WO2020007880A2 - Polypeptides et compositions a activite polysaccharide oxydase lytique - Google Patents

Polypeptides et compositions a activite polysaccharide oxydase lytique Download PDF

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polysaccharide oxidase
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Antoine Margeot
Santa BLANQUET
Jean-Guy BERRIN
David Navarro
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IFP Energies Nouvelles IFPEN
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
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    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
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    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y114/99—Miscellaneous (1.14.99)
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    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates, in general, to enzymes with polysaccharide oxidase activity.
  • the invention relates to the field of the production of second generation ethanol by enzymatic oxidation and hydrolysis of materials containing polysaccharides, and in particular lignocellulosic biomass.
  • the invention relates to the field of celluloses, as well as methods for the manufacture of cellulose fibers and defibrillation of cellulosic substrates.
  • Lignocellulosic biomass is a polysaccharide substrate and a renewable source for the production of biofuels and platform molecules for industry. Its conversion to products of interest, such as saccharides and cellulose fibers, requires the combined action of enzymes, mostly of fungal origin.
  • cellulolytic microorganisms To degrade this type of polysaccharide substrate, mainly composed of cellulose, hemicelluloses and lignin, cellulolytic microorganisms generally produce enzymatic mixtures containing cellulases, hemicellulases, pectinases and lignolytic enzymes. A concerted action of the different enzymes is necessary for optimal degradation of lignocellulose.
  • the degradation of cellulose requires in particular the coordinated and synergistic action of different types of enzymes. More particularly, efficiently converting cellulose into small molecules requires the synergistic action of cellulases, that is to say endoglucanases (EG), cellobiohydrolases (CBH) and B-glucosidases.
  • EGs cleave b- 1, 4 bonds at random in cellulosic chains, thereby releasing new terminations for the action of cellobiohydrolases (CBH) which in turn release cellobiose units.
  • CBH cellobiohydrolases
  • the b-glucosidases produce glucose molecules from cellobiose, thereby reducing the inhibitory effect of cellobiose on HBC.
  • hydrolytic enzymes are found in the class of glycoside hydrolases (GH), and cellulases in particular in the families GH5, GH6, GH7, GH 12, GH45 and GH48.
  • LPMO monooxygenases
  • AA auxiliary activity
  • Trichoderma reesei An enzyme producer frequently used in industry is the fungus Trichoderma reesei which is capable of producing large quantities of enzymes.
  • the enzyme cocktail known as “K975” represents a low diversity of enzymes and is not sufficiently effective.
  • T. aurantiacus an enzymatic cocktail of T. reesei containing 7% of the protein AA9 (LPMO) of T. aurantiacus was capable of hydrolyzing 90% of the cellulose to 4 mg of protein per gram of cellulose, making it possible to reduce the amount of enzymes needed by a factor of 2.
  • Other members of the AA9 family have been identified in several fungal species, notably in Podospora anserina, Myceliophthora thermophila or Phanerochaete chrysosporium.
  • WO 2018/050300 teaches the identification of LPMOs, and their implementation in a process for the production of sugars from lignocellulosic biomass.
  • WO 2016/193617 teaches methods of manufacturing nanocelluloses, comprising a step of enzymatic treatment of said substrate with a cleavage enzyme belonging to the family of lytic polysaccharide mono-oxygenases (LPMOs), capable of ensuring oxidative cleavage of said fibers of fibers celluloses.
  • LPMOs lytic polysaccharide mono-oxygenases
  • the object of the invention is to meet these needs.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a sequence having an amino acid identity of at least 20% with a polypeptide sequence of reference SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2, using a BLAST-P comparison method, said BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity as defined above, characterized in that it comprises a sequence having an amino acid identity of at least 80% with a reference polypeptide sequence SEQ ID N ° 1 or SEQ ID N ° 2, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • said isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity can be characterized in that it comprises a reference polypeptide sequence chosen from SEQ ID No. 5 to SEQ ID No. 382 and SEQ ID No. 383.
  • the invention relates to a composition with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a polypeptide with polysaccharide oxidase activity as defined above.
  • composition can be characterized in that it further comprises at least one polypeptide with polysaccharide-degradase activity chosen from: a cellulase, a hemicellulase, a ligninase and a carbohydrate oxidase.
  • polypeptide with polysaccharide-degradase activity chosen from: a cellulase, a hemicellulase, a ligninase and a carbohydrate oxidase.
  • Said composition with polysaccharide oxidase activity can be characterized in that it is capable of being obtained from one or more organisms of the fungus or yeast type, in particular chosen from the genera: Achlya, Acremonium, Aspergillus, Cephalosporium, Chrysosporium , Cochliobolus, Endothia, Fusarium, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Pyricularia, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Podospora, Pycnoporus, Fusarium, Thermonospora especially Aspergillus or Trichoderma; preferably Aspergillus or Podospora.
  • Said polysaccharide oxidase activity composition can be characterized in that said polysaccharide oxidase activity polypeptide is obtained recombinantly.
  • the invention relates to a kit comprising at least:
  • a first part comprising a polypeptide with polysaccharide oxidase activity as defined above, or a composition comprising said polypeptide with polysaccharide oxidase activity;
  • a second part comprising a polypeptide with polysaccharide-degradase activity chosen from a cellulase, a hemicellulase, a ligninase and a carbohydrate oxidase, or a composition comprising said polypeptide with polysaccharide-degradase activity.
  • the invention relates to a host capable of recombinantly expressing a polypeptide with polysaccharide oxidase activity as defined above.
  • Said host can in particular be a yeast, a bacterium or a fungus.
  • the invention relates to an isolated nucleic acid coding for a polypeptide with polysaccharide oxidase activity as defined above.
  • the invention relates to a process for obtaining a sugar from a polysaccharide substrate, comprising at least one step of bringing said substrate into contact with a polypeptide with polysaccharide oxidase activity such as defined above, or of a composition with polysaccharide oxidase activity comprising the said polypeptide with polysaccharide oxidase activity.
  • said substrate is a lignocellulosic substrate.
  • the invention relates to a process for the production of alcohol from a lignocellulosic substrate, characterized in that it comprises obtaining a sugar by a process for obtaining a sugar as defined below. above, and the alcoholic fermentation of said sugar by an alcohol-producing microorganism.
  • the invention relates to a method for preparing a cellulosic substrate for the manufacture of cellulose fibers, which method comprises at least the following steps consisting in:
  • a) have a cellulosic substrate capable of forming cellulose fibers; b) bringing said substrate into contact, in the presence of an electron donor, with at least one polypeptide with polysaccharide oxidase activity under conditions capable of ensuring oxidative cleavage of said cellulose fibers;
  • polypeptide with polysaccharide oxidase activity has an amino acid identity of at least 20% with a reference polypeptide sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2, using a BLAST comparison method- P, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to a process for defibrillation of a cellulosic substrate, which process comprises at least the following steps consisting in:
  • polypeptide with polysaccharide oxidase activity has an amino acid identity of at least 20% with a reference polypeptide sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2, using a BLAST comparison method- P, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to a process for manufacturing cellulose fibers, which process comprises at least the following steps consisting in:
  • polypeptide with polysaccharide oxidase activity has an amino acid identity of at least 20% with a reference polypeptide sequence SEQ ID No 1 or SEQ ID No 2, using a BLAST comparison method -P, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to cellulose fibers resulting from a defibrillation process and / or from a process for manufacturing cellulose fibers as defined above.
  • Figure 1 Monitoring over time of the hydrolysis yield with the T. reeser cocktail, on three pretreated biomass. The error bars represent G standard deviation calculated on 3 replicates.
  • Curve B. On Poplar Increase of the hydrolysis yield up to a value of 60% at Time (h) h) 140.
  • Figure 2A-2C Modification of the hydrolysis yield in the presence of secretomes from the CIRM-BRFM 1490 strain of "Aspergillus japonicus, compared to the hydrolysis yield in the presence of the reference cocktail alone.
  • On miscanthus The lightest boxes (on the left) illustrate the performance of the secretomes on miscanthus at 24h and the darkest boxes (on the right) illustrate the performance of the secretomes on miscanthus at 96h.
  • On poplar The lightest boxes (on the left) illustrate the performance of secretomes on poplar at 24 h and the darkest boxes (on the right) show the performance of secretomes on poplar at 96 h.
  • Figure 3 conservation of the catalytic module and consensus sequence. Graphic representation of consensus amino acids during the alignment of 378 X273 modules, generated using the WebLogo application (Crooks et al., 2004). On the ordinate, sequence preservation unit expressed in bits. On the abscissa, position in the module consensus reference sequence. The size of the amino acids is represented as a function of the frequency observed, as defined according to the algorithm specified in Crooks et al. (2004).
  • Figure 4 Synergy of X273 with CBHI for the release of cellobiose from cellulose nanofibrils.
  • the enzymes AaX273 and PaX273 (8 pg) reacted with a mixture of 0.1% cellulose nanofibrils (NFC) for 16 h in the presence of ascorbate (lmM), then the NFCs were washed and hydrolyzed by the CBHI cellulase of T. reesei (0.8 pg) for 30 minutes.
  • NFC cellulose nanofibrils
  • FIG. 5 Concentration of glucose released after 24 hours of hydrolysis of miscanthus by the reference cocktail, with or without addition of X273.
  • the test sequential: the X273 (2.2 mM) acted for 24 hours, then the cocktail K975 + SP188 (1 mg / g MS) was added for 24 hours.
  • the simultaneous test the X273 and the K975 + SP188 cocktail were added together for 24 hours.
  • the error bars represent the standard deviation calculated on 3 replicas.
  • concentration of glucose released in g / L.
  • control center in the presence of T.
  • Figure 6 Improvement in the accessibility of cellulose by X273, by measuring the cellobiose released in the presence of a Trichoderma reesei cellulase
  • the inventors have sought to identify secretomas of Aspergillus capable of supplementing a reference cellulolytic cocktail derived from T. reesei on a series of lignocellulosic biomasses known as recalcitrant, such as straw , poplar or miscanthus.
  • the inventors produced secretomes from cultures under different conditions and from several strains of Aspergillus, selected from the CIRM-CF (International Center for Microbial Resources - Filamentous Mushrooms) collection at INRA.
  • CIRM-CF International Center for Microbial Resources - Filamentous Mushrooms
  • secretomes providing the greatest improvements in miscanthus hydrolysis yield have been selected.
  • a protein of interest appeared during the exploration of the content of the secretomes, which is present only in the secretomes capable of improving the hydrolysis of miscanthus. This was not recognized during the CAZy annotation.
  • this protein contains a module having similarities with those found in the AA 10 family, followed by a C-terminal extension predicted as a disordered region. After verification using the CAZy tools, it was then established that this protein does not belong to the AA10 family, but to a family not yet characterized named X273 (internal referencing in CAZy).
  • this family of enzymes exhibits behavior of the polysaccharide oxidase (LPMO) type, which materializes in particular by the presence of a copper ion within its active center and the production of fUC in presence of an electron donor such as ascorbic acid.
  • LPMO polysaccharide oxidase
  • the inventors are of the opinion that the X273 family (also mentioned in the description as a polypeptide with polysaccharide oxidase activity according to the invention), present in the fungal genomes, is characterized by a catalytic module belonging to a new LPMO family.
  • this new family of LPMOs is therefore characterized by a polypeptide with polysaccharide oxidase activity, comprising a sequence having an amino acid identity of at least 20% with a polypeptide sequence of reference SEQ ID No. 1 (from from Podospora anserina) or SEQ ID N ° 2 (from Aspergillus aculeatus), using a BLAST-P comparison method, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • this new family of LPMOs is characterized by a polypeptide with polysaccharide oxidase activity, comprising a sequence having an amino acid identity of at least 40% with a polypeptide sequence of reference SEQ ID No. 1 (from Podospora anserina) or SEQ ID N ° 2 (from Aspergillus aculeatus), using a comparison method BLAST-P, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • this new family of LPMOs is characterized by a polypeptide with polysaccharide oxidase activity, comprising a sequence having an amino acid identity of at least 50% with a polypeptide sequence of reference SEQ ID No. 1 (from Podospora anserina) or SEQ ID N ° 2 (from Aspergillus aculeatus), using a BLAST-P comparison method, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • this new family of LPMOs is characterized by a polypeptide with polysaccharide oxidase activity, comprising a sequence having an amino acid identity of at least 60% with a polypeptide sequence of reference SEQ ID No. 1 (from Podospora anserina) or SEQ ID N ° 2 (from Aspergillus aculeatus), using a BLAST-P comparison method, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • this new family of LPMOs is characterized by a polypeptide with polysaccharide oxidase activity, comprising a sequence having an amino acid identity of at least 70% with a polypeptide sequence of reference SEQ ID No. 1 (from Podospora anserina) or SEQ ID N ° 2 (from Aspergillus aculeatus), using a BLAST-P comparison method, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • this new family of LPMOs is characterized by a polypeptide with polysaccharide oxidase activity, comprising a sequence having an amino acid identity of at least 80% with a polypeptide sequence of reference SEQ ID No. 1 (from Podospora anserina) or SEQ ID N ° 2 (from Aspergillus aculeatus), using a BLAST-P comparison method, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • this new family of LPMOs is characterized by a polypeptide with polysaccharide oxidase activity, comprising a sequence with an amino acid identity of at least 90% with a reference polypeptide sequence SEQ ID No. 1 (from Podospora anserina) or SEQ ID No. 2 (from Aspergillus aculeatus), using a comparison method BLAST-P, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the two reference sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 each correspond to the entire form of the polypeptide, including (i) a signal peptide in the N-terminal position, as predicted by the SignalP 4.1 software, (ii) the catalytic module including a 1st histidine at the N-terminal, and (iii) a C-terminal extension.
  • the catalytic module is responsible for the polysaccharide oxidase activity, and is characterized by the presence of an active center of the “Histidine brace” type also found in the enzymes of known LPMO type, and capable of fixing copper.
  • polypeptides with polysaccharide oxidase activity are in particular characterized by the presence of an active site formed by two conserved Histidine residues, one of the two Histidine residues generally being at the N-terminal end of the catalytic module.
  • the presence of the signal peptide and of the C-terminal extension are optional for obtaining a polysaccharide oxidase activity.
  • sequences SEQ ID No 3 and SEQ ID No 4 correspond respectively to the signal peptides of the sequences SEQ ID No 1 and SEQ ID No 2.
  • sequences SEQ ID N ° 5 and SEQ ID N ° 6 correspond respectively to the catalytic modules of the sequences SEQ ID N ° 1 and SEQ ID N ° 2.
  • the two reference sequences SEQ ID N ° 1 and SEQ ID N ° 2 share between them 45% of sequence identity, with an E-value of 2e 53 .
  • the two reference sequences SEQ ID N ° 5 and SEQ ID N ° 6 share between them 45% of sequence identity, with an E-value of 6th 52 .
