WO2008156214A1

WO2008156214A1 - フラボン及びデルフィニジンを含むバラ及びその生産方法

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Publication number: WO2008156214A1
Application number: PCT/JP2008/061603
Authority: WO
Inventors: Yoshikazu Tanaka; Yukihisa Katsumoto; Yuko Fukui; Masako Mizutani; Noriko Nakamura; Junichi Togami
Original assignee: International Flower Developments Pty Ltd
Current assignee: International Flower Developments Pty Ltd
Priority date: 2007-06-20
Filing date: 2008-06-19
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2009-12-20
Also published as: CN101688198A; RU2010101623A; BRPI0814715A2; US20100287668A1; TW200908873A; IL202820A0; ECSP099815A; CO6170373A2; JPWO2008156214A1; AU2008264442A1; CA2691156A1; KR20100029104A; EP2159282A4; EP2159282A1

Abstract

本発明は、遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィニジンを含むことを特徴とするバラを提供する。当該フラボン及びデルフィニジンは、典型的には、それぞれ、導入されたフラボン合成酵素遺伝子及びフラボノイド3', 5'−水酸化酵素遺伝子の発現によって生成される。前記フラボン合成酵素遺伝子は、例えば、ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子であり、具体例として、ゴマノハグサ科キンギョソウ由来のフラボン合成酵素遺伝子、及びゴマノハグサ科トレニア由来のフラボン合成酵素遺伝子である。また、フラボノイド3', 5'−水酸化酵素遺伝子は、例えば、パンジー(Viola xwittrockiana)由来のフラボノイド3', 5'−水酸化酵素遺伝子である。

Description

フラボン及びデルフィ二ジンを含むバラ及びその生産方法

技術分野

本発明は、フラボン（flavone)及びデルフィ二ジン（delphinidin) を人為的に含有させたバラ（a rose)に関する。本発明は、遺伝子操明

作によりフラボン及びデルフィ二ジンを含めることにより生ずるコピグメンテ一ション効果（co- pigm田entation effect)によりバラの花色を改変する方法、特に花色を青色方書向に変化させる方法にも関する。

背景技術

花は植物の生殖器官であり次の世代となる種子を生産するために必要である。種子を形成するためには花粉がめしべに付着し、受精することが必要である。通常花粉の運搬は、蜂や蝶などの昆虫や、ハチドリ、まれにはコゥモリにより行われる。花弁の役割は花粉を運ぶこれらの生物を魅了することにあり、植物はそのために、花の色や形、模様に工夫を凝らしている。

花の色は鑑賞の際にも花卉の最も重要な形質であることから、古くから様々な色の花が交配によって育種されてきた。しかしながら、ひとつの植物種の花があらゆる色をもつ場合は少なく、たとえば、交配により作製されたバラ（rose (Rosa hybrida))、力一ネーショ (carnat ion (Dianthus caryop yl lus) ) キク (chrysanthemum (Chr ysanthemum moriiolium))、ユリ（1 i ly (Li 1 ium SPP. ) )などには紫力ら青の品種がなく、ハナショウプ（Japanese garden iris (Iris ens ata thumb. ))やリンドウ（gent ian (Gent iana tr i flora) )には鮮やかな赤い品種はない。

花色のうち、淡い黄色から赤色、青色はフラポノイド（ilavonoid )及びアントシァニン（anthocyanin) (フラポノィドに属する有色配糖体）に由来することが多い。フラポノイドは植物の代表的な二次代謝物で、以下に示すように、 C6C3C6の基本骨格をもち、フエニルァラニンとマロ二ル CoAから合成される。 C環の酸化状態により、フラボン、フラポノール（flavonol)などに分類される。

卜リセチンフラポ /一フラポンフラポノイドは、紫外線を吸収したり、ラジカルを除去したりするので、もともとは植物体を様々なストレスから保護する機能を担つていたと考えられる。また健康によい成分としても近年注目されている（Harborne and Williams 2000 Phy tochemi s t ry 55, 481-504 参照）。

有色のアン卜シァニンには、数百分子種が知られているが、以下に示すように、その発色団であるアントシァニジン（anthocyanidin )には、（ 1 ) オレンジ色から赤色の花に多いペラルゴ二ジン（pela rgonidin)、（ 2) 赤色から紅色の花に多いシァニジン（cyan id in) 及びぺォニジン（_Peonidin)、並びに（ 3) 紫から青色の花に多いデルフィ二ジン（del ph in id in)、ペチュニジン（pe tun id in)及びマルビジン（malvidin)の 6種が一般的である。

ペラ Jレゴニジン

アントシァニンの構造はその色に大きな影響を与える。アントシァニンの B環の水酸基数が増えると青みが増す。従って、デルフィ二ジン型アントシァニンは、ペラルゴ二ジン型アントシァニン、シァニジン型アントシァニンに比べ青い。アントシァニンを含むフラポノイドの生合成は、植物種を超えてよく保存されている。フラポノイドは細胞質で生合成され、糖やァシル基が付加した後に、液胞へと輸送され蓄積される（Tanaka et al. 005 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80, 卜 24、及び Tanaka and Brugl iera 2006 A inswor th 編、 Flowering and its manipul at ion、 pp.201-239, Bla ckwel 1 Publ ishing Ltd.参照）。

生合成に関わる酵素の構造遺伝子はすべてクローニングされている。組換え植物を作製できれば、これらの遺伝子の発現を人為的に調整することにより花で蓄積するフラポノィドの構造と量を改変し、花色を変えることができる（Tanaka et al. 2005 Plant Cell, Ti ssue and Organ Culture 80, ト 24、及び Tanaka and Brugl iera 20 06 Ainswor th 編、 Flowering and its manipulat ion pp.201-239, Blackwell Publ ishing Ltd.参照）。たとえば、花弁でデルフィ二ジンを生産できないカーネーションゃバラにおいて、デルフィニジンを合成するために必要なフラポノィド 3'， 5'—水酸化酵素（以下、「F3' 5'H」と略す。）遺伝子を発現させることにより、デルフィ二ジンを生産させ、自然にはない青い花を作製した例がある（Tanak a 2006 Phytochemistry Reviews 5, 283 - 291参照）。

このように植物の代謝を人為的に改変する方法は代謝工学と呼ばれることがある。代謝を改変し、目的の物質を蓄積させるためには、目的の物質を生産する酵素遺伝子を組換え植物において発現させればよいが、しばしば植物自身が持つ内在の酵素との競合により、目的の物質の蓄積がまったく、あるいはほとんど起こらず、産業上有用な形質を持つに至らないことも多い。

たとえば、ペチュニア（Petunia hybrida)はそのジヒドロフラポノール還元酵素（以下、「DFR」と略す。）の特異性のためにペラルゴンジンを蓄積できず、したがってオレンジ色の花色の品種は天然には存在しない。

