WO2000077220A2 - Verfahren zur veränderung von peptidsynthetasen in der weise, dass sie ihre substrataminosäuren n-methylieren können - Google Patents

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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)

Definitions

  • the invention relates to the modification of peptide synthetases (PPS) in such a way that they can N-methylate their substrate amino acids. This is achieved by a targeted modification or exchange of the functional subunits (activation domains) of these enzymes
  • PPS Peptide synthetases
  • Some PPS modules also accept unusual (non-proteinogenic) amino acids as substrates, such as alpha-aminoadipic acid (in penicillin) or phenylglycine (in p ⁇ stinamycin), which is catalyzed by the PPS A peptide is synthesized by the enzyme-catalyzed condensation of the amino acids bound to the modules.
  • unusual (non-proteinogenic) amino acids such as alpha-aminoadipic acid (in penicillin) or phenylglycine (in p ⁇ stinamycin), which is catalyzed by the PPS A peptide is synthesized by the enzyme-catalyzed condensation of the amino acids bound to the modules.
  • This condensation is directed in such a way that the substrate amino acid bound to the first module of the PPS (based on the N-termmus of the PPS) is the beginning (N-termmus ) of the synthesized peptide thus determines the number hl and the order of the modules within a PPS, the length and the sequence of the synthesized peptide (Kleinkauf H, von Dohren H (1990) Eur J Biochem 192 1-15) This is of crucial importance, since when exchanging or inserting or deleting of PPS modules, the structure of the product formed thereafter can be predicted genetically
  • All known PPS modules have in common that they are composed of at least three functional domains (Figure 1A). These three domains are (1) the adenylation domains, necessary for the recognition and adenyheration of the substrate amino acids, and (2) the ACP domains , necessary for the covalent binding of the adenylated amino acid in the form of a thioester and (3) the condensation domains, necessary for the condensation of all amino acids bound to the PPS to the synthesized peptide (Stachelhaus et al (1995) FEMS Microbiol Lett 125 3-14).
  • activation domains and ACP domains are also referred to as activation domains ( Figure 1A) because together they enable the recognition and covalent binding of substrate amino acids in the form of a reactive thioester.
  • a special group are those activation domains that can also N-methylate their substrate amino acids after covalent binding PPS with such activation domains consequently contains this in the successor Peptide resulting from condensation also N-methylated amino acids
  • the number of currently known or cloned genes coding for activation domains with N-methyltransferase activity (11 domains) is however significantly lower than the number of activation domains without N-methyltransferase activity (over 80 Domains)
  • many of the activation domains with N-methyltransferase activity show comparable substrate activity, e.g.
  • the invention described here is important because it also describes the conversion of activation domains without N-methyltransferase activity into activation domains with N-methyltransferase activity, with the original amino acid substrate specificity being retained. Any specificity of an existing PPS module can thus a corresponding module derivative with additional N-methyltransferase activity can be provided. These derivatives can then be used to construct new or modified PPS whereby the peptide synthesized by the PPS is N-methylated at the desired peptide formations. This enables the synthesis of new peptides with Possible New Pharmacological Properties Many of the already known pharmacologically active peptides and peptide derivatives, such as, for example, the cyclosponn, contain N-methylated amino acids. The selective N-methylation of individual nitrogen atoms in the peptide formations v on polypeptides, is hardly or not possible by chemical methods
  • the invention is based on the fact that all activation domains with N-methyltransferase activity have an additional domain which is located between the adenylation domain and ACP domains ( Figure 1B). This additional domain is referred to below as N-methyltransferase domains and mediates the N-methylation of the bound substrate amino acid
  • the invention includes methods for converting activation domains without N-methyltransferase activity into activation domains with N-methyltransferase activity and their use for the redesign of PPS for the synthesis of N-methylated amino acids and peptide activation domains without N - Methyltransferase activity of a PPS can in principle be converted into activation domains with N-methyltransferase activity in two ways
  • N-methyltransferase domain is inserted as a functional unit in an activation domain.
  • the N-methyltransferase domain can be inserted directly between the adenylation domains and ACP domains of the activation domains to be converted ( Figure 2A).
  • Two can also be inserted closely adjacent fusion sites are used here, the area between the fusion sites in the activation domain to be converted is deleted and replaced by corresponding areas which are inserted together with the N-methyltransferase domain ( Figure 2 B).
  • the N-methyltransferase domains can also be inserted as a block with a subsequent ACP domain (or parts thereof) behind the activation domains, which results in an exchange of the original ACP domains by the inserted ACP domains (or parts thereof) ( Figure 2C and 2D)
  • the substrate specificity of the converted activation domains is retained in all insertions, however, since the adenylation domain (recognition and adenyherization of the substrate amino acid) is not changed
  • Suitable insertion sites for the insertion of the N-methyltransferase domains into an activation domain are determined by the transition between the adenylation domains and the ACP domain. These result from the sequence comparison between activation domains with N-methyltransferase domains and activation domains without N-methyltransferase domains ( Figure 3)
  • the N-methyltransferase domains are approximately 45 amino acids behind (C-terminal) of the consensus sequence known as "core motif 5" QVKI RG (F / H / Y) RIE (/ D GEIE (Turgay et al (1992 ) Mol Microbiol 6 529-546) of the adenylation domains and immediately N-term to the consensus sequence
  • All described methods for converting an activation domain without N-methyltransferase activity into an activation domain with N-methyltransferase activity or their use for the construction of new PPS include a targeted modification and combination of the corresponding DNA sections of peptide synthetase genes. which codes for the N-methyltransferase domains of any activation domains with N-methyltransferase activity, inserted into the DNA segment which codes for the activation domains to be converted. This must be done in such a way that a common reading frame is formed after the insertion and the coded N-methyltransferase domains become an integral part of the coded activation domains.
  • the DNA fragment from a gene of a PPS which codes completely or partially for the activation domains to be converted can be cloned in plasmids.
  • plasmids for cloning and modification of DNA k
  • All common methods of molecular biology can be used, such as the polymerase chain reaction (PCR).
  • the cloning and DNA manipulations can be carried out in all plasmids and organisms suitable for this purpose, such as pUC plasmids and E. coli, for the cloning and modification of the DNA Already existing or, for example, PCR-generated restriction sites can be used.
  • Such methods are described in Example 1 and involve the introduction of a residual functional site into the DNA of the Actmomycm synthetase II gene, which is then used for the subsequent module exchange
  • new PPS By inserting a DNA segment coding for the N-methyltransferase domains into the gene segment of a PPS, new PPS can be constructed.
  • the expression of a new PPS gene can take place in plasmids and lead to the synthesis of new products
  • Example 4 describes and includes the expression of a recombinant PPS gene according to the Transformation of a corresponding plasmid in Strepiomyces Hvidans and detection of the catalytic activity of the PPS encoded by the PPS gene.
  • DNA segments can also be used to introduce PPS genes into the genome of organisms or to change PPS genes already present in the genome, as shown, for example, in the gene for surfactin synthetase in Bacillus subtilis (Stachelhaus et al. (1995) Science 269 (5220): 69-72). Accordingly, modules with N-methyltransferase activity can also be introduced into genomic PPS genes and lead to the formation of new, N-methylated peptides.
  • the DNA sequences of the oligonucleotides used in the PCR are listed in Table 2.
  • the sizes of the PCR fragments given in the examples relate to PCR fragments whose ends were cut with the restriction enzymes mentioned in the examples. Additional restriction sites in the oligonucleotides were used to first clone the PCR fragments in E. coli standard plasmids before the cloning described in the examples.
  • the DNA sequence of the gene of actinomvcin synthetase II ( ⁇ cmB) is stored in the database "GenBank” under the entry AF047717.
  • the DNA sequence of a 3849 bp B ⁇ mHl fragment from the gene of actinomvcin synthetase III ( ⁇ cm (X) is that Examples attached below.
  • the actinomycin synthetase II (ACMS II) from Strepiomyces chrysom ⁇ llus has two modules without an N-methyltransferase domain, of which module 1 activates the amino acid threonine and module 2 the amino acid valine.
  • module 1 activates the amino acid threonine
  • module 2 the amino acid valine.
