WO2006080409A1

WO2006080409A1 - ５－置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組換えｄｎａ、形質転換された細胞、および、光学活性ｎ－カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法

Info

Publication number: WO2006080409A1
Application number: PCT/JP2006/301253
Authority: WO
Inventors: Kenichi Nishi; Satohiro Yanagisawa; Hirokazu Nanba; Makoto Ueda; Naoto Noro
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2005-01-31
Filing date: 2006-01-26
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2007-07-31
Also published as: JPWO2006080409A1; US20080261268A1; US7709235B2; EP1852510A1; EP1852510A4; JP5096911B2

Abstract

　本発明は、新規なヒダントインラセマーゼ、及びそれを用いた光学活性Ｎ－カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法を提供する。本発明の特徴として、バチルス　スピーシーズ（Bacillus sp.）ＫＮＫ５１９ＨＲ株から単離・精製された新規ヒダントインラセマーゼ、当該ヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を含む組換えプラスミド、及び当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子を導入された形質転換体が挙げられる。本発明の別の特徴として、５－置換ヒダントイン化合物にヒダントイナーゼやＮ－カルバミルアミノ酸アミドハイドロラーゼと同時に当該ヒダントインラセマーゼを存在させることによる、光学活性Ｎ－カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法が挙げられる。

Description

5 _置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードする DNA、組換え DNA、形質転換された細胞、および、光学活性 N_力ルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法

技術分野

[0001] 本発明は、微生物由来の新規なヒダントインラセマーゼ活性を有するポリペプチド、これをコードする _DNA、及びヒダントインラセマーゼを生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体、及びそれらを用いたヒダントインラセマーゼの製造方法、また、ヒダントインラセマーゼを用いた効率的な光学活性 N 力ルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法に関するものである。

関連出願の相互参照

[0002] 曰本国特許 2005— 022802号（2005年 1月 31曰出願）の明細書、請求の範囲、図面および要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによって本出願に合体される。

背景技術

[0003] ヒダントインラセマーゼは、光学活性 5 置換ヒダントインィ匕合物、すなわち D—または L 5—置換ヒダントインィ匕合物に作用し、当該化合物のラセミ化反応を触媒する酵素であり、医薬品、化学工業品、食品添加物などの原料として重要な光学活性 N —力ルバミルアミノ酸、又は光学活性アミノ酸を、 5—置換ヒダントインィ匕合物から製造するのに利用できる。

[0004] [化 6] N—力ルバミル- n

ヒダントイナ一ゼ ^R\^COOH ^Dハ;:Jイドロラ一ゼド R^^COOH H -. - -- '

HN-^ NHCONH₂ NHj

O

D— 5詈换ヒダントイン N—力ルバミル一 D—アミノ酸 D—アミノ酸ヒダントインラセマーゼ OOH

L— 5 S換ヒダントイン N—力ルバミル一 L一アミノ酸 L一アミノ酸反応式（ I )

[0005] すなわち反応式 (I)に示すように、 5—置換ヒダントインィ匕合物力光学活性 N—力ルバミルアミノ酸を製造するためには、ヒダントインラセマーゼと立体選択性を有するヒダントイナーゼを同時に用いればよい。また、 5—置換ヒダントインィ匕合物から光学活性アミノ酸を製造するためには、ヒダントインラセマーゼと、立体選択性を有するヒダントイナーゼとを同時に用いて、さらに立体選択性を有するか又は有さない N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼを用いればょヽ。

[0006] ここで、ヒダントイナーゼと N—力ルノミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼの両酵素反応は別々に 2段階で行なうことができ、または、両酵素を混合して反応することで 2つの反応を一段階の反応として行なうこともできる。

[0007] ヒダントイナーゼを用いた反応の後の脱力ルバミルィ匕反応は、上記のように酵素を用いた方法のほか、従来から良く知られている化学反応による脱力ルバミルィ匕法を採用することちでさる。

[0008] このように、ヒダントイナーゼと N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼを用いる反応方法において、原料である 5—置換ヒダントインィ匕合物のラセミ化を、ヒダントインラセマーゼを用いることによりヒダントイナーゼ反応と同時に進行すれば、光学活性 N —力ルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸へ定量的に変換することができ、高い収率が得られる。

[0009] 一方、上記反応系中でィ匕学的にラセミ化する 5—置換ヒダントインィ匕合物も知られているがその種類は限られており、多くの 5—置換ヒダントインィ匕合物の化学的ラセミ化速度は遅いか、実質的には進行しない。このため、ヒダントインラセマーゼを使用しな力つた場合、収率が低くなるという問題があり、本反応系にヒダントインラセマーゼを使用することは非常に有用である。そこで、ラセミ化速度の遅い光学活性 5—置換ヒダントインィ匕合物のラセミ化促進を目的としてヒダントインラセマーゼの探索がなされている。

[0010] ヒダントインラセマーゼを生産する微生物として、例えばアースロバクタ一（Arthroba cter)属（特許文献 1、非特許文献 1)、シユードモナス (Pseudomonas)属（特許文献 2 、非特許文献 2)、ァグロパクテリゥム (Agrobacterium)属（非特許文献 3、非特許文献 4、特許文献 3)、シノリゾビゥム (Sinorhizobium)属（非特許文献 5)、マイクロバクテリウム（Microbacterium)属（特許文献 4)、フラボバタテリゥム（Flavobacterium)属（特許文献 5)、パスッレラ (Pasteurella)属（特許文献 6)、キャンディダ (Candida)属（特許文献 7)に属する微生物が知られている。

特許文献 1 :特開昭 62— 122591号公報

特許文献 2：特開平 4 - 271784号公報

特許文献 3：国際公開第 WO03/100050号公報

特許文献 4：特開 2002— 330784号公報

特許文献 5 :特開 2003— 210176号公報

特許文献 6 :特開 2003— 210177号公報

特許文献 7：特開昭 61— 47194号公報

非特許文献 1 :J. BiotechnoL, vol.80, 217 (2000)

非特許文献 2 : J. BacterioL, vol.174, 7989 (1992)

非特許文献 3 :Appl. Microbiol. BiotechnoL, 57, 680 (2001)

非特許文献 4 : Biotechnol. Prog., 18, 1201 (2002)、 Biochem. Biophys. Res. Commun . 303, 541 (2003)

非特許文献 5 :Appl. Microbiol, 70, 625 (2004) 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0011] しかし、上記いずれの文献においても、例えば非天然のアミノ酸である D—ノルバリン、 D—ノルロイシン、 D—ぺ-シラミン、 D— O—メチルセリン、 D—ホモセリンなどの製造において、対応する 5—置換ヒダントインのラセミ化活性を有する酵素は報告されていない。

[0012] また、バチルス（Bacillus)属の細菌について、ヒダントインラセマーゼ活性があることはまったく知られておらず、また、ヒダントインラセマーゼを精製、単離し、性質を調べた報告、ヒダントインラセマーゼ遺伝子の単離にっ、ての報告はこれまでになされていない。

[0013] 本発明の一つの目的は新規のヒダントインラセマーゼを提供することにある。また、本発明の別の目的は、当該ヒダントインラセマーゼのアミノ酸配列、その遺伝子の D NA配列を明らかにし、当該酵素を生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体、及びそれらを用いた当該ヒダントインラセマーゼの製造方法を提供することにある。さらに本発明の別の目的は、当該ヒダントインラセマーゼを利用した効率的な光学活性 N—力ルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0014] 本発明者らは上記課題に鑑み、広く土壌よりヒダントインラセマーゼ活性を有する微生物を探索した結果、優れた性質を有するヒダントインラセマーゼを高生産するバチルス (Bacillus)属細菌を新たに分離した。そして、当該微生物カもヒダントインラセマ一ゼを単離、精製し、ヒダントインラセマーゼ遺伝子の単離、ならびに宿主微生物での発現を達成した。さらに、本発明で得たヒダントインラセマーゼは前述の非天然型アミノ酸に対応する 5—置換ヒダントイン化合物にも作用することが明らかとなった。このようにして得られたヒダントインラセマーゼを、ヒダントイナーゼや N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼと同時に 5—置換ヒダントインィ匕合物に作用させることにより、光学活性 N—力ルバミルアミノ酸及び光学活性アミノ酸の反応収率を向上させることが可能となり、本発明を完成するに至った。 [0015] 即ち、本発明の一つの特徴は、下記の性質を有し、ヒダントインラセマーゼ活性を有するポリペプチドである：

1.分子量：約 139, 000、

2. L— 5—（2—メチルチオェチル）ヒダントインに対する Km値：約 0. 304mM、

3.作用温度の範囲： 25°C〜65°C、至適温度 40°C

4.作用 pHの範囲： 6〜10、至適 pH8〜9、

5.温度安定性： 30°C以下、

6. pH安定性： 4. 5〜8. 0。

[0016] また、本発明の別の特徴は、配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。

[0017] 本発明の別の特徴は、上記のポリペプチドをコードする DNAである。

[0018] 本発明の別の特徴は、上記の DNAを含む組換えプラスミドである。

[0019] 本発明の別の特徴は、上記の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体である。

[0020] 本発明の別の特徴は、上記のポリペプチドを生産する能力を有し、かつ、バチルス

(Bacillus)属に属する微生物である。

本発明の別の特徴は、上記のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするヒダントインラセマーゼの製造方法である。

本発明の別の特徴は、上記のヒダントインラセマーゼ活性を有するポリペプチド、上記の形質転換体、又は上記の微生物を、光学活性 5—置換ヒダントインィ匕合物に作用させることを特徴とする光学活性 5 -置換ヒダントインのラセミ化方法である。

[0021] 本発明の別の特徴は、上記のヒダントインラセマーゼ活性を有するポリペプチド、上記の形質転換体、又は上記の微生物を、一般式（1)

[0022] [化 7]

[0023] (式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有して V、てもよ、炭素数 7〜20のァラルキル基、もしくは置換基を有して、てもよ、炭素数 6〜20のァリール基を表す。）で表される光学活性 5—置換ヒダントインィ匕合物に作用させることを特徴とする光学活性 5 -置換ヒダントインのラセミ化方法である。

[0024] 本発明の別の特徴は、上記のポリペプチド、上記の形質転換体、又は上記の微生物と、ヒダントイナーゼを、 5—置換ヒダントインィ匕合物に作用させることを特徴とする光学活性 N—力ルバミルアミノ酸の製造方法である。

本発明の別の特徴は、上記のポリペプチド、上記の形質転換体、又は上記の微生物と、ヒダントイナーゼを、前記式（1)で表される 5—置換ヒダントインィ匕合物に作用させることを特徴とする、一般式 (2) :

[0025] [化 8]

