WO1994019097A1 - Verfahren und vorrichtung zum durchmischen von flüssigkeiten in mikrotiterplatten - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum durchmischen von flüssigkeiten in mikrotiterplatten Download PDF

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WO1994019097A1 PCT/DE1994/000139 DE9400139W WO9419097A1 WO 1994019097 A1 WO1994019097 A1 WO 1994019097A1 DE 9400139 W DE9400139 W DE 9400139W WO 9419097 A1 WO9419097 A1 WO 9419097A1
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mixing
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Gunter Siegfried Fischer
Gerhard Peter Wilhelm KÜLLERTZ
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
    • B01F33/40—Mixers using gas or liquid agitation, e.g. with air supply tubes
    • B01F33/407—Mixers using gas or liquid agitation, e.g. with air supply tubes by blowing gas on the material from above
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
    • B01F33/30—Micromixers

Definitions

  • the invention relates to a method for the contact-free mixing of solutions in the cavities of microtiter plates.
  • microtiter plates Homogeneous solutions in microtiter plates are necessary if chemical reactions with measurements of the optical density in the individual cavities of a microtiter plate have to take place in a defined manner.
  • Processes for the contact-free mixing of liquids are known to a large extent.
  • the methods used are based on the one hand on the transmission of vibrations to the liquid-containing vessels or use flowing liquids or gases in order to achieve mixing by swirling.
  • Processes for producing homogeneous solutions in microtiter plates are based on the mechanical transmission of accelerated movements to the microtiter plate.
  • the microtiter plate is made to vibrate by a vibrator.
  • Vibration generator is usually one
  • the vibration generator can also be a carriage which can be influenced in a targeted manner and moved linearly and on which the microtiter plate is placed, as is the case, for example, in the microtiter plate evaluation system (MR 7000) from Dynatech (14340, Syllyfield Circle, Chantilly, VA 22021, USA). is realized.
  • MR 7000 microtiter plate evaluation system
  • the microtiter plate is accelerated in a circular manner so that the liquid in the individual cavities is set into a circular motion due to its inertia. Mixing is to be achieved by this circular movement.
  • the motion sensor is usually a shaker, as is also used in chemical laboratories for mixing larger quantities of liquid.
  • the aim of the invention is the rapid mixing of liquid quantities in microtiter plates using a non-contact method, which is particularly suitable for the subsequent, also time-dependent, optical determination of the concentration in the liquids.
  • the object of the invention is to provide a novel method and a device for the rapid, contact-free mixing of liquids in microtiter plates.
  • a gas stream is directed onto the liquid surface in such a way that only a part of the liquid surface is hit by the gas stream. This displaces the liquid that is exposed to the gas flow. If the gas pressure drops, the liquid can flow back again. By repeating this process several times, the liquid in the microtiter plate is mixed in the desired manner.
  • gases or gas mixtures which do not show any undesired interactions with the liquid present in the microtiter plate are suitable as the gas type. Air, but also nitrogen and argon, have been found to be particularly suitable for aqueous solutions.
  • the frequency of the intermittent or pulsating gas flow must be so low that at least part of the displaced liquid can flow back. This depends on the viscosity of the liquid.
  • the frequency must be like this be large that the mixing of the liquids in the microtiter plates takes place in a time which is sufficiently fast for the user and is preferably chosen to be about 6 bursts per second. In general, however, one can say that a frequency of 1 to 10 is suitable.
  • the intensity of the pulsating gas flow must be chosen so that it is strong enough to displace part of the liquid which is exposed to the gas flow. But it must not be so strong that liquid from the individual
  • Microtiter plate cavity is pressed out.
  • the strength must also be chosen so that gas bubbles do not form due to the turbulence that forms on the liquid surface exposed to the gas jet.
  • the direction of the gas jet is preferably perpendicular to the liquid surface. This procedure leads to a pulsating mixing behavior of the liquid. However, it can also be advantageous to point the gas jet obliquely at the liquid surface. With a suitable inclined arrangement of the pulsating gas jet on the edge zone of the liquid surface, circular movements of the liquid can occur and mixing can be achieved.
