UA69393C2 - Водорозчинний агрегат похідної інсуліну - Google Patents

Abstract

Описано розчинні у воді агрегати похідних інсуліну людини тривалої дії, в яких залишки В24-В30 В-ланцюга є послідовністю Phe-X-X-X-X-Х-Х, де кожен Х незалежно представляє будь-яку амінокислоту або делецію, і принаймні один Х є залишком лізину, -заміщеним -літохолевою кислотою або -літохолевою кислотою через глутаміловий, глутаміловий, β– або аспартиловий лінкер. Механізм подовження дії базується на частковому або повному утворенні розчинних агрегованих форм похідних, які відрізняються розміром, більшим за альдолазу (мол. маса -158 кДа) у заданій гель-фільтраційній системі.

Description

Опис винаходу

Даний винахід стосується розчинних у воді агрегатів похідних інсуліну людини тривалої дії, похідних 2 інсуліну людини, здатних утворювати такі агрегати, фармацевтичних композицій, що їх містять, та застосування таких агрегатів у лікуванні від діабету.

Діабет - загальна назва захворювань людей, що мають надмірну екскрецію сечі, яка спостерігається при діаресез теййивз та аіарей(ез іпзірідиз. ЮОіаребез теййШиз є метаболічним захворюванням, при якому більшою або меншою мірою втрачається здатність до утилізації глюкози. Близько 295 усіх людей страждають від діабету. 70 З часу впровадження інсуліну у 1920-х роках тривають постійні дослідження з метою вдосконалення лікування від даіаребез теїйШив. Щоб уникнути граничного рівня глікемії, хворі на діабет нерідко практикують багаторазову ін'єкційну терапію, коли інсулін вводять щоразу під час їжі. Багато хворих на діабет лікуються шляхом інсулінових ін'єкцій кілька разів на день у режимі, який включає одну-дві ін'єкції інсуліну тривалої дії на день для задоволення основної потреби разом з болюсними ін'єкціями швидкодіючого інсуліну для задоволення потреби, пов'язаної з їжею.

Інсулінові композиції тривалої дії спеціалістам добре відомі. Так, один з основних типів інсулінових композицій тривалої дії включає водні суспензії кристалів інсуліну або аморфного інсуліну для ін'єкцій.

Застосовувані у цих композиціях інсулінові сполуки, як правило, є протамінним інсуліном, цинковим інсуліном або протаміно-цинковим інсуліном.

Коли з інсуліну людини або тварин утворюють високомолекулярні форми, наприклад, у присутності 7п2-іонів, результатом є осадження у формі кристалів або аморфного продукту (Вгапде. Саїіепісв іпеціїпе, рр. 20-27. Зргіпдег Мепад 1987). Таким чином, при рН 7 і застосуванні 6 7п2"/гексамеру інсуліну свині результатом є майже повне осадження з розчину ((Сгапі Віоспет .. 126, 433-440. 1972). Найбільш розчинний з сч ов Запропонованих агрегатів складається з 4 гексамерних одиниць, що відповідає молекулярній масі близько 144кДа. У роботі Віопаей еїг аї. (Оіабесез 21 (Зиррі. 2). 492-505. 1972) описано розчинну одиницю інсуліну (о) свині у присутності 712" при рН 7 як гексамер. Ранні досліди з ультрацентрифугуванням при рН 2 показали, що інсуліновий димер, мол. маса 12кДа, є превалючим видом (УЧейгеу, Маїшге 197, 1104-1105, 1963; Оейгеу,

Віоспетівігу 5, 489-498. 1966; УОепПтеу, Віоспетівігу 5, 3820-3824. 1966). Фредерік (Егедегісд), працюючи при со рН 8 і застосовуючи 0,4-0,89о (маса/маса) 7п2" відносно інсуліну, виявив молекулярну масу 72кДа, що відповідає додекамерній структурі, а застосовуючи 195 7п - молекулярну масу близько 200-300кДа (Агсп. о

Віоспет Віорпуз. 65, 218-228, 1956). Широкий огляд подібних станів тваринного інсуліну можна знайти у роботі со

ВіІюпаеї! еї аї. (Аду. Протеїн Спет. 26, 297-330.1972).

З застосування суспензій інсуліну пов'язані певні недоліки. Так, для забезпечення точного дозування о частинки інсуліну мають бути суспендовані до гомогенного стану шляхом обережного збовтування перш, ніж Ге) взяти з ампули або виштовхнути з картриджа визначений об'єм суспензії. Крім того, для зберігання суспензій інсуліну, температура має підтримуватися у вужчих межах, ніж для розчинів інсуліну з метою уникнення утворення грудок або коагуляції.

