WO2003074088A2 - Kopplung niedermolekularer substanzen an hydroxyalkylstärke - Google Patents

Kopplung niedermolekularer substanzen an hydroxyalkylstärke Download PDF

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WO2003074088A2
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Definitions

  • a recently pursued approach to remedy the problems described is the coupling of such problematic substances to readily soluble biocompatible polymers, such as. B. polyethylene glycol and dextran.
  • the coupling allows the molecular weight to be increased beyond the threshold of 70 kD, so that the plasma residence time of smaller molecules can be increased drastically, and the hydrophilic polymer component can also improve solubility in the aqueous environment.
  • the object of the invention is therefore to provide such alternatives and to develop simple and efficient methods for producing such alternative conjugates.
  • hydroxyalkyl starch conjugates which are characterized in that the binding interaction between the hydroxyalkyl starch molecule and the low molecular weight substance is based on a covalent bond, which is the result of a coupling reaction between the terminal aldehyde group or one of these Is the functional group of the hydroxyalkyl starch molecule resulting from chemical reaction and a functional group of the low molecular weight substance which is reactive with this aldehyde group or the functional group of the hydroxyalkyl starch molecule resulting therefrom, the bond resulting directly from the coupling reaction possibly being modified by a further reaction to form the covalent bond mentioned above.
  • the invention further encompasses pharmaceutical compositions containing these conjugates, the use of these conjugates and compositions for the prophylactic or therapeutic treatment of the human or animal body, and methods for producing these conjugates and compositions.
  • the hydroxyalkyl starch (HAS) used according to the invention can be prepared by a known method, e.g. B. Hydroxyalkylation of starch at the C 2 - and / or C ⁇ position of the anhydroglucose units with alkylene oxide or 2-chloroalkanol, for. B. 2-chloroethanol (see, for example, US 5,218,108 for the hydroxyethylation of starch), with various desired molecular weight ranges and degrees of substitution. Any of the commercially available preparations can also be used.
  • hydroxyalkyl starch includes methyl, ethyl, isopropyl and n-propyl, with ethyl being particularly preferred.
  • HES hydroxyethyl starch
  • the average molecular weight of the hydroxyalkyl starch can range from about 3 kD to several million Daltons, preferably from about 10 kD to about 2000 kD, more preferably from about 70 kD to about 1000 kD, particularly preferably from about 130 kD.
  • the average molecular weight of the hydroxyalkyl starch is preferably selected so that the glomerular threshold of 70 kD is exceeded for the conjugates.
  • the degree of substitution (ratio of the number of modified anhydroglucose units to the number of total anhydroglucose units) can also vary and will often range from about 0.2 to 0.8, preferably about 0.3 to 0.7, more preferably about 0.5 , (Note: The numbers refer to the "Degree of Substitution", which is between 0 and 1).
  • the ratio of C 2 - to C ⁇ substitution is usually in the range from 4 to 16, preferably in the range from 8 to 12.
  • the functional group of the hydroxyalkyl starch molecule involved in the coupling reaction is the terminal aldehyde group or a functionality resulting from this by chemical reaction.
  • Such a chemical reaction is the selective oxidation of this aldehyde group with a suitable oxidizing agent, such as. B. iodine, bromine or some metal ions, or by means of electrochemical oxidation to a carboxyl group or activated carboxyl group, e.g. B. an ester, lactone, amide, wherein the carboxyl group is optionally converted into the activated derivative in a second reaction.
  • a suitable oxidizing agent such as. B. iodine, bromine or some metal ions
  • electrochemical oxidation to a carboxyl group or activated carboxyl group, e.g. B. an ester, lactone, amide, wherein the carboxyl group is optionally converted into the activated derivative in a second reaction.
  • This carboxyl group or activated carboxyl group can then be coupled to a primary amino or thiol group of the low molecular weight substance to form an amide bond or thioester bond.
  • Another possibility is
  • a conjugate according to the invention can also be obtained by reacting the low molecular weight substance with a suitable physiologically compatible bifunctional linker molecule to introduce a desired functional group.
  • the remaining reactive group of the coupled linker molecule is also regarded as a “reactive functional group of the low molecular weight substance” for the purposes of the present invention.
  • Suitable linker molecules contain at one end a grouping which is linked to a reactive functional group of the low molecular weight substance, e.g. B. an amino, thiol, carboxyl or hydroxy group, a covalent bond, and at the other end a group that with the terminal aldehyde group or a functional group resulting therefrom by chemical reaction, for. B. a carboxyl group, activated carboxyl group, amino or thiol group, can also enter into a covalent bond.
  • a biologically compatible bridge molecule of suitable length e.g. B. a group derived from an alkane, an (oligo) alkylene glycol group or another suitable oligomer group.
  • Preferred groups that can react with amino groups are e.g. B. N-hydroxysuccinimide esters, sulfo-N-hydroxysuccinimide esters, imido esters or other activated carboxyl groups; preferred groups that can react with thiol groups are, for example, maleimide and carboxyl groups; preferred groups that can react with aldehyde or carboxyl groups are e.g. B. amino or thiol groups.
  • linker molecules for linking SH and NH functions are:
  • AMAS N- ⁇ (maleimidoacetoxy) succinimide ester
  • BMPS N-ß (Maleimidopropyloxy) succinimide ester
  • linker molecules for linking SH and SH functions are:
  • BM (PEO) 4 (1.11-bis-maleimidotetraethylene glycol).
  • exemplary linker molecules for linking NH and NH functions are:
  • EGS ethylene glycol bis (succinimidyl succinate).
  • linker molecules for linking SH and CHO functions are:
  • BMPH N- (ß-maleimidopropionic acid) hydrazide TFA
  • PDPH (3- (2-pyridyldithio) propionylhydrazide).
  • An exemplary linker molecule for linking SH and OH functions is PMPI (N- (p-maleimidophenyl) isocyanate).
  • BMPA N-ß-maleimidopropionic acid
  • linker molecules for converting an NH function into a COOH function are MSA (methyl-N-succinimidyl adipate) or longer-chain homologs thereof or corresponding derivatives of ethylene glycol.
  • Exemplary linker molecules for converting a COOH function into an NH function are DAB (1,4-diaminobutane) or longer-chain homologs thereof or corresponding derivatives of ethylene glycol.
  • An exemplary linker molecule that reacts with an amino group of a molecule and provides a protected amino group at a greater distance from this molecule to avoid steric hindrance is TFCS (N- ⁇ (trifluoroacetylcaproyloxy) succinimide ester).
  • linker molecules are known to those skilled in the art and are commercially available or can be designed as required and depending on the available and desired functional groups of the HAS and the low molecular weight substances to be coupled and can be prepared by known processes.
  • the terminal aldehyde group of the HAS is with a molar excess of iodine, preferably in a molar ratio of iodine to HAS of 2: 1 to 20: 1, particularly preferably about 5: 1 to 6: 1, in aqueous basic solution selectively oxidized.
  • a molar excess of iodine preferably in a molar ratio of iodine to HAS of 2: 1 to 20: 1, particularly preferably about 5: 1 to 6: 1, in aqueous basic solution selectively oxidized.
  • an amount of hydroxyalkyl starch is first dissolved in warm distilled water and a little less than 1 mol equivalent of aqueous iodine solution, preferably in a concentration of about 0.05-0.5 N, particularly preferably about 0.1 N , admitted.
  • an aqueous NaOH solution in a molar concentration that is about 5-15 times, preferably about 10 times the iodine solution is slowly added dropwise at intervals of several minutes to the reaction solution until the solution begins after the addition become.
  • a little less than 1 molar equivalent of the above aqueous iodine solution is again added to the reaction solution, the dropping of the NaOH solution is resumed and the addition of iodine and NaOH is repeated until about 5.5-6 molar equivalents of iodine solution and 11-12 molar equivalents of NaOH Solution, based on the hydroxyalkyl starch, have been added.
  • reaction solution is desalted, for example by dialysis or ultrafiltration, subjected to cation exchange chromatography and the reaction product is obtained by lyophilization.
  • the selective oxidation with alkaline stabilized solutions of metal ions for. B. Cu ++ or Ag + , also in approximately quantitative yield (Example 2).
  • An approximately 3-10-fold molar excess of the oxidizing agent is preferably used.
  • the selectively oxidized hydroxyalky starch is then reacted in a suitable organic solvent with a primary amino group of the desired low molecular weight substance to form an amide bond.
  • Preferred solvents were selected from the group of polar, non-protic solvents; dimethyl sulfoxide (DMSO) was particularly preferably used.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the coupling of selectively oxidized hydroxethyl starch (ox-HES) to various model compounds went smoothly even in the absence of an activator.
  • the coupling reactions preferably take place in the presence of a carbodiimide, more preferably in the presence of DCC (dicyclohexyldicarbodiimide), most preferably in the presence of EDC (1- (3-dimethylamino-propyl) -3-ethylcarbodiimide).
  • the reactive group of the hydroxyalkyl starch molecule can also be an amine or thiol group formed by chemical reaction of the terminal aldehyde group.
  • reductive amination of the aldehyde group can be carried out by reaction with ammonia in the presence of hydrogen and a catalyst or in the presence of sodium cyanoborohydride.
  • the resulting amine or thiol group can then react with a free carboxyl group or aldehyde group of the low molecular weight substance.
  • Amide or thioester bonds or Schiff bases are initially formed, which can optionally be modified by a further reaction.
  • the terminal aldehyde group of the hydroxyalkyl starch molecule or a functional group resulting therefrom by chemical reaction can also be reacted with a suitable physiologically compatible, bifunctional linker molecule.
  • the "functional group resulting from the terminal aldehyde group of the hydroxyalkyl starch molecule by chemical reaction" is the remaining reactive functional group of the bifunctional linker molecule with which the terminal aldehyde group or the functional group resulting therefrom has been reacted. In this way, the terminal aldehyde group can also be converted into a desired functional group.
  • Suitable linker molecules contain at one end a grouping which is linked to the terminal aldehyde group or a functional group resulting therefrom by chemical reaction, e.g. B. a carboxyl group, activated carboxyl group, amino or thiol group, can enter into a covalent bond, and at the other end a group that with a reactive functional group of the low molecular weight substance, for. B. an amino, thiol, carboxyl or OH group, preferably aryl-OH group, can enter into a covalent bond. Between the two functional groups of the linker molecule there is a biologically compatible bridge molecule of suitable length, e.g. B.
  • Preferred groups that can react with amino groups are e.g. N-hydroxysuccinimide esters, sulfo-N-hydroxysuccinimide esters, imido esters or other activated carboxyl groups; preferred groups that can react with thiol groups are e.g. Maleimide and carboxyl groups; preferred groups that can react with aldehyde or carboxyl groups are e.g. Amino or thiol groups.
  • Preferred reducing agents are sodium borohydride, sodium cyanoborohydride, organic boron complexes, e.g. a 4- (dimethylamino) pyridine boron complex, N-ethyldiisopropylamine boron complex, N-ethylmorpholine boron complex, N-methylmorpholine boron complex, N-phenylmorpholine boron complex, lutidine boron complex, triethylamine boron complex, trimethylamine boron complex;
  • Suitable stereoselective reducing agents are, for example, sodium triacetate borohydride, sodium triethyl borohydride, sodium trimethoxy borohydride, potassium tri-sec-butyl borohydride (K-Selectride), sodium tri-sec-butyl borohydride (N-Selectride), lithium tri-sec-butyl borohydride (L-Selectride) ), Potassium tria
  • the coupling reaction of HAS or oxidized HAS to a low molecular weight substance is preferred in an organic solvent, more preferably a polar, non-protic solvent, in which the HAS and preferably because of the expected poor water solubility of the substance and the poor stability of the lactone in an aqueous medium the low-molecular substance is also soluble.
  • Suitable solvents for HAS are e.g. B. DMSO, glycol, diglycol, triglycol and N-methylpyrrolidone. It is also possible to use mixtures of DMSO with other solvents if the low molecular weight substance is not soluble in DMSO or another preferred solvent for HAS. However, the reaction can sometimes also be carried out advantageously in a heterogeneous phase.
