WO2004058958A1 - 補酵素結合型グルコース脱水素酵素 - Google Patents

Abstract

本発明は電子受容体存在下でグルコースを酸化する反応を触媒し、マルトースへの作用性が5%以下と低く、1,10-フェナントロリンで阻害される微生物由来の可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を提供する。さらに、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造方法および該該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した測定方法ならびに測定試薬を提供する。本発明により補酵素結合型グルコース脱水素酵素の産業的用途への応用が可能となり、該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した試料中のグルコースの測定方法、消去方法、有機化合物の製造方法などを含む物質生産および分析の用途において使用が可能となる。また、血糖値を正確に測定可能なグルコースセンサを提供可能となった。よって、医薬、臨床分野および食品分野での素材の改質加工に使用可能であるなど、利用価値の高い酵素の提供が可能となった。

Description

明細書

補酵素結合型グルコース脱水素酵素

技術分野 本発明は、 新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素、 該補酵素結合型 グルコース脱水素酵素の製造方法、 および該補酵素結合型グルコース脱水素酵素の 生産能を有する微生物に関する。 また、 本発明は試料中のグルコースの測定に際し、 該補酵素結合型グルコース脱 水素酵素を使用した測定方法、 該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を含有する試 薬および試薬組成物に関する。 さらには有機化合物の製造方法などを含む製造原料 などの物質生産および分析の用途に関する。 さらに、 本発明は試料中の特定成分を迅速かつ簡便に高精度で定量することがで きるバイオセンサに関する。 具体的には、 該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を 使用したグルコースセンサに関する。

背景技術 ダルコ一スは血液中に存在し、 糖尿病の重要なマーカ一として利用されている。 グルコース測定法としては、 従来から化学法と酵素法が存在するが、 一般的に特異 性、 安全性の面で酵素法が優れているとされている。 酵素法としては、 グルコース ォキシダーゼ、 グルコース- 6-リン酸脱水素酵素あるいは NAD (P)依存性グルコース 脱水素酵素を使用した測定法がある。 しかし、 グルコースォキシダーゼあるいはグ ルコース- 6-リン酸脱水素酵素を使用した測定法は、 複数の酵素を使用するため簡 便な反応系ではない。 また、 このグルコース- 6-リン酸脱水素酵素を使用したおよ び N A D ( P )依存性グルコース脱水素酵素を使用した測定法では反応系に補酵素であ る NAD (P)を添加しなければならないという煩雑性があった。 近年、 試料中の特定成分について、 試料液の希釈や撹拌などを行うことなく簡易 に定量する方式として、 様々なバイオセンサが提案されている。 例えば、 バイオセ ンサは、 絶縁性の基板上にスクリーン印刷などの方法で作用極、 対極および参照極 からなる電極系を形成し、 この電極系上に接して親水性高分子と酸化還元酵素と電 子受容体を含む酵素反応層を形成したものなどがある。 糖尿病患者が年々増加しており、 病院のみならず在宅でも利用可能でかつ簡便な 血糖の測定方法および血糖値の管理手段が求められている。 現在、 血糖測定用とし て、 簡易型のグルコースセンサが使用されているが、 こうしたセンサに広く使用さ れているグルコースォキシダーゼは、 溶存酸素濃度によつて測定値に誤差が生じる 可能性が高い。 また、 ニコチンアミ ド系補酵素依存性のグルコース脱水素酵素を用 いたバイオセンサは、 バックグラウンドのノイズが高く、 補酵素や補助酵素などを 別途添加する必要があるため反応系が複雑であり、 さらに発色系による測定の場合 は高価な光学系を必要とするなどの欠点がある。 溶存酸素濃度の影響を受けず、 かつ NAD (P)非存在下においてグルコースに作用 する酵素として、 ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素が知 られているが、 該ピロロキノリンキノンは酵素と解離しやすいという問題点があつ た。 さらに、 特開 2000- 350588号公報および特開 2001- 197888号公報において開示 されたピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素は、 グルコース に対する選択性が低いという欠点があった。 一方、 大腸菌（Escher ichi a col i)由来 ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（特開平 10-243786 号 公報）、 シユードモナス 'エスピー（Pseudomonas sp. )由来ピロ口キノリンキノンを 補酵素とするグルコース脱水素酵素（Agr ic. B iol. Chem. (1980) 44 : 1505-1512) , およ びダルコノバクタ一 ·サブォキシダンス（Gluconobac ter suboxydans)由来ピロロキ ノ リ ン キ ノ ン を 補 酵 素 と す る グ ル コ ー ス 脱 水 素 酵 素 (Agr ic. Biol. Chem. (1981) 45 : 851- 861)のマルト一スに対する作用性は、 それぞれ 3%、 3. 2%, であるが、 菌体の膜画分に存在しているため、 可溶化による酵素の抽 出操作が必要という煩雑性があつた。 また、 グルコースの 3 位の水酸基を酸化する補酵素結合型グルコース- 3-脱水素 酵素が、 J. Biol. Chem. (1967) 242 ： 3665-3672, Appl. Microb iol. B iotechnol. (1999) 51 ： 58-64、 Ap l. B iochem. B iotechnol. (1996) 56 ： 301-310 および Enzyme Microb. Technol. (1998) 22 ： 269-274 で報告されているが、 いずれもグ ルコースに対する選択性が低い。 マルトースは輸液成分として広く使用されており、 輸液を投与した患者の血中マルトース濃度は髙いため、 グルコースに特異的に作用 し、 特にマルト一スへの作用性が低い血糖測定用酵素の開発が望まれていた。

本発明は、 上に述べた産業上の要請に応えるため、 グルコースに対する基質認識 性に優れ、 マルト一スに対する作用性の低い、 新規なグルコース脱水素酵素を提供 すること、 その製造方法および生産能をもつ微生物を提供することを課題としてい る。

また、 本発明は新規なダルコース脱水素酵素を利用したグルコースを迅速かつ簡 便に高精度で定量可能な優れたグルコース測定方法、 測定試薬およびバイオセンサ、 さらにはグルコース消去試薬を提供することを課題としている。

発明の開示 本発明は前記課題を解決するためになされたものであって、 本発明者らは、 各方 面から検討した結果、 新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素に着目し た。 該補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、 電子受容体存在下でグルコースを酸 化する反応を触媒し、 例えば、 EC (酵素番号） 1. 1. 99 に分類される酵素である。 さ らに、 本発明者らは、 該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を生産する各種微生物 を鋭意検索した結果、 補酵素結合型グルコース脱水素酵素の生産微生物および補酵 素結合型グルコース脱水素酵素を見出した。 本発明は、 触媒反応時において補酵素が常に結合したグルコース脱水素酵素を提 供する。 該補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、 電子受容体存在下で、 ダルコ一 ス、 特にグルコースの 1位の水酸基を酸化する反応を触媒するという理化学的性質 をもつ。 該補酵素結合型グルコース脱水素酵素はマルト一スへの作用性が 5%以下、 好ましくは 3%以下であり、 マルトースへの作用性が低い。 また、 該補酵素結合型 グルコース脱水素酵素は 1, 10-フエナントロリンで酵素反応が阻害される性質を有 し、 終濃度 5mM の 1, 10-フエナント口リンで 50%以上阻害され、 好ましくは 2mM 1, 10-フエナント口リンで 50 以上阻害され、 より好ましくは lmM 1, 10-フエナント 口リンで 50%以上阻害される。 また、 該補酵素結合型グルコース脱水素酵素は 50mM クェン酸 · ナトリウム緩衝液（pH5. 5)存在下において、 50°Cで 15 分の熱処理後も 85%以上の残存酵素活性を有する。 本発明のグルコース脱水素酵素に結合する補酵 素は、 例えばフラビン化合物であればよく、 例えばフラビンアデニンジヌクレオチ ドなどの補酵素である。 また、 本発明は、 該補酵素結合型グルコース脱水素酵素の 性質および/または実質的に同等な性質を有するタンパク質またはその塩について、 該タンパク質をコードするアミノ酸配列あるいは当該配列に 1またはそれ以上のァ ミノ酸残基の欠失、 置換もしくは付加による変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 生物学的に活性で安定なタンパク質を含む。 さらに、 本発明の補酵素結合型ダルコ ース脱水素酵素は、 微生物由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素であり、 好ま しくは真核微生物由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素、 より好ましくは寄託 菌株 FERM BP-08578由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素である。 現在までにァスペルギルス ·ォリゼ（Aspergi l lus oryzae)の細胞質画分および培 養液中に、 フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコース脱水素酵素 の 存 在 が 確 認 さ れ て い る （ KHAN- GI BAK (BIOCHEMICA ET BI0PHYSI CA ACTA. (1967) 139 : 277-293) ) ₀ しかし、 該グルコース脱水素酵素は重金属イオンのみ で阻害され、 1， 10-フエナントロリンを含む金属キレーターで阻害されないという 特徴の理化学的性質を有する。 そのため、 該グルコース脱水素酵素を使用した測定 系における反応停止試薬として重金属以外は使用できず、 反応停止後の重金属廃液 の処理が煩雑であるといった問題を有している。 またこの酵素は安定性が低く、 実 用性に難が有る。 一方、 本発明で見出した補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、 その特徴として、 従来知られていたァスペルギルス ·ォリゼ由来補酵素結合型ダル コース脱水素酵素に比べて安定性が高く、 また重金属イオンの他、 微量の 1, 10-フ ェナントロリンで阻害されるため反応停止などの作業が簡便という性質を有してい る。 本発明は、 新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造方法を提供 する。 本発明は、 新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素生産能を有する微 生物を提供する。 該微生物は好ましくは真核微生物であり、 より好ましくはァスぺ ルギルス (Aspergi 1 l us) 属、 さ らに好ま しく はァスぺルギルス · テレウス (Aspergi l l us te rreus)であり、 最も好ましくは寄託菌株 FERM BP- 08578である。 本発明は、 新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した方法を 提供する。 好ましくは試料中のグルコースの測定に際し、 該補酵素結合型ダルコ一 ス脱水素酵素を使用したダルコースの測定方法である。 補酵素結合型ダルコース脱 水素酵素を使用したグルコースの消去方法および有機化合物の製造方法である。 本発明は、 新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を含有する試薬を 提供する。 該試薬は、 好ましくは試料中のグルコースの測定に用いる該補酵素結合 型グルコース脱水素酵素を含有するグルコースの測定試薬、 および補酵素結合型グ ルコース脱水素酵素を含有するグルコースの消去試薬および有機化合物の製造試薬 である。 本発明は、 新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を含有する試薬組 成物を提供する。 該組成物は、 好ましくは試料中のグルコースの測定に用いる該補 酵素結合型グルコース脱水素酵素を含有するグルコースの測定組成物、 補酵素結合 型グルコース脱水素酵素を含有するグルコースの消去組成物および有機化合物の製 造用原料である。 本発明は、 新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用するバイオ センサを提供し、 試料中の特定成分を定量および/または定性可能なバイオセンサ を提供する。 該バイオセンサは、 好ましくは、 該補酵素結合型グルコース脱水素酵 素を使用したグルコースセンサである。 これら本発明の提供する測定方法、 測定試薬、 測定化合物、 バイオセンサのひ とつの好ましい態様は、 かかる測定反応系にフェリシアン化カリウム （へキサシァ ノ鉄（I I I)酸カリウム） を終濃度 2mM- 500mM で用いることを特徴とするものである。 本発明において、 該補酵素結合型グルコース脱水素酵素の 「マルトースに対する 作用性」、 「マルト一スへの作用性」 およびこれに類似する表現で 「作用性」 として 表示される値 ）は、 該酵素のグルコースに対する酵素活性を 10Mとし、 そのマル ト一スもしくは作用性の対象とされる物質に対する該活性の相対強度を百分率で表 した数値である。

図面の簡単な説明 図 1は、 実施例 3 ( 3. 2) の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の相対活性は）と pH との関係を示した図である。 記号は測定値および緩衝液の種類を示し、 緩衝液はそ れぞれ、 口クェン酸 · リン酸ナトリウム緩衝液（pH4. 6〜6. 2)、 ♦リン酸カリウム緩 衝液（pH6. 8- 7. 2) , 〇トリス ·塩酸緩衝液（pH7, 8〜8. 6)および▲ダリシン ·水酸化 ナトリウム （pH9. 2〜9. 5) である。 該酵素の至適 pHは pH 7. 0〜9. 0であった。 図 2は、 実施例 3 (3. 3) の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の残存活性 ）と pH との関係を示した図である。 記号は測定値および緩衝液の種類を示し、 緩衝液はそ れぞれ、 口クェン酸 · リン酸ナトリウム緩衝液（pH3. 2〜6. 4)、 ♦リン酸カリウム緩 衝液（pH6. 3〜 9)、 〇トリス ·塩酸緩衝液（pH7. 3〜8. 6)および▲ダリシン ·水酸化 ナトリゥム緩衝液（ρΗ9· 1〜11. 4)である。 該酵素の安定 pHは pH 4. 5〜8. 5であった。 図 3 は、 実施例 3 (3. 4) の補酵素結合型グルコース脱水素酵素相対活性 Wと温度 との関係を示した図である。 該酵素の至適温度は、 55°C付近であった。 図 4 は、 実施例 3 (3. 5) の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の熱処理後の残存 活性 Wと処理温度との関係を示した図である。 酵素は約 50°C以下で安定であるこ とが示された。 図 5 は、 実施例 4 のグルコース定量のための検量線で、 DCIP 吸光度変化一ダルコ ース濃度を示す。 図 6は、 実施例 5の補酵素結合型グルコース脱水素酵素固定化電極でのグルコース 定量の検量線である。 記号はそれぞれ、 Xはアルゴン飽和、 △は酸素飽和、 〇は空 気飽和条件下を示す。