  • a £ «; ⁇ /. ' Interface into the gene of the ACMS II ( ⁇ cmB).
  • This EcoR ⁇ ' interface and an already present in the gene (a / interface make it possible to pass through the region coding for the activation domain of module 2 by any Cl ⁇ l- Exchange EcoR F fragments.
  • the exchange includes numerous cloning steps, which are first described formally and then in detail.
  • the plasmid pACM5 was used to generate an EcoR ['restriction site in the gene of ACMS II (acmB) ( Figure 4; Schauwecker et a /. (1998) J. Bacteriol., 180: 2468- 2474).
  • the pasmid pACM5 ( Figure 4) carries the acmB gene behind a constitutive streptomycete promoter (mel P) and is a derivative of the streptomycete plasmid plJ702.
  • a 4923 bp Ps / ZC / ⁇ -'fragment which encompasses the me / promoter and most of the 5 ' region of the acmB (up to the C / ⁇ Z interface at bp pos. 4519 in acmB), was isolated from pACM5 and cloned into the E. coli plasmid pSP72 (A in Figure 5). Then part of the immediately adjacent 3 ' region of the acmB (starting with the C / ⁇ / interface at bp 4519) was amplified by PCR with the oligonucleotides pnm-A and pnm-B (PCR fragment
  • Example 2 Exchange of a complete activation domain without N-methyltransferase activity by an activation domain with N-methyltransferase activity in a PPS.
  • the exchange of a complete activation domain was carried out in the actinomycin synthetase II (ACMS II) from Streptomvces chrvsomallus.
  • the activation domain of module 2 was replaced by an activation domain with N-methyltransferase activity.
  • the activation domain with N-methyltransferase activity used for the exchange comes from the actinomycin Synthetase III (ACMS III) and is also specific for valine
  • ACMS III actinomycin Synthetase III
  • Example 3 Conversion of an activation domain without N-methyltransferase activity into an activation domain with N-methyltransferase activity and introduction of these converted activation domains into a PPS.
  • N-methyltransferase domain was inserted between the adenylation domain and the ACP domain in the valine activation domains from module 2 of the ACMS II. This activates the activation domains of the ACMS II with an additional N-methyltransferase activity.
  • Methyitransferase domains come from module 3 of ACMS III. The exchange involves numerous cloning steps, which are first described formally and in detail below
  • the area of the acmB-Ge s from bp pos. 4591 to 5899 with the oligonucleotides pnm-G and pnm- (PCR fragment 1 in Figure 6) and the area of bp pos 5932 to 6251 with the oligonucleotides pnm- ⁇ and pnm-J (PCR fragment 2 in Figure 6) amplified by PCR. Thereafter, PCR fragment 2 was first cloned as a 330 bp HindIII-EcoR fragment in pBlueScnpt and then the PCR fragment 1 used as 1386 bp Clal-SnaBI pigment.
  • Example 4 Expression of recombinant PPS with introduced N-methyltransferase domains and in vitro testing of their N-methyltransferase activity.
  • Streptomycetes were carried out according to standard protocols (Hopwood et al (1985) Genetic manipulation of Streptomyces A laboratory manual The John Innes Foundation, Norwich, England) Die
  • the plasmid-coded PPS was purified from the transformants in each case from 1 liter of YEME culture medium after the stationary growth phase had been reached (3 days of growth)
  • Proteins were broken up mechanically (French press). The genomic DNA, which was also released, was cleaved by incubation with DNAse I to obtain a thin suspension. Cell debris was removed by centrifugation and proteins were then added by adding ammonium sulfate until a final concentration of 55% was reached. precipitated The precipitated proteins were separated by size by exclusion chromatography (Saulenmat ⁇ x Ultrogel-AcA-34 from Biosepra). Protein fractions with proteins larger than 200 kDa were combined and further purified via an anion exchanger (Saulenmat ⁇ x Q-Sepharose FF from Pharmacia) Proteins bound to the anion exchanger were released from the anion exchanger by continuous addition of NaCl.
  • the PPS constructed in Examples 2 and 3 eluted in a range between 150 to 250 mM NaCI.
  • the PPS partially purified according to this protocol can then, for example, be used be further analyzed according to the following regulations
  • the PPS is incubated with the emarked substrate amino acid as described above, but an additional 3 ⁇ l of 0.1 M S-adenosyl-methionine (SAM) is added to the mixture as a donor for the methyl group transferred to the amino acid TCA precipitation, the PPS is washed with 4 ml of 5% TCA (two servings) and then with 2 ml of ethanol and dried at 37 ° C.
  • SAM S-adenosyl-methionine
  • a peptide can be analyzed in a simple manner by acid hydrolysis and subsequent detection of the individual ammosaur components. This applies in particular to peptides which are formed by PPS since the ammosaur sequence of the synthesized peptide is already known through the arrangement of the modules.
  • the analysis of the peptide formed in vitro can be carried out as follows, for example: 100 ⁇ l of purified PPS is mixed with all substrate amino acids of the PPS (2 mM each), SAM (2 mM), ATP (10 mM) and MgCl 2 (20 mM) Incubated in a total volume of 150 ⁇ l for 25 min at 30 ° C.
  • threonyl -N-methyl-valine peptide linkage by the PPS constructed in Examples 2 and 3 can be carried out, for example, as follows: 20 ⁇ l of the peptide released from the PPS from each batch (a batch with 14 C-labeled threonm and a batch with 1 C-labeled valine ) are chromatographed on a silica gel 60 TLC film (Merk) with the eluent n-butanol glacial acetic acid H 2 0 (volume 80 20 20).
  • Tsr thiostrepton
  • Amp ampiciliin
  • Figure 2 shows the modification of activation domains by inserting an N-
  • FIG. 3 shows the sequence comparison of selected activation domains in the
  • Figure 4 shows the starting plasmids used in the examples
  • Figure 5 shows the introduction of a £ coRV residual interface in acmB
  • Figure 6 shows the cloning of C / ⁇ I £ coRV cassettes for the construction of recombinant acmB genes
  • Figure 7 shows plasmids for the expression of the recombinant PPS genes

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Veränderung von Peptidsynthetasen (PPS) in der Weise, daß sie ihre Substrataminosäuren N-methylieren können. PPS sind Enzyme, die Peptide auf nicht-ribosomale Weise synthetisieren. Die PPS sind modular aufgebaut. Jedes Modul besitzt eine Aktivierungsdomäne, welche die jeweilige Substrataminosäure erkennt und kovalent bindet. Die von der PPS katalysierte Peptidsynthese erfolgt dann durch die Kondensation der kovalent gebundenen Substrataminosäuren. Eine geringe Anzahl der bekannten Aktivierungsdomänen ist in der Lage, die gebundenen Substrataminosäuren auch zu N-methylieren. Die hier beschriebene Erfindung ermöglicht die Umwandlung von Aktivierungsdomänen ohne N-Methyltransferase-Aktivität in Aktivienngsolomänen nu7 N-île-thyltransferase-Aktivität, wobei die ursprüngliche Substratspezifität erhalten bleibt.

Description

Verfahren zur Veränderung von Peptidsynthetasen in der Weise, daß sie ihre Substrataminosäuren N-methyiieren können.