  • the molar ratio of HAS to low molecular weight substance in the coupling reaction is usually about 20: 1 to 1: 1, preferably about 5: 1 to 1: 1.
  • the coupling yields are usually more than 40%, often more than 60% and not infrequently more than 80% (see examples).
  • the low-molecular substance to be coupled is preferably an active pharmaceutical ingredient whose solubility in an aqueous medium and / or whose bioavailability, stability and residence time in the body are to be increased.
  • the term “low molecular weight substance” is also intended to include peptides of up to about 50 amino acids.
  • the active pharmaceutical ingredient is preferably from the group consisting of antibiotics, antidepressants, antidiabetics, antidiuretics, anticholinergics, antiarrhythmics, antiemetics, antitussives, antiepileptics, antihistamines, antifungal agents, antifungal agents, antifungal agents Antithrombotics, androgens, antiandrogens, estrogens, antiestrogens, antiosteoporosis agents, antitumor agents, vasodilators, other antihypertensive agents, antipyretic agents, painkillers, anti-inflammatory agents, ⁇ -blockers, immunosuppressants and vitamins are selected.
  • active pharmaceutical ingredients with an NH 2 group as reaction partner of the coupling with HAS are:
  • Preferred examples of active pharmaceutical ingredients with an NH 2 group as reactants for coupling with HAS are 6-aminopenicillinic acid, 7-aminocephalosporinic acid, 7-aminocephalosporanic acid and 7-aminopenicillanic acid.
  • Taxol and palcitaxel are specific examples of such active substances with an aliphatic OH group as reaction partner of the coupling with HAS.
  • the reaction products of the chemical coupling described above can be examined by known methods and the coupling efficiency can be determined.
  • a UV calibration curve can be created for the low-molecular substance in question and used to determine the content of low-molecular substance in the sample or the proportion of the low-molecular substance in the coupling product. If the low molecular weight substance shows no UV absorption, corresponding colorimetric or electrochemical detection methods can be developed in analogy to known methods.
  • the saccharide portion in the conjugate is specific, for example, by a glycan Coloring of the separated reaction products is detectable. A quantitative glycan determination is also possible.
  • the coupling yield of reactions involving primary amines could also be determined by derivatizing the unreacted amines with fluorescamine and determining the fluorescence.
  • the improved solubility in water can be checked simply by trying solutions.
  • the increased hydrophilicity can be determined using an OECD method for determining the logP value. This correlates the retention time of substances in RP-HPLC with the distribution coefficient in an n-octanol / water mixture. All of the HES conjugates according to the invention investigated with this method eluted in the exclusion volume of a C18 column, and therefore showed no interactions with the C18 material.
  • the conjugates of the present invention can optionally be used as such or in the form of a pharmaceutical composition for the prophylactic or therapeutic treatment of the human or animal body.
  • compositions comprise a pharmaceutically effective amount of a conjugate according to the invention as an active ingredient as well as a pharmaceutically suitable carrier and optionally other therapeutic or galenic ingredients or auxiliaries.
  • auxiliaries can e.g. B. include diluents, buffers, flavoring agents, binders, surfactants, thickeners, lubricants, preservatives (including antioxidants) and substances which serve to make the formulation isotonic with the blood of the intended recipient.
  • a pharmaceutically effective amount is that amount which is sufficient to have a desired positive effect when administered once or several times as part of a treatment for the relief, healing or prevention of a disease state.
  • a pharmaceutically acceptable carrier is a carrier that is compatible with both the drug and the patient's body.
  • compositions will vary depending on the desired or appropriate route of administration. Suitable routes of administration can for example be oral, parenteral, e.g. B. subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraarterial, intra-articular, intrathecal, extradural injection or optionally infusion, intranasal, intratracheal, rectal or topical administration.
  • routes of administration can for example be oral, parenteral, e.g. B. subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraarterial, intra-articular, intrathecal, extradural injection or optionally infusion, intranasal, intratracheal, rectal or topical administration.
  • the pharmaceutical compositions may conveniently be presented in unit dosage form and prepared by any of the methods well known in the pharmaceutical arts.
  • the HAS conjugates of the present invention can also be used in all other fields in which other polymer conjugates, e.g. B. PEG conjugates were used.
  • Some specific, non-limiting examples are the use of a HAS conjugate as an immobilized reaction partner for a reaction in a heterogeneous phase or as a column material for affinity chromatography. Further possible uses will be readily apparent to the person skilled in the art knowing the properties of the HAS conjugates according to the invention disclosed here.
  • the partially desalted solution was subjected to chromatography on a cation exchange column (Amberlite IR-120, H + form) in order to convert the aldonate groups into aldonic acid groups.
  • the water was then removed by lyophilization and the lactone form thus obtained.
  • alkaline copper reagent (3.5 g of Na 2 PO 4 , 4.0 g of K-Na tatrat in 50 ml of H 2 O, plus 10 ml of 1 N NaOH, 8.0 ml of 10% strength (wt ./Vol.) CuS0 4 solution and 0.089 g K-iodate in 10 ml H 2 0, after adding 18 g Na sulfate make up to 100 ml). It is heated at 100 ° C for 45 minutes. After cooling, 0.2 ml of 2.5% Kl solution and 0.15 ml of 2 MH 2 SO 4 are added.
  • Hydroxyethyl starches with a higher molar mass e.g. 130 kD, 250 kD, 400 kD
  • hydroxyethyl starches with a lower molar mass e.g. 10 kD, 25 kD, 40 kD
  • a solution of 0.24 mmol of HES-130 kD in 10 ml of deionized water was prepared with heating. This solution was heated in a 100 ml round-bottomed flask to a temperature of 70-80 ° C. and with 1.17 mmol stabilized Cu 2+ (e.g. Rochelle salt as stabilizer or other stabilizers) and dilute aqueous NaOH. Solution added (final concentration 0.1 N NaOH). The temperature was then raised to 100 ° C. and the reaction was allowed to continue until a reddish color had developed. The reaction was stopped and the reaction mixture was cooled to 4 ° C. The reddish precipitate was removed by filtration.
  • stabilized Cu 2+ e.g. Rochelle salt as stabilizer or other stabilizers
  • the filtrate was dialyzed against deionized water and then converted into the lactone as in Example 1.
  • the oxidation was quantitative (yield> 99%).
  • This method could also be used to oxidize low molecular weight HES (e.g. HES-10 kD, HES-25 kD, HES-40 kD) and higher molecular weight HES species (e.g. 130 kD, 250 kD, 400 kD).
  • the success of the coupling is determined using an analytical standard, e.g. B. gel permeation chromatography and ninhydrin test for free amino groups detected.
  • the yield of the coupling product was approximately 85% for the coupling with ox-HES-130 kD and approximately 80% for the coupling with ox-HES-10 kD lactone.
  • ox-HES-130 kD lactone 1.3 g of ox-HES-130 kD lactone were dissolved in 10 ml of N-methylpyrrolidone at 70 ° C. with stirring. 17 mg of daunorubicin (Fluka # 30450), dissolved in 3 ml of DMF, were added dropwise. The reaction mixture was stirred under these conditions for 20 hours, cooled to room temperature and finally shaken with 40 ml of distilled water. The majority of the solvents were removed by dialysis against water and then freeze-dried. The coupled daunorubicin was detected by RP-HPLC and UV-VIS detection.
  • Example 11 The reaction described in Example 11 was also carried out with 16 mg of 6-aminopenicillinic acid instead of 7-aminocephalosporin under the same conditions and the reaction product was worked up and analyzed under the same conditions.
  • EXAMPLE 13 The reaction described in Example 11 was also carried out with 16 mg of 6-aminopenicillinic acid instead of 7-aminocephalosporin under the same conditions and the reaction product was worked up and analyzed under the same conditions.
  • the resulting product was treated with GPC (Superose 12 , Amersham-Pharmacia, Sweden) and UV detection at 280 nm A stoichiometry of approximately 1: 1 for the coupling product resulted from the quantification of the peptide based on the Trp absorption and the quantification of the polysaccharide content by the phenol / sulfuric acid stain.
  • camptothecin 20 mg were dissolved in 5 ml of dry DMSO at 50 ° C. in a round bottom flask. 36 mg of 1,4-diaminobutane in 2 ml of dry DMSO were added dropwise to this solution. The reaction mixture was left for 24 hours under these conditions with gentle stirring. The conjugation product was purified by flash chromatography. The yield was approximately 83%.
  • the reaction mixture was further stirred for 24-36 h and then the pH was adjusted to 4 with 0.1 N HCl to stop the reaction.
  • the solution was desalted by dialysis and lyophilized.
  • the coupling product was verified by means of GPC and UV photometer.
  • doxorubicin (Fluka # 45584) were suspended in 4 ml of 0.1 N Na phosphate buffer (pH 7.5) at room temperature in the presence of a triple molar excess of HES-130 kD. The reaction mixture was stirred vigorously for 30 minutes and 3 ml of a 0.8 M NaBH 3 CN solution were slowly added. The reaction was kept under stirring for 48 hours at room temperature. It was then diafiltered with a 10 kD membrane to remove salts and unreacted doxorubicin. The diafiltered solution was lyophilized and the coupling product was examined with GPC and RP-HPLC.
  • 0.5 mg of daunorubicin hydrochloride, 829.2 mg of ox-HES 70 kD and 0.108 mg of DMAP were dissolved in 2 ml of DMSO in an argon atmosphere in a two-necked flask and heated at 70 ° C. for 24 h. Acetone (20 ml) was then added, the coupling product precipitating. The solution was centrifuged and the precipitate was washed several times with acetone and centrifuged. A slightly pink solid was obtained which was dissolved in water and dialyzed against water. After freeze-drying, 656 mg (80%) of a light pink solid are obtained. The purity of the coupled daunorubicin was checked by RP-HPLC.
  • Example d The reaction described in Example d was also carried out using 1.57 mg of 6-aminopenicillanic acid instead of 7-aminocephalosporanic acid and 135.54 mg of ox-HES 70 kD under the same conditions.
  • the reaction product was worked up and analyzed under the same conditions. After purification, 88 mg of coupling product (65%) were obtained as a white solid.
  • the reaction mixture was further stirred for 24-36 h and then the pH was adjusted to 4 with 0.1 N HCl to stop the reaction.
  • the solution was desalted by dialysis and lyophilized.
  • the coupling product was verified by means of GPC and UV photometer.
  • Glucagon (66 x 10 "9 mol, 0.23 mg), oxHES 70 kD (6.6 x 10 " 6 mol, 123 mg) are dissolved in 1 ml DMSO in a round bottom flask. At intervals of 1 h, 8 portions of DDC are added until a total of 23.08 mg have been added to the reaction solution. After a reaction time of 24 h, the reaction is stopped by adding 15 ml of water. The coupling product purified by dialysis against water. After freeze-drying, 79 mg of white coupling product (65

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Kopplung von niedermolekularen Substanzen an ein von Stärke abgeleitetes modifiziertes Polysaccharid, wobei die bindende Wechselwirkung zwischen dem modifizierten Polysaccharid und der nieder­molekularen Substanz auf einer kovalenten Bindung beruht, welche das Ergebnis einer Kopplungsreaktion zwischen der endständigen Aldehydgruppe oder einer aus dieser Aldehydgruppe durch chemische Umsetzung hervorgegangenen funktionellen Gruppe des modifizierten Polysaccharidmoleküls und einer mit dieser Aldehydgruppe oder daraus hervorgegangenen funktionellen Gruppe des Polysaccharidmoleküls reaktionsfähigen funktionellen Gruppe der niedermolekularen Substanz ist, wobei die bei der Kopplungsreaktion unmittelbar resultierende Bindung gegebenenfalls durch eine weitere Reaktion zur obengenannten kovalenten Bindung modifiziert sein kann. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die bei der Kopplung gebildeten Konjugate umfassen, und die Verwendung dieser Konjugate und Zusammensetzungen zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

Description

Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polvsaccharid
Es gibt eine Vielzahl niedermolekularer Substanzen von kommerziellem Interesse, insbesondere Arzneiwirkstoffe und Pflanzenschutzmittel, deren Einsatz durch unbefriedigende Löslichkeitseigenschaften im wässrigen Milieu und/oder geringe Verweilzeit im Körper eingeschränkt oder sogar verhindert wird. So werden beispielsweise kleine Arzneimittelmoleküle durch die glomeruläre Filtration in der Niere (Ausschlussgrenze etwa 70 kD) häufig zu schnell wieder aus dem Kreislauf entfernt, so dass eine ständige kostspielige und für den Patienten unbequeme Nachversorgung mit diesem Medikament, z. B. durch häufig wiederholte Verabreichungen oder Infusion, erforderlich ist.
