WO1983000148A1 - Substance accroissant l'effet antibacterien et son procede de preparation - Google Patents

Substance accroissant l'effet antibacterien et son procede de preparation Download PDF

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Takeda Chemical Industries Ltd
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas

Definitions

  • the present invention relates to a novel antibacterial enhancer 2 having an action of enhancing the recommendability of antibiotics, a novel antibacterial enhancer 2, and a method for producing the same.
  • the present invention relates to a novel antibacterial potent substance T2 and a method for producing the same.
  • the present invention provides a method for culturing (1) an antibacterial substance F2 and a salt thereof, and (2) an antibacterial substance * 2 producing bacterium belonging to Eudomonas, in a local area, and preparing This is a method for producing an antibacterial enhancer 2 which specializes in producing and accumulating antibacterial property 3 ⁇ 4high quality 62 6 and collecting it.
  • the workers of the present study separated a large number of microorganisms in the soil for the purpose of finding new ⁇ ⁇ substances and searched for the antibiotics produced by them, and found that certain microorganisms revealed new antibacterial and potent substances.
  • the microorganism is produced, the microorganism
  • antibacterial substance was identified as a novel active substance, and was referred to as antibacterial fe2 strong substance F2.
  • the antibacterial enhancer «F2 is simply referred to as“ F2J ”.
  • the antibacterial potent substance used in the present invention ⁇ 2 which belongs to the genus Pseudoaonaa, It has the ability to produce the antimicrobial enhancer F2: mi Any glaze For example, ⁇ Eudo, “Eggplant-Adfy, (Pseud omo -nas acidopiiila) Q-6302 and PseudOBonas see oacl do dii la) SB— 7231 0 strains o
  • Pseudomonas spp. Used in the present invention is easily changed in its properties, and can be easily mutated by, for example, an artificial mutating means using ultraviolet rays, X ⁇ , and a chemical S3 ⁇ 4! ), What kind even in the mutant strain and used for all as having a ⁇ M capacity of F 2 to the subject invention of the present invention door is Ru can ⁇
  • carbon sources include, for example, glucose, glucose, matose, molasses, glycerol, oils and fats (eg, soybean oil, olive oil, etc.), and organic granules (eg, quenze, amberjack). Satoshi, guconic acid, etc. * Anything that can be degraded is used as appropriate.
  • nitrogen-producing are soybean flour, cottonseed flour, 3 -n-steep liquor, dried yeast, yeast extract, meat extract, bebton, urea, ammonium nitrate, and ammonia.
  • Organic nitrogen compounds and inorganic nitrogen compounds can be used.
  • non-contact for example:
  • WiFO Tricum potassium chloride, potassium phosphate, magnesium phosphate, monophosphate, disodium phosphate Any of the four types commonly used for culturing bacteria, either alone or in combination .
  • Further oxidizable yellow compounds such as sodium acid sodium, sodium sodium, etc. ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the amount was found to increase.
  • stin and sodium thiosulfate are preferred.
  • the concentration of the yellow compound in the medium is preferably from 0.1 to 1.0 W ZV, more preferably from 0. 02 to 0.5. When a yellow compound is added to a medium: ar ⁇ , the amount of F2 produced increases, which is extremely industrially advantageous.
  • ferrous nitrate, tin luate, 4 heavy metals, vitamins, biotin, and all vitamins are added as needed.
  • a quencher and a surfactant may be added to the medium.
  • organic substances and pyrotechnics may be added as appropriate to assist in the labor of bacteria and promote the production of F2.
  • the cultivation method may be the same as that used in general production methods, and may be either solid culture or liquid culture.
  • solid culture plant culture, portable culture
  • the culture temperature is preferably in the range of about 15 to 35, and the soil pH is in the range of about 4 to 8, and is about 8 hours to 168 hours, preferably 2 hours to 144 hours.
  • the produced F2 is mainly present in the culture solution, it is advantageous that the nutrient is separated into the supernatant and the cells by centrifugation or filtration, and then purified from the supernatant. However, it is also possible to purify directly from the culture medium.
  • WiPO The measurement of mosquito concentration of this substance was carried out, for example, by using the Escherichia coli IFO 12734 strain as test S, using the broth agar containing 0.5 M of cefmenokime, and using the force-jet method and paper disc method. I can do it.
  • a 3 ⁇ 4 KazuSatoshi culture After the completion 3 ⁇ 4 nutrient and ⁇ obtained ⁇ liquid is passed through the active ⁇ column, eluting with a hydrophilic organic solvent system I 1 2 is ⁇ .
  • Aqueous solvents such as acetone, methetiketone, methisobutyketone, and other low ketones, such as methanol, methano, tanano, isobrovano, propano, butano, etc.
  • One example is a mixture of water and a single solvent or a mixed solvent.
  • an ion-exchanged toothbrush [Amberlite IRA—400, 402, manufactured by Rohm and House, USA; And 'Chemica manufactured; Diaion S JL-21A Japan, manufactured by Mitsubishi Kasei (Japan)] etc. can be used advantageously.
  • an aqueous solution such as food soil to elute the effective substance K.
  • column ⁇ 3 ⁇ 4 of the eluate perform column chromatography again on activated carbon.
  • the eluate from which the effective substance R was eluted was shrunk, and acetone and the like were added to precipitate the precipitate.
  • Fig. 1 shows the recovery yield of Lithium phosphide.
  • nuclear magnetic ⁇ 3 ⁇ 4-spectrum (1 0 0 Mflz in dimethicone scan Foki de) S 1. admit 8 4 to one CH 3 ⁇ Guna.
  • Gray Gourry Bapuku reaction positive for manganese and potassium reagents. Negative for ninhydrin reagent, Sakaguchi reaction, and molybdenum.