発明を実施するための最良の形態 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、 例えば、 EC 1. 1. 99 に分類され る酵素であり、 好ましくは EC 1. 1. 99. 10、 EC 1. 1. 99. 13もしくは EC 1. 1. 99. 17で 示される酵素であればよく、 補酵素結合型の酵素であり、 好ましくは可溶性の補酵 素結合型酵素である。 つまり、 酵素の抽出および/または精製過程で界面活性剤を 使用することなく、 水溶液の状態で取出し得る酵素である。 ここでいう補酵素とは、 フラビン化合物であればよく、 フラビンアデニンジヌクレオチド、 フラビンモノヌ クレオチドなどが挙げられる。 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、 触媒反応時において、 補酵素が 常に結合したダルコース脱水素酵素であればよい。 該補酵素結合型グルコース脱水 素酵素は、 少なくとも以下の性質を有する。 電子受容体存在下でグルコースを酸化 する皮応を触媒し、 特にグルコースの 1位の水酸基を酸化する反応を触媒するとい う理化学的性質を有する。 また、 該補酵素結合型グルコース脱水素酵素のマルトー スへの作用性は低く、 たとえば 5 以下、 好ましくは 3 以下である。 さらに、 該補 酵素結合型グルコース脱水素酵素の酵素活性は終濃度 5mM 1, 10-フエナント口リン で 50%以上阻害され、 好ましくは 2mM 1, 10-フエナント口リンで 50%以上阻害され、 より好ましくは lmM 1, 10-フエナントロリンで 50%以上、 より最適には ImM 1, 10- フエナント口リンで 60%以上阻害される。 また、 該補酵素結合型グルコース脱水素 酵素は 50mM クェン酸 ·ナトリウム緩衝液（_PH5.5)存在下において、 50°Cで 15分の 熱処理後も 85%以上の残存酵素活性率を有する。 また、 本発明は、 上述する理化学 的性質を有する補酵素結合型グルコース脱水素酵素に関し、 または該補酵素結合型 グルコース脱水素酵素と実質的に同等な活性を有するタンパク質またはその塩につ いて、 該タンパク質をコードするアミノ酸配列あるいは当該配列に 1またはそれ以 上のアミノ酸残基の欠失、 置換もしくは付加による変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 生物学的に活性で安定なタンパク質および塩であり、 該理化学的性質をコ一 ドするアミノ酸配列に関する。 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素であるタンパク質およびその塩は、 上記理化学的性質を有する微生物由来が好ましい。 本発明の補酵素結合型ダルコ一 ス脱水素酵素の由来となる微生物、 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の 生産能を有する微生物としては、 例えば、 原核生物に属するァーカンギゥム (Archangium)属、 ァ一ケォグロバス （Archaeoglobus)属、 ァーセノ フ ォナス (Arsenophonus) 属、 ァ一 レ ンシァ （Ahrensia) 属、 ァゥ レオパク テ リ ゥム (Aureobacterium)属、 ァェロコッカス（Aerococcus)属、 ァェロピルム（Aeropyrum) 属、 ァエロミクロビゥム（Aeromicrobium)属、 ァエロモナス（Aeromonas)属、 アキフ ェクス （Aduifex)属、 アクアスピリ ラム （Aduaspirillum)属、 アクアバクタ一 (Aduabacter)属、 アクアパクテリゥム（Anuabacterium)属、 アクアミクロピウム (Aduamicrobium)属、 ァクチノアロティクス（Act inoal loteichus)属、 ァクチノキネ ォスポラ（Actinokineospora)属、 ァクチノコラリア（Actinocorallia)属、 ァクチノ シネマ（Actinosynnema)属、 ァクチノスポランギゥム（Actinosporangium)属、 ァク チノパクルム（Actinobaculum)属、 ァクチノバチルス（Act inobaci 1 lus)属、 ァクチ ノビク二ジゥム（Actinopycnidium)属、 ァクチノビスポラ（Actinobispora)属、 ァク チノプラネス（Actinoplanes)属、 ァクチノポリスポラ（Actinopolyspora)属、 ァク チノポリモルファ （Actinopolymorpha)属、 ァクチノマイセス（Act inomyces)属、 ァ クチノマジユラ（Actinomadura)属、 ァクロカルボスポラ（Acrocarpospora)属、 ァグ ロコッカス（Agrococcus)属、 ァグロパクテリゥム（Agrobacterimn)属、 ァグロマイ セス（Agromyces)属、 ァクロマチゥム（Achromatium)属、 ァグロモナス（Agromonas) 属、 ァクロモバクタ一（Acliromobacter)属、 アコレプラズマ（Acholeplasma)属、 ァ サイァ（Asaia)属、 ァシジアヌス（Acidianus)属、 ァシジスファエラ（Acidisphaera) 属、 ァシジフイリゥム（Acidiphilium)属、 ァシジミクロピウム（Acidimicrobium)属、 ァシジ口バス（Acidilobus)属、 ァシダミノコッカス（Acidaminococcus)属、 ァシダ ミノバク夕一 (Acidaminobacter)属、 ァシヂチォバチルス（Acidithiobacillus)属、 アジトコッカス（Agitococcus)属、 ァシドサ一マス（Acidothermus)属、 ァシドセラ (Acidocella)属、 ァシ ドバクテリ ウ Λ (Acidobacterium)属、 ァシ ドポラクス (Acidovorax) 属 、 ァ シ ド モ ナ ス （Acidomonas) 属 、 ァ シ ネ ト ノ ク タ 一 (Acinetobacter)属、 ァスチカコ一リス （Asticcacaulis)属、 ァステロレプラズマ (Asteroleplasma)厲、 ァセチトマクラム （Acet i tomaculum)属、 ァセチビブリオ (Acetivibrio)属、 ァセトアナエロピウム（Acetoanaerobium)属、 ァセトゲニゥム (Acetogenium)属、 ァセトサーマス（Acetothermus)属、 ァセトネマ（Acetonema)属、 ァセトパクター（Acetobacter)属、 ァセトバクテリゥム（Acetobacterium)属、 ァセ トハロピウム（Acetohalobium)属、 ァセトフイラメンタム（Acetof i lamentum)属、 ァ セトミクロビゥム（Acetomicrobium)属、 ァゾァ一カス（Azoarcus)属、 ァゾスピラ (Azospira)属、 ァゾスピリラム (Azospirillum)属、 ァゾトバクタ一 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エイケネラ (Eikenella) 属、 エー リ キ ア （Ehrlichia) 属、 ェ ク シグオノ ク テ リ ゥム (Exiguobacterium)属、 ェクセロスポラ（Excel lospora)属、 ェク トチォロドスビラ (Ectothiorhodospira)属、 ェジフシァネラ （Aegypt ianel la)属、 エッガーセラ (Eggerthella) 属、 エ ッ シェ リ ヒ ァ （Escherichia) 属、 エ ド ワー ド シエラ (Edwards iel la)属、 エビンゲラ (Ewingella)属、 エペリスロゾーン (Eperythrozoon) 属、 エリシぺロスリクス（Erysipelothrix)属、 エリスロバクタ一（Erythrobacter) 属、 エリス口ミクロビゥム（Erythromicrobium)属、 エリスロモナス（Erythromonas) 属、 エリ トロスポランギゥム（Elytrosporangium)属、 エルシニア（Yersinia)属、 ェ ルビニァ（Erwinia)属、 エレモコッカス（Eremococcus)属、 ェンシファー（Ensi fer) 属、 ェンテロコッカス（Enterococcus)属、 ェンテロバクタ一（Enterobacter)属、 ェ ントモプラズマ（Entomoplasma)属、 ェンヒドロパクター（Enhydrobacter)属、 ェン ぺドパクター（Empedobacter)属、 ォエノコッカス（Oenococcus)属、 ォエルスコビア (Oerskovia)属、 ォ一シャニモナス （Oceanimonas)属、 才ーシャ ノスピリ ラム (Oceanospirillum)属、 ォキサロバクタ一（Oxalobacter)属、 ォキサロファガス (Oxalop agus) 属、 ォキソパク ター （Oxobacter) 属、 ォク 夕デカバク タ一 (Octadecabacter)属、 ォク ロバク トラム （Ochrobactrum)属、 オシ口ク ロ リス (Oscillochloris)属、 オシロスビラ （Oscillospira)属、 ォべスムバクテリゥム (Obesumbacterium)属、 オリエンチア（Orient ia)属、 オリゲラ（Oligella)属、 オリ ゴトロファ （Oligotropha)厲、 オリパクラム（Oribaculum)属、 オルニチニコッカス (Ornithinicoccus)属、 オルニチニミクロピウム（Ornithinimicrobium)属、 オル二 トパクテリ ゥム （Ornithobacterium)属、 ォレニァ （Orenia)属、 ガー ドネレラ (Gardnerella) 属、 カ ーニモナス （Ca.rnimonas) 属、 力 一 ノ ノ ク テ リ ゥム (Carnobacterium)属、 カウチオプラネス（Couchioplanes)属、 カウドリア（Cowdria) 属、 カウロバクタ一（Caulobacter)属、 力セォバクタ一（Caseobacter)属、 力テニバ クテリゥム（Catenibacterium)属、 力テニュ口プラネス（Catenuloplanes)属、 カテ ノコッカス （Catenococcus)属、 力テラ トスポラ （Catellatospora)属、 力 卜ネラ (Catonella) 属 、 カ プス ラ リ ス （Capsularis) 属、 力 プ ノ シ ト フ ァ ー ガ (Capnocytophaga)属、 ガリォネラ (Gal 1 ionel la)属、 力リオフアノン (Caryophanon) 属、 ガリコラ（Gallicola)属、 カリマトバクテリゥム（Calymmatobacterium)属、 力 ルディ ォバクテリ ゥム （Cardiobacterium) 属、 カルディ セル口シラプ夕一 (Caldicellulosiruptor)属、 カルディバーガ（Caldivirga)属、 カルデロパクテリゥ ム（Calderobacterium)属、 カルボキシジブラキゥム（Carboxydibrachium)属、 カル ボキシドサ一マス（Carboxydothermus)属、 カルポフィラス（Carbophilus)属、 カロ ラマ夕一（Caloramator)属、 キサントパクター（Xanthobacter)属、 キサントモナス (Xanthomonas)属、 キシレラ（Xylella)属、 キシロフィラス（Xylophilus)属、 キセノ ラ ブダス （Xenorhabdus) 属、 キタサ ト ァ （Kitasatoa) 属、 キ夕サ ト スポラ (Kitasatospora) 属、 キチ ノ フ ァ ーガ （Chitinophaga) 属、 キ ト コ ッ カ ス (Kytococcus)属、 キネォコッカス（Kineococcus)属、 キネォスポリア（Kineosporia) 属、 キネラ（Quinella)属、 キブデロスポランギゥム（Kibdelosporangium)属、 キヤ ン ピロパク ター （Campylobacter) 属、 キンゲラ （Kingella) 属、 ク ツネ リ ア (Kutzneria) 属、 ク プ リ ア ビダス （Cupriavidus) 属、 ク ラ ウ ロ コ ッ カ ス (Craurococcus) 属、 グ ラ シェ コ ラ （Glaciecola) 属、 グ ラ シ リ Aチルス (Gracilibacillus) 属、 グラニユ リ 力テラ （Granul icatel la) 属、 グラノヽメ ラ (Grahamella)属、 クラビバクタ一（Clavibacter)属、 クラミジァ（Chlamydia)属、 ク ラミ ドフイラ（Chlamydophila)属、 クリオバクテリゥム（Cryobacterium)属、 グリコ マイセス （Glycomyces)属、 クリシォゲネス （Chrysiogenes)属、 クリスチスビラ (Cristispira)属、 クリセォパクテリゥム（Chryseobacterium)属、 クリセォモナス (C ryseoionas)属、 ク リ ナリ ウム （Crinal ium)属、 ク リ プトスポランギゥム (Cryptosporangium)属、 クリプトバクテリゥム（Cryptobacterium)属、 クリベラ (Kluyvera) 属 、 ク リ ベ ラ （Kribbella) 属 、 ダ ル コ ナ セ ト パ ク タ ー (Gluconacetobacter) 属、 ダルコ ノ バク タ一 （Gluconobacter) 属、 ク ルチア (Kurthia) 属、 クル トノ クテ リ ゥム (Curtobacter ium) 属、 タ レ ノ ス リ クス (Crenothrix)属、 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（Thermoleophilum) 厲、 サイ ト フ ァーガ （Cytophaga) 属、 ザィ モパクター (Zymobacter)属、 ザィモフィラス（Zymophilus)属、 .ザィモモナス（Zymomonas)属、 サギッッラ（Sagittula)属、 サッカロコッカス（Saccharococcus)属、 サッカロスリ クス（Saccharothrix)属、 サッカロバクタ一（Saccharobacter)属、 サッカロポリス ホラ（Saccliaropolyspora)属、 サッカロモノスポラ（Saccharomonospora)属、 ザノ リレ ジニァ（Zavarzinia)属、 サブテルコラ（Subtercola)属、 サプロスビラ（Saprospira) 属、 サムソニァ（Samsonia)属、 サリニコッカス（Salinicoccus)属、 サリニビブリオ (Salinivibrio)属、 サリバチルス (Sal ibaci 1 lus)属、 サルコビゥム (Sarcobium)属、 サルチナ （Sarcina) 属、 サルモネラ （Salmonel la) 属、 サレゲンチバクタ一 (Salegentibacter)属、 サンギパクター（Sanguibacter)属、 サンダラシノバクタ一 (Sandaracinobacter) 属、 ジア ドパク ター （Dyadobacter) 属、 ジア リ ス ター (Dialister)属、 ジエツチア（Dietzia)属、 シェワネラ（Shewanella)属、 ジォスリク ス （Geothrix) 属、 ジオダ一マ ト フ ィ ラス （Geodermatophilus) 属、 ジオ トガ (Geotoga)属、 ジォパクター（Geobacter)厲、 ジォバチルス（Geobaci 1 lus)属、 ジォ ビブリオ（Geovibrio)属、 ジクチォグロムス（Dictyoglomus)属、 シクロクラスチカ ス （Cycloclasticus)属、 シクロセルペンス（Psychroserpens)属、 シクロノ 'クタ一 (Psychrobacter)属、 シクロパクテリゥム（Cyclobacterium)属、 シクロフレキサス (Psychrof lexus)属、 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(Dechloro onas) 属、 テサラ コ ッ カ ス (Tessaracoccus)属、 デスルファシナム（Desulfacinum)属、 デスルフイ トパクテリ ゥム（Desulf itobacterium)属、 デスルフォカプサ（Desulfocapsa)属、 デスルフォコ ッカス (Desulfococcus)属、 ァス レフ才サ Jレチナ (Desulfosarcina)属、 テス Jレフ才 スピラ（Desulfospira)属、 デスルフォスポロシナス（Desulfosporosinus)属、 デス ルフォセラ（Desulfocella)属、 デスルフオタレア（Desul fotalea)属、 デスルフォチ グナム（Desulfotignum)属、 デスルフォ トマクラム（Desulfotomaculum)属、 デスル フ ォ ナ ト ロ ナム （Desul fonatronum) 属、 デス ル フ ォ ナ ト ロ ノ ビ ブ リ オ (Desulfonatronovibrio) M, デスルフオニスポラ（Desulfonispora)属、 デスルフォ ネマ（Desulfonema)属、 デスルフォバ一ガ（Desulfov ga)属、 デスルフォパクター (Desulfobacter)属、 デスルフォバクテリゥム（Desul f obacterium)属、 デスルフォ バクラ（Desulfobacula)属、 デスルフォパッカ（Desulfobacca)属、 デスルフォバル バス（Desulfobulbus)属、 デスルフオハ口ピウム（Desulfohalobium)属、 デスルフォ ビブリオ（Desuliovibrio).