WO1998029558A1 - Media for culturing microorganisms and process for producing unsaturated fatty acids or lipids containing the same - Google Patents

Media for culturing microorganisms and process for producing unsaturated fatty acids or lipids containing the same Download PDF

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Kenichi Higashiyama
Toshiaki Yaguchi
Kengo Akimoto
Sakayu Shimizu
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Suntory Ltd
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    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6432—Eicosapentaenoic acids [EPA]

Definitions

  • the present invention relates to a novel culture medium for culturing microorganisms, and a method for producing an unsaturated fatty acid-containing oil or fat obtained by culturing a microorganism belonging to the genus Mortierella having the ability to produce unsaturated fatty acids in the medium.
  • Unsaturated fatty acids such as arachidonic acid, dihomo-a-linolenic acid, eicosapentaenoic acid, and mead acid are powerful and have a wide variety of physiological activities, such as prostaglandin, thromboxane, prostacyclin, and leucot. It is said to be a precursor of Lien and has been attracting attention in recent years. For example, arachidonic acid is being studied rapidly along with DHA (docosahexaenoic acid) as a component particularly necessary for the development of infants, and Lantin et al.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • a method for producing mead acid using a mutant obtained by subjecting a Mortierella microorganism to a mutation treatment and having a reduced or deleted ⁇ 12 desaturation activity is also known ( Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-9188 8). Also, a method for producing a large amount of dihomo-arinolenic acid using a mutant strain obtained by subjecting a microorganism of the genus Mortierella to a mutation and having a reduced or deleted ⁇ 5 desaturation activity.
  • a filamentous fungus such as Mortierella sp.
  • the viscosity of the culture solution often increases due to the growth of cells.
  • the present invention relates to a method for producing an unsaturated fatty acid-containing fat or oil by fermentation of a microorganism belonging to the genus Mortierella, wherein unsaturated fatty acid productivity
  • the purpose of the present invention is to provide an unsaturated fatty acid-containing fat or oil in an economical and stable manner by improving the growth of non-saturated fatty acids, the accumulation of unsaturated fatty acids, and the accumulation of total lipids.
  • the present invention has an advantage that, for example, unsaturated fatty acids can be obtained in a high yield, and aims to provide an inexpensive medium for culturing microorganisms.
  • the present inventors have comprehensively studied not only the unsaturated fatty acid yield but also the bacterial morphology and lipid composition change in the effect of adding salts to the culture medium. It has been found that it is extremely effective to add all ions of calcium, sodium, calcium, magnesium and phosphoric acid at a predetermined concentration and in a good balance, and have completed the present invention. Was.
  • the present invention relates to phosphates, potassium ions, sodium ions, magnesium ions and calcium ions, which are 5 to 60 mM, 5 to 60 mM, 2 to 5 mM, respectively. 0 mM, 0.5 to 9 mM, 0.5 to 12 mM, and a medium for culturing microorganisms, and a filamentous fungus in the medium, particularly to the genus Mortierella.
  • a method for producing an unsaturated fatty acid or a lipid containing the same which has improved productivity by culturing a microorganism belonging thereto.
  • the unsaturated fatty acid refers to a fatty acid having 16 or more carbon atoms and one or more double bonds, and among them, a fatty acid having 18 or more carbon atoms and two or more double bonds.
  • polyunsaturated fatty acids such as arlinoleic acid, dihomoarinolenic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, mead acid, 6, 9-octadecadienic acid, 8, 1 1 — Eicosadic acid and the like.
  • the medium for culturing microorganisms of the present invention contains phosphate ions, calcium ions, sodium ions, magnesium ions, and calcium ions in the medium at 5 to 60 mM, 5 to 60 mM, 5 to 60 mM, respectively. 2 to 50 mM, 0.5 to 9 mM, 0.5 to 12 mM, preferably 10 to 45 mM, 10 to 45 mM, 5 to 40 mM, l to 40 mM, respectively It is in the range of 6 mM and 1 to 9 mM, and can be used for culturing microorganisms, for example, filamentous fungi.
  • the medium of the present invention contains phosphate ions, potassium ions, and sodium ions.
  • Components other than magnesium ions and calcium ions eg, a carbon source, a nitrogen source, a micronutrient source, etc. can be appropriately combined depending on the microorganism used.
  • any microorganism used for producing unsaturated fatty acid-containing fats and oils can be used as long as it is a microorganism belonging to the genus Mortierella.
  • a microorganism for example, a strain described in MYCOTAXON, Vol. XL1V, No. 2, pp. 257-265 (1992) can be used.
  • strains belonging to these type cultures or strains isolated from nature can be used as they are, but natural mutations that differ in properties from the original strains obtained by one or more growth and / or isolation steps. Stocks can also be used.
  • the microorganism used in the present invention is a mutant or recombinant strain of a microorganism belonging to the genus Mortierella (wild strain), that is, the amount of the microorganism in the oil and fat compared to the amount produced by the original wild strain when cultured using the same substrate. And those designed to increase the specific and Z or total unsaturated fatty acid content, or to increase the total fat content, or both.
  • a mutant strain designed to have a high content of a specific unsaturated fatty acid a Mortierella alpina SAM1861 lacking ⁇ 12 desaturation activity (Shin-Keken Co., Ltd. No. 3) No. 590, FERMBP — 359 0), and Mortierella 'Alpina SAM 186 0 0 lacking ⁇ 5 desaturation activity (Microe Kenjo No. 3589, FERMBP-35) 8 9).
  • microorganisms that are designed to produce the same amount of unsaturated fatty acids as the corresponding wild-type strain by efficiently using cost-effective substrates.
  • the microorganisms belonging to the genus Mortierella can be produced in a conventional manner except that the concentrations of phosphate, potassium, sodium, magnesium and potassium ions in the culture medium are adjusted to a predetermined range. Therefore, it can be cultured.
  • a spore, a hypha or a pre-culture solution obtained by pre-culturing the above strain is inoculated into a liquid medium or a solid medium and cultured.
  • Glucose, fructoses, xylose as carbon sources Saccharose, maltose, soluble starch, molasses, glycerol, mannitol, citric acid, cornstarch, etc.
  • Maltose, fructose, corn starch, glycerol, citrate are preferred.
  • Nitrogen sources include organic nitrogen sources such as peptone, yeast extract, malt extract, meat extract, casamino acid, corn steep liquor and urea, and inorganic nitrogen sources such as ammonium nitrate and ammonium sulfate. Although it can be used, particularly by using a nitrogen source obtained from soybean alone or in combination, or in combination with the nitrogen source, a more preferable synergistic effect of salt addition can be obtained. As a nitrogen source obtained from soybeans, it is desirable that the nitrogen content per component excluding water is 2% or more, preferably 3% or more, and more preferably 5% or more.
  • Examples of the nitrogen source obtained from soybeans include defatted soybeans or heat-treated; acid-treated; alcohol-treated; enzymatic-treated; chemical-modified; or denaturation by chemical and / or physical treatments including the treatment. And / or regeneration; removal of some components using water and / or organic solvents; filtration and removal of some components by Z or centrifugation; freezing; crushing; drying; and processing such as Z or sieving.
  • Untreated or defatted soybeans can be used singly or in combination, and commonly used are soybeans, defatted soybeans, soybean flakes, edible soybean tamper Boiled soybeans, soymilk, soy milk, and kinako, etc. Soluble components removed Things are preferred.
  • precursors of unsaturated fatty acids include, for example, hydrocarbons such as hexadecane or octadecane; oleic acid or linoleic acid.
  • Fatty acids such as carboxylic acid or salts thereof, or fatty acid esters, for example, ethyl esters, glycerin fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters; or olive oil, soybean oil, rapeseed oil, cottonseed oil or coconut oil. Such fats and oils can be used alone or in combination.
  • the amount of the substrate to be added is 0.0001 to 10%, preferably 0.5 to 10%, based on the medium.
  • these substrates may be cultured as the sole carbon source.
  • the phosphate ion in the medium is 5 to 60 mM
  • the calcium ion is 5 to 6 OmM
  • the sodium ion is Range from 2 to 5 O mM
  • magnesium ion ranges from 0.5 to 9 mM
  • calcium ions range from 0.5 to 12 mM, and preferably 10 to 45 mM phosphate ions in the culture medium.
