UA65623C2 - Vla-4: omepupa-v inhibitors - Google Patents

Description

Даний винахід стосується нових сполук, що корисні для інгібіювання, зміни або запобігання клітинної адгезії і патологій, опосередковуваних клітинною адгезією. Даний винахід також стосується фармацевтичних готових форм препаратів, що включають ці сполуки, і до засобів їх застосування для інгібіювання і запобігання клітинної адгезії і патологій, опосередковуваних клітинною адгезією. Сполуки і фармацевтичні композиції даного винаходу можуть використовуватись в якості терапевтичних або профілактичних агентів. Вони особливо добре підходять для лікування багатьох запальних і автоїмунних захворювань.

Клітинна адгезія являє собою процес, у ході якого клітини асоціюються одна з одною, мігрують у напрямку специфічної мішені або локалізуються в межах позаклітинної матриці. Сама по собі клітинна адгезія складає один із фундаментальних механізмів, що лежать в основі великого числа біологічних явищ. Наприклад, клітинна адгезія відповідає за адгезію кровотворних клітин із ендотеліальними клітинами і наступною міграцією цих кровотворних клітин із кровоносних судин і до ділянки ушкодження. Як така клітинна адгезія відіграє роль у великій кількості патологій таких як, наприклад, запальні й імунні реакції у ссавців.

Дослідження молекулярної основи клітинної адгезії виявили, що різноманітні макромолекули на поверхні клітини - у цілому відомі як клітинно-адгезійні молекули або рецептори - опосередковують міжклітинні або клітинно-матричні взаємодії. Наприклад, білки надродини, що називається, «інтегринами», є ключовими медіаторами адгезійних взаємодій між кровотворними клітинами і їх навколишнім середовищем (М.Е. Нетіег, «МА Ргоївіпз іп Ше Іпієдп Ратіїу: Бігисішгев, Еипсійоп5 апа ТНеїг Воїє оп І еикосуїев", Апп. Нему. Іттипої)., 8, р. 365 (1990)). Інтегрини являють собою нековалентні гетеродимерні комплекси, що складаються з двох субодиниць, називаних а і 0. Існує, щонайменше, 17 різноманітних с субодиниць (с1-510, о-ІЇ, о-М, о-О, о-Х, о-І1ІВ, о-М і 0-Е) і, щонайменше, 9 різноманітних Д субодиниць (01-89), що ідентифіковані на сьогоднішній день.

На основі типу компонентів субодиниць с: і Д молекула кожного інтегрину може бути віднесена до підродини.

Інтегрин с4р1, також відомий як найпізніший антиген-4 (мегу Іа(е апіїдеп-4 - МІ А-4) або СЮ494/С029, являє собою поверхневий рецептор клітини лейкоцита, що бере участь у великій кількості як міжклітинних, так і клітинноматричних адгезійних взаємодій (М.Е. Нетіег, Апп. Нем. Іттипої!., 8, р.365 (1990)). Він служить у якості рецептора для поверхневого білка індукованої є цитокіном ендотеліальної клітини, адгезійної молекули- 1 васкулярних клітин (мазсцаг сеїЇ аапевіоп тоїІесшіе-1 - "УСАМ-!"), а також для позаклітинної матричної білки фібронектину ("ЕМ") (Виедо еї аї, 9. Сеї! Віо!., 177, р. 179 (1991); Маупег еї аї., у. Сеї! Віо!., 105, р. 1873 (1987);

Ктгатег еї аї., у. Віої. Снет., 264, р. 4684 (1989): Сепівеп еї аї.. 5сіепсе, 24, р. 1228 (1988)). Показано, що моноклональні антитіла анти-УБЬА-4 ("під 5") інгібують МІ А-4-залежні адгезивні взаємодії як іп міїго, так і іп мімо (БГегдизоп еї аї., Ргос. Маї)!. Асад. 5ві., 88, р. 8072 (1991); Регдигоп евї аї., 9У. Іттипої., 150, р. 1172 (1993)).

Результати досвідів іп мімо підтверджують, що інгібіювання Мі А-4-залежної клітинної адгезії може запобігати, інгібіювати або змінювати деякі запальні й автоімунні патології (В.І... Горь єї аі., "пе Рашорпузіоіодіс Воїе ої а4

Іпгедіїпв Іп Мімо", У.Сіїп. Іпмеві, 94, рр. 1722-28 (1994)).

Для того, щоб ідентифікувати мінімальну активну амінокислотну послідовність, необхідну для зв'язування із МІ А-4, Котоїуа із співавторами синтезували ряд пептидів, що перекриваються, на основі амінокислотної послідовності С5-1 області (МІ А-4-зв'язуючий домен) конкретних виглядів фібронектину ("Те Міпіта)!

Еззепіїа! бедиепсе ог а Ма)ог Сеїї Туре-5ресійс Адпевіоп Зйе (С51) УМИйпіп Ше АПГегпаїймеїу Зріїсей Туре І!

Соппесіїпд Зедтепі ботаїп ої Рібгопесіїп Із І еисіпе-Азрапіс Асіа-Маїїпе", 9. Віої. Спет, 266 (23), стор. 15075- 79, (1991)). Вони ідентифікували 8-амінокислотий пептид, Сс1и-Оє-І ен-Азр-МаІ-Рго-5Зе!-ТНг, а також два більш дрібних перекриваючихся пентапептида, (сіШ-Ое-І ен-Азр-Ма! і ІГеи-Авр-Маі-Рго-бег, що мають інгібуючу активність у відношенні ЕМ-залежної адгезії клітин. Ці результати означають, що трипептид ІГеи-Авр-Ммаї є мінімальною послідовністю для клітинно-адгезійної активності. Пізніше було показано, що ІГеи-Агр-Маї зв'язується тільки з лімфоцитами, що експресують активовану форму МІ А-4, що викликає сумніви в можливості використання такого пептиду іп мімо (Е.А. МУаупег еї аї, "Асіїмайоп-Оерепдепі НКесодпійоп бу

Нетайороівєїйс СеїЇв ої Ше ГОМ бЗедиєпсе іп Ше М ВНедіоп ої Ріргопесіїп", У. СеїІ. Віої, 116 (2), стор. 489-497 (1992)). Проте згодом було показано, що деякі більш значні пептиди, що містять послідовність ГОМ, є активними Іп мімо (Т.А. Регдизоп еї аії, "Пмо Іпіедпіп Віпаїпуд Реріїдез Аргодаїе Т-сеїІ-Медіагейа Іттипе

Везропзевз іп Мімо,", Ргос. Маїй!. Асад. Зеї. ОБА, 88,. стор. 8072-76 (1991),- і 5.М. УМані еї аї, "Зупіпейс Ріргопесіїп

Реріїдез З,ирргев5 Аппгів іп Наїз Бу Іпіеггиріїпду І еикосуїе Аапезіоп апа Весгийтепі", У). Сіїп. Іпмеві, 94, рр. 655- 62 (1994)). Також описаний циклічний пентапептид, що може інгібіювати адгезію як МІ А-4, так і МІ А-5 із ЕМ (Див, наприклад, О.М. Моміп еї аї, "А Моме! Сусіїс Репіареріїде Іппібії5 «4р1 апа с5р1 Іпіедгіп-тедіайей Сеї

Аапезіоп", 9У.Віої. Спет, 268 (27), стор. 20352-59 (1993); а також публікацію РСТ РСТ/О591/04862). Даний пентапептид заснований на трипептидній послідовності Агд-сіу-Агр із ЕМ, що відома як основний лейтмотив при розпізнаванні сайта для деяких позаклітинних матричних білків.

Приклади інших інгібіторів М А-4 приводяться, наприклад, у патентній заявці США 08/376372 і МО 98/04913, що знаходиться спільно на розгляді, що спеціально включені в якості довідкового матеріалу. В 05514 376372 описані лінійні пептидильні сполуки, що містять р-амінокислоти, що мають інгібуючу активність у відношенні клітинної адгезії. Міжнародні патентні заявки УУО 94/15958 і МО 92/00995, спеціально включені в якості довідкового матеріалу, описують циклічний пептид і пептидомиметичні сполуки з активністю, що модулює адгезію клітин. В міжнародних патентних заявках УУО 93/08823 і УМО 92/08464 (включені в якості довідкового матеріалу) описуються гуанідиніл-, сечовину- і сполуки, що містять тіосечовину, що модулюють клітинну адгезію. У патенті США Ме5260277 (також включений у якості довідкового матеріалу) описуються гуанідинільні сполуки, що модулюють клітинну адгезію.

Незважаючи на ці досягнення, все ще залишається потреба в низькомолекулярних специфічних інгібіторах МІ А-4-залежної адгезії клітин, що мають поліпшені фармакокінетичні і фармакодинамічні властивості, такі як пероральна біодоступність і значна тривалість дії. Такі сполуки могли б дати корисні агенти для лікування, зміни, запобігання і придушення різноманітних патологій, опосередковуваних клітинною адгезією і зв'язуванням МІ А-4.

Сполуки даного винаходу є інгібіторами МІ А-4 інтегрину, блокуючи таким чином зв'язування Мі А-4 із його різноманітними лігандами, такими як МСАМ-1 і області фібронектину Таким чином, дані сполуки корисні в процесах |інгібіювання клітинної адгезії в тому числі, клітинної активації, міграції, проліферації і диференціювання. Ці сполуки корисні для інгібіювання, запобігання і придушення опосередкованої МІ А-4 клітинної адгезії і патологій, пов'язаних із цією адгезією, таких як запальні й імунні реакції, включаючи, наприклад, розсіяний склероз, астму, алергічний риніт, алергічний кон'юнктивіт, запальні легеневі захворювання, ревматоїдний артрит, септичний артрит, діабет 1-го типу, трансплантацію органів, рестеноз, автотрансплантацію кісткового мозку, запальні наслідки вірусних інфекцій, міокардит, запальне захворювання стравоварильного тракту, у тому числі неспецифічний виразковий коліт і хвороба Крона, деякі типи токсичного й імунного нефриту, підвищену дермальну чутливість, псоріаз, пухлинний метастаз, множинну мієлому й атеросклероз. Сполуки даного винаходу можуть використовуватися по одному або в сполученні з іншими терапевтичними або профілактичними агентами для інгібіювання, зміни, запобігання або придушення клітинної адгезії. Даний винахід також пропонує фармацевтичні готові форми препаратів, що містять дані інгібітори МІ А-4-опосередковуваної клітинної адгезії і засоби застосування сполук і композицій даного винаходу для інгібіювання клітинної адгезії.

На Фіг.1 показана сприйнятливість дихальних шляхів овець після лікування ОомМеРИШРА-М. Овець, чутливих від природи до Авсаїгіз зиит, провокують аерозолем алергену Азсагів вит через 2 години після введення аерозолю оМеРИРА-М у зазначених дозах або еквівалентній кількості носія. В зазначені періоди часу вимірюють механіку легеневого подиху і записують у вигляді зміни питомого опору дихальних шляхів у порівнянні з попереднім дослідженню базовим значенням (ліва група графіків). Усталеність або опір дихальних шляхів вдихуваному карбахолу визначають до початку дослідження і через 24 години після провокації алергеном (права група графіків). Сприйнятливість дихальних шляхів призводять у вигляді відношення РСодоо (кількість карбахолу, необхідна для збільшення усталеності на 40095) шляхом порівняння розмірів до провокації і після провокації.

Фіг2. Овець, чутливих від природи до Авсагіз вит, провокують введенням аерозолю омеРШОРА-М у зазначених дозах або аерозолю Авсагіз 5цит. Зміни в усталеності дихальних шляхів вимірюють після аерозольної провокації і пікову питому легеневу усталеність (у см НгО/сек) після провокації порівнюють із базовими значеннями. "в р-«0,05 у порівнянні з РВ5О-контролем, односторонній дисперсійний аналіз, із наступним тестом Даннета для множинного порівняння з контрольною групою. Показує статистично значуще збільшення пікової питомої легеневої усталеності в порівнянні з РВ5 (фосфатно-сольовий буферний розчин) контрольної групи.

Фіг.3. Овець, чутливих від природи до Авсаїгіз зишт, провокують аерозолем алергену Авсагіз зиит через 24 години після четвертого щоденного введення аерозолю оОмМеРИРА-М (0,0Змг) або еквівалентної кількості носія (етанол звичайний фізіологічний розчин, 1:2, верхній графік; Тгіз:звичайний фізіологічний розчин, 1:499, нижній графік). У зазначений час вимірюють механіку легеневого подиху і виражають у вигляді зміни питомої усталеності дихальних шляхів від базового значення перед дослідженням (ліві графіки). Усталеність дихальних шляхів до вдихуваного карбахолу визначають до початку дослідження і через 24 години після провокації алергеном (праві графіки). Сприйнятливість дихальних шляхів записують у вигляді відношення

РСдаоо (кількість карбахолу, необхідного для збільшення усталеності на 40095) порівнянням значень до провокації і після провокації. фіг4. Мишей Ваїр/с, попередньо сенсибілізованих до ОМЕВ (динітрофторбензол), провокують шляхом нанесення ОМЕВ на тильну поверхню лівого вуха і носія на тильну поверхню правого вуха. Через 24 години вимірюють товщину кожного вуха за допомогою мікрометра. ОМеРОРА-М вводять у зазначених дозах через 4 години після провокації ОМЕВ. Сполуку позитивного контролю (-КОНТ) дають у максимально ефективній кишковій дозі. Значення являють собою середні значення хх стандартна помилка середнього для 8 тварин.

Верхній графік показує абсолютне набрякання вуха. Нижній графік показує відсоток інгібіювання набрякання вуха в порівнянні з контролем із використанням носія (МЕН).

Фіг.5. Аналіз конкуренції між ОМмМеРИОРА-М і відомим інгібітором при різноманітних умовах активації. дикаї- клітини (1. 1,5хЮЄ/мл) у ТВ5 плюс 2ММ Мп? 1мММ Са?" плюс 1ТМММ Ма? 1мМММ Са?» плюс 10мМ Маг», 10ММ

Маг або 10мМ Мод плюс 1Омкг/мл Т52/16, опрацьовують 5нМ ЗН-відомого інгібітору одного або 5нМ ЗН- відомого інгібітору плюс 10нМ ВІО 1591 протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Клітини потім пелетизують центрифугуванням, знову суспендують у 100мкл ТВ5 плюс Мп" і аналізують за допомогою сцинтиляційного підрахунку. Кількість імпульсів, пов'язане в цих умовах, визначає інтегрин, що не зайнятий випробуваною сполукою і, отже, вільний для зв'язування з ЗН-відомим інгібітооом.

Даний винахід пропонує сполуки, що спроможні інгібіювати МІ А-4-опосередковувану клітинну адгезію інгібіюванням зв'язування лігандів із рецептором. Кращою сполукою є (Н)-М-((4-ІЇ(2-метилфеніл- аміно)карбоніл|іаміно|Їфеніл|ацетил|-І -проліл-З-метил)-Д -аланін, що позначається тут як «оМеРИРА-У» і поданий наступною формулою І: м. сон з Х щроря о сн сну І ! ощеривАнУу

Винахід також охоплює фармацевтично прийнятні похідні, солі й ефіри ОмМеРОРА-У.

Сполуки Формули | містять один або більш асиметричних центрів і, отже, можуть бути у вигляді рацемічних сумішей, окремих енантіомерів, діастереомірних сумішей і індивідуальних діастереомерів. Даний винахід припускає охоплення всіх таких ізомерних форм сполуки Формули |.