バラなどの DFR遺伝子を導入することによりペラルゴ二ジンを蓄積させたオレンジ色のペチュニアが報告されているが、ペラルゴ二ジンを蓄積させるためには、 DFRと競合するフラボノィド 3'-水酸化酵素（以下、「Π'1ϋ と略す。）、 F3' 5'H、フラポノール合成酵素

(以下、「FLS」と略す。）の遺伝子が欠損しているペチュニア品種を用いる必要があり、これらが欠損していないペチュニアにバラの DFR遺伝子を導入しても表現型の変化は認められない（Tanaka an d Brugl iera 2006 Ains orth 編、 Flowering and its manipul at io n、 pp.201-239, Blackwell Publ ishing Ltd.参照）。したがって目的の遺伝子を単に導入するだけで目的の化合物が蓄積し表現型があらわれるかどうかは予想できない。

さらに、代謝工学においては予想外の結果が出ることも多い。たとえば、トレニァ（Torenia hybrida)においてフラボン合成酵素遺伝子の発現を抑制したところ、フラボン量が減少し、フラバノン（f lavanone)の蓄積が見られた。フラパノンが蓄積すればァントシァニン量は増加するはずであるが、実際にはアントシァニン量も減少した（Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263, 2002) 。このように代謝物の増減を予想することは困難で目的の表現型を得るためには鋭意工夫が必要である。

また、アントシァニンは結合する芳香族ァシル基の数が増えると分子内コピグメント作用により青くなる。 2つ以上の芳香族ァシル基をもつアントシアンはポリアシル化アントシァニンと呼ばれ、安定な青い色を呈する（Harborne and Williams 2000 phytochemistr y 55, 481 - 504参照）。

必須色素であるアントシァニン色素自体の構造によるほか、共存するフラポノイド（コピグメントともいう）や金属イオン、液胞の p Hなどによっても花の色は変化する。たとえば、フラボンゃフラポノ一ルは、代表的なコピグメン卜で、アントシァニンとサンドィツチ状に積み重なることにより、アン卜シァニンを青くし、濃く見えるようにする効果がある（Goto (1987) Prog. Chem. Org. Natl.

Prod. 52参照）。この点で、フラボンは無色の補助色素成分であるといえる。たとえばフラボンの一種であるイソビテキシン（isov i texin) はノ、ナショゥフ (Japanese gardeniris (Iris ensata Thunb . ))においてアントシァニンに対しコピグメント効果を発揮し、色を青くする。また、イソビテキシンはアントシァニンを安定化することによりハナショウブの花の色を安定化することも示されている

(Yabuya et al. Euphytica 2000 115, 卜 5参照）。また、フラポンはフラポノールよりも強いコピグメント効果を示すとが多い。たとえば遺伝子組換え力一ネーションの解析ではフラポンがフラボノールよりもコピグメン卜効果が強いことが示されてる (Fukui et al. Phytochemi s t ry, 63, 15-23, 2003参照）。したがって、フラボンの蓄積は花の色を青くするために重要であるしかしな力 sら、すべての植物がフラボンを生産できるわけではな

< 、バラやペチュニァなどはフラボンを蓄積しないことが知られている。また、フラボンは、花色以外に、紫外線の吸収、さまざまなス卜レス、他の微生物との相互作用などにも関与しており、フラポンを合成させるしとにより新しい形質を持った植物を得ることができることも知られている（フラボン合成酵素をコードする遺伝子に関する特許文献として、特開 2000-279182を参照のこと）。しかしながら、バラにおいてフラボンを発現させた例は未だ知られていないフラボンはフラボン合成酵素が触媒する反応によりフラバノンから合成される。すなわち、ァピゲニン（apigenin)はナリンゲニン（n aringenin)から、ルテオリン Uuteol in)はエリオジクチオール（er i odictyol)から、卜リセチン（trice t in)はペン夕ヒドロキシフラバノンから合成される。フラボン合成酵素には、フラボン合成酵素 I とフラボン合成酵素 IIの 2種類がある。両者は同じ反応を触媒するが、異なるタイプの酵素である。フラボン合成酵素 Iは 2-ォキソグル夕ル酸依存的なジォキシゲナ一ゼ（Britsch et al. (1981) Z. Na turforsch 36c PP. 742-750, 及び Britsch (1990) Arch. Biochem . Biophys.282 pp. 152- 160参照）の 1種であり、フラボン合成酵素 IIはチトクローム P450型のモノォキシゲナーゼである。フラボン合成酵素 IIの構造遺伝子は、トレニァ、キンギヨソゥ、シソ（Perilla frutescens)、ガ一ベラ（gerbera (Gerbera hybr ida) )、リンドウなどから得られている（Tanaka and Brugl iera 2006 Ainsworth 編、 F lowering and its mani ul at ion pp.201-239, Blackwel 1 Publish ing Ltd.参照）。

フラボン合成酵素遺伝子を、フラボンを生産しない遺伝子組換え植物において発現させると、フラボンが合成されることが予想される。しかしながら、ペチュニアにおいてトレ二ァのフラボン合成酵素遺伝子を発現させたところ、濃い青紫色の花の色が薄くなつたとの報告もある（Tsuda et al. Plant Biotechnology, 21, 377-386, 2004) ₀ また、リンドウ由来のフラボン合成酵素遺伝子をタバコで発現させたところ、フラボンが合成されたが、やはり花の色は薄くなったとの報告もある（Nakatsuka et al. 2006, Molecular Breed ing 17:91-99) 。このように、フラボンが合成されても必ずしも花色は青くならない。言い換えれば、コピグメント効果を示さない原因として、アントシァニンとフラボンの量や比が適切でないことや、アントシァニンとフラボンの糖やァシル基による修飾が適切ではないことなどが挙げられる。これらの結果から、単にフラボン合成酵素遺伝子を発現させフラボンを蓄積させるだけでは花の色をより青くすることはできないということが示唆される。

バラは最も人気のある花卉植物であり、紀元前から栽培されていた記録がある。また、数百年にわたり人為的な品種改良がされてきた。その結果、ペラルゴ二ジン、シァニジン、フラポノールといつたフラボノイドを含むバラが得られている。また、近年では遺伝子組換えの手法を用いて、自然のバラにはないデルフィ二ジンを生産するバラも作られている。しかしながら、フラボンを蓄積するバラは、交配によっても遺伝子組換えによっても未だ得られていない。発明の開示植物の品種改良に遺伝子組換えの手法を用いることの最大の利点は、交配による品種改良と異なり、交配することができない植物や他の生物の遺伝子を利用して植物を改良できることである。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いると他種の生物の任意の遺伝子を任意の植物、たとえばバラに導入し、その植物に新しい能力を付与することができるとされている。しかしながら、ノ Xラはァラビドプシス（Arabidops is ihal iana)やタノコ（tobacco (Nicot iana tabacum L - ))などのモデル植物とは異なり、導入した遺伝子が機能するかどうかはその遺伝子の起源や使用するプロモーターなどに大きく依存することが知られている。