[0026] (式中、 Rは前記と同じ。 )で表される光学活性 N—力ルバミルアミノ酸の製造方法である。

[0027] 本発明の別の特徴は、上記のポリペプチド、上記の形質転換体、又は上記の微生物と、ヒダントイナーゼおよび N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼを、 5—置換ヒダントインィ匕合物に作用させることを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法である

[0028] 本発明の別の特徴は、上記のポリペプチド、上記の形質転換体、又は上記の微生物と、ヒダントイナーゼおよび N 力ルバミルアミノ酸アミドノ、イド口ラーゼを、前記式（ 1)で表される 5 置換ヒダントインィ匕合物に作用させることを特徴とする、一般式 (3)： [化 9]

[0030] (式中、 Rは前記と同じ。 )で表される光学活性アミノ酸の製造方法である。

発明の効果

[0031] 本発明のヒダントインラセマーゼは、非天然型アミノ酸に対応する 5 置換ヒダントイン化合物にも効率よく作用しうる酵素である。 5—置換ヒダントインィ匕合物、特に非天然型のアミノ酸に対応する 5 置換ヒダントインィ匕合物にヒダントイナーゼや N カルノミルアミノ酸アミドノ、イド口ラーゼを作用させて、光学活性 N—力ルバミルアミノ酸や光学活性アミノ酸を製造する際に本発明のヒダントインラセマーゼを同時に存在させることにより、反応収率を向上させることができる。また、本発明の微生物及び形質転換体によって、上記の新規なヒダントインラセマーゼを効率よく製造することができる。さらに、本発明のヒダントインラセマーゼ、または、ヒダントインラセマーゼを生産する微生物を利用することで、効率良く光学活性 N 力ルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸を製造することができる。

図面の簡単な説明

[0032] [図 1]本発明の実施形態としてのヒダントインラセマーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド pBHROOlの制限酵素地図を示す図である。

[図 2]本発明の実施形態としてのヒダントインラセマーゼの L— 5— (2—メチルチオェチル）ヒダントインに対する Km値を示すグラフである。

[図 3]本発明の実施形態としてのヒダントインラセマーゼの作用温度の範囲と至適温度を示すグラフである。

[図 4]本発明の実施形態としてのヒダントインラセマーゼの作用 pHの範囲と至適 pH を示すグラフである。

[図 5]本発明の実施形態としてのヒダントインラセマーゼの温度安定性を示すグラフである。

[図 6]本発明の実施形態としてのヒダントインラセマーゼの pH安定性を示すグラフである。

[図 7]本発明の実施形態としてのヒダントインラセマーゼの基質阻害効果を示すダラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0033] 以下、本発明を実施形態に基づいて詳細に説明する。

[0034] 1.ポリペプチド

まず、本発明の実施形態としてのポリペプチドについて説明する。本発明のポリべプチドは、ヒダントインラセマーゼ活性を有するポリペプチドであって、以下のような理化学的性質を有することを特徴とする。

1)作用

光学活性 5—置換ヒダントインィ匕合物のラセミ化反応を触媒する。

2)分子量

約 139, 000

3) L— 5—（2—メチルチオェチル）ヒダントインに対する Km値

約 0. 304mM

4)作用温度の範囲

温度範囲 25°C〜65°C、至適温度 40°C

5)作用 pHの範囲

pH範囲 6〜10、至適 pH8〜9

6)温度安定性

30°C以下

7) pH安定性

pH4. 5〜8. 0

さらには、以下の理ィ匕学的性質も有する。 8)比活性 (後述の測定法において、 1分間に 1 μ molの D— 5—（2—メチルチオェチル)ヒダントインを生成する酵素量を lunitと定義する）

純粋酵素 lmgあたり 24. 2unit

9)基質阻害

50〜80mM L— 5—（2—メチルチオェチル）ヒダントインを基質としたときに基質阻害を受ける。

[0035] 実施形態にお!、て、ポリペプチドのヒダントインラセマーゼ活性は、例えば、 50mM

L- 5- (2—メチルチオェチル）ヒダントインを含む 50mM Tris (トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン）一 HC1緩衝液 (pH7. 5)中における、 30°C、 30分間での D— 5— (2—メチルチオェチル)ヒダントインの生成を高速液体クロマトグラフィー (HPLC)等を用いて定量することにより測定することができる。

[0036] 実施形態のヒダントインラセマーゼ（以下、適宜「本酵素」または「本ヒダントインラセマーゼ」とする。）は、以下に例示するように、由来や酵素の性質等の点で、背景技術の項目で説明した他の公知のヒダントインラセマーゼとは明らかに異なる新規なヒダントインラセマーゼである。

[0037] (i)本酵素は、ァグロバタテリゥムラジオパクター（Agrobacterium radiobacter)由来のヒダントインラセマーゼ（国際公開第 WO03/100050号）と比較してアミノ酸配列の相同性は 50%であり、両者は異なる配列である。また、本酵素は基質阻害を受けるのに対して、ァグロバタテリゥムラジオパクター由来のヒダントインラセマーゼは基質阻害を受けなヽ点で相違する。

[0038] (ii)本酵素は、マイクロバタテリゥムリクエファシエンス（Microbacterium liquefacien s) (特開 2002— 330784号公報）のヒダントインラセマーゼと比較してアミノ酸配列の相同性は 48%であり、両者は異なる配列である。また、本酵素は至適温度が約 40°C であるのに対して、マイクロバタテリゥムリクエファシエンスのヒダントインラセマーゼは至適温度が 50〜60°Cである点で相違する。

[0039] (iii)本酵素は、シユードモナススピーシーズ（Pseudomonas sp.)のヒダントインラセマーゼ（特開平 4— 271784号公報、 J. BacterioL, vol.174, 7989 (1992))と比較してアミノ酸が 3残基異なる。また、本酵素は至適温度が 40°C、至適 pH8〜9であるのに対して、シユードモナススピーシーズのヒダントインラセマーゼは至適温度力 S45°C、至適 pHが 9. 5である点で相違する。シユードモナススピーシーズのヒダントインラセマーゼは、 L- 5- (2—メチルチオェチル）ヒダントインと同様に、 L— 5—（1 メチルプロピル)ヒダントインに対して高いラセミ化活性を示す。具体的には、 L— 5— (2—メチルチオェチル)ヒダントインを基質とした場合の相対活性を 100として、 L— 5— (1 メチルプロピル)ヒダントインを基質とした場合の相対活性を求めると、 132である（特開平 4— 271784号公報の表 1の反応時間 10分における D体の割合を参照)。

[0040] 一方、本酵素は、高いラセミ化活性を示す L— 5—（2—メチルチオェチル)ヒダントインに対する活性を 100としたときの、 L— 5— (1—メチルプロピル)ヒダントインを基質とした場合の相対活性は 2である（実施例 2の表 2参照)。したがって、本酵素とシュードモナススピーシーズのヒダントインラセマーゼとは、上記至適温度および pHのほか基質特異性の点でも大きく異なっており、両酵素の性質は明らかに異なる。

[0041] ここで、従来、バチルス（Bacillus)属に属する微生物がヒダントインラセマーゼ活性を有する力否かは知られていな力つた。この点、本出願の発明者によって取得された実施形態のヒダントインラセマーゼは、ヒダントインラセマーゼ活性の有無が知られて V、な力つたバチルス (Bacillus)属に属する微生物に由来する新規な酵素である。さらに、本ヒダントインラセマーゼが上記のような公知のヒダントインラセマーゼとは性質が異なる酵素であり、非天然型アミノ酸に対応する 5 置換ヒダントインィ匕合物にも作用する点は、本出願の発明者によって初めて明らかにされた事項である（実施例 2の表 2参照)。

[0042] 2.微生物

本発明の実施形態としてのポリペプチドは、好適には、バチルス (Bacillus)属に属する微生物から取得することが出来、より好ましくは、バチルススピーシーズ (Bacillu s sp.)KNK519HR株から取得できる。

[0043] 上記のバチルススピーシーズ（Bacillus sp.)KNK519HR株は、本発明において発明者らが分離、取得した菌株であり、受託番号 FERM BP— 10477として、 200 5年 12月 12日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ IPOD：〒 305-8566 茨城県つくば巿東 1 1 1 中央第 6)に寄託されている (原寄託日 2004年 12月 15日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）。以下に、バチルススピーシーズ（Bacillus sp.)KNK519HR株の菌学的性質を示す。

1.形態

1)直径 1. 0- 1. 1 μ ηι Χ 2. 0—4. 程度の桿菌

2)グラム染色：陽性

3)運動性:有り

4)胞子の有無：有り

5)寒天平板培地培養でのコロニー形態：円形、周縁波状、凸状、光沢あり、黄色

2.培養的性質

1)生育温度試験： 37°C ( + )、 45°C (―)

3.生理学的性質

1)カタラーゼ： +

2)ォキシダーゼ：

3)グルコース力の酸 Zガス産生 (酸産生 Zガス産生）： Z—

4) OZFテスト (酸化 Z発酵）

5)発酵性試験

グリセローノレ： +

エリスリトール：

D ァラビノース：

Lーァラビノース：

リボース： +

D キシロース： +

Lーキシロース：

アド二トール：

β—メチノレ一 D キシロース：一

ガラクトース： +

グノレコース： + フラクトース： +

マンノース：一

ソノレボース：一

ラムノース：一

ズルシトーノレ：一

イノシトール：一

マンニトール： +

ソルビトール：一

aーメチルー D—マンノース：一 aーメチルー D—グルコース：一

N—ァセチルダルコサミン： + アミグダリン：一

アルブチン： +

エスクリン： +

サリシン： +

セロビオース： +

マルトース： +

乳糖: - メリビオース：一

白糖: +

トレノヽロース： + ィヌリン：一

メレチトース：一

ラフィノース： +

澱粉： +

グリコーゲン： +

キシリトーノレ：一

ゲンチオビオース：一 D ッラノース：一

D リキソース：

D タガトース：

D フコース：

Lーフコース：

D ァラビトーノレ：

Lーァラビトール：

ダルコネート：：

2—ケトグノレコン酸：一

5—ケトグルコン酸：—

)生化学試験

β ガラクトシダーゼ：

アルギニンジヒドロラーゼ：

リシンデカルボキシラーゼ：

オル-チンデカルボキシラーセ：

クェン酸の利用性：

H S産生：

2

ゥレアーゼ：

トリプトファンデァミナーゼ：

インドール産生：

ァセトイン産生 (VP) :—

ゼラチナーゼ：+

硝酸塩還元：

7)嫌気での生育性：

8) 10%NaClでの生育性： +

9)馬尿酸塩加水分解性：

10)カゼイン加水分解性： +

上記の菌学的性質、及び、 16SrDNA配列解析から、 KNK519HR株はバチルススピーシーズ（Bacillus sp.)と同定された。

[0046] なお、本発明のポリペプチドを生産する微生物は、上述した微生物の野生株であつても良いし、変異改良された変異株であってもよい。変異株は、上記 KNK519HR株に、 UV照射や、 N—メチノレ N，一-トロ一 N -トロソグァ-ジン（NTG)、ェチルメタンスルフォネート (EMS)等の薬剤による処理といった当業者に周知の方法を行なうことで取得できる。

