WO1993001210A2 - Hcv peptidantigene und verfahren zur bestimmung von hcv - Google Patents

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    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • HCV peptide antigens and method for determining HCV
  • the invention relates to new HCV peptide antigens, a method for producing these peptide antigens, and a method for determining HCV using the peptide antigens.
  • Hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis ⁇ virus, cytomegalovirus and Epstein-Barr virus) are referred to as non-A, non-B hepatitis (NANB hepatitis).
  • NANB hepatitis is in turn divided into parenterally and sporadically transmitted non-A, non-B hepatitis and enterally transmitted non-A, non-B hepatitis.
  • the causative agent, hepatitis C virus (HCV) has recently been isolated for parenterally and sporadically transmitted NANB hepatitis (Choo Q.-L. et. Al. Science 244 (1989) 359-362 and Kuo, G. et al. Science 244 (1989) 362-364).
  • HCV is a major cause of NANB hepatitis worldwide and is transmitted through contaminated blood or blood products, blood transmission or through close personal contact.
  • the amino acid sequence of the HCV virus proteins is over
  • EP-A 0 318 216, EP-A 0 363 025, EPA 388 232 and EP-A 0 396 748 are known.
  • the HCV genome is 10.862 nt in length.
  • the proteins resulting from translation have one Total length of approximately 3000 amino acids.
  • the proteins can be divided into structural proteins (shell and core proteins) and non-structural proteins (NS1 - NS5).
  • HCV is expediently determined by detecting antibodies against HCV in body fluids by immunological tests. Binding partners for anti-HCV antibodies are therefore required for such immunological tests.
  • non-structural C 100-3 HCV protein as a binding partner in immunological tests (tests by ABBOTT LABORATORIES, USA and ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS INC., USA; Science 244 (1989) 359-364; Van der Poel CL et al. Lancet 337 (1991) 317; Alter HJJ Gastroent. Hepatol. (Suppl.) 1990, 78).
  • the object of the present invention is therefore to provide peptide antigens which are specific for anti-HCV antibodies and are suitable for immunological tests for anti-HCV antibodies.
  • peptide antigens which are partial sequences of these peptide antigens of at least four, preferably at least seven, amino acid lengths. Suitable partial sequences are shown in the sequence listing and designated with letter / number combinations (eg 6 a, 2 b).
  • Particularly preferred partial sequences are: from sequence 2:
  • Partial sequences with a maximum length of 9 amino acids are particularly preferred.
  • these are the sequences 6b, 6d, 6e, 2e, 2f, 2d, 2g, 4a.
  • the peptide antigens with the sequences 1-3 are in the C 100-3 range of the HCV proteins and the peptide antigens with the
  • Sequences 1 - 8, 10 - 13 and the peptide antigen of sequence 9 are described by, -.
  • Anti-HCV antibody detection is carried out according to the methods familiar to the person skilled in the art. Another
  • the invention therefore relates to a method for determining HCV antibodies, which is characterized in that the sample with a combination of at least two peptide antigens from the group of sequences 1-13 or peptide antigens, the partial sequences of these peptide antigens of at least four, preferably of at least 7 amino acids in length, incubated and under conditions which allow the formation of an antibody-antigen complex, the amount of the ⁇ -the peptide antigen-bound anti-HCV antibodies is determined.
  • a combination of at least two of the peptide antigens according to the invention or partial sequences thereof is used. It is particularly preferred to combine the peptide antigens of the sequences 1-3 or partial sequences thereof with at least one peptide antigen from the group of the sequences 4-13 or partial sequences thereof.
  • Suitable partial sequences of sequence 9 are:
  • the antigens can be combined, for example, by using several individual peptide antigens or by peptide antigens being covalently bound to one another, expediently via an amino acid bridge which differs from amino acid sequence sequences naturally occurring in HCV proteins or a peptide linker.
  • Combinations of the antigens are particularly preferred:
  • the antigens are preferably used in approximately the same molar amounts.
  • the combination of the antigens with sequences 11, 12, 8a is particularly suitable for the detection of sera from patients in whom an HCV infection has healed (convalescence sera).
  • the antigens are preferably used individually, without covalent binding to one another, or covalently bound to one another using a peptide linker.
  • Infection parameters HCV is necessary, are preferably used for the detection of heterogeneous immunoassays. This
  • heterogeneous tests allow washing steps that significantly reduce the measurement signal background, thereby increasing the sensitivity.
  • the determination can be carried out by a radio immunoassay, enzyme immunoassay or by immunofluorescence.
  • the peptide antigen is usually immobilized for this purpose.
  • the sample which is to be tested for anti-HCV antibodies is added and the antibodies bound to the antigen are determined via a labeled anti-human immunoglobulin antibody.
  • the peptide antigen according to the invention can be immobilized by adsorption, covalently or via a biological binding pair such as biotin / streptavidin, antibody / antigen, or sugar / lectin.
  • the peptide antigen is covalently bound to this partner.
  • the peptide antigens according to the invention can preferably be used for immunoassays by methods familiar to the person skilled in the art, for example on beads, plastic tubes or microtiter plates (preferably polystyrene or copolymers of
  • polystyrene This is preferably done in that the peptide antigen is non-specifically adsorbed on the surface or is covalently bound to functionalized or activated surfaces.
  • the non-specific adsorption can be improved by combining the peptide antigen with a protein to form a conjugate and using this conjugate for adsorption (cf., for example, EP-A 0 269 092).
  • the bin fertilization can also be carried out using an immobilized antibody.
  • the peptide antigen should be changed so that the EDitop is not due to the binding of the antibody
  • the peptide antigen is preferably conjugated to the binding partner via a spacer.
  • This spacer expediently contains 10-50, preferably 10-30 atoms and is also preferably an essentially linear molecule. Examples include spacers made from alkyl, polyether or
  • a peptide antigen with a length of 4-9 amino acids is bound to the support via a linear spacer of 10-30 atoms. If a spacer of amino acids is to be used, it expediently consists of amino acids which do not correspond to the sequence sequence in the immediate vicinity of the peptide antigen in the HCV gene.
  • the peptide antigen according to the invention is covalently bound to biotin, the immobilization taking place via an avidin / streptavidin solid phase.
  • Determination methods are also suitable, in which the detection is carried out not via a labeled antibody but via a labeled, further peptide antigen, sequences 1-13 or partial sequences thereof.
  • the peptide antigens according to the invention can be prepared by the methods for peptide synthesis familiar to the person skilled in the art.
  • Another object of the invention is therefore a method for producing the peptide antigen according to the invention, which consists in that the C-terminal end forming amino acid is bound to a support, the peptide antigen is built up step by step from the C-terminal end and is then cleaved from the support.
  • an amino acid is linked to an insoluble, easily filterable polymer via its carboxy group, for example, and the peptide chain is then built up step by step from the C-terminal end.
  • an N-protected amino acid is reacted with a reactive grouping of the synthetic resin.
  • the N ⁇ protecting group is removed from the amino acid covalently anchored to the carrier particle and the resulting aminoacyl polymer is reacted with the next N-protected amino acid.
