WO2007097106A1 - 新規微生物、当該新規微生物を用いたドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の製造方法 - Google Patents

新規微生物、当該新規微生物を用いたドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の製造方法 Download PDF

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Shuichi Takizawa
Norihiko Higaki
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    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C

Definitions

  • the present invention relates to a novel microorganism that produces dodecahydro-3a, 6,6,9a_tetramethylnaphtho [2, lb] furan intermediate using sclareol as a substrate, and further, dodecahydro- 3a, 6,6,9a-Tetramethylnaphtho [2, lb] relates to the production of furan intermediate.
  • Dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, 1-b] furan (sometimes called ambroxan TM) is a highly fragrant fragrance, mainly made of clary sage ( Salvia sclarea) Force is also produced by chemical conversion from extracted Sclareol.
  • Figure 1 shows the process of producing dodecahydro_3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, l-b] furan from sclerole.
  • dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan intermediates include decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethylnaphthalene ethanol.
  • sclareolide dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, 1-b] furan-2 (1H toon; (Sclareolide)), not shown in FIG.
  • Dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan intermediates include cyclic ethers (8 ⁇ , 13-oxide-12,13-dehydro-15,16-dinorlabdane) It has been known.
  • Patent Document 1 discloses the production of decahydro-2-hydroxy_2,5,5,8a-tetramethylnaphthaleneethanol by Hyphozyma roseoniger ATCC20624.
  • Patent Document 2 discloses the production of dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, l_b] furan intermediate by Cryptococcus laurentii ATCC20920, and Patent Document 3 discloses Bensingtonia cilliata ATCC20919.
  • dodecahydro_3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, l_b] furan intermediate is disclosed, and in Patent Document 4, Cryptococcus albidus ATCC20918 and Cryptococcus albidus ATCC
  • dodecahydro_3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan intermediate by 20921 is disclosed.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 2547713
  • Patent Document 2 Patent No. 2802588
  • Patent Document 3 Patent No. 3002654
  • Patent Document 4 Patent No. 2063550
  • the present invention efficiently produces dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate using sclareol as a substrate. And a method for producing a dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan intermediate using the microorganism. It aims to.
  • the present inventors have intensively studied to isolate and identify microorganisms having the desired characteristics using the soils of Haga-gun, Tochigi Prefecture and Utsunomiya-shi, Tochigi Prefecture as a separation source.
  • the present invention was made based on the knowledge that dodecahydro_3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan intermediate can be produced using sclareol possessed by these novel microorganisms as a substrate. is there.
  • novel microorganisms according to the present invention all belong to the Ascomycetes, and sclareoyl as a substrate, dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, l_b] furan intermediate Has the ability to generate Microorganisms belonging to the Ascomycetes with this ability are a new finding, and dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan and its It can be a microorganism useful for the production of intermediates.
  • the nucleotide sequence of a gene encoding 28S rRNA (hereinafter referred to as 28S rDNA) was determined for the novel microorganism isolated and identified by the present inventors, the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 were obtained. Further, when the nucleotide sequence of a gene encoding 18S rRNA (hereinafter referred to as 18S rDNA) was determined for the novel microorganism, the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 were obtained. Furthermore, the new microorganism exhibited the mycological properties shown in Table 1.
  • the present inventor identified a novel microorganism based on the base sequence of 28S rDNA shown in SEQ ID NOs:! To 3, the base sequence of 18S rDNA shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 and the mycological properties shown in Table 1. As a result, the new microorganism could not be identified except for belonging to the Ascomycetes. In other words, it was concluded that the new microorganisms do not fall into the known genus and species belonging to the Ascomycetes and constitute a new genus. Classification using mycological properties is Barnett, JA, Payne, RW, and Yarrow, D. (2000) Yeasts: Characteris rd.
  • the microorganism according to the present invention belongs to the Ascomycetes, and in the process of synthesizing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho using sclareol as a substrate. It is a microorganism that has the ability to produce intermediates in it.
  • the microorganism according to the present invention has 28S rDNA consisting of a base sequence having 95% or more homology with the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3, or in the base sequences shown in SEQ ID NOs: 4-6. It is desirable to have 18S rDNA consisting of a base sequence having a homology of 95% or more.
  • the microorganism according to the present invention desirably has the mycological properties described in Table 1.
  • the microorganism according to the present invention is an ascomycete yeast identified by the accession number FERM BP-10713, FERM BP-10712 or FERM BP-10714, a genus, preferably a species, belonging to the ascomycete yeast. More preferably, it is a microorganism belonging to a strain.
  • the intermediate includes decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethylnaphthaleneethanol and / or sclareolide (dodecahydro_3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, 1-b] furan-2 (1H) -one).
  • the present invention can provide a method for producing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate using the novel microorganism according to the present invention.
  • the method for producing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, l_b] furan intermediate according to the invention comprises culturing the novel microorganism in a medium containing sclareol, and using doclara-3a as a base material. , 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, 1-b] furan intermediates in the synthesis process.
  • an intermediate in the process of synthesizing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan belongs to Ascomycetes and uses sclareol as a substrate. It is possible to provide a novel microorganism having the ability to From this intermediate, dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan, which is a raw material for fragrances and the like, can be produced. Therefore, by using the novel microorganism according to the present invention, dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan can be produced at low cost.
  • a method for producing a tetramethylnaphtho [2, l_b] furan intermediate can be provided.
  • dodecahydro_3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan intermediate according to the present invention, dodecahydro_3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] It becomes possible to produce francs at low cost.
  • FIG. 1 is a diagram showing a process for producing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan from sclareol.
  • the novel microorganism according to the present invention belongs to the Ascomycetes, and is an intermediate in the process of synthesizing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan based on sclareol. Dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate).
  • the novel microorganism according to the present invention can be isolated from soil using as an index the ability to produce dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, l_b] furan intermediate.
  • the ability of dodecahydro_3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate to be produced is determined by culturing the test microorganism in a sclareol-containing medium and containing dodecahydro-3a, 6, This can be evaluated by detecting the 6,9a-tetramethylnaphtho [2, l_b] furan intermediate.
  • the dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate contained in the medium is obtained from the medium after removal of the test microorganism using an organic solvent from the medium. After extracting 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan intermediate, it can be detected, for example, by gas chromatography (GC).
  • GC gas chromatography
  • the detection of dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan intermediate is not limited to GC, but includes, for example, gas-liquid chromatography (GLC), thin layer chromatography (TLC ), High pressure liquid chromatography (HPLC), infrared spectroscopy (IR) and nuclear magnetic resonance (NMR) can be used.