[0047] 本発明のポリペプチドを生産する微生物を培養する培地としては、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュ一クロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、ォレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモ-ゥム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ一、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、炭酸カルシゥム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽ェキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用され得る。更に、ヒダントインラセマーゼの生産を増強させるために、 5—置換ヒダントイン化合物を少量添加することもできる。その培地中濃度は、 0. 001重量％以上、 10重量％以下、好ましくは 0. 01 重量％以上、 1重量％以下の範囲から選ばれる。

[0048] 培養は、温度として通常 20°C以上、 40°C以下、好ましくは 25°C以上、 35°C以下の範囲、 pHとしては通常 6以上、 8以下、好ましくは 6. 5以上、 7. 5以下の範囲で好気的に行い得る。培養時間は通常 1日以上、 5日間以下程度で行い得る。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。

[0049] 3.酵素の精製

ヒダントインラセマーゼの分離精製は、次のようにして行ない得る。まず、上記培養終了後に培養液力遠心分離などにより菌体^^め、超音波破砕機などの手段により菌体を破砕して、粗酵素液を得る。この粗酵素液を、塩析法、カラムクロマトグラフィ一法などにより精製することで精製ヒダントインラセマーゼを得ることができる。

[0050] 本発明のポリペプチドは、上記のようにして、ヒダントインラセマーゼを生産する能力を有する微生物を培養し、ヒダントインラセマーゼを蓄積させて、これを採取することによって得られる。本発明のポリペプチドは上述した微生物力も取得される酵素であつてもょヽし、後述するように遺伝子組換え技術を利用して得られた形質転換体から生産される酵素であってもよい。実施形態の酵素としては、配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをあげることができる。

[0051] 4. DNA

次に本発明の DNAについて説明する。本発明の DNAは上記のようなヒダントインラセマーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNAであればよぐ好ましくは配列表の配列番号 1のアミノ酸配列をコードする DNA、例えば、配列表の配列番号 2 で示される塩基配列を有する DNAを挙げることができる。なお、通常 1つのアミノ酸に複数の塩基コドンが対応していることから、配列番号 1で示されるアミノ酸配列をコードするほかの塩基配列を持つ DNAも、配列番号 2で示される塩基配列と等価であり、本発明の DNAに含まれる。

[0052] 特定の塩基配列と「等価の塩基配列」の範囲には、例えば、その特定の塩基配列に対応するアミノ酸配列をコードする、その塩基配列とは別の塩基配列が含まれる。その他、「等価の塩基配列」には、その塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および Zまたは付加された塩基配列を有し、かつその塩基配列によってコードされるポリペプチドの活性 (例えばヒダントインラセマーゼ活性)を有する塩基配列を含む。「数個の塩基」とは、好ましくは 10塩基以下であり、より好ましくは 9 、 8、 7、 6、 5、 4、 3、または 2個以下である。

[0053] 本発明の実施形態としてのヒダントインラセマーゼ遺伝子を含む DNAは、例えば、バチルススピーシーズ（Bacillus sp.)KNK519HR株から取得することができるが、もちろん化学的に合成したものであっても構わない。目的の DNAを取得する一例を以下に示す。

[0054] まず、ヒダントインラセマーゼ活性を有する微生物より精製されたヒダントインラセマーゼの N末端のアミノ酸配列を、気相プロテイン 'シークェンサ一などで決定する。このようにして得られた N末端アミノ酸配列、及び、既知ヒダントインラセマーゼの相同配列部位にもとづいて設計した DNAプライマーを合成する。

[0055] 次に、ヒダントインラセマーゼの起源となる微生物より、染色体 DNAを単離する。染色体の DNAは、培養された細胞から、 UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc.社製）を用いて得られる。

[0056] この染色体 DNAを铸型に、上記の DNAプライマーを用いて PCRを行うことで、目的の遺伝子の一部を取得できる。

[0057] 次に、既に取得した部分遺伝子のさらに N末側と C末側をコードする DNA断片をィンバース PCR法により取得することができる（例えば Nucleic Acids Res.16,8186(1988 )を参照)。この DNA断片の塩基配列を決定後、酵素の N末端より上流と推定される部分、及び、 C末端より下流と推定される部分のそれぞれの塩基配列にもとづき DN Aプライマーを作成する。この DNAプライマーを用いて、先に得た染色体 DNAを铸型とした PCRを行なうことで、目的とするヒダントインラセマーゼ遺伝子の全長を含む DNA断片を取得できる。

[0058] 次いで、得られたヒダントインラセマーゼ遺伝子を含む DNA断片をベクター DNAと T4 DNAリガーゼなどを用いて結合させることにより組換えプラスミドを得ることができる。このプラスミドを用いて、ベクターに挿入したヒダントインラセマーゼ遺伝子を含む DNA断片部分の塩基配列を解析、ヒダントインラセマーゼ酵素の N末端アミノ酸配列をコードする塩基があることを確認し、また、これより翻訳開始部位と終止コドンを確認することでオープンリーディングフレームを決定する。

[0059] このようにして取得した DNA、または該 DNAをベクターに組み込んで得られる組換えプラスミドを用いることにより、宿主微生物を形質転換し形質転換体を得ることができる。

[0060] 5.宿主およびベクター

宿主、ベクターとしては、「組換え DNA実験指針」（科学技術庁研究開発局ライフサイエンス課編：平成 8年 3月 22日改定）に記載の宿主一ベクター系を用いることができる。例えば、宿主としては、ェシエリヒア（Escherichia)属、シユードモナス（Pseudo monas)属、フラボバタテリゥム（Flavobacterium)属、バチノレス（Bacillus)属、セラチア（ Serratia)属、コリネバタテリゥム（Corynebacterium)属、ブレビバタテリゥム（Brevibacte rium)属、ァグロノくクテリゥム (Agrobacterium)属、ァセトノクタ一 (Acetobacter)属、グルコノバクタ一（Gluconobacter)属、ラクトバチルス (Lactobacillus)属、ストレプトコッカス（Streptococcus)属またはストレプトマイセス（Streptomyces)属に属する微生物を用いることがでさる。

[0061] ベクターは上記の宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物としてェシエリヒアコリ（Escherich ia coli)、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ましい。このようなベクターとしては、例えば、当業者が容易に入手可能、あるいは巿販されている PUC18 (タカラバイオ株式会社）、 pUC19 (タカラバイオ株式会社）、 pBR3 22 (タカラバイオ株式会社）、 pACYC184 (株式会社-ツボンジーン）、 pSClOl (フナコシ株式会社)、 pT7Blue (タカラバイオ株式会社)、又は国際公開第 WO94Z03 613号公報の明細書の記載に基づいて当業者が製造しうる pUCNT、またはそれらの誘導体を挙げることができる。また、酵素の生産量を上昇させるために強力な構造プロモーターをもつように改質したベクターを使用することもできる。

[0062] 6.形皙転橼体

形質転換体の一例として、上記のようにして取得した DNAを pUCNTに組み込んだ組換えプラスミド pBHROOl (図 1参照）を用いてェシエリヒアコリ（Escherichia coli ) HB101を形質転換し、形質転換体ェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB 101 (pB HR001)を得ることができる。プラスミド pBHROOlは、図 1の制限酵素地図にて特定される。

[0063] 上記方法で得られた形質転換体ェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB101 (pBH ROODは受託番号 FERM BP— 10476として、 2005年 12月 12日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (IPOD :干 305-8566 茨城県つくば巿東 1 - 1 - 1 中央第 6)に寄託されて、る（原寄託日 2004年 12月 15日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管)。

[0064] なお、本発明で用いた組換え DNA技術は当該分野にぉ、て周知であり、例えば、 Molecularし loning 2nd Edition (Cold bpnng Harbor Laboratory Press, 1989)、 Curren t Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley- Interscie nce)に記載されている。

[0065] 形質転換体の培養は、通常の培地を用いて行えば良、。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地で良い。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースゃシユークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモ-ゥム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンス 'ティープ' リカーなどが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。

[0066] 培養は通常温度範囲 25°C力も 40°Cで行える力 25°Cから 37°Cが特に好ましい。

また、 pHは通常 4から 8で培養できるが 5から 7. 5が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。必要に応じてイソプロピル 1 チォー j8— D—ガラタトサイド (IPTG)、ラタトース等を添加する等の酵素誘導のための処理を行うこともできる。

[0067] 7. 光学活件 N 力ルバミルアミノ酸または光学活件アミノ酸の ¾告方法

次に、本発明のヒダントインラセマーゼを使用する、効率的な光学活性 N—カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法にっ、て説明する。実施形態としての光学活性 N—力ルバミルアミノ酸は、前記反応式 (I)に示す方法で、 5—置換ヒダントインィ匕合物から、ヒダントイナーゼを作用させることによる加水分解で N—力ルバミルアミノ酸に変換することができる。また、生成した N 力ルバミルアミノ酸は、前記反応式 (I)に示す方法で、力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼを作用させることにより加水分解されてアミノ酸に変換することができる。このとき、ヒダントインラセマーゼを同時に用いることで、化学的ラセミ化速度が遅い 5—置換ヒダントインィ匕合物から、効率良く定量的に光学活性 N 力ルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸を製造できる

[0068] 本発明において、光学活性 N—力ルバミルアミノ酸を製造するためには、本発明のヒダントインラセマーゼと、立体選択性を有するヒダントイナーゼとを同時に用いることが重要である。また、光学活性アミノ酸を製造するためには、本発明のヒダントインラセマーゼと、立体選択性を有するヒダントイナーゼとを同時に用いて光学活性 N—力ルバミルアミノ酸としたのちに、 N 力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼを使用するか化学的な脱力ルバミルィ匕を行ってもよいし、本発明のヒダントインラセマーゼと、ヒダントイナーゼと、 N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼとを同時に使用してもよい。ヒダントイナーゼ及び N—力ルバミルアミノ酸アミドノ、イド口ラーゼを同時に用いる場合、いずれかの酵素が立体選択性を有すれば、光学活性アミノ酸を得ることが出来る。

[0069] 8.ヒダントイナーゼ

ここでヒダントイナーゼとは、 5—置換ヒダントイン誘導体を加水分解して N—力ルバミルアミノ酸誘導体を生成する活性を有する酵素である。本発明で用いるヒダントイナーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できる力例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物を挙げることがでさる。