  • the N ⁇ protecting group is removed from the dipeptide covalently bound to the carrier resin and the resulting aminoacyl polymer is reacted with the next N-protected amino acid. Any excess
  • Reagents and by-products are removed by simple filtration. Once the desired peptide sequence has been produced in this way, the covalent bond between the C-terminal amino acid and the anchor group of the polymeric support is cleaved. The insoluble carrier is removed from the peptide now in solution by simple filtration. The peptide is purified using chromatographic methods.
  • the peptide antigens according to the invention can be prepared according to Merrifield, JACS 85 (1964) 2146. Any biotinylation that may be required can be carried out, for example, according to PNAS USA 80 (1983) 4045.
  • a preferred biotinylating agent for this is biotinylaminocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester.
  • a preferred method for the production of biotinylated peptide antigens is the introduction of the biotin residue at the N-terminus during a solid phase synthesis of the peptide antigen. This method is preferably used when the peptide antigen contains several ⁇ -lysine amino groups which are not to be biotinylated.
  • Example uses dicyclohexylcarbodiimide or as an active ester.
  • a detection antibody which is directed, for example, against the Fc part of human IgG is immobilized.
  • a monoclonal antibody is preferably used for this.
  • the peptide antigen is then in solution.
  • Sample liquid is bound by the wall antibody.
  • the bound antibody can then bind the analyte, which is labeled with a suitable detection system, e.g. can be detected competitively with a peptide antigen-enzyme conjugate.
  • peptide antigens according to the invention it is also possible to obtain antibodies by means of the immunization methods known to the person skilled in the art, with which the virus itself can be detected in an immunological test.
  • Another object of the invention is therefore a method for the production of antibodies, which is characterized in that a mammal is immunized with a peptide according to the invention, which is optionally bound to a carrier, and the antibodies by known methods e.g. can be obtained from the serum or spleen.
  • the invention therefore furthermore relates to a method for the determination of HCV viruses, which is characterized in that the sample is incubated with an antibody according to the invention under conditions which permit antigen-antibody complex formation, and the amount of the antibody-antigen complex formed is determined .
  • Another object of the invention is a method for the production of vaccines using the peptide antigens according to the invention and a vaccine for the treatment of HCV infections, containing as the immunogen an optionally carrier-bound peptide antigen of the sequences 1-8, 10-13 or partial sequences thereof or at least two peptide antigens of sequences 1-13 or partial sequences thereof in a pharmacologically effective dose and in a pharmaceutically acceptable formulation.
  • peptide antigens are preferably first lyophilized and then, if appropriate
  • Vaccination with the vaccine or vaccine combinations according to the invention can be carried out by the methods familiar to the person skilled in the art, for example intradermally, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously, subcutaneously and intranasally.
  • the vaccine can be suspended, for example, in physiological saline his.
  • the vaccine can be used for intranasal or intraoccular application, for example in the form of a spray or an aqueous solution.
  • inactivation for example against proteolytic enzymes in the oral cavity or in the stomach.
  • temporary protection can be provided, for example, by encapsulating the immunogens. This encapsulation can, for example, be covered with a protective agent
  • Microencapsulation or when embedding a large number of immunogens according to the invention in a protective carrier (macroencapsulation).
  • the encapsulation material can be semipermeable or become semipermeable when introduced into the human or animal body.
  • a biodegradable substance is usually used as the carrier for the encapsulation.
  • the peptide was prepared using Fmoc (fluorenyloxycarbonyl) solid phase synthesis. The reactions were on one
  • the coupling success was checked by means of the Kaiser test (Anal. Biochemistry 34 (1970) 595), the resin loading was determined by means of UV absorption of the released fulven group after each piperidine cleavage.
  • the peptide was synthesized on 5 g of Wang resin (polystyrene / 1% divinylbenzene) with a charge of 0.50 mmol / g (JACS 95 (1973) 1328). After the synthesis, the degree of loading was still 0.39 mmol / g.
  • the release of the peptide was treated with 200 ml of trifluoroacetic acid, 200 ml of dichloromethane, 10 ml of ethanedithiol, 10 ml of m-cresol, 5 ml of ethyl methyl sulfide and 5 ml of water in 30 minutes at room temperature.
  • the cleavage solution was concentrated several times with toluene, then the peptide was precipitated with diethyl ether.
  • reaction mixture was stirred for 2 hours at room temperature under argon under constant control by means of analytical RP-HPLC. If ⁇ 5% educt was present, the reaction mixture was placed directly on a preparative RP-HPLC column and the product material by means of a 0.1% trifluoroacetic acid / water to 0.1% trifluoroacetic acid / acetonitrile gradient (gradient: 0% to 100% in 90 Minutes). The product material was obtained by concentrating and lyophilizing the product fractions. The yields were between 40% and 90%.
  • HPLC HPLC, HPCE and TLC for the purity, FAB-MS (Molpeak) and TLC with specific staining reagents (p-dimethylaminocinnamaldehyde on biotin) and content determination via microanalysis (nitrogen) served as analytics.
  • HCV antibodies are determined in a 2-step sandwich immunoassay.
  • the reagents are labeled as follows
  • the cutoff for a positive signal in the ELISA is defined as the mean absorbance at 420 nm plus 3 standard deviations of a collective of 10 negative control sera. The samples were measured at a sample dilution of 1: 250).
  • Serum 1 was negative in the Ortho HCV antibody ELISA test system from ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS INC. however positive due to the clinical picture.
  • Sera 2-5 were tested by Ortho Laboratories, sera 6 and 7 with ABBOTT HCV EIA, Cat.No. 3 A53-24, ABBOTT LABORATORIES INC. identified as positive.
  • the peptide antigens 1 - 6 were solid-phase biotinylated with dimethoxytrityl-biotin on the ⁇ -amino group of an additional N-terminally introduced lysine.
  • the peptide antigen mixtures 1 + 4 and 3 + 6 were used in a molar mixing ratio of 1: 1.
  • Serum (1:10 diluted in 50 ⁇ l incubation buffer and 100 ⁇ l reagent 1) is added to each well (well) of a streptavidin-coated microtiter plate. The mixture is incubated for one hour at room temperature and then washed five times with 200 ⁇ l wash solution. 150 ⁇ l reagent are added 2, incubated for one hour at room temperature and washed three times with 200 ⁇ l of washing solution, 150 ⁇ l of color reagent are added, incubated for one hour at room temperature and the absorbance measured at 420 nm photometrically.
  • Tables II, III, IV, V, VI and VII show the results.
  • Table II means:
  • Ortho Relative size of the measurement signal in the Ortho test (cf.
  • Table III empty field like table II full circle: measured value four times blank or greater at 50 ng
  • Peptide ro bowl empty circle: measured value triple blank or greater at 50 ng peptide per well. nt: measurement not carried out
  • Reagent 1 is a mixture of 10 ng each of the above
  • the peptide mixtures each contained 50 ng of the individual peptides.
  • Sequence 2b 50 ⁇ g / ml Sequence 2d 100 ⁇ g / ml
  • the cutoff for a positive signal in the immunoassay as example 3 is defined as the mean absorbance at 420 nm plus 2 standard deviations of a collective of 6 negative control sera.
  • the samples are diluted 1: 100 with incubation buffer).