Um diesen Nachteil zu umgehen, werden in einigen Fällen schwerlösliche Arzneiwirkstoffe als öliger Bolus verabreicht, der an der Injektionsstelle häufig schmerzhafte Ablagerungen bildet. Darüber hinaus ist der Einsatz solcher schwerlöslicher Medikamente oft mit toxischen Nebenwirkungen aufgrund ihrer Ablagerung in Organen wie Leber und/oder Niere verbunden. Solche unerwünschten Nebenwirkungen haben wiederum zur Folge, dass der in vivo einsetzbare Konzentrationsbereich des Wirkstoffes stark eingeschränkt ist.
Ein in jüngerer Zeit verfolgter Ansatz zur Behebung der geschilderten Probleme besteht in der Kopplung solcher problematischer Substanzen an gut lösliche biokompatible Polymeren, wie z. B. Polyethylenglycol und Dextran. Durch die Kopplung lässt sich einerseits das Molekulargewicht über den Schwellenwert von 70 kD hinaus erhöhen, so dass die Plasma-Verweilzeit kleinerer Moleküle drastisch gesteigert werden kann, andererseits kann durch den hydrophilen Polymeranteil die Löslichkeit im wässrigen Milieu verbessert werden.
Bisher wurden die meisten Modifizierungen mit Polyethylenglycol oder Dextran durchgeführt, wobei PEG generell bevorzugt wird, da es einfachere Produkte ergibt. Dextran-Konjugate zeigen jedoch oft hohe Allergenität, eine geringe metabolische Stabilität und in vielen Fällen geringe Ausbeuten bei den Kopplungsreaktionen. Beim Einsatz von PEG-Konjugaten wurden ebenfalls über unangenehme bis gefährliche Nebenwirkungen wie Juckreiz, Überempfindlichkeitsreaktionen und Pankreatitis berichtet. Ferner ist öfter die biologische Aktivität der Wirkstoffe nach der PEG- Kopplung zum Teil stark erniedrigt. Zudem ist der Metabolismus der Abbauprodukte von PEG-Konjugaten noch weitgehend unbekannt und stellt möglicherweise ein Gesundheitsrisiko dar.
Es besteht somit nach wie vor Bedarf an physiologisch gut verträglichen Alternativen zu Dextran- oder PEG-Konjugaten, mit denen die Löslichkeit von schlecht löslichen niedermolekularen Substanzen verbessert und/oder die Verweildauer von niedermolekularen Substanzen im Plasma erhöht werden kann, wodurch verbesserte pharmakodynamischen Eigenschaften des Wirkmoleküls erreicht werden.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, solche Alternativen bereitzustellen und einfache und effiziente Verfahren zur Herstellung solcher alternativer Konjugate zu entwickeln.
Überraschend wurde gefunden, dass sich diese Aufgabe durch Hydroxyalkylstärke- Konjugate lösen lässt, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass die bindende Wechselwirkung zwischen dem Hydroxyalkylstärkemolekül und der niedermolekularen Substanz auf einer kovalenten Bindung beruht, welche das Ergebnis einer Kopplungsreaktion zwischen der endständigen Aldehydgruppe oder einer aus dieser Aldehydgruppe durch chemische Umsetzung hervorgegangenen funktionellen Gruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls und einer mit dieser Aldehydgruppe oder daraus hervorgegangenen funktionellen Gruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls reaktionsfähigen funktionellen Gruppe der niedermolekularen Substanz ist, wobei die bei der Kopplungsreaktion unmittelbar resultierende Bindung gegebenenfalls durch eine weitere Reaktion zur obengenannten kovalenten Bindung modifiziert sein kann.
Die Erfindung umfasst ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese Konjugate enthalten, sowie die Verwendung dieser Konjugate und Zusammensetzungen zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers sowie Verfahren zur Herstellung dieser Konjugate und Zusammensetzungen. Die erfindungsgemäß eingesetzte Hydroxyalkylstärke (HAS) kann nach einem bekannten Verfahren, z. B. Hydroxyalkylierung von Stärke an der C2- und/oder Cβ- Position der Anhydroglucoseeinheiten mit Alkylenoxid oder 2-Chloralkanol, z. B. 2- Chlorethanol, (siehe z. B. US 5,218,108 für die Hydroxyethylierung von Stärke), mit verschiedenen gewünschten Molekulargewichtsbereichen und Substitutionsgraden hergestellt werden. Es können auch beliebige der im Handel erhältlichen Präparationen eingesetzt werden. Die Definition der Alkylgruppierung in „Hydroxyalky- stärke", wie hier verwendet, schließt Methyl, Ethyl, Isopropyl und n-Propyl ein, wobei Ethyl besonders bevorzugt ist. Ein wesentlicher Vorteil der Hydroxyethylstärke (HES) ist es, dass diese als biokompatibler Plasmaexpander bereits behördlich zugelassen ist und in großem Stil klinisch eingesetzt wird.
Das mittlere Molekulargewicht der Hydroxalkylstärke kann im Bereich von etwa 3 kD bis mehreren Millionen Dalton, vorzugsweise etwa 10 kD bis etwa 2000 kD, bevorzugter im Bereich von etwa 70 kD bis etwa 1000 kD, besonders bevorzugt bei etwa 130 kD, liegen. Zur Erhöhung der Verweilzeit der niedermolekularen Substanz im Organismus wird das mittlere Molekulargewicht der Hydroxyalkylstärke vorzugsweise so gewählt, das der glomeruläre Schwellenwert von 70 kD bei den Konjugaten überschritten wird. Der Substitutionsgrad (Verhältnis der Anzahl modifizierter Anhydroglucoseeinheiten zur Anzahl der gesamten Anhydroglucoseeinheiten) kann ebenfalls variieren und wird häufig im Bereich von etwa 0,2 bis 0,8, vorzugsweise etwa 0,3 bis 0,7, noch bevorzugter etwa 0,5, liegen. (Anmerkung: Die Zahlen beziehen sich auf den "Degree of Substitution", der zwischen 0 und 1 liegt). Das Verhältnis von C2- zu Cβ-Substitution liegt gewöhnlich im Bereich von 4 bis 16, vorzugsweise im Bereich von 8 bis 12.
Diese Parameter lassen sich nach bekannten Verfahren einstellen. Erfahrungen mit der Verwendung von Hydroxyethylstärke als Blutersatzstoff haben gezeigt, dass die Verweilzeit von HES im Plasma vom Molekulargewicht und dem Substitutionsgrad und Substitutionstyp (C2-Substitution oder Cβ-Substitution) abhängt, wobei ein höheres Molekulargewicht, ein höherer Substitutionsgrad und ein höherer Anteil der C2-Substitution die Verweilzeit erhöht. Diese Beziehungen gelten auch für die erfindungsgemäßen Konjugate von Hydroxyalkylstärke und niedermolekularen Substanzen, so dass die Verweilzeit eines bestimmten Konjugats im Plasma über den Polysaccharidanteil einstellbar ist.
Wie bereits erwähnt, ist die an der Kopplungsreaktion beteiligte funktioneile Gruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls die endständige Aldehydgruppe oder eine daraus durch chemische Umsetzung hervorgegangene Funktionalität.
Ein Beispiel für eine solche chemische Umsetzung ist die selektive Oxidation dieser Aldehydgruppe mit einem geeigneten Oxidationsmittel, wie z. B. lod, Brom oder einigen Metallionen, oder auch mittels elektrochemischer Oxidation zu einer Carboxylgruppe oder aktivierten Carboxylgruppe, z. B. einem Ester, Lacton, Amid, wobei die Carboxylgruppe gegebenenfalls in einer zweiten Reaktion in das aktivierte Derivat überführt wird. Diese Carboxylgruppe oder aktivierte Carboxylgruppe kann dann mit einer primären Amino- oder Thiolgruppe der niedermolekularen Substanz unter Ausbildung einer Amidbindung oder Thioesterbindung gekoppelt werden. Eine weitere Möglichkeit ist die Kopplung mit einer Hydroxyl-Funktion der niedermolekularen Substanz unter Esterbildung.
Ein erfindungsgemäßes Konjugat kann aber auch dadurch erhalten werden, dass die niedermolekulare Substanz zur Einführung einer gewünschten funktionellen Gruppe mit einem geeigneten physiologisch verträglichen bifunktionellen Linkermolekül umgesetzt wird. Die verbleibende reaktionsfähige Gruppe des angekoppelten Linkermoleküls wird für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ebenfalls als „reaktionsfähige funktionelle Gruppe der niedermolekularen Substanz" betrachtet.
Geeignete Linkermoleküle enthalten an einem Ende eine Gruppierung, die mit einer reaktionsfähigen funktionellen Gruppe der niedermolekularen Substanz, z. B. einer Amino-, Thiol-, Carboxyl- oder Hydroxy-Gruppe, eine kovalente Bindung eingehen kann, und am anderen Ende eine Gruppierung, die mit der endständigen Aldehydgruppe oder einer daraus durch chemische Umsetzung hervorgegangenen funktionellen Gruppe, z. B. einer Carboxylgruppe, aktivierten Carboxylgruppe, Amino- oder Thiolgruppe, ebenfalls eine kovalente Bindung eingehen kann. Zwischen den beiden funktionellen Gruppen des Linkermoleküls befindet sich ein biologisch verträgliches Brückenmolekül geeigneter Länge, z. B. eine Gruppierung, die sich von einem Alkan ableitet, eine (Oligo)alkylenglycolgruppierung oder eine andere geeignete Oligomergruppierung. Bevorzugte Gruppierungen, die mit Aminogruppen reagieren können, sind z. B. N-Hydroxysuccinimidester, Sulfo-N- hydroxysuccinimid-ester, Imidoester oder andere aktivierte Carboxylgruppen; bevorzugte Gruppierungen, die mit Thiolgruppen reagieren können, sind z.B. Maleimid- und Carboxylgruppen; bevorzugte Gruppierungen, die mit Aldehyd- oder Carboxyl-gruppen reagieren können, sind z. B. Amino- oder Thiolgruppen.
Beispielhafte Linkermoleküle zur Verknüpfung von SH- und NH-Funktionen sind:
AMAS (N-α(Maleimidoacetoxy)succinimidester)
BMPS (N-ß(Maleimidopropyloxy)succinimidester)
GMBS (N-γ(Maleimidobutyryloxy)succinimidester)
EMCS (N-ε(Maleimidocaproyloxy)succinimidester)
MBS (m-(Maleimidobenzoyl)-N-hydroxysuccinimidester)
SMCC (Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat)
SMPB (Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat)
SPDP (Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)proprionat)
Sulfo-GMBS (N-γ(Maleimidobutyryloxy)sulfosuccinimidester)
Sulfo-EMCS (N-ε(Maleimidocaproyloxy)sulfosuccinimidester).
Beispielhafte Linkermoleküle zur Verknüpfung von SH- und SH-Funktionen sind:
BMB (1.4-Bis-maleimidobutan)
BMDB (1.4-Bis-maleimido-2.3-dihydroxybutan)
BMH (Bis-maleimidohexan)
BMOE (Bis-maleimidoethan)
DTME (Dithio-bis-maleimidoethan)
HBVS (1.6-Hexan-bis-vinylsulfon)
BM(PEO)3 (1.8-Bis-maleimidotriethylenglycol)
BM(PEO)4 (1.11-Bis-maleimidotetraethylenglycol). Beispielhafte Linkermoleküle zu Verknüpfung von NH- und NH-Funktionen sind:
BSOCOES (Bis-(2-(succinimidyloxycarbonyloxy)ethyl)sulfon
BS3 (Bis-(sulfosuccinimidyl)suberat)
DFDNB (1.5-Difluor-2.4-dinitrobenzol)
DMA (Dimethyladipimidat HCI))
DSG (Disuccinimidylglutarat)
DSS (Disuccinimidylsuberat)
EGS (Ethylenglycol-bis-(succinimidylsuccinat).