W02005/017147によれば、フラボノィド 3', 5'一水酸化酵素遺伝子 (F3' 5'H)をバラに導入した場合、遺伝子組換えバラにおいて、ペチュニァやリンドウに由来する同遺伝子は発現せず、デルフィ二ジンも検出されなかったが、興味深いことにパンジー由来の同遺伝子は発現し、デルフィ二ジンを生産するという新しい能力をバラに付与することができた。この結果はバラにおいては、どの植物種由来の遺伝子を導入すれば機能するかは容易に類推できないことを示している。

また、キクにおいてはある遺伝子を導入することができてもその遺伝子がキクで機能するかどうかは予想することは困難であり、また組換えキクの加齢にしたがって導入した遺伝子が機能しなくなることが知られている。組換え植物において異種の遺伝子の転写によく使用されるカリフラワーモザイクウィルスの 3 5 Sプロモータ一は、リンドウにおいては機能しないことも報告されている（Mi shiba et al. Plant Journal 2005, 44: 54卜 556参照）。

フラボンをバラで合成させるためには、フラボン合成酵素遺伝子を発現させればよいことは容易に類推できるが、ジォキシゲナ一ゼ型又はチトクローム P450型のいずれのフラボン合成酵素を発現させればよいのか、どの植物起源のフラボン合成酵素遺伝子を発現させればよいのかなどについては、容易に類推することはできないので、試行錯誤が要求される。また、コピグメント効果は液胞中にアントシァニンとフラボンゃフラボノールが一定の濃度で共存すれば生じる現象であるが、発色源であるアン卜シァニンの配糖化等の修飾状態に対し、コピグメントとなるフラボンやフラポノールがより適合した配糖化等の修飾を受けていることが必要であることも明らかにされている（Nature. 2005 Aug 11； 436 (7052)： 791、及び Nature, 358, 515-518 (1992)参照）。

つまり、必要な色調発現のためには、アントシァニンとフラボン • フラポノールが、最適な構造上の組み合わせをとることが必要であり、また、どのように修飾されたアントシァニンとフラボン ' フラボノールを共存させればよいのかという点についても試行錯誤を要するであろう。さらに、フラボン合成酵素がバラで機能したとしても、天然のバラではナリンゲニンなどのフラバノンはフラバノン 3 -水酸化酵素（以下、「F3H」と略す。）により速やかに水酸化されるため、フラバノンからフラボンが合成されるとは限らない。

従って、本発明は、バラにおける目的とする色調発現のために適切な色素を含むバラを提供しょうとするものである。

上記の課題を解決するため、本発明者は、種々検討の結果、パラに人為的にフラボン及びデルフィ二ジンを含有せしめることにより目的とする色調発現が達成されることを見出し、本発明を完成した具体的には、本発明は以下の通りのものである：

1. 遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィ二ジンを含むことを特徴とするバラ（a rose)。 2. 前記フラボンが、導入されたフラボン合成酵素遺伝子の発現によって生成したものである、前記 1に記載のバラ。

3. 前記フラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子である、前記 2に記載のバラ。

4. 前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハクサ利-キンギヨソゥ (Scrophulariaceae, Antirrhinum ma jus) 由来のフラボン合成酵素遺伝子である、前記 3に記載のバラ。

5. 前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハグサ科トレニァ（Scrophulariaceae, Torenia hybrida)由来のフラボン合成酵素遺伝子である、前記 3に記載のバラ。

6. 前記ゴマノハグサ科キンギヨソゥ由来のフラボン合成酵素遺伝子が、

( 1 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、

( 2 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個のァミノ酸の付加、欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、

( 3 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は

( 4 ) 配列番号 1に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下で八イブリダィズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、

のいずれかをコ一ドする遺伝子である、前記 4に記載のバラ。

7. 前記ゴマノハグサ科トレニァ由来のフラボン合成酵素遺伝子が、

( 1 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 ( 2 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、

( 3 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は

( 4 ) 配列番号 3に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイプリダイズする核酸によりコ一ドされたフラボン合成酵素、

のいずれかをコードする遺伝子である、前記 4に記載のパラ。

8. 前記デルフィ二ジンが、導入されたパンジー（Viola X wittr ockiana)由来のフラボノィド 3'， 5'—水酸化酵素遺伝子の発現によつて生成したものである、前記 1〜 7のいずれかに記載のバラ。

9. 前記パンジー由来のフラポノイド 3'， 5'—水酸化酵素遺伝子が、

( 1 ) 配列番号 8に記載のアミノ酸配列を有するフラポノィド 3' ， 5'一水酸化酵素、

( 2 ) 配列番号 8に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラポノィド 3' , 5'—水酸化酵素、

( 3 ) 配列番号 8に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配列同一性を有するァミノ酸配列を有するフラボノィド 3'， 5'—水酸化酵素、又は

( 4 ) 配列番号 7に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイプリダイズする核酸によりコードされたフラボノィド 3'， 5'—水酸化酵素、

のいずれかをコードする遺伝子である、前記 8に記載のパラ。

1 0. フラボン合成酵素遺伝子及びフラポノイド 3', 5'—水酸化酵素遺伝子の導入前の宿主と比べて花色が変化している、前記 2〜 9のいずれかに記載のバラ。

1 1 . 前記花色の変化が、青に向けての変化である、前記 1 0に記載のバラ。

1 2. 前記花色の変化が、 L*a*b表色系色度図における色相角度

( Θ ) が胄方向軸である 2 7 0 ° に近づく変化である、前記 1 0又は 1 1 に記載のバラ。

1 3. 前記花色の変化が、花弁の反射スペクトルの極小値が長波長側にシフトする変化である、前記 1 0に記載のパラ。

1 4. 前記 1 〜 1 3のいずれかに記載のバラと同じ性質を有する、その部分、子孫、組織、栄養増殖体又は細胞。

1 5. 遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィ二ジンを含めることにより生ずるコピグメンテーシヨン効果によりバラの花色を改変する方法。

1 6. 前記コピグメンテーシヨン効果が、花色を青色方向に変化させる効果である、前記 1 5に記載の方法。発明を実施するための最良の形態

用語の定義

用語「バラ（a rose) J とは、本明細書中で使用するとき、バラ目パラ科バラ属 (Order, Rosales, Family, Rosaceae, Genus Rosa)の落葉低木である鑑賞用植物の総称をいい、特定の品種に限定されることを意図されず、また、植物の全体又は通常花を含む部分を意味する。

