЕСТІМ (зареєстрована торгова марка) та вакцина
МАХІО (зареєстрована торгова марка); інгібітор топоізомерази 1 (наприклад, ІШАЕТОТЕСАМ (зареєстрована торгова марка)); гтКН (наприклад, АВАКЕІХ (зареєстрована торгова марка));
ВАУ439006 (сорафеніб; Вауег); 50-11248 (сунітиніб, ЗОТЕМТ (зареєстрована торгова марка),
Ріїгег); перифозин, інгібітор СОХ-2 (наприклад, целекоксиб або еторикоксиб), інгібітор 60 протеосом (наприклад, Р5З341); бортезоміб (МЕЇ САБЕ (зареєстрована торгова марка)); ССІ-779;
тіпіфарніб (К11577); сорафеніб, АВТ510; інгібітор Всі-2, такий як облімерсен натрію (СЕМАБЕМЗЕ (зареєстрована торгова марка)); піксантрон; інгібітори ЕСЕК (див. визначення нижче); інгібітори тирозинкінази (див. визначення нижче); інгібітори серинтреонінкінази, такі як рапаміцин (сиролімус, КАРАМИМЕ (зареєстрована торгова марка)); інгібітори фарнезилтрансферази, такі як лонафарніб (ЗСН 6636, 5ЗАКАБАК"М); і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якої з наведених вище сполук; а також комбінації двох або більше зазначених вище сполук, наприклад, СНОР - абревіатура для позначення комбінованого терапевтичного засобу на основі циклофосфаміду, доксорубіцину, вінкристину та преднізолону; і РОЇРОХ - абревіатура для позначення схеми лікування оксаліплатином (ЕГОХАТІМТМ) в поєднанні з 5-РШ і лейковорином.
Термін "химерне" антитіло стосується антитіла, в якому частина важкого та/або легкого ланцюгів походить із певного вихідного матеріалу або виду, у той час як залишок важкого та/або легкого ланцюга походить з іншого вихідного матеріалу або виду.
Термін "клас" антитіла стосується типу константного домену або константної ділянки, які містяться в його важкому ланцюзі. Існує п'ять основних класів антитіл: ІдА, дО, ІДЕ, Ідс та І9М, і деякі з них можна додатково поділити на підкласи (ізотипи), наприклад Ідс1, Ідс2, доз, Ідо4,
ІДАТ та ІдА2. Константні домени важкого ланцюга, які відповідають різним класам імуноглобулінів, називаються а, б, є, у та М відповідно.
Термін "цитотоксичний засіб", як він використовується у даному документі, стосується речовини, яка пригнічує клітинну функцію або запобігає їй та/(або викликає загибель або руйнування клітин. Цитотоксичні засоби включають без обмеження радіоактивні ізотопи (наприклад, 2"АЇ, 1911, 125|, з0у, 186Де, 188Ще, 15351т, 212Ві, гр, 212рРЬ та радіоактивні ізотопи Гц); хіміотерапевтичні засоби або лікарські засоби (наприклад, метотрексат, адріаміцин, алкалоїди барвінку (вінкристин, вінбластин, етопозид), доксорубіцин, мелфалан, »мітоміцин С, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалювальні засоби); засоби, що інгібують ріст; ферменти та їх фрагменти, такі як нуклеолітичні ферменти; антибіотики; токсини, такі як низькомолекулярні токсини або ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, у тому числі їх фрагменти та/або їх варіанти; і різні хіміотерапевтичні засоби, розкриті вище. "Ефекторні клітини" стосуються лейкоцитів, що експресують один або більше ЕсК та виконують ефекторні функції. У певних варіантах здійснення клітини експресують щонайменше
ЕсуУКІ! ота виконують ефекторну функцію(функції) АЮОСС. (Приклади лейкоцитів, які опосередковують АЮСС, включають мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМО), природні клітини-кілери (МК), моноцити, цитотоксичні Т-клітини та нейтрофіли. Ефекторні клітини можуть бути виділені з природних вихідних матеріалів, наприклад з крові. У певних варіантах здійснення ефекторні клітини можуть являти собою ефекторні клітини людини. "Ефекторні функції" стосуються тих видів біологічної активності, які пов'язані з Ес-ділянкою антитіла, яка залежить від ізотипу антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіл включають: зв'язування Сід та комплементзалежну цитотоксичність (СОС); зв'язування Ес-рецептора; антитілозалежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (АОСС); антитілозалежний клітинно- опосередкований фагоцитоз (АДОСР); пригнічувальну дію щодо рецепторів клітинної поверхні (наприклад, рецепторів В-клітин) і активацію В-клітин.
Термін "епітоп" включає будь-яку детермінанту, здатну бути зв'язаною антитілом. Епітоп являє собою ділянку антигена, яка зв'язується антитілом, що спрямоване на антиген, і містить специфічні амінокислоти, які безпосередньо контактують з антитілом. Детермінанти епітопу можуть включати хімічно активні поверхневі групи молекул, такі як амінокислоти, бічні ланцюги цукру, фосфорильні або сульфонільні групи, і можуть мати специфічні тривимірні структурні характеристики та/або специфічні характеристики заряду. Як правило, антитіла, специфічні щодо певного антигена-мішені, переважно розпізнають епітоп на антигені-мішені в складній суміші білків та/"або макромолекул.
Термін "Ес-рецептор"' або "БСК" стосується рецептора, який зв'язується з Ес-ділянкою антитіла. У деяких варіантах здійснення БСК являє собою нативний БСК людини. У деяких варіантах здійснення ЕсК є таким, що зв'язує антитіло дб (гамма-рецептор) і включає рецептори підкласів ЕСуУКіІ, ЕСсуКіІІ та ЕсукКІ, у тому числі алельні варіанти та альтернативно сплайсовані форми цих рецепторів. Рецептори ЕсукКіІ! включають ЕсукІІА ("активувальний рецептор") і ЕсуКІІВ ("інгібувальний рецептор"), які мають подібні амінокислотні послідовності, що відрізняються головним чином своїми цитоплазматичними доменами. Активувальний рецептор ЕсукІІА містить у своєму цитоплазматичному домені імунорецепторний тирозиновий активувальний мотив (ІТАМ). Інгібувальний рецептор ЕсукіїВ містить у своєму 60 цитоплазматичному домені імунорецепторний тирозиновий інгібувальний мотив (ІТІМ). (Див.,
наприклад, публікацію Юаегоп, Аппи. Кеу. Іттипої. 15: 203-234 (1997)). Огляд ЕсК наведено, наприклад, у публікаціях Камеїсі апа Кіпеї, Аппи. Кеу. Іттипої 9: 457-492 (1991); Сареї! еї аї.,
Іттипотеїйнод3з 4: 25-34 (1994); та де Нааз егаї., 9. І аб. Сііп. Меа. 126: 330-341 (1995). Інші ЕсК, включно з тими, які будуть ідентифіковані в майбутньому, охоплюються в даному документі терміном "ЕСЕ".
Термін "Ес-рецептор" або "БСК" також включає неонатальний рецептор, ЕсКп, який відповідає за передачу материнських Ідс плоду (Сиуег еї аї., У. Іттипої. 117: 587 (1976); та Кіт еї аї.,, 9. Іттипої. 24: 249 (1994)) та регуляцію гомеостазу імуноглобулінів. Відомі способи вимірювання зв'язування з ЕсКп (див., наприклад, СПеїйе апа У/ага., Іттипої. Тодау 18(12): 592- 598 (1997); СНеїїіе еї аї., Маїште ВіоїесппоІоду, 15(7): 637-640 (1997); Ніпюп еї аї., у. Віої. Спет. 279(8): 6213-6216 (2004); У/О 2004/92219 (Нітоп еї а!.)).
Зв'язування з ЕсКп людини іп мімо та час напівжиття в сироватці крові поліпептидів з високою афінністю зв'язування ЕсКп людини можна аналізувати, наприклад, на трансгенних мишах або в трансфікованих лініях клітин людини, що експресують ЕсКп людини, або на приматах, яким вводять поліпептиди з варіантом Ес-ділянки. У М/О 2000/42072 (Ргезіа) описано варіанти антитіл з поліпшеним або зменшеним зв'язуванням з ЕсК. Див. також, наприклад,
Зп» еї а!., у. Віої. Снет. 9(2): 6591-6604 (2001).
Термін "Ес-ділянка" у даному документі використовується для визначення С-кінцевої ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну, яка містить щонайменше частину константної ділянки. Термін охоплює Ес-ділянки нативної послідовності та варіанти Ес-ділянок. В одному варіанті здійснення
Ес-ділянка важкого ланцюга ІдсСс людини простягається від Суз226 або від Рго230 до карбоксильного кінця важкого ланцюга. Однак, можуть бути наявними або відсутніми С-кінцевий лізин (І уз447) або гліцин-лізин (СІу446-І уз447) Ес-ділянки. Якщо в даному документі не вказано інше, нумерація амінокислотних залишків у Ес-ділянці або константній ділянці відповідає системі нумерації ЕЕ), яка також називається індексом ЕЕ), як описано в КарБаї єї аїЇ., хХедоепсе5 ої Ргоївїн5 ої Іттипоїіодіса! Іпіегеві, Бій Ей. Рибріїс Неайй 5егмісе, Маїйопаї! Іпзійшевз ої Неай,
Веїпезаа, МО, 1991.
Термін "антитіло, що містить Ес-ділянку" стосується антитіла, яке містить Ес-ділянку. С- кінцевий лізин (залишок 447 згідно з системою нумерації ЕМ) або С-кінцевий гліцин-лізин (залишки 446-447) Рс-ділянки можна видалити, наприклад, під час очищення антитіла або за допомогою рекомбінантної інженерії нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло. Відповідно композиція, що містить антитіло, яке має Ес-ділянку, відповідно до даного винаходу, може містити антитіло з 5446-К447, з 5446 і без К447, з усіма видаленими 5446-К447 або суміш трьох типів антитіл, описаних вище.
Терміни "варіабельна ділянка" або "варіабельний домен" стосуються домену важкого або легкого ланцюга антитіла, який залучений до зв'язування антитіла з антигеном. Варіабельні домени важкого та легкого ланцюгів (МН і МІ. відповідно) нативного антитіла зазвичай мають подібні структури, причому кожен домен містить чотири консервативні каркасні ділянки (ЕК) і три гіперваріабельні ділянки (НМК) (див., наприклад, Кіпаї еї аї., Киру Іттипоіоду, 6" єй., М.Н.
Егеетап апа Со., сторінка 91 (2007). Одного домену МН або МІ може бути достатньо для надання антигензв'язувальної специфічності. Крім того, антитіла, які зв'язують певний антиген, можуть бути виділені з використанням домену МН або У. з антитіла, яке зв'язує антиген, для скринінгу бібліотеки комплементарних доменів МІ. або УН відповідно. Див., наприклад, Ропоїапо еї аї., У. Іттипої. 150: 880-887 (1993); Сіакзоп еї а!., Майте 352: 624-628 (1991). "Каркасна ділянка" або "РК" стосується залишків варіабельних доменів, відмінних від залишків гіперваріабельної ділянки (НМК). ЕК варіабельного домену зазвичай складається з чотирьох доменів ЕК: ЕК, ЕК2, ЕКЗ та ЕК4. Відповідно, послідовності НМК та ЕК зазвичай розташовані в такій послідовності в МН (або М): ЕК1-НІ(І11)-ЕН2-На(І2)-ЕНЗ-НЗІ(І 3)-ЕВА.
Терміни "повнорозмірне антитіло", "іІнтактне антитіло" та "повне антитіло" використовуються в даному документі як взаємозамінні для позначення антитіла, що має структуру, по суті подібну до структури нативного антитіла, або має важкі ланцюги, які містять Ес-ділянки, визначені у даному документі. "Функціональна Ес-ділянка" має "ефекторну функцію" Ес-ділянки нативної послідовності.
Зразкові "ефекторні функції! включають зв'язування Сід; СОС; зв'язування Ес-рецептора;
АОСС; фагоцитоз; пригнічувальну дію щодо рецепторів клітинної поверхні (наприклад, рецептора В-клітин; ВСК) тощо. Такі ефекторні функції, як правило, вимагають, щоб Ес-ділянка була об'єднана зі зв'язувальним доменом (наприклад, варіабельним доменом антитіла), і їх можна оцінювати за допомогою різних аналізів, які розкриваються, наприклад, у розділі "Визначення" в даному документі.
"Людське антитіло" являє собою антитіло, що має амінокислотну послідовність, яка відповідає послідовності антитіла, що виробляється в організмі людини або в клітині людини, або одержаного з донорного організму, відмінного від людського, в якому використовується репертуар людських антитіл або інші антитіло-кодувальні послідовності людини. Це визначення людського антитіла, зокрема, виключає гуманізоване антитіло, що містить антигензв'язувальні залишки, відмінні від людських. "Людська консенсусна каркасна ділянка" являє собою каркасну ділянку, в якій представлені амінокислотні залишки, що найбільш розповсюджені у вибірці послідовностей каркасних ділянок
МІ. або МН імуноглобуліну людини. Як правило, вибірка послідовностей Мі або МН імуноглобуліну людини одержана з підгрупи послідовностей варіабельних доменів. Зазвичай підгрупа послідовностей являє собою підгрупу, описану в КаБбаї еї аїІ., ЗХедоепсев ої Ргоївіп5 ої
Іттипоіодісаї! Іпіегезі, п'яте видання, публікації МІН 91-3242, Бетесда, Меріленд (1991), томи 1- 3. В одному варіанті здійснення для МІ. підгрупою є підгрупа кі відповідно до описаного у Кабаї ех ам. вище. В одному варіанті здійснення для МН підгрупою є підгрупа І відповідно до описаного у Кабаї еїгаї. вище. "Гуманізоване" антитіло стосується химерного антитіла, що містить амінокислотні залишки із
НМЕК, відмінних від людських, та амінокислотні залишки із ЕК людини. У певних варіантах здійснення гуманізоване антитіло буде містити по суті всі зі щонайменше одного і, як правило, двох варіабельних доменів, в яких усі або по суті всі НМК (наприклад, СОК) відповідають НУК антитіла, відмінного від людського, і всі або по суті всі ЕК відповідають людському антитілу.
Гуманізоване антитіло необов'язково може містити щонайменше частину константної ділянки антитіла, одержану з людського антитіла. "Гуманізована форма" антитіла, наприклад, антитіло, відмінне від людського, стосується антитіла, яке піддали гуманізації.
Термін "гіперваріаабельна ділянка" або "НМ", використовуваний у даному документі, стосується кожної з ділянок варіабельного домену антитіла, які є гіперваріаабельними в послідовності ("ділянки, що визначають комплементарність" або "СОК"), і/або утворюють структурно визначені петлі ("тіперваріабельні петлі"), і/або містять залишки, що контактують з антигеном ("антигенні контакти"). Як правило, антитіла включають шість НМЕ: три в МН (НІ, Н2,
НЗ) і три в МІ (11, 12, Г3). Приклади НУК у даному документі включають:
Зо (а) гіперваріабельні петлі, утворені амінокислотними залишками 26-32 (І 1), 50-52 (І 2), 91-96 (13), 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) та 96-101 (НЗ) (Споїйіа апа І езкК, У). Мої. Віо!. 196: 901-917 (1987)); (Б) СОК, утворені амінокислотними залишками 24-34 (І 1), 50-56 (І 2), 89-97 (І 3), 31-356 (НІ), 50-65 (Н2) та 95-102 (НЗ) (Кабаї евї а!., Зедиепсез ої Ргоївїіп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, Бій Еа.
Рибіїс Неанцй 5егуісе, Маїйопаї! Іпзійшез ої Неайй, Веїйезаа, МО (1991)); (с) антигенні контакти, утворені амінокислотними залишками 27с-36 (І 1), 46-55 (І 2), 89-96 (13), 30-355Б (НІ), 47-58 (Н2) та 93-101 (НЗ) (МасСаїшт еї а!., У. Мої. Вісі. 262: 732-745 (1996)); і (а) комбінації (а), (5) та/або (с), в тому числі амінокислотні залишки НМК 46-56 (І 2), 47-56 (12), 48-56 (12), 49-56 (І 2), 26-35 (НІ), 26-355Б (НІ), 49-65 (Нг), 93-102 (НЗ) і 94-102 (НЗ).
Якщо не зазначено інше, залишки НМК та інші залишки у варіабельному домені (наприклад, залишки ЕК) у даному документі нумеруються відповідно до КаБбаї єї а). вище. "Імунокон'югат" являє собою антитіло, кон'юговане з однією або більше гетерологічними молекулами, у тому числі без обмеження цитотоксичним засобом. "Виділене" антитіло є антитілом, яке було відокремлене від компонента його природного середовища. У деяких варіантах здійснення антитіло очищають до чистоти, що становить більше 95 95 або 99 95, визначеної, наприклад, за допомогою електрофоретичних (наприклад,
ЗО5-РАСЕ, ізоелектричного фокусування (ІЕЕ), капілярного електрофорезу) або хроматографічних способів (наприклад, іонообмінної або обернено-фазової НРІ С). Для огляду способів оцінки чистоти антитіл див., наприклад, Ріайтап еї аїЇ., ). Спготаїйодг. В 848: 79-87 (2007). "Виділена" нуклеїнова кислота стосується молекули нуклеїнової кислоти, відокремленої від компонента її природного середовища. Виділена нуклеїнова кислота включає молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься в клітинах, які зазвичай містять молекулу нуклеїнової кислоти, але молекула нуклеїнової кислоти наявна позахромосомно або в місці розташування в хромосомі, яке відрізняється від її природного місця розташування в хромосомі. "Виділена нуклеїнова кислота, що кодує антитіло" стосується однієї або більше молекул нуклеїнових кислот, що кодують важкі та легкі ланцюги антитіл (або їх фрагменти), у тому числі такої молекули(молекул) нуклеїнової кислоти в одному векторі або окремих векторах, і такої молекули(молекул) нуклеїнової кислоти, присутньої в одному або більше місцях у клітині- хазяїні.
Використовуваний у даному документі термін "вектор" стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної забезпечувати розмноження іншої нуклеїнової кислоти, до якої вона приєднана. Цей термін включає вектор як структуру нуклеїнової кислоти, що реплікується самостійно, а також вектор, вбудований у геном клітини-хазяїна, в яку він був уведений. Деякі вектори здатні спрямовувати експресію нуклеїнових кислот, до яких вони функціонально приєднані. Такі вектори в даному документі позначають як "вектори експресії".
Терміни "клітина-хазяїн", "лінія клітин-хазяїв" і "культура клітин-хазяїв" використовуються як взаємозамінні і стосуються клітин, в які введена екзогенна нуклеїнова кислота, у тому числі потомства таких клітин. Клітини-хазяї включають "трансформанти" і "трансформовані клітини", які включають первинну трансформовану клітину та потомство, одержане з неї, незалежно від кількості пересівів. За вмістом нуклеїнової кислоти потомки можуть бути не повністю ідентичними материнській клітині, але можуть містити мутації. У даний документ включено мутантне потомство, яке має ту саму функцію або біологічну активність, що й відібране шляхом скринінгу або селекції у вихідної трансформованої клітини.
Термін "моноклональне антитіло", використовуваний у даному документі, стосується антитіла, одержаного з популяції по суті однорідних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають популяцію, є ідентичними та/або зв'язують один і той самий епітоп, за винятком можливих варіантів антитіл, наприклад, що містять мутації, які існують у природі, або виникають під час одержання препарату моноклонального антитіла, такі варіанти, як правило, наявні в незначних кількостях. На відміну від препаратів поліклональних антитіл, які зазвичай включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло препарату моноклональних антитіл спрямоване проти однієї детермінанти на антигені. Таким чином, модифікатор "моноклональний" вказує на характер антитіла, одержаного з по суті однорідної популяції антитіл, і не повинен тлумачитися як такий, що потребує одержання антитіла будь-яким конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, які будуть використовуватися відповідно до даного винаходу, можуть бути створені за допомогою різних методик, у тому числі без обмеження гібридомної методики, методики рекомбінантної ДНК, методики фагового дисплею та методик, що передбачають використання трансгенних тварин, які містять усі або частину локусів імуноглобуліну людини, при цьому такі методики й інші зразкові методики одержання моноклональних антитіл описані в даному документі. "Голе антитіло" стосується антитіла, яке не є кон'югованим з гетерологічним фрагментом (наприклад, цитотоксичним фрагментом) або радіоактивною міткою. Голе антитіло може бути присутнім у фармацевтичному складі. "Нативні антитіла" стосуються природних молекул імуноглобулінів з різними структурами.
Наприклад, нативні антитіла (9 являють собою гетеротетрамерні глікопротеїни розміром приблизно 150000 дальтон, що складаються з двох однакових легких ланцюгів та двох однакових важких ланцюгів, які зв'язані дисульфідним зв'язком. У напрямку від М- до С-кінця кожний важкий ланцюг містить варіабельну ділянку (МН), яку також називають доменом варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельним доменом важкого ланцюга, за якою слідують три константні домени (СНІ, СН2 їі СНЗ). Подібним чином, у напрямку від М- до С-кінця кожний легкий ланцюг містить варіабельну ділянку (МІ), яку також називають доменом варіабельної ділянки легкого ланцюга або варіабельним доменом легкого ланцюга, за якою слідує домен константної ділянки легкого ланцюга (СІ). Легкий ланцюг антитіла може бути віднесений до одного з двох типів, названих каппа (к) і лямбда (А), на підставі амінокислотної послідовності його константного домену. "Го-ділянка нативної послідовності" передбачає амінокислотну послідовність, ідентичну амінокислотній послідовності Ес-ділянки, яку виявляють у природі. Людські Ес-ділянки нативної послідовності включають Ес-ділянку нативної послідовності людського Їдс1 (алотипів, відмінних від А, та алотипів А); Ес-ділянку нативної послідовності людського Ід2; Ес-ділянку нативної послідовності людського ДОЗ та Ес-ділянку нативної послідовності людського Ідся, а також їх природні варіанти. "Варіант Ес-ділянки" передбачає амінокислотну послідовність, яка відрізняється від такої Ес- ділянки нативної послідовності щонайменше однією амінокислотною модифікацією (зміненням), переважно однією або більше амінокислотними замінами. Переважно, варіант Ес-ділянки характеризується наявністю щонайменше однієї амінокислотної заміни порівняно з Ес-ділянкою нативної послідовності або з Ес-ділянкою вихідного поліпептиду, наприклад наявністю від приблизно однієї до приблизно десяти амінокислотних замін та переважно від приблизно однієї до приблизно п'яти амінокислотних замін в Ес-ділянці нативної послідовності або в Ес-ділянці вихідного поліпептиду. Варіант Ес-ділянки в даному документі переважно характеризується 60 щонайменше приблизно 80 95 гомологією з Ес-ділянкою нативної послідовності та/або з Ес-
ділянкою вихідного поліпептиду, більш переважно щонайменше приблизно 90 95 гомологією з ними та найбільш переважно щонайменше приблизно 95 95 гомологією з ними. «Відсоткова (95) ідентичність амінокислотних послідовностей" щодо еталонної поліпептидної послідовності визначається як відсоткова частка амінокислотних залишків у кандидатній послідовності, які є ідентичними амінокислотним залишкам у еталонній поліпептидній послідовності, після вирівнювання послідовності та введення гепів, якщо це необхідно, для досягнення максимального значення відсоткової ідентичності послідовності та без урахування будь-яких консервативних замін як частини ідентичності послідовностей. Вирівнювання з метою визначення відсоткової ідентичності амінокислотних послідовностей може бути досягнуто різними способами, які відомі фахівцеві в даній галузі, наприклад із використанням загальнодоступного комп'ютерного програмного забезпечення, такого як ВІ А5Т, ВІ А5Т-2,
АСОМ, програмне забезпечення Медаїїдп (ОМА5БТАК) або СЕМЕТУХ (зареєстрована торгова марка) (Сепеїух Со., Ца.). Фахівці в даній галузі техніки можуть визначати відповідні параметри для вирівнювання послідовностей, у тому числі будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання вздовж усієї довжини порівнюваних послідовностей.
Комп'ютерна програма для порівняння послідовностей АГ ІОМ-2 була створена компанією
Сепепіесі, Іпс., а вихідний код був поданий разом із документацією користувача у Соругідні
ОПісе, США, Вашингтон, округ Колумбія, 20559, де вона зареєстрована під реєстраційним номером США ТХИ510087. Програма АГІОМ-2 є загальнодоступною від Сепепіесі, Іпс.,
Південний Сан-Франциско, Каліфорнія, або її можна скласти з вихідного коду. Програма АГІСМ- 2 повинна бути складена для використання в операційній системі ОМІХ, у тому числі в цифровій
ОМІХ М4.00. Усі параметри порівняння послідовностей задаються програмою АГІОМ-2 і не змінюються.
У випадках, коли АГІОМ-2 використовується для порівняння амінокислотних послідовностей,
Фо ідентичності амінокислотної послідовності для певної амінокислотної послідовності А щодо певної амінокислотної послідовності В, з нею або відносно неї (що альтернативно можна сформулювати як "певна амінокислотна послідовність А, яка характеризується конкретним 95 ідентичності амінокислотної послідовності щодо певної амінокислотної послідовності В, з нею або відносно неї, або передбачає такий 95 ідентичності"), обчислюється наступним чином: 100-кратна частка Х/У, де Х являє собою кількість амінокислотних залишків, визначених як однакові програмою вирівнювання послідовностей АГІОМ-2 за вирівнювання А та В у цій програмі, і де У являє собою загальну кількість амінокислотних залишків у В. Буде зрозуміло, що якщо довжина амінокислотної послідовності А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності В, 90 ідентичності амінокислотних послідовностей за порівняння А з В не дорівнюватиме 95 ідентичності амінокислотних послідовностей за порівняння В з А. Якщо не вказано інше, усі значення 95 ідентичності амінокислотних послідовностей, що використовуються в даному документі, одержуються, як описано у попередньому параграфі, за допомогою комп'ютерної програми АГІСМ-2.
Термін "фармацевтичний склад" стосується препарату, який має таку форму, що дозволяє біологічній активності активного інгредієнта, який міститься в ньому, бути ефективною і який не містить додаткових компонентів, неприйнятно токсичних для суб'єкта, якому буде вводитися склад. "Індивідуум" або "суб'єкт" є ссавцем. Ссавці включають без обмеження одомашнених тварин (наприклад, корів, овець, кішок, собак та коней), приматів (наприклад, людей та приматів, відмінних від людей, таких як мавпи), кроликів та гризунів (наприклад, мишей та пацюків). У певних варіантах здійснення індивідуум або суб'єкт являє собою людину. "Фармацевтично прийнятний носій" стосується інгредієнта у фармацевтичному складі, відмінного від активного інгредієнта, який є нетоксичним для суб'єкта. Фармацевтично прийнятний носій включає без обмеження буфер, наповнювач, стабілізатор або консервант. "Ефективна кількість" засобу, наприклад, фармацевтичного складу, стосується кількості, ефективної у дозах та протягом періодів часу, необхідних для досягнення необхідного терапевтичного або профілактичного результату.
Термін "листівка-вкладка" використовується для позначення інструкцій, які зазвичай містяться в комерційних упаковках терапевтичних продуктів, які містять інформацію про показання, застосування, дозування, введення, комбіновану терапію, протипоказання та/або попередження щодо використання таких терапевтичних продуктів.
Термін "СТІ А-4", використовуваний у даному документі, стосується будь-якого нативного
СТІ А-4 із будь-якого донорного організму, що належить до хребетних, у тому числі ссавців, 60 таких як примати (наприклад, люди) та гризуни (наприклад, миші та пацюки), якщо не зазначено інше. Термін охоплює "повнорозмірний", не підданий процесингу СТІ А-4, а також будь-яку форму СТІ А-4, одержану в результаті процесингу в клітині. Цей термін також охоплює природні варіанти СТІ А-4, наприклад сплайс-варіанти або алельні варіанти. Амінокислотна послідовність зразкового людського СТІ А-4 представлена під 5ЕО ІЮО МО: 214, амінокислотна послідовність
СТІ А-4 миші представлена під 5ЕО ІЮО МО: 247, амінокислотна послідовність СТІ А-4 мавпи представлена під 5ЕО ІЮО МО: 248, та амінокислотна послідовність позаклітинного домену людського СТІ А-4 представлена під ЗЕО ІО МО: 28. В даному документі СТІ А-4 також може бути описаний як СТІ А4.
Термін "регуляторні Т-клітини (Тгед-клітини)" стосується субпопуляції Т-клітин, що регулюють імунну систему, підтримують толерантність до аутоантигенів і пригнічують аутоімунні захворювання. Ці клітини, як правило, пригнічують або знижують індукцію та проліферацію ефекторних Т-клітин. Найкраще вивченими Тгед-клітинами є клітини, що експресують С04,
С025 та Рохр3 (2004-0025: Тгед-клітини). Ці Тгед відрізняються від хелперних Т-клітин. Для ідентифікації та моніторингу Тгед-клітин використовують кілька різних способів. За визначенні за експресією СО4 та СО25 (2040025: клітини) Тгед-клітини становлять від приблизно 5 95 до приблизно 10 95 субпопуляції зрілих СО4-Т-клітин у мишей та людей, тоді як у цільній крові можна виміряти від приблизно 1 95 до приблизно 2 95 Тгед. Ідентифікацію та моніторинг можна здійснювати шляхом подальшого вимірювання експресії Еохр3 (6040025 Еохр3" клітини). Крім того, в комбінації з присутністю СО4 ії СО25 як інший маркер можна використовувати відсутність експресії або низький рівень експресії СО127. Тгед-клітини також експресують високий рівень
СТІ А-4 і СІТАК. Тгед також можна ідентифікувати за допомогою способів, описаних в наведених нижче прикладах.
Застосовні в даному документі терміни "по суті подібний", "по суті рівний" або "по суті такий самий" стосуються досить високого ступеня подібності між двома числовими значеннями (наприклад, одного, асоційованого з антитілом за даним винаходом, та іншого, асоційованого з еталонним/порівнювальним антитілом), такого що фахівець у даній галузі може вважати різницю між двома значеннями такою, що має незначну або нульову біологічну та/або статистичну значущість в контексті біологічної характеристики, що вимірюється зазначеними значеннями (наприклад, значеннями КО).
Використовуваний у даному документі термін "лікування" (і його граматичні варіанти, такі як "лікувати" або "здійснення лікування") стосується клінічного втручання в спробі змінити природний перебіг у індивідуума, якого лікують, і воно може бути здійснено як для профілактики, так і в ході клінічної патології. Необхідні ефекти лікування включають без обмеження запобігання виникненню або рецидиву захворювання, полегшення симптомів, зменшення будь-яких прямих або опосередкованих патологічних наслідків захворювання, запобігання метастазуванню, зменшення швидкості прогресування захворювання, полегшення або зменшення тяжкості хворобливого стану та ремісію або поліпшення прогнозу. У деяких варіантах здійснення антитіла за даним винаходом використовують для затримки розвитку захворювання або для уповільнення прогресування захворювання.
Термін "пухлина" стосується будь-якого росту і проліферації неопластичних клітин, як злоякісних, так і доброякісних, а також всіх передракових і ракових клітин і тканин. Терміни "рак", "раковий", "порушення проліферації клітин", "проліферативне порушення" і "пухлина" не є взаємовиключними, як вказано в даному документі.
Термін "пухлинна тканина" означає тканину, що передбачає щонайменше одну пухлинну клітину. Пухлинна тканина зазвичай складається з популяції пухлинних клітин, які утворюють основну частину пухлини (паренхіми), та сполучних тканин і кровоносних судин, які існують між цими клітинами і підтримують пухлину ("строми"). Різниця між ними в одних випадках очевидна, а в інших вони переплетені. Пухлинні тканини можуть бути інфільтровані імунними клітинами тощо. З іншого боку, "непухлинна тканина" означає тканину, відмінну від пухлинної тканини(тканин) в живому організмі. Здорові/нормальні тканини, що не перебувають у хворобливому стані, є типовими прикладами непухлинних тканин.
І. КОМПОЗИЦІЇ ТА СПОСОБИ
В одному аспекті даний винахід частково базується на антитілах до СТІ А-4 і шляхах їх використання. У деяких варіантах здійснення представлені антитіла які зв'язуються з СТІ А-4.
Антитіла за даним винаходом застосовні, наприклад, для діагностики або лікування раку.
А. Зразкові антитіла до СТІ А-4
В одному аспекті у даному винаході представлені виділені антитіла, які зв'язуються з СТІ А- 4. У певних варіантах здійснення антитіло до СТІ А-4 за даним винаходом має активність зв'язування СТІ А-4 в залежності від концентрації аденозинвмісної сполуки. У деяких варіантах 60 здійснення активність зв'язування з СТІ А-4 є вищою в присутності аденозинвмісної сполуки порівняно з такою за відсутності аденозинвмісної сполуки. В іншому варіанті здійснення активність зв'язування з СТГ А-4 є вищою в присутності аденозинвмісної сполуки у високій концентрації порівняно з такою в присутності аденозинвмісної сполуки у низькій концентрації. В додаткових варіантах здійснення активність зв'язування з СТІ А-4 відрізняється, наприклад, у два рази або більше, З рази або більше, 5 разів або більше, 10 разів або більше, 20 разів або більше, 30 разів або більше, 50 разів або більше, 100 разів або більше, 200 разів або більше, 300 разів або більше, 500 разів або більше, 1 х 103 разів або більше, 2 х 103 разів або більше, З х 103 разів або більше, 5 х 103 разів або більше, 1 х 10" разів або більше, 2 х 107 разів або більше, З х 107 разів або більше, 5 х 107 разів або більше або 1 х 105 разів або більше.
У деяких варіантах здійснення активність зв'язування антитіла до СТІ А-4 може бути представлена за допомогою значення КО (константи дисоціації). У додатковому варіанті здійснення значення КО антитіла до СТІ А-4 в присутності аденозинвмісної сполуки є меншим, ніж за відсутності аденозинвмісної сполуки. Як альтернатива, в іншому варіанті здійснення значення КО антитіла до СТІ А-4 в присутності аденозинвмісної сполуки у високій концентрації є меншим, ніж в присутності аденозинвмісної сполуки у низькій концентрації. У додатковому варіанті здійснення значення КО антитіла до СТІ А-4 відрізняються, наприклад, у два рази або більше, З рази або більше, 5 разів або більше, 10 разів або більше, 20 разів або більше, 30 разів або більше, 50 разів або більше, 100 разів або більше, 200 разів або більше, 300 разів або більше, 500 разів або більше, 1 х 103 разів або більше, 2 х 103 разів або більше, З х 103 разів або більше, 5 х 103 разів або більше, 1 х 107 разів або більше, 2 х 107 разів або більше, З х 104 разів або більше, 5 х 107 разів або більше, або 1 х 105 разів або більше. Значення КО антитіл до
СТІ А-4 в присутності аденозинвмісної сполуки або в присутності аденозинвмісної сполуки у високій концентрації може становити, наприклад, 9 х 10-77 М або менше, 8 х 107 М або менше, 7 х 10-77 М або менше, 6 х 107 М або менше, 5 х 107 М або менше, 4 х 107 М або менше, 3 х 10-77
М або менше, 2 х 107 М або менше, 1 х 107 М або менше, 9 х 108 М або менше, 8 х 108 М або менше, 7 х 108 М або менше, б х 108 М або менше, 5 х 108 М або менше, 4 х 108 М або менше, З х 108 М або менше, 2 х 108 М або менше, 1 х 108 М або менше, 9 х 109 М або менше, 8 х 109 М або менше, 7 х 109 М або менше, б х 109 М або менше, 5 х 109 М або менше, 4 х 109 М або менше, 3 х 109 М або менше, 2 х 109 М або менше, 1 х 109 М або менше, 9 х 1079 М або менше, 8 х 1079 М або менше, 7 х 1079 М або менше, б х 1079 М або менше, 5 х 1079 М або менше, 4 х 1079 М або менше, 3 х 1079 М або менше, 2 х 1079 М або менше або 1 х 1070 М або менше. Значення КО антитіла до СТІ А-4 за відсутності аденозинвмісної сполуки або в присутності аденозинвмісної сполуки у низькій концентрації може становити, наприклад, 1 х 1029 М або більше, 2 х 109 М або більше, З х 109 М або більше, 4 х 108 М або більше, 5 х 108 М або більше, 6 х 108 М або більше, 7 х 108 М або більше 8 х 10- 8 М або більше, 9 х 108 М або більше, 1 х 10- М або більше, 2 х 10- М або більше, 3 х 1077 М або більше, 4 х 107 М або більше, 5 х 10- М або більше, 6 х 10- М або більше, 7 х 107 М або більше, 8 х 10-7 М або більше, 9 х 107 М або більше, 1 х 106 М або більше, 2 х 105 М або більше 3 х 106 М або більше, 4 х 105 М або більше, 5 х 105 М або більше, 6 х 105 М або більше, 7 х 106 М або більше, 8 х 10 М або більше або 9 х 106 М або більше.
В іншому варіанті здійснення активність зв'язування антитіла до СТІ А-4 може бути представлена за допомогою значення Ка (константа швидкості дисоціації) замість значення КО.
В іншому варіанті здійснення активність зв'язування антитіла до СТІ А-4 може бути представлена за допомогою зв'язувальної кількості СТІ А-4 на одиницю кількості антитіла.
Наприклад, в аналізі методом поверхневого плазмонного резонансу кожну зі зв'язувальної кількості антитіла, іммобілізованого на сенсорному чипі, та зв'язувальної кількості антигена, що в подальшому зв'язується з ним, вимірюють як резонансну одиницю (КИ). Значення, одержане шляхом ділення зв'язувальної кількості антигена на зв'язувальну кількість антитіла, можна визначити як зв'язувальну кількість антигена на одиницю кількості антитіла. Конкретні способи вимірювання та розрахунку таких зв'язувальних кількостей описані в наведених нижче прикладах. У деяких варіантах здійснення зв'язувальна кількість СТІ А-4 в присутності аденозинвмісної сполуки є більшою, ніж за відсутності аденозинвмісної сполуки. Як альтернатива, в іншому варіанті здійснення зв'язувальна кількість СТІ А-4 в присутності аденозинвмісної сполуки у високій концентрації є більшою, ніж в присутності аденозинвмісної сполуки у низькій концентрації. У додатковому варіанті здійснення зв'язувальна кількість СТІ А-4 відрізняється, наприклад, у два рази або більше, З рази або більше, 5 разів або більше, 10 разів або більше, 20 разів або більше, 30 разів або більше, 50 разів або більше, 100 разів або більше, 200 разів або більше, 300 разів або більше, 500 разів або більше, 1 х 103 разів або більше, 2 х 103 разів або більше, 3 х 103 разів або більше, 5 х 103 разів або більше, 1 х 107 разів або 60 більше, 2 х 107 разів або більше, З х 107 разів або більше, 5 х 107 разів або більше або 1 х 105 разів або більше. Значення зв'язувальної кількості СТІ А-4 в присутності аденозинвмісної сполуки або в присутності аденозинвмісної сполуки у високій концентрації може становити, наприклад, 0,01 або більше, 0,02 або більше, 0,03 або більше, 0,04 або більше, 0,05 або більше, 0,06 або більше, 0,07 або більше, 0,08 або більше, 0,09 або більше, 0,1 або більше, 0,2 або більше, 0,3 або більше, 0,4 або більше, 0,5 або більше, 0,6 або більше, 0,7 або більше, 0,8 або більше, 0,9 або більше або 1 або більше. Значення зв'язувальної кількості СТІ А-4 за відсутності аденозинвмісної сполуки або в присутності аденозинвмісної сполуки у низькій концентрації може становити, наприклад, 0,5 або менше, 0,4 або менше, 0,3 або менше, 0,2 або менше, 0,1 або менше, 0,09 або менше, 0,08 або менше, 0,07 або менше, 0,06 або менше, 0,05 або менше, 0,04 або менше, 0,03 або менше, 0,02 або менше, 0,01 або менше, 0,009 або менше, 0,008 або менше, 0,007 або менше, 0,006 або менше, 0,005 або менше, 0,004 або менше, 0,003 або менше, 0,002 або менше або 0,001 або менше.
У деяких варіантах здійснення значення КО, значення Ка, значення зв'язувальної кількості та значення, описані в даному документі, вимірюють або розраховують шляхом виконання аналізу методом поверхневого плазмонного резонансу за температури 25 "С або 37 "С (див., наприклад, приклад З в даному документі).
Може бути вибрана будь-яка концентрація аденозинвмісних сполук за умови, що при цьому виявляється різниця в активності зв'язування антитіла до СТІА-4. У певних варіантах здійснення висока концентрація може включати, наприклад, 1 нМ або вище ніж 1 нМ, З нм або вище ніж З нМ, 10 нМ або вище ніж 10 нМ, 30 нМ або вище ніж 30 нМ, 100 нМ або вище ніж 100
НМ, 300 нМ або вище ніж 300 нМ, 1 мкМ або вище ніж 1 мкм, З мкМ або вище ніж З мкМ, 10 мкм або вище ніж 10 мкМ, 30 мкМ або вище ніж 30 мкМ, 100 мкМ або вище ніж 100 мкм, 300 мкм або вище ніж 300 мкМ, 1 мм або вище ніж 1 мМ, З мм або вище ніж З мМ, 10 мм або вище ніж 10 мм, 30 мм або вище ніж 30 мМ, 100 мм або вище ніж 100 мм, 300 мм або вище ніж 300 мМ та 1 М або вище ніж 1 М. Як альтернатива, висока концентрація в даному випадку може являти собою достатню кількість, за якої відповідне антитіло до СТІ А-4 демонструє максимальну активність зв'язування. В одному варіанті здійснення 1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ, 1 мМ або достатня кількість, за якої відповідне антитіло до СТІ А-4 демонструє максимальну активність зв'язування, може бути вибрана як висока концентрація в даному випадку. У певних варіантах здійснення низька концентрація може включати, наприклад, 1 мМ або нижче ніж 1 мМ, 300 мкм або нижче ніж 300 мкМ, 100 мкМ або нижче ніж 100 мкМ, 30 мкМ або нижче ніж 30 мкМ, 10 мкм або нижче ніж 10 мкМ, З мкМ або нижче ніж З мкМ, 1 мкМ або нижче ніж 1 мкМ, 300 нМ або нижче ніж 300 нМ, 100 нМ або нижче ніж 100 нМ, 30 нМ або нижче ніж 30 нМ, 10 нм або нижче ніж 10 нМ, 3 нм або нижче ніж 3 нМ, 1 нМ або нижче ніж 1 нм, 300 пМ або нижче ніж 300 пМ, 100
ПМ або нижче ніж 100 пМ, 30 пМ або нижче ніж 30 пМ, 10 пМ або нижче ніж 10 пМ, З пМ або нижче ніж З пМ та 1 пМ або нижче ніж 1 пМ. Як альтернатива, низька концентрація в даному випадку може являти собою концентрацію, за якої відповідне антитіло до СТІ А-4 демонструє мінімальну активність зв'язування. Випадок, коли суттєва концентрація дорівнює нулю (за відсутності аденозинвмісної сполуки), також може бути вибраний як варіант здійснення низької концентрації. В одному варіанті здійснення 1 мМ, 100 мкм, 10 мкМ, 1 мкМ, концентрація, за якої відповідне антитіло до СТІ А-4 демонструє мінімальну активність зв'язування, або відсутність аденозинової сполуки можуть бути вибрані як нижча концентрація в даному випадку. В іншому варіанті здійснення наступні значення можуть бути вибрані як співвідношення високої концентрації до низької концентрації, наприклад, 3З-кратне або більше, 10-кратне або більше,
З0-кратне або більше, 100-кратне або більше, 300-кратне або більше, 1 х 10З-кратне або більше, З х 103-кратне або більше, 1 х 101-кратне або більше, З х 101-кратне або більше, 1 х 105-кратне або більше, З х 105-кратне або більше, 1 х 109-кратне або більше, З х 106-кратне або більше, 1 х 107-кратне або більше, З х 107-кратне або більше, 1 х 108-кратне або більше, 3 х 108-кратне або більше, 1 х 109-кратне або більше, 3 х 109-кратне або більше, 1 х 1019-кратне або більше, З х 1019-кратне або більше, 1 х 10!!-кратне або більше, З х 1011-кратне або більше або 1 х 1012-кратне або більше.
В іншому варіанті здійснення антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом мають активність зв'язування також із аденозинвмісними сполуками. Зв'язувальна кількість аденозинвмісної сполуки на одиницю кількості антитіла до СТІ А-4 може бути розрахована із застосуванням зазначеного вище способу та застосовуватися як активність зв'язування антитіла з аденозинвмісною сполукою. Конкретні способи вимірювання та розрахунку таких зв'язувальних кількостей описані в наведених нижче прикладах. Значення зв'язувальної кількості аденозинвмісної сполуки на одиницю кількості антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом може становити, наприклад, 0,0001 або більше, 0,0002 або більше, 0,0003 або більше, 0,0004 або бо більше, 0,0005 або більше, 0,0006 або більше, 0,0007 або більше, 0,0008 або більше, 0,0009 або більше, 0,001 або більше, 0,002 або більше, 0,003 або більше, 0,004 або більше, 0,005 або більше, 0,006 або більше, 0,007 або більше, 0,008 або більше, 0,009 або більше або 0,01 або більше.
В іншому варіанті здійснення антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом утворюють потрійний комплекс з аденозинвмісною сполукою та СТІ А-4. В одному варіанті здійснення антитіло до
СТІ А-4 зв'язується з аденозинвмісною сполукою за допомогою СОКІ, СОК2 та СОКЗ важкого ланцюга. В одному варіанті здійснення антитіло до СТІ А-4 має зв'язувальний мотив для аденозинвмісної сполуки. Зв'язувальний мотив для аденозинвмісної сполуки може складатися, наприклад, із щонайменше однієї амінокислоти, присутньої в положеннях 33, 52, 52а, 53, 56, 58, 95, 96, 100а, 10056 та 100с відповідно до нумерації за Кабаї. У додатковому варіанті здійснення антитіло до СТІ А-4 зв'язується з аденозинвмісною сполукою, наприклад, за допомогою щонайменше однієї амінокислоти, вибраної з групи, що складається з амінокислоти в положеннях 33, 52, 52а, 53, 56, 58, 95, 96, 100а, 1005 та 100с відповідно до нумерації за Кабаї.
У певних варіантах здійснення антитіла до СТІ А-4 містять щонайменше одну амінокислоту, вибрану з групи, що складається з ТНг в положенні 33, 5ег в положенні 52, Зег в положенні 52а,
Агу в положенні 53, Туг в положенні 56, Туг в положенні 58, Туг в положенні 95, СІу в положенні 96, Меї в положенні 100а, І еи в положенні 1005 та Тгр в положенні 100с відповідно до нумерації за Кабраї. СТІ А-4 може додатково зв'язуватися з комплексом, утвореним зв'язуванням антитіла до СТІ А-4 та аденозинвмісної сполуки. Більше того, аденозинвмісна сполука може бути присутня на поверхні контакту, де взаємодіють антитіло до СТІ А-4 і СТІ А-4, та може зв'язуватися з ними обома. Такими методиками, як аналіз кристалічної структури, описаний нижче, може бути підтверджено, що антитіло до СТІ А-4 утворює потрійний комплекс з аденозинвмісною сполукою та СТІ А-4 (див. приклади).
В іншому варіанті здійснення антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом зв'язуються із щонайменше однією амінокислотою, вибраною з групи, що складається з амінокислот в положенні З (Ме), положенні 33 (СІй), положенні 35 (Аго), положенні 53 (ТНг), положенні 97 (бій), положенні 99 (Ме), положенні 100 (Туг), положенні 101 (Рго), положенні 102 (Рго), положенні 103 (Рго), положенні 104 (Туг), положенні 105 (Туг) та положенні 106 (Гей) людського
СТІ А-4 (позаклітинний домен; 5ЕО ІЮО МО: 28). Ці амінокислоти можуть утворювати епітоп антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом. В іншому варіанті здійснення антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом зв'язуються з ділянкою від амінокислоти в положенні 97 (Си) до амінокислоти в положенні 106 (Гей) людського СТІ А-4 (позаклітинний домен; 5ЕБЕО ІЮО МО: 28). В іншому варіанті здійснення антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом зв'язуються з ділянкою від амінокислоти в положенні 99 (Ме) до амінокислоти в положенні 106 (Гей) людського СТІ А-4 (позаклітинний домен; 5ЕО ІЮО МО: 28).
В іншому варіанті здійснення антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом конкурують з
АВАМОО4 (МН, 5ЕО ІО МО: 10; МІ, 5ЕО ІО МО: 11; НМВ-НІ, 5ЕО ІО МО: 100; НУВ-Н2, 5ЕО І
МО: 101; НУВ-НЗ, 5ЕО І МО: 102; НУВ-11, 5ЕО І МО: 113; НУМВ-12, 5ЕО ІО МО: 114; НУВ-І 3,
ЗБО ІО МО: 115) за зв'язування з СТІ А-4. В іншому варіанті здійснення антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом зв'язуються з тим самим епітопом, що і АВАМО04. Якщо є надлишок антитіл до СТІ А-4, зв'язування АВАМО04 з СТІ А-4 може бути зменшено, наприклад, на 10 95 або більше, 15 95 або більше, 20 95 або більше, 25 95 або більше, 30 95 або більше, 35 95 або більше, 40 У5 або більше, 45 95 або більше, 50 95 або більше, 55 95 або більше, 60 95 або більше, 65 95 або більше, 70 95 або більше, 75 95 або більше, 80 95 або більше, 85 95 або більше, 90 95 або більше або 95 95 або більше. В даному документі представлені зразкові конкурентні аналізи.
В іншому варіанті здійснення антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом демонструють цитотоксичну активність щодо клітин, що експресують СТІ А-4. Якщо на поверхні клітини-мішені експресується СТІ А-4 та антитіло до СТІ А-4 зв'язується з ним, клітина може бути пошкоджена.
Пошкодження клітини може бути обумовлено ефекторними клітинами, зв'язаними з антитілом, наприклад, активністю, що являє собою антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС), та активністю, що являє собою антитілозалежний клітинний фагоцитоз (АОСР), або це може бути обумовлено комплементами, зв'язаними з антитілом, наприклад, активністю, що являє собою комплементзалежну цитотоксичність (СОС). Як альтернатива, пошкодження може бути обумовлено цитотоксичним засобом (наприклад, радіоїзотопом або хіміотерапевтичним засобом), кон'югованим з антитілом, таким як імунокон'югат. Цитотоксичність в даному випадку може включати ефекти індукції загибелі клітин, пригнічення проліферації клітин та погіршення функцій клітин. Якщо антитіло до СТІ А-4 присутнє в достатній кількості, це може обумовлювати пошкодження, наприклад, 10 95 або більше, 1595 або більше, 20 95 або більше, 25 95 або більше, 30 95 або більше, 35 95 або більше, 40 95 або більше, 45 95 або більше, 50 95 або більше, бо 55 95 або більше, 60 95 або більше, 65 95 або більше, 70 95 або більше, 75 95 або більше, 80 95 або більше, 85 95 або більше, 90 95 або більше або 95 95 або більше клітин, що експресують
СТІ А-4. Вимірювання такої цитотоксичної активності може бути здійснено шляхом порівняння її з вимірюванням за відсутності антитіла або в присутності антитіла негативного контролю. В даному документі представлені зразкові аналізи цитотоксичності.
В іншому варіанті здійснення антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом демонструють нейтралізувальну активність щодо СТІ А-4. Відомо, що СТІ А-4 функціонує шляхом взаємодії із своїм лігандом СОВ80 (8В7-1) або СО86 (В7-2). У певних варіантах здійснення антитіла до СТІ А-4 інгібують взаємодію СТІ А-4 з СО80О (8В7-1) або СО86 (87-2). Якщо антитіло до СТІ А-4 присутнє в достатній кількості, це може інгібувати взаємодію СТІ А-4 з СО8О (87-1) або СО86 (В7-2), наприклад, на 10 95 або більше, 15 95 або більше, 20 95 або більше, 25 95 або більше, 30 95 або більше, 35 95 або більше, 40 95 або більше, 45 95 або більше, 50 95 або більше, 55 95 або більше, 60 95 або більше, 65 95 або більше, 70 95 або більше, 75 о або більше, 80 95 або більше, 85 95 або більше, 90 95 або більше або 95 95 або більше. Вимірювання такої інгібувальної активності може бути здійснено шляхом порівняння її з вимірюванням за відсутності антитіла або в присутності антитіла негативного контролю. В даному документі представлені конкретні способи вимірювання нейтралізувальної активності.
В іншому варіанті здійснення антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом зв'язуються з СТІ А-4, одержаними з декількох видів тварин. Зразкові види тварин можуть включати ссавців, наприклад, людей, мавп, мишей, пацюків, хом'яків, морських свинок, кроликів, свиней, велику рогату худобу, кіз, коней, овець, верблюдів, собак і котів. У певних варіантах здійснення антитіла до СТІ А-4 зв'язуються з СТІ А-4, одержаними від людей та тварин, відмінних від людей (наприклад, мавп, мишей і пацюків). Амінокислотна послідовність людського СТІ А-4 представлена під 5ЕО ІЮО МО: 214, амінокислотна послідовність СТІ А-4 мавп представлена під
ЗЕО ІЮО МО: 247, та амінокислотна послідовність СТІ А-4 мишей представлена під ЗЕО ІЮО МО: 248. Амінокислотні послідовності СТІ А-4, одержаних з інших видів тварин, також можуть бути належним чином визначені способами, відомими фахівцям у даній галузі.
У певних варіантах здійснення аденозинвмісні сполуки за даним винаходом можуть включати, наприклад, аденозин (АБО), аденозинтрифосфат (АТФ), аденозиндифосфат (АДФ), аденозинмонофосфат (АМФ), циклічний аденозинмонофосфат (цАМФ), дезоксиаденозин (адбо), дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксиаденозиндифосфат (дАДФ), дезоксиаденозинмонофосфат (дАМФ) та аденозин-(у-тіо)у-трифосфат (АТРУЗБ).
В одному аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК МН, вибрані з наступного: (ад НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 223; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ІО МО: 224; та (с) НМАК-Н3З, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІО МО: 225. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМА-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5БО ОО МО: 223; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ІО МО: 224; та (с) НМАК-Н3З, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІЮ МО: 225.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК УМ, вибрані з наступного: (а) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 226; (Б) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 227; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІЮ МО: 228. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-1І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 226; (Б) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 227; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІЮ МО: 228.
В іншому аспекті антитіло за даним винаходом містить: (а) домен МН, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НУК МН, вибрані з наступного: (Її)
НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ІЮО МО: 223, (ії) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 224, та (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 225; та (Б) домен МІ, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК Мі, вибрані з наступного: () НМЕК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність під 5БО 10 МО: 226, (ії) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 227, та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІЮ МО: 228.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 223; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під 5260 1О МО: 224; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під 260 60 ІО МО: 225; (8) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 226; (е) НМК-12,
що містить амінокислотну послідовність під 5БО ІО МО: 227; та () НМК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІЮ МО: 228.
В одному аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК МН, вибрані з наступного: (ад НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ОО МО: 100; (б) НМВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ОО МО: 101; та (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІО МО: 102. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО І МО: 100; (Б) НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ОО МО: 101; та (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 102.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК УМ, вибрані з наступного: (а) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 113; (5) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 114; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІЮО МО: 115. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-11, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 113; (5) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 114; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 115.
В іншому аспекті антитіло за даним винаходом містить: (а) домен МН, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НУК УН, вибрані з наступного: (і)
НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 100, (її) НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 101, та (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під «ХЕ ІЮ МО: 102; та (Б) домен МІ, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК Мі, вибрані з наступного: (ї) НМК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність під 5БО 10 МО: 113, (ї) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 114, та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 115.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить: (а) НМЕК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ОО МО: 100; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під 5260 10 МО: 101; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під 260
ІО МО: 102; (8) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 113; (е) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5БО ІО МО: 114; та () НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО: 115.
В одному аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК МН, вибрані з наступного: (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ОО МО: 100; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ІЮО МО: 104; та (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІО МО: 102. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5БО ОО МО: 100; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під 5260 1О МО: 104; та (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 102.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК УМ, вибрані з наступного: (а) НМК-11, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 116; (5) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІЮО МО: 115. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМА-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 116; (5) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 115.
В іншому аспекті антитіло за даним винаходом містить: (а) домен МН, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НУК МН, вибрані з наступного: (Її)
НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 100, (ії) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 104, та (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під «ХЕ ІЮ МО: 102; та (Б) домен МІ, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК Мі, вибрані з наступного: () НМЕ-11, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО 10 МО: 116, (її) НМК-1І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117, та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 115.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить: (а) НМК-НІ, що 60 містить амінокислотну послідовність під 560 ОО МО: 100; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під 5260 1О0 МО: 104; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під 260
ІО МО: 102; (8) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 116; (є) НУВ-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5БО І МО: 117; та () НМК-І3З, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО: 115.
В одному аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК МН, вибрані з наступного: (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 105; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ІЮО МО: 106; та (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІО МО: 102. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5БО ІО МО: 105; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ІЮО МО: 106; та (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 102.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК УМ, вибрані з наступного: (а) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 122; (Б) НМВ-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІЮО МО: 133. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-1І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 122; (Б) НМВ-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 133.
В іншому аспекті антитіло за даним винаходом містить: (а) домен МН, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НУК УН, вибрані з наступного: (ї)
НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ІЮО МО: 105, (ії) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 106, та (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під «ХЕ ІЮ МО: 102; та (Б) домен МІ, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК Мі, вибрані з наступного: () НМЕК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність під 5БО І МО: 122, (ії) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117, та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 133.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить: (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 105; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під 5260 1О0 МО: 106; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під 260
ІО МО: 102; (8) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 122; (е) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5БО ІЮ МО: 117; та () НМК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО: 133.
В одному аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК МН, вибрані з наступного: (ад НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ІО МО: 108; та (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІО МО: 102. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМАК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5БО ОО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ІО МО: 108; та (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 102.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НУК МІ, вибрані з наступного: (а) НМК-11, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 121; (5) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 123; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІЮО МО: 153. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-1І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 121; (5) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІО МО: 123; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 153.
В іншому аспекті антитіло за даним винаходом містить: (а) домен МН, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НУК УН, вибрані з наступного: (і)
НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ІЮО МО: 107, (ії) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 108, та (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 102; та (Б) домен МІ, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК Мі, вибрані з наступного: () НМЕК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність під 5БО 10 МО: 121, (ії) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 123, та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під 60 ЗЕО ІО МО: 153.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під 5260 1О0 МО: 108; (с) НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під 260
ІО МО: 102; (8) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 121; (е) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5БО ІО МО: 123; та () НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІЮ МО: 153.
В одному аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК МН, вибрані з наступного: (ад НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 107; (б) НМВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ОО МО: 110; та (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІО МО: 102. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІО МО: 107; (Б) НУМВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ОО МО: 110; та (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 102.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК УМ, вибрані з наступного: (а) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 122; (Б) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІЮО МО: 133. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-1І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 122; (Б) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 133.
В іншому аспекті антитіло за даним винаходом містить: (а) домен МН, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НУК МН, вибрані з наступного: (Її)
НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 107, (ії) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 110, та (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під «ХЕ ІЮ МО: 102; та (Б) домен МІ, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК Мі, вибрані з наступного: (ї) НМК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність під 5БО І МО: 122, (ії) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117, та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 133.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить: (а) НМЕК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під 5260 10 МО: 110; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під 260
ІО МО: 102; (8) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 122; (е) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5БО І МО: 117; та () НМК-І3З, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО: 133.
В одному аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК МН, вибрані з наступного: (ад НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ІО МО: 112; та (с) НМАК-Н3З, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІО МО: 102. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5БО ОО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ОО МО: 112; та (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 102.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК УМ, вибрані з наступного: (а) НМВ-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 128; (5) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІЮО МО: 133. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМА-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 128; (5) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 133.
В іншому аспекті антитіло за даним винаходом містить: (а) домен МН, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НУК УН, вибрані з наступного: (і)
НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ІЮО МО: 107, (ії) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність під 5БО 10 МО: 112, та (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під «ХЕ ІЮ МО: 102; та (Б) домен МІ, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК Мі, вибрані з наступного: () НМЕК-Ї71, що містить 60 амінокислотну послідовність під 5ЕО 10 МО: 128, (її) НМК-1І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117, та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 133.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під 5260 10 МО: 112; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під 260
ІО МО: 102; (8) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність під БЗЕО 10 МО: 128; (є) НУВ-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5БО І МО: 117; та () НМК-І3З, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО: 133.
В одному аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК МН, вибрані з наступного: (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ОО МО: 111; та (с) НМАК-Н3З, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІО МО: 152. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5БО ОО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ОО МО: 111; та (с) НМАК-Н3З, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 152.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК УМ, вибрані з наступного: (а) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 128; (Б) НМВ-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІЮО МО: 133. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-1І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 128; (Б) НМВ-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 133.
В іншому аспекті антитіло за даним винаходом містить: (а) домен МН, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК УН, вибрані з наступного: (Її)
НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ІЮО МО: 107, (ії) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 111, та (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під «ХЕ ІЮ МО: 152; та (Б) домен МІ, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК Мі, вибрані з наступного: () НМЕ-11, що містить амінокислотну послідовність під 5БО 10 МО: 128, (ії) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117, та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 133.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під 5260 10 МО: 111; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під 260
ІО МО: 152; (8) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 128; (е) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та () НМК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО: 133.
В одному аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК МН, вибрані з наступного: (а) НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ІО МО: 112; та (с) НМАК-Н3З, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІО МО: 102. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМАК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5БО ОО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ІО МО: 112; та (с) НМАК-Н3З, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 102.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК УМ, вибрані з наступного: (а) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 129; (Б) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІО МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІЮО МО: 133. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-1І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 129; (Б) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 133.
В іншому аспекті антитіло за даним винаходом містить: (а) домен МН, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК МН, вибрані з наступного: (Її)
НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ІЮО МО: 107, (ії) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 112, та (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну 60 послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 102; та (Б) домен МІ, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК Мі, вибрані з наступного: () НМЕК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність під 5БО 10 МО: 129, (ії) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117, та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 133.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить: (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 1О МО: 112; (с) НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під БЕ
ІО МО: 102; (8) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 129; (е) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5БО І МО: 117; та () НМК-І3З, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО: 133.
В одному аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК МН, вибрані з наступного: (ад НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 107; (Б) НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ОО МО: 111; та (с) НМАК-Н3З, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІО МО: 152. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІО МО: 107; (Б) НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ОО МО: 111; та (с) НМАК-Н3З, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 152.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НУК МІ, вибрані з наступного: (а) НМК-11, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 129; (Б) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІЮО МО: 133. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-1І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 129; (Б) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 133.
В іншому аспекті антитіло за даним винаходом містить: (а) домен МН, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НУК МН, вибрані з наступного: (Її)
НМУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО 10 МО: 107, (її) НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 111, та (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під «ХЕ ІЮ МО: 152; та (Б) домен МІ, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК Мі, вибрані з наступного: (ї) НМК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність під 5БО 10 МО: 129, (ії) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117, та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 133.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під 5260 10 МО: 111; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під 260
ІО МО: 152; (8) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 129; (е) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5БО І МО: 117; та () НМК-І3З, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО: 133.
В одному аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК МН, вибрані з наступного: (ад НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під 5260 ІО МО: 109; та (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІО МО: 102. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5БО ОО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зХЕО ІО МО: 109; та (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 102.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НУК МІ, вибрані з наступного: (а) НУВ-11, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 130; (5) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗБО ІЮО МО: 133. В одному варіанті здійснення антитіло містить: (а) НМАК-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 130; (5) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 133.
В іншому аспекті антитіло за даним винаходом містить: (а) домен МН, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НУК МН, вибрані з наступного: (Її) 60 НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ІЮО МО: 107, (ії) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність під 5БЕО 10 МО: 109, та (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під «ХЕ ІЮ МО: 102; та (Б) домен МІ, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або усі три послідовності НМК Мі, вибрані з наступного: () НМЕК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність під 5БО І МО: 130, (її) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117, та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під 5ЗЕО ІЮ МО: 133.
В іншому аспекті у даному винаході представлено антитіло, що містить: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 560 ІО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під 5260 10 МО: 109; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під 260
ІО МО: 102; (8) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 130; (є) НУВ-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5БО І МО: 117; та () НМК-І3З, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО: 133.
У певних варіантах здійснення будь-які одна або більше амінокислот антитіла до СТІ А-4, як представлено вище, містять заміни у наступних положеннях НМЕ: - В НМА-НІ1 (ЗЕО ІО МО: 223): положення 2; - В НМАК-Н2 (ЗЕО ІО МО: 224): положення 4, 5, 7, 13 та 16; - в НМА-НЗ (ЗЕО ІО МО: 225): положення 3; - В НМК-І-1 (ЗЕО ІО МО: 226): положення 1, 3, 6, 11, 12 та 14; - В НМК-І2 (5ЕО ІО МО: 227): положення 1, 3, 4 та 7; - в НМАК-ІЗ (5ЕО ІО МО: 228): положення 1 та 10.
У певних варіантах здійснення заміни являють собою консервативні заміни, як представлено в даному документі. У певних варіантах здійснення будь-яка одна або більше з наступних замін можуть бути здійснені в будь-якій комбінації: - в НМА-НІ1 (ЗЕО ІО МО: 100): Н2А, К або К; - в НМА-Н2 (ЗЕО ІЮО МО: 101): 547; К50; 57Н; 013Е або Кк; К16К; - в НМА-НЗ (5ЕО ІО МО: 102): КЗА; - в НМК-І 1 (ЗЕО І МО: 113): Т10, О або Е; ТЗР; О6О; М11тТ; М12УУ; 514Н; - в НМК-І2 (5ЕО ІО МО: 114): Е1Е або У; 531; К45; 57Е або К; - в НМК-ІЇ З (ЗЕО ІЮ МО: 115): 510; МІ1ОТ.
Усі можливі комбінації наведених вище замін охоплюються консенсусними послідовностями під ЗЕО ІЮО МО: 223, 224, 225, 226, 227 та 228 для НМА-НІ, НУВ-Н2, НУВ-НЗ, НУВ-11, НУВ-І2 та НМА-ІЗ відповідно.
У будь-якому з наведених вище варіантів здійснення антитіло до СТІ А-4 є гуманізованим. В одному варіанті здійснення антитіло до СТІ А-4 містить НМЕ, як у будь-якому з наведених вище варіантів здійснення, і додатково містить акцепторну каркасну ділянку людини, наприклад каркасну ділянку імуноглобуліну людини або консенсусну каркасну ділянку людини. В іншому варіанті здійснення антитіло до СТІ А-4 містить НМК, як у будь-якому з наведених вище варіантів здійснення, та додатково містить МН або Мі, що містить послідовність ЕК. У додатковому варіанті здійснення антитіло до СТІ А-4 містить послідовність(послідовності) ЕК варіабельного домену важкого ланцюга та/або легкого ланцюга, як вказано далі: для варіабельного домену важкого ланцюга КІ! передбачає будь-яку з амінокислотних послідовностей під ЗЕО ІЮ МО: 229-232, ЕК2 передбачає амінокислотну послідовність під ЗЕО
ІЮО МО: 233, ЕКЗ передбачає амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 234, та ЕК4 передбачає амінокислотну послідовність під 5ЕО ІО МО: 235; а для варіабельного домену легкого ланцюга ЕК! передбачає будь-яку з амінокислотних послідовностей під ЗЕО ІЮ МО: 236-238, ЕК2 передбачає будь-яку з амінокислотних послідовностей під 5ЕО ІЮ МО: 240-241,
ЕКЗ передбачає будь-яку з амінокислотних послідовностей під 5ЕО ІЮ МО: 242-244, та ЕК4 передбачає будь-яку з амінокислотних послідовностей під 5ЕО ІЮ МО: 245-246.
В іншому аспекті антитіло до СТІ А-4 містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга (МН), що характеризується щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 У, 95 У, 96 95, 97 5, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю під
ЗБО ІО МО: 10. У певних варіантах здійснення послідовність МН, що характеризується щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 У, 9495, 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентичністю, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або делеції порівняно з еталонною послідовністю, але антитіло до СТІ А-4, що містить таку послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з СТІ А-4. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10, до 11, до 12, до 13, до 14 або до 15 амінокислот було замінено, вставлено та/або видалено у послідовності під ЖЕО
ІО МО: 10. У певних варіантах здійснення заміни, вставки або делеції знаходяться в ділянках поза НМЕ (тобто у ЕК). Необов'язково антитіло до СТІ А-4 містить послідовність МН під ЗЕО ІЮ 60 МО: 10, у тому числі посттрансляційні модифікації цієї послідовності. У конкретному варіанті здійснення МН містить одну, дві або три НМЕ, вибрані з наступного: (а) НМА-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5БО 10 МО: 100, (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ІО МО: 101, та (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕО ІО МО: 102. Посттрансляційні модифікації включають без обмеження модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга з одержанням піроглутамінової кислоти шляхом піроглутамілування.
В іншому аспекті представлено антитіло до СТІ А-4, де антитіло містить варіабельний домен легкого ланцюга (М), що характеризується щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 У, 94 Фо, 95 Уо, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю під 5ЕО ІО МО: 11. У певних варіантах здійснення послідовність МІ, що характеризується щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 У, 9495, 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентичністю, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або делеції порівняно з еталонною послідовністю, але антитіло до СТІ А-4, що містить таку послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з СТІ А-4. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10, до 11, до 12, до 13, до 14 або до 15 амінокислот було замінено, вставлено та/або видалено у послідовності під ЖЕО
ІО МО: 11. У деяких варіантах здійснення заміни, вставки або делеції знаходяться в ділянках поза НМЕК (тобто у ЕК). Необов'язково антитіло до СТІ А-4 містить послідовність МІ. під зЕО ІЮ
МО: 11, у тому числі посттрансляційні модифікації цієї послідовності. У конкретному варіанті здійснення МІ. містить одну, дві або три НМК, вибрані з наступних: (а) НМК-11, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО 10 МО: 113; (5) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 114; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕБЕО ІО МО: 115. Посттрансляційні модифікації включають без обмеження модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга з одержанням піроглутамінової кислоти шляхом піроглутамілування.
В іншому аспекті представлено антитіло до СТІ А-4, де антитіло містить варіабельний домен легкого ланцюга (М), що характеризується щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 У, 94 Фо, 95 Уо, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю під 5ЕО ІО МО: 149. У певних варіантах здійснення послідовність МІ, що характеризується щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 У, 9495, 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентичністю, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або делеції порівняно з еталонною послідовністю, але антитіло до СТІ А-4, що містить таку послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з СТІ А-4. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10, до 11, до 12, до 13, до 14 або до 15 амінокислот було замінено, вставлено та/або видалено у послідовності під «ЗЕО
ІО МО: 149. У деяких варіантах здійснення заміни, вставки або делеції знаходяться в ділянках поза НМЕК (тобто у ЕК). Необов'язково антитіло до СТІ А-4 містить послідовність МІ. під зЕО ІЮ
МО: 149, у тому числі посттрансляційні модифікації цієї послідовності. У конкретному варіанті здійснення МІ. містить одну, дві або три НМК, вибрані з наступних: (а) НМК-11, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 130; (5) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 117; та (с) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність під
ЗЕБЕО ІО МО: 133. Посттрансляційні модифікації включають без обмеження модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга з одержанням піроглутамінової кислоти шляхом піроглутамілування.
В іншому аспекті представлено антитіло до СТІ А-4, де антитіло містить УН, як у будь-якому з варіантів здійснення, наведених вище, та Мі, як у будь-якому з варіантів здійснення, наведених вище. В одному варіанті здійснення антитіло містить послідовності МН та Мі під БЕО
ІЮО МО: 10 та 5БО ІО МО: 11 відповідно, у тому числі посттрансляційні модифікації таких послідовностей. В одному варіанті здійснення антитіло містить послідовності МН та Мі під ЗЕО
ІО МО: 98 та 5БО ІО МО: 99 відповідно, у тому числі посттрансляційні модифікації таких послідовностей. В одному варіанті здійснення антитіло містить послідовності МН та Мі під ЗЕО
ІО МО: 83 та 5БО ІО МО: 97 відповідно, у тому числі посттрансляційні модифікації таких послідовностей. В одному варіанті здійснення антитіло містить послідовності МН та Мі. під ХЕО
ІО МО: 86 та 5ЕО ІО МО: 134 відповідно, у тому числі посттрансляційні модифікації таких послідовностей. В одному варіанті здійснення антитіло містить послідовності МН та Мі під ЗЕО
ІЮО МО: 136 та 5ЕО ІЮО МО: 95 відповідно, у тому числі посттрансляційні модифікації таких послідовностей. В одному варіанті здійснення антитіло містить послідовності МН та Мі під ЗЕО
ІО МО: 140 та 5ЕО ІО МО: 146 відповідно, у тому числі посттрансляційні модифікації таких послідовностей. В одному варіанті здійснення антитіло містить послідовності МН та Мі під ЗЕО
ІО МО: 141 та 5ЕО ІО МО: 146 відповідно, у тому числі посттрансляційні модифікації таких послідовностей. В одному варіанті здійснення антитіло містить послідовності МН та Мі. під 5Е0 60 ІО МО: 140 та 5ЕО ІО МО: 147 відповідно, у тому числі посттрансляційні модифікації таких послідовностей. В одному варіанті здійснення антитіло містить послідовності МН та Мі під ЗЕО
ІО МО: 141 та 5ЕО ІО МО: 147 відповідно, у тому числі посттрансляційні модифікації таких послідовностей. В одному варіанті здійснення антитіло містить послідовності МН та Мі під ЗЕО
ІО МО: 136 та 5ЕО ІО МО: 149 відповідно, у тому числі посттрансляційні модифікації таких послідовностей. У додатковому аспекті представлено гетеромерне антитіло до СТІ А-4, при цьому антитіло містить щонайменше дві різні варіабельні ділянки, вибрані з варіабельних ділянок, що включають послідовності МН та МІ, представлені вище. В одному варіанті здійснення антитіло містить послідовності МН та Мі під ЗЕО ІЮ МО: 140 та 5ЕО ІЮО МО: 146 відповідно, та послідовності МН та Мі. під ЗЕО ІО МО: 141 та 5ЕО ІО МО: 146 відповідно, у тому числі посттрансляційні модифікації таких послідовностей. В одному варіанті здійснення антитіло містить послідовності МН та Мі під 5ЕО ІЮО МО: 140 та 5БО ІЮ МО: 147 відповідно, та послідовності МН та Мі під ЗЕО ІЮ МО: 141 та 5ЕО ІЮО МО: 147 відповідно, у тому числі посттрансляційні модифікації таких послідовностей. Посттрансляційні модифікації включають без обмеження модифікацію глутаміну або глутамату на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга з одержанням піроглутамінової кислоти шляхом піроглутамілування.
Якщо амінокислота на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла до СТІ А-4, представленого в даному документі, являє собою глутамін, то така амінокислота може бути замінена глутаматом. Якщо амінокислота на М-кінці важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла до СТІ А-4, представленого в даному документі, являє собою глутамат, то така амінокислота може бути замінена глутаміном.
У додатковому аспекті у даному винаході представлено антитіло, яке зв'язується з тим самим епітопом, що і антитіло до СТІ А-4, представлене в даному документі. Наприклад, у певних варіантах здійснення представлено антитіло, яке зв'язується з тим самим епітопом, що і будь-яке з антитіл, наведених в таблиці 4, таблиці 9, таблиці 14 та таблиці 19. У певних варіантах здійснення представлено антитіло, яке зв'язується з епітопом у фрагменті СТІ А-4, що містить щонайменше одну амінокислоту, вибрану з групи, що складається з амінокислоти в положенні З (Ме), положенні 33 (СІй), положенні 35 (Аго), положенні 53 (ТНг), положенні 97 (бій), положенні 99 (Ме), положенні 100 (Туг), положенні 101 (Рго), положенні 102 (Рго), положенні 103 (Рго), положенні 104 (Туг), положенні 105 (Ту) та положенні 106 (Іеи) з послідовності під ЗЕО ІО МО: 28. У певних варіантах здійснення представлено антитіло, яке зв'язується з епітопом у фрагменті СТІ А-4, що складається з амінокислот від положення 97 (Сім) до положення 106 (І еи) з послідовності під ЗЕО ІО МО: 28. У певних варіантах здійснення представлено антитіло, яке зв'язується з епітопом у фрагменті СТІ А-4, що складається з амінокислот від положення 99 (Меї) до положення 106 (І еи) з послідовності під зЕО ІЮО МО: 28.
У додатковому аспекті даного винаходу антитіло до СТІ А-4 згідно з будь-яким із вищевказаних варіантів здійснення являє собою моноклональне антитіло, в тому числі химерне, гуманізоване або людське антитіло. В одному варіанті здійснення антитіло до СТІ А-4 являє собою фрагмент антитіла, наприклад РЕу-, Рар-, ЕРар-д-, 5сЕм-фрагмент, діатіло або Е(аб)»2- фрагмент. В іншому варіанті здійснення антитіло являє собою повнорозмірне антитіло, наприклад інтактне антитіло ІДС1, інтактне антитіло Ід4 або антитіло іншого класу або ізотипу, як визначено в даному документі.
У додатковому аспекті антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом містять Ес-ділянку. У додатковому аспекті антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом містять константні ділянки.
Константні ділянки можуть являти собою константні ділянки важкого ланцюга (в тому числі Ес- ділянки), константні ділянки легкого ланцюга або і ті, й інші. У деяких варіантах здійснення Ес- ділянка являє собою ділянку нативної послідовності. Зразкові константні ділянки важкого ланцюга, одержані з нативних антитіл, можуть включати, наприклад, константні ділянки важкого ланцюга, як, наприклад, з людського Їдсе1 (ЗЕО ІО МО: 249), людського Їд052 (5ЕО ІО МО: 250), людського ДОЗ (5ЕО ІЮ МО: 251) та людського Їдш4 (ЗЕО ІЮО МО: 252). Крім того, інші зразкові константні ділянки важкого ланцюга можуть включати константні ділянки важкого ланцюга під
ЗЕБЕО ІО МО: 82 та 158. Зразкові константні ділянки легкого ланцюга, одержані з нативних антитіл, можуть включати, наприклад, константні ділянки легкого ланцюга, як, наприклад, з людського ланцюга к (5ЕО ІО МО: 33, 63 та 159) і людського ланцюга АХ (5ЕО ІО МО: 53 та 87).
В іншому варіанті здійснення Ес-ділянка являє собою варіант Ес-ділянки, одержаний шляхом додавання варіантів змінення амінокислот до Ес-ділянки нативної послідовності. У певних варіантах здійснення варіант Ес-ділянки характеризується посиленою зв'язувальною активністю із щонайменше одним рецептором Есу, вибраним із групи, що складається з ЕсуКіа,
ЕсукКПа, ЕсукІИБ та ЕсукІШа, порівняно з Ес-ділянкою нативної послідовності. В додаткових варіантах здійснення варіант Ес-ділянки характеризується посиленою зв'язувальною активністю 60 щодо ЕсукПа та ЕсукПШа порівняно з Рс-ділянкою нативної послідовності. Приклади константних
Зо ділянок важкого ланцюга, що складають такий варіант Ес-ділянки, включають, наприклад, константні ділянки важкого ланцюга, наведені в таблицях 26-30, та константні ділянки важкого ланцюга під 560 ІЮ МО: 31, 32, 41-46, 65, 66, 81, 207, 239, 253-271, 276, 277 та 278.
Ес-ділянка нативної послідовності зазвичай складається з гомодимера, що складається з двох ідентичних поліпептидних ланцюгів. У певних варіантах здійснення варіант Ес-ділянки може являти собою гомодимер, що складається з поліпептидних ланцюгів з однаковою послідовністю, або гетеродимер, що складається з поліпептидних ланцюгів з послідовностями, що відрізняються одна від одної. Подібним чином, константні ділянки важкого ланцюга, що складають Ес-ділянку, можуть являти собою гомодимер, що складається з поліпептидних ланцюгів з однаковою послідовністю, або гетеродимер, що складається з поліпептидних ланцюгів з послідовностями, що відрізняються одна від одної. Приклади гетеромерних константних ділянок важкого ланцюга включають, наприклад, константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під 5ЕО ІЮО МО: 31 та 32; константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під зЗЕО ІЮО МО: 43 та 44; константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під зХЕО ІЮО МО: 45 та 46; константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під 5ЕО І МО: 254 та 256; константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під ЗЕО ІО МО: 257 та 258; константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під 5ЕО ІО МО: 259 та 260; константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під 5Е0О ІЮО МО: 261 та 263; константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під 5ЕО ІЮО МО: 262 та 264; константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під ЗЕ 1О МО: 265 та 267; константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під 5ЕО ІЮ
МО: 266 та 268; константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під зЗЕО
ІО МО: 269 та 270; константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під
ЗЕО ІЮО МО: 271 та 81; константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під
ЗЕО ІО МО: 65 та 66; константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під
ЗЕО ІЮО МО: 239 та 207; константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під 5ЕО ІО МО: 259 та 276; та константні ділянки важкого ланцюга, що містять поліпептидні ланцюги під 52ЕО ІЮ МО: 65 та 278.
В іншому аспекті антитіло до СТІ А-4 згідно з будь-яким із вищевказаних варіантів здійснення може передбачати будь-які ознаки, окремо або в комбінації, як описано в наведених нижче розділах 1-7. 1. Активність зв'язування антитіла
У певних варіантах здійснення активність зв'язування антитіла, представленого в даному документі, являє собою константу дисоціації (КО), що становить 10 мкМ або менше, 1 мкМ або менше, 100 нМ або менше, 10 нМ або менше, 1 нм або менше, 0,1 нМ або менше, 0,01 нМ або менше або 0,001 нМ або менше (наприклад, 109 М або менше, наприклад від 109 М до 10-33 М, наприклад від 109 М до 10-33 М).
В одному варіанті здійснення активність зв'язування антитіла вимірюють за допомогою аналізу зв'язування з антигеном, міченим радіоактивною міткою (НІА). В одному варіанті здійснення КІА здійснюють із Раб-версією антитіла, що становить інтерес, і його антигеном.
Наприклад, афінність зв'язування Раб з антигеном у розчині вимірюють шляхом урівноваження
Еаь із мінімальною концентрацією (725І)-міченого антигена в присутності титраційного ряду неміченого антигена з наступним захопленням зв'язаного антигена на планшеті, покритому антитілами до Раб (див., наприклад, публікацію Спеп еї аї., у. Мої. Віої. 293: 865-881(1999)). Для встановлення умов для аналізу багатолункові планшети МІСКОТІТЕК (зареєстрована торгова марка) (Тпепто 5сіепійс) покривають на ніч за допомогою 5 мкг/мл захоплювального антитіла до Раб (Сарреї І арх) у 50 мм карбонаті натрію (рН 9,6), а потім блокують за допомогою 2 95 (вага/об'єм) бичачого сироваткового альбуміну в РВ5 протягом двох - п'яти годин за кімнатної температури (приблизно 23 "С). У неадсорбувальному планшеті (Мипс Мо 269620) 100 пМ або 26 пмМ Г5Ц-антигена змішують із серійними розведеннями Бар, що становить інтерес (наприклад, відповідно до оцінки антитіла до МЕСЕ, Рабр-12, в Ргевіа вї а)., Сапсег Нев. 57: 4593- 4599 (1997)). Рар, що становить інтерес, потім інкубують протягом ночі; однак інкубація може тривати довше (наприклад, близько 65 годин) для забезпечення досягнення рівноваги. Після цього суміші переносять на планшет для захоплення для інкубації за кімнатної температури (наприклад, протягом однієї години). Потім розчин видаляють і планшет промивають вісім разів 0,195 розчином полісорбату 20 (ТМ/ЕЕМ-20 (зареєстрована торгова марка)) у РВ5. Коли планшети висихають, додають 150 мкл/лунка сцинтилятора (МІСКОЗСІМТ-20О7М; РаскКагоа) і планшети зчитують на гамма-лічильнику ТОРСОШМТ'М (РасКкага) протягом десяти хвилин.
Концентрації кожного Бар, що забезпечують 20 95 максимального зв'язування або менше, відбирають для використання в аналізах конкурентного зв'язування.
В одному варіанті здійснення активність зв'язування антитіла вимірюють із застосуванням аналізу захоплення ліганду із застосуванням аналізу методом поверхневого плазмонного резонансу як принципу вимірювання, наприклад, за допомогою ВІАСОКЕ (зареєстрована торгова марка) Т200 або ВІАСОКЕ (зареєстрована торгова марка) 4000 (СЕ Неайсаге,
Уппсала, Швеція). Для керування пристроєм застосовують програмне забезпечення системи управління ВІАСОКЕ (зареєстрована торгова марка). В одному варіанті здійснення набір для зв'язування аміну (ЗЕ НеайНсаге, Уппсала, Швеція) використовують відповідно до інструкцій постачальника та сенсорний чіп, покритий карбоксиметилдекстраном (СЕ Неайсаге, Уппсала,
Швеція), іммобілізують за допомогою молекули для захоплення ліганду, наприклад антитіла до мітки, антитіла до дб та білка А. Молекулу для захоплення ліганду розбавляють 10 мМ розчином ацетату натрію за відповідного рН і вводять за відповідної швидкості потоку та часу введення. Аналіз активності зв'язування виконують із застосуванням буфера, що містить 0,05 95 полісорбату 20 (інша назва ТМУМЕЕМ-20 (зареєстрована торгова марка)), як буфера для аналізу за швидкості потоку від 10 до 30 мкл/хвилина та за температури аналізу, що становить переважно 25"С або 37 "С. У разі здійснення аналізу шляхом забезпечення захоплення антитіла як ліганду молекулою для захоплення ліганду, серійне розведення антигена або Ес- рецептора, одержане з використанням буфера для аналізу (аналіту), вводять після захоплення цільової кількості антитіла шляхом введення антитіла. У разі здійснення аналізу шляхом забезпечення захоплення антигена або Ес-рецептора як ліганду молекулою для захоплення ліганду, серійне розведення антитіла, одержане з використанням буфера для аналізу (аналіту), вводять після захоплення цільової кількості антигена або Ес-рецептора шляхом введення антигена або Ес-рецептора.
В одному варіанті здійснення результати аналізу аналізували за допомогою програмного забезпечення для оцінки ВІАСОКЕ (зареєстрована торгова марка). Кінетичні параметри розраховують шляхом одночасної апроксимації сенсограм зв'язування та дисоціації із застосуванням моделі зв'язування 1:1, і можна розрахувати швидкість зв'язування (Коп або Ка), швидкість дисоціації (Кої або Ка) та рівноважну константу дисоціації (КО). Якщо активність зв'язування слабка, особливо якщо дисоціація відбувається швидко і важко розрахувати кінетичні параметри, рівноважну константу дисоціації (КО) можна розрахувати із застосуванням моделі стаціонарного стану. Як іще один параметр активності зв'язування можна розрахувати "зв'язувальну кількість аналіту на одиницю кількості ліганду" шляхом ділення зв'язувальної кількості аналіту за конкретної концентрації (КО) на кількість захопленого ліганду (КО). 2. Фрагменти антитіла
У певних варіантах здійснення антитіло, представлене в даному документі, являє собою фрагмент антитіла. Фрагменти антитіл включають без обмеження Рар-, Рар'-, Рар-5Н-, Е(аб)г-,
Ем- і зсЕм-фрагменти та інші фрагменти, описані нижче. Огляд певних фрагментів антитіл див. у
Ниазоп еї аї., Маї. Мед. 9: 129-134 (2003). Огляд зсЕу-фрагментів див., наприклад, у Рінскіййп, в
ТНе Рнаптасоїіоду ої Мопосіопа! Апііродієв, мої. 113, Возепригу апа Моотге еав., (Зргіпдег-Мепіад,
Мем Могк), рр. 269-315 (1994); також див. УМО 93/16185 і патент США МоМо 5571894 та 5587458.
Обговорення ЕРаб- та Е(ар)2-фрагментів, що містять залишки епітопу, що зв'язує рецептор реутилізації, та характеризуються збільшеним періодом напівжиття іп мімо див. у патенті США Мо 5869046.