Якщо раніше вважали, що протаміни є неімуногенними, то зараз з'ясувалося, що протаміни можуть бути « 70 імуногенними у людині, і що їх застосування з медичними цілями може призвести до утворення антитіл (Затиеї! 8 с еї аїЇ., 5іцдіез оп Ше іттиподепісйу ої ргоїатіпез іп Ппитапз ап ехрегітепіаІ апітаіє ру теапвз ої а й тісго-сотріетепі їїхайоп (еві. Сііп. Ехр. Іттипої. 33, рр. 252-260 (1978)). "» Крім того, було знайдено свідчення того, що протаміно-інсуліновий комплекс сам є імуногенним (Кигі еї аі., Сігсцайпуд дс оапіроду (0 ргоїатіпе іп райепів ігеаїед м/йй ргоїатіпе-іпзціпв. Оіарефіодіса 25. рр. 322-324 (1983)). Отже, деяким пацієнтам слід уникати застосування інсулінових композицій тривалої дії, що

Ге») містять протаміни.

Ще одним типом інсулінових композицій тривалої дії є розчини, що мають рівень рН нижче фізіологічного рН, о з яких інсулін виділяється завдяки підвищенню рівня рН при введенні розчину. Недолік полягає у тому, що со тверді частинки інсуліну діють як місцевий подразник, викликаючи запалення тканини у місці ін'єкції.

У МО 91/12817 (Момо Могаїзк А/5) описано розчинні інсулінові композиції тривалої дії, які включають о інсулінові комплекси кобальту (ПІ). Тривалість дії цих комплексів є посередньою, а біонакопичування є зниженим. с» Розчинні інсулінові похідні, що містять ліпофільні замісники, зв'язані з с-аміногрупою лізинового залишку у будь-якій з позицій від В26 до ВЗ30, було описано, наприклад, у УМО 95/07931 (Момо МогаїзкК А/5), МО 96/00107 (Момо МогаївкК А/5) та УМО 97/31022 (Момо МогаївкК А/5). Такі похідні мають тривалішу дію після підшкірної ін'єкції порівняно з розчинним інсуліном людини, і ця триваліша дія пояснюється оборотним зв'язуванням з альбуміном у підшкірному шарі, крові та периферичній тканині (Магкиззеп, Оіарефіодіа 39, 281-288. 1996; о Кигагпаїв. Віоспет .). 312. 725-731, 1995; КиггпаІв, У. РІпагт Зсіепсез 85. 304-308. 1996; апа М/півпднат. ко Віоспетівігу 36. 2826-2831. 1997).

Однак, нами було знайдено новий механізм подовження дії деяких розчинних похідних інсуліну. Цей новий бо механізм базується на частковому або повному утворенні розчинних агрегованих форм похідних, які відрізняються розміром, більшим за альдолазу (мол. маса - 158кДа) у визначеній гель-фільтраційній системі.

Фіг.1. Калібрувальна крива значень Кду порівняно з молекулярною масою у гель-фільтраційній системі з застосуванням колонки з Зерпасгу! 4 5-300 НК у водному нейтральному елюенті, що містив 125мММ хлориду натрію та 20мММ фосфату натрію при рН 7,4. Спостерігають близький лінійний взаємозв'язок між К ду та 65 логарифмом молекулярної маси. Стандарти показані у таблиці 1.

Фіг.2. Гель-фільтрація ГузВ 29(Ме о-карбоксигептадеканоїл) дев(В30) інсуліну людини, що має 0,2 та З

7п2"гексамер, відповідно, з застосуванням колонки Зерпасгу!?Ф 5-300 НЕ. у водному нейтральному елюенті, що містить 125ММ хлориду натрію та 20ММ фосфату натрію при рН 7,4, демонструє важливе значення 7п2" для утворення агрегатів для цієї похідної. Колонку 28х1см елюювали при швидкості 15мл/год. Похідні інсуліну вводили (200мкл) як еталонна композиція, що містить б00мкМ похідної, 0,2 або З 7п 2/6 молекул інсуліну, 20ММ масі, 16мМ фенолу, 16мМ м-крезолу, 7"ММ фосфату натрію при рН 7,5.

Фіг.3. Гель-фільтрація ГузВ 29(Меє о-карбоксигептадеканоїл) дев(В30) інсуліну людини, що має З 7п2/гексамер з застосуванням колонки Зерпасгу!Ф 5-300 НЕ у водному нейтральному елюенті, що містить ;мМ буферного розчину фосфату натрію, рН 7,5, 10мММ хлориду натрію, 1бмМ фенолу, 1бмМ м-крезолу та 70 1,690(маса/об'єм) гліцерину. Порівняння з Фіг.2 пояснює важливість концентрації хлориду натрію для утворення агрегатів цієї похідної.

Фіг.4. Схема синтезу спряжених лігандів.

Використаний нами вираз "похідна інсуліну" (та інші пов'язані з ним вирази) стосується інсуліну людини або його аналога, у якому принаймні один органічний замісник є зв'язаним з однією або кількома 79 амінокислотами.

Під використаним нами терміном "аналог інсуліну людини" (та іншими пов'язаними з ним виразами) розуміють інсулін людини, у якому одну або кілька амінокислот було видалено і/або заміщено іншою амінокислотою, включаючи амінокислоти, що не піддаються кодуванню, або інсулін людини, що містить додаткові амінокислоти, тобто, більше, ніж 51 амінокислоту.