Декларований винахід також має на увазі, що до його об'єму входять фармацевтично прийнятні солі сполуки Формули !. Поняття «фармацевтично прийнятної солі» стосується солей, одержуваним із фармацевтично прийнятних нетоксичних основ або кислот, включаючи органічні і неорганічні підстави й органічні або неорганічні кислоти. Солі, одержувані з неорганічних основ, включають солі алюмінію, амонію, кальцію, міді, заліза (ІІ), заліза (1), літію, магнію, марганцю (ІІ), марганцю (ІІ), калію, натрію, цинку і т.д.

Особливо кращими є солі амонію, кальцію, магнію, калію і натрію.

Солі, одержувані з фармацевтично прийнятних органічних нетоксичних основ, включають солі первинних, повторних і третинних амінів, заміщених амінів, у тому числі природних заміщених амінів, циклічних амінів і основних йонобмінних смол, таких як аргінін, бетаїн, кофеїн, холін, М'М'-дибензилетилендіамін, діетиламін, 2- діетиламіноетанол, 2-диметиламіноетанол, етаноламін, етилендіамін, М-етилморфолін, М-етилпіперидин, глюкамін, глюкозамін, гістидин, гідрабамін, ізопропіламін, лізин, метилглюкамін, морфолін, піперазин, піперидин, поліамінні смоли, прокаїн, пурини, теобромін, триетиламін, триметиламін, трипропіламін, трометамін і ін.

Коли сполука даного винаходу є основною, солі можуть утворюватися з фармацевтично прийнятних нетоксичних кислот, включаючи неорганічні й органічні кислоти. Такими кислотами є оцтова, бензолсульфонова, бензойна, камфорсульфонова, лимонна, етансульфонова, фумарова, глюконова, глутамініва, бромістоводнева, соляна, ізетіонова, молочна, малеїнова, яблучна, мигдальна, метансульфонова, слизова, азотна, памова, пантотенова, фосфорна, бурштинова, сірчана, винна, п- толуолсульфонова кислота й аналогічні. Особливо кращими є лимонна, бромистоводнева, соляна, малеїнова, фосфорна, сірчана і винна кислоти.

Крім того, заявлений винахід охоплює проліки, зокрема, складноефірні проліки, у яких карбоксильна група: (в)-чЧ-Ц4-((2-метилфеніламіно)карбонілІаміно|феніл|ацетиліІ -проліл-З-метил)р-аланіну етерифійована будь-яким із спиртів. Кращими спиртами є метанол, етанол, пропанол, бутанол або С 1-10 алкілові спирти з лінійними або розгалуженими ланцюжками.

Спроможність сполук Формули І антагонізувати дії МІ А-4 робить їх корисними для запобігання, лікування або реверсії симптомів, розладів або захворювань, індукує зв'язуванням МІ А-4 із їх лігандами. Так, дані антагоністи інгібують процеси клітинної адгезії у тому числі клітинної активації, міграції, проліферації і диференціювання. Таким чином, відповідно до ще одного аспекту даного винаходу, винахід надає засоби лікування, запобігання, зміни або придушення порушень або захворювань, опосередковуваних МІ А-4. Такими захворюваннями і порушеннями є, наприклад, астма, розсіяний склероз, алергічний риніт, алергічний кон'юнктивіт, запальні легеневі захворювання, ревматоїдний артрит, множинна мієлома, септичний артрит, діабет 1-го типу, відторгнення трансплантованого органа, запальне захворювання кишечника та ін.

Сполуки даного винаходу можуть синтезуватися з використанням будь-якого звичайного прийому, декілька прикладів яких приведені в описі. Переважно ці сполуки хімічно синтезуються з легкодоступних вихідних матеріалів, таких як а-амінокислоти і їх функціональні еквіваленти. Модулярні і конвергентні методи синтезу цих сполук також є кращими. При конвергентному підході, наприклад, значні відрізки кінцевого продукту доставляються разом на останній стадії синтезу, замість того, щоб добавляти невеличкі фрагменти до молекулярного ланцюжка, що росте.

Сполуки даного винаходу можуть також модифікуватися приєднанням відповідних функціональних груп для посилення селективних біологічних властивостей. Такі модифікації відомі в даній області і включають видозміни, що підвищують біологічну проникність до даної біологічної системи (наприклад, до крові, лімфатичної системи, центральної нервової системи), підвищують пероральну доступність, підвищують розчинність, щоб забезпечити можливість введення шляхом ін'єкції змінюють метаболізм і швидкість виведення. Прикладами таких модифікацій є, але не обмежуються ними, етерифікація поліетиленгликолями, одержання похідних за допомогою піволатів або жирнокислотних замінників, перетворення в карбамати, гідроксилювання ароматних кілець і гетероатомне заміщення в ароматних кільцях.

В всьому описі термін «пацієнт» стосується ссавців, у тому числі людини. А поняття «клітина» стосується будь-якої клітині, переважно клітин ссавців, включаючи клітини людини.

Після синтезу активність і МІ А-4-специфічність сполук даного винаходу може бути визначена з використанням досліджень іп мікго і іп мімо.

Наприклад, інгібуюча клітинну адгезію активність цих сполук може бути виміряна шляхом визначення концентрації інгібітору, необхідної для блокування зв'язування клітин, що експресують Мі А-4, із планшетами, покритими фібронектином або С51. При випробуванні цього типу лунки мікротитровального планшета покривають або фібронектином (що містить С5-1 послідовність) або С5-1. Якщо використовується С5-1, то він має бути кон'югований із білком носія, таким як бичачий сироватковий альбумін, для того, щоб прикріпити його до лунок. Після покриття лунок добавляють варійовані концентрації випробуваної сполуки разом із підхожим чином міченими клітинами, що експресують МІ А-4. Альтернативно може спочатку добавлятися випробувана сполука і дають їй можливість інкубуватися з покритими лунками перед додаванням клітин. Клітини лишають інкубуватися в лунках щонайменше, на 30 хвилин. Після інкубації лунки спустошують і промивають.

Інгібіювання зв'язування вимірюють шляхом кількісного визначення флуоресценції або радіоактивності, пов'язаної з планшетом, для кожної із різноманітних концентрацій випробуваної сполуки, а також для контролю, що не містить випробувана сполука.

Клітини, що експресують МІ А-4, що можуть бути використані в цьому випробуванні, включають Натоз клітини, Ушкаї клітини, клітини АЗ75 меланоми, а також лімфоцити периферичної крові (РВІ) людини. Клітини, використовувані в даному випробуванні, можуть мітиться будь-яким підхожим засобом, наприклад, флуоресцентно або можуть мати радіоактивну мітку.

Для кількісного визначення інгібуючої активності, сполуки винаходу може також використовуватися метод безпосереднього або прямого зв'язування. В даному аналізі білок злиття, МСАМ-Ідса, що містить перші два імуноглобулінових домени МСАМ (0102), приєднані вище міждоменної області молекули да ("УСАМ2О-ІДСе"),

кон'югується з маркерним, ферментом, таким як лужна фосфатаза («АР»). Синтез даного білка злиття "МСАМ-

Іа" описаний у РСТ публікації УУО 90/13300, зміст якої включено в якості довідкового матеріалу. Кон'югування даного білка злиття з маркерним ферментом досягається методами поперечної зшивки, добре відомими в даній області.

МСАМ-Ідса-ферментний кон'югат потім поміщають до лунок багатолункового фільтраційного планшета, такого як планшет, що утримується в системі МіПроге Мийізсгтеєп Аззау Зузіет (МіПроге Согр., Вейюга, МА).

Потім до лунок добавляють різноманітні концентрації випробуваної інгібуючої сполуки, наступним додаванням клітин, що експресують МІ А-4. Клітини, сполуки і МСАМ-Іда-ферментний кон'югат змішують разом і лишають інкубуватися при кімнатній температурі.

Після інкубації лунки вакуумно дренуються, залишаючи клітини і будь-які пов'язані МСАМ. Кількісний аналіз пов'язаних МСАМ визначають шляхом додавання відповідного колориметричного субстрату для ферменту, кон'югованого з МСАМ-Іда, і визначення кількості продукту реакції. Зменшена кількість продукту реакції вказує на підвищену активність, що інгібує зв'язування. Протокол деяких аналізів описаний нижче.

Для того щоб оцінити МІ А-4 специфічність інгібуючих сполук, даного винаходу, проводять аналіз на інших основних групах інтегринів, тобто раг і ДЗ, а також інших ДІ інтегринів, таких як МІ А-5, МІ А-6 і с4р7. Ці аналізи можуть бути аналогічні аналізам інгібіювання адгезії і безпосереднього зв'язування, описаним вище, із заміною відповідної інтегрин-експресуючої клітини, і відповідного ліганду. Наприклад, поліморфно-ядерні клітини (РММ) експресують р2 інтегрини на своїй поверхні і зв'язуються з ІСАМ. Інтегрини ДЗ залучені до агрегації тромбоцитів, і інгібіювання може бути виміряно за допомогою стандартного аналізу агрегації тромбоцитів.

МІА-5 специфічно зв'язується з послідовностями Ага-сіу-Азр, тоді як МІ А-6 зв'язується з ламінином. с«4р7 являє собою нещодавно відкритий гомолог МІ А-4, що також зв'язується з фібронектином і МСАМ.

Специфічність щодо «4р7 визначають за допомогою аналізу зв'язування, в якому використовують описаний вище маркерний кон'югат МСАМ-Ідс-фермент і лінію клітин, що експресують «4р7, але не МІ А-4, таку як клітини АМРІ-8866 або У.

Після ідентифікації МІ А-4-специфичних інгібіторів їх можна додатково охарактеризувати в аналізах іп мімо.

В однім із таких аналізів випробовується інгібіювання контактної гіперчутливості у тварин, в такому, як описаний Р.Г. Спізпоїт єї аї, "Мопосіопа! Апіїбодієв о Ше Іпієдгеїп о-4 Зирипії Іппірії Ше Мигппе Сопіасі

Нурегзепвйймну Незропзе", Еишг. У. Іттипої, 23, рр. 682-688 (1993), і в "Сштепі Ргоїосої іп Іттипоіоду", У.Е.

Соїїдап, еї аї., Ед5., допп УМіеу 5 Боп5, Мем Могк, 1, рр. 4.2.1-4.2.5 (1991), змісти яких включені в якості довідкового матеріалу. У даному аналізі шкіру тварини сенсибілізують шляхом впливу подразника, такого як динітрофторбензол, із наступним легким фізичним подразненням, таким як легке почухування шкіри гострою крайкою. Після періоду видужання тварин повторно сенсибілізують, наслідуючи тієї ж методиці. Через декілька днів після сенсибілізації одне вухо тварини піддають впливу хімічного подразника, тоді як інше вухо опрацьовують контрольним розчинником, що не дратує. Незабаром після опрацювання вух тварині вводять різноманітні дози інгібітору МІ А-4 шляхом підшкірної ін'єкції. іп мімо інгібіювання запалення, пов'язаного з клітинною адгезією, оцінюють виміром реакції набрякання обробленого вуха тварини щодо неопрацьованого.

Набрякання вимірюють із використанням штангенциркуля або іншого підхожого інструмента для виміру товщини вуха. Таким чином, можна ідентифікувати ті інгібітори винаходу, що найбільше добре підходять для інгібіювання запалення.

Ще один метод іп мімо, що може застосовуватися для випробування інгібіторів даного винаходу, являє собою аналіз астми в овець. Даний аналіз проводять по суті так, як описано в роботі М.М. Абганат еї аї., "а4-

Іптедгіпз Медіайсе Апіїдеп-іпадисей І аге Вгопспіа! Незропзез апа РгоІопдеа Аїігмау Нурегтезропвімепевв іп Зпеер",

У. Сіїп. Іпмеві., 93. рр. 776-887 (1994), зміст якої включено в якості довідкового матеріалу. У цьому аналізі вимірюють інгібіювання індукованої антигеном Авзсаїгіз відповідної реакції дихальних шляхів пізньої фази і гіперчутливості дихальних шляхів в алергічних овець. Сполуки даного винаходу можуть бути також випробувані в аналізі агрегації тромбоцитів.

Інгібітори МІ А-4 винаходу показали надзвичайно сприятливу активність і селективність. В цілому ці сполуки селективні для МІ А-4 (більш, ніж у 1000 разів у порівнянні з «487 і «5р1), дають негативний результат у звичайних дослідженнях Рапі аб і звичайному поп-сІ Р тесті Еймса, бездоганні в стандартних додаткових фармакологічних тестах і ефективні на моделі овець після введення один разом на день відповідно до продиктованого рівня застосування на людях 1мМг/день або менше.

Заявлені сполуки мають несподівано чудову активність у порівнянні зі структурно родинними МІ А-4 інгібіторами. Наприклад, у Азсагіз-чутливих овець, оброблюваних один раз на день протягом чотирьох днів за допомогою розпиленого лікарського засобу в дозі 0,1мМг/кг і потім оброблених антигеном через 24 години після введення останньої дози ліків, раніше випробувані сполуки по суті пом'якшували ранню реакцію і блокували бронхостеноз пізньої фази і розвиток неспецифічної гіпервразливості З урахуванням біоеквівалентності для людини буде потрібно сумарна доза для пацієнта вагою 7Окг у 7мг. Крім того, ліки вводилося вівцям через ендотрахеальну трубку при дозах відкладення, що оцінюються в 2 рази більше, ніж звичайно що досягаються в людини за допомогою пероральних інгаляторних пристроїв. Крім того, мабуть, що буде потрібно додавання наповнювачів (ексципієнтів) до кінцевої твердої рецептури, щоб оптимізувати процес заповнення пристрою і доставку ліків. Дані чинники припускають можливу дозу, необхідну людині, 14мг або більш, що перевищує технічну межа 1-5мг, що може доставлятися однократним приведенням у дію інгалятора сухого порошку (ОРІ). Хоча необхідна доза могла б доставлятися за допомогою багатократного приведення в дію ОРІ, це було би хибою на ринку астматичних препаратів, де звичайні дози інгальованого стероїду складають 0,2-1,0мг. оМеРИРА-М послаблює ранню реакцію, блокує бронхостеноз пізньої фази і нормалізує гіпервразливість при мінімальній дозі 0,00Змг/кг при введенні у вигляді однократної розпиленої дози за дві години до провокації антигеном. Більш того, добова доза в 0,001мМг/кг протягом 4 днів при провокації антигеном через 24 години після останньої дози дає максимальну реакцію. Таким чином, ОМмМеРИОРА-М у 30-100 разів більш активний, ніж попередні сполуки, і має рівень доз у межах найкращих продаваних інгальованих стероїдів. ОМмМеРОРА-М, також як і передостання проміжна сполука синтезу, має високий ступінь кристалічності (См. Фіг.1, Таблиця 1).

Крім того, омеРШОРА-М має поліпшений метаболічний профіль у порівнянні з відомими сполуками інгібіторами МІ А-4. Наприклад, після аерозольного введення заявлені сполуки швидко перетворюються в менше активний метаболіт, що є переважним продуктом, що виділяється бронхоальвеолярною промивною рідиною (ВАГ Е), і також переважним продуктом, що виявляється у великому колі кровообігу, де він виявляє більш тривалий період напіввиведення з плазми, ніж вихідна сполука. Хоча швидке метаболічне перетворення в менш активні сполуки є корисною стратегією для досягнення зниженого системного впливу, сполуки, що метаболізуються в побічні продукти майже або зовсім мають не активності, створюють менше складностей при розробці і є кращими з точки зору можливих перспектив.