  • LLC gas-liquid chromatography
  • TLC thin layer chromatography
  • HPLC High pressure liquid chromatography
  • IR infrared spectroscopy
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • the present inventor has isolated a novel microorganism belonging to the Ascomycetes from soil in Haga-gun, Tochigi Prefecture and Utsunomiya, Tochigi Prefecture.
  • the isolated novel microorganism has the ability to produce dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan intermediate in the medium by culturing in the medium containing sclareol. is doing.
  • the inventor named the new microorganisms Ascomycete sp. KSM-JL2842, Ascomycete sp. KSM-J3571 and Ascomycete sp.
  • KSM-JL4651 and the National Institute for Advanced Industrial Science and Technology (IPOD: ⁇ 305-8566 Ikegi, Ibaraki, Tsukuba 1-chome, 1-chome, 1-centre, 6), deposit numbers FERM BP-10713, FERM BP-10712 and FERM BP-10714, respectively.
  • the novel microorganism according to the present invention includes a yeast belonging to the Ascomycetes identified by the accession number FERM BP_10713, FERM BP-10712 or FERM BP-10714, and the same genus as the yeast.
  • a yeast belonging to the Ascomycetes identified by the accession number FERM BP_10713, FERM BP-10712 or FERM BP-10714, and the same genus as the yeast.
  • the same species as the yeast more preferably the same strain as the yeast and dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [ 2,1_b] furan intermediates will be included.
  • the ascomycetous yeasts identified by the accession numbers FERM BP_10713, FERM BP-10712, and FERM BP-10714 have 28S rDNAs containing the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively. Therefore, the novel microorganism according to the present invention is a nucleotide sequence having 95% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or more similarity to the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs:! To 3 Ascomycetous yeast having 28S rDNA containing, which contains microorganisms capable of producing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan intermediate.
  • the ascomycetous yeasts identified by the accession numbers FERM BP_10713, FERM BP-10712, and FERM BP-10714 have 18S rDN A containing the base sequences shown in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, respectively. . Therefore, the novel microorganism according to the present invention has a nucleotide sequence having a homology of 95% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or more with respect to the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4 to 6.
  • Ascomycetous yeast having 18S rDNA including microorganisms capable of producing dodecahydrin-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan intermediate.
  • the above-described novel microorganism according to the present invention can be used to produce dodecahydro_3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, l_b] furan intermediate.
  • the produced dodecahydro_3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan intermediate is dodecahydro_3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho, which is a high-value-added, high-perfume fragrance.
  • 2, l_b] Can be used as a raw material in the production of furan.
  • the novel microorganism according to the present invention is used.
  • the microorganism is cultured in a medium containing sclareol.
  • a medium any medium having any composition can be used as long as microorganisms belonging to the ascomycetous fungi can grow.
  • usable media include solid media and liquid media containing carbon sources, nitrogen sources, metal minerals and vitamins.
  • a surfactant or an antifoaming agent may be added according to the culture conditions.
  • Examples of the carbon source added to the medium include monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides and polysaccharides, and two or more of these may be used in combination.
  • examples of the carbon source other than the saccharide include organic acid salts such as acetate.
  • each of these components may be used alone, or a plurality of components may be mixed and used as necessary.
  • the nitrogen source includes, for example, inorganic and organic ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium carbonate, ammonium phosphate and ammonium acetate, urea, peptone, meat extract, yeast extract and casey. And nitrogen-containing organic substances such as glycine hydrolysates, and amino acids such as glycine, glutamic acid, alanine and methionine.
  • each of these components may be used alone, or a plurality of components may be mixed and used as necessary.
  • examples of the metal minerals include sodium chloride sodium, ferrous sulfate, magnesium sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, and calcium carbonate.
  • each of these components may be used alone, or a plurality of components may be mixed and used as necessary.
  • the culture conditions for culturing the novel microorganism according to the present invention are not particularly limited, and the culture is carried out by adjusting the pH and temperature within the optimum range.
  • the optimum pH range is 3 to 8, preferably 4 to 8, and more preferably 5 to 7.
  • the optimum temperature range is 10 to 35 ° C, preferably 15 to 30 ° C, more preferably 20 to 30 ° C.
  • anaerobic culture, stationary culture, and culture using a fermenter culture can be carried out by resting cell reaction and immobilized cell reaction.
  • the concentration of sclareol added to the medium having such a composition is not particularly limited, but is preferably 0.1% to 50%. Sclareol may be added to the medium prior to culturing or may be added during the culturing (fed-batch culture). In addition, compositions other than sclareol, such as carbon sources, nitrogen sources, vitamins, minerals, surfactants and antifoaming agents, can be fed simultaneously.
  • the dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate can be recovered from the medium after culturing a new microorganism as described above.
  • Dodecahydro-3a, 6,6,9a-teto The method for recovering the lamethylnaphtho [2, l_b] furan intermediate from the medium is not particularly limited as long as it is performed according to a known method.
  • dodecahydro_3a, 6,6,9a-tetra can be obtained by separating and removing cells from the medium and then combining centrifugation, ultrafiltration, ion exchange, reverse osmosis membrane, electrodialysis, salting out, crystallization, etc.
  • Methylnaphtho [2, 1-b] furan intermediate can be isolated and purified.
  • Decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8 a-tetramethylnaphthalene ethanol uses acidic catalysts such as P-toluenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid chloride, catalytic amounts of sulfuric acid and acidic ion exchangers Thus, it is converted to dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan by dehydration cyclization in various solvents.
  • acidic catalysts such as P-toluenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid chloride, catalytic amounts of sulfuric acid and acidic ion exchangers
  • GC gas chromatography
  • FID Fluorescence Detector
  • the inlet temperature is 250 ° C
  • the injection method is split mode (split ratio 100: 1)
  • the total flow is 200 ml / min
  • the column flow rate is The column was 0.4 ml / min
  • DB-WAX ⁇ 0.1 mm ⁇ 10 m
  • the oven temperature was 250 ° C.
  • the cyclic ether form of dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, lb] furan intermediate has a peak around 0.8 minutes
  • sclareolide has a peak around 2.4 minutes. Sclareol peaked around 2.7 minutes
  • decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethylnaphthaleneethanol peaked around 3 minutes.
  • KSM-JL2842 the bacteriological properties of KSM-JL2842 were identified as follows. Wet and light red colonies were observed on the YM agar (Becton Dickinson) plate medium, and the periphery of the colonies was slightly smooth. As a result of observing the microscopic features, formation of ovarian to oval and cylindrical vegetative cells was observed, and vegetative cells were observed to proliferate upon budding. As a result of the biochemical property test, the results shown in Table 2 were obtained. In Table 2, + indicates positive reaction,-indicates negative reaction, and w indicates weak positive reaction. The KSM-JL2842 grew at 25 ° C and did not grow above 30 ° C.