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a reference polypeptide sequence chosen from SEQ ID No. 5 to SEQ ID No. 382 and SEQ ID N 383.
  • an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity is capable of binding to ceullose, and / or comprises a module for binding to cellulose.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a reference polypeptide sequence chosen from SEQ ID No. 2, 34, 40, 50, 51, 60, 61 , 82, 84, 86,
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a polypeptide sequence having at least 20% identity with a reference sequence chosen from SEQ ID No. 2, 34 , 40, 50, 51, 60, 61, 82, 84, 86, 87, 89, 93, 97, 103, 110, 121, 146, 156, 166, 174, 179, 181, 185, 188, 189, 207 , 210, 220, 227, 233, 239, 266, 270, 273, 285, 287, 291, 297, 300, 310, 319, 326.
  • a reference sequence chosen from SEQ ID No. 2, 34 , 40, 50, 51, 60, 61, 82, 84, 86, 87, 89, 93, 97, 103, 110, 121, 146, 156, 166, 174, 179, 181, 185, 188, 189, 207
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a polypeptide sequence having at least 40% identity with a reference sequence chosen from
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a polypeptide sequence having at least 80% identity with a reference sequence chosen from
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a sequence polypeptide having at least 90% identity with a reference sequence chosen from
  • BLAST-P method also called Protein Basic Local Alignment Search Tool method
  • the BLAST-P method has in particular been described in Altschul et al. (1990, J Mol Biol, Vol. 215 (n ° 3): 403-410), Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res. Vol. 25: 3389-3402) and Altschul et al. (2005, FEBS J. Vol. 272: 5101-5109).
  • the BLAST-P method is preferably used according to the following parameters: (i) Expected threshold: 10; (ii) Word Size: 6; (iii) Max Matches in a Query range: 0; (iv) Matrix: BLOSSUM62; (v) Gap costs: Existence 11, Extension 1; (vi) Compositional Adjustments: Conditional compositional score matrix adjustment, (vii) No filter; (viii) No mask.
  • the score of an alignment, S is calculated as the sum of the substitution and gap scores.
  • the substitution scores are given in a table (see PAM, BLOSUM below).
  • Gap scores are generally calculated as the sum of the Gs, the gap opening penalty and L, the gap extension penalty.
  • G the cost of a gap would be G + Ln.
  • the choice of the costs of the gaps, G and L are empirical, but it is usual to choose a high value for G (10-15) and a low value for L (1-2).
  • Optimal alignment means aligning two sequences with the highest possible score.
  • the "percentage of identity" between two polypeptides means that the percentage of identical amino acids between the two polypeptide sequences to be compared, obtained after optimal alignment, this percentage being entirely statistical and the differences between the two polypeptide sequences being distributed randomly along their length.
  • the comparison of two polypeptide sequences is traditionally carried out by comparing the sequences after having aligned them optimally, said comparison must be able to be carried out by segment or by using an "alignment window". The optimal alignment of the sequences for their comparison is achieved using the BLAST-P comparison software.
  • the percentage of identity between two amino acid sequences is determined by comparing the two optimally aligned sequences within which the nucleic acid sequences to be compared may contain additions or deletions with respect to the sequence of benchmark for optimal alignment between the two polypeptide sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of positions in which an amino acid is identical between the two sequences, preferably between two complete sequences, then by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the window d alignment and multiplying the result by 100 in order to obtain the percentage of identity between the two sequences.
  • polypeptide sequences having at least 20% amino acid identity with a reference sequence include those which have at least 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26 %, 27%,
  • polypeptide sequence having at least 20% identity is intended to mean sequences comprising at least 40% identity, very particularly at least 80% identity, and preferably at least 90% identity with a reference sequence; such as SEQ ID N ° 1 or 2.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a reference polypeptide sequence having at least 40% identity with a reference sequence SEQ ID No. 5 to SEQ ID No. 383.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a reference polypeptide sequence having at least 50% identity with a reference sequence SEQ ID N ° 5 to SEQ ID No. 383.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a reference polypeptide sequence having at least 60% identity with a reference sequence SEQ ID N ° 5 to SEQ ID No. 383.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a reference polypeptide sequence having at least 70% identity with a reference sequence SEQ ID No. 5 to SEQ ID No. 383.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a reference polypeptide sequence having at least 80% identity with a reference sequence SEQ ID No. 5 to SEQ ID No. 383.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a reference polypeptide sequence having at least 90% identity with a reference sequence SEQ ID N ° 5 to SEQ ID No. 383.
  • the “percentage identity” between two nucleic acid sequences represents the percentage of identical nucleotide residues between the two nucleic acid sequences to be compared, obtained after optimal alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly over the length of the sequences.
  • the comparison of two nucleic acid sequences is traditionally carried out by comparing the sequences after having aligned them optimally, the said comparison can be carried out by segment or by using an “alignment window”. The optimal alignment of the sequences for comparison is achieved using the BLAST-N comparison software.
  • the percentage identity between two nucleic acid sequences is determined by comparing the two optimally aligned sequences in which the nucleic acid sequences to be compared may contain additions or deletions compared to the reference sequence. of the optimal alignment between the two sequences
  • the percentage of identity is calculated according to the number of positions at which the nucleotide residues are identical between the two sequences, preferably between the two complete sequences, then by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the alignment window and multiplying the result by 100 in order to obtain the percentage of identity between the two sequences.
  • nucleotide sequences having at least 20% identity with the reference sequence include those having at least 21%, 22%,
  • nucleotide sequence having at least 20% identity is intended to mean sequences comprising at least 40% identity, very particularly at least 80% identity, and preferably at least 90% identity with a reference sequence; such as SEQ ID N ° 1 or 2.
  • BLOSUM Blocks Substitution Matrix
  • substitution score matrices in which the scores for each position are derived from the observation of the frequency of substitution of blocks in local alignments for related proteins. Each matrix is drawn for an evolution distance special.
  • the alignment from which the scores were derived was created from sequences not sharing more than 62% identity. Sequences with more than 62% identity are represented by a unique sequence in the alignment so as not to over-represent close members of the same family.
  • an E-value (also called Expect Value or e-value) is a parameter calculated when the BLAST-P method is used, the said parameter representing the number of different alignments with equivalent scores or with better than S whose appearance is expected during a search in the database by chance.
  • E-value the E-value
  • an e-value of 18 or less includes e-values of 20 or less, 25 or less, 30 or less, 40 or less, 1 e 50 or less, 1 e 60 or less, 1 e 70 or less, 1 e 80 or less, 1 e 90 or less and 1 e 100 or less.
  • cellulosic substrate or “lignocellulosic substrate” is meant any biomass material (including organic materials of plant origin, including algae, animal or fungal) and containing cellulose, in particular in the form of cellulosic fibers (c cellulose fibers).
  • Lignocellulosic biomass means any biomass capable of being used as a lignocellulosic substrate. Lignocellulosic biomass can in particular be classified according to its origin:
  • a lignocellulosic substrate can be obtained from a lignocellulosic biomass including: poplar, pine, miscanthus, willow, switchgrass, corn, sugar cane, wheat , rice, oats, barley, beet, olive, vine, cotton, eucalyptus, fruit trees.
  • the cellulosic substrate is advantageously obtained from wood (of which cellulose is the main component), but also from any fibrous plant rich in cellulose, such as, for example, cotton, linen, hemp, bamboo, kapok, coconut fiber (coir), ramie, jute, sisal, raffia, papyrus and certain reeds, bagasse of sugarcane, beet (and especially beet pulp), citrus fruits, stems corn or sorghum, or annual straw plants.
  • wood of which cellulose is the main component
  • any fibrous plant rich in cellulose such as, for example, cotton, linen, hemp, bamboo, kapok, coconut fiber (coir), ramie, jute, sisal, raffia, papyrus and certain reeds, bagasse of sugarcane, beet (and especially beet pulp), citrus fruits, stems corn or sorghum, or annual straw plants.
  • Cellulosic substrates can also be obtained from marine animals (such as tunicate), algae (such as Valonia or Cladophora) or bacteria for bacterial cellulose (such as bacterial strains of the Gluconacetobacter type) .
  • marine animals such as tunicate
  • algae such as Valonia or Cladophora
  • bacteria for bacterial cellulose such as bacterial strains of the Gluconacetobacter type
  • cellulose will be chosen from primary walls such as the fruit parenchyma (for example beets, citrus fruits etc.) or secondary walls, such as wood.
  • primary walls such as the fruit parenchyma (for example beets, citrus fruits etc.) or secondary walls, such as wood.
  • the cellulosic substrate advantageously consists of a cellulosic material prepared by chemical or mechanical means, from any cellulosic source as mentioned above (and in particular from wood).
  • Material containing lignocellulose is generally present, for example, in stems, leaves, bran, husks and rachis of plants or leaves, branches, and wood of trees.
  • the material containing lignocellulose can also be herbaceous material, agricultural and forestry remains, municipal solid waste, paper waste, and pulp and paper shredding remains. It should be understood here that the material containing lignocellulose can be in the form of material of the cell wall of the plant containing lignin, cellulose, and hemicellulose in a mixed matrix.
  • the material containing lignocellulose is a lignocellulosic biomass chosen from the group consisting of: grass, switchgrass, spartine, tares, baldingère false reed, miscanthus, sugar processing residues, sugar cane bagasse, agricultural waste, rice straw, rice husk, barley straw, corn on the cob, straw cereals, wheat straw, canola straw, oat straw, oat shell, corn stover, soy flour, corn flour, forest waste, recycled wood pulp fiber, paper mud, sawdust, hardwood, softwood, agave and combinations thereof.
  • the material containing lignocellulose is chosen from a group comprising: corn flour, corn fiber, rice straw, pine wood, wood chips, poplar, bagasse , paper and pulp processing waste.
  • cellulose is meant a linear homopolysaccharide derived from biomass (including organic matter of plant origin, algae included, cellulose of animal origin as well as cellulose of bacterial origin) and consisting of units (or cycles ) of glucose (D-Anhydroglucopyranose - AGU for “Anhydro glucose unit”) linked together by glycosidic linkages b- (1-4).
  • the repeating pattern is a glucose dimer also called cellobiose.
  • AGUs have 3 hydroxyl functions: 2 secondary alcohols (on the carbons in positions 2 and 3 of the glucose cycle) and a primary alcohol (on the carbon in position 6 of the glucose cycle).
  • these polymers combine by intermolecular bonds of the hydrogen bond type, thus conferring a fibrous structure on the cellulose.
  • the association of chains formed from cellobiose dimers forms an elementary nanofibrill of cellulose (the diameter of which is approximately 5 nm).
  • the association of elementary nanofibrils forms a nanofibril (whose diameter generally varies from 50 to 500 nm; this includes 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 and 500 nm).
  • the arrangement of several of these nanofibrils then forms what is generally called a cellulose fiber.
  • cellulose fiber designates all of the forms of cellulose capable of being obtained after a defibrillation process, or delamination of a cellulosic substrate; this includes forms of cellulose having a dimension of the order of a nanometer, as well as forms of cellulose having a larger dimension.
  • nanocelluloses refers to the different forms of cellulose with a dimension on the order of a nanometer. According to the invention, this term encompasses in particular two families of nanocelluloses: cellulose nanocrystals and cellulose fibrils.
  • cellulose fibrils are synonyms.
  • Each cellulose nanofibril contains crystalline parts stabilized by a solid network of inter- and intra-chain hydrogen bonds. These crystal regions are separated by amorphous regions.
  • NCCs cellulose nanocrystals
  • the NCCs advantageously comprise at least 50% of crystalline part, more preferably at least 55% of crystalline part. They generally have a diameter ranging from 5 to 70 nm (preferably less than 15 nm) and a length ranging from 40 nm to approximately 1 ⁇ m, preferably ranging from 40 nm to 500 nm; which includes 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 and 500 nm.
  • cellulose nanocrystals are synonymous.
  • cellulose whiskers are synonymous.
  • microcrystals or “cellulose nanocrystal” are synonymous.
  • NCCs cellulose nanocrystals
  • polysaccharide-containing material includes a substance or composition comprising polysaccharides.
  • polysaccharide is used in its conventional sense and designates polymeric carbohydrates composed of long chains of monosaccharides held together by glycosidic bonds. During their hydrolysis, the polysaccharides release the soluble monosaccharides or oligosaccharides constituting them.
  • the polysaccharides which are preferably considered are the polysaccharides derived from plants, and very particularly cellulose, such as that found in lignocellulose.
  • This term thus includes any material (or substrate or biomass) comprising at least one (or a plurality of) polysaccharide (s) chosen from: cellulose, hemicellulose and pectin; which notably includes polysaccharide substrates comprising at least 30% by weight of cellulose and hemicellulose.
  • s polysaccharide
  • material containing lignocellulose refers to material consisting mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. This term is synonymous with “lignocellulosic material”. Such material is also referenced as “Biomass”. According to this definition, a material containing lignocellulose is an example of a cellulosic substrate capable of forming cellulose fibers.
  • lignocellulosic material or substrate or biomass containing at least 30% by weight (wt), preferably at least 50% by weight, preferably at least 70% by weight, preferably at least 90% by weight of lignocellulose.
  • lignocellulosic material may include other compounds such as polypeptides and sugars, which includes fermentable and / or non-fermentable sugars.
  • a material containing lignocellulose particularly considered according to the invention can be chosen from pine, poplar, straw and miscanthus.
  • a “polysaccharide oxidizing enzyme” or a “polysaccharide oxidase activity polypeptide” include the polypeptides with the following properties:
  • said polypeptide produces hydrogen peroxide in the presence of oxygen and an electron donor compound, such as ascorbates,
  • polypeptide increases in a dose dependent manner, in the absence or in the presence of an electron donor compound, the degradation of a material containing polysaccharides such as lignocellulose, caused by cellulases and / or hemicellulases such that, for example, xylanases,
  • said polypeptide increases in a dose dependent manner, in the absence or in the presence of an electron donor compound, the degradation of a material containing polysaccharides such as lignocellulose, caused by cellulases.
  • an electron donor compound is used herein in its usual sense for a person skilled in the art.
  • an electron donor compound is a chemical entity capable of donating electrons to another compound.
  • An electron donor compound is a reducing agent due to its ability to donate electrons and is itself oxidized when it donates electrons to another chemical entity.
  • An electron donor compound as specified above for the oxidation properties of polysaccharides includes, but is not limited to, ascorbates and cellobiose dehydrogenases (CDH).
  • CDH cellobiose dehydrogenases
  • the reducing agent can advantageously be supplied by biomass (lignin) which can act as an electron donor.
  • LPMO Lignostic Polysaccharide Monooxygenase
  • CAZy database Carbohydrate Active enzymes, Lombard et al., 2014
  • This term therefore includes in particular all of the polypeptides with polysaccharide oxidase activity belonging to the families AA9, AA10, AA11, AA13, AA14 and AA15.