  • An aqueous solution with a pH of 3 to ⁇ 9 is stable by heating for 6 ⁇ 10 minutes.
  • Example 1 The physicochemical property S of I * 2 dinatremite obtained in ⁇ 2 is as follows.
  • Fig. 2 shows the absorption by potassium bromide tablets.
  • An aqueous solution of pH 3 to pS9 is stable by heating at 60 t for 10 minutes.
  • Fig. 3 shows the absorption spectrum of potassium bromide.
  • the aqueous solution of ⁇ 3— ⁇ 9 is stable after heating for 60 minutes and 10 minutes.
  • the physicochemical properties of the F2 disodium clay illustrated are as follows.
  • Fig. 4 shows the absorption spectrum of potassium bromide tablets.
  • Gray Goubak reaction permanganic acid. -Responsible for ⁇ ⁇ , ⁇ reagent, Sakaguchi reaction, and lip reagent.
  • OV PI Table 1: Obtained in Example Z; Antibacterial activity of tep 2 by sepmenome and melinam ( ⁇ bacteria: E. coli IPO 12734)
  • Table 2 and Table 3 show that F2 also enhances the anti-S action against B-teus mirabilis AT CC ⁇ 1100 against the anti-g action of cefmenocikim and melinam. It is clear.
  • Table 5 Growth of F2 (obtained from ⁇ « ⁇ ) and the cell under ⁇ 7 ⁇ -lequin or sepme-no-yme.
  • F2 can be used in combination with these ⁇ substances to control IB bacterial infections in breast milk (eg, mice, rapto, dogs, humans) and poultry ( ⁇ ,- ⁇ birds, ae). Can be used for treatment.
  • cefmenoglyph 0.5 ⁇ 2.0 ⁇ and 1 * 2 0.5 ⁇ 10f to physiological saline 1 It is dissolved in 0 to 10 and mixed with an intravenous solution for injection, and administered to adults 2 to 3 times a day.
  • F2 is a promising * compound as a synthetic intermediate for new drugs
  • the gamma 2 LD 50 when was Shizuhiza administered ⁇ in mice was> 1 fk.
  • the antimicrobial r3 ⁇ 4- ⁇ strong substance F2 having 3 ⁇ 4S of feLb is compared with the ⁇ ⁇ ⁇ antibiotic, the antibiotic S containing s in water-soluble acidic R is first
  • Fig. 1 obtained in Example / 2 Monosodium ⁇
  • Fig. 2 shows Example 2 c-vpi viro ⁇ I * 2 disodium obtained
  • Fig. 3 shows ⁇ * 2 monosodium obtained
  • FIG. 4 and FIG. 4 show the infrared absorption spectrum of the F 2 disodium plant obtained in the example.
  • 31363 is a culture medium obtained from glucose 1 *, boribevton (manufactured by Daigo Nutrition Chemical Co., Ltd.) 0.5 ⁇ 5 «, meat kiss 0.5 «, food 0.5 * ( ⁇ 7.0). 2 'Yokozaka Loplasco is inoculated into 2' bottles, and reciprocated for 28 hours at 28. The nutrient is used as a seed.
  • a cultivation medium consisting of glycerol 3 g course 0 ⁇ 1 *, bobbeton 0.5 ⁇ 5 *, meat extract 0.5 ⁇ 5 *, IiaC 10.5 *, and stin 0.1 ⁇ 1 * is placed in a fermentation building made of 120 it 200 J capacity stainless steel.
  • the solution was adjusted to pH 7.0 with 30 sodium hydroxide solution, steamed at 120 t for 20 minutes, and inoculated with the inoculum. Then, the cells were cultured for 78 hours under the conditions of a temperature of 28 t, aeration of 20 J / min, and a rotation speed of 180 rpm.
  • the seed S was weighed after being adjusted and steam sterilized at 120 ⁇ 3 for 20 minutes.
  • the cells were cultured for 78 hours under the conditions of 28 degrees Celsius, 120 minutes of aeration, and 180 rpm of stirring. This culture was centrifuged in a flash press and the cells were separated to obtain a supernatant 110 i. 4. Adjust to 2, and then use activated charcoal (white egret for chromatography, Takeda Pharmaceutical S Industries) for 15 hours.
  • the antibacterial enhancer F2 has a function of inhibiting the anti-ST activity of the antibacterial antibiotic, and can be used in combination with a monolactam antibiotic, for example, in mammals such as mice, pts, dogs, and humans. -! It can be used to treat bacterial infections in birds and ahi poultry.