  • the mycological properties of KSM-J3571 were identified as follows. YM Agar (Becton Dickinson) flat Wet, pale red to yellow-red colonies were observed on the plate medium, and the periphery of the colonies was smooth. As a result of observing microscopic features, formation of vegetative cells having an oval to elliptical shape and a spindle shape was observed, and the vegetative cells were observed to proliferate upon budding. As a result of the biochemical property test, the results shown in Table 2 were obtained. The KSM-J3571 grew at 25 ° C, showed weak growth at 30 ° C, and did not grow above 35 ° C.
  • KSM-JL4651 The bacteriological properties of KSM-JL4651 were identified as follows. Wet and light red colonies were observed on YM agar (Becton Dickinson) plate medium, and the periphery of the colonies was slightly smooth. As a result of observing the microscopic features, formation of vegetative cells in the shape of an egg, an ellipse, and a cylinder was observed, and the vegetative cells were observed to proliferate upon budding. As a result of the biochemical property test, the results shown in Table 2 were obtained. In addition, this KSM-JL4651 grew at 30 ° C and did not grow above 35 ° C.
  • the results of determining the base sequence of the 28S rDNA D1 / D2 region are shown in SEQ ID NOs: 1 to 3, respectively.
  • the results of determining the base sequence of 18S rDNA are shown in SEQ ID NOs: 4 to 6, respectively.
  • For homology search BLAST was used.
  • the base sequence of 28S rDNA D1 / D2 region obtained from KSM-JL2842 is the base sequence of Pseudourotium zonatum (AF096198), which is a kind of Ascomycota, and 94.9%, the base sequence of Crinula caliciiformis (A Y544680) And 94.6% homology.
  • the 18S rDNA base sequence is 98.8% of the base sequence of Bulgaria inquinans (AJ224362), a type of ascomycete, 99.8% of the base sequence of ascomycete sp.
  • KSM-JL2842 is a yeast that constitutes a completely new genus classified as an ascomycetous net, because it is difficult to estimate taxonomic groups below the net level. From the results of this Example, this bacterium could be identified as Ascomycete sp. KSM-JL2842.
  • KSM-J3571 strength The obtained 28S rDNA D1 / D2 region nucleotide sequence is Pseudourotium zonatum (AF096198), which is a kind of Ascomycota, 9 ⁇ 9%, Leuconeurospora pulche rrima (AF096193) nucleotide sequence 94.8% showed 94.6% homology with the base sequence of Crinula caliciiformis (AY544680).
  • the 18S rDNA nucleotide sequence showed 99.0% homology with the nucleotide sequence of ascomyc ete sp.
  • KSM-J3571 is a yeast that constitutes a completely new genus that is classified as an ascomycete net, because it is difficult to estimate taxa below the net level. From the results of this Example, this bacterium could be identified as Ascomycete sp. KSM-J3571.
  • the 28S rDNA D1 / D2 region nucleotide sequence obtained from KSM-JL4651 is the salt d sequence of Pseudourotium zonatum ( ⁇ 96198), a kind of Ascomycota, 94.%, Leuconeurospora pulch It showed 94.4% homology with the base sequence of errima (AF096193).
  • the 18S rDNA nucleotide sequence showed 98.8% homology with the nucleotide sequence of ascomycete sp. BBA71218 (AJ301960), a type of ascomycete, and 98.8% homology with the nucleotide sequence of Bulgaria inquinans (8) 224362).
  • KSM-JL4651 is a yeast that constitutes a completely new genus classified as an ascomycete net, because it is difficult to estimate taxonomic groups below the net level. From the results of this Example, this bacterium could be identified as Ascomycete sp. KSM-JL4651.
  • Ascomycete sp. KSM-JL2842 and KSM-J3571 are the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (IPOD: ⁇ 305-8566, 1-chome, 1-chome Tsukuba, Ibaraki, Japan 6) Ascomycete sp. KSM-JL4651 was deposited as FERM BP-1 0714 on July 13, 2006 as accession numbers FERM BP-10713 and FER M BP-10712 on January 12, 2006.