Діатіла являють собою фрагменти антитіл з двома антигензв'язувальними сайтами, які можуть бути бівалентними або біспецифічними. Див., наприклад, ЕР 404097; УМО 1993/01161;
Ниавзоп 6вї аї., Маї. Меа. 9: 129-134 (2003); та Ноїїїпдег єї аї!., Ргос. Маї). Асай. бсі. ОБА 90: 6444- 6448 (1993). Триатіла та тетратіла також описані в Нидзоп еї аї., Маї. Мед. 9: 129-134 (2003).
Однодоменні антитіла являють собою фрагменти антитіл, що містять весь варіабельний домен важкого ланцюга або його частину або весь варіабельний домен легкого ланцюга або його частину з антитіла. У певних варіантах здійснення однодоменне антитіло являє собою людське однодоменне антитіло (Юотапії5, Іпс., ММактат, МА; див., наприклад, патент США Мо 6248516 В1).
Фрагменти антитіл можуть бути виготовлені за допомогою різних методик, в тому числі без обмеження протеолітичного розщеплення інтактного антитіла, а також шляхом продукування рекомбінантними клітинами-хазяями (наприклад, Е. сої або фагом), як описано у даному документі. 3. Химерні та гуманізовані антитіла
У певних варіантах здійснення антитіло, представлене в даному документі, являє собою 60 химерне антитіло. Деякі химерні антитіла описані, наприклад, у патенті США Мо 4816567 та
Могтізоп еї аї., Ргос. Маїй. Асад. 5сі. ОБА, 81: 6851-6855 (1984)). В одному прикладі химерне антитіло містить варіабельну ділянку, відмінну від людської (наприклад, варіабельну ділянку, одержану від миші, пацюка, хом'яка, кролика або примата, відмінного від людини, наприклад, мавпи), і людську константну ділянку. У додатковому прикладі химерне антитіло являє собою "антитіло з перемиканням класу", клас або підклас якого був змінений порівняно з вихідним антитілом. Химерні антитіла включають їх антигензв'язувальні фрагменти.
У певних варіантах здійснення химерне антитіло являє собою гуманізоване антитіло. Як правило, антитіло, що не є людським, гуманізують для зниження імуногенності для людей, зберігаючи при цьому специфічність та афінність вихідного антитіла, відмінного від людського.
Як правило, гуманізоване антитіло містить один або більше варіабельних доменів, у яких НМУЕ, наприклад СОК (або їх частини) одержані з антитіла, відмінного від людського, а ЕК (або їх частини) одержані з послідовностей людських антитіл. Гуманізоване антитіло необов'язково також включатиме щонайменше частину константної ділянки людини. У деяких варіантах здійснення деякі залишки ЕК у гуманізованому антитілі замінені відповідними залишками з антитіла, відмінного від людського (наприклад, антитіла, з якого одержані залишки НМК), наприклад, для відновлення або поліпшення специфічності або афінності антитіл.
Гуманізовані антитіла та способи їх створення описані, наприклад, у АІтадго апа Егапв55оп,
Егопі. Віозсі. 13: 1619-1633 (2008), а також додатково описані, наприклад, в Кіесптапп еї аї.,
Маїште 332: 323-329 (1988); Оцееп еї аїЇ., Ргос. Майї! Асай. сі. ОБА 86:10029-10033 (1989); патентах США МоМо 5821337, 7527791, 6982321 та 7087409; КазПтіїгі єї аІ., Меїтосдіз 36: 25-34 (2005) (описано трансплантацію ділянки, що визначає специфічність (ЗОК)); Радіап, Мої.
Іттипої. 28: 489-498 (1991) (описано "зміну поверхні"); ОаІГАсдпа еї а!., Меїпоа» 36: 43-60 (2005) (описано "шафлінг ЕК"); та ОзБбоцтпт вї а!., Меїподіз 36: 61-68 (2005), та Кіїтка еї а!., Вг. У. Сапсег, 83: 252-260 (2000) (описано підхід "спрямованої селекції" для шафлінгу ЕК).
Каркасні ділянки людини, які можуть бути використані для гуманізації, включають без обмеження каркасні ділянки, вибрані за допомогою способу "найкращого наближення" (див., наприклад, 5ітв еї аї.,.». Іттипої. 151: 2296 (1993)); каркасні ділянки, одержані з консенсусної послідовності людських антитіл певної підгрупи варіабельних ділянок легкого або важкого ланцюгів (див., наприклад, Сапег єї аї., Ргос. Маї). Асад. сі. ОА, 89: 4285 (1992); та Ргевіа єї а), У. Іттипої., 151: 2623 (1993)); зрілі (у яких відбулися соматичні мутації) каркасні ділянки людини або каркасні ділянки зародкової лінії людини (див., наприклад, АІтадго апа Егапвзоп,
Екопі. Віовсі. 13: 1619-1633 (2008)); та каркасні ділянки, одержані в результаті скринінгу бібліотек ЕК (див., наприклад, Васа єї аї!., у. ВіоїЇ. Спет. 272: 10678-10684 (1997), та Козок еї аї.,
У. ВіоІ. Спет. 271: 22611-22618 (1996)). 4. Людські антитіла
У певних варіантах здійснення антитіло, представлене в даному документі, являє собою людське антитіло. Людські антитіла можуть бути одержані з використанням різних методик, відомих у даній галузі. Людські антитіла описані загалом у мап бі)К та мап де М/іпКеї, Ситт. Оріп.
Ріаптасої. 5: 368-374 (2001), та І опрего, Сит. Оріп. Іттипої. 20: 450-459 (2008).
Людські антитіла можуть бути одержані шляхом введення імуногену трансгенній тварині, яка була модифікована для одержання інтактних людських антитіл або інтактних антитіл із людськими варіабельними ділянками у відповідь на антигенну дію. Такі тварини, як правило, містять усі локуси імуноглобулінів людини або їх частину, які замінюють ендогенні локуси імуноглобулінів, або які присутні позахромосомно або інтегровані в хромосоми тварини у довільному порядку. У таких трансгенних мишей ендогенні локуси імуноглобулінів були загалом інактивовані. Огляд способів одержання людських антитіл від трансгенних тварин див. у
Гопрего, Маї. Віоїтесп. 23: 1117-1125 (2005). Див. також, наприклад, патенти США МоМо 6075181 та 6150584, де описана технологія ХЕМОМОИБЕТМ: патент США Мо 5770429, де описана технологія НиМар (зареєстрована торгова марка); патент США Мо 7041870, де описана технологія К-М МОШЗ5Е (зареєстрована торгова марка), та публікацію заявки на патент США Мо 5 2007/0061900, де описана технологія МеіосімМоизе (зареєстрована торгова марка). Людські варіабельні ділянки з інтактних антитіл, що продукуються такими тваринами, можуть бути додатково модифіковані, наприклад, шляхом їх об'єднання з іншою константною ділянкою людини.
Людські антитіла також можуть бути одержані за допомогою способів на основі використання гібридом. Описано лінії клітин мієломи людини та гетеромієломи людини та миші для одержання моноклональних людських антитіл (див., наприклад, Ко2рог 9. Іттипої., 133: 3001 (1984); Вгодешиг єї аІ., Мопосіопа! Апіроду Ргодисіоп Тесппіднез апа Арріісайопв5, рр. 51-63 (Магсе! ОекККег, Іпс., Мем/ ХогК, 1987); та Воегпег еї аї., У. Іттипої., 147: 86 (1991)). Людські 60 антитіла, одержані за допомогою технології В-клітинної гібридоми людини, також описані в Гі єї аІ.,, Ргос. Маї. Асай. 5сі. ОБА, 103: 3557-3562 (2006). Додаткові способи включають способи, описані, наприклад, у патенті США Мо 7189826 (описано одержання моноклональних антитіл
ЇІОМ людини з ліній клітин гібридоми) та Мі, Хіапдаї Міапуїхиє, 26(4): 265-268 (2006) (описано гібридоми типу "людина-людина"). Технологія гібридом людини (Тгіота (есппоЇоду) також описана у МоПтегз апа Вгапаїеїп, Нізіоіоду апа Нізіорашйоїіоду, 20(3): 927-937 (2005), та МоПтегв апа Вгапаїєїп, Меїнод»5 апа Ріпаіпд5 іп Ехрепітепіа! апа Сіїпіса! Рнаптасоіоаду, 27(3): 185-191 (2005).
Людські антитіла також можуть бути одержані шляхом виділення послідовностей варіабельних доменів Ру-клону, вибраних із бібліотек фагових дисплеїв, одержаних від людини.
Такі послідовності варіабельних доменів потім можна об'єднати з необхідним константним доменом людини. Нижче описані методики відбору людських антитіл з бібліотек антитіл. 5. Антитіла, одержані з бібліотек
Антитіла за даним винаходом можуть бути виділені шляхом скринінгу комбінаторних бібліотек щодо наявності антитіл з необхідною активністю або видами активності. Наприклад, у даній галузі відомі різноманітні способи генерування бібліотек фагових дисплеїв та скринінгу таких бібліотек щодо наявності антитіл, що характеризуються необхідними характеристиками зв'язування. Такі способи розглядаються, наприклад, у Ноодепроот єї аЇ., в Меййовд5 іп
Моїесшіаг Віоіоду 178: 1-37 (О'"Віїєп еї а!., ед., Нитап Ргев5, Тоїсула, МУ, 2001), та додатково описані, наприклад, у МсеСайепу еї а!., Маїшге 348: 552-554; СІаскзоп еї аї!., Майте 352: 624-628 (1991); Магїкз еї аї., 9. Мої. Віої. 222: 581-597 (1992); Магк5 апа Вгадригу, в Меїйоавз іп МоІесшаг
Віоіоду 248: 161-175 (Го, ед., Нитап Ргез5, Тоїоула, МУ, 2003); 5ідапи еї аї., У. Мої. Віо!ї. 3938(2): 299-310 (2004); І ее еї аї., У. Мої. Віої. 340(5): 1073-1093 (2004); РеПоивзе, Ргос. Май). Асай. 5сі.
ИБА 101(34): 12467-12472 (2004); та І ее еї аї., 9. Іттипої. Меїнодз 284(1-2): 119-132 (2004).
У певних способах з використанням фагових дисплеїв репертуари генів МН та МІ окремо клонують шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та рекомбінують у довільному порядку у фагових бібліотеках, які потім можна піддавати скринінгу щодо наявності антигензв'язувального фагу, як описано у М/іпіег еї аї., Апп. Неу. Іттипої., 12: 433-455 (1994).
Фаги зазвичай представляють фрагменти антитіл або у вигляді одноланцюгових Ем-фрагментів (зсЕм), або у вигляді ЕРар-фрагментів. Бібліотеки з імунізованих донорних організмів забезпечують антитіла з високою афінністю щодо імуногену без необхідності конструювання гібридом. Як альтернатива, можна клонувати репертуар від донора без обробки (наприклад, від людини) для забезпечення єдиного донора антитіл до широкого спектра антигенів, що не є власними, та власних антигенів без будь-якої імунізації, як описано у сгіййн5 єї а)., ЕМВО ., 12: 725-734 (1993). Нарешті, бібліотеки від донора без обробки також можна створити синтетичним шляхом за допомогою клонування сегментів М-гена, що не підлягали перегрупуванню, зі стовбурових клітин та з використанням ПЛР-праймерів, що містять випадкову послідовність, для кодування високоваріабельних ділянок СОКЗ та здійснення перегрупування іп мійго, як описано в НоодепБроот та У/іпієг, ). Мої. Віоі., 227: 381-388 (1992). Патентні публікації, в яких описано фагові бібліотеки людських антитіл, включають, наприклад: патент США Мо 5750373 і публікації заявок на патент США МоМо 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 та 2009/0002360.
Антитіла або фрагменти антитіл, виділені з бібліотек людських антитіл, у даному документі розглядаються як людські антитіла або фрагменти людських антитіл. 6. Поліспецифічні антитіла
У певних варіантах здійснення антитіло, представлене в даному документі, є поліспецифічним антитілом, наприклад біспецифічним антитілом. Поліспецифічні антитіла являють собою моноклональні антитіла, які характеризуються специфічністю зв'язування щонайменше щодо двох різних сайтів. У певних варіантах здійснення одна із одиниць специфічності зв'язування направлена на СТІ А-4, а інша - на будь-який інший антиген. У певних варіантах здійснення біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися з двома різними епітопами СТІ А-4. Біспецифічні антитіла також можна застосовуватися для забезпечення локалізації цитотоксичних засобів у клітинах, які експресують СТІ А-4. Біспецифічні антитіла можуть бути одержані у вигляді повнорозмірних антитіл або фрагментів антитіл.
Методики створення поліспецифічних антитіл включають без обмеження рекомбінантну коекспресію двох пар важкий ланцюг-легкий ланцюг імуноглобуліну, що мають різну специфічність (див. Міївієїп та Сцеїо, Маїште 305: 537 (1983)), ЛО 93/08829 та Тгашипескег еї аї.,
ЕМВО .. 10: 3655 (1991)), а також конструювання за принципом "виступ в западину" (див., наприклад, патент США Мо5731168). Поліспецифічні антитіла також можуть бути одержані шляхом конструювання із застосуванням ефекту електростатичної взаємодії для одержання Ес- 60 гетеродимерних молекул (МО 2009/089004А1); зшивання двох або більше антитіл або фрагментів (див., наприклад, патент США Мо 4676980 та Вгеппап вї а!., 5сіепсе, 229: 81 (1985)); використання "лейцинових застібок" для одержання біспецифічних антитіл (див., наприклад,
Козів!Іпу еї аї., У. Іттипої., 148(5): 1547-1553 (1992)); використання технології "діатіло" для створення фрагментів біспецифічних антитіл (див., наприклад, НоїІїпдег еї аї., Ргос. Маї!. Асад. зЗсі. ОБА, 90: 6444-6448 (1993)); використання одноланцюгових димерів Ем (5сЕм) (див., наприклад, Сстгибег еї аї., у. Іттипої., 152: 5368 (1994)); та одержання триспецифічних антитіл, як описано, наприклад, у Тий еї а|!., у. Іттипої. 147: 60 (1991).
Сконструйовані антитіла з трьома або більше функціональними антигензв'язувальними сайтами, зокрема "антитіла-восьминоги", також включені в даний документ (див., наприклад, 05 2006/0025576А1).
Антитіло або його фрагмент також включає "Бар подвійної дії" або "ОАЕ", що містить антигензв'язувальний сайт, який зв'язується з СТІ А-4, а також з іншим антигеном, що відрізняється (див., патент США 2008/0069820, наприклад). 7. Варіанти антитіл
У певних варіантах здійснення розглядаються варіанти амінокислотних послідовностей антитіл, представлених у даному документі. Наприклад, може бути необхідно поліпшити афінність зв'язування та/або інші біологічні властивості антитіла. Варіанти амінокислотної послідовності антитіла можуть бути одержані шляхом введення відповідних модифікацій у нуклеотидну послідовність, що кодує антитіло, або шляхом синтезу пептидів. Такі модифікації включають, наприклад, делеції та/"або вставки та/або заміни залишків у амінокислотних послідовностях антитіла. Для одержання остаточної конструкції може бути виконана будь-яка комбінація делеції вставки та заміни за умови, що остаточна конструкція буде характеризуватися необхідними характеристиками, наприклад, зв'язуванням антигена. а) Варіанти заміни, вставки та делеції
У певних варіантах здійснення представлені варіанти антитіл, що мають одну або декілька амінокислотних замін. Сайти, що становлять інтерес, для замісного мутагенезу включають НУК та ЕК. Консервативні заміни наведені в таблиці 1 під заголовком "переважні заміни". Більш суттєві зміни наведені в таблиці 1 під заголовком "зразкові заміни" та, як далі описано нижче, вони стосуються класів бічних ланцюгів амінокислот. Заміни амінокислот можуть бути введені в антитіло, що становить інтерес, і продукти піддані скринінгу щодо необхідної активності, наприклад, збережене/поліпшене зв'язування антигена, зниження імуногенності або поліпшену
АрСС або СОС.
Таблиця 1 залишок заміни заміни
Ше(д 77711111 бешоМа;МекА2а;Рпеснорлейцин./:/ ви /: с: /З їец(у 111111 НорлейцинйеоМа;МекАюв Ред /-:/ Ле ' б
Амінокислоти можуть бути розділені на групи в залежності від їх спільних властивостей бічних ланцюгів: (1) гідрофобні: норлейцин, метіонін (Мей), аланін (Аа), валін (Маї), лейцин (І еи) та ізолейцин (Пе); (2) нейтральні та гідрофільні: цистеїн (Су), серин (5ег), треонін (ТНг), аспарагін (Азп) та глутамін (Сп); (3) кислотні: аспартат (Азр) та глутамат (Си); (4) основні: гістидин (Нів), лізин (І уз) та аргінін (Ага); (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: гліцин (Су) і пролін (Рго); та (6) ароматичні: триптофан (Тгр), тирозин (Туг) і фенілаланін (Ре).
Неконсервативне заміщення стосується заміни представника одного з цих класів представником з іншого класу.
Один тип варіанта з заміною передбачає заміну одного або більше залишків гіперваріабельної ділянки вихідного антитіла (наприклад, гуманізованого або людського антитіла). Як правило, одержаний варіант(варіанти), відібраний для подальшого дослідження, матиме модифікації (наприклад, поліпшення) певних біологічних властивостей (наприклад, підвищену афінність, знижену імуногенність) відносно вихідного антитіла та/або матиме суттєвою мірою збережені певні біологічні властивості вихідного антитіла. Зразковим варіантом з заміною є антитіло із зрілою афінністю, яке може бути одержане зручним способом, наприклад, з використанням методик дозрівання афінності на основі фагових дисплеїв, таких як описані в даному документі. Коротко, один або більше залишків НУК піддають мутації і варіанти антитіл представляють на фагові та піддають скринінгу щодо конкретної біологічної активності (наприклад, афінність зв'язування).
У НМК можна вносити варіанти змінення (наприклад, заміни), наприклад, для поліпшення афінності антитіл. Такі варіанти змінення можуть бути внесені в "гарячі точки" НМК, тобто залишки, кодовані кодонами, які піддаються мутації з високою частотою під час процесу соматичного дозрівання (див., наприклад, Споулапигу, Меїпоаз Мої. Віої. 207: 179-196 (2008)), та/або залишки, що контактують з антигеном, з одержанням варіанта УН або МІ, який тестують щодо афінності зв'язування. Дозрівання афінності шляхом конструювання та повторного відбору з вторинних бібліотек було описано, наприклад, у Ноодепроот еї аї., в Мейїйовдв5 іп
Моїесшіаг Віоіоду 178: 1-37 (О'Втієп еї аї., ед., Нитап Ргев5, Тоїоула, М), (2001)). У деяких варіантах здійснення дозрівання афінності різноманітність вводять у варіабельні гени, вибрані для дозрівання, будь-яким із ряду способів (наприклад, ПЛР зі схильністю до помилок, шафлінг ланцюгів або олігонуклеотид-спрямований мутагенез). Потім створюється вторинна бібліотека.
Потім бібліотеку піддають скринінгу для ідентифікації будь-яких варіантів антитіл із необхідною афінністю. Інший спосіб забезпечення різноманітності включає підходи, спрямовані на НМЕ, в яких декілька залишків НМК (наприклад, 4-6 залишків одночасно) піддають рандомізації.
Залишки НМК, які беруть участь у зв'язуванні антигена, можна специфічно ідентифікувати, наприклад, за допомогою аланін-сканувального мутагенезу або моделювання. Зокрема, мішенями часто є СОК-НЗ і СОК-І 3.
У певних варіантах здійснення заміни, вставки або делеції можуть зустрічатися в межах однієї або більше НМК, за умов, що такі варіанти змінення не суттєво зменшують здатність антитіла зв'язувати антиген. Наприклад, у НМК можуть бути внесені консервативні варіанти змінення (наприклад, консервативні заміни, представлені в даному документі), які суттєво не зменшують афінність зв'язування. Такі варіанти змінення можуть відбуватися, наприклад, поза залишками, що контактують з антигеном, у НМК. У певних варіантах здійснення варіантів послідовностей МН та МІ, наведених вище, кожна НМК або не змінюється, або містить не більше однієї, двох або трьох амінокислотних замін.
Застосовний спосіб для ідентифікації залишків або ділянок антитіла, які можуть бути мішенями для мутагенезу, називається "аланін-сканувальний мутагенез", як описано у
Сиппіпдпат апа У/еїз (1989) Зсіепсе, 244: 1081-1085. У цьому способі залишок або групу цільових залишків (наприклад, заряджені залишки, такі як аго, азр, Пів, Іуз та дій) ідентифікують і замінюють нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, аланіном або поліаланіном) для визначення того, чи здійснюється вплив на взаємодію антитіла з антигеном.
Подальші заміни можуть бути введені в місцях розташування амінокислот, що демонструє функціональну чутливість до початкових замін. Альтернативно або додатково можна проаналізувати кристалічну структуру комплексу антиген-антитіло для визначення точок контакту між антитілом та антигеном. Такі контактні залишки та сусідні залишки можуть бути мішенями або усунені як кандидати для заміни. Варіанти можна піддавати скринінгу для 60 визначення того, чи притаманні їм необхідні властивості.
Вставки амінокислотних послідовностей включають вставки шляхом злиття з аміно- та/або карбоксикінцем, довжина яких варіює від одного залишку до поліпептидів, що містять сотню або більше залишків, а також вставки всередині послідовності одиничних або множинних амінокислотних залишків. Приклади кінцевих вставок включають антитіло з М-кінцевим метіоніловим залишком. Для молекули антитіла інші варіанти вставки включають злиття ферменту (наприклад, для АЮЕРТ) або поліпептиду, який забезпечує збільшення періоду напіввиведення антитіла з плазми крові, з М- або С-кінцем антитіла. р) Варіанти глікозилювання
У певних варіантах здійснення антитіло, представлене в даному документі, змінюють для збільшення або зменшення ступеня глікозилювання антитіла. Додавання або видалення сайтів глікозилювання до антитіла для зручності може бути здійснено шляхом зміни амінокислотної послідовності таким чином, щоб створити або видалити один або більше сайтів глікозилювання.
Якщо антитіло містить Ес-ділянку, приєднаний до неї вуглевод може бути змінений. Нативні антитіла, що виробляються клітинами ссавців, зазвичай містять розгалужений двоантенарний олігосахарид, який, як правило, приєднаний М-зв'язком до Азп297 домену СНО Ес-ділянки. Див., наприклад, УУгідні еї аї., ТІВТЕСН 15: 26-32 (1997). Олігосахарид може включати різні вуглеводи, наприклад, манозу, М-ацетилглюкозамін (СіІсСМАс), галактозу та сіалову кислоту, а також фукозу, приєднану до СісМАс у "стовбурі" двоантенарної олігосахаридної структури. У деяких варіантах здійснення модифікації олігосахариду в антитілі за даним винаходом можуть бути здійснені з метою створення варіантів антитіл з певними поліпшеними властивостями.
В одному варіанті здійснення представлені варіанти антитіл, що мають вуглеводну структуру, у якій відсутня фукоза, приєднана (прямо або опосередковано) до Ес-ділянки.
Наприклад, кількість фукози в такому антитілі може становити від 1 95 до 80 95, від 1 95 до 65 95, від 595 до 65 95 або від 2095 до 40 95. Кількість фукози визначають шляхом обчислення середньої кількості фукози у цукровому ланцюзі на Азп297 відносно суми всіх глікоструктур, приєднаних до Авп 297 (наприклад, складних, гібридних та високоманозних структур), виміряної за допомогою мас-спектрометрії МА 0І-ТОБЕ, як описано, наприклад, в МО 2008/077546. Азп297 стосується залишку аспарагіну, розташованого приблизно у положенні 297 в Ес-ділянці (нумерація БО залишків Ес-ділянки); однак, А5зп297 також може бути розташований на приблизно -/- З амінокислоти вище або нижче від положення 297, тобто між положеннями 294 і 300, внаслідок наявності незначних змін послідовностей в антитілах. Такі варіанти фукозилювання можуть характеризуватися поліпшеною функцією АОСС. Див., наприклад, публікації патентів США МоМе 05 2003/0157108 (Ргевіа, Г.); 05 2004/0093621 (Куоша Накко
Кодуо Со., ЦЯ). Приклади публікацій, що стосуються варіантів "дефукозильованих" або "фукозодефіцитних" антитіл, включають: О5 2003/0157108; МО 2000/61739; МО 2001/29246; 05 2003/0115614; 05 2002/0164328; 05 2004/0093621; 005 2004/0132140; 005 2004/0110704; 5 2004/0110282; 005 2004/0109865; МО 2003/085119; МО 2003/084570; МО 2005/035586;. МО 2005/035778; МО2005/053742; М О2002/031140; ОКалакі еї аї., У. Мої. Вії. 336: 1239-1249 (2004);
Уатапе-Онпикі еї а!., Віоїесі. Віоепо. 87: 614 (2004). Приклади ліній клітин, здатних продукувати дефукозильовані антитіла, включають клітини Гес13 СНО з дефіцитом фукозилювання білка (Нірка еї аї., Атгсй. Віоспет. Віорпу5. 249: 533-545 (1986); заявка на патент США Мо 5 2003/0157108 АТ, Ргезіа, І; та МО 2004/056312 А1, Адатз евї аї., зокрема в прикладі 11), і лінії клітин, нокаутних, наприклад, за геном альфа-1,6-фукозилтрансферази, БОТВ8, нокаутні клітини
СНО (див., наприклад, Уатапе-ОНпикі еї аї., Віоїесн. Віоепд. 87: 614 (2004); Капаа, У. еї аї.,
Віотесппої. Віоепо., 94(4): 680-688 (2006); та УМО 2003/085107).
Варіанти антитіл додатково забезпечуються олігосахаридами з двох частин, наприклад, у яких двоантенарний оолігосахарид, приєднаний до Ес-ділянки антитіла, поділяється за допомогою (ІсСМАс. Такі варіанти антитіл можуть характеризуватися зменшеним рівнем фукозилювання та/або поліпшеною функцією АОСС. Приклади таких варіантів антитіл описані, наприклад, у УМО 2003/011878 (УуЧеап-Маїгеї єї аІ.); патент США Мо 6602684 (тапа еї а!.) та 5 2005/0123546 (тапа еї аІ.-). Також представлені варіанти антитіл з щонайменше одним залишком галактози в олігосахариді, приєднаним до Ес-ділянки. Такі варіанти антитіл можуть характеризуватися поліпшеною функцією СОС. Такі варіанти антитіл описані, наприклад, в УМО 1997/30087 (Рагеї! еї аІ.); УМО 1998/58964 (Каїсй, 5.); і УМО 1999/22764 (Каїсч, 5.). с) Варіанти Ес-ділянок
У певних варіантах здійснення одна або більше амінокислотних модифікацій можуть бути введені в Ес-ділянку антитіла, представленого в даному документі, з одержанням таким чином варіанта Ес-ділянки. Варіант Ес-ділянки може містити послідовність Ес-ділянки людини (наприклад, Ідс1, Ідс2, ДОЗ або Ідсб4 Ес-ділянки людини), що характеризуєтеся наявністю 60 модифікації амінокислоти (наприклад, заміни) в одному або більше положеннях амінокислот.
У певних варіантах здійснення даного винаходу розглядається варіант антитіла, який характеризується деякими, але не всіма ефекторними функціями, що робить його бажаним кандидатом для варіантів застосування, в яких є важливим період напіввиведення антитіла іп мімо, але деякі ефекторні функції (такі як комплемент та АОСС) є непотрібними або шкідливими.
Для підтвердження зниження/елімінації активності СОС та/або АОСС можна проводити аналізи цитотоксичності іп мйго та/або іп мімо. Наприклад, можна проводити аналізи зв'язування Ес- рецепторів (ГСК), щоб упевнитися в тому, що антитілу не притаманне зв'язування з Есук (отже, ймовірно, не притаманна АЮСсС-активність), але воно зберігає здатність зв'язування ЕсКп.
Первинні клітини для опосередкування АЮСС, МК-клітини, експресують тільки ЕсукКІїї, тоді як моноцити експресують ЕсукіІ, ЕсукіЇ та ЕсукіІй. Експресія БСК на гемопоетичних клітинах узагальнена в таблиці З на сторінці 464 в Камеїсі апа Кіпеї, Аппи. Кеу. Іттипої!. 9: 457-492 (1991). Необмежувальні приклади аналізів іп мйго для оцінки АЮОСС-активності молекули, що становить інтерес, описані в патенті США Мо 5500362 (див., наприклад, Неї|Івігот, І. еї аї., Ргос.
Маг! Асай. сі. ОБА 83: 7059-7063 (1986)), та НеїЇвігот, І! єї аї!., Ргос. Маг! Асай. 5сі. ОБА 82: 1499-1502 (1985); 5821337 (див. Вгиддетапп, М. еї аї., У. Ехр. Мей. 166: 1351-1361 (1987)).
Альтернативно можуть бути застосовані способи, що не стосуються радіоактивного аналізу (див., наприклад, нерадіоактивний аналіз цитотоксичності АСТІ"М для проточної цитометрії (СеПтесппоЇоду, Іпс. Маунтін-В'ю, Каліфорнія; і СуоТох 96 (зареєстрована торгова марка), нерадіоактивний аналіз цитотоксичності (Рготеда, Медісон, Вісконсін). Застосовні ефекторні клітини для таких аналізів включають мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) та природні клітини-кілери (МК). Як альтернатива або доповнення, АОСС-активність молекули, що становить інтерес, можна оцінити іп мімо, наприклад в моделі на тварині, такій як розкрита в
Сіупез еї аї. Маг! Асад. 5сі. ОБА 95: 652-656 (1998). Аналізи зв'язування С14д також можуть бути проведені для підтвердження того, що антитіло не здатне зв'язувати Сід, і отже воно позбавлено СОС-активності. Див., наприклад, ЕЇІ5А на зв'язування Сід і СЗс в УМО 2006/029879 ії УМО 2005/100402. Для оцінки активації комплементу може бути проведений аналіз
СОС (див., наприклад, Са7апо-Запіого еї аї., у). Іттипої. Меїноаз 202: 163 (1996); Стадо, М.5. еї аї., Віоса 101: 1045-1052 (2003); та Стадо, М.5. та М.). СіІеппіє, Віоса 103: 2738-2743 (2004)).
Зв'язування ЕсКп та визначення кліренсу/часу напівжиття іп мімо також можна виконувати із застосуванням способів, відомих з рівня техніки (див., наприклад, Реїкома, 5.В. єї аї., Ійг1.
Іттипої!. 18(12): 1759-1769 (2006)).
Антитіла зі зниженою ефекторною функцією включають антитіла із заміною одного або більше із залишків Ес-ділянки 238, 265, 269, 270, 297, 327 та 329 (патент США Мо 6737056). Такі мутантні варіанти Ес включають мутантні варіанти Ес із замінами у двох або більше положеннях амінокислот 265, 269, 270, 297 та 327, у тому числі так званий мутантний варіант Ес "САМА" із заміщенням залишків 265 та 297 на аланін (патент США Мо 7332581).
Описані деякі варіанти антитіл з підвищеним або зниженим рівнем зв'язуванням з ЕсК (див., наприклад, патент США Мо 6737056; МО 2004/056312 та ЗНівїдз еї аї., У. Вісі. Снет. 9(2): 6591- 6604 (2001)).
У певних варіантах здійснення варіант антитіла містить Ес-ділянку з однією або більше амінокислотними замінами, які забезпечують поліпшення АЮОСС, наприклад, замінами в положеннях 298, 333 та/або 334 Ес-ділянки (нумерація залишків за ЕМ).
У деяких варіантах здійснення в Ес-ділянку вносяться зміни, що приводять до зміни (тобто збільшених або зменшених) зв'язування С14д та/або комплемент-залежної цитотоксичності (СОС), наприклад, як описано в патенті США Мо 6194551, УЛО 99/51642 та Ідизодіє еї аї., 4.
Ітітипої. 164: 4178-4184 (2000).
Антитіла зі збільшеними значеннями часу напівжиття та підвищеним рівнем зв'язування з неонатальним Ес-рецептором (ЕсКп), який відповідає за передачу материнських ДО плоду (Сциуег еї аї., У. Іттипої. 117: 587 (1976); та Кіт еї аї., У. Іттипої. 24: 249 (1994)), описані в
БО О52005/0014934А1 (Ніпоп еї а1.). Такі антитіла містять Ес-ділянку з однією або більше замінами в них, які забезпечують збільшення рівня зв'язування Ес-ділянки з ЕсКп. Такі Ес-варіанти включають варіанти із замінами в одному або більше із залишків Ес-ділянки 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 або 434, наприклад, заміною залишку 434 Ес-ділянки (патент США Мо 7377126).
Див. також Юипсап «5 Уміпіег, Маїшге 322: 738-740 (1988); патент США Мо 5648260, патент
США Мо 5624821 та УМО 94/29351, що стосуються інших прикладів варіантів Ес-ділянки. а) Сконструйовані варіанти антитіл з доданим цистеїном
У певних варіантах здійснення може бути необхідно створити сконструйовані антитіла з доданим цистеїном, наприклад "(піомМАбБ", в яких один або більше залишків антитіла замінені 60 залишками цистеїну. У конкретних варіантах здійснення замінювані залишки знаходяться у доступних сайтах антитіла. У разі заміни таких залишків цистеїном, реакційноздатні тіолові групи таким чином розміщуються на доступних сайтах антитіла і можуть бути використані для кон'югування антитіла з іншими фрагментами, такими як фрагменти лікарських засобів або фрагменти лінкер-лікарський засіб, для створення імунокон'югата, як описано далі в даному документі. У певних варіантах здійснення будь-який один або більше з наведених залишків можуть бути замінені цистеїном: М205 (нумерація за Кабаї) легкого ланцюга; А118 (нумерація
Е)О) важкого ланцюга; та 5400 (нумерація ЕО) Ес-ділянки важкого ланцюга. Сконструйовані антитіла з доданим цистеїном можуть бути одержані, як описано, наприклад, у патенті США Мо 7521541. е) Похідні антитіл
У певних варіантах здійснення антитіло, представлене в даному документі, може бути додатково модифіковано таким чином, щоб воно містило додаткові небілкові фрагменти, які відомі в даній галузі та легко доступні. Фрагменти, придатні для дериватизації антитіла, включають без обмеження водорозчинні полімери. Необмежувальні приклади водорозчинних полімерів включають без обмеження поліетиленгліколь (РЕС), співполімери етиленгліколю/пропіленгліколю, карбоксиметилцелюлозу, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, полі-1,3-діоксолан, полі-1,3,6-триоксан, співполімер етилен/малеїнового ангідриду, поліамінокислоти (або гомополімери, або статистичні співполімери) і декстран або полі(н-вінілпіролідон)поліетиленгліколь, поліпропіленгліколеві гомополімери, співполімери поліпропіленоксиду/етиленоксиду, поліоксиетильовані багатоатомні спирти (наприклад, гліцерин), полівініловий спирт та їх суміші. Пропіональдегід поліетиленгліколю може мати переваги у виробництві завдяки його стабільності у воді. Полімер може мати будь-яку молекулярну масу, і може бути розгалуженим або нерозгалуженим. Кількість полімерів, приєднаних до антитіла, може варіювати, і якщо приєднано більше ніж один полімер, вони можуть являти собою однакові або різні молекули. Загалом, кількість та/або тип полімерів, що застосовуються для дериватизації, можна визначити, виходячи з міркувань, що включають без обмеження конкретні властивості або функції антитіла, яке слід поліпшити, а також того, чи буде похідна антитіла застосовуватися в терапії у визначених умовах тощо.
В іншому варіанті здійснення представлені кон'югати антитіла та небілкового фрагмента, які можуть вибірково нагріватися під впливом випромінювання. В одному варіанті здійснення небілковий фрагмент являє собою вуглецеву нанотрубку (Кат еї аї., Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА 102: 11600-11605 (2005)). Випромінювання може являти собою випромінювання будь-якої довжини хвилі і передбачає без обмеження довжини хвиль, за яких не завдається шкода звичайним клітинам, але при цьому небілковий фрагмент нагрівається до температури, за якої клітини, близькі до антитіла з небілюовим фрагментом, знищуються.
В. Способи на основі рекомбінантної ДНК та композиції для їх здійснення
Антитіла можуть бути одержані із застосуванням способів на основі рекомбінантної ДНК та композицій для їх здійснення, наприклад, як описано в патенті США Мо 4816567. В одному варіанті здійснення представлено виділену нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло до СТІ А-4, описане в даному документі. Така нуклеїнова кислота може кодувати амінокислотну послідовність, що містить МІ, та/або амінокислотну послідовність, що містить МН антитіла (наприклад, легкі та/або важкі ланцюги антитіла) У наступному варіанті здійснення представлено один або більше векторів (наприклад, векторів експресії), що містять таку нуклеїнову кислоту. В іншому варіанті здійснення представлено клітину-хазяїна, що містить таку нуклеїнову кислоту. В одному з таких варіантів здійснення клітина-хазяїн містить (наприклад, була трансформована з використанням наступного): (1) вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить МІ. антитіла, і амінокислотну послідовність, що містить МН антитіла, або (2) перший вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить МІ. антитіла, і другий вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить МН антитіла. В одному варіанті здійснення клітина-хазяїн є еукаріотичною клітиною, наприклад клітиною яєчника китайського хом'яка (СНО) або лімфоїдною клітиною (наприклад, клітиною МО, М50, Зр2/0). В одному варіанті здійснення представлено спосіб одержання антитіла до СТІ А-4, де спосіб включає культивування клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антитіло, представлене вище, за умов, придатних для експресії антитіла до СТІ А-4, і необов'язково виділення антитіла з клітини-хазяїна (або культурального середовища для клітини-хазяїна).
Для рекомбінантного продукування антитіла до СТІ А-4 нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, наприклад описане вище, виділяють і вставляють в один або більше векторів для подальшого клонування та/або експресії в клітині-хазяїні. Таку нуклеїнову кислоту можна легко бо виділити та секвенувати за допомогою загальноприйнятих процедур (наприклад, за допомогою олігонуклеотидних зондів, здатних до специфічного зв'язування з генами, що кодують важкі й легкі ланцюги антитіла).
Відповідні клітини-хазяї для клонування або експресії векторів, що кодують антитіла, включають описані в даному документі прокаріотичні або еукаріотичні клітини. Наприклад, антитіла можна одержувати з бактерій, зокрема, якщо глікозилювання та ефекторна функція Ес не потрібні. Щодо експресії фрагментів антитіл і поліпептидів у бактеріях, див., наприклад, патенти США МоМо 5648237, 5789199 та 5840523 (див. також Спапоп, Меїтоаз іп МоіІесшаг
Віоіоду, Мої. 248 (В.К.С. Го, ед., Нитапа Ргезз5, Тоїомжа, МУ, 2003), рр. 245-254, де описано експресію фрагментів антитіл в Е. сої). Після експресії антитіло може бути виділено з маси бактеріальних клітин у розчинній фракції і може бути додатково очищено.
Додатково до прокаріотів еукаріотичні мікроорганізми, такі як ниткоподібні гриби або дріжджі, є хазяїнами, придатними для клонування або експресії векторів, що кодують антитіла, у тому числі штами грибів і дріжджів, сигнальні шляхи глікозилювання яких "гуманізовані", що приводить до продукування антитіла з частковим або повним патерном глікозилювання людини.
Див. Сепаогов5, Маї. Віотесі. 22: 1409-1414 (2004), та І і еї аї., Маї. Віоїтесі. 24: 210-215 (2006).
Відповідні клітини-хазяї для експресії глікозильованих антитіл також одержують від багатоклітинних організмів (безхребетних і хребетних). Приклади клітин безхребетних включають клітини рослин та комах. Було виявлено низку штамів бакуловірусів, які можна використовувати спільно з клітинами комах, зокрема для трансфекції клітин Зродоріега
Мидірегаа.
Культури рослинних клітин також можна використовувати як хазяїв. Див., наприклад, патенти США Мо 5959177, Мо 6040498, Мо 6420548, Мо 7125978 та Мо 6417429 (описано технології Р АМТІВООІЕ5 М для продукування антитіл у трансгенних рослинах).
Клітини хребетних також можуть використовуватися як хазяї. Наприклад, застосовними можуть бути лінії клітин ссавців, які адаптовані для росту в суспензії. Іншими прикладами застосовних ліній клітин ссавців є лінія СМ1 нирки мавпи, трансформована 540 (СО5-7); лінія нирки ембріону людини (клітини 293 або 293, описані, наприклад, у Сгапат еї аї., У. Сеп Мігої. 36: 59 (1977)); клітини нирки дитинчат хом'яка (ВНК); клітини Сертолі миші (клітини ТМА4, описані, наприклад, у МайШег, ВіоІ. Нергоа. 23: 243-251 (1980)); клітини нирки мавпи (СМ1); клітини нирки африканської зеленої мавпи (МЕКО-76); клітини раку шийки матки людини (НЕГА); клітини нирки собак (МОСК); клітини печінки пацюків лінії буфало (ВК. ЗА); клітини легені людини (М/138); клітини печінки людини (гепатит 52); пухлина молочної залози миші (ММТ 060562); клітини ТЕ, описані, наприклад, у Маїнег єї а!., Аппа!є М.М. Асай. осі. 383: 44-68 (1982); клітини МКС 5 і клітини Е54. Інші застосовні лінії клітин-хазяїв ссавців включають клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), у тому числі клітини ОНЕКСНО (паб еї аї., Ргос. Маї!.
Асад. 5сі. ОБА 77: 4216 (1980)); і лінії клітин мієломи, такі як МО, М5О ї 5р2/0. Огляд певних ліній клітин-хазяїв ссавців, придатних для продукування антитіл, див., наприклад, в Уаакі апа Уми,
Меїйпоадз іп МоїІесшаг Віоіоду, Мої. 248 (В.К.С. І о, ед., Нитапа Ргев55, Тоїоула, МУ), рр. 255-268 (2003).
Поліклональні антитіла переважно одержують у тварин за допомогою декількох підшкірних (5с) або інтраперитонеальних (Ір) ін'єкцій відповідного антигена та ад'юванта. Може бути застосовним кон'югування відповідного антигена з білком, який є імуногенним у видах, що підлягають імунізації наприклад гемоціаніном молюска Медаїйпига сгепшціайа, альбуміном сироватки крові, тиреоглобуліном великої рогатої худоби або інгібітором трипсину сої, із застосуванням біфункціонального засобу або засобу для дериватизації, наприклад складного ефіру малеіїмідобензоїлсульфосукциніміду (кон'югування за допомогою залишків цистеїну), М- гідроксисукциніміду (за допомогою залишків лізину), глутаральдегіду, ангідриду бурштинової кислоти, ЗОСІ» або Е'"М-С-МЕ, де В та В! являють собою різні алкільні групи.
Тварин (зазвичай ссавців, відмінних від людини) імунізують щодо антигена, імуногенних
БО кон'югатів або похідних шляхом об'єднання, наприклад, 100 мкг або 5 мкг білка або кон'югата (для кроликів або мишей, відповідно) з З об'ємами повного ад'юванта Фрейнда та введення розчину за допомогою внутрішньошкірної ін'єкції в кілька ділянок. Через один місяць тварин стимулюють за допомогою від 1/5 до 1/10 початкової кількості пептиду або кон'югата в повному ад'юванті Фрейнда шляхом підшкірної ін'єкції в кількох ділянках. Через сім - 14 днів у тварин збирають кров і аналізують сироватку крові на титр антитіл. Тварин стимулюють до досягнення плато титру. Переважно, тварину стимулюють кон'югатом того самого антигена, але кон'югованим з іншим білком та/або за допомогою іншого реагенту для зшивання. Кон'югати також можуть бути одержані в культурі рекомбінантних клітин як продукти злиття білків. Крім того, засоби для агрегування, такі як галун, належним чином використовують для підвищення 60 імунної відповіді.
Моноклональні антитіла одержують із популяції по суті однорідних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають популяцію, є ідентичними, за винятком можливих природних мутацій та/або посттрансляційних модифікацій (наприклад, ізомеризації, амідації), які можуть бути присутні в незначних кількостях. Таким чином, визначення "моноклональний" вказує на характер антитіла як такого, що не є сумішшю окремих антитіл.
Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути одержані із застосуванням гібридомного способу, вперше описаного Копіег еї аї., Майте 256(5517): 495-497 (1975). У разі гібридомного способу мишу або іншу відповідну тварину-хазяїна, такого як хом'як, імунізують, як описано в даному документі вище, для забезпечення появи лімфоцитів, які продукують або здатні продукувати антитіла, які специфічно зв'язуються з білком, що використовується для імунізації.
Як альтернатива, лімфоцити можуть бути імунізовані іп міго.
Засіб для імунізації зазвичай містить антигенний білок або його варіант, одержаний шляхом злиття. Зазвичай використовують або лімфоцити периферичної крові (РВІ), якщо необхідні клітини людського походження, або клітини селезінки або клітини лімфатичних вузлів, якщо необхідні донорні організми, що належать до ссавців, відмінних від людини. Потім лімфоцити зливають з імморталізованою лінією клітин із застосуванням відповідного засобу для злиття, такого як поліетиленгліколь, з утворенням гібридомної клітини (Содіпуд, Мопосіопа! Апііїбодієв:
Рііпсірієз апа Ргасіїсе, Асадетіс Ргев5 (1986), рр. 59-103).
Імморталізовані лінії клітин зазвичай являють собою трансформовані клітини ссавців, зокрема клітини мієломи, одержані від гризунів, великої рогатої худоби та людини. Зазвичай використовують лінії клітин мієломи пацюка або миші. Одержані таким чином гібридомні клітини висівають та вирощують у придатному культуральному середовищі, яке переважно містить одну або більше речовин, що інгібують ріст або виживання незлитих вихідних клітин мієломи.
Наприклад, якщо в вихідних клітинах мієломи відсутній фермент гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансфераза (НСОРКТ або НРЕТ), то культуральне середовище для гібридом зазвичай буде містити гіпоксантин, аміноптерин та тимідин (середовище НАТ), які є речовинами, що запобігають росту НОРКТ-дефіцитних клітин.
Переважними імморталізованими клітинами мієломи є ті, що ефективно зливаються, підтримують стабільно високий рівень продукування антитіл вибраними клітинами, що продукують антитіла, та чутливі до середовища, такого як середовище НАТ. Серед них переважними є лінії мієломи миші, такі як лінії, одержані з пухлин миші МОРС-21 та МРО-11, доступні в Центрі розподілу клітин інституту Солка, Сан-Дієго, Каліфорнія, США, та клітини ЗР-2 (та їх похідні, наприклад Хб3-Ад8-653), доступні з Американської колекції типових культур,
Манассас, Вірджинія, США. Лінії клітин мієломи людини та лінії гетеромієломних клітин миші та людини також були описані для одержання людських моноклональних антитіл (Когбог еї аї.,..
Ітітипої. 133(6): 3001-3005 (1984); Вгодеитг еї а!., Мопосіопа! Апіїбоду Ргодисіп Тесппідце5 апа
Арріїсайоп5, Магсе! Оеккег, Іпс., Мему Моїк, рр. 51-63 (1987)).
Культуральне середовище, в якому вирощують гібридомні клітини, аналізують щодо продукування моноклональних антитіл до антигена. Переважно специфічність зв'язування моноклональних антитіл, що продукуються гібридомними клітинами, визначають за допомогою імунопреципітації або аналізу зв'язування іп міо, такого як радіоімунологічний аналіз (КІА) або імуноферментний аналіз (ЕГІ5А). Такі методики та аналізи відомі в даній галузі. Наприклад, афінність зв'язування можна визначити за допомогою аналізу Скетчарда з Мипзоп, Апаї|.
Віоспет. 107(1): 220-239 (1980).
Після ідентифікації гібридомних клітин, які продукують антитіла з необхідною специфічністю, афінністю та/або активністю, клони можна субклонувати за допомогою процедур граничних розведень та вирощувати за допомогою стандартних способів (Содіпд, вище). Придатні для цієї мети культуральні середовища включають, наприклад, середовище ЮО-МЕМ або КРМІ-1640.
Крім того, гібридомні клітини можна вирощувати іп мімо у вигляді пухлин у ссавців.
Моноклональні антитіла, що секретуються субклонами, відповідним чином відокремлюють від культурального середовища, асцитної рідини або сироватки крові за допомогою загальноприйнятих процедур очищення імуноглобуліну, таких як, наприклад, хроматографія на білку А-сефарозі, гідроксиапатиті, гель-електрофорез, діаліз або афінна хроматографія.
Антитіла можуть бути одержані шляхом імунізації відповідної тварини-хазяїна до антигена. В одному варіанті здійснення антиген являє собою поліпептид, що містить повнорозмірний СТІ А- 4. В одному варіанті здійснення антиген являє собою поліпептид, що містить розчинний СТІ А-4.
В одному варіанті здійснення антиген являє собою поліпептид, що містить ділянку, яка відповідає амінокислотам від положення 97 (бій) до положення 106 (Гей) людського СТІ А-4 (позаклітинний домен, 5ЕО ІЮО МО: 28). В одному варіанті здійснення антиген являє собою 60 поліпептид, що містить ділянку, яка відповідає амінокислотам від положення 99 (Ме) до положення 106 (Гей) людського СТІ А-4 (позаклітинний домен, ЗЕО ІО МО: 28). Також даний винахід передбачає антитіла, одержані шляхом імунізації тварини щодо антигена. Антитіла можуть передбачати будь-які ознаки, окремо або в комбінації, описані в наведеному вище розділі "Зразкові антитіла до СТІ А-4".
С. Аналізи
Представлені у даному документі антитіла до СТІ А-4 можуть бути ідентифіковані, піддані скринінгу або охарактеризовані за їх фізичними/хімічними властивостями та/або видами біологічної активності за допомогою різних аналізів, відомих у даній галузі. 1. Аналізи зв'язування та інші аналізи
В одному аспекті антитіло за даним винаходом тестують щодо його антигензв'язувальної активності, наприклад, за допомогою відомих способів, наприклад ЕЇГІ5А, вестерн-блот, поверхневий плазмонний резонанс тощо.
В іншому аспекті можуть бути застосовані конкурентні аналізи для ідентифікації антитіла, що конкурує з антитілами до СТІ А-4, описаними в даному документі (наприклад, антитілами до
СТІ А-4, описаними в таблиці 4, таблиці 9, таблиці 14 та таблиці 19) за зв'язування з СТІ А-4. У певних варіантах здійснення, якщо таке конкурувальне антитіло присутнє у надлишку, це обмежує зв'язування еталонного антитіла з СТІ А-4 (наприклад, знижує рівень зв'язування) щонайменше на 10 сю, 15 сю, 20 сю, 25 сю, Зо сю, 35 сю, 40 сю, 45 сю, 50 сю, 55 сю, 60 о, 65 о, 70 Зо, 7595 або більше. У деяких прикладах зв'язування обмежується щонайменше на 80 95, 85 95, 90 95, 95 95 або більше. У певних варіантах здійснення таке конкурувальне антитіло зв'язується з тим самим епітопом (наприклад, лінійним або конформаційним епітопом), який зв'язується антитілами до СТІ А-4, описаними в даному документі (наприклад, антитілами до СТІА-4, описаними в таблиці 4, таблиці 9, таблиці 14 та таблиці 19). Детальні зразкові способи картографування епітопу, з яким зв'язується антитіло, наведені в Моїтіз (1996) "Еркоре Марріпа
Ргоїосоїв", у Метоодз іп МоіІесціаг Віоіоду мої. 66 (Нитапа Ргез5, Тоїсула, МУ).
В зразковому конкурентному аналізі іммобілізований СТІ А-4 інкубують у розчині, що містить перше мічене антитіло, яке зв'язується з СТІ А-4, та друге немічене антитіло, яке тестують щодо його здатності конкурувати з першим антитілом за зв'язування з СТІ А-4. Друге антитіло може бути присутнім у надосадовій рідині гібридоми. Як контроль, іммобілізований СТІ А-4 інкубують у розчині, що містить перше мічене антитіло, але не містить друге немічене антитіло. Після інкубації в умовах, що забезпечують зв'язування першого антитіла з СТІ А-4, надлишок незв'язаного антитіла видаляють і вимірюють кількість мітки, асоційованої з іммобілізованим
СТІ А-4. Якщо кількість мітки, асоційованої з іммобілізованим СТІ А-4, істотно зменшується у зразку, що тестують порівняно з контрольним зразком, це означає, що друге антитіло конкурує з першим антитілом за зв'язування з СТІ А-4. Див. Напоуу апа ГІ апе (1988) Апіібодієв: А І арогаїогу
Мапаиаї сп.14 (Соїа 5ргіпуд Нагбог І абогаїюгу, Соїа ргіпу Нагбог, МУ). 2. Аналізи активності
В одному аспекті представлені аналізи для ідентифікації антитіл до СТІ А-4, що мають біологічну активність. Біологічна активність може включати, наприклад, активність, що полягає в інгібуванні проліферації клітин, цитотоксичну активність (наприклад, АОСС/СОС -активність та
АрсрР-активність), імуностимулювальну активність та активність, що полягає в інгібуванні СТІ А- 4. Також представлені антитіла, що мають таку біологічну активність іп мімо та/або іп міїго.
У певних варіантах здійснення антитіло за даним винаходом тестують щодо наявності такої біологічної активності.
У певних варіантах здійснення антитіло за даним винаходом тестують щодо його здатності інгібувати ріст або проліферацію клітин іп міо. Аналізи для інгібування росту або проліферації клітин добре відомі в даній галузі. Певні аналізи проліферації клітин, наприклад, описані в даному документі аналізи "знищення клітин", забезпечують вимірювання життєздатності клітин.
Одним таким аналізом є люмінесцентний аналіз життєздатності клітин СейПТйег-СіІо"М, який комерційно доступний від Рготеда (Мадізоп, УМІ). Цей аналіз забезпечує визначення кількості життєздатних клітин у культурі на основі кількісного визначення присутнього АТФ, що є ознакою метаболічно активних клітин. Див. Стоисий еї аї. (1993) У. Іттипої. Меїй. 160: 81-88, патент США
Мо 6602677. Аналіз можна проводити в 96- або 384-лунковому форматі, що робить його придатним для автоматизованого високопродуктивного скринінгу (НТ). Див. Стееє еї аї. (1995)
АпіїСапсег Огиаз 6: 398-404. Процедура аналізу включає додавання одного реагенту (реагенту
СеПТлег-СіІо (зареєстрована торгова марка)) безпосередньо до клітин, що культивуються. Це приводить до лізису клітин та утворення люмінесцентного сигналу, продукованого в результаті люциферазної реакції. Люмінесцентний сигнал пропорційний кількості присутнього АТФ, яка прямо пропорційна кількості життєздатних клітин, присутніх в культурі. Дані можуть бути записані за допомогою люмінометра або пристрою для формування зображення камери ССО.
Вихід люмінесценції виражають у відносних світлових одиницях (КІ 0).
Іншим аналізом щодо клітинної проліферації є аналіз "МТ", колориметричний аналіз, який забезпечує вимірювання окислення броміду 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолію до формазану мітохондріальною редуктазою. Подібно аналізу СеїПТйег-С1іо"М, цей аналіз показує кількість метаболічно активних клітин, присутніх у культурі клітин. Див., наприклад, Мозтапп (1983) 9. Іттипої. Меїйй. 65: 55-63, та 7Напо еї а. (2005) Сапсег Нез. 65: 3877-3882.
Клітини для використання в будь-якому з наведених вище аналізів іп міго включають клітини або лінії клітин, які природним чином експресують СТІ А-4 або були сконструйовані для експресії СТІ А-4. Такі клітини також включають лінії клітин, які експресують СТІ А-4, та лінії клітин, які в нормі не експресують СТІ А-4, але були трансфіковані нуклеїновою кислотою, що кодує СТІ А-4.
В одному аспекті відповідне антитіло до СТІ А-4 тестують щодо його здатності інгібувати ріст або проліферацію клітин іп мімо. У певних варіантах здійснення його антитіло до СТІ А-4 тестують щодо його здатності інгібувати ріст пухлини іп мімо. Для такого тестування можна використовувати модельні системи іп мімо, такі як моделі ксенотрансплантата. В зразковій системі ксенотрансплантата пухлинні клітини людини вводять придатній відмінній від людині тварині з ослабленим імунітетом, наприклад безтимусній "голій" миші. Антитіло за даним винаходом вводять тварині. Вимірюють здатність антитіла інгібувати або зменшувати ріст пухлини. У певних варіантах здійснення наведеної вище системи ксенотрансплантата пухлинні клітини людини є пухлинними клітинами пацієнта-людини. Такі моделі ксенотрансплантатів є комерційно доступними від Опсоїезі ЗтрН (Фрайбург, Німеччина). У певних варіантах здійснення пухлинні клітини людини вводять відмінній від людини тварині, з відповідно ослабленим імунітетом шляхом підшкірної ін'єкції або шляхом трансплантації у відповідну ділянку, таку як жирова тканина молочної залози.
Слід зазначити, що будь-який з наведених вище аналізів можна проводити із застосуванням імунокон'югата за даним винаходом замість антитіла до СТІ А-4 або на додаток до нього.
Типовий аналіз для вимірювання АЮОСс-активності терапевтичного антитіла грунтується на аналізі вивільнення 5'Сг та включає наступні стадії: мічення клітин-мішеней за допомогою
Зо ГР'ЄпМаг2СтО»; опсонізації клітин-мішеней, що експресують антиген на їх клітинній поверхні, антитілом; об'єднання опсонізованих мічених радіоактивним ізотопом клітин-мішеней з ефекторними клітинами у відповідному співвідношенні в мікротитрувальному планшеті в присутності або відсутності тестованого антитіла; інкубування суміші клітин переважно протягом від 16 годин до 18 годин, переважно за температури 37 "С; збирання надосадової рідини та аналізу радіоактивності у зразку надосадової рідини. Потім визначають цитотоксичність тестованого антитіла, наприклад, за наступним рівнянням: показник специфічної цитотоксичності (905) - (радіоактивність в присутності антитіла - радіоактивність за відсутності антитіла) максимальна радісактивність - радіоактивність за відсутності антитіла) х 100. Графік можна побудувати, змінюючи співвідношення клітин-мішеней та ефекторних клітин або концентрацію антитіл.
Для оцінки активації комплементу може бути проведений аналіз комплементзалежної цитотоксичності (СОС), описаний, наприклад, у Са77апо-бапіого евї аї., У. Іттипої. Меїнодз 202: 163 (1996). Коротко, різні концентрації варіанта поліпептиду та комплементу людини розбавляють буфером. Клітини, що експресують антиген, з яким зв'язується варіант поліпептиду, розбавляють до щільності приблизно 1 х 106 клітин/мл. Суміш варіанта поліпептиду, розбавленого комплементу людини та клітин, що експресують антиген, додають у плоскодонний 96-лунковий планшет для тканинних культур та інкубують за температури 37 С та 5 9У5 СО» протягом 2 годин для забезпечення опосередкованого комплементом лізису клітин.
Потім у кожну лунку додають по 50 мкл АЇатаг Вісе (Асситей Іпіегпайіопаї) і інкубують за температури 37 "С протягом ночі. Поглинання вимірюють із застосуванням 9б-лункового флуорометра зі збудженням за 530 нм та випромінюванням за 590 нм. Результати представляють у відносних одиницях флуоресценції (КЕШ). Концентрації зразків можуть бути розраховані за стандартною кривою, і реєструють відсоток активності порівняно з неваріантним поліпептидом для варіанта поліпептиду, що становить інтерес.
Зразковий спосіб аналізу АЮОСР-активності може включати наступне: покривання біочастинок-мішеней, таких як Е. соїї, мічених РІТС (МоіІесшаг Ргобез), або ЄіарпуїососсО5 ацгеив-РІТС, тестованим антитілом; формування опсонізованих частинок; додавання наведених вище опсонізованих частинок до ефекторних клітин ТНР-1 (лінія моноцитарних клітин, доступна з АТСС) у співвідношенні 1:1, 10:11, 30:11, 60:11, 75:11 або 1001 для індукції Есук- 60 опосередкованого фагоцитозу; переважно інкубування клітин та БЕ. соїЇ-РІТС/антитіло за температури 37 С протягом 1,5 години; після інкубації додавання до клітин трипанового синього (переважно за кімнатної температури протягом двох-трьох хвилин) для гасіння флуоресценції бактерій, що не включилися в клітини та прикріпилися до зовнішньої поверхні клітин; перенесення клітин у буфер ЕАС5 (наприклад, 0,1 95 В5А та 0,1 95 азиду натрію в РВ5) для аналізу флуоресценції клітин ТНР-1 із застосуванням ЕАС5 (наприклад, ВО ГАС5 Саїїриг).
Для аналізу ступеня АЮОСР гейт переважно встановлюють на клітини ТНР-1 та вимірюють середню інтенсивність флуоресценції. У переважному варіанті здійснення проводять аналіз
АОСР із застосуванням Е. сої-РІТС в середовищі (контроль) Е. соїЇ-РІЇТС та клітин ТНР-1 (використовують як ЕсукК-незалежну АЮСР активність), а також Е. соїЇ-РІТС, клітини ТНР-1 та тестоване антитіло (використовують як Есук-залежну АОСР активність).
Цитотоксична активність антитіла зазвичай включає зв'язування антитіла з поверхнею клітини. Експресія антигена на поверхні клітини-мішені може бути підтверджена належним чином способами, відомими фахівцям у даній галузі, такими як ЕАС5.
Активацію імунітету можна виявити із застосуванням клітинних або гуморальних імунних відповідей як індикаторів. Активація імунітету, зокрема, передбачає підвищення рівня експресії цитокінів (наприклад, І/-6, 2-С5Е, 1-12, ТМЕс та ІЄМу) або їх рецепторів, підвищення рівня проліферації імунних клітин (наприклад, В-клітин, Т-клітин, МК-клітин, макрофагів та моноцитів), посилення стану активації, посилення функції та посилення цитотоксичної активність. Зокрема, активацію Т-клітин можна виявити шляхом вимірювання підвищених рівнів експресії маркерів активації, таких як СО25, СО69 та ІСО5. Наприклад, відомо, що у пацієнтів, яким вводили антитіло до СТІ А-4 іпілімумаб після введення спостерігалося збільшення рівня ІСО5:С04: Т- клітин у периферичній крові, і це вважається ефектом активації стану системного імунітету шляхом введення антитіла до СТІ А-4 (Сапсег Іттипої). Нев. (2013) 1(4): 229-234).
Для активації Т-клітин потрібна не лише стимуляція за допомогою антигенного рецептора (ТОК), але й допоміжна стимуляція за допомогою СО28. У разі зв'язування СО28 на поверхні Т- клітини з В7-1 (СО80) або В7-2 (СО86) на поверхні клітини, що презентує антиген, допоміжний сигнал передається на Т-клітину, і тоді Т-клітина активується. З іншого боку, СТІ А-4 експресується на поверхні активованих Т-клітин. Оскільки СТІ А-4 зв'язується з СО8О і СО86 з більшою афінністю, ніж з СО28, він переважно взаємодіє з СО8О і СО86, а не з СО28, що приводить до пригнічення активації Т-клітин.
Грунтуючись на такому механізмі дії, інгібувальну активність щодо СТІ А-4 можна виміряти як активність інгібування зв'язування СТІ А-4 з СО8О або СО86. В одному варіанті здійснення аналіз для вимірювання інгібувальної активності щодо СТІ А-4 включає наступні стадії: забезпечення зв'язування очищеного білка СТІ А-4 з підкладкою, такою як мікротитрувальний планшет або магнітні гранули; додавання тестованого антитіла та міченого розчинного СО8О або СО86; вимивання компонентів, що не зв'язалися; та кількісне визначення зв'язаного міченого СО8О або СО86. Чи реагує перехресно тестоване антитіло з СО28 чи ні, можна підтвердити, виконавши подібний аналіз, в якому замість СТІ А-4 використовують СО28. Більше того, в іншому варіанті здійснення функціональний аналіз, який забезпечує виявлення активації
Т-клітин, як описано вище, також можна використовувати для вимірювання інгібувальної активності щодо СТІ А-4. Наприклад, якщо тестоване антитіло, що має інгібувальну активність щодо СТІ А-4, додають до системи, в якій активацію Т-клітин вимірюють шляхом стимуляції популяції Т-клітин клітинами, що експресують СО80О або СО86, активація Т-клітин додатково посилюється.
О. Імунокон'югати
У даному винаході також представлені імунокон'югати, що містять антитіло до СТІ А-4, кон'юговане з одним або більше цитотоксичними засобами, такими як хіміотерапевтичні засоби або лікарські засоби, засоби, що інгібують ріст, токсини (наприклад, білкові токсини, ферментативно активні токсини бактерій, грибів, рослинного або тваринного походження, або їх фрагменти), або радіоактивні ізотопи.
В одному варіанті здійснення імунокон'югат являє собою кон'югат антитіло-лікарський засіб (АБС), в якому антитіло кон'юговане з одним або більше лікарськими засобами, зокрема без обмеження з майтанзиноїдом (див. патенти США МоМео 5208020, 5416064 та європейський патент ЕР 0425235 ВІ); ауристатином, наприклад фрагментами лікарського засобу монометилауристатину ОЕ і ОЕ (ММАЕ і ММАБЕ) (див. патенти США Мо 5635483, та Мо 5780588, та Мо 7498298); доластатином; каліхеаміцином або їх похідними (див. патенти США МоМо 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 та 5877296; Ніптап е6еї аї.,
Сапсег ВНев5. 53: 3336-3342 (1993); та Іоде єї аЇ,, Сапсег ВНев5. 58: 2925-2928 (1998)); антрацикліном, таким як дауноміцин або доксорубіцин (див. Кгаїх евї а!., Ситепі Мед. Спет. 13: 60 00 477-523 (2006); УенНтеу еї а!., Віоогдапіс 5 Мей. Спет. І енег5 16: 358-362 (2006); Тогоом еї аї.,
Віосопі. Спет. 16: 717-721 (2005); Маду еї аї., Ргос. Маї). Асай. 5сі. ОБА 97: 829-834 (2000); рибомснік еї а!., Віоогу. «5 Мей. Спет. І енегв 12: 1529-1532 (2002); Кіпо еї а!., У. Мей. Спет. 45: 4336-4343 (2002) і патент США Мо 6630579); метотрексатом; віндезином; таксаном, наприклад, доцетакселом, паклітакселом, ларотакселом, тезетакселом та ортатакселом; трихотеценом та
СсС1065.
В іншому варіанті здійснення імунокон'югат містить антитіло, описане в даному документі, кон'юговане з ферментативно активним токсином або його фрагментом, включаючи без обмеження ланцюг А дифтерійного токсину, незв'язувальні активні фрагменти дифтерійного токсину, ланцюг А екзотоксину (з Рзепдотопавх аегидіпоза), ланцюг А рицину, ланцюг А абрину, ланцюг А модекцину, альфа-сарцин, білки з АІецпіев Тогаї, білки діантину, білки з Рпуїюіасса атегісапа (РАРІ, РАРІЇ та РАР-5), інгібітор із Мотогаїса сНагапійа, курцин, кротин, інгібітор із заропаїіа опісіпаїї5, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трихотецини.
В іншому варіанті здійснення імунокон'югат містить антитіло, описане в даному документі, кон'юговане з радіоактивним атомом з утворенням радіокон'юЮюгата. Для одержання радіокон'югатів доступні різноманітні радіоактивні ізотопи. Приклади включають 2''АЇ, 791|, 125|, зоу, 186Де, 188Де, 7535, 212Ві, 32р, 212рРр і радіоактивні ізотопи и. У разі використання радіокон'югата для виявлення він може містити радіоактивний атом для сцинтиграфічних досліджень, наприклад То-99т або "23І, або спінову мітку для ядерного магнітного резонансу (ЯМР) (також відомого як магнітно-резонансна томографія, МК), наприклад йод-123, йод-131, індій-111, фтор-19, вуглець-13, азот-15, кисень-17, гадоліній, марганець або залізо.
Кон'югати антитіла та цитотоксичного засобу можуть бути одержані із застосуванням низки біфункціональних засобів для сполучення білків, таких як М-сукцинімідил-3-(2- піридилдитіо)пропіонат (ЗРОР), сукцинімідил-4-(М-малеімідометил)-циклогексан-1-карбоксилат (ЗМСС), імінотіолан (ІТ), біфункціональні похідні імідоестерів (таких як диметиладипімідат НС), активні естери (такі як дисукцинімідилсуберат), альдегіди (такі як глутаральдегід), біс- азидосполуки (такі як біс-(п-азидобензоїл)-гександіамін), похідні біс-діазонію (такі як біс-(п- діазоніумбензоїл)-етилендіамін), діїзоціанати (такі як толуол-2,6-діззоціанат) та біс-активні сполуки фтору (такі як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). Наприклад, імунотоксин на основі рицину можна одержати як описано в МігецНа еї аї., Зсіепсе 238: 1098 (1987). Мічена вуглецем-14 1- ізотіоціанатобензил-3-метилдіетилентриамінпентаоцтова кислота (МХ-ЮОТРА) є зразковим хелатувальним засобом для кон'югування радіонукліду з антитілом. Див. М/О 94/11026. Лінкер може являти собою "лінкер, що розщеплюється", який забезпечує вивільнення цитотоксичного лікарського засобу в клітині. Наприклад, можна застосовувати кислотно-лабільний лінкер, чутливий до пептидаз лінкер, фотолабільний лінкер, диметиловий лінкер або дисульфідвмісний лінкер (Спагі єї а)І., Сапсег Вев5. 52: 127-131 (1992); патент США Мо 5208020).
Імунокон'югтати або АЮС, явно вказані в даному документі, включають без обмеження кон'югати, одержані з реагентами для зшивання, зокрема без обмеження ВМР5, ЕМО5, СМВ5,
НВМУ5, І 0-5МОС, МВ5, МРВН, 5ВАР, 5ІА, БІАВ, 5МОС, 5МРВ, З5МРН, сульфо-ЕМС5, сульфо-
СМВ5, сульфо-КМИО5, сульфо-МВ5, сульфо-БІАВ, сульфо-5МСОС та сульфо-ЗМРВ та 5М5В (сукцинімідил-(4-вінілсульфон)бензоат) які є комерційно доступними (наприклад, від Ріегсе
ВіотесппоїІоду, Іпс., Рокфорд, Іллінойс, США).
Е. Способи і композиції для діагностики та виявлення
У певних варіантах здійснення будь-яке з антитіл до СТІ А-4, представлених у даному документі, можна застосовувати для виявлення присутності СТІ А-4 у біологічному зразку.
Застосовуваний у даному документі вираз "виявлення" охоплює кількісне або якісне виявлення.
У певних варіантах здійснення біологічний зразок передбачає клітину або тканину, наприклад сироватку крові, цільну кров, плазму крові, біоптат, зразок тканини, суспензію клітин, слину, мокроту, рідину ротової порожнини, церебральну рідину, навколоплідні води, асцитну рідину, молоко, молозиво, виділення молочних залоз, лімфу, сечу, піт, слізну рідину, шлунковий сік, синовіальну рідину, асцитну рідину, очну рідину та слиз.
В одному варіанті здійснення представлено антитіло до СТІ А-4 для використання в способі діагностики або виявлення. У додатковому аспекті представлено спосіб виявлення наявності
СТІ А-4 у біологічному зразку. У певних варіантах здійснення спосіб включає приведення біологічного зразка в контакт з антитілом до СТІ А-4, описаним у даному документі, за умов, які забезпечують зв'язування антитіла до СТІ А-4 з СТІ А-4, та виявлення того, чи утворився комплекс між антитілом до СТІ А-4 та СТІ А-4. Такий спосіб може являти собою спосіб іп мійго або іп мімо. В одному варіанті здійснення антитіло до СТІ А-4 застосовують для відбору суб'єктів, що відповідають критеріям терапії антитілом до СТІ А-4, наприклад де СТІ А-4 являє собою біомаркер для відбору пацієнтів.
Антитіло за даним винаходом може використовуватися, наприклад, для перевірки стану імунної відповіді і діагностики дисфункції імунної системи.
У певних варіантах здійснення представлені мічені антитіла до СТІ А-4. Мітки включають без обмеження мітки або фрагменти, які виявляють безпосередньо (такі як флуоресцентні, хромофорні, з електронною щільністю, хемілюмінесцентні та радіоактивні мітки), а також фрагменти, такі як ферменти або ліганди, які виявляють опосередковано, наприклад за допомогою ферментативної реакції або молекулярної взаємодії. Зразкові мітки включають без обмеження радіоізотопи З2Р, 140, 125І, ЗН та "31І, флуорофори, такі як хелати рідкісноземельних металів або флуоресцеїн та його похідні, родамін та його похідні, дансил, умбеліферон, люциферази, наприклад люциферазу світлячка та бактеріальну люциферазу (патент США Мо 4737456), люциферин, 2,3-дигідрофталазіндіони, пероксидазу хріну (НЕР), лужну фосфатазу, бета-галактозидазу, глюкоамілазу, лізоцим, сахарид-оксидази, наприклад глюкозооксидазу, галактозооксидазу, 6б-фосфатдегідрогеназу, гетероциклічні оксидази, наприклад уриказу та ксантиноксидазу, у поєднанні з ферментом, який використовує перекис водню для окиснення попередника барвника, наприклад, НЕР, лактопероксидазу або мікропероксидазу, біотин/авідин, спін-мітки, мітки бактеріофагів, стабільні вільні радикали тощо.
Е. Фармацевтичні склади
Фармацевтичні склади антитіла до СТІ А-4, описані у даному документі, одержують шляхом змішування такого антитіла, що має необхідний ступінь чистоти, з одним або більше необов'язковими фармацевтично прийнятними носіями (НКетіпдіоп'є РНаптасеціїса! 5сіепсе5 1612 еайіоп, О5ої, А. Еа. (1980)) у вигляді ліофілізованих складів або водних розчинів.
Фармацевтично прийнятні носії, як правило, є нетоксичними для реципієнтів у застосовних дозах і концентраціях, і вони включають без обмеження наступне: буфери, наприклад на основі фосфату, цитрату та інших органічних кислот; антиоксиданти, включно з аскорбіновою кислотою та метіоніном; консерванти (наприклад, октадецилдиметилбензиламонію хлорид; гексаметонію хлорид; бензалконію хлорид; бензетонію хлорид; фенол, бутиловий або бензиловий спирти; алкілларабени, наприклад метил- або пропілпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3- пентанол і м-крезол); низькомолекулярні поліпептиди (менш як приблизно 10 залишків); білки, наприклад сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, наприклад полівінілпіролідон; амінокислоти, наприклад гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включно з глюкозою, манозою або декстринами; хелатувальні засоби, наприклад ЕОТА; цукри, наприклад сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; солеутворювальні протиіїони, наприклад натрій; комплекси металів (наприклад, 2п-білкові комплекси) та/або неіонні поверхнево-активні речовини, наприклад поліетиленгліколь (РЕС). Зразкові фармацевтично прийнятні носії в даному документі також включають засоби для диспергування лікарських засобів в інтерстиціальному просторі, такі як розчинні нейтрально-активні гіалуронідазні глікопротетни (зЗНАБЕСР), наприклад розчинні гіалуронідазні глікопротеїни РН-20 для людини, такі як гНиИРН2гО (НУ ЕМЕХ (зареєстрована торгова марка), Вахіег Іпіегпайіопаї, Іпс.). Деякі зразкові ЗНАБЕСР та способи використання, включно з ГНИРН2О, описано в публікаціях патентів США Мо 2005/0260186 та Мо 2006/0104968. В одному аспекті ЗНАБЕСР поєднують з однією або більше додатковими глікозаміногліканазами, наприклад хондроїтиназами.
Зразкові ліофілізовані склади антитіл описано в патенті США Мо 6267958. Водні склади антитіл включають ті, які описано в патенті США Мо 6171586 та МО 2006/044908, останні склади включають гістидин-ацетатний буфер.
Склад за даним документом також може містити більше ніж один активний інгредієнт, необхідний для конкретного показання, лікування якого здійснюють, переважно ті, що мають взаємодоповнювальні види активності за відсутності взаємної негативної дії. Такі активні інгредієнти зазвичай наявні в комбінації в кількостях, ефективних для запланованої мети.
Активні інгредієнти можуть бути включені у мікрокапсули, одержані, наприклад, за допомогою методик коацервації або міжфазної полімеризації, наприклад, гідроксиметилцелюлозні або желатинові мікрокапсули та полі-(метилметакрилатні) мікрокапсули відповідно, у колоїдних системах доставки лікарських засобів (наприклад, ліпосоми, альбумінові мікросфери, мікроемульсії, наночастинки та нанокапсули) або у макроемульсіях. Такі технології описані в Ветіпдіоп'є Рнаппасешцііса! 5сіепсе5 161й еайіоп, Оз5ої,
А. га. (1980).
Можуть бути одержані препарати з уповільненим вивільненням. Відповідні приклади препаратів із уповільненим вивільненням включають напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, при цьому матриці мають форму сформованих 60 виробів, наприклад плівки або мікрокапсули.
Склади, які слід застосовувати для введення іп мімо, зазвичай стерильні. Стерильності можна легко досягти, наприклад, шляхом фільтрації через стерильні фільтрувальні мембрани. б. Терапевтичні способи та композиції
Будь-яке з антитіл до СТІ А-4, представлених у даному документі, може бути застосовано в терапевтичних способах.
В одному аспекті представлено антитіло до СТІ А-4 для використання як лікарського препарату. В додаткових аспектах представлено антитіло до СТІ А-4 для використання у лікуванні пухлини. У певних варіантах здійснення представлено антитіло до СТІ А-4 для використання в способі лікування. У певних варіантах здійснення у даному винаході представлено антитіло до СТІ А-4 для використання у способі лікування індивідуума з пухлиною, що включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла до СТІ А-4. В одному з таких варіантів здійснення спосіб додатково включає введення індивідууму ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного засобу, наприклад, як описано нижче. В додаткових варіантах здійснення у даному винаході представлено антитіло до СТІ А-4 для використання у пошкодженні клітин. У певних варіантах здійснення у даному винаході представлено антитіло до СТІ А-4 для використання у способі пошкодження клітин у індивідуума, що включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла до СТІ А-4 для пошкодження клітин. В додаткових варіантах здійснення у даному винаході представлено антитіло до СТІ А-4 для використання в імунній активації. У певних варіантах здійснення у даному винаході представлено антитіло до СТІ А-4 для використання у способі активації імунітету у індивідуума, що включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла до
СТІ А-4 для активації імунітету. "Індивідуум" відповідно до будь-якого з вищенаведених варіантів здійснення переважно являє собою людину.
У деяких варіантах здійснення пухлина являє собою солідну пухлину. В солідній пухлині пухлинні клітини зазвичай проліферують з утворенням популяції, та пухлинна тканина утворюється головним чином цими клітинами. Крім того, пухлинні тканини живих організмів часто інфільтруються імунними клітинами, такими як лімфоцити, які також становлять частину пухлинних тканин. У деяких варіантах здійснення пухлинні тканини інфільтруються імунними клітинами, зокрема регуляторними Т-клітинами (Тгед-клітинами). В одному варіанті здійснення пошкодження клітин викликається АОСС-активністю, СОС-активністю або АЮСР -активністю. В одному варіанті здійснення пошкоджуються клітини, що експресують СТІ А-4 на своїй клітинній поверхні. В іншому варіанті здійснення клітини, що підлягають пошкодженню, являють собою
Тгед-клітини. У певних варіантах здійснення пошкоджуються Тгед-клітини, що інфільтрувалися в пухлинні тканини. В одному варіанті здійснення імунітет активується за допомогою пошкодження Тгед-клітин (імуносупресія Тгтед-клітинами припиняється). В додаткових варіантах здійснення активується імунітет (зокрема, протипухлинний імунітет) у пухлинних тканинах. У деяких варіантах здійснення активація імунітету являє собою активацію Т-клітин.
В додаткових аспектах ступінь лікарського ефекту, що забезпечується антитілом до СТІ А-4 за даним винаходом, варіює залежно від тканини індивідууму. У певних варіантах здійснення ця ступінь ефекту змінюється в залежності від концентрації аденозинвмісної сполуки в тканині. В додаткових варіантах здійснення ефект посилюється в тканині з високою концентрацією аденозинвмісної сполуки порівняно з тканиною з низькою концентрацією аденозинвмісної сполуки. Тканини з високою концентрацією аденозинвмісної сполуки включають, наприклад, пухлинні тканини. Тканини з низькою концентрацією аденозинвмісної сполуки включають, наприклад, непухлинні тканини, такі як нормальні тканини. У деяких варіантах здійснення імунітет сильніше активується в пухлинній тканині, ніж в непухлинній тканині. Такі відмінності у відповіді не мають спостерігатися за всіх доз антитіл до СТІ А-4, але мають спостерігатися тільки для певного діапазону доз. В іншому варіанті здійснення імунітет активується за більш низької дози в пухлинній тканині, ніж в непухлинній тканині. Більше того, в іншому варіанті здійснення терапевтичний ефект спостерігається за нижчої дози, ніж та, за якої спостерігається побічний ефект. У певних варіантах здійснення терапевтичний ефект є проявом протипухлинного ефекту (наприклад, регресією пухлини та індукцією загибелі клітин або інгібуванням росту пухлинних клітин), а побічний ефект являє собою розвиток аутоїмунного захворювання (включаючи пошкодження нормальних тканин внаслідок надмірних імунних відповідей).
У додатковому аспекті ступінь лікарського ефекту, що забезпечується антитілом до СТІ А-4 за даним винаходом, варіює в залежності від того, чи воно має активність зв'язування з СТІ А-4, яка залежить від аденозинвмісної сполуки (тобто змінюється в залежності від концентрації аденозинвмісної сполуки). У деяких варіантах здійснення антитіла до СТІ А-4 за даним 60 винаходом являють собою антитіла, активність зв'язування яких з СТІ А-4 збільшується в міру збільшення концентрації аденозинвмісної сполуки. У деяких варіантах здійснення контрольне антитіло до СТІ А-4 являє собою антитіло, яке не має активності зв'язування СТІ А-4, яка залежить від концентрації аденозинвмісної сполуки. У певних варіантах здійснення антитіло, яке не має СТІ А-4-зв'язувальної активності, що залежить від концентрації аденозинвмісної сполуки, означає антитіло, у якого СТІ А-4-зв'язувальна активність в присутності та за відсутності сполуки відрізняється, наприклад, у менше ніж два рази, менше ніж 1,8 раза, менше ніж 1,5 раза, менше ніж 1,3 раза, менше ніж 1,2 раза або менше ніж 1,1 раза. Бажано, щоб антитіло до
СТІ А-4 за даним винаходом і контрольне антитіло до СТІ А-4 мали значення СТІ А-4- зв'язувальної активності, по суті еквівалентні одне одному в присутності достатньої кількості аденозинвмісної сполуки.
У деяких аспектах антитіло до СТІ А-4 за даним винаходом і контрольне антитіло до СТІ А-4 відрізняються за лікарським ефектом, що забезпечується кожним антитілом. У певних варіантах здійснення вони розрізняються за лікарським ефектом у тканині з низькою концентрацією аденозинвмісної сполуки. Тканини з низькою концентрацією аденозинвмісної сполуки включають, наприклад, непухлинні тканини, такі як нормальні тканини. Антитіла до СТІ А-4 можуть також бути забезпечені у вигляді фармацевтичного складу, що містить антитіло. У деяких варіантах здійснення в тканині з низькою концентрацією аденозинвмісної сполуки антитіло до СТІ А-4 за даним винаходом демонструє низький рівень активації імунітету порівняно з таким у разі контрольного антитіла до СТІ А-4. У деяких варіантах здійснення в тканині з низькою концентрацією аденозинвмісної сполуки дози антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом, необхідні для активації імунітету, є високими порівняно з такими у разі контрольного антитіла до СТІ А-4. У деяких варіантах здійснення в тканині з низькою концентрацією аденозинвмісної сполуки антитіло до СТІ А-4 за даним винаходом характеризується низьким рівнем побічного ефекту порівняно з контрольним антитілом до СТІ А-4. У деяких варіантах здійснення в тканині з низькою концентрацією аденозинвмісної сполуки дози антитіла до СТІ А- 4 за даним винаходом, за яких спостерігається побічний ефект, є високими порівняно з контрольним антитілом до СТІ А-4. Такі відмінності в відповіді не мають спостерігатися в усіх тканинах (наприклад, в усіх тканинах з низькою концентрацією аденозинвмісної сполуки), але мають спостерігатися тільки в деяких тканинах. У певних варіантах здійснення побічним ефектом є аутоїмунне захворювання (включаючи пошкодження нормальних тканин внаслідок надмірної імунної відповіді).
У деяких аспектах кожне з антитіла до СТІ А-4 за даним винаходом та контрольного антитіла до СТІ А-4, забезпечує по суті еквівалентний лікарський ефект. У певних варіантах здійснення вони забезпечують по суті еквівалентний лікарський ефект в тканині з високою концентрацією аденозинвмісної сполуки. Тканини з високою концентрацією аденозинвмісної сполуки включають, наприклад, пухлинні тканини. Антитіла до СТІ А-4 можуть також бути забезпечені у вигляді фармацевтичних складів, що включають антитіло. У деяких варіантах здійснення в тканині з високою концентрацією аденозинвмісної сполуки антитіло до СТІ А-4 за даним винаходом та контрольне антитіло до СТІ А-4 демонструють по суті еквівалентний рівень активації імунітету. У деяких варіантах здійснення в тканині з високою концентрацією аденозинвмісної сполуки антитіло до СТІ А-4 за даним винаходом та контрольне антитіло до
СТІ А-4 є по суті еквівалентними за дозою, необхідною для активації імунітету. У деяких варіантах здійснення в тканині з високою концентрацією аденозинвмісної сполуки антитіло до
СТІ А-4 за даним винаходом та контрольне антитіло до СТІ А-4 характеризуються по суті еквівалентним рівнем терапевтичного ефекту. У деяких варіантах здійснення в тканині з високою концентрацією аденозинвмісної сполуки антитіло до СТІ А-4 за даним винаходом та контрольне антитіло до СТІ А-4 є по суті еквівалентними за дозою, за якої спостерігається терапевтичний ефект. У певних варіантах здійснення терапевтичний ефект є проявом протипухлинного ефекту (наприклад, регресією пухлини та індукцією загибелі клітин або інгібування росту пухлинних клітин).
У певних варіантах здійснення пухлина вибрана з групи, що складається з раку молочної залози та раку печінки.
У додатковому аспекті даного винаходу представлено використання антитіла до СТІ А-4 у виробництві або одержанні лікарського препарату. В одному варіанті здійснення лікарський препарат призначений для лікування пухлини. У додатковому варіанті здійснення лікарський препарат призначений для використання у способі лікування пухлини, що включає введення індивідууму, що має пухлину, ефективної кількості лікарського препарату. В одному з таких варіантів здійснення спосіб додатково включає введення індивідууму ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного засобу, наприклад, як описано нижче. У 60 додатковому варіанті здійснення лікарський препарат призначений для пошкодження клітин. У додатковому варіанті здійснення лікарський препарат призначений для використання у способі пошкодження клітин у індивідуума, що включає введення індивідууму ефективної кількості лікарського препарату для пошкодження клітин. У додатковому варіанті здійснення лікарський препарат призначений для активації імунітету. У додатковому варіанті здійснення лікарський препарат призначений для використання у способі активації імунітету у індивідуума, що включає введення індивідууму ефективної кількості лікарського препарату для активації імунітету. "ІНдивідуум" відповідно до будь-якого з вищенаведених варіантів здійснення може являти собою людину.
У додатковому аспекті у даному винаході представлений спосіб лікування пухлини. В одному варіанті здійснення спосіб включає введення індивідууму з такою пухлиною ефективної кількості антитіла до СТІ А-4. В одному з таких варіантів здійснення спосіб додатково включає введення індивідууму ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного засобу, описаного нижче. "Індивідуум" відповідно до будь-якого з вищенаведених варіантів здійснення може являти собою людину.
У додатковому аспекті у даному винаході представлений спосіб пошкодження клітин у індивідуума. В одному варіанті здійснення спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла до СТІ А-4 для пошкодження клітин. У додатковому аспекті у даному винаході представлений спосіб активації імунітету у індивідуума. В одному варіанті здійснення спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла до СТІ А-4 для активації імунітету.
В одному варіанті здійснення "індивідуум" являє собою людину.