  • This term also includes LPMO type I (capable of oxidizing glycosidic bonds on carbon C), type II (capable of oxidizing glycosidic bonds on carbon C4) and type III (capable of oxidizing bonds glycosides in both Cl and C4).
  • polysaccharide degrading enzyme or a "polypeptide with polysaccharide degradase activity” includes polypeptides which, in addition to polysaccharide oxidases, contribute to the degradation of polysaccharide substrates such as lignocellulosic biomasses.
  • polypeptides with polysaccharide degradase activity can be chosen from cellulases, hemicellulases, ligninases and carbohydrate oxidases.
  • Cellulases include endoglucanases, cellobiohydrolases and beta-glucosidases.
  • Hemicellulases include xylanases, mannanases, xylosidases, mannosidases, arabinofuranosidaes and esterases.
  • cellulase is likely to include exo-glucanases, endo-glucanases, cellobiohydrolases, cellulose phosphorylases, pectinases, pectate lyases, polygalacturonase, pectin esterases, cellobiose dehydrogenases, mannanases, arabinofuranosidases, feruoyl esterases, arabinofuranases, arabinofurases, arabinofuranase , galactosidases, amylases, acetylxylan esterases, chitin deacetylases, chitinases, and glucosidases.
  • Ligninases include peroxidases, copper radical oxidases (i.e. laccases).
  • Carbohydrate oxidases include lytic polysaccharide monooxygenases (LPMO) and GMC oxidoreductases (i.e. glucose dehydrogenases, cellobiose dehydrogenases).
  • chemical treatment refers to all chemical pretreatments that allow the separation and / or release of cellulose, hemicellulose and / or lignin.
  • suitable chemical pretreatments include, for example, dilute acids, lime, bases, organic solvents, ammonia, sulfur dioxide, carbon dioxide.
  • wet oxidation and hydrothermolysis at controlled pH are also considered to be chemical pretreatments.
  • the pretreatment methods using ammonia are described in particular in PCT applications WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, and WO 2006/110901.
  • mechanical pretreatment refers to all mechanical (or physical) treatments that allow the separation and / or release of cellulose, hemicellulose and / or lignin from material containing lignocellulose.
  • mechanical pretreatments include different types of grinding, irradiation, steam explosion and hydrothermolysis.
  • Mechanical pretreatment includes the fragmentation of a solid (comminution or mechanical size reduction).
  • the fragmentation of a solid includes the techniques of dry grinding, wet grinding and grinding by vibrating bales.
  • Mechanical pretreatment can also include high pressures and / or high temperatures (steam explosion). In some representations of the pretreatment step, said step can combine mechanical and chemical pretreatment.
  • biological pretreatment refers to all biological treatments which allow the separation and / or release of cellulose, hemicellulose and / or lignin from material containing lignocellulose.
  • Biological pretreatments may involve the application of microorganisms capable of solubilizing lignin (see, for example, Hsu, 1996, Pretreatment of biomass, in the Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh and Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic / microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, comprising a sequence having an amino acid identity of at least 20% with a polypeptide sequence of reference SEQ ID No. 1 (from Podospora anserina) or SEQ ID N ° 2 (from Aspergillus aculeatus), using a BLAST-P comparison method, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, as defined above, characterized in that it comprises a sequence having an amino acid identity of at least 40% with a reference polypeptide sequence SEQ ID N ° 1 or SEQ ID N ° 2, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • a polypeptide with polysaccharide oxidase activity can be characterized in that it comprises a sequence having an amino acid identity of at least 45% with a polypeptide sequence of reference SEQ ID No. 1 or SEQ ID N ° 2, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, as defined above, characterized in that it comprises a sequence having an amino acid identity of at least 60% with a reference polypeptide sequence SEQ ID N ° 1 or SEQ ID N ° 2, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, as defined above, characterized in that it comprises a sequence having an amino acid identity of at least 80% with a reference polypeptide sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2, the said BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less .
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, as defined above, characterized in that it comprises a sequence having an amino acid identity of at least 90% with a reference polypeptide sequence SEQ ID N ° 1 or SEQ ID N ° 2, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to one of said isolated polypeptides with polysaccharide oxidase activity, as defined above, characterized in that it comprises a reference polypeptide sequence having an amino acid identity of at least 20% with a sequence chosen from SEQ ID N ° 5 to SEQ ID N ° 383, which includes SEQ ID N ° 7 to 382 and SEQ ID N ° 383.
  • the invention relates to one of said isolated polypeptides with polysaccharide oxidase activity, as defined above, characterized in that it comprises a reference polypeptide sequence having an amino acid identity of at least 80% with a sequence chosen from SEQ ID N ° 5 to SEQ ID N ° 383, which includes SEQ ID N ° 7 to 382 and SEQ ID N ° 383.
  • the invention relates to one of said isolated polypeptides with polysaccharide oxidase activity, as defined above, characterized in that it comprises a reference polypeptide sequence having an amino acid identity of at least 90% with a sequence chosen from SEQ ID N ° 5 to SEQ ID N ° 383, which includes SEQ ID N ° 7 to 382 and SEQ ID N ° 383.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, as defined above, characterized in that it comprises a reference polypeptide sequence chosen from SEQ ID No. 5 to SEQ ID No. 382 and SEQ ID # 383.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, as defined above, characterized in that it comprises a sequence having an amino acid identity of at least 20% with a Reference polypeptide sequence SEQ ID No 5 or SEQ ID No 6, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, as defined above, characterized in that it comprises a sequence having an amino acid identity of at least 40% with a Reference polypeptide sequence SEQ ID No 5 or SEQ ID No 6, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • a polypeptide with polysaccharide oxidase activity can be characterized in that it comprises a sequence having an amino acid identity of at least 45% with a polypeptide sequence of reference SEQ ID No. 5 or SEQ ID N ° 6, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, as defined above, characterized in that it comprises a sequence having an amino acid identity of at least 60% with a Reference polypeptide sequence SEQ ID No 5 or SEQ ID No 6, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, as defined above, characterized in that it comprises a sequence having an amino acid identity of at least 80% with a Reference polypeptide sequence SEQ ID No 5 or SEQ ID No 6, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to an isolated polypeptide with polysaccharide oxidase activity, as defined above, characterized in that it comprises a sequence having an amino acid identity of at least 90% with a Reference polypeptide sequence SEQ ID No 5 or SEQ ID No 6, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to a composition with polysaccharide oxidase activity, characterized in that it comprises a polypeptide with polysaccharide oxidase activity as defined above.
  • the invention relates to a composition with polysaccharide oxidase activity as defined above, characterized in that it also comprises at least a polypeptide with polysaccharide-degradase activity chosen from: a cellulase, a hemicellulase, a ligninase and a carbohydrate oxidase.
  • composition with polysaccharide oxidase activity can be characterized in that it is capable of being obtained from one or more organisms chosen from: Agaricus bisporus, Alternaria alternata, Amanita thiersii, Armillaria ostoyae, Armillaria solidipes, Ascochyta rabiei, Aspergillus arachidicola, Aspergillus bombycis, Aspergillus brasiliensis, Aspergillus campestris, Aspergillus candidus, Aspergillus carbonarius, Aspergillus clavatus, Aspergillus cristatus, Aspergillus fischeri, Aspergillus Aspergillus Aspergillus Aspergillus Aspergillus Aspergillus Aspergillus Aspergillus , Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus nomius, Aspergillus nom
  • composition with polysaccharide oxidase activity can be characterized in that it is capable of being obtained from one or more organisms of the bacteria, fungus (for example filamentous fungi) or yeast type, chosen from genera: Escherichia, Lactococcus, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Phanerochaete, Achlya, Acremonium, Aspergillus, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Endothia, Fusarium, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucoria Pyropia Trichoderma, Podospora, Pycnoporus, Fusarium, Thermonospora especially Aspergillus or Trichoderma or Podospora, preferably Aspergillus or Podospora.
  • fungus for example filamentous fungi
  • yeast type chosen from genera: Escherichi
  • composition with polysaccharide oxidase activity can be characterized in that it is capable of being obtained from one or more organisms of the fungus or yeast type, chosen from the genera: Achlya, Acremonium, Aspergillus, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Endothia, Fusarium, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Pyricularia, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Podospora, Pycnoporus, Asparium or Aspmonospora or Thermonospora or Aspmonospora or Podospora.
  • said composition with polysaccharide oxidase activity can be characterized in that it is capable of being obtained from Aspergillus japonicus.
  • a polypeptide with polysaccharide oxidase activity according to the invention can also be obtained recombinantly.
  • composition with polysaccharide oxidase activity can be characterized in that said polypeptide with polysaccharide oxidase activity is obtained recombinantly.
  • a composition with polysaccharide oxidase activity according to the invention only comprises a polypeptide (or “enzyme”) with polysaccharide oxidase activity according to the invention, ie a polypeptide having a sequence having an amino acid identity at least 20% with a reference polypeptide sequence SEQ ID No. 1 (from Podospora anserina) or SEQ ID No. 2 (from Aspergillus aculeatus), using a BLAST-P comparison method, the so-called BLAST-P comparison giving an e-value of 18 or less.
  • a composition with polysaccharide oxidase activity according to the invention comprises a plurality of polypeptides with polysaccharide oxidase activity according to the invention, ie more than one polypeptide having a sequence having an amino acid identity of at least 20% with a reference polypeptide sequence SEQ ID N ° 1 (from Podospora anserina) or SEQ ID N ° 2 (from of Aspergillus aculeatus), using a BLAST-P comparison method, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • a composition with polysaccharide oxidase activity according to the invention comprises at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 polypeptides with polysaccharide oxidase activity according to the invention.
  • a composition with polysaccharide oxidase activity according to the invention further comprises at least one other polypeptide with polysaccharide oxidase activity; in particular chosen from the lytic polysaccharide monooxygenases, which includes the polypeptides belonging to the LPMO groups AA9, AA10, AA11, AA13 and AAl4.
  • a composition with polysaccharide oxidase activity according to the invention can be used as a composition for degrading a polysaccharide substrate, such as lignocellulosic biomasses.
  • composition with polysaccharide oxidase activity can be used as an auxiliary composition in combination with one or more polypeptides with polysaccharide degradase activity.
  • a polypeptide with polysaccharide oxidase activity according to the invention can be used in the form of a kit.
  • such a kit can comprise a polypeptide with polysaccharide oxidase activity or a composition with polysaccharide oxidase activity according to the invention; and on the other hand, a polypeptide with polysaccharide-degradase activity or a composition comprising said polypeptide with polysaccharide-degradase activity.
  • the invention also relates to a kit comprising at least:
  • a first part comprising a polypeptide with polysaccharide oxidase activity according to the invention, or a composition comprising said polypeptide with polysaccharide oxidase activity;
  • kits can, in particular, correspond to kits for:
  • the invention relates to a host capable of recombinantly expressing a polypeptide with polysaccharide oxidase activity according to the invention.
  • Said host can in particular be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • said host is a yeast or a bacterium or a fungus, for example a filamentous fungus.
  • a "host” can in particular be a yeast chosen from a group comprising: Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia,
  • yeasts can be chosen from: S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus, or K. fragilis.
  • the yeast is chosen from: Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Issatchenkia orientalis, Candida albicans, Candida mexicana, Pichia pastoris, Pichia mississippiensis, Pichia mexicana, Pichia stipitis, Pichia farinosa, Clavispora opuntiait Clavidae , Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe, Hansenula polymorpha, and Schwanniomyces occidentalis.
  • a “host” can in particular be a bacterium chosen from a group comprising: Escherichia, Lactococcus, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas.
  • a "host” can in particular be a fungus chosen from a group comprising: Aspergillus, Trichoderma, Podospora, Myceliophthora, Chrysosporium, Neurospora, Fusarium, Phanerochaete, Penicillium.
  • said host is a yeast.
  • the invention also relates to an isolated nucleic acid encoding a polypeptide with polysaccharide oxidase activity according to the invention.
  • nucleic acid allowing the expression of a polypeptide with polysaccharide oxidase activity can be introduced into the genome of a host (ie yeast) of interest, or also introduced as a non-integrated vector. according to genetic engineering techniques known in the field.
  • the invention also relates to a method for producing a polypeptide with polysaccharide oxidase activity; comprising a step of culturing a host capable of expressing a polypeptide with polysaccharide oxidase activity according to the invention.
  • the invention relates to vectors including a nucleic acid encoding a polypeptide with polysaccharide oxidase activity according to the invention.
  • Said vectors i.e. plasmids or YAC
  • plasmids or YAC are in particular expression vectors capable of directing the expression of a given gene, and associated with an operon.
  • the invention therefore also relates to a process for the production of a polypeptide with polysaccharide oxidase activity; consists in:
  • polypeptides with polysaccharide oxidase activity can be used both in processes for obtaining a sugar from a substrate polysaccharide, fermentation and alcohol production processes from a lignocellulosic substrate.
  • a pre-treatment of the polysaccharide substrate i.e. lignocellulosic biomass
  • to break the structure of the lignocellulosic wall by liquefying certain components and by reducing the crystallinity of the cellulose.
  • enzymes are secreted by a variety of cellulolytic, aerobic or anaerobic, mesophilic or thermophilic organisms, belonging in particular to the genera Clostridium, Thermomonospora, Cellulomonas, Bacteriodes or Streptomyces for bacteria, and Phanerochaete, Trichoderma, Aspergillus or Penicillium for filamentous fungi .
  • This fermentation step is notably implemented by microorganisms such as the yeast Saccharomyces cerevisiae, which is the microorganism the most used in industry thanks to its high yields and low sensitivity to inhibitors.
  • microorganisms such as the yeast Saccharomyces cerevisiae, which is the microorganism the most used in industry thanks to its high yields and low sensitivity to inhibitors.
  • it is naturally not able to use the pentoses produced during the enzymatic hydrolysis.
  • modified strains capable of fermenting sugars such as xylose or arabinose have been developed.
  • these steps can be carried out separately, or even simultaneously.
  • these different steps can be carried out separately, as is the case in a process noted SHF (“Separate Hydrolysis and Fermentation”) where enzymes and yeasts can be used each in their optimal conditions. It is also possible to carry out these steps simultaneously, by a process that is called SSCF (“Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation”).
  • CBP Consolidated Bioprocessing
  • polypeptides with polyssaccharide oxidase activity are particularly advantageous in the context of a step of hydrolysis of polysaccharide substrates.
  • the invention relates to a process for obtaining a sugar from a polysaccharide substrate, comprising at least one step of bringing said substrate into contact with a polypeptide with polysaccharide activity- oxidase, comprising a sequence having an amino acid identity of at least 20% with a reference polypeptide sequence SEQ ID No. 1 (from Podospora anserina) or SEQ ID No. 2 (from Aspergillus aculeatus), using a BLAST-P comparison method, said BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less, or of a composition with polysaccharide oxidase activity comprising said polypeptide.