Потенційні протеолітичні продукти оМеРИОРА-М є неактивними в аналізах Мі А-4-зв'язування, тому протеоліз буде призводити до неактивних продуктів, що не заслуговують уваги. Проте, дослідження метаболізму іп міо, а також іп мімо фармакокінетичені дослідження на пацюках, собаках і вівцях показали, що оМеРИРА-М є протеолітично стабільним.

Таблиця 1

Властивості ОМеРИРА-У у порівнянні з раніше відомими інгібіторами

Мінімальна ефективна доза на моделі овець: однократна доза 0,1 мММг/кг 0,00Змг/кг повторювана доза 0,03-0,1мММг/кг 0,001мММг/кг

Допоміжна фармакологія (побічні ефекти) о Бездоанні/// | б оо Метаболічнийпрофіль./-///////гсИсСсгсргр/ь/0 | АктивніметаболпиїД/ | ::/Ю тижнів

Сполуки даного винаходу можуть бути приготовлені у вигляді готових форм фармацевтичних композиції, що можуть вводитися перорально, парентерально, за допомогою спреїв для інгаляції, локально, ректально, назально, трансбукально, вагінально або через імплантований резервуар. Поняття «парентерально», що використовується в даному описі, включає підшкірне, внутрішньовенне, внутрішньом'язове, інтрартикулярне або внутрішньосуглобне, внутрішньогрудинне, внутрішньооболонкове, внутрішньо печінкове введення, введення всередину ушкодження і внутрішньочерепне введення за допомогою ін'єкцій або вливання.

Фармацевтичні композиції даного винаходу включають будь-яку із сполук даного винаходу або його фармацевтично прийнятне похідне разом із фармацевтично прийнятним носієм. Поняття «носій», використовуване в даному описі включають фармацевтично прийнятні ад'юванти і розчинники.

Фармацевтично прийнятні носії, що можуть використовуватися у фармацевтичних композиціях винаходу, включають, але не обмежуються ними, йонообмінники, окис алюмінію, стеарат алюмінію, лецетин, сироваткові білки, такі як сироватковий альбумін людини, буферні речовини, такі як фосфати, гліцин, сорбінова кислота, сорбат калію, суміші неповних гліцеридів насичених рослинних жирних кислот, воду, солі або електроліти, такі як протамінсульфат, повторний кислий фосфат натрію, кислий фосфат калію, хлорид натрію, солі цинку, колоїдний двоокис кремнію, трисилікат магнію, полівініллиролідон, речовини на основі целюлози, поліетиленгликоль, натрійкарбоксиметилцелюлозу, поліакрилати, воски, блоксополімери поліетилену і поліоксипропілену, поліетиленгликоль і ланолін.

Відповідно до даного винаходу фармацевтичні композиції можуть бути у формі стерильних ін'єкційних препаратів, наприклад, стерильних ін'єкційних водяних або масляних суспензій. Суспензії можуть бути приготовлені відповідно до відомих в даній області прийомів з використанням підхожих диспергуючих або змочуючих агентів і суспендуючих агентів. Стерильні ін'єкційні препарати можуть також подавати стерильні розчини або суспензії для ін'єкцій у нетоксичному парентерально прийнятному розріджувачі або розчиннику, наприклад, як розчин у 1,3-бутандіолі. Серед прийнятних носіїв і розчинників, що можуть застосовуватися, знаходяться вода, розчин Рінгера і ізотонічний розчин хлористого натрію. Крім того, у якості розчинника або суспензійного середовища зручно застосовуються стерильні нелетючі олії. Для даної цілі може застосовуватися будь-яка легка нелетюча олія, у тому числі синтетичні моно- або дигліцериди. Жирні кислоти, такі як олеїнова кислота і її гліцеридні похідні, корисні при одержанні препаратів для ін'єкцій, як і природні фармацевтично прийнятні олії, такі як оливкова олія або касторова олія, особливо у вигляді їх поліоксиетилійованих похідних. Ці масляні розчини або суспензії також можуть містити довголанцюговий спиртовий розріджувач або дисперсант.

Фармацевтичні композиції даного винаходу можуть вводитися в будь-який перорально прийнятній лікарській дозованій формі, що включає, але, не обмежуючись ними, капсули, таблетки, водяні суспензії або розчини. У випадку таблеток для перорального застосування, носіями, що звичайно використовуються, є лактоза і кукурудзяний крохмаль. Звичайно добавляються змащуючі агенти, такі як стеарат магнію. Для перорального введення у формі капсул корисними розріджувачами є лактоза і висушений кукурудзяний крохмаль. Якщо для перорального застосування необхідні водяні суспензії, активний інгредієнт мішається з емульгуючими і суспендуючими агентами. При бажанні, можуть також добавлятися деякі що підсолоджують, смакові і фарбуючі агенти.

Альтернативно, фармацевтичні композиції даного винаходу можуть вводитися у формі свіч для ректального застосування. Вони можуть готуватись змішуванням агента з підхожим ексципієнтом, що не дратує, що є твердим при кімнатній температурі, але рідким при ректальній температурі, і тому буде плавитися в прямій кишці зі звільненням ліків. До таких матеріалів відносяться олія какао, бджолиний віск і поліетиленгликолі.

Фармацевтичні композиції винаходу також можуть вводитись місцево або топічно, особливо коли ціллю лікування є області або органи, легко доступні для місцевого введення, включаючи, наприклад, захворювання очей, шкіри або нижньої області кишкового тракту. Підхожі препарати для місцевого застосування легко готуються для кожної з цих ділянок або органів.

Місцеве застосування в нижній області кишкового тракту може здійснюватися з використанням лікарських форм у вигляді свіч (див. вище) або підхожих препаратів для клізм. Можуть також використовуватися місцеві трансдермальні пластири.

Для місцевого застосування фармацевтичні композиції можуть бути приготовлені у вигляді підхожої мазі, що містить активний компонент, суспендований або розчинений в однім або більше носіях. Носії для місцевого введення сполук даного винаходу включають, але не обмежуються ними, мінеральна олія, вазелінова олія, білий вазелін, пропіленгликоль, поліоксиетилен, поліоксипропіленові сполуки, що емульгують віск і воду.

Альтернативно, фармацевтичні композиції можуть бути сформовані у вигляді підхожого лосьйону або крему, що містить активні компоненти, суспендовані або розчинені в однім або білоше фармацевтично прийнятних носіях. Підхожими носіями є, але не обмежуються ними, мінеральна олія, моностеарат сорбітану, полісорбат 60, цетилові ефіри воску, цетариловий спирт, 2-октилдодеканол, бензиловий спирт і вода.

Для застосування на очах фармацевтичні композиції можуть бути приготовлені у вигляді тонкоподрібнених суспензій в ізотонічному стерильному фізіологічному розчині з установленим значенням рн, або переважно у вигляді розчинів у ізотонічному фізіологічному розчині з установленим значенням рН або з додаванням або без додавання консерванту, такого як бензилалконійхлорид. Альтернативно, очні фармацевтичні композиції можуть бути отримані у вигляді мазі, такої як вазелін.

Фармацевтичні композиції даного винаходу можуть також вводитися у вигляді назального аерозолю або інгаляції з використанням розпорошувача, інгалятора сухого порошку або дозуючого інгалятора. Такі композиції готують відповідно до добре відомого в області фармацевтичних препаратів прийомами, і можуть бути отримані у вигляді розчинів у фізіологічному розчині з використанням бензилового спирту або інших підхожих консервантів, промоторів абсорбції для посилення біодоступності, фторвуглеродів і/або інших узвичаєних що солюбілізуючих і диспергуючих агентів. Крім того, композиції винаходу можуть включати будь- які фармацевтично прийнятні носії, такі як, наприклад, лактоза, для сухих порошкових препаратів.

Кількість активного інгредієнта, що може сполучитися з матеріалами-носіями для готування однократної дозованої форми, змінюється в залежності від реципієнта, що піддається лікуванню, і конкретного засобу введення. Варто розуміти, проте, що конкретне дозування і схема прийому лікарського препарату для будь- якого конкретного пацієнта буде залежати від ряду чинників, в тому числі активності конкретно використовуваної сполуки, віку, ваги тіла, загального стану здоров'я, статі, режиму харчування, часу введення, швидкості виведення, лікарського сполучення, а також від думки лікаря, що лікує, і серйозності захворювання.

Кількість активного інгредієнта може також залежати від терапевтичного або профілактичного агента, якщо він використовується, із котрим цей інгредієнт вводиться спільно.

Дозування і рівень дози сполук даного винаходу, ефективні для запобігання, придушення або інгібіювання клітинної адгезії, будуть залежати від ряду чинників, таких як природа інгібітору, вага пацієнта, ціль лікування, природа патології, що піддається лікуванню, використовувана конкретна фармацевтична композиція, а також думка лікаря, що лікує. Корисні рівні доз приблизно між 0,001 і 10Омг/кг ваги тіла на день, переважно між 0,01 і 5Оомг/кг і більш переважно приблизно 10мг активної сполуки на день на кг. ваги тіла на день.

У тих випадках, коли використовуються композиції для внутрішньовенного введення, підходящий інтервал доз складає приблизно від 0,001мМг до 25мг/кг, більш переважно приблизно від 0,01мМг до 1мМг/кг.

Відповідно до ще одного варіанта здійснення винаходу композиції, що містять сполуку даного винаходу, можуть також включити додатковий агент, обраний із групи, що включає кортикостероїди, бронхолітичні засоби, антиастматичні засоби (стабілізатори гладких клітин), протизапальні засоби, протиревматичні засоби, імунодепресанти, антиметаболіти, імуномодулятори, засоби проти псоріазу і протидіабетичні засоби.

Конкретні сполуки, що відносяться до кожного з цих класів, можуть бути обрані з будь-яких сполук, перерахованих у відповідній групі у виданні: «Сотргепепвзіме Медісіпа! Спетівігу», Регдатоп Ргев5, Охіога,

Епдіапа, стор. 970-986 (1990) (включено в якості довідкового матеріалу). Також до даної групи входять такі сполуки, як теофілін, сульфазалазин і аміноса-ліцилати (протизапальні засоби); циклоспорин, ЕК-506 і рапаміцин (імунодепресанти); циклофосфамід і метотрексат (антиметаболіти); стероїди (інгальовані, пероральні або топічні) і інтерферони (імуномодулятори). Крім того, сполуки винаходу можуть вводитися в сполученні з додатковими інгібіторами клітинної адгезії. При введенні одного або декількох додаткових агентів у сполученні з заявленими Мі А-4-інгібіторами, активні інгредієнти можуть рецептуватись разом, або, альтернативно, можуть вводитися в сполученні. Введення одного або більш активних агентів у сполученні з інгібіторами МІ А-4, заявленого винаходу може бути по суті одночасним або послідовним. Кваліфіковані в даній області спеціалісти можуть легко визначити найбільше підхожий метод застосування в залежності від агентів, що вводяться, бажаного результату, пацієнта і його стану.

У відповідності з іншим варіантом здійснення винахід пропонує засоби запобігання, інгібіювання або придушення асоційованого з клітинною адгезією запалення й асоційованих із клітинною адгезією імунних або автоїмунних реакцій у пацієнта. Асоційована з МІ А-4 клітинна адгезія грає центральну роль при різноманітних запаленнях, імунних і автоїмунних захворюваннях. Таким чином, інгібіювання клітинної адгезії за допомогою сполук даного винаходу може бути використане в засобах лікування або запобігання запальних, імунних і автоїмунних захворювань. Переважно захворювання, що можна лікувати засобами даного винаходу, вибираються з таких захворювань, як астма, артрит, псоріаз, відторгнення трансплантату, розсіяний склероз, діабет і запальне захворювання кишечника.

У цих засобах сполука даного винаходу можуть використовуватися в монотерапії або в сполученні з протизапальними агентами або імунодепресантами. Така комбінаційна терапія включає введення агентів у разовій дозованій формі або у вигляді множинних дозованих форм в той же, або в різний час.

Приклад 1. Одержання оМмеРОРА-МУ оМеРИРА-М, (2)-М-Ц4-((2-метилфеніламіно)карбонілІіаміно|фенілІацетил|-І -проліл-З-метил)-рД-Аланін, одержують по конвергентній схемі синтезу з промислово вироблених сукцинимідил Вос-(І)-проліну (Вос-Рго-

О5и; Васпегп) і напівсульфату (А)-бензил-3-амінобутирата (Седепе Согр.). Сполучення вихідних речовин у

СНеосіг при ЕВМ із наступним гідролізом бутоксикарбонільної (Вос) групи 4 н. НСІ у діоксані давало Наї|-соль, що перекристалізовувалась із суміші СНоСі/Е2О. Сполучення НСіІ-соли із сукцинимідил-2-І(4-(2- (метилфеніламінокарбоніл)|амінофенілацетатом (МРОРА-О5и), отриманим із відповідної кислоти МРОРА-ОН (Вісегса, Іпс.), давало кристалічний бензиловий ефір ОМеРИРА-У, що каталітично гідрувався (1095 Ра/С) у суміші ТГФ/НгГО (9:1), даючи омМеРИОРА-М. Кінцевий продукт утворювався у вигляді білої твердої речовини після перекристалізації з 20956-ного водяного ацетону.

Стислий опис фізичних характеристик

Хімічна назва: (Н)-М-((4-((2-метилфеніламіно)карбоніл|іаміно|феніл|ацетил)|-І -проліл-З-метил)-Д-Аланін

Емпірична формула: С25НзоМаО5

Молекулярна вага: 466,53

Зовнішній вигляд: чистий білий порошок

Температура плавлення: 153,6-154 470

Схема 1

Одержання МРОРА-О5ЦЩ(2) із МРОРА-ОН (1) о о еру т. Ос, СС А о. ; сл и м є ий ли

Схема2

Синтез ОомеРИРА-М (8) із Вос-(І)-Рго-О5и (3) і напівсульфату бензил-(Н)-3-амінобутирату (4).

Я НСКМЖею

Васй. к ша сто ТРА вен) шов рев же ттк

У. й ся «КУ зиюіетля йоводя Зм Кк

Кі 4 5 но ни ЩО люди трлн ПП. СК

С вах а в ше 7

ИМЯ М: водм. ТР Її з

Ж кище кіми. пмасрх 13 хм Вю о га во

ПЕТ А зу соте се

Синтез оМеРОРА-М

Хімічний синтез, використовуваний для одержання оМеРИОРА-М, поданий на Схемах 1 і 2. Похідні матеріали одержують із комерційних джерел і від виробників за контрактом: (1) приготовлений великому фірмою Вісегса, Іпс., РаіпевміМПе, ОН; (3) отриманий від фірми Васпегп Віозсіепсе, Іпс., Кіпод ої Ргизвіа, РА і (4) отриманий від фірми СеЇдепе Согр., Маїтеп, МУ.

Одержання оМеРОРА-У:

Загальні аналітичні методи (НН ЯМР, "С ЯМР, масс-спектрометрія, ІЧ-спектрометрія і високоефективна рідинна хроматографія (ВЕЖХ)

Спектроскопію "Н ЯМР проводять або на приладі Впикег АС 300, Мапйап 500, або Мапйап 600, зразки аналізують або в ДМСО-де щодо сигналу ДМСО-йв (52,49м.д.), або СОСІз щодо сигналу залишкового СНСІз (5 7,24м.д.).

Спектроскопію Зб ЯМР проводять або на приладі Мапйап 500, або на приладі Мапйап 600, зразки аналізують або в ДМСО-йв6 щодо сигналу ДМСО-йв (5 40, 5м.д.), або в СОСІз щодо сигналу СОС Із (5 77,0м.д.).