В іншому аспекті даного винаходу представлені фармацевтичні склади, що містять будь-яке з антитіл до СТІ А-4, представлених у даному документі, наприклад, для використання у будь- якому з вищевказаних терапевтичних способів. В одному варіанті здійснення фармацевтичний склад містить будь-яке з антитіл до СТІ А-4, представлених у даному документі, і фармацевтично прийнятний носій. В одному варіанті здійснення у даному винаході представлений фармацевтичний склад для використання у лікуванні пухлини. В одному варіанті здійснення у даному винаході представлений фармацевтичний склад для використання у пошкодженні клітин. В одному варіанті здійснення у даному винаході представлений фармацевтичний склад для використання у активації імунітету. В іншому варіанті здійснення фармацевтичний склад містить будь-яке з антитіл до СТІ А-4, представлених у даному документі, і щонайменше один додатковий терапевтичний засіб, наприклад, як описано нижче.
У додатковому аспекті у даному винаході представлені способи одержання лікарського препарату або фармацевтичного складу (наприклад, для використання у будь-якому з зазначених вище терапевтичних способів), що включають змішування будь-якого з антитіл до
СТІ А-4, представлених в даному документі, з фармацевтично прийнятним носієм. В одному варіанті здійснення спосіб одержання лікарського препарату або фармацевтичного складу додатково включає додавання щонайменше одного додаткового терапевтичного засобу до лікарського препарату або фармацевтичного складу.
Антитіла за даним винаходом можна використовувати в терапії або окремо, або в комбінації з іншими засобами. Наприклад, антитіло за даним винаходом можна вводити разом з щонайменше одним додатковим терапевтичним засобом. У певних варіантах здійснення додатковий терапевтичний засіб являє собою інгібітор імунних контрольних точок, інгібітор
ЕСЕРЕ, інгібітор НЕКЗ2 або хіміотерапевтичний засіб. Інгібітор імунних контрольних точок може включати, наприклад, інгібітор, що являє собою антитіло до СТІ А-4, інгібітор, що являє собою антитіло до РО-1, інгібітор, що являє собою антитіло до РО-11, інгібітор, що являє собою антитіло до РО-І2, інгібітор, що являє собою антитіло до ТІМ-3, інгібітор, що являє собою антитіло до ГАС-3, інгібітор, що являє собою антитіло до ТІСІТ, інгібітор, що являє собою антитіло до ВТІА, та інгібітор, що являє собою антитіло до МІ5ТА. Інгібітор, що являє собою антитіло до СТІ А-4, може включати, наприклад, іпілімумаб та тремелімумаб. Інгібітор, що являє
БО собою антитіло до РО-1, може включати, наприклад, ніволумаб та пембролізумаб. Інгібітор, що являє собою антитіло до РО-Ї1, може включати, наприклад, атезолізумаб, дурвалумаб та авелумаб. Інгібітор, що являє собою антитіло до РО-І2, може включати, наприклад, інгібувальне антитіло до РО-12. Інгібітор, що являє собою антитіло до ТІМ-3, може включати, наприклад, інгібувальне антитіло до ТІМ-3. Інгібітор, що являє собою антитіло до ГАсС-3, може включати, наприклад, інгібувальне антитіло до І Ас-3. Інгібітор, що являє собою антитіло до
ТІСІТ, може включати, наприклад, інгібувальне антитіло до ТІСІТ. Інгібітор, що являє собою антитіло до ВТІА, може включати, наприклад, інгібувальне антитіло до ВТГА. Інгібітор, що являє собою антитіло до МІЗТА, може включати, наприклад, інгібувальне антитіло до МІ5ТА.
Інгібітор ЕСЕК може включати, наприклад, цетуксимаб, панітумумаб, німотузумаб та залутумумаб. Інгібітор НЕК2 може включати, наприклад, трастузумаб, трастузумаб емтанзин та пертузумаб.
Такі види комбінованої терапії, зазначені вище, охоплюють комбіноване введення (де два або більше терапевтичних засобів включені в один або окремі склади) та окреме введення, в цьому випадку введення антитіла за даним винаходом може відбуватися до, одночасно та/або після введення додаткового терапевтичного засобу або засобів. В одному варіанті здійснення введення кожного антитіла до СТІ А-4 та введення додаткового терапевтичного засобу відбувається протягом приблизно одного місяця або протягом приблизно одного, двох або трьох тижнів або протягом приблизно одного, двох, трьох, чотирьох, п'яти або шести днів.
Антитіла за даним винаходом також можна застосовувати в комбінації з променевою терапією.
Антитіло за даним винаходом (і будь-який додатковий терапевтичний засіб) можна вводити за допомогою будь-яких придатних шляхів, включаючи парентеральний, внутрішньолегеневий та інтраназальний, і, якщо необхідне локальне лікування, введення всередину місця ураження.
Парентеральні інфузії включають внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревне або підшкірне введення. Введення дози може здійснюватися будь-яким придатним шляхом, наприклад за допомогою ін'єкцій, таких як внутрішньовенні або підшкірні ін'єкції почасти залежно від того, чи введення є короткочасним або тривалим. У даному документі розглядаються різні схеми дозування, що включають без обмеження одноразове або множинне введення в різні моменти часу, болюсне введення та імпульсну інфузію.
Антитіла за даним винаходом складають, дозують та вводять у спосіб, відповідний до належної медичної практики. Фактори, які слід враховувати в даному контексті, включають конкретне порушення, що піддається лікуванню, конкретного ссавця, який піддається лікуванню, клінічний стан окремого пацієнта, причину порушення, місце доставки засобу, спосіб введення, схему введення та інші фактори, відомі медичним працівникам. Антитіло необов'язково складають з одним або більше засобами, які в даний час застосовуються для попередження або лікування розладу, що становить інтерес. Ефективна кількість таких інших засобів залежить від кількості антитіл, присутніх у складі, типу порушення чи лікування та інших факторів, про які йшлося вище. Їх зазвичай використовують за тих самих дозувань та шляхів введення, що описані в даному документі, або за дозувань, що становлять від приблизно 1 до 99 95 дозувань,
Зо описаних у даному документі, або за будь-якого дозування та будь-якого шляху, які були емпірично/клінічно визначені як відповідні.
Для попередження або лікування захворювання відповідне дозування антитіла за даним винаходом (за використання окремо або в комбінації з одним або більше іншими додатковими терапевтичними засобами) буде залежати від типу захворювання, що підлягає лікуванню, типу антитіла, тяжкості та перебігу захворювання, від того, чи вводять антитіло у запобіжних або терапевтичних цілях, попередньої терапії, історії хвороби пацієнта та відповіді на антитіло, а також від думки лікаря. Антитіло належним чином вводять пацієнту одноразово або протягом серії процедур. Залежно від типу та тяжкості захворювання, від приблизно 1 мкг/кг до 15 мг/кг (наприклад, від 0,1 мг/кг до 10 мг/кг) антитіла можуть бути початковим дозуванням-кандидатом для введення пацієнту, чи то, наприклад, за допомогою одного або більше окремих введень, чи то за допомогою безперервної інфузії. Одне типове добове дозування може варіювати від приблизно 1 мкг/кг до 100 мг/кг або більше в залежності від згаданих вище факторів. У разі повторних введень протягом кількох днів або довше, в залежності від стану, лікування зазвичай продовжують доти, доки не станеться необхідне пригнічення симптомів захворювання. Одне зразкове дозування антитіла може знаходитися в діапазоні від приблизно 0,05 мг/кг до приблизно 10 мг/кг. Таким чином, пацієнту можна вводити одну або більше доз, що становлять приблизно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг або 10 мг/кг (або будь-яку їх комбінацію). Такі дози можна вводити з перервами, наприклад раз на тиждень або раз на три тижні (наприклад, так, що пацієнт отримує від приблизно двох до приблизно двадцяти або, наприклад, приблизно шість доз антитіла). Можна вводити початкову більш високу навантажувальну дозу, а потім одну або більше нижчих доз. Прогрес цієї терапії легко контролювати за допомогою загальноприйнятих методик та аналізів.
Слід зазначити, що будь-який з наведених вище складів або терапевтичних способів можна реалізувати із застосуванням імунокон'югата за даним винаходом замість або на додаток до антитіла до СТІ А-4.
Н. Готові вироби
В іншому аспекті даного винаходу представлено готовий виріб, що містить матеріали, застосовні для лікування, запобігання та/або діагностики описаних вище розладів. Готовий виріб містить контейнер і етикетку на ньому або листівку-вкладку в комплекті з контейнером. 60 Відповідні контейнери включають, наприклад, пляшки, флакони, шприци, пакети для ІМ
(внутрішньовенних) розчинів тощо. Контейнери можуть бути виготовлені з різних матеріалів, таких як скло або пластик. Контейнер містить композицію, яка власне сама або в поєднанні з іншою композицією ефективна для лікування, запобігання та/або діагностики стану і може мати стерильний отвір для доступу (наприклад, контейнер може бути мішком для внутрішньовенного розчину або флаконом з пробкою, яку можна проколоти голкою для підшкірної ін'єкції).
Щонайменше один активний інгредієнт в композиції являє собою антитіло за даним винаходом.
На етикетці або на листівці-вкладці вказується, що композиція застосовується для лікування вибраного стану. Більше того, готовий виріб може містити: (а) перший контейнер із композицією, що міститься в ньому, де композиція містить антитіло за даним винаходом; і (Б) другий контейнер із композицією, що міститься в ньому, де композиція містить додатковий цитотоксичний або інший терапевтичний засіб. Готовий виріб у цьому варіанті здійснення даного винаходу може додатково містити листівку-вкладку, на якій вказується, що композиції можна застосовувати для лікування певного стану. Альтернативно або додатково готовий виріб може додатково містити другий (або третій) контейнер, що містить фармацевтично прийнятний буфер, такий як бактеріостатична вода для ін'єкцій (ВМУРІ), фосфатно-буферний сольовий розчин, розчин Рінгера та розчин декстрози. Крім того, він може включати інші матеріали, необхідні з комерційної та користувацької позиції, у тому числі інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки та шприци.
Слід зазначити, що будь-який із вищевказаних готових виробів може включати імунокон'югат за даним винаходом замість або на додаток до антитіла до СТІ А-4.
Поліпептиди, що мстять варіант Ес-ділянки
В одному аспекті у даному винаході представлені виділені поліпептиди, що містять варіант
Ес-ділянки. В деяких аспектах поліпептиди являють собою антитіла. В деяких аспектах поліпептиди являють собою білки, що є продуктами злиття з Ес. У певних варіантах здійснення варіанти Ес-ділянки містять щонайменше одне змінення амінокислотного залишку (наприклад, заміну) порівняно з відповідною послідовністю у Ес-ділянці нативної послідовності або еталонного варіанта послідовності (в даному документі можуть сукупно називатися "вихідною"
Ес-ділянкою). Ес-ділянка нативної послідовності зазвичай складена у вигляді гомодимера, що складена у вигляді двох ідентичних поліпептидних ланцюгів. Варіанти змінення амінокислот у варіантах Ес-ділянки за даним винаходом можуть бути введені або в один з двох поліпептидних ланцюгів вихідної Ес-ділянки, або в обидва з двох поліпептидних ланцюгів.
У деяких аспектах у даному винаході представлені варіанти Ес-ділянки, функція яких була модифікована порівняно з такою у разі вихідної Ес-ділянки. У деяких аспектах варіанти Ес- ділянки за даним винаходом характеризуються посиленою активністю зв'язування з рецептором
Есу порівняно з такою у разі вихідної Ес-ділянки. У певних варіантах здійснення варіанти Ес- ділянки за даним винаходом характеризуються посиленою активністю зв'язування із щонайменше одним рецептором Есу, вибраним із групи, що складається з ЕсукКіІа, ЕсукІа,
ЕсуйІІЬ та ЕсукІПШа, порівняно з такою у разі вихідної Ес-ділянки. У деяких варіантах здійснення варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризуються посиленою активністю зв'язування з
ЕсуКПа. У деяких варіантах здійснення варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризуються посиленою активністю зв'язування з ЕсукКІПа. В додаткових варіантах здійснення варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризуються посиленою активністю зв'язування з ЕсукКІа та ЕсукШа.
У деяких варіантах здійснення варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризуються наявністю щонайменше одного змінення амінокислоти у щонайменше одному положенні, вибраному з групи, що складається з положення 234, 235, 236, 298, 330, 332 та 334 відповідно до нумерації ЕО. Як альтернатива, варіанти змінення амінокислот, такі як описані в М/о 2013/002362 та УМО 2014/104165, можуть бути подібним чином використані у даному винаході.
У певних варіантах здійснення активність зв'язування вихідної Ес-ділянки та варіантів Ес- ділянки може бути представлена за допомогою значення КО (константи дисоціації). В одному варіанті здійснення значення співвідношення |значення КО вихідної Ес-ділянки для
ЕсуКІІа|/(значення КО варіанта Ес-ділянки для ЕсуКІІа| становить, наприклад, 1,5 або більше, 2 або більше, З або більше, 4 або більше, 5 або більше, 6 або більше, 7 або більше, 8 або більше, 9 або більше, 10 або більше, 15 або більше, 20 або більше, 25 або більше, 30 або більше, 40 або більше або 50 або більше. В додаткових варіантах здійснення ЕсуКІїа може являти собою
ЕсуКіІІа К, або ЕсукіІІа Н, або також може являти собою обидва. В одному варіанті здійснення значення співвідношення (активність зв'язування вихідної Ес-ділянки з ЕсукКШа|Лактивність зв'язування варіанта Ес-ділянки з ЕсукПШа)| становить, наприклад, 2 або більше, З або більше, 5 або більше, 10 або більше, 20 або більше, 30 або більше, 50 або більше, 100 або більше, 200 60 або більше, 300 або більше, 500 або більше, 1 х 103 або більше, 2 х 103 або більше, 3 х 103 або більше або 5 х 103 або більше. В додаткових варіантах здійснення ЕсукШа може являти собою
ЕсукКШа РЕ, або ЕсукКШа У, або також може являти собою обидва.
В одному варіанті здійснення значення КО варіантів Ес-ділянки для ЕсукКІа становлять, наприклад, 1,0 х 106 М або менше, 5,0 х 107 М або менше, 3,0 х 107 М або менше, 2,0 х 1077 М або менше, 1,0 х 107 М або менше, 5,0 х 109 М або менше, 3,0 х 109 М або менше, 2,0 х 108 М або менше, 1,0 х 109 М або менше, 5,0 х 109 М або менше, 3,0 х 109 М або менше, 2,0 х 109 М або менше або 1,0 х 109 М або менше. В додаткових варіантах здійснення ЕсувПа може являти собою ЕсуКІПа К, або ЕсукКПа Н, або також може являти собою обидва. В одному варіанті здійснення значення КО варіантів Ес-ділянки для ЕсукКШа становлять, наприклад, 1,0 х 105 М або менше, 5,0 х 10-7 М або менше, 3,0 х 10-77 М або менше, 2,0 х 10-77 М або менше, 1,0 х 10-77 М або менше, 5,0 х 108 М або менше, 3,0 х 108 М або менше, 2,0 х 108 М або менше, 1,0 х 108 М або менше, 5,0 х 109 М або менше, 3,0 х 109 М або менше, 2,0 х 109 М або менше, 1,0 х 109 М або менше, 5,0 х 10-19 М або менше, 3,0 х 1079 М або менше, 2,0 х 10-19 М або менше або 1,0 х 1079 М або менше. В додаткових варіантах здійснення ЕсукКШа може являти собою ЕсуЕШа РЕ, або ЕсуКШа У, або також може являти собою обидва.
В іншому варіанті здійснення зв'язувальна активність вихідної Есо-ділянки та варіантів Ес- ділянки може бути представлена за допомогою значення Ка (константа швидкості дисоціації) замість значення КО.
В іншому варіанті здійснення зв'язувальна активність вихідної Ес-ділянки та варіантів Ес- ділянки може бути представлена за допомогою зв'язувальної кількості для рецептора Есу на одиницю кількості Ес-ділянки. Наприклад, в аналізі методом поверхневого плазмонного резонансу кожну зі зв'язувальної кількості Ес-ділянки, іммобілізованої на сенсорному чипі, та зв'язувальної кількості рецептора Есу, що в подальшому зв'язується з ним, вимірюють як резонансну одиницю (КИ). Значення, одержане шляхом ділення зв'язувальної кількості рецептора Есу на зв'язувальну кількість Ес-ділянки, можна визначити як зв'язувальну кількість з рецептором Есу на одиницю кількості Ес-ділянки. Конкретні способи вимірювання та розрахунку таких зв'язувальних кількостей описані в наведених нижче прикладах. У деяких варіантах здійснення значення співвідношення |зв'язувальна кількість варіанта Ес-ділянки з
ЕсукКПа)|/(зв'язувальна кількість вихідної Ес-ділянки з ЕсукКІа| становить, наприклад, 1,5 або
Зо більше, 2 або більше, З або більше, 4 або більше, 5 або більше, 6 або більше, 7 або більше, 8 або більше, 9 або більше, 10 або більше, 15 або більше, 20 або більше, 25 або більше, 30 або більше, або 40 або більше, або 50 або більше. У деяких варіантах здійснення значення співвідношення |зв'язувальна кількість варіанта Ес-ділянки з ЕсукПа/|/Ізв'язувальна кількість вихідної Ес-ділянки з ЕсуКІПШа| становить, наприклад, 2 або більше, З або більше, 5 або більше, 10 або більше, 20 або більше, 30 або більше, 50 або більше, 100 або більше, 200 або більше, 300 або більше, 500 або більше, 1 х 103 або більше, 2 х 103 або більше, 3 х 103 або більше або 5 х 103 або більше.
У певних варіантах здійснення значення КО, значення Ка, значення зв'язувальної кількості та значення, описані в даному документі, вимірюють або розраховують шляхом виконання аналізу методом поверхневого плазмонного резонансу за температури 25 "С або 37 "С (див., наприклад, приклад 6 в даному документі).
У деяких аспектах варіант Ес-ділянки за даним винаходом характеризується поліпшеною селективністю між активувальним та інгібувальним рецепторами Есу порівняно з такою у разі вихідної Ес-ділянки. Іншими словами, значно посилюється активність зв'язування варіанта Ес- ділянки за даним винаходом з активувальним рецептором су, порівняно з такою з інгібувальним рецептором Есу, за порівняння з такими у разі вихідної Ес-ділянки. У певних варіантах здійснення активувальний рецептор Есу являє собою щонайменше один рецептор
Есу, вибраний із групи, що складається з ЕсуКіІа, ЕсукКІПа К, ЕсукКІа Н, ЕсукКШа Е та ЕсукШа М, а інгібувальний рецептор Есу являє собою ЕсукКІІЬ. У деяких варіантах здійснення варіанти Ес- ділянки за даним винаходом характеризуються поліпшеною селективністю між ЕсукКПа та
ЕсуУКІБ. У деяких варіантах здійснення варіант Бс-ділянки за даним винаходом характеризується поліпшеною селективністю між ЕсукІПа та ЕсукіІІЬ. В додаткових варіантах здійснення варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризуються поліпшеною селективністю між ЕсукКПІа та ЕсуКІІБ ї між ЕсуКШа та ЕсуйкІІБ.
У деяких варіантах здійснення варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризуються наявністю щонайменше одного змінення амінокислоти у щонайменше одному положенні, вибраному з групи, що складається з положення 236, 239, 268, 270 та 326 відповідно до нумерації ЕО. Як альтернатива, змінення амінокислот, описані в УМО 2013/002362 та МО 2014/104165, можуть бути подібним чином використані у даному винаході.
У певних варіантах здійснення активність зв'язування вихідної Ес-ділянки та варіантів Ес- ділянки може бути представлена за допомогою значення КО (константи дисоціації). Варіанти здійснення для активності зв'язування з ЕсукКІПа та ЕсуКШа є такими, як описано вище. В одному варіанті здійснення значення співвідношення |значення КО вихідної Ес-ділянки для
ЕсукІІВ|значення КО варіанта Ес-ділянки для ЕсукКІІБ| становить, наприклад, 10 або менше, 5 або менше, З або менше, 2 або менше, 1 або менше, 0,5 або менше, 0,3 або менше, 0,2 або менше або 0,1 або менше. В іншому варіанті здійснення зв'язувальна активність вихідної Ес- ділянки та варіантів Ес-ділянки може бути представлена за допомогою значення Ка (константа швидкості дисоціації) замість значення КО.
В іншому варіанті здійснення зв'язувальна активність вихідної Ес-ділянки та варіантів Ес- ділянки може бути представлена за допомогою зазначеної вище зв'язувальної кількості для рецептора Есу на одиницю кількості Ес-ділянки. У деяких варіантах здійснення значення співвідношення (зв'язувальна кількість варіанта Ес-ділянки з ЕсуКІІБ|/зв'язувальна кількість вихідної Ес-ділянки з ЕсукКІІБ| становить, наприклад, 10 або менше, 5 або менше, З або менше, 2 або менше, 1 або менше, 0,5 або менше, 0,3 або менше, 0,2 або менше або 0,1 або менше. У деяких варіантах здійснення зв'язувальна кількість варіанта Ес-ділянки з ЕсукіІЬ становить, наприклад, 0,5 або менше, 0,3 або менше, 0,2 або менше, 0,1 або менше, 0,05 або менше, 0,03 або менше, 0,02 або менше, 0,01 або менше, 0,005 або менше, 0,003 або менше, 0,002 або менше або 0,001 або менше.
У деяких аспектах варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризуються поліпшеною стабільністю порівняно з вихідною Ес-ділянкою. У певних варіантах здійснення стабільність являє собою термодинамічну стабільність. Термодинамічну стабільність поліпептиду можна оцінювати, наприклад, із застосуванням значення Тт як індикатора. Значення Тт можна виміряти із застосуванням методик, відомих фахівцям у даній галузі, таких як круговий дих роїзм (СО), диференціальна сканувальна калориметрія (053) та диференціальна сканувальна флуориметрія (О5Е). В одному варіанті здійснення у варіанті Ес-ділянки за даним винаходом значення Тт ділянки СН2 підвищується на 0,1 градуса або більше, 0,2 градуса або більше, 0,3 градуса або більше, 0,4 градуса або більше, 0,5 градуса або більше, 1 градус або більше, 2 градуса або більше, З градуса або більше, 4 градуса або більше, 5 градусів або більше, або 10 градусів або більше порівняно з таким вихідної Ес-ділянки.
У деяких варіантах здійснення варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризуються наявністю щонайменше одного змінення амінокислоти у щонайменше одному положенні, вибраному з групи, що складається з положення 250 та 307 відповідно до нумерації Є. Як альтернатива, варіанти змінення амінокислот, описані в УМО 2014/118858, можуть бути подібним чином використані у даному винаході.
У деяких аспектах варіант Ес-ділянки за даним винаходом складається з двох поліпептидних ланцюгів з послідовностями, що відрізняються одна від одної. У додатковому аспекті у варіанті
Ес-ділянки за даним винаходом була забезпечена гетеродимеризація між першим поліпептидом і другим поліпептидом. У разі одержання гетеродимерного білка із застосуванням способу на основі рекомбінації є переважним, щоб зв'язувалися з утворенням гетеродимера переважно пептидні ланцюги, які відрізняються один від одного, а не ідентичні поліпептидні ланцюги, які зв'язуються з утворенням гомодимера. Чи забезпечується гетеродимеризація у варіанті Ес- ділянки, чи ні, можна оцінювати, наприклад, шляхом відділення гомодимерів та гетеродимерів в одержаних варіантах Ес-ділянки за допомогою такої методики, як хроматографія, та шляхом визначення співвідношення кожного компонента.
У деяких варіантах здійснення варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризуються наявністю щонайменше одного змінення амінокислоти у щонайменше одному положенні, вибраному з групи, що складається з положення 349, 356, 366, 368, 407 та 439 відповідно до нумерації ЕО. Як альтернатива, варіанти змінення амінокислот, описані в УМО 2006/106905 та
МО 1996/027011, можуть бути подібним чином використані у даному винаході.
У деяких аспектах варіант Ес-ділянки за даним винаходом характеризується посиленою активністю зв'язування з ЕсКп за кислотного рН. У деяких варіантах здійснення кислотний рн означає рН 4,0-6,5. В додаткових варіантах здійснення кислотний рН являє собою щонайменше один, вибраний з групи, що складаєтьсяз рН 4,0,4,1,4,2,4,3,4,4,4,5,4,6,4,7,4,8, 4,9, 5,0, 5.1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 та 6,5. У певних варіантах здійснення кислотний рН являє собою рн 5,8.
У деяких варіантах здійснення варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризуються наявністю щонайменше одного змінення амінокислоти у щонайменше одному положенні, вибраному з групи, що складається з положення 428, 434, 436, 438 та 440 відповідно до нумерації ЕО. Як альтернатива, варіанти змінення амінокислот, описані в МО 2016/125495, можуть бути подібним чином використані у даному винаході.
В одному аспекті варіант Ес-ділянки за даним винаходом включає щонайменше одне змінення амінокислоти у щонайменше одному положенні, вибраному з групи, що складається з положення 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 349, 356, 366, 368, 407, 428, 434, 436, 438, 439 та 440 відповідно до нумерації ЕШ.
У деяких аспектах варіант Ес-ділянки за даним винаходом характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326 та 334 відповідно до нумерації ЕО. У додатковому аспекті варіант Ес-ділянки характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот у (ї) положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307 та 326 відповідно до нумерації ЕЮО в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки та (ії) положення 236, 250, 270, 298, 307, 326 та 334 відповідно до нумерації БО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В іншому аспекті варіант Ес-ділянки за даним винаходом додатково характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 332 відповідно до нумерації ЕО. У додатковому аспекті варіант Ес-ділянки характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 332 відповідно до нумерації БО в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В іншому аспекті варіант Ес-ділянки за даним винаходом додатково характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 356 відповідно до нумерації ЕО. У додатковому аспекті варіант Ес-ділянки характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 356 відповідно до нумерації БО в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В іншому аспекті варіант Ес-ділянки за даним винаходом додатково характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 366 відповідно до нумерації ЕО. У додатковому аспекті варіант Ес-ділянки характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 366 відповідно до нумерації БО в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В іншому аспекті варіант Ес-ділянки за даним винаходом додатково характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 349 відповідно до нумерації ЕО. У додатковому аспекті варіант Ес-ділянки характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 349 відповідно до нумерації БО в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В іншому аспекті варіант Ес-ділянки за даним винаходом додатково характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 332 відповідно до нумерації ЕО. У додатковому аспекті варіант Ес-ділянки характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 332 відповідно до нумерації БО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В іншому аспекті варіант Ес-ділянки за даним винаходом додатково характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 330 відповідно до нумерації ЕО. У додатковому аспекті варіант Ес-ділянки характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 330 відповідно до нумерації БО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В іншому аспекті варіант Ес-ділянки за даним винаходом додатково характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 439 відповідно до нумерації ЕО. У додатковому аспекті варіант Ес-ділянки характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 439 відповідно до нумерації БО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В іншому аспекті варіант Ес-ділянки за даним винаходом додатково характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в положеннях 366, 368 та 407 відповідно до нумерації
Е). У додатковому аспекті варіант Ес-ділянки характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в положеннях 366, 368 та 407 відповідно до нумерації БО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В іншому аспекті варіант Ес-ділянки за даним винаходом додатково характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 356 відповідно до нумерації ЕО. У додатковому аспекті варіант Ес-ділянки характеризується наявністю змінення амінокислоти в положенні 356 відповідно до нумерації БО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В деяких аспектах варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризуються наявністю варіантів змінення амінокислот в положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 334, 349, 356, 366, 368 та 407 відповідно до нумерації ЕО. У додатковому аспекті варіант Ес- ділянки характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в (ії) положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 349 та 366 відповідно до нумерації ЄЮ в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки та (її) положеннях 236, 250, 270, 298, 307, 326, 334, 356, 366, 368 та 407 відповідно до нумерації БО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В деяких аспектах варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 60 334, 356 та 439 відповідно до нумерації ЕО. В додаткових аспектах варіанти Ес-ділянки характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в (ї) положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326 та 356 відповідно до нумерації БО в першому поліпептиді вихідної
Ес-ділянки та (ії) положеннях 236, 250, 270, 298, 307, 326, 334 та 439 відповідно до нумерації ЕО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В деяких аспектах варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 349, 356, 366, 368 та 407 відповідно до нумерації ЕО. В додаткових аспектах варіанти Ес-ділянки характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в (Її) положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 349 та 366 відповідно до нумерації
ЕО в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки та (її) положеннях 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 356, 366, 368 та 407 відповідно до нумерації БО в другому поліпептиді вихідної
Ес-ділянки.
В деяких аспектах варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 356 та 439 відповідно до нумерації ЕЮОЮ. В додаткових аспектах варіанти Ес- ділянки характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в (ї) положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326 та 356 відповідно до нумерації БЮ в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки та (її) положеннях 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334 та 439 відповідно до нумерації БО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В деяких аспектах варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 349, 356, 366, 368 та 407 відповідно до нумерації ЕО. В додаткових аспектах варіанти
Ес-ділянки характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в (ї) положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 349 та 366 відповідно до нумерації ЄЮ в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки та (ії) положеннях 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 356, 366, 368 та 407 відповідно до нумерації ЕО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В деяких аспектах варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 356 та 439 відповідно до нумерації ЕО. В додаткових аспектах варіанти Ес-ділянки характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в (ї) положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332 та 356 відповідно до нумерації ЄЮ в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки та (ії) положеннях 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334 та 439 відповідно до нумерації ЕЄО в другому поліпептиді вихідної Рс-ділянки.
В деяких аспектах варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 366, 368 та 407 відповідно до нумерації ЕО. В додаткових аспектах варіанти Ес- ділянки характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в (ії) положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326 та 366 відповідно до нумерації БЮ в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки та (ії) положеннях 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 366, 368 та 407 відповідно до нумерації БО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В деяких аспектах варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 366, 368 та 407 відповідно до нумерації ЕЮОЮ. В додаткових аспектах варіанти Ес- ділянки характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в (ії) положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332 та 366 відповідно до нумерації ЄЮ в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки та (її) положеннях 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 366, 368 та 407 відповідно до нумерації БО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В деяких аспектах варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 349, 356, 366, 368 та 407 відповідно до нумерації ЕО. В додаткових аспектах варіанти Ес-ділянки характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в (Її) положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 349 та 366 відповідно до нумерації
ЕО в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки та (її) положеннях 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 356, 366, 368 та 407 відповідно до нумерації БО в другому поліпептиді вихідної
Ес-ділянки.
В деяких аспектах варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в положеннях 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 349, 356, 366, 368 та 407 відповідно до нумерації ЕО. В додаткових аспектах варіанти
Ес-ділянки характеризується наявністю варіантів змінення амінокислот в (ї) положеннях 234, бо 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 349 та 366 відповідно до нумерації БО в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки та (ії) положеннях 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 356, 366, 368 та 407 відповідно до нумерації ЕО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В додаткових варіантах здійснення варіанти Ес-ділянки за даним винаходом характеризуються наявністю щонайменше одного змінення амінокислоти, вибраного із групи, що складається з наступного: () Туг або Рпе в положенні 234, Сіп в положенні 235, Тгр в положенні 236, Меї в положенні 239, Ма! в положенні 250, Авр в положенні 268, Си в положенні 270, АІа в положенні 298, Рго в положенні 307, Авр в положенні 326, Си в положенні 332, Сувз в положенні 349, Гуз в положенні 356 та Тгр в положенні 366 відповідно до нумерації Є в першому поліпептиді вихідної Ес-ділянки та (ії) АІа в положенні 236, Ма! в положенні 250, СІМ в положенні 270, АІа в положенні 298, Рго в положенні 307, Азр в положенні 326, Меї або Гуз в положенні 330, Азр або Сіи в положенні 332, СІ в положенні 334, Суз в положенні 356, Зег в положенні 366, АІа в положенні 368, Ма! в положенні 407, та Сіи в положенні 439 відповідно до нумерації БО в другому поліпептиді вихідної Ес-ділянки.
В додаткових аспектах варіанти Ес-ділянки за даним винаходом додатково характеризуються наявністю будь-якого з наведених вище варіантів змінення амінокислот (а) - (а): (а) АІа в положенні 434 відповідно до нумерації ЕО; (Б) Аіа в положенні 434, Тиг в положенні 436, Агуд в положенні 438 та Си в положенні 440 відповідно до нумерації ЕО; (с) Геи в положенні 428, Аа в положенні 434, Тиг в положенні 436, Агуд в положенні 438 та
Сім в положенні 440 відповідно до нумерації ЕМ; та (4) Геи в положенні 428, АІа в положенні 434, Агуд в положенні 438 та Сім в положенні 440 відповідно до нумерації ЕО.
В додаткових варіантах здійснення у даному винаході представлені поліпептиди, що містять амінокислотну послідовність під будь-яким із з«ЕО ІЮ МО: 43-46, 65, 66, 81, 207, 239, 253-271, 276, 277 та 278. "Рецептори Есу" (в даному документі називаються рецепторами Есу, Есук або Есок) стосуються рецепторів, що можуть зв'язуватися з Ес-ділянкою моноклональних антитіл ІдС1,
ІдОс2, ІДОЗ та Ід04, та зокрема означають будь-якого представника родини білків, що кодуються генами рецептора Есу. У людей ця родина включає без обмеження ЕсукІ (СОб4), у тому числі ізоформи ЕсукКіа, ЕсукіІБ та ЕсуКіс; ЕсукІ! (СО032), у тому числі ізоформи ЕсукКІІа (у тому числі алотипи НІ13З1 (тип Н) та К131 (тип К)), ЕсукКІІБ (у тому числі ЕсукІІБ-1 та ЕсуКІІр-2) та ЕсуКПс; а також ЕсукП (СО16), у тому числі ізоформи ЕсуКШа (у тому числі алотипи М158 та Е158) та
ЕсукІШЬ (у тому числі алотипи ЕсукПЬ-МАї та ЕсукІПБЬ-МА2), та будь-які людські Есук, ізоформи і алотипи ЕсукК, які ще не виявлені. Повідомлялося, що ЕсукІБ!1 та ЕсукІ2 є сплайсинговими варіантами людського ЕсуУКІЬ. Крім того, повідомлялося про сплайсинговий варіант під назвою ЕсукіІїЬЗ (У Ехр Меа, 1989, 170: 1369-1385). На додаток до цих сплайсингових варіантів людський ЕсукІІр передбачає всі сплайсингові варіанти, зареєстровані в МСВІ, а саме МР 001002273.1, МР 001002274.1, МР 001002275.1, МР 00117773. Крім того, людський ЕсукІІр передбачає кожний раніше зареєстрований генетичний поліморфізм, а також
Есукб (Ап Кпешт. 48: 3242-3252 (2003); Копо єї аІ., Нит. Мої. Сепеї. 14: 2881-2892 (2005); та Куодо)м еї аї!., Ай Апет. 46: 1242-1254 (2002)) та кожний генетичний поліморфізм, який буде зареєстровано у майбутньому.
Існує два алотипи ЕсумІІа: один, в якому амінокислота в положенні 131 ЕсуКПа являє собою гістидин (тип Н), та другий, в якому амінокислота в положенні 131 замінена аргініном (тип К) (Улаттегаат, 9. Ехр. Меа. 172: 19-25 (1990)).
ЕсукК передбачає без обмеження ЕсукК людини, миші, пацюка, кроля та мавпи і може бути одержаний із будь-якого організму. ЕсуК миші передбачають без обмеження Есукі! (СО64),
Есукі! (СО032), ЕсукП (СО16) і ЕсуйКПІ-2 (СО16-2) та будь-які ЕсукК миші або ізоформи Есук.
Амінокислотна послідовність людського ЕсукКІ представлена під 5ЕБЕО ІЮО МО: 131 (МР 000557.1); амінокислотна послідовність людського ЕсуКіІІа представлена під 5ЕО ІЮО МО: 132 (ААН2гО0823.1), 5ЕО ІО МО: 142, 5БО Ір МО: 143 або 5БО ІЮО МО: 150; амінокислотна послідовність людського ЕСУКІЬ представлена під 5ЕО 10 МО: 151 (ААІ46679.1), 5ЕО ІЮО МО: 169 або 5ЕО ІЮО МО: 172; амінокислотна послідовність людського ЕсукШа представлена під 5ЕО
ІЮО МО: 174 (ААНЗЗ3678.1), ЗЕО ІО МО: 175, 5БО ІЮО МО: 176 або 5ЕО ІО МО: 177; та амінокислотна послідовність людського ЕсукПЬ представлена під 5ЕО ІЮ МО: 178 (ААІ28563.1).
На відміну від Есу-рецептора, що належить до надродини імуноглобулінів, людський ЕсКп структурно подібний до поліпептидів головного комплексу гістосумісності (МНС) класу І, демонструючи від 22 95 до 29 95 ідентичності послідовності з молекулами МНС класу І (СПегіе єї 60 аІ., Ітт. Тодау (1997) 18 (12): 592-598). ЕРсКп експресується у вигляді гетеродимера, що складається з розчинного ланцюга В або легкого ланцюга (р2-мікроглобулін), що утворює комплекс з трансмембранним ланцюгом « або важким ланцюгом. Як і МНС, ланцюг « ЕсКп містить три позаклітинні домени (01, 02 і а3), а його короткий цитоплазматичний домен закріплює білок на клітинній поверхні. Домени «41 та 42 взаємодіють з ЕсКп-зв'язувальним доменом Ес-ділянки антитіла (Кадпамап еї аїЇ., Іттипйу (1994) 1: 303-315). Амінокислотна послідовність людського ЕсКп представлена під 5ЕО ІО МО: 179 (МР 0040981), та амінокислотна послідовність В2-мікроглобуліну представлена під ЗЕО ІЮО МО: 180. "Вихідна Ес-ділянка", як використовується в даному документі, стосується Ес-ділянки до введення змінення (варіантів змінення) амінокислоти, описаного в даному документі. У деяких варіантах здійснення вихідна Ес-ділянка являє собою Ес-ділянку нативної послідовності (або Ес- ділянку нативного антитіла). Антитіло включає, наприклад, ІдДА (ІдДА1, ІдАг), 1940, ІЧЕ, до (1901,
Ідс2, ІдОЗ3, Ід0с4) та ЗМ. Антитіло може бути одержане від людини або мавпи (наприклад, яванської макаки, макаки резус, мармозетки, шимпанзе або бабуїна). Нативне антитіло може характеризуватися наявністю природних мутацій. Множину послідовностей алотипів Ід, виникнення яких обумовлено генетичним поліморфізмом, описано в публікації МІН Ме 91-3242 "Зедцепсез ої ргоїєїп5 ої іттипоіодіса! іпїеге5і", і будь-яка з них може бути використана у даному винаході. Зокрема, для людського ЇДО1 амінокислотна послідовність в положеннях 356- 358 (нумерація ЕЮШ) може являти собою або ЮОЕЇ, або ЕЕМ. У певних варіантах здійснення вихідна Ес-ділянка являє собою Ес-ділянку, одержану з константної ділянки важкого ланцюга людського ЇДС1 (5ЕО ІО МО: 249), людського ЇдДе2 (5ЕО ІЮ МО: 250), людського ЇдЗ (ЗЕО ІЮ
МО: 251) або людського Ід4 (ЗЕО ІО МО: 252). В іншому варіанті здійснення вихідна Ес-ділянка являє собою Ес-ділянку, одержану з константної ділянки важкого ланцюга під ЗЕО ІЮ МО: 82 або 5ЕО ІО МО: 158. В додаткових варіантах здійснення вихідна Ес-ділянка може являти собою
Ес-ділянку, одержану шляхом додавання змінення (варіантів змінення) амінокислоти, відмінного від змінення (варіантів змінення) амінокислоти, описаного в даному документі, до Ес-ділянки нативної послідовності (Ес-ділянки еталонного варіанта послідовності). Ес-ділянка нативної послідовності зазвичай складена у вигляді гомодимера, що складається з двох ідентичних поліпептидних ланцюгів.
Крім того, варіанти змінення амінокислот, виконані для іншої цілі(цілей), можуть бути об'єднані в описаному в даному документі варіанті Ес-ділянки. Наприклад, можуть бути додані амінокислотні заміни, що забезпечують поліпшення активності зв'язування з ЕсКп (Ніпіоп еї аї.,
У. Іттипої. 176(1): 346-356 (2006); баІгАсдпа еї аї., у. Віої. Спнет. 281(33): 23514-23524 (2006);
Реїкома еї аї., Іл. Ітітипої. 18(12): 1759-1769 (2006); 7аіемх5Ку еї аї., Маї. Віотесппої. 28(2): 157- 159 (2010); УМО 2006/019447; УМО 2006/053301 і МО 2009/086320), та амінокислотні заміни для поліпшення гетерогенності або стабільності антитіла (МО 2009/041613). Як альтернатива, поліпептиди з властивістю стимулювати кліренс антигена, які описані в МО 2011/122011, МО 2012/132067, УМО 2013/046704 або МО 2013/180201, поліпептиди з властивістю специфічного зв'язування з тканиною-мішенню, які описані в М/О 2013/180200, поліпептиди з властивістю повторного зв'язування з множиною молекул антигена, які описані в УМО 2009/125825, МО 2012/073992 або УМО 2013/047752, можуть бути об'єднані з варіантом Ес-ділянки, описаним в даному документі. Як альтернатива, з метою надання здатності зв'язування з іншими антигенами, варіанти змінення амінокислот, розкриті в ЕР1752471 та ЕР1772465, можуть бути об'єднані у СНЗ варіанта Ес-ділянки, описаного в даному документі. Як альтернатива, з метою збільшення часу утримування в плазмі крові, варіанти змінення амінокислот, які забезпечують зниження рі константної ділянки (М/О 2012/016227), можуть бути об'єднані у варіанті Ес-ділянки, описаному в даному документі. Як альтернатива, з метою стимулювання поглинання клітинами, варіанти змінення амінокислот, що забезпечують підвищення рі константної ділянки (МО 2014/145159), можуть бути об'єднані у варіанті Ес-ділянки, описаному в даному документі. Як альтернатива, з метою стимулювання усунення молекули-мішені з плазми крові, варіанти змінення амінокислот, що забезпечують підвищення рі константної ділянки (МО 2016/125495), можуть бути об'єднані у варіанті Ес-ділянки, описаному в даному документі В одному варіанті здійснення таке змінення може включати, наприклад, заміну у щонайменше одному положенні, вибраному з групи, що складається з положення 311, 343, 384, 399, 400 та 413 відповідно до нумерації ЕО. У додатковому варіанті здійснення така заміна може являти собою заміщення амінокислоти на ГІ уз або Агд в кожному положенні.
Крім того, також можуть бути використані методики одержання гетеродимеризованих антитіл, в яких використовується асоціація СНІ і Сі антитіла та асоціація МН і МІ, які описані у
МО 2011/028952.
Як і у способі описаному у М/О 2008/119353 ії УМО 2011/131746, також можна бо використовувати методику одержання гетеродимеризованих антитіл шляхом попереднього одержання двох типів гомодимеризованих антитіл, інкубації антитіл у відновлювальних умовах для їх дисоціації та забезпечення їх асоціації знову.
Крім того, як і у способі, описаному в М/О 2012/058768, також можна використовувати методику одержання гетеродимеризованих антитіл шляхом додавання варіантів змінення до доменів СН2 та СНЗ.
У разі одночасної експресії двох поліпептидів, що містять варіант Ес-ділянки, які містять різні амінокислотні послідовності, для одержання поліпептидів, що містять гетерологічні варіанти Ес- ділянки, поліпептиди, що містять гомологічні варіанти Ес-ділянки, також зазвичай одержують у вигляді домішок. У таких випадках поліпептиди, що містять гетерологічні варіанти Ес-ділянки, можуть бути ефективно одержані шляхом їх відділення та очищення від поліпептидів, що містять гомологічні варіанти Ес-ділянки, із застосуванням відомих технологій. Повідомлялося про спосіб ефективного відділення та очищення гетеродимеризованих антитіл від гомодимеризованих антитіл із застосуванням іонообмінної хроматографії, шляхом введення варіантів змінення амінокислот у варіабельні ділянки двох типів важких ланцюгів антитіла для створення різниці ізоелектричних точок між гомодимеризованими антитілами та гетеродимеризованими антитілами (М/О 2007/114325). Повідомлялося про інший спосіб очищення гетеродимеризованих антитіл із застосуванням хроматографії з використанням білка
А, шляхом конструювання гетеродимеризованих антитіл, що містять два типи важких ланцюгів, одержаних з ІдС2а миші, які зв'язуються з білком А, та Їд025 пацюка, які не зв'язуються з білком
А МО 1998/050431 та УУО 1995/033844).
Крім того, гетеродимеризоване антитіло можна ефективно очистити із застосуванням хроматографії з використанням білка А шляхом заміни амінокислотних залишків в положеннях 435 і 436 (нумерація ЕМ), які розташовані у сайті зв'язування білка А важкого ланцюга антитіла, амінокислотами, такими як Туг або Ніз, з одержанням різних значень афінності зв'язування з білком А.
За даним винаходом змінення амінокислоти означає будь-яку заміну, делецію, додавання, вставку та модифікацію або їх комбінацію. За даним винаходом змінення амінокислоти може бути перефразована як мутація амінокислоти.
Кількість варіантів змінення амінокислот, введених у Ес-ділянку, не обмежена. У певних варіантах здійснення вона може становити 1, 2 або менше, З або менше, 4 або менше, 5 або менше, 6 або менше, 8 або менше, 10 або менше, 12 або менше, 14 або менше, 16 або менше, 18 або менше або 20 або менше.
В одному аспекті у даному винаході представлені способи одержання поліпептиду, що містить варіант Ес-ділянки. В додаткових аспектах у даному винаході представлені способи одержання поліпептиду, що містить варіант Ес-ділянки, функція якого була модифікована. В деяких аспектах поліпептиди являють собою антитіла. В деяких аспектах поліпептиди являють собою білки, що є продуктами злиття з Ес. У певних варіантах здійснення ці способи включають введення щонайменше одного змінення амінокислоти у вихідну Ес-ділянку. У певних варіантах здійснення ці способи включають: (ї) одержання поліпептиду(поліпептидів), що містить вихідну
Ес-ділянку; та (її) введення щонайменше одного змінення амінокислоти у вихідну Ес-ділянку. У певних варіантах здійснення ці способи можуть додатково включати: (ії) вимірювання функції поліпептиду(поліпептидів), що містить варіант Ес-ділянки. Нативна Ес-ділянка зазвичай складається з двох ідентичних поліпептидних ланцюгів. Варіанти змінення амінокислот у вихідній Ес-ділянці можуть бути введені або в один із двох поліпептидних ланцюгів вихідної Ес- ділянки, або в обидва поліпептидні ланцюги.
В іншому варіанті здійснення спосіб одержання поліпептиду(поліпептидів), що містить варіант Ес-ділянки, включає: (ї) одержання однієї або більше нуклеїнових кислот, що кодують поліпептиди, які містять вихідну Ес-ділянку; (ії) введення щонайменше однієї мутації в ділянку(ділянки), що кодує вихідну Ес-ділянку в нуклеїнових кислотах; (ії) введення нуклеїнових кислот, одержаних в (ії), у клітину-хазяїна та (ім) культивування клітини, описаної в (ії), таким чином, щоб здійснювалася експресія поліпептиду(поліпептидів), що містить варіант Ес-ділянки.
У певних варіантах здійснення зазначені вище способи можуть додатково включати: (м) збирання поліпептиду(поліпептидів), що містить варіант Ес-ділянки, з культури клітини-хазятна, описаної в (ім).
У певних варіантах здійснення нуклеїнові кислоти, одержані в (ії), можуть бути включені в один або більше векторів (наприклад, векторів експресії).
У деяких варіантах здійснення варіанти змінення амінокислот, що використовуються у способах одержання за даним винаходом, вибирають з будь-якого одного змінення, вибраного з варіантів змінення, які можуть бути включені у згадані вище варіанти Ес-ділянки, комбінацій 60 окремих варіантів змінення або об'єднаних варіантів змінення, наведених в таблицях 26-30.
Ес-ділянка може бути одержана за допомогою повторного елюювання фракції, адсорбованої на колонці з білком А після часткового розщеплення моноклональних антитіл Їде1, Ідс2, ІдсЗ,
Ід54 або подібних із застосуванням протеази, такої як пепсин. Протеаза конкретно не обмежена, за умови, що вона може розщеплювати повнорозмірне антитіло із забезпеченням одержання РЕаь і Е(аб)2 способом на основі рестрикції шляхом встановлення відповідних умов ферментативної реакції, таких як рнН, і приклади включають пепсин і папаїн.
Поліпептиди, що містять варіант Ес-ділянки за даним винаходом, можуть бути одержані іншими способами, відомими в даній галузі, крім згаданих вище способів одержання.
Поліпептиди, що містять варіант Ес-ділянки, одержані описаними в даному документі способами одержання, також включені в даний винахід.
Способи аналізу, описані в даному документі, або різні способи вимірювання, відомі в даній галузі, можуть бути використані для ідентифікації або скринінгу варіантів Ес-ділянки, представлених в даному документі, для з'ясування або їх фізичних, або хімічних властивостей, або видів біологічної активності.
Аналізи для визначення активності зв'язування поліпептиду, що містить варіант Ес-ділянки, з одним або більше представниками родини ЕсК описані в даному документі або іншим чином відомі в даній галузі. Такі аналізи зв'язування включають без обмеження аналіз методом поверхневого плазмонного резонансу, скринінг за допомогою гомогенного аналізу підсилення люмінесценції за зближення (А!/РНА), ЕЇІЗА та сортування клітин, що активується флуоресценцією (ГАС) (І агаг єї аї., Ргос. Маї!. Асай. сі. ОБА (2006) 103(11): 4005-4010).
В одному варіанті здійснення активність зв'язування поліпептиду, що містить варіант Ес- ділянки, з представниками родини ЕсК, може бути виміряна із застосуванням аналізу методом поверхневого плазмонного резонансу. Наприклад, різні ЕСсСК піддають взаємодії як аналітів з поліпептидом, що містить варіант Ес-ділянки, іммобілізований або захоплений на сенсорному чипі, із застосуванням відомих способів та реагентів (наприклад, білка А, білка І, білка А/5, білка С, антитіл до ланцюга А, антитіл до ланцюга к, антигенних пептидів та антигенних білків).
ЕСВА можуть бути іммобілізовані або захоплені на сенсорному чипі, а поліпептид, що містить варіант Ес-ділянки, може використовуватися як аналіт. В результаті таких взаємодій одержують сенсограми зв'язування, та аналізуючи їх можна розрахувати значення константи дисоціації (КО) таких варіантів зв'язування. Більше того, різниця у значенні резонансної одиниці (КО) на сенсограмах до і після взаємодії з ЕсК (тобто зв'язувальна кількість ЕсК) може бути використана як індикатор активності зв'язування поліпептиду, що містить варіант Ес-ділянки, з
Еск. Крім того, скориговане значення, одержане шляхом ділення зазначеної вище зв'язувальної кількості ЕСсК на різницю значень КО на сенсограмах до і після іммобілізації або захоплення поліпептиду, що містить варіант Ес-ділянки, на сенсорному чипі (тобто зв'язувальна кількість поліпептиду, що містить варіант Ес-ділянки) (тобто скориговане значення являє собою зв'язувальну кількість ЕСК на одиницю кількості поліпептиду, що містить варіант Ес-ділянки), можна використовувати як індикатор активності зв'язування.
У додатковому аспекті у даному винаході представлені фармацевтичні склади, що містять поліпептид, що містить варіант Ес-ділянки, представлений в даному документі. В одному варіанті здійснення зазначені вище фармацевтичні склади додатково містять фармацевтично прийнятні носії.
Приклади
Нижче наведені приклади способів і композицій за даним винаходом. Слід зазначити, що різні інші варіанти здійснення можуть бути реалізовані з урахуванням наведеного вище загального опису.
Приклад 0. Концепція антитіла з перемиканням класу, яке виявляє антитілозалежну цитотоксичну активність щодо маркерів клітинної поверхні регуляторних Т-клітин тільки в мікрооточенні раку
Вважалося, що іпілімумаб проявляє протипухлинний ефект через інгібування пригнічення активації ефекторних Т-клітин за допомогою СТІ А4, що експресується на поверхні ефекторних
Т-клітин; однак нещодавно повідомили про те, що важливою є антитілозалежна цитотоксична активність (АЮОСС-активність) щодо Т-клітин, які експресують СТІ А4, і було виявлено, що видалення регуляторних Т-клітин у пухлинах та АОСсС-активність є важливими механізмами дії протипухлинного ефекту антитіл до СТІ А4.
Крім того, відомо, що АЮСс-активність антитіл ЇдДС1 є результатом індукції цитотоксичної активності за рахунок зв'язування константної ділянки антитіла з Есук МК-клітин і макрофагів, а антитіла з константною ділянкою, модифікованої для підсилення такого зв'язування, індукують сильнішу цитотоксичну активність, що призводить до виникнення протипухлинного ефекту.
З іншого боку, повідомлялося, що видалення регуляторних Т-клітин у всьому організмі викликає системну відповідь, подібну до аутоїмунного захворювання, і вважається, що регуляція балансу між цитотоксичною активністю для виникнення протипухлинного ефекту і системною відповіддю є дуже важливою.
Більш конкретно очікують, що антитіло виявлятиме потужнішу цитотоксичну активність і буде здатне пригнічувати системні відповіді, якщо антитіло може міцно зв'язуватися з регуляторними Т-клітинами або виснаженими Т-клітинами в мікрооточенні раку, забезпечувати сильний протипухлинний ефект шляхом видалення регуляторних Т-клітин або виснажених Т- клітини за допомогою цитотоксичної активності і обмежувати відповідь тільки мікрооточенням раку. Про антитіла з таким механізмом дії поки що не повідомляли. Тому автори даного винаходу фактично створили та перевірили антитіла (антитіла до СТІ А4 із перемиканням класу), які діють проти СТІ А4 тільки локально в пухлині та містять константну ділянку з підсиленим зв'язуванням із Есук, експресованим(и) на МК-клітинах і макрофагах.
Приклад 1. Одержання антитіл, що зв'язуються з антигенами у присутності АТФ або його метаболіту, із бібліотеки наївних антитіл та бібліотеки антитіл раціональної конструкції із застосуванням методики фагового дисплея (1-14) Одержання антигенів для одержання антитіл, що зв'язуються з антигеном, у присутності малої молекули
Як антигени одержували біотинільовану позаклітинну ділянку СТГ А4 миші (тСТі АХ), позаклітинну ділянку людського СТІ А4 (СТІ А4) та абатацепт. Зокрема, стосовно позаклітинної ділянки НАСТІ А4, ген СТІ А4-Ніз-ВАР (ЗЕО ІО МО: 1), в якому Нівз-мітка та ВАР-мітка були злиті з С-кінцем позаклітинної ділянки СТІ А4, синтезували та вставляли в плазміду для експресії у тварини. Антигенний білок експресували й очищали із застосуванням наступного способу.
Одержану плазміду вводили способом ліпофекції в лінію ЕгеесзіуЇе 293-Е (Іпийгодеп), одержану з клітин нирки ембріону людини, яку висівали в колбу після суспендування в середовищі Егеебіує 293 Ехргеззіоп Медіит (Іпийгодеп) за щільності клітин 1,33 х 106 клітин/мл. Через три години після введення плазміди додавали біотин до кінцевої концентрації 100 мкМ, культивували в інкубаторі з СОг (37 "С, 895 СО», 125 об./хв) протягом 4 діб та очищали антиген способом, відомим спеціалістам у даній галузі, із культуральної надосадової рідини. Поглинання розчину очищеного антигена при 280 нм вимірювали із застосуванням спектрофотометра. Концентрацію очищеного антигена розраховували з одержаного виміряного значення із застосуванням коефіцієнта екстинкції, розрахованого методом РАСЕ (Ргоївіп 5сіепсе (1995) 4, 2411-2423). З іншого боку, тСТІ А4-Нів (5іпо Віоіодіс5 Іпс. 50503-МО8Н, номер доступу МР 033973.2), в якому
Ніз-мітка була злита з позаклітинною ділянкою тСТі А4, та абатацепт (Айтеза Согрогайоп), в якому константна ділянка людського Ді була злита з СТІ А4, біотинілювали методом іммобілізації по аміногрупі (Мо за каталогом РІЕКСЕ 21329). (1-2) Одержання антитіл, що зв'язуються з СТІ А4 миші в присутності малих молекул з бібліотеки наївних людських антитіл, за допомогою пенінга із застосуванням гранул
Бібліотеку фагового дисплея людських антитіл, що складається з декількох фагів, які представляють ЕБаб-домени послідовностей людських антитіл, що відрізняються один від одного, сконструювали відповідно до способу, відомого фахівцям у даній галузі, із застосуванням як матриці полі-А РНК, одержаних із РВМС людини, комерційно доступних людських полі-А РНК і подібних.
Зі сконструйованої бібліотеки фагового дисплея наївних антитіл людини відбирали антитіла, активність зв'язування яких із позаклітинною ділянкою СТІ А4 миші (тСТтТІА4) змінюється за наявності та при відсутності малої молекули. Більш конкретно збирали фаги, що представляють антитіла, які демонструють активність зв'язування з тСТІА4, захопленим на гранулах у присутності малої молекули. Фаги вилучали з фагового елюату, елюйованого з гранул при відсутності малої молекули. У даному способі одержання біотин-мічений тСТІі А4 (тСТІ А4-Нів- біотин) використовували як антиген.
Фаги, одержані з Е. соїї, що несуть сконструйовану фагміду для фагового дисплея, очищали загальним способом. Потім одержували розчин фагової бібліотеки, діалізований проти ТВ5.
Пенінг здійснювали із застосуванням антигена, іммобілізованого на магнітних гранулах. Як магнітні гранули використовували гранули, покриті МецїгАмідіп (Зега-Мад 5ЗрееавВеавдв», покриті
МецшгАміаїіп), або гранули, покриті стрептавідином (Юупабеадз» М-280 5ігеріаміаїіп).
Для ефективного одержання залежного від малих молекул антитіла з перемиканням класу в присутності малої молекули, яке може діяти як перемикач у ракових тканинах, здійснювали пенінг відповідно до способу, описаного в попередньому патентному документі УМО 2013/180200. Цей спосіб пенінга забезпечує збагачення антитіла, які зв'язуються з антигеном за наявності аденозин-5'-трифосфату (АТФ) та метаболітів АТФ, але не зв'язуються з антигеном у відсутності АТФ. (1-3) Оцінка активності зв'язування за наявності та при відсутності малої молекули за допомогою фагового ЕГІЗА
З окремих колоній Е. соїї, одержаних у (1-2), вилучали культуральну надосадову рідину, що містить фаг, відповідно до стандартного способу (Меїпоав Мої. Віої. (2002) 178, 133-145).
Культуральні надосадові рідини, вилучені із застосуванням МисіеоРахзі 96 (МАСНЕКУ-МАСЕЇ), піддавали ультрафільтрації. По 100 мкл кожної культуральної надосадової рідини вносили в кожну лунку МисіеоРавзі 96 і центрифугували при 4500 уд протягом 45 хвилин для видалення фільтрату. Додавали 100 мкл Н?гО і знову промивали шляхом центрифугування при 4500 4 протягом 30 хвилин. Потім додавали 100 мкл ТВ5 і суміш залишали стояти за кімнатної температури протягом 5 хвилин, після чого вилучали розчини з фагами, що містяться в надосадових рідинах.
Очищені фаги, в які додавали ТВ5, піддавали ЕГІ5А за наступною процедурою. Планшет для мікротитрування 5ігеріаумеї! 96 (Коспе) покривали на ніч 100 мкл ТВ5, що містить тСТІ А4-
Ніз-біотин. Після промивання кожної лунки ТВ5Т для видалення тсСТі А4-Нів-біотину, не зв'язаного з планшетом, лунки блокували 250 мкл суміші 295 знежиреного молока-ТВ5 протягом 1 години або довше. Після видалення 2 95 знежиреного молока- ТВ5 у кожну лунку додавали одержані очищені фаги і планшет залишали стояти за кімнатної температурі протягом 1 години, що дозволяло антитіло-презентувальним фагам зв'язуватися з тСТтІі А4-Нівз-біотином, наявним у кожній лунці, за відсутності або в присутності АТФ. Після промивання кожної лунки з використанням ТВ5Т або АТФ/ТВ5Т туди додавали НЕР-кон'юговане антитіло до М13 (Атегзпат РПагтасіа Віоїесі), розбавлене за допомогою ТВ5 або АТФ/ТВ5, та інкубували планшет протягом 1 години. Після промивання за допомогою ТВ5Т або АТФ/ТВ5Т реакцію проявлення кольору в розчині в кожній лунці, в яку додавали один розчин ТМВ (2УМЕбО), зупиняли додаванням сірчаної кислоти, а потім вимірювали прояв кольору за поглинанням при 450 нм. У результаті підтверджували багато антитіл, які зв'язалися з тСТІ(А4 лише у присутності АТФ. Результати фагового ЕГІ5А представлені в таблиці 2. У цьому випадку клони з поглинанням, вищим за 0,2, у присутності АТФ визначали як позитивні, а клони, що мають коефіцієнт поглинання, вищий за 2, у присутності/за відсутності АТФ визначали як клони, які характеризуються АТФ-залежною антигензв'язувальною здатністю (клони з перемиканням класу) У цьому прикладі 5М може використовуватися як абревіатура для малої молекули/молекули з низькою масою, такої як АТФ.
Таблиця 2 11111111 Загальнечислоб/ (1-4) Одержання антитіл, що зв'язуються з антигеном у присутності малої молекули, із бібліотеки антитіл раціональної конструкції із застосуванням АТФ або його метаболіту
Із бібліотеки фагового дисплея антитіл раціональної конструкції, створеної в попередньому патентному документі М/О 2015/083764, одержували антитіла, що демонструють антигензв'язувальну активність в умовах присутності АТФ або метаболіту АТФ (наприклад, АДФ,
АМФ, аденозину (АДО) тощо). Для одержання антитіл збирали антитіло-презентувальні фаги, які демонструють здатність зв'язування з антигеном, захопленим на гранулах, у присутності
АТФ або метаболіту АТФ, а потім фаги вилучали з елюату, елюйованого з гранул, в умовах відсутності АТФ або метаболіту АТФ.
Фаги одержували стандартним способом із Е. соїї, що несе сконструйовану фагміду для фагового дисплея. Розчин фагової бібліотеки одержували розведенням із використанням ТВ5 популяції фагів, осаджених шляхом додавання 2,5 М Масі/10 95 РЕС до розчину культури Е. соїї, в якому одержували фаги. Потім до розчину фагової бібліотеки додавали ВЗА до кінцевої концентрації 4 95. Пенінг здійснювали із застосуванням антигена, іммобілізованого на магнітних гранулах. Як магнітні гранули використовували гранули, покриті МешігАмідіп (Зега-Маа
ЗреєаВеавдь, покриті МешігАмідіп), або гранули, покриті стрептавідином (Оупабеайдх М-280 бігеріамідіп). Біотинільований абатацепт (абатацепт-біотин) використовували як антиген.
Для ефективного одержання залежного від малих молекул антитіла з перемиканням класу в присутності малої молекули, яке може діяти як перемикач у ракових тканинах, здійснювали пенінг для збагачення антитіл, що зв'язуються з антигеном у присутності аденозин-5'- трифосфату (АТФ) або метаболіту АТФ та не зв'язуються з антигеном за відсутності АТФ або метаболіту АТФ, відповідно до способу, описаного у попередньому патентному документі УМО 2015/083674. (1-5) Оцінка активності зв'язування в присутності та за відсутності АТФ або його метаболіту за допомогою фагового ЕГІЗА
З окремих колоній Е. соїї, одержаних вищевказаним способом, вилучали культуральну надосадову рідину, що містить фаг, відповідно до стандартного способу (Меїйподз Мо/. Віої. (2002) 178, 133-145). Вилучену культуральну надосадову рідина піддавали ультрафільтрації із застосуванням Мисіеобахї 96 (МАСНЕНЕУ-МАСЕЇ). Фільтрат видаляли центрифугуванням (4500 9, 45 хвилин) МисіеоРавзі 96 із додаванням 100 мкл культуральної надосадової рідини в кожну лунку. МисіІеобазхі 96 із доданими 100 мкл Н2О у кожну лунку знову промивали центрифугуванням (4500 49, 30 хвилин). І нарешті, додавали 100 мкл ТВ5 та вилучали розчин фагів, що міститься в надосадовій рідині кожної лунки МисіеоРаві 96, який залишали стояти за кімнатної температури протягом 5 хвилин.
ТВ5 або ТВ5, що містить АТФ або його метаболіт (5М/ТВ5), додавали до очищених фагів і фаги піддавали ЕГІЗА за наступною процедурою. Планшет для мікротитрування 5ігеріамуеї! 96 (Коспе) покривали на ніч 100 мкл ТВ5, що містить біотин-мічений антиген (абатацепт-біотин), одержаний у прикладі 1-1. Після видалення вільного абатацепт-біотину шляхом промивання кожної лунки планшета за допомогою ТВ5Т лунки блокували 250 мкл суміші 2 95 знежиреного молока-ТВ5 протягом 1 години або довше. Після видалення суміші 2 95 знежиреного молока-
ТВ5 у кожну лунку додавали одержані очищені фаги і планшет залишали стояти при 37 "С протягом 1 години, що дозволяло антитіло-презентувальним фагам зв'язуватися з абатацепт- біотином, присутнім у кожній лунці, за відсутності або в присутності АТФ або його метаболіту.
Після промивання кожної лунки за допомогою ТВ5Т або ТВ5Т, що містить АТФ або його метаболіт (5М/ТВ5Т), туди додавали НЕР-кон'юговане антитіло до М13 (Атегзпат РІагтасіа
Віоїесі)), розбавлене за допомогою ТВ5 або 5М/ТВ5, та інкубували планшет протягом 1 години.
Після промивання лунок за допомогою ТВ5Т або 5М/ТВ5Т реакцію проявлення кольору в розчині в кожній лунці, в яку додавали один розчин ТМВ (7УМЕО), зупиняли додаванням сірчаної кислоти, а потім вимірювали проявлення кольору за поглинанням при 450 нм. У результаті підтверджували багато антитіл, активність зв'язування яких з абатацептом змінюється в присутності та за відсутності АТФ або його метаболіту. Результати фагового
ЕПЗА представлені в таблиці 3. У цьому випадку клони з коефіцієнтом поглинання 5/М, вищим за 2, у присутності АТФ або його метаболіту визначали як позитивні, а клони з коефіцієнтом поглинання, вищим за 2, у присутності/за відсутності АТФ або його метаболіту визначали як клони, які характеризуються антигензв'язувальною здатністю, залежною від АТФ або його метаболіту (клони з перемиканням класу).
Таблиця З днини Цен число писпвнн 0000161
ЗМ -у/- співвідношення » 2) (1-6) Аналіз послідовності антитіл із перемиканням класу, антигензв'язувальна активність яких залежить від присутності або відсутності АТФ та його метаболітів
Аналізували нуклеотидні послідовності генів, ампліфікованих із застосуванням специфічних праймерів І(асРЕ (5ЕО ІЮО МО: 2) і бівзедк (ЗЕО ІО МО: 3) із клонів, що, як визначено, мають антигензв'язувальну активність за умов присутності АТФ та його метаболітів у результаті фагового ЕГІБА. У результаті аналізу одержували клони АВАЮп11-4 020, АВАОп11-4 086,
АВАЮОНІ2-4 014, АВАЮп12-5 001, АВАОН12-5 046 та АВАЮНП5-5 041, які, як було встановлено, характеризуються зв'язувальною активністю з біотин-міченим абатацептом у присутності АТФ та його метаболітів. Назви клонів змінили як АВАМО0О1, АВАМО02, АВАМО0О3, АВАМОО4,
АВАМОО5 та АВАМОО6б відповідно (таблиця 4). 5О0
Таблиця 4
АВАОПТ1-4 086 |АВАМО02 | 7777777 61177117 1111111171сСсСщС
АВАОпТ2-4 014 |АВАМОО3 | 77777778 Ї11111191сСсСщС (1-7) Експресія й очищення антитіл із перемиканням класу, антигензв'язувальна активність яких залежить від присутності та відсутності АТФ та його метаболітів
Гени, що кодують варіабельні діллики АВАМО01, АВАМО02, АВАМО0ОЗ3, АВАМО04, АВАМОО5 та АВАМО0б, одержані з бібліотеки фагового дисплея людських антитіл раціональної конструкції, вставляли в плазміду для експресії людського (Ідс1/лямбда у тварини. Антитіла експресували із застосуванням наступного способу. Одержану плазміду вводили способом ліпофекції в лінію Егеесіуіє 293-Е (Іпийгодеп), одержану з клітин нирки ембріону людини, яку суспендували в середовищі ЕРгеезіуіїе 293 Ехргезвзіоп Медіит (Іпийгодеп) за щільності клітин 1,33 х 106 клітин/мл та висівали при З мл/лунка в кожну лунку б-лункових планшетів. Антитіла очищали від надосадової рідини культури, культивованої в інкубаторі з СОг (37 "С, 8 95 СО», 90 об./хв) протягом 4 днів, із застосуванням гРгоїєїп А Берпагозе"М Равзі Ріо (Атегзпат
Віозсіепсез5) за допомогою способу, відомого фахівцям у даній галузі. Поглинання розчинів очищених антитіл при 280 нм вимірювали із застосуванням спектрофотометра. З одержаних виміряних значень розраховували концентрацію очищених антитіл із застосуванням коефіцієнта екстинкції, розрахованого методом РАСЕ (Ргоївіп 5сієпсе (1995) 4, 2411-2423). (1-8) Оцінка зв'язувальної активності одержаних антитіл щодо СТІ А4 у присутності та за відсутності АМФ за допомогою ЕГІ5ЗА до
Шість одержаних антитіл АВАМО0О1, АВАМО02, АВАМООЗ3, АВАМО04, АВАМОО5 та АВАМООб піддавали ЕГІЗА дО. Відповідним чином одержували буфери, показані в таблиці 5. Біотин- мічений людський СТІ А4 (пСТІ А4-Ніз-біотин) використовували як антиген.
Таблиця 5
Спочатку планшет для мікротитрування 5ігеріауМеї! 96 (Коспе) покривали 100 мкл ТВ5, що містить СТІ А4-Ніз-біотин, за кімнатної температури протягом 1 години або довше. Після промивання кожної лунки планшета буфером для промивання для видалення НСТІА4-Нів- біотину, не зв'язаного з планшетом, лунки блокували 250 мкл блокувального буфера протягом 1 години або довше. У кожну лунку, з якої видаляли блокувальний буфер, додавали по 100 мкл кожного очищеного ЇдС, приготованого в концентрації 2,5 мкг/мл у буфері для зразків, що містить АМФ у кінцевій концентрації 1 мМ і планшет залишали стояти за кімнатної температури протягом 1 години, що забезпечувало зв'язування кожного ІдсС із ВСТІ А4-Ніз-біотином, присутнім у кожній лунці. Після промивання буфером для промивання, що містить АМФ у кінцевій концентрації 1 мМ, планшет, у кожну лунку якого додавали НКР-кон'юговане антитіло до людського (9 (ВІОБОШКСЕ), розбавлене буфером для зразків, інкубували протягом 1 години. Після промивання буфером для промивання, що містить кожну малу молекулу, реакцію проявлення кольору в розчині в кожній лунці, в яку додавали один розчин ТМВ (2УМЕВБ), зупиняли додаванням сірчаної кислоти, а потім вимірювали проявлення кольору за поглинанням при 450 нм. Показані в таблиці 5 буфери, що містять композиції, застосовували як буфери.
Результати вимірювань представлені у таблиці 6. Лункам із надлишковими значеннями присвоювали значення 5,00. Результати показали, що в усіх клонів АВАМО0О1, АВАМО0О2,
АВАМО0З3, АВАМО04, АВАМОО5 і АВАМОО6Є поглинання за відсутності АМФ було значно нижчим, ніж у присутності АМФ. Відповідно до цього результату було підтверджено, що всі клони
АВАМО0О1, АВАМО0О02, АВАМООЗ, АВАМО04, АВАМОО05 та АВАМОО6Є мають властивість змінювати зв'язування з антигеном у залежності від присутності або відсутності малих молекул.
Таблиця 6 молекули (1-9) Оцінка впливу АТФ і його метаболітів на зв'язування з людським СТІ А4 за допомогою поверхневого плазмонного резонансу
Далі АВАМОО0О4 оцінювали як антитіло до СТІ А4 із перемиканням класу.
Взаємодію реакції антиген-антитіло між АВАМО04 та НСТІА4-НіЗ-ВАР аналізували із застосуванням Віасоге 1200 (СЕ Неайсагеє). Забезпечували захоплення АВАМОО04 сенсорним чипом СМ5 (СЕ Неайсаге), на якому був іммобілізований білок А/З (Ріегсе) у відповідній кількості за допомогою методу іммобілізації по аміногрупі, і забезпечували взаємодію з антигеном СТІ А4-Ніз-ВАР, одержаним у прикладі 1-1. ТВ5 використовували як електродний буфер, а 10 мМ гліцин-НСЇІ (рН 1,5) використовували як розчин для регенерації.
Після захоплення 1 мкг/мл АВАМО04, суспендованого в ТВ5, розчин, що містить 500 нм
СТІ А4-Ніз-ВАР і 10 концентрацій АТФ, АДФ або АМФ, розбавлених у стандартному співвідношенні 4 із 4000 мкМ, та 2 мМ МосСі»г впорскували в кожну проточну кювету за швидкості потоку 10 мкл/хв протягом З хвилин. Ці З хвилини використовували як фазу зв'язування
СТІ А4-Ніз-ВАР. Після завершення фази зв'язування впорскування перемикали на електродний буфер на 2 хвилини, які використовували як фазу дисоціації СТІ А4-Нібз-ВАР.
Після завершення фази дисоціації впорскували розчин для регенерації за швидкості потоку 30 мкл/хвилина протягом ЗО секунд. Наведене вище приймали за цикл вимірювання активності зв'язування АВАМО04. Зв'язувальну кількість НСТІ А-4-Нібз-ВАР, що взаємодіє з АВАМО0О4 у фазі зв'язування, коригували за кількістю захопленого антитіла. Застосовували Віасоге 1200
ЕмаїІцчайоп бойїймаге версії 2.0 та Місгозоїї Ехсе! 2013 (Місгозой) для аналізу та побудови графіка даних.
На фіг. 1 показано зв'язувальну кількість АВАМОО4 та СТІ А4-Ніз-ВАР у присутності АТФ та його метаболітів, одержану в результаті цього вимірювання.
Як показано на фіг. 1, було підтверджено, що АВАМО04 має властивість зв'язування з
СТІ А4 із застосуванням як перемикача не тільки АТФ, але і метаболітів АТФ. Крім того, було показано, що антитіло має найбільш сильну активність зв'язування, особливо в присутності
АМР. (1-10) Оцінка зв'язування антитіла з клітинами, що експресують людський СТІ А4
Проточний цитометр використовували для оцінки того, як змінюється взаємодія антиген- антитіло між АВАМО04 та людським СТІ А4 у присутності та за відсутності АМФ. Клітини СНО, які стабільно експресують людський СТІ А4 (клітини СТІ А4-СНО), одержували у відповідній концентрації. У цьому випадку для суспензії використовували РВ5, що містить 0,195 ВБА (буфер для ЕАС5). До 100 мкл клітинного розчину додавали антитіло до кінцевої концентрації 10 мг/мл, потім АМФ додавали до кінцевої концентрації 0, 0,4, 4, 40, 200 та 1000 мкм і залишали стояти при 4 "С протягом 30 хвилин. Після цього клітинну лінію промивали буфером для промивання, який являє собою буфер для ЕАС5, що містить АМФ у кінцевій концентрації 0, 0,4, 4, 40, 200 ї 1000 мкМ, а потім РІТС-мічене вторинне антитіло (Е(аб'2) кози до людського Ід, аабз-РІТС миші, ВесКтап, 732598) і знову залишали стояти при 4 "С протягом 30 хвилин у темряві. Після повторного виконання операції промивання здійснювали вимірювання й аналіз із застосуванням проточного цитометра (ГАС5 СуАп"М АРР). Результати показані на фіг. 2.
Наведені вище результати показують, що АВАМО04 продемонстрував залежну від концентрації АМФ активність зв'язування з клітинами, що експресують РПСТІА4, та продемонстрував залежну від концентрації АМФ активність зв'язування не тільки з розчинними антигенами, але також з антигенами мембранного типу.
(1-11) АОСб-активність тестованого антитіла із застосуванням людських мононуклеарних клітин периферичної крові як ефекторних клітин
Залежну від концентрації антитіл АЮОСсС-активність антитіла, яке зв'язується з антигеном
АТФ-залежним чином, вимірювали в наступний спосіб. У цьому випадку АЮСс-активність тестованого антитіла вимірювали в наступний спосіб із застосуванням людських мононуклеарних клітин периферичної крові (далі називаються людськими РВМС) як ефекторних клітин.
Спочатку готували розчин людських РВМСО. У здорових добровольців (дорослих чоловіків) відбирали 50 мл периферичної крові за допомогою шприца, що вже містив 200 мкл розчину гепарину 1000 оодиниць/мл (Момо-гепарин для ін'єкцій 5000 одиниць, Момо Могаї5кК).
Периферичну кров, розбавлену в 2 рази РВ5(-), ділили на 4 аліквоти і додавали в пробірки для розділення лімфоцитів ІГеисозер (Сгеіпег Віо-Опе), які центрифугували після попереднього впорскування 15 мл Рісої-Радое РГО5. Пробірки для розділення, в які вносили аліквоти периферичної крові, центрифугували при 2150 об./хв протягом 10 хвилин за кімнатної температури, а потім розділяли фракції мононуклеарних клітин. Після промивання клітин, що містяться у фракціях, одноразово за допомогою КРМІ-1640 (Масаїаї Тездиє), що містить 10 95
ЕВ5 (далі називається як 10 95 ЕВ5/КРМІ), клітини суспендували в 10 95 ЕВБ/КРМІ до щільності клітин 1 х 107 клітин/мл. Суспензію клітин використовували як розчин людських РВМС для подальших експериментів.
Потім як клітини-мішені клітини СТГ А4-СНО, одержані шляхом примусової експресії позаклітинної ділянки людського СТІ А4 у клітинах СНО, суспендували і готували в 10 95
ЕВЗ/АКРМІ з одержанням 2 х 105 клітин/мл. Крім того, АМФ (бідта), розбавлений до 4 мМ за допомогою КРМІ, використовували як розчин АМФ для подальших тестів.
Активність АЮОСС оцінювали за вивільненням ГОН (лактатдегідрогенази). Спочатку додавали по 50 мкл розчину антитіл, приготованого в кожній концентрації (0, 0,04, 0,4, 4 ї 40 мкг/мл) у кожну лунку 9б-лункового планшета з О-подібним дном, куди висівали по 50 мкл кожної із клітин-мішеней (1 х 107 клітин/лунка). Крім того, у кожну лунку додавали по 50 мкл розчину АМФ і суміш залишали стояти за кімнатної температури протягом 15 хвилин. У кожну лунку додавали по 50 мкл (5 х 109 клітин/лунка) розчину людських РВМС, планшет центрифугували, а потім залишали стояти при 37 "С протягом 4 годин в інкубаторі з 5 95 діоксиду вуглецю. Після завершення реакції 100 мкл культурального надосадової рідини збирали і переносили в 9б6-лунковий планшет для вимірювання, а потім каталізатор (С) і розчин барвника (С) у наборі для виявлення І ОН (ТаКакКа) змішували при 1:45 і додавали 100 мкл цієї суміші. Після забезпечення реакції за кімнатної температури протягом 15 хвилин додавали 50 мкл 1 н. НСІ для зупинення реакції. Вимірювали поглинання при 492 нм, а АОСсС-активність вимірювали за вивільненням І ОН. АОСс-активність визначали за наступною формулою:
Арсб-активність (95) х ХА-О) - (0-0)) х 1004Д(8-0)-(0-0)).
У наведеній вище формулі А представляє середнє значення активності ІОН (00 при 492 нм) у лунках, в які додавали кожне тестоване антитіло. В представляє середнє значення активності ГОН (00 при 492 нм) у лунках, в які після реакції додавали 10 мкл 20 95 водного розчину Тійоп-Х. С представляє середнє значення активності ГОН (00 при 492 нм) у лунках, в які до клітин-мішеней додавали 150 мкл 10 95 ЕВ5/ЕРМІ або 100 мкл 10 95 ЕВ5/ЕРМІ та 50 мкл розчину АМФ. О представляє середнє значення І ОН-активності (00 при 492 нм) у лунках, що містять лише 10 95 ЕВЗ/КРМІ. Тест здійснювали у двох повторностях і розраховували середнє значення АЮОСсС-активності (95) у тесті, що відображає АЮСс-активність тестованого антитіла.
Результати показані на фіг. 3.
Наведені вище результати продемонстрували, що антитілло АВАМО04 характеризується антигензв'язувальною активністю у присутності АМФ і має здатність до знищення клітин- мішеней, проявляючи АЮОСс-активність.
Приклад 2. Аналіз кристалічної структури антитіла до СТІ А4, що характеризується властивостями АТФ-залежного зв'язування (2-1) Рентгеноструктурний аналіз антитіла АВАМО04, яке зв'язує СТІ А4, що використовує
АМФ як перемикач
Для СТІ А4-зв'язувального антитіла АВАМО04, яке використовує АМФ як перемикач та було одержано з бібліотеки в прикладі 1, аналізували кристалічні структури Еаб-фрагмента АВАМО04 окремо, комплексу Гар-фрагмента АВАМО04 і АМФ та комплексу Раб-фрагмента АВАМОО4,
АМФ і позаклітинного домену СТІ А4. (2-2) Одержання повнорозмірного антитіла АВАМОО4 для кристалізації
Одержання й очищення повнорозмірного антитіла АВАМОО4 для кристалізації здійснювали 60 способом, відомим фахівцям у даній галузі.
(2-3) Одержання Рар-фрагмента для аналізу кристалічної структури Рар-фрагмента
АВАМОО04
Еаб-фрагмент АВАМО04 одержували стандартним способом рестрикційного розщеплення з
П уз-С (Рготеда, номер за каталогом М1671) із наступним завантаженням на колонку з білком А (Мабзеїесі ЗиКе, СЕ Неайсаге), катіонообмінну колонку (НіТгар 5Р НР, СЕ НеаїНсаге) та гель- фільтраційну колонку (Зирегдех200 16/60, СЕ НеакНсаге) для видалення Ес-фрагментів.
Фракції, що містять Гар-фрагменти, об'єднували та зберігали при -80 "С. (2-4) Одержання кристалів Гар-фрагмента АВАМО04
Еаб-фрагмент АВАМО04 для кристалізації очищений за допомогою способу 2-3, концентрували до приблизно 13 мг/мл і кристалізували при 20 "С за методикою дифузії пари в краплі, що сидить. Резервуарний розчин складався з 0,1 М МЕ5, рН 6,5, 25 95 вага/об'єм поліетиленгліколю 4000. Одержані кристали занурювали в розчин 0,08 М МЕ5, рН 6,5, 20 96 вага/об'єм поліетиленгліколю 4000 та 20 95 етиленгліколю. (2-5) Збір даних рентгенівської дифракції для кристалів Раб-фрагмента АВАМО04 та визначення структури
Дані рентгенівської дифракції одержували шляхом вимірювання за допомогою ВІ-17А радіаційної установки РНоїоп Расіогу Організації по дослідженню високоенергетичних прискорювачів. Під час вимірювання кристали постійно тримали в замороженому стані в струмі азоту при -178"С і збирали загалом 360 рентгенівських дифракційних зображень із застосуванням ССО-детектора Очапішт 270 (АОБС), підключеного до каналу променю, при обертанні кристалів на 0,57 за раз. Визначення параметрів комірки, індексацію дифракційних плям та обробку дифракційних даних із дифракційних зображень здійснювали із застосуванням програми Хіаг2 (9. Аррі. Стгуві. 43: 186-190 (2010)), пакету ХО (Асіа. Сгуві. О6б6: 125-132 (2010)) та Зсаїа (Асіа. Стувзі. 062: 72-82 (2006)) і наприкінці одержували дані інтенсивності дифракції з розділенням 1,70 А. Статистичні показники кристалографічних даних показані в таблиці 7.
Структуру визначали способом молекулярної заміни із застосуванням програми Ріазег (3.
Аррі. Стгувзі. (2007) 40, 658-674). Модель пошуку Раб-фрагментів одержували з опублікованої кристалічної структури баб (код РОВ: 4МКІ). Модель будували за допомогою програми Соої (Аста Стузі. 066: 486-501 (2010)) та уточнювали за допомогою програми Кеїпасо5 (Асіа Сгуві. 067: 355-467 (2011)). Кристалографічний фактор достовірності (К) даних інтенсивності дифракції від 52,92 до 1,70 А становив 16,9295, а вільний Б-фактор становив 21,22 95.
Статистичні показники структурного уточнення показані в таблиці 7.
Таблиця 7
Збір даних дифракції рентгенівських променів та статистична обробка даних о Збірданих || АВАМОО4ар | | АВАМООліар-АМР | Г|АВАМОО4Тар-АМР-СТІ-А (Спейсернагрупа| | Раіеї | | Рі | | Рагае --:: І
Параметри елементарної комірки аб,с(А) | 6427,70,86,79,59| | 135,75,135,75,66,04 | | 7229,7229,309,31 с,В.у0 | 190,00,90,00,90,00| | 90,00,90,00,90,00 | | 90,00,90,00,90,00 Ж Н/
ШО 11 жено 010ною 110шее здатність реве | ве ||0ее0|000вие відбиттів
Число характерних 40500 14366 16037 відбиттів
Пенн | ета | юопвя |та (зовнішній шар)
Втеге? (зовнішній зро | вва || леви || та
Обробба.ї//-/-: | /їЇ її здасть 000баватио | О000яллзаюю 1/0000овавіаюю здатність (Числовідбиттів | | З8523 | | 13668. | | (Б 15145 Й
Таблиця 7
Збір даних дифракції рентгенівських променів та статистична обробка даних о Збірданих || АВАМОО4ар | | АВАМООліар-АМР | Г|АВАМОО4Тар-АМР-СТІ-А - Ь
Же 1 звяетта || жеевва | юсоя
КМ5 відхилення від ідеального значення дення! о» 11001100» (Кутизв'язів0 || 17102 || 09275. | | 0842 а: Вледе - У КІ У ДІ | (ВК) - (І (КІ) | / 5 НКІ У ДІ ) (ВК) |, де ЦВК) та «(КІ)» являють собою відповідно інтенсивність вимірювання) та середнє значення інтенсивності відбиття, що характеризується експоненціальним ПКІ. р: В-фактори - У ПНКІ | Рсаїс (НКІ) | - | Рсьє (НКІ) | / У НКІ | Рсьх (НКІ) |, де Есьх та Есас являють собою відповідно спостережувану та розраховану амплітуди структурних факторів. с; Внєе розрахований з 5 95 відбиттів, які випадковим чином не використовують. (2-6) Одержання Рар-фрагмента АВАМО04 із повнорозмірного антитіла для аналізу кристалічної структури комплексу Гар-фрагмента АВАМО0О4 і АМФ та комплексу Гар-фрагмента
АВАМОО04, АМФ і СТІ А4
Еаб-фрагмент АВАМО04 одержували стандартним способом рестрикційного розщеплення папаїном (Коспе Оіадпобвіїс5, Мо за каталогом 1047825) із наступним завантаженням на колонку з білююм А (МаббеїЇесі ЗиКе, СЕ Неайсаге), катіонообмінну колонку (НіТтар 5Р НР, СЕ
Неайсаге) та гель-фільтраційну колонку (Зирегдех200 16/60, СЕ Неайсаге) для видалення Ес- фрагментів. Фракції, що містять Габ-фрагменти, об'єднували та зберігали при -80 "С. (2-7) Створення кристалів комплексу Гар-фрагмента АВАМОО4 і АМР
Еаб-фрагмент АВАМО04 для кристалізації очищений за допомогою способу 2-6, концентрували до приблизно 13 мг/мл, куди додавали АМФ з одержанням кінцевої концентрації 2 ММ, та здійснювали кристалізацію при 20 "С за методикою дифузії пари в краплі, що сидить.