  • the invention relates to a process for obtaining a sugar from a polysaccharide substrate, comprising at least one step of bringing said substrate into contact with a polypeptide with polysaccharide oxidase activity, comprising a sequence having a amino acid identity of at least 20% with a reference polypeptide sequence SEQ ID No 5 (from Podospora anserina) or SEQ ID No 6 (from Aspergillus aculeatus), using a BLAST-P comparison method , the said BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less, or of a composition with polysaccharide oxidase activity comprising the said polypeptide.
  • the invention relates to a process for obtaining a sugar from a polysaccharide substrate, comprising the steps of:
  • a) have a polysaccharide substrate
  • polysaccharide substrate into contact with a polypeptide with polysaccharide oxidase activity, comprising a sequence having an amino acid identity of at least 20% with a polypeptide sequence of reference SEQ ID No. 1 (from Podospora anserina) or SEQ ID N ° 2 (from Aspergillus aculeatus), using a BLAST-P comparison method, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less, or of a composition with polysaccharide oxidase activity comprising said polypeptide;
  • step c) collect the said sugar obtained at the end of step b).
  • the invention relates to a process for obtaining a sugar from a polysaccharide substrate, comprising the steps of:
  • a) have a polysaccharide substrate
  • polysaccharide substrate into contact with a polypeptide with polysaccharide oxidase activity, comprising a sequence having an amino acid identity of at least 20% with a polypeptide sequence of reference SEQ ID No. 5 (from Podospora anserina) or SEQ ID N ° 6 (from Aspergillus aculeatus), using a BLAST-P comparison method, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less, or d a composition with polysaccharide oxidase activity comprising said polypeptide;
  • step c) collect the said sugar obtained at the end of step b).
  • the invention relates to a process for obtaining a sugar as defined above, characterized in that said substrate is a lignocellulosic substrate, and very particularly a lignocellulosic biomass.
  • the invention relates to a process for preparing a fermentation product from a polysaccharide substrate, characterized in that it comprises obtaining a sugar by a process as defined below - Above, and the fermentation of said sugar so as to obtain a fermentation product.
  • the invention relates to a process for the preparation of a fermentation product from a polysaccharide substrate, characterized in that it comprises the following steps:
  • the invention relates to a process for preparing a fermentation product from a polysaccharide substrate, characterized in that it comprises the following steps:
  • the invention relates to a process for the production of alcohol from a lignocellulosic substrate, characterized in that it comprises obtaining a sugar by a process as defined above, and the alcoholic fermentation of said sugar by an alcohol-producing microorganism.
  • the fermentation product is preferably butanol, ethanol, isopropanol or one of their mixtures.
  • the alcoholic fermentation product considered is ethanol.
  • a fermentation process and / or production of alcohol according to the invention is a process for the production of butanol, ethanol, isopropanol or a mixture thereof.
  • the invention relates to a process for the production of alcohol from a lignocellulosic substrate, characterized in that it comprises the following steps:
  • the invention relates to a process for the production of alcohol from a lignocellulosic substrate, characterized in that it comprises the following steps:
  • nanocelluloses Different forms of cellulose have been identified with a dimension of the order of a nanometer, designated under the generic name of "nanocelluloses".
  • nanocelluloses The notably mechanical properties of cellulose fibers, including these nanocelluloses, their capacity to form films and their viscosity, also give them major interest in many industrial fields.
  • Several pretreatment strategies for cellulose fibers have been developed to reduce the energy consumption required for their mechanical delamination.
  • the methods defined below relate to obtaining cellulose fibers from a cellulosic substrate. They involve the implementation of a polypeptide with polysaccharide oxidase activity according to the invention.
  • the invention relates to a process for the preparation of a cellulosic substrate for the manufacture of cellulose fibers, which process comprises at least the following steps consisting in:
  • the invention relates to a process for the preparation of a cellulosic substrate for the manufacture of cellulose fibers, which process comprises at least the following steps consisting in:
  • a) have a cellulosic substrate capable of forming cellulose fibers; b) bringing said substrate into contact, in the presence of an electron donor, with at least one polypeptide with polysaccharide oxidase activity, under conditions suitable for ensuring oxidative cleavage of said cellulose fibers;
  • polypeptide with polysaccharide oxidase activity has an amino acid identity of at least 20% with a reference polypeptide sequence SEQ ID No 5 or SEQ ID No 6, using a BLAST comparison method -P, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to a process for defibrillation of a cellulosic substrate, which process comprises at least the following steps consisting in:
  • the invention relates to a method of defibrillation of a cellulosic substrate, which method comprises at least the following steps consisting in:
  • polypeptide with polysaccharide oxidase activity has an amino acid identity of at least 20% with a reference polypeptide sequence SEQ ID No 5 or SEQ ID No 6, using a BLAST comparison method -P, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to a process for manufacturing cellulose fibers, which process comprises at least the following steps consisting in:
  • a) have a cellulosic substrate capable of forming cellulose fibers; b) bringing said cellulosic substrate into contact with at least one polypeptide with polysaccharide oxidase activity in the presence of an electron donor under conditions capable of ensuring oxidative cleavage of said cellulose fibers;
  • polypeptide with polysaccharide oxidase activity has an amino acid identity of at least 20% with a reference polypeptide sequence SEQ ID No 1 or SEQ ID No 2, using a BLAST comparison method -P, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • the invention relates to a process for manufacturing cellulose fibers, which process comprises at least the following steps consisting in:
  • polypeptide with polysaccharide oxidase activity has an amino acid identity of at least 20% with a reference polypeptide sequence SEQ ID No 5 or SEQ ID No 6, using a BLAST comparison method -P, the so-called BLAST-P comparison method giving an e-value of 18 or less.
  • Said polypeptide with polysaccharide oxidase activity according to the invention is mixed with the cellulosic substrate, so as to allow contact between said polypeptide and the cellulose fibers.
  • the enzymatic treatment step is preferably carried out with gentle stirring, so as to ensure good dispersion of the enzymes within the fibers.
  • This enzymatic treatment step is for example implemented for a period ranging from 24 to 72 hours (preferably 48 hours).
  • the enzymatic treatment step is carried out at a temperature ranging from 30 to 50 ° C., in particular from 30 to 45 ° C.
  • the pH of the reaction conditions of the enzyme in contact with the cellulosic substrate is generally between 3 and 7, which includes between 4 and 7, and in particular between 4 and 6.
  • the said polypeptide can be added to the cellulosic substrate in an enzyme / cellulose ratio (or ratio) ranging from 1: 1,000 to 1: 50, in particular from 1: 500 to 1: 50 or from 1: 100 to 1: 50 or from 1: 1000 to 1: 500, from 1: 500 to 1: 100.
  • said polypeptide is used at a concentration ranging from 0.001 to 10 g / L, in particular from 0.1 to 5 g / L, and more preferably from 0.5 to 5 g / L.
  • the cellulosic substrate is subjected to at least two (or even only two) successive enzymatic treatment steps (in series, advantageously separated by a rinsing step).
  • polypeptide (s) used during each of these enzymatic treatment steps are identical or different; conditions (including the ratio enzyme / substrate) are the same or different between these successive steps.
  • tests for the cleavage of cellulose by a polypeptide according to the invention can be carried out according to the following protocol:
  • a cleavage test can be carried out in a volume of 300 m ⁇ of liquid containing 4.4 mM of LPMO enzyme and 1 mM of ascorbate and 0.1% (weight / volume) of cellulose powder swollen with phosphoric acid (PASC phosphoric acid-swoller cellulose - prepared as described in Wood TM, Methods Enzym 1988, 160: 19-25) in 50 mM of sodium acetate buffer at pH 4.8 or 5 mM of cello-oligosaccharides ( Megazyme, Wicklow, Ireland) in 10 mM sodium acetate buffer at pH 4.8.
  • PASC phosphoric acid-swoller cellulose - prepared as described in Wood TM, Methods Enzym 1988, 160: 19-25 in 50 mM of sodium acetate buffer at pH 4.8 or 5 mM of cello-oligosaccharides ( Megazyme, Wicklow, Ireland) in 10 mM sodium acetate buffer at pH 4.8.
  • the enzymatic reaction can be carried out in a 2 ml tube incubated in a thermomixer (Eppendorf, Montesson, France) at 50 ° C and 580 rpm (rotation per minute).
  • the fibers are brought into contact with enzymes (at a concentration between 1 and 5 g / L and according to enzyme / cellulose ratios of 1: 50, 1: 100, 1: 500 and 1: 1000) and ascorbate (2 mM) then subjected to gentle stirring for 48 hours at 40 ° C.
  • enzymes at a concentration between 1 and 5 g / L and according to enzyme / cellulose ratios of 1: 50, 1: 100, 1: 500 and 1: 1000
  • ascorbate 2 mM
  • the sample After 16 h of incubation, the sample is brought to 100 ° C for 10 minutes in order to stop the enzymatic reaction, then centrifuged at 16,000 revolutions per minute (rpm) for 15 minutes at 4 ° C in order to separate the solution fraction. of the remaining insoluble fraction.
  • the treated fibers are then subjected to a mechanical action with a homogenizer-disperser (Ultra-Turrax power 500 W, maximum speed for 3 minutes), followed by ultrasonic treatment for 3 minutes.
  • a homogenizer-disperser Ultra-Turrax power 500 W, maximum speed for 3 minutes
  • said processes are characterized in that the cellulose fibers obtained at the end of the process are cellulose nanofibrils.
  • said methods are characterized in that the electron donor is chosen from ascorbate, gallate, catechol, reduced glutathione, lignin fragments and fungal carbohydrate dehydrogenases; and preferably ascorbate.
  • said processes are characterized in that the cellulosic substrate is obtained from wood, a fibrous plant rich in cellulose, beetroot, citrus fruits, annual straw plants, animals marine, algae, fungus or bacteria.
  • said processes are characterized in that the cellulosic substrate is chosen from chemical pulp, preferably pulp from chemical wood, more preferably at least one of the following pulp: pulps bleached, semi-bleached pasta, unbleached pasta, bisulfite pasta, sulphate pasta, soda pasta, kraft pasta.
  • said processes are characterized in that the cellulosic substrate is a paper pulp derived from wood, annual plants or fiber plants.
  • said methods are characterized, in that said at least one step of mechanical treatment comprises at least one of the following mechanical treatments:
  • said methods are characterized in that, following said mechanical treatment step, said method comprises a post treatment step chosen from: an acid treatment, an enzymatic treatment, an oxidation, an acetylation, a silylation, or else a derivatization of chemical groups carried by said cellulose fibers.
  • the invention relates to cellulose fibers resulting from a defibrillation process and / or from a process for manufacturing cellulose fibers as defined above.
  • Said cellulose fibers can be characterized in that said cellulose fibers, preferably nanocellulose fibers, contain glucose cycles of which at least one carbon atom is oxidized in position (s) Ci and / or C 4 , or also also CY ,. According to a preferred embodiment, the cellulose fibers are cellulose nanofibrils.
  • the cellulosic substrate brought into contact with said enzyme is then subjected to at least one mechanical treatment step which is intended to delaminate the cellulose fibers in order to obtain the nanocelluloses.
  • Delamination also called “fibrillation” or “defibrillation” consists in separating, by a mechanical phenomenon, the cellulose fibers within the cellulosic substrate, in particular for the manufacture of nanocelluloses.
  • the oxidative cleavage of the cellulose fibers facilitates the delamination of these cellulose fibers during the mechanical treatment step.
  • This step of mechanical delamination of the cellulose fibers can then be carried out under less drastic conditions and therefore less costly in energy.
  • a mechanical treatment can be chosen from mechanical treatments for homogenization, micro-fluidization, abrasion, or cryogrinding.
  • the homogenization treatment involves passing the pretreated cellulosic substrate, typically a cellulose pulp or a liquid cellulose suspension, through a narrow space under high pressure (as described for example in US Pat. No. 4,486,743).
  • This homogenization treatment is preferably carried out by means of a Gaulin-type homogenizer.
  • the pretreated cellulosic substrate typically in the form of a cellulose suspension
  • the pretreated cellulosic substrate is pumped at high pressure and distributed through an automatic valve with a small orifice.
  • a rapid succession of valve openings and closings subjects the fibers to a significant pressure drop (generally at least 20 MPa) and to a shearing action at high speed followed by a deceleration impact at high speed.
  • the passage of the substrate through the orifice is repeated (generally 8 to 10 times) until the cellulose suspension becomes stable.
  • cooling water is generally used.
  • This homogenization treatment can also be implemented using a device of the micro fluidizer type (see for example Sisqueira et al. Polymer 2010 2 (4): 728-65).
  • the cellulose suspension passes through a fine chamber typically in the form of a "z" (the dimensions of the channel of which are generally between 200 and 400 ⁇ m) under high pressure (approximately 2070 bars).
  • the high shear rate which is applied (generally greater than l0 7 .s _1 ) makes it possible to obtain very fine nanofibrils.
  • a variable number of passages for example from 2 to 30, in particular from 10 to 30 or from 5 to 25, and in particular from 5 to 20
  • chambers of different sizes can be used, to increase the degree of fibrillation.
  • the abrasion or grinding treatment (see for example Iwamoto Set al., 2007 Applied Physics A89 (2): 46l-66) is based on the use of a grinding device capable of exerting shear forces provided by grinding stones.
  • the pretreated cellulosic substrate generally in the form of a cellulose pulp, is passed between a static grinding stone and a rotating grinding stone, typically at a speed of the order of 1500 rotations per minute (rpm). Several passages (generally between 2 and 5) may be necessary to obtain nanometric-sized fibrils.
  • a mixer type device (for example as described in Unetani K et al., B io macro molecules 2011, 12 (2), pp. 348-53) can also be used to produce microfibrils from the pretreated cellulosic substrate, for example from a suspension of wood fibers.
  • the cryogenic grinding treatment (Dufresne et al., 1997, Journal of Applied Polymer Science, 64 (6): 1185-94) consists in grinding a suspension of pretreated cellulosic substrate previously frozen with liquid nitrogen. The ice crystals formed inside the cells explode cell membranes and release wall fragments. These processes are generally used for the production of cellulose microfibrils from agricultural products, or residues.
  • the defibrillation and / or manufacturing process of cellulose fibers comprises at least one step of post-treatment of the cellulosic substrate, implemented after said substrate has been subjected to mechanical treatment.
  • said at least one post-treatment step aims to increase the degree of fibrillation of the celluloses (in particular nanocelluloses) obtained and / or to confer on said nanocelluloses new mechanical properties, depending on the applications envisaged.
  • Said at least one post-treatment step can in particular be chosen from an acid treatment, an enzymatic treatment, an oxidation, an acetylation, a silylation, or even a derivatization of certain chemical groups carried by the microfibrils.