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Veränderung von Peptidsynthetasen (PPS) in der Weise, daß sie ihre Substrataminosauren N-methylieren können Dies wird durch eine gezielte Modifikation oder Austausch der funktionellen Untereinheiten (Aktivierungsdomanen) dieser Enzyme erreicht
Peptidsynthetasen (PPS) sind Enzyme, die Peptide auf nicht-πbosomale Weise synthetisieren Die von den PPS synthetisierten Peptide (oder die daraus hervorgehenden Derivate) sind oft von pharmazeutischem Interesse wie beispielsweise die Penicilline Vancomycm, Cephalosponn, Pπstinamycin oder das Actmomycin D Die PPS sind modular aufgebaut Jedes Modul einer PPS erkennt, aktiviert und bindet jeweils eine Aminosäure Einige PPS-Module akzeptieren auch ungewöhnliche (nicht proteinogene) Aminosäuren als Substrate, wie beispielsweise die alpha- Aminoadipinsaure (in Penicillin) oder das Phenylglycm (in Pπstinamycin) Die von der PPS katalysierte Synthese eines Peptides erfolgt durch die enzymkatalysierte Kondensation der an den Modulen gebundenen Aminosäuren Diese Kondensation ist gerichtet, und zwar in der Weise, daß die am ersten Modul der PPS (bezogen auf den N-Termmus der PPS) gebundene Substrataminosaure den Anfang (N-Termmus) des synthetisierten Peptids bildet Somit bestimmt die Anzahl und die Reihenfolge der Module innerhalb einer PPS die Lange und die Sequenz des synthetisierten Peptides (Kleinkauf H ,von Dohren H (1990) Eur J Biochem 192 1-15) Dies ist von entscheidender Bedeutung, da bei einem Austausch bzw dem Einfugen oder Deletieren von PPS-Modulen auf genetischem Wege die Struktur des danach gebildete Produkt vorhersagbar
Allen bekannten PPS-Modulen ist gemeinsam, daß sie sich aus mindestens drei funktioneilen Domänen zusammensetzen (Abbildung 1A) Diese drei Domänen sind (1) die Adenylierungs- Domane, notwendig für die Erkennung und Adenyherung der Substrataminosaure, und (2) die ACP-Domane, notwendig für die kovalente Bindung der adenyherten Aminosäure in Form eines Thioesters und (3) die Kondensationsdomane, notwendig zur Kondensation aller an der PPS gebundenen Aminosäuren zum synthetisierten Peptid (Stachelhaus et al (1995) FEMS Microbiol Lett 125 3-14) Die Adenylierungs-Domane und ACP-Domane werden zusammen auch als Aktivierungsdomane bezeichnet (Abbildung 1A) da sie zusammen die Erkennung und kovalente Bindung der Substrataminosaure in Form eines reaktiven Thioesters ermöglichen Eine besondere Gruppe bilden jene Aktivierungsdomanen die ihre Substrataminosauren nach der kovalenten Bindung auch N-methylieren können Bei PPS mit solchen Aktivierungsdomanen enthalt folglich das bei der nachfolgenden Kondensation entstehende Peptid auch N-methylierte Aminosäuren Die Zahl der zur Zeit bekannten bzw klonierten Gene kodierend für Aktivierungsdomanen mit N-Methyltransferase-Aktivitat (11 Domänen) ist jedoch deutlich gennger als die Zahl der Aktivierungsdomanen ohne N-Methyltransferase-Aktivitat (über 80 Domänen) Zudem zeigen viele der Aktivierungsdomanen mit N-Methyltransferase-Aktivitat eine vergleichbare Substrataktivitat, wie z B für die Aminosäure Valin in den Modulen der Actinomycin Synthetase II aus Streptomvces chrvsomallus (Schauwecker et a/ (1998) J Bacteπol 180 2468-2474) der Cyclosponn Synthetase aus Tolvpocladiwn mveum (Weber et a/ (1994) Cur Genet 26 120-125) und der Enniatin Synthetase aus Fusarmm scirpi (Haese et a/ (1993)
Mol Microbiol 7 905-914)
Die hier beschriebene Erfindung ist deshalb von Bedeutung, da sie auch die Umwandlung von Aktivierungsdomanen ohne N-Methyltransferase-Aktivitat in Aktivierungsdomanen mit N- Methyltransferase-Aktivitat beschreibt, wobei die ursprüngliche Aminosaure-Substratspezifitat erhalten bleibt Für jede Spezifitat eines vorhandenen PPS-Moduls kann somit ein entsprechendes Modul-Derivat mit zusätzlicher N-Methyltransferase-Aktivitat bereitgestellt werden Diese Derivate können dann dazu genutzt werden, neue oder modifizierte PPS zu konstruieren wodurch das von der PPS synthetisierte Peptid an den gewünschten Peptidbmdungen N-methyhert ist Dies ermöglicht die Synthese neuer Peptide mit möglichen, neuen pharmakologischen Eigenschaften Viele der bereits bekannten pharmakologisch aktiven Peptide und Peptid-Denvate, wie beispielsweise das Cyclosponn, enthalten N-methylierte Aminosäuren Die durch die Erfindung erreichbare, selektive N-Methyiierung einzelner Stickstoffatome in den Peptidbmdungen von Polypeptiden, ist durch chemische Methoden kaum oder nicht möglich
Die Erfindung basiert darauf, daß alle Aktivierungsdomanen mit N-Methyltransferase-Aktivitat eine zusätzliche Domäne besitzen, welche zwischen der Adenylierungs-Domane und ACP- Domane lokalisiert ist (Abbildung 1 B) Diese zusätzliche Domäne wird im Weiteren als N- Methyltransferase-Domane bezeichnet und vermittelt die N-Methylierung der gebundenen Substrataminosaure Die Erfindung beinhaltet Verfahren zur Umwandlung von Aktivierungsdomanen ohne N-Methyltransferase-Aktivitat in Aktivierungsdomanen mit N- Methyltransferase-Aktivitat und deren Nutzung zur Neukonstruktion von PPS für die Synthese von N-methylierten Aminosäuren und Peptiden Aktivierungsdomanen ohne N- Methyltransferase-Aktivitat einer PPS können prinzipiell durch zwei Wege in Aktivierungsdomanen mit N-Methyltransferase-Aktivitat überfuhrt werden
(1) Ein ganzes Modul oder die ganze Aktivierungsdomane einer PPS wird ausgetauscht Dieses Verfahren ist in Beispiel 2 beschrieben
(2) Eine N-Methyltransferase-Domane wird als funktionelle Einheit in eine Aktivierungsdomane inseriert Die N-Methyltransferase-Domane kann beispielsweise direkt zwischen die Adenylierungs-Domane und ACP-Domane der umzuwandelnden Aktivierungsdomane inseriert werden (Abbildung 2 A) Zur Insertion können auch zwei dicht benachbarte Fusionsstellen genutzt werden Hierbei wird der zwischen den Fusionsstellen hegende Bereich in der umzuwandelnden Aktivierungsdomane deletiert und durch entsprechende Bereiche ersetzt, die zusammen mit der N-Methyltransferase-Domane inseriert werden (Abbildung 2 B) Dieses Verfahren ist in Beispiel 3 beschrieben Bei der Verwendung von zwei Fusionsstellen kann die N-Methyltransferase-Domane auch als Block mit einer nachfolgenden ACP-Domane (oder Teilen davon) hinter die Aktivierungsdomane inseriert werden wodurch es zu einem Austausch der ursprünglichen ACP-Domane durch die inserierte ACP-Domane (bzw Teilen davon) kommt (Abbildung 2C und 2D) Bei allen Insertionen bleibt die Substratspezifitat der umgewandelten Aktivierungsdomane aber erhalten da die Adenylierungs- Domane (Erkennung und Adenyherung der Substrataminosaure) nicht verändert wird
Geeignete Insertionsstellen für die Insertion der N-Methyltransferase-Domane in eine Aktivierungsdomane werden durch den Übergang zwischen Adenylierungs-Domane und ACP- Domäne festgelegt Diese ergeben sich aus dem Sequenzvergleich zwischen Aktivierungsdomanen mit N-Methyltransferase-Domane und Aktivierungsdomanen ohne N- Methyltransferase-Domane (Abbildung 3) Die N-Methyltransferase-Domanen liegen als Emschub etwa 45 Aminosäuren hinter (C-terminal) der als „core motif 5" bekannten Konsensussequenz QVKI RG ( F/H/Y ) RIE ( / D GEIE (Turgay et al (1992) Mol Microbiol 6 529-546) der Adenylierungs-Domane und unmittelbar N-termmal zur Konsensussequenz