  • the angle at which the gas jet strikes the liquid surface in a non-vertical arrangement must be chosen such that no liquid is torn out of the individual microtiter plate cavity by the gas flow.
  • the gas flow should be such that about 30-60% of the
  • Liquid surface are exposed to the gas flow. However, it can also be advantageous to expose more than 60% or less than 30% of the liquid surface to the gas stream. If the cross-section is chosen too small, in addition to a reduction in the mixing speed, it may be undesirable
  • the cross section of the gas jet should preferably be circular. Large deviations from this circularity can also lead to the inclusion of gas bubbles in guide the liquid medium.
  • Fig. 1 Scheme of the mixing device for microtiter plates
  • the cavities in rows D1 to D12 were empty.
  • the cavities of lines E1 to E12, FI to F12, Gl to G12 and Hl to Hl2 were not mixed. Mixing was carried out immediately after the last one had been added
  • FIG. 1 In order to be able to direct the gas onto the liquid surface according to the invention, the arrangement shown in FIG. 1 was used selected. A gas flow at a pressure of 5 bar was passed from a commercially available pressure bottle with nitrogen via a 1 m long hose line (d - 100 mm) to a roller hose pump. The pump hose 5 has an inner diameter of 80 mm. The pump hose then went straight to that
  • Gas distributor 1 of the mixing device shown in Fig. 1 performed.
  • the pressure of the pump hose against the pump roll bracket and the conveying speed were set so that the gas flow could impinge on the liquid surface from the 8 nozzles 2 at a frequency of about 6 gas bursts per second.
  • Buffer solution 0.035 m HEPES buffer Ph 7.6 stock solution A: Stock solution A is a solution of human hemoglobin
  • 10 ⁇ l of stock solution A were pipetted into 8 cavities 4 of a microtiter plate 3.
  • an 8-channel pipette was used to pipette 200 ⁇ l of the buffer solution in one step to the 10 ⁇ l provided.
  • the extinctions of these 8 cavities were then measured over a period of 600 seconds at intervals of approximately 10 seconds at 390 nm using a commercially available microtiter plate reader at 6 ° C.
  • FIG. 2 show two columns of a microtiter plate with the cavities AI to Hl (column 1) and A2 to H2 (column 2).
  • the absorbance timings in column 2 were obtained using a two-second mixing step.
  • the absorbance timings in column 1 were obtained without mixing.
  • the final absorbances of the unmixed samples do not reach the exact final value even after more than 10 minutes. Visually, inhomogeneities in the individual cavities can still be observed even after 20 minutes. All mixed samples have the same end absorbances after the mixing time.
  • Compressed air was used as the mixed gas, which was produced using a commercially available laboratory radial fan.
  • the delivery rate was 9 m 3 / h at a pressure head of 450 mm water column.
  • the compressed air is fed to a gas distributor 1 via a hose feed 5 of 100 cm in length with an inner diameter of 90 mm.
  • the cycle frequency of the motor-driven 12-channel valve located in the gas distributor can be controlled via the engine speed.
  • the compressed air coming from the valve is directed via nozzles 2 onto the liquid surface of the individual cavities 4.
  • the nozzles 2 were 30 mm long and had a circular cross section.
  • the nozzles 2 had a diameter of 2 mm at the tapered end and 5 mm at the air inlet opening.
  • the distance between the nozzles 2 of the chamber shown in FIG. 1 and the microtiter plate 3 was 5 mm.
  • reaction solution A 120 ⁇ l are automatically pipetted into each cavity. No reaction solution was pipetted into the cavities D1, D2, D3, p4, DS, D6, D7, D8, D9, D10, DU and D12.
  • the 8-fold pipetting automatically pipettes 20 ⁇ l substrate solution per cavity within 7 seconds. No substrate solution was pipetted into the cavities D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, DU and Dl2.
  • the microtiter plate is moved into the "waiting position" for 7 seconds.
  • microtiter plate is mixed in the manner described above.
  • Microtiter plate measured 70 times in approximately 9 seconds.