Мас-спектри записують на мас-спектрометричній системі Різоп5 Ма Ріанопт І С-М5-05 з автоматичним пробозабірником Немієїї Раскага Моадвеї! 1500, і дані опрацьовують із використанням робочої станції для мас- спектрометрії Різоп5 МО Мавг5і упх. Мас-спектри високого розрізнення (НАМ5) визначають із використанням бомбардування швидкими атомами при М-скануванні (РА) на високопольному мас-спектрометрі Ма Апа/уіїїсаї 7АВ 25Е відносно БОР Ж М5-002, М5-006, М5-012 і М5-023. Для генерування іонів використовують цезієву гармату, отримані мас-спектри записують із використанням системи опрацювання даних РОР-11-250.

ІЧ-спектри записують на РегїкКіп-ЕІтег 1600 бепез ЕТІВ.

Аналітичну ВЕЖХ проводять таким чином:

Хроматограми з використанням програми 1 (зрівноважування при 2095 В, запровадження зразка, 2095 В (Іхв.), 2095-7090 В (24хв.), 7095-10095 В (17хв.)) одержують із використанням автоматичної системи добору проб для ВЕЖХ Регїкіп ЕІтег Зепев 200 з УфФ-детектором Репоп ЕІтег 785А (установленим на 214нм) і з УФ- детектором Арріїєй Віозувієте 783А ИМ (установленим на 254нм) з інтегратором РЕ Меївоп 1020.

Приводиться тільки відсоток площі,

Хроматограми з використанням програми 8 (зрівноважування при 1595 В, запровадження зразка, 1595 В (Іхв.), 1595 - 4095 В (25хв.), 4095 У (10хв.)) одержують із використанням системи подачі розчинника Арріїєй

Віозузієте 400 з Уф-детектором 783А з використанням автоматичного пробозабірника УУаїегз 717. Дані опрацьовують із використанням інтегратора Немієїї РасКага 3396 Зепез ІІ. На інтеграторі встановлюють такі параметри: Загасання - 8, Поріг - 5, відхилення площі - 10000, Ширина піку - 0,04, Швидкість діаграми 0,2.

Всі роботи з використанням ВЕЖХ проводять із використанням колонки Мудас с-18 (розмір пір 5т, 4,5мм х 25см, каталожний номер 25218ТРБА).

Розчинник А: (водажО,195 трифтороцтової кислоти (ТЕА)

Розчинник В: (ацетонітрил ж 0,195 ТЕА)

Швидкість потоку: 1 мМл/хв.

Використовують такі градієнтні програми:

Програма 1: (зрівноважування при 2095 В, запровадження зразку, 2095 В (2хв.), 2090 -7095 В (25хв.), 10095 8(5хв).

Фізичні дані для ((4-((2-метилфеніл)аміно|карбоніліаміно|феніл|оцтової кислоти (1, МРОРА-ОН, речовина, вироблена фірмою Вісегса Іпо.):

Т. пл.:210-215"С(розкл.).

ІЧ-(КВг): 3295 (ушир, смуга), 3034 (ушир, смуга), 1707, 1637, 1603, 1551, 1516, 1457, 1414, 1302, 1241, 1189, 1118см".

ІН ЯМР (600МГц, АМСО-ав), 5, м.д: 12,28 (ушир, с, 1Н), 9,0 (с, 1Н), 7,91 (с, 1Н), 7,88 (д, у-7,8Гц, 1Н), 7,43 (д, 9-8,4Гц, 2Н), 7,19 (д, 9-8,4Гц, 2Н), 7,16 (м, 2Н), 6,94 (од, уУ-7,8, 8,4Гцу, 1Н), 3,51(с, 2Н),2,25(с, ЗН). 136 ЯМР (150МГц, АМСО- дв), 6, м.д: 173,0 (С), 152,7 (С), 138,5 (С), 137,5 (С), 130,2 (СН), 129,8 (СН), 128,3 (СН), 127,5 (СН), 126,2 (СН), 122,7 (СН), 121,0 (СН), 118,1 (СН), 40,1 (СН), 17,9 (СН);

МС (ЕЇ)): т/2 285 (М--1)" 193, 152, 134, 132, 109, 108, 106, 93, 91, 57;

Елементний аналіз. Обчислення для СібєНієМ2гОз: С 67,59, Н 5,67, М 9,85. Знайдено: С 67,60, Н 5,70, М 10,01.

Одержання сукцинимідил-І4-((2-метилфеніл)аміно|карбонілІаміно|феніл|ацетату (2, МРОРА-О5И)

До киплячої суспензії о-метилфенілсечовини-фенілоцтової кислоти (1, МРОРА-ОН, 150г, 0,501мМоль, від фірми Вісегса Іпс.) в ацетонітрилі (ббОмл) протягом 10 хвилин при енергійному перемішуванні добавляють тіонілхлорид (41мМл, 0,558моля). Виділяється велика кількість НСІ. Реакційну суміш при безупинному перемішуванні протягом 1,5 годин прохолоджують до кімнатної температури. Реакційна суміш стає рожевою суспензією, до якої однією порцією добавляють твердий М-гідроксисукцинимід (НОбЗи, 75,5г, 0,63бмоля). До даної суміші по краплях добавляють триетиламін (174мл) протягом 30 хвилин, при цьому температуру реакційної суміші підтримують нижче 60"С за допомогою водяної бані. Перемішування продовжують протягом 2 годин, і потім до реакційної суміші добавляють дистильовану воду (500мл). Тверду речовину відфільтровують і промивають 2 л дистильованої води, і ацетонітрилом (2х200мл), сушать на повітрі і потім сушать над Рг2О5 під вакуумом (-0,1мМм рт.ст.), одержуючи сирий продукт (175г, вихід 9795) у вигляді бежевого порошку. Сирий продукт (174г) перекристалізовують з ацетонітрилу (3,5л) із вуглем (10г) для знебарвлення, одержуючи 129г МРОРА-О5и (2, вихід 6895) у вигляді білого порошку (чистота 299965).

Т.пл.: 211,2-211,876.

ІЧ-(КВг): 3904-3203 (ушир, смуга), 1816, 1783, 1654, 1368, 1304, 1244, 1116, 1021 см".

ІН ЯМР (З300МГЦц, ДМСоО-йв), 6, м.д: 9,04 (с, 1Н), 7,92 (с, 1Н), 7,82 (д, 1Н), 7,44 (д, У-8,5Гц, 2Н), 7,24 (д, у8,5ГЦ, 2Н), 7,15 (м, 2Н), 6,93 (дд, 9-7,4, 7,3ГЦ, 1Н), 4,02 (с, 2Н), 2,80 (с, 4Н), 2.23 (с, ЗН).

МС (ЕЇ, Е5" : т/2 382 |(МА)У7), 239, 108, 106;

Фізичні дані для сукцинимідил-Вос-(І )-проліну (Вос-Рго-О5и, 3, речовина, одержувана від фірми Васпегп

Віозсіепсе):

Т.пл.: 132-13670. 14 (КВо): 3456, 2940, 1731, 1619, 1561, 1541, 1497, 1454, 1395, 1337, 1259, 1202, 1118, 1060 см".

ІН ЯМР (З00МГЦц, СОС з), 6, м.д: 4,51 (дд, у-3,8, 8,7Гц, 1Н), 3,56 (м, 1Н), 3,44 (м, 1Н), 2,80 (с, 4Н), 2,32 (м, 1Н), 2,27 (м, 1Н), 1,94 (м, 2Н), 1,43 (с, 9Н).

МС (ЕЇ)): т/2 335 (М-е-М2)" 279, 213, 138, 114, 86;

ВЕЖУ: 97,1965.

Фізичні дані для напівсульфату бензил-(Н)-3-аміно-бутирата (4, речовина, одержувана від фірми СеІдепе

Согр.):

Т. пл.: 249,4-249,876. 14 (КВг): 3515, 3383, 2989, 2945, 2880, 1821, 1788, 1744, 1701, 1476, 1454, 1421, 1394, 1368, 1260, 1241, 1202, 1159, 1077см"

ІН ЯМР (З00МГЦ, СОСІз), 6, м.д: 7,85 (ушир, с, 2Н), 7,26 (с, 5Н), 5,06 (АВ кв., 9У-12,3Гц, 2Н), 4,35 (м, 2Н), 3,73 (м, 1Н), 2,92 (дд, 9-64, 17 1Гцу, 1Н), 2,66 (дд, У-6,4, 17,0Гц, 1Н), 1,35 (д, У9-6,5Гц, ЗН).

МС (ЕЇ): т/2 195 (М3)7", 194 (М--2)", 106, 92, 91;

ВЕЖУ: 99,0965.

Одержання бензилового ефіру М(трет.-бутоксикарбоніл)-І -проліл-З-метил-(Н)-р-аланіну (5)

До добре перемішаної суспензії напівсульфату бензил-(А) -3-амінобутирата (4; 66,7г, 213ммоля) у СНосСіг»

(200мл) добавляють Вос-(І)-Рго-О5и (3; 53,9г, 222ммоля) і ЕїзМ (95мл, 68!ммоль). Реакційну суміш лишають перемішуватися при кімнатній температурі протягом 2 годин. Реакційну суміш розподіляють між ЕЮ Ас (1,57л) і

НгО (250мл), і органічний прошарок промивають 10906-ною лимонною кислотою (З3х250мл), НгО (250мл), насиченим розчином бікарбонату натрію (250мл), Н2О (250мл) і ропою (3х250мл), сушать Ма2504 і концентрують спочатку на роторному випарнику (40"С; -8Омм рт. ст) і потім у високому вакуумі (кімнатна температура, 16г, 0,2мМм рт. ст), одержуючи проміжну сполуку 5 у вигляді в'язкої олії (88,1г), що містить залишковий ЕОАс і СНесі» (відповідно до ЯМР) і має чистоту 29895 (ВЕЖХ). Ця речовина використовують у наступній реакції, без додаткового очищення.

ІН ЯМР (З00МГЦц, СОС Із), 6, м.д: 7,30 (м, 5Н), 6,44 (ушир, с, 1Н), 5,10 (дд, у - 12,3, 141Гц, 2Н), 4,32 (м, 1Н), 4,13 (м, 1Н), 3,34 (ушир, с, 2Н), 2,48 (д, 9-5,1Гц, 2Н), 2,1 (м, 2Н), 1,75 (ушир, с, 2Н), 1,40 (с, 9Н), 1,17 (д, у - б,огГц, ЗН).

МС (Е): т/2 413 |МАМа|" 313, 291, 191, 194, 165, 91.

Одержання гідрохлориду бензилового ефіру І -проліл-З-метил- (В) -(3З-аланіну (6)

До проміжної сполуки 5 із попередньої реакції поступово добавляють розчин 4н НСЇ у діоксані (240мл).

Спостерігається сильне виділення газу (обережно, реакція екзотермічна). Реакційну суміш лишають перемішуватися при кімнатній температурі (2 години) і потім концентрують спочатку на роторному випарнику (45"С; -вОмм. рт. ст), а потім у високому вакуумі протягом ночі (кімнатна температура, 14г, -0,2мМм рт. ст), одержуючи вкрай в'язку речовину, що перекристалізовують із СН2СіІг/ЕС2О (60Омл/700мл), одержуючи 64,0г (загальний вихід 92905 для двох стадій) НСІ-солі 6 у вигляді білої твердої речовини (чистота за даними ВЕЖХ 99,69).

Т.пл.: 119,8-120,576. 14 (КВо): 3217, 3072, 2904, 2756, 1736, 1681, 1560, 1446, 1387, 19352, 1295, 1244, 1178, 1096 см".

ІН ЯМР (500МГц, СОСІз), 6, м.д: 10,21 (ушир, с, 1Н), 8,71 (д, У-8,0ГцЦ, 1Н), 7,77 (ушир, с, 1Н), 7,24 (м, 5Н), 5,00 (с, 2Н), 4,52 (ушир, с, 1Н), 4,22 (триплет, що здається, У-6,5Гц, 1Н), 3,33 (ушир, с, 2Н), 2,67 (дд, 9-5,5, 15,5ГЦ, 1Н), 2,44 (м, 2Н), 1,89 (м, ЗН), 1,15 (д, У-6,5Гц, ЗН). 1307 ЯМР (125МГц, СОСІз), 6, м.д: 171,03 (С-0), 167,67 (С-0), 135,58 (С), 128,43 (СН), 128,13 (СН), 128,06 (СН), 66,34 (СНЗз), 59,71 (СН), 46,55 (СНЗз), 43,34 (СН), 40,42 (СН3з), 30,50 (СНг), 24,23 (СНг), 19,92 (СН).

МО (ЕЇ): т/2 291 |М-СІГ,199, 194, 160, 139, 92, 91;

Елементний аналіз. Обчислено для СтівНгзМ2гОзСі: С 58,80, Н 7,094, М 8,57. Знайдено: С 58,95, Н 6,99, М 8,46.

Одержання бензилового ефіру М-(Ц4-((2-метилфеніламіно) - карбоніліаміно|феніл|ацетил|-І -проліл-3- метил)-(А)-р-аланіну (7)

До розчину НСІ-солі 6 (61,77г, 149ммоля) у ДМФ (125мл) добавляють МРОРА-О5И (2; 69,39г, 181,9ммоля) і потім ЕЇїзМ (9ФОмл/г -10). Реакційну суміш лишають перемішуватися протягом 3,5 годин, потім розбавляють

ЕОДАс (1л) і екстрагують НгО (3х250мл). В цей момент продукт починає випадати в осадок. До органічного прошарку добавляють 10950-ний розчин лимонної кислоти (250мл) (обережно, екзотермічна реакція) і при струшуванні утвориться багатий осадок. Тверда речовина фільтрують через лійку зі спекшимся склом (фільтр

Шотта) (обсяг 2л, М). Тверду речовину промивають лимонною кислотою (1095, 2х250мл), НгО (250мл), насиченим бікарбонатом натрію (2х250мл), НгО (250мл) і ропою (3х250мл) і лишають сушитися на лійці при відсмоктуванні (-ЗОмм рт. ст.) протягом ночі (-14 годин). Одержують не зовсім білу тверду речовину, що перекристалізовують із суміші ТГФ/ЕСО (1л/1,4л), одержуючи 83,3г сполуки 7 (чистота за даними ВЕЖХ 99,690) у вигляді білої твердої речовини.

Фільтрат додатково промивають лимонною кислотою (1095, Зх250мл), НгО (250мл), насиченим бікарбонатом (2х250мл), НгО (250мл) і ропою (3х250мл). З кожним наступним промиванням водою випадає додаткова кількість осадка, проте, промивання продовжують, проявляючи обережність, щоб не загубити осадок. Фільтрування дає 4,02г продукту у вигляді білої твердої речовини. Фільтрат нарешті розбавляють ЕРО (Іл), фільтрують і тверду речовину промивають ЕСО (З3х100мл), одержуючи додаткову порцію (1,67г) білої твердої речовини. Загальний вихід для даної реакції складає 88905.

Т.пл.: 153-153,576. 14 (КВО: 3342, 3307, 3119, 2966, 1737, 1702, 1643, 1590, 1543, 1514, 1455, 1414, 1308, 1238, 1179 см".