Резервуарний розчин складався з 0,1 М буфера Могрпєивз 2, рН 7,5, 37,5 95 вага/об'єм
МРО РІК РЗЗ50, 10 95 карбонових кислот Могрпеиз (Могрпецз, МоЇІесшаг Оітепвіопв). (2-8) Збір даних рентгенівської дифракції для кристалів комплексу Еаб-фрагмента АВАМО04 і АМФ та визначення структури
Дані рентгенівської дифракції одержували шляхом вимірювання за допомогою ВІ-1А радіаційної установки РНоїоп Расіогу Організації по дослідженню високоенергетичних прискорювачів. Під час вимірювання кристали постійно тримали в замороженому стані в струмі азоту при -178 С та збирали 720 рентгенівських дифракційних зображень із застосуванням детектора Рііїайиз 2М (ОЕСТКІ5), підключеного до каналу променю, при обертанні кристалів на 0,257 за раз. Визначення параметрів комірки, індексацію дифракційних плям та обробку дифракційних даних із дифракційних зображень здійснювали із застосуванням програми Хіа?г (..
Аррі. Стувзі. 43: 186-190 (2010)), пакету ХО5 (Асіа. Стгузі. Юб6б6: 125-132 (2010)) та Зсаїа (Асіа.
Стуві. 062: 72-82 (2006)) і наприкінці одержували дані інтенсивності дифракції з розділенням 1,70 А. Статистичні показники кристалографічних даних показані в таблиці 7.
Структуру визначали способом молекулярної заміни із застосуванням програми Равзег (3.
Аррі. Стгувзі. (2007) 40, 658-674). Модель пошуку Раб-фрагментів одержували з опублікованої кристалічної структури Раб (код РОВ: 4МКІ). Модель будували за допомогою програми Соої (Аста Стузі. 066: 486-501 (2010)) та уточнювали за допомогою програми Кейпас5 (Асіа Сгуві. 067: 355-367 (2011)). Кристалографічний фактор достовірності (К) даних інтенсивності дифракції від 47,33 до 2,89 А становив 19,97 95, а вільний К-фактор становив 25,62 95.
Статистичні показники структурного уточнення показані в таблиці 7. (2-9) Одержання позаклітинного домену СТІ Ай
Позаклітинний домен СТІ А4 одержували стандартним способом рестрикційного розщеплення абатацепту за допомогою ендопротеїнази Гуз-С (Коспе, номер за каталогом 11047825001) із наступним завантаженням на колонку з білюм А (МаббеїЇєсі БиКе, СЕ
Неайсаге) та гель-фільтраційну колонку (Зирегдех200 10/300, СЕ Неайсаге) для видалення
Ес-фрагментів. Фракції, що містять позаклітинний домен СТІ А4, об'єднували та зберігали при - (2-10) Одержання комплексу Раб-фрагмента АВАМО04, АМФ і позаклітинного домену
СТІ А4
Позаклітинний домен СТІ А4, очищений способом 2-9, змішували з Еар-фрагментом
АВАМО04, очищеним способом за 2-6, за молярного співвідношення 1,5:1 та додавали туди
АМФ з одержанням кінцевої концентрації 2 мМ. Комплекс очищали гель-фільтраційною хроматографією (Зирегдех200 10/300, СЕ Неайсаге) із застосуванням колонки, урівноваженої за допомогою 25 ММ НЕРЕЗ, рН 7,5, 100 мм Масі, 2 мм АМФ. (2-11) Одержання кристалів комплексу Раб-фрагмента АВАМО04, АМФ і позаклітинного домену ПНСТІ А4
Очищений комплекс концентрували до приблизно 8 мг/мл та кристалізували при 20 "С за методикою дифузії пари в краплі, що сидить, об'єднаної зі способом висівання. Резервуарний розчин складався з 0,1 М буфера Могрпеиз 1, рН 6,5, 37,5 95 вага/об'єм МІКЗ3350, 10 95 галогенів (Могрпеих, МоїЇІесшаг Оітепвіопв). (2-12) Збір даних рентгенівської дифракції для кристалів комплексу Еаб-фрагмента
АВАМОО4, АМФ і позаклітинного домену СТІ А4 та визначення структури
Дані рентгенівської дифракції одержували шляхом вимірювання за допомогою ВІ 32ХИО на
ЗРгіпд-8. Під час вимірювання кристали постійно тримали в замороженому стані в струмі азоту при -178 "С і збирали загалом 180 рентгенівських дифракційних зображень із застосуванням
ССО-детектора МХ-225Н5 (КАМЖМОМІХ), підключеного до каналу променю, при обертанні кристалів на 1,07 за раз. Визначення параметрів комірки, індексацію дифракційних плям та обробку дифракційних даних із дифракційних зображень здійснювали із застосуванням програми Хіаг2 (9. Аррі. Стгуві. 43: 186-190 (2010)), пакету ХО (Асіа. Сгуві. О6б6: 125-132 (2010)) та 5саїа (Асіа. Сгуві. Об2: 72-82 (2006)) і наприкінці одержували дані інтенсивності дифракції з розділенням 1,70 А. Статистичні показники кристалографічних даних показані в таблиці 7.
Структуру визначали способом молекулярної заміни із застосуванням програми Равзег (3.
Аррі. Стгувзі. (2007) 40, 658-674). Модель пошуку Раб-фрагментів одержували з опублікованої кристалічної структури Раб (код РОВ: 4МКІ), а модель пошуку позаклітинного домену ПСТІ А4 одержували з опублікованої кристалічної структури людського СТІ А4 (код РОВ: ЗО5К, .. Віої.
Спет. 286: 6685-6696 (2011)). Модель будували за допомогою програми Соої (Асіа Стгузі. О66: 486-501 (2010)) та уточнювали за допомогою програми Кейпасо (Асіа Сгубзі. 067: 355-367 (2011)). Кристалографічний фактор достовірності (К) даних інтенсивності дифракції від 52,81 до 3,09 ДА становив 23,4995, а вільний Б-фактор становив 31,02 95. Статистичні показники структурного уточнення показані в таблиці 7. (2-13) Ідентифікація сайту взаємодії між АВАМО04 та АМФ
Кристалічна структура показала, що АМФ переважно розпізнається важким ланцюгом антитіла.
Фрагмент аденінового кільця АМФ розпізнається СОКІ та СОКЗ важкого ланцюга, а фрагмент рибози та частина фосфатної групи розпізнаються СОКІ та СОК2.
Зокрема, як показано на фіг. 4, фрагмент аденінового кільця АМФ розпізнається бічними ланцюгами Т33, що належать СОКІ важкого ланцюга, 795 і 1008, та МУ100С, що належать
СОМКЗ, і основними ланцюгами 596 і МІО0А антитіла. Зокрема, з'ясували, що атоми кисню карбонілу в основних ланцюгах 596 і МІО0А утворюють водневі зв'язки з М у положенні 6 АМФ, група МН аміду основного ланцюга М/100С утворює водневий зв'язок з М у положенні 1, а бічні ланцюги У95, 11008 ї М/100С взаємодіють із використанням пі-електронів фрагмента аденінового кільця, тому антитіло із високим ступенем розпізнає фрагмент аденінового кільця.
Фрагмент рибози розпізнається кожним із бічних ланцюгів Т33, що належить СОКІ важкого ланцюга, та У56 і 58, що належать СОК2, через ван-дер-ваальсову взаємодію та через взаємодію пі-електронів у 56. Крім того, фрагмент фосфатної групи розпізнається кожним із бічних ланцюгів Т33, що належить СОКІ важкого ланцюга, та 552, 552А і К53, що належать
СОК2, а також основним ланцюгом 552А. Зокрема, вважається, що водневі зв'язки, утворені бічним ланцюгом 133 і амідною групою МН основного ланцюга 552А із фрагментом фосфатної групи, і ван-дер-ваальсова взаємодія за допомогою 552 і К53 відіграють важливу роль у розпізнаванні фрагмента фосфатної групи. Нумерація амінокислотних залишків Раб базується на схемі нумерації за Кабраї. (2-14) Ідентифікація епітопів АВАМО04
На фіг. 5 та 6 епітопи контактної ділянки АВАМО04 Раб картовані у кристалічній структурі
СТІ А4 та в амінокислотній послідовності, відповідно. Епітопи містять амінокислотні залишки
СТА, що містять один або більше неводневих атомів, розташованих у межах 4,2 А від будь- якої частини Гар АВАМОО04 або АМФ у кристалічній структурі.
Із кристалічної структури стало ясно, що щонайменше М3З, ЕЗ3, КЗ35, Т53, Е97, М99, М100,
Р101, Р102, Р10О3, 104, У105 і 1106 антигена розпізнаються СОК2 і СОКЗ важкого ланцюга та
СОК1 та СОКЗ легкого ланцюга антитіла та АМФ. Зокрема, петля, що складається з М99-М104 антигена, розпізнається з високим ступенем антитілом, так як вона прихована в петлі СОК антитіла, і вважається, що ця петля відіграє основну роль у розпізнаванні антигена антитілом. (2-15) АМФ-залежний механізм зв'язування антигена
Варіабельну ділянку антитіла екстрагували з кристалічної структури Гарб АВАМОО4 окремо, кристалічної структури комплексу бар АВАМО04 і АМФ та кристалічної структури потрійного комплексу, що складається з Раб АВАМО04, АМФ і СТІ А4, та фіг. 7. являє собою накладену фігуру екстрагованих варіабельних ділянок, зосереджених навколо важкого ланцюга. Для АМФ - залежного зв'язування антигена важливою вважається не тільки пряма взаємодія між АМФ та
СТІ А4, показана в прикладі 2-14, але також і структурна зміна антитіла, пов'язана зі зв'язуванням АМФ.
Як показано на фіг 7 шляхом порівняння кристалічної структури антитіла окремо з кристалічною структурою антитіла, з яким зв'язується АМФ, з'ясували, що петльові структури
СОКЗ важкого ланцюга та СОКЗ легкого ланцюга, а також кут обертання між важким ланцюгом та легким ланцюгом у варіабельній ділянці антитіла також змінювався. Крім того, порівнюючи кристалічну структуру антитіла, з яким зв'язується АМФ, та кристалічну структуру потрійного комплексу, що складається з антитіла, АМФ і СТІ А4, також визнано, що структури СОКЗ важкого ланцюга та СОКІ1 легкого ланцюга були додатково змінені зв'язуванням антигена, що демонструє антигензалежні структурні зміни. З іншого боку, оскільки структура петлі СОКЗ легкого ланцюга та кут обертання між важким ланцюгом та легким ланцюгом не змінилися, вважають, що зв'язування АМФ могло змінити структуру антитіла до стану, близького до структури під час зв'язування антигена. Отже, вважають, що структурні зміни, пов'язані зі зв'язуванням АМФ, необхідні для формування відповідної структури для зв'язування антигена і відіграють важливу роль у АМФ-залежному зв'язуванні антигена.
Приклад 3. Створення змінених антитіл до СТІ А4 та оцінювання їх видів активності (3-1) Створення варіантів антитіла АВАМОО04 із підвищеною активністю зв'язування СТІ А4
Амінокислотну послідовність АВАМО04 (МН 5ЕО ІО МО: 10, МІ 5ЕО ІО МО: 11), одержану з фагової бібліотеки людських антитіл раціональної конструкції, описаної в прикладі 1, змінювали для зниження СТІ А4-зв'язувальної активності вказаної послідовності за відсутності аналогів
АТФ для підвищення активності зв'язування людського СТІ А4 за наявності аналогів АТФ і для підсилення зв'язування з АТФ і аналогами АТФ. Щоб досягти цього, створювали варіанти з точковими мутаціями в залишках, які, як очікується, братимуть участь у зв'язуванні, на основі співкристалічної структури АВАМО04 і АМР та співкристалічної структури АВАМО04, АМФ і людського СТІ А4, одержаних способом, описаним у прикладі 2. Крім того, створювали варіанти, в яких кожна амінокислота, що міститься в СОК, була замінена на Аа або Рго. Варіанти точкових мутацій вимірювали за допомогою Віасоге 1200 або Віасоге 4000 (СЕ НеайНсаге) щодо активності зв'язування людського СТІ А4 (абатацепт і СТІ А4-НІіз-ВАР) за відсутності АТФ та в присутності АТФ, АДФ або АМФ для скринінгу мутацій, які підсилюють активність зв'язування.
Варіанти одержували шляхом об'єднання мутацій, які підсилювали активність зв'язування, та розраховували значення КО за допомогою Віасоге. У результаті з'ясували, що введення замін
НЗ2А та 552аТ у важкий ланцюг АВАМОО04 та 1240, Т26Р і ЕБОЕ у легкий ланцюг (відповідно до нумерації за Кара! підсилювало зв'язувальну властивість АВАМО04. Варіант називають 04НО150/041 0072 (МН 5ЕО І МО: 47, МІ 5ЕО ІЮ МО: 48). (3-2) Вимірювання впливу АТФ та його метаболітів на активність зв'язування людського
СТІ А4 у АВАМО0О4 та 04НО150/041 0072 за допомогою поверхневого плазмонного резонансу
Спочатку створювали чип для вимірювання за допомогою Віасоге Т200. Температуру
Віасоге Т200 встановлювали на 25 "С, а швидкість потоку встановлювали на 10 мкл/хвилина.
НВ5О-ЕР- використовували як електродний буфер. Суміш рівних об'ємів МН (М- гідроксисукциніміду) та ЕС (М-етил-М'-(диметиламінопропіл)карбодііміду) додавали до сенсорного чипа СМ5 (СЕ Неайсаге) зі швидкістю потоку 10 мкл/хв протягом 10 хвилин для активації проточних кювет. Потім додавали 25 мкг/мл білка А/5 (Ріегсе), суспендованого в 10
ММ ацетату натрію, рН 4,0, та забезпечували зв'язування при 10 мкл/хв протягом 30 хвилин.
Потім надлишкові активні групи на проточних кюоветах блокували додаванням 1 М етаноламін-
НСІ при 10 мкл/хв протягом 10 хвилин.
Далі вимірювали вплив АТФ і його метаболітів щодо зв'язування антитіла-мішені з людським 60 СТІ А4. Встановлена температура становила 25 "С, і ТВ5 використовували як електродний буфер. Використовували 10 мМ гліцин-НСІ (рН 1,5) як розчину для регенерації. Після забезпечення захоплення антитіла, суспендованого в ТВ, у кожну проточну кювету впорскували розчин ТВ5, що містить 500 нМ СТІ А4-Ніз-ВАР, 10 концентрацій АТФ, АДФ або
АМФ, розбавлених у стандартному співвідношенні 4 із 4000 мкМ, та 2 мМ МаосСі» за швидкості потоку 10 мкл/хв протягом З хвилин. Ці З хвилини використовували як фазу зв'язування
СТІ А4-Ніз-ВАР. Після завершення фази зв'язування впорскування перемикали на електродний буфер на 2 хвилини, які використовували як фазу дисоціації. Після завершення фази дисоціації впорскували розчин для регенерації за швидкості потоку ЗО мкл/хв протягом 30 секунд і це приймали за цикл вимірювання активності зв'язування. Зв'язувальну кількість
СТІ АЗ-НІіз-ВАР, що взаємодіє з АВАМОО04 або 04НО150/041 0072 у фазі зв'язування, коригували за кількістю захопленого антитіла. Результати показані на фіг. 8. Крім того, при вимірюванні зв'язування АВАМО04 і 04Н0150/0410072 концентрацію малих молекул у фазі зв'язування підтримували при 62,5 мкМ або 1 мМ та 8 концентрацій СТІ А4-Нібз-ВАР, розбавлених у звичайному співвідношенні 2 від 2000 нМ, використовувалися у фазі зв'язування. Значення КО, одержані в результаті аналізу зв'язувальної кількості СТІ А4-Нібз-ВАР, показані в таблиці 8.
Застосовували Віасоге Т200 ЕмаїІцайоп Зоїмаге версії 2.0 та Місгозоїї Ехсе! 2013 (МісгозоЮ) для аналізу та побудови графіка даних. Для розрахунку значення КО використовували стаціонарну модель афінності.
Таблиця 8 04нНО150/041-0072
АВАМОО4
ЗМ представляє малу молекулу (АТФ, АДФ або АМФ), що використовується у кожному аналізі. (3-3) Підсилення зв'язувальної здатності шляхом введення комплексних змінень
Для створення кращих антитіл до СТІ А4 в 04Н0150/041 0072, які є варіабельними ділянками антитіла до людського СТІ А4, одержаного в прикладі 3-1, комплексно вводили амінокислот змінення. Варіанти, в яких амінокислотну заміну кожних 18 амінокислот, окрім цистеїну, здійснювали в усіх СОК 04НО150 та 041 0072, створювали способами, відомими фахівцям у даній галузі, такими як ПЛР. Здійснювали вимірювання приблизно 1200 варіантів, створених для зв'язування з людським СТІ А4, із застосуванням Віасоге 4000. Білок Аз (Тпепто Різпег
Зсієпійс) іммобілізували на сенсорному чипі СМ5 бЗегіеєє 5 (СЕ Неайсаге), і антитіла були захоплені чипом шляхом взаємодії з культуральною надосадовою рідиною, що містить варіант антитіла. Потім забезпечували взаємодію розчину людського СТІ А4, до якого додавали малу молекулу (АТФ, АДФ або АМФ), або розчину людського СТІ А4, до якого не додавали малу молекулу, з антитілом для оцінки здатності зв'язування антитіла з людським СТІ А4 у присутності або за відсутності малої молекули. Аналіз здійснювали при 25 "С із застосуванням трис-забуференого сольового розчину, 0,02 96 Р5З20 як електродного буфера.
Змінення, що підсилювали зв'язування з людським СТІ А4 у присутності малої молекули, та змінення, що знижували зв'язування з людським СТІ А4 за відсутності малої молекули, змінення, виявлені із застосуванням вищенаведеного способу, об'єднували для створення антитіл до людського СТГ А4, що демонструють кращі профілі. Для гена важкого ланцюга антитіла 04НО0О150-С1т (5ЕО ІЮО МО: 209), який має 04НО150 як варіабельну ділянку важкого ланцюга, та б1т (5ЕО ІО МО: 82), в якому С-кінцеві Су та І уз людського ЇДО1 були видалені як константні ділянки важкого ланцюга, змінення, виявлені шляхом введення комплексних змінень, та змінень у каркасній ділянці, об'єднували для одержання генів важкого ланцюга антитіла. Для легкого ланцюга антитіла 041 0072-І(ат! (5ЗЕО ІЮО МО: 208), що має 0410072 як варіабельну ділянку легкого ланцюга та людський ланцюг ЛА їІат! (5ЕО ІО МО: 87) як константну ділянку легкого ланцюга, виявлені варіанти змінення об'єднували для створення генів легкого ланцюга антитіла. Крім того, також створювали варіант, в якому каркасну ділянку варіабельної ділянки легкого ланцюга та константної ділянки замінили послідовністю людського к-ланцюга. Для порівняння створювали ген для важкого ланцюга антитіла МОХТО0О1Н-СТ т (5ЕО ІЮО МО: 210), що має варіабельну ділянку важкого ланцюга МОХ1О0О1Н (5ЕО ІО МО: 154), та ген для легкого ланцюга антитіла МОХ1О0О1І-КОМТ (5ЕО ІЮО МО: 211), що має варіабельну ділянку легкого ланцюга МОХ10О011!. (5ЕО ІО МО: 155) існуючого антитіла до людського СТІ А4, описаного в УМО 0114424. Антитіла експресували й очищали способом, відомим фахівцям у даній галузі, шляхом об'єднання цих генів для створення антитіл до СТІ А4, що становлять інтерес. У таблиці 9 наведені 5ЕО ІЮ МО варіабельних ділянок важкого ланцюга, варіабельних ділянок легкого ланцюга, константних ділянок важкого ланцюга, константних ділянок легкого ланцюга та гіперваріабельних ділянок створених антитіл.
Антитіла в даному документі названі відповідно до наступного правила: (варіабельна ділянка важкого ланцюга) - (константна ділянка важкого ланцюга)/(варіабельна ділянка легкого ланцюга) - (константна ділянка легкого ланцюга). Наприклад, це означає, що коли антитіло називається 04НО0150-С21 т/041 0072-І(ат!, то варіабельна ділянка важкого ланцюга цього антитіла називається 04НО150, константна ділянка важкого ланцюга називається С1т, варіабельна ділянка легкого ланцюга називається 0410072, а константна ділянка легкого ланцюга називається Іат!.
Таблиця 9
Амінокислотні послідовності важких ланцюгів, легких ланцюгів та їх гіперваріабельних ділянок (позначені за допомогою ЗЕО ІЮ МО)
Гіперваріабельна ділянка (НУК) ланцюг | ланцюг | ланцюг | ланцюг 04ноО150- 04н1077- 04н1077- 04н1077- 04н1077- 04н1077- 04н1077- 04н1077- 04н1077- 04н1077-
Сстт/041 1305- 83 95 в2 105 | 106 | 102 | 122 | 117 | 133 кОм р4н1206-
О4н1207- ра4н1208- ра4н1208-
Сстт/041 1407- 134 в2 107 | 108 | 102 | 121 | 123 | 153 кОм
Віасоге 7200 використовували для вимірювання зв'язування одержаних антитіл до людського СТІ А4. Як електродний буфер використовували 20 мМ АСЕЗ (рН 7,4), 150 мм Масі, 2 ММ Мас», 0,05595 Тмеєп 20 із додаванням АТФ до бажаної концентрації, та аналіз здійснювали при 37 "С. Спочатку білок С (СА ВІОСНЕМ) іммобілізували на сенсорному чипі
СМ3З Зегіез 5 (СЕ Неайсаге), та антитіла були захоплені шляхом взаємодії з чипом розчину антитіл, приготованому в електродному буфері, що не містить АТФ. Потім шляхом взаємодії з розчином людського СТІ А4, приготованим в електродному буфері, що містить АТФ до бажаної концентрації, або розчином людського СТІ А4, приготованим у електродному буфері, що не містить АТФ, оцінювали здатність зв'язування антитіла до людського СТІ А4 у присутності або за відсутності АТФ. Чипи регенерували за допомогою 25 мМ Масгн та 10 мМ гліцин-НСЇ (рН 1,5) і здійснювали аналіз шляхом повторного захоплення антитіл. Константу дисоціації кожного антитіла до СТІ А4 розраховували із застосуванням програмного забезпечення Віасоге 200
Емаїнайоп ЗоПйумаге 2.0. Зокрема, константу швидкості зв'язування Ка (л/моль/с) і константу швидкості дисоціації Ка (1/с) розраховували шляхом глобальної підгонки сенсограм, одержаних у результаті вимірювання, із застосуванням моделі зв'язування Ленгмюра 1:11. За цими значеннями розраховували константу дисоціації КО (моль/л). Як альтернатива, константу дисоціації КО (моль/л) розраховували з використанням стаціонарної моделі. Крім того, зв'язувальну кількість СТІ А4 на одиницю кількості антитіла розраховували шляхом коригування кількості зв'язаного СТІ А4, розрахованого за сенсограмою, одержаною за допомогою аналізу, за кількістю антитіл, захоплених на поверхні чипа. У таблиці 10 показані результати цього аналізу.
Таблиця 10
Аналіз зв'язування зміненого антитіла з людським СТІ А4
Назва антитіла АТФ-1| АТФ - | АТФ - АТФ - | АТФ -
М.А.: занадто слабке для визначення значення КО "Значення КО було визначене з використанням тієї самої рівноважної моделі
Значенням "зв'язування з людським СТІ А4" у таблиці вказується зв'язувальна кількість людського СТІ А4 на одиницю кількості антитіла при забезпеченні взаємодії людського СТІ А4 при 1000 нМ у кожній із перерахованих умов концентрації АТФ, а "КО для людського СТІ А4 (М)" вказує на константу дисоціації для людського СТІ А4 в умові кожної концентрації АТФ. Значення
КО, позначені у таблиці знаком ", розраховували із застосуванням стаціонарної моделі. Було показано, що всі варіанти, одержані із застосуванням 04НО150-211п/041 0072-Іат!1 як вихідного антитіла, характеризувалися підсиленим зв'язуванням у присутності АТФ порівняно з 04НО150-
С т/041 0072-іаті. Крім того, як 04НО150-С11п/041 0072-іІат!, так і ці варіанти характеризувалися більш високою зв'язувальною кількістю в умовах, коли АТФ був присутнім при 10 мкМ, аніж при 1 мкМ; і зв'язувальна кількість у присутності 100 мкМ була ще більш високою, спостерігали зв'язування з людським СТІГА4 залежним від концентрації АТФ механізмом. З іншого боку, порівняльний МОХ1ТОО1Н-СТ т/МОХ1001І -КОМТ не показав такого залежного від концентрації АТФ зв'язування з людським СТІ А4. Хоча 04Н1077-С41 т/041 1305-
КОМТ, в якому каркасна ділянка легкого ланцюга 04Н1077-С11п/041І 1086-і(ат! та константна ділянка були замінені людським к-ланцюгом, мали підсилене зв'язування з людським СТІ А4 за відсутності АТФ порівняно з 04Н1077-С21 т/041 1086-Іат1і, також підсилювалося зв'язування, залежне від концентрації АТФ. Ці результати показали, що властивість зв'язування з людським
СТІ А4 залежним від АТФ чином зберігається навіть при заміщенні послідовності послідовністю людського к-ланцюга. З-поміж одержаних у цьому випадку антитіл 04Н1077-С1 тп/041 1066-Іат!, 04Н1077-с1п/041 1305-КОМТ та 04Н1207-С1 т/041 1086-І(аті демонстрували майже таку саму активність зв'язування, що й існуюче антитіло до людського СТ А4 МОХ10О01Н-С1 т/МОХ10011 -
КОМТ в умовах, коли АТФ був присутній при 100 мкМ, а 04Н1208-С1 т/041 1407-КОМТ демонстрував більш сильну активність зв'язування, ніж МОХ10О01Н-сС1т/МОХ1001І-КОМТ в умовах, коли АТФ був присутній при 10 мкМ або більше.
Далі з-поміж одержаних антитіл у таблиці 10 оцінювали 04Н1077-(231п/041 1086-Іаті!і та 04Н1208-211п/041 1407-КОМТ щодо зв'язування з СТІ А4 миші. Для порівняння створювали ген для важкого ланцюга антитіла ПОНОг-сО1а (5ЕО ІО МО: 212), що має варіабельну ділянку важкого ланцюга ПОНО2 (5ЕО ІО МО: 156) антитіла до СТІ А4 миші, та ген для легкого ланцюга антитіла ПО 01-КО (ЗЕО ІО МО: 213), що має варіабельну ділянку легкого ланцюга ПО 01 (ЗЕО
ІО МО: 157), та антитіло експресували, очищували й використовували. Аналіз здійснювали із застосуванням Віасоге 1200 у тих самих умовах, що і вимірювання зв'язування з людським
СТІ А4, за винятком використання СТІ А4 миші як зразка (таблиця 11). СТІ А4 миші одержували в наступний спосіб.
Ген позаклітинної ділянки СТІ А4 миші, зв'язаний з Ніз-міткою (тСТІ А4-Ніх) (5ЕО ІЮ МО: 49), синтезували та вставляли в плазміду для експресії у тварині. Одержану плазміду вводили способом ліпофекції в лінію Егеез(уе 293-Е (Іпийгтодеп), одержану з клітин нирки ембріону людини, яку висівали в колбу після суспендування в середовищі Егеебіуіїе 293 Ехргезвіоп
Медіцт (Іпийгодеп) за щільності клітин 1,33 х 105 клітин/мл. Поглинання розчину очищеного антигена при 280 нм вимірювали із застосуванням спектрофотометра. З одержаних виміряних значень розраховували концентрацію очищеного антигена із застосуванням коефіцієнта екстинкції, розрахованого методом РАСЕ (Ргоївіп 5сіепсе (1995) 4, 2411-2423).
Таблиця 11
Аналіз зв'язування змінених антитіл з СТІ А4 миші 11111111 Зв'язуваннязСТІАЯ миші |КоСТіА4 миші (М)
МКМ МКМ 100 мкм МКМ 100 мкм
М.0О.: занадто слабке для визначення зв'язування
Значенням "зв'язування з СТІ А4 миші" у таблиці вказується зв'язувальна кількість СТІ А4 миші на одиницю кількості антитіла при забезпеченні взаємодії СТІ А4 миші при 1000 нМ у кожній із перерахованих умов концентрації АТФ, а "КО для СТІ А4 миші (М)" вказує на константу дисоціації для СТІ А4 миші в умові кожної концентрації АТФ. Було показано, що пОНО2- ата/пиІ 01-КО зв'язується з СТІ А4 миші із тим самим ступенем незалежно від концентрації АТФ, при цьому було продемонстровано, що і 04Н1077-(241 т-041 1086-Іат!, ії 04Н1208-21 п/041 1407-
КОМТ зв'язуються з СТІ А4 миші залежним від концентрації АТФ механізмом. Порівняно зі здатністю зв'язування з людським СТІ А4, показаною в таблиці 10, здатність зв'язування 4Н1077-С1т-0411086-Іат1!і із СТІ А4 миші була в приблизно 5 разів слабшою порівняно зі здатністю зв'язування з людським СТІ А4, а здатність зв'язування 04Н1208-211п/041 1407-КОМТ з СТІ А4 миші була приблизно вдвічі слабшою порівняно зі здатністю зв'язування з людським
СТІ А4 у присутності 100 мкм АТФ. (3-4) Створення контрольного антитіла до тсСТІі А4 та антитіл до тСТі А4 із перемиканням класу
Створювали контрольне антитіло до тсСТтІ А4 (пОНОг-тЕабб/пШІ 01-тК1, абревіатура тМ5- тЕаб5), та антитіла до СТІ А4 із перемиканням класу (04Н1077-тЕаб55/041 1086-тіоОг, абревіатура ЗУМУ1077-тЕРа5б5, та 04Н1208-тРа55/041 14075-тК1, абревіатура 5МУ1208-тЕа55). В антитілі тМ5-тЕа55 використовували варіабельну ділянку важкого ланцюга ПОНО2 (ЗЕО ІЮ МО: 16) і варіабельну ділянку легкого ланцюга ПО О1 (ЗЕО ІО МО: 17), а для константних ділянок використовували константну ділянку важкого ланцюга миші тЕРа55 (5ЕО ІО МО: 18) і константну ділянку легкого ланцюга миші дикого типу тк! (5ЕО ІО МО: 19). У цьому випадку використовували константну ділянку важкого ланцюга миші, яка була змінена для підсилення зв'язування з рецептором Есу. Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
В антитілі ЗУУ1077-тЕРа55 використовували варіабельну ділянку важкого ланцюга 04Н1077 (ЗЕО ІО МО: 20) і варіабельну ділянку легкого ланцюга 0411086 (5ЕО ІО МО: 21), а для константних ділянок використовували константну ділянку важкого ланцюга миші тЕРа55 (ЗЕО 10
МО: 18) і константну ділянку легкого ланцюга миші дикого типу тіОг (ЗЕО ІО МО: 22). У цьому випадку використовували константну ділянку важкого ланцюга миші, яка була змінена для підсилення зв'язування з рецептором Есу. Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
В антитілі БМУ1208-тРа55 використовували варіабельну ділянку важкого ланцюга 04Н1208 (ЗЕО ІО МО: 23) і варіабельну ділянку легкого ланцюга 04114075 (5ЕБО ІО МО: 24), а для константних ділянок використовували константну ділянку важкого ланцюга миші тРа55 (5ЕО ІЮ
МО: 18) і константну ділянку легкого ланцюга миші дикого типу тк! (ЗЕО ІО МО: 19). У цьому випадку використовували константну ділянку важкого ланцюга миші, яка була змінена для підсилення зв'язування з рецептором Есу. Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі. (3-6) Оцінка нейтралізувальної активності антитіла до СТІ А4 із перемиканням класу
Нейтралізувальну активність антитіла до СТІ А4 із перемиканням класу (5УМ1077-тРЕаб55), одержаного в прикладі 3-4, оцінювали способом конкурентного ЕГІЗА. тСТтТІ А4-ЕРс (5ЕО І МО: 25), в якому людська константна ділянка була зв'язана з тсСтТі А4, розбавляли до 5 мкг/мл (55
НМ) з використанням 0,1 М МанНсо»з, 0,05 95 МамМз для приготування розчину тсСТтТі А4-Ес. 100 мкл кожного одержаного розчину тСТІ А4-Ес додавали в 96б-лунковий планшет і планшет залишали стояти при 4 "С протягом ночі для іммобілізації тСТ| А4-Ес на поверхні планшета.
Після З-разового промивання ТВ5, 0,1 95 Тмееп 20 у кожну лунку додавали по 250 мкл розчину
В5А, розбавленого до 2 95 за допомогою ТВ5, для блокування поверхні планшета. Після цього планшет промивали З рази. Кожен із тСО86-Ес-Нів (біпо Віоіодієз Іпс. 50068-МОЗН, номер доступу МР 062261.3), в якому людська константна ділянка та Нів-мітка були злиті з СО86 миші, розбавленим ТВЗ5 до кінцевої концентрації 55 НМ, розчину антитіла 5М/1077-тРЕаб55, розбавленого до кінцевої концентрації 6,25, 1,56, 0,390, 0,0977, 0,0061 і О мкг/мл, і розчину АТФ, розбавленого до кінцевої концентрації 0, 1, 10 і 100 мкМ, змішували в такий спосіб, щоб одержати загалом 100 мкл, суміш додавали в кожну лунку і залишали планшет стояти при 37 "С протягом 1 години. Потім кожну лунку промивали З рази ТВ5, 0,1 95 Тмееп 20, одержаним у такий спосіб, щоб він містив ту ж концентрацію АТФ, що і розчин, доданий у кожну лунку. У кожну лунку додавали 100 мкл тАБ-НАР-Оігесі до Нівз-мітки (МВІ. (Те Зсіепсез), розбавленого в 10000 разів блокувальним буфером у такий спосіб, щоб концентрація АТФ була такою ж, як у розчині, доданому в кожну лунку, і планшет залишали стояти при 37 "С протягом 1 години.
Потім кожну лунку промивали З рази ТВ5, 0,1 95 Тмееп 20, одержаним у такий спосіб, щоб він містив ту ж концентрацію АТФ, що і розчин, доданий у кожну лунку. У кожну лунку додавали по 100 мкл розчину ТМБ і залишали планшет стояти при 37 "С протягом 1 години. У кожну лунку додавали 50 мкл 1 М Нг50»5, щоб зупинити реакцію, і визначали поглинання при 450 нм за допомогою пристрою для зчитування поглинання в мікропланшетах (М/ако Зипгіве).
Значення поглинання в лунках без антитіл у тих самих умовах концентрації АТФ приймали за швидкість зв'язування тСтТІ А4-тСО86 100 95 та оцінювали, наскільки швидкість зв'язування зменшувалася при додаванні антитіл. Результати показані на фіг. 9.
Ці результати показали, що нейтралізувальна активність антитіла 5М/1077 щодо взаємодії тт А4-тСО86б стає сильнішою зі збільшенням концентрації АТФ в аналізі. Ці результати підтвердили, що антитіло 5М/1077 має АТФ-залежну нейтралізувальну активність. (3-7) Ефективність антитіла до СТІ А4 із перемиканням класу на мишачій моделі з трансплантацією клітин сингенної пухлини, збільшення/зменшення регуляторних Т-клітин (Тгед) у пухлині та зміна маркера системної відповіді в селезінці (3-7-1) Одержання лінії клітин та мишачої моделі з трансплантацією лінії клітин сингенної пухлини
Використовувані клітини являли собою клітини лінії раку молочної залози миші ЕМЗА, придбані у КІКЕМ. Клітини ЕМЗА підтримували й пересівали в середовищі КРМІ 1640 (5ідта), що містить 10 95 бичачої сироватки крові (Тпегто Різпег Зсієпіййс). Як мишей використовували мишей СЗН/Нем (віком 7 тижнів, самиці), придбаних у Спагієз Кімег І арогайгіє5, Японія. Клітини
ЕМЗА трансплантували під шкіру ділянки живота мишей та вважали, що модель створена, коли 60 об'єм трансплантованої пухлини становив від приблизно 150 мм? до приблизно 300 мм3.
Об'єм трансплантованої пухлини розраховували за наступною формулою:
Об'єм пухлини - довгий діаметр х короткий діаметр х короткий діаметр/2. (3-7-2) Одержання лікарських засобів для введення
Лікарськими засобами, які призначалися для введення в модель із трансплантованими клітинами ЕМЗА, були контрольне антитіло до СТІ А4 миші (тМ5-тРа55) та антитіло до СТІ А4 із перемиканням класу (ЗМ/1208-тРа55), одержані в прикладі 3-4. Із застосуванням Ніз-буфера (20 мМ Нів-НСЇ, 150 мМ Масі, рН 6,0) одержували тМ5-тЕа55 при 0,0005 мг/мл, 0,005 мг/мл, 0,0125 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,5 мг/мл, 1,5 мг/мл і 5 мг/мл та одержували ЗМ/1208-тРа55 при 0,005 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,5 мг/мл, 5 мг/мл і 25 мг/мл відповідно. (3-7-3) Введення лікарського засобу для вимірювання протипухлинного ефекту
У день 9 після трансплантації мишам уводили тМ5-тЕаб5 у дозах 0,01 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,25 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг, 30 мг/кг ії 100 мг/кг і вводили 5М/1208-тРа55 у дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг ї 500 мг/кг відповідно. Одержані розчини для введення вводили в дозі 20 мл/кг у хвостову вену.
У таблиці 12 показані детальні дані щодо лікування лікарським засобом при вимірюванні протипухлинного ефекту.
Таблиця 12
Вимірювання протипухлинного ефекту на моделі з трансплантованими клітинами ЕМЗА трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації (3-7-4) Оцінка протипухлинного ефекту
Протипухлинний ефект оцінювали за об'ємом пухлини, розрахованим за формулою, описаною в (3-7-1).
Значення швидкості інгібування росту пухлини (ТОЇ: інгібування росту пухлини) розраховували за наступною формулою:
Та (95) - (1 - (середній об'єм пухлини в досліджуваній групі на момент вимірювання - середній об'єм пухлини в досліджуваній групі на момент початкового введення)/(середній об'єм пухлини в контрольній групі на момент вимірювання - середній об'єм пухлини в контрольній групі на момент початкового введення)) х 100.
У результаті показана ефективність лікарського засобу ТО1І-60 95 або більше в день 13 після введення для тМЗ-тЕа5б5 у дозах 0,1 мг/кг або більше та для 5УМ1208-тЕРа55 у дозах 1 мг/кг або більше (фіг. 10 та 11). (3-7-5) Введення лікарського засобу для оцінки кількості Тгед-клітин в пухлині та підтвердження наявності системного ефекту в селезінці
У день 7 після трансплантації вводили контрольне антитіло до СТІ А4 миші (тМ5-тЕа55) у хвостову вену при 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг і 100 мг/кг і вводили антитіло до СТІ А4 із перемиканням класу (5М/1208-тРа55) у хвостову вену при 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг і 500 мг/кг. У таблиці 13 показані детальні дані щодо лікування лікарським засобом для оцінки кількості Тгтед-клітин у пухлині та підтвердження наявності системних ефектів у селезінці.
Таблиця 13
Підтвердження наявності внутрішньопухлинних і системних ефектів у моделі з трансплантованими клітинами ЕМЗА (тМ5-тЕаз5 та 5М/1208-тЕаб5) трансплантації трансплантації 7-й день після трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації (3-7-6) Резекція пухлини та селезінки з моделі на мишах із трансплантованими клітинами
ЕМЗА
У день 6 після введення антитіла мишей піддавали евтаназії під анестезією, здійснювали резекцію пухлини та селезінки. Із зібраної шляхом резекції селезінки одержували суспензію клітин із застосуванням середовища КРМІ-1640 (ЗІСМА), що містить 10 95 ЕВ5 (5ІСМА), а потім піддавали гемолізу із застосуванням набору Моизе Егуїпгосуїе ІГузіпд (КО) для одержання клітин селезінки. Зібрані шляхом резекції пухлини подрібнювали із застосуванням набору Титог
Оівзосіайоп Кії птоизе (Мійепуї). Забезпечували реагування як клітин селезінки, так і подрібнених пухлин із наступними антитілами та аналізували фракції присутніх імунних клітин за допомогою ЕАС5-аналізу: антитіло до СО45 (ВО, клон 30-Е11), антитіло до СОЗ (ВО, клон 145-2С11), антитіло до СО4 (ВО, клон КМ4-5), антитіло до ГохРЗ (еВіозсіепсе, клон БОК-165)), антитіло до ІСО5 (еВіозсіепсе, клон 7Е1709), антитіло до КІ КО1 (Віоівеєдепа, клон 2Е1/КІ КСО).
ЕАСЗ-аналіз виконували за допомогою ВО І 5К Еопезза Х-20 (ВО). (3-7-7) Оцінка пухлинних Тгед-клітин у моделі з трансплантованими клітинами ЕМЗА
Оцінювали зміни в ефекторних Тгед-клітинах (СО4РохРЗ"КІ ВС1) у пухлині після введення контрольного антитіла до СТІ А4 миші (тМ5-тРа55) або антитіла до СТІ А4 із перемиканням класу (5ММ1208-тЕРа55). У результаті як тМ5-тЕаб55, так і БМУ1208-тРа55 викликали зниження співвідношення ефекторних Тгед-клітин до менше за 0,2 95 СО45-позитивних клітин при дозах 1 мг/кг та більше (фіг. 12). (3-7-8) Оцінка системних ефектів щодо селезінки на моделі з трансплантованими клітинами
ЕМЗА
Оцінювали зміни в активованих хелперних Т-клітинах (СО4"Рохр3!СбО5-) у селезінці після введення тМ5-тЕаб55 або 5УМ1208-тРаб55 за допомогою РГАСб-аналізу. У результаті співвідношення активованих хелперних Т-клітин і СО45-позитивних клітин у селезінці суттєво збільшувалося при введенні тМ5-тРа55, але не було суттєвого збільшення у співвідношенні активованих хелперних Т-клітин і СО45-позитивних клітин у селезінці, навіть при підвищенні введеної дози 5ММ1208-тРа55 (фіг. 13). Було підтверджено, що хоча антитіло з перемиканням класу показало таку саму ефективність, що і контрольне антитіло, воно не викликало відповіді в тканинах, відмінних від пухлини, і концепція прояву активності тільки локально в пухлині була доведена на миші іп мімо.
Приклад 4. Створення змінених антитіл до СТІ А4 та оцінка їх видів активності
Здійснювали додаткові змінення й оцінку антитіл до СТІ А4 із перемиканням класу, створених у прикладі 3. (4-1) Підсилення здатності зв'язування з СТІ А4 шляхом змінення в підсиленні зв'язування з
АТФ
За результатами структурного аналізу, здійсненого в прикладі 2-1, було показано, що СОК2 важкого ланцюга антитіла взаємодіє з фосфатною групою АМФ. Вважали, що коли мала молекула являла собою АТФ, у-фосфатна група могла спричинити стеричне утруднення для
СОК2 важкого ланцюга. Потім амінокислоти в цій ділянці замінювали для дослідження підсилення здатності зв'язування з АТФ. Зокрема, створювали 04Н1389-С1 т/041 1086-Іат1 та 04нН1382-С1т/041 1086-Іат1 шляхом уведення варіантів змінення К53О та О55Н у варіабельні ділянки важкого ланцюга 04Н1207-с1т/041І1086-Іат! та 04Н1208-С11п/041 1086-Іаті!, створених у прикладі 3. Крім того, створювали 04Н1389-С11п/041 1305-КОМТ шляхом заміни легкого ланцюга 04Н1389-С11п/041 1086-І(ат!1 послідовністю людського к-ланцюга. У таблиці 14 наведені 5ЕО ІЮ МО варіабельних ділянок важкого ланцюга, варіабельних ділянок легкого ланцюга, константних ділянок важкого ланцюга, константних ділянок легкого ланцюга та гіперваріабельних ділянок цих антитіл.
Таблиця 14
Амінокислотні послідовності важких ланцюгів, легких ланцюгів та їх гіперваріабельних ділянок (позначені за допомогою ЗЕО ІЮ МО)
Важкий | Легкий Важкий | Легкий ланцюг | ланцюг | ланцюг | ланцюг 04н1389-
Сстт/041 1086 136 97 в2 87 107 | 110 | 102 | 122 | 117 | 133 -Іат!
О4н1382-
Сстт/041 1086 135 97 в2 87 107 | 109 | 102 | 122 | 117 | 133 -Іат! 04н1389-
Сстт/041 1305 136 95 в2 107 | 110 | 102 | 122 | 117 | 133 -КОМТ
Віасоге 1200 використовували для оцінки зв'язування створених варіантів із АТФ та з людським СТІ А4. Аналіз зв'язування з АТФ здійснювали при 37 "С із застосуванням 20 мМ
АСЕЗ (рН 7,4), 150 мМ Масі, 2 мм Масі», 0,05 95 Ту"'ееп20 як електродного буфера. По-перше, білок А бийге (СЕ НеайПсагє) іммобілізували на сенсорному чипі СМЗ Зегієз 5 (СЕ Неаїсаге), і антитіла були захоплені чипом шляхом взаємодії з розчином антитіл, приготованим в електродному буфері. Потім оцінювали здатність зв'язування з антитілом шляхом взаємодії з розчином АТФ, одержаним в електродному буфері. Чипи регенерували за допомогою 25 ММ маон і 10 мм гліцин-НСЇІ (рн 1,5) та здійснювали аналіз шляхом повторного захоплення антитіл.
Для зв'язувальної кількості кожного антитіла з АТФ розраховували зв'язувальну кількість АТФ на одиницю кількості антитіла шляхом коригування кількості зв'язування при введенні АТФ у концентрації 100 нМ із кількістю антитіла, захопленого на поверхні чипа. Зв'язування з людським СТІ А4 вимірювали із застосуванням Віасоге Т200 способом, описаним у прикладі 3-3.
У таблиці 15 показані результати цих вимірювань.
Таблиця 15
Аналіз зв'язування з АТФ та з людським СТІ А4 зв'язуванні Зв'язування з СТІАЯ людини. Ко для СТІ АЯ людини (М)
АТФ МКМ |10 мкм 100 мкМ| АТФ |10 мкм /)|100 мкм
М.А.: занадто слабке для визначення значення КО "Значення КО було визначене з використанням рівноважної моделі. 04Н1389-С1п/041 1086-Іат!і та 04Н1382-С211п/041 1086-І(ат!і мали підсилену здатність до зв'язування з АТФ порівняно з вихідними антитілами 04Н1207-С1 п/041 1086-І(ат! та 04Н1208-
С1т/0411086-іІат!, в які не вводили К53О0/555Н. Здатність до зв'язування 04Н1389-
С1тп/0411086-іат!і та 04Н1382-С11п/0411086-іат!і із людським СТІГА4 підсилювалася в приблизно 10 разів у присутності 10 мкМ АТФ порівняно з вихідними антитілами 04Н1207-
С1т/041 1086-іат! та 04Н1208-С21 т/041 1086-Іат!, в які не вводили К530О/555Н. Порівняння зв'язувальних кількостей показало, що здатність зв'язуватися з людським СТІ А4 при більш низьких концентраціях АТФ підсилювалася. Також було показано, що 04Н1389-(231 тп/041 1305-
КОМТ, в якому легкий ланцюг 04Н1389-211п/041 1086-іІат!і замінювали на послідовність людського к-ланцюга, має еквівалентну здатність до зв'язування з АТФ та АТФ-залежну здатність до зв'язування з людським СТІ А4, як і в 04Н1389-(231 т/041 1086-Іаті1. (4-2) Створення контрольного антитіла до людського СТІ А4 та антитіла до СТІ А4 із перемиканням класу та оцінка їх здатності до зв'язування
Створювали контрольне антитіло до людського СТІ А4 (МОХ1О0О1Н-тЕРа55/МОХ10011 -ткК, абревіатура пМ5-тЕа55) та антитіло до СТІ А4 із перемиканням класу (04Н1389- тЕа55/04І 1305-тпК1, абревіатура 5МУ/1389-тЕРа55). В антитілі пМ5-тЕРаб55 використовували варіабельну ділянку важкого ланцюга МОХ1ТОО1Н (ЗЕО ІО МО: 26) і варіабельну ділянку легкого ланцюга МОХ1ТОО1І (5ЕО ІО МО: 27), а для константних ділянок використовували константну ділянку важкого ланцюга миші тЕРаб55 (5ЕО ІО МО: 18) і константну ділянку легкого ланцюга миші дикого типу тк! (5ЕО ІО МО: 19). У цьому випадку використовували константну ділянку важкого ланцюга миші, яка була змінена для підсилення зв'язування з рецептором Есу.
Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
В антитілі ЗУУ1389-тРа55 використовували варіабельну ділянку важкого ланцюга 04Н1389 (ЗЕО ІО МО: 29) і варіабельну ділянку легкого ланцюга 0411305 (5ЕО ІО МО: 30), а для константних ділянок використовували константну ділянку важкого ланцюга миші тЕРа55 (ЗЕО 10
МО: 18) і константну ділянку легкого ланцюга миші дикого типу тк! (ЗЕО ІО МО: 19). У цьому випадку використовували константну ділянку важкого ланцюга миші, яка була змінена для підсилення зв'язування з рецептором Есу. Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
Оцінювали зв'язування створених пПМ5-тЕабзо та 5У/1389-тРаб55 із людським СТІ А4. Як електродний буфер використовували 20 мМ АСЕЗ5 (рн 7,4), 150 мм Масі, 2 мм Мосі», 0,05 95
Тмееп 20 із додаванням АТФ до бажаної концентрації, та аналіз здійснювали при 37 "с.
Спочатку антитіло кролика до мишачого ЇдсС (Тегто Різпег бсіепійс) іммобілізували на сенсорних чипах СМ5 Зегіез 5 (СЕ Неайсаге), та антитіла були захоплені на чипі шляхом взаємодії розчину антитіл, приготованому в робочому буфері, що не містить АТФ. Потім здатність зв'язування антитіла з людським СТІ А4 у присутності або відсутності АТФ оцінювали шляхом взаємодії з розчином людського СТІ А4, приготованим в електродному буфері з АТФ, доданим до бажаної концентрації, або з розчином людського СТІ А4, приготованим в електродному буфері, що не містить АТФ. Чипи регенерували за допомогою 25 мМ Маон і 10
ММ гліцин-НСІ (рН 1,5) та здійснювали аналіз шляхом повторного захоплення антитіл.
Константу дисоціації кожного антитіла до СТІ А4 розраховували із застосуванням програмного забезпечення Віасоге 1200 ЕмаЇсайоп Боїймаге 2.0. Зокрема, константу швидкості зв'язування Ка (л/моль/с) і константу швидкості дисоціації Ка (1/с) розраховували шляхом глобальної підгонки сенсограм, одержаних у результаті вимірювання із застосуванням моделі зв'язування Ленгмюра 171, ії з цих значень розраховували константу дисоціації КО (моль/л). У таблиці 16 показані результати цього аналізу.
Таблиця 16
Аналіз зв'язування варіантів з константними ділянками миші з людським СТІ А4
Було підтверджено, що обидва антитіла, створені із застосуванням константних ділянок миші, зв'язуються з людським СТІ А4. Також було показано, що 5М/1389-тЕа55 зв'язується з людським СТІ А4 залежним від АТФ механізмом подібно 04Н1389-41п/041 1305-КОМТ, створеному із застосуванням тієї самої варіабельної ділянки та людської константної ділянки, показаних в таблиці 15. (4-3) Ефективність кожного з антитіла до СТІ А4 із перемиканням класу та антитіла до
СТІ А4 без перемикання класу в моделі з трансплантацією клітин сингенної пухлини із застосуванням миші з нокіном людського СТІ А4 і отрансееном людського СОЮЗ, збільшення/зменшення регуляторних Т-клітин (Ттед) у пухлині та зміна маркера системної відповіді в селезінці (4-3-1) Лінія клітин
Використовували клітини Нера1-6/поРСЗ. Цю лінію клітин одержували шляхом придбання в
АТСС клітин лінії клітин раку печінки миші Нера1-б6, забезпечення конститутивної експресії людського гена Сіурісап З (пОРСЗ, 5ЕБЕО ІЮО МО: 181) шляхом трансфекції та здійснення клонування. Клітини Нера1-6/лЛ6РСЗ підтримували і пересівали в середовищі О-МЕМ (із високим умістом глюкози) (ЗІСМА), що містить 10 95 ЕВ5 (5ІСМА) і 600 мкг/мл СЕМЕТІСІМ (сірсо). (4-3-2) Одержання моделі на миші з трансплантацією лінії клітин сингенної пухлини
Використовували мишей з КІ людського СТІ А4 і з заміщенням людським СОЗ ЕОС (СТІ А4
Зо КІ пиСбОЗ3 ЕбС-заміщених мишей), які являють собою гібрид миші з нокіном людського СТІ А4 (Віоса (2005) 106 (9): 3127-3133) та створеної у власній лабораторії миші з заміщенням людським СОЗ ЕО (5сі Кер (2017) 7: 45839). Клітини Нера1-6Є/ЛОРСЗ трансплантували під шкіру мишам із НСТІ А4 КІ та заміщенням НСОЗ ЕС, і вважалося, що модель створена, коли середній об'єм трансплантованих пухлин досягав від приблизно 200 мм3 до приблизно 400 мм3.
Об'єм трансплантованої пухлини розраховували за наступною формулою:
Об'єм пухлини - довгий діаметр х короткий діаметр х короткий діаметр/2. (4-3-3) Одержання лікарських засобів для введення
Як лікарські засоби для введення моделі з трансплантованими клітинами Нера1-6/паРСЗ, антитіло до СТІ А4 із перемиканням класу (5УМ1389-тЕРа55) та контрольне антитіло до людського СТІ А4 (пМ5-тЕа5б5), одержане в прикладі 4-2, одержували в концентраціях 0,01, 0,1, 1,5, 10 їі 20 мг/мл та 0,01, 01, 1 ї З мг/мл відповідно із застосуванням Ніз-буфера (150 мМ
Масі/20 мм Нів-НСІ буфер, рН 6,0). (4-3-4) Введення лікарського засобу для вимірювання протипухлинного ефекту
У день 7 після трансплантації вводили ЗМ/1389-тЕРа55 мишам при 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг і 100 мг/кг та вводили ПМ5-тЕа5бо5 при 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг ї 30 мг/кг, у хвостову вену. У таблиці 17 показані детальні дані щодо лікування лікарським засобом із вимірюванням протипухлинного ефекту.
Таблиця 17
Вимірювання протипухлинного ефекту в моделі з трансплантованими клітинами Нера1-6/лО РОЗ трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації (4-3-5) Оцінка протипухлинного ефекту
Протипухлинний ефект оцінювали за об'ємом пухлини, розрахованим за формулою, описаною в (4-3-2). Для статистичного аналізу використовували УМР 11.2.1 (5АБ5 ІпзШиїе Іпс.).
Значення ТО (інгібування росту пухлини) розраховували за наступною формулою:
Та - (1 - (середнє значення об'єму пухлини в досліджуваній групі на момент вимірювання -- середнє значення об'єму пухлини перед уведенням антитіла)/(середнє значення об'єму пухлини в контрольній групі на момент вимірювання - середнє значення об'єму пухлини перед уведенням антитіла)) х 100.
У результаті як ЯМ5-тЕа55, так і 5М/1389-тЕРа55 демонстрували ефективність лікарського засобу Т01-60 або більше в день 18 після введення в дозах 1 мг/кг або більше (фіг. 14 та 15). (4-3-6) Уведення лікарського засобу для оцінки Тгед-клітин у пухлині та підтвердження наявності системних ефектів у селезінці
У день 7 після трансплантації вводили 5МУ1389-тЕРа55 мишам при 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кгі 500 мг/кг у хвостову вену та вводили пПМ5-тЕа55 при 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кгі 30 мг/кг у хвостову вену. У таблиці 18 показані детальні дані щодо лікування лікарським засобом для оцінки кількості Тгед-клітин у пухлині та підтвердження наявності системних ефектів у селезінці.
Таблиця 18
Підтвердження наявності внутрішньопухлинних і системних ефектів у моделі з трансплантованими клітинами Нера1-6/Ла РОЗ (пПМ5-твРа5б»5 та 5МУ1389-тЕаб55)
Група Кількість Лікарський засіб Доза Шлях Дата введення тварин введення вена трансплантації вена трансплантації вена трансплантації вена трансплантації вена трансплантації вена трансплантації вена трансплантації вена трансплантації вена трансплантації вена трансплантації (4-3-7) Резекція пухлини та селезінки з мишачої моделі з трансплантованими клітинами
Нера1-6/ла РОЗ
У день 6 після введення антитіла мишей піддавали евтаназії під анестезією та здійснювали резекцію пухлин і селезінок. Із зібраних шляхом резекції селезінок одержували суспензію клітин із застосуванням середовища КРМІ-1640 (5БІСМА), що містить 10 95 ЕВ5 (5ІСМА), а потім піддавали гемолізу із застосуванням набору Моизе Егуїпгосуїе ІГузіпд (КО) для одержання клітин селезінки. Зібрані шляхом резекції пухлини подрібнювали із застосуванням набору Титог аівзосіайоп Кії, тоизе (МікКепуї). Забезпечували реагування як клітин селезінки, так і подрібнених пухлин із наступними антитілами та аналізували фракції присутніх імунних клітин за допомогою
ЕАС5-аналізу: антитіло до СО45 (ВО, клон 30-Е11), антитіло до СОЗ (ВО, клон ОСНТІ), антитіло до СО4 (ВО, клон КМ4-5), антитіло до ГохР3 (еВіозсіепсе, клон ЕУК-165), антитіло до ІСО5 (еВіозсіепсе, клон 7Е1709), антитіло до ССК7 (Віоієдепа, клон 4812), антитіло до КІ КО1 (Віоіїеєдепа, клон 2Е1/КІКСО1). ЕАС5-аналіз виконували за допомогою ВО ІЇ5К Ропевзза Хх-20 (ВО). (4-3-8) Оцінка пухлинних Тгед-клітин у моделі з трансплантованими клітинами Нера!1- б/лаРСЗ
Оцінювали зміни кількості ефекторних Тгед-клітин (СО4РохР3:ССВНом КІ ВО1) у пухлині після введення 5М/1389-тЕРаб55 або пМ5-тЕРа55. У результаті як тМ5-тЕа5б5, так і 5УМ1389- тЕаб55 викликали зниження співвідношення ефекторних Тгед-клітин до менше за 0,2 95 СО45- позитивних клітин при дозах 1 мг/кг або більше (фіг. 16). (4-3-9) Оцінка системного ефекту щодо селезінки в моделі з трансплантованими клітинами
Нера1-6/ла РОЗ
Оцінювали зміни в активованих хелперних Т-клітинах (СО4Рохр3"!СбО5) у селезінці після введення ПМ5-тЕРабо5 або 5М/1389-птРаб55 за допомогою РАСб-аналізу. У результаті співвідношення активованих хелперних Т-клітин і СО45-позитивних клітин у селезінці суттєво збільшувалося при введенні тМ5-тЕаб5, але не спостерігали суттєвого збільшення активованих хелперних Т-клітин у селезінці при введенні ЗМ/1389-тРЕа5»5, навіть при підвищенні введеної дози (фіг. 17). Було підтверджено, що хоча антитіло з перемиканням класу показало таку саму ефективність, що і контрольне антитіло, але воно не викликало відповіді в тканинах, відмінних від пухлинних. Отже, концепція прояву активності лише локально в пухлині була доведена іп мімо на мишах із КІ людського СТІ А4.
(4-4) Створення контрольного антитіла до СТІ А4 та антитіла до СТІ А4 із перемиканням класу для токсикологічного дослідження на яванській макаці
Створювали контрольне антитіло до СТІ А4 (МОХ1О01Н-Ки125/МОХ10011 -
КОМТ/И/МОХ1001Н-НІО76/МОХ1001І-КОМТ, абревіатура М5-АКТІ) та антитіло до СТІ А4 із перемиканням класу (04Н1389-Кп125/041 1305-КОМТ//04Н1389-НІО76/041 1305-КОМТ, абревіатура 5М/1389-АКТІ). В антитілі М5-АКТІ1 використовували варіабельну ділянку важкого ланцюга МОХ1ТОО1Н (5ЕО ІО МО: 26) і варіабельну ділянку легкого ланцюга МОХ1ТОО1ї. (5ЕО ІЮ
МО: 27), а для константних ділянок використовували константну ділянку важкого ланцюга людини Кп125 (5ЕО ІО МО: 31) і константну ділянку важкого ланцюга людини НІО7б6 (5ЕО ІО МО: 32), описану в попередньому патентному документі ММО 2013/002362, і константну ділянку легкого ланцюга людини КОМТ (5ЕО ІО МО: 33). У цьому випадку використовували константну ділянку важкого ланцюга людини, яка була змінена для підсилення зв'язування з рецептором
Есу. Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
В антитілі ЗУУ1Т389-АКТІ використовували варіабельну ділянку важкого ланцюга 04Н1389 (ЗЕО ІО МО: 29) і варіабельну ділянку легкого ланцюга 0411305 (5ЕО ІО МО: 30), а для константних ділянок використовували константну ділянку важкого ланцюга людини Кп125 (5ЕО
ІО МО: 31), і константну ділянку важкого ланцюга людини НІО76Є (5ЕО ІО МО: 32), та людську константну ділянку легкого ланцюга КОМТ (5ЕО ІО МО: 33). У цьому випадку використовували константну ділянку важкого ланцюга людини, яка була змінена для підсилення зв'язування з рецептором Есу. Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
Гетеродимеризовані антитіла (антитіла, що мають два різних поліпептиди важкого ланцюга та/або два різних поліпептиди легкого ланцюга) у даному документі названі відповідно до наступного правила: (перша варіабельна ділянка важкого ланцюга)-(перша константна ділянка важкого ланцюга)/перша варіабельна ділянка легкого ланцюга)-(перша константна ділянка легкого ланцюга)//друга варіабельна ділянка важкого ланцюга)-(друга константна ділянка важкого ланцюга)/(друга варіабельна ділянка легкого ланцюга)-(друга константна ділянка легкого ланцюга). Наприклад, якщо антитіло називається 04Н1389-Кп125/041 1305-
КОМТ/04Н1389-НІО76/041 1305-КОМТ, це означає, що в цьому антитілі перша варіабельна ділянка важкого ланцюга являє собою 04Н1389, перша константна ділянка важкого ланцюга являє собою Кп125, перша варіабельна ділянка легкого ланцюга являє собою 041 1305, перша константна ділянка легкого ланцюга являє собою КОМТ, друга варіабельна ділянка важкого ланцюга являє собою 04НІ1389, друга константна ділянка важкого ланцюга являє собою НІО7б, друга варіабельна ділянка легкого ланцюга являє собою 0411305, і друга константна ділянка легкого ланцюга являє собою КОМТ. (4-5) Токсикологічне дослідження на яванській макаці
Для оцінки й порівняння токсичності, включно із системною відповіддю, антитіло М5-АВТІ1 або антитіло 5ЗМУ1389-АКТІ1, одержане у прикладі 4-4, уводили самцям яванських макак (по З тварини на кожне антитіло) при 6бО мг/кг один раз на тиждень загалом 5 разів. Уведення здійснювали повільно внутрішньовенно із застосуванням шприцевого насоса і здійснювали спостереження за загальним станом, вимірювання маси тіла, аналіз крові/біохімічний аналіз крові, аналіз кісткового мозку, патологоанатомічне дослідження та вимірювання концентрації лікарського засобу в плазмі крові.
Появу антитіл до лікарського засобу спостерігали протягом періоду введення обох антитіл, але вплив зберігався до кінця періоду введення. Уведення антитіла М5-АКТІ призводило до змін, подібних системним аутоїмунним захворюванням, таких як поява аутоантитіл, запальні зміни (васкуліт, інфільтрація клітинами запалення), анемічні зміни та активація Т-клітин, у той час як зазначені вище зміни не спостерігалися при введенні антитіла 5М/1389-АКТ1. Ці результати показують, що антитіло 5М/1389-АКТІ характеризується зниженою токсичністю іп мімо.
Приклад 5. Створення змінених антитіл до СТІ А4 та оцінювання їх видів активності
Здійснювали додаткове змінення та оцінювання антитіл до СТІ А4 з перемиканням класу, створених у прикладі 4. (5-1) Оптимізація антитіл шляхом введення системних варіантів змінення та замін в каркаси
Варіанти змінення амінокислот системно вводили в СОК 04Н1389-211п/041 1086-Іат1і та досліджували варіанти змінення з кращими профілями. Проводили системне введення та оцінювання варіантів змінення амінокислот із застосуванням способу, описаного в прикладі 3-3.
Створювали варіанти, в які була введена комбінація варіантів змінення, розкритих в даному 60 документі, та були здійснені заміни в каркасах. У таблиці 19 наведені 5ЕО ІЮ МО варіабельних ділянок важкого ланцюга, варіабельних ділянок легкого ланцюга, константних ділянок важкого ланцюга, константних ділянок легкого ланцюга та гіперваріабельних ділянок цих антитіл. Легкі ланцюги 041 1594-Іаті, 041 1581-і(ат1, 041 1610-І(ат!1, 041 1612-Іаті їі 041 1610-І(ат! в таблиці 19 були одержані в результаті внесення варіантів змінення в СОК та каркаси порівняно з легким ланцюгом вихідного антитіла 041 1086-Іат! та містили каркаси і константну ділянку зародкових послідовностей людського ланцюга А. Крім того, 041 1615-КОМТ, 041 1616-КОМТ та 041 1617-КОМТ характеризуються наявністю варіантів змінення, введених в СОК 0411086-іат!1!, та містять каркаси і константну ділянку зародкових послідовностей людського ланцюга А. Варіабельна ділянка важкого ланцюга 04Н1389у373 є ділянкою, одержаною в результаті внесення варіантів змінення в СОК варіабельної ділянки важкого ланцюга 04НІ1389 вихідного антитіла. Варіабельні ділянки важкого ланцюга 04Н1637, 04Н1643, 04нН1654, 04Н1656, 04Н1642 і 04нН1735 характеризуються наявністю варіантів змінення, введених в СОК 04НІ1389, а також замін в каркасних послідовностях на послідовності іншої зародкової лінії.
Таблиця 19
Амінокислотні послідовності важких ланцюгів, легких ланцюгів та їх гіперваріабельних ділянок (позначено за допомогою 5ЕО ІЮО МО)
Назва антитіла Важкий Легкий | Важкий | Легкий ланцюг | ланцюг | ланцюг | ланцюг М 2 Но 2 з ланцюг | ланцюг | ланцюг | ланцюг 04н1389у373-
Сстт/041 1086- 137 97 в2 87 107 | 111 | 102 | 122 | 117 | 133
Іат! 04н1637-
Сстт/041 1086- 138 97 в2 87 107 | 111 | 102 | 122 | 117 | 133
Іат! 04н1637-
Стт/041 1594- 138 144 в2 87 107 | 111 | 102 | 124 | 125 | 133
Іат! 04н1637-
Стт/041 1581- 138 145 в2 87 107 | 111 | 102 | 126 | 127 | 133
Іаті 04н1637-
Ссттт/0411610- 138 146 в2 87 107 | 111 | 102 | 128 | 117 | 133
Іат!1 04н1643-
Ссттт/0411610- 139 146 в2 87 107 | 111 | 102 | 128 | 117 | 133
Іат! 04н1654-
Ссттт/0411610- 140 146 в2 87 107 | 112 | 102 | 128 | 117 | 133
Іат! 04н1656-
Ссттт/0411610- 141 146 в2 87 107 | 111 | 152 | 128 | 117 | 133
Іат! 04н1654-
Сстт/041 1612- 140 147 в2 87 107 | 112 | 102 | 129 | 117 | 133
Іат! 04н1656-
Сстт/041 1612- 141 147 в2 87 107 | 111 | 152 | 129 | 117 | 133
Іат! 04н1654-
Сстт/041 1606- 140 148 в2 87 107 | 112 | 102 | 124 | 117 | 133
Іаті 04н1656-
Сстт/041 1606- 141 148 в2 87 107 | 111 | 152 | 124 | 117 | 133
Іат!
Таблиця 19
Амінокислотні послідовності важких ланцюгів, легких ланцюгів та їх гіперваріабельних ділянок (позначено за допомогою ЗЕО ІЮ МО)
Назва антитіла важ Легкий | Важкий | Легкий ланцюг | ланцюг | ланцюг | ланцюг М 2 Но 2 з ланцюг | ланцюг | ланцюг | ланцюг домені ||» |в реж юю т т
Сстт/041 1615- 136 149 в2 107 | 110 | 102 | 130 ) 117 | 133 кОм
Активність зв'язування створених варіантів з людським СТІ А4 оцінювали способом, описаним в прикладі 3-3 (таблиця 20).
Таблиця 20
Аналіз зв'язування з людським СТІ А4
Значення КО у таблиці, позначені ", розраховували із використанням рівноважної моделі.
Було показано, що всі варіанти, одержані з використанням 04Н1389-21 т/041 1086-Іат!і як вихідного антитіла, зв'язуються з людським СТІ А4 АТФ-залежним чином і характеризуються здатністю зв'язування, що є сильнішою, ніж така вихідного антитіла з КО 3,7 х 108 М за умови, що АТФ присутній за концентрації 10 мкМ. Також було показано, що всі ці антитіла характеризуються здатністю зв'язування, що є сильнішою, ніж у існуючого антитіла до людського СТГ А4, МОХ1О001Н-сС1тт/МОХ1001І-КОМТ, за умови, що АТФ присутній за концентрації 10 мкм.
За допомогою Віасоге Т200 оцінювали здатність зв'язування створених варіантів з людським
СТІ А4 у присутності АДФ або АМФ та порівнювали її зі здатністю зв'язування в присутності
АТФ. Здатність зв'язування з людським СТІ А4 в присутності АДФ або АМФ вимірювали із застосуванням способу, описаного в прикладі 3-3, як і за оцінювання здатності зв'язування в присутності АТФ, але із застосуванням АДФ або АМФ замість АТФ (таблиця 21).
Таблиця 21
Оцінка залежності від АТФ, АДФ та АМФ
Кінетичні параметри для СТІ А4 людини . АТФ - 10 мкм АОР - 10 мкм АМР - 10 мкм
Назва антитіла ка ка ка -1 -1 -1 иа Ткатоо кому деко косму дека ко му
МОоХтоО1н-
Для існуючого антитіла до людського СТІ А4, МОХ1001Н-С1т/МОХ1001І-КОМТ, біли показані подібні кінетичні параметри незалежно від типу малих молекул і їх присутності, тоді як всі АТФ-залежні антитіла до СТІ А4 зв'язувалися з людським СТІ А4 не тільки в присутності
АТФ, але також в присутності АДФ або АМФ, та здатність зв'язування в присутності цих малих молекул була вищою, ніж здатність зв'язування за відсутності малих молекул, показаних в таблиці 20. Отже, було показано, що ці антитіла є антитілами, які зв'язуються з СТІ А4 АТФ-,
АДФ- і АМФ-залежним чином. Ці антитіла характеризувалися найвищою здатністю зв'язування в присутності АТФ, з наступною найвищою здатністю зв'язування в присутності АДФ та найнижчою здатністю зв'язування в присутності АМФ. У всіх випадках здатність зв'язування в присутності АДФ була приблизно в З рази сильнішою, ніж здатність зв'язування в присутності
АМФ, а здатність зв'язування в присутності АТФ була приблизно в 5 разів сильнішою, ніж здатність зв'язування в присутності АМФ. Значення Ка було подібним в присутності будь-якої з малих молекул, але була різниця у значенні Ка. Оскільки дисоціація в присутності АДФ відбувалася швидше, ніж в присутності АТФ, і додатково дисоціація в присутності АМФ відбувалася швидше, ніж в присутності АДФ, було показано, що різниця в значенні КО залежно від типу малої молекули обумовлювалася різницею швидкості дисоціації.
Далі оцінювали здатність зв'язування деяких варіантів з СТІ А4 миші та СТІ А4 яванської макаки. Оцінювали активність зв'язування з людським СТІ А4, СТІ А4 миші та СТІ А4 яванської макаки із застосуванням Віасоге Т200 способом, описаним в прикладі 3-3 (таблиця 22). СТІ А4 яванської макаки одержували наступним способом.
Синтезували ген СуСТІ А4-Ніз-ВАР (ЗЕО ІЮО МО: 50), який являє собою продукт злиття Нів- мітки та ВАР-мітки на С-кінці позаклітинної ділянки СТІ А4 яванської макаки, та вставляли в плазміду експресії тварини. Одержану плазміду вводили способом ліпофекції у лінію Егеесіуе 293-Е (Іпийгодеп), одержану з клітин нирки ембріону людини, яку висівали в колбу після суспендування в середовищі ЕгеезіуЇе 293 (Іпийгодеп) за щільності клітин 1,33 х 109 клітин/мл.
Через три години після трансфекції плазмідою додавали біотин до кінцевої концентрації 100
МКМ, клітини культивували в інкубаторі з СО» (37 "С, 895 СО», 125 об./хв.) протягом 4 діб та очищали антиген способом, відомим спеціалістам у даній галузі, з надосадової рідини культури кожного зразка. Поглинання розчинів очищеного антигена за 280 нм вимірювали із застосуванням спектрофотометра. З одержаних виміряних значень розраховували концентрацію очищеного антигена із застосуванням коефіцієнта екстинкції, розрахованого методом РАСЕ (Ргоїевіп 5сіепсе (1995) 4, 2411-2423).
Таблиця 22
Аналіз зв'язування з СТІ А4 людини, миші та яванської макаки 0 ІКодля СТІ А4 людини (М) |Ко для СТІ А4 миші (М) Ко для СТГ А4 мавпи (М)
Назваантитла АТФ! АТФ |АТФ- АТФ АТФ У АТФ АТФ я
МКМ /|10 мкМ )|100 мкм) 1 мкМ /|10 мкм МКМ 110 мкм
МКМ МКМ
МмОохХтор1н- стт/МОХ10011 - 4,7Е-08 | 5,3Е-08 | 5,4Е-08| МТ. М.Т. М.Т. 11,6Е-07|1,2Е-0711,2Е-07 кОм
Очна. 7,2Е-08 | 1,АЕ-08 | 4,6Е-09 |21Е-07І3,2Е-0811,2Е-0811,4Е-07|2,6Е-0811,2Е-08
Сс1тт/041 1305-КОМТ | " ' ' ' ' ' ' ' ' 04н1654-
Стіт/0411610-Іаті 1,1Е2-07 | 1,5Е-08 | 4,4Е-09 |1,8Е-0712,7Е-0811,0Е-08|1,8Е-07 |2,8Е-0818,1Е-09 04н1656-
Стіт/0411610-Іаті 7,9Е-08 | 1,6Е-08 | 6,2Е-09 І2,3Е-0713,7 Е-0811,4Е-0811,2Е-0712,6Е-0811 0-08 04н1654-
Стіт/0411612-Іаті 1,7Е-07 | З3,0Е-08 | 1,1Е-08 ІЗ,9Е-0714, 8Е-0811,8Е-0813,1 Е-07 |І5,4Е-0812,1Е-08 04н1656-
Стіт/0411612-Іаті 9,5Е-08 | 2,5Е-08 | 7,8Е-09 ІЗ,2Е-0715,4Е-0812,1Е-0811,6Е-0714,1Е-0811,6Е-08 04н1389-
Сіт/0411615-КОМТ 5,8Е-08 | 1,2Е-08 | 5,0Е-09 /1,6Е-0712,6Е-0811,0Е-0811,1Е-0712,1Е-0819,3Е-09
М.Т.: не тестували
Було показано, що усі з шести оцінюваних залежних від малої молекули антитіл до СТІ А4 зв'язувалися не тільки з людським СТІ А4, але також з СТІ А4 миші та з СТІ А4 яванської макаки
АТФ-залежним чином. (5-2) Створення змінених антитіл до СТІ А4 з перемиканням класу та антитіла негативного контролю
Створювали змінені антитіла до СТІА4 з перемиканням класу (04Н1654- тЕаббта Р1/041 1610-ті0/04Н1656-тЕРаббт2М1/041 1610-тіОг, абревіатура 5УУ1610-тРаб55; 04НІ1654-тРабота Р1/041 1612-ті0//04Н1656-тЕРаббта2М1/041 1612-тіОг, абревіатура ЗУУ1612- тЕа55; та 04Н1389-тРа5б5/041 1615-тК1, абревіатура 5М/1615-тРа55) та антитіло негативного контролю (ІС17Нак-тЕабБ/ІС171 -тпК1, абревіатура КІ Н-тРаб55).
В антитілі ХУМ1615-тРа55 використовували варіабельну ділянку важкого ланцюга 04Н1389 (ЗЕО ІО МО: 29) і варіабельну ділянку легкого ланцюга 0411615 (5ЕО ІО МО: 34), а для константних ділянок використовували константну ділянку важкого ланцюга миші тЕРа55 (ЗЕО 10
МО: 18) і константну ділянку легкого ланцюга миші дикого типу тк! (5ЕО ІЮ МО: 19). У цьому випадку використовували константну ділянку важкого ланцюга миші, яка була змінена для підсилення зв'язування з рецептором Есу. Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
В антитілі БМУ1610-тЕа55 як константні ділянки одна варіабельна ділянка важкого ланцюга 04Н1654 (5ЕБО І МО: 35) була приєднана до константної ділянки важкого ланцюга миші тЕаб55та РІ (ЗЕО ІО МО: 36), інша варіабельна ділянка важкого ланцюга 04Н1656 (5ЕО ІО МО: 37) була приєднана до константної ділянки важкого ланцюга миші тРабота2М1 (5ЕО ІЮО МО: 38), а як варіабельну ділянку легкого ланцюга 041 1610 (5ЕО ІО МО: 39) використовували константну ділянку легкого ланцюга миші дикого типу тіОг (5ЕО ІЮО МО: 22). Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
В антитілі БМУ1612-тРа55 як константні ділянки одна варіабельна ділянка важкого ланцюга 04Н1654 (5ЕБО І МО: 35) була приєднана до константної ділянки важкого ланцюга миші тЕаб55та РІ (ЗЕО ІО МО: 36), інша варіабельна ділянка важкого ланцюга 04Н1656 (ЗЕО ІЮ МО: 37) була приєднана до константної ділянки важкого ланцюга миші тРабота2М1 (5ЕО ІЮО МО: 38), а як варіабельну ділянку легкого ланцюга 041 1612 (ЗЕО ІО МО: 40) використовували константну ділянку легкого ланцюга миші дикого типу тіОг (ЗЕО ІО МО: 22). Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
В антитілі негативного контролю як константні ділянки варіабельна ділянка важкого ланцюга
ІСтТ7Нак (5ЕО ІО МО: 51) була приєднана до константної ділянки важкого ланцюга миші тРа55 (ЗЕО ІО МО: 18), а як варіабельну ділянку легкого ланцюга ІС17! (ЗЕБЕО ІО МО: 52) використовували константну ділянку легкого ланцюга миші дикого типу тк! (5ЕО ІО МО: 19).
Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі. (5-3) Оцінювання здатності зв'язування антитіл, що містять константну ділянку миші, з людським СТІ А4
Здатність антитіл до СТІ А4, що містять константну ділянку миші, зв'язуватися з антигеном оцінювали способом, описаним в прикладі 4-2 (таблиця 23). Було показано, що усі з цих антитіл, що містять константну ділянку миші, характеризуються такою самою АТФ-залежною здатністю зв'язування з людським СТІ А4, що і антитіла, показані в таблиці 22, які містять таку саму варіабельну ділянку, але містять людську константну ділянку.
Аналіз зв'язування варіантів з константними ділянками миші з людським СТІ А4
Таблиця 23
Аналіз зв'язування варіантів з константними ділянками миші з людським СТІ А4 11111111 КодляСТіАйлюдиниМ)ЇдГ/:// (5-4) Ефективність антитіл до СТІ А4 з перемиканням класу в моделі з трансплантацією клітин сингенної пухлини із застосуванням миші, трансгенної за СОЗ людини, з нокіном людського СТІ А4, збільшення/зменшення кількості регуляторних Т-клітин (Тгед-клітин) в пухлині та зміна маркера системної реакції в селезінці (5-4-1) Лінія клітин
Використовували клітини Нера1-6/поРСЗ. Цю лінію клітин одержували шляхом придбання в
АТСС клітин лінії клітин раку печінки миші Нера1-б6, забезпечення конститутивної експресії людського гена Сіурісап З (пОРСЗ) за допомогою трансфекції та здійснення клонування.
Клітини Нера1-6/ЛСРСЗ підтримували та пересівали в середовищі О-МЕМ (з високим вмістом глюкози) (5ІСМА), що містило 10 95 ЕВ5 (Зідта) та 0,6 мг/мл 5418 (Масаїаї Тездие). (5-4-2) Створення моделі на миші з трансплантацією лінії клітин сингенної пухлини
Використовували мишей з КІ людського СТІ А4 і з заміщенням людським СОЗ ЕОС (СТІ А4
Зо КІ пиСбОЗ3 ЕбС-заміщених мишей), які являють собою гібрид миші з нокіном людського СТІ А4 (Віоса (2005) 106 (9): 3127-3133) та створеної у власній лабораторії миші з заміщенням людським СОЗ ЕО (5сі Кер (2017) 7: 45839). Клітини Нера1-6Є/ЛОРСЗ трансплантували під шкіру мишам з СТІ АА4 КІ та заміщенням НСОЗ ЕС, і вважалося, що модель створена, коли середній об'єм трансплантованих пухлин досягав від приблизно 200 мм3 до приблизно 400 мм3.
Об'єм трансплантованої пухлини розраховували за наступною формулою:
Об'єм пухлини - розмір за довгою віссю х розмір за короткою віссю х розмір за короткою віссю/2. (5-4-3) Одержання лікарських засобів для введення
Лікарськими засобами, які призначалися для введення в модель з трансплантованими клітинами Нера1-6/ЛОРСЗ, були антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу (5М/1610-тРЕаб55,
ЗМ/1612-тЕРаб5, 5М/1615-тЕа55), одержані в прикладі 5-2. Лікарські засоби для введення одержували із застосуванням Ніз-буфера (20 мМ Нів-НСІ, 150 мМ Масі, рН 6,0) із забезпеченням концентрації 0,03 мг/мл, 0,1 мг/мл і 0,3 мг/мл. (5-4-4) Введення лікарського засобу для вимірювання протипухлинного ефекту
В день 8 після трансплантації три зразки антитіл до СТІ А4 з перемиканням класу вводили мишам за концентрації 0,3 мг/кг, 1 мг/кг і З мг/кг відповідно в хвостову вену. В таблиці 24 показані детальні дані щодо лікування лікарським засобом з вимірюванням протипухлинного ефекту.
Таблиця 24
Вимірювання протипухлинного ефекту в моделі з трансплантованими клітинами Нера1-6/пОоРСЗ (антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу) трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації (5-4-5) Оцінювання протипухлинного ефекту
Протипухлинний ефект оцінювали за об'ємом пухлини, розрахованим за формулою, описаною в (5-4-2).
Значення швидкості інгібування росту пухлини (ТОЇ: інгібування росту пухлини) розраховували за наступною формулою:
ТІ (95) - (1 - (середнє значення об'єму пухлини в досліджуваній групі на момент вимірювання -- середнє значення об'єму пухлини в досліджуваній групі на момент початкового введення)/(середнє значення об'єму пухлини в контрольній групі на момент вимірювання -- середнє значення об'єму пухлини в контрольній групі на момент початкового введення)) х 100.
В результаті для ЗМУ1610-тЕРа55 та 5М/1612-тРа55 була показана ефективність лікарського засобу з ТО1І-60 95 або більше в день 16 після введення у дозах 1 мг/кг або більше, та для
ЗМ/1615-тРаб5 - у дозах З мг/кг або більше (фіг. 18-20). (5-4-6) Введення лікарського засобу для оцінки кількості Тгед-клітин в пухлині та підтвердження наявності системного ефекту у селезінці
В день 10 після трансплантації 5МУ1610-тРа55 вводили у дозі 50 мг/кг, 100 мг/кг і 200 мг/кг,
ЗМ/1612-тРа55 вводили у дозі 50 мг/кг, 100 мг/кг і 200 мг/кг та БМУ1615-тРа55 вводили у дозі 50 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг ії 400 мг/кг мишам в хвостову вену. Крім того, для контрольної групи антитіло негативного контролю ІС17Нак-тЕабб/ІСт1 71 -тК1 (абревіатура КІ Н-тРа55) вводили у дозі 400 мг/кг в хвостову вену. В таблиці 25 показані детальні дані щодо лікування лікарським засобом для оцінювання кількості Тгед-клітин в пухлині та підтвердження наявності системних ефектів у селезінці.
Таблиця 25
Підтвердження наявності внутрішньопухлинних та системних ефектів в моделі з трансплантованими клітинами Нера1-6/пОоРСЗ (антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу) трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації трансплантації (5-4-7) Резекція пухлин та селезінок з моделі на мишах з трансплантованими клітинами
Нера1-6/ла РОЗ
В день 6 після введення антитіла мишей піддавали евтаназії під анестезією, здійснювали резекцію пухлин та селезінок. Із зібраних шляхом резекції селезінок одержували суспензію клітин із застосуванням середовища КРМІ-1640 (5ІСМА), що містить 10 95 ЕВ5 (5ІСМА), а потім піддавали гемолізу із застосуванням набору Моизе Егуїпгосуїе ІГузіпд (КО) для одержання клітин селезінки. Зібрані шляхом резекції пухлини подрібнювали із застосуванням набору Титог аівзосіайоп Кії, тоизе (Мінепуї). Забезпечували реагування як клітин селезінки, так і подрібнених пухлин із наступними антитілами та аналізували фракції присутніх імунних клітин за допомогою
ЕАС5-аналізу: антитіло до СО45 (ВО, клон 30-Е11), антитіло до СОЗ (ВО, клон ОСНТІ), антитіло до СО4 (ВО, клон КМа4-5), антитіло до ГохР3 (еВіозсіепсе, клон БУК-165), антитіло до ІСО5 (еВіозсіепсе, клон 7Е1709), антитіло до ССК7 (Віоієдепа, клон 4812), антитіло до КІ КО1 (Віоіїеєдепа, клон 2Е1/КІКСО1). ЕАС5-аналіз виконували за допомогою ВО ІЇ5К Ропезза Х-20 (ВО). (5-4-8) Оцінювання пухлинних Тгед-клітин на моделі з трансплантованими клітинами Нера1- б/лаРСЗ
Оцінювали зміни кількості ефекторних Тгед-клітинах (СО4-РохР3- СС КІ ВС1) в пухлинах після введення антитіл до СТІ А4 з перемиканням класу. В результаті 5М/1610-тЕаб55,
ЗМ1612-тРаб55 та 5М/1615-птРа55 забезпечували зниження співвідношення ефекторних Тгед- клітин до менше ніж 0,2 У5 СО045-позитивних клітин за усіх введених доз (фіг. 21). (5-4-9у Оцінювання системного ефекту щодо селезінки на моделі з трансплантованими клітинами Нера1-6/ЛОРСЗ
Оцінювали зміни в активованих хелперних Т-клітинах (СО4Рохр3!СО5") в селезінці після введення антитіл до СТІ А4 з перемиканням класу за допомогою БАС5-аналізу. В результаті співвідношення активованих хелперних Т-клітин і СО45-позитивних клітин в селезінці не було значно збільшено при оцінюваних дозах 50 мг/кг для ЗММ1610-тЕа55 та 5М/1612-тЕРа55 та при оцінюваних дозах 200 мг/кг або менше для 5УМ1615-тРа55. Проводили тест Даннета на групі, якій вводили КІ Н-тЕа5б5, із застосуванням ОМР 11.2.1 (5АБ Іпвійше Іпс.) для тестування значущості (фіг. 22). Було підтверджено, що хоча усі антитіла з перемиканням класу демонстрували ефективність, вони не викликали відповіді в тканинах, відмінних від пухлини, і що вони мали властивість проявляти активність тільки локально в пухлині.