  • mM potassium ions are in the range of 10 to 45 mM
  • sodium ions are in the range of 5 to 40 mM
  • magnesium ions are in the range of 1 to 6 mM
  • calcium ions are in the range of 1 to 9 mM.
  • phosphate ions are, for example, dicalcium hydrogen phosphate, monolithium dihydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate and Z or diphosphate.
  • Salts such as hydrogen sodium and potassium, for example, salts such as potassium dihydrogen phosphate, potassium monohydrogen phosphate and / or potassium chloride
  • Sodium ions include, for example, sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, sodium chloride and salts such as sodium chloride or Z or sodium sulfate, and magnesium ion
  • salts such as magnesium chloride and Z or magnesium sulfate, and potassium ion can be obtained by adding salts such as calcium chloride and / or calcium carbonate to a culture medium. There is no particular limitation as long as it is not limited and does not inhibit the growth of bacteria.
  • These salts may be either hydrates or anhydrides.
  • the above salts are used in an appropriate combination so as to be within the range of the ion concentration of the present invention.
  • Li phosphate dihydrogen Ichika Li um KH 2 P0 4
  • sulfuric acid Na Application Benefits um anhydrous Na 2 S0 4
  • magnesium chloride hexahydrate MgC 1 2 - 6H 2 0
  • calcium chloride dihydrate by adding a predetermined amount by blending a four hydrate (CaC ⁇ 2H 2 0)
  • the ions of the present invention can be a child prepared to a predetermined concentration.
  • the addition of such salts greatly increases the unsaturated fatty acid yield.
  • the effect on the cell morphology in liquid culture cannot be specified unconditionally because of the effects of the medium components other than salts and the strain used.
  • the percentage of bacteria in the form of pellets increases with the increase in the amount of sodium, calcium, or magnesium added. Propagation in pulp increases the viscosity of the culture, causing a decrease in fluidity and dissolved oxygen concentration, leading to a decrease in yield.
  • the above-mentioned carbon source, nitrogen source and other medium components can be added to the medium before the start of the culture and / or the culture solution during the culture. These medium components can be added all at once, or they can be added continuously or in multiple portions over time. These medium components can be sterilized and added individually or in a premixed state, and the sterilizing method and the order of addition are not particularly limited.
  • the carbon and nitrogen sources are preferably sterilized separately, and the salts are added by the end of log growth, more preferably before mid-log growth.
  • Other medium components that do not affect the concentrations of phosphate, calcium, sodium, magnesium, and canoledium are not particularly limited as long as they do not inhibit the growth of the bacteria.
  • the total amount of the carbon source is generally 0.1 to 40% by weight, preferably 1 to 25% by weight, and the total amount of the nitrogen source is 0.01 to 10% by weight, preferably.
  • the concentration is 0.1 to 10% by weight, more preferably, the initial carbon source addition amount is 1 to 5% by weight, and the initial nitrogen source addition amount is 0.1 to 6% by weight.
  • the medium is fed with a carbon source and a nitrogen source during the cultivation, and more preferably, only with the carbon source.
  • the culture temperature is 5 to 40 ° C, preferably 20 to 30 ° C. After the cells are grown at 20 to 30 ° C, the culture is performed at 5 to 20 ° C. The production of unsaturated fatty acids can be continued.
  • the culture medium is adjusted to pH 4 to 10, preferably 5 to 8, for aeration, stirring, shaking, or stationary culture. Culture is usually performed for 2 to 20 days. This By culturing as described above, lipids containing unsaturated fatty acids are produced and accumulated in the cells. In the production of unsaturated fatty acids, aeration and stirring culture in a liquid medium is preferred.
  • the target lipid may be a culture medium during the production of lipids by culturing or a sterilized culture medium, a culture medium after the cultivation or a sterilized culture medium, or a culture collected from each.
  • the cells can be obtained from the cells or the dried product according to a conventional method.
  • the target lipid is collected from the cultured cells by, for example, the following method.
  • the cultured cells are obtained from the culture solution by conventional solid-liquid separation means such as centrifugation and Z or filtration.
  • Cultured cells are preferably washed, crushed and dried. Drying can be performed by freeze drying, air drying, or the like.
  • the dried cells are extracted with an organic solvent, preferably under a stream of nitrogen.
  • organic solvent ether, hexane, methanol, ethanol, cross-sectional form, dichloromethane, petroleum ether, etc. can be used. Good results can also be obtained by alternate extraction or extraction with a single solvent of chloroform-methanol / water, preferably with hexane.
  • a high concentration of unsaturated fatty acid-containing lipid can be obtained.
  • extraction can be performed using wet cells instead of the above method.
  • a water-compatible solvent such as methanol or ethanol, or a solvent compatible with water and
  • Mortiere 11a alpina CBS754.68 was used as the arachidonic acid producing bacterium. Glucose 2%, soybean oil 0.
  • Triglyceride content 97.23 ⁇ 4 97.4% 97.03 ⁇ 4 96.03 ⁇ 4 88.33 ⁇ 4
  • Yeast extract TASTONE 154 AG manufactured by Universal Foods
  • Soy protein Ajinomoto S-San Meat Special
  • Mortiere 11a alpina CBS754.68 was used as the arachidonic acid producing bacterium.
  • 50 mL of the preculture was inoculated, and aeration-stirred culture was performed for 8 days at a temperature of 28 ° C, aeration of 0 vvm, stirring at 300 rpm, and a tank pressure of 200 kPa.
  • Glucose concentration was maintained at 1-2% by fed-batch until day 4 and 0.5-1% thereafter.
  • Mortiere 11a alpina CBS754.68 was used as the arachidonic acid-producing bacterium. Prepare 4 types of 25 L medium containing glucose 2%, defatted soy flour 1.5%, soybean oil 0.1%, and the salt components shown in Table 3 in a 50L culture tank, and adjust the initial pH to 6 0. 50 mL of the preculture was inoculated, and aeration-stirred culture was carried out for 8 days at a temperature of 28 ° C., an aeration rate of 1.0 vvm, stirring at 300 rpm, and a tank pressure of 200 kPa. Glucose concentration was maintained at ⁇ 2% by fed-batch until day 4 and 0.5-1% thereafter.
  • the bacterial morphology grew in a mixed state of pellets and pulp, and most of the pellets were rice grain type, about 0.5 to 1.5 mm. In the medium containing only phosphate, very fine pulp was grown, and the fluidity of the medium was greatly reduced. On the other hand, in a medium supplemented with magnesium, calcium, and sodium salts, most of the bacteria are spherical and pellets with a diameter of about 1 to 2 mm, and the fluidity is high but the lipid content per bacterial cell is high. The result was low.
  • Mortielle 11a elongata IF08570, Morti erel la exigua IF08571, Moronereti elera ) IF05941 was used.
  • Medium of 6 types (2 types of X3 strains) containing 2% glucose, 1.5% edible soy protein (Essan Protein SS, manufactured by Ajinomoto Co.), 0.1% rapeseed oil and the components shown in Table 4 Each 5 L was prepared in a 50 L culture tank, and the initial pH was adjusted to 5.8.
  • Ortiere 1 la alpina CBS754.68 was used as the arachidonic acid producing bacterium.
  • 100 mL of the preculture was inoculated, and aeration and agitation cultivation was performed for 8 days at a temperature of 24 ° C, an aeration rate of 1.0 vvm, agitation of 200 rpm, and a tank pressure of 200 kPa.
  • Glucose concentration was maintained at 1-2% by fed-batch until day 4 and 0.5-1% thereafter.
  • conditions 3 and 4 in Table 5 must be maintained at 300 rpm with stirring.
  • Conditions 5 and 6 were increased to 400 rpm.