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Description

明 細 蒈
抗菌性増強物 Kおよびその製造法
技術分！？
本発明は、抗生物質の抗薦性を ¾強する作用を有する新規抗菌性増強 物 2およびその氇、 よびその製造法に関するものである。
背景技術
¾来、 抗生物質の抗菌泎用を増強する物質としては、蛋白質 SP 127 〔 1L Kiknchl ら，ザ - ジャーナ ·ォブ 'アンチビォチタス（ The Journal of Antibiotics ) 35卷，第 209〜214頁， 1977年〕 が知られてお 、本物質はマクロライド抗生物 «の抗菌性を増強する
(同誌，同卷，第 215〜220頁）。 また、 3—ヲクタム抗生物質の不 活性化を防止し、相乗的に抗菌力を増強させる物質としてはクラブラン 酸（ claVulanic acid )が知られて る〔 n iL Leig ら，ジャーナ ·ォブ ' アンチミクロビア · ケモテラビィ （ Journal of Anti- microbial Cheaotherapy ) , (1981 )7· 229〜236〕。
発明の開示
本発明は新規 抗菌性增強物質 T 2およびその らぴにその製造法 に関する。
す *わち本発明は、（1)抗菌性增強 質 F 2およびその塩、（2) ユード モナス厲に属する抗菌性增強物質 Ϊ* 2生産菌を¾地に培養し、 ¾養物中 に抗菌性 ¾強 質 Γ 2を生成蓄積せ 6、 これを採取することを特徵と する抗菌性増強物 2の製造法である。
本勞明者らは、新規な^ ^物質の探菜を目的として多数の微生物を土 壤ょ 分趣し、その産生する抗生物質 分 g探索したところ、 ある種の 微生物が新規 抗菌性增強物質を産生する と、該微生物が ュ一ドモ
0MPI ナス属に属すること、該微生物を逼宜の ¾地に塔養することによってグ
,ム陰拴飆菌に対する βーラク ム 物質の抗 S作用を ¾強する物質 を培地中に蓄積しうる と ¾どを知]?、 これを単離し、その 理化学的 および生物学的諸性質から、当該抗菌性 ¾強物«が新規な活性物 Κであ る とを ¾め、 れを抗菌 fe¾強物質 F 2と称する とにした。
¾お、本明細害では抗菌性増強物 «F 2を単に「 F 2 Jと略称するこ 本発明で使用される抗菌性增強物質 Ρ 2生産菌としては、 シユードモ ナス （ Pseudoaonaa )属に属し、抗菌性増強物質 F 2を産生する能力 を有するものであ: mi如何なる釉菌でもよ 。 たとえば、本尧明者らに よって分楚、命名された^ユード ·《ナス -ア ドフィ， （ Pseud omo- nas acidopiiila ) Q - 6302珠ぉよび ュード¾ナス · メソァ ドフイラ、 PseudOBonas see oacl do dii la ) S B— 7231 0株が あげられる o
上記の G -6 302株 よび S B - 72310株は工業技術院 ¾^¾J ェ窠技術砑究所（ F R I ,日本国 ¾¾筑波郡谷田 町束 1丁目 1番 3 号） ·財団法人発酵斫究所 ( I 0.日本国大 ®府大展市淀川区十三本 町 2丁目 1 7香 85号）およびジ 'アメ リカン 'タイブ.力 チヤ一 · コレクション ( A T C C , The American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive , Rockville, Maryland
20852 US A )に^ぞ のとお] ϊ寄託されて る。
ΟΜΡΙ
Figure imgf000005_0001
上記微生物にお て、 G - 6 3 0 2株の菌学的性状は米国特許第
4， 229 , 4 36号（特許曰，西暦 1 98 0^1 0月 2 1曰）^、 また S B— 7 2 3 1 0株の菌学的 ¾状は米国特許第 4 , 2 25 , 5 86号（特許日 ，西曆 1 98 0年 9月 30日）にそれ^ iX記載されて る。
本発明に用いられるシユード ナス属钿菌は一般にその性状が変化し やすく、たとえば紫外線， X籙 ·化学薬 S¾どを用 る人工変異手段で 容易に変異しうるものであ！)、 どの様 変異株であっても本発明の対象 とする F 2の^ M能を有するものはすべて本発明に使用するととができ る β
本菌の培養に際しては、炭素源としては、たとえぱグ コース ， ュ 一クロース，マ トース，屍糖蜜，グリセロー ，油脂類（ 、大豆油 ，オリーブ油など） ，有機黢穎（例、クェン羧，コハク敏，グ コン酸 ¾ど）*ど哲が资化しうるものが適宜用 られる。 窒素瀕としては、た とえば大豆粉，棉実粉， 3—ン · スティープ ' リ カー，乾燥酵母，酵母 エキス ·肉エキス ，べブトン，尿素， ¾酸ァンモ -ゥム ，確黢アンモ- ゥム，植化アンモ-クム ， リン Sアン ゥム どの有摟窒素化合物や 無機窒素化合物が利用できる。 また、無接 ¾としては、 たとえば: §化ナ
OMPI