В основі даного винаходу лежить виявлення нової агрегованої та розчинної форми похідних інсуліну. Нова розчинна агрегована форма похідних інсуліну повільно дисоціює після підшкірної ін'єкції що робить Її придатною для композицій інсуліну тривалої дії, і перевага полягає у тому, що ця композиція не містить осаду.

Перевагами розчинних композицій перед суспензіями є більша точність при дозуванні, уникнення необхідності струшування ампули або шприца, можливість застосування більш тонкої голки, що робить ін'єкцію не такою с 29 болючою, полегшення наповнення ампул або картриджей та уникнення необхідності використання кульки для Ге) суспендування осаду за відсутності повітря.

Якщо говорити точніше, то даний винахід стосується розчинного у воді агрегату похідних інсуліну, який характеризується тим, що має розмір, більший за альдолазу, в оптимальному варіанті - більший за феритин, як визначено зазначеною нами гель-фільтраційною системою. о

Агрегат згідно з винаходом в оптимальному варіанті має уявний об'єм, що відповідає значенню К ду, Ге») меншому, ніж 0,32, в оптимальному варіанті - меншому, ніж 0,20, як визначено гель-фільтрацією з застосуванням гелю Зерпасгукюю 5-300 НК, або значенню КАу, меншому, ніж 0,50, в оптимальному варіанті - меншому, ніж о 0,40, як визначено гель-фільтрацією з застосуванням гелю Зирегозе? НЕ. Ге)

Агрегат в оптимальному варіанті є розчинним при рн від 6,8 до 8,5.

Зо Нову агреговану форму спостерігають для похідних інсуліну за умов, коли відомо, що для більшості ї-оі інсулінів існує гексамерна одиниця. Таким чином, в оптимальному варіанті втілення, агрегована форма складається з гексамерних субодиниць, краще - з принаймні 4, ще краще - від 5 до 50, найкраще - від 5 до 200 гексамерних субодиниць. Будь-яка гексамерна субодиниця агрегованих форм цього винаходу може мати « з будь-яку з відомих структур Кб, Кз з або Те (Каагепої!т, Віоспетівігу 28. 4427-4435. 1989). 7

Було виявлено, що такі речовини, як 7п 2" та фенольні сполуки, відомі тим, що стабілізують гексамерні с одиниці, також стабілізують нову агреговану форму деяких похідних інсуліну. Структурні елементи, що :з» утворюють агрегати, можуть бути гексамерними одиницями, відомими з визначеної шляхом рентгенографічної кристалографії структури інсуліну (Віопаеї!, Оіабейез 21 (Зиррі. 2). 492-505. 1972). Такі іони, як 7п2", відомі тим, що стабілізують гексамерну одиницю як 2 або 4 7п 2:/гексамер комплекси (Вішпаей, Оіабе(ез 21 (Зиррі. 2).

Ге») 492-505. 1972) є важливими для утворення агрегатів для деяких похідних, наприклад, для со Іугв829(Ме е-карбоксигептадеканоїл) де8(В30) інсуліну людини. Фіг.2 показує гель-фільтрацію

І ув 829(Ме о-карбоксигептадеканоїл) дев(В30) інсуліну людини в описаній нами системі композицій, що містять с О, 2 та З 7п""/гексамер відповідно. За відсутності 7п2" агрегати не утворюються, позиція елюювання вказує на (се) 50 присутність мономеру або димеру. Таким чином, агрегат згідно з винаходом в оптимальному варіанті включає сю» принаймні 2 іони цинку, ще краще - від 2 до 5 іонів цинку, найкраще - від 2 до З іонів цинку на 6 молекул похідної інсуліну. Крім того, агрегат включає принаймні З молекули фенольної сполуки на 6 молекул похідної інсуліну. У центральній порожнині структури 2 7п2"/гексамер 6 залишків СІшВ!З забезпечують місця зв'язування 5бБ для іонів до З Са?" (Зцатеїег еї аіІ., Зсіепсе 212. 560-562. 1981). Таким чином, додавання Са?" іонів стабілізує гексамер і може додаватися до фармацевтичних композицій, за умови, що похідна інсуліну залишається у

Ф) розчині. ко Період напівзникнення агрегату винаходу після підшкірної ін'єкції у людини в оптимальному варіанті є таким самим або довшим, ніж у композиції інсуліну людини МРН. во У найкращому варіанті втілення даного винаходу агрегат складається з похідних інсуліну, які мають зв'язування альбуміну, нижче за зв'язування І уз 829(Ме тетрадеканоїл) дев(В30) інсуліну людини.