Beispielhafte Linkermoleküle zur Verknüpfung von SH- und CHO-Funktionen sind:
BMPH (N-(ß-Maleimidopropionsäure)hydrazid TFA)
EMCA (N-(ε-Maleimidocapronsäure)hydrazid)
KMUH (N-(κ-Maleimidoundecansäure)hydrazid)
M2C2H (4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylhydrazid HCI)
MPBH (4-(4-N-MaleimidophenyI)buttersäurehydrazid HCI)
PDPH (3-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazid).
Ein beispielhaftes Linkermolekül zur Verknüpfung von SH- und OH-Funktionen ist PMPI (N-(p-Maleimidophenyl)isocyanat).
Beispielhafte Linkermoleküle zur Überführung einer SH-Funktion in eine COOH-
Funktion sind:
BMPA (N-ß-Maleimidopropionsäure)
EMCH (N-ß-Maleimidocapronsäure)
KMUA (N- -Maleimidoundecansäure).
Beispielhafte Linkermoleküle zur Überführung einer NH-Funktion in eine COOH- Funktion sind MSA (Methyl-N-succinimidyladipat) oder längerkettige Homologe davon oder entsprechende Derivate von Ethylenglycol.
Beispielhafte Linkermoleküle zur Überführung einer COOH-Funktion in eine NH- Funktion sind DAB (1.4-Diaminobutan) oder längerkettige Homologe davon oder entsprechende Derivate von Ethylenglycol. Ein beispielhaftes Linkermolekül, das mit einer Aminogruppe eines Moleküls reagiert und eine geschützte Aminogruppe in größerem Abstand von diesem Molekül zur Vermeidung einer sterischen Hinderung bereitstellt, ist TFCS (N-ε(Trifluoracetyl- caproyloxy)succinimidester).
Weitere geeignete Linkermoleküle sind Fachleuten bekannt und im Handel erhältlich oder können je nach Bedarf und in Abhängigkeit von den vorhandenen und gewünschten funktionellen Gruppen der HAS und der anzukoppelnden niedermolekularen Substanzen entworfen und nach bekannten Verfahren hergestellt werden.
In einem besonders bevorzugten Herstellungsverfahren wird die endständige Aldehydgruppe der HAS mit einem molaren Uberschuss an lod, vorzugsweise in einem Molverhältnis von lod zu HAS von 2:1 bis 20:1, besonders bevorzugt etwa 5:1 bis 6:1 , in wässriger basischer Lösung selektiv oxidiert. Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen optimierten Verfahren wird zunächst eine Menge an Hydroxyalkylstärke in warmem destilliertem Wasser gelöst und etwas weniger als 1 Moläquivalent wässriger lodlösung, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,05-0,5 N, besonders bevorzugt etwa 0,1 N, zugegeben. Danach wird eine wässrige NaOH- Lösung in einer molaren Konzentration, die etwa das 5-15fache, vorzugsweise etwa das 10fache, der lodlösung beträgt, langsam tropfenweise in Abständen von mehreren Minuten der Reaktionslösung zugegeben, bis die Lösung nach der Zugabe beginnt, wieder klar zu werden. Es wird erneut etwas weniger als 1 Moläquivalent der obigen wäßrigen lodlösung der Reaktionslösung zugegeben, das Zutropfen der NaOH-Lösung wieder aufgenommen und die Zugabe von lod und NaOH werden solange wiederholt, bis etwa 5,5-6 Moläquivalente lodlösung und 11-12 Moläquivalente NaOH-Lösung, bezogen auf die Hydroxyalkylstärke, zugegeben worden sind. Dann wird die Reaktion abgebrochen, die Reaktionslösung entsalzt, z.B. durch Dialyse oder Ultrafiltration, einer Kationenaustauschchromatographie unterworfen und das Reaktionsprodukt durch Lyophilisierung gewonnen. Bei diesem Verfahren werden unabhängig vom Molekulargewicht der HAS fast quantitative Ausbeuten erzielt. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die selektive Oxidation mit alkalischen stabilisierten Lösungen von Metallionen, z. B. Cu++ oder Ag+, ebenfalls in etwa quantitativer Ausbeute (Beispiel 2). Vorzugsweise wird dabei ein etwa 3-10facher molarer Uberschuss des Oxidationsmittels eingesetzt.
Anschließend wird die gebildete selektiv oxidierte Hydroxyalkystärke in einem geeigneten organischen Lösungsmittel mit einer primären Aminogruppe der gewünschten niedermolekularen Substanz unter Ausbildung einer Amidbindung umgesetzt. Bevorzugte Lösungsmittel wurden aus der Gruppe der polar- nichtprotischen Lösungsmittel ausgewählt, besonders bevorzugt wurde Dimethylsulfoxid (DMSO) verwendet. Im Gegensatz zu gängigen, in der Literatur beschriebenen Verfahren für ähnliche Kopplungsreaktionen wurde dabei überraschenderweise gefunden, dass der Einsatz ansonsten obligatorischer Aktivatoren wie Carbodiimide und Triazole nicht erforderlich ist. Die Kopplung von selektiv oxidierter Hydroxethylstärke (ox-HES) an verschiedene Modellverbindungen (siehe Beispiele) ging auch in Abwesenheit eines Aktivators glatt vonstatten.
Vorzugsweise finden die Kopplungsreaktionen jedoch in Gegenwart eines Carbodiimids, mehr bevorzugt in der Gegenwart von DCC (Dicyclohexyldicarbo- diimid), am meisten bevorzugt in der Gegenwart von EDC (1-(3-Dimethylamino- propyl)-3-ethylcarbodiimid), statt.
Die reaktive Gruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls kann auch eine durch chemische Umsetzung der endständigen Aldehydgruppe entstandene Amin- oder Thiolgruppe sein. Beispielsweise kann eine reduktive Aminierung der Aldehydgruppe durch Reaktion mit Ammoniak in Gegenwart von Wasserstoff und einem Katalysator oder in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid durchgeführt werden. Die entstandene Amin- oder Thiolgruppe kann dann mit einer freien Carboxylgruppe oder Aldehydgruppe der niedermolekularen Substanz reagieren. Dabei entstehen zunächst Amid- oder Thioesterbindungen bzw. Schiffsche Basen, die gegebenenfalls durch eine weitere Reaktion modifiziert werden können. T EP03/02084
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Ferner kann die endständige Aldehydgruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls oder eine daraus durch chemische Umsetzung hervorgegangene funktionelle Gruppe auch mit einem geeigneten physiologisch verträglichen, bifunktionellen Linkermolekül umgesetzt werden. In diesem Falle ist für die Kopplungsreaktion die „aus der endständigen Aldehydgruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls durch chemische Umsetzung hervorgegangene funktionelle Gruppe" die verbleibende reaktionsfähige funktionelle Gruppe des bifunktionellen Linkermoleküls, mit dem die endständige Aldehydgruppe oder die daraus hervorgegangene funktionelle Gruppe umgesetzt wurde. Auf diese Weise kann die endständige Aldehydgruppe ebenfalls in eine gewünschte funktionelle Gruppe überführt werden.
Geeignete Linkermoleküle enthalten an einem Ende eine Gruppierung, die mit der endständigen Aldehydgruppe oder einer daraus durch chemische Umsetzung hervorgegangenen funktionellen Gruppe, z. B. einer Carboxylgruppe, aktivierten Carboxylgruppe, Amino- oder Thiolgruppe, eine kovalente Bindung eingehen kann, und am anderen Ende eine Gruppierung, die mit einer reaktionsfähigen funktionellen Gruppe der niedermolekularen Substanz, z. B. einer Amino-, Thiol-, Carboxyl- oder OH-Gruppe, vorzugsweise Aryl-OH-Gruppe, eine kovalente Bindung eingehen kann. Zwischen den beiden funktionellen Gruppen des Linkermoleküls befindet sich ein biologisch verträgliches Brückenmolekül geeigneter Länge, z. B. eine Gruppierung, die sich von einem Alkan ableitet, eine (Oligo)alkylenglycolgruppierung oder eine andere geeignete Oligomergruppierung. Bevorzugte Gruppierungen, die mit Aminogruppen reagieren können, sind z.B. N-Hydroxysuccinimidester, Sulfo-N- hydroxysuccinimidester, Imidoester oder andere aktivierte Carboxylgruppen; bevorzugte Gruppierungen, die mit Thiolgruppen reagieren können, sind z.B. Maleimid- und Carboxylgruppen; bevorzugte Gruppierungen, die mit Aldehyd- oder Carboxylgruppen reagieren können, sind z.B. Amino- oder Thiolgruppen.
Eine Reihe von speziellen, nicht beschränkenden Beispielen für geeignete Linkermoleküle wurden bereits oben unter Bezug auf die Konjugation von Linkermolekülen an niedermolekulare Substanzen angegeben. Bei einem alternativen erfindungsgemäßen Kopplungsverfahren der vorliegenden Erfindung wird die endständige Aldehydgruppe der Hydroxyalkylstärke (HAS) direkt mit einer primären Aminogruppe der niedermolekularen Substanz bzw. eines an diese Substanz gekoppelten Linkermoleküls unter Bildung einer Schiff'schen Base umgesetzt. Anschliessend oder parallel dazu wird die gebildete Schiff'sche Base durch Umsetzung mit einem geeigneten Reduktionsmittel zum Amin reduziert, wodurch eine im wässrigen Milieu stabile Bindung zwischen niedermolekularer Substanz und HAS entsteht.
Bevorzugte Reduktionsmittel sind Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid, organische Borkomplexe, z.B. ein 4-(Dimethylamino)pyridin-Borkomplex, N- Ethyldiisopropylamin-Borkomplex, N-Ethylmorpholin-Borkomplex, N-Methyl- morpholin-Borkomplex, N-Phenylmorpholin-Borkomplex, Lutidin-Borkomplex, Triethylamin-Borkomplex, Trimethylamin-Borkomplex; geeignete stereoselektive Reduktionsmittel sind beispielsweise Natriumtriacetatborhydrid, Natriumtriethyl- borhydrid, Natriumtrimethoxyborhydrid, Kalium-tri-sec-butylborhydrid (K-Selectride), Natrium-tri-sec-butylborhydrid (N-Selectride), Lithium-tri-sec-butylborhydrid (L- Selectride),Kaliumtriamylborhydrid (KS-Selectride) und Lithiumtriamylborhydrid (LS-Selectride).
Die Kopplungsreaktion von HAS oder oxidierter HAS an eine niedermolekulare Substanz wird aufgrund der zu erwartenden schlechten Wasserlöslichkeit der Substanz und der mangelnden Stabilität des Lactons in wässrigem Milieu vorzugsweise in einem organischen Lösungsmittel, bevorzugter einem polaren, nicht-protischen Lösungsmittel, in dem die HAS und vorzugsweise auch die niedermolekulare Substanz löslich ist, durchgeführt. Geeignete Lösungsmittel für HAS sind z. B. DMSO, Glycol, Diglycol, Triglycol sowie N-Methylpyrrolidon. Es ist auch möglich, Mischungen von DMSO mit anderen Lösungsmitteln einzusetzen, falls die niedermolekulare Substanz nicht in DMSO oder einem anderen bevorzugten Lösungsmittel für HAS löslich ist. Die Reaktion kann manchmal aber auch vorteilhaft in heterogener Phase durchgeführt werden. P T/EP03/02084
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Das Molverhältnis von HAS zu niedermolekularer Substanz bei der Kopplungsreaktion beträgt gewöhnlich etwa 20:1 bis 1:1, vorzugsweise etwa 5:1 bis 1:1.
Die Kopplungsausbeuten, bezogen auf die niedermolekulare Substanz, liegen in der Regel bei mehr als 40%, häufig mehr als 60% und nicht selten mehr als 80% (vgl. Beispiele).