  • the extinction changes obtained, the curve of which corresponds to a first-order reaction, can be represented graphically. 3 shows the result of such a measurement.
  • the "do not mix" was achieved by interrupting the corresponding nozzles.
  • the measurement curves can be evaluated as described in EP 0 360 029 AI.
  • Rate constants the mean values and the standard deviations of the rate constants of the same enzyme concentrations, with and without a mixture, are summarized in Table 1.

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
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Abstract

Verfahren und Vorrichtung zum Durchmischen von Flüssigkeiten wobei ein periodisch pulsierend auf eine Flüssigkeitsmenge in einer Mikrotiterplattenkavität einwirkender Gasstrom bei geeigneter Gasart, Frequenz, Stärke, Richtung und geeignetem Querschnitt ein schnelles Durchmischen der Flüssigkeit in der Mikrotiterplattenkavität bewirkt, ohne dass es zu Blasenbildung in der Flüssigkeit kommt, welche das nachfolgende lichtoptische Konzentrationsmessverfahren stören könnte.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum Durchmischen von Flüssigkeiten in Mikrotiterplatten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum berührungsfreien Durchmischen von Lösungen in den Kavitäten von Mikrotiterplatten.
Homogene Lösungen in Mikrotiterplatten sind nötig, wenn chemische Reaktionen mit Messungen der optischen Dichte in den einzelnen Kavitäten einer Mikrotiterplatte definiert ablaufen müssen.
Diese Messungen werden in großem Umfang für diagnostische Verfahren benutzt. In solchen Fällen kann ein verbessertes Mischverfahren von Bedeutung sein.
Verfahren zum berührungsfreien Mischen von Flüssigkeiten sind in umfangreichem Maße bekannt. Die angewendeten Verfahren stützen sich zum einen auf die Übertragung von Schwingungen auf die Flüssigkeit enthaltenden Gefäße oder nutzen strömende Flüssigkeiten oder Gase, um durch Verwirbelung ein Vermischen zu erreichen. Verfahren zur Herstellung homogener Lösungen in Mikrotiterplatten gründen sich auf die mechanische Übertragung von beschleunigten Bewegungen auf die Mikrotiterplatte.
Dabei werden zwei Grundprinzipien genutzt:
A. Lineare beschleunigte Bewegungen:
Die Mikrotiterplatte wird durch einen Schwingungsgeber in rüttelnde Bewegungen versetzt. Durch Ausnutzen der Trägheit der Flüssigkeit wird bei geeigneter Schüttelfrequenz eine solche Bewegung in der Flüssigkeit erreicht, die ein Durchmischen zur Folge hat. Schwingungsgeber ist üblicherweise eine
Schüttelmaschine, wie sie in chemischen Laboratorien auch für das Durchmischen größerer Flüssigkeitsmengen benutzt wird, oder auch eine extra als "Mikroplattenschüttler" vertriebene Vorrichtung. Schwingungsgeber kann aber auch ein über eine Steuerung beeinflußbarer, zielgerichtet linear bewegter Wagen sein, auf den die Mikrotiterplatte gestellt wird, wie dies beispielsweise im Mikrotiterplatten-Auswertesystem (MR 7000) der Firma Dynatech (14340, Syllyfield Circle, Chantilly, VA 22021, USA) realisiert wird.
B. Kreisförmig beschleunigte Bewegung
Die Mikrotiterplatte wird kreisförmig so beschleunigt, daß die Flüssigkeit in den einzelnen Kavitäten auf Grund ihrer Trägheit in kreisende Bewegung versetzt wird. Durch diese kreisende Bewegung soll ein Durchmischen erreicht werden. Bewegungsgeber ist üblicherweise eine Schüttelmaschine, wie sie in chemischen Laboratorien auch für das Durchmischen größerer Flüssigkeitsmengen benutzt wird.