ІН ЯМР (500МГц, ДМСОО-дв), суміш ротамерів 3:2, (піки основної конформації), 5м.д,: 9,00 (ушир, с, 1Н), 7,91 (ушир, с, 1Н), 7,84 (д, 9-8,3Гц, 1Н), 7,68 (д, У-8,3Гц, 1Н), 7,40-7,28 (м, 7Н), 7,13 (СН), 7,06 (д, 9-8,8Гц, 1), 6,92 (т, уче7,ЗГц, 1Н), 5,06 (АВ-квартет, У-12,2Гц, ЮОп-8,9Гц, 2Н), 4,18 (дд, У-3,4Гц, 8,6Гц, 1Н), 4,10 (квінтет, 96,8 ГцЦ, 1), 3,57 (м, 2Н), 3,50-3,22 (м, ЗН), 2,62-2,37 (м, 2Н), 2,23 (с, ЗН), 2,18-1,68 (м, ЗН), 1,05 (д, уУ-6,8Гц,

ЗН); і 5, м.д (піки другорядної конформації): 9,00 (ушир, с, 1Н), 7,91 (ушир, с, 1Н), 7,84 (д, У-8,3ГцЦ, 1), 8,15 (д, 98,3 Гц, 1), 7,40-7,28 (м, 7Н), 7,13 (ЗН), 7,06 (д, 9-8, Гц, 1Н), 6,92 (т, 9У-7,3Гц, 1Н), 5,01 (АВ-квартет, У-12,2ГЦ,

Оп-19,0Гц, 2Н), 4, 32 (дд, 9У-2,4Гц. 8.8ГЦ.1Н), 4,22 (квінтет, 9-6.8Гц, 1Н), 3,57 (м, 2Н), 3,50-3,22 (м, ЗН), 2,62- 2,37 (м, 2Н), 2,23 (с, ЗН), 2,18-1,68 (м, ЗН), 1,10 (д, У9-6,8Гц, ЗН). 136 ЯМР (1253 МГц, ДМСоО-йв), суміш ротамерів, 5, м.д. (піки основної конформації): 170,80 (С-0), 170,52 (С-0), 169,18 (С-0), 152,61 (С-0), 138,10 (С), 137,38 (С), 136,04 (С), 130,05 (СН), 129,63 (СН), 129,47 (СН), 128,58 (С), 128,28 (СН), 127,89 (СН), 127,85 (С), 126,02 (СН), 122,50 (СН), 117,90 (СН), 117,81 (СН), 65,44 (СНг), 59,61 (СН), 47,04 (СН), 41,75 (СН), 40,41 (СН»), 40,00 (Сн»), 29,29 (СН»г), 24,13 (СНг), 19,88 (СН), 17,78 (СНУ); і 5, м.д (піки другорядної конформації): 170,94 (С), 170,52 (С), 169,31 (С-0), 152,61 (С-0), 138,10 (С), 137,38 (С), 136,04 (С), 130,05 (СН), 129,63 (СН), 129,47 (СН), 128,65 (С), 128,28 (СН), 127,89 (СН), 127,85 (С), 126,02 (СН), 120,940 (СН), 117,90 (СН), 117,81 (СН), 65,44 (СН»), 59,91 (СН), 46,51 (СН»), 42,01 (СН), 40,13 (СН), 39,84 (СН»), 31,75 (СН»г), 22,11 (СНнг), 20,05 (СНег), 17/78 (СН»);

МС (Е)): т/2 579 |МАМа|", 557, 454, 426, 357, 336, 293, 267, 201;

Елементний аналіз. Обчислено для Сз2НзеМаОв: С 69,05, Н 6,52, М 10,07. Знайдено: С 68,87, Н 6,52, М9,93.

Одержання М-(4-((2-метилфеніламіно)карбоніл|аміно|феніл|ацетил|-І -проліл-З-метил)-(Н)-Д-аланіну (8;

оМеРИРА-М)

Розчин омМеРИРА-М-ОВп (7; 80,18г) у суміші ТГФ/НгО (9:11, 800мл) гідрують при тиску 55фунтів/дм? (3,87кг/смУ) при Ра/С (1095, 2,44г). Через 25 годин реакційну суміш фільтрують через боїКа Біоеф (144г; Бірег

Заіез 4 ЮОемеіюортепі Согр.) на фільтрі Шотта. Фільтрат повторно фільтрують через ще один прошарок боїкКа

РіоефФ (115г), концентрують до обсягу -250 мл і поступово виливають у толуол (Зл) при енергійному перемішуванні. Суспензію лишають перемішуватися протягом 0,5 годин, фільтрують (через фільтр Шотта обсягом 2л) і отриманий порошок сушать, спочатку на фільтрі з відсмоктуванням (-80мм рт.ст., 0,5 години) і потім, у вакуумній печі (14г, 457С, тиск доводять до 25мм рт.ст. потоком Мг). Білі грудки подрібнюють (ступка і маточка) у тонкий порошок, одержуючи 58,3г (вихід 8795) оОмМеРИРА-М у вигляді білої твердої речовини.

Продукт перекристалізовують із суміші ацетон/НгоО (320мл/75мл). Кристали збирають і сушать спочатку на фільтрі Шотта з відсмоктуванням (1 година, 8Омм рт.ст) і потім у вакуумній печі (25г, 45"С, тиск доводять до 25мм рт.ст потоком М2), одержуючи 47,0г (8495 виділено при кристалізації) ОМеРШРА-МУ у вигляді білої твердої речовини (чистота за даними ВЕЖХ99,190).

Т.пл.:153,6-154,476. 14 (КВт): 39354, 3307, 1719, 1643, 1590, 1543, 1514, 1449, 1308, 1237 см".

ІН ЯМР (600МГЦц, ДМСО-дв5), суміш ротамерів 3:2, 8, м.д. (піки основної конформації): 12,21 (ушир, с, 1Н), 8,99 (с, 1Н), 7,91 (с, 1Н), 7,87 (д, 9-8,2Гц, 1Н), 7,68 (д, 9У- 7,9Гц, 1Н), 7,40 (д, 9-8,6Гц, 2Н), 7,17 (д, 9-5, 9Гц, 2Н), 7.15 (д, У-7,6Гц, 1Н), 7,12 (дд, У-7,9, 8,2ГЦ, 1Н), 6,94 (дд, 9У-7,9, 7,3Гц, 1Н), 4,22 (дд, 9У-3,3, 8,9Гц, 1Н), 4,06 (м, уб,бГЦ, 1), 3,47 (дд, 1Н), 3,44 (д, 9215,0Гц, 1Н), 3,37 (дд, 1Н), 3,29 (д, 9-15,4Гцу, 1Н), 2,46 (дд, 1Н), 2,27 (м, 1Н), 2,25 (із, ЗН), 1.99 (м. 1Н), 1,80 (м, 1Н), 1,78 (м, 1Н), 1,76 (м, 1Н), 1,07 (д, 3-6,6ГцЦ, ЗН) ; і 5, м.д. (піки другорядної конформації): 12,21 (ушир, с, 1Н), 8,99 (із, 1Н), 7,90 (із, 1Н), 7,87 (д, У-8,2Гц, 1Н), 8,12 (д, 9-8,2Гц, 1Н), 7,40 (д, 9-8,6Гц, 2Н), 7,16 (д, уУ25,9 Гц, 2Н), 7,15 (д, 3-1,6Гц, 1Н), 7,12 (дд, 3-1,9, 8,2Гц, 1Н), 6,94 (дд, 3-1,3, 7,3ГЦ, 1), 4,34 (дд, 9У-1,8, 8,4ГцЦ, 1Н), 4,18 (м, 3-6,6, 1Н), 3,60 (м, 2Н), 3,59 (м, 1Н), 3,48 (м, 1Н), 2,47 (дд, 3-6, бГЦ, 15,4ГЦу, 1), 2,40 (дд, 3-6,6, 15,4Гц, 1Н), 2,25 (с, ЗН), 2,15 (м, 1Н), 1,83 (м, 1Н), 1,91 (м, 1Н), 1,77 (м, 1Н), 1,12 (д, 0-6,6Гц, ЗН). 136 ЯМР (150МГЦц, ДМСО-дв5), суміш ротамерів, 5 м.д. (піки основної конформації): 172,4 (С-0), 170,9 (СО), 169,3 (С-0), 152,6 (с-0), 138,2 (С), 137,5 (С), 130,2 (СН), 129,8 (СН), 129,6 (СН), 128,7 (С), 127,4 (С), 126,1 (СН), 122,6 (СН), 120,9 (СН), 118,0 (СН), 117,9 (СН), 59,7 (СН), 46,6 (СН»), 41,7 (СН»), 40,6 (СН»), 40,2 (СНг), 29,4 (СНг), 22,2 (СН), 19,9 (СНЗз), 17,9 (СН); і 5, м.д. (піки другорядної конформації): 172,5 (С-0), 171,0 (С-0), 160,5 (С), 152,7 (С), 138,19 (С), 137,5 (С), 130,2 (СН), 129,8 (СН), 129,6 (СН), 128,8 (С), 127,4 (С), 126,1 (СН), 122,6 (СН), 120,9 (СН), 118,0 (СН), 117,9 (СН), 59,9 (СН), 471 (СН»), 42,0 (СНег), 39,8 (СнН»), 40,3 (СнН»), 31,8 (СнНг»), 24, 2 (Снаг), 20,2 (СН»), 17,9 (СН);

МС (ЕЇ): т/2 468 |М-А-Ма|" 336, 267, 137;

Елементний аналіз для (С25НзоМаО5). Обчислено, 95: С 64,36, Н 6,48, М 12,01. Знайдено, 90: С 64,07, Н 6,40, М 11,85.

Приклад 2. Активність на моделі алергічного легеневого запалення в овець.

Використовували алергічних овець вагою між 27 і 50кг. Було показано попередньо, що всі вівці виявляли як ранню, так і пізню бронхіальні реакції на шгальований розпилений алерген Авзсагів зцшт. Вівці знаходилися у свідомості й утримувалися в модифікованому візку для покупок у розпростертому стані з нерухомими головами. Після місцевої анестезії носових проходів 290-ним лідокаїном, через одну ніздрю в нижню частину стравоходу просувався катетор-балон. Тварин інтубували за допомогою ендотрахеальної трубки з надувною манжетою через іншу ніздрю з використанням гнучкого бронхоскопа з волоконною оптикою в якості направляючого зонда. Всі протоколи випробувань, використовувані при цьому дослідженні, схвалені Моипі

Зіпаї Меаіса! Сепіег Апіта! Везєеагті Соттійеє, що відповідає за забезпечення гуманного відношення і використання експериментальних тварин. Плевральний тиск оцінювався з використанням катетера-балона в стравоході (заповненого їмМл повітря), що розташовувався на 5-10см від шлунково-стравохідного з'єднання.

В цьому положенні кінцевий плевральний тиск при видиху складало в інтервалі від -2 до -5см НгО. Після розміщення балона його закріплювали так, щоб він залишався в цьому ж положенні протягом усього досвіду.

Бічний тиск у трахеї вимірювалося за допомогою катетера з бічним отвором (внутрішній діаметр 2,5см), просунутого через ендотрахеальну трубку і розташованого на відстані від верхнього її кінця.

Катетери трахеального і плеврального тиску з'єднувалися з диференціальним датчиком тиску (МРА5,

Маїїдупе, МопНнгідде, СА) для виміру транслегеневого тиску, що визначається як різниця між трахеальним і плевральним тиском. Проходження повітря вимірювалося шляхом з'єднання проксимального кінця ендотрахеальної трубки з пневматографом (БіІєївсй, ЮОупа Зсіепсе5, Іпс., Вісе ВеїЇ, РА). Сигнали транслегеневого тиску і прохідність дихальних шляхів реєструвалися на многоканальному фізіологічному реєструвальному пристрої пов'язаному з персональним комп'ютером 80-386 0О5 для оперативного розрахунку середнього опору легенів протокові (А) розподілом зміни транслегеневого тиску на зміну протоку при середньому дихальному обсязі (отриманому за допомогою цифрової інтеграції). Середнє значення, щонайменше, п'ятьох подихів, вільних від штучного ковтання, використовували для одержання Ві у см

НгО/п/сек. Відразу ж після виміру Ві визначали грудний газовий об'єм (Мою) у плетизмографі постійного обсягу тіла для одержання питомого опору легенів (ЗНІ,-НіХМю) в л х см НгО/л/сек.

Всі рідкі дози аерозолів утворювалися з використанням одноразового медичного розпорошувача з насадкою (РаїпагорФ, Рипіап Веппеїй, Гепеха, К5), що давав аерозоль із середньомасовим аеродинамічним діаметром 3,2мкм, що визначався за допомогою каскадного імпактора Андерсона. Розпорошувач дозувальною з'єднувався системою, що складається з електромагнітного клапана і джерела стиснутого повітря (20фунтів/кв.дм або 1,41кг/см). Випуск розпорошувача спрямовувався в пластикову Т-подібну деталь, один кінець якої був приєднаний до дихального отвору клапанного респіратора (Нагуага Аррагайшве, 5.МаїййсК, МА).

Електромагнітний клапан активувався протягом однієї секунди на початку дихального циклу респіратора.

Аерозолі подавалися при дихальному обсязі 50Омл і швидкості 20 вдихів на хвилину. Для оцінки бронхіальної сприйнятливості будувалися криві кумулятивної концентраційної реакції на карбахол шляхом виміру ВІ,

відразу ж після інгаляції буфера і після кожного послідовного введення з 10 вдихами концентрацій карбахолу, що підвищуються, (0,25, 0,5, 1,0 2,0 і 4,095 вага/об, у буферному фізіологічному розчині). Провокаційний тест припинявся, коли ЗАГ, збільшувався на більш ніж 40095 від рівня після введення фізіологічного розчину або після введення найбільше високої концентрації карбахолу. Бронхіальна сприйнятливість оцінювалася шляхом визначення кумулятивної концентрації карбахолу (в одиницях подиху), що підвищувала 5Н:, на 40095 щодо розміру після введення фізіологічного розчину (РС400) шляхом інтерполяції по кривій доза-реакція. Одна одиниця подиху визначався як один вдих 195 вага./об. розпиленого розчину карбахолу.

Дози оМмеРИРА-М розчинялися в суміші етанол:звичайний фізіологічний розчин 1:2, або в етанол"200мМ фосфату натрію 1:5, або в Тііз-буфері. При використанні Тгіз-буфера будь-які необхідні розведення здійснювалися з використанням звичайного фізіологічного розчину. Дози готувались у 3З-5мл загального обсягу.

В усіх дослідженнях базове значення сприйнятливості дихальних шляхів (тобто, РСаоо) визначали за три- чотири дні до початку дослідження. При дослідженні попереднього опрацювання однократною дозою вимірювали 5Вї, І тварин опрацьовували сполукою або розчинником. ЗНАНІ, вимірювали повторно через 2 години після опрацювання (безпосередньо перед провокацією), і потім тварин провокували алергеном. У дослідженні з використанням багатократних доз, починаючи за 4 дні до провокації алергеном, тварин опрацьовували один раз на день протягом 4 днів і провокували алергеном через 24 години після введення останньої дози. ЗА: вимірювали до і після введення останньої дози сполуки або після опрацювання розчинником. В усіх дослідженнях 5В; вимірювали відразу ж після провокації алергеном, щогодинно протягом 1-6 годин після провокації і щопівгодини протягом 6,5-8 годин після провокації алергеном. Постпровокаційні визначення сприйнятливості дихальних шляхів (РС400) проводили через 24 години після провокації алергеном.