  • the culture solution was extracted and subjected to GC analysis by the method of Example 1 to determine the production amount of dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate. The results are shown in Table 3.
  • the unit of numerical values shown in Table 3 is "g / L”.

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Abstract

　スクラレオール（Sclareol）を基質としてドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を効率よく生成する。 　目的の特性を有する微生物を単離、同定すべく鋭意検討した結果、従来公知の微生物には分類されない、目的の特性を有する複数の新規微生物を単離、同定した。本発明に係る新規微生物は、子嚢菌網（Ascomycetes）に属し、スクラレオールを基質として、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を生成する能力を有する。当該能力を有する子嚢菌網（Ascomycetes）に属する微生物は新規な知見であり、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン及びその中間体の製造に有用な微生物となりうる。

Description

明 細 書
新規微生物、当該新規微生物を用いたドデカヒドロ- 3a，6，6，9a-テトラメチ ルナフト [2，l_b]フラン中間体の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、スクラレオール（Sclareol)を基質としてドデカヒドロ- 3a,6，6，9a_テトラメチ ルナフト [2，l-b]フラン中間体を生成する新規微生物に関し、さらに当該新規微生物 を用いたドデカヒドロ- 3a,6,6，9a-テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体の製造方法に 関する。
背景技術
[0002] ドデカヒドロ- 3a，6，6,9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フラン（アンブロキサン（商標）と呼 ばれる場合もある）は残香性の高い香料であり、主にクラリーセージ（Salvia sclarea) 力も抽出されたスクラレオール (Sclareol)から化学変換によって製造されてレ、る。スク ラレオールからドデカヒドロ _3a，6,6,9a -テトラメチルナフト [2，l-b]フランを生産するェ 程を図 1に示す。図 1に示すように、ドデカヒドロ- 3a,6,6，9a-テトラメチルナフト [2，l-b] フラン中間体としては、デカヒドロ- 2-ヒドロキシ -2,5，5，8a-テトラメチルナフタレンエタノ ール及びスクラレオリド（ドデカヒドロ- 3a,6，6，9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フラン- 2 (1H トオン; (Sclareolide) )が知られている。また、図 1には示さないが、ドデカヒドロ- 3a，6， 6,9a-テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体としては、環状エーテル体 (8 α， 13-ォキ シド -12， 13-デヒドロ- 15, 16-ジノルラブダン）が知られている。
[0003] 微生物によるスクラレオールからドデカヒドロ- 3a，6，6,9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フ ラン中間体の変換反応は、例えば特許文献 1〜4に記載されている。特許文献 1には Hyphozyma roseoniger ATCC20624によるデカヒドロ- 2_ヒドロキシ _2，5，5,8a-テトラメ チルナフタレンエタノールの生産が開示されている。また、特許文献 2には Cryptococ cus laurentii ATCC20920によるドデカヒドロ- 3a，6,6,9a-テトラメチルナフト [2，l_b]フラ ン中間体の生産が開示され、特許文献 3には Bensingtonia cilliata ATCC20919によ るドデカヒドロ _3a,6,6,9a -テトラメチルナフト [2，l_b]フラン中間体の生産が開示され、 特許文献 4には Cryptococcus albidus ATCC20918及び Cryptococcus albidus ATCC 20921によるドデカヒドロ _3a，6，6,9a-テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体の生産が 開示されている。
[0004] このように、スクラレオールを基質としてドデカヒドロ- 3a，6，6，9a-テトラメチルナフト [2, l_b]フラン中間体を生産する能力を有する微生物としては、特許文献:!〜 4に開示さ れたように担子菌網もしくは Hyphozy腿に属する微生物が知られてレ、るに過ぎなかつ た。
特許文献 1 :特許第 2547713号
特許文献 2 :特許第 2802588号
特許文献 3 :特許第 3002654号
特許文献 4：特許第 2063550号
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、スクラレオールを基質としてドデカヒ ドロ- 3a,6，6，9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フラン中間体を効率よく生成することができ る新規な微生物を提供することを目的とし、更に、当該微生物を用いたドデカヒドロ- 3 a，6，6,9a-テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体の製造方法を提供することを目的と する。
課題を解決するための手段
[0006] 上述した目的を達成するため、本発明者等は、栃木県芳賀郡及び栃木県宇都宫 市の土壌を分離源として目的の特性を有する微生物を単離、同定すべく鋭意検討し た結果、従来公知の微生物には分類されない、 目的の特性を有する複数の新規微 生物を 3株単離、同定することができた。本発明は、これら新規微生物が有するスクラ レオールを基質としてドデカヒドロ _3a，6,6,9a -テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体 の生成を行うことができるといった知見に基づいてなされたものである。
[0007] 本発明に係る新規微生物は、いずれも子嚢菌網 (Ascomycetes)に属し、スクラレオ 一ルを基質として、ドデカヒドロ- 3a,6，6，9a-テトラメチルナフト [2, l_b]フラン中間体を 生成する能力を有する。当該能力を有する子嚢菌網 (Ascomycetes)に属する微生物 は新規な知見であり、ドデカヒドロ- 3a,6,6，9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フラン及びそ の中間体の製造に有用な微生物となりうる。本発明者らが単離、同定した新規微生 物に関して 28S rRNAをコードする遺伝子（以下、 28S rDNAと称する）の塩基配列を 決定したところ、配列番号 1〜3に示す塩基配列であった。また、当該新規微生物に 関して 18S rRNAをコードする遺伝子（以下、 18S rDNAと称する）の塩基配列を決定し たところ、配列番号 4〜6に示す塩基配列であった。さらに、当該新規微生物は表 1 に示す菌学的性質を示した。
[表 1]
KSM-JL2842 KSM-J3571 KSM-JL4651
D-Glucose + + +
D-Ga lactose + + +
L-Sorbose + + W
D-Ribose W W
D-Xylose + + +
L- Arab inose + + +
D-Arabinose + W W
L-Rhamnose + + +
Sucrose + + +
Maltose + + + a, a-Trehalose + + +
Me αί-0-glucoside + + W
D-Cel lcfciose + + +
Sal icin 一 W W
Mef ibiose + + +