  • Example 1 Fungal strains and culture conditions
  • the Aspergillus japonicus strain used in this study is maintained in the collection of the International Center for Microbial Resources - Filamentous Mushrooms (CIRM-CF, INRA, Marseille, France) under the accession number CIRM BRFM. It was cultured on MYA2 agar medium, containing 20 g / l of malt extract, 20 g / l of agar and 1 g / l of yeast extract. The spores were harvested and stored at -80 ° C in 20% glycerol and 80% water.
  • Liquid culture media containing an autoclaved fraction of corn bran or beet pulp (supplied by ARD, Pomacle, Lrance) as carbon source and protein secretory inducer were prepared as follows: 15 g / l of inductor; 2.5 g / l maltose; 1.84 g / l of ammonium tartrate as a source of nitrogen; 0.5 g / l yeast extract; 0.2 g / L KH2PO4; 0.0132 g / L of CaCl2.2H20 and 0.5 g / L of MgSO4.7H20.
  • Another inducing medium was prepared using 4 g / l of Avicel (Sigma-Aldrich, USA); 10 g / l xylose; 1.8 g / l of ammonium tartrate; 0.5 g / l yeast extract; 0.2 g / l KH2PO4; 0.0132 g / L of CaCl2.2H20 and 0.5 g / L of MgSO4.7H20.
  • the three culture media were inoculated with 2 ⁇ 10 5 spores / ml of the five strains, and incubated in baffled flasks in the dark at 30 ° C. with rotary shaking at 105 rpm (Infors HT, Switzerland).
  • the secretomes were stored at -20 ° C, and their total protein concentration was evaluated by the methods of Bradford (Bio-Rad Protein Assay, Ivry, Lrance) and BCA (Bicinchoninic Acid Protein Assay, Sigma-Aldrich) in using a standard range of bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the selected protein sequences from which the predicted sequences of the native signal peptides were removed, were used to generate coding nucleotide sequences optimized for expression in P. pastoris.
  • the complete synthesis of the genes was carried out (Genewiz, USA) and they were cloned into the expression vector pPICZaA (Invitrogen), so as to be in phase with the signal sequence used (that of the y factor a) and with the sequence coding for the C-terminal poly-histidine label.
  • the plasmids were amplified via a transformation of DH5a competent cells of Escherichia coli, then purified using a HiSpeed Plasmid Midi kit (Qiagen, The Netherlands), linearized by the restriction enzyme Pme I and transformed into Pichia pastoris X-33 cells (Invitrogen) by electroporation.
  • the transformants were isolated on an agar medium containing zeocin (100 and 500 mg / L).
  • the transformants with the best secretion rate were cultured in 2 L of BMGY medium containing 1 mL / L of PTM4 salts (. Pichia Trace Minerais 4), 0.2 g / L of biotin in flasks at 30 ° C and 250 rpm for approximately 16 h, until reaching an optical density at 600 nm of between 2 and 6.
  • the expression of the proteins was induced by incubating the cells in 400 ml of BMMY medium containing 1 mL / L of PTM4 salts at 20 ° C and 200 rpm for 3 days, during which medium was supplemented with 3% methanol (vol / vol) each day.
  • the supernatants were collected by centrifugation (4000xg, 4 ° C, 10 min) and filtered through 0.45 ⁇ m membranes (Millipore) to remove the remaining cells.
  • a His-Bind Resin chelated nickel column (1.9 cm3; GE Healthcare, UK) was connected to an ⁇ kta FPLC device (GE Healthcare) and equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 50 mM NaCl and 10 mM imidazole. After adjusting the pH to 7.8, the supernatants were loaded onto the column at 4 ° C.
  • the column was washed with equilibration buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.8, 50 mM NaCl, 10 mM imidazole) and the enzymes were eluted with the same buffer containing 150 mM imidazole.
  • the eluates were concentrated using Amicon centrifugation units (cutoff threshold 10 kDa; Millipore) at 4000 ⁇ g and washed several times with 50 mM sodium acetate buffer (pH 5).
  • Example 4 Tests of degradation of the cellulose in the presence of polypeptides according to the invention:
  • the degradation tests of the cellulose by the polypeptides with polysaccharide oxidase activity were carried out in triplicates, in a volume of 300 pL containing 1% (m / v) of Avicel (Sigma-Aldrich) or PASC (Phosphoric Acid Swollen Cellulose), prepared from Avicel according to the method described by Wood ("Preparation of crystalline, amorphous, and dyed cellulase substrates. In Methods in Enzymology, (Academie Press), pp. 19-25) in 50 mM phosphate buffer pH 6.
  • the LPMOs 0.5 to 5 mM
  • the electron donor L-cysteine or ascorbate, 10 mM to 1 mM
  • H 2 O 2 100 mM
  • the reaction was stopped by scalding the samples at 100 ° C for at least 10 min, then they were centrifuged at 15000xg for 5 min to separate the soluble products from the insoluble fraction.
  • a reaction mixture with a total volume of 800 pL containing 1% (m / v) of nanofibrils of cellulose in 50 mM acetate buffer pH 5.2, as well as 8 ⁇ g of LPMO and 1 mM of ascorbate was incubated in a thermomixer (Eppendorf) at 50 ° C. and 850 rpm, for 16 h.
  • the samples (in triplicate) were scalded at 100 ° C for at least 10 min, then centrifuged at 15000xg for 5 min.
  • the mono and oligosaccharides resulting from the degradation of the cellulose substrates were detected by HPAEC-PAD (Dionex, Thermo Lisher Scientif ⁇ c), according to the method described by Westereng et al. (2013), using non-oxidized cello-oligosaccharides (DP2 to DP6) as standards (Megazyme, Ireland).
  • the pre-treated wheat straw, miscanthus and poplar were obtained from ILP Energys organisms (Rueil-Malmaison, Lrance).
  • the biomass was pretreated by steam explosion under acidic conditions, washed with hot water to remove the free products, and dried at 55 ° C. After one week at room temperature, they were crushed and sieved in order to retain only the particles of size less than 0.8 mm, and their water content (% m / m) was determined by drying at 105 ° C. natural convection oven (VWR, USA).
  • the so-called “K975” cocktail consists of the secretome of the CL847 strain of Trichoderma reesei, produced in the presence of lactose according to the protocol detailed in Herpo ⁇ l-Gimbert et al. (Comparative secretome analyzes oftwo Trichoderma reesei RUT- C30 and CL847 hypersecretory strains, Biotechnology for Bio fuels 2008, 1: 18), and whose specific b-glucosidase activity is 0.8 IU / mg. ) li was supplemented by a commercial cocktail of Aspergillus niger SP 188 b-glucosidases (Novozyme, Denmark).
  • the enzymatic hydrolysis in 2 ml tubes were carried out in triplicates in a reaction volume of 1 ml, in the presence of wheat straw, miscanthus or poplar (50 mg of dry biomass), in 50 mM sodium acetate buffer ( pH 4.8) to which chloramphenicol (0.1 g / F) has been added to avoid microbial contamination. This mixture was incubated for at least 1 hour at 45 ° C.
  • the K975 cocktail was added at a rate of 5 mg / g of dry matter (DM), and the cocktail SP 188 in amounts making it possible to obtain a total b-glucosidase activity of 80 IU / g DM.
  • the miniaturized enzymatic hydrolyses were carried out in 96-well microplates, in which 100 pF of 6.3% (w / v) biomass suspension were distributed in 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.8) in the presence chloramphenicol (0.1 g / L). During the distribution, the biomass suspension was removed using a multichannel pipette in a beaker with constant magnetic stirring, then the plates were sealed and stored at -20 ° C.
  • the enzymes were distributed using a Tecan Genesis Evo 200 robot (Tecan, Lyon, France): the K975 and SP 188 cocktails were distributed in the quantities indicated above, in a volume 15 pF, then 10 pL of diluted 10x secretomes were added (or 10 pL of buffer under reference conditions, present on each plate).
  • Each test was carried out in septuplicates, to which is added a control well containing the enzymes alone (without biomass); a column of each plate was devoted to the control conditions containing the biomass alone (without enzymes).
  • the sealed plates were incubated at 45 ° C with rotary shaking at 850 rpm (Infors), for 24 to 96 hours.
  • the corresponding plates were centrifuged after adding 120 ⁇ L of buffer, then the supernatant was filtered and stored at -20 ° C.
  • the glucose concentration in the samples was measured using the Glucose GOD-PAP reagent (Biolabo, Maizy, France) using a standard range of glucose, and yields were calculated taking into account the amount of cellulosic glucose initially present.
  • Glucose GOD-PAP reagent Biolabo, Maizy, France
  • yields obtained in the presence of secretomes were translated into percentage improvement compared to the internal reference of each hydrolysis.
  • a Student's t-test was performed for each condition to determine if the mean of the results was statistically different from the mean of the references, using the value of the p-value as a criterion.
  • the T. reesei cellulolytic cocktail used comes from the strain CL847, cultivated in the presence of lactose; this having a fairly weak b-glucosidase activity, a commercial preparation of A. b-glucosidases. niger (SP188, Novozyme) has been added in excess, to ensure that potential performance improvements during supplementation are not due to a simple increase in b-glucosidase activity.
  • This reference cocktail was used to carry out the hydrolysis of the three selected biomasses, with a relatively high biomass concentration (5% m / v) in order to approach realistic conditions from the point of view of the process, and a dose of weak enzyme (5 mg / g of dry matter), corresponding for industry to conditions making it possible to reduce costs, and for which the margin for improvement of the hydrolysis yields is high.
  • the reference cocktail was then supplemented with the different Aspergillus secretomes.
  • Aspergillus secretomes were added, according to the protocol established in Berrin et al. ("Exploring the Natural Fungal Biodiversity of Tropical and Temperate Forests toward improvement of Biomass Conversion. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6483-6490, 2012).
  • the amount of protein added is not the same in all the samples, but it reflects the initial proportions of proteins secreted by the fungal strains on each culture medium.
  • the saccharification tests were miniaturized in microplates and automated using a Tecan robot, according to a method already developed in Navarro et al. ("Automated assay for screening the enzymatic release of reducing sugars from micronized biomass. Microb. Cell Factories 9, 58, 2010).
  • the biomass is finely ground and a sufficiently homogeneous suspension is produced to be able to be pipetted into microplates, before adding a reference cocktail and various secretomes.
  • Each test has 7 replicates. Data from three series of hydrolysis (one in tubes and two in microplates) were statistically processed using a Student test.
  • Example 8 Saccharification tests of biomass in the presence of polypeptides with polysaccharide oxidase activity:
  • the tests for supplementing the T. reesei cocktail with the polypeptides for the saccharification of miscanthus were carried out in triplicates according to the enzymatic hydrolysis method described above, using 5 mg of biomass, 1 mg / g DM of cocktail K975 and 80 IU / g MS of b-glucosidase provided by the cocktail SP 188, for 24 h at 45 ° C and 850 rpm.
  • treatment with LPMO (2.2 mM) in the presence of 1 mM ascorbate was carried out for 24 hours before the start of hydrolysis; in the other part, the LPMO and ascorbate were added at the beginning of the hydrolysis, together with the cellulolytic cocktail.
  • the polypeptides were not added. After 24 h, the reaction was stopped and the glucose concentration in the samples was measured using the reagent Glucose GOD-POD (Biolabo).
  • Example 9 Selection and Production of Fungal Proteins of Interest
  • the yeast Pichia pastoris using synthetic genes placed in a vector.
  • Several versions of the Aspergillus aculeatus sequence have been expressed (with the X273 N-terminal module alone, with a truncated C-terminal extension, and with the full C-terminal extension), as well as a similar protein comprising an extension Very short C-terminal, found in Podospora anserina (PaX273).
  • each of the constructs tested begins with a signal peptide, followed by the n-terminal histidine involved in the catalytic triad, and ends at a variable terminal position.
  • the reference polypeptide sequence is SEQ ID No. 2.
  • the reference polypeptide sequence is SEQ ID No. 1.
  • Table 2 Polypeptide sequences chosen for expression in Pichia pastoris.
  • SEQ ID N ° 1 and 2 In addition to SEQ ID N ° 1 and 2, one thus arrives at a refined list of loan of 379 polypeptide sequences (SEQ ID N ° 7 to 383), coming from fungal organisms, and mainly ascomycetes: 335 sequences, against 41 coming of basidiomycetes and 3 of unclassified fungi.
  • the consensus amino acids are represented graphically in FIG. 3, after alignment of the 378 catalytic modules corresponding to the protein sequences SEQ ID Nos. 1, 2 and 7 to 382.
  • the figure is generated by the WebLogo application, according to Crooks et al. (WebLogo: A Sequence Logo Generator. Genome Res. 14, 1188-1190; 2004).
  • the alignment of the sequences corresponding to the X273 module reveals several regions that are well conserved within the family. All the sequences include in particular an N-terminal histidine, as well as a second strictly conserved histidine, which is a characteristic of the active center (“Histidine brace”) of all the LPMOs characterized so far. There are around 20 other strictly preserved residues, including 6 cysteines potentially involved in the formation of disulfide bridges.
  • most of the proteins on the list have a C-terminal extension, more or less long depending on the species. For 7 of them, found in 4 different organisms, this extension includes a cellulose binding module (CBM1).
  • CBM1 cellulose binding module
  • the two secretomes containing X273 having shown an improvement in hydrolysis on the pretreated miscanthus, it is this biomass which was chosen to carry out the saccharification tests. In order to facilitate homogenization, a lower proportion of biomass was used than previously (0.5% m / v), and the dose of enzyme of the reference cocktail was also reduced (1 mg / g of dry matter ). A dose of X273 of 0.2 mg / g of dry matter was added. Two types of hydrolysis were carried out:
  • Example 11 Pre-treatment of PASC cellulosic substrate in the presence of a selection of enzymes belonging to the X273 family.
  • sequence SEQ ID No. 2 improves the accessibility of cellulose to cellulases, by compared to a simple PASC treatment, by improving the cellobiose released after treatment with a T. reesei cellulase (synergistic effect).
  • sequence SEQ ID No 383 has at least 40% of sequence identity with SEQ ID No 1 and SEQ ID No 2.

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Abstract

La présente invention concerne, de manière générale, les enzymes à activité polysaccharide oxydases. En particulier, l'invention concerne le domaine de la production d'éthanol de deuxième génération par oxydation et hydrolyse enzymatique de matériaux contenant des polysaccharides, et notamment la biomasse lignocellulosique. Aussi, l'invention concerne le domaine des celluloses, ainsi que des procédés pour la fabrication de fibres de celluloses et de défibrillation de substrats cellulosiques.

Description

TITRE DE L’INVENTION
Polypeptides et compositions à activité polysaccharide oxydase lytique.
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne, de manière générale, les enzymes à activité polysaccharide oxydases. En particulier, l’invention concerne le domaine de la production d’éthanol de deuxième génération par oxydation et hydrolyse enzymatique de matériaux contenant des polysaccharides, et notamment la biomasse lignocellulosique.