属、 デスルフオフアスティス（Desulfofustis)属、 デスル フオフアバ（Desulfofaba)属、 デスルフオフリガス（Desulfofrigus)属、 デスルフォ ミクロビゥム（Desulfomicrobium)属、 デスルフォモナス（Desul fomonas)属、 テスリレ フォモニレ（Desulfomonile)属、 デスルフォラブダス（Desul forhabdus)属、 デスル フォロパルス（Desulforliopalus)属、 デスルフレラ（Desulfurella)属、 デスルフロ 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ドスピラ （Halorhodospira)属、 パン トエア (Pantoea)属、 パンドラエア（Pandoraea)属、 バンピロビブリオ（Vampirovibrio)属、 ピクロフィラス（Picrophilus)属、 ピシリケッチア（Piscirickettsia)属、 ヒッペア (Hippea) 属、 ビ ト レオ シ ラ （Vitreoscilla) 属、 ビ フ イ ド バ ク テ リ ゥム (Bifidobacterium)属、 ビブリオ（Vibrio)属、 ヒメノバクタ一（Hymenobacter)属、 ピメ ロパクター （Pimelobacter)属、 ピリ メ リ ァ （Pi 1 imel ia)属、 ヒルスキア (Hirschia)属、 ピレラ （Pirel la)属、 ビレルラ （Pirel lula)属、 ピロコ ッカス (Pyrococcus)属、 ピロジクチウム（Pyrodictium)属、 ピロチナ（Pillotina)属、 ピロ バクルム（Pyrobaculum)属、 ピロフイラ (Bilophila)属、 ピロ口パス（Pyrolobus)属、 ファェニァ（Faenia)属、 フアクラミア（Facklamia)属、 ファスコラ一ク トバクテリ ゥム（Phascolarctobacterium)属、 フアルシビブリォ（Falcivibrio)属、 ファンジバ クタ一（Fundibacter)属、 フイ ネゴルジァ （Finegoldia)属、 フイ ブロバクタ一 (Fibrobacter) 属、 フ ィ リ ノ ク タ 一 （Filibacter) 属、 フ イ リ フ ア ク タ ー (Filifactor)属、 フイ ロパクテリ ゥム （Phyl lobacterium)属、 フイ ロバチルス (Filobacillus)属、 フイ ロミクロビゥム（Filomicrobium)属、 フエォスピリラム (Phaeospirillum)属、 フエ二ロバクテリウム（Phenylobacterium)属、 フェリバクテ リウム（Ferribacterium)属、 フェリモナス（Ferrimonas)属、 フェルピドバクテリウ ム （Fervidobacterium)属、 フエログロパス （Ferroglobus)属、 フエ口プラズマ (Ferroplasma)属、 フォコエノパクター（Phocoenobacter)属、 フォトパクテリゥム (Photobacterium)属、 フォ トラブダス （Photorhabdus)属、 フ オルミ ビブリオ (Formivibrio)属、 フソパクテ リ ゥム （Fusobacterium)属、 ブチアゥクセラ (Buttiauxella) 属、 ブチ リ ビブ リ ォ （Butyr ivibr io) 属、 プデロ ビブ リ ォ (Bdellovibrio)属、 ブドビシァ（Budvicia)属、 プフエ二ジァ（Piennigia)属、 ブフ ネ ラ （Buchnera) 属、 フ ュ ー ジバク 夕 一 （Fusibacter) 属、 プラ ウセ レ ラ (Prauserella)属、 ブラギア（Pragia)属、 ブラキスビラ（Brachyspira)厲、 ブラキバ クテリゥム（Brachybacterium)属、 ブラキモナス（Brachymonas)属、 プラス卜クロり ス （Blastochloris)属、 ブラス トコッカス （Blastococcus)属、 ブラス 卜バク夕一 (Blastobacter)属、 ブラス トモナス （Blastomonas)属、 ブラタバクテリ ゥム (Blattabacterium)属、 ブラディ リゾビゥム （Bradyrhizobium)属、 フラテゥリア (Frateuria)属、 ブラナメラ（Branhamel la)属、 プラノコッカス（Planococcus)属、 プラノテトラスポラ（Planotetraspora)属、 プラノビスポラ（Planobispora)属、 プ ラノポリスボラ（Planopolyspora)属、 プラノミクロビゥム（Planomicrobium)属、 プ ラノモノスポラ（Planomonospora)属、 フラビモナス（Flavimonas)属、 フラポバクテ リ ウム （Flavobacterium)属、 フラメォバーガ （Flammeovirga)属、 フランキア (Frankia)属、 プランクトマイセス（Planctomyces)属、 フランシセラ（Francisella) 属、 フ リ ー ド マ二エ ラ （Friedmanniella) 属、 フ リ ゴ リ ノ ク テ リ ゥ ム (Frigoribacterium)属、 フルオリバクタ一（Fluoribacter)属、 ブルクホルデリア (Burkholderia)属、 ブルセラ（Brucella)属、 ブレイジァ（Bulleidia)属、 フレキシ スチぺス（Flexistipes)属、 フレキシスリクス（Flexithrix)属、 フレキシパクタ一 (Flexibacter) 属、 フ レク トバチルス （Flectobaci 1 lus) 属、 プレシオモナス (Plesiomonas)属、 プレネリア (Brenneria)属、 ブレバンジモナス (Brevundimonas) 属、 ブレビネマ（Brevinema)属、 ブレビパクテリゥム（Brevibacterium)属、 ブレビ バチルス （Brevibacillus)属、 プレボテラ （Prevotel la)属、 プロクロロコッカス (Prochlorococcus)属、 プロクロロスリクス （Prochlorothrix)属、 プロクロロン (Prochloron) 属、 ブロ コ ト リ ク ス （Brochothrix) 属、 プロステコ ク ロ リ ス (Prosthecochloris)属、 プロステコバクタ一（Prosthecobacter)属、 プロステコミ クロビゥム （Prosthecomicrobium)属、 プロテウス （Proteus)属、 プロ トモナス (Protomonas)属、 プロピオニゲニゥム （Propionigenium)属、 プロピオニスビラ (Propionispira)属、 プロピオニスポラ （Propionispora)属、 プロピオ二パクター (Propionibacter)属、 プロピオニバクテリゥム（Propionibacterium)属、 プロピオ 二ビブリオ（Propionivibrio)属、 プロピオ二フェラクス（Propioniferax)属、 プロ ビデンシァ（Providencia)属、 フロミクロモノス ラ（Promicromonospora)属、 フロ リ ノポルス （Prolinoborus)属、 ベイジリ ンキア （Bei j erinckia)属、 ベイロネラ (Veillonella)属、 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ポリアンギゥム（Polyangium)属、 ポリヌクレオパクター（Polynucleobacter)属、 ポルカ二エレラ（Volcaniel la)属、 ボルデテラ（Bordetella)属、 ホルデマニア（Holdemania)属、 ボルフイロパクター (Porphyrobacter)属、 ボルフイロモナス（Porphyromonas)属、 ポレリア（Borrel ia) 属、 ホロスポラ（Holospora)属、 ホロファーガ（Holophaga)属、 ホンギア（Hongia)属、 マイォサ一マス（Meiothermus)属、 マイコバクテリゥム（Mycobacterium)属、 マイコ プラズマ （Mycoplasma) 属、 マイ コ プラナ （Mycoplana) 属、 マイ セ ト コ ラ (Mycetocola) 属 、 マ イ ロ イ デス （Myroides) 属 、 マ グ ネ ト ス ピ リ ラ ム (Magnetospirillum) 属、 マク ロ コ ッ カス （Macrococcus) 属、 マク ロモナス (Macromonas)属、 マツシリア（Massil ia)属、 マリカウリス（Maricaul is)属、 マリク ロマチウム（Marichromatium)属、 マリココッカス （Mar inococcus)属、 マリニトガ (Marinitoga) 属、 マ リ 二ラ ビ リ ア （Marinilabilia) 属、 マ リ ノ ス ピ リ ラム (Marinospirillum)属、 マリノバクタ一（Marinobacter)属、 マリノバクテリゥム (Marinobacterium) 属 、' マ リ ノ モ ナ ス (Marinomonas) 属 、 マ ル モ リ コ ラ (Marmoricola)属、 マロノモナス（Malono匪 as)属、 マンノヽィミア（Mannheimia)属、 ミカビブリオ（Micavibrio)属、 ミクソコッカス（Myxococcus)属、 ミクロエロポスポ リア（Microellobosporia)属、 ミクロコッカス （Micrococcus)属、 ミクロシクラス (Microcyclus)属、 ミクロシステイス（Microcystis)属、 ミクロシラ（Microscilla) 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メタノブレビバクタ一 (Metlianobrevibacter)属、 メタノミクロビゥム（Methanomicrobium)属、 メタノラシ ニァ （Methanolacinia)属、 メタ ノ ロバス （Methanolobus)属、 メタロスフェラ (Metallosphaera)属、 メチルァ一キユリア （Methylarcula)属、 メチロカルダム (Methylocaldum) 属、 メチロ コ ッ カス （Methylococcus) 属、 メチロサルチナ (Methylosarcina) 属、 メチロシステイ ス （Metliylocyst is) 属、 メチロシナス (Methylosinus) 属、 メ チ ロ ス フ ェ ラ (Methylosphaera) 属 、 メ チ ロ セ ラ (Methylocella)属、 メチロパク夕一 （Methylobacter)属、 メチロバクテリ ゥム (Methylobacterium) 属、 メチロバチルス （Methylobaci 1 lus) 属、 メチロ ビラ (Methylo ila) 属、 メ チ ロ フ ァ 一ガ （Methylophaga) 属、 メ チ ロ フ ィ ラ ス (Methylophilus) 属、 メチロボラス （Methylovorus) 属、 メチロミ ク ロ ビゥム (Metliylomicrobiui) 属、 メチロモナス （Methylomonas) 属、 メチロ ラ ブダス (Methylorhabdus)属、 メニスカス（Meniscus)属、 メリタンギゥム（Mel ittangium)属, メ リ ッソコッカス （Mel issococcus)属、 モェレレラ （Moel lerel la)属、 モーレラ (Moorella) 属、 モギバクテ リ ゥム （Mogibacter ium) 属、 モデス トパク ター (Modestobacter)属、 モビランカス（Mobiluncus)属、 モラキセラ（Moraxella)属、 モ ルガネ ラ （Morganella) 属、 モルチエ レ ラ （Mortiella) 属、 モ ロ コ ッ カ ス (Morococcus) 属、 ュ一バク テ リ ゥ ム （Eubacterium) 属、 ョ ー ドノ ク タ 一 (Iodobacter)属、 ョケネラ（Yokenel la)属、 ラ一ネラ（Rahnella)属、 ラウールテラ ( aoultella) 属 、 ラ ク ト コ ッ カ ス （Lactococcus) 属 、 ラ ク ト ス フ ェ ラ (Lactosphaera) 属、 ラ ク 卜 ノ チ レス （Lactobacillus) 属、 ラ ク ノ ス ピ ラ (Lachnospira)属、 ラタイパクター （Rathayibacter)属、 ラブドク ロマチウム (Rhabdochromatium)属、 ラブリス（Labrys)属、 ラルストニア（Ralstonia)属、 ラロ バクタ一（Rarobacter)属、 ランプ口システィス（Lamprocyst is)属、 ランプロバクタ 一 (Lamprobacter) 属、 ラ ン プロ ぺデ ィ ア （Lampropedia) 属、 リ エ メ レ ラ (Riemerella)属、 リケッチア（Rickettsia)属、 リケツチエレラ（Rickettsiel la)属、 リケネラ（Rikenella)属、 リステリア（Listeria)属、 リストネラ（Listonel la)属、 リ ソバクタ一 （Lysobacter)属、 リ ゾパク夕一 （Rhizobacter)属、 リ ゾビゥム (Rhizobium)属、 リゾモナス（Rhizomonas)属、 リチカム（Lyticum)属、 リムノバクタ — (Limnobacter)属、 ルイネラ（Lewinel la)属、 ルェゲリア（Rueger ia)属、 ルガモナ ス ( ugamonas) 属、 Jレシノ ク テ リ ウム (Lucibacterium) 属、 Jレティ モナス (Luteimonas)属、 Jレテ才コッカス（Luteococcus)厲、 Jレネラ（Runel la)属、 Jレブリビ バク ス （Rubrivivax) 属、 ルブリ モナス （Rubr imonas) 属、 ルブロバク タ一 (Rubrobacter) 属、 レ ミ ノ コ ッ カ ス （Ruminococcus) 属、 Jレ ミ ノ ノ ク タ 一 (Ruminobacter)属、 レイフソニァ（Leifsonia)属、 レクレルシア（Leclercia)属、 レ ケバリエリア（Lechevalieria)属、 レジオネラ（Legionel la)属、 レニパクテリゥム ( enibacteriui) M, レビネア（Levinea)属、 レプトスピラ（Leptospira)属、 レプト スポリラム（Leptospirillum)属、 レブトスリクス（Leptothrix)属、 レプトトリキア (Leptotrichia)属、 レプトネマ（Leptonema)属、 レミノレラ（Leminorella)属、 レン ッエア （Lentzea) 属、 ロイ コス リ クス （Leucothrix) 属、 ロイ コ ノ ス ト ッ ク (Leuconostoc)属、 ロイコノ、'クタ一（Leucobacter)属、 ローソニア（Lawsonia)属、 口 一ト ロ ピア （Lautropia) 属、 ロカ リ メ ァ （Rochal imaea) 属、 ロセァテ レス は oseateles)属、 ロセイナトロノバクタ一（Roseinatronobacter)属、 ロセイビゥム (Roseibium)属、 ロセイビバクス（Roseivivax)属、 ロセォコッカス（Roseococcus)厲、 ロセォスピラ（Roseospira)属、 口セォスピリラム（Roseospirillum)属、 ロセォパク 夕 一 （Roseobacter) 属、 ロセォバ リ ウ ス （Roseovarius) 属、 口セォモナス (Roseomonas)属、 ロセブリア（Roseburia)属、 口ダノノ、、クタ一（Rhodanobacter)属、 口チア（Rothia)属、 ロドコッカス（Rhodococcus)属、 ロドサ一マス（Rhodothermus) 属、 ロドシクラス（Rhodocyclus)属、 ロドシス夕（Rhodocista)属、 ロドシユードモ ナス （Rhodopseudomonas) 属、 ロ ドス ビラ （Rhodospira) 属、 ロ ドス ピ リ ラム (Rhodospirillum)属、 ロドタラシゥム（Rhodothalassium)属、 口ドパカ (Rhodobaca) 属、 ロ ドパク夕一（Rhodobacter)属、 ロ ドゼゥム （Rhodobium)属、 ロ ドビブリオ (Rhodovibrio)属、 ロドピラ（Rhodopila)属、 ロドフェラクス（Rhodof erax)属、 ロド プラネス （Rhodoplanes) 属、 ロ ドプラム （Rhodovulum)属、 ロ ドミ ク ロ ピウム (Rhodomicrobium)属、 ロネピネラ（Lonepinel la)属、 ワイセラ（Weissella)属、 ヮド リァ（Waddlia)属などに属するものが挙げられる。 また、 例えば真核微生物に属するイツサチェンキア（Issatchenkia)属、 カンジダ (Candida) 属、 ク リ プ ト コ ッ カ ス （Cryptococcus) 属、 ク リ ベロマイ セス (Kluyveromyces) 属、 ク ロエ ッ ケラ （Kloeckera) 属、 サッ カ ロ マイ コ デス (Saccharomycodes)属、 サッカロマイセス（Saccharomyces)属、 ジゴサッカロマイセ ス (Zygosaccharomyces)属、 シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces)属、 シロ パシジゥム（Sirobasidium)属、 ステリグマトマイセス（Sterigmatomyces)属、 スポ リ ドポラス（Sporidobolus)属、 スポロボロマイセス（Sporobolomyces)属、 デッケラ (Dekkera) 属、 デバ リ オマ イ セ ス （Debaryomyces) 属、 ト リ コ ス ポ ロ ン (Tr ichosporon)属、 トリゴノフシス（Trigonopsis)属、 トルラスポラ（Torulaspora) 属、 ト レ メ ラ （Tremella) 属、 ナ ド ソ ニァ （Nadsonia) 属、 ネマ ト ス ポ ラ (Nematospora)属、 ハンセニァスポラ（Hanseniaspora)属、 ピキア（Pichia)属、 フィ ブロバシジゥム（Fibulobasidium)厲、 フイロパシジゥム（Filobasidium)属、 フイロ パシジエラ （Filobasidiella)属、 ブレラ （Bui lera)属、 ブレツタノマイセス (Brettanomyces) 厲、 ホルターマ ンニァ （Holtermannia) 属、 マ ラ ッ セジァ (Malassezia)厲、 メチニコィァ（Metschnikowia)属、 リポマイセス（Lipomyces)属、 ロイコスポリジゥム（Leucosporidium)属、 口ドスポリジゥム（Rhodosporidium)属、 ロドトルラ（Rhodotorula)属、 ァカウ口ペイジ（Acaulopage)属、 アクアモルチェレ ラ（Adiia謝 tierella)属、 アセラリア（Asel lar ia)属、 ァモェビジゥム（Amoebidium) 属、 ァモェポフィルス（Amoebophilus)属、 アルンジヌラ（Arundinula)属、 ゥサロミ ケス（Utharomyces)属、 ェキノスポランジゥム（Echinosporangium)属、 ェンテロブ リ ウ ス （Enterobryus) 属 、 エ ン ド ゴ ネ （Endogone) 属 、 ェ ン ト モ フ ト ラ (Entomophthor ) 属 、 キ ク セ ラ （Kickxella) 属 、 ゲ ニ ス テ ロ ス ボ ラ (Genistellospora)属、 コアネフオラ（Clioanephora)属、 コエマンシァ（Coemansia) 属、 コクロネマ（Cochlonema)属、 コニジオボルス（Conidiobolus)属、 サクセナエア (Saksenaea) 属 、 サ ム 二 ジ ゥ ム （Thamnidium) 属 、 サ ム ノ セ フ ァ リ ス (Thamnocephalis)属、 ジスビラ（Dispira)属、 ジマルガリス（Dimargaris)属、 シン セフアラストルム（Syncephalastrum)属、 シンセファリス（Syncephalis)属、 ズーぺ イジ（Zoopage)属、 スクレ口キスチス（Sclerocyst is)属、 スミチウム（SmittiunO属、 バシジオボルス（Basidiobolus)厲、 パラタエ二エラ（Parataeniella)属、 パラモェ ビジゥム（Paramoebidium)属、 パラヮスキア（Palavascia)属、 ハルペラ（Harpella) 属、 ピプトセファリス（Piptocephalis)属、 ピロボルス（Pilobolus)属、 フィコミケ ス（Phycomyces)属、 ブラケスレア（Blakeslea)属、 ヘッセルチネラ（Hessel tinel la) 属、 ヘリコケフアルム（Helicocephalum)属、 ミコチファ （Mycotypha)属、 ラジオミ ケス （Radiomyces) 属、 レゲ リ オミ ケス （Legeriomyces) 属、 ロノ \° 口 ミ ケス (Rhopalomyces)属、 アクラシス（Acrasis)属、 ァシトステリゥム（Acytostel ium)属、 アルシリア（Arcyria)属、 ェキノステリゥム（Echinostelium)属、 ェキノステリォプ シス （Echinosteliopsis) 属、 オ リ ゴネマ （Oligonema) 属、 カポステ リ ゥム (Cavostelium) 属、 グッ リ ノ プシス （Gut tul inops is) 属、 ク ラ ス 卜 デルマ (Clastoderma)属、 クリブラリア（Cribraria)属、 コエノニァ（Coenonia)属、 コプロ ミクサ（Copromyxa)属、 コマトリ力（Comatriclia)属、 コロデルマ（Col loderma)属、 ジァネマ （Dianema)属、 ジクチォステリ ゥム （Dictyostel ium)属、 ジジミゥム (Didymium)属、 ジデルマ（Diderma)属、 ステモニチス（Stemoni Us)属、 スラウスト キトリウム（Thraustochytrium)属、 セラチォミクサ（Ceratiomyxa)属、 セラチォミ クセラ（Ceratiomyxella)属、 トリキア（Trichia)属、 フィサルム（Physarum)属、 プ ラスモジオフオラ（Plasmodiophora)属、 フリゴ（Ful igo)属、 ブルスラ（Bursul la)属、 プロトステリゥム（Protostelium)属、 プロトスポランジゥム（Protosporangium)属、 へミ トリキア（Hemitrichia)属、 ペリカェナ（Perichaena)属、 ポリスフォンジリウ ム（Polysphondylium)属、 ポリミクサ（Polymyxa)属、 ラビリンツラ（Labyrinthula) 属、 ランプ口デルマ（Lamproderma)属、 リコガラ（Lycogala)属、 リセァ（Licea)属、 ワードミケス（Wardmyces)属、 ァクチノペルテ（Actinopel te)厲、 ァステロスポリウ ム （Asterosporium) 属、 ァルス リ ニゥ ム （Arthrinium) 属、 アルタ ナ リ ア (Alternaria)属、 オイジゥム（Oidium)属、 クラポスポリゥム（Clabosporium)属、 ク ラ ドポトリウム（Cladobotryum)属、 グラフィゥム（Graphium)属、 コレト トリクム (Colletotrichuni) 属、 ス ク レ 口 チウム （Sclerotium) 属、 ス 夕 ゴノ ス ボ ラ (Stagonospora)属、 スチベラ（St ibel la)属、 ッベルクラリア（Tubercularia)属、 バ クトリジゥム（Bactridium)属、 ピクノスリウム（Pycnothyrium)属、 ファェオイサリ ァ （Phaeoisaria)属、 ペスタ ロ ッチエラ （Pestalozziel la) 属、 リ ゾク トニア ( hizoctonia) 属、 リ ノ ク ラ ジエラ （Rhinocladiel la) 属、 レプ ト ス リ ウム (Leptothyrium) 属、 ァク リ オゲ ト ン （Achlyogeton) 属、 ァニソルビジウム (Anisolpidimn)属、 アルブゴ（Albugo)属、 ェクトロゲラ（Ectrogella)属、 オリピジ ゥム（Olipidium)属、 オルビジォプシス（Olpidiopsis)属、 力テナリア（Catenaria) 属、 キトリジゥム（Chytridium)属、 クラドキトリウム（Cladochytrium)属、 コエロ モミ ケス （Coelomomyces) 属、 ゴナポジァ （Gonapodya) 属、 サプロ レグニァ (Saprolegnia) 属、 シ ロ ル ビ ジ ウ ム （Sirolpidium) 属、 シ ン キ ト リ ウ ム (Synchytrium) 属、 八 リ フ ト ロ ス （Hal iphthoros) 属、 ハルポキ ト リ ウ ム (Harpochytrium)属、 ピチウム（Pythium)属、 ヒフォキトリウム（Hyphochytrium)属、 フイソデルマ（Physoderma)属、 フイ リクチジゥム（Phlyctidium)属、 ブラストクラ ジァ （Blastocladia) 属、 ぺロ ノ スボラ （Peronospora) 属、 ぺロ ノ フ ィ ト ラ (Peronophythora)属、 ミクロミコプシス （Micromycopsis)属、 メガキ ト リ ウム (Megachytrium) 属、 モ ノ ブレフ ァ リ ス （Monoblepliaris) 属、 ラゲ二ジゥム (Lagenidium)厲、 リジジォミケス (Rhizidiomyces)属、 リソジゥム（Rhizidium)属、 リ ピジゥム （Rhipidium)属、 レブトミタス （Leptomitus)属、 レブトレダニエラ (Leptolegniella) 属、 ア ク レモニゥム （Acremonium) 属、 ァ ス ペルギルス (Aspergillus)属、 アブシジァ（Absidia)属、 ァラクニオタス（Araclmiotus)属、 ァ ルスロポトリス（Arthrobotrys)属、 ゥロクラジウム（Ulocladium)属、 ェキノポトリ ゥム （Echinobotryum) 属、 ェ ク ソ フ ィ ア ラ （Exophiala) 属、 ェ ピ コ ッ ク ム (Epicoccum) 属、 オイ ジォデン ド ロ ン （Oidiodendron)属、 ォエ ドセフ ァラム (Oedocephalum) 属、 オーレォバシジゥム （Aureobasidium) 属、 クルブラ リ ア (Curvularia) 属、 カ ンデラブレラ （Candelabrella) 属、 カ ンニングノヽメ ラ (Cunning amella) 属、 ギムノ アスカス （Gymnoascus) 厲、 ク ラ ドスポ リ ゥム (Cladosporium)属、 グラフィゥム（Graphium)属、 ダリオクラジウム（Gliocladium) 属、 クリソスポリゥム（Chrysosporium)属、 クロメロスポリウム（Chromelosporium) 属、 ゲォ ト リ クム （Geotrichum)属、 ゲォミ ケス （Geomyces)属、 ケ ト ミ ゥム (Chaetomium) 属、 ゲニ ク リ フ エ ラ （Geniculifera) 属、 ゴナ ト ポ ト リ ス (Gonatobotrys)属、 コニォチリゥム（Coniothyrium)属、 サ一シネラ（Circinella)属、 ジゴリンクス （Zygorhynchus)属、 ジプロジァ（Diplodia)属、 シリンド口カーボン (Cyl indrocarpon)属、 スコブラリオプシス （Scopulariopsis)属、 ス夕チボトリス (Stachybotrys)属、 ステンフィ リ ウム （Stemphyl ium)属、 スポロス リ ッ クス (Sporothrix)属、 セぺドニゥム（Sepedonium)属、 ダクチレラ（Dactylella)厲、 タラ 口ミケス（Talaromyces)属、 ドラトミケス（Dratomyces)属、 トリクルス（Tr ichurus) 属、 トリコクラジウム（Trichocladium)厲、 トリコセシウム（Trichothecium)属、 ト リコデルマ（Trichoderma)属、 トリコフィ トン（Trichophyton)属、 ニグロスポラ (Nigrospora)厲、 パーチシクラジェラ （Vert icicladiella)属、 バーチシリウム (Verticillium)属、 パェシ口ミケス（Paeci lomyces)属、 ピトミケス（Pi thomyces)属、 ビポラリス （Bipolaris)属、 ピレノキエ夕 （Pyrenochaeta)属、 フィァロセファラ (Phialocephala)属、 フィァロフオラ（Phialophora)属、 フォーマ（Phoma)属、 フザ リウム （Fusarium)属、 ぺスタ口チォプシス （Pestalotiopsis)属、 ぺニシリウム (Penicillium)属、 ポトリチス（Botrytis)属、 ミクロスポルム（Microsporum)属、 ミ 口セシウム（Myro thee ium)属、 ムコール（Mucor)属、 メムノ二エラ（Memnoniel la)属、 モナクロスポリゥム （Monacrosporium)属、 モニリア （Monilia)属、 モルチエレラ (Mortierella)属、 ユーぺニシリウム（Eupenicillium)属、 ユーロチウム（Eurotium) 属、 リゾプス（Rhizopus)属、 レプトグラフィゥム（Leptographium)属、 ロビラーダ (Robillarda)属、 ァゥス トロボレ ト ウ ス （Austroboletus)属、 ァゥリクラ リア (Auricularia)属、 アウリスカルピゥム（Auriscalpium)属、 ァガリクス（Agaricus) 属、 ァグロキべ（Agrocybe)属、 ァステロフォナ（Asterophona)属、 ァストラエウス (Astraeus)属、 ァセロェ（Aseroe)属、 ァネルラリア（Anel laria)属、 アマゥロデル マ（Amauroderma)属、 アマ二夕（Amani )属、 アルミルラリア（Armi 1 laria)属、 アル ミルラリエルラ （Armillariella)属、 ァレゥリア （Aleuria)属、 イスクノデルマ (Ischnoderma)属、 イノキべ（Inocybe)属、 イノノ トウス （Inonotus)属、 イレオディ クテイオン（Ileodictyon)属、 ウィンネア（Wynnea)属、 ヴエルパ（Verpa)属、 ヴオル ヴア リエルラ （Volvariella)属、 ウルヌ ラ （Urnula)属、 ェキノ ドンティ ゥム (Echinodontiuni)属、 ェクシディア（Exidia)属、 エルフヴインギア（Elivingia)属、 ォゥデマンシェルラ （Oudemansiella)属、 ォムファリナ（Omphal ina)属、 オンニァ (Onnia)属、 力夕テラスマ（Catathelasma)属、 ガノデルマ（Ganoderma)属、 カマロフ ィルス（Camarophyllus)属、 カルキポルス（Chalciporus)属、 ガレリナ（Galerina)属、 カロケラ（Calocera)属、 カロストマ（Calostoma)厲、 カンタレルス（Cantharellus) 属、 カン夕レルラ （Cantharellula)属、 キア トウス （Cyathus)属、 キク口ミケス (Cyclomyces)厲、 キストデルマ（Cystoderma)属、 キプトトラマ（Cyptotrama)属、 キ マトデルマ（Cymatoderaa)属、 ギムノビルス （Gymnopilus)属、 キューネ口ミケス (Kuehneromyces)属、 ギロドン（Gyrodon)属、 ギロポルス（Gyroporus)属、 ギロミ ト ラ（Gyromitra)厲、 グェピニァ（Guepinia)属、 クサントコニゥム（Xanthoconium)属、 ク シラ リ ア （Xylaria)属、 クセロコムス （Xerocomus)属、 クセロンフ ァ リ ナ (Xeromphalina)属、 クドニァ（Cudonia)属、 クラヴァティア（Clavatia)属、 クラヴ アリア（Clavaria)属、 クラヴアリアデルフス（Clavariadelphus)属、 クラヴィコ口 ナ （Clavkorona) 厲、 ク ラ ヴゥ リ ナ （Clavulina) 属、 ク ラ ヴ ゥ リ ノ プシス (Clavulinopsis)属、 クラテレルス（Craterel lus)属、 クラトルス（Clathrus)属、 ク リ トキべ （CUtocybe)属、 ク リ ト ビルス （CI i topi lus)属、 ク リ ニペルリ ス (Crinipellis)属、 グリフオラ（Grifola)属、 クリプトデルマ（Cryptoderma)属、 ク リブトポルス （Cryptoporus)属、 クルキブルム （Crucibulum)属、 ク レオ口フス (Creolophus)属、 クレピドトウス（Crepidotus)属、 クロォゴムフス（Chroogomphus) 属、 クロロスプレニウム（Chlorosplenium)属、 ゲァストルム（Geastrum)属、 ゲォロ ッスム（Geolossum)属、 コティ リディア（Cotyl idia)属、 コノキベ（Conocybe)属、 コ パヤ シァ （Kobayasia) 属、 コ プ リ ヌ ス （Coprinus) 属、 ゴム フ ィ ディ ウス (Gomphidius)属、 ゴムフス（Gomphus)属、 コリオルス（Cor iolus)属、 コルディケプ ス（Cordyceps)属、 コルティナリウス（Cortinarius)属、 コルトリキア（Coltricia) 属、 コルリ ビア （Collybia)属、 サルコスキファ （Sarcoscypha)属、 サルコ ドン (Sarcodon)属、 サルコドンティア（Sarcodont ia)属、 スィルス（Suillus)属、 スキゾ フィルム （Schizophyllum)属、 スクアマ二夕 （SQuamaidta)属、 スクテルリニア (Scutellinia)属、 スクレ口デルマ（Scleroderma)厲、 ステレゥム（Stereum)厲、 ス トロピロミケス（Strobilomyces)属、 スト口ファリア（Stropharia)属、 スパトゥラ リ ァ （Spathularia) 属、 スパ ラ ッ シス （Sparassis) 属、 ダエダレオプシス (Daedaleopsis)属、 ダクリオミケス（Dacryomyces)属、 ダルディニァ（Daldinia)属、 デイクティオフオラ（Dictyophora)属、 ティロピルス（Tylopilus)属、 ティロミケス (Tyromyces)属、 デスコレア（Descolea)属、 テレフオラ（Thelephora)属、 トウロス トマ（Tulostoma)属、 トラメテス（Trametes)属、 トリコグロッスム（Trichoglossum) 属、 トリココマ（Trichocoma)属、 トリコロマ（Tricoloma)属、 トリコロモプシス (Tricholomopsis)属、 トレメルラ（Tremella)属、 トレメルロドン（Tremellodon)属、 ナェマ ト ロマ （Naematoloma) 属、 二 ド ウ ラ （Nidula)属、 ネオブルガ リ ァ (Neobulgaria)属、 バエォスボラ（Baeospora)属、 パクシルス（Paxi 1 lus)属、 バッ夕 レア （Battarea)属、 パナェォルス （Panaeolus)属、 パヌス （Panus)属、 パネルス (Panellus)属、 バンケラ（Bankera)属、 ヒグロキべ（Hygrocybe)属、 ヒグロフォルス (Hygrophorus)属、 ヒグロ フ ォ ロプシス (Hygrophoropsis)属、 ビスポレルラ (Bisporella)属、 ピソリ トウス（Pisol ithus)属、 ヒドヌム（Hydnum)属、 ヒドネルム (Hydnellum)属、 ヒプシジグス（Hypsizygus)属、 ピプトポルス（Piptoporus)属、 ヒ ポクシロン （Hypoxylon)属、 ヒメノカエテ（Hymenochaete)属、 ヒルシォポルス (Hirschioporus)属、 ピ レロデ レマ（Pyrrhoderma)属、 ファヴオ レス（Favolus)属、 ファェォルス （Phaeolus)属、 ファェォレピオ夕 （Phaeolepiota)属、 ファルス (Phallus)属、 フィストウリナ（Fistulina)属、 フィルロトプシス（Phyllotopsis)属、 フィルロボルス（Phylloporus)属、 フィロボレトウス（Fi loboletus)属、 フェルリヌ ス（Phellinus)属、 フォミ トプシス（Fomi topsis)属、 フォメス（Fomes)属、 フォリオ 夕（Pholiota)属、 プサティレルラ（Psathyrella)厲、 プシロキべ（Ps i locybe)属、 プ セウドコルス（Pseudocolus)厲、 プセウドヒアトウラ（Pseudohiatula)属、 プテルラ (Pterula) 属、 フ ラ ン ム リ ナ （Flammul ina) 属、 プル ヴエ ロ ポ レ ト ウ ス (Pulveroboletus)属、 ブルガリア（Bulgaria)属、 プルテウス（Pluteus)属、 プレゥ ロキベルラ （Pleurocybella)属、 プレゥロ トウス （Pleurotus)属、 プレクタニア (Plectania>属、 フロギオティス（Phlogiotis)属、 ぺジザ（Peziza)属、 ぺニキルリ ォプシス（Penicilliopsis)属、 へべロマ（Hebeloma)属、 ヘリキゥム（Hericium)属、 ヘルヴエルラ （Helvella)属、 ポ ドス ト ロマ （Podostroma)属、 ポリ オゼルス (Polyozellus)属、 ポリポルス（Polyporus)属、 ポリポレルス（Polyporellus)属、 ホ ルターマンニァ（Holtermannia)属、 ポルビティウス（Bolbi t ius)属、 ボルフィ レル ス（Porphyrellus)属、 ポレティヌス（Boletinus)属、 ポレテルス（Boletellus)属、 ポレ ト ウス （Boletus)属、 ポレ トプシス （Boletopsis)属、 ポロディ スクルス (Porodisculus)属、 ボンダルゼウイァ （Bondarzewia)属、 マクロキスティディア (Macrocystidia) 属、 マ ク ロ ポディ ア （Macropodia) 属、 マ ク ロ レ ビオタ (Macrolepiota)属、 マラスミウス（Marasmius)属、 マラスミエルス（Marasmiel lus) 属、 ミクロポルス（Microporus)属、 ミケナ（Mycena)属、 ミ トルラ（Mitrula)属、 ム ティヌス（MuUnus)属、 メラノレゥカ（Melanoleuca)属、 メルリウス（Merulius)属、 モルケラ （Morchella)属、 ラエティ ポルス （Laetiporus)属、 ラ ク タ リ ウス (Lactarius)属、 ラシオスファエラ (Lasiosphaera)属、 ラッ刀リア（Laccaria)属、 ラマリア （Ramaria)属、 ランプテロミケス （Lampteromyces)属、 リオフィルム (Lyophyllum)属、 リギドボルス（Rigidoporus)属、 リコペルドン（Lycoperdon)属、 リジナ（Rhizina)属、 リスルス（Lysurus)属、 リマケルラ（Limacella)属、 リンデラ (Lindera)属、 ルッスラ（Russula)属、 レゥココプリヌス（Leucocoprinus)属、 レゥ コパクシルス （Leucopaxillus)属、 レオティ ア （Leotia)属、 レスピナ ト ウス (Resupinatus)属、 レツキヌム （Leccinum)属、 レビオタ （Lepiota)属、 レビス夕 (Lepista)属、 レンジテス（Lenzites)属、 レン夕リア（Lentaria)属、 レンティヌス (Lentinus)属、 レンティヌラ（Lent inula)属、 レンティネルス（Lent inel lus)属、 口 ジテス（Rozites)属、 ロドキべ（Rhodocybe)属、 ロドトウス（Rhodotus)属、 ロドフィ ルス（Rhodophyllus)属などに属するものが挙げられる。