  • Mortierella alpina SAM1861 (Fishenjo No. 3590, FERM BP-3590) as a middle acid producing bacterium
  • Mortierella alpina SAM1860 (Motherella monolinolenic acid producing bacterium)
  • Wei-Ken Kenjo No. 3589, FERM BP-3589 4 types of 5 L medium containing 2% initial glucose, 1.5% soybean protein (Ajinomoto Co., Essan Meat Co., Ltd.), 0.1% olive oil, and salt components shown in Table 6 (2 Species X 2 strain) was prepared in a 10 L culture tank, and the initial pH was adjusted to 6.0.
  • Inoculated with 1 0 0 ml preculture was done temperature 2 8 ° C, aeration rate 1. 0 vvm, aeration spinner culture for 3 0 0 8 days at r P m.
  • the culture temperature was reduced to 20 ° C on the second day.
  • the glucose concentration was maintained at 1-2% by the fed-batch method.
  • MorUerera alpina CBS754.68 was used as the arachidonic acid-producing bacterium.
  • Initial glucose 2%, large edible ... MPt Npaku 4%, soybean oil 0 1%, KH 2 P ( 0 3% N Na 2 S0 4 0 1%, MgCl 2 -. 6H 2 0 0 0 5%, CaCl 2 - 2H 2 0 0 0.5% culture medium 600 liters
  • Aeration and agitation culture was started at a volume of 0.5 V vm, agitation of 30 rpm, and a tank pressure of 20 OkPa From the first day of culture, the aeration amount and the number of revolutions were adjusted to maintain the dissolved oxygen concentration. Also, 18% glucose was added in multiple portions over the first to fifth days of the culture.
  • the amount of arachidonic acid produced was 13 g ZL.

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Description

明 細 書 微生物培養用培地、 並びに不飽和脂肪酸またはこれを含有する脂質 の製造方法 技術分野
本発明は、 新規な微生物培養用培地、 並びに該培地中で不飽和脂 肪酸生産能を有するモルティエレラ ( ortierella ) 属に属する微 生物を培養して得られる不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法に関する
背景技術
ァラキ ドン酸、 ジホモー ア 一 リ ノ レン酸、 エイ コサペンタエン酸 、 ミ ー ド酸等の不飽和脂肪酸は強力かつ多彩な生理活性を有するプ ロスタグラ ンジン、 トロ ンボキサン、 プロスタサイ ク リ ン、 ロイ コ ト リェン等の前駆物質といわれ、 近年注目されている。 例えばァラ キ ドン酸は、 特に乳児の発育に必要な成分と して、 D H A ( ドコサ へキサェン酸） とともに急速に研究が進められており、 L a n t i n らは生後 3週間以上母乳で育てた乳児と育児用粉乳で育てた乳 児を 9歳まで追跡調査し、 行動面などから脳神経の小さな障害の発 生率を検討した結果、 育児粉乳で育った子供の脳障害発生率は母乳 で育った子供の 2倍であると報告 （ L A N C E T、 v o l . 3 4 4 、 1 3 1 9 - 1 3 2 2 ( 1 9 9 4 ) ) した。
このショ ツキングな結果は母乳には存在するが育児用粉乳にはほ とんど存在しない D H Aやァラキ ドン酸などの不飽和脂肪酸が脳の 発達に関係したためだろう と推測されている。 この他にも、 不飽和 脂肪酸が新生児の脳および網膜の発達に関係しているだろう とする 結果が相ついで報告されるようになり、 未熟児および新生児栄養の 領域においてホッ トな話題と して注目されている。
これら、 不飽和脂肪酸は動物界に広く 分布しており、 例えば、 ァ ラキ ドン酸は動物の副腎腺や肝臓から抽出した脂質から分離されて いる。 しかしながら不飽和脂肪酸の含量は少なく 、 大量供給方法と しては不十分であったことから、 種々の微生物を培養して不飽和脂 肪酸を得る方法が考案されてきた。 中でもモルティ エレラ属に属す る微生物は、 ァラキ ドン酸、 ジホモー ア 一 リ ノ レ ン酸、 エイ コサぺ ン夕ェン酸等の不飽和脂肪酸を生産する微生物と して知られており 、 この微生物を用いた発酵法による該脂肪酸を製造する方法が開発 されている （特開昭 6 3 — 4 4 8 9 1 、 特開昭 6 3 — 1 2 2 9 0、 特開昭 6 3 — 1 4 6 9 6、 特開昭 6 3 _ 1 4 6 9 7 ) 。
さ らにモルティエレラ属微生物に変異処理を施して得られる、 △ 1 2不飽和化活性が低下又は欠失している変異株を用いてミ ー ド酸 を製造する方法も知られている （特開平 5 — 9 1 8 8 8 ) 。 また、 モルティ エレラ属微生物に変異処理を施して得られる、 Δ 5不飽和 化活性が低下又は欠失している変異株を用いて、 ジホモ— ア ー リ ノ レ ン酸を著量製造する方法も知られている （特開平 5 — 9 1 8 8 7 しかし、 モルティ エレラ属のよ うな糸状菌を用いて液体培地で発 酵生産を行なう場合、 往々にして菌体増殖による培養液粘度の増加 とそれに伴う酸素供給不足が起こり、 その対策と して開発された溶 存酸素濃度制御法 （特開平 6 — 1 5 3 9 7 0 ) は生産性向上に大き く 貢献している ものの、 工業規模での培養で経済的に優れた高生産 を実現するのにこれで十分とはいえず、 より安価な培地や微量栄養 素の探索、 培養液流動性改善のための菌形態の制御法等の幅広い培 養技術開発が不可欠である。 このよ う な技術開発の方策と して、 微量栄養素と して塩類の添加 が不飽和脂肪酸生産性ゃ菌形態に及ぼす影響が検討されており、 中 でもカ リ ウム、 ナ ト リ ウム、 カルシウム、 マグネ シウム及びリ ン酸 の各イオンについては、 添加効果に関して種々の報告が成されてい る （国際出願 W 0 9 6 / 2 1 0 3 7 、 特開平 8 — 2 1 4 8 9 3 、 Ap l. Mi crobi ol. Bi otechnol. , vol.39, .450(1993) 、 Biotechnolog y Lett. , vol.12, no.6, p.455(1990) 、 油化学， vol.37， no.3， p.241 (1 989)、 油化学， vol.42， no.11， p.893(1993) ) 。 しかし、 一方でこれ ら主なイオンを全て栄養補給という概念を上回る 0. 5 mM以上の 濃度で添加して、 より積極的な不飽和脂肪酸生産性向上効果を求め た検討を行ない、 なおかつ添加ィォンバラ ンスが及ぼす菌形態や脂 質組成への影響までも検討した報告は成されておらず、 イオン添加 法の最適化が望まれるところである。 発明の開示
従って本発明は、 モルティエレラ属に属する微生物の発酵法によ る不飽和肪酸含有油脂の製造方法であって、 培地に塩類を添加する ことによって、 不飽和脂肪酸生産性、 具体的には菌の増殖、 不飽和 脂肪酸の蓄積、 総脂質の蓄積の全てを向上をさせ経済的かつ安定的 に不飽和脂肪酸含有油脂を提供しょう とするものである。 また本発 明は例えば不飽和脂肪酸が高収率で得られるなどの利点を有し、 か つ安価な微生物培養用培地を提供しょう とするものである。