Beide unter A und B angeführten Verfahren nutzen die Trägheit der Flüssigkeit bei einer auf sie wirkenden beschleunigten Bewegung aus. '
Diese Verfahren sind für größere Flüssigkeitsmengen sehr gut geeignet. Infolge der kleinen Volumina der Kavitäten in Mikrotiterplatten und deren Geometrie treten aber hier die Nachteile dieser Verfahren zutage. Da die Trägheit direkt proportional zur Masse ist, muß bei kleinen Flüssigkeitsmengen eine besonders hohe Beschleunigung angewendet werden, um eine solche Flüssigkeitsbewegung zu erreichen, die ein Durchmischen zur Folge hat. Von weiterem Nachteil sind die Adhäsion der Flüssigkeit an der Mikrotiterplatte. In zylindrischen Gefäßen verhalten sich die mit der Flüssigkeit wechselwirkenden Oberflächen umgekehrt proportional zur Flüssigkeitsmenge. Kleinere Flüssigkeitsmengen sind, bezogen auf das Volumen, größeren Adhäsionskräften ausgesetzt als größere Flüssigkeitsvolumina. Ebenso verhält es sich mit der Oberflächenspannung.
Um dennoch mit dem angewendeten Wirkungsprinzip eine exakte reproduzierbare Durchmischung der Lösungen in allen 96 Kavitäten einer Mikrotiterplatte zu erreichen, müßte eine unpraktikabel hohe Beschleunigung angewendet werden. Diese notwendigen hohen Beschleunigungen können ihrerseits zu Resonanzerscheinungen der Titerplatte führen, in deren Ergebnis es zu Zonen auf der Titerplatte kommen kann, in denen die Durchmischung sehr langsam erfolgt, und zu Bereichen, in denen Flüssigkeit aus den Kavitäten herausspritzt.
Die oben angeführte Möglichkeit, durch strömendes Gas eine
Durchmischung zu erreichen, wird beim Mischen von Flüssigkeiten in Mikrotiterplatten bisher nicht angewendet, da sie in der bisher beschriebenen Art das nachfolgende lichtoptische Meßverfahren durch Einbringen von Gasblasen stören würde. So wurde beispielsweise in der DE-OS 28 37 002 eine Technik beschrieben, in der ein Propeller Luft auf eine Flüssigkeitsoberfläche in der Art bläst, daß die Flüssigkeit gemischt wird und Gasblasen in die Flüssigkeit eingetragen werden. Dieses Einbringen von Gasblasen wurde auch in den DE-OS'en 30 07 842 und 33 13 382 beschrieben, die ebenfalls Gas zum Vermischen nutzen. Gemäß der DE-OS 32 46 791 wird zum Umrühren von Flüssigkeiten unter Vakuum, insbesondere von viskosen Zuckerrohprodukten, Luft kontinuierlich oder impulsartig in den die Flüssigkeit enthaltenden Behälter eingeblasen, der in seiner Behälterwand oder seinem Innenraum eine oder mehrere Injektordüsen aufweist. Aber auch in dieser Anwendungsart werden Gasblasen in die Flüssigkeit eingebracht, die die Anwendung in Mikrotiterplatten verbieten.
Aus den angeführten Gründen ist es mit den genannten Methoden nur schwer möglich, innerhalb weniger Sekunden eine Durchmischung von Flüssigkeiten in Mikrotiterplatten zu erreichen, die das in Mikrotiterplatten angewandte spezielle lichtoptische Meßverfahren nicht nachteilig beeinflussen.
Übliche Mischungen mit Hilfe eines Magnetrührers können nicht durchgeführt werden, da der Lichtstrahl durch den Rührer gestört werden kann. Ziel der Erfindung ist die schnelle Durchmischung von Flüssigkeitsmengen in Mikrotiterplatten mit einer berührungsfreien Methode, welche sich insbesondere für die nachfolgende, auch zeitabhängige lichtoptische Konzentrationsbestimmung in den Flüssigkeiten eignet.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein neuartiges Verfahren sowie eine Vorrichtung zur schnellen berührungsfreien Durchmischung von Flüssigkeiten in Mikrotiterplatten zu schaffen.
