WO1998027201A2

WO1998027201A2 - Gene codierend für aminosäure-deacetylasen mit spezifität für n-acetyl-l-phosphinothricin, ihre isolierung und verwendung

Info

Publication number: WO1998027201A2
Application number: PCT/EP1997/006755
Authority: WO
Inventors: Klaus Bartsch; Guido Kriete; Inge Broer; Alfred Pühler
Original assignee: Hoechst Schering Agrevo GmbH
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1996-12-16
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 1998-06-25
Anticipated expiration: 1999-06-16
Also published as: NZ335852A; HUP0000396A2; PL334530A1; AU5753598A; ES2296318T3; DE59712890D1; CN1171993C; DE19652284A1; US6177616B1; HUP0000396A3; WO1998027201A3; PL193489B1; CZ216699A3; AU727831B2; EP0942965B1; PL193522B1; CN1240476A; CA2275134A1; RU2205219C2; EP0942965A2

Abstract

Die Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die für Deacetylasen oder Proteine mit der biologischen Aktivität einer Deacetylase kodieren sowie transgene Pflanzenzellen, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen transformiert wurden. Diese Moleküle können zur Herstellung von Pflanzen mit gezielt zerstörbaren Teilen, d.h. männlich oder weiblich sterile Pflanzen, durch die spezifische Expression eines Deacetylasegens verwendet werden.

Description

Neue Gene codierend für Aminosäure-Deacetylasen mit Spezifität für N-Acetyl- L-Phosphinothricin, ihre Isolierung und Verwendung

Das Konzept einer chemisch induzierbaren, reversiblen männlichen Sterilität bei Pflanzen durch Antheren-spezifische Expression einer N-Acetyl-Phosphinothricin (N-Acetyl-PPT)-spezifischen Deacetylase wird in der Europäischen Patentanmeldung EP 531 71 6 beschrieben. Die dabei verwendeten Deacetylase- Gene aus Streptomyces viridochromogenes [N-Acetyl-L-Phosphinothricyl-alanyl- alanin (N-Acetyl-PTT)-Deacetylase, dea] bzw. argE aus Escherichia coli (N- Acetyl-L-Ornithin-Deacetylase) codieren Proteine mit Spezifität für N-Acetyl-L- PPT. Für beide Gene konnten bei Tapetum-spezifischer Expression in Pflanzen, das Auftreten männlich steriler Blüten nach Behandlung von Einzelknospen mit N-Acetyl-L-PPT gezeigt werden. Für eine erfolgreiche Anwendung dieses Systems insbesondere bei der Behandlung von ganzen Pflanzen mit N-Acetyl- PPT unter praxisrelevanten Bedingungen ist es von Vorteil, Deacetylasen mit hoher Substataffinität einsetzen zu können. Daher wurde nach weiteren Deacetylasen mit hoher Affinität für N-Acetyl-PPT gesucht.

Der hier beschriebenen Anmeldung liegt somit die Aufgabe zugrunde, DNA- Moleküle zur Verfügung zu stellen, die für Deacetylasen kodieren. Mit diesen Deacetylasen ist es möglich, Pflanzen mit gezielt zerstörbaren Pflanzenteilen herzustellen. Von besonderem Interesse ist das Herstellen von männlich oder weiblich sterilen Pflanzen. Die Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.

Die Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die für Deacetylasen oder Proteine mit der biologischen Aktivität einer Deacetylase kodieren. Die enzymatischen Eigenschaften dieser Proteine werden in den Beispielen beschrieben. Die Erfindung betrifft auch DNA-Moleküle, die ein biologisch aktives Teilfragment oder ein Derivat kodieren. Die erfindungsgemäßen Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate oder allelische Varianten. Unter Fragmenten werden Teile verstanden, die immer noch die biologische Aktivität einer Deacetylase aufweisen.

Die Erfindung betrifft außerdem transgene Pflanzenzellen, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Moleküle transformiert wurden. Die transgenen Pflanzenzellen können nach bekannten Techniken hergestellt werden und zu ganzen Pflanzen regeneriert werden.

Die Erfindung betrifft DNA-Moleküle codierend ein Protein mit der biologischen Aktivität einer N-Acetyl-PPT-Deacetylase.

Die Erfindung betrifft insbesondere DNA-Moleküle codierend ein Protein mit der biologischen Aktivität einer N-Acetyl-PPT-Deacetylase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) DNA-Molekülen, die für ein Protein mit der unter SEQ ID No 2 angegebenen Aminosäuresequenz und Fragmenten und/oder Derivaten davon kodieren;

b) DNA-Molekülen, die für eine unter der SEQ ID No 1 angegebenen Nukleotidsequenz kodieren oder Sequenzen, die im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes von dieser Sequenz abweichen;

c) DNA-Molekülen, die für ein Protein mit der unter SEQ ID No 4

angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmenten und/oder Derivaten davon kodieren und d) DNA-Molekülen, die für eine unter der SEQ ID No 3 angegebenen Nukleotidsequenz kodieren oder Sequenzen, die im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes von dieser Sequenz abweichen.

Die Erfindung betrifft außerdem die nach dem in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahren identifizierten und hinterlegten Mikroorganismen Stenotrophomonas sp. (DSM 9734) und Comamonas acidovorans (DSM 1 1 070)

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Pflanzenzellen oder Pflanzen, die die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle enthalten.

Von besonderen Interessen sind Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gezielt zerstörbaren Teilen durch spezifische Expression eines Deacetylasegens sowie Verfahren zur Herstellung männlich oder weiblich steriler Pflanzen durch spezifische Expression eines Deacetylasegens.

Die vorliegende Anmeldung betrifft also auch:

(1 ) die gezielte Anreicherung von Mikroorganismen mit hoher N-Acetyl-PPT- Deacetylase-Aktivität

(2) die Isolierung von entsprechenden Deacetylase-Genen

(3) die Reinigung und Charakterisierung der von diesen Genen kodierten Proteine mit hoher N-Acetyl-PPT-Deacetylase-Aktivität

(4) die Expression der Deacetylase-Gene in Pflanzen.

Die vorliegende Anmeldung betrifft desweiteren: die DNA-Moleküle, die für Enzyme mit hoher N-Acetyl-PPT-Deacetylase-

Aktivität kodieren die Proteine, die von diesen Genen kodiert werden die Expression dieser Deacetylase-Gene in Pflanzen. Aus Bodenproben lassen sich in Mineralmedium mit Chitin als alleiniger C-Quelle Bakterien anreichern, die in der Lage sind, N-Acetyl-PPT mit hoher Effektivität zu spalten. Auf diese Weise konnten 2 Bakterienstämme als Reinkulturen isoliert werden: Stenotrophomonas sp. (DSM-Hinterlegungs-Nr. DSM 9734) und Comamonas acidovorans (DSM-Hinterlegungs Nr. 1 1 070).

Für die in der industriellen Herstellung erforderlichen Bedingungen ist es jedoch wesentlich vorteilhafter, ein gereinigtes Enzym einsetzen zu können.

Die vorliegende Anmeldung umfaßt neue L-N-Acetyl-PPT spezifische Deacetylasen, ein neues und effektives Verfahren zur Reinigung und Charakterisierung dieses Enzyms aus einer Anreicherungskultur von Bodenmikroorganismen sowie die Verwendung dieser Deacetylase.

Die Erfindung betrifft somit ferner:

1 . Eine Deacetylase mit

- einem Molekulargewicht von 20.000 bis 100.000 Dalton

- einem pH Optimum von 6,5 - 10,0

- einer Substratspezifität gegenüber L-N-Acetyl-Phosphinothricin.

2. Ein Verfahren zur Herstellung einer Deacetylase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein nicht sporenbildender Mikroorganismus in Krabbenchitin enthaltenden Medium kultiviert wird, und die Deacetylase aus diesen Mikroorganismen isoliert wird.