WiFO トリクム ，塩化力リウム ，戾鑀力 ^ゥム ，硓酸マグネ ウム ， リン酸 一力リウム ， リン酸ニナトリウム 4どの通常弒菌の培養に必要な無 類が単独もしくは適宜、組合せて使用される。 さらに资化しうる 黄化 合物たとえば 酸ナトリクム ，チォ％黢ナト リウム ¾どの無據 ¾黄化合 物， スチ ， システィン， メチォ-ン 4どの有接 黄化合物を添： ¾す ると目的物の生成量が増^ることが見出された。特に スティン よ びチォ硫酸ナトリゥムは好まし 。 黄化合物の培地中の濃度は、 0 · 0 1— 1 . 0 W ZV さらに好ましくは、 0 · 0 2〜0 · 5冒 で ある。 ¾黄化合物を培地中に添: ar ^ると、 F 2の生成量が増大し、工業 上きわめて有利である。
また、 ¾酸第 1鉄，琉酸錫 4どの重金属類， ビタミン , ビォチン ¾ どのビタミン類 ¾ども必要に ιεじて添加される。 さらに リコーンオイ ゃ リァ キレングリコー エーチ どの消活剤ゃ界面活性剤を培 地に添加してもよ 。その他菌の勞育を助け、 F 2の生蘆を 進するよ う 有機物や焦機物を適宜に添加してもよ 。
培養方法としては、一般の の生 法と同様に行なえばよく、 固体培養でも液体培養でもよ 。 液体 ¾養の場合は籙置培養，携摔 養
,振逢培騫，通気《養 ¾どいずれを実遂してもよ が、 とくに通気 S拌 培養^1まし 。又培養溫度はおよそ 1 5 〜 3 5 の範囲が好ましく、 地の p Hは約 4〜 8の範囲でおよそ 8時間〜 1 6 8時間、好ましくは 2 時間〜 1 4 4時間 ¾¾H "る。
生成した F 2は主として培養 液中に存在するの 、 養物を遠心分 睽ぁるいは炉通によって上清欲と菌体とに分離し、その上淸液から精製 するのが有利である。 しかし、培夔 ¾から、直接に精製することも可能 である。
O PI
WiPO 本物質のカ懾測定は、 たとえばェシエリキア 'コリ I F O 1 2 7 3 4株を試験 Sとして、セフメノキ ムを 0 · 5 M 含有する肉汁 寒天を用 る力ッブ法 ·ペーパーディスク法によ lJ実威できる。
本抗菌性 ¾強物質 F 2を採取するには、微生物が生産する代謝産物を 採取するのに通常用 られる手段を適宜利用するととができる。 たとえ ば遠心分憝によって菌体を除去したのち、その^液から一《に有効 質 を分璿、採取、精製する方法を用 る。す *わち適当な溶煤に対する溶 解性 よび溶解度の差、溶液からの析出法および析出速度の差、種々の 吸着親和力の差、 ィォン交換体によるィォン交渙クロマトグラフィーあ るいは減圧 ¾綰，凍結乾燥，結晶化，再結晶，乾燥 4どの手段が単独あ る は任意の) H序に組合わせて、 または反復して用い、利用される。 その 1例を示すと次のとお である。 ^わち培^了後 ¾養¾を泸 遏し、得られる ^液を活性戾カラムに通過させ、 吸蓊される I1 2を親水 性有機溶媒系を用いて溶出させる。溴水性有褸溶媒系として用いられる ものには、 ァセ トン，メチ ェチ〃ケト ン ， メチ ^ィソブチ ケトン¾ どの低殺ケトン類，メタノー ,ヱタノ一 ，イソブロバノー〃，ブロ パノー，，ブタノー 等の牴袋ァ コ一 類の単独または混合溶媒と水 との混合か あげられる。 またイオン 5¾樹脂としては当該物 が酸 性 ¾Rであるため、ァ-オン交換齒脂〔アンバーライト I R A— 4 0 0 , 4 0 2 ，米国， ローム ' アンド 'ハウス社製造；ダウェプクスー 1 米国ダウ 'アンド ' ケミカ 社製造；ダイヤイオン S JL— 2 1 A 日本 ，三菱化成（日本）製造〕等の C 1型等が有利に利用出来る。 吸着した 当該物 の溶出には食壌等の水溶液を用 有効物 Kを溶出する。 溶出液 の说¾には再び活性炭の力ラムクロマトグラフィーを行う。 次に有効物 Rを溶出した溶出液を》縮した後、ァセトン等を加えて析出する沈 ϋを
：ニ Κヒ O.V.P1 ^取し のち、 アセ ト ン ， エーチ 等で洗浄後乾燥すると淡褐色の粉末 が得られる。得られた粉末をさらに精製するには、 ¾ ΑΕセフアデック ス（スエーデン ファ マ ア ¾fc¾〉のカラムク マトグラフィ一が有 利に利用出来る。す わち、 Q セフアデプクス A— 25を ン酸瑷 ¾¾( pH 6. 6 )で洗浄した後、さきに得られた粉末を水に溶解した 液を通遇、吸着せしめ、同接衝液で洗浄後、 0· 5冒 7*食¾を含ま 緩衝液で洗浄後 1· 0*食壤を含ませた緩衝液で溶 ffiする。得られ た有効区分を 3. 0に調整後、再び活性炭カラムに通し、水 ¾、20 V/V メタノー 水で ¾浄する。 つ で含水アセ トンで溶出し、 区分を ¾圧濃縮後、ァセトンを加えると F 2が得られる。 また本品は金 属¾およびア モ-ゥム鏖を形成する。金厲¾としては、たとえばナト リウム植， カリウム壎， リチウム ¾ , カ シウム ¾¾どがあげられる。 突 ¾例/*で得られた Ϊ" 2乇ノナトリゥム ¾の物理化学的 はつぎの と:^!?である。
1 ¾点： 21 6〜2 1 9 C (分解）
Z fe の色，彭状：無色結晶性粉末
元素分析： 5鼓化リン上で 40 t , 6時閱滅圧乾澡したもの。 （¾
C 32. 1 1
H 5. 38
H 7. 27
S 10. 67
K& 3. 8
4 分子量：モノナト リウム壌として計募される分子量 605 ,推^ 子式（上記の実 よ]? ) C15~i6H30~3-ft5301 -16S2N
5. 紫外部圾収スペク ト ： 一
OMP1 末端吸収のみ（ 2 1 0 na JsLbに特異 ¾¾収を示さ * 。 ）
a 赤外部吸収スぺクト ：