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Abstract

Es werden neue HCV Peptidantigene, die Teilsequenzen des C-100-3 und env/core mit C-Bereich darstellen, beschrieben. Diese Peptidantigene sind zur Bestimmung von HCV-Antikörpern als Immunogene zur Herstellung von Antikörpern gegen HCV und als Vakzine zur Herstellung von Impfstoffen gegen HCV geeignet.

Description

HCV Peptidantigene und Verfahren zur Bestimmung von HCV
Die Erfindung betrifft neue HCV Peptidantigene, ein Verfahren zur Herstellung dieser Peptidantigene, sowie ein Verfahren zur Bestimmung von HCV unter Verwendung der Peptidantigene.
Das Vorkommen von Virushepatitis in Abwesenheit serologischer Marker von bisher bekannten hepatotropen Agenzien (z.B.
Hepatitis-A-Virus, Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-Δ-Virus, Cytomegalie-Virus und Epstein-Barr-Virus) wird als Non-A, Non-B-Hepatitis (NANB-Hepatitis) bezeichnet. NANB-Hepatitis wird wiederum unterteilt in parenteral und sporadisch übertragene Non-A, Non-B-Hepatitis und enteral übertragene Non-A, Non-B-Hepatitis. Für die parenteral und sporadisch übertragene NANB-Hepatitis wurde vor kurzem das ursächliche Agenz, das Hepatitis-C-Virus (HCV) isoliert (Choo Q.-L. et. al. Science 244 (1989) 359 - 362 und Kuo, G. et. al. Science 244 (1989) 362 - 364).
HCV ist weltweit eine wichtige Ursache von NANB-Hepatitis und wird durch kontaminiertes Blut oder Blutprodukte, Blutübertragungen oder durch engen persönlichen Kontakt übertragen.
Die Aminosäπresequenz der HCV-Virusproteine ist aus
EP-A 0 318 216, EP-A 0 363 025, EPA 388 232 und EP-A 0 396 748 bekannt. Das Genom des HCV hat eine Länge von 10,862 nt. Die durch Translation hervorgehenden Proteine besitzen eine Gesamtlänge von ca. 3000 Aminosäuren. Die Proteine lassen sich in Strukturproteine (Hülle- und Kernproteine) und NichtStrukturproteine (NS1 - NS5) einteilen.
Die Bestimmung von HCV erfolgt zweckmäßig dadurch, daß durch immunologische Tests Antikörper gegen in Körperflüssigkeiten HCV nachgewiesen werden. Für derartige immunologische Tests werden deshalb Bindepartner für Anti-HCV-Antikörper benötigt.
So ist es bekannt, in immunologischen Tests beispielsweise das nicht-strukturelle C 100-3-HCV-Protein als Bindepartner zu verwenden (Tests von ABBOTT LABORATORIES, USA und ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS INC., USA; Science 244 (1989) 359 - 364; Van der Poel C. L. et. al. Lancet 337(1991)317; Alter H.J. J. Gastroent. Hepatol. (suppl.) 1990, 78).
Nachteil dieser Tests ist , daß als Antigen ein rekombinantes Protein verwendet wird. Proteine sind wegen ihrer Denaturierungsanfälligkeit und damit verringerter Löslichkeit und Funktion in diagnostischen Tests schwer zu handhaben. Auch die Größe des Meßsignals ist aufgrund der niedrigen Epitopdichte auf einem Protein geringer als bei einem Test, bei dem ein kurzkettiges Peptidantigen als Bindepartner des Antikörpers verwendet wird. Weiter können bei Verwendung von Proteinen oder langkettigen Peptiden als Antigene in einem
immunologischen Test vermehrt Kreuzreaktivitäten und unspezifische Bindungen von Antikörpern auftreten. Reaktionen mit Proteinen sind zudem oft diffusionskontrolliert, was den erwünschten kurzen Zeiten für immunologische Tests entgegensteht. Außerdem ist die Herstellung von für die Diagnostik einsetzbarem Protein in ausreichender Menge und Qualität zeitraubend und kostenintensiv. Peptide sind durch Synthese leicht zugänglich und sind definierte Moleküle. Es ist demzufolge vorteilhaft, in einem immunologischen Test auf Anti-HCV-Antikörper möglichst kurzkettige Peptidantigene, die nur Ausschnitte der gesamten Proteine darstellen, zu verwenden. Ein derartiges immunologisches Verfahren ist von Okamoto (Japan J. Exp. Met. 60 (1990) 223 - 234) beschrieben. Es hat sich jedoch gezeigt, daß das dort beschriebene kurzkettige Peptidantigen (Sequenz 9), welches aus der core-Region stammt, nicht ausreichend sensitiv für HCV ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, Peptidantigene zur Verfügung zu stellen, die spezifisch für Anti-HCV-Antikörper sind und für immunologische Tests auf Anti-HCV-Antikörper geeignet sind.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Peptidantigene der Sequenzen
1: SerGlyLysProAlallelleProAspArgGluValLeuTyrArgGluPheAsp
2 : GluCysSerGlnHisLeuProTyrlleGluGlnGlyMetMetLeuAlaGluGlnPhe¬
LysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSerArgGln
3 : AlaValGlnThrAsnTrpGlnLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsn 4 : AsnProLysProGlnLysLysAsnLysArgAsnThrAsnArgArg
5 : AsnProLysProGlnArgLysThrLysArgAsnThrAsnArgArg
6 : ProGlnAspValLysPheProGlyGlyGlyGlnlleValGlyGlyVal
7 : ProArgGlySerArgProSerTrpGlyProThrAspProArgArg
8 : GlnLeuPheThrPheSerProArgArgHisTrpThrThrGlnGlyCysAsnCys¬
SerlleTyrProGlyHisIleThrGlyHisArgMetAlaTrpAspMetMetMet¬
AsnTrpSerProThrThrAlaLeuValMetAla
10:GlnLysLysAlaAlaArgAsnThrAsnArgArg
H:HisTrpThrThrGlnGlySerAsnSerSerIleTyrProGlyHis
12 : SerSerlleTyrProGlyHisIleThrGlyHisArgMetAlaTrpAspMetMet 13 :ProGluGlyArgThrTrpAlaGlnProGlyTyrProTrpProLeuTyr oder Peptidantigene, die Teilsequenzen dieser Peptidantigene von mindestens vier, vorzugsweise von mindestens sieben, Aminosäuren Länge darstellen. Geeignete Teilsequenzen sind in den Sequenzprotokollen dargestellt und mit Buchstaben/Zahl-Kombinationen (z.B. 6 a, 2 b) bezeichnet.
Besonders bevorzugte Teilsequenzen sind: aus Sequenz 2:
GluCysSerGlnHisLeuProTyrlleGluGlnGlyMetMetLeu
(Sequenz 2a)
MetMetLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAla
(Sequenz 2b)
MetMetLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSerArg Gln (Sequenz 2c)
HisLeuProTyrlleGlu (Sequenz 2d)
Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln (Sequenz 2e)
Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln (Sequenz 2f) Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr (Sequenz 2g) aus Seσuenz 4;
Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg (Sequenz 4a) aus Sequenz 61
ProGlnAspValLysPheProGlyGlyGlyGlnlle (Sequenz 6a)
Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Phe (Sequenz 6b)
Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val (Sequenz 6d) Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly (Sequenz 6e)
Besonders bevorzugt werden Teilsequenzen, deren Länge maximal 9 Aminosäuren beträgt. Insbesondere sind dies die Sequenzen 6b, 6d, 6e, 2e, 2f, 2d, 2g, 4a.