本発明者等は、 上記課題を解決するために培地への塩類添加効果 について、 不飽和脂肪酸収率のみならず、 菌形態、 脂質組成変化に 関 して総合的に検討した結果、 カ リ ウ ム、 ナ ト リ ウム、 カルシウム 、 マグネシウム及びリ ン酸の全イオンを所定の濃度でかつバラ ンス 良く添加することが極めて有効であることを見出し本発明を完成し た。
従って本発明は、 リ ン酸イオ ン、 カ リ ウムイオ ン、 ナ ト リ ウムィ オ ン、 マグネ シウムイ オ ン及びカルシウムイオ ン力く、 それぞれ 5 ~ 6 0 mM、 5〜 6 0 mM、 2〜 5 0 mM、 0. 5 ~ 9 mM、 0. 5 〜 1 2 mMの範囲にあることを特徴とする微生物培養用培地、 並び に当該培地中での糸状菌、 特にモルティ エレラ (Mortierel la ) 属 に属する微生物の培養による、 生産性の向上した不飽和脂肪酸また はこれを包含する脂質の製造方法を提供する。
本発明において、 不飽和脂肪酸とは炭素数が 1 6以上でかつ二重 結合が 1 個以上の脂肪酸をいい、 またこの中で炭素数が 1 8以上で かつ二重結合が 2個以上の脂肪酸を一般に高度不飽和脂肪酸といい 、 例えばア ー リ ノ レ ン酸、 ジホモー ア リ ノ レ ン酸、 ァラキ ドン酸 、 エイ コサペンタエン酸、 ミ ー ド酸、 6 、 9 —ォク 夕デカ ジエン酸 、 8、 1 1 —エイ コサジェン酸等を挙げる事ができる。 発明を実施するための形態
本発明の微生物培養用培地は、 培地中のリ ン酸イオン、 カ リ ウム イオン、 ナ ト リ ウムイオ ン、 マグネ シウムイオ ン及びカルシウムィ オンが、 それぞれ 5 ~ 6 0 mM、 5〜 6 0 mM、 2〜 5 0 mM、 0 . 5 ~ 9 mM、 0. 5〜 1 2 mMの範囲、 好ま し く はそれぞれ 1 0 〜 4 5 mM、 1 0〜 4 5 mM、 5〜 4 0 mM、 l ~ 6 mM、 1 ~ 9 mMの範囲にあり、 微生物、 例えば、 糸状菌を培養する際に用いる ことができる。
本発明の培地を用いるこ とによって、 不飽和脂肪酸生産能を有す るモルティ エレラ (Mortierella ) 属に属する微生物の場合、 その 培養物から不飽和脂肪酸を高収率で得ることが可能となる。 なお本 発明の培地は、 リ ン酸イオ ン、 カ リ ウムイオン、 ナ ト リ ウムイオン 、 マグネシウムイオン及びカルシウムイオン以外の成分 （例えば炭 素源、 窒素源、 微量栄養源等） を、 使用する微生物に応じて適宜配 合することができる。
本発明において、 不飽和脂肪酸含有油脂を製造する際使用する微 生物は、 モルティ エレラ (Mortierel la ) 属に属する微生物であれ ばすベて使用することができる。 このような微生物と しては、 例え ば MYCOTAXON, Vol. XL1V, No.2, pp. 257- 265 ( 1992)に記載されて いる菌株を使用することができ、 具体的にはモルティ エレラ ' エロ ンカ"夕 ( ortierella elongata) IF08570 , モノレティ エレラ · ェ キシグァ （Mortierella exigua) IF08571 、 モルティ エレラ · ヒ グ'ロ フ イ ラ （Mortierella hygrophi la) IF05941 、 モノレティ エ レ ラ · アルピナ （Mortierella al ina) IF08568 、 ATCC16266 、 AT CC32221 、 ATCC42430 、 CBS 219.35、 CBS224.37 、 CBS250.53 、 CB S343.66 、 CBS527.72 、 CBS528.72 、 CBS529.72 、 CBS608.70 、 CB S754.68 等のモノレテ ィ エレラ亜属 (subgenus Mortierel la) (こ属す る微生物や、 モルティ エレラ · イザベ リ ナ （Mortierella i sabel 1 ina) CBS194.28 、 IF06336 、 IF07824 、 IF07873 、 IF07874 、 IF
08286 、 IF08308 、 IF07884 、 モルティ エ レラ · ナナ （Mortiere: a nana) IF08190 、 モルティ エレラ · ラマ二アナ （Mortierella ramanniana) IF05426 、 IF08186 、 CBS112.08 、 CBS212.72 、 IF 07825 、 IF08184 、 IF08185 . IF08287 、 モルティ エレラ · ヴイ ナ セァ （Mortierella vinacea ) CBS236.82 等のマイ ク ロムコール 亜属 （subgenus Mi cromucor)に属する微生物を挙げるこ とができる これらの菌株はいずれも、 大阪市の財団法人醱酵研究所 （ I F O ) 、 及び米国 American Type Culture Collection (A T C C ) 、 及びオラ ンダ Cen t raa 1 bureau voor Schimmelcul tures ( C B S ) 力、 らなんら制限なく 入手することができる。 また、 本発明者らが土壌 から分離した菌株モルティ エレラ ' エロ ンガタ S A M 0 2 1 9 (微 ェ研菌寄第 8 7 0 3号） （微ェ研条寄第 1 2 3 9号） を使用するこ と もでき る。 これらタイプカルチ ャーに属する菌株、 あるいは自然 界から分離した菌株はそのまま用いる事ができるが、 増殖及びノ又 は単離を 1 回以上行なう事によって得られる元の菌株とは性質の異 なる自然変異株を用いる事もできる。
また本発明に用いる微生物は、 モルティ エレラ属に属する微生物 (野生株） の変異株又は組み換え株、 即ち同じ基質を用いて培養し た時に、 元の野生株が産生する量と比べて、 油脂中の特定の及び Z 又は全部の不飽和脂肪酸含量が多く なるように、 又は総油脂量が多 く なるように、 あるいはその両方を意図して設計されたものが含ま れる。 例えば、 特定の不飽和脂肪酸含量が多く なるように設計され た変異株と して、 Δ 1 2不飽和化活性の欠失したモルティ エレラ · アルピナ S A M 1 8 6 1 (微ェ研条寄第 3 5 9 0号、 F E R M B P — 3 5 9 0 ) や、 Δ 5不飽和化活性の欠失したモルティエレラ ' アルピナ S A M 1 8 6 0 (微ェ研条寄第 3 5 8 9号、 F E R M B P - 3 5 8 9 ) を挙げる事ができる。
さ らに費用効率の優れた基質を効率良く用いて、 対応する野生株 と同量の不飽和脂肪酸を産生するように設計された微生物も含まれ る。
上記モルティ エレラ属に属する微生物は、 培地中の リ ン酸イオン 、 カ リ ウ ムイオン、 ナ ト リ ウムイオ ン、 マグネ シウムイオ ン及び力 ルシゥムイオンの濃度を所定の範囲に調製すること以外は、 常法に 従って培養するこ とができる。 例えば、 上記菌株の胞子、 菌糸又は 予め培養して得られた前培養液を、 液体培地又は固体培地に接種し 培養する。 炭素源と してはグルコース、 フラ ク ト一ス、 キシロース 、 サ ッ カ ロース、 マル ト一ス、 可溶性デンプン、 糖蜜、 グリ セ口一 ル、 マ ンニ トール、 クェン酸、 コー ンスターチ等の一般に使用され ている ものが何れも使用できる力く、 特にグルコース、 マル トース、 フ ラ ク ト ース、 コー ンスターチ、 グリ セロール、 クェン酸が好ま し い。
窒素源と してはペプ ト ン、 酵母エキス、 麦芽エキス、 肉エキス、 カザミ ノ酸、 コーンスティ プリ カ一、 尿素等の有機窒素源、 並びに 硝酸ア ンモニゥム、 硫酸ア ンモニゥム等の無機窒素源を用いる事が できるが、 特に大豆から得られる窒素源を単独または複数で、 ある いは前記窒素源と組み合わせて用いることにより、 より好ま しい塩 類添加の相乗効果が得られる。 大豆から得られる窒素源と しては、 水分を除く成分当りの窒素含量が 2 %以上、 好ま しく は 3 %以上、 より好ま しく は 5 %以上である事が望ま しい。
また、 大豆から得られる窒素源と しては、 脱脂大豆又はこれに熱 処理 ； 酸処理 ； アル力 リ処理 ； 酵素処理 ； 化学修飾 ； 又は該処理を 含む化学的及び/又は物理的処理による変性及び/又は再生 ； 水及 び/又は有機溶媒を用いた一部成分の除去 ； 濾過及び Z又は遠心分 離による一部成分の除去 ； 凍結 ； 粉砕 ； 乾燥 ； 及び Z又は篩い分け 等の加工を施したもの、 あるいは未脱脂大豆に同様の加工を施した ものを単独であるいは複数組み合わせて使用することができ、 一般 的なものと しては大豆、 脱脂大豆、 大豆フ レーク、 食用大豆タ ンパ ク、 おから、 豆乳、 きな粉等が挙げられるが、 特に、 脱脂大豆に熱 変性を施したもの、 より好ま しく は脱脂大豆を約 7 0〜 9 0 °Cで熱 処理しさ らにエタノ ール可溶成分を除去したものが好ま しい。