用語「バラ」の「部分、子孫、組織、栄養増殖体又は細胞」とは、本明細書中に使用するとき、本願発明に係る「バラ」の所望の遺伝的形質が保持されている限り、当該「バラ」に由来するすべての物を意味し、特定のものに限定されることを意図されない。

用語「高ストリンジェン卜条件」とは、本明細書中で使用するとき、例えば、 6 X S S C ( 1 X S S Cの組成： 0. 1 5 M N a C 1 、 0. 0 1 5 クェン酸ナトリウム、 p H 7. 0 ) と 0. 5 % S D Sと 5 Xデンハルトと l O O x g Zm l 変性断片化サケ精子 DNAと 5 0 % ホルムアミドを含む^液中、アンチセンス鎖と、対象の核酸とを 5 5 °Cで一晩保温し、 0. 1 X S S C等の条件及びノ又は 6 0 °C以上等の条件下での洗浄を行なう条件をいい、特に、バックグラウンドの非特異的なシグナルが実質的に存在しなくなる条件をいう。

用語「L*a*b表色系色度図における色相角度（ Θ ) 」とは、本明細書中で使用するとき、 1 9 7 6年国際証明委員会（C I E) で規格化され、日本国においても J I S 8 7 2 9 として採用された色相角度（ Θ ) をいい、 0 ° は赤方向、 9 0 ° は黄方向、 1 8 0 ° は緑方向、そして 2 7 0 ° は青方向である。尚、花の色は、かかる色相角度と、 RH S (英国王立園芸協会）のカラ一チャートのデータを併用して、表すことができる。

フラボン合成遗伝子及びフラボノィド 3'， 5'—水酸化酵素遺伝子の導入

バラに公知の方法で、シソ由来のフラボン合成酵素 IIの遺伝子を、パンジー由来の F3' 5'H遺伝子などとともに導入した。その結果、シソ由来のフラボン合成酵素 IIの遺伝子を導入したバラではフラボンは検出されず、この遺伝子はバラの中では機能しないことが示された。一方、トレニァ又はキンギヨソゥ由来のフラボン合成酵素 II の遺伝子を導入したバラではフラボンが検出され、フラボン合成遺伝子はバラの中で機能することがわかった。

このようにして、従来は存在しなかったフラボンを蓄積するバラを作出することができた。フラボンの総フラポノイド中の含量（％

) は、 1 %以上、好ましくは 5 %以上、より好ましくは 10 %以上、そして最も好ましくは 30 %以上であればよい。アントシァニンとフラボンの両方を蓄積するバラは、同じアントシァニンのみを含むパラよりも、相対的に青い色をしており、フラボンの蓄積が青色化という新しい形質の付与に貢献していることがわかった。

また、交雑試験により、デルフィ二ジン型アントシァニンとフラボンの両者を蓄積する形質は子孫にも伝達されることがわかった。本発明に関連する酵素類は、典型的には、配列表に記載されている特定のアミノ酸配列を有する酵素である。しかしながら、酵素においては、特定の、例えば生来の、アミノ酸配列のみならず、酵素活性に関与する領域以外の領域においてァミノ酸配列が修飾されていても、所望の酵素活性が維持されることはよく知られている。従つて、本発明の酵素類は、配列番号に示す特定のアミノ酸配列に対して、 1個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、本来の酵素活性を維持しているタンパク質、及び配列番号に示す特定のアミノ酸配列に対して 90 %以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、本来の酵素活性を維持しているタンパク質も、本発明の酵素に含まれる。

また、ある酵素をコードする遺伝子を手にすれば、当該遺伝子に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダィズする核酸は、当該酵素と同様の活性を有する酵素をコードしている蓋然性が高いことが知られている。従って、特定の配列番号で示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされ、且つ目的の酵素活性を有する酵素も、本発明の酵素に含まれる。従って、本発明に関与する酵素遺伝子として下記のものが挙げられる。

( A) キンギヨソゥ（Antirrhinum ma.j us)由来のフラボン合成酵素遺伝子

( 2) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、

( 3 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は

(4) 配列番号 1に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、

のいずれかをコードする遺伝子。

(B) トレニァ（Torenia hybrida)由来のフラボン合成酵素遺伝

±_

( 1 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、

(2) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、

( 3 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は

( 4 ) 配列番号 3に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、のいずれかをコードする遺伝子。

( C ) シソ（Peri 11a frutescens)由来のフラボン合成酵素遺伝子

( 1 ) 配列番号 6に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、

( 2 ) 配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、

( 3 ) 配列番号 6 に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は

( 4) 配列番号 5に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、

のいずれかをコ一ドする遺伝子。

(D ) パンジ一（pansy (Viola x wi Urockiana) )由来の 3' , 5'—水酸化酵素遺伝子

( 1 ) 配列番号 8に記載のアミノ酸配列を有する 3'， 5'一水酸化酵素、

( 2 ) 配列番号 8 に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する 3'， 5'—水酸化酵素、

( 3 ) 配列番号 8に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する 3'， 5'—水酸化酵素、又は

( ) 配列番号 7に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされた 3', 5'— 水酸化酵素、

のいずれかをコードする遺伝子。

(Ε) ト_レニァ (Torenia hybrida)由来のメチル基転移酵素遺伝 ( 1 ) 配列番号 1 0に記載のアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、

( 2 ) 配列番号 1 0に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、

( 3 ) 配列番号 1 0に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、又は

'( 4 ) 配列番号 9示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイプリダイズする核酸によりコードされたメチル基転移酵素、

のいずれかをコードする遺伝子。実施例

以下の実施例により本発明を更に具体的に説明する。本実施例は、本発明を例示することのみを目的とし、本発明の範囲を限定するものと解されることを意図されない。

実施例 1 ：アントシァニンに対するフラボンのコピグメント効果のシミュレーション

アントシァニンに対するフラボンのコピグメント効果のシミュレーシヨンを行うため、まずアントシァニン類を調製した。 Cyan inはバラ品種 "Rote Rose" (rose cv. "Rote Rose" )の花弁より抽出、精製した。 Delphinはバーべナ品種 "タピアンバイオレット" （vb erbena cv. "Tapien Violet or vberbena variety Sunmaref T P-V { Tapien Violet" ) \ Tapien" is a Trade Mark registered in Japan))の花弁より抽出した色素を、アルカリ加水分解した後精製した。 Malvin、及び Luteolin 7- 0- glucos ideはフナコシ株式会社より購入した。

このようにして調製した種々のアントシァニンに対してフラボン

(Luteol in 7- O-glucoside) を、 pH5.0の緩衝液中、 0、 1、 2、 4当量のモル濃度比で添加し、吸収スペクトルを測定した。アントシァニンとしては、 Cyanin (Cyanidin 3, 5-diglucos ide) 、 Delphin (D elphinidin 3, 5- diglucos ide) 、 Mai vin (Mai vid in 3, 5-diglucos ide) を用いた。アントシァニンの濃度は Cyanin、 Delphinおよび Ma lvinは lmMとした。