Оптимальними первинними структурами похідних інсуліну для застосування у даному винаході є ті, у яких: а) залишки 824-830 В-ланцюга похідної інсуліну є послідовністю РПе-Х-Х-Х-Х-Х-Х, де кожен Х незалежно представляє будь-яку кодовану амінокислоту або делецію; 65 б) залишки 825-830 В-ланцюга похідної інсуліну є послідовністю РІе-Х-Х-Х-Х-Х, де кожен Х незалежно представляє будь-яку кодовану амінокислоту або делецію;

в) залишки 826-830 В-ланцюга похідної інсуліну є послідовністю Туг-Х-Х-Х-Х, де кожен Х незалежно представляє будь-яку кодовану амінокислоту або делецію; г) залишки 827-830 В-ланцюга похідної інсуліну Є послідовністю Тпг-Х-Х-Х, де кожен Х незалежно представляє будь-яку кодовану амінокислоту або делецію; д) залишки 828-830 В-ланцюга похідної інсуліну є послідовністю Рго-Х-Х, де кожен Х незалежно представляє будь-яку кодовану амінокислоту або делецію; або е) залишки 829-830 В-ланцюга похідної інсуліну є послідовністю І уг-Х, де Х представляє будь-яку кодовану амінокислоту або делецію; 76 за умови, що похідна інсуліну виявляє активність принаймні 595, наприклад, за даними аналізу вільних ліпоцитів або за спорідненістю з рецептором інсуліну.

Замісник у лізиновому залишку похідної інсуліну агрегату згідно з винаходом в оптимальному варіанті є ліпофільною групою, що містить від б до 40 атомів вуглецю. Більшу перевагу віддають замісникам, які є ацильними групами, що мають від 6 до 40, в оптимальному варіанті - від 12 до 36 атомів вуглецю.

Найкращими ліпофільними замісниками у формі ацильних груп є такі:

СснНаЗ-(СНо)в-СО-, (СООН)-(СНо)-СО-, (МНо-СО)-(СНо)-СО-, НО-(СНо)п-СО-, де 4«п«38,

В іншому оптимальному варіанті втілення ліпофільний замісник є 5- ж; літохолевою кислотою або 5-8 літохолевою кислотою.

В іншому оптимальному варіанті втілення ліпофільний замісник є 5-о; або 5-р ізомерами холевої кислоти, 2о гіохолевої кислоти, деоксихолевої кислоти, хенодеоксихолевої кислоти, урсодеоксихолевої кислоти, гіодеоксихолевої кислоти або холанової кислоти.

В іншому оптимальному варіанті втілення ліпофільний замісник є фузидовою кислотою, похідною фузидової кислоти або гліцирретиновою кислотою.

Ще в одному оптимальному варіанті втілення ліпофільний замісник є з'єднаним з лізиновим залишком з Га застосуванням амінокислотного лінкера. Згідно з цим варіантом, ліпофільний замісник є з'єднаним з лізиновим залишком через у- або о-глутаміловий лінкер, або через р- або о-аспартиловий лінкер, або і) через о-амідо-у-глутаміловий лінкер, або через д-амідо-р-аспартиловий лінкер.

Даний винахід також пропонує нові похідні інсуліну, здатні утворювати агрегати. Ці похідні інсуліну можуть існувати у формі агрегатів у фармацевтичних композиціях, або ж, вони можуть існувати у неагрегованій (зе) формі у фармацевтичних композиціях, і у цьому разі агрегати утворюються після підшкірної ін'єкції Ф вищезгаданих композицій.

Відповідним чином, даний винахід також стосується фармацевтичних композицій, що містять агрегат (зе) похідних інсуліну або неагреговані похідні інсуліну, які утворюють агрегати після підшкірної ін'єкції. Ф

В оптимальному варіанті втілення фармацевтична композиція згідно з даним винаходом включає агрегати, значна частина яких (в оптимальному варіанті - більше, ніж 7595) має розмір, більший за розмір альдолази, як (Се) визначено гель-фільтрацією з застосуванням середовища композиції як елюенту.

В іншому варіанті втілення пропонується фармацевтична композиція, що містить здатні до агрегації і швидкодіючі аналоги інсуліну, останні в оптимальному варіанті є інсуліном людини або одним з аналогів Азр?28 « інсуліну людини, ІузВ28Рго829 інсуліну людини або дез(В30) інсуліну людини. Така композиція забезпечує

Швидкий початок дії, а також подовжений графік дії. т с У цьому варіанті втілення фармацевтична композиція в оптимальному варіанті включає агрегований інсулін "» та швидкодіючий інсулін у молярному співвідношенні від 90:10 до 10:90. " Повільна дисоціація агрегованих форм може бути ще уповільнена іп мімо шляхом додавання фізіологічно прийнятних агентів, які підвищують в'язкість фармацевтичної композиції. Таким чином, фармацевтична композиція згідно з винаходом може також включати агент, який підвищує в'язкість, в оптимальному варіанті - (2) поліетиленгліколь, поліпропіленгліколь, їхні співполімери, декстрани та/або полілактиди. со Фармацевтична композиція в оптимальному варіанті також включає буферну речовину, таку, як ТКІ5- фосфатний, гліциновий або гліцилгліциновий (або іншої цвітеріонної речовини) буфер, агент ізотонічності, о такий, як Масі, гліцерол, манітол та/або лактоза та фенол та/або м-крезол, як консерванти. Серед допоміжних со 50 речовин фармацевтичної композиції хлорид натрію, застосований як ізотонічний агент, та фенол, застосований як консервант, є особливо важливими тим, що сприяють агрегації у композиції, а отже, ефективно подовжують сю час зникнення з місця ін'єкції. Фармацевтична композиція згідно з винаходом в оптимальному варіанті включає іони Ма" у концентрації від 10 до 150мММ.