Überraschend wurde gefunden, daß ein periodisch intermittierend auf eine Flüssigkeitsmenge in einer Mikrotiterplattenkavität geblasener Gasstrom bei geeigneter Gasart, Frequenz, Stärke, Richtung und geeignetem Querschnitt ein schnelles Durchmischen der Flüssigkeit in der Mikrotiterplattenkavität verursacht, ohne daß es zur Blasenbildung in der Flüssigkeit kommt, die das nachfolgende lichtoptische Konzentrationsmeßverfahren stören könnte.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Gasstrom so auf die Flüssigkeitsoberfläche gelenkt, daß nur ein Teil der Flüssigkeitsoberfläche von dem Gasstrom getroffen wird. Dadurch wird die Flüssigkeit, die dem Gasstrom ausgesetzt wird verdrängt. Läßt der Gasdruck nach, kann die Flüssigkeit wieder zurückströmen. Durch mehrmaliges Wiederholen dieses Vorganges wird die Flüssigkeit in der Mikrotiterplatte in der gewünschten Art und Weise durchmischt.
Als Gasart sind alle Gase oder Gasgemische geeignet, die keine unerwünschten Wechselwirkungen mit der in der Mikrotiterplatte vorhandenen Flüssigkeit zeigen. Als besonders geeignet für wäεsrige Lösungen erwies sich Luft, aber auch Stickstoff und Argon.
Die Frequenz des intermittierenden oder pulsierenden Gasstroms muß so klein sein, daß zumindest ein Teil der verdrängten Flüssigkeit zurückfließen kann. Dies ist abhängig von der Viskosität der Flüssigkeit. Die Frequenz muß andererseits so groß sein, daß das Mischen der Flüssigkeiten in den Mikrotiterplatten in einer für den Anwender ausreichend schnellen Zeit erfolgt und wird vorzugsweise zu etwa 6 Stößen je Sekunde gewählt. Allgemein kann man aber sagen, daß eine Frequenz von 1 bis 10 geeignet ist.
Die Stärke des pulsierenden Gasstroms muß so gewählt werden, daß er stark genug ist, um einen Teil der Flüssigkeit, die dem Gasstrom ausgesetzt ist, zu verdrängen. Er darf aber nicht so stark sein, daß Flüssigkeit aus der einzelnen
Mikrotiterplattenkavität herausgedrückt wird. Die Stärke muß weiterhin so gewählt werden, daß es auf Grund sich ausbildender Turbulenzen an der dem Gasstrahl ausgesetzten Flüssigkeitsoberfläche nicht zur Bildung von Gasblasen kommt.
Die Richtung des Gasstrahls ist vorzugsweise senkrecht auf die Flüssigkeitsoberfläche gerichtet. Diese Verfahrensweise führt zu einem pulsierenden Mischungsverhalten der Flüssigkeit. Es kann aber auch von Vorteil sein, den Gasstrahl schräg auf die Flüssigkeitsoberfläche zu richten. Bei geeigneter schräger Anordnung des pulsierenden Gasstrahls auf die Randzone der Flüssigkeitsoberfläche kann es zu kreisenden Bewegungen der Flüssigkeit kommen und eine Durchmischung erreicht werden. Der Winkel mit dem der Gasstrahl bei einer nicht senkrechten Anordnung auf die Flüssigkeitsoberfäche trifft, muß so gewählt werden, daß keine Flüssigkeit aus der einzelnen Mikrotiterplattenkavität durch den Gasstrom herausgerissen wird.
Der Gasstrom sollte so beschaffen sein, daß etwa 30-60 % der
Flüssigkeitsoberfläche dem Gasstrom ausgesetzt werden. Es kann aber auch von Vorteil sein, mehr als 60 % oder aber weniger als 30 % der Flüssigkeitsoberfläche dem Gasstrom auszusetzen. Wird der Querschnitt zu klein gewählt, kann es neben einer Verminderung der Mischgeschwindigkeit zu unerwünschter
Blasenbildung kommen. Der Querschnitt des Gasstrahls soll vorzugsweise kreisförmig sein. Starke Abweichungen von dieser Kreisförmigkeit können ebenfalls zum Einschluß von Gasblasen in das Flüssigkeitsmedium führen.