以下の表 1 と 2に示すように、フラボンの添加により、アントシァニン水溶液の吸光度は増大し、その変化の割合（吸光度比）は、 Malvinで最大であった。また、吸収極大（ λ max) もフラボンの添加とともに長波長側へシフトした。その変化の割合は Mai vinで最大、次いで Delphinであつだ。さらに、 L*a*b*表色系により色彩値の評価を行ったところ、フラボンの添加により、色彩の青色化が観察され、彩度も上昇した。その効果は、 Malvinで最も顕著であった。すなわち、 Luteolin 7- 0- glucos ideのコピグメント効果を最も受けるのは Malvinであることが判明した。

表 1 フラボン添加時のアントシァニン水溶液の吸収極大 ( λ max；単 i nm)

表 2

おけるフラボン無添加に対する吸光度比

実施例 2 (参考例）：バラ品種 "Lavande" へのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子とシソ由来フラボン合成酵素遺伝子の導入

特開 2000-279182に記載のシソ由来フラボン合成酵素遺伝子を含むプラスミド、 PYFS3を Xbalで消化した後、平滑末端化し、さらに B amHIで消化して、約 1.8kbのシソフラボン合成酵素遺伝子断片を得た。一方、 W02005/017147に記載の PSPB906を Xholで消化後、平滑末端化し、さらに BamHIで消化した。この平滑末端と BamHI切断部位の間に、前述のシソのフラボン合成酵素遺伝子断片を挿入し 906 - pY FS3を得た。 906- pYES3は E1₂35Sプロモーターと D8夕一ミネ一夕一（いずれも W02005/017147に記載）の間にシソ由来のフラボン合成酵素遺伝子を有するものである。 Ueyama らの報告（Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263 , 2002)に記載された PSPB176の BamHIと Sail部位に、 WO2005/017147 に記載の PCGP1961から BamHIと Xholの部分消化で切り出したパンジ -F3' 5Ή #40遺伝子の断片を挿入したプラスミドを PSPB575とした。この Ascl部位に、上述の 906-PYFS3を Asclで消化して得られる約 3 • 4kbのシソのフラボン合成酵素遺伝子発現カセットを挿入した。得られたプラスミドのうち、 F3' 5' H #40遺伝子の発現カセットとシソのフラボン合成酵素の発現カセットが同じ方向に連結されたべク夕一を PSPB1310 とした。本プラスミドは植物においてはパンジーの F3' 5Ή #40遺伝子とシソのフラボン合成酵素遺伝子構成的に発現する。

このようにして作製した PSPB1310を藤色系バラ品種 "Lavande" ( mauve rose variety "Lavande" )へ導入し、 55個体の开多質転換体を得た。色素分析を行った 50個体のうち 49個体でデルフィ二ジンの蓄積を確認でき、デルフィ二ジン含有率は最高 70% (平均 26%) であった。しかしながら、フラボンは全く検出されず、シソ由来のフラボン合成酵素遺伝子がバラの細胞では機能していないことが推察された。

代表的な形質転換体の分析値を以下の表 3 に示す。

表 3

対照： Lavande対照

De 1 ：デルフィジニジン、 Cya：シァニジン、 Pe 1 ：ペラルゴニジ、 M：ミリセチン、 Q：ケルセチン、 K：ケンフエロール、 Tri ： I セチン、 Lut ：ルテオリン、 Ap i ：ァピゲニン

Del (%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジンの割合実施例 3 ：バラ品種 "Lavande" へのパンジー由来 F3' 5' H #40 遺伝子とトレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の導入

Akashiらの報告（Plant Cell Physiol 40， 1182- 1186, 1999) に記載のトレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子が、プラスミド pBlues cript II SK (-) の EcoRIと Xhol部位に挿入されたプラスミドを pSP B426とした。これを Kpnlで消化した後、平滑末端化し、さらに BamH Iで消化し、約 1.7kbの卜レニァ由来フラボン合成酵素遺伝子断片を得た。一方、 W02005/0ni47に記載の PSPB906を Xholで消化後、平滑末端化し、さらに BamHIで消化した。この平滑末端と BamHI切断部位の間に、前述のトレ二ァのフラボン合成酵素遺伝子断片を挿入し 90 6 - 426を得た。

Ueyama らの報告（IJeyama et al. Plant Science, 163, 253-263 , 2002)に記載された pSPB176の BamHIと Sail部位に、 W02005/017147 に記載の PCGP1961から BamHIと Xholの部分消化で切り出したパンジ -F3' 5' H #40遺伝子の断片を挿入したプラスミドを PSPB575とした。この Ascl部位に、上述の 906 - 426を Asclで消化して得られる約 3 .3 kbのトレ二ァのフラボン合成酵素遺伝子発現カセットを挿入した。得られたプラスミドのうち、 F3' 5' M40遺伝子の発現カセットとトレ二ァのフラボン合成酵素の発現カセットが同じ方向に連結されたベクターを PSPB 1309 とした。本プラスミドは植物においてはパンジー F3' 5'H #40遺伝子とトレ二ァのフラボン合成酵素遺伝子構成的に発現する。

このようにして作製した PSPB1309を藤色系バラ品種 "Lavande" へ導入し、 50個体の形質転換体を得た。色素分析を行った 38個体のうち 36個体でデルフィ二ジンの蓄積を確認でき、デルフィ二ジン含有率は最高 45% (平均 12%) であった。一方、トレニァ由来フラポン合成酵素遺伝子の働きにより、 35個体で新たにフラボン（ルテオリン、ァピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 1.68mgという高い含有量であった。

代表的な形質転換体の分析値を以下の表 4に示す。

、 M : ミリセチン、 Q : ケルセチン、 K : ケンフエロール、 Tri : トリセチン、 Lut ：ルテオリン、 Api ：ァピゲニン

Del (%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジンの割合実施例 4 ：バラ品種 "WKS124" へのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子とトレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の導入

サ一モンピンク系のバラ品種 "WKS124" (salmon-pink rose vari ety "WKS124" )へ実施例 3に記載の pSPB 1309を導入し、 40個体の形質転換体を得た。色素分析を行った 27個体のうち 26個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィ二ジン含有率は最高 96% (平均 81%) であった。一方、トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 26個体で新たにフラボン（トリセチン、ルテオリン、ァピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 4.41mgという高い含有量であった。

代表的な形質転換体の分析値を以下の表 5に示す。表 5

対照： WKS124対照

Del ：デルフィジニジン、 Cya：シァニジン、 Pe 1 ：ペラルゴ二ジン、 M：ミリセチン、 Q：ケルセチン、 K：ケンフエロール、 Tri ：トリセチン、 Lut ：ルテォリン、 Ap i ：ァピゲニン