( Q/ E/ D ) ( I /V) RE ( V/ L ) xxxLPXYM ( V/ I ) P
Alle beschriebenen Methoden zur Umwandlungen einer Aktivierungsdomane ohne N- Methyltransferase-Aktivitat in eine Aktivierungsdomane mit N-Methyltransferase-Aktivitat oder deren Verwendung zur Konstruktion neuer PPS beinhalten eine gezielte Veränderung und Kombination der entsprechenden DNA-Abschnitte von Peptidsynthetase Genen Hierzu wird der DNA-Abschnitt, welcher für die N-Methyltransferase-Domane einer beliebigen Aktivierungsdomane mit N-Methyltransferase-Aktivitat kodiert, in das DNA-Segment, welches für die umzuwandelnde Aktivierungsdomane kodiert eingefugt Dies muß in einer Weise geschehen, daß sich nach der Insertion ein gemeinsamer Leserahmen bildet und die kodierte N- Methyltransferase-Domane integraler Bestandteil der kodierten Aktivierungsdomane wird Hierfür kann beispielsweise das DNA-Fragment aus einem Gen einer PPS welches komplett oder teilweise für die umzuwandelnde Aktivierungsdomane kodiert in Plasmiden kloniert werden Zur Klonierung und Modifikation von DNA können alle gangigen Methoden der Molekularbiologie verwendet werden, wie beispielsweise die Polymerase Kettenreaktion (PCR) Die Klonierungen und DNA-Manipulationen können in allen für diese Zwecke geeigneten Plasmiden und Organismen, wie beispielsweise pUC-Plasmiden und E coli erfolgen Bei der Klonierung und Modifikation der DNA können bereits vorhandene oder beispielsweise durch PCR erzeugte Restriktionsschnittstellen genutzt werden Solche Verfahren sind in Beispiel 1 beschrieben und beinhalten die Einfuhrung einer Restnktionsschnittstelle in die DNA des Gens der Actmomycm Synthetase II welche dann zum nachfolgenden Modulaustausch genutzt wird
Durch die Insertion eines für die N-Methyltransferase-Domane kodierenden DNA-Segments in das Gensegment einer PPS können neue PPS konstruiert werden Die Expression eines neuen PPS-Gens kann in Plasmiden erfolgen und zur Synthese neuer Produkte fuhren Dies ist in
Beispiel 4 beschrieben und beinhaltet die Expression eines rekombmanten PPS-Gens nach der Transformation eines entsprechenden Plasmids in Strepiomyces Hvidans und den Nachweis der katalytischen Aktivität der von dem PPS-Gen kodierten PPS. Auch können DNA-Segmente dazu genutzt werden, PPS-Gene in das Genom von Organismen einzuführen oder bereits im Genom vorhandene PPS-Gene zu verändern, wie beispielsweise gezeigt beim Gen der Surfactin Synthetase in Bacillus subtilis (Stachelhaus et al. (1995) Science 269(5220) :69-72). Entsprechend können daher auch Module mit N-Methyltransferase-Aktivität in genomische PPS- Gene eingebracht werden und zur Bildung neuer, N-methylierter Peptide führen.
Beispiele
Im Folgenden wird das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung anhand von Beispielen näher beschrieben.
Die bei der Durchführung der Beispiele verwendeten Plasmide (pSP72. pBlueScript, piJ702, pSPIJ004 und pACM5) sind in Abbildung 4 schematisch gezeigt und in Tabelle 1 näher erläutert.
Die DNA-Sequenzen der bei der PCR verwendeten Oliqonukleotide sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die in den Beispielen angegebenen Größen der PCR-Fragmente beziehen sich auf PCR- Fragmente, deren Enden mit den in den Beispielen genannten Restriktionsenzymen geschnitten wurden. Zusätzliche Restriktionsschnittstellen in den Oligonukleotiden wurden genutzt, um die PCR-Fragmente vor den in den Beispielen geschilderten Klonierungen zuerst in E.coli- Standardplasmiden zu klonieren.
Die DNA-Sequenz des Gens der Actinomvcin Synthetase II (αcmB) ist in der Datenbank „GenBank" unter dem Eintrag AF047717 abgelegt. Die DNA-Sequenz eines 3849 bp BαmHl- Fragments aus dem Gen der Actinomvcin Synthetase III (αcm(X) ist den Beispielen nachfolgend beigefügt.
Beispiel 1
Einführen einer Restriktionsschnittstelle in das Gen der Actinomycin Synthetase II, um einen Austausch einer Aktivierungsdomäne zu ermöglichen.
Die Actinomycin Synthetase II (ACMS II) aus Strepiomyces chrysomαllus besitzt zwei Module ohne N-Methyltransferase-Domäne, von denen Modul 1 die Aminosäure Threonin und Modul 2 die Aminosäure Valin aktiviert. Um die Aktivierungsdomäne von Modul 2 austauschen zu können, wurde durch Mutagenese eine £«;■/. ( '-Schnittstelle in das Gen der ACMS II (αcmB) eingeführt. Diese EcoR {' -Schnittstelle und eine bereits im Gen vorhandene ( a/-Schnittstelle ermöglichen es, den für die Aktivierungsdomäne von Modul 2 kodierenden Bereich durch beliebige Clαl- EcoR F-Fragmente auszutauschen. Der Austausch beinhaltet zahlreiche Klonierungsschritte, welche zunächst formal und nachfolgend detailliert beschrieben werden.
1. Formale Zusammenfassung der Klonierungsstrategie: Zur Erzeugung einer EcoR ['-Restriktionschnittstelle in das Gen der ACMS II (acmB) wurde das Plasmid pACM5 genutzt (Abbildung 4; Schauwecker et a/. (1998) J. Bacteriol., 180:2468-2474). Das Pasmid pACM5 (Abbildung 4) trägt das acmB-Gen hinter einem konstitutiven Streptomyceten Promotor (mel P) und ist ein Derivat des Streptomyceten-Plasmids plJ702. Durch PCR-Mutagenese und entsprechende Klonierungen wurde eine EcoR F-Schnittstelle in das acmB-Gen hinter den für die Phosphopantethein-Bindungsstelle kodierenden Bereich (in Modul 2) an Basenpaar (bp) Position (Pos.) 6251 eingeführt:
V R D V F E acmB ildtyp (bp 62 -6262) 5 - gtcegggaegtcttcgag
(bp Pos. 6251)
V R D I F E acmB mutagemsiert (bp 62 -6262) 5 - gtccgggatatcttcgag
EcoRV (bp Pos . 6251)
2. Detaillierte Beschreibung der einzelnen Klonierungsschritte:
Zuerst wurde ein 4923 bp Ps/Z-C/α-'-Fragment, welches den me/-Promotor und den größten Teil des 5'-gelegenen Bereichs der acmB umfaßt (bis zur C/αZ-Schnittstelle an bp Pos. 4519 in acmB) aus pACM5 isoliert und in das E.coli Plasmid pSP72 kloniert (A in Abbildung 5). Danach wurde ein Teil des direkt anschließenden 3 '-Bereiches der acmB (beginnend mit der C/α/-Schnittstelle an bp 4519) mit den Oligonukleotiden pnm-A und pnm-B durch PCR amplifiziert (PCR-Fragment
1 in Abbildung 5) und als 1737 bp C/α/-&o/.F-Fragment eingefügt (B in Abbildung 5). Die durch pnm-B eingeführte £coRF-Schnittstelle entspricht bp Pos. 6251 in acmB. Die zusammengesetzten Fragmente wurden dann als komplettes Pstl-EcoRV-Fragment isoliert und in pBlueScript umkloniert (C in Abbildung 5). Hieraus kann dann der zusammengesetzte 5'-Bereich der acmB zur späteren Klonierung als ßαm/-7-£coΛF-Fragment isoliert werden. Der noch fehlende 3'- Bereich der acmB wurde mit den Oligonukleotiden pnm-C und pnm-D amplifiziert (PCR-Fragment
2 in Abbildung 5) und als 2583 bp EcoR V-BamHl-F ragmenl in pSP72 kloniert (D in Abbildung 5). Das erhaltene Plasmid wurde mit Bglll und EcoRV geschnitten und der 5 '-Bereich der αcmB (isoliert als ßα/n -7-£'co/.F-Fragment wie oben beschrieben) eingesetzt. Dies ergibt Plasmid pACMOO-A (Abbildung 5), welches das vollständig zusammengesetzte αcmB Gen mit der an bp Pos. 6251 eingeführten £coÄI '-Schnittstelle trägt.