Lactose + + W
D-Raff inose + + +
Melezitose + + +
Inul in 一 W 一
Soluble starch W + +
Glycerol + + W meso-Erythritol + + W
Ribitol W 一 W
D-Sorbitol + +
D-Mannitoi + + W
D-Galactitol 一 ― 一 myo-lnositol + W W
Glucono-1, 5- lactone W W 一
Ca 2-keto-gluconic acid ― ― W
Ca 5-keto-gluconic acid ― ― W
DL-Lactate + + W
Succinate + + +
Citrate 一 W W
Methanol 一 ― ―
KSM-JL2842 KSM-J3571 KSM-JL4651
D-Glucose 一 一 ―
識原資化愜镟 KSM-JL2842 KSM-J3571 KS -JL4651
Potass iun nitrate + + + [0008] 本発明者は、配列番号:!〜 3に示す 28S rDNAの塩基配列、配列番号 4〜6に示す 18S rDNAの塩基配列及び表 1に示す菌学的性質に基づいて新規微生物の同定を 行ったところ、当該新規微生物は子嚢菌網 (Ascomycetes)に属する以外は同定不能 であった。すなわち、新規微生物は、子嚢菌網 (Ascomycetes)に属する既知の属及 び種には分類されず、新属を構成すると結論付けられた。なお、菌学的性質を用い た分類は、 Barnett, J. A., Payne, R. W.， and Yarrow, D. (2000) Yeasts： Characteris rd
tics and identification, 3 edition. Cambridge University Press, Cambridge, UK. Ku rtzman, C. P. and Fell, J. W. (1998) The Yeasts, a taxonomic study, 4th edition. Els evier, Amsterdam, Netherlands.に従った。
[0009] なお、新規微生物は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ 一 (IPOD： τ 305-8566日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に 2006年 1 月 12日付けで受託番号 FERM BP-10713及び FERM BP_10712、 2006年 7月 13日付 けで受託番号 FERM BP-10714として寄託した。
[0010] すなわち、本発明に係る微生物は、子嚢菌網 (Ascomycetes)に属し、スクラレオー ルを基質としてドデカヒドロ- 3a,6,6，9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フラン合成過程にお ける中間体を生成する能力を有する微生物である。また、本発明に係る微生物は、 配列番号 1〜3に示す塩基配列に対して 95%以上の相同性を有する塩基配列からな る 28S rDNAを有する、又は配列番号 4〜6に示す塩基配列に対して 95%以上の相同 性を有する塩基配列からなる 18S rDNAを有することが望ましい。さらに、本発明に係 る微生物は、表 1に記載された菌学的性質を有することが望ましい。さらにまた、本発 明に係る微生物は、受託番号 FERM BP-10713, FERM BP-10712もしくは FERM BP- 10714で特定される子嚢菌網酵母、当該子嚢菌網酵母の属する属、好ましくは種、よ り好ましくは株に属する微生物であることが望ましレ、。
[0011] 本発明において上記中間体としては、デカヒドロ- 2-ヒドロキシ- 2,5，5，8a-テトラメチ ルナフタレンエタノール及び/又はスクラレオリド（ドデカヒドロ _3a，6, 6, 9a -テトラメチル ナフト [2，1- b]フラン- 2 (1H) -オン）を挙げることができる。
[0012] 一方、本発明は、本発明に係る新規微生物を使用したドデカヒドロ- 3a,6，6，9a-テト ラメチルナフト [2, 1-b]フラン中間体の製造方法を提供することができる。すなわち、本 発明に係るドデカヒドロ- 3a,6，6，9a-テトラメチルナフト [2, l_b]フラン中間体の製造方法 は、スクラレオールを含有する培地で上記新規微生物を培養し、スクラレオールを基 質としてドデカヒドロ- 3a，6，6，9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フラン合成過程における中 間体を生成するものである。
発明の効果
[0013] 本発明によれば、子嚢菌網（Ascomycetes)に属し、スクラレオールを基質としてドデ カヒドロ- 3a,6,6,9a-テトラメチルナフト [2，l-b]フラン合成過程における中間体を生成 する能力を有する新規微生物を提供することができる。この中間体からは、香料等の 原料となるドデカヒドロ- 3a,6,6，9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フランを製造することがで きる。したがって、本発明に係る新規微生物を使用することによって、ドデカヒドロ- 3a, 6,6,9a -テトラメチルナフト [2，l-b]フランを低コストに製造することができる。
[0014] また、本発明によれば、香料等の原料となるドデカヒドロ _3a，6，6,9a-テトラメチルナ フト [2, 1-b]フランの原料となるドデカヒドロ- 3a,6,6，9a-テトラメチルナフト [2, l_b]フラン 中間体の製造方法を提供することができる。本発明に係るドデカヒドロ _3a，6,6,9a -テ トラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体の製造方法によれば、ドデカヒドロ _3a，6，6,9a -テ トラメチルナフト [2，l-b]フランを低コストで製造することが可能となる。
[0015] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2006-048550号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0016] [図 1]スクラレオールからドデカヒドロ- 3a,6，6，9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フランを生 産する工程を示す図である。
発明を実施するため最良の形態
[0017] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0018] 新規微生物
本発明に係る新規微生物は、子嚢菌網 (Ascomycetes)に属し、スクラレオールを基 質としてドデカヒドロ- 3a，6，6，9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フラン合成過程における中 間体（ドデカヒドロ- 3a,6，6，9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フラン中間体）を生成する微生 物である。ここで、ドデカヒドロ- 3a，6,6,9a-テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体とは 、デカヒドロ- 2-ヒドロキシ- 2, 5，5，8a-テトラメチルナフタレンエタノール及びスクラレオリ ド（ドデカヒドロ _3a，6，6,9a -テトラメチルナフト [2，ト b]フラン- 2 (1H) -オン）を意味する。
[0019] 本発明に係る新規微生物は、ドデカヒドロ- 3a,6,6，9a-テトラメチルナフト [2, l_b]フラ ン中間体の生成能を指標として、土壌から単離することができる。ドデカヒドロ _3a，6,6, 9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フラン中間体の生成能は、供試微生物をスクラレオール 含有培地にて培養し、培地中に含まれるドデカヒドロ- 3a,6，6，9a-テトラメチルナフト [2, l_b]フラン中間体を検出することで評価することができる。培地中に含まれるドデカヒ ドロ- 3a,6，6，9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フラン中間体は、供試微生物を除去した後 の培地から有機溶媒を用いてドデカヒドロ- 3a，6,6,9a-テトラメチルナフト [2，l-b]フラン 中間体を抽出した後、例えばガスクロマトグラフィー (GC)等によって検出することが できる。