Найкращою фармацевтичною композицією є композиція, що містять 0,1-2мМ похідної інсуліну згідно з даним винаходом, 0,3-0,995 27п (маса/маса відносно похідної інсуліну) та фенольні сполуки, такі, як фенол або

ГФ) м-крезол, або їх суміші у загальній концентрації 5-50мММ та іони Ма" у концентрації від Т0ММ до 150мМ. т Даний винахід також стосується способу лікування від діаре(ез тейЙйив5, включаючи введення особі, яка потребує такого лікування, ефективної кількості розчинних у воді агрегатів похідних інсуліну згідно з винаходом або ефективної кількості похідної інсуліну згідно з винаходом, здатних утворювати розчинні у воді 60 агрегати після підшкірної ін'єкції.

Похідні інсуліну згідно з винаходом приготовляють загальноприйнятими способами, описаними у У/О 95/07931 (Момо Могаїзк А/5), МО 96/00107 (Момо Могаїзк А/5), УМО 97/31022 (Момо МогаївкК А/5), заявці РСТ

Мо0КО7/00296 (Момо Могаїзк А/5), ЕР 511600 (Кигакау Со. ЦЯ.) та ЕР 712862 (Ві Шу). Похідні, перелічені у таблиці 2, приготовляли шляхом вибіркового ацилювання є-аміногрупи Іуз829 де8(В30) інсуліну людини за бо допомогою лігандів, активізованих у формі відповідних М-гідроксисукцинімідних естерів. Спряжені ліганди приготовляють, застосовуючи традиційні технології пептидної хімії (Фіг.4).

Деякі з похідних, перелічених у вищезгаданих патентних заявках і описаних у публікаціях Магкиззеп,

Оіарефіодіа 39, 281-288,1996; КигагПпаїв, Віоспет .. 312, 725-731, 1995; КигаНпаів. 9. Рпапт оЗсіепсез 85. 304-308. 1996; та МУпіціпопат, Віоспетівігу 36. 2826-2831, 1997 як такі що мають подовжену дію завдяки механізмові зв'язування альбуміну, також є здатними на утворення розчинних агрегатів з високою молекулярною масою згідно з даним винаходом. І уз29(Ме літохоліл-у-СІн-) дев(ВЗ30) інсулін людини з УХО 95/07931 та І уз29(Ме с-карбоксигептадеканоїл-) дев(В30) інсулін людини з МО 97/31022 є прикладами похідних інсуліну, здатних утворювати розчинні агрегати високої молекулярної маси при нейтральному рівні рН. Існує селективність між 70 ліпофільними замісниками у їхній здатності викликати утворення агрегатів. Таким чином, з двох ізомерів,

Гуз 829(Ме літохоліл-у-СІи-) дев(В30) інсуліну людини та Іувб29(Ме літохоліл-ф-СІи-) дев(В30) інсуліну людини, лише перший утворює агрегати у застосованій композиції, див. Таблицю 1.

ВИЗНАЧЕННЯ УТВОРЕННЯ АГРЕГАТІВ

Агреговану форму демонструють шляхом гель-фільтрації з застосуванням гелю з межею ексклюзії 1,500кДа 75 для глобулярних протеїнів і 400кДа для лінійних декстранів. У гель-фільтрації застосовують систему водного буфера з нейтральним рівнем рН, і похідні інсуліну в агрегованому стані подають на колонку у формі фармацевтичної композиції у концентрації ббОнмоль інсуліну/мл. Агреговані стани похідних інсуліну елююють перед альдолазою, що має молекулярну масу 158кДа.

Експеримент з гель-фільтрацією з застосуванням умов, вказаних у цьому розділі, є прямим фізико-хімічним способом для виявлення потенційної властивості утворювати агрегати похідної інсуліну. Зникнення після підшкірної ін'єкції у свиней відбиває, крім різноманітних біологічних факторів, поєднання зв'язування альбуміну і здатності похідної інсуліну до утворення полімеру.