Die Peptidantigene mit den Sequenzen 1 - 3 sind im C 100-3-Bereich der HCV-Proteine und die Peptidantigene mit den
Sequenzen 4 - 8, 10 - 13 im env/core-Bereich der HCV-Proteine enthalten. Die erfindungsgemäßen Peptidantigene mit den
Sequenzen 1 - 8, 10 - 13 und das Peptidantigen der Sequenz 9 (ArgGlyProArgLeuGlyValArgAlaThrArgLysThrSerGluArgSerGln¬ProArgGlyArgArgGlnProIleProLysAlaArgArgProGluGlyArgThr¬TrpAlaGlnProGlyTyrProTrpPro, Okamoto loc. cit) sind durch die Sequenzprotokolle SEQ ID NO: 1 - 32 beschrieben.
Die Durchführung eines Anti-HCV-Antikörper-Nachweis erfolgt nach den dem Fachmann geläufigen Methoden. Ein weiterer
Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Bestimmung von HCV-Antikörpern, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Probe mit einer Kombination von mindestens zwei Peptidantigenen aus der Gruppe der Sequenzen 1 - 13 oder Peptid-antigenen, die Teilsequenzen dieser Peptidantigene von mindestens vier, vorzugsweise von mindestens 7, Aminosäuren Länge darstellen, inkubiert und unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-Antigenkomplexes ermöglichen, die Menge der aβ-das Peptidantigen gebundenen Anti-HCV-Antikörper bestimmt wird.
Erfindungsgemäß wird eine Kombination von mindestens zwei der erfindungsgemäßen Peptidantigene oder Teilsequenzen davon verwendet. Besonders bevorzugt ist es, die Peptidantigene der Sequenzen 1 - 3 oder Teilsequenzen davon mit mindestens einem Peptidantigen aus der Gruppe der Sequenzen 4 - 13 oder Teilsequenzen davon zu kombinieren. Geeignete Teilsequenzen von Sequenz 9 sind:
ArgGlyProArgLeuGlyValArgAlaThrArgLysThrSerGlnArgSerGlnProArg Gly (Sequenz 9a)
SerGlnProArgGlyArgArgGlnProIleProLysAlaArgArgProGluGlyArgThr (Sequenz 9b).
Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr (Sequenz 9c)
Die Kombination der Antigene kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß mehrere einzelne Peptidantigene verwendet werden oder daß Peptidantigene kovalent, zweckmäßig über eine Aminosäurenbrücke, die sich von natürlicherweise in HCV-Proteinen vorkommenden Aminosäuren-Sequenzfolgen unterscheidet oder einen Peptid-Linker, aneinander gebunden sind.
Besonders bevorzugt sind Kombinationen der Antigene:
Sequenz 2b, 4 und 6
Sequenz 2b, 2c, 4 und 6
Sequenz 2a, 2b, 2c, 4 und 6
Sequenz 2a, 2b, 2c, 4, 6, 9a und 9b
Sequenz 2a, 2b, 4, 6, 9a und 3
Sequenz 2a, 2b, 4, 6 und 9a
-Sequenz 2e, 2g, 4a, 6d, 6e
Sequenz 2d, 2f, 4a, 6c, 9c
Sequenz 11, 12, 8a
In Kombinationen werden die Antigene bevorzugt in etwa gleichen molaren Mengen verwendet.
Die Kombination der Antigene mit den Sequenzen 11, 12, 8a ist besonders geeignet zur Erkennung von Seren von Patienten, bei denen eine HCV-Infektion ausgeheilt ist (Rekonvaleszenzseren). Vorzugsweise werden die Antigene einzeln, ohne kovalente Bindung aneinander, oder kovalent aneinander gebunden unter Verwendung eines Peptid-Linkers eingesetzt.
Auf Grund der erhöhten Empfindlichkeit, die bei dem
Infektionsparameter HCV notwendig ist, werden vorzugsweise zum Nachweis heterogene Immunoassays verwendet. Diese
heterogenen Tests erlauben Waschschritte, die den MeßsignalHintergrund erheblich reduzieren wodurch die Empfindlichkeit gesteigert wird.
Beispielsweise kann die Bestimmung durch einen Radio-Immunoassay, Enzym-Immunoassay oder durch Immunfloureszenz erfolgen. Üblicherweise wird hierzu das Peptidantigen immobilisiert. Die Probe, welche auf Anti-HCV-Antikörper untersucht werden soll, wird zugegeben und die an das Antigen gebundenen Antikörper über einen markierten Anti-Human-ImmunglobulinAntikörper bestimmt. Die Immobilisierung des erfindungsgemäßen Peptidantigens kann adsorbtiv, kovalent oder über ein biologisches Bindungspaar wie Biotin/Streptavidin, Antikörper/Antigen, oder Zucker/Lektin erfolgen. Dabei wird das Peptidantigen an diesen Partner kovalent gebunden.
Die erfindungsgemäßen Peptidantigene können für Immunoassays vorzugsweise nach dem Fachmann geläufigen Methoden, beispielsweise an Kugeln (beads), Kunststoffröhrchen oder Mikrotiterplatten (bevorzugt Polystyrol oder Copolymere von
Polystyrol), immobilisiert werden. Dies erfolgt vorzugsweise dadurch, daß das Peptidantigen unspezifisch an der Oberfläche adsorbiert oder kovalent an funktionalisierte oder aktivierte Oberflächen gebunden wird. Die unspezifische Adsorption kann dadurch verbessert werden, daß man das Peptidantigen mit einem Protein zu einem Konjugat verknüpft und dieses Konjugat zur Adsorption verwendet (vgl. z.B. EP-A 0 269 092). Die Bin düng kann auch über einen immobilisierten Antikörper erfolgen. Dazu sollte das Peptidantigen so verändert werden, daß das EDitop nicht durch die Bindung des Antikörpers
blockiertwird z.B. durch Bildung eines Peptid-ProtemKonjugats.
Die Konjugation des Peptidantigens an den Bindungspartner erfolgt vorzugsweise über einen Spacer. Dieser Spacer enthält zweckmäßig 10 - 50, vorzugsweise 10 - 30 Atome und ist ebenfalls bevorzugt ein im wesentlichen lineares Molekül. Beispiele hierfür sind Spacer aus Alkyl-, Polyether- oder
»olvamidketten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein Peptidantigen einer Länge von 4 - 9 Aminosäuren über einen linearen Spacer von 10 - 30 Atomen an den Träger gebunden. Falls ein Spacer aus Aminosäuren verwendet werden soll besteht dieser zweckmäßig aus Aminosäuren, die nicht der Sequenzfolge in unmittelbarer Umgebung des Peptidantigens im HCV-Gen entsprechen. in einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Peptidantigen kovalent an Biotin gebunden, wobei die Immobilisierung über eine Avidin/Streptavidin-Festphase erfolgt.