奥化力リウム锭による ¾収スぺク ト を第 1図に示す。
7. 比旋光度：
〔β〕¾。+6· 85 ( c-0. 38. -CH3C00H )
0〕¾6 - 7· 72 ( c-0. 544. pH 7 リン酸瑷赚）
& 核磁気^ ¾スペク ト （ジメチ ス フォキ ド中 1 0 0 Mflz ) S 1. 8 4に一 CH3の^グナ を認める。
a 溶媒に る溶解 fe:
石油エーテ ^ ·へキサン， ジェチ エーテ ，ベンゼン，静酸ェチ よびクロ口ホ ムには不溶。 Iタノー ， ビリジン，アセトンに は建溶。 メタノー〃， ジメチ ス フォキ ドには可溶。 水には昜溶 c ια 呈色反応：
グレイグーリーバプク反応、遏マンガン羧カリゥム試薬には陽性。 ニンヒ ドリ ン試薬、坂口反応，モーリブ ュ試菜には陰性。
1L 安定性：
pH 3〜ρΗ 9の水溶液は、 6 · 1 0分加熱で安定。
2. ¾基性，中性， ¾性の区別：酸性 fe¾
実 ¾例 <2で得られた I* 2ジナトリゥム壌の物理化学的性 Sはつぎのと お]?である。
L 融点：明確 融点 さ 4 。
Z 物 の色，形状：白色粉末
3. 元素分析： 5酸化リン上 4 0わ 6時間滅圧乾燥した。 （ ）
C 3 1. 3 5
H 5. 2 4
0V.PI ir 6. 78
s 0. 38
Ha 7- 1
4. 分子量：分子中 K&を 2 aol含有するとすれば分子量 647· 6。 5. 紫外部吸収スペク トル：末端吸収
6. 赤外部吸収スペク ト ：
臭化カリウム錠による吸収スベタト を第 2図に示す。
7. 比旋光度： 〔な〕 ¾6+5· 5 °(c-0. 56 , N-Cfl3C00H ) a 溶媒に する溶解性：
石油エーチ ，へキサン， ジェチ エーチ ,ペンゼン ，酢酸ェチ ， ク 口ホ ムおよびァセ トンに不溶。 メタノー ，エタノー お よびビリジンには建溶。 ジメチ ス プォキ^ドには可溶。 水には易 a 呈色反応：
グレイグーリーパプク反応，過マンガン酸力 9ゥム試薬には »性。
-ンヒドリ y試薬，坂口反応，モーリプ ュ試薬には陰性。
ια 安定性：
pH 3〜pS 9の水溶液は 60 t ， 1 0分加熱で安定。
実旅 2で得られた F 2 ノナトリウム壌の物理化学的拴 Rはつぎの とお！)である。
L »点： 207〜208わ（分解）
2. 物質の色，形状：無色结晶性粉末
a 元素分析： 5酸化リン上で 40 t , 6時間 ¾圧乾燥したもの。（¾)
C 32. 59
Ξ 5. 22 N 6. 93
S 0. 1
Na 3. 7
4. 分子量：モノナト リウム植として計算される分子量 621· 6。推定 分子式（上記の実測 ACよ ) 015^16530—34»301 — l6S2,Iia 紫外部吸収スぺク ト ：
末端吸収のみ（ 210 na J5Ltに特異 ¾吸収を示さ *い。 )
6. 赤外部吸収スぺク ト ：
臭化力リウム锭による吸収スぺク ト を第 3図に示す。
7. 比 ½光度 ·· 〔a〕2!? +6· 0o(c-0. 47 ,ΐί - CH3C00H )
核 共鳴スベク ト （ ジメチ〃ス〃フォキ ド中 100 MHz ) S 1. 84に一 CH3のシグナ を認める。
a 溶媒に^る溶解性：
石油エーチ ，へキサン ， ジェチ エーテ ，ベンゼン ·齚酸ェチ およびクロロホ ムには不溶。 エタノー ， ビリ ジン， ァセ ト ンに 溶。 メタノー ， ジメチ ス プォキ ドには可溶。 水には羼溶。 ια 呈色反応：
グレイグーリ一バック反 is；、遏マンガン酸力リウム試薬には陽性。
-ンヒドリン試薬，坂口反応， モーリブ ュ試薬には ¾性。
1L 安定性：
ρΗ 3—ρΗ 9の水溶液は、 60わ， 1 0分加熱で安定。
12. 基性，中性，酸性の区別：羧性物質
実 ¾例 られた F 2ジナトリウム埴の物理化学的性質はつぎのと である。
1· 融点： 明 ¾¾ 点を示さ ¾ 。 2. 物質の色，形状：白色粉末
3. 元素分析： 5酸化リン上 40わ， 6時間滅圧乾燥した。 （*〉
C 30. 83
E 5. 35
N 6. 91
S 9. 68
9a 7. 3
4. 分子量：分子中 Na を 2 nol含有すると ^ば分子量 629· 9。
5. 紫外部吸収スベタト ：末 吸収のみ
6. 赤外部吸収スぺク ト ：
臭化カ リウム錠による吸収スぺクト を第 4図に^^。
7. 比旋光度： 〔β〕¾。+6· le(c-0. 39 , K-CH3C00H )
& 溶煤 する溶解性：
石油エーテ · へキサン， ジェチ エーテ 1 ,ベンゼン ， 酸ェチ
^ , タ c ホ ふおよびァセト yに不溶。 メタノー ，ェタノ一 お よびビ ジンには難溶。 ジメチ ス プォキ ドには可溶。水には县 呈色反 ίδ:
グレイグー ーバプク反応，過マンガン酸力 ウふ試薬には ©性。 -ン ϋド ン試薬、坂口反応， ーリプ yュ試薬には 性。
ια 安定性：
ρΗ 3〜： 9の;^液は 60 t , 10分加熱で安定。
次に抗苗性增強 feXT 2€生 tt^的性状につ て述べる。 F 2は半殺 菌浸度のセフメノキ ムゃメ y yナムの^:下にェ エリキア ·コリに して抗菌 用を ことが第 1表および第 2表から明らかである，
O.V:PI 第 1表：実施例 Zで得； tF 2によるセプメノキ ムおよびメ リナム の抗菌性增強作用（^菌：ェ エリキア · コリ IPO 12734 ) 第 1 表