Приклад 6. Створення Ес-варіанта, здатного посилювати АОСС-/АОСрР-активність
Для створення антитіл з посиленими АЮСС і АОСР, які є цитотоксичними ефекторними функціональними одиницями, досліджували одержання варіантів Ес-ділянки з посиленою здатністю зв'язування з Есук ЕсукПШа і ЕсукКПІа, що активують. (6-1) Створювання та оцінювання варіантів з посиленим зв'язуванням з Есук
Створювали гетеродимеризоване антитіло 04Н1637-Кп125/041 1610-Іат1//04Н1637-
НІО76/041 1610-і(ат!і, яке містило константні ділянки важкого ланцюга Кп125 та НІО76 з посиленою здатністю зв'язування з ЕсукК, що описано в УМО 2013/002362, та містило 04Н1637 як варіабельну ділянку важкого ланцюга та 041 1610-і(ат! як легкий ланцюг. Зокрема, створювали ген для важкого ланцюга антитіла 04Н1637-Кп125 (ЗЕО ІО МО: 162), який передбачав 04Н1637 (ЗЕО ОО МО: 138) як одну варіабельну ділянку важкого ланцюга та містив
І 2347/ 2350/5236УМ/5239М/Н2680/0270Е/5298А, введену в ста (5ЕБО ІЮ МО: 158) з видаленням Оу та Гуз на С-кінці константної ділянки важкого ланцюга людського Ідс1, а також містив у ділянці СНЗ варіанти змінення У349С/1366МУ, які забезпечують гетеродимеризацію.
Подібним чином, створювали ген для важкого ланцюга антитіла 04Н1637-НІО76 (5ЕО ІЮ МО: 163), який передбачав 04Н1637 (ЗЕО ІО МО: 138) як іншу варіабельну ділянка важкого ланцюга та містив 027О0Е/К3260/АЗЗОМ/КЗЗ4Е, введені в константну ділянку важкого ланцюга людського
І61 Та (5БО 10 МО: 158), а також містив у ділянці СНЗ варіанти змінення рз56с/13665/ 368А/У407М, які забезпечують гетеродимеризацію. Із застосуванням 041 1610-
Іат! (5ЕБЕО ІО МО: 161) як легкого ланцюга антитіла створювали гетеродимер 04Н1637-
Ки125/041 1610-Іат31//04Н1637-НІО76/041 1610-і(ат1 способом, відомим фахівцям в даній галузі.
Створювали гени для важких ланцюгів антитіла 04Н1637-Кп462 (5ЕО ІО МО: 164), 04Н1637-
НІЯ4АТ (5ЕО І МО: 165), 04Н1637-НІ445 (5ЕО ІЮО МО: 166), 04Н1637-Кп461 (5ЕО ІЮО МО: 167) та 04НІТ637-НІ443 (5ЕО ІО МО: 168), які крім 2350, 5236, 5239М, Н2680, 0270Е, 5298А, К3260 і
КЗ34Е містили варіанти змінення, введені в ділянку СН2, 1234Е та АЗЗОК, описані в. М/о 2013/002362, як варіанти змінення, що забезпечують зміну зв'язування з Есук; (з236А, 1І332Е і
І3320, описані в Мої. Сапсег ТПег., 2008, 7, 2517-2527 та УМО 2004/029207; та Т250М і Т307Р, описані в М/О 2013/118858, як варіанти змінення, що забезпечують поліпшення стабільності, в комбінації. Крім того, створювали ген для важкого ланцюга антитіла 04Н1654-КТ462 (5ЕО Ір
МО: 182), який передбачав видалення Су і Гуз на С-кінці людського ЇдС1 (І5НО1703), містив такі самі змінення, що і Кп462 в ділянці СН2, містив змінення ЕЗ56К, що забезпечує гетеродимеризацію, як описано в УМО 2006/106905, в ділянці СНЗ, та передбачав 04Н1654 (5ЕО
ІО МО: 140) як варіабельну ділянку важкого ланцюга. Подібним чином, створювали ген для важкого ланцюга антитіла 04Н1656-НТ441 (5ЕО ІО МО: 170), який передбачав видалення су і
Гуз на С-кінці людського Їде1 (ІНО1703), містив такі самі змінення, що і НІ441 в ділянці СН2, містив змінення К439Е, що забезпечує гетеродимеризацію, як описано в УМО 2006/106905, в ділянці СНЗ, та передбачав 04Н1656 (ЗЕО ІО МО: 141) як варіабельну ділянку важкого ланцюга.
Подібним чином, створювали гени 04Н1656-НТ445 (5ЕО І МО: 171), 04Н1654-КТ461 (5ЕО ІЮ
МО: 183) та 04Н1656-НТ443 (5ЕО ІЮО МО: 173). Крім того, досліджували комбінацію варіантів змінення для поліпшення в крові кінетичних показників антитіл, описаних у Маб», 2017, 9, 844- 853. Зокрема, створювали ген для 04Н1654-КТ473 (5БО ІЮО МО: 184), який містив
М434А/у4361/9438К/5440Е, введені в ділянку СНЗ3 04Н1654-КТ462 (5БО ІО МО: 182), що являють собою комбінацію варіантів змінення, які забезпечують посилення зв'язування з людським ЕсКп в кислих умовах, та варіантів змінення, які забезпечують зниження рівня зв'язування з ревматоїдним фактором. Подібним чином, створювали ген для 04Н1656-НТ482 (ЗЕО ІО МО: 185), який містив МА4З4А//4361/9438К/5440Е, введені в ділянку 04Н1656-НТ445 (ЗЕО ІО МО: 171). Подібним чином, створювали важкий ланцюг антитіла 04Н1654-КТ481 (5ЕО
ІО МО: 186) та важкий ланцюг антитіла 04Н1656-НТ498 (5ЕО ІЮО МО: 187) шляхом введення таких самих варіантів змінення в 04Н1654-КТ461 та 04Н1656-НТ443 відповідно. Шляхом об'єднання цих важких ланцюгів та із застосуванням 041 1610-І(ат! або 041 1612-і(аті (5ЕО ІО
МО: 188) як легкого ланцюга створювали необхідні гетеродимеризовані антитіла.
Позаклітинні домени ЕсукК одержували наступним способом. Спочатку синтезували гени позаклітинних доменів ЕсуК способом, відомим фахівцям у даній галузі У цей самий час одержували послідовність кожного ЕсуК на основі інформації, зареєстрованої в МОВІ. Зокрема,
ЕсуУкКІ одержували на основі послідовності з Мо доступу в МСВІ нм 000566.3, ЕсукПа одержували на основі послідовності з Мо доступу в МСВІ нМ 001136219.1, ЕсукПБ одержували на основі послідовності з Мо доступу в МСВІ нМ 004001.3 і ЕсукКІШа одержували на основі 60 послідовності з Мо доступу в МСВІ нМ 001127593.1 та додавали Нів-мітку на С-кінець.
Поліморфний сайт ЕсуКПа одержували з посиланням на У. Ехр. Мей., 1990, 172, 19-25, а поліморфний сайт ЕсукШа одержували з посиланням на .). Сііп. Іпмеві., 1997, 100, 1059-1070.
Вектори експресії одержували шляхом вставки одержаних фрагментів генів у вектори експресії клітин тварин. Одержані вектори експресії тимчасово вводили в клітини Егеебіуе293 (Іпи«йгодеп), одержані з ракових клітин нирки ембріону людини, для експресії білків. Після того, як надосадові рідини культури були зібрані, їх пропускали крізь фільтр з розміром пор 0,22 мкм і очищали загалом в ході наступних чотирьох стадій. Перша стадія являла собою катіонообмінну колонкову хроматографію (ЗР берпагозе ЕЕ), друга стадія являла собою афінну колонкову хроматографію для Нів-мітки (Ніз Тгар НР), третя стадія являла собою колонкову хроматографію з гель-фільтрацією (Зирегдех200), а четверта стадія являла собою асептичну фільтрацію.
Однак, для ЕсукК!І на першій стадії виконували аніонообмінну колонкову хроматографію із застосуванням О-сефарози ЕЕ. Концентрацію очищеного білка розраховували, вимірюючи поглинання за 280 нм із застосуванням спектрофотометра та із застосуванням коефіцієнта екстинкції, розрахованого з одержаного значення за допомогою такого способу, як РАСЕ (Ргоївїп 5сіепсе, 1995, 4, 2411-2423). Людський ЕсКп одержували способом, описаним у УУО 2010/107110.
Взаємодію між створеними антитілами та людськими ЕсукК аналізували наступним способом із застосуванням Віасоге 1200. 50 мМ фосфату Ма, 150 мМ Масі, 0,05 95 ПГувепго (рн 7,4) використовували як єлектродний буфер та аналіз виконували за температури 256. Як сенсорні чипи використовували чипи 5А 5егпез 5 (СЕ Неайсаге), на яких було іммобілізовано
Саріигезеїесі Нитап ГРаб-іатбраа Кіпеїйісз Віоїїп Сопідасе (Тнегто РізНег Зсіепійіс). Здійснювали захоплення антитіл, що становлять інтерес, на цих чипах і забезпечували взаємодію з ними кожного Есук, розбавленого електродним буфером. Чипи регенерували за допомогою 10 мМ гліцин-НСЇІ (рН 1,5) і 25 мМ Маон та проводили аналіз шляхом повторного захоплення антитіл.
Константи дисоціації КО (моль/л) для ЕсукК кожного антитіла розраховували із застосуванням
Віасоге Т200 Емаїцайоп ЗоПймаге 2.0, використовуючи модель зв'язування Ленгмюра 1:1 для
ЕсуКіа та ЕсукКІШа та рівноважну модель афінності для ЕсукКІПа. Для ЕсукКІІр зв'язувальну кількість ЕсукКІИБ она одиницю кількості антитіла розраховували шляхом коригування зв'язувальної кількості ЕсуКІІЬ, одержаної із сенсограми, одержаної шляхом вимірювання, за кількістю антитіл, захоплених на поверхні чипа.
Взаємодію між створеними антитілами та людськими ЕсКп аналізували наступним способом із застосуванням Віасоге 1200. 50 мМ фосфату Ма, 150 мМ Масі, 0,05 95 ПГувеп2го (рн 6,0) використовували як єлектродний буфер та аналіз виконували за температури 256. Як сенсорні чипи використовували чипи 5А 5егієз 5 (СЕ Неаїйсаге), на яких було іммобілізовано
Сарішгезеївесі Нитап Рар-Іатбраа Кіпеїїсз Віоїїп Сопішдаїе (Тнепто Різнег Зсіепійіс). Здійснювали захоплення антитіл, що становлять інтерес, на цих чипах і забезпечували взаємодію з ними
ЕсКп, розбавленого електродним буфером. Чипи регенерували за допомогою 10 мМ гліцин-НСЇ (рН 1,5) і 25 мМ Маон та проводили аналіз шляхом повторного захоплення антитіл. Константу дисоціації для ЕсКп кожного антитіла розраховували із використанням рівноважної моделі, використовуючи Віасоге 1200 ЕмаІнайоп 5оїтмаге 2.0.
В таблиці 26 показані результати цих вимірювань.
Таблиця 26
Аналіз зв'язування варіантів Ес-ділянки з людськими ЕсукК та ЕсКп
Від-
Заміни, Заміни, . Зв'я- носна введені у | введені у Віднос- зува- |ві Ко мі зв'я- домен СНагІдомен СН2 Не Ко для пЕсуйзв (М) льна ідносне значення ло між зува-
Ко для вначен- : С1т та пЕсуНв5 ьна
Назва антитіла | гонетант ) констант: |В ня Ко КІЛЬ л
НОЇ ДІЛЯНКИ|НОЇ ДІЛЯНКИ . КІСТЬ КІЛЬ- (М) між : важкого важкого стт та КІСТЬ ланцюга | ланцюга пЕсу|пЕсу | песу|пЕсу ПЕсСупЕсу ПЕсу
Кп або КТ | НІ або НТ Песни ще в па! пав Ша таро ков пав па в ша вВІнів|Мм він М 04НІ1637- 4,9Е-2,0Е-1,5Е-1,4Е-2.4Е- 04НІ1637- Г234хл 23 вт МОМ раТогкз 4,ОБ-1,2Е-4,1Е-3,4Е-1,9Е-
О4нІв37- нНгв80/02 мае М. М. 1406107 09 09 0,00711,211,6 | 3,6 406,3 125,6
НІО7б6/041І 1610- | 70Е/5298
Іат!і А 234 23 04н1637- 5БО/с236
Кп462/0411610- | М/5239М/ во
Іат" // т25ОМ/Н2 1,5Е-2,2Е-7,0Е-1,7Е-5,2Е-0,001 о4НІ1637- 680/0270 вве мМ |т0|07|о08 | 08|09| 3 09 92рОз| 755458 1,6
НІд41/0411610- | Е/5298А/Т| Указ
Іат!і З07Р/КЗ26 р 234 23 о4н1637- 5О/С236 во
Кп4б2/0411610- | М/8239М/ Е/є298А/Т
Іат" // т2гБОМм/Н2 7,6Е-1,1Е-9,9Е-9,6Е-1,8Е-
О4НІ1637- 6800270 зотвкзає мл м 0708 09 д9 |2030 18,7І37,5| 382,2130,7|. 3,7
НІЗ45/0411610- | Е/5298А/Т з890/К43
Іат!і З07Р/КЗ26 о 4Е 234 23 04н1637- 5060/0236 | О236АЛ2
Кп461/041 1610- | М/5239М/ | 50м/0270
Іат" // Т25ОМ/Н2 | Е/8298А/Т 4,2Е-1,9Е-1,3Е-42,2Е-1 1Е- о4НІ1637- в80/0270 | 307Р/КЗ26 МТ | МО 1341 071 07 | 09 | 09 0025) 12 ОТ 1І1616,5І225,7. ЗИ
НІ443/0411610- | Е/5298А/Т| ОЛЗЗ2Е/К
Іат 307Р/КЗ26| З34Е
О/ЛЗ32Е 234 23
АНІ в5а- 5О/С236 во
Ктабг/оді1610-| М/З239М/ Е/со98А/т
Іат" // т2гБОМм/Н2 3,ОБ-1,6Е-1,1Е-3,3Е-2,2Е- о4нів5в- 6800270 зотвкзае мл м 071 07 09 09 10025|1,6 13,013,9414,7109,6. З
НтТа45/0411610-| Е/5298А/Т з890/К43
Іат!і З07Р/КЗ26 о 4Е 234 23
О4н1654- 5060/0236 | О236АЛ2
КтТ461/0411610- | мув2гЗоМ; | 50м/0270
Іат" // Т25ОМ/Н2 | Е/8298А/Т 3,2Е-2,4Е-2,0Е-2,6Е-1,5Е- о4н1656- 680/0270 | 307Р/КЗ2в 06 1107107 | 09 | 09 02025 1,5184)7,5|525,51561, ЗИ
НТА43/041 1610-| Е/5298А/Т| ОЛЗЗ2Е/К
Іат 307Р/КЗ26| З34Е
О/ЛЗ32Е 234 23
АНІ в5а- 5О/С236 во
Кта73/0411610-| М/8239М/ Е/ео98А/т
Іат" // т2гБОМм/Н2 4,6Е-1,5Е-8,1Е-3,8Е-2,1Е-
О4нів56- 6880/0270 ен ний 2,3 14107108 091 09 0,026 1,1 113,9118,01363,41114,6. 3,2 нНтавг/041.1610-| Е/5298А/Т з890/К43
Іат!і З07Р/КЗ26 4Е р
Таблиця 26
Аналіз зв'язування варіантів Ес-ділянки з людськими ЕсукК та ЕсКп
Від-
Заміни, Заміни, . Зв'я- носна введені у | введені у Віднос- зува- |ві Ко мі зв'я- домен СНагІдомен СН2 не Ко для пЕсуйзв (М) льна ідносне значення ко між зува-
Ко для вначен- : С1т та пЕсуНв5 . констант- | констант- КІЛЬ- льна
Назва антитіла як я ПЕсВп | ня Ко : :
НОЇ ДІЛЯНКИ|НОЇ ДІЛЯНКИ : КІСТЬ КІЛЬ- (М) між ' важкого важкого стт та КІСТЬ ланцюга | ланцюга пЕсу|пЕсу | песу|пЕсу ПЕсСупЕсу ПЕсу
Кп або Кт | НІ або НТ Песни ще В па В па|В Ша таро ков пав па в шара
ВІ нНівЕ|М він М
І 23423 04нН1654- 5060/0236 | С236АЛ2
КтТ481/0411610- | Му/в239М; | 50м/0270
Іат! // Т25О0М/Н2 | Е/5298А/Т 3,ЗЕ-2,6Е-2,ЗЕ-2,8Е-1,6Е- о4нІ1656- в80/0270 | 307Р/КЗгеБ 723 4107 07 | 09 | 09 0022|151|77|6,5 49521520 27
НТА98/041 1610-| Е/5298А/Т1| ОЛЗЗ2Е/К
Іат! 307Р/КЗ2бІ 334Е
О/ЛЗ32Е
І 23423 о4нівБа- БО/сгзв | совО
Ктабг/олі1612-| М/З239М/ | г/га8д/т
Іат! // т2гБом/Нн2 4,1Е-1,4Е-49 1Е-3,4Е-2,3ЗЕ- о4н1656- 6580/0270 вотвКЗавИ, бе 06 1410708 09 | 09 0028 12 1142116,11408,0105,7. 3,4
НтА45/041.1612-| Е/З298А/Т. з8о0/КкЗЗ
Іат! 307Р/К326 о АЕ
І 23423 04нН1654- 5060/0236 | С236АЛ2
Кт461/0411612- | Мув239М; | 50м/0270
Іат! // Т25О0М/Н2 | Е/5298А/Т 3,9Е-2,5Е-2,1Е-2,6Е-1,5Е- о4нт656- в80/0270 | 307Р/КЗ26 25796 111071 07 | 09 | 09 |0025|1,3182|711|536,8158,8 ЗИ
НТА43/041 1612-| Е/5298А/Т1| ОЛЗЗ2Е/К
Іат 307Р/КЗ2б| 334Е
ОЛЗ32Е
І 23423 о4нівБа- 50/02 | риобАта
Кта73/0411612-| М/З239М/ | г/га8д/т
Іат! // т2гБом/Нн2 4,8Е-1,5Е-9,1Е-3,9Е-2,2Е-
О4нів56- 6880/0270 Ди вин 21 14107108 091 09 0,02611,0 113,816,21354,61110,0Ї.Ц 5,2 нНтав2/041.1612-| Е/З298А/Т. з8о0/КкЗЗ
Іат! 307Р/К326 о АЕ
І 23423 04нН1654- 5060/0236 | С236АЛ2
КтТ481/0411612- | Мув239М; | 50м/0270
Іат! // Т25О0М/Н2 | Е/5298А/Т 4,ЗЕ-2,7Е-2,ЗЕ-2,9Е-1,7Е- о4нІ1656- в80/0270 | 307Р/КЗгБ 7 22 134107 07 | 09 | 09 (0022|11|76|64 47920452 28
НТА98/041 1612-| Е/5298А/Т1| ОЛЗЗ2Е/К
Іат 307Р/КЗ2б| 334Е
ОЛЗ32Е
М.Т.: не тестували
Значення "КО для пЕсКп (М)" та "КО для пЕсук (М)" в таблиці позначають константи дисоціації для ПЙЕсКп та кожного ЕсукК, відповідно, а "зв'язувальна кількість" демонструє зв'язувальну кількість ЕсукКіІЬ на одиницю кількості антитіла за забезпечення взаємодії Есукіїр за концентрації 1000 нМ. "Відносне значення для КО між с1т та пЕсКп" та "відносне значення для КО між С1т та пЕсук" являють собою значення, одержані шляхом ділення значення КО 04Н1637-21п/041 1610-і(ат1 для пЕсКп та для кожного ЕсукК на значення КО кожного варіанта відповідно. "Відносна зв'язувальна кількість" позначає значення, одержане шляхом ділення зв'язувальної кількості кожного варіанта щодо ЕсукіІІЬ на зв'язувальну кількість 04Н1637-
Стт/041 1610-і(ат1. Амінокислотні послідовності важкого ланцюга антитіла 04Н1637-с1т та легкого ланцюга антитіла 041 1610-І(ат!і показані під ЗЕО ІЮО МО: 160 їі 161 відповідно. Було показано, що усі із створених гетеродимеризованих антитіл характеризувалися посиленим зв'язуванням з ЕсуКіІїа та ЕсукКІШа порівняно з 04Н1637-С1 т/0411610-І(ат!, який містив константну ділянку нативного людського ЇДС1. Крім того, було показано, що усі з 04Н1637-
Кпа4б2/041 1610-Іат1//04Н1637-НІ441/041 1610-Іаті, 04нН1637-Кп462/041 1610-І(ат1//04Н1637-
НІ445/041 1610-І(ат1 та 04Н1637-Кпаб1/041 1 610-І(ат1//04Н1637-НІ443/041 1 610-І(ат1 характеризувалися посиленим зв'язуванням з ЕсуКПа порівняно з 04Н1637-Кп125/0411610-
Іат1//04Н1637-НІО76/041 1610-Іат!і, який містив варіант Ес-ділянки, описаний в УМО 2013/002362. Було показано, що здатність зв'язування 04Н1637-Кп4б2/041 1610-іат1//04Н1637-
НІ44А5/041 1610-І(ат1 з ЕсукКШа була еквівалентна такій 04Н1637-Ки125/041 1610-Іат1//04Н1637-
НІО76/041 1610-і(ат!, та було показано, що здатність зв'язування 04Н1637-Кп461/041 1610-
Іат1//04Н1637-НІ443/041 1610-Іат!і з ЕсукШа була посилена порівняно з такою 04Н1637-
Ки125/041 1610-Іат31//04Н1637-НІО76/041 1610-іат!. Подібним чином, було показано, що 04н1654-КТ462/041 1610-Іат1//04Н1656-НТ445/041 161 0-Іат!1 та 04н1654-КТ462/041 1612-
Іат1//04Н1656-НТ445/041 1610-Іат!, що містять різні варіанти змінення для гетеродимеризації в константній ділянці та ділянці СНЗ І5НО1703, характеризувалися профілем зв'язування Есук, порівнянним з таким 04Н1637-Кп462/041 1610-Іат1//04Н1637-НІ445/041 1610-іІат!, та було показано, що 04Н1654-КТ461/041 1610-Іат1//04нН1656-НТ443/0411610--ат! і 04нН1654-
КтТа61/041 1612-І(ат1/04Н1656-НТ443/041 1610-іат! характеризуються профілем зв'язування
ЕсукК, порівнянним з таким 04Н1637-Кп461/041 1 610-Іат1//04Н1637-НІ443/041 1610-іат1. Крім того, було показано, що 04Н1654-КТА73/041 1610-Іат1//04Н1656-НТ482/041 1610-Іат1, 04Н1654-
Кта81/041 1610-(ат1/04Н1656-НТ498/0411610-іат!, 04нН1654-КТ473/041 1612-Іат1//04Н1656-
НтавВ82/041 1612-Іат!1 ії 04Н1654-КТ481/041 1612-І(ат1//04Н1656-НТ498/041І 1612-і(ат!, одержані в результаті внесення варіантів змінення для поліпшення кінетичних показників у крові, характеризуються поліпшеною здатністю зв'язування з людським ЕсКп та порівняною здатністю зв'язування з ЕсукК порівняно з такою антитіл до введення варіантів змінення для поліпшення кінетичних показників в крові.
Крім того, створювали ген 04Н1656-НТ451 (5БО ІЮО МОЇ 272), в якому
М434А/у4361/9438К/5440Е були введені в 04Н1656-НТ441, що являють собою комбінацію варіантів змінення, які забезпечують посилення зв'язування з людським ЕсКп в кислих умовах, та варіантів змінення, які забезпечують зниження рівня зв'язування з ревматоїдним фактором.
Амінокислотна послідовність важкого ланцюга антитіла НТ451 представлена під 5ЕО ІЮО МО: 276. Гетеродимеризоване антитіло створювали шляхом об'єднання 04Н1654-КТ473 і 04Н1656-
НТаЯ51 та із застосуванням 041 1610-Іат! як легкого ланцюга антитіла. В таблиці 27 показані результати аналізу взаємодії створених антитіл з людським ЕсКп та з людським Есук.
Таблиця 27
Аналіз зв'язування варіантів Ес-ділянки з людськими ЕсукК та ЕсКп
Віднос-
Відносне Зв'язу- Відносне значення Ко між зв'язу-
Ко для| значен- Ко для пРсунв (М) кількість б1т та пЕсунНь вальна
Назва антитіла пПЕсАпня Ко між! кіль- (М) | С1тт та кість пес пеЕсСу|песу|пЕсу 04Н1656-С1т/041 16104 1,7Е- 9.2Е- | 1,6Е- | 1,3Е- | 1,0Е- 179,7Е- 04НІ1654- кт462/0411610-іат 1 // | 2,0Е- 1,2Е- | 1,8Е- | 9,9Е- | 1,7Е- | 4,4Е-
Нт4АА41/041.1610-Іат 1 04НІ1654- кта73/0411610-іат 1 // | 5,4Е- 1,4Е- | 1,8Е- | 9,2Е- | 2,0Е- | Б1Е- потен в з» ЕОР ЕЕ вон ов|евуноввн 5.
НтаБ1/041 1610-Ііаті х Значення КО було визначене з використанням рівноважної моделі.
Було показано, що обидва створених гетеродимеризованих антитіла 04Н1654-
Кта462/041 1610-(ат1/04Н1656-НТ441/0411610-іат! і 04нН1654-КТ473/041 1610-Іат1//04Н1656-
НТа51/041 1610-Іат!1 характеризуються посиленим зв'язуванням з активувальними Есук ЕсукПа та ЕсукШа, порівняно з 04Н1656-(231п/041 1610-І(ат!, яке містило константну ділянку нативного людського ЇдсС1. Крім того, зв'язування з ЕсукіІІЬ, який являє собою інгібувальний Есук, підтримувалося на тому самому рівні, що і у разі 04Н1656-(2311п/041 1610-Іат!, у обох з цих антитіл. Було показано, що 04Н1654-КТА473/041 1610-Іат1//04Н1656-НТ451/041 1610-і(ат!, в який
М434А/у4361/9438К/5440Е було введено в 04Н1654-КТ462/041 1610-Іат1//04Н1656-
Нта41/041 1610-І(ат1, характеризувалося посиленою здатністю зв'язування з людським ЕсКп порівняно з такою до введення варіантів змінення.
Далі варіанти з посиленим зв'язуванням Есук, створені із застосуванням різних варіантів змінення для гетеродимеризації, описаними в Маї. Віоїесппо!., 1998, 16, 677-681, оцінювали за їх активністю зв'язування з людськими ЕсКп та ЕсукК. Створювали гени для важких ланцюгів антитіла 04Н1389-Кз462 (5ЕБО ІО МО: 191) та 04Н1389-Кт462 (5ЕО ІЮО МО: 199), які містили 04Н1389 (5ЕО ІО МО: 136) як варіабельну ділянку важкого ланцюга та містили константну ділянку важкого ланцюга, яка містила такі самі варіанти змінення, що і КТ462, введені в ділянку
СНІ константної ділянки, з видаленням су і Гув5 на С-кінці людського Їде1 (І5НО1703), та, крім того, в ділянці СНЗ містило Т366УУ, введене як змінення для гетеродимеризації для 04Н1389-
К5462, та 7349С/1366УМ, застосовані як змінення для гетеродимеризації для 04Н1389-Кіт462.
Крім того, створювали гени для важких ланцюгів антитіла 04Н1389-Н5445 (5ЕО ІО МО: 192) та 04Н1389-Ніт445 (5ЕО ІО МО: 200), які містили такі самі варіанти змінення, що і НТ4А45, введені в ділянку СН2, та, крім того, в ділянці СНЗ містили 73665/| З368А/и407У, введені як варіанти змінення для гетеродимеризації для 04Н1389-Н5445, та ЕЗ356С/13665/І З368А/407У, застосовні як змінення для гетеродимеризації для 04Н1389-Ніт445. Подібним чином, створювали 04Н1389-
К5461 (5ЕО І МО: 193), 04Н1389-Кіт461 (5ЕО І МО: 201), 04Н1389-Неь443 (5ЕО ІО МО: 194) та 04нН1389-Ніт443 (5ЕО ІО МО: 202), які містили такі самі варіанти змінення, що і КТА61 та НТ443 в ділянці СН2. Крім того, створювали гени для важких ланцюгів антитіла 04Н1389-Ке473 (5ЕО
ІО МО: 195), 04Н1389-Н5482 (5ЕО ІЮ МО: 196), 04Н1389-К5е481 (5ЕО ІО МО: 197), 04Н1389-
Нза498 (5ЕО І МО: 198), 04Н1389-Кт473 (5ЕО ІО МО: 203), 04Н1389-Нта482 (5ЕО ІО МО: 204), 04Н1389-Кта481 (5ЕО І МО: 205) та 04Н1389-Ніт498 (5ЕО ІО МО: 206), які містили змінення
М434А/у436Т/0438К/5440Е, що забезпечують поліпшення в крові кінетичних показників, введені в зазначені вище константні ділянки важкого ланцюга антитіла К5е462, Неь445, К5461, Нзг443,
Кт462, Нт445, Кіт461 і Ніт443, та містили 04Н389 як варіабельну ділянку. 04І 1615-КОМТ (5ЕО
ІО МО: 190) використовували як легкий ланцюг та створювали гетеродимери, що становлять інтерес. Для порівняння створювали гомодимер 04Н1389-51т/04І 16150КОМТ, що містив 04Н1389-с1т (5ЕО ІО МО: 189). Взаємодію між створеними антитілами та людськими Есук аналізували із застосуванням Віасоге Т200. 50 мМ фосфату Ма, 150 мМ Масі, 0,05 95 Тмееп20 (рН 7,4) використовували як електродний буфер та аналіз виконували за температури 25 "С. Як сенсорні чипи використовували чипи 5А 5егієз 5 (СЕ Неаїйсаге), на яких було іммобілізовано
Саріигезеїесі Нитап Рабр-Карра Кіпеїйсз Віоїіп Сопішдаєе (Тнегто Різнег Зсіепійіс). Здійснювали захоплення антитіл, що становлять інтерес, на цих чипах і забезпечували взаємодію з ними кожного Есук, розбавленого електродним буфером. Чипи регенерували за допомогою 10 мМ гліцин-НСЇІ (рН 1,5) і 25 мМ Маон та проводили аналіз шляхом повторного захоплення антитіл.
Константи дисоціації КО (моль/л) для ЕсукК кожного антитіла розраховували із застосуванням
Віасоге Т200 ЕмаїЇцайоп 5оїтмаге 2.0 та із застосуванням моделі зв'язування Ленгмюра 1:1 для
ЕсуКІа та ЕсукКІПа та рівноважної моделі афінності для ЕсукПа. Для ЕсукІЬ зв'язувальну кількість ЕсукКІИБ она одиницю кількості антитіла розраховували шляхом коригування зв'язувальної кількості ЕсуКІІЬ, одержаної із сенсограми, одержаної шляхом вимірювання, за кількістю антитіл, захоплених на поверхні чипа. Для вимірювання зв'язування з ЕсКп, 50 мМ фосфату Ма, 150 мМ Масі, 0,05 95 Гуеепг20 (рН 6,0) використовували як електродний буфер, та константу дисоціації КО (моль/л) розраховували з використанням рівноважної моделі (таблиця 28). Що стосується констант дисоціації для ЕсуКШа в таблиці 28, значення, позначені «"», являють собою значення, розраховані з використанням рівноважної моделі афінності.
Таблиця 28
Аналіз зв'язування варіантів Ес-ділянки з людськими ЕсукК та ЕсКп
Віднос- на
Відносне Зв'язу- |; Я здау-
Ко для| значен- Ко для пЕсуйв (М) вальна Відносне начення Ко між вальна
Назва антитіла пЕсАпіня Ко між кількість ї кіль- (М) )| б1т та кість
ПЕСНИ пЕсув|песув|пРсув|пРсув|пРсуву єсув ць! ПЕсу |пРсувіЕсуві пРсуй | пЕсуй іа | пав) пан | шає | шам | су АКіа|пак|пані шам | п 04Н1389-С1т/0411615- | 1,3Е- 4, БЕ- | 1,5Е- | 1 1Е- "9Л1Е- 04Н1389-К5462/0411615- ком 1,6Е- 4,7Е- | 1,6Е- | 6,7Е- | 21Е- | 11Е- 04нН1389-Н5445/0411615-| 06 з) 07 | 08) 09 | 09) 0030 | 10) 91 |158|82991 26 ком 04Н1389-К5461/0411615- ком 1,7Е- З,ОБ- | 2,5Е- | 1,6Е- | 1,2Е- | 5,6Е- о4н1389-Не443/0411615-|. 06 м 07107.) 09 | ло б | 175) 559) 67 16272 2 ком 04Н1389-К5473/0411615- ком А, БЕ- 5ЛЕ- | 1,6Е- | 7,5Е- | 2,3Е- | 1,2Е- о4нізве-неаводіяві5-| 07120411 07 | 08 | 09 | 09 | 9026 11р|7602 23 ком 04НІ1389-К5481/0411615-
КОМ // 4,бЕ- 2,8Е- | 2,6Е- | 1,9Е- | 1,3Е- | 6,0Б- однізве-неаоводія615-| 07 | 29 | 4 | 07) 07 | 09 | 10 | 0023 1656) 56 )15007 20 ком 04Н1389-Кт462/0411615-
КОМ // 1,7Е- 4,8Е- | 1,6Е- | 7,4Е- | 2,2Б- | 11Е-
О4ніЗз89-Нта45/0411615-|. 06 м) 07 | 08) 09 | 09) 0029 5 |ть4|8106) 26 ком 04Н1389-Кт461/0411615-
КОМ // 1,7Е- 2,5Е- | 2,6Е- | 1,9Е- | 1,2Е- | 5,6Е- 04Н1389-Нта443/0411615-| 06 0,7 ям) 07| 07.) 09 | ло 02 | 178) 5857 162031 2 ком 04Н1389-Кт473/0411615-
КОМ т 4,бЕ- 6,2Е- | 1,8Е- | 8,7Е- | 2,6Е- | 1,3Е- о4нізве-Нтавгюді1615- 07 | 2833 | 07 | ов | 09 | 09 | 0024 07 | 82 |128|17051| 2 ком 04Н1389-Кт481/0411615- ком А ТЕ- 4,2Е- | 2,9Е- | 21Е- | 1,4Е- | 6,2Е- о4нізве-нтаовюді1615- 07 | 28134 | 07 | 07 | 09 | 30 | 0021 | 115 | 50 пяб9л) 19 ком "; Значення КО було визначене з використанням рівноважної моделі.
МТ: Не тестували
Усі зі створених в даному випадку гетеродимеризованих антитіл характеризувалися посиленою активністю зв'язування з ЕсуКіІЇїа та ЕсуКІПа порівняно з 04Н1389-(2311п/041 1615-
КОМТ. Крім того, усі з 04Н1389-К5473/041 1615-КОМ Г/04Н1389-Нз482/0411615-КОМТ, 04Н1389-
Кв481/041 1615-КОМТ//04Н1389-Н5498/041 1615-КОМТ, 04Н1389-Кта473/041 1615-КОМТ/04Н1389-
Нта82/0411615-КОМТ її 04нН1389-Кт481/041 1615-КОМТ/04Н1389-Ніт498/0411615-КОМТ, які характеризувалися наявністю варіантів змінення, введених для поліпшення в крові кінетичних показників антитіл, характеризувалися посиленою активністю зв'язування з людським ЕсКп порівняно з вихідним антитілом перед введенням варіантів змінення, а щодо активності зв'язування ЕсукК вони характеризувалися таким самим профілем зв'язування, що і вихідне антитіло.
Крім того, створювали ген для 04Н1389-Нт441 (5ЕО ІО МО: 273), який містив 04Н1389 (5ЗЕО
ІО МО: 136) як варіабельну ділянку важкого ланцюга, містив такі самі варіанти змінення, що і
НТА41, введені в СНЕІ2 ділянку важкого ланцюга, та містив У349С/366МУ, застосовані як варіанти змінення для гетеродимеризації в ділянці СНЗ. На відміну від цього, створювали 04Н1389-
Нт451 (5БО ІО МО: 274) з введеними М434А/у436Т/9438К/5440Е, що являють собою комбінацію варіантів змінення, які забезпечують посилення зв'язування з людським ЕсКп в кислих умовах, та варіантів змінення, які забезпечують зниження рівня зв'язування з ревматоїдним фактором. Амінокислотні послідовності важких ланцюгів антитіла Нт441 та
Нтя51 показані під ЗЕО ІО МО: 277 і 278 відповідно. Гетеродимеризовані антитіла створювали із застосуванням 04Н1389-Кт473, 04Н1389-Нт451 або 04Н1389-Нт482 як важкого ланцюга антитіла та 041 1305-КОМТ як легкого ланцюга антитіла. В таблиці 29 показані результати аналізу взаємодії створених антитіл з людським ЕсКп та з людським Есук.
Таблиця 29
Аналіз зв'язування варіантів Ес-ділянки з людськими ЕсукК та ЕсКп
Віднос-
Зв'язу- на
Відносне вальна| Відносне значення Ко між | зв'язу-
Ко для| значен- Ко для пРсунв (М) кіль- б1іт та пЕсувв вальна
Назва антитіла пЕсАпіня Ко між кість кіль- (М) | С1т та кість пон несув|несув песув песув|песуві| песув | песу | ДИеМ| Пееу|песу|ВЕСІ несув а пав|пані|тає| там) пе |ва|тат| Но в у Ов 04Н1389- 1,0Е- 6,9Е- | 1,6Е- | 1.1Е- | 6,9Е- | "8,8Е- 04Н1389-
Кта73/0411305-КОМТ
І зби во тре текреаєт тю | ов) 05 | 97 |200|41,3|2247|. 13 04н1389-
Нта451/041.1305-КОМТ 04Н1389-
Кта73/0411305-КОМТ 3,7Е- бЛЕ- | 8,6Е- | 3,5Е- | 2,7Е- | 9,5Е- / , 2,7 ; , , у й 0,034 | 1,1 | 18,51 30,8 1758,11930,5| 3,0
О4н1з89- 07 11 08 08 09 10
Нта82/0411305-КОМТ " Значення КО було визначене з використанням рівноважної моделі.
Було показано, що обидва створених гетеродимеризованих антитіла, 04Н1389-
Кта73/041 1305-КОМТ//04Н1389-Ніт451/041 1305-КОМТ та 04н1389-Кта473/041 1305-
КОМТ/04Н1389-Нт482/0411305-КОМТ, характеризувалися посиленим зв'язуванням з активувальними Есук ЕсукКІІа та ЕсукШа порівняно з 04Н1389-С1 т/041 1305-КОМТ, яке містило константну ділянку нативного людського Їдс1. Також було показано, що обидва з цих антитіл характеризувалися посиленою здатністю зв'язування з людським ЕсКп порівняно з 04Н1389-
Ст т/041 1305-КОМТ.
Далі варіанти константної ділянки з посиленим зв'язуванням з Есук, виявлені в даному випадку, порівнювали з існуючими варіантами з посиленим зв'язуванням ЕсукК. Створювали гени для важких ланцюгів антитіла МОХ1О01Н-Кп125 (5ЕО І МО: 217), МОХ1О0О1Н-НІО76 (5ЕО
ІЮО МО: 218), МОХТО01Н-Кп462 (5ЕО І МО: 219), МОХтТОБ1Н-НІ445 (5ЕО ІЮ МО: 220),
МОХтТО01Н-Кп461 (5ЕО ІО МО: 221) та МОХТОБІТН-НІЯ443 (5ЕО ІО МО: 222), які передбачали
МОХТОО1Н (ЗЕО ІО МО: 154) як варіабельну ділянку важкого ланцюга та константні ділянки важкого ланцюга, наведені в таблиці 26, та ген для МОХ1О01Н-сСїт (5ЕО ІО МО: 210), що передбачав ділянку СН2 нативного людського (401. Створювали ген для важкого ланцюга антитіла МОХТО01Н-ЗАБОСІЕ (5БО 10 МО: 215), який містив варіанти змінення 236А/52390/332Е в ділянці СН2, описані в Мої. Сапсег ТПег., 2008, 7, 2517-2527, як варіант з посиленим зв'язуванням з ЕсукПа. Крім того, також створювали ген для важкого ланцюга антитіла МОХ1О01Н-САБОАЕ (ЗЕБО ІО МО: 216), який містив 5236А/52390/А330І/332Е в ділянці СН2, описані в 4). Бігисі. Віоі!., 2016, 194, 78-89, як варіант з посиленим зв'язуванням з
ЕсукШа. МОХ1001І-КОМТ (5ЕО ІО МО: 211) використовували як легкий ланцюг антитіла та створювали антитіла, що становлять інтерес. Активність зв'язування цих антитіл з людськими
Есук вимірювали описаним вище способом із застосуванням СаріигезеЇесі Нитап Раб-Карра
Кіпеїйісз Віоїїп Сопіцйдаїе (таблиця 30).
Таблиця 30
Аналіз зв'язування варіантів Ес-ділянки з людськими Есук
Зв'язу- | Відносна
Кодлятееів(М 00 вель | | се
Назва антитіла КІЛЬКІСТЬ кількість пЕсуВ Мпа|пЕсув Па пЕсув | песуВ ПЕсСУуВ | пРсуВ | пЕсуВ
МОХТОрІТнН-Кп125/МОХТО01Н-
МОХТОртнН-Кп46г/мохХтТортн-
МОХТОртТнН-Кп461/МОХТО0 т Н-
Ниазмохтортькомт 001 МЕо7|вевов|тавов| вило оо! | 80 | ме зве) 25 " Значення КО було визначене з використанням рівноважної моделі.
М.Т.: не тестували
Значення "КО для пПЕсук (М)" в таблиці позначає константу дисоціації для кожного з перелічених ЕсукК, а "зв'язувальна кількість" позначає зв'язувальну кількість ЕсуКІІб на одиницю кількості антитіла за забезпечення взаємодії ЕсукіїБ за концентрації 1000 нМ. "Відносне значення для КО між б1т та пЕсук" позначає значення, одержане шляхом ділення значення
КО МОоХтТор1нН-сі1т/МОХ10011-КОМТ для кожного Есук на значення КО кожного варіанта, а "відносна зв'язувальна кількість" позначає значення, одержане шляхом ділення зв'язувальної кількості кожного варіанта щодо ЕсукКІБ на зв'язувальну кількість МОХ10О00О1Н-СТ т/МОХ10011 - кОм.
Усі зі створених гетеродимерів. МОХ1ТО01Н-Кп125/МОХ1О01 Н-НІО76/МОХ10011 -КОМТ,
МОХтТ001нН-Кп462/МОХ1001 Н-НІ445/МОХ10011 -КОМТ і МОхХтТоОр1нН-Кп461/МОХ1001 Н-
НІ443/МОХ1001І-КОМТ характеризувалися посиленим зв'язуванням з ЕсукІШа порівняно з існуючими антитілами МОХ1001Н-САБОІЕ/МОХ10011 -КОМТ і мМОохХторт1н-
СвАБОАПІЕ/МОХ1О01І-КОМТ з посиленим зв'язуванням з ЕсукК. Також було показано, що
МОХтТ001нН-Кп462/МОХ10О01 Н-НІ445/МОХ10011І-КОМТ // характеризувалося посиленим в приблизно 2 рази зв'язуванням з ЕсукКіІїан порівняно з існуючим антитіллом МОХ1ТО01нН-
САБОІЕ/МОХ10011 -КОМТ з посиленим зв'язуванням з ЕсукІІа. (6-2) Оцінювання АЮСсС-активності іп міо різних антитіл, що містять змінені константні ділянки
Для аналізу АЮСС-активності іп міто використовували базовий набір АЮСС Керопег
Віоаззау (Рготеда) для пЕсСуУКПШам. В кожну лунку 96-лункового планшета як клітини-мішені додавали 25 мкл клітин ЯСТІ А4-СНО з одержаною концентрацією 2 х 106/мл із застосуванням середовища та буфер для аналізу (90 95 ВРМІ1640, 10 95 ЕВ5) використовували як середовище.
Потім додавали по 25 мкл розчину кожного антитіла, розбавленого буфером для аналізу, так, щоб кінцева концентрація становила 0, 0,001, 0,01, 0,1 та 1 мкг/мл. Нарешті, як розчин ефекторних клітин додавали 25 мкл клітин дигкаї, що експресують пПЕсукПШам (що входили до набору), одержаних за 6 х 106/мл за допомогою середовища, так що розчини змішувалися до загального об'єму 75 мкл. Планшет залишали стояти за температури 37 "С протягом ночі в інкубаторі з 5 95 СО». Потім планшет залишали стояти за кімнатної температури на 15 хвилині в кожну лунку додавали по 75 мкл реагенту Віо-Сіо. Як реагент Віо-Сіо використовували Віо-діо
І исітегазе Аззау Зузієт (буфер та субстрат). Люмінесценцію кожної лунки потім вимірювали за допомогою пристрою для зчитування планшетів. Значення, одержане шляхом ділення значення люмінесценції кожної лунки на значення люмінесценції лунок без антитіл, визначали як кратність індукції, яку використовували як індекс оцінювання ЛОСС кожного антитіла. Одержані результати представлені на фіг. 23. На даній фігурі кратність індукції представлена у відносних одиницях люмінесценції (КІ 0).
Ці результати показали, що АЮОСс-активність антитіл, що містили змінену Ес, щодо клітин
СТІ А4-СНО була вищою, ніж АЮСсС-активність константної ділянки людського ДС! дикого типу. (6-3) Оцінювання АЮОСР-активності іп міо різних антитіл, що містять змінені константні ділянки
Для аналізу АЮСС-активності іп мійго використовували базовий набір АОСР Керогпег
Віоаззау (Рготеда) для пЕсуКПам. В кожну лунку 9б6-лункового планшета як клітини-мішені додавали 25 мкл клітин АСТІ А4-СНО з одержаною концентрацією 1 х 106/мл із застосуванням середовища та буфер для аналізу (495 сироватка з низьким вмістом їдС в КРМІ1640) використовували як середовище. Потім додавали по 25 мкл розчину кожного антитіла, розбавленого буфером для аналізу, так, щоб кінцева концентрація становила 0, 0,001, 0,01, 0,1 та 1 мкг/мл. Нарешті, як розчин ефекторних клітин додавали 25 мкл клітин ЗУигкаї, що експресують пЕсукКІїан, що входили до набору, так що розчини змішувалися до загального об'єму 75 мкл. Планшет залишали стояти за температури 37 "С протягом ночі в інкубаторі з 5 95
СО». Щільність в розчині клітин Удигкаї, що експресують пЕсукПан, становила 8,25 х 105/мл.
Потім планшет залишали стояти за кімнатної температури на 15 хвилин і в кожну лунку додавали по 75 мкл реагенту Віо-Сіо. Як реагент Віо-СІіо використовували Віо-діо І исітегазе
Авзау бузієт (буфер та субстрат). Люмінесценцію кожної лунки потім вимірювали за допомогою пристрою для зчитування планшетів. Значення, одержане шляхом ділення значення люмінесценції кожної лунки на значення люмінесценції лунок без антитіл, визначали як кратність індукції, яку використовували як індекс оцінювання АОСР кожного антитіла. Одержані результати представлені на фіг. 24. На даній фігурі кратність індукції представлена у відносних одиницях люмінесценції (КІ 0).
Результати показали, що АЮСР-активність антитіл, що містили змінену Ес, щодо клітин
СТІ А4-СНО була вищою, ніж АЮСР -активність константної ділянки людського ЇДС1 дикого типу. (6-4) Оцінювання АЮСсС-активності іп міо антитіл до СТІ А4 з перемиканням класу, що містять змінену Ес
Створювали антитіла до СТІГА4 з перемиканням класу зі зміненою Ес (04Н1654-
Кп46б2/041 1610-Іат1//04Н1656-НІ445/041 1610-І(ат!, абревіатура 5МУУ1610-АВТб6; 04Нн1654-
Кп46б2/041 1612-Іат1//04Н1656-НІ445/041 1612-Іаті, абревіатура ЗУУ1612-АКТб, та 04Н1389-
Кп462/041 1305-КОМТ/04НІ1389-НІ445/041 1305-КОМТ, абревіатура ЗУУ1389-АВТ6).
В антитілі БМУ1610-АКТЄ одна варіабельна ділянка важкого ланцюга 04Н1654 (5ЕО ІЮ МО: 35) була приєднана до константної ділянки важкого ланцюга людини Кп4б62 (ЗЕО ІЮО МО: 43), інша варіабельна ділянка важкого ланцюга 04Н1656 (5ЕО ІЮО МО: 37) була приєднана до константної ділянки важкого ланцюга людини НІ445 (5ЕО ІО МО: 44) як константна ділянка, а як варіабельну ділянку легкого ланцюга 0411610 (5ЕО ІО МО: 39) використовували константну ділянку легкого ланцюга людини дикого типу Їат! (ЗЕО ІО МО: 53). Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
В антитілі ЗМ/У1612-АКТбЄ одна варіабельна ділянка важкого ланцюга 04Н1654 (5ЕО ІО МО: 35) була приєднана до константної ділянки важкого ланцюга людини Кп462 (5ЕО ІЮО МО: 43), інша варіабельна ділянка важкого ланцюга 04Н1656 (5ЕО ІЮО МО: 37) була приєднана до константної ділянки важкого ланцюга людини НІ445 (5ЕО ІО МО: 44) як константна ділянка, а як варіабельну ділянку легкого ланцюга 0411612 (5ЕО ІО МО: 40) використовували константну ділянку легкого ланцюга людини дикого типу Їат! (ЗЕО ІО МО: 53). Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
В антитілі ЗУУ1389-АКТЄ дві варіабельні ділянки важкого ланцюга 04Н1389 (5ЕО ІЮО МО: 29) були приєднані відповідно до константної ділянки важкого ланцюга людини Кп462 (ЗЕО ІЮ МО: 43) та константної ділянки важкого ланцюга людини НІ445 (ЗЕО ІО МО: 44) як константної ділянки, та додатково для варіабельної ділянки легкого ланцюга 0411305 (5ЕО ІО МО: 30) використовували константну ділянку легкого ланцюга людини дикого типу КОМТ (ЗЕО ІЮО МО: 33). Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
Для аналізу АЮСС-активності іп міто використовували базовий набір АЮСС Керопег
Віоаззау (Рготеда) для пЕсСуУКПШам. В кожну лунку 96-лункового планшета як клітини-мішені додавали 12,5 мкл клітин ЯИСТІ А4-СНО з одержаною концентрацією 2 х 106/мл за допомогою середовища та буфер для аналізу (495 сироватка з низьким вмістом їдС в КРМІ1640) використовували як середовище. Далі послідовно додавали розчини АТФ, розбавлені буфером для аналізу так, що кінцева концентрація становила 0 та 100 мкм, а розчини антитіл 5УМ1389-
АВТб, 5М/1610-АКТб та 5УУ1612-АКТб, розбавлені буфером для аналізу так, що кінцева 60 концентрація становила 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 і 10 мкг/мл. Нарешті, як розчин ефекторних клітин додавали 25 мкл клітин Щигкаї, що експресують ПЕесукПШам (що входили до набору), одержаних за 3 х 106/мл за допомогою середовища, і розчини змішували до загального об'єму 75 мкл.
Планшет залишали стояти за температури 37 "С протягом Є годин в інкубаторі з 5 95 СО». Потім планшет залишали стояти за кімнатної температури на 15 хвилин і в кожну лунку додавали по 75 мкл реагенту Віо-Сіо. Як реагент Віо-Сіо використовували Віо-діо І исітегазе Аззау бузівт (буфер та субстрат). Люмінесценцію кожної лунки потім вимірювали за допомогою пристрою для зчитування планшетів. Значення, одержане шляхом ділення значення люмінесценції кожної лунки на значення люмінесценції лунок без антитіл, визначали як кратність індукції, яку використовували як індекс оцінювання АОСС кожного антитіла. Одержані результати представлені на фіг. 25 (5М/1389-АКТб), фіг. 26 (5УУ1610-АКТб) та фіг. 27 (5У/1612-АКТб). На фігурах кратність індукції представлена у відносних одиницях люмінесценції (КІ 0).
Ці результати підтвердили, що АЮОСс-активність антитіл до СТІ А4 з перемиканням класу, що містять змінену Ес, щодо клітин АСТІ А4-СНО відрізняється залежно від присутності та відсутності АТФ, і що спостерігалася АТФ-залежна цитотоксичність щодо клітин СТІ А4-СНО. (6-5) Оцінювання нейтралізувальної активності іп міо антитіл до СТІ А4 з перемиканням класу
Як змінені антитіла до СТІ А4 з перемиканням класу одержували людські антитіла, що містили варіабельні ділянки 5М/1 389, 5УМ1610, 5УМ1612 і 5М/1615.
Щодо антитіла 5МУ1389, 04Н1389 (5ЕО ІО МО: 29) використовували як варіабельну ділянку важкого ланцюга та 041 1305 (5ЕО ІО МО: 30) використовували як варіабельну ділянку легкого ланцюга. Після приєднання варіабельних ділянок до константних ділянок людини експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
Щодо антитіла 5УУ1610, 04Н1654 (5ЕБО ІО МО: 35) і 04Н1656 (5БО ІЮО МО: 37) використовували як варіабельну ділянку важкого ланцюга, а 0411610 (5БО ІО МО: 39) використовували як варіабельну ділянку легкого ланцюга. Після приєднання варіабельних ділянок до константних ділянок людини експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
Щодо антитіла 5УУ1612, 04Н1654 (5БО ІО МО: 35) і 04Н1656 (5БО ІО МО: 37) використовували як варіабельну ділянку важкого ланцюга, а 0411612 (5БО ІО МО: 40) використовували як варіабельну ділянку легкого ланцюга. Після приєднання варіабельних ділянок до константних ділянок людини експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
Щодо антитіла 5УМУ1615, 04Н1389 (5ЕО ІО МО: 29) використовували як варіабельну ділянку важкого ланцюга, а 041 1615 (5ЕО ІЮО МО: 34) використовували як варіабельну ділянку легкого ланцюга. Після приєднання варіабельних ділянок до константних ділянок людини експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
СТІ А-4 ВіосКаде Віоаззау (Рготеда) використовували для вимірювання нейтралізувальної активності іп міто. В кожну лунку 96-лункового планшета як клітини-мішені додавали 25 мкл клітин аАРС-Каїї, прикріплених до набору, з одержаною концентрацією до 1 х 106б/мл за допомогою середовища та буфер для аналізу (1095 ЕВ5 в КРМІ1640) використовували як середовище. Далі послідовно додавали розчини АТФ, розбавлені буфером для аналізу так, що кінцева концентрація становила 0 та 100 мкМ, а потім розчини антитіла, що містили варіабельні ділянки 5М/1389, 5УМ1610, 5УМ1612 і 5М/1615, розбавлені буфером для аналізу так, що кінцева концентрація становила 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 і 10 мкг/мл. Нарешті, як розчин ефекторних клітин додавали 25 мкл клітин ІІ 2-Інс2-СТІ А4-дигКаї (що входили до набору), одержаних при 2 х 1О06/мл за допомогою середовища, так що розчин змішувався до загального об'єму 75 мкл.
Планшет залишали стояти за температури 37 "С протягом Є годин в інкубаторі з 5 95 СО». Потім планшет залишали стояти за кімнатної температури на 15 хвилин і в кожну лунку додавали по 75 мкл реагенту Віо-СіІо. Як реагент Віо-Сіо використовували Віо-Сіо І исітегазе Аззау бувзівт (буфер та субстрат). Люмінесценцію кожної лунки потім вимірювали за допомогою пристрою для зчитування планшетів. Значення, одержане шляхом ділення значення люмінесценції кожної лунки на значення люмінесценції лунок без антитіл, визначали як кратність індукції, яку використовували як індекс оцінювання нейтралізувальної активності кожного антитіла.
Одержані результати показані на фіг. 28 (5УМ1389), фіг. 29 (5МУ1610), фіг. 30 (5М/1612) та фіг. 31 (5МУ1615). На фігурах кратність індукції представлена у відносних одиницях люмінесценції (АГИ).
Ці результати підтвердили, що нейтралізувальна активність антитіл до СТІА4 з перемиканням класу щодо клітин, що експресують ПСТІ А4, була різною в присутності та у відсутності АТФ, і що спостерігалася АТФ-залежна нейтралізувальна активність.
(6-6) Оцінювання цитотоксичної активності іп міїго антитіл до СТІ А4 з перемиканням класу щодо СТІ А4-позитивних регуляторних Т-клітин
Створювали антитіла до СТІГА4 з перемиканням класу зі зміненою Ес (04Н1654-
КтТа73/041 1610-(ат1/04Н1656-НТ451/041 1610-Іат!, абревіатура ЗУМ1610-АНТ5-АСТІ1; 04н1654-КТ473/041 1610-Іат1//04Н1656-НТ482/041 1610-І(ат!, абревіатура ЗМУ1610-
АВТб-АСТІ1; 04нН1389-Кта473/041 1305-КОМТ//04Н1389-Ніт451/041 1305-КОМТ, абревіатура
ЗМ1389-АВТ5-АСТІ1; 04нН1389-Кта473/041 1305-КОМТ//04Н1389-Ніт482/041 1305-КОМТ, абревіатура ЗМУ1389-АНТ6-АСТІ1).
Для антитіла 5М/1610-АКТ5-АСТІ1 використовували 04Н1654-КТ473 (5ЕО ІО МО: 184) як один важкий ланцюг, використовували 04Н1656-НТ451 (5ЕО ІО МО: 272) як інший важкий ланцюг та використовували 0411610-Іат! (5ЕО ІО МО: 161) як легкий ланцюг. Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
Для антитіла 5М/1610-АКТ6-АСТІ1 використовували 04Н1654-КТ473 (5ЕО ІЮО МО: 184) як один важкий ланцюг, використовували 04Н1656-НТ482 (5ЕО ІЮО МО: 185) як інший важкий ланцюг та використовували 0411610-Іат! (5ЕО ІО МО: 161) як легкий ланцюг. Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
Для антитіла 5М/1389-АКТ5-АСТІ1 використовували 04Н1389-Кіт473 (5ЕБО ІЮО МО: 203) як один важкий ланцюг, використовували 04Н1389-НІт451 (ЗЕО ІО МО: 274) як інший важкий ланцюг та використовували 041 1305-КОМТ (5ЕБО ІО МО: 275) як легкий ланцюг. Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
Для антитіла 5М/1389-АКТ6Є-АСТІ1 використовували 04Н1389-Кіт473 (5ЕБО ІЮО МО: 203) як один важкий ланцюг, використовували 04Н1389-Нт482 (ЗЕО ІО МО: 204) як інший важкий ланцюг та використовували 041 1305-КОМТ (5ЕБО ІО МО: 275) як легкий ланцюг. Експресію антитіла та його очистку здійснювали способом, відомим фахівцям у даній галузі.
Оцінювали цитотоксичну активність іп міо створених антитіл до СТІ А4 з перемиканням класу зі зміненою Ес щодо СТІ А4-позитивних регуляторних Т-клітин (СО3-0040025-00458А:
СТІ А43. Спочатку РВМС людини (СТІ Сгуосопзеглей Нитап РВМС, СТІ) піддавали заморожуванню-розморожуванню і суспендували в 50 одиниць/мл інтерлейкіну 2 ((- 2УВАРМІ/10 95 ЕВ5, так що щільність клітин становила 2 х 105 клітин/мл, і культивували за температури 37 "С протягом 4 днів в інкубаторі з 5 95 СО». Через 4 дні клітини збирали та двічі промивали за допомогою КРМІ/1О 95 ЕВ5, а потім висівали по 100 мкл у кожну лунку 96- лункового планшета з О-подібним дном (8 х 105 клітин/лунка або 5 х 10» клітин/лунка) та в кожну лунку додавали 25 мкл розчину КІ.Н-с1т, доведеного за допомогою КРМІ/10 95 ЕВ5З до 8 мг/мл.
Потім додавали по 25 мкл розчину кожного антитіла, одержаного для кожної концентрації (0, 24, 8, 24 і 80 мкг/мл або 0, 0,8, 8, 80 та 800 мкг/мл) у КРМІ/1О 95 ЕВ5, у кожну лунку 96- лункового планшета з О-подібним дном. Крім того, додавали 50 мкл розчину АТФ, доведеного до 0 або 400 мкМ в КРМІ/10 95 ЕВ5, суміш ретельно суспендували, а потім залишали стояти за температури 37 "С протягом 6 годин в інкубаторі з СОг (5 мкл розчину АТФ, доведеного до 0 або 4000 мкМ, додавали кожні 2 години загалом двічі). Через Є годин РВМС збирали, двічі промивали за допомогою Ашіо МАС5 Кіпзіпд ЗоЇшіоп (МінКепуї), забезпечували реагування з наступними антитілами та аналізували присутні фракції імунних клітин за допомогою ЕАС5- аналізу: реагент для визначення життєздатності (Віоіедепа, 2отбіє Адпа), антитіло до СОЗ (ВО, клон: ОСНТІ), антитіло до СО4 (ВО, клон КРА-Т4), антитіло до СО8 (ВО, клон 5К1), антитіло до
СО045КА (ВіоІедепа, клон НІ100), антитіло до СО25 (ВО, клон 2АЗ), антитіло до СО16 (ВіоІєдепа, клон 308), антитіло до СО56 (Віоієдепа, клон НСО5б), антитіло до СТІ А4 (ВіоІедепа, клон ВМІЗ).
ЕАСб-аналіз виконували за допомогою ВО Ї ЗК Еопезза Х-20 (ВО). Співвідношення СТІ Аа4- позитивних регуляторних Т-клітин у життєздатних клітинах розраховували за кожної концентрації антитіла, а відносну величину, за якої значення за концентрації антитіла 0 приймали за 100 95, визначали як рівень виживання (95) СТІ А4-позитивних регуляторних Т- клітин, і це використовували як індекс за оцінювання цитотоксичної активності кожного антитіла.
Одержані результати показані на фіг. 32 (ЗМУ1389-АКТ5-АСТІ), фіг. 33 (5М/1389-АНТ6-АСТІ), фіг. 34 (БМУ1610-АКТ5-АСТІ) та фіг. 35 (ЗМУ1610-АНТ6--АСТІ1).
Ці результати підтвердили, що цитотоксична активність антитіл до СТІ А4 з перемиканням класу зі зміненою Ес щодо СТІ А4-позитивних регуляторних Т-клітин відрізняється в присутності та за відсутності АТФ, і що спостерігалася АТФ-залежна цитотоксична активність щодо СТІ А4- позитивних регуляторних Т-клітин.
Хоча згадані вище винаходи були докладно описані з посиланнями на графічні матеріали та приклади з метою сприяння ясному розумінню, наведений в даному документі опис та приклади не слід розглядати як такі, що обмежують об'єм даного винаходу. Розкриття всіх цитованих в даному документі джерел патентної та наукової літератури чітко включені в даний документ шляхом посилання.