3. Die Verwendung der unter 1 . charakterisierten Deacetylase zur Herstellung männlich steriler Pflanzen sowie zur stereoselektivien Darstellung von L-Phosphinothricin. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Enzym, das ein Temperaturoptimum hat, das zwischen 30°C und 50°C liegt

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Deacetylasen, wird vorzugsweise mit Mikroorganismen durchgeführt, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus den in der Anmeldung beschriebenen Mikroorganismen besteht.

Krabbenchitin kann wie von Shimahara, Kenzo und Takiguchi, Yasuyuki beschrieben (Methods in Enzymology, Vol 1 61 , Seiten 41 7-423, 1 988) erhalten werden oder ist käuflich bei der Firma Sigma erhältlich.

Zur Reinigung der Deacetylase wird der Mikroorganismus in einem für sein Wachstum optimalen Nährmedium kultiviert. Die Anzucht des Mikroorganismus erfolgt aerob, beispielsweise subsmers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern, gegebenenfalls unter Einführung von Luft oder Sauerstoff. Die Fermentation kann in einem Temperaturbereich von etwa 20 bis 40°C, vorzugsweise bei etwa 25 bis 37°C, insbesondere bei 30 bis 37°C, erfolgen. Es wird in einem pH-Bereich zwischen 5 und 8,5, vorzugsweise zwischen 5,5 und 8,0, kultiviert.

Unter diesen Bedingungen zeigen die Mikroorganismen im allgemeinen nach 1 bis 3 Tagen eine nennenswerte Akkumulation des Enzyms. Die Synthese der Deacetylase beginnt mit der log-Phase. Die Produktion des Enzyms kann mit Hilfe von Aktivitätstests durch HPLC-Analysw bzw. photometrisch verfolgt werden. Die zur Produktion der Transaminase verwendete Nährlösung enthält 0,2 bis 5 %, bevorzugt 0,5 bis 2 %, Krabbenchitin sowie anorganische Salze.

An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phosphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle, Eisen, Zink und Mangan enthalten, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. Erfindungsgemäß können wirksame Mengen der Deacetylase in freier oder immobilisierter Form zur Deacetylierung eingesetzt werden, vorzugsweise wird sie in Pflanzen eingesetzt, die deac-Gene exprimieren.

Für die Fixierung kommen die bekannten Verfahren in Betracht, wie die in den Deutschen Offenlegungsschriften 32 37 341 und 32 43 591 beschriebenen Verfahren.

Die Isolierung und Reinigung des Enzyms kann nach klassischen Verfahren über Aufschluß durch Ultraschall und French-Press, Ammoniumsulfat-Fällung, Ionenaustauscher, Affinitätschromatographie und Gelpermeation erfolgen.

Das Enzympräparat läßt sich charakterisieren durch ein Molekulargewicht von 20.000 bis 100.000 Dalton, bevorzugt 30.000 bis 80.000, insbesondere 40.000 bis 70.000 Dalton. Das pH-Optimum des Enzymprodukts liegt in dem pH-Bereich 6,0 bis 10,0, insbesondere 7,0 bis 8,0. Das Temperatur-Optimum des Enzyms liegt zwischen 30 und 50 °C, insbesondere zwischen 35 und 45°C.

Die für die Deacetylasen codierenden Gene wurde in E. coli kloniert. Im Falle des dead -Gens aus Stenotrophomonas sp. wurde eine Phagemid- Expressionsbank aus genomischer DNA in E. coli auf N-Acetyl-PPT-spezifischer Deacetylase-Aktivität gescreent. Das deac2-Gen aus Comamonas acidovorans wurde durch Komplementation einer E. coli - argE - Mutante mit einer genomischen Bank kloniert.

Die aus den DNA-Sequenzen der beiden Gene abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind untereinander ähnlich und besitzen außerdem Homologie zu Hippurat-Hydrolasen, wie sie aus Proteindatenbanken bekannt sind.

Die hohe Substrataffinität des dead -Proteins für N-Acetyl-L-PPT

(K_m = 670 μM) macht sich in den transgenen Pflanzen durch eine hohe Empfindlichkeit des Gewebes gegen diese Substanz bemerkbar. So können bei konstitutiver Expression des deac-Gens Pflanzen erhalten werden, deren Blätter noch auf Konzentrationen bis zu 0,4 mg/ml N-Acetyl-D,L-PPT ( = 0,2 mg/ml L- Enantiomer) sensitiv reagieren. Bei Tapetum-spezifischer Expression wurde die Induktion männlich steriler Blüten durch Behandlung der Knospen mit 2 mg/ml N-Acetyl-D,L-PPT ( = 1 mg/ml L-Enantiomer) erreicht. Die beschriebenen Ergebnisse beziehen sich auf Gewächshauspflanzen. Auf Grund der niedrigen Substanzkonzentrationen ist bei Bedarf unter Freilandbedingungen eine Höherdosierung um das 5- 10fache ohne weiteres möglich.

Die anschließenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung weitergehend zu erläutern. Prozentangaben beziehen sich, wenn nicht anders angegeben, auf das Gewicht. Ferner wird die Erfindung in den Patentansprüchen definiert.

Beispiel : Isolierung und Identifizierung von Bodenmikroorganismen mit einer N-Acetyl-PPT-spezifischen Deacetylase-Aktivität

Je 1 g Boden (sandiger Lehm, Schwanheimer Düne) wurde mit 10 mM NaCI, 10 mM NaPhosphat-Puffer, pH = 7,0 für 1 h bei Raumtemperatur extrahiert. Zur Selektion verschiedener Gruppen von Mikroorganismen wurden die Bodenüberstände in folgende Flüssigmedien überimpft:

(1 ) MS1 -Medium (für Eubakterien) : 5 mM Glucose

5 mM Succinat 1 0 mM Glycerin 1 g/l NH₄CI 50 ml/l Lösung A 25 ml/l Lösung B Lösung A: 50 g/l K₂HP0₄ Lösung B: 2,5 g/l MgS0₄ 0,5 g/l NaCI 25 ml/l Spurenelemente

(2) Chitin-Medium (für Actino- und Streptomyceten, sowie chitinovore Bakterien):

1 0 g/l Krabbenchitin 1 g/l (NH₄)₂S0₄ 0,5 g/l MgS0₄ 50 ml/l Lösung A 1 ml/l Spurenelemente

(3) Antibiotika-Medium (für höhere Pilze): 20 g/l Malzextrakt

10 g/l Glucose 2 g/l Hefeextrakt 0,5 g/l (NH₄)₂S0₄ 50 μg/ml Tetracyclin

Alle Medien enthielten 5 mM N-Acetyl-PPT und wurden nach dem Überimpfen für 3-5 Tage bei 28°C inkubiert.

Die Anreicherungskulturen wurden anschließend auf Deacetylierung von N- Acetyl-PPT getestet. Dazu wurden die Zellen bei 10000 rpm abzentrifugiert und die Überstände im Aminosäureanalysator (Biotronic LC 5001 ) auf Bildung von PPT untersucht. Nur die Chitin-Medium-Kulturen erwiesen sich als Deactylase- positiv. Nach Ausplattierung auf Chitin-Agar wurden von diesen Kulturen ingesamt 40 Einzelkolonien isoliert, in Chitin-Flüssigmedium rekultiviert und erneut auf Deacetlyase -Aktivität getestet. Dabei wurden 6 positive Isolate gefunden, aus denen durch nochmaliges Ausstreichen auf Agar-Platten und Weiterkultivieren von Einzelkolonien die aktiven Reinkulturen gewonnen werden konnten. Der Stamm mit der höchsten Deacetylase-Aktivität wurde als Stenotrophomonas sp. identifiziert (DSM-Hinterlegungs-Nr. DSM 9734).

Beispiel 2: Klonierung und Sequenzierung des N-Acetyl-PPT-Deactylase-Gens aus Stenotrophomonas sp.

Die für die Arbeiten benutzten molekularbiologischen Standardmethoden sind bei Maniatis et al. 1 982, Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. beschrieben.

Genomische DNA aus Stenotrophomonas sp. wurde nach der Methode von Meade et al., 1 982, J. Bacteriol. 149: 1 14-1 22 präpariert. Nach partiellem Verdau mit Sau3A wurde die 5-1 0-kb Größenfraktion isoliert und in den mit BamHI geschnittenen lambda-ZAP-Express-Vektor von Stratagene (ZAP Express Vector Kit, Katalog Nr. 239201 , Instruction Manual) ligiert. Mit dem verpackten Ligationsansatz wurde eine primäre lambda-Phagen-Bank hergestellt und anschließend amplifiziert. Daraus wurde mit Hilfe des pBK-CMV Phagemid- Systems von Stratagene (Katalog-Nr. 21 2209, Instruction Manual) eine Phagemid-Expressionsbank in Escherichia coli angelegt. Diese Genbank wurde durch Aktivitätsscreening mit [^{1 4}C]-N-Acetyl-L-PPT als Substrat auf das

Vorhandensein des Deactylase-Gens geprüft. Zu diesem Zweck wurden 2000 Einzelklone in Miktrotiterplatten überimpft und über Nacht in LB-Medium bei 37°C mit 0,2 mM Isopropylthiogalaktosid (IPTG) als Induktor und 50 μg/ml Kanamycin als Resistenzmarker angezogen. Die Zellen wurden abzentrifugiert und in je 10 μl 1 mM [¹⁴C]-N-Acetyl-L-PPT über Nacht bei 28°C inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze in Achterpools durch Dünnschichtchromatographie und Autoradiographie auf Umsetzung von N-Acetyl-PPT in PPT analysiert (siehe EP 531 71 6, Beispiel 8) und bei positivem Befund die Einzelklone nachgetestet. Mit diesem Verfahren konnte ein positiver Klon mit einem 6-kb Insert aus 1920 Transformanten selektiert werden. Dieses DNA- Fragment wurde durch Restriktionskartierung näher charakterisiert. Durch Subklonierung von Restriktionsfragmenten des Inserts in pUC1 8/1 9 und Transformation der rekombinanten Plasmide in E. coli konnte mit Hilfe des oben beschriebenen Aktivitätstests das deac-Strukturgen auf einem 2,5-kb (2487 Basenpaare) Sall/Smal-Fragment lokalisiert werden (Abb. 1 ). Die Aktivität war von der Orientierung des Fragmentes relativ zum lac-Promoter des Vektors abhängig.

Das 2,5-kb Fragment wurde mit der Sanger-Methode (Sanger et al. 1 977, Proc. Natl. Acad. Sei USA 74:5463-5468) auf beiden Strängen sequenziert. Das gesamte Fragment hat eine Länge von 2487 Nukleotiden (siehe SEQ ID NO. 1 ). Der offene Leserahmen von 1494 Nukleotiden Länge beginnt mit Nukleotid- Nr.367 und endet mit Nr. 1 860.

Expressionstudien mit PCR-Subfragmenten aus diesem Bereich in E. coli zeigten, daß das aktive Deacetylase-Protein von einem 1 365 Nukleotide langen Bereich beginnend mit dem ATG-Startcodon in Position 496 und endend mit dem TGA- Stopcodon in Position 1 860 codiert wird. Die aus der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz stellt ein Polypeptid von 454 Aminosäuren (Seq ID NO 2) mit einem kalkuliertem Molekulargewicht von 48, 1 kDa dar.

Eine Homologiesuche in den EMBL-, DNA- und Protein-Datenbanken ergab Ähnlichkeiten mit der in dieser Anmeldung zum ersten Mal beschriebenen N-Acetyl-PPT-Deacetylase aus Comamonas acidovorans (37,4 % identische Aminosäuren), der Hippurat-Hydrolase aus Campylobacter jejuni (33,9 %) und N-Acyl-L-Amidohydrolase aus Bacillus stearothermophilus (33,7 %). Im folgenden wird das aus Stenotrophomonas isolierte Gen als deacl bezeichnet. Das entsprechende Protein wird als Dead bezeichnet. Aufgrund der Homologie kann man davon ausgehen, daß auch die genannten Hippurathydrolasen und Amidohydrolasen in Kombination mit gewebespezifischen Promotoren und einer anschließedend Behandlung vorteilhaft zur Herstellung von Pflanzen mit selektiv zerstörbaren Geweben, insbesondere männlich und/oder weiblich sterilen Pflanzen, genutzt werden können.

Beispiel 3: Charakterisierung des Dead -Proteins

Zur Überexpression und Reinigung der Deactylase aus Stenotrophamonas sp. (dead ) wurde das Glutathion-S-Transferase (GST)-Gen-Fusionsvektor-System von Pharmacia (Katalog Nr. 27-4581 -01 , Katalog-Nr. 27-4570-01 ) verwendet. Die Methode ist bei Smith and Johnson, 1 988, Gene 67:31 beschrieben. Die Reinigung des Fusionsproteine erfolgt durch Affinitätschromatographie an Glutathion-Sepharose-4B.

Das funktioneile deac-Gen wurde als 1 ,4-kb BamHI/Sall-PCR-Fragment in den GST-Fusionsvektor pGEX-4T-2 unter Kontrolle des lac-Promoters umkloniert. Die Expression von rekombinantem Fusionsprotein wurde durch Zugabe von 0, 1 mM IPTG induziert. Durch SDS/Polyacrylamid-Elektrophorese von Rohextrakten der E. coli-Transformanten konnte das Fusionsprotein als 74-kDa-Bande nachgewiesen werden.

Zur Proteinreinigung wurden die Zellen aus einer 2 I -Kultur einer induzierten, expressionspositiven E. coli Transformanten mit Ultraschall aufgeschlossen und der Extrakt anschließend durch Zugabe von 1 % Triton-X-100 solubilisiert. Der Überstand wurde an Glutathion-Sepharose-4B- gebunden. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS-Puffer ( 140 mM NaCI, 3 mM KCL, 10 mM Na₂HP0₄, 2 mM KH₂P0₄, pH = 7,3) wurde das an die Sepharose-Matrix gebundene Fusionsprotein mit Thrombin gespalten. Das Eluat enthielt als einzige Proteinbande ein Spaltprodukt von 48-kDa (nach denaturierender SDS/Polyacrylamid-Elektrophorese), welches im Enzym-Assay (siehe unten) als N-Acetyl-PPT-Deacetylase identifiziert werden konnte. Mit der beschriebenen Methode ließen sich aus 2 I Bakterienkultur 200 μg Deacetylase-Protein zur Homogenität reinigen.

Die Aktivität des Deacetylase-Proteins wurde mit den zwei folgenden Assays gemessen:

( 1 ) Radioaktiver Test: je 2,5 μg gereinigtes Enzym wurde in 10 μl Ansätzen in PBS-Puffer mit 0, 1 mM [¹⁴C]-N-Acetyl-L-PPT für 1 5 min. bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben 1 :6 in 5 mM KH₂P0₄, 10 % Methanol, pH = 1 ,92 verdünnt und in der HPLC mit Radioaktivitätsdetektor analysiert (Trennsäule: Spherisorb SAX, Laufmittel: 5 mM KH₂P0₄, 10 % Methanol, pH = 1 ,92, Flußrate: 0,5 ml/min). Unter diesen Bedingungen eluiert [¹⁴C]-L-PPT bei 4,5 min. und [¹⁴C]-N-Acetyl-L-PPT bei 6,5 min. Die spezifischen Deacetylase- Aktivitäten wurden in [nmol [¹⁴C]-L-PPT/min/mg Protein] ermittelt. Zur Ermittlung des pH-Optimums wurden die Ansätze in einem Puffer-System aus je 40 mM Bis-Tris, Tris und Caps zwischen pH = 6 und 9 inkubiert. Für die K_m- Wert-Messung wurden 3fach-Bestimmungen mit Konzentrationen von [¹⁴C]-N- Acetyl-L-PPT zwischen 0,01 mM und 1 mM bei pH = 8,0 in Anwesenheit von 1 mM CoCI₂ durchgeführt.