Beispiel 2 Austausch einer vollständigen Aktivierungsdomane ohne N-Methyltransferase-Aktivitat durch eine Aktivierungsdomane mit N-Methyltransferase-Aktivitat in einer PPS.
Der Austausch einer vollständigen Aktivierungsdomane wurde in der Actinomycin Synthetase II (ACMS II) aus Streptomvces chrvsomallus vorgenommen Die Aktivierungsdomane von Modul 2 wurde durch eine Aktivierungsdomane mit N-Methyltransferase-Aktivitat ausgetauscht Die zum Austausch verwendete Aktivierungsdomane mit N-Methyltransferase-Aktivitat stammt aus der Actinomycin Synthetase III (ACMS III) und ist ebenfalls spezifisch für Valin Der Austausch beinhaltet zahlreiche Klonierungsschritte welche zunächst formal und nachfolgend detailliert beschrieben werden
1 Formale Zusammenfassung der Klonierungsstrategie
Der Bereich zwischen einer in acmB liegenden /α7-Schnιttstelle an bp Pos 4519 und einer an bp Pos 6251 eingeführten EcoR F-Schnittstelie (in Plasmid pACMOO-A aus Beispiel 1), welcher für die zweite Aktivierungsdomane der ACMS II kodiert wurde deletiert und durch ein mit PCR generiertes 2961 bp Clal-EcoRl -Fragment ersetzt welches für eine Aktivierungsdomane mit N- Methyltransferase-Aktivitat der ACMS III mit Spezifitat für Valin kodiert Die Bereiche an den Fusionsstellen (Clal und EcoR\S) kodieren für in beiden PPS konservierte Regionen, welche N- terminal und C-terminal zu den Aktivierungsdomanen lokalisiert sind Nach der Insertion des PCR-geneπerten Clal-EcoRl -Fragments in das modifizierte acmB Gen entsteht wieder ein durchgehender Leserahmen, welcher für eine rekombmante ACMS II kodiert
modo, fizierte S R I D V L T S V R D I F E ACMS I I agccgtatcgatgtcctcacc tccgtccgg acgtcttcgag
(in Plasmid pACMOO-A) Clal EcoRV (bp Pos 4591) (bp Pos 6251)
Aktivierungsdomane V L T G L R aus der ACMS II atcgatGTCCTCACC GGCCTGCGCgatate
(2961 bp PCR-Fragment) Clal EcoRV
reXoπbinante S R I D V L T G L R D I F E ACMS II agccgtatcgatGTCCTCACC GGCCTGCGCgatatcttcgag (in Plasmid pACMOO-B) Clal EcoRV (bp Pos 4591) (bp Pos 7480)
Das Gen der rekombmanten ACMS II (in Plasmid pACMOO-B Abbildung 7) wurde in Streptomvces Inndan transformiert und die enzymatische Aktivität der eingeführten
Aktivierungsdomane nach der Expression des PPS-Gens wie in Beispiel 4 beschrieben nachgewiesen
2 Detaillierte Beschreibung der einzelnen Klonierungsschritte Von einem 3849 bp BamHI-FragmerΛ aus dem Gen der ACMS III (αcmC, die Sequenz ist beigefugt), welches für eine Valin-Aktivierungsdomane mit N-Methyltransferase-Domane kodiert, wurde mit den Oligonukleotiden pnm-E und pnm-F durch PCR ein 2967 bp Clαl-EcoR F-Fragment amplifiziert (PCR-Fragment 4 in Abbildung 6) Dieses Clαl-EcoR F-Fragment wurde in das Plasmid pACMOO-A (aus Beispiel 1) kloniert und hierdurch das ursprunglich in pACMOO-A vorhandene Clαl-EcoR \ -Fragment ausgetauscht Das erhaltene Plasmid wurde mit BαmHI und Hindin geschnitten und der Streptomyceten-Anteil aus Plasmid pSPIJ004 (Abbildung 4) als 5130 bp Bglll-Hindlll-Fragment eingesetzt Hierdurch entsteht das Plasmid pACMOO-B (Abbildung 7), weiches sowohl in E coh als auch in Streptomyceten transformiert und selektioniert werden kann
Beispiel 3 Umwandlung einer Aktivierungsdomane ohne N-Methyltransferase-Aktivitat in eine Aktivierungsdomane mit N-Methyltransferase-Aktivitat und Einbringen dieser umgewandelten Aktivierungsdomane in eine PPS.
In die Valin-Aktivierungsdomane aus Modul 2 der ACMS II wurde zwischen die Adenylierungs- Domäne und die ACP-Domane eine zusätzliche N-Methyltransferase-Domane insenert Hierdurch wird die Aktivierungsdomane der ACMS II mit einer zusatzlichen N-Methyltransferase- Aktivitat versehen Die eingesetzte N-Methyitransferase-Domane stammt aus Modul 3 der ACMS III Der Austausch beinhaltet zahlreiche Klonierungsschritte, welche zunächst formal und nachfolgend detailliert beschrieben werden
1 Formale Zusammenfassung der Klonierungsstrategie
Zur geplanten Insertion der N-Methyltransferase-Domane wurden zuerst zwei SnαBl- Schnittstellen im Gen der αcmB an bp Pos 5899 und bp Pos 5932 durch PCR-Mutagenese eingeführt Anschließend wurde der zwischen den beiden .S«a5/-Schnιttstellen liegende Bereich von 33 bp deletiert und durch ein 1263 bp EcoRJ'-EcoRl -Fragment, welches für die oben genannte N-Methyitransferasedomane der ACMS III kodiert, ersetzt Die Ligation der SnαBI- Enden mit den EcoR] -Enden fuhrt zur Bildung einer mit diesen beiden Restriktionsenzymen nicht mehr spaltbaren DNA-Sequenz an den Fusionsstellen Nach der Insertion des PCR-geneπerten £,co/.F-£coÄF-Fragments entsteht bei einer der beiden möglichen Orientierungen wieder ein durchgehender Leserahmen welcher für eine rekombinante ACMS II kodiert
R V A Y V V A D G G T A P D G L R E A ACMS I T cgcctcgtcgcctacgtcgtcgcggacggcggaacggccccggacggtctgcgcgaggccctc
(bp Pos 5899) (bp Pos 5932)
modifizierte R L V A Y V R E A
ACMS I cgcctcgtcgcctacgtagtcgcggacggcggaacggccccggactacgtacgcgaggccctc
SnαBI nαBl
(bp Pos 5899) (bp Pos 5932) N-Met ylierungs-Domane I V A D L L T D aus der ACMS I I I gatATCGTCGCGGAC CTGCTCACCGATate
(1263 bp PCR-Fragment) EcoRl EcoRV
rekombinante R L V A Y I V A D L T D V R E A
ACMS II cgcctcgtegeetacATCGTCGCGGAC CTGCTCACCGATgtacgcgaggcccte ..