Bei der zu koppelnden niedermolekularen Substanz handelt es sich vorzugsweise um einen Arzneiwirkstoff, dessen Löslichkeit in wässrigem Milieu und/oder dessen Bioverfügbarkeit, Stabilität und Verweilzeit im Körper erhöht werden soll. Der Begriff „niedermolekulare Substanz" soll auch Peptide bis zu etwa 50 Aminosäuren einschließen. Vorzugsweise ist der Arzneiwirkstoff aus der Gruppe aus Antibiotika, Antidepressiva, Antidiabetika, Antidiuretika, Anticholinergika, Antiarrhytmika, Antiemetika, Antitussiva, Antiepileptika, Antihistaminika, Antimykotika, Anti- sympathotonika, Antithrombotika, Androgenen, Antiandrogenen, Estrogenen, Antiestrogenen, Antiosteoporosemitteln, Antitumormitteln, Vasodilatatoren, anderen blutdrucksenkenden Mitteln, fiebersenkenden Mitteln, Schmerzmitteln, entzündungshemmenden Mitteln, ß-Blockem, Immunsuppressiva und Vitaminen ausgewählt.
Einige nicht-beschränkende Beispiele von Arzneiwirkstoffen mit einer NH2-Gruppe als Reaktionspartner der Kopplung mit HAS sind:
Albuterol, Alendronat, Amikazin, Ampicillin, Amoxicillin, Amphotericin B, Atenolol, Azathioprin, Cefaclor, Cefadroxil, Cefotaxim, Ceftazidim, Ceftriaxon, Cilastatin, Cimetidin, Ciprofloxacin, Clonidin, Colistin, Cosyntropin, Cycloserin, Daunorubicin, Doxorubicin, Desmopressin, Dihydroergotamin, Dobutamin, Dopamin, Ephedrin, Epinephrin, ε-Aminocapronsäure, Ergometrin, Esmolol, Famotidin, Flecainid, Folsäure, Flucytosin, Furosemid, Ganciclovir, Gentamicin, Glucagon, Hydrazalin, Imipenem, Isoproterenol, Ketamin, Liothyronin, Lutiliberin, Merpatricin, Metaraminol, Methyldopa, Metoclopramid, Metoprolol, Mexiletin, Mitomycin, Neomicin, Netilmicin, Nimodipin, Nystatin, Octreotid, Oxytocin, Pamidronat, Pentamidin, Phentolamin, Phenylephrin, Procainamid, Procain, Propranolol, Ritodrin, Sotalol, Teicoplanin, Terbutalin, Thiamin, Tiludronat, Tolazolin, Trimethoprim, Tromethamin, Vancomycin, Vasopressin und Vinblastin. Bevorzugte Beispiele von Arznei Wirkstoffen mit einer NH2-Gruppe als Reaktionspartner der Kopplung mit HAS sind 6-Aminopenicillinsäure, 7- Aminocephalosporin, 7-Aminocephalosporansäure und 7-Aminopenicillansäure.
Spezielle Beispiele für solche Wirkstoffe mit einer COOH-Gruppe als Reaktionspartner für die Kopplung mit HAS sind:
Acetylcystein, Aziocillin, Aztreonam, Benzylpenicillin, Camptothecin, Cefamandol, Cefazolin, Cefepim, Cefotaxim, Cefotetan, Cefoxitin, Ceftazidim, Ceftriaxon, Cephalothin, Cilastatin, Ciprofloxacin, Clavulansäure, Dicloxacillin, ε-Amino- capronsäure, Floxacillin, Folinsäure, Furosemid, Fusidinsäure, Imipemem, Indomethacin, Ketorolac, Liothyronin, Melphalan, Methyldopa, Piperacillin, Prostacyclin, Prostaglandine, Teicoplanin, Ticarcillin und Vancomycin.
Spezielle Beispiele für solche Wirkstoffe mit einer Aryl-OH-Gruppe als Reaktionspartner der Kopplung mit HAS sind:
Albuterol, Allopurinol, Apomorphin, Ceftriaxon, Dobutamin, Dopamin, Doxycyclin, Edrophonium, Isoproterenol, Liothyronin, Metaraminol, Methyldopa, Minocyclin, Pentazocin, Phenylephrin, Phentolamin, Propofol, Rifamycine, Ritodrin, Teicoplanin, Terbutalin, Tetracyclin und Vancomycin.
Spezielle Beispiele für solche Wirkstoffe mit einer aliphatischen OH-Gruppe als Reaktionspartner der Kopplung mit HAS sind Taxol und Palcitaxel.
Die Reaktionsprodukte der oben beschriebenen chemischen Kopplung können mit bekannten Verfahren untersucht und die Kopplungseffizienz festgestellt werden. Beispielsweise kann eine UV-Eichkurve für die betreffende niedermolekulare Substanz erstellt und dazu verwendet werden, den Gehalt an niedermolekularer Substanz in der Probe bzw. den Anteil der niedermolekularen Substanz am Kopplungsprodukt zu bestimmen. Falls die niedermolekulare Substanz keine UV- Absorption zeigt, können entsprechende kolorimetrische oder elektrochemische Nachweisverfahren in Analogie zu bekannten Verfahren entwickelt werden. Der Saccharidanteil im Konjugat ist beispielsweise durch eine Glykan-spezifische Färbung der aufgetrennten Reaktionsprodukte nachweisbar. Auch eine quantitative Glykanbestimmung ist möglich. Die Kopplungsausbeute von Reaktionen unter Beteiligung primärer Amine könnte auch durch Derivatisierung der nicht-umgesetzten Amine mit Fluorescamin und Bestimmung der Fluoreszenz festgestellt werden.
Die verbesserte Wasserlöslichkeit kann bei schwerlöslichen Ausgangsstoffen einfach durch Lösungsversuche überprüft werden. Im Falle der Kopplung mit teilweise wasserlöslichen Arzneiwirkstoffen kann die erhöhte Hydrophilie mittels einer OECD- Methode zur Ermittlung des logP-Wertes bestimmt werden. Diese korreliert die Retentionszeit von Substanzen in der RP-HPLC mit dem Verteilungskoeffizienten in einem n-Octanol/Wasser-Gemisch. Alle mit dieser Methode untersuchten erfindungsgemäßen HES-Konjugate eluierten im Ausschlußvolumen einer C18- Säule, zeigten also keine Wechselwirkungen mit dem C18-Material.
Die Konjugate der vorliegenden Erfindung können gegebenenfalls als solche oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers eingesetzt werden.
Derartige Zusammensetzungen umfassen eine pharmazeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßes Konjugats als aktiven Bestandteil sowie einen pharmazeutisch geeigneten Träger und gegebenenfalls andere therapeutische bzw. galenische Bestandteile oder Hilfsstoffe. Hilfsstoffe können z. B. Verdünnungsmittel, Puffer, Geschmacksmittel, Bindemittel, oberflächenaktive Mittel, Verdickungsmittel, Gleitmittel, Konservierungsstoffe (einschließlich Antioxidantien) sowie Substanzen einschließen, die dazu dienen, die Formulierung mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers isotonisch zu machen. Eine pharmazeutisch wirksame Menge ist diejenige Menge, welche ausreicht, um bei einmaliger oder mehrmaliger Verabreichung im Rahmen einer Behandlung zur Erleichterung, Heilung oder Verhütung eines Krankheitszustands eine gewünschte positive Wirkung zu entfalten. Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger ist ein Träger, der sowohl mit dem Arzneiwirkstoff als auch mit dem Körper des Patienten kompatibel ist. Die Form der Zusammensetzung wird je nach dem gewünschten bzw. geeigneten Verabreichungsweg variieren. Geeignete Verabreichungswege können beispielsweise die orale, parenterale, z. B. subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intraarterielle, intraartikuläre, intrathekale, extradurale Injektion bzw. gegebenenfalls Infusion, intranasale, intratracheale, rektale oder topische Verabreichung sein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können günstigerweise in Form einer Dosierungseinheit dargeboten werden und nach irgendeinem der auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannten Verfahren hergestellt werden.
Die HAS-Konjugate der vorliegenden Erfindung können auch auf allen anderen Gebieten eingesetzt werden, bei denen andere Polymer-Konjugate, z. B. PEG- Konjugate, zur Anwendung kamen. Einige spezielle, nicht beschränkende Beispiele sind die Verwendung eines HAS-Konjugats als immobilisierter Reaktionspartner für eine Reaktion in heterogener Phase oder als Säulenmaterial für die Affinitätschromatographie. Weitere Anwendungsmöglichkeiten werden für den Fachmann in Kenntnis der hier offenbarten Eigenschaften der erfindungsgemäßen HAS-Konjugate unschwer ersichtlich sein.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne diese jedoch darauf zu beschränken. Insbesondere können analoge Reaktionen auch mit Hydroxymethylstärke und Hydroxypropylstärke durchgeführt und ähnliche Ergebnisse erzielt werden.
BEISPIEL 1
Selektive Oxidation von Hydroxyethylstärke (HES) mit lod
In einem Rundkolben wurden 10 g HES-130 kD in 12 ml entionisiertem Wasser unter Erwärmen gelöst. Zu dieser Lösung wurden 2 ml einer I2-Lösung (0.1 N) gegeben. Eine Pipette mit 2 ml 1.0 N NaOH wurde mit dem Kolben über ein 2-Wege- Verbindungsstück verbunden und die NaOH-Lösung mit ca. 1 Tropfen pro 4 Minuten zugetropft. Nach Zugabe von ungefähr 0.2 ml der NaOH-Lösung war die Lösung entfärbt, zu diesem Zeitpunkt wurde eine zweite Portion von 2 ml 0.1 N lodlösung zugegeben. Die Reaktion war nach Zugabe von insgesamt 14 ml lodlösung und 2.8 ml NaOH-Lösung beendet. Die Reaktionsmischung wurde anschließend gegen entionisiertes Wasser dialysiert.
Lactonisierung:
Die teilweise entsalzte Lösung wurde einer Chromatographie an einer Kationenaustauschersäule (Amberlite IR-120, H+-Form) unterzogen, um die Aldonat- gruppen in Aldonsäuregruppen umzuwandeln. Anschließend wurde das Wasser durch Lyophilisation entfernt und so die Lactonform erhalten.
Bestimmung des Oxidationsgrades:
Zu jeweils 1 ml Probenlösung werden unter N -Atmosphäre 1 ml alkalisches Kupferreagenz (3.5 g Na2P04, 4.0 g K-Na-Tatrat in 50 ml H20, dazu 10 ml 1 N NaOH, 8.0 ml 10%iger (Gew./Vol.) CuS04-Lösung und 0.089 g K-Iodat in 10 ml H20, nach Zugabe von 18 g Na-Sulfat auf 100 ml auffüllen) pipettiert. Es wird 45 Minuten bei 100 °C erhitzt. Nach Abkühlen werden 0.2 ml 2.5%iger Kl-Lösung und 0.15 ml 2 M H2S04 addiert. Nach 5 Min. wird mit 1 Tropfen Phenolrot-Indikatorlösung (1% Gew./Vol.) versetzt und mit 5 mM Na2S203-Lösung bis zum Verschwinden der Farbe titriert. Aus dem Verbrauch an Titrationsmittel lässt sich die Konzentration nichtumgesetzter Aldehydgruppen berechnen.
Es wurde eine annähernd quantitative Ausbeute erzielt (>98%). Hydroxyethylstärken mit höherer molarer Masse (z. B. 130 kD, 250 kD, 400 kD) konnten, genauso wie Hydroxyethylstärken mit niedrigerer molarer Masse (z. B. 10 kD, 25 kD, 40 kD), nach dieser Vorschrift in ähnlich hohen Ausbeuten oxidiert werden.