(2) Nicht-radioaktiver Test: Zur Untersuchung der Substratspezifität wurden je 5 μg gereinigtes Enzym in 20 μl Ansätzen in PBS-Puffer mit je 25 mM einer bestimmten N-Acetyl- bzw. N-Acyl-Aminsäure für 60 min. bei 28°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf Bildung der freien Aminosäuren im Aminosäurenanalysator gemessen (Biotronic LC 5001 ). Die spezifischen Aktivitäten wurden in [nmol Aminosäure/min/mg Protein] ermittelt. Für die N- Acetyl-PPT-Deacetylase wurden ein pH-Optimum von pH = 8 (siehe Tab. 1 ) und ein Temperatur-Optimum von 37°C (siehe Tab. 2) ermittelt. Die kinetischen Messungen ergaben ein K_m-Wert von 670 μM. Durch Zugabe von 1 mM CoCI₂ ließ sich die Enzymaktivität um ca. 20 % steigern.

Tab. 1 : pH-Optimum der N-Acetyl-PPT-Deacetylase

pH-Wert Spez. Aktivität [mol/min/mg Protein]

6 2,4

7 7,2

8 1 2,0

9 8,5

Tab. 2: Temperatur-Optimum der N-Acetyl-PPT-Deacetylase

Temperatur [°C] Spez. Aktivität [nmol/min/mg Protein]:

28 9,6

37 1 6,8

50 14,9 60 4,3

Die Ergebnisse der Messungen der Substratspezifität sind in Tab. 3 dargestellt.

Das Enzym besitzt ein relativ breites Substratspektrum. Die höchsten Umsetzungen wurden mit Hippursäure (N-Benzoyl-Glycin) und N-Acetyl-L- Glutamat erzielt. Die Affinität für N-Acetyl-L-PPT liegt ungefähr 50 % unter der für die beiden oben genannten Substrate. Die Deacetylase besitzt eine ausschließliche Spezifität für N-Acetyl-L-Aminosäuren. Mit den entsprechenden D-Enantiomeren konnten keine Reaktionen beobachtet werden. Tab. 3: Substratspezifität der N-Acetyl-PPT-Deacetylase

Substrat Rel. Aktivität² [%]

Hippursäure 100

(N-Benoyl-Glycin)

N-Ac-Phosphinothricin 43

N-Ac-Ornithin 37

N-Ac-Methionin 0

N-Ac-Tryptophan 0,4

N-Ac-Phenylalanin 24

N-Ac-Tyrosin 1 1

N-Ac-Glutaminsäure 100

N-Ac-Glutamin 30

N-Ac-Glycin 59

N-Ac-Histidin 43

N-Ac-Leucin 33

N-Ac-Valin 2

N-Ac-Serin 4

N-Ac-Prolin 0

1 : Bei allen Verbindungen handelt es sich um die L-Enantiomere. D Diiee mmiitt HHiippppuurrssääuurree ggeemmeesssseennee ssppeezifische Aktivität wurde gleich 100% gesetzt und die anderen Werte darauf bezogen.

Beispiel 4: Konstitutive Expression des dead -Gens in Tabak

Das dead -Strukturgen wurde als 1 ,4-kb BamHI/Sall-PCT-Fragment in den binären Vektor pPCV801 (Koncz and Schell, 1 986, Mol. Gen. Genet. 204: 383- 396) unter Kontrolle des 35S-Promoters umkloniert. Das entstandene Plasmid pPCVKDEACI (Abb. 2) mit dem Expressionsvektor 35S-Promoter-dead - Strukturgen-35S-Terminator wurde unter Verwendung von Standardmethoden in Agrobacterium tumefaciens (Stamm ATHV) transformiert. Blattstückchen von Tabak (Nicotiana tabacum) wurden mit den rekombinanten Agrobakterien nach der Methode von Horsch et al., 1 985, Science 227: 1 229-1 231 transformiert und auf Kanamycin-Medium selektiert, 18 unabhängige Tabak-Transformanten wurden regeneriert und auf Expression der Deacetylase in den Blättern getestet. Im Falle einer Aktivität des Proteins in den transgenen Pflanzen war mit einer Empfindlichkeit der Blätter gegen N-Acetyl-PPT zu rechnen, weil die Substanz in der Pflanze aufgrund der enzymatischen Aktivität der Deacetylase dann in den herbiziden Wirkstoff Phosphinothricin umgewandelt wird.

In einem Tropfenversuch wurden die Blätter der transgenen Pflanzen sowie von mehreren nicht-transgenen Kontrollpflanzen mit je 5 μl der folgenden Konzentrationen von N-Acetyl-D,L-PPT behandelt: 4 mg/ml ( = 1 5 mM), 1 mg/ml ( = 3,75 mM), 0,4 mg/ml ( = 1 ,5 mM), 0, 1 mg/ml ( = 0,38 mM). Die Behandlungsstellen wurden nach 1 -2 Wochen auf Aufhellungen bzw. Nekrosenbildung untersucht. Gleichzeitg wurde die N-Acetyl- PPT-spezifische Deacetylase-Aktivität der Transformanten, sowie der Kontrollpflanzen in Rohextrakten gemessen. Dazu wurden je 100 mg Blattmaterial in 200 μl PBS-Puffer homogenisiert, die Zelltrümmer abzentrifugiert und die proteinhaltigen Überstände über Nacht bei 4°C gegen den gleichen Puffer dialysiert. Je 10 μl dieser Proben wurden mit 0, 1 mM [¹⁴C]-N-Acetyl-L- PPT über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Ansätze wurden anschließend in der HPLC, wie oben beschrieben, auf Bildung von [¹⁴C]-L-PPT analysiert.

Die Testergebnisse der Tropfenversuche und der Aktivitätstests sind für ausgewählte Pflanzen in Tab. 4 dargestellt. Es zeigt sich, daß ca. 60 % der Transformanten das funktioneile Deacetylase-Protein exprimieren und den entsprechenden Phänotyp ausprägen.

Tab. 4: Empfindlichkeit von pPCVKDEACI -Pflanzen gegen N-Acetyl-PPT und Deacetylase-Aktivität in Rohextrakten

¹ : bezogen auf die eingesetzte Radioaktivität ü¹⁴C]-N-Acetyl-L-PPT)

+ + + : starke Nekrose

+ + : deutliche Schädigung

+ : schwache Aufhellung

- : keine Symptome

Beispiel 5: Tapetum-spezifische Expression des dead -Gens in Tabak

Unter Verwendung von Standardmethoden wurde der Tapetum-spezifische Promoter des tapl -Gens aus Löwenmäulchen (Antirrhinum majus) als 2,2-kb EcoRI/BamHI-Fragment mit dem dead -Strukturgen ( 1 ,4-kb BamHI/Sall-PCR- Fragment) und dem 35S-Terminator im Vektor pUC 1 8 fusioniert. Die so entstandenen Expressionskassette tap1 -Promoter-deac-Strukturgen-35S- Terminator wurde als 3,8-kb EcoRI-Fragment an Stelle der 35S- Promoter/Terminator-Region in den binären Vektor pPCV801 einkloniert (Plasmid pPCVTDEACI , Abb. 3) . Die Transformation von Tabak wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Im Falle einer Tapetum-spezifischen Expression der Deacetylase sollten durch Behandlung der Blütenknospen mit N-Acetyl-PPT männlich sterile Blüten induziert werden können. Die Umwandlung des PPT-Derivates in den herbiziden Wirkstoff Phosphinothricin führt zu einer selektiven Schädigung des Tapetum- Gewebes, wodurch die Entwicklung funktioneller Pollen verhindert wird.