この他必要に応じて、 リ ン酸イオン、 カ リ ウムイオン、 ナ ト リ ウ ムイ オン、 マグネ シウムイオン、 カルシウムイオ ン以外に、 鉄、 銅 、 亜鉛、 マンガン、 ニ ッ ケル、 コバル ト等の金属イオ ンやビタ ミ ン 等を微量栄養源と して使用できる。 不飽和脂肪酸の収率を増加せし めるために、 不飽和脂肪酸の前駆体と して、 例えば、 へキサデカ ン 若しく はォク タデカ ンのごとき炭化水素 ； ォレイ ン酸若しく はリ ノ —ル酸のごとき脂肪酸又はその塩、 又は脂肪酸エステル、 例えばェ チルエステル、 グリ セ リ ン脂肪酸エステル、 ソルビタ ン脂肪酸エス テル ； 又はオ リ ーブ油、 大豆油、 なたね油、 綿実油若しく はヤシ油 のごとき油脂類を単独で、 又は組み合わせて使用できる。 基質の添 加量は培地に対して 0 . 0 0 1 〜 1 0 %、 好ま し く は 0 . 5 ~ 1 0 %である。 またこれらの基質を唯一の炭素源と して培養してもよい 本発明において培地中のリ ン酸イオンは 5 〜 6 0 m M、 カ リ ウム イオンは 5 〜 6 O mM、 ナ ト リ ウムイオンは 2 〜 5 O mM、 マグネ シゥムイオンは 0 . 5 ~ 9 mM、 カルシウムイオ ンは 0 . 5 〜 1 2 mMの範囲と し、 好ま し く は培地中のリ ン酸イオンは 1 0 〜 4 5 m M、 カ リ ウムイオンは 1 0 〜 4 5 mM、 ナ ト リ ウムイオンは 5 〜 4 0 m M、 マグネシウムイオンは 1 ~ 6 m M、 カルシウムイオンは 1 ~ 9 mMの範囲とする。
これらイオンの調製は、 リ ン酸イオンは、 例えば、 リ ン酸一水素 二カ リ ウム、 リ ン酸二水素一カ リ ウム、 リ ン酸一水素ニナ ト リ ウム 及び Z又はリ ン酸ニ水素ーナ ト リ ゥム等の塩類、 またカ リ ウムィォ ンは、 例えばリ ン酸一水素二カ リ ウム、 リ ン酸二水素一カ リ ウム及 び/又は塩化カ リ ウム等の塩類、 ナ ト リ ウムイオンは、 例えばリ ン 酸一水素ニナ ト リ ウム、 リ ン酸二水素一ナ ト リ ウム、 塩化ナ ト リ ウ ム及び Z又は硫酸ナ ト リ ウム等の塩類、 マグネシウムイオンは、 例 えば塩化マグネシゥム及び Z又は硫酸マグネシゥム等の塩類、 力ル シゥムイオ ンは、 例えば塩化カルシゥム及び/又は炭酸カルシゥム 等の塩類を培地に添加するこ とにより行う こ とができる力 これに 限られる ものではなく菌の生育を阻害しない物であれば特に制限し ない。
なおこれらの塩類は水和物又は無水物のいずれであってもよい。 また前記の塩類は、 本発明のイオン濃度の範囲内となるよう適宜、 組合せて使用される。 例えば、 リ ン酸二水素一カ リ ウム （KH 2 P04 ) 、 無水硫酸ナ ト リ ウム （Na 2 S04 ) 、 塩化マグネシウム六水和物（MgC 1 2 - 6H 20) 及び塩化カルシウム二水和物（CaC · 2H 20) の 4種類を 配合して所定量添加することにより、 本発明のイオ ンを所定濃度に 調製するこ とができる。
本発明ではこのような塩類添加により、 不飽和脂肪酸収率が大幅 に増大する。 さ らに、 液体培養における菌形態への影響は、 塩類以 外の培地成分及び使用する菌株の影響があるため一概には特定し得 ないが、 例えばリ ン酸添加量増加に伴ってパルプ形態の菌の割合が 増え、 ナ ト リ ウム、 カルシウム、 又はマグネシウム添加量増加に伴 つてペレツ ト形態の菌の割合が増える。 パルプ状での増殖は、 培養 液粘度を上昇させ、 流動性、 溶存酸素濃度低下の原因となり収率低 下を引き起こす。
一方ペレツ ト状での増殖は粘度上昇が起こ りにく く流動性は高い 力 ペレ ッ ト壁が酸素移動の律速となり収率低下を引き起こす。 し かし、 該イオ ンを所定濃度でかつバラ ンス良く添加することによつ て過度のパルプ化、 及び過度のペレツ 卜化が抑えられ、 パルプとぺ レツ 卜の混合状態が維持されることを我々 は発見した。 この技術に よつて菌形態の制御が容易になり、 非常に高い収率を得る事が可能 となる。
上記のようにして得られた不飽和脂肪酸含有脂質は、 その大部分 が ト リ グリ セリ ドであるが、 培地へのリ ン酸添加量増加に伴ってリ ン脂質の割合が増加する。 しかし、 リ ン酸以外に、 カ リ ウムイオン 、 ナ ト リ ウムイオ ン、 マグネ シウムイ オン、 カルシウムイオンを全 てバラ ンス良く添加する事によって、 菌体脂質中 ト リ グリセリ ドの 割合を 9 0 %以上に維持する事ができることを我々は発見した。 目 的脂質が ト リ グリセリ ドの場合、 添加塩類を本発明範囲でバラ ンス させるこ とによつて高回収率を維持することができる。
上記の炭素源、 窒素源、 その他の培地成分は培養開始前の培地及 び/又は培養中の培養液に添加することができる。 これらの培地成 分は一度に添加するこ ともでき、 又は連続的に、 若しく は複数回に 分けて経時的に添加することもできる。 これらの培地成分は各々単 独で、 又は予め混合して殺菌、 添加することができ、 その殺菌方法 、 添加順序は特に制限しない。 好ま し く は、 炭素源と窒素源は別々 に殺菌するのが望ま しく 、 塩類は対数増殖終了までに、 より好ま し く は対数増殖中期より前に添加するのが望ま しい。 リ ン酸イオン、 カ リ ウムイオン、 ナ ト リ ウムイオ ン、 マグネ シウムイオン、 カノレシ ゥムィォン濃度に影響を与えない他の培地成分は菌の生育を阻害し ない濃度であれば特に制限しない。
実用上、 一般に炭素源の総添加量は 0 . 1 ~ 4 0重量％、 好ま し く は 1 ~ 2 5重量％、 窒素源の総添加量は 0 . 0 1 ~ 1 0重量％、 好ま し く は 0 . 1 〜 1 0重量％の濃度とするのが望ま しく 、 より好 ま しく は初発の炭素源添加量を 1 〜 5重量％、 初発の窒素源添加量 を 0 . 1 〜 6重量％と して、 培養途中で炭素源及び窒素源を、 さ ら により好ま し く は炭素源のみを流加して培養する。 培養温度は 5 〜 4 0 °C、 好ま しく は 2 0 〜 3 0 °Cと し、 また 2 0 〜 3 0 °Cにて菌体 を増殖せしめた後 5 〜 2 0 °Cにて培養を続けて不飽和脂肪酸を生産 せしめること もできる。
培地 p Hは 4 〜 1 0、 好ま し く は 5 〜 8 と して通気撹拌培養、 振 とう培養、 又は静置培養を行う。 培養は通常 2 〜 2 0 日間行う。 こ のよう に培養して、 菌体内に不飽和脂肪酸を含有する脂質が生成蓄 積される。 不飽和脂肪酸の製造においては、 液体培地による通気撹 拌培養が好ま しい。
目的とする脂質は、 培養によって脂質を製造する途中の培養液若 しく はその殺菌した培養液、 または培養終了後の培養液若し く はそ の殺菌した培養液、 またはそれぞれから集菌した培養菌体若し く は その乾燥物から、 常法に従って得る事ができる。 培養菌体から、 例 えば次の方法により 目的とする脂質の採取を行う。
培養終了後、 培養液より遠心分離及び Z又は濾過等の常用の固液 分離手段により培養菌体を得る。 培養菌体は好ま しく は、 水洗、 破 砕、 乾燥する。 乾燥は、 凍結乾燥、 風乾等によって行う ことができ る。 乾燥菌体は、 好ま し く は窒素気流下で有機溶媒によって抽出処 理する。 有機溶媒と してはエーテル、 へキサン、 メ タノ ール、 エタ ノ ール、 ク ロ口ホルム、 ジク ロロメ タ ン、 石油エーテル等を用いる ことができ、 またメ 夕ノ ールと石油エーテルの交互抽出やク ロロホ ルムーメ タノール一水の一層系の溶媒を用いた抽出によっても良好 な結果を得ることができ、 好ま しく はへキサンを用いて抽出する。 抽出物から減圧下で有機溶剤を留去することにより、 高濃度の不 飽和脂肪酸含有脂質を得ることができる。 また、 上記の方法に代え て湿菌体を用いて抽出を行う ことができる。 この場合にはメ タノ一 ル、 エタノール等の水に対して相溶性の溶媒、 又はこれらと水及び
Z又は他の溶媒とからなる水に対して相溶性の混合溶媒を使用する
。 その他の手順は上記と同様である。 培養物から採取した不飽和脂 肪酸含有脂質から不飽和脂肪酸含有 ト リ グリ セリ ドを分離精製する には、 常法により、 溶媒抽出、 脱溶媒の後、 脱酸、 脱色、 脱臭、 脱 ガム処理、 あるいは冷却分離などにより行なう事ができる。 実施例
次に、 実施例により この発明を具体的に説明する。
実施例 1 .