本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の生産能を有する上記微生物は、 受 託番号で IF0や ATCCなどに寄託されており、 公知の分譲機関、 法人より入手可能 である。 該微生物として、 好ましくは真核微生物、 より好ましくは糸状菌に属する 微生物が挙げられる。 また 「97508」 として命名され、 独立行政法人産業技術総合 研究所 特許生物寄託センターに、 FERM BP- 08578 として寄託された微生物を使用 してもよい。 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造方法としての一態様は、 本発 明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の生産能を有する微生物を栄養培地にて培 養し、 培養液中に補酵素結合型グルコース脱水素酵素を生成蓄積せしめこれを採取 し、 補酵素結合型グルコース脱水素酵素であるタンパク質およびその塩を取得する ことが挙げられる。 以下、 本発明の寄託菌株 FERM BP- 08578、 該菌株に由来する補酵素結合型ダルコ —ス脱水素酵素、 および該酵素の取得方法について説明する。

1. FERM BP- 08578由来の該酵素の理化学的性質

(1) 作用 ： 国際生化学連合（IUB)の分類で EC 1. 1. 99. 10に該当する酵素であり、 電 子受容体存在下でグルコースの 1位の水酸基を酸化してダルコノ- 5 -ラクトンを生 成する以下の反応を触媒する。 グルコース + 電子受容体 → ダルコノ- <5 -ラク トン + 還元型電子受容体 本発明においては、 電子受容体として例えばフエナジンメ トサルフェート、 1-メ トキシ -5-メチルフエナジゥムメチルサルフェイ 卜、 2, 6-ジクロロフエノールイン ドフエノール、 フェリシアン化合物などが挙げられ利用できる。