Jeweils nur eine Seite der Infloreszenzen (der gesamte Bereich der sich entwickelnden Blütenknospen) wurde mit N-Acetyl-PPT behandelt, die andere Seite der Influoreszen blieb unbehandelt, um sicherzustellen, daß die zu beobachtenden Phänomene nicht auf Mißbildungen der jeweiligen Pflanzen zurückzuführen sind. Die Behandlung wurde zu einem Zeitpunkt durchgeführt, zu dem die einzelnen Knospen nicht größer als 5 mm waren(aktive Phase für Tapetum-Promoter). Die Tabak-Transformanten sowie mehreren NT Sam NN- Kontrollpflanzen wurden innerhalb einer Woche 3x mit 0,2 % N-Acetyl-D,L-PPT ( = 7,5 mM) / 0, 1 % Genapol (Netzmittel) behandelt. Nach dem Aufblühen der Knospen (ca. 9-1 1 Tage nach Abschluß der Behandlung) wurden die Pflanzen auf das Auftreten männlich steriler Blüten untersucht.

Gleichzeitig wurde die N-Acetyl-PPT-spezifische Deacetylase-Aktivität in unreifen Antheren der Transformanten, sowie der Kontrollpflanzen gemessen. Dazu wurden die unreifen Antheren aus ca. 5 mm großen Blütenknospen präpariert und über Nacht bei Raumtemperatur in je 50 μM f ¹⁴C]-N-Acetyl-L- PPT-Lösung inkubiert. Anschließend wurden die Antheren 1 x in 500 μl PBS- Puffer gewaschen und dann in 50 μl PBS-Puffer homogenisiert. Nach Abzentrifugieren der Zelltrümmer wurden die Überstände in der Speed-Vac eingeengt und die Pellets in je 30 μl HPLC-Puffer (5 mM KH₂P0₄, 10 % Methanol, pH = 1 ,92) aufgenommen. Die Ansätze wurden in der HPLC, wie oben beschrieben auf Bildung von [^{1 4}C]-L-PPT analysiert. Die Ergebnisse der Blütenbehandlung und der Aktivitätstests sind für ausgewählte Pflanzen in Tab. 5 dargestellt. In fast allen Transformanten konnte eine Antheren-spezifische Deacetylase-Aktivität festgestellt werden. Bei 3 Transformanten wurden auf der mit N-Acetyl-PPT-behandelten Seite der Blütentraube männlich sterile, d. h. es wurde kein Pollen gebildet, bzw. stark pollenreduzierte Blüten beobachtet. Die Wirkung auf neue, reifende Knospen hielt über einen Zeitraum von ca. 3 Wochen an. Die unbehandelten Blüten der Transformanten, sowie die behandelten Blüten der Kontrollpflanzen waren in allen Fällen fertil. Bei den männlich sterilen Blüten war keine Samenbildung feststellbar. Eine gezielte Fremdbestäubung der männlich sterilen Blüten war jedoch möglich, wodurch bewiesen wurde, daß die weiblichen Blütenteile ihre volle Funktionsfähigkeit behalten haben (Nacken et al , 1 991 , Mol. Gen. Genet. 229: 1 29-136).

Tab. 5: Induzierte männliche Sterilität bei pPCVTDEACI -Pflanzen durch Blütenbehandlung mit N-Acetyl-PPT und Deacetylase-Aktivität in Antheren

Beispiel 6: Isolierung und Identifizierung einer Deacetylase mit Spezifität für N- Acetyl-Phosphinothricin aus Comamonas acidovorans

Eine Bodenprobe aus Bangkok wurde in Mineralsalzmedium (0,5 g K₂HP0₄, 0,2 g MgS0₄, 2 g (NH₄)₂S0₄, 0,01 g FeS0₄ in 980 ml H₂0), das als einzige Kohlenstoffquelle Chitin (2 g/l) enthielt, aufgeschlämmt und anschließend 48 Stunden bei 30°C inkubiert. Dann erfolgte ein Überimpfen in frisches Mineralsalzmedium und nach weiteren 48 Stunden Inkubation wurden Verdünnungsreihen auf LB-Medium (Miller, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbour Laboratory Press) ausplattiert.

Unter den anwachsenden Kolonien befanden sich auch solche eines Bakterienstammes, der sich in Reinkultur durch eine sehr gute Verwertung von N-Acetyl-Glutamat als einziger Kohlenstoffquelle auszeichnet (Ausstreichen auf Mineralsalzmedium mit N-Acetyl-Glutamat ( 2 g/l, als sterilfiltrierte Lösung zu autoklavierten Mineralsalzmedium mit 14 g/l Agar zugeben) führt innerhalb von 12 Stunden Inkubation bei 30°C zur Bildung deutlich sichtbarer Kolonien). Die Deacetylierung von N-Acetyl-PPT wurde wie oben beschrieben nachgewiesen. Der mit der Laborbezeichnung B6 versehene Stamm wurde von der DSM als Comamonas acidovorans identifiziert (DSM 1 1070) .

Beispiel 7: Klonierung des Deactylasegens aus Comamonas acidovorans

Gesamt-DNA aus Comamonas acidovorans wurde isoliert, mit EcoRI verdaut und mit ebenfalls EcoRI-verdauter DNA des Vektors pACYC184 (Cang and Cohen, 1 978, J. Bacteriol. 1 34, 1 141 -1 1 56) ligiert. Der Ligationsansatz wurde zur Elektroporation der E. coli argE-Mutante XSID2 (Mountain et al., 1 984, Mol. Gen. Genet. 1 97, 82-89) verwendet. Durch Selektion auf Komplementation der Arginin-Auxotrophie gelang es, ein 8,9 kb großes EcoRI-Fragment aus dem Genom von C. acidovorans zu isolieren, das für die Komplementation ausreichend ist. Durch Subklonierung ließ sich der komplementierende Bereich auf ein 1 ,4 kb großes Fragment einschränken. Dieses liegt in dem mit pGK83 bezeichneten Derivat des Sequenziervektors pSVB30 (Arnold und Pühler, 1988, Gene 70, 1 72-1 78) vor.

Beispiel 8: Sequenzierung des Deacetylasegens aus Comamonas acidovorans

Das komplementierende 1 ,4 kb ( 1 387 Basenpaare) große Fragment wurde nach bekannten Methoden vollständig doppelsträngig sequenziert.

Beispiel 9: Kodierbereichsanalyse und Homologievergleich des sequenzierten Bereiches

Eine Kodierbereichsanalyse ergab einen offenen Leserahmen von Position 1 bis 1206 (SEQ ID No. 3), der für ein 402 Aminosäuren großes Protein kodiert (SEQ ID NO. 4).

Der Homologievergleich mit bekannten Genen aus Datenbanken zeigt eine deutliche Homologie zu einer N-acyl-L-Amidohydrolase aus Bacillus stearothermophilus (ama, Sakanyan et al., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59, 3878-3888) und einer Hippurathydrolase aus Campylobacter jejuni (bisher keine Veröffentlichung). Im Proteinvergleich weist die Hippurathydrolase 43 % identische Aminosäuren auf (Tab. 6). Darüberhinaus weist das Gen auf DNA- und Protein-Ebene eine sehr auffällige Homologie zu dem aus Stenotrophomonas spec. isolierten Deacetylasegen auf. In Anlehnung an die Bezeichnung des Gens aus Stenotrophomonas sp. wurde das aus C. acidovorans identifizierte Gen mit deac2 bezeichnet. Tabelle 6: Homologievergleich mit bekannten Sequenzen

Beispiel 10: Überexpression des deac2-Gens aus Comamonas acidovorans- Pflanzenkonstrukte

Zur Analyse der Substratspezifität des deac2-Genproduktes aus Comamonas acidovorans, wurde dieses überexprimiert. Dazu wurde das Gen in einen Vektor mit hoher Kopienzahl unter Kontrolle des lacZ Promotors kloniert. Die Expressionseffizienz wurde jedoch durch die gleichzeitige, in einem anderen Leserahmen stattfindende Translation des lacZ-alpha eingeschränkt. Daher wurde diese durch Einführen eines Stop-Codons unterbrochen, so daß der Vektor pGK81 eine vom lac-Z-Gen unbeeinträchtigte Überexpression des deac2- Gens ermöglicht. Dies konnte auch phänotypisch nachgewiesen werden, da diese Konstrukt eine deutlich stärkere Komplementation einer E. coli argE- Mutante aufweist.