ァラキ ドン酸生産菌と してモルティ エレラ · アルピナ （ Mortiere 11a alpina) CBS754.68 を用いた。 グルコース 2 %、 大豆油 0 .
1 %及び表 1 の組成の窒素源、 塩類成分を含む培地 5 Lを 4種類、 1 0 L培養槽に調製し、 初発 p Hを 6 . 0 に調製した。 前培養液 5 0 m Lを接種し、 温度 28°C、 通気量 1 . 0 vvm 、 撹拌 3 0 0 rpm で 8 日間の通気撹拌培養を行なった。 グルコース濃度を 4 日目までは 流加法によ って 1 〜 2 %に、 それ以降は 0 . 5 〜 1 %に維持した。 培養の結果、 酵母エキス培地に 5種類のイオン全てを添加すると ァラキ ドン酸生成量が 1 . 3 5倍に、 大豆タ ンパクに添加すると 1 . 6 8倍に増大し塩類添加の有効性が確認された。 リ ン酸水素カ リ ゥムのみ添加した場合は、 ァラキ ドン酸生成量増加は認められなか つた。
ァラキ ドン酸生成量に加えて、 得られた菌体よりへキサンで脂質 を抽出 した後、 分離条件 （へキサン ： ジェチルエーテル ： ギ酸 = 4 2 : 2 8 : 0 . 3 ) で T L C法で脂質組成毎に分画し、 各組成含量 を T L C / F I Dアナライザー （ャ ト ロ ン社製ィァ ト ロスキャ ン） で定量した。
その結果、 リ ン酸水素カ リ ウムのみの添加によって、 へキサンで 抽出された菌体脂質中の リ ン脂質の割合が増えること、 一方、 リ ン 酸水素力 リ ゥムを含む 4種類の塩類を全て添加するこ とによって、 塩類無添加の場合と同等の脂質組成が得られることが判り、 目的生 産物が ト リ ダリ セ リ ドの場合は、 全イオ ンをバラ ンス良く添加する ことによって ト リ グリセ リ ド含量の高い脂質が得られることを確認 した。 表 1
培 地 酵母 大豆 酵母エキス 1% 大豆タンパク 1.5% 大豆タンパク 1.5!¾
エキス 1% タンパク
1.5% KH,P04 0.3% KH,P04 0.3% KH2P04 0.3¾
(22mM) (22mM) (22mM)
MgC - 6H20 0.05% MgCl2 - 6H20 0.05%
(2.5mM) (2.5mM)
Na2S0. 0.1¾ Na2S04 0.1¾
(7. OmM) (7. OmM)
CaCl2 - 2H20 0.05% CaCl2 - 2H20 0.05¾
(3.4mM) (3.4m )
ァラキドン 酸生成量 2.28g/L 1.93g/L 3.07g/L 3.24g/L 2. OOg/L
総脂肪酸生成量 6.57g/L 5.74g/L 8.82g/L 8.95g/L 5.83g/L
乾燥菌体濃度 17.3g/L 15.7g/L 19.3g/L 22. Og/L 16. Og/L
トリグリセリド 含量 97.2¾ 97.4% 97.0¾ 96.0¾ 88.3¾
リン脂質含量 1.2¾ 1.2% 1.4¾ 1.2¾ 9.5¾
酵母エキス：ユニバーサルフーズ社製 TASTONE 1 5 4 AG
大豆タンパク ：味の素社製 エスサンミート特等
Figure imgf000015_0001
実施例 2
ァラキ ドン酸生産菌と してモルティ エレラ · アルピナ （ Mortiere 11a alpina) CBS754.68 を用いた。 グルコース 2 %、 きな粉 1 . 5 %、 大豆油 0 . 1 %及び表 2 の組成の塩類成分を含む培地 2 5 L を 4種類、 5 0 L培養槽に調製し、 初発 p Hを 6 . 2 に調製した。 前培養液 5 0 mLを接種し、 温度 2 8 °C、 通気量 し 0 vvm 、 撹拌 3 0 0 rpm 、 槽内圧 2 0 0 kPa の条件で 8 日間の通気撹拌培養を行な つた。 グルコース濃度を 4 日目までは流加法によって 1 〜 2 %に、 それ以降は 0 . 5 〜 1 %に維持した。
培養の結果、 塩類添加によってァラキ ドン酸生成量が増大し、 塩 類添加の有効性とより効果的な濃度範囲が確認された。
表 2
Figure imgf000016_0001
実施例 3 .
ァラキ ドン酸生産菌と してモルテ ィ エレラ ' アルピナ （ Mortiere 11a alpina) CBS754.68 を用いた。 グルコース 2 %、 脱脂大豆粉 1 . 5 %、 大豆油 0 . 1 %及び表 3 の組成の塩類成分を含む培地 2 5 Lを 4種類、 5 0 L培養槽に調製し、 初発 p Hを 6 . 0 に調製し た。 前培養液 5 0 mLを接種し、 温度 2 8 °C、 通気量 1 . 0 vvm 、 撹 拌 3 0 0 rpm 、 槽内圧 2 0 0 kPa の条件で 8 日間の通気撹拌培養を 行なった。 グルコース濃度を 4 日目までは流加法によって 〜 2 % に、 それ以降は 0 . 5 〜 1 %に維持した。 塩類無添加培地では、 菌形態がペレツ 卜 とパルプの混合状態で増 殖し、 ペレ ッ トの大部分は米粒型で約 0 . 5 〜 1 . 5 mmであつた。 リ ン酸塩のみを加えた培地では、 非常に細かいパルプ状に増殖し、 培地流動性が大き く 低下した。 一方、 マグネ シウ ム、 .カルシウム、 ナ ト リ ゥム塩を加えた培地では菌の殆どが球状で約 1 〜 2 mm径のぺ レツ ト となり、 流動性は高いが菌体当たりの脂質含量が低い結果と なった。 しかし、 4種類の塩の全てを添加した培地では、 細かい球 状ペレツ 卜 とパルプの混合培養となり、 流動性が損なわれるこ とな く、 脂質含量が高い菌体が得られ、 その結果、 ァラキ ドン酸収率向 上が達成された。
表 3
Figure imgf000017_0001
実施例 4 .