Промислова придатність
Антитіла до СТІА-4 за даним винаходом та способи їх використання можуть використовуватися у розробці, одержанні, забезпеченні, використанні тощо фармацевтичних препаратів з незначними побічними ефектами, оскільки антитіла за даним винаходом при тому, що вони характеризуються активувальною активністю щодо імунних клітин, цитотоксичною активністю та/або протипухлинною активністю, характеризуються слабким ефектом щодо непухлинних тканин, таких як нормальні тканини. Крім того, поліпептиди, що містять варіант Ес- ділянки за даним винаходом, та способи їх одержання та використовування можуть бути застосовані у розробці, одержанні, забезпеченні, використанні тощо таких фармацевтичних препаратів.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 ЧУГАІЇ СЕЙЯКУ КАБУСІКІ КАЙСЯ «1205 АНТИТІЛО ДО СТІА-4 ТА СПОСОБИ ЙОГО ВИКОРИСТАННЯ «1305 С1-А1927рР «1605 Щ Ж278 «1705 РабепсІпПп версія 3.5 «2105 1 «2115 188 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» СТІАЯ «4005 Ж 1
Меє Аїа Сув геш с1у Рпе сіп Агуд Ні їув Аза сіп Гей Ап тей А1а 1 З 10 15
ТЕ Агуд ТпПс Тер Рго Сув ТПг Гей Гей Рпе Рпе Гей Гей РобПе І1е Рго 20 25 зо уаї Рпе Сув пув Аза Меє Нів Уаї Аза біп Рго Аїа Уаї Уаї тей А1а 35 40 45 зек Бек Агуд сіу Іїе Аїа Бек Рпе Уаії Сув біц Туг Аїа бек Рго с01Уу
ЗО зо бо пув Аїа ТПг біц Уаі Агу Уа1і ТПг Уаї гец Агуд біп Аїа Авр Бек сіп 65 7о 75 80 уаї тПгЕ біц уаї Сув Аїа Аїа ТПг Ту Меє Меєсє сіу Авп сій Гей ТПг 85 90 95 бо Рпе гей Авр Авр Бек І1е Сув ТПг біу ТПг Бек Бек с1у Авп сіп Уаї 100 105 110
Авп оГпей ТПг о І1е біп с1у тей Агу А1ї1а Меє АБр ТПпПг с1у Іей Тук Ше 115 120 125
Сув пув Уа1 сіц Гец Мес Тук Рго Рго Рго Туг Тугк гей с1у І1е с01У 130 135 140
Авп осіу ТПг біп І1е Ту Маї І1е АБр Рго бій Рго Суб Рго АБр б5ег 145 150 155 160
АБвр Рпе Нів Нів Нів Нів Нів Нів сіу сб1у сб1у с1у Бек б1у Гей Авп 165 170 175
Авр чІ1е Рпе сіц Аза біп ув І1е сій Тер НівБ с1ц 180 185 «2105 2 «2115 20 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Праймер
Зо «4005 2 сдсаасдсаа ЕєЄааєдсдад 20 «2105 3 «2115» 21 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Праймер «4005 з
ЕдадеЕсссас дасассдесса с 21 «2105 14 «2115 122 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005 4 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у б1у Авр Ггецш Уаі пув Рго сіу с01У 1 З 10 15 сіу Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Тукг 20 25 30 60
ТП Меє Нів Тер Уаії Агуд біп Аз1а Рго с1у Ппув с1у гейш сій Тер Уаї 35 40 45 зек век І1е бБег б5Бег Агуд Бег Агуд Тук Ппув Туг Тугк А1ї1а АБвр 5ег Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Рпе с1у І1е пув АвБп ув Агуд Авп Тер Уа1і Іей Авр Туг Тер 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 «2105 15 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 5 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув ТПг с1у ТПг Бек ТПг Авр Уаі1і с1у Аїа Туг 20 25 30
АБп оТтук Маї Бек Тер Тук біп сіп Нів Рго сб1у Ппув Аїа Рго Ппув Гей 35 40 45
Мес чІ1е Ту біп Уаії Бек пув Агуд Рго Бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе зо зо бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа бій Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув Бек Гец Тук ТПг ТПг Агд 85 90 935
Рго біп гей А1їа Рпе с1у б1у б1у ТПпг пуб Гей ТПг Уаї Іец 100 105 110 бо «2105 6 «2115 122
«2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 б сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у б1у Авр Ггецш Уаі пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 с1у Гей Агуд Гецш Бек Сув Аїа Аза Бек с1у Рпе ТПг Рпе Бек Бек Туг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек Бек Агуд Бек ТПг Туг Аїа Ні Туг Аза Авр Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Агуд Рпе сі1у б1у Агуд с1у Нів тей Ггецш Тгр Уаї Рбе Авр Туг Тер 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 «2105 17 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 7 сіп Бек А1їа еп ТПг о сбіп Рго Рго Бек Аїа Бек біу Бек Рго 0Ш1у с1іп 1 5 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув ТПг с1у ТПг Бек ТПг Авр Уа1ї б1у ТПпг Туг 20 25 30
Ап оТук Маї Бек Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув АТа Рго Ппув Іей 35 40 45
Мес ч1І1е Ту біп с1у Бек пув Агуд Рго Бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе 50 55 бо 60 зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец
65 70 75 80 сіп Аїа бій Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув Бек ТПг Уаї Бек с01у Авр 85 90 935
Рпе Нів Уаї Аїа Рпе б1у с1у с1у ТпПг пув Гей ТПг Уаї Іей 100 105 110 «2105 8 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієпв «4005 8 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у б1у Авр Ггецш Уаі пув Рго сіу с01У 1 З 10 15 сіу Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек с01у Тукг 20 25 30
ТП Меє Нів Тер Уаії Агуд біп Аз1а Рго с1у Ппув с1у гейш сій Тер Уаї
Зо зек Бек Іїе Бек Бег Агуд Бек Агуд Туг Аїа Бек Туг Аїа Авр Бек Уаї бо 35 пув б1у Агд Рпе ТПг І1їе 5Бег Агуд Авр АБп Аїа їув АБп Бек Іецч Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 40 85 90 935
Аза Агуд Рбе сіу І1е їув АБп о Нів Гей Авп Тер Уа1! Рбпе Авр Туг Тгр 100 105 110 45 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 50 «2105 13 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь 55 «4005 19 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15 60
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув ТПг с1у ТПг Бек Бек Авр Уа1 б1у АБр Туг 20 25 30
АБп оТтук Маї Бек Тер Тук біп сіп Нів Рго сб1у Ппув Аїа Рго Ппув Гей 35 40 45
Мес чІ1е Тук б1у Маії Бек пув Агуд Рго Бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе зо 55 бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа бій Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув Бек ТПг Уаї Бек ТПг 5ег 85 90 935
Нів Бек Рго Маі1 Рпе сіу с1і1у б1і1у ТПг пув Гей ТПг Уаї1ї Ієц 100 105 110 «2105 10 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 10 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у б1у Авр Ггецш Уаі пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 с1у тей Агд Гей Бек Сув Аза Аза Бек сіу Рпе ТПг Рпе бБег бБег Нів 20 25 30
ТПгЕ Меє Авп Тер Уа1! Агуд біп Аїа Рго сіу Ппув б1у Гей сій Тгр Уаї 35 40 45 зек Бек Іїе Бек Бек Агуд Бек б1іу Тук Іїе Тук Туг Аїа Авр Бек Уаї зо 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 бо сіу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек бБег 115 120
«2105 11 «2115» 110 «212» БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 11 сіп Бек А1їа еп ТПг о сбіп Рго Рго Бек Аїа Бек біу Бек Рго 0Ш1у с1іп 1 5 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув ТПг с1у ТПг Бек ТПг Авр Уа1ї б1у АБр Туг
Ап оТук Маї Бек Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув АТа Рго Ппув Іей 20
Мес чІ1їе Ту біц ТПг Бек пув Ппув Рго Бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе бо 25 зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 30 сіп Аїа б1ц Авр сій АтТа Авр Тукг Рпе Сув Бек ТПг Туг Аїа Аїа Рго 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 35 100 105 110 «2105 12 «2115 122 40 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 12 45 сі Уаї бі1п Гецп УМаї бійц бек сб1у с1у Авр тей Уаї Ппув Рго С1у с1У 1 5 10 15 сіу Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек с01у Тукг 50 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 55 зек Бек Іїе Бек Бег Агуд Бек Авп Туг Іїе Бек Туг Аїа Авр Бек Уаї 50 55 бо 60 пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг
65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Агуд Тук б1у Аїа тец АБп о Нів Меє гей Тер Уа1! Рбе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 «2105 13 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 13 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув ТПг с1у ТПг Бек ТПг Авр Уаі1і с1у Аїа Туг 20 25 30
Зо
Ап оТук Маї Бек Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув АТа Рго Ппув Іей 35 Меє чІ1їе Туг бек ТПг б5Бекг Пув Агуд Рго Бек бі1у Уаії Рго Авр Аг РіПе бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 40 65 70 75 80 сіп Аїа біц Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув Бек Гец Туг Агуд Туг Аї1а 85 90 935 45 сіп с1і1у Уа1 Уа1 Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 50 «2105 14 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь 55 «4005 14 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у б1у Авр Ггецш Уаі пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 60 сіу Гей Агуд Гей Бек Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек ТПг тТукг 20 25 30
ТПпг Меє Нів Тер Уа1 Агуд біп Аїа Рго сіу Ппув б1у Гей сій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек Бек Агуд Бек сіу Нів Аїа Ні Туг Аза Авр Бек Уаї зо 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Агд Рпе с1у Агд пув пув пув Агуд тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек бБег 115 120 «2105 15
Зо «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 15 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15
ТПг Маї ТПг І1е Бек Сув ТПг с1у ТПг Бек ТПг Авр Уаї сі1у Рпе тус 20 25 30
Ап оТук Маї Бек Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув АТа Рго Ппув Іей 35 40 45
Мес чІ1е Тук біп Авп Бек пув Агуд Рго Бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе бо 50 зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 55 сіп Аїа бій Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув Бек ТПг Ап Агуд Аїа Аїа 85 90 935 бо Агуд Бек Маї Аїа Рпе с1у с1у с1у ТПг пув Гей ТПг Уаї Гей 100 105 110
«2105 16 «2115» 116 «212» БІЛОК «213» ВБаєсив погуедісцв «4005 16 сіп Уа1ї бі1іп Гешп сіп сій Бек с1у Рго с1у Геп Уа1! Ппув Рго Бек с01ци 1 5 10 15
ТПг гей бек Гей ТПг Сув ТПг Уаії Бек с1у Туг Бек І1е бБег бБег ШУ
Тук б1у Тгр АвБп Тгр ч11е Агуд сіп Рго Рго сіу пув с1у Гей бій Тгр 20
І1е с1у Рпе І1е Туг Ту бій б1у Бек ТПг Туг Туг АБп Рго Бек Ше бо 25 пув Бек Агуд Іїе Бек Іїе ТПг Агуд Авр ТПг Бек Ппув АБп о біп Рпе РПе 65 70 75 80 30 пе біп Уаї Авп Бек Уа1! ТПг тТПг біц Авр ТБг Атїа ТПг Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Агуд біп ТП с1у Тук Рпе Авр Туг Тгр б1у біп с1іу ТПг Іец Уаї1ї 35 100 105 110
ТПг Уаї Бек 56г 115 40 «2105 17 «2115 113 «2125 БІЛОК 45 «213» Ваєбив погуедісив «4005 17
Авр І1е УМаї Меє ТПг біп Бек Рго Авр Бек Іей Аза Уаї Бек їешй Щ1Уу 50 1 З 10 15 сій Агуд Аїа ТпПг І1е АвБп о Сув Ппув Бек Бек біп Бек Гец Рпе Ап 5ег 20 25 30 55
Авп о Аїа пув ТПг Авп Ту гей АвБп Тер Туг біп біп ув Рго 1у біп 35 40 45 60
Рго Рго Ппув Іец Іец І1е Туг Туг АТїа Бек ТПг Агуд Нів ТПг с1у Ууаї
50 55 бо
Рго АБр Агуд Рпе Бек біу Бек бі1іу Бек б1у ТПпг АвБр Рпе ТПг Іецй ТПг 65 70 75 80
І1е Бек Бек гей біп А1ї1а б1й Авр Уаії Аза Уаї Туг Тугк Сув біп сбіп 85 90 935
Тер Тук Авр Тук Рго Тук ТПг Рпе сіу Аїа сіу ТПг пув Уаї сій І1е 100 105 110
Туз «2105 18 «2115» 330 «2125 БІЛОК «2135» Мив шивси1ив «4005 18
Аза пув ТПг ТПг Аза Рго Бек Маї Туг Рго Іїей Аза Рго Уа1ї Сув ЩУ 1 5 10 15
Зо
Авр ТПг о ТПг обіу Бек Бек Ма1і ТПг Іїейш б1у Сув Гей Уа1ї пув сО1у Туг 20 25 30
Рпе Рго біц Рго Уаї ТПпг Гей ТПг Тер Авп о бБег сіу Бек Пец бБег 5Бег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сіп Бек Авр Іїецй Туг ТПг Іецй зо зо бо зек Бек Бек Уа1 ТПг Уа1 ТПг Бек Бек ТПг Тер Рго Бек біп Бек І1е 65 70 75 80
ТП Сув Авп о Уа1ї Атїа Нів Рго А1їа бек Бек ТПг пув Ма1 Авр Гпув Гув 85 90 935
І1е бій Рго Агуд б1у Рго ТПпг І1е Губв Рго Сув Рго Рго Сув Кув Сув 100 105 110
Рго АТїа Рго АБп Ге Гей с1у с1у Рго Авр Уаї Рпе І1е РПе Рго Рго 115 120 125 пув Іїе Ппув Авр Уаії Ггец Мес Іїе Бек Гец Бек Рго І1їе Уаії ТПг Сув бо 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек біц Авр Авр Рго Авр Уаії сіп ч11е Бек Тгр 145 150 155 160
Рпе Уаї АвБп АвБп Уаї біц Уаї Нів ТПг АТа сбіп ТПг сіп Тбг Нів Агд 165 170 175 січ Авр Тук Авп Бек ТПг тей Агуд Уаї Уаї Бек Аїа їец Рго ІчІ1е с1іп 180 185 190
Нів біп Авр Тер Месє Бек б1у пув сій Рпе пув Сув пув Уаї АвБп Авп 195 200 205 гув Авр Гец Рго Аїа Рго ІчІ1їе біц Агуд ТПг І1е Бек пув Рго пуб с01Уу 210 215 220 зек Уаі1 Агуд Аїа Рго сСіп Уа1і Тук Уаї Ггец Рго Рго Рго біц сбіц с1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув пув біп Уаі ТПг Ггецп ТПг Сув Меє Уаї ТПг Авр Рпе Меє 245 250 255
Рго бій Авр І1е Тук Маї сій Тер ТПг АвБп о Авп о с1у пув Тс сб1іц Гей 260 265 270
Авпотук пув АвБп ОТГ бій Рго УМаії Іей Авр Бек АвБр бі1у Бек Тук РПе 275 280 285
Мес Тук Бек пув Ггец Агуд Уаі біцш пув пув Авп о Тгр Уаї сій Агд Авп 290 295 300 зек Тук Бек Сув Бек уа1ї Уа1 Нів сіц сі1у тец Нів АБвБп Нів Нів ТПпг 305 310 315 320
ТПгЕ пув Бек Рпе бек Агуд ТПг Рго с1УуУу Пув 325 330 «2105 19 «2115» 107 «2125 БІЛОК «2135» Мив шивси1ив «4005 19
Аг Аїа АБр Аїа Аза Рго ТПг Уаї Бек І1е РПпе Рго Рго Бек бек бі1іц 1 5 10 15 60 сіп Гей ТПг Бек сіу сіу Аїа Бек Уаї Уаї Сув Рпе Гец Ап Ап Ріє
20 25 30
Тук Рго пув Авр ч1І1е АвБп Уаї пув Тгр ув І1е АБр б1у Бек бій Агд 35 40 45 сіп Ап обіу Уаі1і Гей Ап Бек Тер ТПг Авр біп Авр Бек Пув Авр 5Бег 50 55 бо
ТПг Тук Бек Меє бек Бек ТПг Гей ТПг Гей ТПпг ув Авр бій Ту б1ц 65 70 75 80
Агуд Нів АвБп о Бек Тук ТПг Сув бій АтТа ТПг Нів пуб ТПг Бек ТПг 5Бег 85 90 935
Рго І1їе Уа1 пув Бек Рпе Авп Агд АвБп сій Сув 100 105 «2105 20 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 20
Зо сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у б1у Авр Ггецш Уаі пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 с1у Гей Агуд Гецш Бек Сув Аїа Аза Бек с1у Рпе ТПг Рпе Бек Бек Аг4д 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зек Бек Іїе Бек ТПг Агуд Бек б1іу Тук Іїе Тук Туг Аїа біц Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Агуд тує б1у ув Агуд б1й1 Авр Меє Гей Тер Уа1 Рбпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 60 115 120
«2105 21 «2115» 110 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «005» 21 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув Авр б1у Рго Бек ТПпг б1у Уа1 с1у АвБр Туг 20 25 30
Ап оТук Маї Нів Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув Аза Рго Ппув Іей 35 40 45
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе 50 55 бо
Зек біу Бек Ппув Бек с1у АБп ТПг Аїа Бек Гей ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа біц Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув біп ТПг Туг Аза Аїа Рго
Зо 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 «2105 22 «2115» 106 «2125 БІЛОК «213» Мив шивси1и5 «4005 ЩД 22 сіу біп Рго Ппув Бек Бек Рго Бек Уаї ТПг Гец Рпе Рго Рго Бек 5ег 1 5 10 15 сі бій Ге сбіц ТПг АвБп о пув АТїа ТПг о Гец Уаї Сув ТПг І1е ТПг АБр 20 25 30
Рпе Тук Рго с1у Маї Маї ТПпг Уаї Авр Тгр ув Уаі1і АБр с1у ТПг РгО 35 40 45 уаї тПг біп б1у Мес біц ТП ТП обіп Рго Бек Ппув сіп бек Авп Авп 50 55 бо бо пув Тук Мес Аїа Бек Бек Туг Ггецп ТПг Гей ТПг Аза Агуд Аза Тер с1и 65 70 75 80
Агуд Нів Бек Бек Туг Бек Сув біп Уа1ї ТП Нів сіц сіу Нів ТПг Уаї 85 90 935 сій Ппув Бек Гец бБег Агуд Аїа Авр Сув Бекг 100 105 «2105 23 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 23 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зек век І1їе Бек ТПг Агуд Бек с1іу Туг І1е Туг Туг Аї1а Агд 5Бег Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 «2105 24 «2115 111 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 24
Авр І1е УМаї Меє ТПг біп Бек Рго Іеий Бек тей Рго Уаі ТПпг Рго Щ1У 1 5 10 15 60 бій Рго Аїа Бек Іїе Бек Сув Авр біу Рго Бек ТПг Авр Уаї 01У Авр
20 25 30
Тук Авп Тер Уаї Нів Тер Ту бі1іп сбіп пув Рго с1у сіп Аза Рго Агд 35 40 45
Теч Геп Іїе Тук Тук ТПг Бек Бек Ппув Рго біц сіу Уаї Рго Авр Агд 50 55 бо
Рпе Бек біу Бек б1і1у Бек б1у ТПг Авр Рпе ТПг Іїей Гув І11е б5Бег Аг4д 65 70 75 80 уаї бі Аза біц Авр Уаї сіу Ма1і Тук Тук Сув сіп ТПг Туг Аї1а А1а 85 90 935
Рго пейш с1у Рго ТПг Рпе с1у біп сб1у ТПг Ппув Гей ТПг Уаї Гей 100 105 110 «2105 25 «2115» 356 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» СТІА4 «4005 25 сі Атїа ч11е сбіп Уаї ТПг біп Рго Бек Уа1ї Уа1ї тей Аза Бек БбБег Нів 1 З 10 15 сі1у Уаї А1їа Бек Рпе Рго Сув сій Тук Бек Рго Бек Нів АвБп ТПг Авр 20 25 30 сій Уаі1 Агуд Уаі1 ТпПг Уаі1і Ггец Агуд біп ТПг Авп Авр біп Мес ТПг с1іц 35 40 45 уаї Сув Аїа ТПг ТПгЕ Рпе ТПг біц пув Авп о ТПг о Уаї с1і1у Рпе Гей Авр бо 50 Тук Рго Рпе Сув Бек б1у ТПг Рпе Авп о біц Бек Акуд Уа1 АвБп ей ТПг 65 70 75 80
І1е біп с1у гей Агу А1ї1а Уаї Авр ТпПг с1у Гей Тук Гей Сув Гув Уаї1ї 55 85 90 935 сій Геп Меєсє Тук Рго Рго Рго Тук Рпе Уаї сіу Мес с1у АвБп с1у ТПг 100 105 110 60 сіп І1їе Тук Уаі1ї І1їе АвБр Рго біц Рго Сув Рго Авр Бек Авр Ропе Авр 115 120 125
І1е сіц б1у Агд Меє АБр с1у Сув Ппув Рго Сув ІчІ1е Сув ТПг Уаї Рго 130 135 140 сій Уаі1 Бек Авр Уаі1і Рпе Іїе Рпе Рго Рго Пув Рго Пув Авр Уаї Гец 145 150 155 160
ТПгЕ І1е ТПг гей ТПг Рго пув Маї ТПг Сув Уаї Уаї Уаї АБр І1е 5ег 165 170 175 гув Авр Авр Рго сіц Уаі1 сіп Рпе Бек Тер Рпе Уаї АвБр Ар Уаї с1ци 180 185 190 уаї Нів ТпПг АТа сбіп ТПг о біп Рго Агд бій бій біп Рпбе Авп Бек ТЕГ 195 200 205
Рпе Аг Бек Уаї Бек бій Гей Рго І1е Мес Нів сіп Авр Тгр Гей Авп 210 215 220 сіу пув біц Рпе Ппув Сув Агуд Уаі Авп бБег Аїа Аїа Рпе Рго Аїа Рго 225 230 235 240
І1е бій пув ТПг о І1е Бек пув ТПпг пув б1у Агуд Рго їув Аза Рго сіп 245 250 255 уаї Тук ТПг І1їе Рго Рго Рго пув бій сіп Меє Аїа пув Авр Гпувз Уаї 260 265 270 зек Гей ТПг Сув Мес Іїе ТПг Ар Рпе Рпе Рго біц Ар І1е ТПг Уаї 275 280 285 сій Тер бі1п Тер Авп с1у біп Рго Аїа сій Авп Туг пув Авп ТПпгс с1іп 290 295 300
Рго І1е Меє АБр ТПг АвБр б1у Бек Тугк Рпе Уаі1ї Туг Бек Ггув Іецй Авп 305 310 315 320 уаї біп пув Бек Авп Тгр біц Аїа сіу Авп ТПг Рпе ТПг Сув Бек Уаї 325 330 335
Ттец Нів бій с1у гейш Нів Авп Нів Нів ТПг біц пув Бек Іецй бБекг Нів 340 345 350 60 зек Рго с1у Гув
«2105 26 «2115» 118 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 26 сіп Уаі1 сбіп Гец Уаі сіц Бек сі1у сіу сіу Уаї Уаї біп Рго с01у Агд 1 5 10 15 зек гей Агд Гей бБег Сув Аїа Аїа бек с1іу Ропе ТПг Рпе бБег б5Бег Туг
ТП Меє Нів Тер Уаії Агуд біп Аз1а Рго с1у Ппув с1у гейш сій Тер Уаї 20 35 40 45
ТПЕ Рпе І1е бек Туг Авр сіу Авп Авп пув Туг Туг Аїа Авр Бек Уаї 50 55 бо 25 пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр Ап Бек Пув Ап о ТПг Гец Туг 65 70 75 80
Зо тей біп Мес Ап бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза чІ1е Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Акгуд ТПг о б1іу Тер Гецш с1у Рго Рпе Авр Туг Тер С1у біп с1у ТІПг 100 105 110
Тїец Уаї ТПг Уаї 5Бег 5ег 115 «2105 27 «2115» 108 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 27 січ І1е Уаї Гей ТПг біп Бек Рго с1у ТПг ІТей Бек Гей Бек Рго с1Уу 1 5 10 15 сій Агуд Аїа ТпПг Гей бБег Сув Агуд Аїа Бек біп Бек Уаї сіу Бек Бег 20 25 30
Тук гей Аїа Тгр Ту сіп біп пув Рго бі1у біп Аз1а Рго Агуд Іецй Іецй 35 40 45 60
І1е Тук б1у А1їа Рпе Бек Агуд Аїа ТпПг б1у І1е Рго АБр Агуд РПпе 5ег 50 55 бо сі1у Бек б1у Бек б1у ТПг Авр Рпе ТПг Пец ТПг І1е Бек Агд Ге с1и 65 70 75 80
Рго бій АвБр Рпе А1їа Маї Туг Туг Сув біп біп Тук с1у Бек Бек Рго 85 90 935
Тер ТПгЕ Рпе сіу сіп сіу ТПг пув Маї бій тІ1е пув 100 105 «2105 28 «2115 127 «2125 БІЛОК «213» Ното варієпв «4005 28 пув Аза Меє Нів уаї Аїа сбіп Рго Аза Уаї Уаї Іецш Аза бБег бБег Аг4д 1 З 10 15 сіу Іїе Аїа Бек Рпе Уаі1 Сув сбіц Туг Аїа Бек Рго б1у Ппув Аїа ТПг 20 25 30
Зо сій Уаі1 Агуд Уаі1 ТПпг Уаі1і Ггец Агуд біп Аза Авр Бек біп Уаії ТПг с1ц 35 уаї Сув Аїа Аїа ТПг Тук Месє Мес сіу Авп сій Гей ТПг Рпе Гей Авр бо 40 АБвр Бек І1е Сув ТПг с1у ТПг Бек Бек б1у Авп біп Уа1 АвБп Гей ТіПг 65 70 75 80
І1е біп с1у гей Агу А1ї1а Меє Авр ТпПг с1у Гей Тук Іїе Сув ПГув Уаї1ї 45 85 90 935 сій Геп Меєсє Тук Рго Рго Рго Туг Тук Гец С1у І1їе С1у АБп с1у ТПг 100 105 110 50 сіп І1їе Тук Уаі1ї Іїе АвБр Рго біц Рго Сув Рго Авр Бек Авр РПе 115 120 125 55 «2105 29 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь 60 «4005 29 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Меє Авп Тер Уа1! Агуд біп Аїа Рго сіу Ппув б1у Гей сій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї зо 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек бБег 115 120 «2105 30 «2115 111 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 30
Авр І1е УМаї Меє ТПг біп Бек Рго Іеий Бек тей Рго Уаі ТПпг Рго Щ1У 1 5 10 15 сій Рго А1ї1а Бек І1їе Бек Сув Авр б1у Рго Бек ТПг с1у Уаї 01Уу Авр 20 25 30
Тук Авп Тук Уаї Нів Тер Ту бі1іп сбіп пув Рго с1у сіп Аза Рго Агд 35 40 45
Теч Геп Іїе Тук Рпе ТПг Бек Ппув Ппув Рго Бек біу Уаї Рго Авр Агд 50 55 бо
Рпе Бек біу Бек б1і1у Бек б1у ТПг Авр Рпе ТПг Іїей Гув І11е б5Бег Аг4д 65 70 75 80 60 уаї бі Аза біц Авр Уаї сіу Ма1і Тук Тук Сув сіп ТПг Туг Аї1а А1а
85 90 935
Рго Пец б1у Рго Меє Рпе б1у біп б1у ТПг Гув Іїей бій Іїе Гув 100 105 110 «2105 31 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 31
А1їа бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаії Рпе Рго Гей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо
Зо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук чІ1е Сув Авп Уаі1! Авп оНів Ппув Рго Бек АвБп ТПг Ппув Уаі1ї! Авр Гувг 85 90 935 пув Ммаї бій Рго пув Бек Сув Авр пуб ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій Ту біп Тер б1у Рго Меєс Уаі1ї Рпе Іей Рпе Рго РгО 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр ТПг Гец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек Авр бій бій Рго сій УМаї Ппув Рпе Авп Тгр 145 150 155 160 тук Маї Авр с1у Уаї сбіц Маї Нів Авп Аїа пув ТпПг пув Рго Агд б1и 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец ТПг Уаї Гец 60 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205 пув Аїа Гецп Рго Аїа Рго ІчІїе біцш Ппув ТПг І1е Бек пув Аїа пув с01У 210 215 220 б1п Рго Агд бій Рго біп Уа1ї Сув ТПг пе Рго Рго Бек Агд АБр б1и 225 230 235 240 теп ТПпг пув АвБп обіп Уаі1! Бек Гец Тер Сув Гец Уаї Ппув с1у РПпе Тукг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 мМма1 Рпе Бек Сув Бек Уа1ї Мес Нів сій Аїа тей Нів Авп Нів Туг ТПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гец Бек Гец Бек Рго 325 «2105 32 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 32
А1їа бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаії Рпе Рго Гей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо 60 тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг
65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935 пув Ммаї бій Рго пув Бек Сув Авр пуб ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей тей б1у б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр ТПг Гец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 мМа1т1 уаї Маї Авр Уаї Бек Нів біц сій Рко біц Маї Ппув Рпе АвБп Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп Туг Авп о Бек ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец ТПг Уаї Гец 180 185 190
Зо
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр А1їа гей Рго Меє Рго І1е бій бій ТПпг І1е Бек їгув Аї1а їув Щ1Уу 210 215 220 б1п Рго Агд бій Рго біп Уа1 Тук ТПг Пец Рго Рго Бек Агд Сув б1и 225 230 235 240 теп ТПпг пув АвБп обіп Уаі1! Бек Гец Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у РПпе Тукг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Уаї1ї Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 бо мМма1 Рпе Бек Сув Бек Уа1ї Мес Нів сій Аїа тей Нів Авп Нів Туг ТПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гец Бек Гец Бек Рго «2105 33 «2115» 107 «2125 БІЛОК «213» Ното варієпв «4005 33
Ага ТПг оУаї Аза Аза Рго Бек Маі Рпе І1е РПпе РгОо Рго Бег АБр б1ц 1 З 10 15 сіп Гей Ппув Бек сіу ТПг Аїа Бек Уаї Уаї Сув Ггец Гец Ап Ап РіПе 20
Тук Рго Агуд сій Аїа пув Маї біп Тгр ув Маії АвБр АБп Аза Іецй сіп 25 зек б1у АвБп Бек біп сіц Бек Уаї ТПг біц біп Авр Бек Пув Авр 5Бег бо 30 ТПг Ту Бек Пец Бек Бек ТПг Гей ТПг Гей б5Бег Ппув Аза Авр Туг б1ци 65 70 75 80 пув Нів пув уаї Ту Аїа Сув сій Уаї ТПг Нів біп б1у Іецй бБег бег 35 85 90 935
Рго Маї ТПг пув Бек Рпе АБп Агуд сС1у біц Сув 100 105 40 «2105 34 «2115 111 «2125 БІЛОК 45 «213» Ното варієпв «4005 34
Авр І1е УМаї Меє ТПг біп Бек Рго Іеий Бек тей Рго Уаі ТПпг Рго Щ1У 50 1 З 10 15 бій Рго Аїа Бек Іїе Бек Сув біп сбіу Рго Бек ТПг сб1у Уаії 01Уу Авр 20 25 30 55
Тук Авп Тук Уаї Нів Тер Ту бі1іп сбіп пув Рго с1у сіп Аза Рго Агд 35 40 45 60
Теч Геп Іїе Тук Рпе ТПг Бек Ппув Ппув Рго Бек біу Уаї Рго Авр Агд
50 55 бо
Рпе Бек біу Бек б1і1у Бек б1у ТПг Авр Рпе ТПг Іїей Гув І11е б5Бег Аг4д 65 70 75 80 уаї бі Аза біц Авр Уаї сіу Ма1і Тук Тук Сув сіп ТПг Туг Аї1а А1а 85 90 935
Рго Пец б1у Рго Меє Рпе б1у біп б1у ТПг Гув Іїей бій Іїе Гув 100 105 110 «2105 35 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 35 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
Зо
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 Зек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1ї1е Туг Туг А1а Агуд Бек Уаї1ї бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 40 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935 45
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 50 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 55 «2105 36 «2115» 330 «2125 БІЛОК «2135» Мив шивси1ив бо «4005 36
Аза пув ТПг ТПг Аза Рго Бек Маї Туг Рго Іїей Аза Рго Уа1ї Сув ЩУ 1 5 10 15
Авр ТПг ТПг о біу Бек Бек Уа1ї ТПпг Гей б1у Сув Гей Уаї пув с1у Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг тей ТПг Тер Авп Бек біу бБег Гей бБег бег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сіп Бек Авр Іїецй Туг ТПг Іецй 50 55 бо зек Бек Бек Уа1 ТПг Уа1 ТПг Бек Бек ТПг Тер Рго Бек біп Бек І1е 65 70 75 80
ТП Сув Авп о Уа1ї Атїа Нів Рго А1їа бек Бек ТПг пув Ма1 Авр Гпув Гув 85 90 935
І1е бій Рго Агуд б1у Рго ТПг чІ1їе Ппув Рго Сув Рго Рго Сув пув Сув 100 105 110
Рго А1їа Рго АБп тей тей б1у б1у Рго АвБр Уаі Рпе Іїе Рпе Рго РгО
Зо 115 120 125 пув Іїе Ппув Авр Уаії Ггец Мес Іїе Бек Гец Бек Рго І1їе Уаії ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек біц Авр Авр Рго Авр Уаії сіп ч11е Бек Тгр 145 150 155 160
Рпе Уаї АвБп АвБп Уаї біц Уаї Нів ТПг АТа сбіп ТПг сіп Тбг Нів Агд 165 170 175 січ Авр Тук Авп Бек ТПг тей Агуд Уаї Уаї Бек Аїа їец Рго ІчІ1е с1іп 180 185 190
Нів біп Авр Тер Месє Бек б1у пув сій Рпе пув Сув пув Уаї АвБп Авп 195 200 205 гув Авр Гец Рго Аїа Рго ІчІ1їе біц Агуд ТПг І1е Бек пув Рго пуб с01Уу 210 215 220 зек Уаі1 Агуд Аїа Рго сСіп Уа1і Тук Уаї Ггец Рго Рго Рго біц сбіц с1ц 225 230 235 240 60
Мес тПпг пув пув біп Уаі ТПг Ггецп ТПг Сув Меє Уаї ТПг Авр Рпе Меє
245 250 255
Рго бій АБвр чІ1е Ту Маї бій Тер ТПпг АвБп Авп б1у Гув ТпПг бій Іецй 260 265 270
Авпотук пув АБп ОТГ бій Рго Уаі Іей Агуд Бек АвБр бі1у Бек Тук РПе 275 280 285
Мес Тук Бек пув Ггец Агуд Уаі біцш пув пув Авп о Тгр Уаї сій Агд Авп 290 295 300 зек Тук Бек Сув Бек уа1ї Уа1 Нів сіц сі1у тец Нів АБвБп Нів Нів ТПпг 305 310 315 320
ТПгЕ пув Бек РібПе Бек Агуд ТПг Рго с1Уу Гув 325 330 «2105 37 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 37
Зо сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У 1 5 10 15 зек гей Агд Гей бБег Сув Аїа Аїа бек біу Рпе ТПг Рпе Бек 5Бег Гпув 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Акуд Туєк б1у А1ї1а Агуд бій Авр Меє Ггецш Тгр Уаї Рбе Авр Туг Тер 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 60 115 120
«2105 38 «2115» 330 «2125 БІЛОК «213» Мив штивси1ив «4005 38
Аза пув ТПг ТПг Аза Рго Бек Маї Туг Рго Іїей Аза Рго Уа1ї Сув ЩУ 1 З 10 15
Авр ТПг о ТПг обіу Бек Бек Ма1і ТПг Іїейш б1у Сув Гей Уа1ї пув сО1у Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг тей ТПг Тер Авп Бек біу бБег Гей бБег бег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сіп Бек Авр Іїецй Туг ТПг Іецй 50 55 бо
Зек Бек Бек Ма1! ТПг Уа1! ТПг Бек Бек ТПг Тгр Рго Бек біп Бек І1е 65 70 75 80
ТП Сув Авп о Уа1ї Атїа Нів Рго А1їа бек Бек ТПг пув Ма1 Авр Гпув Гув
Зо 85 90 935
І1е бій Рго Агуд б1у Рго ТПпг І1е Губв Рго Сув Рго Рго Сув Кув Сув 100 105 110
Рго А1їа Рго АБп тей тей б1у б1у Рго АвБр Уаі Рпе Іїе Рпе Рго РгО 115 120 125 пув Іїе Ппув Авр Уаії Ггец Мес Іїе Бек Гец Бек Рго І1їе Уаії ТПг Сув 130 135 140 ма1т1 уаї Маї Авр Уаї Бек б1ш Авр Авр Рго Авр Уаї сбіп І1е Бек Тгр 145 150 155 160
Рпе Уаї АвБп АвБп Уаї біц Уаї Нів ТПг АТа сбіп ТПг сіп Тбг Нів Агд 165 170 175 сій Авр Туг Ап бек ТПг Гец Агуд Уаї Уаї Бек Аїа Гец Рго І1е сіп 180 185 190
Нів біп Авр Тер Месє Бек б1у пув сій Рпе пув Сув пув Уаї АвБп Авп 195 200 205 60 гув Авр Гец Рго Аїа Рго ІчІ1їе біц Агуд ТПг І1е Бек пув Рго пуб с01Уу
210 215 220 зек Уаі1 Агуд Аїа Рго сСіп Уа1і Тук Уаї Ггец Рго Рго Рго біц сбіц с1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув пув біп Уаі ТПг Ггецп ТПг Сув Меє Уаї ТПг Авр Рпе Меє 245 250 255
Рго бій АБвр чІ1е Ту Маї бій Тер ТПпг АвБп Авп б1у Гув ТпПг бій Іецй 260 265 270
Авпотук пув АвБп ОТГ бій Рго УМаії Іей Авр Бек АвБр бі1у Бек Тук РПе 275 280 285
Меє Тугк б5Бек біц Гей Агуд Уаії біш пув Ппув АБвп Тгр Уаії бій Аг Авп 290 295 300 зек Тук Бек Сув Бек уа1ї Уа1 Нів сіц сі1у тец Нів АБвБп Нів Нів ТПпг 305 310 315 320
ТПгЕ пув Бек Рпе бек Агуд ТПг Рго с1УуУу Пув 325 330
Зо «2105 39 «2115» 110 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005 39 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15 зек Уа1 ТПг Іїе Бек Сув біц с1у Рго Бек ТПг сіу Уаї с1у Авр Тукг 20 25 30
Ап оТер Уаї Нів Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув АТа Рго Ппув Іей 35 40 45
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе 50 55 бо
Зек біу Бек Ппув Бек с1у АБп ТПг Аїа Бек Гей ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа бій АвБр біц Аза Авр Тукг Тук Сув біп ТПг Туг Аза Аїа Рго 60 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 «2105 140 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 40 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15 зек Уа1 ТПг Іїе Бек Сув біц с1у Рго Бек ТПг сіу Уаї с1у Авр Тукг 20
ТпПг Тук Маі1 Нів Тер Тук біп бі1іп Нів Рго б1у Ппув АТа Рго Ппув Іей 25 Меє чІ1е Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго Бек біу Маї Рго Авр Агкд РБПе бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 30 65 70 75 80 сіп Аїа бій АвБр біц Аза Авр Тукг Тук Сув біп ТПг Туг Аза Аїа Рго 85 90 935 35 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 40 «2105 41 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь 45 «4005 41
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 50 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30 55
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 бо с1іу Ма1ї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї Ггецш сіп бек Бек с1у Ге Тук бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935 пув Ммаї бій Рго пув Бек Сув Авр пуб ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій Ггеш Гей Аїа с1у Рго Авр Уаї Рпе Іїей РпПе Рго Рго 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр ТПг Гец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц Авр Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175
Зо сі біп Туг Авп о Бек ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец ТПг Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тер Гей АвБп осіу пув бій Тук пув Сув пув Уа1ї! Бек Авп 195 200 205 пув Аїа Гецп Рго Аїа Рго біц біц Ппув ТПг І1е Бек пув Аїа пув с01У 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бег Агд АБр б1ц 225 230 235 240 теп ТПпг пув АвБп обіп Уаі1! Бек Гец ТПг Сув Гец Уаї Ппув с1у РПпе Тукг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпоТтук пув ТП ТЕ Рго Рго Уаії Гей Авр бБег Авр сіу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп бо 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гец Бек Гец Бек Рго 325 «2105 42 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 42
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Уаї ТПг Уаї Бек Тгр АБп Бек с1у Аїа тей ТПг 5Бег сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег
Зо зо зо бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 35 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935 40 пув Ммаї бій Рго пув Бек Сув Авр пуб ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110 45 Рго Аїа Рго бій Ггеш Гей Аїа с1у Рго Авр Уаї Рпе Іїей РпПе Рго Рго 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр ТПг Гец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц Авр Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 60 сі біп Туг Авп о Бек ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец ТПг Уаї Гец
180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205 пув Аїа Гецп Рго Гец Рго біц біц Ппув ТПг І1е Бек пув Аїа пув с01У 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бег Агд АБр б1ц 225 230 235 240 теп ТПпг пув АвБп обіп Уаі1! Бек Гец ТПг Сув Гец Уаї Ппув с1у РПпе Тукг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е А1ї1а Уаї сій Тгр бій Бек АвБп о с1іу біп Рго 610 Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300
Зо уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гец Бек Гец Бек Рго 325 «2105 43 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 43
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Уаї ТПг Уаї Бек Тгр АБп Бек с1у Аїа тей ТПг 5Бег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 60 зо зо бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935 пув Маї б1ш Рго Ппув Бек Сув Авр Ппув ТПг Нів ТПг о Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій Рпе біп Тгр б1у Рго Меєс Уаі1ї Рпе Іей Рпе Рго РгО 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек Авр бій бій Рго сій УМаї Ппув Рпе Авп Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп тує АвБп Атїа ТПг Туг Агуд Маї Уаї Бек Уа1ї Ггец Рго Уаї Гей 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго І1е бій гпув ТПг І1е Бек їгув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Сув ТПг Гец Рго Рго Бег Агд АБр б1ц 225 230 235 240 теп ТПпг пув АвБп обіп Уаі1! Бек Гец Тер Сув Гец Уаї Ппув с1у РПпе Тукг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е А1ї1а Уаї сій Тгр бій Бек АвБп о с1іу біп Рго 610 Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 60 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп пув Бек Гецп бБег Гецп б5Бег Рго 325 «2105 144 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 44
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15
Зек ТПг бек б1у с1у ТПг АТїа Аза Ггецш с1у Сув тей Уаї пув Авр Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег бо
Зо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 35 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935 40 пув Маї б1ш Рго Ппув Бек Сув Авр Ппув ТПг Нів ТПг о Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 45 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 50 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160 55
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 бо сі біп тує АвБп Атїа ТПг Туг Агуд Маї Уаї Бек Уа1ї Ггец Рго Уаї Гей 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго пув Рго АБр бій бій Тпг І1е Бек їгув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд Сув б1ц 225 230 235 240 пе ТПг пув Авп обіп Уа1ї Бек Ггец Бек Сув Аїа Уа! пув с1у Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Уаї1ї Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300
Зо уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гей Бек Гей Бек Рго 325 «2105 45 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 45
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15
Зек ТПг бек б1у с1у ТПг АТїа Аза Ггецш с1у Сув тей Уаї пув Авр Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо 60 тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук чІ1е Сув Авп Уаі1! Авп оНів Ппув Рго Бек АвБп ТПг Ппув Уаі1ї! Авр Гувг 85 90 935 пув Ммаї бій Рго пув Бек Сув Авр пуб ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій Рпе біп Тгр б1у Рго Меєс Уаі1ї Рпе Іей Рпе Рго РгО 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек Авр бій бій Рго сій УМаї Ппув Рпе Авп Тгр 145 150 155 160 тук Маї Авр с1у Уаї сбіц Маї Нів Авп Аїа пув ТпПг пув Рго Агд б1и 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец
Зо 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго бій бій гпув ТпПг І1е Бек їгув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Сув ТПг Гец Рго Рго Бег Агд АБр б1ц 225 230 235 240 їпецп Тпг пув Авп обіп Уаї Бек Гей Тгр Сув Гецш Уаї пув б1у Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 60 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг
305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гец Бек Гец Бек Рго 325 «2105 46 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 46
А1їа бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаії Рпе Рго Гей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо
Зо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук чІ1е Сув Авп Уаі1! Авп оНів Ппув Рго Бек АвБп ТПг Ппув Уаі1ї! Авр Гувг 85 90 935 пув Ммаї бій Рго пув Бек Сув Авр пуб ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160 тук Маї Авр с1у Уаї сбіц Маї Нів Авп Аїа пув ТпПг пув Рго Агд б1и 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 60 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго бій бій бій Тпг І1е Бек Ггув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 б1п Рго Агд бій Рго біп Уа1 Тук ТПг Пец Рго Рго Бек Агд Сув б1и 225 230 235 240 теп ТПпг пув АвБп обіп Уаі1! Бек Гец Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у РПпе Тукг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Уаї1ї Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 мМма1 Рпе Бек Сув Бек Уа1ї Мес Нів сій Аїа тей Нів Авп Нів Туг ТПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гец Бек Гец Бек Рго 325 «2105 47 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 47 сі Уаї бі1п Гецп УМаї бійц бек сб1у с1у Авр тей Уаї Ппув Рго С1у с1У 1 5 10 15 сіу Гей Агуд Гей Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Аї1а 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зек Бек Іїе Бек ТПг Агуд Бек б1іу Тук Іїе Тук Туг Аїа Авр Бек Уаї 50 55 бо 60 пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг
65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 «2105 148 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 48 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув Авр б1у Рго Бек ТПг Авр Уа1 б1у АБр Туг 20 25 30
Зо
Ап оТук Маї Бек Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув АТа Рго Ппув Іей 35 Меє чІ1е Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго Бек біу Маї Рго Авр Агкд РБПе бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 40 65 70 75 80 сіп Аїа бій Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув Бек ТПг Туг Аза Аїа Рго 85 90 935 45 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 50 «2105 149 «211» 168 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність 55 «2205 «2235» СТІА4 «4005 49 60
Мес Аїа Сув Ггецшц с1у Ггец Агуд Агуд Ту пуб Аїа сіп Гей сіп Гей Рго
1 5 10 15 век Агуд ТПг Тер Рго Рпе Уаї Аїа Гец Гец ТПг Гец Гец Рпе Ії1е Рго 20 25 30
Ууаї Рпе 5ег бішц Аїа чІ1е сіп Уаї ТПг о біп Рго Бек Уаі1ї Уаї Гей А1їа 35 40 45 зек Бек Нів сіу уаї1ї АТїа Бек Рпе Рго Сув біц Туг Бек Рго бБекг Нів 50 55 бо
Авп оТПг Авр бій Уаї Агуд Уаї Тс Уаї тей Агу біп ТПпг АБп АБр біп 65 70 75 80
Меє тпг біц Маї Сув Аїа ТПг ТПг Рпе ТПг бій пув Авп о Тпгс Уа1 С1У 85 90 935
Рпе Гей Авр Тук Рго Рпе Суб Бек бі1у ТПг Рпе АвБп бій бБег Агу Уаї1ї 100 105 110
Авп оГпей ТПг о ч11е біп с1у гей Агу А1ї1а Уаії Авр ТпПг с1у Гей Тукг Іец 115 120 125
Зо
Сув пув Уа1 сіц Гец Мес Тук Рго Рго Рго Тук Рпе Уаі сіу Меє сщ1У 130 135 140
Авп осіу ТПг біп І1е Ту Маї І1е АБр Рго бій Рго Суб Рго АБр б5ег 145 150 155 160
АБвр Рпе Нів Нів Нів Нів Нів Нів 165 «2105 150 «2115» 188 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» СТІА4 «4005 50
Меє Аїа Сув геш с1у Рпе сіп Агуд Ні їув Азї1а Агуд Гей Ап Тецй А1а 1 З 10 15
ТПгЕ Агуд ТП Агуд Рго Тук ТПг Гей Гей Рпе бек Гей Гей Рпе І1е Рго 20 25 30 60 уаї Рпе Бек пув Аза Меє Нів Уаї Аза біп Рго Аїа Уаї Уаї тей А1а 35 40 45
Ап обБег Агуд біу І1е Аза Бек Рпе Уаї Сув біц Туг Аїа б5ег Рго 01У 50 55 бо пув Аїа ТПг біц Уаі Агу Уа1і ТПг Уаї гец Агуд біп Аїа Авр Бек сіп 65 70 75 80 уаї тПгЕ біц уаї Сув Аїа Аїа ТПг Ту Меє Меєсє сіу Авп сій Гей ТПг 85 90 935
Рпе гей Авр Авр Бек І1е Сув ТПпг бі1іу ТПг Бек Бек с1у Авп сіп Уаї1ї 100 105 110
Авп оГпей ТПг о І1е біп с1у тей Агу А1ї1а Меє АБр ТПпПг с1у Іей Тук Ше 115 120 125
СсСув пув Маї бій пейп Меє Тук Рго Рго Рго Туг Ту Меє С1у І1е с01Уу 130 135 140
Авп осіу ТПг біп І1е Ту Маї І1е АБр Рго бій Рго Суб Рго АБр б5ег 145 150 155 160
Авр Рпе Нів Нів Нів Нів Нів Нів сіу с1у сб1у с1у Бек с1у Гей Авп 165 170 175
Авр чІ1е Рпе сіц Аза біп ув І1е сій Тер НівБ с1ц 180 185 «2105 51 «2115» 116 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» УН «4005 51 сіп Уаі1 сбіп Гец сіп сіп Бек сб1у Рго біп Гец Уаії Агуд Рго с1у Аї1а 1 5 10 15 зек Уаї пув Іїе бек Сув Ппув Аїа бек сіу Туг Бек Рпе ТПг 5Бег Туг 20 25 30
Тер Меє Нів Тер Уаї АвБп о біп Агуд Рго б1у сіп с1у гей бі Тер І1е 60 35 40 45 сіу Меє І1їе Авр Рго Бек Тук Бек біц ТПг Агд Гец Ап о біп Гпув РПе 50 55 бо гув Авр пув Аїа ТПг Гец ТПг о Уаї Авр Ппув Бек Бек Бек ТПг Аїа Тукг 65 70 75 80
Ммеє біп Гей бБег Бек Рго ТПг Бек б1ш Авр Бек Аїа Уаі1ї Туг Тук Сув 85 90 935
А1їа гей Ту б1у Авп Ту Рпе Авр Туг Тгр б1у біп б1у ТПпг ТпПг Іей 100 105 110
ТПг Уаї Бек 56г 115 «2105 ч.Н52 «2115» 107 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» УІ, «4005 52
Авр чІ1е біп Меє ТПг біп Бек Бек Бек Бек Рпе бБег Уаі Бек їешй Щ1Уу 1 5 10 15
Авр Ага Маї ТПг І1е ТПпг Сув ув Аза Бек бій АвБр І1е Туг АБп Агд 20 25 30
Те Аїа Тер Тук біп біп Ппув Рго с1у АБп Аїа Рго Агд Іец Іец Іїє 35 40 45 зек б1у Аїа ТПг Бек Гец біц ТПг сіу Маі Рго Бек Агд Ропе бек с01Уу зо зо бо зек біу Бек с1іу Ппув Авр Тук ТПг Гец Бек Іїе ТПг Бек Гец сіп ТПг 65 70 75 80 сій Авр Уаі1 Аїа ТПг Тук Тук Сув біп біп Тук Тер Бек ТПг Рго Тукг 85 90 935
ТПЕ Рпе сіу сіу сіу ТПг пув Гей бій Уаї Ппув 100 105 бо «2105 153 «2115» 106
«2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» сі «4005 53 сіу біп Рго пув Аїа Аїа Рго Бек Уаї ТПг Гец Рпе Рго Рго Бек 5ег 1 З 10 15 сі бій Ге сбіп Аїа Ап о пув Аїа ТПг о Гец Уаї Сув Гец І1е Бек Авр 20 25 30
Рпе Туг Рго с1у А1ї1а Маї ТПпг Уаі А1ї1а Тер ув Аза Авр бек бек Рго 35 40 45 уаї пув Аїа сіу Маії сбіц ТП ТП ТП Рго бек Ппув сіп бек Авп Авп 50 55 бо пув Ту Аї1а Аза бБег Бек Туг Гей б5Бек пе ТПг Рго бій біп Тер Гув 65 70 75 80 зек Нів Агуд Бек Туг Бек Сув біп Уаї ТПг Нів біц б1у Бек ТПг Уаї
Зо 85 90 935 сій пув ТПпг Уаі1і Аза Рго ТПг біц Сув бБег 100 105 «2105 54 «4005 54 оо «2105 1555 «4005 55 оо «2105 56 «4005 56 оо «2105 157 «4005 57 оо «2105 58 «4005 58 60 оо
«2105 599 «4005 59 оо «2105 60 «4005 60 оо «2105» 61 «400» 61 оо «2105 62 «4005 62 оо «2105 63 «2115» 107 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» СІ, «4005 63
Зо
Ага ТПг оУаї Аза Аза Рго Бек Маі Рпе І1е РПпе РгОо Рго Бег АБр б1ц 1 5 10 15 сіп Гей пув Бек с1у ТПг Аїа Бек Уаї Уаї Сув тей Гей Авп Авп Ріє 20 25 30
Тук Рго Агуд сій Аїа пув Маї біп Тгр ув Маії АвБр АБп Аза Іецй сіп 35 40 45 зек б1у АвБп Бек біп сіц Бек Уаї ТПг біц біп Авр Бек Пув Авр 5Бег 50 55 бо
ТПгЕ Тук Бек Гей бек Бек ТПг Гей ТПг Гей Бек гув Аз1а АБр Туг б1ц 65 70 75 80 пув Нів пув уаї Ту Аїа Сув сій Уаї ТПг Нів біп б1у Іецй бБег бег 85 90 935
Рго Маї ТПг пув Бек Рпе Авп Акуд б1у с1ц Сув 100 105 «2105 64 60 «4005 64 оо «2105 65665 «2115» 328 «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 65
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 25 с1іу Ма1ї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї Ггецш сіп бек Бек с1у Ге Тук бБег бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 30 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935 35
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110 40
Рго Аїа Рго бій Рпе біп Тгр б1у Рго Меєс Уаі1ї Рпе Іей Рпе Рго РгО 115 120 125 45 пув Рго Ппув Авр Уаї пеп Меєс І1е Бек Акд ТПг Рго сбіц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек Авр бій бій Рго сій УМаї Ппув Рпе Авп Тгр 50 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 55 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190 60
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп
195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго І1е бій гпув ТПг І1е Бек їгув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Сув ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп обіп Уаії бек Ггецш Тгр Сув гей Уаї Ппув сі1у Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпоТтук пув ТП ТЕ Рго Рго Уаії Гей Авр бБег Авр сіу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів АТа Нів ТПг ТПг 305 310 315 320
Зо
Ага пув бій Гей бБег Гей Бек Рго 325 «2105 656566 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 66
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15
Зек ТПг бек б1у с1у ТПг АТїа Аза Ггецш с1у Сув тей Уаї пув Авр Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо 60 тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук чІ1е Сув Авп Уаі1! Авп оНів Ппув Рго Бек АвБп ТПг Ппув Уаі1ї! Авр Гувг 85 90 935
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160 тук Маї Авр с1у Уаї сбіц Маї Нів Авп Аїа пув ТпПг пув Рго Агд б1и 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец
Зо 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго пув Рго АБр бій бій Тпг І1е Бек їгув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд Сув б1ц 225 230 235 240
Меє тпг пув Авп сб1іп Уа1! б5Бек Гей Бек Сув Аїа Уаї пув с1у Рбе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Уаї1ї Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 60 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів АТа Нів ТПг ТПг
305 310 315 320
Ага пув бій Гей бБег Гей Бек Рго 325 «2105 6567 «4005 67 оо «2105 68 «4005 68 оо «2105 69 «4005 69 оо «2105 70 «4005 70 оо «2105 771
Зо «4005 71 оо «2105 2172 «4005 72 оо «2105 1173 «4005 Ж 7Ят73 оо «2105 М74 «4005 БК74 оо «2105 75 «4005 75 оо «2105 76 «4005 76 оо «2105 177 60 «4005 77 оо
«2105 178 «4005 7178 оо «2105 79 «4005 79 оо «2105 80 «4005 80 оо «2105 81 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 81
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15
Зо зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Уаї ТПг Уаї Бек Тгр АБп Бек с1у Аїа тей ТПг 5Бег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег зо 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій Ггеш Гей Аїа с1у Рго Бек Уа1ї Рпе Іей РпПе Рго Рго 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув бо 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп тує АвБп Атїа ТПг Туг Агуд Маї Уаї Бек Уа1ї Ггец Рго Уаї Гей 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго бій бій бій Тпг І1е Бек Ггув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп обіп Уаії бек гей бек Сув Аїа Уаії Ппув сіу Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е А1ї1а Уаї сій Тгр бій Бек АвБп о с1іу біп Рго 610 Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Уаї1ї Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів АТа Нів ТПг ТПг 305 310 315 320
Ага пув бій Гей бБег Гей Бек Рго 325 «2105 82 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 82 бо А1їа бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаії Рпе Рго Гей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо пе Бек Бек Ма1ї Уаї ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек тей с1у ТПг с1іп Тбг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935 пув Ммаї бій Рго пув Бек Сув Авр пуб ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей тей б1у б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125
Зо
Кпув Рго Пув Авр ТПг Гец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 ма1т1 уаї Маї Авр Уаї Бек Нів біц Авр Рго біц Уаї Ппув Рпе АвБп Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп Туг Авп о Бек ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец ТПг Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205 пув Аїа Гецп Рго Аїа Рго ІчІїе біцш Ппув ТПг І1е Бек пув Аїа пув с01У 210 215 220 сіп Рго Агуд бій Рго сб1іп Уа1! Тук ТПг Гей Рго Рго Бек Агд сій с1и 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп о біп Уаії Бек Ггецп ТПг Сув гей Уаії Ппув с1іу Рпе Туг 60 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285
Пец Тук Бек Ппув Гей ТПг Уаі1 Авр Пув бБег Агд Тгр біп б1п С1Уу АвпП 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гец Бек Гец Бек Рго 325 «2105 83 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієпв «4005 83 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у б1у Авр Ггецш Уаі пув Рго сіу с01У
Зо 1 З 10 15 сіу Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек 5Бег Агд 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зек Бек Іїе Бек ТПг Агуд Бек б1іу Тук Іїе Тук Туг Аїа біц Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агд Рпе ТПг І1їе 5Бег Агуд Авр АБп Аїа їув АБп Бек Іецч Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 60 «2105» 84
«2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 84 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек 5Бег Агд 20 25 30
ТПгЕ Меє Авп Тер Уа1! Агуд біп Аїа Рго сіу Ппув б1у Гей сій Тгр Уаї 35 40 45 зек Бек Іїе Бек ТПг Агуд Бек б1іу Тук Іїе Тук Туг Аїа біц Бек Уаї зо 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Зо
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек бБег 115 120 «2105 85 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 85 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек гей Агд Гей бБег Сув Аїа Аїа бек біу Рпе ТПг Рпе Бек 5Бег Гпув 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зек Бек Іїе Бек ТПг Агуд Бек б1іу Тук Іїе Тук Туг Аїа біц Бек Уаї 50 55 бо 60 пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 еп біп Меє АвБп б5ег Гей Агуд Аїа сіц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 «2105 986 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієпв «4005 86 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 З 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
Зо
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 зек Бек Іїе Бек ТПг Агуд Бек б1іу Тук Іїе Тук Туг Аїа Агуд Бек Уаї бо 40 пув б1у Агд Рпе ТПг І1їе 5Бег Агуд Авр АБп Аїа їув АБп Бек Іецч Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 45 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 50 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 55 «2105 87 «2115» 106 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність 60 «2205
«223» СІ, «4005 87 с1у б1п Рго пув Аза Аїа Рго Бек Уаії ТПг Ге Робе Рго Рго 5Бег 5ег 1 5 10 15 сі бій Ге сбіп Аїа Ап о пув Аїа ТПг о Гец Уаї Сув Гец І1е Бек Авр 20 25 30
Рпе Туг Рго с1у А1ї1а Маї ТПпг Уаі А1ї1а Тер ув Аза Авр бек бек Рго 35 40 45 уаї пув Аїа сіу Маії сбіц ТП ТП ТП Рго бек Ппув сіп бек Авп Авп 50 55 бо пув Туг Аїа Аїа Бек Бек Тук Гец Бек Гец ТПг Рго біц сбіп Тгр Гувг 65 70 75 80 зек Нів Агуд Бек Тук Бек Сув біп Уаї ТПг Нів бі с1у Бек ТПг Уаї 85 90 935 сій пув ТПпг Уаі1і Аза Рго ТПг біц Сув бБег
Зо 100 105 «2105 88 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 88 сіп Бек А1їа еп ТПг о сбіп Рго Рго Бек Аїа Бек біу Бек Рго 0Ш1у с1іп 1 5 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув Авр б1у Рго Бек ТПг Авр Уа1 б1у АБр Туг 20 25 30
Ап оТук Маї Нів Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув Аза Рго Ппув Іей 35 40 45
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе 50 55 бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 бо сіп Аїа б1ц Авр сій АтТа Авр Тукг Рпе Сув Бек ТПг Туг Аїа Аїа Рго 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 «2105 89 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієпв «4005 89 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 З 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув Авр б1у Рго Бек ТПг Авр Уа1 б1у АБр Туг 20
Ап оТук Маї Бек Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув АТа Рго Ппув Іей 25
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе бо 30 Зек біу Бек Ппув Бек с1у АБп ТПг Аїа Бек Гей ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа біц Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув біп ТПг Туг Аза Аїа Рго 35 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 40 «2105 190 «2115» 110 «2125 БІЛОК 45 «213» Ното варієпв «4005 90 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 50 1 З 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув Авр б1у Рго Бек ТПпг б1у Уа1 с1у АвБр Туг 20 25 30 55
Ап оТук Маї Бек Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув АТа Рго Ппув Іей 35 40 45 60
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе
50 55 бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа бій Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув Бек ТПг Туг Аза Аїа Рго 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 «2105 091 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 91 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув Авр б1у Рго Бек ТПг Авр Уа1 б1у АБр Туг 20 25 30
Зо
Ап оТер Уаї Бек Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув Аза Рго Ппув Іей 35 Меє чІ1е Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго Бек біу Маї Рго Авр Агкд РБПе бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 40 65 70 75 80 сіп Аїа бій Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув Бек ТПг Туг Аза Аїа Рго 85 90 935 45 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 50 «2105 1392 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь 55 «4005 92 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15 60
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув Авр б1у Рго Бек ТПг Авр Уа1 б1у АБр Туг 20 25 30
АБпоТер Маї Нів Тер Тук біп сіп Нів Рго сб1у Ппув АТїа Рго Ппув Гей 35 40 45
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе зо 55 бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа бій Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув Бек ТПг Туг Аза Аїа Рго 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 «2105 93 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 193 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув Авр б1у Рго Бек ТПпг б1у Уа1 с1у АвБр Туг 20 25 30
АБп оТтук Маї Нів Тер Тук біп сіп Нів Рго сб1у Ппув АТїа Рго Ппув Гей 35 40 45
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе зо 55 бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа бій Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув Бек ТПг Туг Аза Аїа Рго 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 бо «2105 194 «2115» 110
«2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 94 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15
ТПг Маї ТПг І1е Бек Сув Авр с1у Рго Бек ТПг Авр Уа1! С1у АБвр тус 20 25 30
Ап оТук Маї Нів Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув Аза Рго Ппув Іей 35 40 45
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе 50 55 бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа біц Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув біп ТПг Туг Аза Аїа Рго 85 90 935 пе біу Рго Меє Рпе с1у сіу с1у ТПг Ппув пеп ТПг Уаї Гей 100 105 110 «2105 195 «2115 111 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 95
Авр І1е УМаї Меє ТПг біп Бек Рго Іеий Бек тей Рго Уаі ТПпг Рго Щ1У 1 5 10 15 сій Рго А1ї1а Бек І1їе Бек Сув Авр б1у Рго Бек ТПг с1у Уаї 01Уу Авр 20 25 30
Тук Авп Тук Уаї Нів Тер Ту бі1іп сбіп пув Рго с1у сіп Аза Рго Агд 35 40 45
Теч Геп Іїе Тук Рпе ТПг Бек Ппув Ппув Рго Бек біу Уаї Рго Авр Агд 50 55 бо
Рпе Бек біу Бек б1і1у Бек б1у ТПг Авр Рпе ТПг Іїей Гув І11е б5Бег Аг4д 65 70 75 80 60 уаї бі Аза біц Авр Уаї сіу Ма1і Тук Тук Сув сіп ТПг Туг Аї1а А1а
85 90 935
Рго Пец б1у Рго Меє Рпе б1у біп б1у ТПг Гув Іїей бій Іїе Гув 100 105 110 «2105 196 «2115» 107 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» СІ, «4005 96
Ага ТПг оУаї Аза Аза Рго Бек Маі Рпе І1е РПпе РгОо Рго Бег АБр б1ц 1 5 10 15 сіп Гей Ппув Бек сіу ТПг Аїа Бек Уаї Уаї Сув Ггец Гец Ап Ап РіПе 20 25 30
Тук Рго Агуд сій Аїа пув Маї біп Тгр ув Маії АвБр АБп Аза Іецй сіп 35 40 45
Зек бі1у АБп Бек біп бій Бек Уаї ТПг сій сб1п Авр Бек пув Авр бБег 50 55 бо
ТПгЕ Тук Бек Гей бек Бек ТПг Гей ТПг Гей Бек гув Аз1а АБр Туг б1ц 65 70 75 80 пув Нів пув уаї Ту Аїа Сув сій Уаї ТПг Нів біп б1у Іецй бБег бег 85 90 935
Рго Маї ТПг пув Бек Рпе АБп Агуд сС1у біц Сув 100 105 «2105 97 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 97 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув Авр б1у Рго Бек ТПпг б1у Уа1 с1у АвБр Туг 20 25 30 60
Ап оТук Маї Нів Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув Аза Рго Ппув Іей
35 40 45
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе зо зо бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа біц Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув біп ТПг Туг Аза Аїа Рго 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 «2105 198 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 98 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у б1у Авр Ггецш Уаі пув Рго сіу с01У 1 5 10 15
Зо сіу Гей Агуд Гей Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Аї1а 20 25 30
ТПгЕ Меє Авп Тер Уа1! Агуд біп Аїа Рго сіу Ппув б1у Гей сій Тгр Уаї 35 40 45 зек Бек Іїе Бек ТПг Агуд Бек б1іу Тук Іїе Тук Туг Аїа Авр Бек Уаї зо 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек бБег 115 120 «2105 99 60 «2115» 110 «2125 БІЛОК
«213» Ното варієепь «4005 99 сбіп Бек Аїа Гей ТПг обіп Рго Рго 5Бег Аїа Бек біу Бек Рго с01у сіп 1 5 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув Авр б1у Рго Бек ТПг Авр Уа1 б1у АБр Туг 20 25 30
Ап оТук Маї Бек Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув АТа Рго Ппув Іей 35 40 45
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе 50 55 бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа б1ц Авр сій АтТа Авр Тукг Рпе Сув Бек ТПг Туг Аїа Аїа Рго 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей
Зо 100 105 110 «2105 100 «2115 15 «212» БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 100
Зек Нів ТПпг Меє Авп 1 5 «2105 101 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 101 зек Іїе Бек Бек Агуд Бек сіу Тук Іїе Тук Тук Аїа Авр Бек Уаї Гувг 1 5 10 15 у «2105 102 бо «2115» 13 «2125 БІЛОК
«213» Ното варієепь «4005 102
Тук 61у пув Агуд біц Авр Меє Гей Тгр Уаії Рпе Авр Туг 1 5 10 «2105 103 «2115 15 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 103 зек Аї1а ТПг Меє АвпП 1 5 «2105» 104 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 104 зек Іїе Бек ТПг Агуд Бек сіу Тук Іїе Тук Тук Аїа Авр Бек Уаї Гувг 1 5 10 15
Зо о1У «2105 105 «2115 15 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 105 век Агуд ТПг Мес Авп 1 5 «2105» 106 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005» 106 зек Іїе Бек ТПг Агуд Бек сіу Тук Іїе Тук Тук Аїа біц Бек Уаї Гувг 1 5 10 15 о1У 60 «2105 107
«2115 15 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 107 век Ппув ТПг Мес Авп 1 5 «2105» 108 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 108 зек Іїе Бек ТПг Агуд Бек сіу Тук Іїе Тук Туг Аїа Агуд Бек Уаї Гувг 1 5 10 15 о1У «2105» 109 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь
Зо «4005 109 зек І1е Бек ТПг сбіп Бек Нів Тук І1е Тук Туг А1ї1а Агуд Бек Уаї Гув 1 5 10 15 о1У «2105» 110 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 110 зек І1е Бек ТПг сбіп Бек Нів Тук І1е Тук Туг А1їа бій Бек Уаї Гув 1 5 10 15 о1У «2105 111 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь 60 «4005 111 зек І1е Бек ТПг сбіп Бек Нів Тук І1е Тук Туг Аїа бій Бек Уаї Агд 1 5 10 15 о1У «2105 112 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 112 зек І1е Бек ТПг сбіп Бек Нів Тук І1е Тук Туг А1їа Агд Бек Уаї Агд 1 5 10 15 о1У «2105 113 «2115» 14 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь
Зо «4005 113
ТПгЕ б1іу ТПг Бек ТПг Авр Уаї сіу Авр Тугк Авп Туг Уаї 5ег 1 5 10 «2105 114 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 114 сій ТП Бек Ппув Ппув Рго 5Бег 1 5 «2105» 115 «2115 10 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005 115 век ТПпг Туг Аїа Аза Рго Гец с1у Рго Мес 1 З 10 «2105» 116 «2115» 14 бо «212» БІЛОК «213» Ното варієепь
«4005» 116
Авр сб1у Рго Бек ТПг Авр УМа1ї б1у Авр Туг Авп Туг Уаї1ї б5ег 1 5 10 «2105 117 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 117
Рпе ТПг Бек Гпув пув Рго бБег 1 5 «2105» 118 «2115» 14 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005» 118
Авр с1у Рго Бек ТПг Авр Уаї б1у Авр Туг Авп Туг Уа1ї Нів 1 5 10
Зо «2105» 119 «2115» 14 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 119
Авр сб1у Рго Бек ТПг б1у Ма1ії б1у Авр Туг Авп Туг Уаї1ї б5ег 1 5 10 «2105 120 «2115» 14 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 120
Авр сб1у Рго Бек ТПг Авр УМа1ї б1у Авр Туг Авп Тгр Уаі1ї 5ег 1 5 10 «2105 121 «2115» 14 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005 121
Авр с1у Рго Бек ТПг Авр Уаї б1у Авр Туг Авп Тер Уа1і Нів 60 1 З 10
«2105 122 «2115» 14 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005 122
Авр с1у Рго Бек ТПг б1і1у Уаї сб1у Авр Туг Авп Тукг Уа1ї Нів 1 5 10 «2105 123 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 123 тТук ТПг Бек Бек пув Рго с1ц 1 5 «2105 124 «2115» 14 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 124
Зо біп б1у Рго Бек ТПг с1у Ма1 с1у Авр Туг АБп Тгр Уаї Нів 1 5 10 «2105 125 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 125
Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго Гуз 1 5 «2105» 126 «2115» 14 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 126 біп б1у Рго Бек ТПг с1у Ма1 с1у Авр Туг ТПг Тер Ууаї Нів 1 5 10 «2105 127 «2115 7 «2125 БІЛОК бо «2135» Ното варієпв
«4005 127
Рпе ТПг І1е пув Ппув Рго Гуз 1 5 «2105 128 «2115» 14 «2125 БІЛОК «213» Ното варієпв «4005 128 сі б1у Рго Бек ТПг с1у Ма1 с1у Авр Туг АБп Тгр Уаї Нів 1 5 10 «2105 129 «2115» 14 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 129 сі б1у Рго Бек ТПг с1у Уаї с1у Авр Туг ТіПг Тук Уаї Нів 1 5 10 «2105» 130 «2115» 14 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 130 біп б1у Рго Бек ТПг с1у Ма1 с1у Авр Туг АвБп Туг Уаї Нів 1 5 10 «2105» 131 «2115» 374 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 131
Мес Тер Рпе Гецш ТПг ТПг Ггец Ггец гей Тгр Уаі Рго Уаі Авр с1у сіп 1 5 10 15
Ууаї Авр ТПг тТПг пув Аїа Уаії І1їе ТПг гей сбіп Рго Рго Тгр Уаї 5ег 20 25 30 ма1 Рпе бі1іп сій сій ТПг оУаї ТПпг Гей Нів Сув біц Уаї Гей Нів ей 35 40 45
Рго сіу Бек Бек Бек ТПг біп Тер Рпе ей АвБп б1у ТПпПг Аза ТПпг сі1п 60 зо 55 бо
ТПгЕ Бек ТПг Рго бек Туг Агуд І1е ТПг Бек Аза Бек Уа1і АвБп АвБр б5ег 65 70 75 80 сіу бій Туг Агуд Сув біп Агуд б1іу Гец Бек б1у Агуд Бек АвБр Рго Іїе 85 90 935 сіп гейш б1ц І1е Нів Акуд б1іу Тер Геш Гей Гей біп Уаї Бек Бек Аг4д 100 105 110 уаї Рпе ТтТпПг біш с1у сій Рго Іїец Аїа тей Агуд Сув Нів Аїа Тгр Гув 115 120 125
Авр пув пей Маї Туг Авп Маї тей Туг Туг Агу АБп б1у Гув Аїа РПе 130 135 140
Тпув Рпе Рпе Нів Тер Ап Бек Авп Гей ТПг І1е Іец Гув ТПг АБп чІ1е 145 150 155 160 зек Нів Авп о сіу ТПг Тук Нів Сув Бек сіу Меє с1у пув Нів Агд Туг 165 170 175
ТПг Бек Аїа с1у І1е бек Маї ТПК Уаї ув біц Ггеп Рпе Рго Аїа Рго 180 185 190
Ууаї Ггец Авп Аза Бек Уаі ТПг Бек Рго Гей гей сій с1у Авп Гей Уаї 195 200 205
ТПг гей бек Сув сій ТПг пуб Гей гей тей біп Агуд Рго б1у Іецй сіп 210 215 220 теп Тук Рпе Бек Рпе Тук Мес сіу Бек Ппув ТПг Ггец Агуд б1у Аг Ап 225 230 235 240
ТПг Бек Бек сій Туг сіп ч11е Гей ТПг А1ї1а Агуд Агд б1й АвБр бБег "У 245 250 255 пе Тук Тер Сув бій Аїа Аїа ТтПг біц Авр с1у АБп Уаї Ггеш Гпув Аг4д 260 265 270 век Рго біц Ге сіц Гец сіп Уаї Гец сіу Гец біп Гец Рго ТПг Рго 275 280 285 уаї Тер Рпе Нів Уа1 Гей РпПе Тукг Іец Аза Уаї с1у ІчІ1е Меє РіПе Гей 290 295 300 60
Ууаї Авп ТтТПг Уаї Ггецп Тгр Уаі ТПг І1їе Агд пув сій Гей пув Агд Гуз 305 310 315 320 ув пув Тер Авр Гей бій І1е Бек Гец Авр Бек б1іу Нів бій Ппув Гув 325 330 335 уаї І11е Бек Бек гей сбіп біц АвБр Агуд Нів тей сі бі сій Гей Гу 340 345 350
Сув бі1іп бій сбіп пув бій бій сбіп Гец біп біц б1у Уаї Нів Аг Гув 355 360 365 бій Рго сіп с1іу Аїа ТПг 370 «2105 132 «2115» 316 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 132
Мес тПг Мес біц ТПг біп Мес бек біп Азп Уаії Сув Рго Агуд Авп Гей 1 5 10 15
Зо
Тер гец гей бсіп Рго Гей ТПг Уаї Гей гей Гей Гей Аїа бБег А1їа Авр 20 25 30 зек біп Аїа Аїа Рго Рго Ппув Аїа Уаї Ггецшц Ппув Гец біц Рго Рго Тгр 35 40 45
І1е Авп Уа1ї тей сбі1іп бій Авр Бек Уаї ТПпг Гей ТПг Сув б1п с1у А1а 50 55 бо
Агуд Бек Рго біц Бек Авр Бек І1е сіп Тер Рпе Нів АвБп с1іу АБп Іей 65 70 75 80
І1е Рго ТПг Нів ТП обіп Рго Бек Туг Агуд Рпе пув Аза АБп АБп АвБп 85 90 935
Авр Бек с1у бій Тук ТПпг Сув біп ТПпг б1у біп ТПпг Бек Гей б5Бег Авр 100 105 110
Рго Уаї Нів Іец ТПпг Уаї тей Бек сі Тер гец Уаі1! гец сбіп ТПг РгОо 115 120 125 бо Нів пеп бій Рбе сб1іп сіц с1іу сій ТБг І11е Меє Гей Агкуд Сув Нів Бег 130 135 140
Тер пув Авр пуб Рго гей УМаї Ппув Маї ТПг Рпе Рпе сбіп АвБп с1Уу Гуз 145 150 155 160 зек біп пув Рпе бек Нів Гей Авр Рго ТПг Рпе Бек І1е Рго сіп Аїа 165 170 175
Ап оНів Бек Нів Бек б1у Авр Туг Нів Сув ТПг с1у АБп І1е с1у Туг 180 185 190
ТПг Гецп Рпе Бек Бек Ппув Рго Ма1ї ТПг І1е ТПг Уаї с1іп Уаї Рго 5Бег 195 200 205
Мес сіу Бек Бек Бек Рго Мес сіу Уаі Іїе Уаії Аїа Уаї Уаї І1е А1а 210 215 220
ТПг Аїа Уаі Аза Аїа І1ї1е Уаії Аза Аїа Уаї Уаї А1їа гей І1е Тук Сув 225 230 235 240
Ага пув пуб Агуд І1е Бек Аза АвБп Бек ТПг Авр Рго Уаі їув Аза Аза 245 250 255
Зо сіп Рпе бій Рго Рго сіу Агуд сіп Мес І1їе Аїа чІ1ї1е Агд Гпув Агд сіп 260 265 270 пе бій б1ц Тс Авп Авп Авр о Туг бій Тпгс Ата Авр с1у с1у Тугє Меє 275 280 285
ТПгЕ Гей Авп о Рго Агуд Аза Рго ТПг Авр АБр АБр губв АвБп о І1е Туг Іец 290 295 300
ТПг гей Рго Рго АвБп Авр Нів Уаїії АвБп Бек Авп АвпП 305 310 315 «2105 133 «2115 10 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005 133 сіп ТПпг Туг Аїа Аза Рго Гец с1у Рго Мес 1 З 10 «2105» 134 «2115 111 бо «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь
«4005 134
Авр І1е УМаї Меє ТПг біп Бек Рго Іеий Бек тей Рго Уаі ТПпг Рго Щ1У 1 З 10 15 бій Рго Аїа Бек Іїе Бек Сув Авр біу Рго Бек ТПг Авр Уаї 01У Авр 20 25 30
Тук Авп Тер Уаї Нів Тер Ту бі1іп сбіп пув Рго с1у сіп Аза Рго Агд 35 40 45
Теч Геп Іїе Тук Тук ТПг Бек Бек Ппув Рго біц сіу Уаї Рго Авр Агд 50 55 бо
Рпе Бек с1у Бек с1у Бек с1у ТПг Авр Рпе ТПг Гей пув І1е 5ек Агд 65 70 75 80 уаї бі Аза біц Авр Уаї сіу Ма1і Тук Тук Сув сіп ТПг Туг Аї1а А1а 85 90 935
Рго Пец б1у Рго ТПг Рпе б1у біп б1у ТпПг Гув Тей бій Іїе Гув 100 105 110
Зо «2105» 135 «2115 122 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005 135 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 З 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Туг А1а Агуд Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агд Рпе ТПг І1їе 5Бег Агуд Авр АБп Аїа їув АБп Бек Іецч Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 60 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 «2105» 136 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005» 136 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Меє Авп Тер Уа1! Агуд біп Аїа Рго сіу Ппув б1у Гей сій Тгр Уаї зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї
Зо зо зо бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 35 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935 40
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 45 сіу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек бБег 115 120 «2105» 137 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 137 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 бо зек гей Агд Гей бБег Сув Аїа Аїа бек біу Рпе ТПг Рпе Бек 5Бег Гпув 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг Атїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 «2105» 138 «2115 122 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005 138 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 З 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї бо 50 Агу с1у Агуд Рбе ТПг І1е Бек Агд АБр АБп о Аїа Ппув Ап о бБег Гей Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 55 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 60 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 «2105» 139 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 139 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 ТПгЕ Меє Авп Тер Уа1! Агуд біп Аїа Рго сіу Ппув б1у Гей сій Тгр Уаї зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 25 зо 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80
Зо тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935 35
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 40 сіу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек бБег 115 120 «2105 140 45 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 140 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У 1 5 10 15 зек гей Агд Гей бБег Сув Аїа Аїа бек біу Рпе ТПг Рпе Бек 5Бег Гпув 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 60 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Туг А1а Агуд Бек Уаї 50 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг Атїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 «2105» 141 «2115 122 «2125 БІЛОК «213» Ното варієпв «4005 141 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У
Зо 1 З 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо
Агу с1у Агуд Рбе ТПг І1е Бек Агд АБр АБп о Аїа Ппув Ап о бБег Гей Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук б1у А1ї1а Агуд б1й Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уаї ТПг Уаї Бек Бек 115 120 60 «2105 142
«2115» 317 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 142
Мес тПг Мес біц ТПг біп Мес бек біп Азп Уаії Сув Рго Агуд Авп Гей 1 5 10 15
Тер гец гей бсіп Рго Гей ТПг Уаї Гей гей Гей Гей Аїа бБег А1їа Авр 20 25 30
Зек біп А1ї1а АТа АТїа Рго Рго пув Аїа Уаї Гей пув гец бій Рго Рго 35 40 45
Тгр чІ1е Авп Уаї Гей сіп сій Авр Бек Маії ТПг тей ТПпг Сув б1п Щ1Уу 50 55 бо
Аза Агуд Бек Рго біц Бек Авр Бек чІ1е біп Тер Рбе Нів АвБп сб1у Авп 65 70 75 80
Тец І1е Рго ТПг Нів ТпПг біп Рго Бек Туг Агд Рпе їув Аза АБп АвБпП 85 90 935
Зо
Авп о Авр о бБек с1у бій Тугк ТПпг Сув біп ТПпг б1у біп ТПпг бБег Іецй б5ег 100 105 110
АБвр Рго Маї Нів теп ТПг Уаї Гей Бек б1іш Тер Гей Уаї тей сіп ТтіПг 115 120 125
Рго Нів гец біц Рпе бі1іп бій с1у бі ТпПг І1е Меє Ггец Агд Сув Нів 130 135 140 век Тер Ппув Авр Пув Рго Гец Уаї Ппув Маі ТПг Рпе Рпе сіп Ап с01Уу 145 150 155 160 пув Бек біп пув Рпе Бек Нів Гей Авр Рго ТПг Рпе бек І1е Рго сіп 165 170 175
Аза Авп о Нів Бек Нів Бек б1у Авр Туг Нів Сув ТПг с1у АБп І1е 01У 180 185 190 тук ТПпг Гей РібПе Бек Бек Ппув Рго Ма1і ТПг І1е ТПг Уаї сіп Уа1ї! Рго 195 200 205 зек Меє сіу Бек Бек Бек Рго Мес сіу чІ1їе ІчІ1їе Уаї Аїа Уаї Уаї пе бо 210 215 220
А1їа ТтПпг Аїа Уаі Аа А1ї1а І1е Уаії Аза Аза Уаї Уаї Аза тей І1е Туг 225 230 235 240
Сув Агуд пув Ппув Агуд І1їе Бек Аїа Авп Бек ТПг Ар Рго Уаї пув Аї1а 245 250 255
А1а сбіп Рбе бій Рго Рго с1у Акуд біп Мес І1е Аїа І1е Агуд пув Агд 260 265 270 сіп Гей біц біц ТПг Ап АвБп Авр Туг біц ТПг Аза Ар с1у 1у Тукг 275 280 285
Мес тПпг Ггец Ап Рго Агуд Аза Рго ТПг Авр Авр Авр губ АБп о ч11е Туг 290 295 300 теп ТПпг Гей Рго Рго Авп Авр Нів Уаії Авп Бек Авп Авп 305 310 315 «2105» 143 «211» 218 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь
Зо «4005 143
Мес тПг Мес біц ТПг біп Мес бек біп Азп Уаії Сув Рго Агуд Авп Гей 1 5 10 15
Тер гец гей бсіп Рго Гей ТПг Уаї Гей гей Гей Гей Аїа бБег А1їа Авр 20 25 30 зек біп Аїа Аїа Аїа Рго Рго Ппув Аїа Уаї Ггецш Ппув Гец біц Рго Рго 35 40 45
Тгр ч1І1е Авп Уа1ї тей сбі1іп бій Авр Бек Уаї ТПг Гей ТПг Сув б1п Щ1У бо
Аза Агуд Бек Рго біц Бек Авр Бек чІ1е біп Тер Рбе Нів АвБп сб1у Авп 50 65 70 75 80
Тец І1е Рго ТПг Нів ТпПг біп Рго Бек Туг Агд Рпе їув Аза АБп АвБпП 85 90 935 55
Авп о Авр о бБек с1у бій Тугк ТПпг Сув біп ТПпг б1у біп ТПпг бБег Іецй б5ег 100 105 110 60
Авр Рго Уаї Нів Іец ТПг Уаї тей Бек бі Тер гейш Уаі1! гец сіп Тс
115 120 125
Рго Нів гец біц Рпе бі1іп бій с1у бі ТпПг І1е Меє Ггец Агд Сув Нів 130 135 140 век Тер Ппув Авр Пув Рго Гец Уаї Ппув Маі ТПг Рпе Рпе сіп Ап с01Уу 145 150 155 160 пув Бек біп Ппув Рпе бБег Агуд Гец Авр Рго ТПг Рпе Бек І1е Рго сіп 165 170 175
Аза Авп о Нів Бек Нів Бек б1у Авр Туг Нів Сув ТПг с1у АБп І1е 01У 180 185 190 тук ТПпг Гей РібПе Бек Бек Ппув Рго Ма1і ТПг І1е ТПг Уаї сіп Уа1ї! Рго 195 200 205 век Меє сіу Бек Бек Бек Рго Мес с1у Ше 210 215 «2105» 144 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 144 сіп Бек А1їа еп ТПг о сбіп Рго Рго Бек Аїа Бек біу Бек Рго 0Ш1у с1іп 1 5 10 15 зек Уа1 ТПг Іїе Бек Сув біп с1іу Рго Бек ТПг сіу Уаї с1у Авр Тукг 20 25 30
Ап оТер Уаї Нів Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув АТа Рго Ппув Іей 35 40 45
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго пув сіу Маі Рго Авр Ага РіПе бо 50 зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 55 сіп Аїа б1ц Авр сій АтТа Авр Туг Тук Сув сб1іп ТПг ТтТуг Аїа Аїа Рго 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 60 100 105 110
«2105» 145 «2115» 110 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005 145 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15 зек Уа1 ТПг Іїе Бек Сув біп с1іу Рго Бек ТПг сіу Уаї с1у Авр Тукг 20 25 30
ТП Тер Маі1 Нів Тер Тук біп бі1іп Нів Рго б1у Ппув АТа Рго Ппув Іей 35 40 45
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Іїе пув Ппув Рго пув сіу Маі Рго Авр Ага РіПе 50 55 бо
Зек біу Бек Ппув Бек с1у АБп ТПг Аїа Бек Гей ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа бій АвБр біц Аза Авр Тукг Тук Сув біп ТПг Туг Аза Аїа Рго
Зо 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 «2105» 146 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієпв «4005» 146 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15 зек Уа1 ТПг Іїе Бек Сув біц с1у Рго Бек ТПг сіу Уаї с1у Авр Тукг 20 25 30
Ап оТер Уаї Нів Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув АТа Рго Ппув Іей 35 40 45
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе 50 55 бо бо Зек біу Бек Ппув Бек с1у АБп ТПг Аїа Бек Гей ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа бій АвБр біц Аза Авр Тукг Тук Сув біп ТПг Туг Аза Аїа Рго 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 «2105 147 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 147 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15 зек Уа1 ТПг Іїе Бек Сув біц с1у Рго Бек ТПг сіу Уаї с1у Авр Тукг 20 25 30
ТпПг Тук Маі1 Нів Тер Тук біп бі1іп Нів Рго б1у Ппув АТа Рго Ппув Іей 35 40 45
Меє чІ1е Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго Бек біу Маї Рго Авр Агкд РБПе 50 55 бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа бій АвБр біц Аза Авр Тукг Тук Сув біп ТПг Туг Аза Аїа Рго 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 «2105» 148 «2115» 110 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005» 148 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 5 10 15 зек Уа1 ТПг Іїе Бек Сув біп с1іу Рго Бек ТПг сіу Уаї с1у Авр Тукг 20 25 30 60
Ап оТер Уаї Нів Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув АТа Рго Ппув Іей
35 40 45
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе зо зо бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа бій АвБр біц Аза Авр Тукг Тук Сув біп ТПг Туг Аза Аїа Рго 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гей 100 105 110 «2105» 149 «2115 111 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 149
Авр І1е УМаї Меє ТПг біп Бек Рго Іеий Бек тей Рго Уаі ТПпг Рго Щ1У 1 5 10 15
Зо бій Рго Аїа Бек Іїе Бек Сув біп сбіу Рго Бек ТПг сб1у Уаії 01Уу Авр 20 25 30 тТук Авп Тук Ма1 Нів Тер Тук сіп б1іп Ггув Рго с1у сб1іп Аїа Рго Агд 35 40 45
Теч Геп Іїе Тук Рпе ТПг Бек Ппув Ппув Рго Бек біу Уаї Рго Авр Агд зо 55 бо
Рпе Бек біу Бек б1і1у Бек б1у ТПг Авр Рпе ТПг Іїей Гув І11е б5Бег Аг4д 65 70 75 80 уаї бі Аза біц Авр Уаї сіу Ма1і Тук Тук Сув сіп ТПг Туг Аї1а А1а 85 90 935
Рго Пец б1у Рго Меє Рпе б1у біп б1у ТПг Гув Іїей бій Іїе Гув 100 105 110 «2105 150 «211» 218 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь 60 «4005 150
Мес тПг Мес біц ТПг біп Мес бек біп Азп Уаії Сув Рго Агуд Авп Гей 1 5 10 15
ТЕр Ге Гей сіп Рго пецш ТПг Уаї Гей Гей Гей Гей Аїа б5Бег Аїа Авр 20 25 30 зек біп Аїа Аїа Аїа Рго Рго Ппув Аїа Уаї Ггецш Ппув Гец біц Рго Рго 35 40 45
Тгр чІ1е Авп Уаї Гей сіп сій Авр Бек Маії ТПг тей ТПпг Сув б1п Щ1Уу 50 55 бо
Аза Агуд Бек Рго біц Бек Авр Бек чІ1е біп Тер Рбе Нів АвБп сб1у Авп 65 70 75 80
Тец І1е Рго ТПг Нів ТпПг біп Рго Бек Туг Агд Рпе їув Аза АБп АвБпП 85 90 935
АБп оАвр бек б1у бі Тук ТпПг Сув біп ТПг б1у б1іп ТБПг Бек Гей Бег 100 105 110
Авр Рго Уаї Нів Іец ТПг Уаї тей Бек бі Тер гейш Уаі1! гец сіп Тс
Зо 115 120 125
Рго Нів гец біц Рпе бі1іп бій с1у бі ТпПг І1е Меє Ггец Агд Сув Нів 130 135 140 век Тер Ппув Авр Пув Рго Гец Уаї Ппув Маі ТПг Рпе Рпе сіп Ап с01Уу 145 150 155 160 пув Бек біп пув Рпе Бек Нів Гей Авр Рго ТПг Рпе бек І1е Рго сіп 165 170 175
А1а Авп о Нів Бек Нів Бек с1у Авр Туг Нів Сув ТпПсг С01у АБп І1е Щ1У 180 185 190
Тук ТПг гей Рпе бек бек пуб Рго Маі ТПг І1е ТПг Уаї сіп Уаї Рго 195 200 205 век Меє сіу Бек Бек Бек Рго Мес с1у Ше 210 215 «2105» 151 «2115» 291 «2125 БІЛОК бо «2135» Ното варієпв
«4005 151
Мес с1у І1їе Ггецш Бек Рпе Гей Рго Уаі гей Аїа ТПг сій Бек Авр Тгр 1 5 10 15
Аза Авр Сув Ппув Бек Рго біп Рго Тер с1у Нів Меє Гей Ггец Тгр ТЕПг 20 25 30
А1ї1а уаї гей Рпе гей Аза Рго Уаі Аза с1у ТПг Рго Аза Аза Рго РгО 35 40 45 пув Аїа уаї Ггешп пув Гей бій Рго біп Тер І1е АвБп Уаї Ггеш сіп с1ци 50 55 бо
Авр Бек Маї ТПг Іец ТПпг Сув Агуд с1у ТПг Нів Бек Рго біц бБег Авр 65 70 75 80 зек І1е бі1іп Тер Рпе Нів Авп с1іу АвБп Гец І1е Рго ТПг Нів ТПпг сіп 85 90 935
Рго Бек Туг Агд Рпе ув А1їа АБп АБп АБп Авр Бек б1у бій Туг ТПпг 100 105 110
Зо
Сув біп ТП о с1іу біп ТпПг Бек Гей Бек Авр Рго Уаії Нів Те ТПг Уаї 115 120 125 пе Бек біш Тер Гей Уаї тей сб1іп ТПг Рго Нів тей сб1іц Рпбе сіп с1ци 130 135 140 сі1у бій ТПпг ч1І1е Уаї гейш Агуд Сув Нів Бек Тгр їув Авр Гув Рго Іецй 145 150 155 160 уаї Ппув Маї ТПг Рпе Рпе біп Азп сіу Ппув Бек Ппув пуб Рпе 5ег Аг4д 165 170 175 век Авр Рго Авп Рпе Бек І1ї1е Рго біп Аза АБп о Нів Бек Нів Бек щу 180 185 190
Авр Тук Нів Сув ТПг б1у АБп чІ1е с1у Тук ТПг Гей Тук Бек Бек Гув 195 200 205
Рго Маї ТПг І1е ТПпг Уаї сіп Аїа Рго Бек Бек Бек Рго Месє с1у Пе 210 215 220
І1е Уаї А1їа Уаї Уаї ТПпг с1у І1е А1ї1а Уаі Аза Аза І1е Уаі1і Аза Аїа бо 225 230 235 240 уаї Маї Аїа гецшп І1їе Тук Сув Агуд пув пуб Агуд ч11е Бек Аїа АБп Рго 245 250 255
ТПгЕ Авп оРго Авр сій Аза Авр пув Маї с1у А1ї1а б1й АБп ТПпг І1е ТпПг 260 265 270 тук Бек Гей Гей Мес Нів Рго Авр Аїа гец б1іц сій Рго АвБр АБр с1іп 275 280 285
Авп Ага І1е 290 «2105 152 «2115 13 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 152 тук 61у Аїа Акуд бій Авр Меє Гей Тер Уаї Рпе Авр Туг 1 5 10 «2105 153 «2115 10 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 153 сіп ТПпг Туг Аїа Аза Рго Гец с1у Рго ТПг 1 5 10 «2105 154 «2115» 118 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» УН «4005 154 сіп Уа1ї бі1п Гецш Уаї сі Бек с1у с1у с1у Маі1 Уа1! б1п Рго 01у Агк4д 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Тукг 20 25 30
ТП Меє Нів Тер Уаії Агуд біп Аз1а Рго с1у Ппув с1у гейш сій Тер Уаї 35 40 45 60
ТПЕ Рпе І1е бек Туг Авр сіу Авп Авп пув Туг Туг Аїа Авр Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агд Рпе ТПг І1їе 5Бег Агу Авр АвБп Бек їув АБп о ТПг Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза чІ1е Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага ТПг ос1у Тер Гей б1у Рго Рпе Авр Туг Тгр б1у біп 01у ТПпг 100 105 110
Тїец Уаї ТПг Уаї 5Бег 5ег 115 «2105» 155 «2115» 108 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» УІ, «4005 155
Зо сій Іїе Уаі1ї Гец ТПг біп Бек Рго біу ТПг Ггец бек Гей бек Рго с01Уу 1 5 10 15 січ Агуд Азїа ТОП о Гей бек Сув Агуд Аза Бек сбіп Бек Уаї с1у Бек бБег 20 25 30
Тук гей Аїа Тгр Ту сіп біп пув Рго бі1у біп Аз1а Рго Агуд Іецй Іецй 35 40 45
І1е Тук б1у А1їа Рпе Бек Агуд Аїа ТпПг б1у І1е Рго АБр Агуд РПпе 5ег 50 55 бо сіу Бек сіу Бек сіу ТПг Авр Рпе ТПг Гец ТПг І1е Бек Агд Гец с1ц 65 70 75 80
Рго бій АвБр Рпе А1їа Маї Туг Туг Сув біп біп Тук с1у Бек Бек Рго 85 90 935
Тер ТПпг Рпе сС1у бі1іп с1у ТПг пув Уа1! сі І1е Гуз 100 105 «2105» 156 60 «2115» 116 «2125 БІЛОК
«213» Штучна послідовність «223» УН «4005 156 сіп Уаі1 сбіп Ге сіп сіц Бек с1іу Рго сбіу Гец Уаї Ппув Рго Бек біц 1 5 10 15
ТПг гей бек Гей ТПг Сув ТПг Уаії Бек с1у Туг Бек І1е бБег бБег ШУ 20 25 30
Тук б1у Тгр АвБп Тгр ч11е Агуд сіп Рго Рго сіу пув с1у Гей бій Тгр 35 40 45
І1е с1у РПе І1е Тук Тук сій с1у Бек ТПпг Тук Туг АвБп Рго Бек Ії1е 50 55 бо пув Бек Агуд Іїе Бек Іїе ТПг Агуд Авр ТПг Бек Ппув АБп о біп Рпе РПе 65 70 75 80 тей біп Уаі1 АвБп Бек Уаї ТПг ТПг біц Авр ТПг Аїа ТПг Тук Тук Сув 85 90 935
Зо
Аза Агуд біп ТП с1у Тук Рпе Авр Туг Тгр б1у біп с1іу ТПг Іец Уаї1ї 100 105 110
ТПг Уаї Бек 56г 115 «2105» 157 «2115 113 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» УІ, «4005 157
АБвр чІ1е Маї Меє тТПг о сіп Бек Рго Авр бек Ггецш Аїа Уа1ї Бек теп 0Щ1Уу 1 5 10 15 сій Агуд Аїа ТпПг І1е АвБп о Сув Ппув Бек Бек біп Бек Гец Рпе Ап 5ег 20 25 30
Авп о Аїа пув ТПг Авп Ту гей АвБп Тер Туг біп біп ув Рго 1у біп 35 40 45 60
Рго Рго Ппув Іец Іец І1е Туг Туг АТїа Бек ТПг Агуд Нів ТПг с1у Ууаї 50 55 бо
Рго Авр Агуд Ропе Бек б1у Бек сіу Бек б1у ТПг Авр Рпе ТПг Гей ТЕПг 65 70 75 80
І1е Бек Бек гей біп А1ї1а б1й Авр Уаії Аза Уаї Туг Тугк Сув біп сбіп 85 90 935
Тер Тук Авр Тук Рго Тук ТПг Рпе сіу Аїа сіу ТПг пув Уаї сій І1е 100 105 110
Туз «2105» 158 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 158
Зо
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15
Зек ТПг бек б1у с1у ТПг АТїа Аза Ггецш с1у Сув тей Уаї пув Авр Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935 пув Маї б1ш Рго Ппув Бек Сув Авр Ппув ТПг Нів ТПг о Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей тей б1у б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 60 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр ТПг Гец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц Авр Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160 тук Маї Авр с1у Уаї сбіц Маї Нів Авп Аїа пув ТпПг пув Рго Агд б1и 165 170 175 сі біп Туг Авп о Бек ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец ТПг Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205 пув Аїа Гецп Рго Аїа Рго ІчІїе біцш Ппув ТПг І1е Бек пув Аїа пув с01У 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бег Агд АБр б1ц 225 230 235 240 пе ТПг пув Авп обіп Уа1ї Бек Ггецп ТПг Сув Гей Уа! пув с1у Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гей Бек Гей Бек Рго 325 «2105 159 «2115» 107 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 бо «223» сі
«4005 159
Ага ТПг оУаї Аза Аза Рго Бек Маі Рпе І1е РПпе РгОо Рго Бег АБр б1ц 1 5 10 15 сіп Гей Ппув Бек сіу ТПг Аїа Бек Уаї Уаї Сув Ггец Гец Ап Ап РіПе 20 25 30
Тук Рго Агуд сій Аїа пув Маї біп Тгр ув Маії АвБр АБп Аза Іецй сіп 35 40 45
Зек бі1у АБп Бек біп бій Бек Уаї ТПг сій сб1п Авр Бек пув Авр бБег 50 55 бо