Aussi, l’invention concerne le domaine des celluloses, ainsi que des procédés pour la fabrication de fibres de celluloses et de défibrillation de substrats cellulosiques.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
La biomasse lignocellulosique est un substrat polysaccharidique et une source renouvelable pour la production de biocarburants et de molécules plateformes pour l’industrie. Sa conversion en produits d’intérêts, tels que les saccharides et les fibres de cellulose, requiert l’action combinée d’enzymes, pour la plupart d’origine fongique.
Compte tenu de la complexité et de la récalcitrance de la biomasse lignocellulosique, sa dégradation est un des verrous dans le développement d’un procédé de bioéthanol 2G économiquement viable.
Pour dégrader ce type de substrat polysaccharidique, composé essentiellement de cellulose, hémicelluloses et de lignine, les microorganismes cellulolytiques produisent généralement des mélanges enzymatiques contenant des cellulases, hémicellulases, pectinases et des enzymes ligno lytiques. Une action concertée des différentes enzymes est nécessaire pour une dégradation optimale de la lignocellulose. La dégradation de la cellulose nécessite notamment l'action coordonnée et synergique de différents types d’enzymes. Plus particulièrement, convertir efficacement de la cellulose en petites molécules nécessite l'action synergique des cellulases, c'est-à-dire des endoglucanases (EG), des cellobiohydrolases (CBH) et des B-glucosidases. Les EG clivent les liaisons b- 1 ,4 au hasard dans les chaînes cellulosiques, libérant ainsi de nouvelles terminaisons pour l'action des cellobiohydrolases (CBH) qui à leur tour libèrent des unités de cellobiose. Les b-glucosidases produisent des molécules de glucose à partir du cellobiose, atténuant ainsi l'effet inhibiteur du cellobiose sur la CBH.
Toutes les enzymes avec activités sur carbohydrates sont répertoriées dans la base de données CAZy (Carbohydrate Active enzymes, Lombard et al, 2014), en classes (en fonction de leur mode d’action) et en familles en fonction de leur séquence et de paramètres structuraux, qui déterminent aussi les propriétés enzymatiques.
Par exemple, les enzymes hydrolytiques se trouvent dans la classe des glycoside hydrolases (GH), et les cellulases notamment dans les familles GH5, GH6, GH7, GH 12, GH45 et GH48.
Aussi, des effets synergiques ont été montrés pour des enzymes à activité oxydative agissant sur la cellulose. Les premiers représentants de cette famille, les « Lytic Polysaccharide Monooxy gênas es » (LPMO) ont été isolés des champignons filamenteux Thielavia terrestris et Thermoascus aurantiacus (Harris et al. ; « Stimulation of Lignocellulosic Biomass Hydrolysis by Proteins of Glycoside Hydrolase Family 61 : Structure and Function of a large, Enigmatic Family ; Biochemistry (Moscl.) 49, 3305- 3316 ; 2010). Elles oxydent les liaisons glycosidiques des chaînes de polysaccharides en libérant des acides aldoniques, et augmentent ainsi l’accessibilité du substrat pour les enzymes hydrolytiques.
Ces monooxygénases (LPMO) sont classées parmi les enzymes à activité auxiliaire (AA) (Levasseur et al., 2014) au sein des familles AA9, AA10, AA11, AA13, AA14 et AA15. Les LPMO avec activité sur cellulose appartiennent à la famille AA9. Mais d’autres familles de monooxygénases ont été découvertes : la famille AA10 regroupe des enzymes bactériennes analogues aux AA9, les membres de la famille AA11 ont une activité sur la chitine, ceux de la famille AA 13 agissent sur l’amidon, ceux de la famille AA14 agissent sur le xylane et ceux de la famille AA15 sur celllulose et chitine.
Un producteur d’enzymes fréquemment employé en industrie est le champignon Trichoderma reesei qui est capable de produire des grandes quantités d’enzymes. Notamment, le cocktail d’enzymes dit « K975 » représente une faible diversité d’enzymes et n’est pas suffisamment efficace. En comparant le génome de T. reesei à d’autres génomes issus d’espèces proches, on constate effectivement que T. reesei possède à la fois moins de gènes impliqués dans la dégradation des carbohydrates de la paroi végétale et que les enzymes sont moins diversifiées.
Des nombreux travaux de recherche ont donc visé à supplémenter ce mélange par des enzymes ayant une plus importante activité spécifique ou une activité complémentaire au répertoire présent dans T. reesei, ce qui permettrait de diminuer la dose d’enzymes à mettre en œuvre.
Il a ainsi été montré qu’un cocktail enzymatique de T. reesei contenant 7 % de la protéine AA9 (LPMO) de T. aurantiacus était capable d’hydrolyser 90 % de la cellulose à 4 mg de protéine par gramme de cellulose, permettant de réduire la quantité d’enzymes nécessaire d’un facteur 2. D’autres membres de la famille AA9 ont été identifiés chez plusieurs espèces fongiques, notamment chez Podospora anserina, Myceliophthora thermophila ou Phanerochaete chrysosporium.
WO 2018/050300 enseigne l’identification de LPMOs, et leur mise en oeuvre dans un procédé de production de sucres à partir de biomasse lignocellulosique.
WO 2016/193617 enseigne des procédés de fabrication de nanocelluloses, comprenant une étape de traitement enzymatique du dit substrat par une enzyme de clivage appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs), aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de celluloses.
Malgré les nouvelles stratégies de prétraitement, les coûts de production des nanocelluloses restent élevés, les rendements incertains, et la qualité et les propriétés sont variables.
Il subsiste ainsi un besoin d’identifier de nouvelles familles enzymatiques pour le traitement de ces substrats polysaccharidiques, et notamment la biomasse lignocellulosique. En particulier, il subsiste un besoin d’identifier des familles d’enzymes capables, seules ou en combinaison avec le dit cocktail de T. reesei, d’améliorer le rendement d’hydrolyse enzymatique.
Par exemple, il subsiste un besoin de familles enzymatiques capables d’hydrolyser des biomasses récalcitrantes telles que le miscanthus et/ou le peuplier.
Il subsiste également un besoin de familles enzymatiques permettant d’améliorer les procédés existants d’obtention sucres et/ou de fibres de cellulose à partir de substrats polysaccharidiques tels que les biomasses lignocellulosiques.
L’invention a pour objet de répondre à ces besoins. RESUME DE L’INVENTION
Selon un premier objet, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
En particulier, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 80% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Tout particulièrement, le dit polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase peut être caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence choisie parmi SEQ ID N°5 à SEQ ID N°382 et SEQ ID N°383.
Selon un second objet, l’invention concerne une composition à activité polysaccharide-oxydase, caractérisée en ce qu’elle comprend un polypeptide à activité polysaccharide oxydase tel que défini ci-dessus.
En particulier, la dite composition peut être caractérisée en ce qu’elle comprend en outre au moins un polypeptide à activité polysaccharide-dégradase choisi parmi : une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une carbohydrate oxydase.
La dite composition à activité polysaccharide oxydase peut être caractérisée en ce qu’elle est susceptible d’être obtenue à partir d’un ou plusieurs organismes de type champignon ou levure, notamment choisis parmi les genres : Achlya, Acremonium, Aspergillus, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Endothia, Fusarium, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Pénicillium, Pyricularia, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Podospora, Pycnoporus, Fusarium, Thermonospora tout particulièrement Aspergillus ou Trichoderma ou Podospora; préférentiellement Aspergillus ou Podospora.
La dite composition à activité polysaccharide-oxydase peut être caractérisée en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase est obtenu de façon recombinante. Selon un troisième mode de réalisation, l’invention concerne un kit comprenant au moins :
- une première partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase tel que défini ci-dessus, ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase;
- une seconde partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharide-dégradase choisi parmi une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une carbohydrate oxydase, ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-dégradase.
Selon un quatrième mode de réalisation, l’invention concerne un hôte apte à exprimer de manière recombinante un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase tel que défini ci-dessus. Le dit hôte peut être notamment une levure, une bactérie ou un champignon.
Selon un cinquième mode de réalisation, l’invention concerne un acide nucléique isolé codant pour un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase tel que défini ci-dessus.
Selon un sixième mode de réalisation, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique, comprenant au moins une étape de mise en contact du dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide- oxydase tel que défini ci-dessus, ou d’une composition à activité polysaccharide-oxydase comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase. De préférence, le dit substrat est un substrat lignocellulosique.
En particulier, l’invention concerne un procédé de production d’alcool à partir d’un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu’il comprend l’obtention d’un sucre par un procédé d’obtention d’un sucre tel que défini ci-dessus, et la fermentation alcoolique dudit sucre par un microorganisme alcooligène. Selon un septième mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de préparation d’un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, le dit substrat avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Selon un huitième mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de défibrillation d’un substrat cellulosique, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose, lequel a été préalablement mis en contact avec un donneur d’électrons et un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d’un donneur d’électron; et
b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de défïbriller le dit substrat,
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Selon un neuvième mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à:
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, ledit substrat cellulosique avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer lesdites fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique,
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Selon un dixième mode de réalisation, l’invention concerne des fibres de celluloses issues d’un procédé de défibrillation et/ou d’un procédé de fabrication de fibres de cellulose tel(s) que défini(s) ci-dessus.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1: Suivi au cours du temps du rendement d’hydrolyse avec le cocktail de T. reeser, sur trois biomasses prétraitée. Les barres d’erreur représentent G écart-type calculé sur 3 réplicats. En ordonnée : rendement d’hydrolyse sur trois biomasses prétraitée A. Sur paille ; B. Sur miscanthus ; C. Sur peuplier (exprimées en pourcentage par rapport à la cellulose disponible dans le substrat initial). En abscisse : le temps en heure à partir du temps 0 d’hydrolyse. Courbe A. Sur paille : Augmentation du rendement d’hydrolyse jusqu’à une valeur de 90% à Temps (h) 140. Courbe B. Sur Peuplier : Augmentation du rendement d’hydrolyse jusqu’à une valeur de 60% à Temps (h) 140. Courbe C. Sur miscanthus : Augmentation du rendement d’hydrolyse jusqu’à une valeur de 50% à Temps (h) 140.
Figure 2A-2C: Modification du rendement d’hydrolyse en présence de sécrétomes issus de la souche CIRM-BRFM 1490 d "’Aspergillus japonicus, par rapport au rendement d’hydrolyse en présence du cocktail de référence seul. A. Sur paille B. Sur miscanthus C. Sur peuplier. Les moyennes ont été calculées sur 7 à 15 réplicats par point (les * signalent les moyennes pour lesquelles le test de Student par rapport à la référence donne une p-value < 0.05). En ordonnée : Amélioration du rendement d’hydrolyse dont les valeurs sont caractérisées de -15% à 15%. En abscisse : les différents sécrétomes de la souche CIRM-BRMF 1490, selon les substrats sur lesquels ils ont été produit (ASM : autoclavat de son de maïs, SBP : pulpe de betterave, Avicel), testés en supplémentation du cocktail de référence sur une des trois biomasses à 24, 48 ou 96h d’hydrolyse. A. Sur paille : Les boites les plus claires illustrent les performances des sécrétomes sur la paille à 24h (à gauche de chaque entrée) et les boites les plus foncées les performances des sécrétomes sur la paille à 48h (à droite de chaque entrée). B. Sur miscanthus : Les boites les plus claires (à gauche) illustrent les performances des sécrétomes sur miscanthus à 24h et les boites les plus foncées (à droite) les performances des sécrétomes sur miscanthus à 96h. C. Sur peuplier : Les boites les plus claires (à gauche) illustrent les performances des sécrétomes sur peuplier à 24h et les boites les plus foncées (à droite) les performances des sécrétomes sur peuplier à 96h.
Figure 3 : conservation du module catalytique et séquence consensus. Représentation graphique des acides aminés consensus lors de l’alignement de 378 modules X273, générée en utilisant l’application WebLogo (Crooks et al., 2004). En ordonnée, unité de conservation de séquence exprimée en bits. En abscisse, position dans la séquence consensus référence du module. La taille des acides aminés est représentée en fonction de la fréquence observée, telle que défini selon l’algorithme précisé dans Crooks et al. (2004).
Figure 4: Synergie des X273 avec CBHI pour la libération de cellobiose à partir de nanofibrilles de cellulose. Les enzymes AaX273 et PaX273 (8 pg) ont réagi avec un mélange de nano fibrilles de cellulose (NFC) à 0,1% pendant l6h en présence d’ascorbate (lmM), puis les NFC ont été lavées et hydrolysées par la cellulase CBHI de T. reesei (0,8 pg) pendant 30 minutes. En ordonnée : Aire des pics de cellobiose (en nC.min). En abscisse : ( à gauche) cellulase CBHI en présence de NFC, contrôle {au centre ) cellulase CBHI supplémentée d’enzyme à activité polysaccharide-oxydase issue de Aspergillus aculeatus (référencée AaX273 . ( à droite ) cellulase CBHI supplémentée d’enzyme à activité polysaccharide-oxydase issue de Podospora anserina (référencée PaX273 . La marge d’erreur représente l’écart type.
Figure 5: Concentration de glucose libéré après 24h d’hydrolyse du miscanthus par le cocktail de référence, avec ou sans ajout de X273. Le test séquentiel : les X273 (2,2 mM) ont agi pendant 24h, puis le cocktail K975+SP188 (lmg/g MS) a été ajouté pendant 24h. Le test simultané : les X273 et le cocktail K975+SP188 ont été ajouté ensemble pour 24h. Les barres d’erreur représentent l’écart-type calculé sur 3 réplicas. En ordonnée : concentration de glucose libéré (en g/L). En abscisse : ( à gauche) substrat miscanthus en présence de cocktail T. reesei, contrôle (au centre ) en présence de cocktail T. reesei supplémenté d’enzyme à activité polysaccharide-oxydase issue de Aspergillus aculeatus (référencée AaX273). ( à droite ) en présence de cocktail T. reesei supplémenté d’enzyme à activité polysaccharide-oxydase issue de Podospora anserina (référencée PaX273). Pour chacune des trois expériences, deux types d’hydrolyse sont effectuées, séquentiel (à gauche) ou simultanée (à droite).
Figure 6 : Amélioration de l’accessibilité de la cellulose par X273, par mesure du cellobiose libéré en présence d’une cellulase de Trichoderma reesei
(CBH1). Le test est réalisé sur PASC ( Phosphoric Acid Swollen Cellulose), traité en l’absence d’enzyme X273 (colonne de gauche), en présence de AaX273 issu de Aspergillus aculeatus (SEQ ID N°2), de AjX273 issu de Aspergillus japonicus (SEQ ID N°383), de P1X273 issu de Pestalotiopsis fîci (SEQ ID N°l75) ou de ApX273 issu de Aureobasidium pullulans (SEQ ID N°208) - de gauche à droite. En ordonnée, la quantité de cellobiose libérée, exprimée en mg/L.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Afin de remédier aux inconvénients précités de l’état de la technique, les inventeurs ont cherché à identifier des sécrétomes d 'Aspergillus capables de supplémenter un cocktail cellulolytique référence issu de T. reesei sur une série de biomasses lignocellulosiques dites récalcitrantes, telles que la paille, le peuplier ou le miscanthus.