Ebenso geeignet sind Bestimmungsverfahren, bei denen die Detektion nicht über einen markierten Antikörper, sondern über ein markiertes, weiteres Peptidantigen Sequenzen 1 - 13 oder Teilsequenzen davon erfolgt.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Peptidantigene ist nach den dem Fachmann geläufigen Methoden zur Peptidsynthese möglich. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Peptidantigens, welches darin besteht, daß die das C-terminale Ende bildende Aminosäure an einen Träger gebunden wird, vom C-terminalen Ende das Peptidantigen schrittweise aufgebaut und anschließend vom Träger abgespalten wird.
Im einzelnen wird dazu eine Aminosäure beispielsweise über ihre Carboxygruppe an ein unlösliches, leicht filtrierbares Polymer geknüpft, und dann vom C-terminalen Ende her die Peptidkette schrittweise aufgebaut. Zu diesem Zweck wird eine N-geschützte Aminosäure mit einer reaktiven Gruppierung des Kunstharzes zur Reaktion gebracht. Von der am Trägerpartikel kovalent verankerten Aminosäure wird die Nα-Schutzgruppe entfernt und das resultierende Aminoacylpolymer mit der nächsten N-geschützten Aminosäure umgesetzt. Von dem am Trägerharz kovalent gebundenen Dipeptid wird die Nα-Schutzgruppe entfernt und das resultierende Aminoacylpolymer mit der nächsten N-geschützten Aminosäure umgesetzt. Alle überschüssigen
Reagentien und Beiprodukte werden durch einfaches Filtrieren entfernt. Ist die gewünschte Peptidsequenz auf diese Weise hergestellt, wird die kovalente Bindung zwischen der C-terminalen Aminosäure und der Ankergruppierung des polymeren Trägers gespalten. Der unlösliche Träger wird durch einfache Filtration von dem nun in Lösung befindlichen Peptid entfernt. Das Peptid wird mittels chromatographischer Methoden gereinigt.
Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Peptidantigene nach Merrifield, JACS 85(1964)2146 hergestellt werden. Eine gegebenenfalls erforderliche Biotinylierung kann beispielsweise nach PNAS USA 80 (1983) 4045 erfolgen. Ein bevorzugtes Biotinylierungsmittel hierfür ist Biotinylaminocapronsäure-N- hydroxysuccinimidester.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von biotinylierten Peptidantigenen ist die Einführung des Biotinrestes am N-Terminus während einer Festphasensynthese des Peptidantigens. Dieses Verfahren wird bevorzugt dann verwendet, wenn das Peptidantigen mehrere ∈-Lysin-Aminogruppen enthält, die nicht biotinyliert werden sollen. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn man N-α-Fmoc-N-∈-biotinyl-aminocaproyl)lysin, N-α- Fmoc-N-∈-Biotinyllysin oder bei Biotinylierung der N-terminalen Aminosäuren Biotin, Biotinylaminocapronsäure oder Dimethoxytritylbiotin mit einem Aktivierungsreagenz wie zum
Beispiel Dicyclohexylcarbodiimid oder als Aktivester einsetzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Nachweisantikörper der beispielsweise gegen den Fc-Teil von humanem IgG gerichtet ist, immobilisiert. Vorzugsweise wird hierzu ein monoklonaler Antikörper verwendet. Das Peptidantigen befindet sich dann in Lösung. Der nachzuweisende Antikörper (Analyt) und auch alle anderen Antikörper der
Probenflüssigkeit werden vom Wandantikörper gebunden. Der gebundene Antikörper kann dann den Analyten binden, der mit einem geeigneten Nachweissystem, z.B. kompetitiv mit einem Peptidantigen-Enzymkonjugat nachgewiesen werden kann.
Mit den erfindungsgemäßen Peptidantigenen ist es auch möglich, durch die dem Fachmann geläufigen Verfahren der Immunisierung Antikörper zu erhalten, mit denen das Virus selbst in einem immunologischen Test nachgewiesen werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Säugetier mit einem erfindungsgemäßen Peptid, welches gegebenenfalls an einen Träger gebunden ist, immunisiert wird und die Antikörper nach bekannten Verfahren z.B. aus dem Serum oder der Milz gewonnen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden B-Lymphozyten der immunisierten Tiere in Gegenwart von transformierenden Agen zien mit einer geeigneten Zellinie fusioniert, die Zellinie, welche die gewünschten Antikörper produziert, kloniert und kultiviert und aus den Zellen oder dem Kulturüberstand die monoklonalen Antikörper gewonnen.
Mit diesem Antikörper ist es möglich, HCV-Viren direkt zu bestimmen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Bestimmung von HCV-Viren, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Probe mit einem erfindungsgemäßen Antikörper unter Bedingungen, die eine Antigen-Antikörperkomplexbildung erlauben, inkubiert, und die Menge des gebildeten Antikörper-Antigenkomplexes bestimmt wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Peptidantigene sowie ein Vakzin zur Behandlung von HCV-Infektionen, enthaltend als Immunogen ein gegebenenfalls trägergebundenes Peptidantigen der Sequenzen 1 - 8, 10 - 13 oder Teilsequenzen davon oder mindestens zwei Peptidantigene der Sequenzen 1 - 13 oder Teilsequenzen davon in einer pharmakologisch effektiven Dosis und in einer pharmazeutisch akzeptablen Formulierung.
Die Herstellung dieser Impfstoffe kann nach den bekannten Methoden durchgeführt werden. Bevorzugt werden jedoch die Peptidantigene zunächst lyophilisiert und anschließend, ggf.
unter Zusatz von Hilfsstoffen, suspendiert.
Die Impfung mit dem erfindungsgemäßen Vakzin oder Vakzinkombinationen kann durch die dem Fachmann geläufigen Methoden erfolgen, beispielsweise intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan und intranasal.
Zur intramuskulären oder subkutanen Gabe kann das Vakzin beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert sein. Zur intranasalen oder intraoccularen Applikation kann das Vakzin, beispielsweise in Form eines Sprays oder einer wäßrigen Lösung angewendet werden. Für lokale, beispielsweise orale Gabe ist es häufig erforderlich, die Immunogene zeitweise gegen Inaktivierung zu schützen, beispielsweise gegen proteolytische Enzyme in der Mundhöhle oder im Magen. Ein derartiger vorübergehender Schutz kann beispielsweise durch Verkapselung der Immunogene erfolgen. Diese Verkapselung kann beispielsweise durch Überziehen mit einem Schutzmittel
(Mikroverkapselung) oder bei Einbettung einer Vielzahl von erfindungsgemäßen Immunogenen in einen schützenden Träger (Makroverkapselung) erfolgen.
Das Verkapselungsmaterial kann semipermiabel sein oder beim Einbringen in den menschlichen oder tierischen Körper semipermeabel werden. Üblicherweise wird für die Verkapselung eine biologisch abbaubare Substanz als Träger verwendet.
Die nachfolgenden Beispiele und Sequenzprotokolle erläutern die Erfindung weiter.