ТПгЕ Тук Бек Гей бек Бек ТПг Гей ТПг Гей Бек гув Аз1а АБр Туг б1ц 65 70 75 80 пув Нів пув уаї Ту Аїа Сув сій Уаї ТПг Нів біп б1у Іецй бБег бег 85 90 935
Рго Маї ТПг пув Бек Рпе АБп Агуд сС1у біц Сув 100 105
Зо «2105» 160 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 160 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек гей Агд Гей бБег Сув Аїа Аїа бек біу Рпе ТПг Рпе Бек 5Бег Гпув 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 60 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув
85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160
Ма1 Бек Тер Авп Бек біу А1ї1а гейш ТПг Бек с1і1у Маї Нів ТПг РібБе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Зо
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув пув Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240 с1і1у б1у Рго Бек Уаії Рпе Гпей Рпе Рго Рго Ппув Рго пув АБр ТПг Гей 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Нів біш Авр Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту Авп Бек ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іецш ТПпг Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 бо с1у пув бій Тук Ппув Сув Ппув Уа1! 5Бег Авп Гув Аза Те Рго Аза Рго 325 330 335
І1е бій пув ТПг о І1е Бек ув Аїа пув б1у бі1іп Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей ТПпПг Сув Гец Уаї Ппув б1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер бі Бек Авп с1у біп Рго бій Авп Авп Туг пув ТПг ТПс Рего 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445
Зо зек Рго 450 «2105» 161 «2115» 216 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» І1сі «4005» 161 сіп Бек А1їа еп ТПг о сбіп Рго Рго Бек Аїа Бек біу Бек Рго 0Ш1у с1іп 1 5 10 15 зек Уа1 ТПг Іїе Бек Сув біц с1у Рго Бек ТПг сіу Уаї с1у Авр Тукг 20 25 30
Ап оТер Уаї Нів Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув АТа Рго Ппув Іей 35 40 45
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе 50 55 бо 60 зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец
65 70 75 80 сіп Аїа бій АвБр біц Аза Авр Тукг Тук Сув біп ТПг Туг Аза Аїа Рго 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гец с1у сіп 100 105 110
Рго пув Аїа А1їа Рго Бек Ма1ї ТПг тей Рпе Рго Рго Бек Бек бій б1ц 115 120 125 теп біп Аїа АвБп о Гпув Аїа ТПг о Гец Уаї Сув Гец І1е Бек Авр РПе Туг 130 135 140
Рго с1у Аїа Уаї тТПпг Уаї Аїа Теср ув Аз1а Авр Бек Бек Рго Маї Гув 145 150 155 160
Аза с1у Маї бій ТПг Тс Тбг Рго Бек пув біп Бек Авп АвБп о Гув Туг 165 170 175
Аза Аза Бек Бек Туг Іец Бек Гей ТПг Рго бій сбіп Тгр пув бБег Нів 180 185 190
Зо
Агуд Бек Тук Бек Сув біп Уаї ТПпг Нів бі сіу Бек ТПг Уаї сіц Гув 195 200 205
ТПгЕ УМаії Аза Рго ТПг сій Сув бБег 210 215 «2105» 162 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 162 сіп Уаї бі1п Гецп Маї сбіц бек сб1у с1у с1у теп Уаї пув Рго С1у с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 60 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо
Агу с1у Агуд Рбе ТПг І1е Бек Агд АБр АБп о Аїа Ппув Ап о бБег Гей Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1а А1їа їешп с1і1у Сув геш Маї пув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уаї Ттіг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго
Зо 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув пув Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
СсСув Авр пув ТПг Нів ТБг о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бі Тук с1іп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго пув Рго пуб АБр ТПг Іецй 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Авр бій бій Рго бій Маї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі АвБр б1у Уа1 б1ци 275 280 285 60 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ
290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іецш ТПпг Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп пув Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335
І1е бій пув ТПг о І1е Бек ув Аїа пув б1у бі1іп Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 уаї Сув ТПг Ггецп Рго Рго Бек Агуд Авр сій Гей ТПг пуб Авп о біп Уаї 355 360 365 зек гей Тер Сув Гечш Уаї Ппув с1іу Рпе Туг Рго Бек АБр І1е Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Зо
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 ек Рго 450 «2105» 163 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 163 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 З 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30 60
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45
Зек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1ї1е Туг Туг А1а сій Бек Уаї 50 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125
Зек Ма1 Рпе Рго Гей Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг бек с1у Ш1уУу ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів пув Рго Бек Авп о ТПг пув Маії Авр пув пув Маї сій Рго Ппув Бег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240 сіу б1у Рго Бек Уа1і Рпе Гец Рпе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг Гецй 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270 60
Нів біш бій Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц
275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту Авп Бек ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іецш ТПпг Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп Авр Аїа Гец Рго Меєс Рго 325 330 335
І1е бій бій ТПг о І1е Бек ув А1їа пув б1у бі1іп Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350
Ууаї Тук ТПг Гей Рго Рго 5Бег Агуд Сув бій Гей ТПг пув Авп сіп Уаї 355 360 365 зек Гей Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Зо
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Уаі1ї Бек Гпув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Меє Нів біц Аїа Гей Нів АБп о Нів Туг ТПг біп Ппув Бек Ггечп Бек Іецй 435 440 445 зек Рго 450 «2105» 164 «2115» 450 «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005» 164 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 60 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПг Меє Авп Тгр Уаії Агуд біп Азїа Рго сб1у Ппув б1і1у Ге сій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї зо зо бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сі1іу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг пув 01У Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190
УМа1і1 Рго Бек Бек Бек тей с1у ТПпг сіп ТПг Тук ІчІ1е Сув Авп Уа1! Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув пув Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Рпе сіп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго пув Рго пуб АБр Уаї1ї Іец 245 250 255 60
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег
260 265 270
Авр бій бій Рго бій Маї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі АвБр б1у Уа1 б1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335
І1е сій Ппув ТПг І1е Бек Ппув Аїа пув с1у біп Рго Акд бій Рго сіп 340 345 350 уаї Сув ТПг Ггецп Рго Рго Бек Агуд Авр сій Гей ТПг пуб Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей Тер Сув Гец Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380
Зо сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Уа1 Авр пув Бек Агуд Тер бі1іп біп с1у Авп Уаї Ррпе Бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105» 165 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не 60 «4005» 165 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек гей Агд Гей бБег Сув Аїа Аїа бек біу Рпе ТПг Рпе Бек 5Бег Гпув 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Агуд тує б1у ув Агуд б1й1 Авр Меє Гей Тер Уа1 Рбпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго
Зо 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1ї1а Уаї Гей біп бек Бек с1у Гей Туг Бек Гей Бек Бек Уаї Ууаї тіг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув пув Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240 60
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец
245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Нів біш бій Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 с1у пув бій Тук Ппув Сув Ппув Уа1! 5Бег АвБп Авр Аза Іей Рго Аза Рго 325 330 335
І1е бій бій ТПг о І1е Бек ув А1їа пув б1у бі1іп Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агуд Сув сій Гей ТПг пуб Авп о біп Уаї 355 360 365
Зо зек Гей Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Уаї Ппецш Авр Бек Авр бі1у Бек Рпе Рпе Гей Уа1ї бек Ппув Гей ТЕГ 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105» 166 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність 60 «2205
«223» Не «400» 166 сіп Уаї біп Гей Уаї сій Бек сіу біу б1у тей Уаї пув Рго б01у щ1Уу 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг Атїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр
Зо 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160
Ма1 Бек Тер Авп Бек біу А1ї1а гейш ТПг Бек с1і1у Маї Нів ТПг РібБе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув пув Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220 60
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй
225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Нів біш бій Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Уаї Уа1 Бек Уаї Гей Рго Уа1ї! гец Нів сіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп Авр Аїа Гец Рго Пув Рго 325 330 335
Авр бій бій Тс о чІ1е Бек ув Аїа пув б1у бі1п Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350
Зо уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агуд Сув сій Гей ТПг пуб Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер бі Бек Авп с1у біп Рго бій Авп Авп Туг пув ТПг ТПс Рего 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Уаі1ї Бек Гпув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 60 «2105» 167 «2115» 450
«2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 167 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 З 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо
Агу с1у Агуд Рбе ТПг І1е Бек Агд АБр АБп о Аїа Ппув Ап о бБег Гей Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув
Зо 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1а А1їа їешп с1і1у Сув геш Маї пув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уаї Ттіг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205 60
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув пув Уа1 сій Рго Ппув бБег
210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Рпе сіп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго пув Рго пуб АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Авр бій бій Рго бій Маї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі АвБр б1у Уа1 б1ци 275 280 285 уа1 Нів АвБп Аїа пув ТПг о пув Рго Акуд бій бій б1п Туг АвБп АТїа ТЕПг 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335
Зо сій бій Ппув ТПг І1їе Бек Ппув Аїа Ппув біу біп Рго Агуд біц Рго сіп 340 345 350 уаї Сув ТПг Ггецп Рго Рго Бек Агуд Авр сій Гей ТПг пуб Авп о біп Уаї 355 360 365 зек гей Тер Сув Гечш Уаї Ппув с1іу Рпе Туг Рго Бек АБр І1е Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 60 век Ркго 450
«2105» 168 «2115» 450 «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005» 168 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 25 Зек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1ї1е Туг Туг А1а сій Бек Уаї бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 30 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935 35
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 40 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 45 Зек Ма1 Рпе Рго Гей Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг бек с1у Ш1уУу ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 50 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175 55
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 60 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп
195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув пув Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Нів біц бій Рко біц Маї Ппув Рпе Авп Тгр Тук Маї Авр сіу уУаї с1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320
Зо сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335 сі бій біц Тпг І1їе Бек Ппув Аїа Ппув біу біп Рго Агуд біц Рго сіп 340 345 350
Ууаї Тук ТПг Гей Рго Рго 5Бег Агуд Сув бій Гей ТПг пув Авп сіп Уаї 355 360 365 зек Гей Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Уаі1ї Бек Гпув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430 бо Меє Нів біц Аїа Гей Нів АБп о Нів Туг ТПг біп Ппув Бек Ггечп Бек Іецй 435 440 445 зек Рго «2105» 169 «2115» 310 «2125 БІЛОК «213» Ното варієпв «4005» 169
Мес с1у І1їе Ггецш Бек Рпе Гей Рго Уаі гей Аїа ТПг сій Бек Авр Тгр 1 5 10 15
Аза Авр Сув Ппув Бек Рго біп Рго Тер с1у Нів Меє Гей Ггец Тгр ТЕПг 20
А1ї1а уаї гей Рпе гей Аза Рго Уаі Аза с1у ТПг Рго Аза Аза Рго РгО 25 пув Аїа Уаі1 Ггешп Ппув Гец сбіц Рго сбіп Тер ч1І1їе Ап Уаї Ггец сіп с1іц бо 30 АБвр Бек Маї ТПг теп ТПг Сув Агуд біу ТПг Нів Бек Рго бій Бек Авр 65 70 75 80 зек І1е бі1іп Тер Рпе Нів Авп с1іу АвБп Гец І1е Рго ТПг Нів ТПпг сіп 35 85 90 935
Рго Бек Туг Агд Рпе ув А1їа АБп АБп АБп Авр Бек б1у бій Туг ТПпг 100 105 110 40
Сув біп ТП о с1іу біп ТпПг Бек Гей Бек Авр Рго Уаії Нів Те ТПг Уаї 115 120 125 45 теп Бек бій Тер ге уаї гей сіп ТПг Рго Нів Іец б1ц Рпе сіп с1и 130 135 140 50 сі1іу бій тТПг І1е Уаї Гей Агуд Сув Нів Бек Тер Гув Авр пув Рго Гей 145 150 155 160 уаї Ппув Маї ТПг Рпе Рпе біп Азп сіу Ппув Бек Ппув пуб Рпе 5ег Аг4д 55 165 170 175 век Авр Рго Авп Рпе Бек І1ї1е Рго біп Аза АБп о Нів Бек Нів Бек щу 180 185 190 60
Авр Тук Нів Сув ТПг б1у АБп чІ1е с1у Тук ТПг Гей Тук Бек Бек Гув 195 200 205
Рго Уаї ТПг І1е Тпг Уаї біп Аза Рго 5Бег бБег бек Рго Меє с1у І1е 210 215 220
І1е Уаї А1їа Уаї Уаї ТПпг с1у І1е А1ї1а Уаі Аза Аза І1е Уаі1і Аза Аїа 225 230 235 240 уаї Маї Аїа Ггецшп І1їе Тук Сув Агуд пув пуб Агуд ч11е б5Бег Аїа Гей Рго 245 250 255 сіу Тук Рго сбіц Сув Агуд біц Мес сіу біц ТПг Гец Рго біц Ппув Рго 260 265 270
Аза АБвп оРго ТПг АБп Рго АБр бій Аза АвБр губ Уаі1і с1у Аї1а 61 Авп 275 280 285
ТПг І1е ТПс Туг Бек Ггец Ггецш Меє Нів Рго АвБр Аза Гей сій бій Рго 290 295 300
Авр Авр сбіп АБп Аг І1е 305 310 «2105 170 «2115» 450 «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 170 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45
Зек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1ї1е Туг Туг А1а сій Бек Уаї 50 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг бо 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук б1у А1ї1а Агуд б1й Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сі1іу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг пув 01У Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190
УМа1і1 Рго Бек Бек Бек тей с1у ТПпг сіп ТПг Тук ІчІ1е Сув Авп Уа1! Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Нів біц бій Рко біц Маї Ппув Рпе Авп Тгр Тук Маї Авр сіу уУаї с1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 60 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335
І1е сій біш ТПг чІ1е Бек пув Аїа Ппув б1у біп Рго Агуд бій Рго сіп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей ТПпПг Сув Гец Уаї Ппув б1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Уа1 Авр пув Бек Агуд Тер бі1іп біп с1у Авп Уаї Ррпе Бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг біп сій бБег Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105 171 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 171 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Меє Авп Тер Уа1! Агуд біп Аїа Рго сіу Ппув б1у Гей сій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 60 зо 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Акуд Туєк б1у А1ї1а Агуд бій Авр Меє Ггецш Тгр Уаї Рбе Авр Туг Тер 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1ї1а Уаї Гей біп бек Бек с1у Гей Туг Бек Гей Бек Бек Уаї Ууаї тіг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Меє І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уа1ї 5ег 260 265 270
Нів біш бій Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 60 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 с1у пув бій Тук Ппув Сув Ппув Уа1! 5Бег АвБп Авр Аїа Тецй Рго Ппув Рго 325 330 335
Авр бій бій Тс о чІ1е Бек ув Аїа пув б1у бі1п Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей ТПпПг Сув Гец Уаї Ппув б1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Уаї Ппецш Авр Бек Авр б1і1у Бек Рпе Рпе Гей Туг Бек Ппув Гей ТЕГ 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї
Зо 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг біп сій бБег Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105 172 «2115» 217 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 172
Мес с1у І1їе Ггецш Бек Рпе Гей Рго Уаі гей Аїа ТПг сій Бек Авр Тгр 1 5 10 15
Аза Авр Сув Ппув Бек Рго біп Рго Тер с1у Нів Меє Гей Ггец Тгр ТЕПг 20 25 30
А1ї1а уаї гей Рпе гей Аза Рго Уаі Аза с1у ТПг Рго Аза Аза Рго РгО 35 40 45 бо пув Аїа уаї Ггешп пув Гей бій Рго біп Тер І1е АвБп Уаї Ггеш сіп с1ци 50 55 бо
Авр Бек Маї ТПг Іец ТПпг Сув Агуд с1у ТПг Нів Бек Рго біц бБег Авр 65 70 75 80 зек І1е бі1іп Тер Рпе Нів Авп с1іу АвБп Гец І1е Рго ТПг Нів ТПпг сіп 85 90 935
Рго Бек Туг Агд Рпе ув А1їа АБп АБп АБп Авр Бек б1у бій Туг ТПпг 100 105 110
Сув біп ТтТПг б1у б1іп Тбг Бек гей Бек Авр Рго Уаї Нів Гей ТПг Уаї 115 120 125 теп Бек бій Тер ге уаї гей сіп ТПг Рго Нів Іец б1ц Рпе сіп с1и 130 135 140 сі1у бій ТПпг ч1І1е Уаї гейш Агуд Сув Нів Бек Тгр їув Авр Гув Рго Іецй 145 150 155 160 уаї Ппув Маї ТПг Рпе Рпе біп Азп сіу Ппув Бек Ппув пуб Рпе 5ег Аг4д 165 170 175
Зо век Авр Рго Авп Рпе Бек І1ї1е Рго біп Аза АБп о Нів Бек Нів Бек щу 180 185 190
Авр Тук Нів Сув ТПг б1у Авп І1е сіу Тук ТПг Гей Туг Бек Бек Гув 195 200 205
Рго Уаї ТПг І1е ТПг Уаї сб1іп Аза Рго 210 215 «2105 173 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 173 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30 60
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї
35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї зо 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук б1у А1ї1а Агуд б1й Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сі1іу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг пув 01У Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160
Зо уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190
УМа1і1 Рго Бек Бек Бек тей с1у ТПпг сіп ТПг Тук ІчІ1е Сув Авп Уа1! Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270 бо Нів біц бій Рко біц Маї Ппув Рпе Авп Тгр Тук Маї Авр сіу уУаї с1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335 сі бій бі Того І1е Бек пув А1їа пув сС1у б1п Рго Агуд бій Рго с1іп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей ТПпПг Сув Гец Уаї Ппув б1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Зо
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Уа1 Авр пув Бек Агуд Тер бі1іп біп с1у Авп Уаї Ррпе Бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг біп сій бБег Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105 174 «2115» 254 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005 174
Мес Тер біп Ггецш Ггецш Ггецш Рго ТПг Аїа Гей Гей Гей Гей Уаї бек А1а 1 З 10 15 сіу Меє Агкуд ТПг біц Ар Гец Рго Ппув Аїа Уаї Уаї Рпе Ггец біц Рго 20 25 30 60 сіп Тер Туг Акуд Уаі Гецшц сіц Ппув Авр Бек Уаї ТПг Ггец пув Сув сіп 35 40 45 с1у Аїа Тук Бек Рго бій Авр АБп Бек ТПг с1іп Тер Рпе Нів Авп с1и 50 55 бо зек Гей Іїе Бек Бек сіп Аїа Бек Бек Тук Рпе Іїе АБр Аїа Аїа ТПг 65 70 75 80
Ууаї Авр Авр Бек б1у біц Тук Агуд Сув біп ТПг Абзп о Гей бек ТПг Гей 85 90 935 век Авр Рго Уаї сіп геш біш Ма1! Нів І1е сіу Тер Іецй Іецп Іец сіпП 100 105 110
Аза Рго Агуд Тер Уаії Рпе ув сій бі Авр Рго І1ї1е Нів Іец Агд Сув 115 120 125
Нів Бек Тер ув Авп о ТПг Аїа Гей Нів пув Ма1ї ТПг Туг тей сб1п Авп 130 135 140 с1у пув б1у Акуд Ппув Тук Рпе Нів Нів Авп Бек Авр Рпе Туг І1е Рго 145 150 155 160 пув Аїа ТПг Гецшп Ппув Авр Бек сіу Бек Тук Рпе Сув Агуд с1іу Гей Уаї 165 170 175 сіу Бек Ппув Авп Уаі Бек Бек біц ТПг Уаї Ап чІ1е ТПг І1е ТПг сіп 180 185 190 сіу Гей Бек Уа1 Бек ТПг Іїе Бек Бек Рпе Рпе Рго Рго с1у Тук сіп 195 200 205
Мма1 Бек Рпе Сув Гей Уа1ї Мес Уаї Гей їейп Рбе А1а Уаї Авр ТПг с01Уу 210 215 220 теп Тук Рпе Бек Уаії Ппув ТПг Авп ч1І1е Агуд Бек Бек ТПг Агуд АБр Тер 225 230 235 240
Тпув Авр Нів пув Рпе пуб Тер Агуд пув Авр о Рго біп Авр Гув 245 250 «2105 175 «2115» 254 «2125 БІЛОК бо «2135» Ното варієпв
«4005 175
Мес Тер біп Ггецш Ггецш Ггецш Рго ТПг Аїа Гей Гей Гей Гей Уаї бек А1а 1 5 10 15 сіу Меє Агкуд ТПг біц Ар Гец Рго Ппув Аїа Уаї Уаї Рпе Ггец біц Рго 20 25 30 сіп Тер Туг Акуд Уаі Гецшц сіц Ппув Авр Бек Уаї ТПг Ггец пув Сув сіп 35 40 45 с1у Аїа Тук Бек Рго бій Авр АБп Бек ТПг с1іп Тер Рпе Нів Авп с1и 50 55 бо зек Гей Іїе Бек Бек сіп Аїа Бек Бек Тук Рпе Іїе АБр Аїа Аїа ТПг 65 70 75 80
Ууаї Авр Авр Бек б1у біц Тук Агуд Сув біп ТПг Абзп о Гей бек ТПг Гей 85 90 935 век Авр Рго Уаї сіп геш біш Ма1! Нів І1е сіу Тер Іецй Іецп Іец сіпП 100 105 110
Зо
Аза Рго Агуд Тер Уаії Рпе ув сій бі Авр Рго І1ї1е Нів Іец Агд Сув 115 120 125
Нів Бек Тер ув Авп о ТПг Аїа Гей Нів пув Ма1ї ТПг Туг тей сб1п Авп 130 135 140 с1у пув б1у Акуд Ппув Тук Рпе Нів Нів Авп Бек Авр Рпе Туг І1е Рго 145 150 155 160 пув Аїа ТПг Гецп Ппув Авр Бек сіу Бек Тук Рпе Сув Агуд б1у Гецп РПе 165 170 175 сіу Бек Ппув Авп Уаі Бек Бек біц ТПг Уаї Ап чІ1е ТПг І1е ТПг сіп 180 185 190 сіу Гей Аїа Уа1 Бек ТПг Іїе Бек Бек Рпе Рпе Рго Рго с1у Тук сіп 195 200 205
Мма1 Бек Рпе Сув Гей Уа1ї Мес Уаї Гей їейп Рбе А1а Уаї Авр ТПг с01Уу 210 215 220 теп Тук Рпе Бек Уаії Ппув ТПг Авп ч1І1е Агуд Бек Бек ТПг Агуд АБр Тер бо 225 230 235 240
Тпув Авр Нів пув Рпе пуб Тер Агуд пув Авр о Рго біп Авр Гув 245 250 «2105 176 «2115» 208 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 176
Мес Тер біп Ггецш Ггецш Ггецш Рго ТПг Аїа Гей Гей Гей Гей Уаї бек А1а 1 5 10 15 сіу Меє Агкуд ТПг біц Ар Гец Рго Ппув Аїа Уаї Уаї Рпе Ггец біц Рго 20 сіп Тер Туг Акуд Уаі Гецшц сіц Ппув Авр Бек Уаї ТПг Ггец пув Сув сіп 25 с1у Аїа Тук Бек Рго бій Авр АБп Бек ТПг с1іп Тер Рпе Нів Авп с1и бо зек Гей Іїе Бек Бек сіп Аїа Бек Бек Тук Рпе Іїе АБр Аїа Аїа ТПг 30 65 70 75 80
Ууаї Авр Авр Бек б1у біц Тук Агуд Сув біп ТПг Абзп о Гей бек ТПг Гей 85 90 935 35 век Авр Рго Уаї сіп геш біш Ма1! Нів І1е сіу Тер Іецй Іецп Іец сіпП 100 105 110 40
Аза Рго Агуд Тер Уаії Рпе ув сій бі Авр Рго І1ї1е Нів Іец Агд Сув 115 120 125 45 Нів Бек Тер ув Авп о ТПг Аїа Гей Нів пув Ма1ї ТПг Туг тей сб1п Авп 130 135 140 с1у пув б1у Акуд Ппув Тук Рпе Нів Нів Авп Бек Авр Рпе Туг І1е Рго 50 145 150 155 160 пув Аїа ТПг Гецп Ппув Авр Бек сіу Бек Тук Рпе Сув Агуд б1у Гецп РПе 165 170 175 55 сіу Бек Ппув Авп Уаі Бек Бек біц ТПг Уаї Ап чІ1е ТПг І1е ТПг сіп 180 185 190 60 сіу Гей Аїа Уа1 Бек ТПг Іїе Бек Бек Рпе Рпе Рго Рго с1у Тук сіп
195 200 205 «2105 177 «2115» 208 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 177
Мес Тер біп Ггецш Ггецш Ггецш Рго ТПг Аїа Гей Гей Гей Гей Уаї бек А1а 1 5 10 15 сіу Меє Агуд ТПг сій Авр тей Рго пув Аїа Уа1ї Уаї Рпе гецп с1и Рго сіп Тер Туг Акуд Уаі Гецшц сіц Ппув Авр Бек Уаї ТПг Ггец пув Сув сіп 20 35 40 45 с1у А1а Туг Бек Рго бій Авр Авп Бек ТПг о біп Тер Рпе Нібв АБп сС1и 50 55 бо 25 зек Гей Іїе Бек Бек сіп Аїа Бек Бек Тук Рпе Іїе АБр Аїа Аїа ТПг 65 70 75 80
Зо
Ууаї Авр Авр Бек б1у біц Тук Агуд Сув біп ТПг Абзп о Гей бек ТПг Гей 85 90 935 век Авр Рго Маї сіп еп біц Уаї Нів І1е сС1у Тгр гец Ггец Гей сіп 100 105 110
Аза Рго Агуд Тер Уаії Рпе ув сій бі Авр Рго І1ї1е Нів Іец Агд Сув 115 120 125
Нів Бек Тер Пув АвБп о ТПг Аза тей Нів пув Ма1 ТПг Тук гец сбіп Авп 130 135 140 с1у пув б1у Акуд Ппув Тук Рпе Нів Нів Авп Бек Авр Рпе Туг І1е Рго 145 150 155 160 пув Аїа ТПг Гецшп Ппув Авр Бек сіу Бек Тук Рпе Сув Агуд с1іу Гей Уаї 165 170 175 сіу Бек пув Авп Уаї Бек Бек б1іц ТПг Уаї АвБп чІ1е ТПг І1е ТтПгс с1іп 180 185 190 сіу Гей Аїа Уа1 Бек ТПг Іїе Бек Бек Рпе Рпе Рго Рго с1у Тук сіп 60 195 200 205
«2105 178 «2115 233 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005 178
Мес Тер біп Ггецш Ггецш Ггецш Рго ТПг Аїа Гей Гей Гей Гей Уаї бек А1а 1 З 10 15 сіу Меє Агкуд ТПг біц Ар Гец Рго Ппув Аїа Уаї Уаї Рпе Ггец біц Рго 20 25 30 сіп Тер Тук Бек Уаі1і Ггецшц сіц Ппув Авр Бек Уаї ТПг Ггец пув Сув сіп 35 40 45 с1у А1а Туг Бек Рго бій Авр Авп Бек ТПг о біп Тер Рпе Нібв АБп сС1и 50 55 бо
Ззек Гей І1е Бек Бек біп Аїа бек Бек Тук Рпе І1е АБр Аза Аїа ТЕПг 65 70 75 80
Ууаї Авп Авр Бек б1у біц Тук Агуд Сув біп ТПг Абзп о Гей бек ТПг Гей
Зо 85 90 935 век Авр Рго Уаї сіп геш біш Ма1! Нів І1е сіу Тер Іецй Іецп Іец сіпП 100 105 110
Аза Рго Агуд Тер Уаії Рпе ув сій бі Авр Рго І1ї1е Нів Іец Агд Сув 115 120 125
Нів Бек Тер Пув АвБп о ТПг Аза тей Нів пув Ма1 ТПг Тук гец сбіп Авп 130 135 140 с1у пув Авр Агуд пув Туг Рпе Нів Нів Авп бБег Авр Рпе Нів І1е Рго 145 150 155 160 пув Аїа ТПг Гецшп Ппув Авр Бек сіу Бек Тук Рпе Сув Агуд с1іу Гей Уаї 165 170 175 сіу Бек Ппув Авп Уаі Бек Бек біц ТПг Уаї Ап чІ1е ТПг І1е ТПг сіп 180 185 190 сіу Гей Аїа Уа1 Бек ТПг Іїе Бек Бек Рпе Бек Рго Рго с1у Тук сіп 195 200 205 60
Ууаї Бек Рпе Сув Ггецш Уаї Мес Уаї Ггецш гей Рпе Аїа Уаії Авр ТПг с01У
210 215 220 теп Тук Рпе Бек Уаї Ппув ТПг Ап І1е 225 230 «2105 179 «2115» 365 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 179
Меє с1у Маї Рго Агуд Рго біп Рго Тер Аїа тецш с1у Гей Гей Іецй РБПе 1 5 10 15
Тїец тей Рго сіу Бек Ггеш с1у Аза сіц Бек Нів Іец Бек Іец Іец Туг 20 25 30
Нів гейш ТПг Атїа Уаї Бек Бек Рго А1їа Рго с1іу ТПг Рго Аза Роіе Тгр 35 40 45 уаї Бек б1у Тер Гецш б1у Рго біп біп Тук Гей бек Тук Авп бБег Гей 50 55 бо
Зо
Ага сб1у бій Азїа бій Рго Сув б1у А1ї1а Тгр Уаі1і Тер бій АвБп сіп Уаї1ї 65 70 75 80 зек Тер Ту Тер біш пув бій ТПг Тбг Авр їец Агуд чІ1е пув біч Гув 85 90 935 теп Рпе Гей сіц Аїа Рпе Ппув Аїа Гец сіу с1і1у Ппув б1у Рго Тук ТПг 100 105 110
Те біп сіу Гешп Гец сіу Сув біц Гец б1у Рго АвБр Ап ТПг бек Уаї 115 120 125
Рго ТПг Аїа пув Рпе Аза тей Авп б1у бій бій Рпе Меєс АвБп РПпе Авр 130 135 140 теп пув біп сіу ТПг Тер с1у б1у Авр Тер Рго біц Аза Гец Аїа Іїе 145 150 155 160
Ззек біп Агд Тер біп б1іп б1іп Авр пув Аїа Аїа АБп о пув бі Гей ТПг 165 170 175
Рпе гец гец РпПе Бек Сув Рго Нів Агуд гей Агуд сій Нів гец сбіц Агд 60 180 185 190 сіу Агкуд б1у АБп Гец біц Тер Пув біц Рго Рго Бек Мес Агд Гей Гувг 195 200 205
Аза Аг Рго Бек Бек Рго бі1у Рпе бБег Уаі Гей ТПг Сув Бек Аїа РПе 210 215 220 зек Рпе Тугк Рго Рго біц Гей сіп Гей Агуд Рбе ей Агуд АБп с1Уу Гей 225 230 235 240
Аза Аїа с1у ТПг с1у біп б1у Авр Рпе б1у Рго Авп бБег АБр б1у б5ег 245 250 255
Рпе Нів Аїа Бек Бек Бек Гей ТПг Уаї пув Бек с1у Авр біц Нів Нів 260 265 270 тТук Сув Сув І1е Уаї сіп Нів Аза б1у гей Аза сіп Рго Гей Агд Уаї 275 280 285 сій Гей біц Бек Рго Аїа Ппув Бек Бек Уаії Ггецш Уаї Уаї с1у І1е Уаї 290 295 300
І1е с1у Уаї тей Ггеш Гей ТПг АТїа Аїа А1ї1а Уаї сіу сС1у А1їа Гей Гей 305 310 315 320
Тгр Агуд Агуд Меє Агуд Бек сб1у Гей Рго Аза Рго Тгр І1е б5Бег Іей Аг4д 325 330 335 сіу Авр Авр ТПг сіу Уаі1ї Ггец Гец Рго ТПг Рго с1у біц Аза сбіп АБр 340 345 350
А1ї1а Авр гей пув Авр Уаії АвБп Уаі І1е Рго Аза ТПг Аза 355 360 365 «2105» 180 «2115» 119 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 180
Мес Бек Агуд Бек Уаі Аїа гец Аїа Уаії гей Аїа Гей Гей бек Гей б5ег 1 5 10 15 сіу Гей біц Аза І1їе сіп Агуд ТПг о Рго Ппув ч1І1іе сбіп Уаї Тук Бек Агд 20 25 30 60
Нів Рго Аїа сіц Авп о біу пув Бек Авп Рпе Гей Ап Сув Тук Уаї бБег
35 40 45 с1у Рпе Нів Рго Бек Авр чІ1е сіц Уаї Авр їец Іецшц Гув АБп с1у с1и зо зо бо
Агуд ч11е сіц пув Уаї бі1ц Нів Бек Авр Гей Бек Рпе Бек пув Авр Тгр 65 70 75 80 век Рпе Тук Гецш Гец Тук Тук ТПг біц Рпе ТПг Рго ТПг бі Гпув АБр 85 90 935 сі тує А1ї1а Сув Агкуд Маі1і Авп Нів Уаї ТПг Іец Бек біп Рго пув І1е 100 105 110 ма1 пув Тер Авр Агд Авр Мес 115 «2105» 181 «2115» 580 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 181
Зо
Мес Аїа сбі1у ТПг Уаії Агуд ТПг Аза Сув Гей Уаії Уаї Аїа Меє Гей Гей 1 5 10 15 зек гей Авр Рпе Рго б1і1у сіп Аїа сіп Рго Рго Рго Рго Рго Рго Ар 20 25 30
А1їа тпПг Сув Нів біп Уаї Агуд Бек Рпе Рпе сбіп Агд Гей сіп Рго с01Уу 35 40 45
Теч пув Тер Уаі1і Рго біц ТПг Рго Уаї Рго сбіу Бек Авр Гецй сіп Уаї 50 55 бо
Сув Гей Рго Ппув с1іу Рго ТПг Сув Сув Бек Агд Пув Месє сбіц сбіц Гув 65 70 75 80
Тук біп гей ТПг Аза Агуд Гей Авп Меє сій сіп Гей Гей сіп бек А1а 85 90 935
Зек Меє сбіш Ггешп Ппув Рпе тей І1е І1е сіп Авп Аїа А1їа Уаї Рпе сіп 100 105 110 сі Аза Рпе сій І1ї1е Ууаї Уаі1 Агуд Нів Аїа їув АвБп о Туг ТПг АвБп Аїта 60 115 120 125
Мес Рпе Ппув Авп о Авп о Туг Рго Бек Гей ТПг Рго сіп Аїа Рпе сій РіПе 130 135 140 уаї 61у біц Рпе Рпе ТПг Авр Уаії бек гей Тугк І1е Гей сіу Бек Авр 145 150 155 160
І1е Авп Уа1 Авр Авр Меє Уаії Авп бій Ггеш Рпе Авр бБег Іецй РоПе Рго 165 170 175 уаї ІчІїе Тук ТПг біп Ггецш Месб Абзп Рго сіу Гей Рго Авр бек Аїа Гей 180 185 190
Авр ч11е АБп бій Сув тей Агуд б1у А1а Агу Агу АБр Гей Гув Уа1 РПе 195 200 205 сіу АвБп Рпе Рго Ппув Гец Іїе Мес ТПг сіп Уаї Бек Ппув Бек Гец сіп 210 215 220 уаї тПпг Агуд ч1І1е Рпе Ггецш сбіп Аїа Гей Абзп Гей сіу ч11е сій Уаї І1е 225 230 235 240
АБпотТПг Тбг Авр о Нів Ггеш Ппув Рбпе Бек пув Авр Сув с1у Агуд Меє Гей 245 250 255
ТПгЕ Агуд Меє Тгр Тук Сув бек Тугк Сув біп сі1у Ппейп Меє Меє Уаї Гуз 260 265 270
Рго Сув б1у с1у Ту Сув АвБп УМаії УМаї Меє бі1іп сб1у Сув Меє А1а щ1Уу 275 280 285 уаї уаї біц І1їе Авр Ппув Туг Тгр Агд бій Тук І1е Гей бек гей сій 290 295 300 сій Гей Уаі1 АвБп сіу Мес Туг Агуд І1е Туг Авр Мес біц Авп Уаї Гей 305 310 315 320 пес б1і1у ге Рпе Бек ТПг І1е Нів Авр Бек І1ї1е біп Тук Уаї с1іп ГПув 325 330 335
Ап Аза сі1у Ппув тей ТПг ТПпг ТПпгс ч1І1е с1у пув Гей Сув АтТа Нів бБег 340 345 350 сіп біп Агуд біп Туг Агуд Бек Аїа Тук Тук Рго біц Ар Гец РпПе Іїе 355 360 365 60
Авр пув пув Маї Іец туз Ууаї Аїа Нів уаї сбіш НівБ сіц сіц ТПг Іей 370 375 380 зек век Агуд Агд Агуд біц Гей чІ1е сіп Пув Гецш пув Бек Рпе Іїе 5ег 385 390 395 400
Рпе Тук Бек А1їа Іец Рго сі1у Туг І1їе Сув Бек Нів Бек Рго Уаї А1а 405 410 415 бій АвБп о Авр ТпПг Гей Сув Тер АБп о сіу біп біц Гец Уаї біц Агд Ттуг 420 425 430 зек біп гув Аза Аза Агуд Авп о сіу Месє пув Авп обіп Рпе Ап Гей Нів 435 440 445 сій Гешп Ппув Меєсє Ппув сіу Рго біц Рго Уаї Уаї Бек біп І1е І1е Авр 450 455 460 ув Гей пув Нів І1е АвБп біп Ггец Гец Акуд ТПг Меєс бек Меє Рго ув 465 470 475 480 сіу Агкуд Уа1 Ггец Авр Ппув Авп Гец Авр біц біц сб1у Рпе сій бек с01Уу
Зо 485 490 495
Авр Сув б1у Авр АБр бій АБр бій Сув І1е с1у б1у Бек 01у АБр Щ1У 500 505 510
Мес чІ1їе пув Маії Ппув Авп біп Ггец Агуд Рпе гей Аїа сій гей Аїа Туг 515 520 525
Авр гей Авр Маії Авр АвБр А1а Рго б1у АвБп Бек біп біп Аза ТПг РгОо 530 535 540 ув Авр АБп обі І1е Бек ТПг Рпе Ні Авп Гей б1іу АвБп Уаї Нів бБег 545 550 555 560
Рго пе пуб пгей тей ТПг Бек Меє Аза І1е Бек Уа1 Уа1 Сув Рпе РПе зЗ65 570 575
Рпе Гечц Уа1 Нів 580 «2105 182 «2115» 450 «2125 БІЛОК 60 «213» Штучна послідовність
«223» Не «4005 182 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У 1 5 10 15 зек гей Агд Гей бБег Сув Аїа Аїа бек біу Рпе ТПг Рпе Бек 5Бег Гпув 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Туг А1а Агуд Бек Уаї 50 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Агуд тує б1у ув Агуд б1й1 Авр Меє Гей Тер Уа1 Рбпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1ї1а Уаї Гей біп бек Бек с1у Гей Туг Бек Гей Бек Бек Уаї Ууаї тіг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220 60
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Рпе сіп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Уаї Рпе Гей Рпе Рго Рго ПпувБ Рго Ппув Авр Уаї Ієй 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Авр бій бій Рго бій Маї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі АвБр б1у Уа1 б1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 с1у пув бій Тук Ппув Сув Ппув Уа1! 5Бег АвБп Авр Аза Іей Рго Аза Рго 325 330 335
І1е бій пув ТПг о І1е Бек ув Аїа пув б1у бі1іп Рго Агуд бій Рго біп
Зо 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд пув сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей ТПпПг Сув Гец Уаї Ппув б1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Уаї Ппецш Авр Бек Авр б1і1у Бек Рпе Рпе Гей Туг Бек Ппув Гей ТЕГ 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 60 «2105» 183
«2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 183 сіп Уаї бі1п Гецп УМаї сбіц бек сб1у с1у с1у Уа1 Ууаї б1іп Рго С1у с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 20 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Туг А1а Агуд Бек Уаї бо 25
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 30 пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг Атїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 35 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 40 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140 45
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 50 Ма1 Бек Тер Авп Бек біу А1ї1а гейш ТПг Бек с1і1у Маї Нів ТПг РібБе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 55 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205 60
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
СсСув Авр пув ТПг Нів ТБг о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго біц Рпе с1іп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго пув Рго пуб АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Авр бій бій Рго бій Маї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі АвБр б1у Уа1 б1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Уаї Уа1 Бек Уаї Гей Рго Уа1ї! гец Нів сіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго
Зо 325 З3о 335 сій бій Ппув ТПг І1їе Бек Ппув Аїа Ппув біу біп Рго Агуд біц Рго сіп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд пув сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей ТПпПг Сув Гец Уаї Ппув б1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер бі Бек Авп с1у біп Рго бій Авп Авп Туг пув ТПг ТПс Рего 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 60 зек Рго
«2105» 184 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 184 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У 1 З 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 25 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Туг А1а Агуд Бек Уаї бо 30 Агу с1у Агуд Рбе ТПг І1е Бек Агд АБр АБп о Аїа Ппув Ап о бБег Гей Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 35 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 40 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 45 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140 50 А1а А1їа їешп с1і1у Сув геш Маї пув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уаї Ттіг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 55 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 60 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів пув Рго Бек Авп о ТПг пув Маії Авр гув Агуд Уаї сій Рго Ппув Бег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Рпе сіп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго пув Рго пуб АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Авр бій бій Рго бій Маї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі АвБр б1у Уа1 б1ци 275 280 285 уа1 Нів АвБп Аїа пув ТПг о пув Рго Акуд бій бій б1п Туг АвБп АТїа ТЕПг 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335
І1е бій пув ТПг о І1е Бек ув Аїа пув б1у бі1іп Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд пув сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей ТПг Сув Гей Уа1ї пув с1у Рпе Туг Рго Бек АвБр ІчІ1е Аїа Уаї1ї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430 60
Мен Нів сій АТа гейш Ні Аїа Нів ТПг ТПпг Агд пув бій Гей Бек Іец
435 440 445 зек Рго 450 «2105» 185 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 185 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45
Зек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1ї1е Туг Туг А1а сій Бек Уаї 50 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук б1у А1ї1а Агуд б1й Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125
Зек Ма1 Рпе Рго Гей Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг бек с1у Ш1уУу ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175 60
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190
Ууаї Рго Бек бБег Бек Гей с1і1у ТПг біп Тпг Тук І1е Сув Авп Уа1ї! Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Нів біц бій Рко біц Маї Ппув Рпе Авп Тгр Тук Маї Авр сіу уУаї с1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп Авр Аїа Гец Рго Пув Рго 325 330 335
Авр бій бій Тс о чІ1е Бек ув Аїа пув б1у бі1п Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 мМма1т1 Ттук ТПпг Гей Рго Рго Бек Агд сій біш Мес ТПг о пув Авп сбіп Уаї 355 360 365 зек Гей ТПпПг Сув Гец Уаї Ппув б1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415 60
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї
420 425 430
Мен Нів сій АТа гейш Нів Аїа Нів ТПг ТПпг Агд бій бі Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105» 186 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005» 186 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Меє Авп Тер Уа1! Агуд біп Аїа Рго сіу Ппув б1у Гей сій Тгр Уаї зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Туг А1а Агуд Бек Уаї 35 зо 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 40 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935 45
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сі1іу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг пув 01У Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 60 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї1ї пеп біп Бек Бек бі1у Гей Туг б5Бег Гей бБег бек Уаї Уаї ТтПг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Рпе сіп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго пув Рго пуб АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Меє І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уа1ї 5ег 260 265 270
Авр бій бій Рго бій Маї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі АвБр б1у Уа1 б1ци
Зо 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335 сі бі пув ТПг о І1е Бек пув А1ї1а пув С1у б1п Рго Агуд бій Рго с1іп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд пув сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 З6о 365 зек Гей ТПпПг Сув Гец Уаї Ппув б1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400 60
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг
405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гейш Ні Аїа Нів ТПг ТПпг Агд пув бій Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105» 187 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 187 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У 1 5 10 15 зек гей Агд Гей бБег Сув Аїа Аїа бек біу Рпе ТПг Рпе Бек 5Бег Гпув 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Акуд Туєк б1у А1ї1а Агуд бій Авр Меє Ггецш Тгр Уаї Рбе Авр Туг Тер 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140 60
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160
Ма1 Бек Тер Авп Бек біу А1ї1а гейш ТПг Бек с1і1у Маї Нів ТПг РібБе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго Ппув Рго Ппув Авр Уаї Ієй 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег
Зо 260 265 270
Нів біш бій Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 с1у пув бій Тук Ппув Сув Ппув Уа1! 5Бег АвБп Авр Аза Іей Рго Аза Рго 325 330 335 сі бій біц Тпг І1їе Бек Ппув Аїа Ппув біу біп Рго Агуд біц Рго сіп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей ТПпПг Сув Гец Уаї Ппув б1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 60 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго
385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гейш Нів Аїа Нів ТПг ТПпг Агд бій бі Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105» 188 «2115» 216 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» І1сі «4005 188 сіп Бек А1їа еп ТПг о сбіп Рго Рго Бек Аїа Бек біу Бек Рго 0Ш1у с1іп 1 5 10 15 зек Уа1 ТПг Іїе Бек Сув біц с1у Рго Бек ТПг сіу Уаї с1у Авр Тукг 20 25 30
ТпПг Тук Маі1 Нів Тер Тук біп бі1іп Нів Рго б1у Ппув АТа Рго Ппув Іей 35 40 45
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе 50 55 бо зек біу Бек Ппув Бек сіу АвБп ТПг Аїа Бек Гец ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа б1ц Авр сій АтТа Авр Туг Тук Сув сб1іп ТПг ТтТуг Аїа Аїа Рго 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гец с1у сіп 100 105 110
Рго пув Аїа А1їа Рго Бек Ма1ї ТПг тей Рпе Рго Рго Бек Бек бій б1ц 115 120 125 60 гА1 теп біп Аїа АвБп о Гпув Аїа ТПг о Гец Уаї Сув Гец І1е Бек Авр РПе Туг 130 135 140
Рго с1у Аїа Уаї Тпг Уаї Аїа Тер пув Аїа Авр бек Бек Рго Уаї Гув 145 150 155 160
Аза с1у Маї бій ТПг Тс Тбг Рго Бек пув біп Бек Авп АвБп о Гув Туг 165 170 175
Аза Аза Бек Бек Туг Іец Бек Гей ТПг Рго бій сбіп Тгр пув бБег Нів 180 185 190
Агуд Бек Тук Бек Сув біп Уаї ТПпг Нів бі сіу Бек ТПг Уаї сіц Гув 195 200 205
ТПгЕ УМаії Аза Рго ТПг сій Сув бБег 210 215 «2105» 189 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 189 сі Уаї бі1п Гешп Маї сбіц бек сб1у с1у с1у теп Уаї пув Рго С1у с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї бо 50 пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 55 пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг Атїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 60 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1а А1їа їешп с1і1у Сув геш Маї пув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уаї Ттіг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув пув Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
СсСув Авр пув ТПг Нів ТБг о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго сіц Ге Іецй 225 230 235 240 сіу б1у Рго Бек Уа1і Рпе Гец Рпе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг Гецй 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Нів біш Авр Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту Авп Бек ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Уаї Уа1 Бек Уаї Гей ТПг Уаї Ггец Нів сіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп пув Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 З3о 335
І1е бій пув ТПг о І1е Бек ув Аїа пув б1у бі1іп Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 60 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей ТПпг Сув Гечп Маї Ппув с1іу Рпе Туг Рго Бек АБр І1е Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 ек Рго 450 «2105» 190
Зо «211» 218 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» І1сі «4005 190
Авр І1е УМаї Меє ТПг біп Бек Рго Іеий Бек тей Рго Уаі ТПпг Рго Щ1У 1 З 10 15 бій Рго Аїа Бек Іїе Бек Сув біп сбіу Рго Бек ТПг сб1у Уаії 01Уу Авр 20 25 30
Тук Авп Тук Уаї Нів Тер Ту бі1іп сбіп пув Рго с1у сіп Аза Рго Агд 35 40 45
Теч Геп Іїе Тук Рпе ТПг Бек Ппув Ппув Рго Бек біу Уаї Рго Авр Агд 50 55 бо
Рпе Бек с1у Бек с1у Бек с1у ТПг Авр Рпе ТПг Гей пув І1е 5ек Агд 65 70 75 80 уаї бі Аза біц Авр Уаї сіу Ма1і Тук Тук Сув сіп ТПг Туг Аї1а А1а 60 85 90 935 гАА
Рго Пец б1у Рго Меє Рпе б1у біп б1у ТпПг губ ей бій І1їе Гув Аг4д 100 105 110
ТПг Маії Аза А1їа Рго Бек Уаі Рпе І1е Рбпе Рго Рго бБег АБр бій біп 115 120 125 еп пув Бек с1іу ТПг Аїа бек Уа1 Уаї Сув Пец їецш АБп АБп Рпе Туг 130 135 140
Рго Агуд бій Аїа пув Маї біп Тер пув Уаії АвБр АБп Аза Іецй біп б5ег 145 150 155 160 сіу АвБп Бек біп сбіц Бек Уа1і ТПг біц біп Авр Бек Ппув Авр Бек ТПг 165 170 175
Ттук Бек Гей бек бек ТПг Гей ТПг Гей бек пув Аїа Авр Ту бі Гуз 180 185 190
Нів пув Ма1 Тук Аїа Сув біц Уаї ТПпг Нів сіп с1у Гей Бек Бек Рго 195 200 205
Уа1 тпг пув Бек Рпе АБп Агуд с1у січ Сув 210 215 «2105» 191 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 191 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 З 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо бо пув б1у Агд Рпе ТПг І1їе 5Бег Агуд Авр АБп Аїа їув АБп Бек Іецч Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125
Зек Ма1 Рпе Рго Гей Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг бек с1у Ш1уУу ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190
Зо уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів пув Рго Бек Авп о ТПг пув Маії Авр гув Агуд Уаї сій Рго Ппув Бег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Рпе сіп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго пув Рго пуб АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Авр бій бій Рго бій Маї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі АвБр б1у Уа1 б1ци 275 280 285 уа1 Нів АвБп Аїа пув ТПг о пув Рго Акуд бій бій б1п Туг АвБп АТїа ТЕПг 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп бо 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335
І1е бій пув ТПг о І1е Бек ув Аїа пув б1у бі1іп Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 мМма1т1 Ттук ТПпг Гей Рго Рго Бек Агд сій біш Мес ТПг о пув Авп сбіп Уаї 355 360 365 зек Гей Тер Сув Гец Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Меє Нів біц Аїа Гей Нів АБп о Нів Туг ТПг біп Ппув Бек Ггечп Бек Іецй 435 440 445 зек Рго 450 «2105 192 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 192 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 бо Зек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1ї1е Туг Туг А1а сій Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сі1іу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг пув 01У Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
Зо
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190
УМа1і1 Рго Бек Бек Бек тей с1у ТПпг сіп ТПг Тук ІчІ1е Сув Авп Уа1! Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Нів біц бій Рко біц Маї Ппув Рпе Авп Тгр Тук Маї Авр сіу уУаї с1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ бо 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп Авр Аїа Гец Рго Пув Рго 325 330 335
АБр бій сій ТБг очІ1е Бек Ппув Аїа пув б1у біп Рго Акд бій Рго сіп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Уаі1ї Бек Гпув Іецй ТПг 405 410 415
Уа1 Авр пув Бек Агуд Тер бі1іп біп с1у Авп Уаї Ррпе Бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105 193 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 193 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30 бо ТПгЕ Меє Авп Тер Уа1! Агуд біп Аїа Рго сіу Ппув б1у Гей сій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Агуд тує б1у ув Агуд б1й1 Авр Меє Гей Тер Уа1 Рбпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160
Зо уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1ї1а Уаї Гей біп бек Бек с1у Гей Туг Бек Гей Бек Бек Уаї Ууаї тіг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Рпе сіп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго пув Рго пуб АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Меє І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уа1ї 5ег 260 265 270
Авр бій бій Рго бій Маї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі АвБр б1у Уа1 б1ци 60 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 с1у пув бій Тук Ппув Сув Ппув Уа1! 5Бег АвБп Авр Аза Іей Рго Аза Рго 325 330 335 сій бій Ппув ТПг І1їе Бек Ппув Аїа Ппув біу біп Рго Агуд біц Рго сіп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей Тер Сув Гец Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Уаї Ппецш Авр Бек Авр б1і1у Бек Рпе Рпе Гей Туг Бек Ппув Гей ТЕГ 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105» 194 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 194 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 бо зек гей Агд Гей бБег Сув Аїа Аїа бек біу Рпе ТПг Рпе Бек 5Бег Гпув 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг Атїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
Зо
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160
Ма1 Бек Тер Авп Бек біу А1ї1а гейш ТПг Бек с1і1у Маї Нів ТПг РібБе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго Ппув Рго Ппув Авр Уаї Ієй 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 60 260 265 270
Нів біш бій Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Уаї Уа1 Бек Уаї Гей Рго Уа1ї! гец Нів сіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335 сі бій біц Тпг І1їе Бек Ппув Аїа Ппув біу біп Рго Агуд біц Рго сіп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер бі Бек Авп с1у біп Рго бій Авп Авп Туг пув ТПг ТПс Рего 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Уаі1ї Бек Гпув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105» 195 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 195 бо сі Уаї бі1п Гешп Маї сбіц бек сб1у с1у с1у теп Уаї пув Рго С1у с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агд Рпе ТПг І1їе 5Бег Агуд Авр АБп Аїа їув АБп Бек Іецч Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125
Зо зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1а А1їа їешп с1і1у Сув геш Маї пув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уаї Ттіг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
СсСув Авр пув ТПг Нів ТБг о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго біц Рпе с1іп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго пув Рго пуб АБр Уаї1ї Іец 60 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Авр бій бій Рго бій Маї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі АвБр б1у Уа1 б1ци 275 280 285 уа1 Нів АвБп Аїа пув ТПг о пув Рго Акуд бій бій б1п Туг АвБп АТїа ТЕПг 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335
І1е бій пув ТПг о І1е Бек ув Аїа пув б1у бі1іп Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек гей Тер Сув Гечш Уаї Ппув с1іу Рпе Туг Рго Бек АБр І1е Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гейш Ні Аїа Нів ТПг ТПпг Агд пув бій Гей Бек Іец 435 440 445 век Ркго 450 «2105» 196 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 бо «223» Не
«4005» 196 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45
Зек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1ї1е Туг Туг А1а сій Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110
Зо сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125
Зек Ма1 Рпе Рго Гей Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг бек с1у Ш1уУу ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів пув Рго Бек Авп о ТПг пув Маії Авр гув Агуд Уаї сій Рго Ппув Бег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй бо 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Нів біц бій Рко біц Маї Ппув Рпе Авп Тгр Тук Маї Авр сіу уУаї с1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп Авр Аїа Гец Рго Пув Рго 325 330 335
Авр бій бій Тс о чІ1е Бек ув Аїа пув б1у бі1п Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 мМма1т1 Ттук ТПпг Гей Рго Рго Бек Агд сій біш Мес ТПг о пув Авп сбіп Уаї 355 360 365 зек Гей Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Уаі1ї Бек Гпув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Меє Нів біц Аїа Гей Нів Аза Ні ТПг ТПг Агуд пув бій Гей бек Іецй 435 440 445 зек Рго 450 «2105» 197 «2115» 450 бо «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність
«223» Не «4005 197 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Меє Авп Тер Уа1! Агуд біп Аїа Рго сіу Ппув б1у Гей сій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї зо 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Зо
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сі1іу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг пув 01У Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190
УМа1і1 Рго Бек Бек Бек тей с1у ТПпг сіп ТПг Тук ІчІ1е Сув Авп Уа1! Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег бо 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Рпе сіп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго пув Рго пуб АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Меє І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уа1ї 5ег 260 265 270
Авр бій бій Рго бій Маї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі АвБр б1у Уа1 б1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335 сі бі пув ТПг о І1е Бек пув А1ї1а пув С1у б1п Рго Агуд бій Рго с1іп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей Тер Сув Гец Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Уа1 Авр пув Бек Агуд Тер бі1іп біп с1у Авп Уаї Ррпе Бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гейш Ні Аїа Нів ТПг ТПпг Агд пув бій Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 60
«2105» 198 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 198 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек гей Агд Гей бБег Сув Аїа Аїа бек біу Рпе ТПг Рпе Бек 5Бег Гпув
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 20 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо 25 пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80
Зо тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Агуд тує б1у ув Агуд б1й1 Авр Меє Гей Тер Уа1 Рбпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1ї1а Уаї Гей біп бек Бек с1у Гей Туг Бек Гей Бек Бек Уаї Ууаї тіг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 60 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго Ппув Рго Ппув Авр Уаї Ієй 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Нів біш бій Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 с1у пув бій Тук Ппув Сув Ппув Уа1! 5Бег АвБп Авр Аза Іей Рго Аза Рго 325 330 335 сі бій біц Тпг І1їе Бек Ппув Аїа Ппув біу біп Рго Агуд біц Рго сіп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Уаї Ппецш Авр Бек Авр бі1у Бек Рпе Рпе Гей Уа1ї бек Ппув Гей ТЕГ 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гейш Ні Аїа Нів ТПг ТПпг Агд пув бій Гей Бек Іец 435 440 445 60 зек Рго «2105» 199 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 199 сі Уаї бі1п Гешп Маї сбіц бек сб1у с1у с1у теп Уаї пув Рго С1у с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо
Зо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг Атїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160
Ма1 Бек Тер Авп Бек біу А1ї1а гейш ТПг Бек с1і1у Маї Нів ТПг РібБе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 60 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
СсСув Авр пув ТПг Нів ТБг о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго біц Рпе с1іп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго пув Рго пуб АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Авр бій бій Рго бій Маї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі АвБр б1у Уа1 б1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Уаї Уа1 Бек Уаї Гей Рго Уа1ї! гец Нів сіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 З3о 335
І1е бій пув ТПг о І1е Бек ув Аїа пув б1у бі1іп Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 уаї Сув ТПг Ггецп Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей Тер Сув Гец Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер бі Бек Авп с1у біп Рго бій Авп Авп Туг пув ТПг ТПс Рего 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430 60
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 век Ркго 450 «2105 200 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 200 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 З 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї
Зо зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї бо 35 пув б1у Агд Рпе ТПг І1їе 5Бег Агуд Авр АБп Аїа їув АБп Бек Іецч Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 40 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 45 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 50 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140 55 А1а А1їа їешп с1і1у Сув геш Маї пув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уаї Ттіг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 60 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів пув Рго Бек Авп о ТПг пув Маії Авр гув Агуд Уаї сій Рго Ппув Бег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Нів біш бій Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц 275 280 285 уа1 Нів АвБп Аїа пув ТПг о пув Рго Акуд бій бій б1п Туг АвБп АТїа ТЕПг 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп Авр Аїа Гец Рго Пув Рго 325 330 335
Авр бій бій Тс о чІ1е Бек ув Аїа пув б1у бі1п Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агуд Сув сій Меє ТПг пув Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей бек Сув АТїа Уа1 пув с1у Рпе Туг Рго Бек АвБр ІчІ1е Аїа Уаї1ї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Уаі1ї Бек Гпув Іецй ТПг 405 410 415 60
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Меє Нів біц Аїа Гей Нів АБп о Нів Туг ТПг біп Ппув Бек Ггечп Бек Іецй 435 440 445 зек Рго 450 «2105» 201 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 201 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
Зо
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 Зек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1ї1е Туг Туг А1а сій Бек Уаї бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 40 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935 45
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 50 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 55 Зек Ма1 Рпе Рго Гей Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг бек с1у Ш1уУу ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг бо 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190
УМа1і1 Рго Бек Бек Бек тей с1у ТПпг сіп ТПг Тук ІчІ1е Сув Авп Уа1! Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Рпе сіп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго пув Рго пуб АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
АБвр бій бій Рго біц Маї Ппув Рбе Авп Тгр Тук Уаії Авр сі1у уаї с1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335 сій бій Ппув ТПг І1їе Бек Ппув Аїа Ппув біу біп Рго Агуд біц Рго сіп 340 345 350 ма1т1 Сув Трпг Гей Рго Рго Бек Агд сій біш Мес ТПг о пув Авп сбіп Уаї 355 360 365 зек Гей Тер Сув Гец Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400 60
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув б5Бег Агуд Тгр біп біп б1у АБвп Уаії РПпе 5ег Сув бБег Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105 202 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 202 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15
Зо зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Меє Авп Тер Уа1! Агуд біп Аїа Рго сіу Ппув б1у Гей сій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї зо 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сі1іу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг пув 01У Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг бо 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1ї1а Уаї Гей біп бек Бек с1у Гей Туг Бек Гей Бек Бек Уаї Ууаї тіг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Меє І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уа1ї 5ег 260 265 270
Нів біш бій Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335 сі бій бі Того І1е Бек пув А1їа пув сС1у б1п Рго Агуд бій Рго с1іп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агуд Сув сій Меє ТПг пув Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 60 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Уаї Ппецш Авр Бек Авр бі1у Бек Рпе Рпе Гей Уа1ї бек Ппув Гей ТЕГ 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105 203 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 203
Зо сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек гей Агд Гей бБег Сув Аїа Аїа бек біу Рпе ТПг Рпе Бек 5Бег Гпув 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Агуд тує б1у ув Агуд б1й1 Авр Меє Гей Тер Уа1 Рбпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 60 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160
Ма1 Бек Тер Авп Бек біу А1ї1а гейш ТПг Бек с1і1у Маї Нів ТПг РібБе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Рпе сіп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Уаї Рпе Гей Рпе Рго Рго ПпувБ Рго Ппув Авр Уаї Ієй 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Авр бій бій Рго бій Маї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі АвБр б1у Уа1 б1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 с1у пув бій Тук Ппув Сув Ппув Уа1! 5Бег АвБп Авр Аза Іей Рго Аза Рго 325 330 335
І1е бій пув ТПг о І1е Бек ув Аїа пув б1у бі1іп Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 уаї Сув ТПг Ггецп Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 60 зек Гей Тер Сув Гец Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 бі Тер бій Бек Авп б1у сбіп Рго сій АвБп АБп о Тук пув ТПг ТПгс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гейш Ні Аїа Нів ТПг ТПпг Агд пув бій Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105 204 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 204 сі Уаї бі1п Гешп Маї сбіц бек сб1у с1у с1у теп Уаї пув Рго С1у с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї бо 50 пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 55 пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг Атїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 60 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1а А1їа їешп с1і1у Сув геш Маї пув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уаї Ттіг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
СсСув Авр пув ТПг Нів ТБг о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго сіц Ге Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Нів біш бій Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Уаї Уа1 Бек Уаї Гей Рго Уа1ї! гец Нів сіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп Авр Аїа Гец Рго Пув Рго 325 З3о 335
Авр бій бій Тс о чІ1е Бек ув Аїа пув б1у бі1п Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 60 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агуд Сув сій Меє ТПг пув Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1іу Рпе Туг Рго Бек АБр І1е Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Уаі1ї Бек Гпув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гейш Ні Аїа Нів ТПг ТПпг Агд пув бій Гей Бек Іец 435 440 445 ек Рго 450 «2105 205
Зо «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 205 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 З 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агд Рпе ТПг І1їе 5Бег Агуд Авр АБп Аїа їув АБп Бек Іецч Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 60 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125
Зек Ма1 Рпе Рго Гей Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг бек с1у Ш1уУу ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів пув Рго Бек Авп о ТПг пув Маії Авр гув Агуд Уаї сій Рго Ппув Бег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Рпе сіп 225 230 235 240
Тер б1у Рго Меє Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго пув Рго пуб АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Авр бій бій Рго бій Маї пуб Рпе АвБп Тгр Туг Уаі АвБр б1у Уа1 б1ци 275 280 285 уа1 Нів АвБп Аїа пув ТПг о пув Рго Акуд бій бій б1п Туг АвБп АТїа ТЕПг 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335 60 сій бій Ппув ТПг І1їе Бек Ппув Аїа Ппув біу біп Рго Агуд біц Рго сіп 340 345 350
Ууаї Сув ТПг Гей Рго Рго 5Бег Агд бі бій Меє ТПг о пув Авп сіп Уаї 355 360 365 зек Гей Тер Сув Гец Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Меє Нів біц Аїа Гей Нів Аза Ні ТПг ТПг Агуд пув бій Гей бек Іецй 435 440 445 зек Рго
Зо 450 «2105» 206 «2115» 450 «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005» 206 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45
Зек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1ї1е Туг Туг А1а сій Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг бо 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сі1іу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг пув 01У Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190
УМа1і1 Рго Бек Бек Бек тей с1у ТПпг сіп ТПг Тук ІчІ1е Сув Авп Уа1! Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Нів біц бій Рко біц Маї Ппув Рпе Авп Тгр Тук Маї Авр сіу уУаї с1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 60 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335 бі бі бій Тпгс о чІ1їе 5Бег Ппув Аїа Ппув с1у біп Рго Агд бій Рго сіп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агуд Сув сій Меє ТПг пув Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Уаі1ї Бек Гпув Іецй ТПг 405 410 415
Уа1 Авр пув Бек Агуд Тер бі1іп біп с1у Авп Уаї Ррпе Бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гейш Ні Аїа Нів ТПг ТПпг Агд пув бій Гей Бек Іец
Зо 435 440 445 зек Рго 450 «2105 207 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 207
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Уаї ТПг Уаї Бек Тгр АБп Бек с1у Аїа тей ТПг 5Бег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 60 зо 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Агуд Маї сій Рго пув Бек Сув Авр Пув ТПгЕ Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп тує АвБп Атїа ТПг Туг Агуд Маї Уаї Бек Уа1ї Ггец Рго Уаї Гей 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго бій бій бій Тпг І1е Бек Ггув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд Сув б1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп обіп Уаії бек гей бек Сув Аїа Уаії Ппув сіу Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е А1ї1а Уаї сій Тгр бій Бек АвБп о с1іу біп Рго 610 Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Уаї1ї Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 60 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів АТа Нів ТПг ТПг 305 310 315 320
Аг пув бій Ге Бек Іецй Бек Рго 325 «2105» 208 «2115» 216 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» І1сі «4005 208 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп 1 З 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув Авр б1у Рго Бек ТПг Авр Уа1 б1у АБр Туг 20 25 30
Ап оТук Маї Бек Тер Тук біп біп Нів Рго с1у пув АТа Рго Ппув Іей
Зо
Мес чІ1їе Тук Рпе ТПг Бек пув Ппув Рго бек сіу Маі Рго Авр Ага РіПе бо 35 Зек біу Бек Ппув Бек с1у АБп ТПг Аїа Бек Гей ТПг Уаї Бек с01Уу Гец 65 70 75 80 сіп Аїа бій Авр біц Аза Авр Тук Рпе Сув Бек ТПг Туг Аза Аїа Рго 40 85 90 935 теп с1у Рго Месє Рпе сіу сіу сіу ТПг Ппув Гец ТПг Уаї Гец с1у сіп 100 105 110 45
Рго пув Аїа А1їа Рго Бек Ма1ї ТПг тей Рпе Рго Рго Бек Бек бій б1ц 115 120 125 50 теп біп Аїа АвБп о Гпув Аїа ТПг о Гец Уаї Сув Гец І1е Бек Авр РПе Туг 130 135 140 55 Рго с1у Аїа Уаї тТПпг Уаї Аїа Теср ув Аз1а Авр Бек Бек Рго Маї Гув 145 150 155 160
Аза с1у Маї бій ТПг Тс Тбг Рго Бек пув біп Бек Авп АвБп о Гув Туг 60 165 170 175
Аза Аза Бек Бек Туг Іец Бек Гей ТПг Рго бій сбіп Тгр пув бБег Нів 180 185 190
Агуд Бек Тук Бек Сув біп Уаї ТПпг Нів бі сіу Бек ТПг Уаї сіц Гув 195 200 205
ТПпг Маї Аїа Рго ТПг сі Сув бБег 210 215 «2105 209 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 209 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у б1у Авр Ггецш Уаі пув Рго сіу с01У 1 З 10 15 сіу Гей Агуд Гей Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Аї1а 20 25 30
Зо
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 зек Бек Іїе Бек ТПг Агуд Бек б1іу Тук Іїе Тук Туг Аїа Авр Бек Уаї бо 40 пув б1у Агд Рпе ТПг І1їе 5Бег Агуд Авр АБп Аїа їув АБп Бек Іецч Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 45 85 90 935
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 50 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 55 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140 бо А1а А1їа їешп с1і1у Сув геш Маї пув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уаї Ттіг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів пув Рго Бек Авп о ТПг пув Маії Авр пув пув Маї сій Рго Ппув Бег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240 сіу б1у Рго Бек Уа1і Рпе Гец Рпе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг Гецй 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Зо
Нів біш Авр Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц 275 280 285 уа1 Нів АвБп Аїа пув ТПг о пув Рго Акд бій бій б1п Туг Авп Бек ТПг 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іецш ТПпг Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп пув Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335
І1е бій пув ТПг о І1е Бек ув Аїа пув б1у бі1іп Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агд бій сій Меє ТПг пубв Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей ТПг Сув Гей Уа1ї пув с1у Рпе Туг Рго Бек АвБр ІчІ1е Аїа Уаї1ї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго бо 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Меє Нів біц Аїа Гей Нів АБп о Нів Туг ТПг біп Ппув Бек Ггечп Бек Іецй 435 440 445 зек Рго 450 «2105» 210 «211» 446 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 210 сіп Уаі1 сбіп Гец Уаі сіц Бек сі1у сіу сіу Уаї Уаї біп Рго с01у Агд 1 5 10 15
Зо зек Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Тукг 20 25 30
ТП Меє Нів Тер Уаії Агуд біп Аз1а Рго с1у Ппув с1у гейш сій Тер Уаї 35 40 45
ТПг Рпе чІ1е бек Туг Авр б1у АБп АБп о Ппув Туг Туг Аїа Авр 5ег Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр Ап Бек Пув Ап о ТПг Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза чІ1е Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага ТПг ос1у Тер Гей б1у Рго Рпе Авр Туг Тгр б1у біп 01у ТПпг 100 105 110 теп Уаі1 ТПг Уаі1ї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаі Ропе Рго 115 120 125 бо пе АТїа Рго Бек Бек пув Бек ТПг Бек с1у бі1у ТПг АтТа Аїа теп С1Уу 130 135 140
Сув Гешп Уаі1 Ппув Авр Тук Рпе Рго біц Рго Уаї ТПг Уаї Бек ТЕгр Авп 145 150 155 160 зек б1у А1ї1а Гей ТПг Бек с1і1у Ма1 Нів ТПг Ррбе Рго Аза Уаї їецп сіп 165 170 175 зек Бек сіу Гецп Тукг Бек Гец Бек Бек Уаї Уаї ТПг Уаї Рго Бек 5Бег 180 185 190
Ззек Гей б1у ТПпг сбіп ТПг Туг ч11е Сув Авп Уа1ї АвБп о Нів пув Рго бБег 195 200 205
АвпоТтТпг о пув Маї Авр о пув пув Маї бій Рго пув Бек Сув АвБр Гув ТПг 210 215 220
Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго А1ї1а Рго сій Гей гей сСіу сіу Рго бБег 225 230 235 240 уаї Рпе Ггецш Рпе Рго Рго Ппув Рго Пув Авр ТПг гей Меє І1е 5ег Аг4д 245 250 255
Зо
ТПгЕ Рго біц Уа1! ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Ууаї Бек Нів бій Авр Рго 260 265 270 сі Маї пув Рпе Авп Тер Туг Уаї Авр с1у Уа1 біц Уаї Нів Авп А1а 275 280 285 пув ТПпПгЕ пув Рго Агуд біц біц біп Туг Авп Бек ТПг Туг Агуд Уаї Уаї 290 295 300 зек уаї Гей ТПпг Уаї гейш Нів сіп Авр Тер Тец АвБп о б1у Ггув сі Туг 305 310 315 320 пув Сув Ппув Уаі1і Бек АвБп Ппув Аїа Гец Рго Аїа Рго ІчІ1ї1е біц Ппув ТПг 325 330 335
І1е Бек пув Аїа пув б1у біп Рго Агу бій Рго біп Уаі1 Туг ТПг Іей 340 345 350
Рго Рго Бек Агуд б1іш бій Меє ТПг гув Авп обіп Уаї Бек Гей ТПг Сув 355 360 365 теп Уаї1ї Ппув с1іу Рпе Туг Рго Бег Авр І1їе Аїа Уаї біц Тер біц 5Бег бо 370 375 380
Авп осбіу біп Рго бій Авп Авп о Туг пуб ТПг Тпг Рго Рго Уаії Іецй Авр 385 390 395 400 век Авр сіу Бек Рпе Рпе Гец Тук Бек Ппув Гец ТПг Уаї Авр Ппув 5Бег 405 410 415
Агд Тер б1п біп б1у Авп Уаї РіПе Бек Сув Бек Уаї Меє Нів с1ц А1а 420 425 430
Тец Нів АБп Нів Ту ТПг сбіп пуб Бек Іец Бек Іецй бБег Рго 435 440 445 «2105» 211 «2115» 215 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» І1сі «4005 211 сій Іїе Уаі1ї Гец ТПг біп Бек Рго біу ТПг Ггец бек Гей бек Рго с01Уу 1 5 10 15
Зо сій Агуд Аїа ТпПг Гей бБег Сув Агуд Аїа Бек біп Бек Уаї сіу Бек Бег 20 25 30
Тук гей Аїа Тгр Ту сіп біп пув Рго бі1у біп Аз1а Рго Агуд Іецй Іецй 35 40 45
ІТ1е Тук с1у Аїа Рпе Бек Агуд Аїа ТПг с1у чІ1е Рго Авр Агуд РбПе 5Бег 50 55 бо сіу Бек сіу Бек сіу ТПг Авр Рпе ТПг Гец ТПг І1е Бек Агд Гец с1ц 65 70 75 80
Рго бій АвБр Рпе А1їа Маї Туг Туг Сув біп біп Тук с1у Бек Бек Рго 85 90 935
Тер ТПгЕ Рпе сіу сіп сіу ТПг пув Маї сій ч1І1е пув Агуд ТПг Уаї А1а 100 105 110
Аза Рго Бек Маі Рпе І1е Рпе Рго Рго бБег АвБр бій біп Гей Ггув бБег 115 120 125 бо сі1у ТПг А1тї1а Бек Маї Уаї Сув гец Ггец Авп Авп Рпе Туг Рго Агд с1и 130 135 140
Аза пув Маї сбіп ТеЕр пув Маії АвБр АБп Азїа Те біп Бек б1у Авп б5Бег 145 150 155 160 сіп бій Бек Уаі1 ТПг сіц сбіп Авр Бек Ппув Авр Бек ТПг Тук Бек Гец 165 170 175 зЗзек Бек ТПг Гей ТПг Ггец Бек пув АТїа Авр Тук б1цп Кгув Нів пув Уаї 180 185 190 тук Аїа Сув сі Ма! ТП Нів сіп с1у тей Бек Бек Рго Уа1! ТПг Гув 195 200 205 век Рпе АБп Агуд С1у біц Сув 210 215 «2105 212 «2115» 444 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не
Зо «4005 212 сіп Уаі1 сбіп Ге сіп сіц Бек с1іу Рго сбіу Гец Уаї Ппув Рго Бек біц 1 5 10 15
ТПг гей бек Гей ТПг Сув ТПг Уаії Бек с1у Туг Бек І1е бБег бБег ШУ 20 25 30
Тук б1у Тгр АвБп Тгр ч11е Агуд сіп Рго Рго сіу пув с1у Гей бій Тгр 35 40 45
І1е с1у РПе І1е Тук Тук сій с1у Бек ТПпг Тук Туг АвБп Рго Бек Ії1е бо пув Бек Агуд Іїе Бек Іїе ТПг Агуд Авр ТПг Бек Ппув АБп о біп Рпе РПе 50 65 70 75 80 тей біп Уаі1 АвБп Бек Уаї ТПг ТПг біц Авр ТПг Аїа ТПг Тук Тук Сув 85 90 935 55
Аза Агуд біп ТП с1у Тук Рпе Авр Туг Тгр б1у біп с1іу ТПг Іец Уаї1ї 100 105 110 60
ТПг Уаї бек бек Аїа бек ТПг Ппув сіу Рго Бек Уаії РпПе Рго Гей А1а
115 120 125
Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек бі1у б1у ТПпг Аза Аза їей с1у Сув Іецй 130 135 140 уаї пув Авр Тук Рпе Рго біц Рго Уаі ТПг Уаї бек Тгр Авп бек с01Уу 145 150 155 160
Аза тей ТПг Бек біу Уаї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уа1! Гей сіп Бек бБег 165 170 175 сіу Гей Тук Бек Гей Бек Бек Уаї Уаї ТПг Уаї Рго Бек Бек Бек Гец 180 185 190 сі1іу Тйг біп ТПпг о Тук І1е Сув Авп о Маії Авп Нів пув Рго Бек Авп ТПг 195 200 205 пув Ммаї Авр пув пув Ма1ї бій Рго Ппув Бек Сув Авр тТув ТПг Нів тТПпс 210 215 220
Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго сбіц Гец Гец сіу сб1іу Рго Бек Уаї РПе 225 230 235 240
Зо
Гей Рпе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг Гец Мес І1І1е Бек Агд ТПг Рго 245 250 255 сі Ууаї ТпПг Сув уаї Ууаї Уаі1 Авр Уаї Бек Нів бі1ц Авр Рго сі Уаї 260 265 270 ув Рпе АвБп Тер Тук Маі1 Авр с1у Маї сій Уаї Нів АБп Аїа Ппув ТПг 275 280 285 пув Рго Агуд біц біц біп Туг Авп Бек ТПг Туг Агуд Уаї Уаї бек Уаї 290 295 300 теп ТПпг Уаї гейш Нів біп Авр Тер Гец АвБп о б1іу пув бій Туг Ппув Сув 305 310 315 320 пув Уаі1 Бек АвБп Гпув Аїа Гец Рго Аїа Рго Іїе сіц Ппув ТПг І1е 5ег 325 330 335 пув Аїа пув сіу біп Рго Агуд біц Рго біп Уаї Тук ТПгЕ Ггец Рго Рго 340 345 350 бо зек Агуд АБр бій Гей ТПг о пув Авп осбіп Уаї Бек Гей ТПг Сув Геч Уаї 355 360 365 пув б1у Рпе Тук Рго Бек Авр І1їе Аїа Уаі біц Тгр бій бек АвБп с01Уу 370 375 380 сбіп Рго біц АвБп о АвБп о Тук Ппув ТПг ТП Рго Рго Уаї Ггец Авр 5Бег Авр 385 390 395 400 сіу Бек Рпе Рпе Гец Тук Бек Ппув Гец ТПг Уаї Авр Гпув Бек Агд Тгр 405 410 415 сіп біп б1у Авп Уаї РіПе бек Сув Бек Уаї Меє Нів с1ц Аїа Гей Нів 420 425 430
Ап оНів Тук ТПг біп ув Бек Гей бБег Гей Бек Рго 435 440 «2105» 213 «2115» 220 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» І1сі
Зо «4005 213
Авр І1е УМаї Меє ТПг біп Бек Рго Авр Бек Іей Аза Уаї Бек їешй Щ1Уу 1 5 10 15 сій Агуд Аїа ТпПг І1е АвБп о Сув Ппув Бек Бек біп Бек Гец Рпе Ап 5ег 20 25 30
Авп о Аїа пув ТПг Авп Ту гей АвБп Тер Туг біп біп ув Рго 1у біп 35 40 45
Рго Рго Ппув тей Ггеш І1е Туг Туг Аїа Бек ТПг Агуд Нів ТПг с1у Уаї бо
Рго АБр Агуд Рпе Бек біу Бек бі1іу Бек б1у ТПпг АвБр Рпе ТПг Іецй ТПг 50 65 70 75 80
І1е Бек Бек гей біп А1ї1а б1й Авр Уаії Аза Уаї Туг Тугк Сув біп сбіп 85 90 935 55
Тер Тук Авр Тук Рго Тук ТПг Рпе сіу Аїа сіу ТПг пув Уаї сій І1е 100 105 110 60 гув Агуд Тпг Уаі1і Аза Аїа Рго Бек Уаії Рпе чІ1е Рпе Рго Рго 5ег Авр
115 120 125 сій біп Гей Ппув Бек сіу ТПг Аїа Бек Уаї Уаї Сув Ггец Ггец Ап АвпП 130 135 140
Рпе Туг Рго Агуд бій Аїа пув Маї бі1іп Тер гув Уаі1ї АБр АБп Аза Іецй 145 150 155 160 сіп Бек б1у АвБп Бек сбіп сіц Бек Уаї ТПг біц біп Авр Бек Пув Авр 165 170 175 зек ТПг Тук Бек Гец Бек Бек ТПг Гец ТПг Гец Бек пув Аїа Ар Тукг 180 185 190 сі пув Нів пув Маї Туг Аїа Сув біц Уаї ТПг Нів сбіп с1у Гей бБег 195 200 205 век Рго Уа1 ТПг Ппув Бек Рпе АвБп Агуд б1у біц Сув 210 215 220 «2105 214 «2115 223 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 214
Меє А1а Сув Гей с1у Рпе сбі1іп Агуд Нів пув Аїа сіп Гей Авп ТІецй А1а 1 5 10 15
ТПгЕ Агуд ТБ Теср Рго Сув ТПг Гей Гей Рпе Рпе Гей Гей Рпе І1е Рго 20 25 30 уаї Рпе Сув пув Аза Меє Нів Уаї Аза біп Рго Аїа Уаї Уаї тей А1а 35 40 45 зек Бек Агуд сіу Іїе Аїа Бек Рпе Уаії Сув біц Туг Аїа бек Рго с01Уу бо 50 пув Аїа ТПг біц Уаі Агу Уа1і ТПг Уаї гец Агуд біп Аїа Авр Бек сіп 65 70 75 80 55 мМма1 тпг біц Маї Сув Аїа А1ї1а ТПг Ту Меє Месє с1у АвБп сій Іей ТПг 85 90 935
Рпе гей Авр Авр Бек І1е Сув ТПпг бі1іу ТПг Бек Бек с1у Авп сіп Уаї1ї 60 100 105 110
Авп оГпей ТПг о І1е біп с1у тей Агу А1ї1а Меє АБр ТПпПг с1у Іей Тук Ше 115 120 125
Сув пув Уа1 сіц Гец Мес Тук Рго Рго Рго Туг Тугк гей с1у І1е с01У 130 135 140
АБп ос1іу ТПг біп ч11е Тук Маї І1е АвБр Рго біц Рго Сув Рго Авр Бег 145 150 155 160
Авр Рпе гей гей Тгр І11е тей Аза Аза Уаї Бек Бек б1у Гей Рпе РПе 165 170 175
Тук Бек Рпе Гей Гей ТПг Аїа Уаї бек Гей Бек Ппув Меє гей пув Гуз 180 185 190
Ага Бек Рго Ппейп ТПг ТПг о б1у Маї Ту Маї пув Меє Рго РгО ТПг б1ци 195 200 205
Рго бій Сув бій пув біп Рпе біп Рго Туг Рпе І1е Рго І1е Авп 210 215 220
Зо «2105» 215 «211» 446 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 215 сіп Уа1ї бі1п Гецш Уаї сі Бек с1у с1у с1у Маі1 Уа1! б1п Рго 01у Агк4д 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Тукг 20 25 30
ТП Меє Нів Тер Уаії Агуд біп Аз1а Рго с1у Ппув с1у гейш сій Тер Уаї 35 40 45
ТПЕ Рпе І1е бек Туг Авр сіу Авп Авп пув Туг Туг Аїа Авр Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр Ап Бек Пув Ап о ТПг Гец Туг 65 70 75 80 бо пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг АтТа І1е Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага ТПг ос1у Тер Гей б1у Рго Рпе Авр Туг Тгр б1у біп 01у ТПпг 100 105 110 теп Уаі1 ТПг Уаі1ї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаі Ропе Рго 115 120 125 теп Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1і1у с1у ТПг Аза Аїа гей с01Уу 130 135 140 сув ге Уаї пув Авр Туг Рпе Рго сій Рго Уаї ТПг Уаї Бек Тер АвпП 145 150 155 160 зек б1у А1ї1а Гей ТПг Бек с1і1у Ма1 Нів ТПг Ррбе Рго Аза Уаї їецп сіп 165 170 175 зек Бек сіу Гецп Тукг Бек Гец Бек Бек Уаї Уаї ТПг Уаї Рго Бек 5Бег 180 185 190 зек гецп бі1у ТПпПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї АвБп о Нів Кгув Рго бег 195 200 205
Зо
АвпоТтТпг о пув Маї Авр о пув пув Маї бій Рго пув Бек Сув АвБр Гув ТПг 210 215 220
Нів ТП о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Ігец Гей Аїа с1у Рго Авр 225 230 235 240 уаї Рпе Ггецш Рпе Рго Рго Ппув Рго Пув Авр ТПг гей Меє І1е 5ег Аг4д 245 250 255
ТПгЕ Рго біц Уа1! ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Ууаї Бек Нів бій Авр Рго 260 265 270 сі Ууаї пув Рпе Авп Тер Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нібв АБп Аїа 275 280 285 пув ТПпПгЕ пув Рго Агуд біц біц біп Туг Авп Бек ТПг Туг Агуд Уаї Уаї 290 295 300
Ззек Ма1! Ггецш ТПпг Уаї гей Нів сбі1п Авр Тер Гей АБп о с1у пув с1и Туг 305 310 315 320 пув Сув Ппув Уаі1і Бек АвБп Ппув Аїа Гец Рго Аїа Рго біц сбіц Ппув ТПг 60 325 З3о 335
І1е Бек пув Аїа пув б1у біп Рго Агу бій Рго біп Уаі1 Туг ТПг Іей 340 345 350
Рго Рго Бек Агуд АБр бій Гей ТПпг Гув АБп обіп Уа1і Бек Гей ТПг Сув 355 360 365 пе Маї пув б1у Рпе Туг Рго Бек Авр І1е Аїа Уа! сі Тер с1и бБег 370 375 380
Авп осбіу біп Рго бій Авп Авп о Туг пуб ТПг Тпг Рго Рго Уаії Іецй Авр 385 390 395 400 век Авр сіу Бек Рпе Рпе Гец Тук Бек Ппув Гец ТПг Уаї Авр Ппув 5Бег 405 410 415
Агуд Тер біп біп б1у АвБп о Уа1ї Рпе бек Сув Бек Уа1 Меєсє Нів сіц А1а 420 425 430
Тец Нів АБп Нів Ту ТПг сбіп пуб Бек Іец Бек Іецй бБег Рго 435 440 445
Зо «2105» 216 «211» 446 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005» 216 сіп Уа1ї бі1п Гецш Уаї сі Бек с1у с1у с1у Маі1 Уа1! б1п Рго 01у Агк4д 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Тукг 20 25 30
ТП Меє Нів Тер Уаії Агуд біп Аз1а Рго с1у Ппув с1у гейш сій Тер Уаї 35 40 45
ТПЕ Рпе І1е бек Туг Авр сіу Авп Авп пув Туг Туг Аїа Авр Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр Ап Бек Пув Ап о ТПг Гец Туг 65 70 75 80 бо пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг АтТа І1е Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага ТПг ос1у Тер Гей б1у Рго Рпе Авр Туг Тгр б1у біп 01у ТПпг 100 105 110 теп Уаі1 ТПг Уаі1ї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаі Ропе Рго 115 120 125 теп Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1і1у с1у ТПг Аза Аїа гей с01Уу 130 135 140 сув ге Уаї пув Авр Туг Рпе Рго сій Рго Уаї ТПг Уаї Бек Тер АвпП 145 150 155 160 зек б1у А1ї1а Гей ТПг Бек с1і1у Ма1 Нів ТПг Ррбе Рго Аза Уаї їецп сіп 165 170 175 зек Бек сіу Гецп Тукг Бек Гец Бек Бек Уаї Уаї ТПг Уаї Рго Бек 5Бег 180 185 190 зек гецп бі1у ТПпПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї АвБп о Нів Кгув Рго бег 195 200 205
Зо
АвпоТтТпг о пув Маї Авр о пув пув Маї бій Рго пув Бек Сув АвБр Гув ТПг 210 215 220
Нів ТП о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Ігец Гей Аїа с1у Рго Авр 225 230 235 240 уаї Рпе Ггецш Рпе Рго Рго Ппув Рго Пув Авр ТПг гей Меє І1е 5ег Аг4д 245 250 255
ТПгЕ Рго біц Уа1! ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Ууаї Бек Нів бій Авр Рго 260 265 270 сі Ууаї пув Рпе Авп Тер Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нібв АБп Аїа 275 280 285 пув ТПпПгЕ пув Рго Агуд біц біц біп Туг Авп Бек ТПг Туг Агуд Уаї Уаї 290 295 300
Ззек Ма1! Ггецш ТПпг Уаї гей Нів сбі1п Авр Тер Гей АБп о с1у пув с1и Туг 305 310 315 320 пув Сув Ппув Уаі1і Бек АвБп пув Аїа Гец Рго Гец Рго біц сбіц Ппув ТПг 60 325 З3о 335
І1е Бек пув Аїа пув б1у біп Рго Агу бій Рго біп Уаі1 Туг ТПг Іей 340 345 350
Рго Рго Бек Агуд АБр бій Гей ТПпг Гув АБп обіп Уа1і Бек Гей ТПг Сув 355 360 365 пе Маї пув б1у Рпе Туг Рго Бек Авр І1е Аїа Уа! сі Тер с1и бБег 370 375 380
Авп осбіу біп Рго бій Авп Авп о Туг пуб ТПг Тпг Рго Рго Уаії Іецй Авр 385 390 395 400 век Авр сіу Бек Рпе Рпе Гец Тук Бек Ппув Гец ТПг Уаї Авр Ппув 5Бег 405 410 415
Агуд Тер біп біп б1у АвБп о Уа1ї Рпе бек Сув Бек Уа1 Меєсє Нів сіц А1а 420 425 430
Тец Нів АБп Нів Ту ТПг сбіп пуб Бек Іец Бек Іецй бБег Рго 435 440 445
Зо «2105 217 «211» 446 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 217 сіп Уа1ї бі1п Гецш Уаї сі Бек с1у с1у с1у Маі1 Уа1! б1п Рго 01у Агк4д 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Тукг 20 25 30
ТП Меє Нів Тер Уаії Агуд біп Аз1а Рго с1у Ппув с1у гейш сій Тер Уаї 35 40 45
ТПЕ Рпе І1е бек Туг Авр сіу Авп Авп пув Туг Туг Аїа Авр Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр Ап Бек Пув Ап о ТПг Гец Туг 65 70 75 80 бо пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг АтТа І1е Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага ТПг ос1у Тер Гей б1у Рго Рпе Авр Туг Тгр б1у біп 01у ТПпг 100 105 110 теп Уаі1 ТПг Уаі1ї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаі Ропе Рго 115 120 125 теп Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1і1у с1у ТПг Аза Аїа гей с01Уу 130 135 140 сув ге Уаї пув Авр Туг Рпе Рго сій Рго Уаї ТПг Уаї Бек Тер АвпП 145 150 155 160 зек б1у А1ї1а Гей ТПг Бек с1і1у Ма1 Нів ТПг Ррбе Рго Аза Уаї їецп сіп 165 170 175 зек Бек сіу Гецп Тукг Бек Гец Бек Бек Уаї Уаї ТПг Уаї Рго Бек 5Бег 180 185 190 зек гецп бі1у ТПпПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї АвБп о Нів Кгув Рго бег 195 200 205