Pour ce faire, les inventeurs ont produit des sécrétomes à partir de cultures dans différentes conditions et de plusieurs souches d’Aspergillus, sélectionnées dans la collection CIRM-CF (Centre International de Ressources Microbiennes - Champignons Filamenteux) de l’INRA.
Notamment, des sécrétomes apportant les plus fortes améliorations de rendement d'hydrolyse du miscanthus ont été sélectionnés. Une protéine d’intérêt est apparue durant l’exploration du contenu des sécrétomes, laquelle est présente uniquement dans les sécrétomes capables d’améliorer l’hydrolyse du miscanthus. Celle-ci n’avait pas été reconnue lors de l’annotation CAZy. Cependant, en comparant sa séquence à la base de données de l’outil NCBI BLAST, et en utilisant un serveur de prédiction de structure 3D, il est apparu que cette protéine contient un module présentant des similitudes avec ceux retrouvés dans la famille AA 10, suivi d’une extension C-terminale prédite comme région désordonnée. Après vérification en utilisant les outils CAZy, il a alors été établi que cette protéine n’appartient pas à la famille AA10, mais à une famille encore non caractérisée nommée X273 (référencement interne à CAZy).
De manière surprenante, il a été montré que cette famille d’enzymes présente un comportement de type polysaccharide oxydase (LPMO), lequel se matérialise notamment par la présence d’un ion cuivre au sein de son centre actif et la production d’fUC en présence d’un donneur d’électrons tels que l’acide ascorbique.
Il a aussi été montré que cette famille enzymatique présente, en présence de cellulases, une activité synergique sur la cellulose et tout particulièrement sur les nanofibrilles de celluloses (NCF).
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les inventeurs sont d’avis que la famille X273 (aussi mentionnée dans la description comme polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon l’invention), présente dans les génomes fongiques, est caractérisée par un module catalytique appartenant à une nouvelle famille de LPMO.
Selon l’invention, cette nouvelle famille de LPMOs est donc caractérisée par un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acides aminés d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus ), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
En particulier, selon l’invention, cette nouvelle famille de LPMOs est caractérisée par un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acides aminés d’au moins 40% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus ), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
En particulier, selon l’invention, cette nouvelle famille de LPMOs est caractérisée par un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acides aminés d’au moins 50% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus ), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
En particulier, selon l’invention, cette nouvelle famille de LPMOs est caractérisée par un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acides aminés d’au moins 60% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus ), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
En particulier, selon l’invention, cette nouvelle famille de LPMOs est caractérisée par un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acides aminés d’au moins 70% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
En particulier, selon l’invention, cette nouvelle famille de LPMOs est caractérisée par un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acides aminés d’au moins 80% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
En particulier, selon l’invention, cette nouvelle famille de LPMOs est caractérisée par un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acides aminés d’au moins 90% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus ), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Les deux séquences références SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2 correspondent chacune à la forme entière du polypeptide, incluant (i) un peptide signal en position N- terminale, tel que prédit par le logiciel SignalP 4.1, (ii) le module catalytique incluant une lere histidine en N-terminal, et (iii) une extension C-terminale.
Le module catalytique est responsable de l’activité polysaccharide-oxydase, et est caractérisé par la présence d’un centre actif de type « Histidine brace » également retrouvé dans les enzymes de type LPMO connues, et capable de fixer le cuivre.
Les polypeptides à activité polysaccharide oxydase selon l’invention sont en particulier caractérisés par la présence d’un site actif formé par deux résidus Histidine conservés, l’un des deux résidus Histidine étant généralement à l’extrémité N-terminale du module catalytique.
A ce titre, la présence du peptide signal et de l’extension C-terminale sont optionnelles pour l’obtention d’une activité polysaccharide oxydase.
Pour référence, les séquences SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4 correspondent respectivement aux peptides signal des séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.
Pour référence, les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 correspondent respectivement aux modules catalytiques des séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.
Pour référence, les deux séquences de référence SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2 partagent entre elles 45% d’identité de séquence, avec une E-value de 2e 53.
Pour référence, les deux séquences de référence SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 partagent entre elles 45% d’identité de séquence, avec une E-value de 6e 52.
En particulier, 379 séquences polypeptidiques, toutes d’origine fongique ont été identifiées (recherche réalisée en mai 2018 sur la base de données nr de l'outil NCBI BLAST-P): soit 335 séquences provenant d’ascomycètes, 41 séquences provenant de basidiomycètes et 3 de champignons non classifiés (répertoriées SEQ ID N°7 à 383). Ainsi, selon certains modes de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence choisie parmi SEQ ID N°5 à SEQ ID N°382 et SEQ ID N°383.
Selon un mode de réalisation, un polypeptide isolé à activité polysaccharide- oxydase selon l’invention est apte à se lier à la ceullose, et/ou comprend un module de liaison à la cellulose.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence choisie parmi SEQ ID N°2, 34, 40, 50, 51, 60, 61, 82, 84, 86,
87, 89, 93, 97, 103, 110, 121, 146, 156, 166, 174, 179, 181, 185, 188, 189, 207, 210, 220, 227, 233, 239, 266, 270, 273, 285, 287, 291, 297, 300, 310, 319, 326.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique ayant au moins 20% d’identité avec une séquence référence choisie parmi SEQ ID N°2, 34, 40, 50, 51, 60, 61, 82, 84, 86, 87, 89, 93, 97, 103, 110, 121, 146, 156, 166, 174, 179, 181, 185, 188, 189, 207, 210, 220, 227, 233, 239, 266, 270, 273, 285, 287, 291, 297, 300, 310, 319, 326.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique ayant au moins 40% d’identité avec une séquence référence choisie parmi
SEQ ID N°2, 34, 40, 50, 51, 60, 61, 82, 84, 86, 87, 89, 93, 97, 103, 110, 121, 146, 156, 166, 174, 179, 181, 185, 188, 189, 207, 210, 220, 227, 233, 239, 266, 270, 273, 285, 287, 291, 297, 300, 310, 319, 326.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique ayant au moins 80% d’identité avec une séquence référence choisie parmi
SEQ ID N°2, 34, 40, 50, 51, 60, 61, 82, 84, 86, 87, 89, 93, 97, 103, 110, 121, 146, 156, 166, 174, 179, 181, 185, 188, 189, 207, 210, 220, 227, 233, 239, 266, 270, 273, 285, 287, 291, 297, 300, 310, 319, 326.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique ayant au moins 90% d’identité avec une séquence référence choisie parmi
SEQ ID N°2, 34, 40, 50, 51, 60, 61, 82, 84, 86, 87, 89, 93, 97, 103, 110, 121, 146, 156, 166, 174, 179, 181, 185, 188, 189, 207, 210, 220, 227, 233, 239, 266, 270, 273, 285, 287, 291, 297, 300, 310, 319, 326.
Des modes de réalisation particuliers, mettant en œuvre un polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon l’invention, sont développés ci-après.
Définitions générales
De manière générale, et tout au long du présent texte, les termes de type “ comprendre” ou “ inclure”, ainsi que leurs variations, sont susceptibles d’englober d’autres éléments que ceux explicitement mentionnés. Ces termes peuvent, le cas échéant, être remplacés par“ consister en”. Les articles“un” et Ame” incluent également“plus d’un” ou“ plus d’une”, ce qui inclut“ une pluralité”, ou encore“deux ou plus”.
Par « méthode BLAST-P » (appelée aussi Protein Basic Local Alignement Search Tool method), on entend une méthode d’analyse bien connue pour l’homme du métier. La méthode BLAST-P a notamment été décrite dans Altschul et al. (1990, J Mol Biol, Vol. 215 (n°3) :403-4l0), Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res. Vol. 25:3389- 3402) et Altschul et al. (2005, FEBS J. Vol. 272:5101-5109). La méthode BLAST-P peut être réalisée en utilisant l’outil de NCBI disponible en ligne (adresse internet : http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE= Proteins). Quand la méthode BLAST-P est utilisée dans la présente demande, elle est utilisée de préférence selon les paramètres suivants: (i) Expected threshold : 10; (ii) Word Size : 6; (iii) Max Matches in a Query range : 0; (iv) Matrix : BLOSSUM62; (v) Gap costs : Existence 11, Extension 1; (vi) Compositional Adjustments : Conditional compositional score matrix adjustment, (vii) No filter; (viii) No mask.
Comme cela est bien connu, le score d’un alignement, S, est calculé comme la somme des scores de substitution et de gap. Les scores de substitution sont donnés dans une table (voir PAM, BLOSUM ci-dessous). Les scores de gap sont généralement calculés comme la somme des G, la pénalité d’ouverture d’un gap et L, la pénalité d’extension d’un gap. Pour un gap d’une longueur n, le coût d’un gap serait de G+Ln. Le choix des coûts des gaps, G et L sont empiriques, mais il est habituel de choisir une valeur élevée pour G (10-15) et une faible valeur pour L (1-2). Un alignement optimal signifie l’alignement de deux séquences avec le score le plus haut possible.
Dans le cadre de la présente invention, le « pourcentage d’identité » entre deux polypeptides signifie que le pourcentage d’acides aminés identiques entre les deux séquences polypeptidiques à comparer, obtenu après un alignement optimal, ce pourcentage étant entièrement statistique et les différences entre les deux séquences polypeptidiques étant distribués aléatoirement sur leur longueur. La comparaison de deux séquences polypeptidiques est traditionnellement réalisée en comparant les séquences après les avoir alignées de façon optimale, la dite comparaison doit pouvoir être conduite par segment ou en utilisant une « fenêtre d’alignement ». L’alignement optimal des séquences pour leur comparaison est réalisé en utilisant le software de comparaison BLAST-P.
Dans son principe, le pourcentage d’identité entre deux séquences d’acides aminés est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale au sein desquelles les séquences d’acides nucléiques à comparer peuvent contenir des additions ou délétions par rapport à la séquence de référence de l’alignement optimal entre les deux séquences polypeptidiques. Le pourcentage d’identité est calculé en déterminant le nombre de positions dans lesquelles un acide aminé est identique entre les deux séquences, de préférence entre deux séquences complètes, puis en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre d’alignement et en multipliant le résultat par 100 afin d’obtenir le pourcentage d’identité entre les deux séquences.
Comme il est entendu dans la présente demande, des séquences polypeptidiques ayant au moins 20% d’identité en acides aminés avec une séquence de référence comprennent celles qui ont au moins 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%,
28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%,
43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,
28%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%,
73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,
88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% et 99% d’identité en acides aminés avec ladite séquence de référence. En particulier, on entend par « séquence polypeptidique ayant au moins 20% d’identité », les séquences comprenant au moins 40% d’identité, tout particulièrement au moins 80% d’identité, et préférentiellement au moins 90% d’identité avec une séquence référence ; telle que SEQ ID N°1 ou 2.
Ainsi, selon certains modes de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant au moins 40% d’identité avec une séquence de référence SEQ ID N°5 à SEQ ID N°383.
Ainsi, selon certains modes de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant au moins 50% d’identité avec une séquence de référence SEQ ID N°5 à SEQ ID N°383.
Ainsi, selon certains modes de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant au moins 60% d’identité avec une séquence de référence SEQ ID N°5 à SEQ ID N°383.
Ainsi, selon certains modes de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant au moins 70% d’identité avec une séquence de référence SEQ ID N°5 à SEQ ID N°383.
Ainsi, selon certains modes de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant au moins 80% d’identité avec une séquence de référence SEQ ID N°5 à SEQ ID N°383.
Ainsi, selon certains modes de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant au moins 90% d’identité avec une séquence de référence SEQ ID N°5 à SEQ ID N°383.
De manière similaire, le « pourcentage d’identité » entre deux séquences d’acides nucléiques représente le pourcentage de résidus nucléotidique identiques entre les deux séquences d’acides nucléiques à comparer, obtenus après un alignement optimal, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant distribuées de façon aléatoire sur la longueur des séquences. La comparaison de deux séquences d’acides nucléiques est traditionnellement réalisée en comparant les séquences après les avoir alignées de façon optimale, la dite comparaison pouvant être conduite par segment ou en utilisant une « fenêtre d’alignement ». L’alignement optimal des séquences en vue de leur comparaison est réalisé en utilisant le software de comparaison BLAST-N.
En principe, le pourcentage d’identité entre deux séquences d’acides nucléiques est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale dans lesquelles les séquences d’acides nucléiques à comparer peuvent contenir des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence de l’alignement optimal entre les deux séquences Le pourcentage d’identité est calculé selon le nombre de positions auxquels les résidus nucléotidiques sont identiques entre les deux séquences, de préférence entre les deux séquences complètes, puis en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre d’alignement et en multipliant le résultat par 100 afin d’obtenir le pourcentage d’identité entre les deux séquences.
Comme il est entendu ici, les séquences nucléotidiques ayant au moins 20% d’identité avec la séquence de référence incluent celles ayant au moins least 21%, 22%,
23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%,
38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%,
53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 28%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%,
68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%,
83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98% et 99% d’identité en nucléotides avec la séquence de référence.
En particulier, on entend par « séquence nucléotidique ayant au moins 20% d’identité », les séquences comprenant au moins 40% d’identité, tout particulièrement au moins 80% d’identité, et préférentiellement au moins 90% d’identité avec une séquence référence ; telle que SEQ ID N°1 ou 2.
Les matrices BLOSUM (Blocks Substitution Matrix) sont des matrices de score de substitution dans lesquelles les scores pour chaque position sont dérivés de l’observation de la fréquence de substitution des blocks dans des alignements locaux pour des protéines apparentées. Chaque matrice est dessinée pour une distance d’évolution particulière. Dans la matrice BLOSUM62, par exemple, l’alignement à partir duquel les scores ont été dérivés a été créé à partir de séquences ne partageant pas plus de 62% d’identité. Les séquences qui possèdent plus de 62% d’identité sont représentées par une séquence unique dans l’alignement afin de ne pas surreprésenter des membres proches d’une même famille.
Comme utilisé ici, une E-valeur (aussi appelé Expect Value ou e-value) est un paramètre calculé quand la méthode BLAST-P est utilisée, le dit paramètre représentant le nombre d’alignements différents avec des scores équivalents ou avec meilleur que S dont l’apparition est attendue lors d’une recherche dans la base de données par hasard. Ainsi, plus la E-valeur (ou « E-value ») sera basse, et plus le score et l’alignement seront significatifs.
Ainsi, une e-value de le 18 ou moins englobe les e- values de le 20 ou moins, le 25 ou moins, le 30 ou moins, le 40 ou moins, 1 e 50 ou moins, 1 e 60 ou moins, 1 e 70 ou moins, 1 e 80 ou moins, 1 e 90 ou moins et 1 e 100 ou moins.