[0070] D体選択的な加水分解を触媒するヒダントイナーゼとしては、細菌に属するものとしてァセトパクター属 (Acetobacter)、ァクロモノくクター属 (Achromobacter)、ァェロノくクター属（Aerobacter)、ァグロバタテリゥム属（Agrobacterium)、アルカリゲネス属（Alcal igenes)、ァルスロパクター属（Arthrobacter)、バチルス属（Bacillus)、ブレビバタテリゥム属 (Brevibacterium)、コリネノクテリゥム属 (Corynebacterium)、ェンテロノくクタ一属（Enterobacter)、エルウイニァ属 (Erwinia)、ェシエリヒア属 (Escherichia)、クレブシエラ属 (Klebsiella)、ミクロノくクテリゥム属 (Microbacterium)、ミクロコッカス属 (Microco ecus)、プロタミノバクター属 (Protaminobacter)、プロテウス属 (Proteus)、シユードモナス属（Pseudomonas)、サノレチナ属（Sartina)、セラチア属（Serratia)、キサントモナス属 (Xanthomonas)、ァエロモナス属 (Aeromonas)、フラポバクテリゥム属 (Flavobacteri um)、リゾピウム属（Rhizobium)など、放線菌に属するものとしてァクチノミセス属 (Acti nomyces)、ミコノクテリゥム属 (Mycobacterium)、ノカノレティア属 (Nocardia)、ストレプトミセス属（Streptomyces)、ァクチノプラネス属 (Actinoplanes)、ロドコッカス属 (Rhodo coccus)など、かびに属するものとしてァスペルギルス属（Aspergillus)、パェシロミセス属（Paecilomyces)、ぺ -シリウム属（Penicillium)など、酵母に属するものとしてはキヤンディダ属（Candida)、ピヒア属（Phichia)、ロードトルラ属（Rhodotorula)又はトル口プシス属（Torulopsis)などに属する微生物由来のヒダントイナーゼが挙げられる。

[0071] その中でも好ましくは、ァグロバタテリゥム属（Agrobacterium)、バチルス属（Bacillu s)、シユードモナス属（Pseudomonas)又はリゾビゥム属（Rhizobium)に属する微生物由来のヒダントイナーゼが挙げられる。

[0072] さらに好ましくは、ァグロバタテリゥムスピーシーズ (Agrobacterium sp.) KNK71 2 (FERM BP— 1900)、バチノレススピーシーズ（Bacillus sp.) KNK245 (FERM BP— 4863)、シユードモナスプチダ（Pseudomonas putida) IFO 12996、シユードモナススピーシーズ（Pseudomonas sp.) KNK003A (FERM BP— 3181)又はリゾビゥムスピーシーズ（Rhizobium sp.) KNK1415 (FERM BP— 4419)由来のヒダントイナーゼが挙げられる。

[0073] L体選択的な加水分解を触媒するヒダントイナーゼとしては、バチルス属（Bacillus )、フラボバタテリゥム属（Flavobacterium)、ァルスロパクター属（Arthrobacter)、シュードモナス属（Pseudomonas)又はノカルディア属（Nocardia)に属する微生物由来のヒダントイナーゼを挙げることができる。

[0074] ヒダントイナーゼを効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えば国際公開第 WO96Z20275号記載のように、ヒダントイナーゼ活性を示す菌株カもヒダントイナーゼ遺伝子をクローユングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換え DNA技術については当該分野において周知である。

[0075] このようにして得られた D体選択的ヒダントイナーゼを高生産する形質転換体としては国際公開第 WO96Z20275号記載の、バチルススピーシーズ（Bacillus sp.) KN K245 (FERM BP— 4863)由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB 101 pTH104 (FERM BP— 4864)、ァグロバクテリウムスピーシーズ (Agrobacterium sp.) KNK712 (FERM BP— 1900)由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB101 pAHIO 43 (FERM BP— 4865)、又はシユードモナススピーシーズ（Pseudomonas sp.) K NK003A (FERM BP— 3181)由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB101 pPHD301 (FERM BP— 4866)を挙げることができる。

[0076] これら形質転換体によるヒダントイナーゼの生産、ある、は、前述のヒダントイナーゼ活性を示す菌株によるヒダントイナーゼの生産は、例えば、国際公開第 WO96Z20 275号記載の、通常の栄養培地を用いて培養を行えば良ぐ必用に応じて、酵素誘導のための処理を行うこともできる。

[0077] 9. N—力ルノミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ

N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼは、 N—力ルバミルアミノ酸誘導体をカロ水分解してアミノ酸誘導体を生成する活性を有する酵素である。本発明で用いる N —力ルバミルアミノ酸アミドノ、イド口ラーゼとしては、前述のヒダントイナーゼと同様に、動物、植物、又は微生物由来のいずれでも使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。酵素源となる微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であれば!/、ずれも利用できる。

[0078] 例えば公知の D体選択的 N—力ルバミルアミノ酸アミドノ、イド口ラーゼとして、特公昭 57— 18793号、特公昭 63— 20520号、特公平 1—48758号および特開平 6— 2 33690号に開示されたァクロモパクター（Achromobacter)属、ァエロパクター（Aerob acter)属、ァエロモナス (Aeromonas)属、ァグロノくクテリゥム (Agrobacterium)属、ァノレカリゲネス (Alcaligenes)属、ァルスロパクター（Arthrobacter)属、バチノレス (Bacillus) 属、ブラストパクター（Blastobacter)属、ブラディリゾビゥム（Bradyrhizobium)属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium)属、コマモナス（Comamonas)属、フラボバクテリウム（ Flavobacterium)属、モラキセラ（Moraxellaリ属、ノヽラコッカス (Paracoccus)属、シユードモナス（Pseudomonas)属、リゾビゥム（Rhizobium)属、セラチア（Serratia)属、又はスポロサルシナ（Sporosarcina)属に属する微生物由来の N—力ルノミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼが挙げられる。

[0079] そのなかでも好ましくは、ァグロバタテリゥム（Agrobacterium)属、ブラストパクター（B lastobacter) J¾、コマモナス (Comamonas)属、ンュ' ~~トモナス (Pseudomonas) J¾、又はリゾビゥム（Rhizobium)属に属する微生物由来の酵素が挙げられる。

[0080] さらに好ましくは、ァグロバタテリゥムスピーシーズ (Agrobacterium sp.) KNK712 (FERM BP— 1900)、リゾビゥムスピーシーズ（Rhizobium sp.)KNK1415 (FER M BP— 4419)、又はシユードモナススピーシーズ（Pseudomonas sp.)KNK003 A (FERM BP— 3181)由来の N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼが挙げられる。

[0081] 公知の L体選択的な加水分解を触媒する N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼとしては、ァルスロパクター属（Arthrobacter)、ミクロバタテリゥム属（Microbacterium )又はシユードモナス属（Pseudomonas)に属する微生物由来の N—力ルノミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼを挙げることができる。

[0082] 上記微生物は野生株であってもよぐまた、変異処理によって N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ活性が高められた変異株であってもよい。さらに、遺伝子組換え等の方法を用いて、上記微生物由来の N—力ルバミルアミノ酸アミドノ、イド口ラーゼを高生産するように作成された形質転換微生物であってもよヽ。

[0083] N—力ルバミルアミノ酸アミドノ、イド口ラーゼを効率良く高生産する形質転換微生物は、例えば国際公開第 WO92Z10579号記載のように、 N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ活性を示す菌株カも N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ遺伝子をクロー-ングした後、適当なベクターとの糸且換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。

[0084] このようにして得られた、 D体選択的な N—力ルノミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼを高生産する形質転換微生物としては、国際公開第 WO92Z10579号記載のァグロバタテリゥムスピーシーズ (Agrobacterium sp.)KNK712 (FERM BP— 1900)由来の N—力ルバミルアミノ酸アミドノ、イド口ラーゼ遺伝子を含有するェシエリヒアコリ（ Escherichia coli)jM109 (pAD108) (FERM BP— 3184)、シユードモナススピ一シーズ（Pseudomonas sp.) KNK003A (FERM BP— 3181)由来の N—カルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ遺伝子を含有するェシエリヒアコリ（Escherichia coli)j M109 (pPD304) (FERM BP— 3183)および国際公開第 WO94Z03613号記載の遺伝子改変により耐熱性の向上したァグロバタテリゥムスピーシーズ (Agrobact erium sp.)KNK712 (FERM BP— 1900)由来の N—力ルバミルアミノ酸アミドハィドロラーゼ遺伝子を含有するェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB101 (pNT4553 ) (FERM BP— 4368)などを挙げることができる。

[0085] N 力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼの生産は、前述の N 力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ活性を示す微生物、或、は形質転換微生物を通常の方法で培養することにより行い得る。培養は、通常液体栄養培地で行われる力固体表面培養によっても行うことができる。培地には、通常資化し得る炭素源、窒素源、各種微生物の生育に必須の無機塩栄養素を含有させる。更に 4—ヒドロキシフエニルダリシン、フエ-ルグリシン等のアミノ酸； N 力ルバミルメチォニン、 N 力ルバミルフエ- ルァラニンなどの N 力ルバミル一 α—アミノ酸； 5— (4—ヒドロキシフエ-ル）ヒダントイン、 5—フエ-ルヒダントイン等の 5—置換ヒダントイン類；ゥラシル、ジヒドロウラシル、 j8—ウレイドプロピオン酸等のピリミジン代謝物;尿素; Fe²⁺、 Fe³⁺、 Be²⁺、 Co²⁺、 Al³⁺、 Li+、 Mn²⁺、 Mg²⁺、 Cs+等の金属イオン類、またはイソプロピル 1 チォー β D ガラタトサイド (IPTG)、ラタトース等の酵素誘導剤を少量添加して Ν カルノミルアミノ酸アミドノ、イド口ラーゼを増強蓄積させることが好まし、。これら Ν カルノミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ生産増強物質の培地中濃度は、金属イオン類で 0 . ImM以上、 10mM以下、その他の物質で 0. 01重量％以上、 1重量％以下の範囲力選ばれる。

[0086] 培養は通常、温度として 20°C以上、 85°C以下の範囲、好ましくは 25°C以上、 60°C 以下の範囲、 pHとしては 4以上、 11以下の範囲、好ましくは pH5以上、 9以下の範囲が用いられ、通気攪拌によって微生物の生育を促進することもできる。

[0087] 10.酵素

本発明において、上記ヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼおよび N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼは、酵素自体として用いることができるほか、本酵素活性を有する微生物もしくはその処理物としても用いることができる。ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物を意味する。