Zur Transformation von Pflanzen wurde das deac2-Strukturgen unter der Verwendung des binären Vektors pROK1 (Baulcombe et al. 1 986, Nature, 321 : 446-449) hinter den konstitutiven 35S-Promoter bzw. den tapetum-spezifischen Promoter TA-29 umkloniert. Die erhaltenen Expressionsplsmide pGK83 und pMF9 sind in den Abbildungen dargestellt. Beispiel 1 1 : Untersuchung der Substratspezifität des deac2-Genproduktes aus Comamonas acidovorans

Zur Untersuchung der Substratspezifität des deac2-Genproduktes aus Comamonas acidovorans wurden durch Toluol/Ethanol-Behandlung permeabilisierte Zellen des E. coli Stammes XLI-Blue mit und ohne den Vektor pGK81 verwendet. Die Induktion des durch den in diesem Stamm vorhandenen Lac'-Repressors reprimierten deac2-Gens ließ sich durch IPTG-Behandlung erzielen. Die permeabilisierten Zellen wurden mit verschiedenen N-acetylierten Aminosäuren (Endkonzentration 25mM) für 3 Stunden bei 30°C inkubiert und die Überstände mit Hilfe eines Aminosäure-Analysators untersucht. Dabei ergab sich, daß mehr als 20 % des zur Verfügung gestellten N-Acetyl- Ornithins umgesetzt wurde. Auch für N-Acetyl-Phosphinothricin ließ sich eine, analog der eingesetzten Konzentration an N-Acetyl-Phosphinothricin, zunehmende Deacetylierung zu Phosphinothricin feststellen (Tabelle 7).

Tabelle 7: Umsetzung N-acetylierter Aminosäuren durch das deac2-Genprodukt

Angegeben sind die Konzentrationen der eingesetzten N-acetylierten Aminosäuren und der durch Deacetylierung entstandenen Aminosäuren.

Abb. 1 Restriktionskarte des 2,5-kb Sall/BamHI-Fragmentes, welches die

N-Acetyl-PPT-spezifische Deacetylase-Aktivität vermittelt. Position und Orientierung des dead -Strukturgens sind durch Pfeil markiert (BP = Basenpaare) . Abb. 2 Karte des Plasmids pPVCKDEACI zur konstitutiven Expression des deac-Gens in Pflanzen

Abb. 3 Karte des Plasmids pPCVTDEACI zur Tapetum-spezifischen

Expression des deac-Gens in Pflanzen

Abb. 4 Karte des Plasmids pGK83

Abb. 5 Karte des Plasmids pMF9

OΛPEST " r. --. E ' Ξ! I DIE •\ ^'TΞ -V-^{' •}' ^{"*" •}os \. .E λN ERKENNUNG D P. -^!7N Ξ? : -EG¹ ^"SO ^•. • '.i -. C* •'.S IS

F R :. , ^*Ξ ^* £C1 : . ^'CΛ-^' PATT- — , ^•"..- AHΓ. JT-

INTERNATIONALES F0R.MBL.-s

ϊoεcns ≤ r.eπr.g Agrüvc GmbH ^rcrschür,c Ξiccr.eime H 372

= 5925 ?rar.:-:furz /Main

EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ΞRSTKINTERLΞGUNG. ausgestellt zemlß Rege. ^" . von cer unten angeztoeπen .NTERNATiONALEN HINTΞ?.LΞC Nσ3STELLΞ

1. J ENNZHCH UNG S MIKROORGANISMUS

• 'vom HINTERLEGE?, zugeteilte, aezugszetcneπ von αer INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zuzetemc ΞTNGANGSN MMER

: 3010 i

II WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE 7AX0N0MISCKΞ BEZEICHNUNG

Mit Oem unter I. oezeicnneten Mikroorganismus wurαe

( i eine isser.scπaήlicne Bescπreioung

( ; eine vorgescmazene taxonomiscne Bezeicnnung eingercicnt.

,^'Zutreπeπαej anicreuzeni

III. EINGANG UND ANNAHME

j Diese mtεπuuonaie Himeπezuπgssteile nimmt αen unter i αezeicnne.en Mικrσorgantsm--_ an. cer sei inr zrr . ; ; : - . . - . . i^'Dacum αc- ! Erstnimenegung)- einzezaπgen _s_ j

I IV. EINGANG DES ANTRAGS ALT UMWANDLUNG

Der unter 1 oezeicnnete MDcπiorzanismus ist bei dieser lπtemauonaien Hinterlegungsstelle zrr eingegangen ^;Tιatum αer sπi- ninteπeguπg) unα ein Antrag au:' Umwandlung αieser Erstntnterieguπg in sine Hinterlegung gemäß Buoace^j::- vertrag ist am eingegangen fDacum oes Eingangs ces Antrags auf Umwanαiungj

■ V INTERNATIONALE HTNTEF-LEGUNGSSTELLE

Name: DSM-DELTΞCHΞ SAMMLUNG VON Imrerscπππi cni cer z ver eruπg cer internationalen Hinterlegungsstelle

MIKROORGANISMEN UND ZELLK .TUREN GmbH cenizte .-"ersoπteni oαer c:_ . αcπ von inr erτ .2:r.uz'.en Beαiensiet.:-.

Mascnerocer Weg :r D-3S I--. sraunscnwei. O/ , -. ^

Falls Rege: ό öuςrtstac. ; z -ffl ist αies αer Zeitountr. zu αern αer Status einer internationa^len .-.mterⁱegungssteue erworse- worαen is.. .APESTER \ ERTRAG Ü3Ξ-. --E r TERNAΪIOXλL.-

.A E KE U G r ER H-NΓER ICU G VON NEKRCORGAN.''..:

INTERNATIONALES FORMBLATT

Prof. 2r. P-άhler

Lehrstuhl für Genetik Universität Bielefeld Postfac. 130131 EMPFANGSBESTÄTIGUNG BE ERSTHETIS-CΪGUNG. D-32Ξ01 Bielefeld ansec-irllt remlü Rseel 7.1 voα aer unten angegebenen INTERNATIONALEN HNTESLϊGCNGSSTELLE

I

^! L KENNZEICHNUNG DES .MIKROORGANISMUS

Vom H33STERI-EGΞR zu-eaeilt« Bsugszeichea: Von aer INTERNATIONALEN HNTESLΞGUNG3S" zuπ- ütβ HN^QANGSNUMMER; B6

ΩSK 11070

II. WISSENSCHAPTUrHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCKΞ BEZEICHNUNG

Mit dem unter I. bezeicanetEi MU-rαorςanis us wurde

( ) ς_αe -"Lssinscnafilte e BesςnreΛuπs

(X ) eine vor esc-uagese oxonomiscne Bezetcαnung eingereich..

1 (Zuπs≤enass iwcreuzeaj.

HL EINGANG UND ANNAHME

Diese inremauαnale K_ε-eri£_rur.e_-iθ_Jιe ■"""*" ήen un-S I cezBirπnrtπ. Milcroorgaπisrπus an. aer bei ihr ^; 19 9 c - C 7 - 12 fDajam cer Ξrsthinirj-cfcuuς erngigangsa IΛ

IV. EINGANG DES .ANTRAGS ALT UMWANDLUNG

! Der unter i nezaicanes Mücrooresa_Mtπus ist bei dieser lnιemiüθ-_-_eaιK-raeτιec"-nc_-rtβüe am eingegangen ⁽Danun der Eist^» j ά exieguπg. und cm _Λ3tπg auf Umwandlung αieser E-xmi-terieςCTζ: m iine Hinrn-iegung gemlS Buαaocι=τ Vertrag ist am i eingegangen (Dπaπn ces Emsangs ces Antrags auf Urowanalung),

V, INTERNATIONALE HINT__RLEGcrNGSSTELI_E

Niffls: DSMZ-DEUTSCHΞ SAMMLUNG VON Un-ersenrtftfen) aer zur Verssomg oer t emaπonaicn Huπe .ϊϊ -lsajieUe

MKROCRijANISMΞN UND 7ττnπr. T.7ESX GπibK befuetεn Peι«unen) oαer zs (der) von inr er acntieten Eeαiβitβun.