[0020] なお、ドデカヒドロ- 3a，6,6,9a-テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体の検出には、 G Cに限らず、例えば、気液クロマトグラフィ (GLC)、薄層クロマトグラフィ (TLC)、高圧液 体クロマトグラフィ (HPLC)、赤外スペクトル (IR)及び核磁気共鳴 (NMR)のような従来公 知の分析方法を使用することができる。
[0021] 本発明者は、このような手法によって栃木県芳賀郡及び栃木県宇都宮巿の土壌か ら子嚢菌網 (Ascomycetes)に属する新規微生物を単離している。単離した新規微生 物は、スクラレオールを含有する培地で培養することによって、培地中にドデカヒドロ- 3a，6，6,9a -テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体を生成する能力を有している。本発 明者は、この新規微生物を Ascomycete sp. KSM- JL2842、 Ascomycete sp. KSM-J35 71及び Ascomycete sp. KSM-JL4651と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (IPOD： τ 305-8566日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)にそれぞれ受託番号 FERM BP-10713, FERM BP-10712及び FERM BP- 10714として寄託している。
[0022] 本発明に係る新規微生物は、当該受託番号 FERM BP_10713、 FERM BP-10712も しくは FERM BP-10714で特定される子嚢菌網（Ascomycetes)に属する酵母及び、当 該酵母と同一の属に分類され、好ましくは当該酵母と同一の種に分類され、より好ま しくは当該酵母と同一の株に分類され且つドデカヒドロ- 3a，6，6,9a-テトラメチルナフト[ 2,l_b]フラン中間体を生成する能力を有する微生物を含むこととなる。
[0023] また、受託番号 FERM BP_10713、 FERM BP-10712及び FERM BP-10714で特定さ れる子嚢菌酵母は、それぞれ配列番号 1、 2及び 3に示す塩基配列を含む 28S rDNA を有している。したがって、本発明に係る新規微生物は、配列番号:!〜 3のいずれか 1に示す塩基配列に対して 95%以上、好ましくは 98%以上、より好ましくは 99%以上の相 同性を有する塩基配列を含む 28S rDNAを有する子嚢菌酵母であって、ドデカヒドロ- 3a，6，6,9a -テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体の生成能を有する微生物を含むこと となる。
[0024] さらに、受託番号 FERM BP_10713、 FERM BP-10712及び FERM BP-10714で特定 される子嚢菌酵母は、それぞれ配列番号 4、 5及び 6に示す塩基配列を含む 18S rDN Aを有している。したがって、本発明に係る新規微生物は、配列番号 4〜6のいずれ 力 1に示す塩基配列に対して 95%以上、好ましくは 98%以上、より好ましくは 99%以上の 相同性を有する塩基配列を含む 18S rDNAを有する子嚢菌酵母であって、ドデカヒド 口- 3a,6,6,9a-テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体の生成能を有する微生物を含む こととなる。
[0025] 新規微生物によるドデカヒドロ- 3a.6.6,9a-テトラメチルナフト「2. blフラン中間体の製 造
上述した本発明に係る新規微生物を使用して、ドデカヒドロ _3a，6，6,9a-テトラメチル ナフト [2， l_b]フラン中間体を製造することができる。製造されたドデカヒドロ _3a，6，6,9a -テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体は、付加価値の高い、残香性の高い香料で あるドデカヒドロ _3a,6,6，9a -テトラメチルナフト [2，l_b]フランを製造する際の原料として 使用すること力 Sできる。
[0026] 本発明に係る新規微生物を使用してドデカヒドロ- 3a,6，6，9a-テトラメチルナフト [2,1- b]フラン中間体を製造する際には、先ず、本発明に係る新規微生物を、スクラレオー ルを含有する培地で培養する。培地としては、子嚢菌網に属する微生物が生育可能 である培地であれば如何なる組成の培地をも使用することができる。使用可能な培 地は、炭素源、窒素源、金属ミネラル類及びビタミン類等を含有する固体培地及び 液体培地等を挙げることができる。なお、本発明に係る新規微生物を培養するため の培地には、培養条件等に応じて界面活性剤や消泡剤を添加してもよい。
[0027] 培地に添加される炭素源としては、単糖、二糖、オリゴ糖及び多糖が挙げられ、こ れら 2種以上を混合して用いても良い。ここで糖質以外の炭素源としては、例えば酢 酸塩等の有機酸塩が挙げられる。ここで、炭素源としては、これら各成分を単独で使 用しても良いし、必要に応じ複数成分を混合して使用しても良い。
[0028] また、窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、 硝酸アンモニゥム、炭酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥム及び酢酸アンモニゥム等の 無機並びに有機アンモニゥム塩、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス及びカゼィ ン加水分解物等の窒素含有有機物、グリシン、グルタミン酸、ァラニン及びメチォニン 等のアミノ酸等が挙げられる。ここで、窒素源としては、これら各成分を単独で使用し ても良いし、必要に応じ複数成分を混合して使用しても良レ、。
[0029] さらに、金属ミネラル類としては、例えば塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシ ゥム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛及び炭酸カルシウム等が挙げられる。ここで、金属ミネ ラル類としては、これら各成分を単独で使用しても良いし、必要に応じ複数成分を混 合して使用しても良い。
[0030] 本発明に係る新規微生物を培養する際の培養条件としては、特に限定されず、至 適範囲の pH及び温度に調整して行われる。具体的に pHの至適範囲は、 3〜8、好ま しくは 4〜8、より好ましくは 5〜7である。また、温度の至適範囲は、 10〜35°C、好ま しくは 15〜30°C、より好ましくは 20〜30°Cである。培養は、振とう培養、嫌気培養、 静置培養、醱酵槽による培養の他、休止菌体反応及び固定化菌体反応も用いること ができる。
[0031] このような組成の培地に添加するスクラレオール濃度は、特に限定されないが、 0.1 %〜50%とすることが好ましい。スクラレオールは、培養に先立って培地に添加しても 良いし、培養途中で添加（流加培養）してもよい。また、スクラレオール以外の組成、 例えば炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラル、界面活性剤、消泡剤も同時に流加するこ とが可能である。
[0032] ドデカヒドロ- 3a，6，6,9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フラン中間体は、上述したように新 規微生物を培養した後、培地から回収することができる。ドデカヒドロ- 3a,6，6，9a-テト ラメチルナフト [2, l_b]フラン中間体を培地から回収する方法は、公知の方法に従って 行えば良ぐ特に限定されない。例えば、培地から菌体を分離除去した後、遠心分離 、限外ろ過、イオン交換、逆浸透膜、電気透析、塩析、晶析等を組み合わせることに よりドデカヒドロ _3a，6，6,9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フラン中間体を単離 ·精製するこ とがでさる。