BEISPIEL 2
Selektive Oxidation von HES mit Cu2+-lonen
Unter Erwärmen wurde eine Lösung von 0.24 mMol HES-130 kD in 10 ml entionisiertem Wasser hergestellt. Diese Lösung wurde in einem 100-ml-Rundkolben auf eine Temperatur von 70-80 °C erhitzt und mit 1,17 mMol stabilisiertem Cu2+ (z. B. Rochelle- Salz als Stabilisator oder andere Stabilisatoren) und verd. wässriger NaOH-Lösung versetzt (Endkonzentration 0,1 N NaOH). Danach wurde die Temperatur auf 100 °C erhöht und die Reaktion solange laufen lassen, bis eine rötliche Farbe entstanden war. Die Reaktion wurde gestoppt und die Reaktionsmischung auf 4 °C abgekühlt. Der rötliche Niederschlag wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde gegen entionisiertes Wasser dialysiert und anschließend wie in Beispiel 1 in das Lacton umgewandelt. Die Oxidation verlief quantitativ (Ausbeute >99%). Nach dieser Methode ließen sich auch niedermolekulare HES (z. B. HES-10 kD, HES-25 kD, HES-40 kD) und höhermolekulare HES-Spezies (z. B. 130 kD, 250 kD, 400 kD) oxidieren.
BEISPIEL 3
Kopplung von selektiv oxidierter Hydroxyethylstärke (ox-HES) an Alendronat
In einem 100-ml-Rundkolben wurden 5 mg Alendronat (ein Bisphosphonat) und ein 3-5facher molarer Überschuß an ox-HES Lacton (hergestellt wie in Beispiel 1 oder 2 beschrieben) in 4-5 ml DMSO gelöst. Die Suspension wurde auf 70°C erwärmt und unter mäßigem Rühren (Magnetrührer) 24-36 Stunden belassen. Die Reaktion wurde dann abgebrochen und die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt. Danach wurden 20-30 ml Wasser zugegeben und diese Lösung gegen destilliertes Wasser dialysiert. Anstelle der Dialyse kann auch eine Ultrafiltration mit einer geeigneten Ausschlussgrenze der Membran eingesetzt werden. Dies ermöglicht nicht nur den Austausch des Lösungsmittels sondern auch eine Konzentration der Lösung, welche anschließend lyophilisiert wird. Der Erfolg der Kopplung wird mittels analytischer Standard verfahren, z. B. Gelpermeationschromatographie und Ninhydrin-Test auf freie Aminogruppen, nachgewiesen. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt betrug ca. 85% für die Kopplung mit ox-HES-130 kD und ca. 80 % für die Kopplung mit ox-HES-10 kD Lacton.
BEISPIEL 4
Kopplung von selektiv oxidierter HES (ox-HES) an Amphotericin B
12.0 g getrocknetes ox-HES-130 kD Lacton wurden in 30 ml trockenem DMSO in einer N2-Atmosphäre gelöst. Die Lösung wurde auf 70 °C erwärmt und 52 mg Amphotericin B zugegeben. Unter Lichtausschluss wurde die Reaktion für 24 h unter diesen Bedingungen belassen. Der Nachweis der erfolgreichen Kopplung wurde durch Gelpermeationschromatographie mit photometrischer Detektion bei 385 nm (λmaχ des Amphotericins) geführt. Nach Abschluss der Reaktion wurde durch Zugabe von 80 ml destilliertem Wasser gestoppt und intensiv gegen Wasser dialysiert. Lyophilisation ergab ein schwach gelbes Kopplungsprodukt. (Ausbeute ca. 87%).
Unter vergleichbaren Bedingungen wurde bei der Kopplung von ox-HES-10 kD Lacton mit Amphotericin B eine Ausbeute von ca. 75% erzielt.
BEISPIEL 5
Kopplung von ox-HES an Ampicillin
In einem 100-ml-Rundkolben wurden 1.3 g trockenes ox-HES-130 kD Lacton in 5 ml trockenem DMSO gelöst. Diese Lösung wurde auf 45°C erwärmt und 11.0 mg Ampicillin (Aldrich # 27.186-1) zugegeben. Die Reaktion lief unter moderatem Rühren für 20 h und wurde nach dieser Zeit durch die Zugabe von 25 ml destilliertem Wasser abgestoppt. Die Reaktionsmischung wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Der Kopplungserfolg wurde durch Analyse des Produkts mit GPC und Bestimmung der freien Aminogruppen am Ampicillin mit Ninhydrin nachgewiesen.
BEISPIEL 6
Kopplung von ox-HES an Neomycin
3 x 10"5 Mol ox-HES-25 kD Lacton wurden in 5 ml N-Methylpyrrolidon bei 60°C in einem 50-ml-Reaktionsgefäß unter Magnetrühren gelöst. Nach der Zugabe von 10 mg Neomycin in 2 ml trockenem DMSO wurde für ca. 10 h zum Rückfluss gekocht. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur beendete die Zugabe von weiteren 35 ml Wasser die Reaktion. Durch Dialyse wurde der größte Teil der Solventien entfernt und das Kopplungsprodukt anschließend lyophilisiert. Durch GPC mit UV-Detektion konnte Kopplungsprodukt mit ca. 82 % Ausbeute nachgewiesen werden.
BEISPIEL 7
Kopplung von ox-HES an Mepartricin
10 ml Ethylenglcol waren notwendig, um 2.5 g ox-HES-130 kD Lacton und 22 mg Mepartricin (erhältlich von Societa Prodotti Antibiotici, Mailand, Italien) unter Erwärmen vollständig zu lösen. Das Lösungsmittel war zuvor entgast und getrocknet worden. Die Reaktionslösung wurde 36 h lang unter Lichtausschluss und einer Inertgas-Atmosphäre gerührt und die Reaktion schließlich durch den Eintrag von 40 ml eiskaltem Wasser gestoppt. Das Ethylenglycol wurde mittels Ultrafiltration (10-kD- Membran) abgetrennt, anschließende Lyophilisierung ergab 2.1 g schwach gelbliches Pulver. Die weitere Reinigung erfolgte durch RP-HPLC an einer C18- Säule mit UV/VIS-Detektion.
BEISPIEL 8
Kopplung von ox-HES an Nystatin
In einem 100-ml-Rundkolben wurden 2.5 g trockenes ox-HES-130 kD Lacton in 10 ml trockenem DMSO gelöst. Nach Zugabe von 9.5 mg Nystatin wurde auf 60 °C erwärmt und unter Inertgas-Atmosphäre und im Dunkeln gerührt. Die Reaktion lief unter moderatem Rühren für 48 h und wurde nach dieser Zeit durch Zugabe von 50 ml destillierten Wasser abgestoppt. Die Reaktionsmischung wurde gegen dest. Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Die erfolgreiche Kopplung konnte durch RP-HPLC (C18-Säule) und Detektion bei 325 nm nachgewiesen werden. Die Ausbeute, anhand der Absorption des Produktpeaks abgeschätzt, betrug ca. 67%.
BEISPIEL 9
Kopplung von ox-HES an Mitomycin C
2.5 g ox-HES-130 kD Lacton und 20 mg Mitomycin (Fluka # 69824) wurden in 10 ml einer 9:1 -Mischung von DMSO:MeOH bei 60°C gelöst. Die Reaktionslösung wurde 24 h unter Rückfluss gehalten und danach wurden zum Abstoppen der Reaktion 40 ml Wasser zugegeben. Diese Lösung wurde über Nacht gegen entionisiertes Wasser dialysiert und anschließend einer Gefriertrocknung unterzogen. Der Nachweis der Kopplung wurde mittels RP-HPLC und Detektion bei 320 nm geführt. Das erwartete Kopplungsprodukt entstand in einer Ausbeute von 82%. BEISPIEL 10
Kopplung von ox-HES an Daunorubicin
1.3 g ox-HES-130 kD Lacton wurden in 10 ml N-Methylpyrrolidon bei 70 °C unter Rühren gelöst. Dazu wurden 17 mg Daunorubicin (Fluka #30450), gelöst in 3 ml DMF, tropfenweise zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 20 h lang unter diesen Bedingungen gerührt, auf Raumtemperatur abgekühlt und schließlich mit 40 ml destilliertem Wasser geschüttelt. Mittels Dialyse gegen Wasser wurde der Hauptteil der Lösungsmittel entfernt und anschließend gefriergetrocknet. Das gekoppelte Daunorubicin wurde durch RP-HPLC und UV-VIS-Detektion nachgewiesen.
BEISPIEL 11
Kopplung von ox-HES an 7-Aminocephalosporin
In einem 100-ml-Rundkolben wurden 3.0 g ox-HES-130 kD Lacton und 20 mg 7- Aminocephalosporin (Fluka #07300) in 5 ml trockenem DMSO unter magnetischem Rühren gelöst. Die Temperatur wurde auf 50°C erhöht und für 15 h gehalten. Nach dieser Zeit wurde auf 25 °C abgekühlt und die Reaktionsmischung durch Zugabe von 5 ml destilliertem Wasser verdünnt. DMSO und nicht umgesetztes 7-Aminocephalo- sporin wurden mittels Dialyse gegen destilliertes Wasser entfernt. Die Lösung wurde anschließend lyophilisiert und das Produkt durch DC und GPC analysiert.
BEISPIEL 12
Kopplung von ox-HES an 6-Aminopenicillinsäure
Die in Beispiel 11 beschriebene Reaktion wurde auch mit 16 mg 6-Aminopenicillin- säure an Stelle des 7-Aminocephalosporins unter denselben Bedingungen durchgeführt und das Reaktionsprodukt unter denselben Bedingungen aufgearbeitet und analysiert. BEISPIEL 13
Kopplung von ox-HES an LHRH
1,0 g getrocknetes ox-HES-130 kD Lacton wurde mit 5 mg LHRH (Lutiliberin, „luteinizing hormone releasing hormone") (Bachern, Schweiz) in 10 ml trockenem DMSO inkubiert. Die Reaktion ging 15 h lang bei 45°C unter Rühren vonstatten und wurde durch die Zugabe von 40 ml Wasser gestoppt. Hesyliertes LHRH wurde durch Lyophilisierung gewonnen, nachdem es extensiv gegen Wasser dialysiert worden war, um die Hauptmenge an DMSO und nicht umgesetztes Peptid zu entfernen. Das entstandene Produkt wurde mit GPC (Superose 12, Amersham-Pharmacia, Schweden) und UV-Detektion bei 280 nm analysiert. Eine Stöchiometrie von ungefähr 1 :1 für das Kopplungsprodukt ergab sich aus der Quantifizierung des Peptids auf der Basis der Trp-Absorption und der Quantifizierung des Polysaccharid- Anteils durch die Phenol/Schwefelsäure-Färbung.
Beispiel 14
Kopplung von ox-HES an Camptothecin
In einem Rundkolben wurden 20 mg Camptothecin in 5 ml trockenem DMSO bei 50 °C gelöst. Zu dieser Lösung wurden 36 mg 1.4-Diaminobutan in 2 ml trockenem DMSO getropft. Die Reaktionsmischung wurde für 24 h unter diesen Bedingungen und leichtem Rühren belassen. Das Konjugationsprodukt wurde durch Flashchromatographie gereinigt. Die Ausbeute betrug ca. 83%.
Für die Kopplungsreaktion des modifizierten Camptothecins mit ox-HES-130 kD wurde der gesamte Reaktionsansatz nach Reinigung zusammen mit 3.6 g des Polysaccha- rid-Lactons in 8 ml trockenem DMSO unter Rühren und Erwärmen auf 50 °C gelöst. Der Verlauf der Reaktion wurde durch RP-HPLC von Proben aus der Reaktionsmischung verfolgt. Nach 20 h bei 50 °C konnte keine weitere Produktbildung mehr beobachtet werden und die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 ml destilliertem Wasser gestoppt. Nach Dialyse gegen Wasser wurde das Kopplungsprodukt gefriergetrocknet. Die Analyse erfolgte durch GPC und Anfärbung der freien Aminogruppe im modifiziertem, nicht-umgesetztem Camptothecin mit Ninhydrin auf einer DC-Platte. BEISPIEL 15 Kopplung von ox-HES an Prostacyclin a) Aminofunktionalisierung
352 mg Prostacyclin (Sigma-Aldrich) wurden in 5 ml trockenem DMF mit 2% Methylenchlorid (V/V) bei 0°C gelöst. Dazu wurden 1.3 g Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 5 ml trockenem DMF gegeben. Unter leichten Rühren ließ man 30 Minuten reagieren. Anschließend wurde ein 5-fach molarer Uberschuss (bezogen auf Prostacyclin) an 1.5-Diaminoethylether addiert und die Lösung langsam auf Raumtemperatur erwärmt. Die Reinigung des aminofunktionalisierten Kopplungsproduktes erfolgte mit Flashchromatographie an Silica-Phase.
b) Hesylierung
220 mg des gereinigten Kopplungsproduktes aus a) wurden in 8 ml Glycol bei Raumtemperatur gelöst. Dazu wurden 4.0 g ox-HES-130 kD Lacton, gelöst in 10 ml Glycol, unter Rühren gemischt und auf 45 °C erwärmt. Nach einer Reaktionszeit von 8 h wurde im Eisbad abgekühlt und intensiv gegen Wasser dialysiert. Die klare Lösung wurde mit RP-HPLC an einer C18-Säule untersucht. Aus dem Verhältnis der Flächen im Ausschlussvolumen der Säule (Kopplungsprodukt) und der Ausgangssubstanz konnte die Kopplungseffizienz berechnet werden. Die Ausbeute betrug 53%.