(2) 基質特異性：下記する活性測定方法 1 で D-グルコースおよび他の各基質（D-セ ロビオースは 193mM、 D-トレハロースおよび！)-ラフイノースは 121mMを除き、 いず れも終濃度 ' 333mM)を使用した場合の該酵素の相対反応性（基質特異性）は、 表 1 の 様であった。 また、 終濃度 550mM、 lOOmMの ！)-グルコースおよびマルト一スを使用 した場合の相対反応性（基質特異性）は、 表 2の様であった。 D-グルコースには強く 作用し、 D-マンノース、 1, 5-アンヒドロ- D-グルシトール、 D-セロビオース、 D- I、 レハロース、 マルトース、 D-ガラク トース、 D-グルコース- 6-リン酸、 D -フルク ト —スには弱く作用した。 また、 L-ァラビノース、 ラクトース、 D-ソルビトール、 グ ルコン酸、 スクロース、 D-マンニトール、 L-ソルボース、 D-リポース、 L-ラムノー ス、 D-グルコース-卜リン酸、 D-ラフイノース、 エタノール、 グリセロールにはほ とんど作用しなかった。

(3) 至適 pH： H 7. 0から pH 9. 0 (4) 安定 pH： H 4. 5から H 8. 5

(5) 至適温度： 55で付近 (6) 温度安定性 ： 50°C以下で安定である

(7) 分子量：ゲル濾過法で測定した分子量は約 130kDa であり、 ドデシル硫酸ナト リゥム-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法では約 85kDaであった。 (8) Km値： 49. 7mM D -グルコース

(9) 等電点：等電点電気泳動法で測定した補酵素結合型グルコース脱水素酵素の等 電点 <pl)は、 約 4. 4であった。 ( 10) 阻害剤：下記する活性測定方法 1 に、 終濃度 ImMの各添加物を添加し、 活性 を測定したところ、 対照区に対し、 各添加物により表 3の様な阻害効果が認められ た。 また、 下記する活性測定法 1 に、 各終濃度の 1, 10-フエナント口リン（メタノ ールに溶解）を添加したところ表 4 の様な阻害効果が認められた。 本酵素の活性は、 重金属イオン（Ag+、 Cu²⁺、 Hg²⁺)で強く阻害され、 · 1, 10-フエナント口リン、 プロフ ラビン、 Mn"で 60 以上阻害された。

( 1 1) 補酵素 ： フラビンアデニンジヌクレオチド 補酵素結合型グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝 子の塩基配列に関しても本発明に属する。

本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造に際し、 該補酵素結合型ダル コース脱水素酵素製造に使用される微生物は、 本発明の補酵素結合型グルコース脱 水素酵素を生産可能な生物であればよく、 例えば、 微生物、 好ましくは真核微生物、 より好ましくは糸状菌に属する微生物を使用して効率的に製造することができる。 特には、 「97508」 と命名され、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ ンターに、 FERM BP-08578 として寄託された微生物を使用してもよい。 該寄託菌株 は、 本発明者らによって土壌中より分離され、 その菌学的性質は、 下記の通りであ る。 なお、 本発明においては、 前記菌株の変異株も使用できる。 変異株は、 紫外線、 ェックス線などの放射線または化学的変異剤（NTG など）などの処理によって得られ る。

2. FERM BP- 08578の菌学的性質

(1) 形態的性質 ： ポテト ·デキストロース寒天培地上で生育した本菌株の光学顕微 鏡下での形態的特徴を以下に記述する。 菌糸は幅 2 mから 4 ΠΙ、 規則的な隔壁を 有する。 菌糸の大半は直線的な生育で、 膨化した菌糸はほとんどみられず、 分枝を 有する。 数本の菌糸がより集まり、 菌糸束を形成する。 菌糸幅はほぼ一定。 菌糸の 表面は平滑で、 壁はやや厚い。 気中菌糸基部を中心に結晶体の形成がある。

かすがい連結の形成はみられない。 培戔 2週間後までの菌体からは有性 ·無性生殖 器官の形成はみられず、 分裂子および厚壁胞子の存在もみられない。

(2) 各培地での生育状態 ： 全ての寒天培地上において菌糸は綿毛状。 気中菌糸色調 は白色を呈する。 ポテト ·デキストロース寒天培地培養では淡橙色から橙色の裏面 着色を呈する。 生育は中程度で、 25°C 1 週間培養後のコロニーはポテト ·デキス トロースおよびオートミール寒天培地で直径 30随から 35mm、 麦芽エキス寒天培地 では直径 37mmから 38匪であった。 また、 ポテト ·デキストロース寒天培地培養で 淡黄色、 オートミール寒天培地で薄赤色ないし灰赤色の可溶性色素の産生がみられ た。 培養 2週間後までの菌体からは分生子柄などの生殖器官の形成はみられず、 滲 出液の産生もみられなかった。

(3) 生理的性質：本菌株は、 好気性で、 ポテト ·デキストロース寒天培地において 生育至適温度は 37°C付近である。

3. FERM BP- 08578の分類学的特徴 以上の性質に基づき寄託菌株である 「97508」 を、 ホークスワース、 サッ トン、 エーンズワース編、 エーンズワース ' アンド ' ビスビーズ 'ディクショナリー ' ォ ブ ·ザ · ファンジャィ第 7版に従って検索を行った。 この検索から該寄託株は、 ァ スペルギルス （Aspergi l l us)属に属する微生物であることが示された。 さらに、 BLAST相同性検索を行った。 ゲノム DNA をテンプレートとして、 PCR法により 18s rDNA フラグメントの増幅を行った後、 精製した PCR 産物の配列を解読した。 類似 の塩基配列を GenBank (GenBank/EMBL/DDBJ 国際 DNA配列データベース）から検索す るため、 BLAST (Al t scliul e t al. , 1997)による相同性検索を行った結果、 該寄託株 「97508」 は、 ァスペルギルス ·テレウス（Aspergi l lus terreus)であることが判明 した。 本発明における補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造方法の一態様として、 上記の微生物を培養し、 微生物菌体内および/または菌体外に該補酵素結合型ダル コース脱水素酵素を発現、 もしくは生産させ得る方法が挙げられる。 本発明で使用される微生物の培養には、 通常の微生物培養用培地が使用でき、 炭 素源、 窒素源、 無機物その他使用微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有する ものであれば、 合成培地、 天然培地の何れでも使用可能である。 炭素源としては、 グルコース、 シュクロース、 デキストリン、 澱粉、 グリセリン、 糖蜜などが使用で きる。 窒素源としては、 塩化アンモニゥム、 硝酸アンモニゥム、 .硫酸アンモニゥム、 リン酸アンモニゥムなどの無機塩類、 DL-ァラニン、 L -グルタミン酸などのアミノ 酸類、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 麦芽エキス、 コーンスティープリカ一な どの窒素含有天然物が使用できる。 無機物としては、 リン酸一ナトリウム、 リン酸 ニナトリウム、 リン酸一カリウム、 リン酸二カリウム、 硫酸マグネシウム、 塩化第 二鉄などが使用できる。 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を得るための培養は、 通常、 振盪培 養や通気攛拌などの方法による好気的条件下で行うのがよく、 25 でから 60 ° (：、 かつ PH 5より 8の範囲で行うのが好ましい。 培養期間は 2 日から 4日の範囲が 好ましい。 この様な方法で培養することにより、 培養物中、 特に培養液中に補酵素 結合型グルコース脱水素酵素を生成蓄積することが出来る。 また、 本 ί咅養方法によ り、 培養微生物内にも補酵素結合型グルコース脱水素酵素を生成蓄積することがで きる。 ついで、 培養物中から補酵素結合型グルコース脱水素酵素を得る方法は、 通 常の蛋白質の精製方法が使用できる。 この方法とは、 例えば、 微生物を培養後、 遠 心分離などにより微生物を除き培養上清を得る方法、 もしくは、 微生物を培養後、 培養液を遠心分離して培養微生物を得、 適当な方法で該培養微生物を破砕し、 破砕 液から遠心分離などによって上清液を得る方法である。 これらの上清液中に含まれ る補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、 塩析、 溶媒沈殿、 透析、 イオン交換クロ マトグラフィー、 疎水吸着ク ρマトグラフィー、 ゲルろ過、 ァフィ二ティークロマ 卜グラフィー、 電気泳動などの適当な精製操作を組み合わせることによって精製で さる。 また、 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を得るための培養は、 固体培 地も使用できる。 培養方法には特に制限はなく、 静置培養によってもよく、 培養物 を常時混合するような回転培養や流動層培養などによっても行うことができるが、 設備投資の少ない培養装置としては静置培養が好ましい。 ついで、 培戔物中から補 酵素結合型グルコース脱水素酵素を得る方法は、 通常の蛋白質の精製方法が使用で きる。 即ち、 培養物に水などの抽出剤を加えて攪拌したのち、 ふすまなどの培地固 形分を遠心分離、 濾過などの分離法により除去して抽出液を得ることにより行うこ とができる。 また、 菌体内に蓄積された補酵素結合型グルコース脱水素酵素の回収 は、 上記の抽出液を得た培養物残渣を海砂などの研磨剤とともに磨砕したのち、 水 などを加えて、 菌体から遊離された補酵素結合型グルコース脱水素酵素を抽出する 方法などで行うことができる。 また、 全補酵素結合型グルコース脱水素酵素を得る には、 培養物全体を海砂などの研磨剤とともに磨砕したのち、 水などを加えて、 菌 体から遊離された捕酵素結合型グルコース脱水素酵素と培地中に分泌された補酵 結合型グルコース脱水素酵素の両方を一挙に抽出する方法などで行うことができる _c これらの上清液中に含まれる補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、 塩析、 溶媒沈 殿、 透析、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水吸着クロマトグラフィー、 ゲルろ 過、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 電気泳動などの適当な精製操作を組み合 わせることによって精製できる。 また、 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、 合成による補酵素結合型 グルコース脱水素酵素や遺伝子工学によつて得られた組換え型の補酵素結合型ダル コース脱水素酵素であってもよい。 当業者は本発明の補酵素結合型グルコース脱水 素酵素の理化学的性質に由来するタンパク質およびその塩の開示に基づいて容易に 補酵素結合型グルコース脱水素酵素を得ることができる。 例えば、 補酵素結合型グ ルコース脱水素酵素については、 糸状菌を含む微生物や動植物などの天然物から抽 出するほか、 そのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列をもとに 合成法によって得ることができるし、 該補酵素結合型グルコース脱水素酵素遺伝子 の遺伝子断片を市販の発現ベクターなど公知の発現ベクターに挿入し、 得られたプ ラスミ ドを使用して大腸菌などの宿主を形質転換し、 形質転換体を培養して目的の 補酵素結合型グルコース脱水素酵素を得るといった遺伝子工学によって該補酵素結 合型グルコース脱水素酵素を工業的に製造することも可能である。 本酵素の活性測定においては、 該酵素を、 好ましくは終濃度 0. 1-1 uni t/ml に なるように適宜希釈して用いる。 なお、 該酵素の酵素活性単位（uni t)は 1分間に 1 mol のグルコースを酸化する酵素活性である。 本発明の補酵素結合型グルコース 脱水素酵素の酵素活性は、 次の方法で測定できる。

(i) 酵素活性測定法- 1

0. 1M リン酸カリゥム緩衝液（pH7. 0) 1. Oml、 1. OM D-グルコース 1. Oml、 3mM 2, 6- ジクロロフェノールインドフエノール（以下 DCIP という） 0. lml、 3mM 卜メ トキシ -' 5-メチルフエナジゥムメチルサルフェイ ト 0. 2ml、 水 0. 65ml を 3ml 石英セル （光 路長 1cm) に添加し、 恒温セルホルダー付き分光光度計にセッ 卜して 37でで 5分間 ィンキュベート後、 酵素溶液 0. 05ml を添加後、 DCIPの 600mnにおける吸光度変化 (△ABS/min)を測定する。 DCIP の pH7. 0 におけるモル吸光係数を 16. 3 X l O^m M-¹ とし、 1分間に l mol の DCIPが還元される酵素活性が実質的に該酵素活性 lun i t と等価であることから、 吸光度変化より該酵素活性を次式に従って求めた。