(in Plasmid pACMOO-C) (bp Pos 5899) (bp Pos. 7156)
Das Gen der rekombinanten ACMS II (in Plasmid pACMOO-C, Abbildung 7) wurde in Streptomvces hvidans transformiert und die neu eingeführte N-Methyltransferase-Aktivitat der rekombinanten PPS wie in Beispiel 4 beschrieben nachgewiesen
2 Detaillierte Beschreibung der einzelnen Klonierungsschritte
Zur Einfuhrung der .S/.αÄ/-Schnιttstellen wurden der Bereich des acmB-Ge s von bp Pos. 4591 bis 5899 mit den Oligonukleotiden pnm-G und pnm- (PCR-Fragment 1 in Abbildung 6) sowie der Bereich von bp Pos 5932 bis 6251 mit den Oligonukleotiden pnm-\ und pnm-J (PCR- Fragment 2 in Abbildung 6) durch PCR amplifiziert Danach wurde zuerst das PCR-Fragment 2 als 330 bp Hindlfl-EcoR -Fragment in pBlueScnpt kloniert und dann das PCR-Fragment 1 als 1386 bp Clal-SnaBI-Fxagment eingesetzt. Hierdurch entsteht ein DNA-Fragment, welches für die fast vollständige Aktivierungsdomane von Modul 2 der ACMS II kodiert und in welches eine Snαß/-Schnιttstelle eingeführt wurde (A in Abbildung 6) In diese '/7αß/-Schnittstelle wurde anschließend ein 1263 bp EcoRV-EcoR F-Fragment eingesetzt, welches von einem 3849 BαmHl- Fragment aus dem Gen der ACMS III (αcmC, die Sequenz ist beigefugt) durch PCR mit den Oligonukleotiden pnm-K und pnm-L amplifiziert wurde (PCR-Fragment 3 in Abbildung 6) Die Orientierung des inserierten EcoRl -EcoRl '-Fragments welches für die N-Methyltransferase- Domane der ACMS III kodiert, wurde mittels DNA-Sequenzierung überprüft Durch die Fusion der £coRF-Enden mit den .SπoßZ-Enden konnte die zusammengesetzte Aktivierungsdomane dann komplett als 2961 bp Clαl-EcoR F-Fragment isoliert werden und wurde in das Plasmid pACMOO-A (aus Beispiel 1) kloniert und hierdurch das ursprünglich in pACMOO-A vorhandene Clαl-EcoRV- Fragment ausgetauscht Das erhaltene Plasmid wurde mit BαmHI und Hindin geschnitten und der Streptomyceten-Anteil aus Plasmid pSPIJ004 (Abbildung 4) als 5130 bp Bglll-Hindlll- Fragment eingesetzt Hierdurch entsteht das Plasmid pACMOO-C (Abbildung 7), welches sowohl in E coh als auch in Streptomyceten transformiert und selektioniert werden kann
Beispiel 4 Expression rekombinanter PPS mit eingeführter N-Methyltransferase-Domane und in vitro Testung ihrer N-Methyltransferase-Aktivitat.
Zur Expression der in den Beispielen 2 und 3 konstruierten PPS-Gene wurden die dort beschriebenen Plasmide pACMOO-B und pACMOO-C (Abbildung 7) in Streptomvces hvidans (Stamm TK64) transformiert Die Transformation sowie die mikrobielle Kultivierung von
Streptomyceten erfolgte nach Standardprotokollen (Hopwood et al (1985) Genetic manipulation of Streptomyces A laboratory manual The John Innes Foundation, Norwich, England) Die
Reinigung der plasmidkodierten PPS aus den Transformanten erfolgte jeweils aus 1 Liter YEME Kulturmedium nach dem Erreichen der stationären Wachstumsphase (3 Tage Wachstum) Die
Reinigung der PPS auf einen für die Analyse notwendigen Reinheitsgrad beruht im wesentlichen auf einem bereits detailliert beschrieben Protokoll (Schauwecker et al (1998) J Bacteπol
180 2468-2474) und wird deshalb im Folgenden nur schematisch erläutert Zur Freisetzung von
Proteinen wurden die Zellen mechanisch aufgebrochen (French-Press) Die ebenfalls freigesetzte genomische DNA wurde durch eine Inkubation mit DNAse I gespalten um eine dünnflüssige Suspension zu erhalten Zelltrummer wurden durch Zentπfugation entfernt und Proteine anschließend durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 55% gefallt Die gefällten Proteine wurden durch eine Ausschlußchromatographie (Saulenmatπx Ultrogel-AcA-34 von Biosepra) nach Große aufgetrennt Proteinfraktionen mit Proteinen einer Große von mehr als 200 kDa wurden vereinigt und weiter über einen Anionenaustauscher (Saulenmatπx Q-Sepharose FF von Pharmacia) aufgereinigt Die an den Anionenaustauscher gebundenen Proteine wurden durch kontinuierliche Zugabe von NaCI vom Anionenaustauscher freigesetzt Die in den Beispielen 2 und 3 konstruierten PPS eluierten in einem Bereich zwischen 150 bis 250 mM NaCI Die nach diesem Protokoll partiell gereinigten PPS können dann beispielsweise nach folgenden Vorschriften weiter analysiert werden
Beispielvorschπft zum in vitro Nachweis der spezifischen Erkennung und Bindung von Aminosäuren an eine PPS
100 μl angereinigte PPS werden mit mit 3 μl 14C-markιerter Substrataminosaure (100 μCi/ml), 2 μl MgCI2 (1 M) und 15 μl ATP (0,1 M) gemischt und für 30 min bei 30°C inkubiert Die PPS wird durch Zugabe von 2 ml 7% Tπchioressigsaure (TCA) gefallt, mit 10 ml 5% TCA gewaschen und die am Enzym gebundene Menge der Substrataminosaure durch Messen der Radioaktivität bestimmt
Beispielvorschπft zum in vitro Nachweis der durch eine PPS katalysierte N-Methylierung von Aminosäuren
Zum Nachweis der N-Methylierungs-Aktivitat wird die PPS wie oben beschrieben mit demarkierter Substrataminosaure inkubiert dem Ansatz aber noch zusätzlich 3 μl 0,1 M S- Adenosyl-Methionin (SAM) als Donor für die auf die Aminosäure übertragene Methyigruppe zugesetzt Nach der TCA-Fallung wird die PPS mit 4 ml 5% TCA (zwei Portionen) und danach mit 2 ml Ethanol gewaschen und bei 37°C getrocknet Durch Zugabe von 300 μl Perameisensaure und einer Inkubation für 6 Stunden bei 20 °C wird die als Thioester gebundene Substrataminosaure freigesetzt Der Ansatz wird anschließend im Vakuum bis zur Trockene eingeengt Die Aminosäure wird durch Zugabe von 40 μl Ameisensaure gelost und die Umwandlung in die N-methylierte Form beispielsweise durch chromatographische Methoden nachgewiesen Für die Umwandlung von Valin in N-Methyl-Valm kann beispielsweise folgendermaßen verfahren werden 20 μl von der PPS freigesetzten ( 4C-markιerte) Aminosäure wird parallel mit 5 μl der entsprechenden Referenzen (0 1 M Valin und 0,5 M N-Methyl-Valm) auf einer Kieselgel 60 DC-Folie (Merck) mit dem Laufmittel n-Butanol Essigsaure H20 (Volumen 80 20 20) chromatographiert Die Aminosäuren werden durch eine Ninhydnnreaktion, und einem Autoradiogramm für die 14C- markierte Substrataminosaure sichtbar gemacht