Del (%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジンの割合実施例 5 ：バラ品種 "Lavande" でのパンジー由来 F3' 5' H # 40遺伝子とキンギヨソゥ由来フラボン合成酵素遺伝子の発現とバラ内在性フラポノール合成酵素遺伝子の抑制

Tanakaらの報告 (Encyclopedia of rose science vol. 1, pp.34 1-350, ISBN 0- 12-227621-3) に記載のバラのフラポノール合成酵素をコードする cMAが、プラスミドベクタ一 pBluescript II SK-にクローニングされたものを pRFLSとする。ベクターのマルチクロ一ニングサイト上流の配列に由来する Reverseプライマー（AACAGCTiVT GACCATG) (配列番号 1 1 ) と、バラのフラポノール合成酵素 cMA の配列の 5'末端から約 0.8kb下流の配列に加えて Hindi II認識配列を付加した RFLS- Hindlllプライマ一 ( GATCTTGTTAAGCTTGTTGTAGACATAC ) (配列番号 1 2 ) を用い、 pRFLSを鎵型として常法に従い PCRを行つた。

得られた断片を Hindi IIで部分消化し、続いて Saclで消化することにより、バラフラポノール合成酵素 cDNAの上流約 0.85kbに由来する断片を得た。一方、 pRFLS をベクターのマルチクローニングサイトの BamHIとフラボノール合成酵素 cDNA内に存在する Hind II Iで切断し、バラフラボノール合成酵素 cMAの上流約 0.6kbに由来する断片を得た。フラポノ一ル合成酵素 cMAに由来するこれら約 0.6kbの断片並びに約 0.85kbの断片を、 W02005/059141に記載の PSPB184 を、 B amHIおよび Saclにて消化し得られる BamHI/SacI部位に挿入し、 pSPB 1402を得た。

次に、特開 2000- 279182に記載のキンギヨソゥ由来フラボン合成酵素遺伝子 ANFNS2をベクター pBluescript II から BamHIと Xholから切り出し、これを W02005/017147に記載の PSPB906を BamHIと Xholで消化して得られるプロモーターと夕一ミネ一ターに連結した。これを p SPB577とする。 p SPB577を Asclで切断して得られるキンギヨソゥのフラボン合成酵素発現カセット断片を実施例 2に記載の P SPB5 75の Ascl部位に挿入したものを p SPB908とする。

このようにじて得られた PSPB908を Asclで部分消化し、ここに、 p SPB1402を Asclで消化して得られる約 3.5kbのバラフラボノール合成酵素 cDNAに由来する二本鎖 RNA発現カセットを揷入した。得られたプラスミド P SPB 1403は、パンジー F3' 5'H #40、キンギヨソゥ FNS遺伝子、バラ FLS遺伝子の二本鎖 RNA発現カセッ卜が同方向に連結されたバイナリ -ベクターである。本プラスミドは植物においては F3' 5' H #40遺伝子遺伝子とキンギヨソゥフラボン合成酵素遺伝子を構成的に発現し、さらに RNAi法により内在性のフラボノール合成酵素遺伝子の発現を抑制するようデザインされている。

藤色系バラ品種 "Lavande" へ pSPB 1403を導入し、 82個体の形質転換体を得た。色素分析を行った 82個体のうち 64個体でデルフィ二ジンの蓄積を確認でき、デルフィ二ジン含有率は最高 72% (平均 19 %) であった。一方、キンギヨソゥ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 70個体で新たにフラボン（トリセチン、ルテオリン、ァピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 2.50mgという高い含有量であった。

代表的な形質転換体の分析値を以下の表 6に示す。

表 6

対照： Lavande対照

Del ：デルフィジニジン、 Cya：シァニジン、 Pel ：ペラルゴ二ジン、 M：ミリセチン、 Q：ケルセチン、 K：ケンフエロール、 Tri : トリセチン、 Lut ：ルテオリン、 Api ：ァピゲニン

Del (%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジンの割合実施例 6 ：バラ品種 "WKS124" でのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子とキンギヨソゥ由来フラボン合成酵素遺伝子の発現とバラ内在性フラボノール合成酵素遺伝子の抑制

実施例 5に記載の PSPB1403をサーモンピンク系バラ品種 "WKS124 " へ導入し、 20個体の形質転換体を得た。色素分析を行った 20個体全てでデルフィ二ジンの蓄積を確認でき、デルフィ二ジン含有率は最高 89% (平均 55%) であった。一方、キンギヨソゥ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 20個体全てで新たにフラボン（ルテォリン、ァピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 1.26mgという高い含有量であった。

代表的な形質転換体の分析値を以下の表 7に示す。

表 7

対照： S 124対照

Del ：デルフイジ二ジン、 Cya：シァニジン、 Pe 1 ：ペラルゴ二ジン、 M：ミリセチン、 Q：ケルセチン、 K：ケンフエロール、 Tri ：トリセチン、 Lut ：ルテォリン、 Ap i ：ァピゲニン

Del (%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジンの割合実施例 7 ：バラ品種 "WKS124" へのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子とトレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入

実施例 3 に記載の PSPB 1309を Pacl処理し、トレニァ由来のフラポン合成酵素発現カセットとパンジー由来 F3' 5'H #40遺伝子発現カセットの連結部位付近に存在する（より厳密には、フラボン合成酵素発現カセッ卜の D8ターミネ一夕一 3'末端付近に存在する） Pacl部位とベクターのマルチクローニングサイト内の Pacl部位を切断することにより、パンジー F3' 5'H #40遺伝子発現カセットを切り出した。一方、 W02003-062428に記載トレニァのメチル基転移酵素遺伝子発現カセットを有するバイナリ一べクタ一 pSPB 1530を Paclで切断し、そこに上記のパンジー F3' 5'H #40発現カセットを、メチル基転移酵素遺伝子発現カセッ卜と同じ方向に挿入した。本プラスミドを TM T-BP40とする。

一方、 PSPB 1309を Asclで切断し、トレ二ァのフラボン合成酵素発現カセットを切り出した。これを TMT- BP40の Ascl部位に、これらの発現カセットと同じ方向に挿入し、得られたプラスミドを pSFL535 とした。本プラスミドは植物において、パンジー F3' 5'H #40遺伝子とトレニァのメチル基転移酵素遺伝子、及びトレ二ァのフラボン合成酵素遺伝子を構成的に発現する。

このようにして得られた PSFL535をサーモンピンク系バラ品種 "W KS124" へ導入し、 173個体の形質転換体を得た。アントシァニジン分析を行った 98個体の形質転換体のうち 88個体でマルビジン（デルフィニジンの 3'位と 5'位がメチル化されたアントシァニジン）の蓄積を確認でき、バラの花弁においてパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子とトレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高 84% (平均 50%) であった。