Figure imgf000013_0002
*肉汁^培地に記 ¾通!?の薬剤を含ませ、 8«怪のペーパーディ スクを用いて検定。
*聿 8酺径 0ペーパーディスクに試科溶 25 μ ίを浸みとま《寒 天上に置いた。
第 2表：実尨剁 2で得た F 2によるセフメノキ ムおよびメ リナム の抗 S性 ¾強作用（試 菌：エ エリキア 'コリ IFO 12734 ) 第 2 表
Figure imgf000013_0001
* , ** ；ぃすれも第 1表と同意義を示す。
同搛にブ テウス · ミラビリス AT C C ≥ 11 00に対するセフ メノキ ム よびメ yリナムの抗 g 用に対しても F 2は抗 S作用を增 強させる泎用を示す とが第 3表および第 4 ¾^ら明らかである。
第 3表：実旌 Zで得た F 2によるセフメノキ ム よびメ^リナム の抗菌性場強^用 * 菌：ブロテウス · ミラビリス A T C C
21 100 )
3 表
Figure imgf000014_0001
*試驗菌、 度 外は第 1表と同"^件で^。 第 4表：実 例 2で得た F 2によるセフメノキ ムおよぴメ リナム の抗菌性增強作用 * (試験菌：プロテウス · ミラビリス A T C C 21 100 )
'ノ 第 表
Figure imgf000015_0001
*試験菌、共存薬剤濃度 tel外は第 1表と同一条件で轼驗。
また ϊ* 2はエ^ヱリキア · コ リの增殖に対してセファレキ ンやセフ
o
メノキ ムと共像して強 生育 £害作用を示す o。第 5表および第 6表に は 5 «fZWのセ 7ァレキ ンおよび 1 のセフメノキ ム共存下に F 2を働ら;^たときのヱシエリキア ·コリの增¾ ^を^。
第 5表： F 2 (突 ¾«Ζで得たもの〉とセ7ァレキ ンま はセプメ ノキ ムの^下のェ yエリキア .コ I F 0 1 2734の生育 £害 作用
第 5 表
600 に: JH る吸光度
T 2の添: ίϋ^
¾度 無 添 加
セプメノ^
0 2. 6 Z 35
1 2.65 1.80 a 60
10 Z 65 a 25
100 2.70 a 95 a 30 蔗糖 12« (冒/ V )を含有する T AB培地（ディフコ社製アンチビ ォチクメジゥム 3 · 1 · 75* ,ディフコ ¾ fii酵母エキス 0· 5*) に水， 50/«-/W セプアレキ ンまたは 10 «f W セフメノキ ム 1 Wおよび ϊ A Β 地て対数增«期初期まで場殖さ Γ7¾1培養液 1 W を接種し、 37わで 2時間援 g培養したのち、培養液の吸光度を マズ •ボ ュロム社製のスぺクト Τ2-プク 20比色 Ifを用 て 600 naで 瀕定した。
第 6表： F2 (突旌词 で得たもの）とセファレキ ンまたはセフメ ノキ ムの^ #下のェ ^エ キア · コ リ I F 0 12734の生育阻害 作用 *
第 6 表
Figure imgf000016_0001
*第 5表と同一の方法による。
第 5表および第 6表から^らか¾ように Γ 2はセファレキ ン よび セフメノキ ム^ fE下にヱシエリキア ·コ の增¾を 害し、吸光度の 下をひきおこしている。 さらに、培養液を位相差顕微篱を用いて観察 すると、 F 2無添加時にはセファレキ yンまたはセフメノキ ムの影 § を受けて籟跑は非常に長く って るが、 P 2を添加すると添加濱度に 応じて伸長 ifcが抑えられると同時に、 部分的 ¾»大が と 、 また溶苣 が進行した。 本発明方法によって得られる抗菌性增強物 ¾F 2はェ エリキア ·コ リ ，ブロ ウス · ミラビ スの ¾染マウスに、 セフメノキ ムゃセプア レキシンと共働して親著 4抗菌作用を示した。 し がつて、 F 2はこれ ら^物質と併用するととによ 乳動 (例、マウス · ラプト，ィヌ ,人）および家禽（钾、 -ヮトリ ，ァ e ）の上 IB細菌の感染症の治療 に用 ることができる。
抗菌性增強物質 F 2をたとえぱ大 K菌感染症の治療に用いるには、 it とえばセフメノキ ム 0· 5〜2.0 ^と 1* 2 0. 5〜1 0 f とを生理 的食 水 1 0〜1 0 に溶解して、点滴静厥注射液にまぜて成人に対 して 1 日に 2〜 3回投与する。
さらに、 F 2は新し 医薬 の合成中間体としても Sめて有望 *化合 物である
Γ 2をマウスに静膝投与 ΰたときの LD50 は〉 1 f kであった。 feLbの笾 ¾Sを有する抗菌 r¾ -增強物質 F 2を、 ¾ ^抗生物質と比铰 してみると、まず水溶性酸性 Rで sを含有する抗生物 Sとしては、ベ
=^9ン類、 セファ-ス^!; ン類があげられるが、本品は赤外 収ス ベクト にお て 1 720«一1 は上に吸収を示さず、 また通常の方法 では抗菌性を示さ 4 とから、 これらとは異なる。
また、 ユードモナス属钿 Sによって産生される抗生物質としては数 多くのものが知られて るが、水溶性酸性物質で Sを含有する抗細菌性 fe fci^く知られて 。 またシユードモナス属細菌 1¾外の 物の^する 知抗生物質の ずれとも物理化学的および生 学的性状 を異にしている。 したがって末穎物質は新規化合物であると判新される。 図面の簡単 &説明