Утворення розчинних агрегатів високої молекулярної маси демонструють шляхом гель-фільтрації з застосуванням колонки Зерпасгу! 7 858-300 НЕ у водному нейтральному елюенті, що містить 125мММ хлориду с натрію та 20мМ фосфату натрію при рН 7,4. Цю буферну систему вибрали для імітації іонної сили та рН тканини (У з метою одержання можливості виявлення похідних, агрегованих за умов, подібних до умов після підшкірної ін'єкції. Зрозуміло, що в інших буферних системах, що мають нижчу концентрацію хлориду натрію, або нижче або вище значення рн, похідні не можуть проявлятися в агрегованому стані. Однак, якщо треба оцінити фактичний стан агрегації у фармацевтичній композиції, середовище композиції, виключаючи 7п2", який є зв'язаний о інсуліном, застосовують як елюент для гель-фільтрації. (о)

Колонку 28хі1см елюювали при швидкості 1бмл/год. Похідні інсуліну вводили (20О0мкл) як стандартну с композицію, що містить б00мкМ похідної, 200 або З0ОмкМ 7п2", 20мМ Масі (або регульовану кількість), 16мММ фенолу, 16мМ м-крезолу, 7"ММ фосфату натрію при рН 7,5. (22)

Межа ексклюзії Зерпасгу!? 5-300 НЕ. вказується виробником, Ріагтасіа, як молекулярна маса 1,500кДа для со глобулярних протеїнів і 400кДа для лінійних декстранів. На практиці елюювання розчинених речовин різних розмірів характеризується наявним об'ємом як значення Куду:

Кду-(Ме"МоХМт-Мо), де Ме є об'ємом елюювання, Мо є об'ємом порожнин, наприклад, об'єм елюювання блакитного декстрану, М т « 70 є загальним об'ємом. Таким чином, значення Кду не залежить від розміру колонки. У цій системі альдолаза ть) с (мол. маса 158кДа) елююється при Кду приблизно 0,32, альбумін (мол. маса 6б7кДа) - при Кду приблизно 0,38, і мономерна форма інсуліну (мол. маса бкДа) - при Кду приблизно 0,71. Градуювання колонки з застосуванням :з» ряду стандартів молекулярної маси показує близький лінійний взаємозв'язок між Кам та логарифмом молекулярної маси, див. Фіг.1.

Значення К ду, константи зв'язування альбуміну та період напівзникнення для асоціювання похідних б інсуліну, більших за альдолазу (мол. маса 158кДа), неасоційованих похідних інсуліну, менших за альдолазу, та стандартів застосовують як маркери розміру молекул. Константи зв'язування альбуміну та періоди о напівзникнення у свиней нормалізували, застосовуючи І уз 829(Ме тетрадеканоїл) де5(В30) інсулін людини як (4) еталонну сполуку. Було виміряно період напівзникнення Т 5053; для МРН інсуліну у свиней 10,5год (Магкизвзеп еї со 5о а. 1996). с»

Сполуки Кду Звязування альбуміну Період напівзникнення Т509;, ни М піний в ШЕ 00030 більші за альдолазу."" о ю во еверетотстрилектарюн 00000000

СЕТ нів ШИН ПИЙ ПИЛ менші за альдолазу."" еунледияии 11110810 пнсулінлюдини без цину 110211 бо Гуз829(Ме літохоліл (без цинку) 0,74 стандарт 1

Водор вого супи людини мономерний мол маса ба) 07001110

Рибонуєтеяза мол маса иДЮ 22111011 05311111 дпевумн моло маса блдО 01111111 08831111

Атедоляза (мол маса ащЕ 11111111 08211111 0 Катвлаз мол Меса свжда) 111111111111111100005911111111111011

Феритинімол маса дода) 1 1бмМе 111

Тиротовулн смол масаєєеда 00000000 00860 " фосфату натрію, 16мМ фенолу, 16мМ м-крезолу, 1,695 гліцерину при рН 7,5.

Прикладами похідних інсуліну, які здатні утворювати розчинні агрегати з високою молекулярною масою і мають тривалу дію на основі, насамперед, цієї властивості, є ІузВ29(Ме літохоліл-у-с1Ш-)де8(В30) інсулін людини, див. Таблицю 1. Видно, що співвідношення між періодом напівзникнення та константою зв'язування альбуміну є високим для цього класу сполук. Прикладами похідних інсуліну, які не здатні утворювати розчинні агрегати з високою молекулярною масою, але мають тривалу дію на основі зв'язування альбуміну, є І уз 829(Ме сч літохоліл-у-СІш-)дев(В30) інсулін людини та І узВ29(Ме-тетрадеканоїл-)де5(В30) інсулін людини, див. Таблицю 1. (8)

Видно, що співвідношення період напівзникнення/константа зв'язування альбуміну є низьким для цього класу сполук.