Legenden zu den Figuren:
Fig. 1: Schema der Mischvorrichtung für Mikrotiterplatten
Fig. 2: Einfluß des Mischvorgangs auf die Extinktion einer Lösung von 10 μl Haemoglobinlösung, die mit 200 μl Puffer versetzt wurde, gemäß Beispiel 1. Ordinate jeder einzelnen Kavität: 1.2-2.2 E bei
405 nm Abszisse jeder einzelnen Kavität: 10-753 Sekunden (Zeit, nach Zugabe der Pufferlösung) Die Kavitäten von Spalte AI bis Hl ohne Verwendung der Mischeinrichtung. Die Kavitäten von Spalte A2 bis H2 unter Verwendung der Mischeinrichtung. Mischzeit: 2 Sekunden nach Zugabe der Pufferlösung.
Fig. 3: Einfluß des Mischvorgangs auf die Geschwindigkeit der durch die Peptidyl Prolyl cis/trans Isomerase katalysierten Reaktion gemäß Beispiel 2. Ordinate jeder einzelnen Kavität: 0.73-0.9 E bei 390 nm Abszisse jeder einzelnen Kavität: 81 - 637 Sekunden Die Kavitäten der Zeilen AI bis A12, Bl bis B12 und Cl bis C12 unter Verwendung der
Mischeinrichtung.
Die Kavitäten der Zeile Dl bis D12 waren leer. Die Kavitäten der Zeilen El bis E12, FI bis F12, Gl bis G12 und Hl bis Hl2 wurden nicht gemischt. Gemischt wurde unmittelbar nach Zugabe der letzten
Lösung durch den eingebauten automatischen Dosierer des Dynatechgerätes. Die Mischzeit betrug 7 Sekunden.
Beispiel 1:
Um das Gas erfindungsgemäß auf die Flüssigkeitsoberfläche richten zu können, wurde die in Fig. 1 dargestellte Anordnung gewählt. Aus einer handelsüblichen Druckflasche mit Stickstoff wurde ein Gasström mit einem Druck von 5 bar über eine 1 m lange Schlauchleitung (d - 100 mm) zu einer Wälzschlauchpumpe geleitet. Der Pumpenschlauch 5 besitzt einen Innendurchmesser von 80 mm. Der Pumpenschlauch wurde dann direkt zu dem
Gasverteiler 1 der in Fig. 1 dargestellten Mischeinrichtung geführt. Der Preßdruck des Pumpenschlauchs an die Pumpenrollbügel und die Fördergeschwindigkeit wurden so eingestellt, daß der Gasstrom stoßweise mit einer Frequenz von etwa 6 Gasstößen je Sekunde aus den 8 Düsen 2 auf die Flüssigkeitsoberfläche auftreffen konnte.
Mit dieser Anordnung wurden mit den im weiteren beschriebenen Verfahrensweisen und Lösungen die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse erhalten. Folgende Lösungen wurden verwendet:
Pufferlösung: 0,035 m HEPES Puffer Ph 7,6 Stammlösung A: Die Stammlösung A ist eine Lösung von menschlichem Haemoglobin
In 8 Kavitäten 4 einer Mikrotiterplatte 3 wurden 10 μl der Stammlösung A pipettiert. Unmittelbar vor dem Mischen wurden mit einer 8 Kanalpipette 200 μl der Pufferlösung in einem Schritt zu den vorgelegten 10 μl pipettiert. Anschließend wurden die Extinktionen dieser 8 Kavitäten über einen Zeitraum von 600 Sekunden in Intervallen von etwa 10 Sekunden, bei 390 nm mit einem handelsüblichen Mikrotiterplattenreader bei 6 °C gemessen.