BEISPIEL 16
Kopplung von HES an Alendronat
In einem 100-ml-Rundkolben wurde ein zehnfacher molarer Uberschuss an HES-25 kD zu einer Lösung von 2.25 mg Alendronat in 4 ml Phosphatpuffer (0.1 M, pH 7.5) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde geschüttelt, um das Polysaccharid vollständig zu lösen, und dann wurde ein dreißigfacher molarer Uberschuss an NaBH3CN zugegeben. Die Reaktion lief bei Raumtemperatur 48 h lang ab, wobei die Entstehung eines Kopplungsprodukts an einem Aliquot durch Umsetzung mit Fluorescamin, das mit freien Aminogruppen ein fluoreszierendes Produkt ergibt, nachgewiesen wurde. BEISPIEL 17
Kopplung von HES an Amoxillin
In einem Zweihalskolben wurden 4.0 ml 0.1 N Na-Phosphatpuffer (pH 7.5) vorgelegt und darin 1.5 g HES-40 kD durch Erwärmen auf 60 °C gelöst. Nach Abkühlen auf 25 °C wurden 7.0 mg Amoxillin (Fluka #10039) unter magnetischem Rühren zugegeben. In einem separaten Gefäß wurde eine Lösung von NaBH3CN, die einem dreißigfachen molaren Uberschuss entsprach, in 2 ml des gleichen Na-Phosphat- puffers hergestellt. Mit Hilfe eines Tropftrichters wurde die Cyanoborhydrid-Lösung langsam der ersten Lösung in einem Zeitraum von 30 Minuten zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde 24-36 h lang weitergerührt und dann der pH-Wert zum Stoppen der Rektion mit 0.1 N HCI auf 4 eingestellt. Die Lösung wurde durch Dialyse entsalzt und lyophilisiert. Der Nachweis des Kopplungsprodukt erfolgte mittels GPC und UV-Photometer.
BEISPIEL 18
Kopplung von HES an Cefaclor
In einem 100-ml-Rundkolben wurden 4 ml 0.1 N Na-Phosphatpuffer (pH 7.0) dazu verwendet, 110 mg NaBH3CN zu lösen. Unter Rühren wurden 6.0 x 10'5 Mol HES- 130 kD und 2.0 x 10"5 Mol Cefaclor (Fluka #22125) zugegeben. Die Reaktionstemperatur wurde bei 25 °C gehalten und die Reaktionsmischung 24 h lang moderat gerührt. Danach wurde die Lösung auf pH 4.0 angesäuert und weitere 30 Minuten lang gerührt. Zur Entsalzung und Konzentration wurde ultrafiltriert (10-kD-Membran). Das Kopplungsprodukt wurde mittels HP-GPC bei 265 nm nachgewiesen.
BEISPIEL 19
Kopplung von HES an Doxorubicin
6.0 mg Doxorubicin (Fluka #45584) wurden in Gegenwart eines dreifachen molaren Überschusses an HES-130 kD in 4 ml 0.1 N Na-Phosphatpuffer (pH 7.5) bei Raumtemperatur suspendiert. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten lang stark gerührt und langsam mit 3 ml einer 0.8 M NaBH3CN-Lösung versetzt. Die Reaktion wurde für 48 h lang bei Raumtemperatur unter Rühren gehalten. Anschließend wurde mit einer 10-kD-Membran diafiltriert, um Salze und nicht umgesetztes Doxorubicin zu entfernen. Die diafiltrierte Lösung wurde lyophilisiert und das Kopplungsprodukt mit GPC und RP-HPLC untersucht.
BEISPIEL 20
Kopplung von HES an Vasopressin
In einem Rundkolben, der mit einem Tropftrichter versehen war, wurden 1.25 g HES- 130 kD in 5 ml 0.1 M Na-Phosphatpuffer, pH 8.0, unter Erwärmen und leichtem Rühren gelöst. Zu dieser Lösung wurden 5 mg Vasopressin (Bachern, Schweiz) zugegeben. 30 mg NaBH3CN wurden in 2 ml 0.1 M Phosphatpuffer (pH 7.5) gelöst und langsam über den Tropftrichter der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktion wurde etwa 24 h lang bei 25 °C stehen gelassen. Zur Beendigung der Reaktion wurde der pH-Wert durch die Zugabe von 0.1 N HCI auf 4,0 abgesenkt. Nach extensiver Dialyse gegen Wasser wurde das hesylierte Produkt gefriergetrocknet. Die Analyse erfolgte mit GPC wie oben beschrieben und UV-Detektion bei 220 nm.
BEISPIEL 21
Kopplung von ox-HES 70 kD an Neomycin
In einem Zweihalskolben wurden unter Argonatmosphäre 1.01 mg Neomycin (Sulfat- Salz) und 126.21 mg oxHES 70 kD in 2 ml DMSO aufgelöst und nach Zugabe von 0.81 mg DMAP 24 h bei 70 °C erhitzt. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe von Aceton beendet, wobei das Kopplungsprodukt ausfiel. Der Feststoff wurde in Wasser aufgelöst und 48 h durch Dialyse gegen Wasser aufgereinigt. Nach Gefriertrocknung erhielt man 80 mg weißes Kopplungsprodukt (63 %).
BEISPIEL 22
Alternative Methode der Kopplung von ox-HES 70 kD an Neomycin
Die Kopplung von Neomycin an ox-HES 70 kD ließ sich ebenfalls erfolgreich bei Raumtemperatur in DMSO mit Zugabe von EDC als Aktivator durchführen. Hierfür wurden 16.97 mg Neomycin (Sulfat-Salz), 348 mg ox-HES 70 kD und 2.28 mg DMAP in 1 ml DMSO aufgelöst. Nach Zugabe von 3.83 mg DCC (1 Äquivalent) rührte man die Lösung 2 h und wiederholte die Zugabe eines Äquivalents DCC. Dieses Verfahren wurde wiederholt, bis 10 Äquivalente DCC in die Reaktionslösung zugegeben wurden. Die Reaktionszeit betrug insgesamt 24 h. Nach Zugabe von 20 ml Aceton in die Lösung fiel das Kopplungsprodukt aus. Der Feststoff wurde in Wasser aufgelöst und 48 h durch Dialyse gegen Wasser aufgereinigt. Nach Gefriertrocknung erhielt man 280 mg weißes Kopplungsprodukt (80 %).
BEISPIEL 23
Kopplung von ox-HES 70 kD an Daunorubicin
In einem Zweihalskolben wurden 0.5 mg Daunorubicin-Hydrochlorid, 829.2 mg ox- HES 70 kD und 0.108 mg DMAP in 2 ml DMSO unter Argonatmosphäre gelöst und 24 h bei 70 °C erhitzt. Anschließend gab man Aceton (20 ml) dazu, wobei das Kopplungsprodukt ausfiel. Die Lösung wurde zentrifugiert und der Präzipitat mehrmals mit Aceton gewaschen und zentrifugiert. Man erhielt einen leicht rosagefärbten Feststoff, der in Wasser aufgelöst und gegen Wasser dialysiert wurde. Nach Gefriertrocknung erhält man 656 mg (80 %) eines leicht rosa gefärbten Feststoffes. Die Reinheit des gekoppelten Daunorubicins wurde mittels RP-HPLC überprüft.
BEISPIEL 24
Kopplung von ox-HES 130 kD an 7-Aminocephalosporansäure
In einem 100-ml-Rundkolben wurden 383 mg ox-HES-130 kD und 1.22 mg 7-Amino- cephalosporansäure (Fluka #07300) in 2 ml trockenem DMSO unter magnetischem Rühren gelöst. Die Temperatur wurde auf 70°C erhöht und für 24 h gehalten. Nach dieser Zeit wurde auf 25 °C abgekühlt und das Reaktionsprodukt durch Zugabe von 20 ml Aceton ausgefällt. Der Feststoff wurde mit 20 ml Aceton gewaschen und in 20 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die weitere Reinigung des Kopplungsproduktes erfolgte mittels Dialyse gegen destilliertes Wasser. Die Lösung wurde anschließend lyophilisiert und das Produkt durch DC und GPC analysiert. Man erhielt 270 mg Kopplungsprodukt (70 %) in Form eines weißen Feststoffes. BEISPIEL 25
Kopplung von ox-HES 70 kD an 6-Aminopenicillansäure
Die in Beispiel d beschriebene Reaktion wurde auch mit 1.57 mg 6-Aminopenicillan- säure an Stelle der 7-Aminocephalosporansäure und 135.54 mg ox-HES 70 kD unter denselben Bedingungen durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde unter denselben Bedingungen aufgearbeitet und analysiert. Nach der Aufreinigung erhielt man 88 mg Kopplungsprodukt (65 %) als weißen Feststoff.
BEISPIEL 26
Kopplung von HES 40 kD an Amoxicillin
In einem Zweihalskolben wurden 4.0 ml 0.1 N Na-Phosphatpuffer (pH 7.5) vorgelegt und darin 1.5 g HES-40 kD durch Erwärmen auf 60 °C gelöst. Nach Abkühlen auf 25 °C wurden 7.0 mg Amoxicillin (Fluka #10039) unter magnetischem Rühren zugegeben. In einem separaten Gefäß wurde eine Lösung von NaBHaCN, die einem dreißigfachen molaren Uberschuss entsprach, in 2 ml des gleichen Na-Phosphat- puffers hergestellt. Mit Hilfe eines Tropftrichters wurde die Cyanoborhydrid-Lösung langsam der ersten Lösung in einem Zeitraum von 30 Minuten zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde 24-36 h lang weitergerührt und dann der pH-Wert zum Stoppen der Rektion mit 0.1 N HCI auf 4 eingestellt. Die Lösung wurde durch Dialyse entsalzt und lyophilisiert. Der Nachweis des Kopplungsprodukt erfolgte mittels GPC und UV-Photometer.
BEISPIEL 27
Kopplung von ox-HES 70 kD an Amoxicillin
In einem 100-ml-Rundkolben wurden 173 mg ox-HES 70 kD und 0.85 mg Amoxicillin in 2 ml trockenem DMSO unter magnetischem Rühren gelöst. Die Temperatur wurde auf 70°C erhöht und für 24 h gehalten. Nach dieser Zeit wurde auf 25 °C abgekühlt und das Reaktionsprodukt durch Zugabe von 20 ml Aceton ausgefällt. Der Feststoff wurde mit 20 ml Aceton gewaschen und in 20 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die weitere Reinigung des Kopplungsproduktes erfolgte mittels Dialyse gegen destilliertes Wasser. Die Lösung wurde anschließend lyophilisiert und das Produkt durch DC und GPC analysiert. Man erhält 151 mg Kopplungsprodukt (87 %) in Form eines weißen Feststoffes.