Beispielvorschπft zum in vitro Nachweis der durch eine PPS katalysierten Bildung von Peptiden
Grundsätzlich kann ein Peptid durch saure Hydrolyse und anschließendem Nachweis der einzelnen Ammosaurekomponenten auf einfachem Wege analysiert werden Dies tπfft besonders auf Peptide zu, welche durch PPS gebildet werden da die Ammosauresequenz des synthetisierten Peptids durch die Anordnung der Module bereits bekannt ist Durch den Einsatz von 14C-markιerten Aminosäuren kann die Analyse des in vitro gebildeten Peptids beispielsweise wie folgt durchgeführt werden 100 μl angereinigte PPS wird mit allen Substrataminosauren der PPS (jeweils 2 mM), SAM (2 mM), ATP (10 mM) und MgCI2 (20 mM) in einem Gesamtvolumen von 150 μl für 25 min bei 30°C inkubiert Gegebenenfalls können der Inkubation auch weitere Enzyme, welche mit der zu testenden PPS zusammenarbeiten zugesetzt werden (Pfennig et al (1999) JBC 274 12508-12515) Es werden mehrere Inkubationen parallel angesetzt, wobei sich die Zahl der Ansätze nach der Anzahl der Module in der PPS richtet und in jedem Ansatz die dem Modul entsprechende Aminosäure 14C-markιert eingesetzt wird Aus jedem Ansatz wird die PPS wie oben beschrieben mit TCA gefallt das Syntheseprodukt mit Performsaure abgespalten und das gebildete Peptid nach dem Einengen in Ethanol Wasser (Volumen 1 1) gelost und durch chromatographische Methoden nachgewiesen Zum Nachweis der Threonyl-N-methyl-Valin Peptidverknupfung durch die in Beispiel 2 und 3 konstruierte PPS kann beispielsweise folgendermaßen verfahren werden 20 μl des von der PPS freigesetzten Peptids aus jedem Ansatz (ein Ansatz mit 14C-markιertem Threonm und ein Ansatz mit 1 C-markιertem Valin) werden auf einer Kieselgel 60 DC-Folie (Merk) mit dem Laufmittel n-Butanol Eisessig H20 (Volumen 80 20 20) chromatographiert Die bei beiden Ansätzen entstehenden Produkte mit identischem Rf-Wert werden durch Extraktion mit Ethanol Wasser (Volumen 1 1) isoliert, im Vakuum eingeengt und die Ammosaren durch saure Hydrolyse (6 N HCI 110°C 20h) aus den Peptiden freigesetzt Die Identifikation der freigesetzten 1 C-markιerten Aminosäuren erfolgt durch erneute Chromatographie auf DC-60 Platten mit dem gleichen Laufmittel Hierdurch können die Komponenten Threonm und N-Methyl-Valm im gebildeten Peptid nachgewiesen werden Besteht ferner die Möglichkeit ein Referenz-Peptid auf chemischen Weg zu synthetisieren kann dieses direkt mit dem enzymatisch gebildeten und 14C-markιerten Peptid verglichen werden beispielswseise durch HPLC mit einer zur Trennung von Peptiden geeigneten Säule wie der SuperPac Pep-5 - Säule von Pharmacia Tabellen und Abbildungen
Tabelle 1
Verwendete Ausgangsplasmide zur Durchführung der Beispiele
Figure imgf000013_0001
Abkürzungen: Tsr = Thiostrepton; Amp = Ampiciliin;
Tabelle 2
Bei den Beispielen verwendete PCR-Oligonukleotide
Figure imgf000014_0001
Nukleotidsequenz des bei der Durchführung der Beispiele verwendeten -B H-Fragments aus dem acmC - Gen
Nukleotidsequenz Nummeπerung der Basenpaare
GGATCCACCT GCTCGACACC GCCACCGCCC AACCCGAGCA GCCCCTCAGC CGCATCGACG 0000000060 TCCTCACCCC GGAGGAGAGG AACCGCACGA TCGTCGAGGT CAACCGGACC GAACTGCCGC 0000000120 TGCCCGACGC CTCGTTGGCG GAGCTGTTCG AACAACAGGT GACCCTCACA CCCGACGCCC 0000000180 CCGCCCTGGT CAGCGACGGC GCCACGCTCA GCTACTCCGA GCTCAACACG CGCGCCAACC 0000000240 ACCTCGCCCA CCAGCTCACC ACCCGGGGCA TCCGCCCCGG CGACGCCGTC GCCGTCCTCC 0000000300 TCCAACGCTC CCCCGACACC GTCACCACCG TCCTCGCCCT CGCCAAGACC GGCGCGACCT 0000000360 ACATCCCCCT CGACAGCCGC TACCCCGCCG ACCGCTACCG CCTCGTCCTC GACGAGACCC 0000000420 GCACCAAACT CCTCATCACC GACCACACCA CCGACCTCGA CACCACCACA ACCCAGTTCA 0000000480 ACCCCGCCGA CACCCCCCAC GACGGCGAAG ACCCCGGCAA CCCGAACCAC ACCACCCACC 0000000540 CCGACGACGC CGCCTACATC ATGTACACCA GCGGCTCCAC CGGCCGCCCC AAGGGCGTCA 0000000600 TCGCCACCCA CCGCAACATC ACCGCCCTCG CCCTCGACCC CCGCTTCGAC CCCACCGCCC 0000000660 ACCGCCGCGT CCTCCTCCAC TCCCCCACCG CCTTCGACGC CTCCACCTAC GAGATCTGGG 0000000720 TCCCCCTCCT CAACGGCAAC ACCGTCGTCC TCGCCCCCAC CGGCGACCTC GACGTCCACA 0000000780 CCTACCACCG CGTCATCACC GACCAGCAGA TCACCGCCCT CTGGCTGACC AGCTGGGTCT 0000000840 TCAACCTCCT CACCGAGCAG AGCCCGGAGA CCTTCACCCG GGTCCGGCAG ATCTGGACCG 0000000900 GCGGCGAGGC CGTCTCCGGC GCCACCGTCA CCCGGCTTCA GCAGGCATGC CCCGACACCA 0000000960 CCGTGGTCGA CGGCTACGGC CCCACCGAGA CCACCACCTT CGCCACCCAC CACCCCGTCC 0000001020 CCACCCCCTA CACCGGCTCC GCCGTCGTCC CCATCGGCCG CCCCATGGCC ACCATGCACA 0000001080 CCTACGTGCT CGACGACAGC CTCCAGCCCG TCGCCCCCGG CGTCACCGGC GAGCTCTACC 0000001140 TCGCTGGCAG CGGCCTCGCC CGCGGCTACC TGGACCGCCC CGCCCTCACC GCCGAACGCT 0000001200 TCGTCGCCAA CCCGTACGCC GCACCCGGAG AACGCATGTA CCGCACCGGC GACCTGGCAC 0000001260 GCTGGAACCC CGACGACCAC CTCGAGTACG CCGGCCGCGC CGACCACCAG GTCAAGGTCC 0000001320 GCGGCTTCCG CATCGAACCC GGCGAGATCG AGAACGTCCT CACCGACCAT CCCGCCGTCG 0000001380 CCCAGGCCGC CGTCCACCTC AACCGGGACC AGCCCGGCAA CCCCCGGCTC GTCGCGTACG 0000001440 TCGTCGCGGA CACCTCGGCG CCGAGCAGCG ATGTGGACCA GCAGCACCAG ATCGGCGAGT 0000001500 GGCAGGACCT CTACGACTCC CTCTACGCGG CCCCCACGGC CGAGTTCGGC GAGGACTTCT 0000001560 CCGGCTGGAA CAGCAGCTAC GACGGCCGGC CGATCCCCCT CGACCAGATG CGGGAGTGGC 0000001620 GCGACGCCAC CGTGGAACGC ATCCGCGGCC TCAACCCGCG CCGGGTGCTG 6AGATCGGCG 0000001680 TCGGCACGGG CCTGCTGCTC GCGAAGCTGG CCCCCGAGTG CGAGGAGTAC TGGGGCACGG 0000001740 ACCTCTCGCC CACCGTGATC GAGGCGCTCT CCCGGCACGT CGACGCCGAC CCGGAGCTGG 0000001800 CCCGGCGGGT CACCCTGCGG GCCGGTGCCG CGCACGAGCA CGAGGGGCTG CCCGTCGGCC 0000001860 ACTTCGACAC CGTCGTGCTC AACTCCGTGG TCCAGTACTT CCCGAACGCC GACTACCTCG 0000001920 CCCAGGTCAT CGAGCAGGCG CTSCGGCTGC TGGCCCCCGG CGGCGCCGTG TTCATCGGCG 0000001980 ACATCCGCAA CCCGCGGCTG CTGCGCACCT TCACCACCGC CGTCCAGACC GCCCGCGCGG 0000002040 AGGACCCGGC CGACACCGCC GCCGTGCGGC GCGCCGTCGA GCAGAGCCTG GTGCTGGAGA 0000002100 AGGAACTCCT GGTCGACCCG GAGTACTTCA CCGCGCTCAC CCACCGCCTC CCGGACCTCG 0000002160 CCGGCGTCGA CCTGCGGCTC AAGTGCGGCG CCGCCCACAA CGAGTTGACC CGCTACCGCT 0000002220 ACGACACCAC GCTCCACAAG GCCGGAATCA CCGCGCTCCC GCTGTCCGAG GCCGCCGTCC 0000002280 TGGCCTGGCC GCAGGACGCC