In einem anderen Meßansatz wurde zu Vergleichszwecken die oben angeführte Prozedur mit Ausnahme des Mischens wiederholt. Die in der Fig. 2 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen zwei Spalten einer Mikrotiterplatte mit den Kavitäten AI bis Hl (Spalte 1) und A2 bis H2 (Spalte 2). Die Extinktions-Zeitverläufe in Spalte 2 wurden unter Einbeziehen eines zwei Sekunden dauernden Mischschrittes erhalten. Die Extinktions-Zeitverläufe in Spalte 1 wurden ohne Mischen erhalten. Als Zeit t=0 wurde der Zeitpunkt der Zugabe der Haemoglobin-Stammlösung benutzt. Die Endextinktionen der ungemischten Proben erreichen auch nach mehr als 10 Minuten nicht den exakten Endwert. Visuell lassen sich auch nach 20 Minuten noch Inhomogenitäten in den einzelnen Kavitäten beobachten. Alle gemischten Proben weisen nach der Mischzeit gleiche Endextinktionen auf.
Beispiel 2:
Als Mischgas wurde Druckluft verwendet, die mittels eines handelsüblichen Laborradiallüfters hergestellt wurde. Die Fördermenge betrug 9 m3/h bei einer Druckhöhe von 450 mm Wassersäule. Entsprechend Fig. 1 wird die Druckluft über eine Schlauchzuführung 5 von 100 cm Länge mit einem Innendurchmesser von 90 mm zu einem Gasverteiler 1 geführt.
Die Taktfrequenz des im Gasverteiler befindlichen motorgetriebenen 12-Kanalventils ist über die Motorgeschwindigkeit steuerbar. Die vom Ventil ausgehende Druckluft wird über Düsen 2 auf die Flüssigkeitsoberfläche der einzelnen Kavitäten 4 gelenkt. Die Düsen 2 waren 30 mm lang und wiesen einen kreisförmigen Querschnitt auf. Die Düsen 2 wiesen Durchmesser von 2 mm am verjüngten Ende und 5 mm an der Lufteintrittsöffnung auf.
Die Frequenz des Luftstroms je Einzeldüse wurde zu 3
Luftimpulsen je Sekunde eingestellt. Der Abstand der Düsen 2 der in Fig. 1 abgebildeten Kammer zur Mikrotiterplatte 3 betrug 5 mm.
Die nachfolgend beschriebene Messung wurde mit folgenden Lösungen vorgenommen:
Reaktionslösung A:
25 mg Chymotrypsin gelöst in 25 ml 0,035 m HEPES Puffer Ph 7,6 Probelösung: gleiche Konzentrationen von biologischen Rohhomogenaten, die Peptidyl Prolyl cis/trans Iεomeraseaktivität gegenüber dem Substrat Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-p-Nitroanilid aufwiesen Reaktionslösung B:
1 mg/ml Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-p-Nitroanilid gelöst in einer Lösung von 1 ml 0.035 m HEPES Puffer Ph 7,6 plus 10 μl Dirnethylsulfoxid
Durchführung der Messung:
Mit Hilfe einer automatischen Pipettierstation der Firma GILSON/USA wurden jeweils 10 μl der einzelnen Probe in jede einzelne Kavität pipettiert. Die Kavitäten Dl, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, DU und Dl2 wurden nicht mit Probenlösung versehen. Alle weiteren Meß- und Pipettiervorgänge wurden mit Hilfe eines programmierbaren kommerziellen Mikrotiter- plattenreaders "MR 7000" der Firma Dynatech/USA mit den oben aufgeführten Lösungen, mit folgenden Einzelschritten vorgenommen:
1. Mit der 8-fach-Pipettierung werden automatisch je 120 μl Reaktionslösung A in jede Kavität pipettiert. In die Kavitäten Dl, D2, D3, p4, DS, D6, D7, D8, D9, D10, DU und D12 wurde keine Reaktionslösung pipettiert.
2. Innerhalb von 7 Sekunden werden mit der 8-fach-Pipettierung automatisch je 20 μl Substratlösung je Kavität pipettiert. In die Kavitäten Dl, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, DU und Dl2 wurde keine Substratlösung pipettiert.