[0033] 製造されたドデカヒドロ _3a，6，6,9a -テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体を用いて ドデカヒドロ- 3a,6，6，9a-テトラメチルナフト [2, l_b]フランを製造する方法としては、特に 限定されず、従来公知の方法を適宜使用することができる。具体的には、スクラレオリ ドは、例えば水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、又は水素化ホウ 素カリウム/塩化リチウム混合物で還元することによって、デカヒドロ- 2-ヒドロキシ -2， 5, 5, 8a_テトラメチルナフタレンエタノールに変換する。デカヒドロ- 2-ヒドロキシ -2, 5, 5,8 a-テトラメチルナフタレンエタノールは、酸性触媒、例えば、 P-トルエンスルホン酸、 p -トルエンスルホン酸クロリド、触媒量の硫酸及び酸性イオン交換体を用いて、種々の 溶媒中で脱水環化によりドデカヒドロ- 3a,6,6，9a-テトラメチルナフト [2，l-b]フランに変 換される。
実施例
[0034] 以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以 下の実施例に限定されるものではない。
[0035] 〔実施例 1〕新規微生物の単離
以下のようにして、栃木県芳賀郡及び栃木県宇都宮巿の土壌より新規微生物の単 離を行った。
[0036] 先ず、 0.2%酵母エキス、 0.2%硝酸アンモニゥム、 0.1%リン酸 1カリウム、 0.05%硫酸 マグネシウム · 7水和物、 2.0%寒天、 1.0%スクラレオール（別滅菌）及び 0.5%ツイーン 80 (別滅菌）からなる寒天培地上に土壌懸濁液を 100 μ Γ塗布した。 25°Cにて？〜 14日 間培養し、生育したコロニーを 0.2%酵母エキス、 0.2%硝酸アンモニゥム、 0.1%リン酸 1カリウム及び 0.05%硫酸マグネシウム · 7水和物を含有する液体培地に接種し、 25°C で 1日間培養し種菌とした。次に、 0.2%酵母エキス、 0.2%硝酸アンモニゥム、 0.1%リン 酸 1カリウム、 0.05%硫酸マグネシウム · 7水和物、 1.0%スクラレオール（別滅菌）及び 0 .5%ツイーン 80 (別滅菌）を含有する培地に種菌を 1%植菌し、 25°Cにて 1週間培養し た。
[0037] 培養終了後、培養液 0.1mlを使用し、酢酸ェチル 0.6mlにて目的物質を抽出し、適 宜希釈してガスクロマトグラフィー（GC)分析を行った。 GC分析装置は Agilent techno logies 6890Nで行い、分析条件は以下のとおりである。検出器としては FID (Flame Ion ization Detector)を使用し、注入口温度を 250°Cとし、注入法をスプリットモード（スプ リット比 100 : 1)とし、トータルフローを 200ml/分とし、カラム流速を 0.4ml/分とし、カラム としては J&W社製の DB-WAX ( φ 0. lmm X 10m)を使用し、オーブン温度を 250°Cとし た。本条件により、ドデカヒドロ- 3a，6,6,9a-テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体であ る環状エーテル体は 0.8分付近にピークが現れ、スクラレオリドは 2.4分付近にピーク が現れ、スクラレオールは 2.7分付近にピークが表れ、デカヒドロ- 2-ヒドロキシ -2,5,5, 8a-テトラメチルナフタレンエタノールは 3分付近にピークが現れた。
[0038] 本条件で 6950個の種菌についてドデカヒドロ- 3a,6，6，9a-テトラメチルナフト [2, 1-b] フラン中間体の生成能を評価したところ、主としてデカヒドロ 2-ヒドロキシ -2,5，5，8a-テ トラメチルナフタレンエタノールを生成することができる新規微生物を単離することが できた。単離した新規微生物を KSM-JL2842、 KSM-J3571及び KSM-JL4651と命名し た。
[0039] 〔実施例 2〕新規微生物の分類
実施例 1で単離した KSM-JL2842、 KSM-J3571及び KSM-JL4651の菌学的性質を 特定するとともに rDNAを解析することで、これらの菌株の分類を試みた。
[0040] 先ず、 KSM-JL2842の菌学的性質を以下のように特定した。 YM寒天（Becton Dicki nson)平板培地上において湿性で淡赤色のコロニーが観察され、コロニーの周辺部 はやや平滑状を示した。微視的特徴を観察した結果、卵形〜楕円形、円筒形の栄 養細胞の形成が認められ、栄養細胞は出芽によって増殖する様子が観察された。生 化学的性状試験を行った結果、表 2に示す結果が得られた。なお、表 2において、 + は反応が陽性、—は反応が陰性、 wは弱い陽性反応が認められたことを示す。また、 本 KSM-JL2842は 25°Cで生育し、 30°C以上では生育しなかった。
[0041] KSM-J3571の菌学的性質を以下のように特定した。 YM寒天（Becton Dickinson)平 板培地上において湿性で淡赤色〜黄赤色のコロニーが観察され、コロニーの周辺 部は平滑状を示した。微視的特徴を観察した結果、卵形〜楕円形、紡錘形の栄養 細胞の形成が認められ、栄養細胞は出芽によって増殖する様子が観察された。生化 学的性状試験を行った結果、表 2に示す結果が得られた。また、本 KSM-J3571は 25 °Cで生育し、 30°Cで弱い生育が認められ、 35°C以上では生育しなかった。
KSM-JL4651の菌学的性質を以下のように特定した。 YM寒天（Becton Dickinson) 平板培地上において湿性で淡赤色のコロニーが観察され、コロニーの周辺部はやや 平滑状を示した。微視的特徴を観察した結果、卵形〜楕円形、円筒形の栄養細胞 の形成が認められ、栄養細胞は出芽によって増殖する様子が観察された。生化学的 性状試験を行った結果、表 2に示す結果が得られた。また、本 KSM-JL4651は 30°Cで 生育し、 35°C以上では生育しな力つた。
[表 2]
Figure imgf000014_0001
KSM-JL2842 KSIVW3571 KS -0L4651
D-Qlucose 一 ― ―
KS - L2842 KSN 3571 KSNNL4651
Potass iim nitrate + + + [0043] 次に、 KSM_JL2842、 KSM-J3571及び KSM-JL4651の rDNAを以下のように解析した 。すなわち、 O ' Donnell等の方法（O ' Donnell, K. 1993. Fusarium and its near relativ es. In Reynolds, D. R. and Taylor, J. W. (Eds) The Fungal Holomorph: Mitotic, Mei otic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics, CAB International, Wallingf ord )により、 28S rDNA D1/D2領域及び 18S rDNAの解析を行レ、、帰属分類群を推 定した。 28S rDNA D1/D2領域の塩基配列を決定した結果をそれぞれ配列番号 1〜 3に示す。また、 18S rDNAの塩基配列を決定した結果をそれぞれ配列番号 4〜6に 示す。なお相同検索は BLASTを用いた。
[0044] KSM-JL2842から得られた 28S rDNA D1/D2領域塩基配列は子嚢菌類の一種であ る Pseudourotium zonatum (AF096198)の塩基配列と 94·9%、 Crinula caliciiformis (A Y544680)の塩基配列と 94.6%の相同性を示した。また、 18S rDNA塩基配列は子嚢菌 の一種である Bulgaria inquinans (AJ224362)の塩基配列と 98.8%、 ascomycete sp. BB A71218 (AJ301960)の塩基配列と 98·9%、 Cryptosporiopsis radicicola (DQ002903)の 塩基配列と 98.9%などのように高い相同性を示した。しかしながら、 KSM-JL2842は、 網レベル以下の分類群の推定は困難であり、子嚢菌網に分類される全く新規な属を 構成する酵母であると結論付けられた。本実施例の結果から、本菌を Ascomycete sp . KSM-JL2842として同定することができた。
[0045] KSM-J3571力 得られた 28S rDNA D1/D2領域塩基配列は子嚢菌類の一種である Pseudourotium zonatum (AF096198)の塩≤gti列と 94.9%、 Leuconeurospora pulche rrima (AF096193)の塩基配列と 94.8%、 Crinula caliciiformis (AY544680)の塩基配列 と 94.6%の相同性を示した。また、 18S rDNA塩基配列は子嚢菌の一種である ascomyc ete sp. BBA71218 (AJ301960)の塩基配列と 99.0%、 Bulgaria inquinans (AJ224362) の塩基配列と 98.8%の相同性を示した。しかしながら、 KSM-J3571は、網レベル以下 の分類群の推定は困難であり、子嚢菌網に分類される全く新規な属を構成する酵母 であると結論付けられた。本実施例の結果から、本菌を Ascomycete sp. KSM-J3571 として同定することができた。