Отримані значення виражені у вигляді середнього значення х стандартна помилка середнього. Зміну ЗА обчислювали для кожної вівці у вигляді різниці від предпровокаційного базового значення 5В;-

Постпровокаційні зміни в значенні 5Ві характеризувалися ранньою реакцією дихальних шляхів (ЕАВ), що розвивалась протягом приблизно 0-4-годинного періоду. За ній йде пізня реакція дихальних шляхів (ГАР), що розвивалася протягом приблизно 4-8-годинного періоду після провокації алергеном. Площі під кривими ЕАВ і

І АВ обчислювалися для кожної тварини з використанням правила трапецій. Значні зменшення площі під кривими ЕАБВ і АВ у порівнянні з плацебо-контролем, сприймалися як терапевтичний вплив на індуковані алергеном зміни 5А;. Сприйнятливість дихальних шляхів до карбахолу (РС400Х оцінену до і через 24 години після провокації алергеном, виражали у вигляді відношення РС400 (пост/предпровокаційні значення РСаоо)

Для кожної вівці. Значне підвищення відношення РСоо в порівнянні з плацебо-контролем вважалось терапевтичним ефектом. Порівняння з плацебо-контролем проводилися з використанням одностороннього дисперсійного аналізу наступним тестом Даннета для множинного порівняння з контролем. Порівняння, що призводили до р«е0,05, вважались статистично значущими.

Фіг1 показує залежність від аерозолізованої інгібуючої дози, оОМеРИОРА-М відповідної реакції, що спостерігається в чутливих до Авсагіз зишт овець, провокованих через 2 години після введення дози. Ліві графіки демонструють зміну питомого легеневого опору ЗНАНІ, СМ НегО/сек. Праві графіки показують сприйнятливість дихальних шляхів до інгальованого карбахолу (відношення РСаоо перед/постпровокаційне значення) визначену через 24 години після провокації. ОМмМеРШРА-М при дозах 0,01 і 0,0Змг не інгібіювали ранню або пізню реакцію дихальних шляхів або не змінювали гіпервразливість до карбахолу через 24 години після провокації алергеном. Дози 0,1, 1 і Змг інгібують ранню реакцію дихальних шляхів і максимально інгібіювали пізню реакцію дихальних шляхів. Ці дози також інгібіювали гіпервразливість до карбахолу через 24 години після провокації алергеном. Статистичний аналіз цих даних поданий у Таблиці 2.

Таблиця 2

РР | ЇЇ 77777171 | 712 | 585:50/62 | 4855069 | 0495003 77717171. 003 | вюНМ5 | 2 | 1062-31 | 398023 | 043000 11111111 роло | вЮНМ5 | 4 | 25480747 | бля | лив 11111111 0о | ЕОНРВВ | 2 | 245070 | ботядва" | поБОМИ" 77711711 800 | вюНнРВВ | 2 | 2475062 | ва | їо70о8"

М5 - звичайний фізіологічний розчин "вр«0,05 у порівнянні з РВ5-контролем, односторонній дисперсійний аналіз із наступним тестом Даннета для множинного порівняння з контрольною групою. Показує статистично значуще зменшення ЕАВ або ГАВ у порівнянні з контрольною групою з введенням РВ5.

Овець, від природи чутливих до Авсагіз звишит, провокували аерозолем алергену Авсаїгіз зиит через 2 години після введення аерозолю омеРИРА-У у зазначених дозах або через 24 години після останньої дози повторюваного щоденного введення протягом 4 днів підпорогової дози ОМеРИОРА-М або еквівалентної кількості РВ5. Механіку легеневого подиху, що описується як зміна питомого опору дихальних шляхів від базового значення до проведення дослідження, вимірюють протягом 8 годин після алергічної провокації.

Ранню Реакцію Дихальних Шляхів (0-4 часу, ЕАН) і Пізню Реакцію Дихальних Шляхів (4-8 годин, І АВ) виражають у вигляді середньої площі під кривою залежності Д Питомого Легеневого Опору від часу 5 5. є. т. (стандартна помилка середнього). Опір дихальних шляхів інгсальованому карбахолу визначали до початку досліджень і через 24 години після провокації алергеном. Сприйнятливість дихальних шляхів приводиться у вигляді відношення РС400 (кількість карбахолу, необхідна для підвищення опору на 40095) при порівнянні пред-провокаційної і постпровокаційної величин.

Подразлива дія разової дози

Жодна з доз ОмМеРИРА-У, що використовувалися в описаному вище дослідженні, не справила подразливої дії, про що свідчить відсутність зміни опору дихальних шляхів у порівнянні з базовим опором після провокації алергеном Азсагіз зишт. Це показано на Ффіг.2.

Вивчення повторюваних доз

На Фіг.3 видно, що доза оМеРИРА-М 0,0Змг, що, як було показано, не є ефективною, коли використовується в якості разової дози при екстреному попередньому введенні, проте, має захисну дію, якщо її вводити один раз на день протягом 4 днів, коли провокацію антигеном показують, що цей ефект спостерігався при використанні двох різноманітних препаратів. Гіпервразливість до карбахолу після додаткових 24 годин також інгібіювалась максимально, як показано на верхньому і нижньому правих графіках

Фіг.3. Захисна дія омеРОРА-М була значною проти ЕАНВ і ГАА і щодо гіпервразливості до карбахолу.

Кількісний аналіз поданий у Таблиці 3.

Результати даного дослідження показують, що разове попереднє введення невеличкої молекули інгібітору

МІ А-4, оМеРИОРА-М, за допомогою аерозолю, може захищати індуковані алергеном ранні і пізні реакції дихальних шляхів і від індукованої після провокації алергеном гіпервразливості дихальних шляхів (АНВ) на моделі алергічних овець. Ніякої подразливої дії на дихальні шляхи не спостерігалося при введенні будь-якої із доз ОМеРИРА-М, що подаються у вигляді разового попереднього введення. Результати показали також, що ефективна доза омеРОРА-М може бути зменшена за рахунок багатократних опрацювань. Сумарно ці дані дають вагоме свідчення того, що адгезія МІ А-4 грає ключову роль у патофізіологічних показниках (ГАК і АНВ) тривалих запальних подій, що ініційованих в дихальних шляхах алергічних овець після провокації алергеном.

Таблиця З дози і РВ5 | | 77777777 | 8 | 4335081 | 4963040 | 0385003 КфЬ( 77777777 1003 | тів м5 | 4 | 14050357 | 0о2юв | Тоаоол х- р-0,05 у порівнянні з РВ5-контролем, односторонній дисперсійний аналіз, із наступним тестом Даннета для множинного порівняння з контрольною групою. Показує статистично значуще зменшення ЕАК або АВ або значне збільшення відношення РС400 в порівнянні з контрольною групою з використанням РВ5.

Овець, від природи чутливих до Авсаїгіз зишт, провокували аерозолем алергену Авсагіз зиит через 24 години після введення останньої дози при повторюваному щоденному введенні протягом 4 днів підпорогової дози оМеРИОРА-М або еквівалентної кількості РВ5. Механіку легеневого подиху, що описується як зміна питомого опору дихальних шляхів від базового значення до проведення дослідження, вимірювали протягом 8 годин після провокації алергеном. Ранню Реакцію Дихальних Шляхів (0-4 години, ЕАНВ) і Пізню Реакцію

Дихальних Шляхів (4-8 годин, АРК) виражають у вигляді середньої площі під кривою залежності Питомого

Легеневого Опору від часу ж 5. є. т. Опір дихальних шляхів до інгальованого карбахолу визначався до ініціювання дослідження і через 24 години після провокації алергеном. Сприйнятливість дихальних шляхів приводиться у вигляді відношення РСдзоо (кількість карбахолу, необхідна для підвищення опору на 40095) при порівнянні значень до провокації і після провокації.

Приклад 3. Активність на моделях алергічної реакції уповільненого типу

Дослідження еритроцитів овець

В усіх досвідах використовували вільних від специфічних патогенів самок мишей Ват Б/с у віці 8-10 тижнів, отриманих від даскхоп І арх. Тваринам дають їжу і воду без обмежень. Еритроцити овець (5АВС) у розчині

Елсевера (АІвемег5 в5оЇшШіоп) від тих самих овець одержували щотижня від Спапев Вімег Рпапт. бегмісе5 (бБошіпргдде, МА). АВС пелетизували центрифугуванням при 10009 протягом 10 хвилин при 4?"С, і будь-яку видиму лейкоцитну плівку видаляли. Клітини потім промивали у фізіологічному розчині. Пелети клітин повторно суспендували у фізіологічному розчині і підраховувалися з використанням гемоцитометра. Клітини розводились фосфатно-сольовим буфером (РВ5) до концентрації 2х108 5ВВС на мл. На 0 день мишей сенсибілізували підшкірною ін'єкцією 2х107 5А8ВС у 100мкл РВ5. На 5-ий день готували 5В8ВС як описано вище, але розбавляли в РВ5 до кінцевої концентрації 4х10 5АВС/мл. З цього препарату 25мкл ін'єкували підшкірно в подушечку правої задньої лапи.

Для введення до кишечнику сполуки, ОмМеРОРА-М (Партія Ж2770-029) перетворювався в готову форму препарату в розчиннику - 6095 РЕС400 у 0,02мМ ТВІ5 - до вихідної концентрації 5мг/мл. Відповідні розведення готували в розчиннику РЕС/ТВІ5 і вводили ентерально в обсязі 10Омкл. анти-мі А-4 антитіло (РБ/2) розводили фізіологічним розчином у концентрації 4,3 мг/кг ії вводили внутрішньоочеревинно в 100мкл. Всі опрацювання проводилися відразу ж після провокації овець АВС.

Набрякання непровокованої контрольної (лівої) і провокованої (правої) подушечок задніх лап вимірювали з використанням натяжного товщиномера (Мішоуо, Модель 304-196, Буег, І апсазіег, РА) через 20 годин після провокації подушечки лапи. Отримані дані подають у вигляді зміни товщини подушечки, визначеного шляхом вирахування товщини лівої задньої лапи з товщини правої задньої лапи. Зміни товщини подушечок порівнювали з використанням двостороннього критерію Ст'юдента.

Антитіло антнН-міІ А-4 РБ/2 у дозі 4,Змг/кг (внутрішньоочеревинно) інгібіювало набрякання приблизно на 3095, тоді як ОМеРОРА-У, введений ентерально в дозі 20мг/кг, на даній моделі не виявляв ніякої дії (дані не подані). Вивчалася ефективність ОМмМеРИОРА-МУ, що вводилась в дозі 20мг/кг через кишечник, на ОТН моделі,

індукованій 5АВС, на мишах, і при цьому не спостерігалося ніякої ефективності.

Приклад 4. Активність на моделях гіперчутливості уповільненого типу ("РТН)

Модель контактної гіперчутливості

В усіх дослідженнях використовували вільних від вірусів самок мишей Ваїр/с (Часкеоп І арогаюгіез, Ваг

Нарюбог, МЕ), що утримувалися по чотирьох на клітину в клітинах мікроізолятора в пристрої для тварин, вільних від біогенних вірусів, Її що отримували для мишей без обмежень корм і питну воду Мишей анестезували сумішшю кетамін:'ксилазин (90:10мг/кг, внутрішньоочеревинно). Ділянка черевної шкіри площею Зсм?, мечоподібна у напрямку до лобка, відчинялась, ретельним голінням шерсті, і шкіру протирали 7095-ним етанолом. На оголену черевну шкіру рівномірно наносився 25мкл обсяг 0,595 ОМЕВ у розчиннику, що складається з ацетону й оливкової олії, 4:106./06. Шкіру злегка дряпали кінчиком піпетки, щоб спровокувати невеличке запалення. Мишей вкладали горілиць в їх клітинах і давали їм відійти від анестезії. Через 24 години після початкової сенсибілізації мишей знову сенсибілізували 25мкл 0,5956-ного ОМЕВ у розчиннику на тій же ділянці черевної шкіри, після чого знову злегка дряпали кінчиком піпетки. Другу сенсибілізацію проводили на мишах без анестезії. На 5-ий день (приблизно через 120 годин після початкової сенсибілізації) субподразливу дозу сенсибілізуючої речовини, (0,296 ОМЕВ розчиннику ацетон:оливкова олія, 4:106./06. використовували для провокації імунної реакції. Мишей анестезували сумішшю кетамін:ксилазин (90:10мг/кг, внутрішньочеревинно) і по 1Омкл 0,296-ного розчину ОМЕВ завдавали на тильну поверхню лівого вуха. На правому вусі проводили аналогічне нанесення розчинника ацетон:оливкова олія, 4:106./06.. Протягом наступних 24 годин розвивалася двохфазна реакція набрякання вуха, як показано на Ффіг.4. Через 24 години після провокації мишей знову анестезували сумішшю кетамін'ксилазин і вимірювали товщину обох вух із використанням інженерного мікрометра з точністю до 10'7дм (2,54хХ10 см).

Сполуку (100мкл) або відповідний розчинник (Диметилсульфоксид, ДМСО) в ізотонічному фосфатно- сольовому буферному розчині (РВ5) (100мкл), вводили перорально за допомогою шлункового зонда через 4 години після провокації імунної реакції на 5-ий день. Для кожного проведеного опрацювання використовували групи з 8 мишей. оМеРИРА-М (Партія Ме044-076) розчиняли в дистильованій воді з додаванням 0,595 натрій- фосфатного буфера, рн-8,8, і 395 ДМСО. Реакцію набухання вуха в кожної з мишей обчисляли як різницю між товщиною вуха після опрацювання розчинником і товщиною вуха після провокації ОМЕВ через 24 години після провокації. Звичайно індуковане ОМЕВ набрякання вуха складало 65-75хХ10"дм (165-191х10"см). Інгібіювання реакції набрякання вуха визначали шляхом порівняння обробленої групи тварин із контрольною групою, обробленої розчинником. Статистичну значимість різниці серед оброблених груп оцінювали з використанням одностороннього дисперсійного аналізу з наступним тестом Даннета для множинних порівнянь із контрольною групою (бузіаї, 5РУО5 Іпс.) із використанням ре«0,05. Отримані розміри виражалися у вигляді середніх значень ї стандартна помилка.

На Ффіг.4 подано порівняння реакцій набрякання вуха, що були виміряні через 24 години після провокації

ОМЕВ на мишах, що одержували розчинник (ДМСО, РВ5), сполука позитивного контролю (що дається в дозі 0,ОЗмкг/кг) або 0,03 або 0,Змг/кг омеРОРА-М, що вводиться ентерально (через тонку кишку) через 4 годину після провокації ОМЕВ (верхній графік). Відсоток інгібіювання, викликаного опрацюванням, поданий на нижньому графіку. Обидві дози ОМмеРИРА-У значно інгібіювали реакцію набрякання вуха до ступеня, близького до ступеня, що виявляється позитивною контрольною сполукою.

Разові тонкокишкові дози в 0,03 або 0,Змг/кг омеРИШРА-М, що даються через 4 години після провокації

ОМЕВ, можуть значно інгібіювать реакцію набрякання вуха на моделі контактної алергічної реакції на мишах.

Приклад 5. Біохімія 5.1. Рецепторна спорідненість омеРИОРА-М, виміряна з використанням кон'югату МСАМ-Ід із лужною фосфатазою при проведенні оцінки прямого зв'язування (ОВА) із МСАМ-1ІД.