In den Sequenzprotokollen bedeuten:
Sequenz SEQ ID NO
1 1
2 2
2 a 3
2 b 4
2 c 5
2 d 6
2 e 7
2 f 8
2 g 9
2 h 10 Sequenz SEQ ID NO
3 11
4 12
4 a 13
4 b 14
5 15
6 16
6 a 17
6 b 18
6 c 19
6 d 20
6 e 21
7 22
8 23
8 a 24
9 25
9 a 26
9 b 27
9 c 28
10 29
11 30
12 31
13 32
Beispiel 1
Synthese von H-ProArgGlySerArgProSerTrpGlyProThrAspProArgArg- OH
Das Peptid wurde mittels Fmoc (Fluorenyloxycarbonyl)-Festphasensynthese hergestellt. Die Reaktionen wurden an einem
Labortec (Schweiz) SP 640 Peptidsynthesizer durchgeführt. Die Kupplungsreaktionen wurden bezüglich Fmoc-Aminosäure-Derivat mit 2.4 Äquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid und 2.2
Äquivalenten N-Hydroxybenzotriazol während 90 Minuten durchgeführt. Als Reaktionsmedium kam Dimethylformamid zum Einsatz. Die Fmoc-Gruppe wurde mittels 20 % Piperiden in DMF in 10 und 20 Minuten abgespalten. 2.0 Äquivalente von den folgenden Aminosäure-Derivaten kamen zum Einsatz: Pro,
Arg(mit PMC (Pentamethylchroman)-Schutzgruppe), Gly, Ser(mit tert.-Butyl-Schutzgruppe), Trp, Thr(mit tert.-Butyl-Schutzgruppe), Asp(mit tert.-Butylester-Schutzgruppe). Die Kupplungsreaktionen wurden mit der Hälfte der Reagentien
wiederholt. Der Kupplungserfolg wurde mittels Kaiser-Test (Anal. Biochemistry 34(1970)595) geprüft, die Harzbeladung wurde mittels UV-Absorption der freigesetzten Fulven-Gruppe nach jeder Piperidin-Spaltung ermittelt. Das Peptid wurde an 5 g Wang-Harz (Polystyrol/l % Divinylbenzol) mit einer Ladung von 0.50 mMol/g synthetisiert (JACS 95(1973)1328). Nach der Synthese betrug der Beladungsgrad noch 0.39 mMol/g.
Die Freisetzung des Peptids wurde mit 200 ml Trifluoressigsäure, 200 ml Dichlormethan, 10 ml Ethandithiol, 10 ml m-Kresol, 5 ml Ethylmethylsulfid und 5 ml Wasser in 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Abspaltlösung wurde mehrmals mit Toluol eingeengt, dann das Peptid mit Diethylether gefällt.
Zur Entfernung der Scavenger und anderer kleiner Moleküle wurde das Rohmaterial über eine Sephadex GlO-Säule gereinigt. Es wurden nach Lyophilisieren 3.2 g Material einer Reinheit von 42 % (RP-HPLC) erhalten. Um das Material auf die Endreinheit von >95 % zu bringen, wurden 400 mg Peptid über eine präparative RP-HPLC-Säule (40mmx250mm) gefüllt mit C18-Material (5 Mikrometer, 300 Angström) und einem Wasser/Trifluoressigsäure-, Acetonitril/Trifluoressigsäure-Gradienten gereinigt. Es fielen nach Lyophilisation 118 mg 96.5 %iges (HPLC) weißes Material an. Die Identität des Materials wurde mittels FAB-MS geprüft. Beispiel 2
Zur Biotinylierung des Peptidantigens aus Beispiel 1 wurde ein Moläquivalent möglichst konzentriert (Löslichkeit ist von der Aminosäuresequenz abhängig) in Argon-gesättigtem Kaliumphosphatpuffer (0,1 mol/l, pH 8,0) gelöst und mit 3 Äquivalenten D-Biotinyl-€-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester gelöst in Argon-gesättigtem Dimethylformamid (Lösung von 1 μmol Reagenz in 5 μl DMF) versetzt.
Man rührte das Reaktionsgemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Argon unter ständiger Kontrolle mittels analytischer RP-HPLC. Wenn < 5% Edukt vorhanden waren, wurde der Reaktionsansatz direkt auf eine praparative RP-HPLC-Säule gegeben und das Produktmaterial mittels einem 0.1% Trifluoressigsäure/Wasser- zu 0.1% Trifluoressigsäure/ Acetonitril-Gradienten (Steigung: 0% auf 100% in 90 Minuten) gereinigt. Das Produktmaterial wurde durch Einengen und Lyophilisation der Produktfraktionen erhalten. Die Ausbeuten lagen zwischen 40 % und 90%. Als Analytik dienten für die Reinheit HPLC, HPCE und TLC, für die Identität FAB-MS (Molpeak) und TLC mit spezifischen Anfärbereagentien (p-Dimethylaminozimtaldehyd auf Biotin) und Gehaltsbestimmung über Mikroanalyse (Nitrogen).
Beispiel 3
HCV-Antikörper werden in einem 2-Schritt-Sandwich-Immunoassay bestimmt. Zum Nachweis werden die Reagentien mit folgender
Zusammensetzung verwendet:
Reagenz 1 :
0.10 μg/ml (Peptidantigene 1,3,4,5,6) oder 0.25 μg/ml (Peptidantigene 2,4,7), biotinyliertes Peptidantigen oder eine 1:1 Mischung solcher Peptidantigene 40 mmol/1 Phosphatpuffer pH 7.0
0.9 Gew.-% NaCl
10 Vol.-% Rinderserum
Reagenz 2 :
20 mU/ml eines Konjugats aus polyklonalem Antikörper gegen humanes Immunglobulin (Schaf) und Peroxidase
40 mmol/1 Phosphatpuffer pH 7.0
0.05 Gew.-% Tween® 20
0.2% Rinderserumalbumin
0.2% Rinder-IgG
In einem mit Streptavidin beschichteten Polystyrolröhrchen (hergestellt nach Beispiel 1 von EP-A 0 344 578) werden 1 ml Reagenz 1 und 10 μl Probe eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird dreimal mit Leitungswasser gewaschen und mit 1 ml Reagenz 2 für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird dreimal mit Leitungswasser gewaschen. Zur Nachweisreaktion werden 1 ml ABTS® (2,2'- Azino-di-[3-ethyl-benzthiazolinsulfonat (6)]-Diammoniumsalz, 1,9 mmol/l, in 100 mmol/l Phosphateitratpuffer pH 4.4 mit 3.2 mmol/1 Natrium-perborat) zugegeben. Nach 60 min wird die Extinktion bei 420 nm photometrisch gemessen. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 1:
Figure imgf000019_0001
Erläuterungen zu Tabelle 1:
-/+: negativ/positiv (Der Cutoff für ein positives Signal im ELISA ist definiert als die mittlere Extinktion bei 420 nm plus 3 Standardabweichungen eines Kollektivs von 10 negativen Kontrollseren. Die Proben wurden bei einer Probenverdünnung von 1:250 vermessen).
Serum 1 war negativ im Test im Ortho-HCV-Antikörper ELISA-Test-system von ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS INC. jedoch positiv aufgrund des klinischen Bildes.
Die Seren 2 - 5 wurden nach dem Test von Ortho Laboratories, die Seren 6 und 7 mit dem ABBOTT HCV EIA, Kat.No. 3 A53-24, ABBOTT LABORATORIES INC. als positiv identifiziert.