Anie ii t: Maseaerodei- Weg lb D-38124 -.raunrenweig es. s_^-z_^

Daιu=- 19 55 - 07 - 15^'

' Fall« Regel 6.4 Bucaπaoe α _ZUCÄ. ist aiei aer Zeπnuni.., ZU asm cer Stiius einer mtsrnaoonüeπ Kin^ts^{f l}egungssteύe erworaen wcraen ui oπnblart DSMZ-3P« -»-r-?-?- Susi 0196 SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER :

(A) NAME : Hoechst Schering AgrEvo GmbH

(B) STRASSE: -

(C) ORT: Frankfurt

(D) BUNDESLAND: -

(E) LAND: Deutschland

(F) POSTLEITZAHL: 65926

(G) TELEPHON: 069-305-5596 (H) TELEFAX: (+69) 357175

( I ) TELEX : -

(ii) ANMELDETITEL: Neue Gene codierend fuer

Aminosaeure-Deacetylen mit Spezifitaet fuer N-Acetyl-L-Phosphinothricin, ihre Isolierung und Verwendung

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4

(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 1:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 1365 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzel

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon

(B) LAGE: 1..1365 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 1:

ATGATCCGCA AGACCGTTCT GTTGACTGCG CTGTCCTGCG CCCTGGCCTC CGCGACAGCC 60

ACCGCCGCCG AAGGCCAGCG GCCCGAGGTG GAGGCCGCCG CCGCGCGCCT GCAGCGGCAG 120

GTGGTGGAGT GGCGCCGCGA TTTCCACCAG CATCCGGAGC TGTCCAACCG CGAGGTGCGC 180

ACCGCCGCCA AGGTGGCCGA GCGCCTGCGC GCGATGGGCC TGCAACCGCA GACCGGCGTC 240

GCCGTGCACG GCGTGGTGGC GATCATCAAG GGCGCCCTGC CGGGGCCGAA GATCGCCCTG 300

CGCGCGGACA TGGACGCGCT GCCGGTGACC GAACAGACCG GGCTGCCGTT CGCCTCCACC 360

GCCACGGCCG AGTACCGCGG CGAGAAGGTC GGGGTGATGC ATGCCTGCGG CCACGACGCC 420

CATACCGCCA CCCTGCTCGG CGTGGCCGAC GCGCTGGTGG CCATGCGCGA CACGCTGCCC 480

GGCGAAGTAA TGCTGATCTT CCAGCCGGCC GAGGAAGGCG CGCCGCCGCC GGAGCAGGGC 540

GGTGCCGAGC TGATGCTCAA GGAGGGGCTG TTCAAGGAGT TCAAGCCGGA GGCGGTGTTC 600

GGCCTGCACG TGTTCTCCAG CGTCCAGGCC GGGCAGATCG CCGTGCGCGG CGGCCCGCTG 660

ATGGCCGCCT CCGACCGCTT CGCCATCACC GTCAACGGCC GCCAGACCCA TGGCTCGGCG 720

CCCTGGAACG GCATCGATCC GATTGTCGCC GCCTCCGACC TGATCGGCAC CGCGCAGACC 780

ATCGTCAGCC GCCGCGCCAA CCTGTCCAAG CAGCCGGCGG TGCTGACCTT CGGCGCGATC 840

AAGGGCGGCA TCCGCTACAA CATCATCCCC GACTCGGTGG AGATGGTCGG CACCATCCGC 900

ACCTTCGACC CGGACATGCG CAAGCAGATC TTCGCCGACT TGCGCAACGT CGCCGAGCAC 960

ACCGCTGCCG CATGGCGCCA CCGCCACCAC CGACATCTAC GAGAAGGACG GCAACCCGGC 1020

CACGGTCAAC GACCCGGCGC TGACCGCGCG CATGCTGCCC AGCCTGCAGG CCGTGGTCGG 1080

CAAGGACAAC GTCTACGAGC CGCCGCTGCA GATGGGCTCG GAGGACTTCT CGCTGTATGC 1140

GCAGCAGGTG CCGGCGATGT TCTTCTTCGT CGGCTCCACC GGCGCGGGCA TCGACCCGGC 1200

CACCGCGCCC AGCAACCACT CGCCGAAGTT CCTGCTCGAC GAGAAGGCGC TGGACGTGGG 1260 CCTGCGCGCG CTGCTGCAGG TGTCGCTGGA CTATCTGCAC GGTGGCAAGG CGGGGTGACC 1320

CCTGCCAGTA TCGTGCCCCC GATACGGAAG AAGGACCTCC CATGA 1365

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 2:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 454 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzel

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein

(B) LAGE: 1..454

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 2:

Met Ile Arg Lys Thr Val Leu Leu Thr Ala Leu Ser Cys Ala Leu Ala 1 5 10 15

Ser Ala Thr Ala Thr Ala Ala Glu Gly Gin Arg Pro Glu Val Glu Ala 20 25 30

Ala Ala Ala Arg Leu Gin Arg Gin Val Val Glu Trp Arg Arg Asp Phe 35 40 45

His Gin His Pro Glu Leu Ser Asn Arg Glu Val Arg Thr Ala Ala Lys 50 55 60

Val Ala Glu Arg Leu Arg Ala Met Gly Leu Gin Pro Gin Thr Gly Val 65 70 75 80

Ala Val His Gly Val Val Ala Ile Ile Lys Gly Ala Leu Pro Gly Pro 85 90 95

Lys Ile Ala Leu Arg Ala Asp Met Asp Ala Leu Pro Val Thr Glu Gin 100 105 110 Thr Gly Leu Pro Phe Ala Ser Thr Ala Thr Ala Glu Tyr Arg Gly Glu 115 120 125

Lys Val Gly Val Met His Ala Cys Gly His Asp Ala His Thr Ala Thr 130 135 140

Leu Leu Gly Val Ala Asp Ala Leu Val Ala Met Arg Asp Thr Leu Pro 145 150 155 160

Gly Glu Val Met Leu Ile Phe Gin Pro Ala Glu Glu Gly Ala Pro Pro 165 170 175

Pro Glu Gin Gly Gly Ala Glu Leu Met Leu Lys Glu Gly Leu Phe Lys 180 185 190

Glu Phe Lys Pro Glu Ala Val Phe Gly Leu His Val Phe Ser Ser Val 195 200 205

Gin Ala Gly Gin Ile Ala Val Arg Gly Gly Pro Leu Met Ala Ala Ser 210 215 220

Asp Arg Phe Ala Ile Thr Val Asn Gly Arg Gin Thr His Gly Ser Ala 225 230 235 240

Pro Trp Asn Gly Ile Asp Pro Ile Val Ala Ala Ser Asp Leu Ile Gly 245 250 255

Thr Ala Gin Thr Ile Val Ser Arg Arg Ala Asn Leu Ser Lys Gin Pro 260 265 270

Ala Val Leu Thr Phe Gly Ala Ile Lys Gly Gly Ile Arg Tyr Asn Ile 275 280 285

Ile Pro Asp Ser Val Glu Met Val Gly Thr Ile Arg Thr Phe Asp Pro 290 295 300

Asp Met Arg Lys Gin Ile Phe Ala Asp Leu Arg Asn Val Ala Glu His 305 310 315 320

Thr Ala Ala Ala Trp Arg His Arg His His Arg His Leu Arg Glu Gly 325 330 335

Arg Gin Pro Gly His Gly Gin Arg Pro Gly Ala Asp Arg Ala His Ala 340 345 350 Ala Gin Pro Ala Gly Arg Gly Arg Gin Gly Gin Arg Leu Arg Ala Ala 355 360 365