ァラキ ドン酸生産菌と してモルテ ィ エレラ · エロ ンガタ （Morti re 11a elongata) IF08570 、 モルティ エ レラ ' エキ シグァ (Mort i erel la exigua) IF08571 、 モ ノレティ エレラ ' ヒグロフ イ ラ （Mo rtierel la hygro_phi la) IF05941 を用いた。 グルコース 2 %、 食 用大豆タ ンパク （味の素社製、 エスサ ンプロテイ ン S S ) 1 . 5 % 、 なたね油 0 . 1 %及び表 4 の組成成分を添加した 6種類 （ 2種類 X 3 菌株） の培地 2 5 Lを各々 5 0 L培養槽に調製し、 初発 p Hを 5 . 8 に調製した。 温度 2 4 °C、 通気量 1 . 0 vvm 、 撹拌 2 0 0 rp m 、 槽内圧 1 . 0 kg/cm2G の条件で通気撹拌培養を開始し、 7 日間 培養を行つた。 流加法により ダルコ一ス濃度を 5 日目までは 1 · 5 %に維持し、 その後はグルコースを流加しなかった。 培養 7 日目の 終了時にはグルコースが枯渴した。
その結果、 塩類添加によるァラキ ドン酸収率増大が確認された。
表 4
Figure imgf000018_0001
実施例 5 .
ァラキ ドン酸生産菌と してモルティ エレラ · アルピナ （ ortiere 1 la alpina) CBS754.68 を用いた。 初発グルコース 2 %、 大豆油 0 . 1 %及び培養途中流加も含む表 5 の組成の窒素源及び塩類成分 の培地 2 5 Lを 6種類、 5 0 L培養槽に調製し、 初発 p Hを 6 . 0 に調製した。 前培養液 1 0 0 mLを接種し、 温度 2 4 °C、 通気量 1 . 0 vvm 、 撹拌 2 0 0 rpm 、 槽内圧 2 0 0 kPa で 8 日間の通気撹拌培 養を行なった。
グルコース濃度を 4 日目までは流加法によって 1 〜 2 %に、 それ 以降は 0 . 5〜 1 %に維持した。 窒素源を流加した場合は溶存酸素 濃度を維持するために、 表 5 の条件 3及び 4 は撹袢を 3 0 0 rpm ま で、 条件 5及び 6 は 4 0 0 r p m まで上昇させた。
培養の結果、 塩類添加によるァラキ ドン酸生成量が確認された。 さ らに、 栄養源を多量添加して比較的高い濃度で培養を行った場合 でも、 塩類添加効果が確認された。
表 5 条件番号 1 2 3 4 5 6
初発大豆タンパク量 1.5% 1.5% 1.5% 1.5% 1.5% 1.5% 大豆タンパク途中流加量 0.6% 0.6% 1.6% 1.6% 初発 KH2P04¾ 0.3%(22mM) 0.3%(22mM) 0.3%(22m ) 初発 MgCl2 · 6H20量 0.05% (2.5mM) 0.05% (2.5m ) 0.05% (2.5m ) 初発 Na2S04量 0.1%(7. OmM) 0.1%(7. OmM) 0.1%(7. OmM) 初発 CaCl2 · 2H20量 0.05% (3.4mM) 0.05% (3.4mM) 0.05% (3.4mM) ァラキドン酸生成量 3.60g/L 4.90g/L 5. OOg/L 6.81g/L 7.32g/L 9.04g/L 大豆タンパク ：味の素社製 エスサンミート特等
実施例 6 .
ミ 一 ド酸生産菌と してモルティ エレラ · アルピナ SAM1861 (微ェ 研条寄第 3590号、 FERM BP- 3590) を、 ジホモー ア 一 リ ノ レ ン酸生産 菌と してモルティ エレラ · アルピナ SAM1860 (微ェ研条寄第 3589号 、 FERM BP-3589) を用いた。 初発グルコース 2 %、 大豆夕 ンパク （ 味の素社製、 エスサン ミ ー ト特等） 1 . 5 %、 オリ ブ油 0 . 1 %及 び表 6 の組成の塩類成分を含む培地 5 Lを 4種類 （ 2種類 X 2菌株 ) 、 1 0 L培養槽に調製し、 初発 pHを 6 . 0 に調製した。 前培養液 1 0 0 mlを接種し、 温度 2 8 °C、 通気量 1 . 0 vvm 、 攪拌 3 0 0 rP m で 8 日間の通気攪拌培養を行った。 培養温度は 2 日目に 2 0 °Cに 下げた。 また、 グルコース濃度を流加法によって 1〜 2 %に維持し た。
その結果、 塩類添加による ミ一ド酸及びジホモー ア ー リ ノ レン酸 収率増大が確認された。
表 6
Figure imgf000021_0001
実施例 7 .
ァラキ ドン酸生産菌と してモルティ エレラ · アルピナ （MorUer 11a alpina) CBS754.68 を用いた。 初発グルコース 2 %、 食用大 豆タ ンパク 4 %、 大豆油 0 . 1 %、 KH2P( 0 . 3 %N Na2S04 0 . 1 %、 MgCl 2 - 6H20 0 . 0 5 %, CaCl 2 - 2H 20 0 . 0 5 %の 培地 6 0 0 0 Lを 1 0 k L培養槽に調製し、 初発 pHを 6 . 1 に調整 した。 前培養液 3 0 Lを接種し、 培養温度 2 6 °C、 通気量 0 . 5 V v m、 撹拌 3 0 r p m、 槽内圧 2 0 O k P aで通気撹拌培養を開始 した。 培養 1 日目から、 溶存酸素濃度を維持するように通気量、 回 転数を調整しながら培養を続けた。 また、 1 8 %のグルコースを培 養 1 日目から 5 日目にかけて複数回に分けて添加した。
1 0 日間の通気撹拌培養を行った結果、 ァラキ ドン酸生成量は 1 3 g Z Lであった。
第 1 3規則の 2 に規定する寄託された微生物への言及
国際寄託当局
名称 ： 工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名 ： 茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3号
寄託日及び寄託番号 ：
(1) 寄託微生物の名称 ： モルティ エレラ ' エロ ンガタ SAM0219 寄託日 ： 1986年 3月 19日
寄託番号 ： FERM BP-1239
(2) 寄託微生物の名称 ： モルティ エレラ ' アルピナ SAM1860 寄託日 ： 1991年 9月 30日
寄託番号 ： FERM BP- 3589
(3) 寄託微生物の名称 ： モルティ エレラ ' アルピナ SAM1861 寄託日 ： 1991年 9 月 30日
寄託番号 ： FERM BP- 3590

Claims

請 求 の 範 囲
1. 糸状菌の培養において、 培地中のリ ン酸イオン、 カ リ ウムィ オ ン、 ナ ト リ ウムイオン、 マグネ シウムイオ ンおよびカルシウムィ オンの濃度を制御するこ とによ って、 培養中の糸状菌の菌学的な形 態を制御し、 糸状菌の生産物の生産性を高めることを特徴とする糸 状菌の培養方法。
2. 培地中の リ ン酸イオン、 カ リ ウムイオン、 ナ ト リ ウムイ オ ン 、 マグネ シウムイオンおよびカルシウムイオ ンの濃度が、 それぞれ 5〜 6 0 mM、 5〜 6 0 mM、 2〜 5 0 mM、 0. 5〜 9 mM、 0
. 5〜 1 2 mMの範囲にある微生物培養用培地を用いて糸状菌を培 養する請求項 1 に記載の方法。
3. 培地中の リ ン酸イオ ン、 カ リ ウムイオン、 ナ ト リ ウムイオ ン 、 マグネ シウムイオンおよびカルシウムイオンの濃度が、 それぞれ 1 0〜 4 5 mM、 1 0〜 4 5 mM、 5〜 4 0 mM、 l ~ 6 mM、 1 〜 9 mMの範囲にある微生物培養用培地を用いて糸状菌を培養する 請求項 2 に記載の方法。