[0088] 更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定ィ匕して得た固定ィ匕酵素としても用いられ得る。固定ィ匕は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行い得る。酵素の固定ィヒに使用される支持体としては、例えば、 Duolite A— 568または DS— 17186 (ローム 'アンド'ハース社：登録商標）などのフエノールホルムアルデヒド陰イオン交換榭脂、 Amberlite IRA935、 I RA945、 IRA901 (ローム 'アンド'ハース社：登録商標）、 Lewatit OC1037 (バイエル社:登録商標）、 Diaion EX— 05 (三菱ィ匕学:登録商標）などのポリスチレン榭脂のような各種アミンゃアンモ-ゥム塩あるいはジエタノールァミン型の官能基を持つ各種の陰イオン交換樹脂が適している。その他、 DEAE セルロースなどの支持体ち使用することがでさる。

[0089] 11.酵素反応

本発明の実施形態としての酵素反応は以下の方法で行うことができる。本発明において、酵素反応の基質として用いられる 5—置換ヒダントインィ匕合物は、 D体、 L体、ラセミ体、または、 D体と L体とが任意の割合で混合したものの、いずれを用いることもできる。酵素反応の基質として、 5—置換ヒダントインィ匕合物を用いることができ、好ましくは、前記一般式（1)で表される 5 置換ヒダントインィ匕合物が用いられる。

[0090] ここで、 Rは置換基を有して!/、てもよ!/、炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有して!、てもよ、炭素数 7〜20のァラルキル基、もしくは置換基を有して、てもよ、炭素数 6〜20のァリール基を表す。上記 Rにおける置換基を有して、てもよ、炭素数 1〜 20のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、 1 メチルプロピル基、力ルバモイルメチル基、 2—力ルバモイルェチル基、ヒドロキシメチル基、 1ーヒドロキシェチル基、メルカプトメチル基、 2—メチルチオェチル基、（1 メルカプト 1ーメチル）ェチル基、カルボキシメチル基、 2—カルボキシェチル基、 4—アミノブチル基、 3—グァ -ジノプロピル基、 4 (5)—イミダゾールメチル基、ェチル基、 n—プロピル基、 n—ブチル基、メトキシメチル基、 2—ヒドロキシェチル基、 3 ァミノプロピル基、 2 シァノエチル基、 3 シァノプロピル基、 4 （ベンゾィルァミノ）ブチル基、または、 2—メトキシカルボニルェチル基などが挙げられる。置換基を有して、てもよ、炭素数 7〜20のァラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、 4ーヒドロキシベンジル基、又は、 3, 4—メチレンジォキシベンジル基等が挙げられる。置換基を有して、てもよ、炭素数 6〜20 のァリール基としては、フエ-ル基、または 4ーヒドロキシフエ-ル基などが挙げられる [0091] 上記の基質を用いて、上記のヒダントインラセマーゼを、上記立体選択的ヒダントイナーゼ、またはヒダントイナーゼ及び N 力ルノミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼと、同時に存在させ、水性媒体中で反応を行う。基質の仕込み濃度は 0. 1% (WZV)以上、 90% (w/v)以下、好ましくは 1% (w/v)以上、 60% (w/v)以下で溶解または懸濁した状態で反応を行い、反応温度は 10°C以上、 80°C以下、好ましくは 20°C以上、 60°C以下の適当な温度で調節し、 pH4以上、 9以下、好ましくは pH5以上、 8以下に保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。また、基質を連続的に添加しうる。反応は、ノツチ法または連続方式で行い得る。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。

[0092] 水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸ェチル、酢酸ブチル、トルエン、クロ口ホルム、 n キサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との 2層系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必要に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属などを添加することもできる。

[0093] 力べして、本発明のヒダントインラセマーゼにて 5 置換ヒダントインィ匕合物をラセミ化しつつ、該 5—置換ヒダントイン化合物は立体選択的ヒダントイナーゼにより一方の光学活性体のみが加水分解され光学活性な N—力ルバミルアミノ酸に変換される。更に、必要に応じて、 N—力ルバミルアミノ酸アミドノ、イド口ラーゼも併用することにより光学活性 N—力ルバミルアミノ酸はさらに光学活性アミノ酸へ変換される。または、 N —力ルバミルアミノ酸アミドノ、イド口ラーゼを用いず、化学的な脱力ルバミル化反応に供して光学活性アミノ酸を得ても良ヽ。

[0094] 生成した光学活性 N—力ルバミルアミノ酸類及び光学活性アミノ酸類の単離は、常套分離方法、例えば、抽出、濃縮、晶析、またはカラムクロマトグラフィーなどの分離方法や、それらの組み合わせにより分離、精製することができる。

[0095] 上記本発明の実施形態としての製造方法によって得られる光学活性 N—力ルバミルアミノ酸は、例えば、上記一般式（2)で表されるものであり、具体的には、 N カルノミル D 口イシン、 N 力ルバミル D—イソロイシン、 N 力ルバミル D—バリン、 N 力ルバミル— D ノルロイシン、 N 力ルバミル— D ノルパリン、 N 力ルバミル D—メチォニン、 N 力ルバミル D—システィン、 N 力ルバミル—D ぺニシラミン、 N 力ルバミル D—フエ-ルァラニン、 N 力ルバミル D—フエ-ルグリシン、又は、 N カルノミル— D— 4—ヒドロキシフエ-ルグリシン等が挙げられる。また、上記実施形態の製造方法によって得られる光学活性アミノ酸は、例えば、上記一般式（3)で表されるものであり、具体的には、 D 口イシン、 D—イソロイシン、 D バリン、 D ノルロイシン、 D ノルパリン、 D—メチォニン、 D システィン、 D ぺ-シラミン、 D フエ二ルァラニン、 D フエ-ルグリシン、又は、 D— 4—ヒドロキシフエ- ルグリシン等が挙げられる。

実施例

[0096] 以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

[0097] (実施例 1)ヒダントインラセマーゼの精製

バチルススピーシーズ（Bacillus sp.)KNK519HR株（FERM BP— 10477)を、表 1の組成の培地（500ml容—坂口フラスコ）に植菌して 30°Cで 17時間、好気的に振とう培養した。

[0098] [表 1]

[0099] 上記培地は、 pH7に調整、オートクレープ殺菌して使用した。ただし、グルコースは他の培地成分と別に殺菌し、殺菌後に添加した。フラスコ中の液量は 300mlとした。

[0100] 培養終了後、遠心分離により菌体を集菌し、 ImMのジチオスレィトール (DTT)を含む 50mMリン酸カリウムノッファー (pH7. 0)に懸濁後、超音波により破砕した後に遠心し、上清を粗酵素液として取得した。粗酵素液に硫酸アンモニゥムを 60〜90 %飽和になるように添加して塩祈した沈殿を遠心分離により取得した。この沈殿を 1 mMの DTTを含む 50mMリン酸カリウムバッファー（pH7. 0)〖こ溶解、同バッファーで透析後、 TSKgel DEAEトヨパール 650M (東ソ一社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、 ImMの DTTを含む 50mMリン酸カリウムバッファー（pH7. 0)で 0 〜0. 6M NaClのグラジェントをかけて溶出して、活性のあるフラクションを集めた。このフラクションに、 1. 5Mとなるように硫酸アンモ-ゥムをカ卩えた後、 TSKgel Phe nylトヨパール 650M (東ソ一社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行、、 ImMの DTTを含む 50mMリン酸カリウムバッファー（pH7. 0)で 1. 5〜0Mの硫酸アンモ- ゥムのグラジェントをかけて溶出した。得られた活性画分を ImMの DTTを含む 50m Mリン酸カリウムバッファー（pH7. 0)で透析した後、 1. 5Mとなるように硫酸アンモ- ゥムを加え、 RESOURCE ISO 1ml (アマシャムフアルマシア社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行、、 ImMの DTTを含む 50mMリン酸カリウムバッファー（p H7. 0)で 1. 5〜0Mの硫酸アンモ-ゥムのグラジェントをかけて溶出した。得られた活性画分を ImMの DTTを含む 50mMリン酸カリウムバッファー（pH7. 0)で透析し、精製ヒダントインラセマーゼを得た。

[0101] この精製ヒダントインラセマーゼを SDS—ポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、ヒダントインラセマーゼはほぼ単一バンドとして検出された。これを HPLC ( カラム： YMC— Pack PROTEIN— RP (YMC社製）、溶離液： 20%ァセトニトリル水溶液〜 80%ァセトニトリル水溶液のグラジェント、流速： lmlZmin.、カラム温度： 25°C、検出： 230nm)で分析したところ、精製ヒダントインラセマーゼの純度は約 93 %であった。

[0102] (実施例 2)ヒダントインラセマーゼの性質

実施例 1で得られた精製ヒダントインラセマーゼの性質を以下のように調べた。

[0103] [N末端アミノ酸配列] 実施例 1の HPLC分析の際に分取したヒダントインラセマーゼを用、て、プロテインシークェンサ一 p_roci_se492 (アプライドバイオシステムズ社製）で N末端アミノ酸配列を解析した。その結果、 N末端カゝら 40アミノ酸の配列を決定できた。その配列を、配列表の配列番号 3に示した。

[0104] [比活性]

得られた精製ヒダントインラセマーゼの活性は、 L— 5— (2—メチルチオェチル)ヒダントイン 50mMを含む 50mM Tris— HC1緩衝液（pH7. 5)中で、 30°C、 30分間に生成する D—5— (2—メチルチオェチル）ヒダントインの増加量を HPLCで定量することにより求めた。 HPLC分析は、カラム： Chirobiotic T(4. 6mm X 250mm, A STEC社製）、溶離液： 0. 01 % (v/v) Triethylamine acetate (pH6. 8) /meth anol=9Zl、流速： 0. 7ml/min.、カラム温度： 35°C、検出： 210nmで行なった。このとき 1分間に 1 μ molの D— 5—（2—メチルチオェチル）ヒダントインを生成する酵素量を lunitと定義した。また、タンパク質の定量は、 BSAを標準タンパク質として Lo wry法で行った。その結果、精製したヒダントインラセマーゼの比活性は 24. 2unit/ mgタンパク質であった。

[0105] [Km値の測定]

L- 5- (2—メチルチオェチル）ヒダントインに対する Km値を、ラインゥエーババークのプロットにより求めた。図 2に示したように、 L- 5- (2—メチルチオェチル）ヒダントインに対する Km値は 0. 304mMであった。

[0106] [作用温度の範囲'至適温度]

作用温度の範囲と至適温度を調べた。 40°Cでの活性を 100%とした場合の各温度での相対活性を図 3に示した。本酵素の至適温度は 40°Cで、検討した 25〜65°Cの範囲でよく作用した。

[0107] [作用 pHの範囲]

作用 pHの範囲と至適 pHを調べた。 pH8. 9での活性を 100%とした場合の各 pH での相対活性を図 4に示した。本酵素は pH6〜10の範囲で作用し、至適 pHは 8〜9 であった。

[0108] [温度安定性] 本酵素の温度安定性を、各温度で 30分間処理した後の残活性で調べたところ、図 5に示すように 30°Cで 80%の残存活性を示し、 70°Cではほぼ失活した。