3. Für 7 Sekunden wird die Mikrotiterplatte in "Warteposition" gefahren.
4. Während dieser 7 Sekunden wird die Mikrotiterplatte in der oben angegebenen Weise gemischt.
5. Danach wird die Extinktion aller Kavitäten der
Mikrotiterplatte im Zeittakt von etwa 9 Sekunden 70 mal gemessen. Die erhaltenen Extinktionsänderungen, deren Kurve einer Reaktion erster Ordnung entspricht, lassen sich graphisch darstellen. In Fig. 3 ist das Ergebnis einer solchen Messung abgebildet. Um die Wirkung der Mischeinrichtung einschätzen zu können, wurden nur die ersten drei Reihen in der angegebenen Weise gemischt. Das "Nicht mischen" wurde durch die Unterbrechung der entsprechenden Düsen erreicht.
Die Meßkurven lassen sich wie unter EP 0 360 029 AI beschrieben, auswerten. Die entsprechenden
Geschwindigkeitskonstanten, die Mittelwerte und die Standardabweichungen der Geschwindigkeitskonstanten gleicher Enzymkonzentrationen, mit und ohne Mischung, sind in Tab. 1 zusammengefaßt.
Tab. 1:
Einfluß des Mischvorganges auf die Geschwindigkeitskonstante (k) der Peptidyl Prolyl cis/trans Isomeraseaktivität(') . Statistische Auswertung der in Fig. 3 abgebildeten Meßkurven
Reihe k (s-1) Δk(s_1)
[Mittelwert] [Standardabweichung] Mischart
AI - A12 0,0162 .0008 patentgemäß
Bl - H12 0,0161 .0010 patentgemäß
Cl - C12 0,0162 .0009 patentgemäß
El - E12 0,0137 .0050 Dynatech )
FI - F12 0,0158 .0019 Dynatech b)
Gl - G12 0,0214 .0097 Dynatech b)
Hl - H12 0,0147 .0064 Dynatech b)
a) Berechnung nach EP 0 360 029 AI b) Mischung mit dem internen Mischer des
Mikrotiterplattenreaderε
"MR7000" der Firma Dynatech für 7 Sekunden

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum berührungsfreien Durchmischen von Flüssigkeiten in Kavitäten einer Mikrotiterplatte, bei welchem ein Gasstrom mit einem Querschnitt, der kleiner ist als der lichte Querschnitt der jeweiligen Kavität, mit niedriger Frequenz intermittierend in die Kavität geblasen wird, derart, daß eine Teilflüssigkeit in der Kavität unter dem Druck des auftreffenden Gasstroms blasenfrei verdrängt und durch Absenken des Druckes für das Zurückfließen wieder freigegeben wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem eine Frequenz im Bereich von 1 bis 10 Hz, vorzugsweise von 6 Hz angewendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem der
Querschnitt des Gasstroms 30 bis 60 % des lichten Querschnittes der Kavität beträgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem der Gasstrom senkrecht zu der Flüssigkeitsoberfläche ausgerichtet ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem der Gasstrom schräg zur Flüssigkeitsoberfläche ausgerichtet und auf eine Stelle im Abstand von der Achse der Kavität gerichtet wird.
6. Vorrichtung zum Durchmischen von Flüssigkeiten in Kavitäten einer Mikrotiterplatte, mit einem Gasverteiler (1), der eine der Anzahl der Kavitäten (4) der Mikrotiterplatte (3) entsprechende Mehrzahl von Gasdüsen (2) aufweist, die jeweils auf eine der Kavitäten (4) ausgerichtet sind und deren Düsenmündung einen kleineren Durchmesser als der Durchmesser der Kavitäten (4) aufweisen, einer an den Gasverteiler (1) angeschlossenen Druckluftquelle und einer den Gasdüsen (2) zugeordneten Steuerung, mit welcher eine mit niedriger Taktfrequenz von 1 bis 10 Hz intermittierende Gaszufuhr zu den Gasdüsen (2) einsteuerbar ist.
PCT/DE1994/000139 1993-02-26 1994-02-10 Verfahren und vorrichtung zum durchmischen von flüssigkeiten in mikrotiterplatten Ceased WO1994019097A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DEP4306085.4 1993-02-26
DE4306085A DE4306085A1 (de) 1993-02-26 1993-02-26 Verfahren und Vorrichtung zum Durchmischen von Flüssigkeiten in Mikrotiterplatten

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WO1994019097A1 true WO1994019097A1 (de) 1994-09-01

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