Ala Ala Asp Gly Leu Gly Gly Leu Leu Ala Val Cys Ala Ala Gly Ala 370 375 380

Gly Asp Val Leu Leu Arg Arg Leu His Arg Arg Gly His Arg Pro Gly 385 390 395 400

His Arg Ala Gin Gin Pro Leu Ala Glu Val Pro Ala Arg Arg Glu Gly 405 410 415

Ala Gly Arg Gly Pro Ala Arg Ala Ala Ala Gly Val Ala Gly Leu Ser 420 425 430

Ala Arg Trp Gin Gly Gly Val Thr Pro Ala Ser Ile Val Pro Pro Ile 435 440 445

Arg Lys Lys Asp Leu Pro 450

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 3:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 1273 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzel

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL : exon

(B) LAGE: 1..1273

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

ATGGCCTTGC TGCAGGAGCT GCTGGACAGC GCACCCGAGA TCACCGCGCT GCGCCGCGAC 60

ATACATGCCC ATCCCGAACT GTGCTTCGAG GAACTGCGCA CCGCCGACCT GGTGGCCCGG 120

CAGCTCGAAG GCTGGGGCAT TGCCGTGCAC CGCGGCCTGG GCCGCACGGG CGTGGTGGGC 180 ACCATCCACG GCCGTGACGG CGGCGCCAGC GGCCGGGCCA TCGGGCTGCG CGCCGACATG 240

GACGCCCTGC CCATGCAGGA GTTCAACACC TTCGAGCACG CCAGCCGCCA CGCCGGAAAA 300

ATGCATGCCT GCGGACATGA CGGCCATGTC GCCATGCTGC TGGCCGCCGC GCAGTACCTG 360

GCCGTGCACC GCGACAGCTT CGAGGGCACG GTGCACCTGA TCTTCCAGCC GGCCGAAGAG 420

GGCGGCGGCG GGGCGCGCGA GATGGTCGAG GACGGCCTGT TCACCCAGTT CCCCATGCAG 480

GCCGTGTTCG GCATGCACAA CTGGCCGGGC ATGAAGGCCG GCACCATGCC GTGGGCCCCG 540

GGCCCGGCCA TGGCGTCGAG CAACGAGTTC CGCATCGTCG TGCGCGGCAA GGGCGGCCAC 600

GCGGCCATGC CGCACATGGT GATCGACCCG CTGCCCGTGG CGGCCCAGCT CATCCTGGGC 660

CTGCAGACCA TCGTCAGCCG CAACGTCAAG CCCATCGAGG CGGGCGTGGT CTCGGTCACC 720

ATGGTCCATG CGGGCGAGGC CACGAACGTG GTGCCCGACA GCGTGGAGCT GCAGGGCACG 780

GTGCGCACCT TCACGCTGGA GGTGCTGGAC CTGATCGAGC GGCGCATGAA GGCCCTGGCC 840

GAGAGCATCT GCGCGGCGCA TGACACGCGC TGCGAGTTCG AGTTCGTGCG CAACTACCCG 900

CCCACCATCA ACTCCGCCCC GGAGGCCGAG TTCGCACGCC GCGTCATGGC CGAGGTCGTG 960

GGCGAGGCCA ACGTGCTGCC CCAGGAGCCG TCCATGGGCG CCGAGGACTT CGCCTTCATG 1020

CTGCTGGAAA AGCCCGGCGC CTACTGCTTC ATCGCCAATG GCGACGGCGA CCACCGCGCC 1080

ATCGGCCACG GCGGCGGTCC CTGCACGCTG CACAACCCCA GCTACGACTT CAACGACCAG 1140

CTGATTCCGC AGGGCGCCAC GTTCTGGGTG AAGCTGGCCC AGCGCTGGCT GAGCGAGCCC 1200

ACGCGCTGAG GCCTTGCGGG GTCCGGCCGA CACCGGCATG TCACACACCG CACCTAGCAT 1260

GCGGTCCCTG TGA 1273 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 4:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:

(A) LÄNGE: 402 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzel

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein

(B) LAGE: 1..402

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 4:

Met Ala Leu Leu Gin Glu Leu Leu Asp Ser Ala Pro Glu Ile Thr Ala 1 5 10 15

Leu Arg Arg Asp Ile His Ala His Pro Glu Leu Cys Phe Glu Glu Leu 20 25 30

Arg Thr Ala Asp Leu Val Ala Arg Gin Leu Glu Gly Trp Gly Ile Ala 35 40 45

Val His Arg Gly Leu Gly Arg Thr Gly Val Val Gly Thr Ile His Gly 50 55 60

Arg Asp Gly Gly Ala Ser Gly Arg Ala Ile Gly Leu Arg Ala Asp Met 65 70 75 80

Asp Ala Leu Pro Met Gin Glu Phe Asn Thr Phe Glu His Ala Ser Arg 85 90 95

His Ala Gly Lys Met His Ala Cys Gly His Asp Gly His Val Ala Met 100 105 110

Leu Leu Ala Ala Ala Gin Tyr Leu Ala Val His Arg Asp Ser Phe Glu 115 120 125

Gly Thr Val His Leu Ile Phe Gin Pro Ala Glu Glu Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ala Arg Glu Met Val Glu Asp Gly Leu Phe Thr Gin Phe Pro Met Gin 145 150 155 160

Ala Val Phe Gly Met His Asn Trp Pro Gly Met Lys Ala Gly Thr Met 165 170 175

Pro Trp Ala Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser Ser Asn Glu Phe Arg Ile 180 185 190

Val Val Arg Gly Lys Gly Gly His Ala Ala Met Pro His Met Val Ile 195 200 205

Asp Pro Leu Pro Val Ala Ala Gin Leu Ile Leu Gly Leu Gin Thr Ile 210 215 220

Val Ser Arg Asn Val Lys Pro Ile Glu Ala Gly Val Val Ser Val Thr 225 230 235 240

Met Val His Ala Gly Glu Ala Thr Asn Val Val Pro Asp Ser Val Glu 245 250 255

Leu Gin Gly Thr Val Arg Thr Phe Thr Leu Glu Val Leu Asp Leu Ile 260 265 270

Glu Arg Arg Met Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile Cys Ala Ala His Asp 275 280 285

Thr Arg Cys Glu Phe Glu Phe Val Arg Asn Tyr Pro Pro Thr Ile Asn 290 295 300

Ser Ala Pro Glu Ala Glu Phe Ala Arg Arg Val Met Ala Glu Val Val 305 310 315 320

Gly Glu Ala Asn Val Leu Pro Gin Glu Pro Ser Met Gly Ala Glu Asp 325 330 335

Phe Ala Phe Met Leu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Tyr Cys Phe Ile Ala 340 345 350

Asn Gly Asp Gly Asp His Arg Ala Ile Gly His Gly Gly Gly Pro Cys 355 360 365

Thr Leu His Asn Pro Ser Tyr Asp Phe Asn Asp Gin Leu Ile Pro Gin 370 375 380 Gly Ala Thr Phe Trp Val Lys Leu Ala Gin Arg Trp Leu Ser Glu Pro 385 390 395 400

Thr Arg

Claims

Patentansprüche

1 . DNA-Molekül codierend ein Protein mit der biologischen Aktivität einer N-Acetyl-Phosphinothricin-Deacetylase.

2. DNA-Molekül codierend ein Protein mit der biologischen Aktivität einer N-Acetyl-Phosphinothricin-Deacetylase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

c) DNA-Molekülen, die für ein Protein mit der unter SEQ ID No 4 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmenten und/oder Derivaten davon kodieren und

d) DNA-Molekülen, die für eine unter der SEQ ID No 3 angegebenen Nukleotidsequenz kodieren oder Sequenzen, die im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes von dieser Sequenz abweichen.

3. Verfahren zur Isolierung von Mikroorganismen mit hoher N-Acetyl- Phosphinothricin-Deactylase-Aktivität.

4. Stenotrophomonas sp. (DSM 9734) und Comamonas acidovorans (DSM 1 1070).

5. Pflanzenzellen oder Pflanzen, die ein DNA-Molekül nach Anspruch 1 enthalten.

6. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gezielt zerstörbaren Teilen durch spezifische Expression eines Deacetylasegens.

7. Verfahren zur Herstellung männlich oder weiblich steriler Pflanzen durch spezifische Expression eines Deacetylasegens.