[0109] [_PH安定'性]

pH安定性について調べた。本酵素を 30°C、 16時間、各 pHで処理した後の残活性を、未処理酵素液の活性を 100%として図 6に示した。本酵素は pH4. 5〜8. 0の間で比較的安定であった。

[0110] [分子量の測定]

ゲルろ過クロマトグラフィー法 (カラム: TSKgel G3000SW (東ソ一社製））により標準タンパク質の溶出時間と比較して分子量を測定したところ、約 139,000であった。また、 SDS ポリアクリルアミド電気泳動により標準タンパク質との移動度と比較してサブユニット分子量を測定したところ、約 31, 000であった。

[0111] [基質特異性]

精製ヒダントインラセマーゼの基質特異性を調べた。それぞれ、 50mM L— 5— ( 2—メチルチオェチル）ヒダントイン、 50mM D— 5—（2—メチルチオェチル）ヒダントイン、 13mM D— 5— (1—メルカプト一 1—メチル）ェチルヒダントイン、 8mM L 5 イソブチルヒダントイン、 50mM L- 5- (1 メチルプロピル）ヒダントイン、または、 4mM L— 5 ベンジルヒダントインを含む 0. 9mlの 50mM Tris— HC1緩衝液 (_PH7. 5)に実施例 1で得た精製ヒダントインラセマーゼ 0. 1mlを添加して 30°Cで反応させた後、 IN HC1 0. lmlを添カ卩して反応を停止した。 D— 5— (1—メルカプト 1ーメチル)ェチルヒダントイン以外の基質を用いた反応の分析は、反応液の遠心上清をイオン交換水で 2倍希釈し、反応液中に生成した D— 5 置換ヒダントイン化合物を HPLCで定量することで行なった。 HPLC分析は前記の条件で行なった。また、 D— 5—（1 メルカプト 1ーメチル)ェチルヒダントインを基質として用いた反応の分析は、反応液を lmlの酢酸ェチルで抽出して得た試料を、次の条件で HPL C分析により定量することで行なった。カラム： CHIRALPAK AD— H (ダイセル社製）、溶離液:へキサン Zイソプロパノール = 9Zl、流速： lmlZmin. 、カラム温度： 25°C、検出： 210nm。その結果を表 2に、 L—5—（2—メチルチオェチル）ヒダントインに対する活性を 100としたときの相対活性値で示した。 [0112] [表 2]

[0113] (実施例 3)バチルススピーシーズ（Bacillus SD.) KNK519HR株の牛.産するヒダントインラセマーゼの某皙特異件

実施例 1と同様に調製したバチルススピーシーズ（Bacillus sp.) KNK519HR株の粗酵素液を用いて、バチルススピーシーズ（Bacillus sp.) KNK519HR株の生産するヒダントインラセマーゼの基質特異性を調べた。それぞれ、 4mM L— 5—ベンジルヒダントイン、 50mM L- 5 - (2—メチルチオェチル）ヒダントイン、または、 8m M L—5—イソブチルヒダントインを含む 0. 9mlの 50mM Tris— HC1緩衝液（pH 7. 5)に上記粗酵素液 0. 1mlを添カ卩して、 30°Cで反応させた後、 IN HC1 0. lml を添加して反応を停止した。その遠心上清をイオン交換水で 2倍希釈し、反応液中に生成した D— 5—置換ヒダントインィ匕合物を HPLCで定量した。 HPLC分析は、力ラム： Chirobiotic T (4. 6mm X 250mm、 ASTEC社製）、溶離液： 0. 01% (v/v ) Triethylamme acetate Η6. 8) / methanol = 9/ 1、流速： 0. 7ml/ mm.、カラム温度： 35°C、検出： 210nmで行なった。また、 50mM 5—メチルヒダントインを含む 50mM Tris— HC1緩衝液（pH7. 5) 0. 9ml〖こ上記バチルススピーシーズ（B acillus sp.) KNK519HR株の粗酵素液 0. lml、後述の培養液 lml分の D体選択的ヒダントイナーゼ活性を有する組換え大腸菌および培養液 lml分の D体選択的 N— 力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ活性を有する組換え大腸菌を同時に添加して、 30°Cで反応させた後、 IN HC1 0. lmlを添カ卩して反応を停止した。 IN NaOH を添加して中和した後、遠心分離し、上清中に生成した D ァラニンを D—アミノ酸ォキシダーゼとペルォキシダーゼを用 V、た酵素法で定量した。

[0114] 酵素法による D ァラニンの定量は次のように実施した。反応液上清をイオン交換水で 5倍希釈し、 1. 3mM 4 ァミノアンチピリン、 2. 2mM N ェチル N— (2 —ヒドロキシ一 3—スルフォプロピル）一 m—トルイジン、 0. 8U/ml ペルォキシダーゼ（CALZYME Lavoratories, Inc.社製、製品番号 100A0600)、 1. 2U/ml D—アミノ酸ォキシダーゼ（SIGMA社製、製品番号 A5222)、および、 40mM リン酸カリウム緩衝液 (_PH7. 9)からなる発色液と 1 : 1で混合し、室温で 90分間させ、 55 5nmの吸光度を測定して、反応液中に生成した D ァラニン量を定量した。その結果を表 3に、 L— 5—イソプチルヒダントインに対する活性を 100としたときの相対活性値で示した。

[0115] 本実施例で使用する、 D体選択的ヒダントイナーゼ活性を有する組換え大腸菌および D体選択的 N -力ルバミルアミノ酸アミドノ、イド口ラーゼ活性を有する組換え大腸菌の培養液は次のようにして得た。 D体選択的ヒダントイナーゼ活性を有する組換え大腸菌であるェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB 101 (pTH 104) (FERM BP 4864)を 500ml坂口フラスコ内で滅菌した 50mlの培地（トリプトン 16g、イーストェキス 10g、塩化ナトリウム 5g、水 11、塩化マンガン 400ppm、滅菌前 pH7、別途ろ過滅菌したアンピシリンナトリウム lOOppm)に接種して、 37°Cで 24時間振とう培養した。また、 D体選択的 N—力ルバミルアミノ酸アミドノ、イド口ラーゼ活性を有する組換え大腸菌であるェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB101 (pNT4553) (FERM BP —4368)を 500ml坂口フラスコ内で滅菌した 350mlの培地（トリプトン 16g、イーストエキス 10g、塩ィ匕ナトリウム 5g、水 11、滅菌前 pH7、別途ろ過滅菌したアンピシリンナトリウム lOOppm)に接種して、 37°Cで 36時間振とう培養した。

[0116] [表 3] 基質

L-5一イソブチルヒダントイン 100

し一 5一（2—メチルチオェチル）ヒダントイン 61

L-5一ベンジルヒダントイン 35

L-5ーメチルヒダン卜イン 20

[0117] なお、上記ェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB 101 (pTH 104) (FERM BP— 4864)は、 1994年 11月 2日付けで、ェシエリヒアコリ (Escherichia coli) HB101 (p NT4553) (FERM BP— 4368)は 1993年 7月 22日付けで、それぞれ記載の受託番号にて、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (IPOD :〒3 05-8566 茨城県つくば巿東 1 1 1 中央第 6)に寄託されている。

[0118] (実施例 4)バチルススピーシーズ（Bacillus SD.) KNK519HR株の生産するヒダントインラセマーゼの某晳阻害

バチルススピーシーズ（Bacillus sp.)KNK519HR株の生産するヒダントインラセマーゼの基質阻害効果を実施例 1で調製した粗酵素液を用いて調べた。 5、 10、 50 、または、 80mM L— 5—（2—メチルチオェチル）ヒダントインを含む 50mM Tris HC1緩衝液 (pH7. 5) 0. 9mlと上記粗酵素液 0. 1mlの混合反応液中 30°Cで、 1 0、 20、 30、ないし、 40分間反応させた後、 IN HC1 0. 1mlを添カ卩してヒダントインラセマーゼを失活させ、遠心上清をイオン交換水で 2倍希釈し、反応液中に生成した D- 5- (2—メチルチオェチル）ヒダントインを HPLCで定量した。 HPLC分析は実施例 3と同じ条件で実施した。それぞれの初発基質濃度について反応初速度を求め、初発基質濃度との関係を図 7に示した。その結果、バチルススピーシーズ (Bacillu s sp.)KNK519HR株の生産するヒダントインラセマーゼは、 50、ないし、 80mM L 5—（2—メチルチオェチル)ヒダントインを基質としたときに基質阻害を受けることが明らかになった。

[0119] ( 施例 5)ヒダントインラセマーゼ遣伝早の単離

バチノレススピーシーズ（Bacillus sp.)KNK519HR株のコロニーを、培地 10ml (l 6g トリプトンペプトン（DIFCO社製）、 10g バクトイーストエキス（Becton Dickin son and Company社製）、 5g NaClに水をカ卩えて 1Lとして pH7に調製、オートクレーブ殺菌して使用）に植菌して 30°Cで 12時間、好気的に振とう培養した。

[0120] 培養終了後、遠心分離で菌体を集菌して、 UltraClean Microbial DNA Isolation Kit

(MO BIO Laboratories, Inc.社製）を用いて DNA溶液を取得した後、エタノールで析出させ、遠心分離で得られた沈殿を 10mM Tris— HC1緩衝液（pH8. 0、 ImM エチレンジァミン四酢酸)へ溶解させることで染色体 DNAを調製した。次いで、実施例 2で得た N末端アミノ酸配列にもとづ、て設計した DNAプライマー（Primer— 1：配列表の配列番号 4)と、既知のヒダントインラセマーゼの配列相同部位にもとづいて設計した DNAプライマー（Primer— 2：配列表の配列番号 5)を用いて、先に得た染色体 DNAを铸型に PCRを行った。その結果、目的のヒダントインラセマーゼ遺伝子の一部 (部分遺伝子と称す)を取得した。

[0121] 次に、目的遺伝子の全長を取得するために以下の操作を行った。上記部分遺伝子において、酵素の N末端側、 C末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、部分遺伝子の外側方向へ向けた DNAプライマー（Primer— 3：配列表の配列番号 6、及び、 Primer— 4 :配列表の配列番号 7)を合成した。このプライマーを用い、先に得た染色体 DNAを制限酵素 Kpnl、 Spelで分解したものを Τ4 DNAリガーゼを用いて環化させて得た DNAを铸型に、インバース PCRを行った。これにより、既に取得した部分遺伝子のさらに外側の遺伝子部分を含む DNA断片を取得した。この DNA断片の塩基配列を決定後、酵素の N末端より上流と推定される部分に制限酵素 Ndelの切断部位を結合させた配列をもつ DNAプライマー（Primer— 5：配列表の配列番号 8)と、 C末端より下流と推定される部分に制限酵素 EcoRI切断部位を結合させた配列をもつ DNAプライマー（Primer— 6：配列表の配列番号 9)を用いて、この配列の間の DNAを先に得た染色体 DNAを铸型にした PCRにより増幅することでヒダントインラセマーゼ遺伝子の全長を含む DNA断片（配列表の配列番号 10)を取得した。得られた DNA断片の塩基配列を解析し、ヒダントインラセマーゼ遺伝子の全長 (配列表の配列番号 2)が含まれてヽることを確認した。