Die Peptidantigene 1 - 6 wurden mit Dimethoxytrityl-Biotin fest-phasenbiotinyliert an der ∈-Aminogruppe eines zusätzlich N-termi nal eingeführten Lysins.
Die Peptidantigenmischungen 1 + 4 und 3 + 6 wurden in einem molaren Mischungsverhältnis von 1:1 eingesetzt.
Beispiel 4
Es wurden weitere Seren mit Peptiden und Peptidmischungen in einem Zweischritt-Sandwich-Immunoassay auf mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten geprüft.
Die Durchführung der Bestimmung erfolgte weitgehend analog Beispiel 3. Dabei wurden folgende Reagentien verwendet:
Reagenz 1:
50 ng Peptid (oder die in den Tabellenerklärungen genannten Men gen) in 100 μl Inkubationspuffer (40 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,0, 0,9 Gew.-% NaCl, 10 Vol.-% Rinderserum. Reagenz 2 :
Konjugat aus polyklonalem Antikörper gegen humanes Immunglobulin (Schaf) und Peroxidase (Peroxidaseaktivität 20 mU/ml), 40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7,0, 0,05 Gew.-% Tweenc 20, 0,2 % Rinderserumalbumin, 0,2 % Rinder-IgG.
Waschlösung
40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7,0, 0,9 Gew.-% Natriumchlorid, 0,05 Gew.-% Tweenc 20.
Farbreagenz
10 mg ABTSc, 80 μl 0,4 % H2 O2 in 10 ml Citrat-Phosphatpuffer (pH 4,4, 100 mmol/l).
Pro Napf (well) einer mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatte werden Serum (1 : 10 verdünnt in 50 μl Inkubationspuffer und 100 μl Reagenz 1 zugegeben. Es wird eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend fünfmal mit je 200 μl Waschlosung gewaschen. Es werden 150 μl Reagenz 2 zugegeben, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal mit je 200 μl Waschlösung gewaschen. Es werden 150 μl Farbreagenz zugegeben, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und die Extinktion bei 420 nm photometrisch gemessen.
Die Tabellen II, III, IV, V, VI und VII zeigen die Ergebnisse. In den Tabellen bedeuten: Tabelle II:
Ortho: relative Größe des MeßSignals im Test von Ortho (vgl.
Beispiel 3. leeres Feld: Meßwert kleiner als zweifacher Leerwert oder
identisch mit Leerwert (bestimmt mit biotinyliertem, mit HCV-Antikörpern nicht reaktivem Peptid (nonsens-Sequenz)). voller Kreis: Meßwert dreifacher Leerwert oder größer bei 50 ng
Peptid pro Napf. leerer Kreis: Meßwert zweifacher Leerwert bei 50 ng Peptid pro
Napf volles
Quadrat: Meßwert dreifacher Leerwert oder größer bei 250 ng
Peptid pro Napf. leeres
Quadrat: Meßwert zweifacher Leerwert oder größer bei 250 ng
Peptid pro Napf.
* : Negativkontrollen
Tabelle III leeres Feld: wie Tabelle II voller Kreis: Meßwert vierfacher Leerwert oder größer bei 50 ng
Peptid ro Napf. leerer Kreis: Meßwert dreifacher Leerwert oder größer bei 50 ng Peptid pro Napf. n.t.: Messung nicht durchgeführt
2a, 2b, 3, 4,
6 : Anstelle eines einzelnen Peptidantigens wurde in
Reagenz 1 eine Mischung aus je 10 ng der genannten
Peptide verwendet.
* : Negativkontrollen
Tabelle IV
Die Bedeutung der Symbole entspricht den Angaben zu Tabelle II.
Die Peptidmischungen enthielten jeweils 50 ng der einzelnen Peptide.
Beispiel 5:
Tabellen V, VI und VII
Ergebnisse von Immunoassays analog Beispiel 3, wobei im Reagenz 1 folgende Peptidkonzentrationen eingesetzt wurden:
Bei Verwendung von mehreren Antigenen in Kombination werden die Einsatzmengen entsprechend der Anzahl der verschiedenen Antigene reduziert.
Sequenz 2a 50 μg/ml
Sequenz 2b 50 μg/ml Sequenz 2d 100 μg/ml
Sequenz 2f 100 μg/ml
Sequenz 2h 100 μg/ml
Sequenz 4 400 μg/ml
Sequenz 4a 350 μg/ml
Sequenz 4b 250 μg/ml
Sequenz 4c 300 μg/ml
Sequenz 6 350 μg/ml
Sequenz 6a 350 μg/ml
Sequenz 6b 350 μg/ml
Sequenz 6c 250 μg/ml
Sequenz 6d 300 μg/ml
Sequenz 8a 900 μg/ml
Sequenz 9a 350 μg/ml
Sequenz 9c 350 μg/ml
Sequenz 11 300 μg/ml
Sequenz 12 550 μg/ml
+/- : pos./neg. (Der Cutoff für ein positives Signal im Immunoassay wie Beispiel 3 ist definiert als die mittlere Extinktion bei 420 nm plus 2 Standardabweichungen eines Kollektivs von 6 negativen Kontrollseren. Die Proben sind mit Inkubationspuffer 1 : 100 verdünnt).
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0002
SEQ ID NO: 1
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQÜENZLÄNGE: 18 Aminosäuren
Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg
5 10 15
Glu Phe Asp
SEQ ID NO: 2
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQÜENZLÄNGE: 33 Aminosäuren
Glu Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met Leu
5 10 15
Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala
20 25 30
Ser Arg Gln
SEQ ID NO: 3
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQÜENZLÄNGE: 15 Aminosäuren
Glu Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met Leu
5 10 15
SEQ ID NO: 4
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQÜENZLÄNGE: 18 Aminosäuren
Met Met Leu Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu
5 10 15 Gln Thr Ala SEQ ID NO: 5
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQÜENZLÄNGE: 21 Aminosäuren
Met Met Leu Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu
5 10 15 Gln Thr Ala Ser Arg Gln
20
SEQ ID NO: 6
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQÜENZLÄNGE: 6 Aminosäuren
His Leu Pro Tyr Ile Glu
5
SEQ ID NO: 7
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQÜENZLÄNGE: 9 Aminosäuren
Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln
5
SEQ ID NO: 8
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 7 Aminosäuren
Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln
5 SEQ ID NO: 9
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 9 Aminosäuren
Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr
5
SEQ ID NO: 10
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQÜENZLÄNGE: 10 Aminosäuren Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala
5 10
SEQ ID NO: 11
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 19 Aminosäuren
Ala Val Gln Thr Asn Trp Gln Lys Leu Glu Thr Phe Trp Ala Lys
5 10 15
His Met Trp Asn
SEQ ID NO: 12
ART DER-SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 15 Aminosäuren
Asn Pro Lys Pro Gln Lys Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg
5 10 15 SEQ ID NO: 13
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 9
Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg
5
SEQ ID NO: 14
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 10 Aminosäuren Gln Lys Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg
5 10
SEQ ID NO: 15
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 15 Aminosäuren
Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Ar
5 10 1
SEQ ID NO: 16
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQÜENZLÄNGE: 16 Aminosäuren
Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gl
5 10 1
Val SEQ ID NO: 17
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 12 Aminosäuren
Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile
5 10
SEQ ID NO: 18
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 9 Aminosäuren
Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Phe
5
SEQ ID NO: 19
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 12 Aminosäuren Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val
5 10
SEQ ID NO: 20
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 9 Aminosäuren
Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val
5 SEQ ID NO: 21
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 9 Aminosäuren Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly
5
SEQ ID NO: 22
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 15 Aminosäuren
Pro Arq Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg
5 10 15
SEQ ID NO: 23
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 47 Aminosäuren Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Gly
5 10 15
Cvs Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met
20 25 30
Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val
35 40 45
Met Ala
SEQ ID NO: 24
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 18 Aminosäuren
Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu
5 10 15
Val Met Ala SEQ ID NO: 25
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 45 Aminosäuren
Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu
5 10 15
Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg
20 25 30
Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro
35 40 45
SEQ ID NO: 26
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQÜENZLÄNGE: 21 Aminosäuren
Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu
5 10 15
Arg Ser Gln Pro Arg Gly
20
SEQ ID NO: 27
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 20 Aminosäuren
Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg
5 10 15
Pro Glu Gly Arg Thr
20 SEQ ID NO: 28
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 15 Aminosäuren
Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr
5 10 15
SEQ ID NO: 29
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 11 Aminosäuren
Gln Lys Lys Ala Ala Arg Asn Thr Asn Arg Arg
5 10
SEQ ID NO: 30
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 15 Aminosäuren
His Trp Thr Thr Gln Gly Ser Asn Ser Ser Ile Tyr Pro Gly His
5 10 15 SEQ ID NO: 31
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 18 Aminosäuren
Ser Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp
5 10 15
Asp Met Met
SEQ ID NO: 32
ART DER SEQUENZ: Peptid
SEQÜENZLÄNGE: 16 Aminosäuren
Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu
5 10 15
Tyr

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. HCV Peptidantigene mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 1, 2, 11, 12, 15, 16, 22, 23, 29-32 oder mit Teilsequenzen davon mit mindestens 4 Aminosäuren Länge.