У УМО 97/31022 було розроблено фармацевтичну композицію ІузВ29(Ме о-карбоксигептадеканоїл)дев(В830) со інсуліну людини, що містить ббОнмоль/мл похідної, бмМІМ буферного розчину фосфату натрію з рН 7,5, 10ММ о хлориду натрію, 16мМ фенолу, 16мМ м-крезолу, 2-3 7п?"/гексамеру та 1,695 (маса/об'єм) гліцеролу. Для встановлення ступеня агрегації у цій композиції здійснювали гель-фільтрацію з застосуванням такої самої со колонки, як описана вище, але з застосуванням середовища композиції як елюента. 7п 2", як правило, є Ф зв'язаний інсуліном, а отже, не вважається компонентом середовища. Оскільки елюент містить фенольні

Зо речовини, концентрацію похідної у фракціях відстежують шляхом високоефективної рідинної хроматографії со (НР'І С), див. Фіг.3. Значення КАу близько 0,45 показує, що гексамерні або додекамерні одиниці є превалючими різновидами у композиції, тобто, у цій опублікованій композиції не було агрегатів похідних інсуліну з високою молекулярною масою. «

Було розроблено альтернативний спосіб вимірювання здатності похідних інсуліну до утворення розчинних агрегатів з високою молекулярною масою, придатний для НРІ С обладнання. Розміри колонки, об'єм ін'єкції та в) с швидкість потоку відповідають даним першого способу, тоді, як температуру було підвищено до 37"С, а "» фосфатний буфер замінено на тригідроксиметиламінометангідрохлорид та додатковий хлорид натрію. " Визначено, що агрегований стан інсуліну елююється перед гель-фільтрацією стандартної альдолази, як у першому способі.

Значення К ду, показані для двох рівнів цинку у Таблиці 2. Порівняно з еталоном, Гуз 829(Ме

Ф тетрадеканоїл-)де5(В30) інсуліном, довгий період зникнення з підшкірних відкладень корелюється зі схильністю (се) похідної інсуліну до утворення великих агрегатів.

Фо

Фо

Пост т ТЛНННИ НИСТ ИНИ НННЕ ОНИ ПОН НН Нє НН з

С) 000 еінелтеюветоемлетеночевюн 00002000 ю п т ЗГИНИ ПОСТ НИ ПОС ПОЗИ поз "шен 101011 -амінобуганоїл-)де5(В30) НІ

ІГуз829(Ме-холаноїл-)дев(В30) НІ 0,40 017 0,48 20,1 б5

І ув829(Ме-гексадеканоїл-о-аміно-у 0,38 0,41 0,56 15,3 -СіІн-)дев(830) НІ пнсулінлюдини (ЯОО01064 |в 1011112 дерево ні (мономерний, моломаса вда) 000000000007311

Рибонутензя (моло маса зиДЮ 01111110 0 Овальбумінімоло маса язкда) 00000006 педоляза (мол маса вада 000000010000000060000000100000

Феритин (мол. маса 40кДа) в 1) Нормалізований до І узВ29(Ме-тетрадеканоїл-)дев(В30) інсуліну людини (Т5095-14,Згод). 2) Зирегове 6 НК 10/30 (Рпагтсіа Віоїесп) елюювали при 377 хлоридом натрію, 140мМ, тригідроксиметиламінометаном, 1О0мММ, азидом натрію, 0,0295, та хлороводневою кислотою, яку додавали до рН 7,4. Після ЗОхв елюювання (0,25мл/хв) здійснювали промивання протягом 150хв (О,Бмл/хв). Об'єм ін'єкції становив 200мкл.

Фіг. 1

Мол. маса то 10500) 100000 1000 10000000 ' у 0 ле рєТТО) с що т т т тп ТІ о)

МКК С о С 1077 сті рі ТА зи А А А Р 2 А АНТ ЕН 17 1 1 ТТ ЕЕГНІ о 7 11 ДЕ 1 ТА ЕЕ 20001117 ТТГ гію ІЕЕ Ме да! 73:01 БІДНІ ТОНІ З ЕН тА ТЕТ ЕН ме)

ІЕЕ 7 «7170777 ЗЕ 6 Ті злі 11 ЕРНІ (22) пишними я Лях КЕ ПО Я Ло НЕ А ТЯ ДОН НОНОХ ПОЕ То НК Я ТИ 5 77.3 ж! 7 СЗГ СТ ЕЕГ (се) т пер І ТАН поки Я поли ливо ПЕ Я КП ПНЯ Ноя Тони ля То МК У У дно за Ше: З ЯМ КУ о ЩЕ У НТ У ЕАН 1 я 1 ТІ ТСН « бвї 1 111777 711111 АУЕ ВЕН а 11 РЕДИС 1 171 ЕН

ПОВНО ТНЕ ПИТ ПИНРОННЕННИ МЕТИ КТ В Пов ПОЛЕ ЗНО ЛЕЧО У КАНОН Пн ди З ЗА в) с шинки клини тт миши виш МИ ЕЛ Я Кп ПД Во р ЗА В В поні ча НСх У я 35 77.77 1 11 рт ері "» 5 05! 7 юс 1 ДО ГГ И еН , Ж нні ши ляти нив ши ше я жиле везе си с ГОСТ ТІ рей п ДН Срере я У ее Р 077 ТАН ОЇ ЕП ре тес ІЧАКЕр (с) 04! с» МЕ ТІЇ 1 ЕТО ди А КЕБ