[0122] 施例 6)ヒダントインラセマーゼ遣伝早発現する鉬. ¾ プラスミドの作成

実施例 5で得られたヒダントインラセマーゼ遺伝子の N末端、 C末端部分にそれぞれ制限酵素 Ndel及び EcoRIの切断部位を結合させた配列を持つプライマー（Prim er— 7 :配列表の配列番号 11、 Primer— 8 :配列表の配列番号 12)を用いて、この間の DNAを実施例 5で得た染色体 DNAを铸型にした PCRにより増幅することで配列表の配列番号 2に示されるオープンリーディングフレームの DNA断片を取得した。

[0123] この DNA断片を制限酵素 Ndelと EcoRIで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミド pUCNT (国際公開第 WO94Z03613号参照）と T4 DNAリガーゼを用いて結合することで、図 1の制限酵素地図で表され、ヒダントインラセマーゼ遺伝子を大量に発現できるように設計された pBHROO 1を取得した。

[0124] (実施例 7)ヒダントインラセマーゼ遺伝子を含む組椽ぇ体 DNAを用いた形皙転椽体の作成実施例 6で得られたプラスミド pBHROOlをェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB1 01のコンビテントセルと混合することで形質転換を行い、寒天培地（トリプトン 10g、ィ一ストエキス 5g、塩ィ匕ナトリウム 10g、寒天 15g、アンピシリン 100mg、脱イオン水にて 11にメスアップ、滅菌前 pH7. 0、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）にプレ一ティングして、ヒダントインラセマーゼ遺伝子を含む組換え体 DNAを含有する形質転換体ェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB101 (pBHROOl)をコロニーとして取得した。

[0125] 得られた形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した 6mlの培地 (前記の培地力も寒天を除いたもの）に植菌後、 37°Cで 23時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液カゝら遠心分離により菌体魏菌し、 50mM Tris—塩酸緩衝液 (pH 7. 5)に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体のヒダントインラセマーゼ酵素液を取得した。得られた酵素液 0. 1mlを用いて、実施例 2と同じ方法でヒダントインラセマーゼ活性を測定したところ、ヒダントインラセマーゼ活性が確認された。

[0126] ( 施例 8)形皙転橼体のヒダントインラセマーゼの特虽件

実施例 7で得た形質転換体のヒダントインラセマーゼ酵素液を用いて、実施例 2と同じ方法で基質特異性を調べた。その結果を表 4に、 L- 5- (2—メチルチオェチル )ヒダントインに対する活性を 100としたときの相対活性値で示した。

[0127] [表 4] 基質

L-5- - (2—メチルチオェチル）ヒダントイン 100

D-5- - (2—メチルチオェチル）ヒダントイン 52

D-5- - ( 1—メルカプト一 1ーメチル）ェチルヒダントイン 9

L-5-イソプチルヒダントイン 174

L-5- ( 1一メチルプロピル）ヒダントイン 2

L-5-ベンジルヒダントイン 35

[0128] 施例 9)ヒダントインラセマーゼ活件菌禾 II用した光学活件アミノ酸の合成

実施例 3に示した D体選択的ヒダントイナーゼ活性を有する組換え大腸菌であるェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB 101 (pTH104) (FERM BP— 4864)、および、 D体選択的 N -力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ活性を有する組換え大腸菌であるェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB101 (pNT4553) (FERM BP— 43 68)を、実施例 1で培養したヒダントインラセマーゼ活性を有するバチルススピーシーズ（Bacillus sp.)KNK519HR株の培養液と同時に、 DL— 5— (2—メチルチオェチル）ヒダントイン、または、 DL— 5—メチルヒダントインのそれぞれに作用せしめ、対応する D アミノ酸を合成した。

[0129] 1. DL— 5—（2—メチルチオェチル）ヒダントインから D メチォニンの合成

実施例 1のバチルススピーシーズ（Bacillus sp.)KNK519HR株の培養液 lml分の菌体と、実施例 3の D体選択的ヒダントイナーゼ活性を有する組換え大腸菌の培養液 lml分の菌体、および、実施例 3の D体選択的 N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ活性を有する組換え大腸菌の培養液 lml分の菌体を、 2% (w/v) DL- 5 — (2—メチルチオェチル）ヒダントインを含む 50mM Tris— HC1緩衝液（pH7. 5) 0. 5mlに懸濁し、 30°Cで反応を行った。 19時間後に反応液に IN HC1 0. 05ml を添加して反応を停止し、反応上清をイオン交換水で 50倍希釈して HPLCで分析した。 HPLC分析は実施例 3に示した条件で行なった。その結果、モル収率 80%で D メチォニンが生成し、光学純度は 86. 0%eeであった。それと比較して、 KNK519 HR株培養菌体を添カ卩しなかった場合、モル収率 39%で D—メチォニンが生成し、 3 8mol%の L 5—（2—メチルチオェチル）ヒダントインが残存した。

[0130] 2. DL— 5—メチルヒダントインから D ァラニンの合成

実施例 1のバチルススピーシーズ（Bacillus sp.)KNK519HR株の培養液 lml分の菌体と、実施例 3の D体選択的ヒダントイナーゼ活性を有する組換え大腸菌の培養液 lml分の菌体、および、実施例 3の D体選択的 N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ活性を有する組換え大腸菌の培養液 lml分の菌体を、 2% (w/v) DL- 5 —メチルヒダントインを含む 50mM Tris— HC1緩衝液（pH7. 5) 0. 5mlに懸濁し、 30°Cで反応した。 18時間後に反応液に IN HC1 0. 05mlを添カ卩して反応を停止し、イオン交換水で 20倍希釈した後、遠心分離し、上清を HPLCで分析した。

[0131] HPLC分析は次に示す条件で実施した。カラム： CROWNPAK CR+ (4. 6mm

X 150mm,ダイセル社製）、溶離液： HCIO (pHl. 5)、流速： 0. 4ml/min.、力

4

ラム温度： 4°C、検出： 210nm。その結果、 KNK519HR株培養菌体を添カ卩しなかつた場合の DL— 5—メチルヒダントインの残存率が 32%であったのに対して、残存率は 3. 6%であり D ァラニン生成量が増加した。

[0132] (実施例 10)形皙転椽体を刺用した光学活件 N—力ルバミルアミノ酸及び光学活件アミノ酸の合成

実施例 7で得たヒダントインラセマーゼ活性を有する形質転換体、実施例 3で得た D 体選択的ヒダントイナーゼ活性を有する組換え大腸菌ェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB101 (pTH104)、および実施例 3で得た D体選択的 N—力ルノミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ活性を有する組換え大腸菌ェシエリヒアコリ（Escherichia coli) H B101 (pNT4553)のそれぞれを培養後の培養液力も遠心分離により集菌し、 50m M Tris— HC1緩衝液 (pH7. 5)に懸濁して超音波により菌体を破砕して各酵素液を取得した。それらの酵素液を、 DL— 5—イソブチルヒダントイン、 DL— 5— (2—メチルチオェチル）ヒダントイン、 DL— 5—（1 メルカプト 1ーメチル）ェチルヒダントイン、または、 DL— 5—ベンジルヒダントインに作用させて、対応する D— N 力ルバミルアミノ酸又は D -アミノ酸を合成した。

[0133] 1. DL— 5 イソブチルヒダントインから D 口イシンの合成

前記のヒダントインラセマーゼ活性を有する形質転換体の培養液 2ml分、前記の D 体選択的ヒダントイナーゼ活性組換え菌の培養液 2ml分、および、前記の D体選択的 N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ活性組換え菌の培養液 10ml分の菌体破砕液を、 5% (wZv) DL— 5—イソブチルヒダントインを含む 0. 83M 2— [4— (2 ― hydroxyetnyl)― 1— piperazmyl]etnanesulfonic acid (HEPES)— NaOH 緩衝液 (pH7. 0) 2mlに懸濁し、 30°Cで反応を行った。また、比較例としてヒダントインラセマーゼ活性組換え菌破砕液を添加しな、反応も行なった。 2時間後に反応液を 0. 01 % (v/v) Triethylamine acetate (pH6. 8) /methanol= 9/lで 50倍希釈して、遠心上清を HPLCで分析した。その結果、変換率 99%で 100%eeの D— ロイシンが生成した (L体 n. d. ) ₀また、比較例であるヒダントインラセマーゼ活性組換え菌破砕液を添加しな、反応では変換率 26%であった。 HPLC分析によるアミノ酸の定量は次に示す条件で実施した。カラム： CROWNPAK CR+ (4. 6mm X I 50mm、ダイセル社製）、溶離液： HCIO (pHl. 5)、流速： lmlZmin. 、カラム温度 : 25°C、検出： 210nm。

[0134] 2. DL— 5—イソブチルヒダントインから D—N—力ルバミルロイシンの合成

前記のヒダントインラセマーゼ活性を有する形質転換体の培養液 2ml分、前記の D 体選択的ヒダントイナーゼ活性組換え菌の培養液 2ml分の菌体破砕液を、 5% (w/ v) DL— 5—イソブチルヒダントインを含む 0. 2M Tris— HC1緩衝液（pH8. 5) 2ml に懸濁し、 30°Cで反応を行った。また、比較例としてヒダントインラセマーゼ活性組換ぇ菌破砕液を添加しない反応も行なった。 6時間後に反応液を 0. 01% (v/v)Triet hylamine acetate (pH6. 8) Zmethanol= 9Zlで 50倍希釈して、遠心上清を H PLCで分析した。その結果、変換率 74%で 100%eeの D— N—力ルノミルロイシンが生成した (L体 n. d. ) ₀また、比較例であるヒダントインラセマーゼ活性組換え菌破砕液を添加しない反応では、変換率 49%であった。 HPLC分析による定量は次に示す条件で実施した。カラム： Chirobiotic T(4. 6mmX 250mm、 ASTEC社製）を 2本連結、溶離液：0. 01% (v/v) Triethylamine acetate (pH6. 8) /metha nol= 9Zl、流速： 0. 7ml/min.、カラム温度： 35°C、検出： 210nm。