2. HCV Peptidantigene nach Anspruch 1 mit Teilsequenzen von maximal 9 Aminosäuren Länge.
3. HCV Peptidantigene nach Anspruch 2 mit den Teilsequenzen
4. HCV Peptidantigene gemäß Anspruch 1 mit den Teilsequenzen SEQ ID NO: 3, 4, 5, 10, 14, 17, 19, 24.
5. Kombination von HCV-Peptidantigenen aus
SEQ ID NO: 4, 12, 16
SEQ ID NO: 4, 5, 12 und 16
SEQ ID NO: 3, 4, 5, 12 und 16
SEQ ID NO: 3, 4, 5, 12, 16, 26 und 27
SEQ ID NO: 3, 4, 11, 12, 16 und 26
SEQ ID NO: 3, 4, 12, 16 und 26
SEQ ID NO: 7 , 9, 13, 20, 21
SEQ ID NO: 6, 8, 13, 19, 28 oder
SEQ ID NO: 25, 30, 31
6. Verfahren zur Herstellung von Peptidantigenen nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die das C-terminale Ende bildende Aminosäure an einen Träger σebunden wird, vom C-terminalen Ende das Peptidanrigen schrittweise aufgebaut und anschließend vom Träger abgespalten wird.
7. Verfahren zur Bestimmung von HCV-Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einer Kombination von mindestens zwei Peptidantigenen aus der Gruppe SEQ ID NO: 1, 2, 11, 12, 15, 16, 22, 23, 25, 29-32 oder Peptidantigenen, die Teilsequenzen dieser Peptidantigene von mindestens 4 Aminosäuren Länge darstellen, inkubiert und, unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-Antigenkomplexes ermöglichen die Menge der an das Peptidantigen gebundenen HCV-Antikörper bestimmt wird.
8. verfahren nach Anspruch 7, dadurch' gekennzeichnet, daß die Kombination mindestens ein Peptidantigen mit 4 - 9 Aminosäuren Länge enthält, welches eine Teilsequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 11, 12, 15, 16, 22, 23, 25, 29-32 darstellt.
9. Verfahren nach Anspruch 7 , dadurch gekennzeichnet, daß eine Kombination von mindestens zwei HCV-Antigenen aus der Gruppe SEQ ID NO: 1-32 verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Kombinationen
SEQ ID NO 4, 12, 16
SEQ ID NO 4, 5, 12 und 16
SEQ ID NO 3, 4, 5, 12 und 16
SEQ ID NO 3, 4, 5, 12, 16, 26 und 27
SEQ ID NO 3, 4, 11, 12, 16 und 26
SEQ ID NO 3, 4, 12, 16 und 26
SEQ ID NO 7, 9, 13, 20, 21
SEQ ID NO 6, 8, 13, 19, 28 oder
SEQ ID NO 24, 30, 31 verwendet werden.
11. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen HCV- Antigene, dadurch gekennzeichnet, daß ein Säugetier mit einem gegebenenfalls trägergebundenen Peptidantigen SEQ ID NO: 1, 2, 11, 12, 15, 16, 22, 23, 29-32 oder einer Teilsequenz davon immunisiert wird, polyklonale Antikörper gewonnen werden oder Zellen dieser Tiere, die Antikörper produzieren, zu Zellinien immortalisiert werden und aus diesen Zellinien monoklonale Antikörper gewonnen werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Peptidantigene, die Teilsequenzen darstellen, SEQ ID NO: 1-32 verwendet werden.
13. Verfahren zur Bestimmung von HCV-Viren, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einem Antikörper nach Anspruch 11 oder 12 unter Bedingungen, die eine Antigen- Antikörperkomplexbildung erlauben, inkubiert wird, und die Menge des gebildeten Antikörper-Antigenkomplexes bestimmt wird.
14. Vakzin zur Behandlung von HCV-Infektionen, enthaltend ein gegebenenfalls trägergebundenes Peptidantigen SEQ ID NO: 1, 2, 11, 12, 15, 16, 22, 23, 29-32 oder mindestens zwei Peptidantigene SEQ ID NO: 1-32 oder Peptidantigene, die Teilsequenzen dieser Peptidantigene von mindestens 4 Aminosäuren Länge darstellen als Immunogen, in einer pharmakologisch effektiven Dosis und in einer pharmazeutisch akzeptablen Formulierung.
15. Vakzin nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als Peptidantigene, die Teilsequenzen
SEQ ID NO: 4, 12 , 16
SEQ ID NO: 4, 5, 12 und 16
SEQ ID NO: 3, 4, 5, 12 und 16
SEQ ID NO: 3, 4, 5, 12, 16, 26 und 27
SEQ ID NO: 3, 4, 11, 12, 16 und 26
SEQ ID NO: 3, 4, 12, 16 und 26
SEQ ID NO: 7 , 9, 13, 20, 21
SEQ ID NO: 6, 8, 13, 19, 28 oder
SEQ ID NO: 24 30, 31 verwendet werden.
16. Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen unter Verwendung der Peptidantigene SEQ ID NO 1, 2, 11, 12, 15, 16, 22, 23, 29-32 oder von mindestens zwei der Peptidantigene SEQ ID NO: 1-32 oder Peptidantigene, die Teilsequenzen dieser Peptidantigene von mindestens 4
Aminosäuren Länge darstellen, als Immunogene.
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