一方、トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 77個体で新たにフラボン (卜リセチン、ルテオリン、ァピゲニン) の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 4.58 mgという高い含有量であった。また、 51個体でメチル化されたトリセチンが検出された。

代表的な形質転換体の分析値を以下の表 8に示す。表 8

対照： WKS124対照

Del：デルフィジニジン、 Cya：シァニジン、 Pe t：ペチュニジン、 Pe l：ペラルゴ二ジン、 Peo：ぺォニジン、 Mai：マルビジン、 M：ミリセチン、 Q ケルセチン、 K :ケンフエロール、 Tri：トリセチン、 Lut：ルテオリン、 Api：ァピゲニン

Del (%) 二ジン中のデルフィ二ジン系色素（デルフィ：: ：:ジン、ペチュニジン、マルビジン）の割合、

Mai (%) 二ジン中のマルビジンの割合

実施例 8 ：バラ品種 "Lavande へのパンジー由来 F3' 5' H _# 40遺伝子と卜レニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニァ由来アン卜シァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入

実施例 7 に記載の PSFL535を藤色系バラ品種 "Lavande" へ導入し、 130個体の形質転換体を得た。アントシァニジン分析を行った 118 個体の形質転換体のうち 37個体でマルビジン（デルフィ二ジンの 3' 位と 5'位がメチル化されたアントシァニジン）の蓄積を確認でき、バラの花弁においてパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子とトレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高 55.6% (平均 20.5%) であった。

一方、トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 78個体で新たにフラボン (卜リセチン、ルテオリン、ァピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 5. 11 mgという高い含有量であった。また、フラボンを生産していた形質転換体のうち 20個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリンが検出された。

代表的な形質転換体の分析値を以下の表 9 に示す。

表 9

対照 ·ラノヾンデ対照

Del：デルフィ二ジン、 Cya：シァニジン、 Pet：ペチュニジン、 Pel：ペラルゴ二ジン： Peo：ぺォニジン、 Mai：マルビジン、 M：ミリセチン、 Q：ケルセチン： K：ケンフエロール、 Tri：トリセチン、 Lut：ルテオリン、 Api：ァピゲニン

Del {%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素（デルフィ二ジン、ペチュニジン、マルビジン）の割合

Mai {%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合

実施例 9 ：バラ品種 "WKS82" へのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子とトレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入

実施例 7に記載の pSFL535を藤色系バラ品種 "WKS82" (mauve ros e variety "WKS82" )へ導入し、 250個体の形質転換体を得た。 7 ントシァニジン分析を行った 232個体の形質転換体のうち 110個体でマルビジン（デルフィ二ジンの 3'位と 5'位がメチル化されたアン卜シァニジン）の蓄積を確認でき、バラの花弁においてパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子とトレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高 65.2% (平均 19.7%) であった。

一方、トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 125 個体で新たにフラボン (卜リセチン、ルテオリン、ァピゲニン) の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 4. 71mgという高い含有量であった。また、フラボンを生産していた形質転換体のうち 80個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリンが検出された。

代表的な形質転換体の分析値を以下の表 1 0に示す。

表 1 o

対照： WKS82対照

De l：デルフィ二ジン、 Cya：シァニジン、 Pe t：ペチュニジン、 Pel：ペラルゴ二ジン： Peo：ぺォニジン、 Mai：マルビジン、 M：ミリセチン、 Q：ケルセチン： K：ケンフエロール、 Tri：トリセチン、 Lut：ルテオリン、 Api：ァピゲニン

De l (%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素（デルフィ二ジン、ペチュニジン、マルビジン）の割合

Mai (%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合

実施例 1 0 ：バラ品種 "WKS140" へのパンジー由来 F3' 5' H # 40遺伝子とトレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入

実施例 7に記載の pSFL535を藤色系バラ品種 "WKS140" (mauve ro se variety "WKS140" )へ導入し、 74個体の形質転換体を得た。ァントシァニジン分析を行った 74個体の形質転換体のうち 20個体でマルビジン (デルフィ二ジンの 3'位と 5'位がメチル化されたアントシァニジン）の蓄積を確認でき、バラの花弁においてパンジー由来 F3 ' 5Ή #40遺伝子とトレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高 51.3% (平均 33.5%) であった。

一方、トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 29個体で新たにフラボン (卜リセチン、ルテオリン、ァピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 3.04 mgという高い含有量であった。また、フラボンを生産していた形質転換体のうち 20個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリンが検出された。

代表的な形質転換体の分析値を以下の表 1 1 に示す。

表 1 1

対照： WKS140対照

Del：デルフィ二ジン、 Cya：シァニジン、 Pet：ペチュニジン、 Pel：ペラルゴ二ジン： Peo：ぺォニジン、 Mai：マルビジン、 M：ミリセチン、 Q :ケルセチン： K :ゲンフエロール、 Tri：トリセチン、 Lut：ルテオリン、 Api：ァピゲニン

Del (%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素（デルフィ二ジン、ペチュニジン、マルビジン）の割合

Mai {%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合

実施例 1 1 ：フラボン及びマルビジン合成能の後代への伝播一パンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子とトレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子とトレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子を導入した遺伝子組換えバラと栽培バラとの交雑

バラに付与したフラボン合成能の後代への遺伝様式を調査するため、実施例 7で作出したマルビジン及びフラボンを生産するバラ ( 表 8中、植物 No.6) を花粉親として用いた交配を行った。種子親には、中輪系栽培バラ "Medeo (メデォ） " （floribunda rose variet y "Medeo" )を用いた。

取得した形質転換体 Fl雑種後代のうち 10個体の色素分析を行ったところ、 7個体でマルビジンの蓄積が確認され、バラの花弁においてパンジー由来 F3' 5'H #40遺伝子とトレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高 68, 2% (平均 46.6%) であった一方、トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 8個体の形質転換体後代でフラボン（トリセチン、ルテオリン、ァピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lg あたり 7.35mgという極めて高い含有量であった。また、フラボンを生産していた形質転換体後代のうち 6個体でメチル化されたトリセチンが検出された。

代表的な形質転換体後代の分析値を以下の表 1 2に示す。表 1 2

Del：ルフィ二ジン、 Cya：シァニジン、 Pet：ペチ eo a M：ミリセチン、 Q：ケルセチン： K：ケンフエロール、 Tri：トリセチン、 Lut :ルテオリン、 Api：ァピゲニン Del (%) 二ジン中のデフィニジン系色素（デルフィ二ジン、ペチュニジン、マルビジン）の割合 Mai (%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合