МСАМ-Ід одержували й очищали відповідно з опублікованими даними (Чакиромугкі А. єї аї. СеїЇ Аапевіоп апа Соттипісайоп 3, 131-142, 1995). Кон'югацію з кишковою лужною фосфатазою (АР) плоду значної рогатої худоби з метою розщеплення хромогенного субстрату проводили відповідно до публікації І оБь В. В. еї аї.Сеї

Аапезіоп апа Соттипісайоп 3, 385-397, 1995. Зв'язування з МІ А-4 оцінювали на лінії Т-клітин людини, Удигкаї (с4д81). На поверхні цих клітин при ТМММ Мп"? МСАМ-Ід-АР і омеРИРА-М конкурували за зв'язування з с4рД1.

При оцінці реакції прямого зв'язування з МСАМ-Ід омеРИОРА-М конкурує з МСАМ-ІД-АР за зв'язування з клітинами ЧигКкаї при ТМММ Мпсі В залежності від концентрації з ІСзо 8-1 н (п-:9). Отримані результати подані в

Таблиці 4. 5.2. Рецепторна спорідненість ОМеРШОРА-М, вимірювана з використанням кон'югату МСАМ-Ід із лужною фосфатазою методом аналізу очищений МІ А-4 білок/білок.

МІ А-4 очищався від екстракту детергенту високоекспресуючого підклону, що с«4-трансфекційованих К562 клітин за допомогою афінної хроматографії з антитілами і іммобілізувався в лунках мікротитровального планшета для проведення аналізу конкурентного зв'язування білок/білок. МСАМ-ІД-АР зв'язували з планшетом, покритим очищеними МІ А-4, у відсутності або в присутності ОМеРОРА-М (Партія 22) і 1МММ Мпсі.

Планшети зчитувалися при довжині хвилі 405нм, і дані аналізувалися з використанням програми бойМах у. 2.32.

Зв'язування кон'югату МСАМ-Ід з очищеним МІ А-4 блокувалося цілком специфічним нейтралізуючим моноклональним антитілом анти-а4 (НР 1/2). Два значення ІСво, отримані для ОМмеРОРА-М при приведенні аналізу МІ А-4 білок/білок, подані в Таблиці 4, як і значення ІСзо, отримані на клітинах диКкаї при оцінці конкурентного зв'язування з МУСАМ-1Ід-АР і при оцінці адгезії С51 клітин. 5.3. Рецепторна спорідненість ОМеРИРА-У, оцінена в аналізі адгезії клітин С5-1. в. Адгезія клітин диїКкаї до кон'югату С51/В5А

Пептид МНео-цистеїн-тирозин- С5-1 синтезують і конденсують із ВБА-5ЗМОС (5МОС являє собою гетеробіфункціональний кросс-лінкер, що реагує з вільними аміно-групами на бичачому сироватковому альбуміні (В 5А) і одним цистеїном синтетичного пептиду) при співвідношенні С51/В5А 10:1. Лунки планшета покривають протягом ночі 100мкл кон'югату, розведеного до кінцевої концентрації їмкг/мл. Наступного дня лунки блокують В5А у РВ5 протягом 1 години і потім промивають три рази.

Лінію Т-клітин людини, диїКкаї, мітять за допомогою 2мкМ флуоресцентного барвника ВСЕСЕ-АМ (2",7"-біс- (2-карбоксиетил)-5- і -6)-карбоксифлуоресцеінацетоксиметиловий ефір) (МоІесшаг Ргобез Іпс., Еидепе,

Огедоп; каталог ЩВ-1150), що інтерналізується і деетерифіціюється, уловлюючи в такий спосіб барвник всередину живих клітин. Клітини Ушкаї (1х10 клітин/лунку) в буфері, що містить ТМММ Мп", добавляють до покритих планшетів в присутності послідовних триразових розведень інгібітору. Кожну концентрацію оцінюють двічі. Після 30 хвилин перебування при кімнатній температурі планшети перевертають і промивають три рази або доти, доки не буде клітин, прикріплених до контрольних лунок, покритим тільки В5А. С5І-прикріплені клітини визначають кількісно у флуоресцентному планшет-рідері Суїюйног із використанням довжини хвилі порушення 485нм і емісійної довжини хвилі 53Онм.

Клітини, що прикріпилися до С51/В5А у відсутності сполуки, служать в якості контролю з інгібіюванням 095, тоді як клітини, що прикріпилися до одного В5А, служать в якості контролю з 10095-ним інгібіюванням.

Значення ІСво обчисляють із використанням програми ОеїГадгарни, версія 5.

Адгезія мічених клітин Ушикаї при Мп?" цілком блокується ЕЮОТА і нейтралізуючим анти-х4р1, тАв (моноклональне антитіло) НР 1/2, указуючи на те, що зв'язування є специфічним. У Таблиці 4 подана активність ОМеРИРА-М в аналізі адгезії до СО1/БСА, а також результати оцінки реакції зв'язування.

ОМеРОРА-М є сильним антагоністом МІ А-4 у буферах, що містять Мп». Він у 80 разів більш активний при оцінці при Мп?" на ізольованому МІ А-4, ніж на клітинах дикаї при оцінці реакції зв'язування. ОМеРОРА-М є функціональним антагоністом, що виявляється за його спроможністю в залежності від дози і цілком блокувати адгезію клітин дшикаї до С51. Абсолютні значення при оцінці адгезії є більшими, ніж значення, що спостерігаються при оцінці реакції зв'язування. Це може бути наслідком багатовалентної природи адгезії. В усіх форматах досліджень інгібіювання зв'язування за допомогою ЕОТА і НР 1/2 ілюструє специфічне зв'язування з МІ А-4.

Таблиця 4. Рецепторна спорідненість оМеРШОРА-М при їмММ Мпсі», виміряна в аналізі реакції конкурентного зв'язування з МСАМ-Ід, адгезії клітин С51 і в аналізі очищений МІ А-4 білок/білок. -Ш- 252535 ШЕ помилка (нм

Клітини диткаї

С51

Очищений МІ А-4 ол валом) 5.4. Специфічність інгібуючої дії ОомМеРОРА-М а) Специфічність ОМеРИРА-М, оцінювана з використанням УУ-клітин в аналізі реакції прямого зв'язування з МСАМ-19 і адгезії до С51.

Зв'язування з о487 оцінюють на УМ-клітинах при Мп". В аналізі зв'язування МСАМ-Ід і омеРОРА-М конкурують за зв'язування з «4087 на ОУ-клітинах (див. розділ 4.1.1. для протоколу аналізу). При дослідженні клітинної адгезії ОмМеРОРА-М випробують його на спроможність блокувати зв'язування /МУ-клітин (04087) із кон'югатом С51/В5А. оМеРИРА-М не блокує с«4р7-зв'язування з МСАМ-Ід або С51/В5А. Ма анти-р7, Рір27 (Рнагтіподеп), інгібує ці взаємодії, однозначно показуючи, що зв'язування є «4р7-специфічним. Отже, ОМмМеРОРА-М є специфічним інгібітором для МІ А-4. Отримані результати подані в Таблиці 5. б) Специфічність ОМмМеРШИРА-У, вивчена з використанням адгезії клітин К562 до лунок, покритим Еп-120.

Неопрацьовані 9б-ти лункові полістирольні планшети з плоским дном покривають 5мкг/мл Еп-120 протягом ночі при 4"С. Планшети промивають двічі фосфатно-сольовим буферним розчином (РВБ) і блокують 195 бичачим сироватковим альбуміном (В5А) протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшети промивають двічі ТВ5-буфером, що містить їмММ Мапсі» (буфер для дослідження). Клітини К562 мітять за допомогою 2мкМ флуоресцентного барвника, ВСЕСЕ-АМ, (див. розділ 4.1.3) і зв'язують із планшетом протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Планшети перевертають і промивають три рази, і прикріплені клітини кількісно визначають у флуоресцентному планшет-рідері Суїюйног із використанням збудливої довжини хвилі 485нм і емісійної довжини хвилі 53Онм.

Адгезія клітин К562 до Еп-120 цілком блокується нейтралізуючим антитілом анти-с5, ПАТ (РНаптіпдеп), вказуючи на специфічне зв'язування через МІ А-5. Інгібіювання зв'язування клітин К562 із фрагментами ЕпігОК за допомогою ОМеРИРА-М в дозах 100мкМ було відсутнє. Див. нижче Таблицю 5. в) Оцінка реакції агрегації, проведена з метою визначення специфічності ОмМеРШРА-М.

Методи

Активність проти оріюШа оцінюють за допомогою стандартної агрегометрії тромбоцитів із використанням збагаченої тромбоцитами плазми. АОР використовують для ініціювання агрегації при плазми, де Са"? і Мд"? є основними двовалентними катіонами. У якості позитивного контролю використовують СВОООР при 10Омкг/мол.

Результати оМеРИРА-М випробують в трьох дозах 1, 10 і 100мкМ. Він не інгібує агрегацію тромбоцитів, індуковану

АОРР, у жодній із доз. Отримані результати приведені в Таблиці 5. ОМеРШОРА-М є високо (210000 разів) специфічним для МІ А-4. Він не має помітної активності (» 100мкМ) у відношенні родинних інтегринів, «4р7 і

МІ А-5 або по відношенню до рЗ-інтегрину, оріїріПа.

Таблиця 5

Інгібуюча активність ОМеРИОРА-У, виміряна в аналізі конкурентного зв'язування з «4087 і МСАМ-1І9д, в аналізі адгезії «407 і МІ А-5 і при вивченні агрегації тромбоцитів

МСАМ-1д аналіз прямого К Інгібіювання 395 при 100мкМ

Приклад 6. Оцінка ОМеРОРА-М для індукції І ІВ5 6.1. Виміри на клітинах Уигкаї із використанням антитіла

ІІВ85 9ЕС7 а) Індукцію ГІВ5 антагоністами «481 оцінюють іп міо із використанням аналізу ЕАС5. Клітини

Ушкаї (2х107лунка) попередньо інкубують при 37"С протягом 20 хвилин із фізіологічним розчином із буфером

ТАУВ, що містить 2 МММ МоСЬ (Ма2-ТВ5), окремо або з послідовними розведеннями випробуваних сполук.

Зразки переносять на крижану баню і доповнюють антитілом ГІВ5, 9ЕС7, із кінцевою концентрацією 10мкг/мол. Клітини промивають двічі за допомогою Мад"2-ТВ5 і знову суспендують при розведенні 1:200 Ід цапа проти пацюків, кон'югованого з РІТС (ізотіоцианат флуоресцеїну) у Ма"2-ТВ5, і витримують протягом 30 хвилин при 4"С. Клітини промивають двічі і знову суспендують у Ма -ТВ5. Середню інтенсивність флуоресценції (МЕЇ) визначають за допомогою аналізу БАС (Весіоп Оіскіпвоп РАСосап). Результати виражені у вигляді МЕ. Дані аналізують із використанням програм Місгозоїйї Ехеї! м5.0 і Сенадгарн м4.0.

На Фіг.5 показано, що омеРИРА-М індукує відкриття ГІВ5 епитопу в порівнянні з 2мМ Мао"? -буфера (Графік В). Індукція є концентраційно-залежною і аналогічна за розміром індукції що спостерігається у випадку 1мМ Мп"? (Графік А). Пропускання І ІВ5 антитіла і детекції антитіла, або пропускання тільки детекції антитіла усуває лікування (Графік В). ЕОзо реакції складає -20нМ.

Висновок

Подані дані показують, що оМеРИОРА-М індукує те ж саме конформаційну зміну в МІ А-4, що спостерігається у випадку природних лігандів. Розміри для І ІВ5 звичайно потрапляють в інтервал, визначений методами аналізу зв'язування й адгезії, що для ОМеРИРА-М рівні відповідно ЗНМ і 22нМ. 6.2. Багатовидовий рецепторний скринінг а) Рецепторна спорідненість оМеРИРА-М, виміряна при оцінці прямого зв'язування МСАМ-Їд із використанням кон'югату МСАМ-Ід із лужною фосфатазою і лімфоцитів периферичної крові або клітин селезінки, отриманих від різноманітних виглядів.

Лімфоцити периферичної крові (РВІ) виділяють із периферичної крові людини, овець і собак, використовуючи методи, описані для РВІ. овець (Абгапат М.М. еї аї. 9. Сіїп. Іпмезі. 93:776-787, 1994). Аналіз конкурентного зв'язування МСАМ-ІД-АР використовують для порівняння зв'язування оМеРИОРА-М із цими різноманітними типами клітин.

Значення ІС50О, вимірювані для ОомеРШРА-М на лімфоцитах периферичної крові або на клітинах селезінки, отриманих від різноманітних виглядів, при Мп", подані в Таблиці 6. При Мп"? оМеРИРА-М інгібує з аналогічними значеннями ІСзо зв'язування МСАМ-Ід із лімфоцитами людини, пацюків, собак, овець і мишей.

Відсутні свідчення видової специфічності. Це узгоджується з високим ступенем зберігання послідовності, що спостерігається серед видів для МІ А-4 і його природних лігандів, С51 ії МСАМ.

Таблиця 6

Рецепторна спорідненість ОМеРИРА-У, виміряна в аналізі конкурентного зв'язування МСАМ-1Ід із використанням кон'югату МСАМ-1Ід із лужною фосфатазою і лімфоцитів периферичної крові або клітин селезінки, від різноманітних видів

Вид, | Джерело | Двовалентнийкатон, | ІСво(нМ) -ЗзКХ

Миша | //// Спленоцитиї/ | 7 Ми? | 42(п-71

Приклад 7. Рецепторна кінетика ОМеРОРА-М 7.1. Конкурентний аналіз із використанням в якості зонда ЗН-відомого інгібітору Клітини Уиїкаї витримують у середовищі АРМІ-1640 плюс 1095 сироватки плоду значної рогатої худоби при 37"С у термостаті для тканинних культур. Для вивчення реакції зв'язування клітини пелетизують центрифугуванням, промивають два рази ТВ5 (50мМ Ттгівз-НСЇ, 150мМ Масі, 0,195 бичачого сироваткового альбуміну, 24М глюкози, 10ММ НЕРЕБ, рНІ,4), суспендують при концентрації приблизно 2х109 клітин/мл у ТВ5 і підраховують із використанням гемоцитометра Меибранег. Клітини додатково розбавляють до концентрації 1,5х10б/мл в зазначених буферах і піддають специфічному опрацюванню, визначеному для кожного дослідження. Клітини потім пелетизують центрифугуванням знову суспендують у 100мкл буфера для аналізу і переносять у сцинтиляційну судину, що містить 2,9мл 5сіпіїМегзе ІІ (Бізпег Зсієпійіс). Радіоактивність, пов'язану з клітинами, кількісно визначають за допомогою сцинтиляційного підрахунку. Імпульси, пов'язані в цих умовах, визначають інтегрин, який не зайнятий випробуваною сполукою і, отже, вільний для сполучення з ЗН-відомим інгібітором. Всі дослідження проведені в покритих кремнієм пробірках (еррепаогї Шшре) ємністю 1,5мл із стандартним обсягом зразку Тмл.

Неспецифічне зв'язування ЗН-відомого інгібітору з клітинам (фон) вимірюють шляхом визначення інгібітору, пов'язаного у відсутності іона металу. Пов'язані специфічні імпульси обчисляють шляхом вирахування неспецифічних імпульсів із загальної кількості пов'язаних імпульсів.