ПСГ СН ееюху яе ки ЕХО со і з прі ЕЕ ДЕ Юкка ВН 1 ЕД С ЕЕ, пера с 1 ні РЕД ета 0,3 Я ПЕРЕ со нич икаці ДН Ти Де схе ен с о ДЛ І ДАО зве и пив с» о НТ о п РЦу св рьо ее "11, УГОДИ о) уДреурм ечелкее в 02 ПИ ис ЛИРИВ Я Т ПИЛИ ТИВ ТИ ЛАК КЕН З ХХ СНЕКИ УААН ЛА ВЕУ Я ЗЕ МАК дес вия ку ЗИ

АН) ТЛА О1ЄРНЦ -Х ідесвряроювье і ТІ 1 ГОДІ 11.1 плине лиєлик я ПИ ЕТ ли п АТО В НО ПЕ ТД ОВО ПОН КОНКУ ТЕ ПНЯ ек я ех пили тил ЛО ПАН по ХО ЛО ЕТ о ПОВ п ПАННО СНО Я НЯ Во по УЖЕ СУ з М Я за (Ф) ві! 6 ють АРЬН 1 п Су ТС ГЬГИ іме) і лі (11 ИДЦЕа тер геть 1 ГОР. ДАЕ 1 771 УК о С 1 ІТТ ЕІ бо б тт ге б5

Фіг. 2 с 05 т тт тт НЗООСЛ0 о

ФО о. є 70 х 05. 5 | / Ї-я-3 гл ма; 0.1. Ї--22я, с ' дев | а гл!

Ж оо. і В: -- х у А

Е за о сю ПЕН ННИ еп і Й Сл Й вна нач и , щей 1 б 0,3 05 а,7 ба 1 13 15

Ках

Фіг, 3 с 50 о

Ї нні - 40

Як!

Е 30 - Ф г - Ю -ї со х 0 Фу о - -.5 3.25 0 02585 075 1 1.25 1,5 ' (Се)

Ках « о, с з (с) (Се) (95) «со 20 сб» (Ф) ко 60 65

Фіг. 4 чі . г. он М-гідроксисукцинімід

М,М'-дициклогексилкарбодіїмід --н т и 0 9000 о Тетрагідрофуран, 02С, 1 год, ВТ, 16 год он о | ши о-н НМ СООІВу ші о Діізопропілетиламін о М,М'-диметилформамід, КТ, З год

ОН

. я с н О-(М-сукцинімідил)- о

Й . 1,1,3,3-тетраметилуроній р тетрафторборат на а о снснеоон Діїзопропілетиламін со 7 . Тетрапдрофуран, КТ, 4 год б он й о (22) - (Се) н 4.

М исОови о Оез (830) НІ, ацетонітрил/вода, « о о рН 10, 159С, 1 год но) с 0-м пи . о 2. ТЕА, КТ, 1 год

Б он (6) (22) щі сувег(Ме літохоліл-у-іш-) де5(В30) НІ (95) о 50 сю»

Claims (7)

Формула винаходу

1. Розчинний у воді агрегат похідної інсуліну, який відрізняється тим, що залишки 824-830 В-ланцюга похідної інсуліну є послідовністю РПе-Х-Х-Х-Х-Х-Х, де кожен Х незалежно представляє будь-яку амінокислоту Ф) або делецію, і принаймні один Х є залишком лізину, Ін -заміщеним 5-- гу, -літохолевою кислотою о або 5-й -літохолевою кислотою через є - глутаміловий, У глутаміловий, В - або є - аспартиловий лінкер, при цьому: бо а) вказаний агрегат має розмір більший за альдолазу, як визначено у гель-фільтраційній системі та б) вказаний агрегат містить принаймні 2 іони цинку, краще - від 2 до 5 іонів цинку, ще краще - від 2 до З іонів цинку, на 6 молекул похідної інсуліну.

2. Агрегат за п. 1, який відрізняється тим, що має розмір, більший за феритин, як визначено у гель-фільтраційній системі. бо 3. Агрегат за п. 1, який відрізняється тим, що має уявний об'єм, який відповідає значенню Кду, меншому, ніж

0,32, як визначено гель-фільтрацією із застосуванням гелю Зерпасгу!? 5-300 НЕ.

4. Агрегат за п. 1, який відрізняється тим, що має уявний об'єм, який відповідає значенню Кду, меншому, ніж 0,20, як визначено гель-фільтрацією з застосуванням гелю Зерпасгу!? 8-300 НЕ.

5. Агрегат за будь-яким за п. Табо 2, який відрізняється тим, що має уявний об'єм, який відповідає значенню Кду, меншому, ніж 0,50, як визначено гель-фільтрацією із застосуванням гелю Зирегозе? НВ.

6. Агрегат за п. 5, який відрізняється тим, що має уявний об'єм, який відповідає значенню Кду, меншому, ніж 0,40, як визначено гель-фільтрацією із застосуванням гелю Зирегове? 6НЕ.

7. Агрегат за будь-яким з пп. 1-5, який відрізняється тим, що він є розчинним при рН у межах від 6,8 до 8,5. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2004, М 9, 15.09.2004. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с щі 6) (зе) (о) (зе) (о) (Се) -

с . и? (о) се) (95) Фо сю іме) 60 б5