実施例 1 2 ：フラボン合成能の後代への伝播

パンジー由来 F3' 5' H # 40遺伝子及びトレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子を導入したバラ品種 "WKS124" と、パンジ —由来 F3' 5'H #40遺伝子とトレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子を導入したバラ品種 "Lavande" の交配

バラに付与したフラボン合成能の後代への遺伝様式を調査するため、実施例 3で作出したフラボン生産株（表 4中、植物 No.4) を花粉親として用いた交配を行った。種子親には、バラ品種 WKS124へ pS PB1532を導入し、パンジー由来 F3' 5'H # 40遺伝子およびトレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子の働きにより花弁でマルビジンを高蓄積した形質転換体 WKS 124/1532-12-1 (W02003/06242 8に記載）を用いた。

取得した形質転換体後代のうち 149個体の色素分析を行ったところ、 88個体でフラボン（トリセチン、ルテオリン、ァピゲニン）の蓄積が確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 4. 09mgという高い含有量であった。また、 42個体でメチル化されたトリセチンが検出され、 11個体でメチル化されたルテオリン（Chryso eriol (3'Met-Lut) ) が検出された。なお、色素分析を行った 149 個体のうち、 129個体でマルビジンの蓄積が確認できた。マルビジン含有率は最高 79% (平均 36%) であった。

代表的な形質転換体後代の分析値を以下の表 1 3に示す。

表 1 3

M：ミリセチン、 Q：ケルセチン、 K：ケンフエロール、 Tr i：トリセチン、 Lut：ルテオリン、 Ap i：ァピゲニン De l (%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素（デルフィ二ジン、ペチュニジン、マルビジン）の割合、 Mai (%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合

実施例 1 3 ：フラボンを含むバラの花色の評価

実施例 4及び 7 において作出された形質転換体（バラ品種 "WKS1

24" を宿主とする）について、 ( 1 ) 主な色素としてデルフィニジンを蓄積し、フラポンを含まないもの、（ 2 ) 主な色素としてデルフィニジンを蓄積し、フラボンを含むもの、及び（ 3 ) 宿主（主な色素としてペラハゴ一ジンを蓄積）というグループに分類し、それぞれの花弁の色彩について分光測色計を用いて評価を行った（ n =

10) 。

主色素がデルフィ二ンンタイプのパラ、マルビジンタイプのバラいずれにおいても、フラボンが共存する場合に花弁の色相角度は青色方向へシフトしていた。また、主色素がマルビジンタイプのバラにおいては、その傾向がより顕著であり、反射スペクトルの極小（ λ Min) も長波長側へ大きくシフトしていた。以上の結果から、フラボンの共存により花弁の色彩が青く変化することが確認された。結果を以下の表 1 4 に示す。

表 1 4

色相角度（hue) ： L*a*b*表色系において、 a* (赤方向）の軸を 0 ° として、ここから反時計方向の色相に対して移動した角度で、色の位置がわかるようにしたもの。 90° であれば黄方向、 180° であれぱ、緑方向、 270° であれば青方向、 0° (= 360° )であれば赤方向ということになる。すなわち、数値が 270° に近いほど色相は青い。産業上の利用の可能性

本発明により、鑑賞用植物として人気のある花卉植物であるバラにおいて、遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィ二ジンを含ませることで、コピグメンテーシヨン効果によりバラの花色を青色方向に変化させることができる。青色の花色をもつバラは観賞用植物としての商品需要が見込まれる。

で、本明細書中に引用した特許文献、非特許技術文献の全てを、個別に又はそれらを全体として、本明細書中に援用する。

れまで、本発明を説明してきたが、本発明は、その本質から ¾6 脱せずに、修正又は変更されうると解されるべきであり、本発明の範囲は、実施例の記載に基づくのではな添付の請求の範囲により画されるべきことはいうまでもない。

Claims

請求の範囲

1. 遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィ二ジンを含むことを特徴とするバラ（a rose)。

2. 前記フラボンが、導入されたフラボン合成酵素遺伝子の発現によって生成したものである、請求項 1 に記載のバラ。

3. 前記フラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子である、請求項 2に記載のバラ。

4. 前記ゴマノ八ダサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハクサ科キン千ョソゥ (Scrop ular iaceae, Ant i rrhinum ma jus) 由来のフラボン合成酵素遺伝子である、請求項 3に記載のバラ。

5. 前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハグサ科トレニァ（Scrophular iaceae, Torenia hybrida)由来のフラボン合成酵素遺伝子である、請求項 3 に記載のバラ。

( 2 ) 配列番号 2 に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、

( 3 ) 配列番号 2 に記載のアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は

( 4 ) 配列番号 1 に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェン卜条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、

のいずれかをコードする遺伝子である、請求項 4に記載のバラ。

( 2 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、

( 4 ) 配列番号 3 に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイプリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、

のいずれかをコ一ドする遺伝子である、請求項 5に記載のバラ。

8. 前記デルフィ二ジンが、導入されたパンジー（Viola X wittr ockiana)由来のフラポノィド 3'， 5'—水酸化酵素遺伝子の発現によつて生成したものである、請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載のバ

( 1 ) 配列番号 8 に記載のアミノ酸配列を有するフラポノィド 3' ， 5'—水酸化酵素、

( 2 ) 配列番号 8 に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及びノ又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラポノィド 3'， 5 '—水酸化酵素、

( 3 ) 配列番号 8に記載のァミノ酸配列に対して 90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボノィド 3'， 5 '—水酸化酵素、又は ( 4 ) 配列番号 7 に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたフラボノィド 3'， 5'一水酸化酵素、

のいずれかをコードする遺伝子である、請求項 8に記載のパラ。

1 0. フラボン合成酵素遺伝子及びフラポノィド 3' , 5'一水酸化酵素遺伝子の導入前の宿主と比べて花色が変化している、請求項 2 〜 9のいずれか 1項に記載のバラ。

1 1 . 前記花色の変化が、青に向けての変化である、請求項 1 0 に記載のバラ。

1 2. 前記花色の変化が、 L*a*b表色系色度図における色相角度 ( Θ ) が青方向軸である 2 7 0 ° に近づく変化である、請求項 1 0 又は 1 1 に記載のバラ。

1 3. 前記花色の変化が、花弁の反射スペクトルの極小値が長波長側にシフトする変化である、請求項 1 0に記載のバラ。

1 4. 請求項 1〜 1 3のいずれか 1項に記載のバラと同じ性質を有する、その部分、子孫、組織、栄養増殖体又は細胞。

1 5. 遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィ二ジンを含めることにより生ずるコピグメンテ一シヨン効果によりバラの花色を改変する方法。

1 6. 前記コピグメンテーシヨン効果が、花色を青色方向に変化させる効果である、請求項 1 5に記載の方法。