Проведено ряд конкурентних досліджень для підтвердження того, що оМеРИОРА-М і відомий інгібітор конкурують за той самий сайт на МІ А-4. По-перше, Н-відомий інгібітор змішують із еквімолярною кількістю оМеРИРА-М, 10-ти кратним надлишком і з 100 кратним надлишком, інкубують із клітинами диїкаї і оцінюють спроможність інгібітору, що не містить радіоактивності, (холодного інгібітору) конкурувати за зв'язування з відомим інгібітором. Опрацювання за допомогою ОМеРИШРА-М дають залежне від дози інгібіювання зв'язування

ЗН-відомого інгібітору. Концентрація ОМеРОРА-У, що необхідна для конкурування зі зв'язуванням ЗН-відомого інгібітору, у 10 разів більше, ніж необхідно, коли інгібітор, що не містить радіоактивності, використовується в якості конкурента, що узгодиться з його більш низькою спорідненістю до Мп-"-активованого МІ А-4. По-друге,

Мап2-- активовані клітини дикаї опрацьовують Н-відомим інгібітором для того, щоб спочатку зайняти МІ А-4 радіоактивним зондом і потім добавляють надлишок холодного (тобто такого, що не містить радіоактивності) оМеРИРА-М. Наступні опрацювання надлишком, що не містить радіоактивності ОМмМеРОРА-М або відомим інгібітором не різняться за їх спроможністю витискувати радіоактивний зонд По-третє, Мп"- активовані клітини

Уцікаї опрацьовують кількостями, що насичують, омеРИОРА-М і вимірюють швидкість, за якої оМеРОРА-М дисоціює. На відміну від тривалого періоду напіврозпаду відомого інгібітору для Мп-"-активованого МІ А-4, оМеРИРА-М легко визволяється з омеРИРА-МУ-МІ А-4 із періодом напіврозпаду (нг) менш ніж 10 хвилин.

Велике розходження в її» для оМеРИРА-М і відомого інгібітору означає, що більш низька спорідненість оМеРИРА-М до МІ А-4 є результатом його більш високої швидкості виведення.

Дані по дисоціації показують, що зв'язування ОМеРИРА-М із МІ А-4 залежить у високому ступені від стану активації МІ А-4, і що він виявляє ту ж саму селективність для активації, що спостерігається у випадку відомого інгібітору. Як і у випадку Мп""-активованих МІ А-4, час (т дисоціації ОМеРОРА-М із Мд"-активованих МІ А-4 складає менше 10 хвилин, найменшу тимчасову точку, що може бути визначена при конкурентному форматі. З іншого боку, при Мд2:" плюс активуюче антитіло, Т52/16, 2 продовжується (до 20 хвилин). Всі можливі стани активації не оцінювалися докладно, проте розроблений простий скринінг, що може легко проясняти розходження. У цьому дослідженні фіксовані концентрації ОМеРОРА-М (1ОнМ) змішують із 5нМ ЗН-відомого інгібітору і проводять зв'язування в цих умовах при різних станах активації. Якщо омеРОРА-М має аномально висока або низька спорідненість із МІ А-4, це можна визначити за різницею в кількості ЗН-відомого інгібітору.

Розходження в процентному розмірі пов'язаного при різноманітних умовах активації ЗН-відомого інгібітору наближаються до того, що можна було б пророчити на підставі відомих властивостей інгібітору.

Дослідження реакції зв'язування підтверджують, що оМеРИРА-М конкурує з відомим інгібітором за зв'язування з МІ А-4 у концентраціях, що узгоджуються з його спорідненістю, і показують, що дві сполуки конкурують за той же самий сайт на інтегрині. Подібність ОМеРИОРА-М і відомого інгібітору при зв'язуванні при різноманітних станах активації МІ А-4, означає, що механізм зв'язування є аналогічним. 7.2. Вивчення ОМмМеРИРА-МУ у Рапіабз і в скринінгах Сегер Проведені випробування ОМеРОРА-М у Рапіарв

Ргойіпд5осгееп, Оізсомегузсгеєп і за Імуноскринінговим графіком радіолігандних, ферментних і функціональних аналізів, а також за графіком мембранних рецепторів Сегер. Не спостерігається ніякої значної активності оМеРИРА-М при 10мкМ у будь-якому аналізі, включаючи аналіз МК! рецептора, у відношенні якого відомі інгібітори виявляють деяку активність.

За даними Сегер повідомляється також що оМеРИОРА-М не спричиняє ніякої інгібуючої дії на АСЕ протеазу людини. Джерелом АСЕ-протеаз є ендотеліальні клітини людини (НОМЕС). ЗН-НОС, доданий до

НОМЕС, перетворюється в ЗН-гіпурову кислоту і гліцилгліцин за допомогою АСЕ. Каптоприл, сильний АСЕ- інгібітор, блокує це перетворення з ІСзо 990пМ, тоді як омеРИРА-М в концентрації 10мкМ не блокує.

Фізичні властивості оМеРИРА-М являє собою від білого до не зовсім білого кольору кристалічний порошок. Він є розчинним в

ДМСО, і має розчинність у воді 0,120мг/мол. Поведінка ОМеРИРА-М при нагріванні, вивчена за допомогою

Диференціальної Скануючої Калориметрії, (0550), термогравіметричного аналізу (ТОА) і мікроскопії в гарячому стані, показує, що матеріал плавиться приблизно при 160"С. Дані аналізу О5С і ТА приблизно при 1367 означають, що омеРИОРА-М втрачає летючі домішки, що, вірогідно, узгоджується з дегідратацією моногідрату.

Готова форма препарату

Препарат для розпилення

Вказівки щодо виробництва 100мл препарату для розпилення, що містить 5мг/мл оМеРИРА-У, подані нижче.

Приготувати 200мл вихідного буферного розчину в такий спосіб: 1. Зважити 0,286г Трометаміну (фармакопея США) у підхожому контейнері. 2. Зважити 1,676 г хлористого натрію (фармакопея США) у тому ж контейнері. 3. Додати 200мл води для ін'єкцій (фармакопея США). Змішати до одержання гомогенної суміші. 1. Зважити 0,500г оМмеРИРА-М у підхожому контейнері. 2. Додати 100мл буфера, приготовленого на стадії 1. 3. Змішати до одержання гомогенної суміші. 4. Профільтрувати стерильно в підхожий контейнер. 5. Герметично закрити підхожою кришкою. Типові властивості препарату: рН: 7.4, Осмотичний тиск: 290мОсмМ

Приклад 9. Визначення стабільності, методика ВЕЖХ

Колонка: 7ограхФ 58-С18, частки Змкм, 4,6х150мм

Захисна колонка: 7ограхФ 58-С18, частки 5мкм, 4,6х12,5мМмМ

Швидкість потоку: Тмл/хвил.

Температура колонки: 40"С

Температура автоматичного пробозабірника: 47

Рухлива фаза А: 0,195 (вага./об.) трифтороцтової кислоти (ТЕА) У воді

В: 0,195 (вага./об.) ТЕА у 9095 (об./об) ацетонітрилу, 1090 (об./об) води

Градієнт: Час (хвил.) до в 0-3 15 3-18 15-100 18-21 100 21-28 15

Вприск: 1Омкл 0,2мг/мл розчинів у Тгів/МасСі/вода (об'ємний проміжний продукт) або в 0,195 ТЕА/4595 ацетонітрилу (кінцевий продукт).

Визначення: УФ 254нм (основне) і 215нм

Контроль: оМмеРИРА-МУ, нагрітий у киплячій воді протягом 20 хвилин.

Попередні методи якісного визначення закінчені.

Стабільність лікарської сполуки

Не спостерігається ніякого розкладання в об'ємному проміжному продукті при збереженні протягом двох тижнів при таких умовах збереження: при 40"С в закритій судині; при 50"С в закритій судині; при 25"С і відносної вологості (ВВ) 6090; і при 40; і 08 7595. Чкрез чотири тижні один або два піки розкладання стають помітними при збереженні при 40 і 507С, але рівень піка кожної домішки ще складає менше 0,0295.

Стабільність розчину а) Препарат для розпилення, 5г/мл у Тгіз/масі, що зберігався при кімнатній температурі протягом двох місяців, має піки розкладання з раннім часом елюювання при загальному рівні 195 (при 254нМ) і 2-395 (при 215). р) Нагрівання препарату для розпилення в киплячій воді протягом 20 хвилин знижує чистоту від 99,995 до 98,790 при 254НМ і від 10095 до 93,695 при 215НМ. с) Розчин із концентрацією 0,2мг/мл у Тгіз/МасСі/вода при нейтральному значенні рН є стабільним при 2- 8"С, щонайменше, протягом тижня.

Для кваліфікованого в даній області спеціаліста очевидно, що різноманітні модифікації і зміни можуть бути проведені в заявленому винаході без відступу від суті й обсягу винаходу. Таким чином, припускається, що даний винахід охоплює модифікації і варіанти даного винаходу, за умови, що вони знаходяться в межах обсягу формули винаходу, що прикладається, і її еквівалентів.

с вне нн Й 4 й 32

І Вл ке т з З но ВВ 10 з ах Ши іі З, - 7 ія -Ща їй х ; - . х й зх ї те; А Е їв 1 з їх М: : ЧО ї їз Й ве

З арі ші й 12 5. ш ГО йо мг я

В Кі | у зктн-і Е і В вв нь Ло Зав х ; Бе оо хуя ТВ: " 5

Я в мя " Дунім 5 г: пери ровне: т и в х й. - в

Е Аж ті гЗ

Е - 9 К д з їх І са ВУ

І - . д вв Б і Ка К. й зе 1 т Ж фо тм 0 г 1 я нених ний я ут м . з о вро я з Щщ ж? 1 З. ролан 8. їх) ж сн сек фія 4 Е 4 12

Зм г 3 Кк 18 2 іх яв

КЯ В, - я в 1 і: роя т, Як в» Я І те дм 9 4 о) г 4 в ГУ

Час пісдх провокації усві,

ФИЖРА і:ях НИ в!

Я п Бахокозкачених й 1 НІ Пісхелривакан їй як 1 ре УЗ її 5 ше 5 Ж 5 ; Но щ Бк их 5 4 по 2-4 В г в. м

Е Й КУ

ІЗ м ве,

Е А х р Пр -

КЕ ко -КИ Н й 7 і. їх кети ши дае зм т ше -: і | щі ши ши ши ши ще: Ж х У в 17 Бе Я ї. й

ЩА нія я ден р рент пи

Авомів 001 005 п і з

ОМУРВОВАУУ Дюзасюгі

ФРАЗ

3 ши пи шк ве х 53

НЕ сен ВВ й щ Кз з а ши ОО ій ях ї що гамак :

Боу І ; ке БУ з : фонннндчннннй нон, ї ; шо 5 вав ше х й . ! Е

Е у ях В і і: й ЩЕ і. .

Ї | оба о Ж

Й як ч-.

Сл -о о 2 4 5 я

Часлігоя прожован ютаийх: Ту,

ФЕРУВА ЛЬ фігура 4А

Реакція розпухашня вуха я ще си Ї

ЕВ 4 ' ях ! . - дво | - . ще а і а 1

А й «в й

РАСТ. ЖКОНТ. ба оз оМерОрА-У (мг/кг внутрішньопог кової обробка фігура Б

Бач 90 інгібування ве -- ш т х ж і й ІЗ шо

Е шо о ї а | 4 й

КОНТ. 923 Й Іо оНеРОБА-УХ (кг перорад. БНО) «обробка

ФІГУРА 4 фура ЗА зо - 1-4 омевпра-у єї і 5 ІВ0-

Е

- що

В і с -

З

Бо

Ж кВ і чл а

З ко " Буферпий фо ооо 00 о пі 1 в оМеРОВА-У мкм) тв фігура 5Б г в аО» : ще - 8: ї 80 : хо 0-4 І у В оо о й з ож я ї я 5Б8 8 вв В в оо щ З я ко е

Ебь

ОО 000 омевувАетрмм)

ФІГУРА 5

Claims (23)

1. Сполука, що інгібує клітинну адгезію М сО,н 9 І ХК 6) п ММ о М сн, Н Н Н сн, ВІО 1591 і її фармацевтично прийнятні похідні, проліки або солі.

2. Сполука за п. 1, де проліки являють собою складний ефір.

З. Сполука за п. 2, де проліки - складний ефір одержують взаємодією сполуки ВІО 1591 з С1-Сісалкіловим спиртом з прямим або розгалуженим ланцюгом.

4. Сполука за п. 2, де проліки - складний ефір одержують взаємодією сполуки ВІО 1591 з Сі-Слалкіловим спиртом з прямим або розгалуженим ланцюгом.

5. Сполука за п. 2, де проліки - складний ефір представлені наступною формулою: М Сов ше «ХХ о. ММ о М сн, Н Н Н сн, де А являє собою Сі1-Сіоалкіл з прямим або розгалуженим ланцюгом.

6. Сполука за п. 5, де К являє собою Сі-Сазалкіл з прямим або розгалуженим ланцюгом.

7. Сполука за п. 1, що являє собою М сок а | о й 7 «ХХ о ММ о М сн, Н Н Н сн,

8. Фармацевтична композиція, що містить сполуку за п. 1 і фармацевтично прийнятний носій.

9. Фармацевтична композиція за п. 8, що додатково містить другий агент, вибраний з групи, яка включає кортикостероїди, бронходилятатори, антиастматичні агенти, протизапальні агенти, протиревматичні агенти, імунодепресанти, антиметаболіти, імуномодулятори, засоби проти псоріазу та антидіабетичні агенти.

10. Фармацевтична композиція за п. 8, що додатково містить одну або більше сполук інгібіторів клітинної адгезії.

11. Фармацевтична композиція за п. 10, в якій вказана одна або більше сполук інгібіторів клітинної адгезії являють собою інгібітори МІ А-4.

12. Фармацевтична композиція за п. 8, де сполука являє собою проліки - складний ефір.

13. Фармацевтична композиція, що містить сполуку, яка інгібує клітинну адгезію, що являє собою М СОН в ММ о М сн, Н Н Н сн, ВІО 1591 або її сіль і фармацевтично прийнятний носій.

14. Спосіб запобігання, інгібування або придушення клітинної адгезії у ссавців, при якому проводять стадію введення зазначеному ссавцю ефективної кількості фармацевтичної композиції за будь-яким з пп. 2 або 13.

15. Спосіб за п. 14, в якому зазначений засіб використовують для запобігання, інгібування або придушення запалення.

16. Спосіб лікування астми, алергічного риніту, розсіяного склерозу, атеросклерозу, запального захворювання кишечнику або множинної мієломи у ссавців, при якому вводять зазначеному ссавцю терапевтично ефективну кількість сполуки за п. 1 або фармацевтичну композицію за пунктами 2 або 13.

17. Спосіб лікування розсіяного склерозу у ссавців, при якому вводять зазначеному ссавцю терапевтично ефективну кількість сполуки за п. 1.

18. Спосіб лікування запальних захворювань кишечнику у ссавців, при якому вводять зазначеному ссавцю терапевтично ефективну кількість сполуки за п. 1.

19. Спосіб лікування, запобігання або полегшення симптомів астми, при якому вводять пацієнту, який страждає астмою, терапевтично ефективну кількість сполуки за п. 1.

20. Сполука за будь-яким з пунктів 1-7 як агент для виготовлення медикаменту для лікування захворювань, опосередкованих клітинною адгезією.

21. Сполука за пунктом 20 як активний агент для лікування захворювання, вибраного з групи, яка включає астму, розсіяний склероз, алергічний риніт, алергічний кон'юнктивіт, запальні легеневі захворювання, ревматоїдний артрит, множинну мієлому, септичний артрит, діабет І типу, відторгнення трансплантованих органів і запальне захворювання кишечнику.

22. Сполука за п. 21 як активний агент для лікування розсіяного склерозу.

23. Сполука за п. 21 як активний агент для лікування запального захворювання кишечнику.