[0046] KSM-JL4651から得られた 28S rDNA D1/D2領域塩基配列は子嚢菌類の一種であ る Pseudourotium zonatum (ΛΡΌ96198)の塩 目 d列と 94.り%、 Leuconeurospora pulch errima (AF096193)の塩基配列と 94.4%の相同性を示した。また、 18S rDNA塩基配 列は子嚢菌の一種である ascomycete sp. BBA71218 (AJ301960)の塩基配列と 99.0% 、 Bulgaria inquinans (八】224362)の塩基配列と98.8%の相同性を示した。しかしながら 、 KSM-JL4651は、網レベル以下の分類群の推定は困難であり、子嚢菌網に分類さ れる全く新規な属を構成する酵母であると結論付けられた。本実施例の結果から、本 菌を Ascomycete sp. KSM-JL4651として同定することができた。
[0047] なお、 Ascomycete sp. KSM-JL2842及び KSM-J3571は、独立行政法人産業技術 総合研究所 特許生物寄託センター (IPOD： τ 305-8566日本国茨城県つくば巿東 1 丁目 1番地 1中央第 6)に 2006年 1月 12日付けで受託番号 FERM BP-10713及び FER M BP-10712として、 Ascomycete sp. KSM-JL4651は、 2006年 7月 13日に FERM BP- 1 0714として寄託した。
[0048] 〔実施例 3〕ドデカヒドロ- 3a,6，6，9a-テトラメチルナフト [2, 1-b]フラン中間体の生産性検 討
本実施例では、 Ascomycete sp. KSM-JL2842のドデカヒドロ- 3a,6,6,9a_テトラメチル ナフト [2， 1-b]フラン中間体の生産性を検討した。先ず、 Ascomycete sp. KSM-JL2842 を 2.1% YM broth (Becton Dickinson)に 1白金耳植菌し、 25°Cにて 2日間振とう培養 したものを種菌とした。次に、 2.1% YM broth, 0.1%硫酸マグネシウム · 7水和物、 1%ッ ィーン 80及び 2%スクラレオールからなる培地へ種菌を 2%植菌し、 25°Cにて振とう培養 を行った。培養液は実施例 1の手法にて抽出及び GC分析を行い、ドデカヒドロ- 3a，6, 6,9a-テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体の生産量を求めた。結果を表 3に示す。 なお、表 3に示した数値の単位は" g/L"である
[表 3]
4曰 7曰 1 0曰
スクラレオリ ド 0. 3 0. 4 0. 2
デカヒ ドロ- 2-ヒ ドロキシ- 2， 5， 5， 8a- テトラメチルナフタレンエタノール 12. 0 15. 7 14. 5
環状エーテル 0. 5 0. 4 0. 8 [0049] 表 3に示した結果より、 Ascomycete sp. KSM- JL2842は、ドデカヒドロ- 3a，6，6,9a_テト ラメチルナフト [2,l_b]フラン中間体のうち主としてデカヒドロ- 2-ヒドロキシ- 2,5,5,8a-テ トラメチルナフタレンエタノールを生成できることが明らかとなった。
[0050] 〔実施例 4〕ドデカヒドロ- 3a,6，6，9a-テトラメチルナフト [2,l_b]フラン中間体の生産性検 討
本実施例では、 Ascomycete sp. KSM_JL2842、 KSM- J3571及び KSM-JL4651のド デカヒドロ- 3a,6,6,9a -テトラメチルナフト [2,l_b]フラン中間体の生産性を検討した。先 ず、これらの菌株を 0.2% Yeast extract (Becton Dickinson)、 0.2%硝酸アンモニゥム 、 0.1%リン酸 1カリウム、 0.05%硫酸マグネシウム · 7水和物、 1.0%グルコースに 1白金 耳植菌し、 25°Cにて 2日間振とう培養したものを種菌とした。次に、 0.2% Yeast extrac t (Becton Dickinson)、 0.2%硝酸アンモニゥム、 0.1%リン酸 1カリウム、 0.05%硫酸マ グネシゥム · 7水和物、 1.0%グルコース、 0.5%ツイーン 80及び 1.0%スクラレオールから なる培地へ種菌を 1%植菌し、 25°Cにて 6日間振とう培養を行った。培養液は実施例 1 の手法にて抽出及び GC分析を行い、ドデカヒドロ- 3a,6，6，9a-テトラメチルナフト l]フラン中間体の生産量を求めた。結果を表 4に示す。なお、表 4に示した数値の単 位は" gん"である。
[表 4]
Figure imgf000017_0001
[0051] 表 4に示した結果より、 Ascomycete sp. KSM- JL2842、 KSM- J3571及び KSM- JL465 1はドデカヒドロ _3a，6,6,9a -テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体を生産することが明 らかとなつた。
[0052] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] 子嚢菌網（Ascomycetes)に属し、スクラレオーノレ（Sclareol)を基質として、ドデカヒド 口- 3a,6,6,9a-テトラメチルナフト [2，l-b]フラン合成過程における中間体を生成する能 力を有する微生物。
[2] 配列番号 1〜3のいずれかに示す塩基配列に対して 95%以上の相同性を有する塩 基配列からなる 28S rDNAを有する、又は配列番号 4〜6のいずれかに示す塩基配列 に対して 95%以上の相同性を有する塩基配列からなる 18S rDNAを有することを特徴 とする請求項 1記載の微生物。
[3] 以下の表 1のいずれかに記載された菌学的性質を有することを特徴とする請求項 1 又は 2記載の微生物。
[表 1]
Figure imgf000019_0001
m . KSW-JL2842 K3KJ3571 KSM-JL4651
D-Glucose 一 ― 一
S¾?黷化 tt¾ KSM-JL2842 KSM-J3571 KS -JL4651
Potassium nitrate + + + 受託番号 FERM BP_10713、 FERM BP-10712もしくはFERM BP-10714で特定され る子嚢菌網酵母であることを特徴とする請求項 1乃至 3いずれか一項記載の微生物。 受託番号 FERM BP_10713、 FERM BP- 10712もしくは FERM BP-10714で特定され る子嚢菌網酵母と同一の属に属する微生物であることを特徴とする請求項 1乃至 3い ずれか一項記載の微生物。
受託番号 FERM BP_10713、 FERM BP- 10712もしくは FERM BP-10714で特定され る子嚢菌網酵母と同一の種に属する微生物であることを特徴とする請求項 1乃至 3い ずれか一項記載の微生物。
上記中間体として、デカヒドロ- 2-ヒドロキシ -2，5，5,8a-テトラメチルナフタレンエタノ ール及び/又はスクラレオリド（ドデカヒドロ- 3a，6,6,9a-テトラメチルナフト [2，l-b]フラン -2 (1H) _オン；（Sclareolide) )を生成する能力を有する請求項 1乃至 6いずれか一項 記載の微生物。
スクラレオール（Sclareol)を含有する培地で請求項 1乃至 7いずれか一項記載の微 生物を培養し、スクラレオールを基質としてドデカヒドロ- 3a,6,6，9a-テトラメチルナフト[ 2,1-b]フラン合成過程における中間体を生成する、ドデカヒドロ- 3a,6,6,9a-テトラメチ ルナフト [2， 1-b]フラン中間体の製造方法。
上記中間体として、デカヒドロ- 2-ヒドロキシ -2，5，5,8a-テトラメチルナフタレンエタノ ール及び/又はスクラレオリド（ドデカヒドロ _3a，6,6,9a -テトラメチルナフト [2，l-b]フラン _2 (1H) -オン；（Sclareolide) )を回収する工程を有することを特徴とする請求項 8記載 のドデカヒドロ _3a，6,6,9a -テトラメチルナフト [2，l-b]フラン中間体の製造方法。
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