4. 糸状菌がモルティ エレラ (Mortierella ) 属に属する微生物 であることを特徴とする請求項 1 に記載の糸状菌を培養する方法。
5. 糸状菌がモルティ エレラ属モルティ エレラ亜属 （subgenus ortierella) に属する微生物であることを特徴とする請求項 4 に記 載の糸状菌を培養する方法。
6. 生成物が不飽和脂肪酸である、 請求項 1 〜 5 のいずれか 1 項 に記載の方法。
7. 前記不飽和脂肪酸がア ー リ ノ レン酸、 ジホモ一 ア ー リ ノ レ ン 酸、 ァラキ ドン酸、 エイ コサペン夕ェン酸、 ミ ー ド酸、 6， 9 —ォ ク タデカジエン酸及び 8， 1 1 一エイ コサジェン酸から成る群から 選択されたものである請求項 6 に記載の方法。
8. 不飽和脂肪酸またはこれを含有する脂質の製造方法であって 、 モルティ エレラ (Mortierella ) 属に属する微生物を、 リ ン酸ィ オ ンが 5〜 6 0 mM、 カ リ ウムイオ ン力 5〜 6 0 mM、 ナ ト リ ウム イオン力く 2〜 5 0 m M、 マグネ シウムイオンが 0. 5〜 9 m Mおよ びカルシウムイオンが 0. 5〜 1 2 m Mの範囲にある培地中で、 培 養することを特徴とする不飽和脂肪酸またはこれを含有する脂質の 製造方法。
9. 不飽和脂肪酸またはこれを含有する脂質の製造方法であって 、 モルティ エレラ （Mortierella ) 属に属する微生物を、 リ ン酸ィ オン力く 1 0〜 4 5 mM、 カ リ ウムイオン力く 1 0〜 4 5 mM、 ナ ト リ ゥムイオン力く 5 ~ 4 O mM、 マグネ シウムイオン力く l 〜 6 mMおよ びカルシウムイオ ンが 1 〜 9 m Mの範囲にある培地中で、 培養する ことを特徴とする不飽和脂肪酸またはこれを含有する脂質の製造方 法。
10. 前記リ ン酸イオンが、 リ ン酸一水素二カ リ ウム、 リ ン酸二水 素一力 リ ゥム、 リ ン酸一水素ニナ ト リ ゥム及びリ ン酸ニ水素ーナ ト リ ゥムからなる群より選ばれた少なく と も 1 つ以上の塩類によって 供給され、 前記カ リ ウムイオンが、 リ ン酸一水素二カ リ ウム、 リ ン 酸二水素一力 リ ゥム及び塩化力 リ ゥムからなる群より選ばれた少な く と も 1 つ以上の塩類によって供給され、 前記ナ ト リ ウムィオンが
、 リ ン酸一水素ニナ ト リ ウム、 リ ン酸二水素一ナ ト リ ウム、 塩化ナ ト リ ウム及び硫酸ナ ト リ ゥムからなる群より選ばれた少なく と も 1 つ以上の塩類によって供給され、 前記マグネシウムイオンが、 塩化 マグネシゥム及び Z又は硫酸マグネシゥムの塩類によつて供給され
、 前記カルシウムイオンが、 塩化カルシウム及び/又は炭酸カルシ ゥムの塩類によつて供給されることを特徴とする請求項 8 または 9 記載の製造方法。
11. 前記イオンが、 リ ン酸二水素一カ リ ウム （KH2 P04)、 無水硫 酸ナ ト リ ウム（Na2S04)、 塩化マグネシゥム六水和物（MgCl2 · 6H20) 及び塩化カルシウム二水和物（CaCl2 ·2Η2 0)の組合せによって供給 されるこ とを特徴とする請求項 8又は 9記載の製造方法。
12. 前記不飽和脂肪酸がァラキ ドン酸、 7— リ ノ レ ン酸、 ジホモ 一 γ - リ ノ レン酸、 ミ 一 ド酸及び Ζ又はエイ コサペンタエン酸であ ることを特徴とする請求項 8乃至 1 1 のいずれか 1項記載の製造方 法。
13. 前記モルティ エレラ ( ortierella ) 属に属する微生物が、 モルティ エレラ亜属 （subgenus Mortierella) に属する微生物であ る請求項 8乃至 1 2のいずれか 1項記載の製造方法。
14. 前言己モノレティ エレラ亜属 (subgenus Mortierel la) に属する 微生物が、 モルティ エレラ · アルピナ (Mortierella alpina) 、 モ ノレティ エレラ · エロ ンガ'夕 (Mortierella elongata) 、 モノレティ ェ レラ ' エキシグァ （Mortierella exigua) 又はモルティ エレラ · ヒ グロフ イ ラ （Mort ier— el la hygroD_hi la) である請求項 1 3記載の製 造方法。
15. さ らに前記培地に大豆から得られる窒素源を添加することを 特徴とする請求項 8乃至 1 4のいずれか 1項記載の製造方法。
16. 前記大豆から得られる窒素源が、 水分を除く成分当りの窒素 含量が少なく とも 2重量％以上であるこ とを特徴とする請求項 1 5 記載の製造方法。
17. 前記大豆から得られる窒素源が、 脱脂大豆、 未脱脂大豆、 及 びこれらに加工を施したものからなる群より選ばれた少なく と も一 つ以上であるこ とを特徴とする請求項 1 5又は 1 6記載の製造方法
18. 前記脱脂大豆又は未脱脂大豆に施される加工が、 熱処理 ； 酸 処理 ； アル力 リ処理 ； 酵素処理 ； 化学修飾 ； 又は該処理を含む化学 的及び/又は物理的処理による変性及び Z又は再生 ； 水及び Z又は 有機溶媒を用いた一部成分の除去 ； 濾過及び/又は遠心分離による 一部成分の除去 ； 凍結 ； 粉砕 ； 乾燥 ； 及び/又は篩い分けであるこ とを特徴とする請求項 1 7記載の製造方法。
19. 前記大豆から得られる窒素源が、 脱脂大豆に少なく と も熱変 性を施したものであるこ とを特徴とする請求項 1 5又は 1 6記載の 製造方法。
20. さ らに前記培地に酵母エキスを添加することを特徴とする請 求項 1 5乃至 1 9のいずれか 1 項記載の製造方法。
21. リ ン酸イオン、 カ リ ウムイオン、 ナ ト リ ウムイオン、 マグネ シゥムイオ ン及びカルシウムイオン力く、 それぞれ 5〜 6 0 mM、 5 〜 6 0 mM、 2〜 5 0 mM、 0. 5〜 9 mM、 0. 5 〜 1 2 mMの 範囲にあることを特徴とする微生物培養用培地。
22. リ ン酸イオン、 カ リ ウムイオン、 ナ ト リ ウムイオ ン、 マグネ シゥムイオ ン及びカルシウムイオン力く、 それぞれ 1 0〜 4 5 mM、 1 0〜 4 5 mM、 5 〜 4 0 mM、 l 〜 6 mM、 l 〜 9 mMの範囲に あることを特徴とする微生物培養用培地。
23. 上記微生物が、 糸状菌であることを特徴とする請求項 2 1 又 は 2 2記載の微生物培養用培地。
24. 上記微生物が、 モルティエレラ ( ortierella ) 属に属する 微生物であるこ とを特徴とする請求項 2 1 又は 2 2記載の微生物培 養用培地。
25. 上記微生物が、 モルティ エレラ属モルティ エレラ亜属 （subg enus Mortierella) に属する微生物であるこ とを特徴とする請求項 2 1 又は 2 2記載の微生物培養用培地。
26. 5〜 6 0 mMの リ ン酸イオン、 5 〜 6 0 mMのカ リ ウムィォ ン、 2 ~ 5 0 mMのナ ト リ ウムイオ ン、 0. 5〜 9 mMのマグネ シ ゥムイ オ ンおよび 0. 5〜 1 2 mMのカルシウムイオ ンの微生物培 養用培地への使用。
27. 1 0 〜 4 5 mMの リ ン酸イオ ン、 1 0 ~ 4 5 mMのカ リ ウム イオ ン、 5 〜 4 0 mMのナ ト リ ウムイオン、 l 〜 6 mMのマグネ シ ゥムイオンおよび 1 〜 9 mMのカルシウムイオンの微生物培養用培 地への使用。
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