酵索 Sf性

x ojg X 酵索 希釈率 (i i) 酵素活性測定法 - 2

1. 0M リン酸カリウム緩衝液（pH7. 0) 3. 4 1、 1. 0M D -グルコース 0. lml、 20mM DC IP 86. 6 /x 1 を 37Tで 5分間インキュベート後、 酵素溶液 0. 01mlを添加して攪拌 し、 5 分間反応後 100°Cで 3 分間インキュベートし反応を停止した。 さらに lOOmM グリシン ·ナトリウム緩衝液（ρΗ13· 0) 0. 19ιΚ 2. ON 水酸化カリウム 0. 01ml を添 加し 37°Cで 10 分間インキュベートし、 溶液中の D -ダルコン酸を D -ダルコノ- δ - ラク トンに変換した後、 lOOmM トリス · 塩酸緩衝液（pH7. 5) 0. 39mK 1. ON 塩酸 0. 01ml を添加し、 pH を中性にした。 溶液中の D -ダルコン酸を D -ダルコン酸 /D-グ ルコノ - δ -ラクトン定量キッ ト（ベーリンガ一 ·マンハイム社製）により定量した。 1 分間に 1 i mo l の D -ダルコノ- <5 -ラクトンを生成する酵素活性が実質的に該酵素 活性 lim i t と等価であることから、 D -ダルコノ -《5 -ラクトンの生成量から該酵素活 性を同定した。 本発明は、 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した物質生産およ び分析用途の提供に関し、 医薬用または食品素材の改質加工への使用に関する。 一 例として、 該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を試薬として生体物質を含む該試 料中のグルコースの消去方法、 測定方法およびそれらの試薬、 試薬組成物に使用す る。 また、 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した有機化合物の製 造方法および製造原料に使用する。 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、 電子受容体存在下で、 ダルコ一 スを酸化する反応を触媒する酵素である。 本発明では、 前記反応に本発明の補酵素 結合型グルコース脱水素酵素を使用する。 補酵素結合型グルコース脱水素酵素とし ては、 限定されるわけではないが、 該補酵素結合型グルコース脱水素酵素を生産す る真核微生物に由来する補酵素結合型グルコース脱水素酵素が好ましく、 特に、 糸 状菌に由来する補酵素結合型グルコース脱水素酵素が好ましい。 次に、 本発明によって得られた補酵素結合型グルコース脱水素酵素の用途につい て説明する。 補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、 電子受容体存在下で、 ダルコ —スを酸化する反応を触媒する酵素であるから、 この反応による変化が利用できる 用途であれば、 特に制限されない。 例えば、 補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、 生体物質を含む該試料中のグルコースの測定用試薬、 消去用試薬へ使用することが 可能である。 また、 医療分野、 臨床分野への使用が可能であり、 補酵素結合型グル コース脱水素酵素を使用した物質生産および分析の用途において使用が可能となる。 本発明のバイオセンサは、 酵素として本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵 素を含む反応層に使用したセンサであればよい。 例えば、 該バイオセンサは、 絶縁 性基板上にスクリーン印刷などの方法を利用して作用極、 その対極および参照極か らなる電極系を形成し、 この電極系上に接して親水性高分子と酸化還元酵素と電子 受容体とを含む酵素反応層を形成することによって作製される。 このバイオセンサ の酵素反応層上に基質を含む試料液を滴下すると、 酵素反応層が溶解して酵素と基 質が反応し、 これにともなって電子受容体が還元される。 酵素反応終了後、 還元さ れた電子受容体を電気化学的に酸化させ、 このとき、 このバイオセンサは得られる 酸化電流値から試料液中の基質濃度を測定することが可能である。 また、 この他に、 発色強度或いは PH 変化などを検知する方式のバイオセンサも構築可能である。 こ れらのバイオセンサにより、 測定対象物質を基質とする酵素を選択することによつ て、 様々な物質の測定が可能である。 例えば、 酵素に本発明の補酵素結合型ダルコ —ス脱水素酵素を選択すると、 試料液中のグルコース濃度を測定するグルコースセ ンサを作製することができる。 バイオセンサの電子受容体としては、 電子の授受能に優れた化学物質を用いるこ とができる。 電子の授受能に優れた化学物質とは、 一般的に 「電子伝達体」、 「メデ イエ一夕」 あるいは 「酸化還元媒介剤」 と呼ばれる化学物質であり、 これらに該当 する化学物質として、 例えば、 特表 2002- 526759に挙げられた電子伝達体や酸化還 元媒介剤などを利用してもよい。 バイオセンサは、 安価なフェリシアン化カリウム (へキサシァノ鉄（I I I)酸力リ ゥム） を電子受容体として用いることが多く、 一般に終濃度 lmM以下で用いられる。 しかし本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素はフェリシアン化力リウムを 2- 500mM、 より好ましくは 30_100mM と高濃度で用いる事で、 より感度良く D-グル コースを測定する事が可能である。 本発明の測定方法、 測定試薬、 測定化合物、 バ ィォセンサなどの好ましい態様は、 それにかかる測定反応系にフェリシアン化力リ ゥムを終濃度 2-500mMで用いられることを特徴とするものである。

実施例 以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 本発明はその要旨を超えな い限り、 以下の実施例によって限定されるものではない。 以下の実施例における補 酵素結合型グルコース脱水素酵素活性の定量は前記の方法に従って行った。

実施例 1

寄託菌株 97508株の培養 グルコース（和光純薬工業社製） 1%、 脱脂大豆（日本食販社製） 2%、 コー： プリカ一（共同商事社製） 0. 5%、 および硫酸マグネシウム（ナカライテスク社製） 0. 1¾ より成る培地（pH6. 0) 100ml を 500ml 容の培養フラスコに入れ、 121°Cで 20 分間殺 菌し、 冷却後、 培養フラスコに寄託菌株 97508株を一白金耳接種し、 30でで 88時 間振盪培養して、 該菌株の種培養液とした。 前記と同様の組成からなる培地に消泡 剤を添加した培地 4Lを 5L容のジャーファーメンターに入れ、 121"Cで 30分間殺菌 し、 冷却後、 ジャーフアーメンターに前記の種培養液を 40ml接種し、 28でで 31時 間、 通気撹拌の条件で培養して、 該菌株の前培養液とした。 ついで、 前記と同様の 組成からなる培地に消泡剤を添加した培地 160Lを 200L容量のジャーフアーメン夕 —に入れ、 121°Cで 20分間殺菌して冷却したのち、 前記の前培養液 1. 6L を接種し、 28°Cで 41 時間、 通気攪拌の条件で該菌株を培養した。 培養終了後、 培養液を遠心 分離して培養上清を回収した。 実施例 2

培養上清からの補酵素結合型グルコース脱水素酵素の単離 以下のステップ 2. 1〜2. 5 により補酵素結合型グルコース脱水素酵素を単離した。

2. 1. 濃縮：

実施例 1 の培養上清 160L を限外濾過膜 「ペリコン 2モジュール」 （ミリポア社製） で濃縮し、 20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7. 5)に置換し、 粗酵素液を得た。

2. 2. Butyl— TOYOPEARL650M (東ソ一社製）による精製（第 1回) ：

前記粗酵素液を、 65% 飽和硫酸アンモニゥム液（pH7. 5)になるように調整後、 遠 心分離し上清を得た。 65% 硫酸アンモニゥムを含む 20mM リン酸カリウム緩衝液 (pH7. 5)で予め平衡化した Buty卜 TOYOPEARL650Mカラム（直径 4. 7cmX高さ 7. 7cm)に、 この粗酵素液を通液して酵素を吸着させた。 このカラムを同緩衝液で洗浄したのち、 30% 硫酸アンモニゥムを含む 20mMリン酸カリゥム緩衝液（pH7. 5)で酵素を溶出させ て活性画分を集めた。 さらに、 同緩衝液から 20mM リン酸カリゥム緩衝液（pH7. 5) へのグラジェント溶出法で酵素を溶出させて前記活性画分とあわせた。

2. 3. DEAE-セル口ファイン A- 500 (生化学工業社製）による精製：

前記活性画分を限外濾過膜 「ペリコン 2モジュール」 で濃縮し、 脱塩後 15 ト リス ·塩酸緩衝液（PH8. 5)と平衡化させた。 同緩衝液で平衡化した DEAE-セルロフ ァイン A- 500 カラム（直径 4. 7cmx高さ 5. 2cm)にこの画分を通液し、 溶出液を集め た。

2. 4. Bu 卜 TOYOPEARL650M (東ソ一社製）による精製（第 2回) ：

前記溶出液を、 65% 飽和硫酸アンモニゥム液（pH7. 5)になるように調整後、 遠心 分離し上清を得た。 65% 硫酸アンモニゥムを含む 20mM リ ン酸カリウム緩衝液 (pH7. 5)で予め平衡化した Butyl-TOYOPEARL650Mカラム（直径 4. 7cmX高さ 3. 6cm)に、 この上清を通液して酵素を吸着させた。 該カラムを同緩衝液で洗浄したのち、 30% 硫酸アンモニゥムを含む 20mM リン酸カリウム緩衝液（pH7. 5)で酵素を溶出させて 活性画分を集めた。

2. 5. TSKgel G3000SW (東ソ一社製）による精製：

前記活性画分をペンシル型膜濃縮モジュール 「ACP— 0013」 （旭化成工業社製）で 濃縮し、 脱塩後 0. 2M 塩化ナトリゥムを含む 50mM リン酸カリゥム緩衝液（pH5. 5)と 平衡化させた。 前記緩衝液で平衡化した TSKge l G3000SW (直径 2. 15cmX高さ 60cm) に、 この画分を通液し、 同緩衝液で酵素を溶出させ活性画分を分取した。 活性画分 をセン卜リプラス 10 (アミコン社製）で濃縮し、 脱塩後 50 クェン酸 · リン酸ナト リウム緩衝液（PH5. 5)に置換した。 得られた酵素は、 比活性約 1, 100uni t/mgであり. その精製度は粗酵素液に対し約 170倍であった。

実施例 3

補酵素結合型グルコース脱水素酵素の性質試験 上記の実施例 2によって単離した補酵素結合型グルコース脱水素酵素について、 作用性、 至適 pH、 安定 pH、 至適温度、 温度安定性、 基質特異性、 分子量、 阻害剤 および補酵素を調べた。

3. 1. 作用性：

補酵素結合型グルコース脱水素酵素を、 8. 66mM DCIP存在下で 500mM D -ダルコ一 スと反応させ、 反応産物を D -ダルコン酸 /D -ダルコノ- δ -ラクトン定量キットで定 量した。 その結果、 D -ダルコン酸の生成が確認され、 これより本発明の補酵素結合 型グルコース脱水素酵素は D-グルコースの 1 位の水酸基を酸化する反応を触媒す る酵素であることが明らかになった。

3. 2. 至適 ρΗ：

酵素活性測定法- 2 の緩衝液を、 それぞれクェン酸 · リン酸ナトリゥム緩衝液 (ρΗ4. 0- 5. 5) , リン酸カリウム緩衝液（ρΗ6. 5〜7. 5)、 トリス ·塩酸緩衝液（ρΗ8. 0〜 9. 0)もしくはグリシン ·水酸化ナトリウム緩衝液（ρΗ9. 5〜10. 0) (各緩衝液とも終濃 度で 17mM)に適宜置き換えて、 酵素活性測定法- 2 と同様の方法で様々な pH域にお ける該精製酵素の酵素活性を測定した （図 1)。 その結果、 補酵素結合型ダルコ一 ス脱水素酵素の至適 pHは、 7. 0〜9. 0であった。

3. 3. 安定 pH：

補酵素結合型グルコース脱水素酵素を、 それぞれ 50mM 濃度の緩衝液、 すなわち クェン酸 · リン酸ナトリゥム緩衝液（pH3. 2〜6. 4)、 リン酸カリゥム緩衝液（pH6. 3~ 6. 9) トリス ·塩酸緩衝液（pH7. 3〜8. 6)およびグリシン '水酸化ナトリゥム緩衝液 (PH9. 1〜11. 4)に溶解し、 40°Cで 60 分間保持した後に、 活性測定方法- 1 で酵素活 性を測定し、 酵素活性の残存率を分析した （図 2)。 その結果、 補酵素結合型ダル コース脱水素酵素の安定 pHは、 4. 5〜8. 5であった。

3. 4. 至適温度：

補酵素結合型グルコース脱水素酵素を 50mM クェン酸 · リン酸ナトリウム緩衝液 (pH5. 5)に溶解し、 上記の活性測定方法- 1により 30で〜 62°Cまでの範囲で酵素活性 -を測定した （図 3)。 その結果、 補酵素結合型グルコース脱水素酵素の至適温度は、 55°C付近であった。

3. 5. 温度安定性：

補酵素結合型グルコース脱水素酵素を 50mM クェン酸 · リン酸ナトリウム緩衝液 (PH5. 5)に溶解し、 0でより 55°Cまでのいくつかの温度で 15分間保持したのち、 活 性測定方法 1 で酵素活性を測定し、 酵素活性の残存率を分析した （図 4)。 ここで、 酵素活性の残存率は、 0°Cで 15 分間保持した時の酵素活性値を 10 として算出し た。 その結果、 補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、 501 においても 89%の酵素 活性が保持され、 約 50で以下で安定であった。

3. 6. 基質特異性および Km値：

活性測定方法- 1 における活性測定用反応液の基質を、 D-グルコースおよび他の 各基質（いずれも終濃度 333 、 D-セロビオースは 193mM、 D-トレハロースおよび D-ラフイノースは 121mM)を使用し、 酵素活性測定法- 1 に則り該酵素の酵素活性を 測定した。 該酵素の D -グルコースに対する活性値を 100 %として、 各基質に対する 活性値はそれに対する相対値として表 1に示した。

また同様に、 D-グルコースおよびマルト一スについてそれぞれ終濃度 550mMおよ び lOOmM の 2 種類を設定し、 相対反応性（酵素活性）を測定した。 結果は D -ダルコ —スの値を基準に相対値として表 2に示した。