GAGGCACTCG CCCGGCACCT GGCCGAGGCC CGGCCGGAGC 0000002340 GGCTGCGCGT CACCGGCGCG CCCAACTCCC GGATAGCCGC CGACCTCGCG GCCCAGCACG 0000002400 CCCTGGAGTC CGGCACCGCC CCGGCCGGGC CCCCGACCGG GCCCTACGCC ACGGAGCAGC 0000002460 CGGACCTCGA GGCACTCCAC CGCCTCGGGG AGGACCACGG GTACTGGACG GCCGTCACCT 0000002520 GGTCCGCCCA CCGCCCCGAC ACCGTCGACC TCACCTTCGT CCGGCGCGGC CTGCTCGACG 0000002580 GCGCCGTCCC GGTCGGTACG TACGCCCCGG CGGCCGCCGG CGACCCGGCG ACGCCGCTCA 0000002640 CCGCCTTCAC CACCAACCCC GTCGGCAGCC GGGGCACCGC CGCGCTGCTC ACCGCGCTGC 0000002700 GCGAACACGC CGCCGCCCAA CTGCCCGACT ACATGCGGCC CGCCGCAATC GTCCCGCTCG 0000002760 ACCGCCTGCC GCTCACCGCC AACGGCAAGC TCGACCGGGC CGCCCTCCCG GCACTCGACC 0000002820 CGGAGCACGC GGACACCGGC CGCGCCCCCA GGACGCCGCA GGAGCAGGTG GTCTGCGAGC 0000002880 TGTTCGCGGA GGTGCTCGGC CGGCCGCTCG TCGGTGTGGA CCAGGACTTC TTCGACCTCG 0000002940 GCGGGCACTC GCTGCTCGCC ACCCGGCTGA TCGCCCGGCT GCGCGCCGCC TTCGGCGTGG 0000003000 AACTGGGCCT GCGCAGCCTC TTCGAGGCGC CGACGCCGGG CGGGATCGCC GCCCGGCTGG 0000003060 ACCTCQACGA CCCGGACGGC TCCTACGAGG TGGTGCTGCC GCTGCGCGCC CAGGGCAGCA 0000003120 GGCCGCCGCT GTTCTGCATC CACCCCGGTG GCGGCATCAG CTGGTCGTAC AGCGCGCTGA 0000003180 TC-AAGCACCT CGGCCCGGAG TACCCGCTGT ACGGCATCCA GGCGCGCAGC CTGGCCCGCC 0000003240 CGGAGCCGCG GCCGGAGAGC ATCGAGGAGA TGGCGGTGGA CTACGCCGAC CAGATCCAGG 0000003300 GCGTGCAGCC GCACGGCCCC TACCACCTGG CCGGCTGGTC GTTCGGCGGG CTGTGCGCCC 0000003360 ATGCCCTGGC CGCGGAGTTC CAGCGGCGCG GCGAGCCGGT GGCGCTGGTC GCGGTGCTCG 0000003420 ATGTGATCCC GAACTGGCAG GGGCTCACCC ACGACGACGT CCCGGCCCCC GACGACCGGG 0000003480 TGATGCTGCT GTACCACGTC GGCCTGGTCG ACGACGGCAG CCACCGCAAC GACCGCGAAG 0000003540 AGCTGACCTT CGCCAGGGCC CGCGAGATCC TGCGCCGCCA GGGCAGTGTG CTCGCCAACC 0000003600 TGGAGGAGGA CCGGCTCACC ACGATCACCG AGATCTCGGC CAACAACACC CATCTGACCG 0000003660 TCGACTACCA GCCCGGCCCG ATCGACGGCG ACCTGCTGCT GATCGCCGCC TCGGAACAGC 0000003720 AGGACCCGGC GGTCACCGCC GATGCCTGGC GGCCGTACGT CTGCGGCGCG GTCGAGGCCC 0000003780 ACGTGGTGCC CGGCGAGCAC GGCTCCATGC TGACCCGGCC CGGCACCCTG GCCGAGATCG 0000003840 GCCGGATCC 0000003849 Abbildung 1 zeigt den schematischen modularen Aufbau von PPS und die Unterteilung in funktionelie Domänen
Abbildung 2 zeigt die Modifikation von Aktivierungsdomanen durch Insertion einer N-
Methyltransferase-Domane
Abbildung 3 zeigt den Sequenzvergleich von ausgewählten Aktivierungsdomanen im
Bereich der Übergänge zu N-Methyltransferase-Domanen
Abbildung 4 zeigt die in den Beispielen verwendeten Ausgangsplasmide
Abbildung 5 zeigt die Einfuhrung einer £coRV-Restπktιonsschnιttstelle in acmB
Abbildung 6 zeigt die Klonierung von C/αI-£coRV-Kassetten für die Konstruktion rekombinanter acmB-Gene
Abbildung 7 zeigt Plasmide zur Expression der rekombinanten PPS-Gene

Claims

Patentansprüche
1 Verfahren zur Einfuhrung von N-Methyltransferase-Domanen in PPS-Aktivierungsdomanen durch gezielte Veränderung und Kombination der entsprechenden DNA-Abschnitte von Polypeptidsynthetase-Genen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen für die N-Methyltransferase-Aktivitat einer beliebigen Aktivierungsdomane mit N-Methyltransferase-Aktivitat kodierenden DNA-Abschnitt als integralen Bestandteil in ein DNA-Segment, das für die umzuwandelnde Aktivierungsdomane kodiert, einfugt oder dieses DNA-Segment insgesamt gegen einen eine beliebige Aktivierungsdomane mit N-Methylierungsdomane kodierenden DNA- Abschnitt austauscht
2. Verfahren zur Herstellung von Polypeptidsynthetasen mit N-Methyltransferase- Aktivitat, dadurch gekennzeichnet, daß man in Polypeptidsynthetase-Genen einen für die N-Methyltransferase-Aktivitat einer beliebigen Aktivierungsdomane mit N- Methyltransferase-Aktivitat kodierenden DNA-Abschnitt als integralen Bestandteil in ein DNA-Segment, das für die umzuwandelnde Aktivierungsdomane kodiert, einfügt oder dieses DNA-Segment insgesamt gegen einen eine beliebige Aktivierungsdomane mit N-Methyltransferase-Aktivitat kodierenden DNA-Abschnitt austauscht, das neue Gen in geeigneten Sytemen transformiert und die rekombinante Polypeptidsynthetase exprimiert
3 Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das für die N-Methyltransferase-Domane kodierende DNA-Fragment zusammen mit DNA-Linker-Sequenzen inseriert wird
4 Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Insertion der
DNA-Sequenz, welche für eine N-Methyltransferase-Domane kodiert, gleichzeitig auch DNA-Sequenzen verändert werden, welche für die ACP-Domane oder Aktivierungs-Domane oder Kondensationsdomane kodieren 5 Verwendung der nach Anspruch 1 und den Ansprüchen 3-4 hergestellten DNA-Sequenzen für die Veränderung naturlicher PPS-Gene, bereits veränderter PPS-Gene oder Teilen davon, sowie die Verwendung zur Neukonstruktion von PPS-Genen oder Teilen davon
6 Verwendung der nach Anspruch 1 und den Ansprüchen 3-5 hergestellten DNA-Sequenzen für die Veränderung naturlicher Gene von Polyketidsynthetasen (PKS), bereits veränderten PKS-Genen oder Teilen davon, sowie die Verwendung zur Neukonstruktion von PKS-Genen oder Teilen davon
7 Verwendung der nach Anspruch 1 und den Ansprüchen 3-6 hergestellten DNA-Sequenzen für die Konstruktion von Plasmiden und genetisch veränderten Organismen zur Synthese der durch die DNA-Sequenzen kodierten Proteine
8 Verwendung der nach Anspruch 7 hergestellten Proteine zur enzymatischen in vivo und in vitro Synthese von Aminosäuren, Polypeptiden und Peptidyl-Acetyl-Mischstrukturen, welche N-methylierte Aminosäuren oder deren Derivate enthalten
9 Verwendung der nach Anspruch 7 hergestellten Proteine zur fermentativen
Synthese von Aminosäuren, Polypeptiden und Peptidyl-Acetyl-Mischstrukturen, welche N-methylierte Aminosäuren oder deren Derivate enthalten, wobei die Fermentation sowohl mit als auch ohne Zufutterung von Aminosäuren, Acetaten oder anderen organischen Zwischenprodukten erfolgen kann
10 Polypeptidsynthetasen, deren Aktivierungsdomanen ohne N-Methyltransferase- Aktivitat ganz oder teilweise in Aktivierungsdomanen mit N-Methyltransferase- Aktivitat umgewandelt worden sind
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