[0135] 3. L— 5—イソブチルヒダントインから D—口イシンの合成

前記のヒダントインラセマーゼ活性を有する形質転換体の培養液 2ml分、前記の D 体選択的ヒダントイナーゼ活性組換え菌の培養液 2ml分、および、前記の D体選択的 N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ活性組換え菌の培養液 8ml分の菌体破砕液を、 5% (wZv) L— 5—イソブチルヒダントインを含む 0. 63M HEPES— Na OH緩衝液 (pH7. 0) 2mlに懸濁し、 40°Cで反応を行った。 2. 5時間後に反応液を 10mMリン酸カリウム緩衝液 (pH2. 0) /ァセトニトリル = 95/5で 50倍希釈して、遠心上清を HPLCで分析した。その結果、変換率 99%で 100%eeの D—ロイシンが生成した (L体 n. d. ) ₀ HPLC分析によるアミノ酸の定量は、上述の「1.」で説明した条件と同じ条件で実施した。

[0136] 4. DL— 5—（2—メチルチオェチル）ヒダントインから D—メチォニンの合成

前記のヒダントインラセマーゼ活性組換え菌、前記の D体選択的ヒダントイナーゼ活性組換え菌、および、前記の D体選択的 N—力ルバミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ活性組換え菌の、それぞれの培養液 2ml分の菌体破砕液を、 l% (w/v) DL- 5- (2—メチルチオェチル）ヒダントインを含む lOOmMリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 0) 2 mlに懸濁し、 40°Cで反応を行った。また、比較例としてヒダントインラセマーゼ活性組換え菌破砕液を添加しな、反応も行なった。 2時間後に反応液を 10mMリン酸力リウム緩衝液 (PH2. 0) /ァセトニトリル = 95/5で 20倍希釈して、遠心上清を HPL Cで分析した。その結果、変換率 93%で D—メチォニンが生成し、この時、比較例であるヒダントインラセマーゼ活性組換え菌破砕液を添加しなヽ反応では、変換率 47 %であった。 HPLC分析によるアミノ酸の定量は次に示す条件で実施した。カラム: D evelosil ODS HG 5 (4. 6mm X 150mm、ノムラケミカル社製）、溶離液： 60m Mリン酸カリウム緩衝液（5mMデカンスルホン酸ナトリウム） Zメタノール = 3Zl、流速： lmlZmin.、カラム温度： 40°C、検出： 210nm。

[0137] 5. DL— 5— (1—メルカプト一 1—メチル）ェチルヒダントインから D ぺ-シラミンの合成

前記のヒダントインラセマーゼ活性組換え菌の培養液 2ml分、前記の D体選択的ヒダントイナーゼ活性組換え菌の培養液 2ml分、および、前記の D体選択的 N—カルノミルアミノ酸アミドハイド口ラーゼ活性組換え菌の培養液 4ml分の菌体破砕液を、 1 % (w/v) DL— 5— ( 1—メルカプト 1—メチル）ェチルヒダントインを含む lOOmM

HEPES- NaOH緩衝液 (pH7. 0) 2mlに懸濁し、 40°Cで反応を行った。また、比較例としてヒダントインラセマーゼ活性組換え菌破砕液を添加しない反応も行なった。 2. 5時間後に反応液を 10mMリン酸カリウム緩衝液 (pH2. 0) /ァセトニトリル = 9 5Z5で 20倍希釈して、遠心上清を HPLCで分析した。その結果、変換率 86%で 10 0%eeの D ぺ-シラミンが生成した (L体 n. d. ) ₀また、比較例であるヒダントインラセマーゼ活性組換え菌破砕液を添加しない反応では、変換率 52%であった。 HPL C分析は上述の「4.」で説明した条件と同じ条件で行なった。

[0138] 6. DL— 5 ベンジルヒダントインから D フエ-ルァラニンの合成

上述の「1.」で説明した条件と同じ条件で、基質を DL— 5 ベンジルヒダントインとして反応した。また、比較例としてヒダントインラセマーゼ活性組換え菌破砕液を添カロしない反応も行なった。その結果、反応 9時間で変換率 83%で 98. l%eeの D フェニルァラニンが生成した。また、比較例であるヒダントインラセマーゼ活性組換え菌破砕液を添加しない反応では変換率 40%であった。

7. DL- 5-ベンジルヒダントインから D -N-力ルバミルフエ-ルァラニンの合成上述の「2.」で説明した条件と同じ条件で、基質を DL— 5—ベンジルヒダントインとして反応した。また、比較例としてヒダントインラセマーゼ活性組換え菌破砕液を添加しない反応も行なった。その結果、反応 20時間で変換率 84%で D—N—力ルバミルフエ-ルァラニンが生成した。また、比較例であるヒダントインラセマーゼ活性組換え菌破砕液を添加しな!、反応では、変換率 48%であった。

ラフである。

Claims

請求の範囲 [I] 下記の性質を有し、ヒダントインラセマーゼ活性を有するポリペプチド。

1.分子量

約 139, 000

2. L— 5—（2—メチルチオェチル）ヒダントインに対する Km値

約 0. 304mM

3.作用温度の範囲

温度範囲 25°C〜65°C、至適温度約 40°C

4.作用 pHの範囲

pH範囲 6〜10、至適 pH8〜9

5.温度安定性

30°C以下

6. pH安定性

pH4. 5〜8. 0

[2] バチルス (Bacillus)属に属する微生物に由来する請求項 1記載のポリペプチド。

[3] 前記微生物が、バチルススピーシーズ（Bacillus sp.)KNK519HR株（FERM BP

10477)である請求項 2記載のポリペプチド。

[4] 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。

[5] 請求項 1から 4のいずれ力 1項に記載のポリペプチドをコードする DNA。

[6] 配列表の配列番号 1のアミノ酸配列をコードする DNA。

[7] 配列表の配列番号 2に示す塩基配列もしくはこれと等価の塩基配列を有し、ヒダントインラセマーゼの遺伝子を含む DNA。

[8] 請求項 5から 7の、ずれか 1項に記載の DNAを含む組換えプラスミド。

[9] 前記組換えプラスミド力プラスミド pBHROOlである請求項 8記載の組換えプラスミド

[10] 請求項 8または 9に記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体。

[II] 前記宿主微生物がェシエリヒアコリ（Escherichia coli)である請求項 10に記載の形質転換体。

[12] 前記形質転換体がェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB101 (pBHROOl) (FER

M BP- 10476)である請求項 10に記載の形質転換体。

[13] 請求項 1または 4に記載のポリペプチドを生産する能力を有し、かつ、バチルス (Bacil lus)属に属する微生物。

[14] バチルススピーシーズ（Bacillus sp.)KNK519HR株（FERM BP— 10477)、又はその変異株である請求項 13記載の微生物。

[15] 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするヒダントインラセマーゼの製造方法。

[16] 前記微生物が請求項 10から 12のいずれか 1項に記載の形質転換体、又は、請求項

13もしくは 14記載の微生物である、請求項 15に記載のヒダントインラセマーゼの製造方法。

[17] 前記ヒダントインラセマーゼの生産能を有する微生物力バチルススピーシーズ (Ba cillus sp.)KNK519HR株（FERM BP— 10477)である請求項 16に記載のヒダントインラセマーゼの製造方法。

[18] 前記ヒダントインラセマーゼの生産能を有する形質転換体力ェシエリヒアコリ（Esch erichia coli) HB101 (pBHROOl) (FERM BP— 10476)である請求項 16に記載のヒダントインラセマーゼの製造方法。

[19] 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載のヒダントインラセマーゼ活性を有するポリぺプチド、請求項 10から 12のいずれか 1項に記載の形質転換体、又は請求項 13もしくは

14に記載の微生物を、光学活性 5—置換ヒダントイン化合物に作用させることを特徴とする光学活性 5—置換ヒダントインのラセミ化方法。

[20] 前記光学活性 5—置換ヒダントイン化合物が一般式（1)

[化 1]

(式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有して V、てもよ、炭素数 7〜20のァラルキル基、もしくは置換基を有して、てもよ、炭素数 6〜20のァリール基を表す。）で表される光学活性 5—置換ヒダントインである、請求項 19記載の光学活性 5 -置換ヒダントインのラセミ化方法。

[21] 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載のヒダントインラセマーゼ活性を有するポリぺプチド、請求項 10から 12のいずれか 1項に記載の形質転換体、又は請求項 13もしくは 14に記載の微生物と、ヒダントイナーゼを、 5—置換ヒダントインィ匕合物に作用させることを特徴とする光学活性 N—力ルバミルアミノ酸の製造方法。

[22] 前記光学活性 5—置換ヒダントイン化合物が一般式（1)

[化 2]

(式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有して V、てもよ、炭素数 7〜20のァラルキル基、もしくは置換基を有して、てもよ、炭素数 6〜20のァリール基を表す。）で表される 5—置換ヒダントインであり、前記光学活性 N—力ルバミルアミノ酸が一般式（2)

[化 3]

(式中、 Rは前記と同じ)で表される光学活性 N—力ルバミルアミノ酸である、請求項 2 1記載の光学活性 N—力ルバミルアミノ酸の製造方法。

[23] 前記光学活性 N 力ルバミルアミノ酸が、 N 力ルバミル D ロイシン、 N 力ルバミル—D—イソロイシン、 N 力ルバミル D パリン、 N 力ルバミル D ノルロイシン、 N カノレバミノレー D ノノレバリン、 N カノレバミノレー D—メチォニン、 N 力ノレノミル D—システィン、 N 力ルバミル D ぺニシラミン、 N 力ルバミル D— フエ-ルァラニン、 N 力ルバミル— D フエ-ルグリシン、又は、 N 力ルバミル— D 4ーヒドロキシフエ-ルグリシンである請求項 22に記載の製造方法。

[24] 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載のヒダントインラセマーゼ活性を有するポリぺプチド、請求項 10から 12のいずれか 1項に記載の形質転換体、又は請求項 13もしくは 14に記載の微生物と、ヒダントイナーゼおよび N—力ルバミルアミノ酸アミドノ、イドロラーゼを、 5 -置換ヒダントインィ匕合物に作用させることを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法。

[25] 前記 5 置換ヒダントイン化合物が一般式（1)

[化 4]

(式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1 20のアルキル基、置換基を有して V、てもよ、炭素数 7 20のァラルキル基、もしくは置換基を有して、てもよ、炭素数 6 20のァリール基を表す。）で表される 5 置換ヒダントインであり、前記光学活性アミノ酸が一般式 (3)

[化 5]

(式中、 Rは前記と同じ。）で表される光学活性アミノ酸である、請求項 24記載の光学活性アミノ酸の製造方法。

光学活性アミノ酸力 D—ロイシン、 D—イソロイシン、 D—パリン、 D—ノルロイシン、 D—ノルパリン、 D—メチォニン、 D—システィン、 D—ぺ-シラミン、 D—フエ二ルァラニン、 D—フエ-ルグリシン、又は、 D— 4—ヒドロキシフエ-ルグリシンである請求項 2 5に記載の製造方法。