BEISPIEL 28
Kopplung von ox-HES 70 kD an Cefadroxil
In einem 100-ml-Rundkolben wurden 610 mg ox-HES 70 kD und 2.965 mg Cefadroxil in 2 ml trockenem DMSO unter magnetischem Rühren aufgelöst. Die Temperatur wurde auf 70°C erhöht und für 24 h gehalten. Anschließend kühlte man die Temperatur auf 25 °C ab und fällte das Reaktionsprodukt durch Zugabe von 20 ml Aceton aus. Der Feststoff wurde mit 20 ml Aceton gewaschen und in 20 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die weitere Reinigung des Kopplungsproduktes erfolgte mittels Dialyse gegen destilliertes Wasser. Die Lösung wurde anschließend lyophilisiert und das Produkt durch DC und GPC analysiert. Man erhielt 490 mg Kopplungsprodukt (87 %) in Form eines weißen Feststoffes.
BEISPIEL 29
Kopplung von ox-HES 70 kD an Glucagon
In einem Rundkolben werden Glucagon (66 x 10"9 mol, 0.23 mg), oxHES 70 kD (6.6 x 10"6 mol, 123 mg) in 1 ml DMSO gelöst. In Zeitabständen von 1 h gibt man in 8 Portionen DDC hinzu bis insgesamt 23.08 mg in die Reaktionslösung zugegeben worden sind. Nach einer Reaktionszeit von 24 h, wird die Reaktion durch Zugabe von 15 ml Wasser abgebrochen. Das Kopplungsprodukt durch Dialyse gegen Wasser aufgereinigt. Nach Gefriertrocknung erhält man 79 mg weißes Kopplungsprodukt (65

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Konjugat von Hydroxyalkylstärke und einer niedermolekularen Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass die bindende Wechselwirkung zwischen dem Hydroxyalkylstärkemolekül und der niedermolekularen Substanz auf einer kovalenten Bindung beruht, welche das Ergebnis einer Kopplungsreaktion zwischen (i) der endständigen Aldehydgruppe oder einer aus dieser Aldehydgruppe durch chemische Umsetzung hervorgegangenen funktionellen Gruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls und (ii) einer mit dieser Aldehydgruppe oder daraus hervorgegangenen funktionellen Gruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls reaktionsfähigen funktionellen Gruppe der niedermolekularen Substanz ist, wobei die bei der Kopplungsreaktion unmittelbar resultierende Bindung gegebenenfalls durch eine weitere Reaktion zur obengenannten kovalenten Bindung modifiziert sein kann. . Konjugat nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die aus der endständigen Aldehydgruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls hervorgegangene funktionelle Gruppe eine der funktionellen Gruppen eines bifunktionellen Linkermoleküls ist, mit dem die endständige Aldehydgruppe oder eine daraus hervorgegangene funktionelle Gruppe umgesetzt wurde. . Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktionsfähige funktionelle Gruppe der niedermolekularen Substanz eine der funktionellen Gruppen eines bifunktionellen Linkermoleküls ist, welches an die niedermolekulare Substanz gekoppelt wurde. . Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Bindung das Ergebnis einer Kopplungsreaktion zwischen einer durch selektive Oxidation der endständigen Aldehydgruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls gebildeten Carboxylgruppe oder aktivierten Carboxylgruppe und einer primären Aminogruppe oder Thiolgruppe der niedermolekularen Substanz ist. Konjugat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Bindung eine Amidbindung ist, welche das Ergebnis einer Kopplungsreaktion zwischen einem durch selektive Oxidation der endständigen Aldehydgruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls gebildeten Lacton und einer primären Aminogruppe der niedermolekularen Substanz ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Bindung eine Aminbindung ist, welche das Ergebnis einer Kopplungsreaktion zwischen der endständigen Aldehydgruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls und einer primären Aminogruppe der niedermolekularen Substanz unter Bildung einer Schiff sehen Base und der Reduktion der Schiff'schen Base zum Amin ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydroxyalkylstärkemolekül ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 70 bis etwa 1000 kD aufweist.
Konjugat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydroxyalkylstärkemolekül ein Molekulargewicht von etwa 130 kD aufweist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydroxyalkylstärkemolekül einen Substitutionsgrad von etwa 0,3 bis etwa 0,7 aufweist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydroxyalkylstärkemolekül ein Verhältnis der C2- zu Cβ-Substitution von 8 bis 12 aufweist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydroxyalkylstärkemolekül ein Hydroxyethylstärkemolekül ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die niedermolekulare Substanz ein Arzneiwirkstoff ist. Konjugat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Arzneiwirkstoff aus der Gruppe aus Antibiotika, Antidepressiva, Antidiabetika, Antidiuretika, Anticholinergika, Antiarrhytmika, Antiemetika, Antiepileptika, Antihistaminika, Antimykotika, Antisympathotonika, Antithrombotika, Andro- genen, Antiandrogenen, Estrogenen, Antiestrogenen, Antiosteoporosemitteln, Antitumormitteln, Vasodilatatoren und anderen blutdrucksenkenden Mitteln, fiebersenkenden Mitteln, Schmerzmitteln, entzündungshemmenden Mitteln, ß-Blockem, Immunsuppressiva und Vitaminen ausgewählt ist.
Konjugat nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die an der Kopplungsreaktion beteiligte funktionelle Gruppe des Arzneiwirkstoffs eine Aminogruppe ist.
Konjugat nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Arzneiwirkstoff aus der Gruppe aus Albuterol, Alendronat, Amikazin, Aminopenicillin, Amoxicillin, Atenolol, Azathioprin, Cefaclor, Cefadroxil, Cefotaxim, Ceftazidim, Ceftriaxon, Cilastatin, Cimetidin, Ciprofloxacin, Clonidin, Colistin, Cosyntropin, Cycloserin, Daunorubicin, Doxorubicin, Desmopressin, Dihydroergotamin, Dobutamin, Dopamin, Ephedrin, Epinephrin, ε-Aminocapronsäure, Ergometrin, Esmolol, Famotidin, Flecainid, Folsäure, Flucytosin, Furosemid, Ganciclovir, Gentamicin, Glucagon, Hydrazalin, Imipenem, Isoproterenol, Ketamin, Liothyronin, Lutiliberin, Merpatricin, Metaraminol, Methyldopa, Metoclopramid, Metoprolol, Mexiletin, Mitomycin, Neomycin, Netilmicin, Nimodipin, Nystatin, Octreotid, Oxytocin, Pamidronat, Pentamidin, Phentolamin, Phenylephrin, Procainamid, Procain, Propranolol, Ritodrin, Sotalol, Teicoplanin, Terbutalin, Thiamin, Tiludronat, Tolazolin, Trimethoprim, Tromethamin, Vancomycin.Vasopressin und Vinblastin ausgewählt ist.
Konjugat nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die an der Kopplungsreaktion beteiligte funktionelle Gruppe des Arzneiwirkstoffs eine Carboxylgruppe oder aktivierte Carboxylgruppe ist. Konjugat nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Arzneiwirkstoff aus der Gruppe aus Acetylcystein, Aziocillin, Aztreonam, Benzylpenicillin, Camptothecin, Cefamandol, Cefazolin, Cefepim, Cefotaxim, Cefotetan, Cefoxitin, Ceftazidim, Ceftriaxon, Cephalothin, Cilastatin, Ciprofloxacin, Clavulansäure, Dicloxacillin, ε-Aminocapronsäure, Floxacillin, Folinsäure, Furosemid, Fusidinsäure, Imipemem, Indomethacin, Ketorolac, Liothyronin, Melphalan, Methyldopa, Piperacillin, Prostacyclin, Prostaglandine, Teicoplanin, Ticarcillin und Vancomycin ausgewählt ist.
Konjugat nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die an der Kopplungsreaktion beteiligte funktionelle Gruppe des Arzneiwirkstoffs eine aliphatische oder Aryl-OH-Gruppe ist.
Konjugat nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Arzneimittelwirkstoff aus der Gruppe aus Albuterol, Allopurinol, Apomorphin, Ceftriaxon, Dobutamin, Dopamin, Doxycyclin, Edrophonium, Isoproterenol, Liothyronin, Metaraminol, Methyldopa, Minocyclin, Palcitaxel, Pentazocin, Phenylephrin, Phentolamin, Propofol, Rifamycine, Ritodrin, Taxoi, Teicoplanin, Terbutalin, Tetracyclin und Vancomycin ausgewählt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge eines Konjugats nach irgendeinem der Ansprüche 12 bis 19 sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und gegebenenfalls weitere Hilfs- und Wirkstoffe.
Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 12 bis 19 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 20 zur therapeutischen oder präventiven Behandlung von Menschen oder Tieren.
Verfahren zur Herstellung eines Hydroxyalkylstärke-Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kopplungsreaktion zwischen der endständigen Aldehydgruppe oder einer aus dieser Aldehydgruppe durch chemische Umsetzung hervorgegangenen funktionellen Gruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls und einer mit dieser Aldehydgruppe oder daraus hervorgegangenen funktionellen Gruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls reaktionsfähigen funktionellen Gruppe der niedermolekularen Substanz durchgeführt wird und wobei die bei der Kopplungsreaktion unmittelbar resultierende Bindung gegebenenfalls durch eine weitere Reaktion modifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die endständige Aldehydgruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls durch selektive Oxidation in die entsprechende Lactongruppe überführt und diese anschließend mit einer primären Aminogruppe der niedermolekularen Substanz umgesetzt wird, so dass das Hydroxyalkylstärkemolekül durch eine Amidbindung an die niedermolekulare Substanz gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die selektive Oxidation der Aldehydgruppe mit lod oder Metallionen in wässriger basischer Lösung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplungsreaktion in Gegenwart eines Carbodiimids, vorzugsweise 1-(3- Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (EDC), durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplungsreaktion in heterogener Phase durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplungsreaktion in homogener Phase in DMSO oder N-Methylpyrrolidon oder Glycol durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplungsreaktion in DMSO oder N-Methylpyrrolidon oder Glycol in Abwesenheit eines Aktivators durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet; dass die endständige Aldehydgruppe des Hydroxyalkylstärkemoleküls mit einer primären Aminogruppe der niedermolekularen Substanz unter Bildung einer Schiff sehen Base gekoppelt wird und die gebildete Schiff sehe Base zum Amin reduziert wird, so dass das Hydroxyethylstärkemolekül durch eine Aminbindung an die niedermolekulare Substanz gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Reduktionsmittel Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid oder ein organischer Borkomplex ist.
Verfahren zur Herstellung von selektiv an der endständigen Aldehydgruppe oxidierter Hydroxyalkylstärke, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydroxyalkylstärke in einem Molverhältnis von lod zu HAS von 2:1 bis 20:1 in wäßriger basischer Lösung umgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis von lod zu HAS etwa 5:1 bis 6:1 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Menge von Hydroxyalkylstärke in warmem destilliertem Wasser gelöst wird und etwas weniger als 1 Moläquivalent wässriger lodlösung zugegeben wird, b) NaOH-Lösung in einer molaren Konzentration, die etwa das 5-15fache der lodlösung beträgt, langsam tropfenweise in Abständen von mehreren Minuten der Reaktionslösung zugegeben wird, bis die Lösung nach der Zugabe beginnt, wieder klar zu werden, c) erneut etwas weniger als 1 Moläquivalent wässriger lodlösung der Reaktionslösung zugegeben wird, d) das Zutropfen der NaOH-Lösung wieder aufgenommen wird, e) die Schritte b) bis d) solange wiederholt werden, bis etwa 5,5-6 Moläquivalente lodlösung und 11-12 Moläquivalente NaOH-Lösung, bezogen auf die Hydroxyalkylstärke, zugegeben worden sind, f) die Reaktion dann abgebrochen und die Reaktionslösung entsalzt und einer Kationenaustauschchromatographie unterworfen und das Reaktionsprodukt durch Lyophilisierung gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der wässrigen lodlösung um eine etwa 0,05 - 0,5 N lodlösung handelt.
Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass die molare Konzentration der NaOH-Lösung etwa das 10fache der lodlösung beträgt.
Verfahren zur Herstellung von selektiv an der endständigen Aldehydgruppe oxidierter Hydroxyalkylstärke, dadurch gekennzeichnet, dass die HAS in wässriger alkalischer Lösung mit einem molaren Uberschuss an stabilisierten Metallionen, ausgewählt aus Cu2+-lonen und Ag+-lonen, oxidiert wird.
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