第 1図は実施例 /·で得た？ 2モノナトリウム瘇、第 2図は実 ¾例 2で c-vpi viro ^ 得た I* 2ジナトリウム壌、第 3図は実 で得た Ϊ* 2モノナトリウム
¾および第 4図は実 例 で得た F 2ジナトリウム植の赤外部吸叹スぺ クト を «tそれ示す。
発明を実 *するための最良の 態
は下に実 ½例をもってさらに詳钿に本発明の内容を説明するが、 れ によって本発明が δ定されるものでは 。パーセントは、特にことわ の ¾ かぎ 重量/容量 *を示す。
実施例/
栄養寒天薪面上に生育させた yユードモナス ' ァ ^ド 7イラ G -6 302株 - Ρ 4344 ; Ι Ρ 0 1 3774 ; AT C C-
31363 )のき体を、 グルコース 1 * ,ボリべブトン（大五栄養化学 社製） 0· 5« ,肉 キス0. 5«，食 0. 5 * ( ρΗ 7· 0)から ¾ る培地 50 を含む 2 J容坂ロプラスコ 2'本に接種して、 28 で 8時間往復捩 S«養しその 養物を種菌とする。
次にグリセロー 3 グ コース 0 · 1 * ,ボ べブトン 0· 5 * ，肉エキス 0· 5 * , IiaC10. 5 * , スティン 0· 1 *から る培 地 120 it200 J容スチンレス製発酵棟に入れ、その液性を 30 水黢化ナトリウム溶液で pH 7. 0に調製し、 1 20 tで 20分間蒸気 «菌したのち、前記種菌を接種した。つ で温度 28 t，通気 il 20 J /分，授梓回転数 1 80 r. p aの条件下で 78時間培養した。 この培 養 を ヤーブレス遠心分離機にかけ、菌体を分離し、 清液 1 10 i をえた。 H 4. 2 に調整したのち活性炭（クロマト用 白サギ 武田 薬品工業製） 1 5 を充てんしたカラムに通 US性物質を圾着さ"
45 で ¾K¾50 ァセトン水 45 で溶出した。溶出液を 10 J宛分覉し、ェ ェ キア -コリ I P 0 1 2734を被検菌としてセ
EACT
O PI プメノキ ムひ. 05 ^ 9 /ml を含有する肉汁寒天で有効区分をしらべ、 フラク ョン; f£2〜3を集めて水 20 Jを加えた後、ダウェプタス一 1 (C1) (米国 ダク 'アンド'ケミカ ΟΙ業製造〉 1 0 Jを詰めたカラ ムに通した。水 25 Jで ¾璩後、 5*食¾水50 Jで溶出した。有劫区 分を集め pH 4. 0 に調整後、再び活性炭カラム （ 8 ）に通し、水 24 で洗鲦後 20 V/V«メタノー Λ^Κで溶出を t?^た。 ^区分を 50 Wまで滅圧濱縮した後、 アセト ン 20 を加え、析出する沈でんを泸 取、 アセ ト ン 50" ,エーチ 1 00"で ¾絲、滅圧乾燥すると粗物 質 25 fが得られた。
ととに得られた粗物質 ί 0 を Μ 25リン酸瑷街液（ ρΗ 6. 6) 500 Wに溶解した後、同緩衝欲で接街化された Q A E Sephadex A 一 25 (スエーデン ， ファ マ ア社製造）カラム 20 に通遏させ 吸着せしめ 同锾銜液 400"でカラムを ¾奪し、 0· 5 *食植を添 加した同瑷 40 でカラムを 後、 1 »食植を添加した同緩街 欲で溶出を ff^た。有効フラク ョンを集め、 N一 ¾酸を添加して液性 を pH 3. 0 に調整した後活性炭カラム 6 に filさせ 。 同カラム を水 200 W , 50 Ύ/1 メタノー A^t l 0 で洗 した後、 80 ヌ / %4、Jプ ー 水で溶出を行 、 フ，ク 3ンを集めて pH を 5 · 5に調整し のち «圧下に濃綰した後、 メタノー 50 Wを加え て溶解し泸過後、冷所に放置した。析出した桔晶を炉取し、エーテ で ¾濂後、 5酸化リ ン上で «圧下、 40 ， 6時間乾燥し、 2· 8 の F 2 · ノナト リゥム ¾の結晶を得た。その赤外部吸収スぺク ト を第 1 図に示す。 元素分析 C 32. 11, H 5.38. M 7.27, S ΐ β7 ( Ha 3. 8 «
実旅例 >2 実 ¾例/で得られた ί12モノナト リウム鏖 3 · 0 »を水90«/に溶解 後、冷却し 4がら N—水酸化ナトリクム 4 · 5 Wを加えた後、 pHを涎 定しながら注意して K一； ^化ナト ウムを加え PS 7. 0 に瘸整し 後、凍耪乾燥を行 白色粉末の!12 · ジナトリタム： S3· 1 -が得ら れ 。本 fiを 4 6時間減圧乾燥したものの赤外部' ぺク トラムは第 2図に示される。 また元素分析莪は C 31· 35， H 5· 24, K 6. 78, S 10. 38, Ka 7. 1«であった β
実施例 2
栄養寒天斜面上に生育さ^: ユード乇ナス - メソァ yドフイラ S B- 72310 ( P E M-PjiS4653 ； I P O 13884 ； A T C C一 31433 )の鹵体を、 グ コース 1 * ,ボリべブトン（大五栄 養化学 ¾¾) 0· 5* ,肉エキス 0; 5 * ,食渲0. 5* ( pH 7. 0) から ¾る培地 50 を^ 2 容坂口フラスコ 2本に接種して、 28 で 48時間往 ffi振盪培養しその培餐物を種 とする。