Зо
АвпоТтТпг о пув Маї Авр о пув пув Маї бій Рго пув Бек Сув АвБр Гув ТПг 210 215 220
Нів ТП о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Тук біп Тер с1у Рго Мес 225 230 235 240 уаї Рпе Ггецш Рпе Рго Рго Ппув Рго Пув Авр ТПг гей Меє І1е 5ег Аг4д 245 250 255
ТПЕ Рго бій Уаї ТПг Сув Маї Уаї Уаї Авр Уаії бек Авр бій бій Рго 260 265 270 сі Ууаї пув Рпе Авп Тер Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нібв АБп Аїа 275 280 285 пув ТПпПгЕ пув Рго Агуд біц біц біп Туг Ап Аза ТПг Туг Агуд Уаї Уаї 290 295 300
Ззек Ма1! Ггецш ТПпг Уаї гей Нів сбі1п Авр Тер Гей АБп о с1у пув с1и Туг 305 310 315 320 пув Сув Ппув Уаі1і Бек АвБп Ппув Аїа Гец Рго Аїа Рго ІчІ1ї1е біц Ппув ТПг 60 325 З3о 335
І1е Бек пув Аїа пув б1у біп Рго Агу бій Рго біп Уаі1ї Сув ТПг Іей 340 345 350
Рго Рго Бек Агуд АБр бій Гей ТПпг Гув АБп обіп Уа1і Бек Гей Тер Сув 355 360 365 пе Маї пув б1у Рпе Туг Рго Бек Авр І1е Аїа Уа! сі Тер с1и бБег 370 375 380
Авп осбіу біп Рго бій Авп Авп о Туг пуб ТПг Тпг Рго Рго Уаії Іецй Авр 385 390 395 400 век Авр сіу Бек Рпе Рпе Гец Тук Бек Ппув Гец ТПг Уаї Авр Ппув 5Бег 405 410 415
Агуд Тер біп біп б1у АвБп о Уа1ї Рпе бек Сув Бек Уа1 Меєсє Нів сіц А1а 420 425 430
Тец Нів АБп Нів Ту ТПг сбіп пуб Бек Іец Бек Іецй бБег Рго 435 440 445
Зо «2105» 218 «211» 446 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005» 218 сіп Уа1ї бі1п Гецш Уаї сі Бек с1у с1у с1у Маі1 Уа1! б1п Рго 01у Агк4д 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Тукг 20 25 30
ТП Меє Нів Тер Уаії Агуд біп Аз1а Рго с1у Ппув с1у гейш сій Тер Уаї 35 40 45
ТПЕ Рпе І1е бек Туг Авр сіу Авп Авп пув Туг Туг Аїа Авр Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр Ап Бек Пув Ап о ТПг Гец Туг 65 70 75 80 бо пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг АтТа І1е Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага ТПг ос1у Тер Гей б1у Рго Рпе Авр Туг Тгр б1у біп 01у ТПпг 100 105 110 теп Уаі1 ТПг Уаі1ї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаі Ропе Рго 115 120 125 теп Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1і1у с1у ТПг Аза Аїа гей с01Уу 130 135 140 сув ге Уаї пув Авр Туг Рпе Рго сій Рго Уаї ТПг Уаї Бек Тер АвпП 145 150 155 160 зек б1у А1ї1а Гей ТПг Бек с1і1у Ма1 Нів ТПг Ррбе Рго Аза Уаї їецп сіп 165 170 175 зек Бек сіу Гецп Тукг Бек Гец Бек Бек Уаї Уаї ТПг Уаї Рго Бек 5Бег 180 185 190 зек гецп бі1у ТПпПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї АвБп о Нів Кгув Рго бег 195 200 205
Зо
АвпоТтТпг о пув Маї Авр о пув пув Маї бій Рго пув Бек Сув АвБр Гув ТПг 210 215 220
Нів ТП о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго біц Ггеш Гей сС1у сб1іу Рго Бег 225 230 235 240 уаї Рпе Ггецш Рпе Рго Рго Ппув Рго Пув Авр ТПг гей Меє І1е 5ег Аг4д 245 250 255
ТПгЕ Рго біц Уа1! ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр уаї Бек Нів бій сій Рго 260 265 270 сі Ууаї пув Рпе Авп Тер Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нібв АБп Аїа 275 280 285 пув ТПпПгЕ пув Рго Агуд біц біц біп Туг Авп Бек ТПг Туг Агуд Уаї Уаї 290 295 300
Ззек Ма1! Ггецш ТПпг Уаї гей Нів сбі1п Авр Тер Гей АБп о с1у пув с1и Туг 305 310 315 320 пув Сув Ппув Уаі1і Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Мес Рго чІ1ї1е сбіц сбіц ТПг 60 325 З3о 335
І1е Бек пув Аїа пув б1у біп Рго Агу бій Рго біп Уаі1 Туг ТПг Іей 340 345 350
Рго Рго Бек Агуд Сув бій Гей ТПпг Гув АвБп обіп Уа1і Бек Гей Бек Сув 355 360 365
А1їа Маї пув б1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іч1І1е Аза Уаї сій Тер сій 5Бег 370 375 380
Авп осбіу біп Рго бій Авп Авп о Туг пуб ТПг Тпг Рго Рго Уаії Іецй Авр 385 390 395 400 век Авр сіу Бек Рпе Рпе Гец Уаї Бек Ппув Гец ТПг Уаї Авр Ппув Бег 405 410 415
Агуд Тер біп біп б1у АвБп о Уа1ї Рпе бек Сув Бек Уа1 Меєсє Нів сіц А1а 420 425 430
Тец Нів АБп Нів Ту ТПг сбіп пуб Бек Іец Бек Іецй бБег Рго 435 440 445
Зо «2105» 219 «211» 446 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 219 сіп Уа1ї бі1п Гецш Уаї сі Бек с1у с1у с1у Маі1 Уа1! б1п Рго 01у Агк4д 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Тукг 20 25 30
ТП Меє Нів Тер Уаії Агуд біп Аз1а Рго с1у Ппув с1у гейш сій Тер Уаї 35 40 45
ТПЕ Рпе І1е бек Туг Авр сіу Авп Авп пув Туг Туг Аїа Авр Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр Ап Бек Пув Ап о ТПг Гец Туг 65 70 75 80 бо пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг АтТа І1е Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага ТПг ос1у Тер Гей б1у Рго Рпе Авр Туг Тгр б1у біп 01у ТПпг 100 105 110 теп Уаі1 ТПг Уаі1ї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаі Ропе Рго 115 120 125 теп Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1і1у с1у ТПг Аза Аїа гей с01Уу 130 135 140 сув ге Уаї пув Авр Туг Рпе Рго сій Рго Уаї ТПг Уаї Бек Тер АвпП 145 150 155 160 зек б1у А1ї1а Гей ТПг Бек с1і1у Ма1 Нів ТПг Ррбе Рго Аза Уаї їецп сіп 165 170 175 зек Бек сіу Гецп Тукг Бек Гец Бек Бек Уаї Уаї ТПг Уаї Рго Бек 5Бег 180 185 190 зек гецп бі1у ТПпПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї АвБп о Нів Кгув Рго бег 195 200 205
Зо
АвпоТтТпг о пув Маї Авр о пув пув Маї бій Рго пув Бек Сув АвБр Гув ТПг 210 215 220
Нів ТП о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Рпе сбіп Тер с1у Рго Мес 225 230 235 240 уаї Рпе Ггец Рпе Рго Рго Ппув Рго пув Авр Уаії Гей Меє І1е 5ег Аг4д 245 250 255
ТПЕ Рго бій Уаї ТПг Сув Маї Уаї Уаї Авр Уаії бек Авр бій бій Рго 260 265 270 сі Ууаї пув Рпе Авп Тер Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нібв АБп Аїа 275 280 285 пув ТПпПгЕ пув Рго Агуд біц біц біп Туг Ап Аза ТПг Туг Агуд Уаї Уаї 290 295 300
Ззек Маї Ггецп Рго Маї Гей Нів сбі1п Авр Тер Гей АБп о с1у пув с1и Туг 305 310 315 320 пув Сув Ппув Уаі1і Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго чІ1ї1е біц Ппув ТПг 60 325 З3о 335
І1е Бек пув Аїа пув б1у біп Рго Агу бій Рго біп Уаі1ї Сув ТПг Іей 340 345 350
Рго Рго Бек Агуд АБр бій Гей ТПпг Гув АБп обіп Уа1і Бек Гей Тер Сув 355 360 365 пе Маї пув б1у Рпе Туг Рго Бек Авр І1е Аїа Уа! сі Тер с1и бБег 370 375 380
Авп осбіу біп Рго бій Авп Авп о Туг пуб ТПг Тпг Рго Рго Уаії Іецй Авр 385 390 395 400 век Авр сіу Бек Рпе Рпе Гец Тук Бек Ппув Гец ТПг Уаї Авр Ппув 5Бег 405 410 415
Агуд Тер біп біп б1у АвБп о Уа1ї Рпе бек Сув Бек Уа1 Меєсє Нів сіц А1а 420 425 430
Тец Нів АБп Нів Ту ТПг сбіп пуб Бек Іец Бек Іецй бБег Рго 435 440 445
Зо «2105 220 «211» 446 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 220 сіп Уа1ї бі1п Гецш Уаї сі Бек с1у с1у с1у Маі1 Уа1! б1п Рго 01у Агк4д 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Тукг 20 25 30
ТП Меє Нів Тер Уаії Агуд біп Аз1а Рго с1у Ппув с1у гейш сій Тер Уаї 35 40 45
ТПЕ Рпе І1е бек Туг Авр сіу Авп Авп пув Туг Туг Аїа Авр Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр Ап Бек Пув Ап о ТПг Гец Туг 65 70 75 80 бо пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг АтТа І1е Тук Тук Сув 85 90 935
Зоо
Аза Ага ТПг ос1у Тер Гей б1у Рго Рпе Авр Туг Тгр б1у біп 01у ТПпг 100 105 110 теп Уаі1 ТПг Уаі1ї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаі Ропе Рго 115 120 125 теп Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1і1у с1у ТПг Аза Аїа гей с01Уу 130 135 140 сув ге Уаї пув Авр Туг Рпе Рго сій Рго Уаї ТПг Уаї Бек Тер АвпП 145 150 155 160 зек б1у А1ї1а Гей ТПг Бек с1і1у Ма1 Нів ТПг Ррбе Рго Аза Уаї їецп сіп 165 170 175 зек Бек сіу Гецп Тукг Бек Гец Бек Бек Уаї Уаї ТПг Уаї Рго Бек 5Бег 180 185 190 зек гецп бі1у ТПпПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї АвБп о Нів Кгув Рго бег 195 200 205
Зо
АвпоТтТпг о пув Маї Авр о пув пув Маї бій Рго пув Бек Сув АвБр Гув ТПг 210 215 220
Нів ТП о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго біц Ггецш Гей Аїа сіу Рго 5Бег 225 230 235 240 уаї Рпе Ггец Рпе Рго Рго Ппув Рго пув Авр Уаії Гей Меє І1е 5ег Аг4д 245 250 255
ТПгЕ Рго біц Уа1! ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр уаї Бек Нів бій сій Рго 260 265 270 сі Ууаї пув Рпе Авп Тер Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нібв АБп Аїа 275 280 285 пув ТПпПгЕ пув Рго Агуд біц біц біп Туг Ап Аза ТПг Туг Агуд Уаї Уаї 290 295 300
Ззек Маї Ггецп Рго Маї Гей Нів сбі1п Авр Тер Гей АБп о с1у пув с1и Туг 305 310 315 320 пув Сув Ппув Уаі1і Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Ппув Рго АБр біц біц ТОП 60 325 З3о 335
І1е Бек пув Аїа пув б1у біп Рго Агу бій Рго біп Уаі1 Туг ТПг Іей 340 345 350
Рго Рго Бек Агуд Сув бій Гей ТПпг Гув АвБп обіп Уа1і Бек Гей Бек Сув 355 360 365
А1їа Маї пув б1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іч1І1е Аза Уаї сій Тер сій 5Бег 370 375 380
Авп осбіу біп Рго бій Авп Авп о Туг пуб ТПг Тпг Рго Рго Уаії Іецй Авр 385 390 395 400 век Авр сіу Бек Рпе Рпе Гец Уаї Бек Ппув Гец ТПг Уаї Авр Ппув Бег 405 410 415
Агуд Тер біп біп б1у АвБп о Уа1ї Рпе бек Сув Бек Уа1 Меєсє Нів сіц А1а 420 425 430
Тец Нів АБп Нів Ту ТПг сбіп пуб Бек Іец Бек Іецй бБег Рго 435 440 445
Зо «2105 221 «211» 446 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 221 сіп Уа1ї бі1п Гецш Уаї сі Бек с1у с1у с1у Маі1 Уа1! б1п Рго 01у Агк4д 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Тукг 20 25 30
ТП Меє Нів Тер Уаії Агуд біп Аз1а Рго с1у Ппув с1у гейш сій Тер Уаї 35 40 45
ТПЕ Рпе І1е бек Туг Авр сіу Авп Авп пув Туг Туг Аїа Авр Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр Ап Бек Пув Ап о ТПг Гец Туг 65 70 75 80 бо пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг АтТа І1е Тук Тук Сув 85 90 935 зЗо2
Аза Ага ТПг ос1у Тер Гей б1у Рго Рпе Авр Туг Тгр б1у біп 01у ТПпг 100 105 110 теп Уаі1 ТПг Уаі1ї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаі Ропе Рго 115 120 125 теп Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1і1у с1у ТПг Аза Аїа гей с01Уу 130 135 140 сув ге Уаї пув Авр Туг Рпе Рго сій Рго Уаї ТПг Уаї Бек Тер АвпП 145 150 155 160 зек б1у А1ї1а Гей ТПг Бек с1і1у Ма1 Нів ТПг Ррбе Рго Аза Уаї їецп сіп 165 170 175 зек Бек сіу Гецп Тукг Бек Гец Бек Бек Уаї Уаї ТПг Уаї Рго Бек 5Бег 180 185 190 зек гецп бі1у ТПпПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї АвБп о Нів Кгув Рго бег 195 200 205
Зо
АвпоТтТпг о пув Маї Авр о пув пув Маї бій Рго пув Бек Сув АвБр Гув ТПг 210 215 220
Нів ТП о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Рпе сбіп Тер с1у Рго Мес 225 230 235 240 уаї Рпе Ггец Рпе Рго Рго Ппув Рго пув Авр Уаії Гей Меє І1е 5ег Аг4д 245 250 255
ТПЕ Рго бій Уаї ТПг Сув Маї Уаї Уаї Авр Уаії бек Авр бій бій Рго 260 265 270 сі Ууаї пув Рпе Авп Тер Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нібв АБп Аїа 275 280 285 пув ТПпПгЕ пув Рго Агуд біц біц біп Туг Ап Аза ТПг Туг Агуд Уаї Уаї 290 295 300
Ззек Маї Ггецп Рго Маї Гей Нів сбі1п Авр Тер Гей АБп о с1у пув с1и Туг 305 310 315 320 пув Сув Ппув Уаі1і Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго біц сбіц Ппув ТПг 60 325 З3о 335
ЗОЗ
І1е Бек пув Аїа пув б1у біп Рго Агу бій Рго біп Уаі1ї Сув ТПг Іей 340 345 350
Рго Рго Бек Агуд АБр бій Гей ТПпг Гув АБп обіп Уа1і Бек Гей Тер Сув 355 360 365 пе Маї пув б1у Рпе Туг Рго Бек Авр І1е Аїа Уа! сі Тер с1и бБег 370 375 380
Авп осбіу біп Рго бій Авп Авп о Туг пуб ТПг Тпг Рго Рго Уаії Іецй Авр 385 390 395 400 век Авр сіу Бек Рпе Рпе Гец Тук Бек Ппув Гец ТПг Уаї Авр Ппув 5Бег 405 410 415
Агуд Тер біп біп б1у АвБп о Уа1ї Рпе бек Сув Бек Уа1 Меєсє Нів сіц А1а 420 425 430
Тец Нів АБп Нів Ту ТПг сбіп пуб Бек Іец Бек Іецй бБег Рго 435 440 445
Зо «2105 222 «211» 446 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 222 сіп Уа1ї бі1п Гецш Уаї сі Бек с1у с1у с1у Маі1 Уа1! б1п Рго 01у Агк4д 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек сбіу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Тукг 20 25 30
ТП Меє Нів Тер Уаії Агуд біп Аз1а Рго с1у Ппув с1у гейш сій Тер Уаї 35 40 45
ТПЕ Рпе І1е бек Туг Авр сіу Авп Авп пув Туг Туг Аїа Авр Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр Ап Бек Пув Ап о ТПг Гец Туг 65 70 75 80 бо пе біп Мес Авп Бек Гей Агуд А1а сбіц Авр ТПг АтТа І1е Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага ТПг ос1у Тер Гей б1у Рго Рпе Авр Туг Тгр б1у біп 01у ТПпг 100 105 110 теп Уаі1 ТПг Уаі1ї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаі Ропе Рго 115 120 125 теп Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1і1у с1у ТПг Аза Аїа гей с01Уу 130 135 140 сув ге Уаї пув Авр Туг Рпе Рго сій Рго Уаї ТПг Уаї Бек Тер АвпП 145 150 155 160 зек б1у А1ї1а Гей ТПг Бек с1і1у Ма1 Нів ТПг Ррбе Рго Аза Уаї їецп сіп 165 170 175 зек Бек сіу Гецп Тукг Бек Гец Бек Бек Уаї Уаї ТПг Уаї Рго Бек 5Бег 180 185 190 зек гецп бі1у ТПпПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї АвБп о Нів Кгув Рго бег 195 200 205
Зо
АвпоТтТпг о пув Маї Авр о пув пув Маї бій Рго пув Бек Сув АвБр Гув ТПг 210 215 220
Нів ТП о Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго біц Ггецш Гей Аїа сіу Рго 5Бег 225 230 235 240 уаї Рпе Ггец Рпе Рго Рго Ппув Рго пув Авр Уаії Гей Меє І1е 5ег Аг4д 245 250 255
ТПгЕ Рго біц Уа1! ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр уаї Бек Нів бій сій Рго 260 265 270 сі Ууаї пув Рпе Авп Тер Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нібв АБп Аїа 275 280 285 пув ТПпПгЕ пув Рго Агуд біц біц біп Туг Ап Аза ТПг Туг Агуд Уаї Уаї 290 295 300
Ззек Маї Ггецп Рго Маї Гей Нів сбі1п Авр Тер Гей АБп о с1у пув с1и Туг 305 310 315 320 пув Сув Ппув Уаі1і Бег АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго біц сбіц сбіц ТОПг 60 325 З3о 335
Зо5
І1е Бек пув Аїа пув б1у біп Рго Агу бій Рго біп Уаі1 Туг ТПг Іей 340 345 350
Рго Рго Бек Агуд Сув бій Гей ТПпг Гув АвБп обіп Уа1і Бек Гей Бек Сув 355 360 365
А1їа Маї пув б1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іч1І1е Аза Уаї сій Тер сій 5Бег 370 375 380
Авп осбіу біп Рго бій Авп Авп о Туг пуб ТПг Тпг Рго Рго Уаії Іецй Авр 385 390 395 400 век Авр сіу Бек Рпе Рпе Гец Уаї Бек Ппув Гец ТПг Уаї Авр Ппув Бег 405 410 415
Агуд Тер біп біп б1у АвБп о Уа1ї Рпе бек Сув Бек Уа1 Меєсє Нів сіц А1а 420 425 430
Тец Нів АБп Нів Ту ТПг сбіп пуб Бек Іец Бек Іецй бБег Рго 435 440 445
Зо «2105 223 «2115 15 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «2205 «221» ІНША ОЗНАКА «2225 (2)..(2) «223» Хаа являє собою Нів, Аза, Агуд або Гув «4005 223 зек Хаа ТПг Меє АвпП 1 5 «2105 224 «2115 17 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «2205 «221» ІНША ОЗНАКА «222» (4)..(4) «223» Хаа являє собою Бек або тіг «2205 «221» ІНША ОЗНАКА 60 «222» (5)..(5) «223» Хаа являє собою Агуд або сіп
«221» ІНША ОЗНАКА «222» (7)..(7) «223» Хаа являє собою с1у або Нів «2205» «221» ІНША ОЗНАКА «222» (13)..(13) «223» Хаа являє собою Авр, сіц або Аг4д «2205» «221» ІНША ОЗНАКА «222» (16)..(16) «223» Хаа являє собою Кгув або Агд «4005 224 зек Іїе Бек Хаа Хаа Бек Хаа Тукг І1їе Туг Туг Аїа Хаа Бек Уаї Хаа 1 5 10 15 о1У
«2105 225 «2115 13 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «2205» «221» ІНША ОЗНАКА «222» (3)..(3) «223» Хаа являє собою Ппув або Аї1а «4005 Щ 225 тук 61у Хаа Акуд бій Авр Меє Гей Тер Уаї Рпе Авр Туг 1 5 10 «210» 226 «2115 14 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «2205 «221» ІНША ОЗНАКА «2225 (1)..(1) «223» Хаа являє собою ТПг, Авр, сбіп або сіц «2205 «221» ІНША ОЗНАКА «2225 (3)..(3) «223» Хаа являє собою ТПг або Рго 60 «2205 «221» ІНША ОЗНАКА
«222» (6)..(6) «223» Хаа являє собою Ар або 0Щ1У «2205» «221» ІНША ОЗНАКА «222» (11)..(11) «223» Хаа являє собою Авп або ТПг «2205» «221» ІНША ОЗНАКА «222» (12)..(12) «223» Хаа являє собою Тукг або Тгр «2205» «221» ІНША ОЗНАКА «222» (14)..(14) «223» Хаа являє собою бек або Нів «4005 226
Хаа б1у Хаа Бек ТПпг Хаа Уа1ї с1у Авр Туг Хаа Хаа Уа1ї Хаа 1 5 10 «2105 227 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь
Зо «2205» «221» ІНША ОЗНАКА «222» (1)..(1) «223» Хаа являє собою бій, РПе або Туг «2205» «221» ІНША ОЗНАКА «222» (3)..(3) «223» Хаа являє собою бек або І1е «2205» «221» ІНША ОЗНАКА «222» (4)..(4) «223» Хаа являє собою Ппув або 5Бег «2205» «221» ІНША ОЗНАКА «222» (7)..(7) «223» Хаа являє собою Бек, сій або Гув «4005 Щ 227
Хаа ТПпг Хаа Хаа Гпув Рго Хаа 1 5 «2105» 228 «2115 10 «2125 БІЛОК бо «2135» Ното варієпв зов
«221» ІНША ОЗНАКА «222» (1)..(1) «223» Хаа являє собою бек або сіп «2205» «221» ІНША ОЗНАКА «222» (10)..(10) «223» Хаа являє собою Меє або Тігс «4005 228
Хаа ТПпг Туг Аза Аза Рго Іїей с1у Рго Хаа 1 5 10 «2105 229 «2115 30 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 229 сі Уаї бі1п Гецп УМаї бійц бек сб1у с1у Авр тей Уаї Ппув Рго С1у с1У 1 5 10 15 сіу Гей Агуд Гей Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг РпПе 5ег
Зо 20 25 30 «2105» 230 «2115 30 «212» БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 230 сі Уаї бі1п Гешп Маї сбіц бек сб1у с1у с1у теп Уаї пув Рго С1у с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг РпПе 5ег 20 25 30 «2105» 231 «2115 30 «212» БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 231 сіп Уаї бі1п Гецп Маї сбіц бек сб1у с1у с1у теп Уаї пув Рго С1у с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг РпПе 5ег 60 20 25 30 зо9
«2105 232 «2115 30 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005 232 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гей бБег Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг РпПе 5ег 20 25 30 «2105 233 «2115» 14 «2125 БІЛОК «213» Ното варієпв «4005 233
Тер Уаії Агуд сбіп Аза Рго сіу пув сіу Гей сій Тгр Уаї 5ег 1 5 10 «2105 234 «2115 32 «212» БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 234
Агуд Рпе ТПг Іїе Бек Агуд АБр АБп Аїа пуб Ап бБег Гец Туг Гец сіп 1 5 10 15
Мес Ап Бек Ггец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Туг Туг Сув Аї1а Аг4д 20 25 30 «2105 235 «2115 11 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 235
Тер 61у б1іп с1у ТПг Ггец Маї ТПг Уаї Бек 5ег 1 5 10 «2105» 236 «2115 22 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005» 236 60 сіп Бек Аїа Гей ТПг сіп Рго Рго Бек Аїа Бек сбіу Бек Рго 01у сіп
1 5 10 15
ТПгЕ Маї ТПг І1е Бек Сув 20 «2105 237 «2115 22 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 237 сіп Бек А1їа еп ТПг о сбіп Рго Рго Бек Аїа Бек біу Бек Рго 0Ш1у с1іп 1 5 10 15 зек Уа1 ТПг Іїе Бек Сув 20 «2105 238 «2115 23 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 238
АБвр чІ1е Маї Меє тТПг о сіп Бек Рго Іїецй Бек Гей Рго Уа1 ТПг Рго 0Щ1У 1 5 10 15 бій Рго Аїа Бек Іїе Бек Сув 20 «2105 239 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 239
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 бо с1іу Ма1ї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї Ггецш сіп бек Бек с1у Ге Тук бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій Рпе біп Тер с1у Рго Мес Уаї Рпе Іей РпПе Рго Рго 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек Авр бій бій Рго сій УМаї Ппув Рпе Авп Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175
Зо сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тер Гей АвБп осіу пув бій Тук пув Сув пув Уа1ї! Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго бій бій гпув ТпПг І1е Бек їгув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Сув ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп обіп Уаії бек Ггецш Тгр Сув гей Уаї Ппув сі1у Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпоТтук пув ТП ТЕ Рго Рго Уаії Гей Авр бБег Авр сіу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп бо 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів АТа Нів ТПг ТПг 305 310 315 320
Ага пув бій Гей бБег Гей Бек Рго 325 «2105» 240 «2115 15 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 240
Тер Тук біп сіп Нів Рго біу пув Аза Рго Ппув Геш Меє чІ1е Туг 1 5 10 15 «2105» 241 «2115 15 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005» 241
Тер Тук біп сіп пуб Рго сіу біп А1їа Рго Агд їейп їей Ії1е Туг 1 5 10 15
Зо «2105 242 «2115 32 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005 242 сіу Маі1 Рго Авр Агуд Рпе Бек сіу Бек Ппув Бек б1у АвБп ТПг Аїа 5ег 1 З 10 15 тей ТПпПг Уаі1 Бек с1у Гец сбіп Аїа біц Авр біц Аза Ар Тук РПпе Сув 20 25 30 «2105 243 «2115 32 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005 243 сіу Маі1 Рго Авр Агуд Рпе Бек сіу Бек Ппув Бек б1у АвБп ТПг Аїа 5ег 1 З 10 15 тей ТПпПг Уаі1 Бек с1у Гец сбіп Аїа біц Авр біц Аза Авр Тук Тук Сув 20 25 30 60
«2105» 244 «2115 32 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 244 сіу Уаі1 Рго Авр Агуд Рпе Бек сіу Бек біу Бек б1і1у ТПг Авр РПпе ТПг 1 5 10 15 теп пув Іїе Бег Агуд Уаі сбіц Аїа біц Авр Уаї сіу Ууаї Тук Тук Сув 20 25 30 «2105 245 «2115 10 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 245
Рпе с1у с1у б1у ТПпг пуб Гей ТПг Уаї Іец 1 5 10 «2105» 246 «2115 10 «2125 БІЛОК «2135» Ното варієпв «4005» 246
Рпе с1у біп с1у Тпг пув гей бій І1е Гуз 1 З 10 «2105 247 «2115 223 «2125 БІЛОК «2135» Мив шивси1ив «4005 247
Меє Аїа Сув пеш с1у Гей Агуд Агуд Ту губ Аза біп Гей біп Гей Рго 1 5 10 15 век Агуд ТПг Тер Рго Рпе Уаї Аїа Гец Гец ТПг Гец Гец Рпе Ії1е Рго 20 25 30
Ууаї Рпе 5ег бішц Аїа чІ1е сіп Уаї ТПг о біп Рго Бек Уаі1ї Уаї Гей А1їа 35 40 45 зек Бек Нів сіу уаї1ї АТїа Бек Рпе Рго Сув біц Туг Бек Рго бБекг Нів 50 55 бо 60
Авп оТПг Авр бій Уаї Агуд Уаї Тс Уаї тей Агу біп ТПпг АБп АБр біп
65 70 75 80
Мес тПпг біц Уаї Сув Аза ТПг ТПг Рпе ТПг бій пув Авп о ТПг Уаї с1У 85 90 935
Рпе Гей Авр Тук Рго Рпе Суб Бек бі1у ТПг Рпе АвБп бій бБег Агу Уаї1ї 100 105 110
Авп оГпей ТПг о ч11е біп с1у гей Агу А1ї1а Уаії Авр ТпПг с1у Гей Тукг Іец 115 120 125
Сув пув Уа1 сіц Гец Мес Тук Рго Рго Рго Тук Рпе Уаі сіу Меє сщ1У 130 135 140
АБп ос1іу ТПг біп ч11е Тук Маї І1е АвБр Рго біц Рго Сув Рго Авр Бег 145 150 155 160
Авр Рпе гей гей Тгр 11е Іїей УМаї Аза Уаї Бек Гей с1у Гей Рпе РПе 165 170 175
Тук Бек Рпе Гей Уаі! ТПг Аїа Уаї бек Гей Бек Ппув Меє гей пув Гуз 180 185 190
Зо
Ага Бек Рго Ппейп ТПг ТПг о б1у Маї Ту Маї пув Меє Рго РгО ТПг б1ци 195 200 205
Рго бій Сув бій пув біп Рпе біп Рго Туг Рпе І1е Рго І1е Авп 210 215 220 «2105» 248 «2115 223 «2125 БІЛОК «213» Масаса тавсісц1агів «4005» 248
Меє Аїа Сув геш с1у Рпе сіп Агуд Ні їув Азї1а Агуд Гей Ап Тецй А1а 1 5 10 15
ТПгЕ Агуд ТП Агуд Рго Тук ТПг Гей Гей Рпе бек Гей Гей Рпе І1е Рго 20 25 30 мМма1 Рпе Бек Ппув Аїа Меєсє Нів Уаї Аїа сіп Рго А1ї1а Уаї Уаї тей А1а 35 40 45
Авп обБег Агуд с1у І1е А1їа Бек Рпе Уаї Сув бій Туг А1ї1а Бек Рго щЩ1У 60 зо зо бо пув Аїа ТПг біц Уаі Агу Уа1і ТПг Уаї гец Агуд біп Аїа Авр Бек сіп 65 70 75 80 уаї тПгЕ біц уаї Сув Аїа Аїа ТПг Ту Меє Меєсє сіу Авп сій Гей ТПг 85 90 935
Рпе гей Авр Авр Бек І1е Сув ТПг біу ТПг Бек Бек с1у Авп сіп Уаї 100 105 110
Авп оГпей ТПг о І1е біп с1у тей Агу А1ї1а Меє АБр ТПпПг с1у Іей Тук Ше 115 120 125
Сув пув Уа1 сіц Гец Мес Тук Рго Рго Рго Туг Ту Меє сіу І1е с0Щ1У 130 135 140
Авп осіу ТПг біп І1е Ту Маї І1е АБр Рго бій Рго Суб Рго АБр б5ег 145 150 155 160
Авр Рпе гей гей Тгр І11е тей Аза Аза Уаї Бек Бек б1у Гей Рпе РПе 165 170 175
Тук Бек Рпе Гей пе ТПг Аїа Уаї Бек Гей Бек Ппув Меє Гей пув Гув 180 185 190
Ага Бек Рго Ппейп ТПг ТПг о б1у Маї Ту Маї пув Меє Рго РгО ТПг б1ци 195 200 205
Рго бій Сув бій пув біп Рпе біп Рго Туг Рпе І1е Рго І1е Авп 210 215 220 «2105» 249 «2115» 330 «2125 БІЛОК «213» Ното варієпв «4005 249
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 З 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 60 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег
50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935 пув Ммаї бій Рго пув Бек Сув Авр пуб ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей тей б1у б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125 пув Рго Ппув Авр ТПг Гей Меєс І1е Бек Акуд ТПг Рго сбіц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц Авр Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175
Зо сі біп Туг Авп о Бек ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец ТПг Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205 пув Аїа гей Рго АТа Рго ІчІ1е сіцш Ппув ТПг І1е Бек пув Аїа пув 01Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бег Агд АБр б1ц 225 230 235 240 теп ТПпг пув АвБп обіп Уаі1! Бек Гец ТПг Сув Гец Уаї Ппув с1у РПпе Тукг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 бо Пец Тук Бек Ппув Гей ТПг Уаі1 Авр Пув бБег Агд Тгр біп б1п С1Уу АвпП 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп пув Бек Гец Бек Гец Бек Рго с01Уу Гувг 325 330 «2105 250 «2115» 326 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 250
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Сув бБег Аг4д 1 5 10 15 век ТПпПг Бек біц Бек ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 с1іу Ма1ї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї Ггецш сіп бек Бек с1у Ге Тук бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1ї ТПг Уаї Рго Бек Бек АвБп Рпе с1іу ТПг сбіп ТтТПг 65 70 75 80
Тук ТП Сув Авп оУаї Авр Нів Кгув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
ТПгЕ Уаї бій Агуд пув Сув Сув Маї сій Сув Рго Рго Субв Рго Аї1а Рго 100 105 110
Рго Маії А1їа с1у Рго Бек Ма1і Рпе Іїей Рпе Рго Рго Гув Рго Гув Авр 115 120 125
ТПг пец Меє І1е Бек Агу ТПг Рго сій Уа! ТПг Сув Маї Уаї Уа1ї Авр 130 135 140 уаї Бек Нів бій Авр Рго сіц Уаї біп Рпе АБп Тгр Ту Уа1і АБр Щ1У 145 150 155 160 уаї бі уаї Нів Авп Аза пуб ТПг о Тув Рго Агд бій бі біп Рпе Авгп 165 170 175 60 зек ТПпг Рпе Агу Уаї Уа1 Бек Уаі1! Ггец ТПг Уаї Уаї Нів сб1п Авр Тгр 180 185 190
Тїец АБп о б1у Ппув бі Тук Ппув Сув Пув Маї Бек АБп Гпув б1у Геч Рго 195 200 205
Аза Рго чІ1е сій пув ТПг І1е Бек пув ТпПг пув б1у бі1іп Рго Агу 61 210 215 220
Рго біп Маї Тук ТПг Гей Рго Рго Бек Агуд бій бій Меє ТПпг Гув Авп 225 230 235 240 сіп Уаі1 Бек Гей ТПг Сув Гец Уаї Ппув б1у Рпе Тук Рго Бек АБр Іе 245 250 255
А1ї1а уаї бій Тегр бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп Авп о Туг Гув ТПг 260 265 270
ТПг Рго Рго Меє Гпецп Авр Бек Авр б1у Бек Рпе РпПе Гей Туг Бек Гув 275 280 285 тей ТпПг Уаі1 Авр Ппув Бек Агуд ТеЕр біп біп б1у Авп Уаії Рпе бек Сув 290 295 300 зек уаї Меє Нів сій АТа гейш Нів Авп о Нів Тук ТПг біп Гув бБекг Іецй 305 310 315 320 век Гей Бек Рго с1у Гув 325 «2105 251 «2115 377 «2125 БІЛОК «213» Ното варієепь «4005 251
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Сув бБег Аг4д 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 бо с1іу Ма1ї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї Ггецш сіп бек Бек с1у Ге Тук бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 8о
Тук ТП Сув Авп оУаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 535
Агуд Ма1ї сіц пец туз ТП Рго Гей сС1у Авр ТПг ТПг Нів Тс Сув РгОо 100 105 110
Аку Сув Рго біц Рго пув Бек Сув Авр ТПг Рго Рго Рго Сув Рго Агд 115 120 125
Сув Рго біц Рго Ппув Бек Сув Авр ТПг Рго Рго Рго Сув Рго Агд Сув 130 135 140
Рго бій Рго Ппув Бек Сув Авр ТПг Рго Рго Рго Суб Рго Агуд Сув Рго 145 150 155 160
Аза Рго бій гей гей б1у б1у Рго Бек Уа1і Рпе Гей Рпе Рго Рго Гув 165 170 175
Зо
Рго пув Авр ТПг тей Меє І1е Бек Агу ТПг Рго бій Уа1 ТПпПг Сув Уаї1ї 180 185 190 ма1 Уаї Авр Уаї Бек Нів бі1ц Авр Рго сіц Уаї сбі1п Рпе пув Тгр Туг 195 200 205 уаї Авр с1у Ма1ї сіц Уа1! Нів АБп Аїа Гув ТПг пув Рго Агуд бій с1и 210 215 220 сбіп Тук Авп бБег ТПг Рпе Агуд Уа1! Уаї Бек Уаї Іец ТПпг Уаї Гей Нів 225 230 235 240 сіп Авр Тер Гец Авп о сіу Ппув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек Авп Гув 245 250 255
А1їа гей Рго Аза Рго І1е бій пув ТПг І1е Бек пуб ТпПг Ггув Ш1у біп 260 265 270
Рго Акад бій Рго біп Уаї Тук ТБПг Гей Рго Рго Бек Акуд б1іц сі Меє 275 280 285
ТПгЕ пув Авп обіп Уаї бек гей ТПг Сув Гей Уаї пув с1у Рпе Туг Рго бо 290 295 300 век Авр І1їе Аїа Уаі сіц Тер сбіц Бек Бек б1і1у біп Рго біц Ап АП 305 310 315 320
Тук Авп оТПг Тс Рго Рго Меє Гей Авр Бек Авр бі1іу Бек Рпе РПе Іеєцй 325 330 335
Тук Бек Ппув Гей ТПг Уаї Авр пув Бек Агд Тер біп біп с1у Ап ІчІ1е 340 345 350
Рпе Бек Сув Бек Уаї Меє Нів сій АТа гейш Нів Авп Агуд Рпе ТПг сіп 355 360 365 пув Бек Гец Бек Гец Бек Рго с01Уу Гувг 370 375 «2105 252 «2115 327 «2125 БІЛОК «213» Ното варієпв «4005 252
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Сув бБег Аг4д
Зо 1 З 10 15 век ТПпПг Бек біц Бек ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо пе Бек Бек Ма1ї Уаї ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек тей с1у ТП Бпув ТПг 65 70 75 80
Тук ТП Сув Авп оУаї Авр Нів Кгув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Ага Маї сій Бек пув Тук б1у Рго Рго Суб Рго Бек Сув Рго Аїа РгОо 100 105 110 сій Рпе Гец сіу сіу Рго Бек Уаії Рпе Гецш Рпе Рго Рго Пув Рго Гу 115 120 125 60
Авр ТтТПг гей Меє І1е Бек Агу ТПг Рго бій Уа1 ТПпг Сув Уа1 Уа1ї1 Уаї1ї
130 135 140
Авр Маії Бек біп бій Авр Рго бій Уаі1і бі1іп Рпе АвБп Тгр Туг Уа1і1 Авр 145 150 155 160 сі1у Уаї бій Ууаї Нів Авп Аза пуб ТПг о пув Рго Агд бій бій сбіп РБПе 165 170 175
Ап обБек ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї гей ТПг Уа1! Ггец Нів сбіп Авр 180 185 190
Тер гей Авп о сіу пув сій Ту пув Сув пув Ма1ї Бек Авп Гув о1Уу Іецй 195 200 205
Рго Бек Бек І1їе б1цш Ппув ТПг І1ї1е Бек пув Аїа пув С1у б1п Рго Агд 210 215 220 бій Рго біп Уаі1і Тук ТПг Гец Рго Рго Бек біп біц біц Мес тТПг Гув 225 230 235 240
Авп обіп Маї Бек гей ТПг Сув тей Маї пув б1у Рпе Туг Рго б5Бег Авр 245 250 255
Зо
І1е А1їа Уаї бій Тгр бій Бек Авп б1у біп Рго бій АБп АвБп о Туг Гув 260 265 270
ТПЕ ТП Рго Рго Маії Гей Авр Бек Авр бі1іу Бек Рпе Рпе Іей Туг б5ег 275 280 285
Агуд Гей Тпг оУа1ї1ї Авр пув Бек Агуд Тер бі1іп біц с1у Авп Уаї РПе 5ег 290 295 300
Сув Бек Ууаї Меє Нів бій Аїа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг біп Гпув бБег 305 310 315 320
Тецй Бек Гей Бек Гей с1Уу Гув 325 «2105 253 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН 60 «4005 253
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпг Бек сбіу б1іу ТПг Аїа Аїа Гей сіу Сув їеиш Уаї Гпув Авр Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935 пув Маї б1ш Рго Ппув Бек Сув Авр Ппув ТПг Нів ТПг о Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо
Зо 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп тує АвБп Атїа ТПг Туг Агуд Маї Уаї Бек Уа1ї Ггец Рго Уаї Гей 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго І1е бій бій ТПпг І1е Бек їгув Аї1а їув Щ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд Сув б1ц 225 230 235 240 60 теп ТПпг пув АвБп обіп Уаі1! Бек Гец Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у РПпе Тукг
245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Уаї1ї Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гей Бек Гей Бек Рго 325 «2105 254 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» «СН «4005 254
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 З 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег бо 50 пе Бек Бек Ма1ї Уаї ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек тей с1у ТПг с1іп Тбг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 55 85 90 935
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110 60
Рго Аїа Рго бій Рпе біп Тгр б1у Рго Меєс Уаі1ї Рпе Іей Рпе Рго РгО 115 120 125 пув Рго Ппув Авр Уаї Гей Меє чІ1е 5ег Агуд ТПг Рго бій Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек Авр бій бій Рго сій УМаї Ппув Рпе Авп Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
АБвр Аїа Гей Рго Аза Рго чІ1е сій пув ТПг І1е Бек пув Аїа Ггув -Щ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд Ппув с1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп о біп Уаії Бек Ггецп ТПг Сув гей Уаії Ппув с1іу Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285
Пец Тук Бек Ппув Гей ТПг Уаі1 Авр Пув бБег Агд Тгр біп б1п С1Уу АвпП 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гец Бек Гец Бек Рго 325 «2105 255 «2115» 328 «2125 БІЛОК 60 «213» Штучна послідовність
«2235 КМсСН «4005 255
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15
Зек ТПг бек б1у с1у ТПг АТїа Аза Ггецш с1у Сув тей Уаї пув Авр Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Агуд Маї сій Рго пув Бек Сув Авр Пув ТПгЕ Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп тує АвБп Атїа ТПг Туг Агуд Маї Уаї Бек Уа1ї Ггец Рго Уаї Гей 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго І1е бій бій ТПпг І1е Бек їгув Аї1а їув Щ1Уу 210 215 220 60 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Меє тПпг опув Авп о сбіп Уа1ї бек пеш ТПг Сув Гей Уаї Ппув б1у Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп бій Бек Гей Бек Гей Бек Рго 325 «2105 256
Зо «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» «СН «4005 256
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 З 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо пе Бек Бек Ма1ї Уаї ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек тей с1у ТПг с1іп Тбг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 60 85 90 935
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125 пув Рго Ппув Авр Уаї пеп Меєс І1е Бек Акд ТПг Рго сбіц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
АБвр Аїа Гей Рго Ппув Рго Авр сій бій ТПг І1е Бек пув Аїа гув Щ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп о біп Уаії Бек Ггецп ТПг Сув гей Уаії Ппув с1іу Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285
Пец Тук Бек Ппув Гей ТПг Уаі1 Авр Пув бБег Агд Тгр біп б1п С1Уу АвпП 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп бій Бек Гец бБег Ге б5Бег Рго 325 60
«2105 257 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 257
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15
Зек ТПг бек б1у с1у ТПг АТїа Аза Ггецш с1у Сув тей Уаї пув Авр Туг
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 20 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо 25 тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80
Зо тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Агуд Маї сій Рго пув Бек Сув Авр Пув ТПгЕ Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій Рпе біп Тгр б1у Рго Меєс Уаі1ї Рпе Іей Рпе Рго РгО 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек Авр бій бій Рго сій УМаї Ппув Рпе Авп Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп тує АвБп Атїа ТПг Туг Агуд Маї Уаї Бек Уа1ї Ггец Рго Уаї Гей 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 60 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго бій бій гпув ТпПг І1е Бек їгув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд Ппув с1ц 225 230 235 240
Меє тпг пув Авп сб1іп Уа! Бек Ггецп ТПг Сув теп уаї пув с1у Рбе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гей Бек Гей Бек Рго 325 «2105 258 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 258
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо бо пе Бек Бек Ма1ї Уаї ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек тей с1у ТПг с1іп Тбг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125 пув Рго Ппув Авр Уаї пеп Меєс І1е Бек Акд ТПг Рго сбіц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Зо
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
АБвр Аїа Гей Рго Аїа Рго сій сій бій ТПг І1е Бек пув Аїа гув -Щ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп о біп Уаії Бек Ггецп ТПг Сув гей Уаії Ппув с1іу Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285
Пец Тук Бек Ппув Гей ТПг Уаі1 Авр Пув бБег Агд Тгр біп б1п С1Уу АвпП 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг бо 305 310 315 320 сіп бій Бек Гец бБег Ге б5Бег Рго «2105 259 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 259
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15
Зек ТПг бек б1у с1у ТПг АТїа Аза Ггецш с1у Сув тей Уаї пув Авр Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег бо
Зо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 35 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935 40 Агуд Маї сій Рго пув Бек Сув Авр Пув ТПгЕ Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій Рпе біп Тгр б1у Рго Меєс Уаі1ї Рпе Іей Рпе Рго РгО 45 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 50 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек Авр бій бій Рго сій УМаї Ппув Рпе Авп Тгр 145 150 155 160 55
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 бо сі біп тує АвБп Атїа ТПг Туг Агуд Маї Уаї Бек Уа1ї Ггец Рго Уаї Гей 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго І1е бій гпув ТПг І1е Бек їгув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд Ппув с1ц 225 230 235 240
Меє тпг пув Авп сб1іп Уа! Бек Ггецп ТПг Сув теп уаї пув с1у Рбе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300
Зо уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів АТа Нів ТПг ТПг 305 310 315 320
Агуд пув сій тей Бек Гей Бек Рго 325 «2105» 260 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005» 260
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 З 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 60 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег
50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125 пув Рго Ппув Авр Уаї пеп Меєс І1е Бек Акд ТПг Рго сбіц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175
Зо сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
АБвр Аїа Гей Рго Ппув Рго Авр сій бій ТПг І1е Бек пув Аїа гув Щ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп о біп Уаії Бек Ггецп ТПг Сув гей Уаії Ппув с1іу Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 бо Пец Тук Бек Ппув Гей ТПг Уаі1 Авр Пув бБег Агд Тгр біп б1п С1Уу АвпП 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів АТа Нів ТПг ТПг 305 310 315 320
Ага бій бій Гей бБег Гей Бек Рго 325 «2105» 261 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «400» 261
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15
Зек ТПг бек б1у с1у ТПг АТїа Аза Ггецш с1у Сув тей Уаї пув Авр Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег
Зо 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Агуд Маї сій Рго пув Бек Сув Авр Пув ТПгЕ Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій Рпе біп Тгр б1у Рго Меєс Уаі1ї Рпе Іей Рпе Рго РгО 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек Авр бій бій Рго сій УМаї Ппув Рпе Авп Тгр 145 150 155 160 60
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій
165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго І1е бій гпув ТПг І1е Бек їгув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Меє тпг пув Авп сб1іп Уа! Бек Ггецп Тер Сув теп Уаї пув с1у Рбе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285
Зо теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гей Бек Гей Бек Рго 325 «2105 262 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» «СН «4005 262
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 З 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30 60
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 с1іу Ма1ї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї Ггецш сіп бек Бек с1у Ге Тук бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій Рпе біп Тгр б1у Рго Меєс Уаі1ї Рпе Іей Рпе Рго РгО 115 120 125 пув Рго Ппув Авр Уаї пеп Меєс І1е Бек Акд ТПг Рго сбіц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек Авр бій бій Рго сій УМаї Ппув Рпе Авп Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
АБвр Аїа Гей Рго Аза Рго чІ1е сій пув ТПг І1е Бек пув Аїа Ггув -Щ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Сув ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп обіп Уаії бек Ггецш Тгр Сув гей Уаї Ппув сі1у Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270 60
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе
275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гец Бек Гец Бек Рго 325 «2105» 263 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 263
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15
Зек ТПг бек б1у с1у ТПг АТїа Аза Ггецш с1у Сув тей Уаї пув Авр Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Агуд Маї сій Рго пув Бек Сув Авр Пув ТПгЕ Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 60 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160 тук Маї Авр с1у Уаї сбіц Маї Нів Авп Аїа пув ТпПг пув Рго Агд б1и 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго пув Рго АБр бій бій Тпг І1е Бек їгув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Меє тпг пув Авп сб1іп Уа1! б5Бек Гей Бек Сув Аїа Уаї пув с1у Рбе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп
Зо 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Уаї1ї Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гей Бек Гей Бек Рго 325 «2105» 264 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» «СН «4005» 264
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 60 1 З 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 с1іу Ма1ї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї Ггецш сіп бек Бек с1у Ге Тук бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125 пув Рго Ппув Авр Уаї пеп Меєс І1е Бек Акд ТПг Рго сбіц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
АБвр Аїа Гей Рго Ппув Рго Авр сій бій ТПг І1е Бек пув Аїа гув Щ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд Сув б1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп обіп Уаії бек гей бек Сув Аїа Уаії Ппув сіу Рпе Туг 245 250 255 60
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпоТтук пув ТП ТЕ Рго Рго Уаії Гей Авр бБег Авр сіу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Уаї1ї Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гец Бек Гец Бек Рго 325 «2105 265 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 265
Зо
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15
Зек ТПг бек б1у с1у ТПг АТїа Аза Ггецш с1у Сув тей Уаї пув Авр Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Агуд Маї сій Рго пув Бек Сув Авр Пув ТПгЕ Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій Рпе біп Тгр б1у Рго Меєс Уаі1ї Рпе Іей Рпе Рго РгО 60 115 120 125
ЗА
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек Авр бій бій Рго сій УМаї Ппув Рпе Авп Тгр 145 150 155 160 тук Маї Авр с1у Уаї сбіц Маї Нів Авп Аїа пув ТпПг пув Рго Агд б1и 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго бій бій гпув ТпПг І1е Бек їгув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Меє тпг пув Авп сб1іп Уа! Бек Ггецп Тер Сув теп Уаї пув с1у Рбе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гей Бек Гей Бек Рго 325 «210» 266 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 бо «223» «СН
«400» 266
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 с1іу Ма1ї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї Ггецш сіп бек Бек с1у Ге Тук бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Зо
Рго Аїа Рго бій Рпе біп Тгр б1у Рго Меєс Уаі1ї Рпе Іей Рпе Рго РгО 115 120 125 пув Рго Ппув Авр Уаї пеп Меєс І1е Бек Акд ТПг Рго сбіц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек Авр бій бій Рго сій УМаї Ппув Рпе Авп Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
АБвр Аїа Гей Рго Аїа Рго сій сій пув ТПг І1е Бек пув Аїа гув -Щ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Сув ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц бо 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп обіп Уаії бек Ггецш Тгр Сув гей Уаї Ппув сі1у Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпоТтук пув ТП ТЕ Рго Рго Уаії Гей Авр бБег Авр сіу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гец Бек Гец Бек Рго 325 «2105 267 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність
Зо «2205 «2235 КМсСН «4005 267
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15
Зек ТПг бек б1у с1у ТПг АТїа Аза Ггецш с1у Сув тей Уаї пув Авр Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег бо 50 тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 55 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935 бо Агуд Маї сій Рго пув Бек Сув Авр Пув ТПгЕ Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160 тук Маї Авр с1у Уаї сбіц Маї Нів Авп Аїа пув ТпПг пув Рго Агд б1и 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго бій бій бій Тпг І1е Бек Ггув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220
Зо сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Меє тпг пув Авп сб1іп Уа1! б5Бек Гей Бек Сув Аїа Уаї пув с1у Рбе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Уаї1ї Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гей Бек Гей Бек Рго 325 «2105» 268 60 «2115» 328 «2125 БІЛОК
«213» Штучна послідовність «2235 КМсСН «4005» 268
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 с1іу Ма1ї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї Ггецш сіп бек Бек с1у Ге Тук бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Зо
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125 пув Рго Ппув Авр Уаї пеп Меєс І1е Бек Акд ТПг Рго сбіц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205 бо АБвр Аїа Гей Рго Аїа Рго сій сій бій ТПг І1е Бек пув Аїа гув -Щ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд Сув б1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп обіп Уаії бек гей бек Сув Аїа Уаії Ппув сіу Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпоТтук пув ТП ТЕ Рго Рго Уаії Гей Авр бБег Авр сіу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Уаї1ї Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гец Бек Гец Бек Рго 325
Зо «2105» 269 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005» 269
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15
Зек ТПг бек б1у с1у ТПг АТїа Аза Ггецш с1у Сув тей Уаї пув Авр Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 60 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув
85 90 935
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій Рпе біп Тгр б1у Рго Меєс Уаі1ї Рпе Іей Рпе Рго РгО 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек Авр бій бій Рго сій УМаї Ппув Рпе Авп Тгр 145 150 155 160 тук Маї Авр с1у Уаї сбіц Маї Нів Авп Аїа пув ТпПг пув Рго Агд б1и 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Зо
Авр Аїа гей Рго Аза Рго І1е бій гпув ТПг І1е Бек їгув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Меє тпг пув Авп сб1іп Уа! Бек Ггецп Тер Сув теп Уаї пув с1у Рбе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів АТа Нів ТПг ТПг 305 310 315 320 бо Агуд пув сій тей Бек Гей Бек Рго 325
«2105 270 «2115» 328 «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 270
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 25 с1іу Ма1ї Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї Ггецш сіп бек Бек с1у Ге Тук бБег бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 30 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935 35
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110 40
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125 45 пув Рго Ппув Авр Уаї пеп Меєс І1е Бек Акд ТПг Рго сбіц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 50 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 55 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190 60
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп
195 200 205
Авр Аїа гей Рго пув Рго АБр бій бій Тпг І1е Бек їгув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп обіп Уаії бек гей бек Сув Аїа Уаії Ппув сіу Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпоТтук пув ТП ТЕ Рго Рго Уаії Гей Авр бБег Авр сіу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Уаї1ї Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів АТа Нів ТПг ТПг 305 310 315 320
Зо
Ага пув бій Гей бБег Гей Бек Рго 325 «2105 271 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 271
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15
Зек ТПг бек б1у с1у ТПг АТїа Аза Ггецш с1у Сув тей Уаї пув Авр Туг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо 60 тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук чІ1е Сув Авп Уаі1! Авп оНів Ппув Рго Бек АвБп ТПг Ппув Уаі1ї! Авр Гувг 85 90 935
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій Рпе біп Тгр б1у Рго Меєс Уаі1ї Рпе Іей Рпе Рго РгО 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї Уаї Авр Уаії Бек Авр бій бій Рго сій УМаї Ппув Рпе Авп Тгр 145 150 155 160 тук Маї Авр с1у Уаї сбіц Маї Нів Авп Аїа пув ТпПг пув Рго Агд б1и 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец
Зо 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго бій бій гпув ТпПг І1е Бек їгув Аї1а їув щЩ1Уу 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд біц с1ц 225 230 235 240
Меє тпг пув Авп сб1іп Уа! Бек Ггецп Тер Сув теп Уаї пув с1у Рбе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 60 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів АТа Нів ТПг ТПг
305 310 315 320
Ага пув бій Гей бБег Гей Бек Рго 325 «2105 272 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 272 сіп Уаі1і сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сіу сбі1у Маі Уаї сбіп Рго сіу с1У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45
Зек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1ї1е Туг Туг А1а сій Бек Уаї 50 55 бо
Ага сб1у Аг Рпе ТПг І1е Бек Агуд АБр АБп Аза Губв АвБп о бБег Іецй Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Ага Тук б1у А1ї1а Агуд б1й Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125
Зек Ма1 Рпе Рго Гей Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг бек с1у Ш1уУу ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175 60
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190
Ууаї Рго Бек бБег Бек Гей с1і1у ТПг біп Тпг Тук І1е Сув Авп Уа1ї! Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270
Нів біц бій Рко біц Маї Ппув Рпе Авп Тгр Тук Маї Авр сіу уУаї с1ци 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335
І1е бій бій ТПг о І1е Бек ув А1їа пув б1у бі1іп Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 мМма1т1 Ттук ТПпг Гей Рго Рго Бек Агд сій біш Мес ТПг о пув Авп сбіп Уаї 355 360 365 зек Гей ТПпПг Сув Гец Уаї Ппув б1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Туг Бек Ггув Іецй ТПг 405 410 415 60
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї
420 425 430
Мен Нів сій АТа гейш Нів Аїа Нів ТПг ТПпг Агд бій бі Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105 273 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 273 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек Гей Агуд Гец Бек Сув Аїа Аїа Бек біу Рпе ТПг Рпе Бек Бек Гувг 20 25 30
ТПгЕ Меє Авп Тер Уа1! Агуд біп Аїа Рго сіу Ппув б1у Гей сій Тгр Уаї зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 35 зо 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 40 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935 45
Аза Ага Тук с1у пув Агуд бій Авр Меє тей Тгр Уа1і Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сі1іу біп б1у ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг пув 01У Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160 60 уаї Бек Тер Авп Бек сіу Аїа їец ТПг Бек бі1у Уаї Нів ТПг Ропе Рго 165 170 175
А1їа уаї1ї пеп біп Бек Бек бі1у Гей Туг б5Бег Гей бБег бек Уаї Уаї ТтПг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маі Рпе гей Рпе Рго Рго пубв Рго їубв АБр Уаї1ї Іец 245 250 255
Меє І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уа1ї 5ег 260 265 270
Нів біш бій Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц
Зо 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 сіу пув біц Тук Ппув Сув Ппув Уаії Бек АвБп АвБр Аїа Гец Рго Аїа Рго 325 330 335
І1е сій сій Тс о чІ1е Бек пув Аїа пув с1у біп Рго Акд бій Рго сіп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агуд Сув сій Меє ТПг пув Авп о біп Уаї 355 З6о 365 зек Гей Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго 385 390 395 400 60
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Уаі1ї Бек Гпув Іецй ТПг
405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гей Нів АвБп о Нів Туг ТПпг о біп Гпув бБег Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105 274 «2115» 450 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Не «4005 274 сі Уаі1 сіп Гец Уаї сіц Бек б1у сбі1у б1у Ггецшц Уаії пув Рго сіу с01У 1 5 10 15 зек гей Агд Гей бБег Сув Аїа Аїа бек біу Рпе ТПг Рпе Бек 5Бег Гпув 20 25 30
ТПгЕ Мес Авп Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зЗзек Бек І1е Бек ТПг біп Бек Нів Тук І1е Туг Ту А1ї1а сій Бек Уаї 50 55 бо пув б1у Агуд Рпе ТПг Іїе Бег Агуд АвБр АвБп Аза Пув Ап Бек Гец Туг 65 70 75 80 тей біп Мес Ап о бБег Гец Агуд Аїа біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 935
Аза Агуд тує б1у ув Агуд б1й1 Авр Меє Гей Тер Уа1 Рбпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сіу біп сіу ТПг Гец Уа1і ТПг Уаї Бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув 1у Рго 115 120 125 зек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Рго Бек Бек Ппув Бек ТПг Бек б1у с1у ТПг 130 135 140 60
А1ї1а Аї1а гей с1у Сув пе Маї пув Авр Туг Рпе Рго бій Рго Уа1ї1 ТПпг 145 150 155 160
Ма1 Бек Тер Авп Бек біу А1ї1а гейш ТПг Бек с1і1у Маї Нів ТПг РібБе Рго 165 170 175
А1їа уаї Ппейп біп Бек Бек б1і1у тей Туг бБег Гей бБег бБег Уаі1і Уа1ї ТПпг 180 185 190 уаї Рго Бек Бек Бек Ггецш с1і1у ТПг біп ТПг Тук чІ1е Сув Авп Уаї Авп 195 200 205
Нів Ппув Рго Бек АвБп ТПг туз Уаї Авр пув Агуд Уа1 сій Рго Ппув бБег 210 215 220
Сув Авр Гпув ТПг Нів ТпПг Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Іецй Іецй 225 230 235 240
А1їа с1у Рго Бек Маії Рпе Гей Рпе Рго Рго Ппув Рго Ппув Авр Уаї Ієй 245 250 255
Мес чІ1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаі ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег
Зо 260 265 270
Нів біш бій Рго біц Уаї пуб Рпе АвБп Тгр Тук Уаі1 Авр сіу Уаї с1ц 275 280 285 уаї Нів Авп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд бі бій біп Ту АвБп АтТа ТЕГ 290 295 300 тТук Агуд Ма1 Уаї Бек Уаї Іец Рго Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 с1у пув бій Тук Ппув Сув Ппув Уа1! 5Бег АвБп Авр Аза Іей Рго Аза Рго 325 330 335
І1е бій бій ТПг о І1е Бек ув А1їа пув б1у бі1іп Рго Агуд бій Рго біп 340 345 350 уаї Тук ТПпг Ггец Рго Рго Бек Агуд Сув сій Меє ТПг пув Авп о біп Уаї 355 360 365 зек Гей Бек Сув Аїа Уаї Ппув с1у Рпе Тук Рго Бек Авр Іїе Аїа Уаї 370 375 380 60 сій Тер біц Бек АвБп о сіу біп Рго біц Авп Ап о Туг Ппув ТПг Тс Рго
385 390 395 400
Рго Маії пейп Авр Бек Авр біу Бек Рпе Рпе Іей Уаі1ї Бек Гпув Іецй ТПг 405 410 415
Ууаї Авр пув Бек Агуд Тгр біп біп сіу Авп Уаі Рпе бек Сув Бек Уаї 420 425 430
Мен Нів сій АТа гейш Ні Аїа Нів ТПг ТПпг Агд пув бій Гей Бек Іец 435 440 445 зек Рго 450 «2105 275 «211» 218 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» І1сі «4005 275
АБвр чІ1е Маї Меє тТПг о сіп Бек Рго Іїецй Бек Гей Рго Уа1 ТПг Рго 0Щ1У 1 5 10 15 бій Рго Аїа Бек Іїе Бек Сув Авр біу Рго Бек ТПг сб1у Уаії 01Уу Авр 20 25 30
Тук Авп Тук Уаї Нів Тер Ту бі1іп сбіп пув Рго с1у сіп Аза Рго Агд 35 40 45
Теч Геп Іїе Тук Рпе ТПг Бек Ппув Ппув Рго Бек біу Уаї Рго Авр Агд 50 55 бо
Рпе Бек біу Бек б1і1у Бек б1у ТПг Авр Рпе ТПг Іїей Гув І11е б5Бег Аг4д 65 70 75 80 маї1 б1п Аза сій Авр Уаї с1у Маї Тук Тук Сув бі1іп ТПг Туг АТїа А1а 85 90 935
Рго Пец б1у Рго Меє Рпе б1у біп б1у ТпПг губ ей бій І1їе Гув Аг4д 100 105 110
ТПг Маії Аза А1їа Рго Бек Уаі Рпе І1е Рбпе Рго Рго бБег АБр бій біп 115 120 125 60 теп Ппув Бек сіу ТПг Аїа Бек Уаї Уаї Сув Гец Гец Ап Ап РПе Туг 130 135 140
Рго Агуд біш Аїа пув Уаї біп Тер Ппув Маії Авр АвБп Аїа Гец сбіп 5ег 145 150 155 160 сіу АвБп Бек біп сбіц Бек Уа1і ТПг біц біп Авр Бек Ппув Авр Бек ТПг 165 170 175
Ттук Бек Гей бек бек ТПг Гей ТПг Гей бек пув Аїа Авр Ту бі Гуз 180 185 190
Нів пув Ма1 Тук Аїа Сув біц Уаї ТПпг Нів сіп с1у Гей Бек Бек Рго 195 200 205 уаї тпПг пув Бек Рпе АвБп Агуд с1у біц Сув 210 215 «2105 276 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 276
А1їа бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаії Рпе Рго Гей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег бо 50 тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 55 тТук чІ1е Сув Авп Уаі1! Авп оНів Ппув Рго Бек АвБп ТПг Ппув Уаі1ї! Авр Гувг 85 90 935
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 60 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 мМа1т1 уаї Маї Авр Уаї Бек Нів біц сій Рко біц Маї Ппув Рпе АвБп Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго І1е бій бій ТПпг І1е Бек їгув Аї1а їув Щ1Уу 210 215 220 сіп Рго Агуд бій Рго сб1іп Уа1! Тук ТПг Гей Рго Рго Бек Агд сій с1и 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп о біп Уаії Бек Ггецп ТПг Сув гей Уаії Ппув с1іу Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Тук Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 мМма1 Рпе Бек Сув Бек Уаї Мес Нів сій Аїа тей Нів Аїа Нів ТПг тТПг 305 310 315 320
Ага бій бій Гей бБег Гей Бек Рго 325 «2105 277 «2115» 328 бо «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність збо
«2235 КМсСН «4005 277
А1їа Бек ТПг пув б1у Рго Бек Ма1і Рпе Рго Іїей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Уаї ТПг Уаї Бек Тгр АБп Бек с1у Аїа тей ТПг 5Бег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег зо 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 тТук І1е Сув Авп Уаії Авп о Нів КГув Рго Бек Авп ТПг пув Уа1 Авр Гув 85 90 935
Зо
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій Ггеш Гей Аїа с1у Рго Бек Уа1ї Рпе Іей РпПе Рго Рго 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 уаї уаї уаї Авр Уа1 Бек Нів біц біц Рго бій Уаї пув Рпе Ап Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тер Гей АвБп осіу пув бій Тук пув Сув пув Уа1ї! Бек Авп 195 200 205
Авр Аїа гей Рго Аза Рго І1е бій бій ТПпг І1е Бек їгув Аї1а їув Щ1Уу бо 210 215 220 сбіп Рго Агуд бій Рго сіп Уа1ї Тук ТПг Гец Рго Рго Бек Агд Сув б1ц 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп обіп Уаії бек гей бек Сув Аїа Уаії Ппув сіу Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е А1ї1а Уаї сій Тгр бій Бек АвБп о с1іу біп Рго 610 Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Уаї1ї Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 уа1ї Рпе Бек Сув Бек Уа1 Месє Нів біцш Аза тей Нів Авп Нів Тук ТЕПг 305 310 315 320 сіп Ппув Бек Гец Бек Гец Бек Рго 325
Зо «2105 278 «2115» 328 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 КМсСН «4005 278
А1їа бек ТПг Ппув б1у Рго Бек Уаії Рпе Рго Гей Аза Рго Бек Бек Гув 1 5 10 15 зек ТПпПг Бек сіу сіу ТПг Аїа Аїа Гец сіу Сув Гец Уаї Ппув Авр Тукг 20 25 30
Рпе Рго бій Рго Маії ТПг Уаї Бек Тгр АвБп Бек б1у Аї1а Іей ТПпПг 5ег 35 40 45 сі1у уаї Нів ТПпг Рпе Рго Аїа Уа1! Ггец сСіп Бек Бек б1у Іецп Туг бБег 50 55 бо тей Бек Бек Уа1 Уа1 ТПг Уа1ї Рго Бек Бек Бек Гец с1у ТПг сбіп ТПг 65 70 75 80 бо тТук чІ1е Сув Авп Уаі1! Авп оНів Ппув Рго Бек АвБп ТПг Ппув Уаі1ї! Авр Гувг 85 90 935
Агуд Маї1ї сіц Рго туз Бек Сув Авр пув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув 100 105 110
Рго Аїа Рго бій тей Іїей Аза б1у Рго Бек Уа1і Рпе Іей Рпе Рго РгОо 115 120 125
Кпув Рго Пув Авр Уаії Ггец Мес І1е Бек Агуд ТПг Рго біц Уаї ТПг Сув 130 135 140 мМа1т1 уаї Маї Авр Уаї Бек Нів біц сій Рко біц Маї Ппув Рпе АвБп Тгр 145 150 155 160
Тук Маі1 Авр сіу Уаї біц Уаї Нів АвБп Аїа гпув ТПг пув Рго Агд сій 165 170 175 сі біп Туг АвБп Аїа ТПг Туг Агуд Уаї Уаї Бек Уаї Ггец Рго Уаї Гец 180 185 190
Нів біп Авр Тегр гец АвБп об1і1у Кпув сій Тук пув Сув пув Уаї Бек Авп 195 200 205
Зо
Авр Аїа гей Рго Аза Рго І1е бій бій ТПпг І1е Бек їгув Аї1а їув Щ1Уу 210 215 220 б1п Рго Агд бій Рго біп Уа1 Тук ТПг Пец Рго Рго Бек Агд Сув б1и 225 230 235 240
Мес тПпг пув Авп обіп Уаії бек гей бек Сув Аїа Уаії Ппув сіу Рпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаї бій Тер бій Бек АвБп б1у біп Рго бій Авп 260 265 270
АвпотТук пув ТПг Тс Рго Рго УМаі Іей Авр Бек АвБр біу Бек Рпе РПе 275 280 285 теп Уаї1ї Бек Ппув Гец ТПг Уа1і Авр Ппув Бек Агуд Тер біп сбіп с1Уу Авп 290 295 300 мМма1 Рпе Бек Сув Бек Уаї Мес Нів сій Аїа тей Нів Аїа Нів ТПг тТПг 305 310 315 320
Ага пув бій Гей бБег Гей Бек Рго

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Антитіло до СТІ А-4, яке містить: (1) (а) НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 112; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 102; (4) НУМВ-І1, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІО МО: 128; (є) НУВ-12, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 117; та () НМК- ІЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮО МО: 133; (2) (а) НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 111; (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 152; (4) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність під зЗЕО ІО МО: 128; (є) НУВ-12, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 117; та () НМК- ІЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮО МО: 133; (3) (а) НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 112; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ІЮ МО: 102; (4) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність під 260 ІО МО: 129; (є) НУВ-1І2, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 117; та (М НМК- ІЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІЮ МО: 133; або (4) (а) НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: 107; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність під БЕО ІЮ МО: 111; (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність під зЕО ІЮО МО: 152; (4) НМК-І11, що містить амінокислотну послідовність під 260 ІО МО: 129; (є) НУВ-1І2, що містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 117; та () НМК- ІЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕО ІО МО: 133.
2. Антитіло до СТІ А-4, яке містить: (1) послідовність УН, представлену під ЗЕО ІО МО: 140, та послідовність МІ, представлену під 5ЗЕО ІЮ МО: 146; (2) послідовність УН, представлену під ЗЕО ІЮО МО: 141, та послідовність МІ, представлену під 5ЗЕО ІЮ МО: 146; (3) послідовність УН, представлену під ЗЕО ІО МО: 140, та послідовність МІ, представлену під ЗЕО ІЮ МО: 147; (4) послідовність УН, представлену під ЗЕО ІЮО МО: 141, та послідовність МІ, представлену під ЗЕО ІЮ МО: 147; (5) першу варіабельну ділянку, що містить послідовність УН, представлену під 5ЕО ІЮО МО: 140, та послідовність МІ, представлену під ЗЕО ІЮ МО: 146, та другу варіабельну ділянку, що містить послідовність УН, представлену під ЗЕО ІЮО МО: 141, та послідовність МІ, представлену під 5Е0 ІО МО: 146; або (6) першу варіабельну ділянку, що містить послідовність МН, представлену під ЗЕО ІЮ МО: 140, та послідовність МІ, представлену під ЗЕО ІЮ МО: 147, та другу варіабельну ділянку, що містить послідовність УН, представлену під ЗЕО 10 МО: 141, та послідовність МІ, представлену під БЕО ІО МО: 147.
3. Фармацевтичний склад, що містить антитіло за п. 1 або 2 та фармацевтично прийнятний носій.
4. Фармацевтичний склад за п. 3, де фармацевтичний склад призначений для використання у лікуванні пухлини.
5. Фармацевтичний склад за п. 4, де імунітет в пухлинній тканині активується за допомогою дози, нижчої, ніж така в непухлинній тканині.
сокде АДФ «овоне Аще дек, ат - т: сх. йо плс ї Ко я : ДИ хо0обн : с СХ ож поз нн кн нічні око чпнннннан чне пнеться ха й І : Ку я Я кох : Х є ду ЛЕ : К Ку ся ММ де я Ж що З ід хе Км жан 5 ре: а діа щі і 15 1 НО МКК ОА: са ся є. Канни. АТ, АД, АМЕВімКМ
Фіг. 1 ФО Мо- ї - нн ї - т - шко З і ок се Ек І: ; : чт ах т ше» З ї а да ш її Пр па я мк а зник Баз янтитіля р ---о Її Оз феожко фе зх фо зе фе оз» Ж с Я ША ще ке Ше ШЕУ Концентрашія АМФ (мкм) (ріг. 2
ТО - - ж - АМФ Ка ЩО й рай (5 2 У з опр Ка проку г 7 ай - зво ВАТА ЕН) а «Кк н- шх В ою і як як - Не м т м а. рек з Ву , -о І яка - й - зак й ля « НО нок зак ! бокові дн тоне нір БАК пої ві 1 із те я сть ськ летів й катего кдт й (2 чу : птапцЕнНтрнція анЕитілия її МБ МЛ А
Фіг. З зе "чно Шен І о ско і ск АК я ; "ЩЕ ен Ск З я ї й. Зк зе ей н Я ко ай ; м Я з. Я і Й ЗБ Б: З її й мом :- Ше -х-еа Ї ох з «У не. І мой Ж Х ЗК, з. НН с Я за а ЗБЕ в Є й я ОВК КК х В Ії с ЖЕ ЗА й ч т КК М ах Бо и Соше Божеси « О И е Б ж Ей я А 0 АК г міс ШИШЙ ЗОЗ ОС ях я і Я ЕЕ ХО ОО Уа ; ТЕ КУ х 7 "р Є жан У КЕ жен: ова Мо МОМ і Ка: Пор ОХ десь Й Я Км ех й ху «ех І й З ях ще З ж 5. ж В с.-г а Як Я нн і о обо дееж Щі Я Ж ї5 ї х С АК ках х шк ЕН А х Е З й |. ЖМегкний ланнк Бажкни ланнюг
Фіг. 4 є КО, їх СТЕК вед х ші Зеацое Я Й ке Уукох Оу М. З ! . . Я ор аю ; і Я ще ше к зе Кобчеу жа Бо се зх х шо аж оби ЯК ОО оямвкяь ВО споеютя КО ВЕ бок В пу зе и. я шо са) М о шик ! їй «же Продеких в ь ЗО ме ей пе МІ СХ АК со х Я ЕК кокон. СХ М я що х ща ч каско ВОК й ТК їх МАХ ІК У. че ххх о. ХУ о що я і щі Парех і - ше я КО і-й | 5 ЩІ як. зх - у | | . І МИ Важкий ландюг - бак Я і шк - Ж - ВУ . СЕ КЕ к. ще » р: ше ше ше ша ная Б Ж ще ,. БЕ У , 5 ре У і З С пе Ух: що ря шк па Зх о. Ем ще НЯ ВО х «хх ж се. й в ВУХ ще те оду б а Ж вет Й - ЗИ вищо ; оч ОКУ й іч 5 йе еУКе Зої я ІЕЕ ще НЕ шо Же 8 ще Я щі дк, р бе ото Ж ї бих й на ще - : кими ши о, З к ще з КК М Ме о ЩО ОВ оз БЯ "Де Ї й ж З М й дж НИХ шо І тв. Ь - в зр Я рана шьс й й. та п КК Х Дуо МИ 5 ч й з Є Ше о . і Бажкни ланцеж Летпкні ланцит
Фіг. 5 о Безакліннний домен СТБ АЯ 01 ин рт фаза вавлваатз аву ававатва: ВаАвВиУАСВАХУ АК НОЇ АКВА ВИ. Я и, : ши ом м М: о себя: 345 5; 55455 8 ІК АТ ЕХУВУХ У На АБВЕВКУТЕМ ОА АТМ пон : : Е І т ї : т : : : : ї Я ї ї 7 ши шо шо 3 т : : : : : : : у : : ит : : ї ї : ї : То ї Важ В я: я ву во г и аа: в: у: В аз иа ж у В а п в п Б Із вв в'ю с в тів Вів м У іа вА МОЮ ровом ооо я М пе во а ШИ КЕ : ОН с та кє о: а в» Б: ко: ява иа до о Но ооо ооо оо оо ооо но ооо шу : і : їх ІК СУ НЕ у вав п ї : б ВВ а фІжЖ мМ Ів ДЕ мние ше ; | нн сш пн пнннвнтннннінннізвннннпан ння та ж а я я я кв Я: Ин НЕ Р виш ово о кк в'вк ше ов ОК, «Невпорядковані ЩО й Ба 5:55
Фіг. о Є МО - Є о я я че о К Ме 3 он ян Кк ме Ж Е в і шен св пе НИ щ-- с око НН БЛННнь Но ие шх ї с «ей Х ші й й з і в ХХ х Й Ж "ШЕ Її оф Ж Хокк ЧИ з Р і - СК х Зак с Ще чи й. х КУ ОКХ У Зб. КК, ох олова МН о З и а
Х. У х я р: с ОКХ КК : нак Б Й х МКМ І о, х ня же ріс Ж що. в
Ж. їх Х й Я ВК ак Как 5. Ж в. Кр» . «а і. оч Б в АЬ РУ «В з БМ ожекх ї Б Б Я "й Є ча. Я 5 ЕТ ОО М хх Воші а ; пря в Ж ей в Ж Я Легкий лани Важкий панцют
Фіг. 7 ек ен ВАЛ й зе ею ПВОДОКОЗ ЗЕ яеожкх ВЕДМЕЖАТ пт сітківку так кі посох ПТО ПИ ДК ВИ ко Во ПКЕЕ АР 0 ефе СКК КК АК 00 ее КЕН КАМ ТЕ д т пох : Я ше т ще ЩО шпат тюитт тити вно Ши У ВОДУ оон ни ння оон чі х : ен о : ох ее до : а з? " х : - ших Кк Х : що З дж. пиляння ючнчиникя мой : я Ще що : що к : са С ЩЕ : ШИ ще. Кен : хо см т с их -о Ж ди я ЯК шани Ак их - : ЩЕ ет ї ки З но МОУ : я он ще дю ки ще ще т пі І ж х ж ХХ о ОМ. УМ чилі ниття нити тики ня т- В ла і жено в М появ дак, Бодя я Щі їв 124 1500 10000 ро МЕЖ щі 1 ТМ ІА ОО МАК ща ; Ши Кони, АТФ, АДФ, АМФ (мкМ) «Ж Канн. АБ, АД. А Ме (МКМ) де ЗА: се У ЩЕ по же Що я ша цей ій ков жк: з ше ЖЖ ОО ххюю ж ех ескдр Воддкет ке, ооо Ж У ос о НН ск да ще Зк з в и Мк а У Вей м їх аж НЕ Я т - : чо й -т тех Б ч се г св А с Я ме сет Й МЕМ АТ Я б. - ва Б о ЕОМ , ри Б О000оеен і мКМАТФ у, че щ З я се її в; т ЩЕ. ЖЕ Що яке НІ МЕМІ АТФ а їх що БА: х Щ : а УМ КУТІ г са да а щ-- МО и. а г : г І іпбб ІТТ х п 77 то стві ще сх с люті ху
Фіг. З
ЩЕ. д- : г -ежідееКонтраль Ж ся 2 й : - : г - т «Її до х х : я сккккккіфрнннн ТЕ І УНО ВК с В з; зазнодінсмь Й ЗЕ МКГ Е В ва що : ЖЕ Ії ща : и | зво ЗО МЕЯКТ ЗК дяк пи ие тую отже з ой Клін аиН шт М х що 15 КУ аа фіг. 10 б . ; х Е і Ж : у щ- : з Є : : щ : а зеннййннне Ї МІУКЕ Ки ЖЖ фони» па ек. ші зеесоффнне ПО з Кг М : и я : : РИ сну зеннфрення ТЕК) МНЕТКГ
ОО. ДТ сля : , з зкенннвефнння З МКК з Ані після трансплантації
ФУ. 11 їх тю жд ДТ я тити тя яти З : : пе 1 т їх З ї ж : : : Е З : ш З Ї Ш 1: : «ЕХ : : т : Її м 2 : КК : ї А - Ї щоб о : | неї т З шк ; хе й Я З ї КЕ ї г з : 1 Її 7 м її т У т -к 1 їж ; ї ї г ї Її ях ї зи: : : с шим Її Е а ві і шодо 1 юо о ще зо: ко Кл щи : ї й ї «Е Буфер : : їх ВУ У Е ї г ЕІ пкт порад вутид : середо луватт ться З Е ОНА вич о-шаЗо імп! і БУІЗОб- ша ГМК ; м жено ВЕ; І : г їоожхки і : ї 7 Ге з ї : оо ШУ Ху рення нні нн нет наічнкя нні няння яти тн нта т нія ніч ч няття ян нет че чия нн янаія нія тна т ен ят ня нія няння ка : ! зх х і пи І хе ш і ; - жі Е ; ш ї К ї й ї з г х
3.
4. ї г . Е : м ї з Е ї - : ! Е і І | ; Знех ї з К КО т : " Я К з : Ж : : Е з : ї ! Е: ! : ц ї ! І: з : щ : ! Е ! | і т Ж її ї ї їх - ! ; ї : н їх д п їв пер! оо І ії що ва І вона оо. Бе ОБуфері ; і "їх ПИ ЕК СК небу кров : ЛНВ ера іхт ! д : на і п-ва імговт! : УЖ паз Гмпткгі ! ча етан х 7 Ї і основі: і ! Кореї ї х ОН
Фіг. 13
ЗВ В Бубер на основі Ні: а 1509 А і мгг КЕ к Од ще ія х дерти ; -- Во. СА ОМ мкг ее , - ї й х 13 15 є о Зо Яніпіля трансплантації
Фіг. 14 ЮК | шк «во фоБевер ка основі Пів в си Пі мгжг Кк й я ТВОЮ . 2, ж Ж є ди вої моежКг , 5 1409 ох й вет ; Зб мг я; я 1900 й оче и Щоостяк 5 За мткг ; Моди зн, же ВОЗ " й не й Йоснжевеюь - ВО -- о У 10 15 26 25 Зо Дніпкля тринсплантанн
Фіг. 15 ле В о з Же : - :
хе. і : к і : і у і : сш : Я м . ! щк | | З - ШЕ: Га она ВМ5 РаЗ5 еплюг! ! ЗАТВ веах Гмпекгі ЕОСНОВі | ! т: !
Фіг. 15 - на | Е і І З Е шк шк - ! | жк ще ж З Ко ШЕ: шо ях К : ! ЩЕ ! ще ш ! : ! ! | | ; а | : ЕЕ ! Я й є ! | ! ! щ я Буфер, 84 і 13 о і во що - основі. ВМо-мева |мгкгі | ЗК 1О навала імаЕкгі .
Фіг. 17 зм 0, им поли и . пи ВО АХ п
Фе. о в Ж я «АВМ : «5 й - ї чок ще Х те я Е й мин ню ВОРДЕ Ж І ЕЕ ДК МХ КК Я док бвотх ска В зннфннн З МКГ щ- й Тіт щі - : - щі І псля трансп лянЕмнНІВ
Фіг. 185 ки . . о
ЕЕ. й «УВА : г - Я тА 7 : Ж. оз : КУ Х ж : Зк зх ай ює КОНТ ш : З . ОВЕН - я. ; - о ; ОМ ї я енефеннсся З З МКГ п» : з г Ч 5 Зв Ка МЕ : З й ой . І шк : а НН и и ВЖЕ ЖИ ке : 7-Й о З ОАЕ ТИ КИ їй З З БУ Ттеті трест - сах МІНІ ПЬСЛЯ тринесплантаНи
Фіг. 15 хх : їх хо гр м ї "же -ое : уж певне: " х ши «Ж Ж зеннефенняя З мтоКК зу ! "ще - воду Ь. ЩІ снення З МКК - ПК рт ІД пені р діння ФООЩЖК 1 і . п шк Те в х є хі дні пкля трансплантації
Фіг. 20 сте ж п ї Ео Ж ї в - ЩЕ їх Е в 1
4. 3 ОК т- І - З Кз т х ї х . ш пзі В М к о. й і В ОО ТІ за а 5 Ноя о ОК КЗ і ! Е Хе 5 оКІ НО ек г, А ще тк лот і пекар кт І (а Мч ЗАМ Цар аха Зі рах АКТІ ж пгаза ! Ви г. гднні - г с ; К ле їмгяхі Їмп'жгі Гатукті ! регі - 7 !
Фіг. 21
НЕ З г жк ; ШО тк «ї . Е ШЕ з я зн Ж Я | ше е ж ш в й ! шо ш хо й г ШЕ І ж Е а 56 о ж 50 юю 0юЮ в -х ЖІН. отак пе сотхтя хх пе счлуєкч г с-г : ках ОО ДЛ Ен аЗх жі пах і іБіЗаираЗх джек іїмп/кгі імпт'вгі іїмт/егі ! рик Е
Фіг. 22 їх ї з ее САЗОАТЦВ я - В и Га СЕ де х х ї шо х міжн» ож они АКТІВ Ка іст ях хе м т мох -- й Маки а Щ і Коннентрація антитіла (мМкриМлІ
Фіг. 23 й
- . Ж хх . тов о: я хо 7 с я - шо бл я 01 і Конпнентрація знінтіла (мкг
Фіг. 24 3 ШО гу - ма «ж 7 : ух в - "ек й « м СА не внн АТ Й МЕМ о ж загоіррнь КЕ ОО НОЇ Е Е я к я - т ща . с. с. . ТИ а пі і 18
Фіг. 25
За в А. Е і реч , ча 5 К ' й за я ї ' щ я - айв АТ ОМЕМ во по. Мт. . шо . о и заоірня АР: НО МК В и в форте ре В З пк Концентрація знІнтіла мк млі
Фіг. 26 - за х і Коля ш и ; ж зв " а 30 ; Ж Ж ж й Ми і Р че АТФ МЕМ ж щ ж - знак г Що зо як й КИ За 1 і їй Концентрація знІнтіла МЕГОМЛІ
Фіг. 27 ке ! В | ; рн о 01 01 1 ів цк
Фіг. 28 б Е В Ж о оо- Бо: Е : Фожо ж : мнитівреннь ДО МК ЖК Е : тн АТФ Й мкм д : . й зак с- х ни - хи З пі 1 і 10 Концентрапі: антнтила ГМКГУМЛО
Фіг. 29 щ і м шк : ж : знноовреннння А НИ МЕМІ Е ! - АГРО МКМ щи НН щі 1 ів КЕ
Фіг. 30 Е : з фе АТР МЕМ
З а. зн "Й БІ п 1 і 13 що Концентрація зніІНтТілО МЕ МЛ)
Фіг. 531
ЗИ 1388-АКТОАЄСТІ я ; ох КК КК КК КК КК ї 140 . х т ж й тя - «Й -- щ : доп - Шк ща - АТФ О МКМ зно а. х х ча сосни ЕР ЗО МЕМ ЕМ я ХЕ й 93 і З Ів Концентрація знтнтіла смкг/ мл
Фіг. 32 БЗУУ1385-АКТаАСТІ я 140 ! ах я а. бони ; щі теж З Я чь ве оен- Й - АВ КМ - т тонн за ЕЕ ал дн во Що й п. 1 ї в її
Фіг. 53
UAA202202688A 2019-12-27 2019-12-27 Антитіло до ctla-4 та його застосування UA128549C2 (uk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2019/051447 WO2021131021A1 (ja) 2019-12-27 2019-12-27 抗ｃｔｌａ－４抗体およびその使用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA128549C2 true UA128549C2 (uk) 2024-08-07

Family

ID=76573011

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA202202688A UA128549C2 (uk) 2019-12-27 2019-12-27 Антитіло до ctla-4 та його застосування

Country Status (17)

Country Link
US (2) US20230058982A1 (uk)
EP (1) EP4082570B1 (uk)
JP (3) JP7373588B2 (uk)
KR (2) KR102645629B1 (uk)
CN (2) CN120757649A (uk)
AU (1) AU2019479791B2 (uk)
CA (1) CA3162444C (uk)
CO (1) CO2022010422A2 (uk)
CR (1) CR20220357A (uk)
FI (1) FI4082570T3 (uk)
IL (1) IL294226B2 (uk)
MX (1) MX2022007840A (uk)
MY (1) MY202559A (uk)
PE (1) PE20221585A1 (uk)
PH (1) PH12022551580A1 (uk)
UA (1) UA128549C2 (uk)
WO (1) WO2021131021A1 (uk)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101680906B1 (ko) 2007-09-26 2016-11-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 정상영역 개변체
TWI687439B (zh) 2011-06-30 2020-03-11 中外製藥股份有限公司 異源二聚化多胜肽
SG11201404751UA (en) 2012-02-09 2014-09-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified fc region of antibody
JP6628966B2 (ja) 2012-06-14 2020-01-15 中外製薬株式会社 改変されたＦｃ領域を含む抗原結合分子
DK3078744T3 (da) 2013-12-04 2020-09-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-bindende molekyler, antigen-bindingsaktiviteten af hvilke varierer i henhold til koncentrationen af forbindelser, og biblioteker af molekylerne
WO2022044248A1 (ja) * 2020-08-28 2022-03-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量体Ｆｃポリペプチド
TWI879694B (zh) * 2021-06-25 2025-04-01 日商中外製藥股份有限公司 抗ctla-4抗體的用途
US12448451B2 (en) 2021-06-25 2025-10-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-CTLA-4 antibody and use thereof
AR126220A1 (es) * 2021-06-25 2023-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-ctla-4
KR20250122541A (ko) 2022-10-25 2025-08-13 사이즈믹 테라퓨틱, 인코포레이티드. 변이체 IgG FC 폴리펩티드 및 그 용도
WO2025119346A1 (en) * 2023-12-07 2025-06-12 LaNova Medicines Limited Anp-dependent antibodies

Family Cites Families (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
DK0752248T3 (da) 1992-11-13 2000-11-13 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimæriske og radioaktivt mærkede antistoffer mod humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantig
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
DE122009000068I2 (de) 1994-06-03 2011-06-16 Ascenion Gmbh Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
ATE299938T1 (de) 1997-05-02 2005-08-15 Genentech Inc Ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
CZ302706B6 (cs) 1998-12-23 2011-09-14 Pfizer Inc. Lidská monoklonální protilátka, farmaceutická kompozice tuto protilátku obsahující, bunecná linie produkující tuto protilátku, izolovaná molekula kódující težký nebo lehký retezec uvedené protilátky, hostitelská bunka obsahující tuto izolovanou molek
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PL209392B1 (pl) 1999-01-15 2011-08-31 Genentech Inc Przeciwciało, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała oraz zastosowanie przeciwciała
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
EP1212422B1 (en) 1999-08-24 2007-02-21 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
ES2248127T3 (es) 1999-10-04 2006-03-16 Medicago Inc. Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos en presencia de nigtrogeno.
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING A POLYPEPTIDE
EP1240319A1 (en) 1999-12-15 2002-09-18 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CA2953239A1 (en) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
NZ571596A (en) 2001-08-03 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
CA2463879C (en) 2001-10-25 2012-12-04 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
EP1500400A4 (en) 2002-04-09 2006-10-11 Kyowa Hakko Kogyo Kk MEDICAMENT WITH ANTIBODY COMPOSITION
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
EP1553975B8 (en) 2002-09-27 2023-04-12 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
US9296820B2 (en) 2003-11-05 2016-03-29 Roche Glycart Ag Polynucleotides encoding anti-CD20 antigen binding molecules with increased Fc receptor binding affinity and effector function
EP2478912B1 (en) 2003-11-06 2016-08-31 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates with anti-HER2 or anti-CD22 antibodies and their use in therapy
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
EP1740615B1 (en) 2004-03-31 2014-11-05 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
PT1737891E (pt) 2004-04-13 2013-04-16 Hoffmann La Roche Anticorpos anti p-selectina
EP2471813B1 (en) * 2004-07-15 2014-12-31 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AU2005304624B2 (en) 2004-11-12 2010-10-07 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
EP1699826B1 (en) 2005-01-05 2009-03-11 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Synthetic immunoglobulin domains with binding properties engineered in regions of the molecule different from the complementarity determining regions
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
EP2009101B1 (en) 2006-03-31 2017-10-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
TW200812616A (en) 2006-05-09 2008-03-16 Genentech Inc Binding polypeptides with optimized scaffolds
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
ES2593484T3 (es) 2007-03-29 2016-12-09 Genmab A/S Anticuerpos biespecíficos y métodos de producción de los mismos
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
KR101680906B1 (ko) 2007-09-26 2016-11-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 정상영역 개변체
HRP20150279T1 (hr) 2007-12-26 2015-05-08 Xencor, Inc. Fc inaäśice s promijenjenim vezanjem na fcrn
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
KR102057826B1 (ko) 2008-04-11 2019-12-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
JP5717624B2 (ja) 2009-03-19 2015-05-13 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
TWI667257B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
HRP20241208T1 (hr) 2010-04-20 2024-11-22 Genmab A/S Heterodimerni proteini koji sadrže fc fragment protutijela i postupci za njihovu proizvodnju
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
WO2012032080A1 (en) * 2010-09-07 2012-03-15 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H Stabilised human fc
ES2758994T3 (es) 2010-11-05 2020-05-07 Zymeworks Inc Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
WO2012132067A1 (ja) 2011-03-30 2012-10-04 中外製薬株式会社 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
GB201103955D0 (en) 2011-03-09 2011-04-20 Antitope Ltd Antibodies
EP2686345B1 (en) 2011-03-16 2018-04-25 Amgen Inc. Fc variants
TWI687439B (zh) 2011-06-30 2020-03-11 中外製藥股份有限公司 異源二聚化多胜肽
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
RU2014117505A (ru) 2011-09-30 2015-11-10 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула для ускорения удаления антигенов
SG11201404751UA (en) 2012-02-09 2014-09-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified fc region of antibody
WO2013180200A1 (ja) * 2012-05-30 2013-12-05 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
EP2857419B1 (en) 2012-05-30 2021-01-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for eliminating aggregated antigens
ES2876009T3 (es) * 2012-12-27 2021-11-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Polipéptido heterodimerizado
WO2014145159A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Permeon Biologics, Inc. Charge-engineered antibodies or compositions of penetration-enhanced targeting proteins and methods of use
DK3078744T3 (da) * 2013-12-04 2020-09-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-bindende molekyler, antigen-bindingsaktiviteten af hvilke varierer i henhold til koncentrationen af forbindelser, og biblioteker af molekylerne
JP6413235B2 (ja) 2013-12-06 2018-10-31 株式会社ニコン 撮像素子および撮像装置
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
MA53355A (fr) 2015-05-29 2022-03-16 Agenus Inc Anticorps anti-ctla-4 et leurs procédés d'utilisation
AU2016355569B2 (en) * 2015-11-18 2020-01-02 Merck Sharp & Dohme Llc CTLA4 binders
WO2018223182A1 (en) * 2017-06-05 2018-12-13 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research A combination of, or a bispecific binding molecule to, an immune checkpoint molecule antagonist and a rank-l (nf- kb ligand) antagonist for cancer therapy or prophylaxis and uses therefor.
WO2019148444A1 (en) * 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
KR102259473B1 (ko) * 2018-08-10 2021-06-02 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항cd137 항원 결합 분자 및 그의 사용
BR112021008060A2 (pt) * 2018-10-31 2021-11-23 Bioatla Inc Polipeptídeo, anticorpo anti-ctla4 ou fragmento de anticorpo, imunoconjugado, composição farmacêutica, dose única de composição farmacêutica, método de tratar câncer, e, kit para diagnóstico ou tratamento
AR126220A1 (es) * 2021-06-25 2023-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-ctla-4
TWI879694B (zh) * 2021-06-25 2025-04-01 日商中外製藥股份有限公司 抗ctla-4抗體的用途

Also Published As

Publication number Publication date
US20230058982A1 (en) 2023-02-23
CO2022010422A2 (es) 2022-09-09
BR112022011723A2 (pt) 2022-09-06
KR20240035914A (ko) 2024-03-18
MY202559A (en) 2024-05-08
EP4082570A1 (en) 2022-11-02
PE20221585A1 (es) 2022-10-06
WO2021131021A1 (ja) 2021-07-01
CN115942956B (zh) 2025-08-15
IL294226B2 (en) 2025-05-01
KR102645629B1 (ko) 2024-03-07
CA3162444C (en) 2024-04-30
CR20220357A (es) 2022-08-24
KR20220119433A (ko) 2022-08-29
JP7373588B2 (ja) 2023-11-02
FI4082570T3 (fi) 2026-04-30
PH12022551580A1 (en) 2023-11-20
CN120757649A (zh) 2025-10-10
EP4082570A4 (en) 2023-09-13
JP7624493B2 (ja) 2025-01-30
CN115942956A (zh) 2023-04-07
US20260092115A1 (en) 2026-04-02
IL294226A (en) 2022-08-01
JP2025061475A (ja) 2025-04-10
IL294226B1 (en) 2025-01-01
EP4082570B1 (en) 2026-02-25
JP2024010057A (ja) 2024-01-23
AU2019479791A1 (en) 2022-07-14
JPWO2021131021A1 (uk) 2021-07-01
MX2022007840A (es) 2022-07-19
AU2019479791B2 (en) 2024-05-02
CA3162444A1 (en) 2021-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA128549C2 (uk) Антитіло до ctla-4 та його застосування
ES2841299T3 (es) Anticuerpos anti-CD38
AU2022299846B2 (en) Anti–ctla-4 antibody
EP2673373B1 (en) Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use
JP7501991B2 (ja) 抗体及び関連分子並びにその使用
UA128387C2 (uk) Антитіло до lag3
UA123826C2 (uk) Антитіла до pd1 та способи їх застосування
US12415857B2 (en) Anti-CTLA-4 antibody and use thereof
EA013677B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение
TWI879694B (zh) 抗ctla-4抗體的用途
UA123398C2 (uk) Виділене антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує cd154, та фармацевтична композиція, яка його містить
DK2905335T3 (en) Anti-human dlk-1 antibody with anti-tumor activity in vivo
AU2017321973A1 (en) Composition and methods of treating B cell disorders
BR112023022992B1 (pt) Anticorpo anti-ctla-4 e formulação farmacêutica compreendendo o mesmo
TW202216764A (zh) 抗ctla-4抗體及其之用途
BR112022011723B1 (pt) Anticorpo anti-ctla-4, e formulação farmacêutica
EA045931B1 (ru) Анти-ctla-4 антитело и его применение
HK40007158A (en) Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use
HK1191978B (en) Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use
HK1191978A (en) Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use