これより補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、 D-グルコースには強く作用し、 D -マンノース、 1, 5-アンヒドロ- D-グルシトール、 D-セロビオース、 D-トレハロー ス、 マルトース、 D-ガラクトース、 D -グルコース- 6-リン酸、 D -フルク トースには 弱く作用した。 また、 該酵素は L-ァラビノース、 ラク ト一ス、 D -ソルビトール、 ダルコン酸、 スクロース、 D-マンニトール、 L-ソルポース、 D-リボース、 L-ラムノ —ス、 D -グルコース-卜リン酸、 D -ラフイノ一ス、 エタノール、 グリセロールには ほとんど作用しなかった。 該酵素の Km値は、 D -グルコースに対し、 49. 7 であつ た。 表 1

相対 性 (%)

D-グルコース 100

2-デォキシ -D-グルコース 48

D-キシロース 9. 1

D—マンノース 2.8

1,5-アンヒドロ- D-グルシ 1 ル 2

D-セロビオース 2

D-トレハロース 1.7

マルトース 1.4

D -ガラク 1 ^一ス 1.2

D-グルコース- 6-リン酸 d 1. 1

D-フ Jレク! ^一ス 0 0

L-ァラビノース 0. 1>

ラク卜ース 0. 1>

D -ソルビ! ル 0. 1>

グルコン酸 0. 1 >

スクロース 0. 1>

D-マンニ! ル 0. 1 >

L -ソルポース 0. 1>

D-リポース 0. 1>

L-ラムノース 0. 1>

D-グルコース- 1-リン酸 0. 1>

D -ラフィノース 0. 1 >

エタノール 0. 1 >

グリセロール 0. 1> 表 2 終濃度 （mM) 相対活性 (%)

D—グルコース 550 1 00

マル I ス 550 2. 8

D—グルコース 1 00 1 00

マル! ス 1 00 0. 5

3.7. 分子量およびサブュニッ ト分子量：

補酵素結合型グルコース脱水素酵素を、 0.2M NaCl を含む 50mM リン酸カリウム 緩衝液（PH7.5)に溶解し、 移動相に同緩衝液を使用して TSKge卜 3000SW (直径 0.75cmX長さ 60cm、 東ソ一社製）にて分析した。 分子量マ一カー（オリエンタル酵 母工業社製）を指標にして、 補酵素結合型グルコース脱水素酵素の分子量は約 130kDa であった。 12. 5 ポリアクリルアミ ドゲルを使用し Lae匪 l i らの方法 (Nature (1970) 227 : 680- 685)に従い、 この発明の補酵素結合型グルコース脱水 素酵素を SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動（SDS- PAGE)に掛けた。 泳動後にク マシー · ブリリアント · ブルー染色し、 移動度を分子量マ一力一（アマシャムファ ルマシアバイオテク社製）のそれと比較した結果、 本発明の補酵素結合型ダルコ一 ス脱水素酵素のサブュニット分子量は約 85kDaであった。

3. 8. 阻害剤

活性測定方法- 1 の反応系に終濃度が ImM になるように表 3 の各種添加物を阻害 剤としてそれぞれ加え、 活性測定方法- 1 により補酵素結合型グルコース脱水素酵 素の活性を測定した。 対照区は、 表 3 の添加物を加えない以外は活性測定方法 - 1 に従い行った。 該対照区における該酵素活性値を 100 %として、 それぞれの添加物 を加えた場合の相対活性値と対照区との差分を阻害効果 ）とした。 その結果、 表 3に示す阻害効果が認められた。

また、 前記の活性測定方法- 1 において、 それぞれ終濃度が lmM、 5mM、 10mM、 25 Μおよび 50mM になるようにメタノールに溶解した 1, 10-フエナントロリンをそ れぞれ加え、 本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の活性を活性測定方法 - 1 Jこ従い測定した。 なお、 反応系に対するメタノールはいずれも終濃度 10% (v/v)で あった。 対照区は、 活性測定方法- 1 に、 終濃度が lW (v/v)になるようにメタノー ルを添加して測定を行った。 結果を表 4 に示した。 その結果、 1, 10-フエナント口 リンによる阻害効果は、 1, 10-フエナントロリンが、 最終濃度 ImMで 62. 0%、 5mMで 76¾, 10mMで 85 、 25mMで 9 、 50mMで 95%と高かった （表 3)。

本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素に対する阻害効果は各添加物によつ て異なり、 重金属イオン（Ag+、 Cu²⁺および Hg²⁺)で最も強く、 1, 10-フエナントロリ ン、 プロフラビンおよび Mn²⁺で 60 以上の阻害効果が認められた。 表 3

添加物 阻害効果 （％) 添加物 阻害効果 （％) なし 0 キナクリン 5.0

0 卜リ 卜ン X-100 6.2

ZnC 0 CoCI₂ 7.0

AIGI₃ 0 リンゴ酸 8.1 安息香酸 0 D-酒石酸 8.5

EDTA 0.4 ョ一ド酢酸 9.5

CdGI₂ 0.8 システアミン 9.8

LiCI 0.9 2， 2'-ビビリジン 10.8 アミノグァ二ジン硫酸塩 1.1 8 -キノリノール 13.9

H₂0₂ 1.7 KCM 14.5

M-ェチルマレイミ ド 1.8 MiCI₂ 16.5 尿素 1.9 FeCI 25.0

MaCI 2.5 マレイン酸 26.2 チロン 2.5 ァクリノール 29.0

BaCI₂ 2.6 2-二トロ安息香酸 44.3

PbCI₂ 2.7 SnCI₂ 45.5

MgCI₂ 2.8 ァクリフラビン 49.0 フマル酸 3.4 1, 10-フエナントロリン 62.0 シクロセリン 3.6 プロフラビン 62.0

DL-ぺニシラミン 4.3 MnCI₂ 75.5 meso-酒石酸 5.6 AgN0₃ 99.4 クェン酸 5.6 CuCI₂ 100

CaCI₂ 5.7 ngci₂ 100 表 4

3. 9. 補酵素 ：

本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素溶液に D -グルコースを添加し、 吸 光分析を行ったところ、 385 n mおよび 465 n mに認められた吸収極大が該添加により 消失したことから、 補酵素がフラビンアデニンジヌクレオチドであることが明らか になった。 なお、 これらの吸収極大は FADに特有であり、 FADのみ加えない対照反 応系を構築した場合に観測されないものであった。

実施例 4

グルコースの定量 前記の実施例 1で精製した寄託菌株 97508株由来の補酵素結合型グルコース脱水 素酵素を使用し、 活性測定方法 1 における 333mM D -グルコースを、 0. 333 から 33mM の範囲の D -グルコースに代えて使用した場合の吸光度の減少速度を測定した。 すなわち D -グルコースの濃度が、 0. 333mM、 0. 5mM、 lmM、 2mM、 5mM、 6. 67mM, 10 、 20mM、 33mMの各濃度における吸光度変化を測定した。 測定結果を図 5に示す。

その結果、 検量線 （相関係数 r=0. 997) が作成できた。 これより、 補酵素結合型 グルコース脱水素酵素を使用した ！) -グルコースの定量が可能であることが示され た。 実施例 5

酵素固定化電極によるグルコースの測定 前記の実施例 2で精製した寄託菌株 97508株由来の補酵素結合型グルコース脱水 素酵素を使用し、 酵素固定化電極による D-グルコースの測定を行った。 本酵素 3. 4U を固定化したグラッシ一カーボン（GC)電極を用いて、 グルコース濃度に対す る応答電流値を測定した。 電解セル中に、 l OOmM リン酸ナトリウムバッファー (pH7. 0) 2. 7ml および 1M へキサシァノ鉄（I I I)酸カリウム （フェリシアン化力リウ ム） 水溶液 0. 3ml を添加した。 GC電極をポテンシヨスタツト BAS 100B/W (BAS製）に 接続し、 40で、 アルゴン飽和、 酸素飽和、 空気飽和、 各条件下で溶液を撹拌し、 銀 塩化銀参照電極に対して +500mVを印加した。 これらの系に 1M D-グルコース溶液を 30 i l 添加し、 定常状態の電流値を測定した。 更に同量の 1M D -グルコース溶液を 添加し電流値を測定するという作業を、 各々 3 回繰り返した。 この電流値を既知の グルコース濃度（約 10、 20、 30、 40 ）に対してプロッ トしたところ、 検量線が作 成できた （図 6)。 これより本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用し た酵素固定化電極でグルコースの定量が可能であることが示された。 さらに、 気体 の飽和条件によらず検量線が一致したことにより、 該補酵素結合型グルコース脱水 素酵素が酸素に対して極めて不活性であること、 および該酵素を利用した酵素固定 化電極で、 酸素の影響を受けずに、 D-グルコースを定量可能であることが示された _c

実施例 6

酵素固定化電極による標準血清中のグルコースの測定 実施例 5 に準じた方法で、 酵素固定化電極によりコントロール血清 I ヮコ一 B (和光純薬製） を用いて、 血清中のグルコース濃度の測定を行った。 電解セル中に、 l OOmM リン酸ナトリウムバッファ一（ρΗ7· 0) 2. 4mlおよび 1M へキサシァノ鉄（I I I) 酸カリウム （フェリシアン化カリウム） 水溶液 0. 3ml を添加し、 電流値が定常状態 になったところで、 血清を添加し電流値を測定した。 同様にして既知濃度の D -グ ルコース溶液用いて測定を行い、 検量線を作成した。 該血清中のグルコース濃度は、 検量線法により 4. 5mM と同定され、 これはへキソキナーゼ · グルコース- 6-リン酸 脱水素酵素法で同定した該血清中のグルコース濃度と一致した。 これより本発明で 用いた補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極で、 血清中の

D-グルコースが定量可能であることを示された。

産業上の利用可能性 本発明によって、 マルト一スへの作用性が 5%以下であり、 1, 10-フエナントロリ ンで阻害される、 可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の提供が可能となつ た。 さらには工業的生産に適した該補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造方法、 その為の生産微生物が提供される。 これによつて、 補酵素結合型グルコース脱水素 酵素の産業的用途への応用が可能となり、 詳細には、 マルト一スを成分とする輸液 を投与した糖尿病患者の血糖値をも正確に測定可能となった。 また、 本発明の補酵 素結合型グルコース脱水素酵素を使用することで、 グルコースセンサにおいても微 量のグルコースが測定可能で、 かつ利用可能となった。 また、 該補酵素結合型グル コース脱水素酵素を使用した試料中のグルコースの測定方法、 消去方法、 有機化合 物の製造方法などを含む物質生産および分析の用途において使用が可能となり、 医 薬、 臨床分野および食品分野での素材の改質加工に使用可能であるなど、 利用価値 の高い酵素の提供が可能となった。

Claims

請求の範囲

1. 電子受容体存在下で、 グルコースを酸化する反応を触媒し、 マルト一スへの作 用性が低いことを特徴とする可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素。

2. 電子受容体存在下で、 グルコースを酸化する反応を触媒し、 マルトースへの作 用性が 5%以下であり、 1, 10-フエナント口リンで阻害されることを特徴とする請求 項 1記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素。

3. 終濃度 ImMの 1, 10-フエナント口リンで 50%以上阻害されることを特徴とする請 求項 1ないし 2記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素。

4. 補酵素がフラビン化合物であることを特徴とする請求項 1 より 3 のいずれか 1 項に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素。

5. グルコースの 1位の水酸基を酸化することを特徴とする請求項 1 より 4のいず れか 1項に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素。

6. 微生物由来である請求項 1 より 5 のいずれか 1項に記載の補酵素結合型ダルコ ース脱水素酵素。

7. 真核微生物由来である請求項 6に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素。

8. ァスペルギルス 'テレウス （Aspergi l l us terreus) 由来である請求項 7に記載 の補酵素結合型グルコース脱水素酵素。

9. 受託番号 FERM BP- 08578のァスペルギルス ·テレウス （Aspergi l lus terreus) 由来である請求項 8に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素。

10. 請求項 1より 5のいずれか 1項に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の 性質または実質的に同等な性質を有するタンパク質であって、 該タンパク質をコー ドするアミノ酸配列あるいは当該配列に 1またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、 置換もしくは付加による変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 生物学的に活性で 安定なタンパク質であることを特徴とする補酵素結合型グルコース脱水素酵素。

11. 請求項 1より 5のいずれか 1項に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の 生産能を有することを特徴とする微生物。

12. 真核微生物である請求項 11に記載の微生物。

13. ァスペルギルス ·テレウス (Aspergi l l us terreus) である請求項 12に記載の 微生物。

14. 受託番号 FERM BP 08578 のァスペルギルス · テレウス （Aspergi l lus terreus) である請求項 13の微生物。

15. 請求項 1より 5のいずれか 1項に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の 製造方法であって、 請求項 11より 14のいずれか 1項に記載の微生物を培養し、 培 養により補酵素結合型グルコース脱水素酵素を生成せしめ、 これを採取することを 特徴とする補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。

16. 請求項 1 より 10のいずれか 1項に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素 を使用することを特徴とするグルコースの測定方法。

17. 使用に際し、 フェリシアン化物を終濃度 2mM- 500mMで用いることを特徴とする 請求項 16記載の測定方法。

18. 請求項 1 より 10のいずれか 1項に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素 を含有することを特徴とするグルコース測定試薬組成物。

19. 使用に際し、 フェリシアン化物を終濃度 2mM- 500mMで用いることを特徴とする 請求項 18記載の測定試薬組成物。

20. 請求項 1 より 10のいずれか 1項に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素 を使用することを特徴とするグルコース測定用のバイオセンサ。

21. 使用に際し、 フェリシアン化物を終濃度 2mM- 500mMで用いることを特徴とする 請求項 20記載のバイオセンサ。