次にグリセロー 3 * ,グ コース 0 · 1 * ,ボ べブト ン 0. 5* ，肉エキス 0· 5 *， lfaC10- 5 « , スティン 0· 1 から ¾る 地 1 20 を 2004容ステンレス製勞酵 itに λ 、その液性を 30* 水酸化ナトリウム溶液にて pH 7. 0 に！ ¾整し、 120X3で 20分間蒸 気滅菌したのち、前記種 Sを接重した。つ で S度 28 ¾ ,通気量 120 Ζ分，携拌回転数 180 Γ·ρ·Β·の条件下で 78時間培養した。 この培 養物を ャープレス遠心分 g機にかけ、菌体を分離し、上清液 1 10 i をえた。 4. 2 に調整しfeのち活拴炭（クロマト用 白サギ 武田 薬 S工業製） 1 5 Jを充てんした力ラムに通し活性 fe を吸疳させ水 45 Jで 後 50 TZT«ァセトン水 45 で溶出した。溶出液を 10 宛分画し、ヱ ヱリキア 'コ I 12734を被検菌としてセ フメノキ ム 0. 05 /Wを含有する肉汁寒天で有劲区分をしらべ、 フ，ク ヨン/ £2〜3を集めて水 20 を加えた後、 ダウエックス- 1 (C1) (米国 ダウ 'アンド'ケミカ / E荣製造） 10 Jを詰めた力， ムに通した。水 25 で ¾濂後、 5 «食¾水 50 Jで溶出した。有劫区 分を集め pH 4. 0 に ¾δ後、再び活性炭カラム （ 84 )に通し、水 24 で¾¾¾20 メタノー 水で溶 を行った。 有効区分を 50 Wまで ¾圧濃縮した後、 アセ トン 20 を加え、析出する沈でんを庐 取、 アセ ト ン 50· ，エーテ 10 ΟβΤΤ疣 ¾後、滅圧乾燥すると粗物 質 21 fが得られた。
とに得られ ¾S物 109を MZ100 »；ン酸瑷街液（ pH 6. 6) 500«に溶解し 7t後、罔緩衝液で緩衝化された <l A E Sephadex A 一 25 (スエーデン ， ファ マ^ア ¾ ^造）カラム 200"に通遏させ 吸蓊せしめた。 同瑗¾¾40 Orfでカラムを し、 0. 5*食 ¾を添 加した同 S街液 40 Orfでカラムを洗蘇後 1 «食¾を添加した同緩街液 で溶出を行った。 ^フラク ョンを集め、 K一 ¾酸を添加して液性を pfl 3· 0に詞整した後活性炭カヲム 6 に通過させた。 同カラムを 水 20 , 8 ィ、ノブタノ一 水で溶出を行い、有効プ，ク 3ンを集めて pH 5· 5に襄整したのち滅圧下に濃綰した後、 メタノー 5 を加えて溶屏し、 ^過後冷所に放置した。析出した結晶を 取し、 エーテ A^C¾濠後、 5羧化リン上で滅 SE 、 40 υ , 6時間乾燥し、 r
2 · *ノナトリゥム 锫晶 1 · 5 を得た。そ 外部吸収スぺク ト を第 3図に示す。元素分析疽 C 32.59, H 5.22, H 6.93, S
10.14, Ha 3.7 («)。
実旄例《
実 ½例 2で得られた F 2モノナト リク 0 *を水 3 に溶解 後、冷却し ¾がら K一水綾化ナト リウム約 1 · 5 Wを加えた後、 ρΗを ¾¾し¾がら注意して Κ一水酸化ナト ウムを加え ρΗ 7. 0 に講整し 後、凍結 を行ない白色粉末の I* 2ジナト ウム¾1 · 05 ,が得 られた。本品を 40 t 6時間滅圧乾燥したものの赤外部スぺク トラふは 第 4図に示される。 また元素分析 fitは C 30.83, H 5.35. K 6.9i , S 9. 68, K¾ 7. 3*
Figure imgf000022_0001
産棻上の利用可能性
抗菌性増強物質 F 2は、 ーヲクタム抗生物質の抗 ST作用を增^る 用を有し、 ^一ラクタム抗生物質と併用することによって、たとえば マウス、 ，プト、 ィヌ、人等の哺 ある は-！ トリ、 ァヒ の 家禽の細菌感染症の治療に用 ることができる。
0ΜΡΙ んー W V iS OO ,
て

Claims

請 求 の 範 囲 〔1〕 モノナト リウム ¾として次の物理化学的性状を有する抗菌拴增強 物 RF 2およびその ¾
(1) 外観：無色結晶性粉末
(2) 元素分析铒 ) ：
C 3 81 ± 1
Figure imgf000023_0001
S 0 81 ± 1
5 o o
Na 3 87± 0
(3) 紫外部吸収スぺクトル： 210 naは上に特異: 5:吸収を示さ 。
(4) 赤外部吸収スぺク ト ：臭化力 9ゥム錠による吸収スぺク ト の 主な吸収（波数）は次のとお である： '
1690， 1665, 1555, 1375, 1220, 1050, 820(c«一1)
(5) ： 〔《〕¾6 +6。±20 (H-CH3C00H)
(6) 溶解性：石油エーテ 、 へキサン、 ジヱチ エーテ A\ ベンゼン、 酷酸ヱチ よびクロロホ ムには不溶。 エタノー 、 ビリジンお よびアセトンには難溶。 メタノー/ ^ よびジメチ ス フォキシド には可溶。 水には易溶。
(7) 塊基性、 中性、酸性の区別：酸性 質
(8) 分子 it: 594±77 (モノナト リウム¾としてナトリウム含量 よ]?計算）
(9) 呈色反応：グレイグーリ一パプク反応 ·過マンガン酸力リウム試 薬に δ§¾ο -ンヒ ドリ ン試薬、坂口反応、 モーリッ ュ試薬に陰性。 〔2〕 ユードモナス属に属する抗菌性增強物質 F 2生産菌を培地に培
O'MPI ' 養し、培養物中に抗菌性増強物質 F 2を生成 せしめ、 とれを採取す ることを特¾とする抗菌性增強物質 F 2の製造法。
O PI
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