Par « substrat cellulosique » ou « substrat lignocellulosique », on entend en toute matière de la biomasse (englobant les matières organiques d’origine végétale, algues incluses, animale ou fongique) et contenant de la cellulose, notamment sous forme de fibres cellulosiques (c.à.d. des fibres de cellulose).
Par « biomasse lignocellulosique », on entend toute biomasse susceptible d’être mise en œuvre en tant que substrat lignocellulosique. La biomasse lignocellulosique peut notamment être classée en fonction de son origine :
- résidus agricoles produits lors de la culture de différentes plantes destinées à l’alimentation ;
- déchets forestiers de bois dur ou de bois tendre, issus de l’industrie du bois ou des pâtes et papiers ;
- plantes énergétiques issues de cultures dédiées (i.e. herbes vivaces et taillis à courte rotation) ;
- déchets solides municipaux et industriels.
Par exemple, un substrat lignocellulosique peut être obtenu à partir d’une biomasse lignocellulosique englobant: le peuplier, le pin, le miscanthus, le saule, le panic érigé (ou « switchgrass »), le maïs, la canne à sucre, le blé, le riz, l’avoine, l’orge, la betterave, l’olivier, la vigne, le coton, l’eucalyptus, les arbres fruitiers.
Le substrat cellulosique est obtenu avantageusement à partir de bois (dont la cellulose est le composant principal), mais aussi de tout végétal fibreux riche en cellulose, comme par exemple, le coton, le lin, le chanvre, le bambou, le kapok, les fibre de noix de coco (coir), la ramie, la jute, le sisal, le raphia, le papyrus et certains roseaux, la bagasse de canne à sucre, la betterave (et notamment la pulpe de betterave), les agrumes, les tiges de maïs ou de sorgho, ou encore les plantes annuelles à paille.
Les substrats cellulosiques peuvent également être obtenus à partir d’animaux marins (comme le tunicier par exemple), d’algues (comme par exemple Valonia ou Cladophora ) ou de bactéries pour la cellulose bactérienne (comme par exemple les souches bactériennes de type Gluconacetobacter).
On choisira, selon les applications, de la cellulose issue de parois primaires comme le parenchyme des fruits (par exemple les betteraves, les agrumes etc.) ou de parois secondaires, comme le bois.
Le substrat cellulosique consiste avantageusement en un matériau cellulosique préparé par des moyens chimiques ou mécaniques, à partir de toute source cellulosique telle que mentionnée ci-dessus (et notamment à partir du bois).
Le matériel contenant la lignocellulose est généralement présent, par exemple, dans les tiges, les feuilles, le son, les enveloppes et les rachis des plantes ou feuilles, branches, et le bois des arbres. De manière non-limitative, le matériel contenant la lignocellulose peut aussi être du matériel herbacé, des restes de l’agriculture et de la sylviculture, des déchets municipaux solides, des déchets papier, et des restes de broyage de pulpe et de papier. Il faut comprendre ici que le matériel contenant la lignocellulose peut se trouver sous la forme de matériel de la paroi cellulaire de la plante contenant de la lignine, cellulose, et hémicellulose dans une matrice mixte.
Selon certains modes de réalisation particuliers, notamment ceux visant la production de fibres de cellulose, le matériel contenant de la lignocellulose est une biomasse lignocellulosique choisie dans le groupe consistant en : l'herbe, le switchgrass, la spartine, l’ivraie, la baldingère faux-roseau, le miscanthus, les résidus de transformation du sucre, la bagasse de canne à sucre, les déchets agricoles, la paille de riz, la balle de riz, la paille d'orge, l’épi de maïs, la paille de céréales, la paille de blé, la paille de canola, la paille d’avoine, la coque d’avoine, la canne de maïs, la farine de soja, la farine de maïs, les déchets forestiers, la fibre de pâte de bois recyclée, la boue de papier, la sciure de bois, le bois dur, le bois résineux, l'agave et ses combinaisons. Dans un mode de réalisation préféré, le matériel contenant de la lignocellulose est choisi dans un groupe comprenant : la farine de maïs, la fibre de maïs, la paille de riz, le bois de pin, les copeaux de bois, le peuplier, la bagasse, le papier et les déchets de traitement de la pâte.
Par « cellulose », on entend un homopolysaccharide linéaire issu de la biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale, algues incluses, la cellulose d’origine animale ainsi que la cellulose d’origine bactérienne) et constitué d’unités (ou cycles) de glucose (D-Anhydroglucopyranose - AGU pour « Anhydro glucose unit ») reliées entre elles par des liaisons glycosidiques b-(1-4). Le motif de répétition est un dimère de glucose également appelé cellobiose.
Les AGU possèdent 3 fonctions hydroxyles : 2 alcools secondaires (sur les carbones en positions 2 et 3 du cycle de glucose) et un alcool primaire (sur le carbone en position 6 du cycle de glucose).
Ces polymères s'associent par des liaisons intermoléculaires de type liaison hydrogène, conférant ainsi une structure fibreuse à la cellulose. En particulier, l'association des chaînes formées de dimères de cellobiose forme une nano fibrille élémentaire de cellulose (dont le diamètre est d’environ 5 nm). L’association de nanofibrilles élémentaires forme une nano fibrille (dont le diamètre varie généralement de 50 à 500 nm ; ce qui inclut 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 nm). L’agencement de plusieurs de ces nanofibrilles forme ensuite ce qui est généralement appelé une fibre de cellulose.
Le terme « fibre de cellulose » désigne l’ensemble des formes de cellulose susceptibles d’être obtenues à l’issue d’un procédé de défibrillation, ou délamination d’un substrat cellulosique ; ce qui inclut les formes de cellulose ayant une dimension de l'ordre du nanomètre, ainsi que les formes de cellulose ayant une dimension supérieure.
Le terme « nanocelluloses » désigne les différentes formes de cellulose ayant une dimension de l’ordre du nanomètre. Ce terme englobe en particulier selon l’invention, deux familles de nano celluloses : les nanocristaux de cellulose et les fibrilles de cellulose.
Les termes « fibrilles de cellulose », « nanofibrilles (de cellulose) », « nanofibres (de cellulose) », « cellulose nanofibrillée », « microfibrilles (de cellulose) », « cellulose microfibrillée », « microfibrillated cellulose », « cellulose nanofibrils » sont synonymes.
Chaque nano fibrille de cellulose contient des parties cristallines stabilisées par un solide réseau de liaisons hydrogènes inter- et intra-chaines. Ces régions cristallines sont séparées par des régions amorphes.
L’élimination des parties amorphes des nano fibrilles de cellulose, permet d’obtenir des nanocristaux de cellulose (NCCs).
Les NCCs comportent avantageusement au moins 50% de partie cristalline, de préférence encore au moins 55% de partie cristalline. Ils ont généralement un diamètre allant de 5 à 70 nm (de préférence inférieur à 15 nm) et une longueur allant de 40 nm à environ 1 pm, de préférence allant de 40 nm à 500 nm ; ce qui inclut 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 nm.
Les termes « nanocristaux de cellulose », « cellulose nanocristalline », « cellulose whiskers », « microcristaux » ou « cellulose nanocrystal » sont synonymes. Dans la suite de la présente demande, le terme « nanocristaux de cellulose » (NCCs) sera utilisé de manière générique.
Comme utilisé ici, un « matériel contenant des polysaccharides » englobe une substance ou une composition comprenant des polysaccharides.
Le terme « polysaccharide » est utilisé dans son sens conventionnel et désigne des carbohydrates polymériques composés de longues chaînes de monosaccharides maintenus ensemble par des liaisons glycosidiques. Lors de leur hydrolyse, les polysaccharides libèrent les monosaccharides ou oligosaccharides solubles les constituant.
Les polysaccharides qui sont préférentiellement considérés sont les polysaccharides dérivés de plantes, et tout particulièrement la cellulose, telle que celle retrouvée dans la lignocellulose.
Ce terme englobe ainsi tout matériel (ou substrat ou biomasse) comprenant au moins un (ou une pluralité de) polysaccharide(s) choisis parmi : la cellulose, l’hémicellulose et la pectine; ce qui inclut notamment les substrats polysaccharidiques comprenant au moins 30 % en poids de cellulose et d’hémicellulose.
Le terme « matériel contenant de la lignocellulose » utilisé ici fait référence à un matériel constitué principalement de cellulose, d’hémicellulose et de lignine. Ce terme est synonyme de « matériel lignocellulosique ». Un tel matériel est aussi référencé comme « biomasse ». Selon cette définition, un matériel contenant de la lignocellulose est un exemple de substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose.
Ce terme englobe ainsi tout matériel (ou substrat ou biomasse) lignocellulosique contenant au moins 30 % en poids (wt), de préférence au moins 50% en poids, de préférence au moins 70% en poids, de préférence au moins 90% en poids de lignocellulose. A cet égard, un matériel lignocellulosique est susceptible de comprendre d’autres composés tels que des polypeptides et sucres, ce qui inclut des sucres fermentables et/ou non-fermentables.
Ainsi, un matériel contenant de la lignocellulose particulièrement considéré selon l’invention peut être choisi parmi le pin, le peuplier, la paille et le miscanthus.
Comme utilisé dans la présente demande, une « enzyme oxydant les polysaccharides » ou un « polypeptide à activité polysaccharide oxydase » englobent les polypeptides avec les propriétés suivantes :
- le dit polypeptide produit du peroxyde d’hydrogène en présence d’oxygène et d’un composé donneur d’électrons, tel que les ascorbates,
- le dit polypeptide augmente de manière dose dépendante, en l’absence ou en présence d’un composé donneur d’électrons, la dégradation d’un matériel contenant des polysaccharides tel que la lignocellulose, causée par des cellulases et/ou des hémicellulases telles que, par exemple, les xylanases,
- le dit polypeptide augmente de manière dose dépendante, en l’absence ou en présence d’un composé donneur d’électrons, la dégradation d’un matériel contenant des polysaccharides tel que la lignocellulose, causé par des cellulases.
Le terme « composé donneur d’électron » est utilisé ici dans son sens habituel pour un homme du métier. Ainsi, un composé donneur d’électron est une entité chimique capable de donner des électrons à un autre composé. Un composé donneur d’électron est un agent réducteur grâce à sa capacité à donner des électrons et est lui-même oxydé quand il donne des électrons à une autre entité chimique. Un composé donneur d’électrons comme spécifié plus haut pour les propriétés d’oxydation des polysaccharides, englobe, de manière non exhaustive, des ascorbates et des cellobiose déshydrogénases (CDH). En l’absence d’un réducteur, tel que l’ascorbate, l’agent réducteur peut de façon avantageuse être fourni par la biomasse (la lignine) qui peut agir en tant que donneur d’électron. Le terme“ LPMO”, ou“ Lytic Polysaccharide Monooxygenase”, désigne dans son sens le plus large, et sauf indication contraire, l’ensemble des familles répertoriées dans la base de données CAZy (Carbohydrate Active enzymes, Lombard et al., 2014) et aptes à oxyder des polysaccharides. Ce terme inclut donc en particulier l’ensemble des polypeptides à activité polysaccharide oxydase appartenant aux familles AA9, AA10, AA11, AA13, AA14 et AA15. Ce terme inclut aussi les LPMO de type I (capables d’oxyder les liaisons glycosidiques sur le carbone Cl), de type II (capables d’oxyder les liaisons glycosidiques sur le carbone C4) et de type III (capables d’oxyder les liaisons glycosidiques à la fois en Cl et en C4).
Le terme « enzyme dégradant les polysaccharides » ou un « polypeptide à activité polysaccharide dégradase » englobe les polypeptides qui, outre les polysaccharides oxydases, contribuent à la dégradation des substrats polysaccharidiques tels que les biomasses lignocellulosiques. Ainsi, des polypeptides à activité polysaccharide dégradase peuvent être choisis parmi les cellulases, hémicellulases, ligninases et carbohydrate oxydases.
Les cellulases englobent les endoglucanases, cellobiohydrolases et beta- glucosidases. Les hemicellulases englobent les xylanases, mannanases, xylosidases, mannosidases, arabinofuranosidaes et esterases. Ainsi le terme « cellulase » est susceptible d’inclure les exo-glucanases, endo-glucanases, cellobiohydrolases, cellulose phosphorylases, pectinases, pectate lyases, polygalacturonase, pectin esterases, cellobiose dehydrogenases, mannanases, arabinofuranosidases, feruoyl esterases, arabinofuranosidases, fructofuranosidases, galactosidases, galactosidases, amylases, acetylxylan esterases, chitin deacetylases, chitinases, et glucosidases.
Les ligninases englobent les peroxydases, copper radical oxydases (i.e. laccases). Les carbohydrate oxydases englobent les lytic polysaccharide monooxygenases (LPMO) et les GMC oxydoreductases (i.e. glucose dehydrogenases, cellobiose dehydrogenases).
Le terme “ traitement chimique” fait référence à tous les prétraitements chimiques qui permettent la séparation et/ou la libération de la cellulose, hémicellulose et/ou lignine. Des exemples de ces prétraitements chimiques adéquats incluent, par exemple des acides dilués, de la chaux, des bases, des solvants organiques, de l’ammoniaque, du dioxyde de soufre, du dioxyde de carbone. De plus l’oxydation humide et l’hydrothermolyse à pH contrôlé sont aussi considérées comme des prétraitements chimiques. Les méthodes de prétraitements utilisant de l’ammoniaque sont notamment décrites dans les demandes PCT WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, et WO 2006/110901.
D’autres exemples de prétraitement adéquat sont décrits par Schell et al., 2003, Appl. Biochem and Biotechn. Vol. 105-108: 69-85, et Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, et U.S. Publication No. 2002/0164730.
Le terme « prétraitement mécanique » fait référence à tous les traitements mécaniques (ou physiques) qui permettent la séparation et/ou la libération de la cellulose, de Thémicellulose et/ou de la lignine à partir d’un matériel contenant de la lignocellulose. Par exemple, les prétraitements mécaniques incluent différents types de broyage, irradiation, explosion à la vapeur et l’hydrothermolyse. Le prétraitement mécanique inclut la fragmentation d’un solide (comminution ou réduction mécanique de la taille). La fragmentation d’un solide inclut les techniques de broyages en milieu sec, de broyage en milieu humide et de broyage par balles vibrantes. Le prétraitement mécanique peut aussi inclure des fortes pressions et/ou des températures élevées (explosion à la vapeur). Dans certaines représentations de l’étape de prétraitement, la dite étape peut combiner un prétraitement mécanique et chimique.
Comme il a été utilisé dans la présente invention, le terme « prétraitement biologique » fait référence à tous les traitements biologiques qui permettent la séparation et/ou la libération de la cellulose, hémicellulose et/ou lignine à partir d’un matériel contenant de la lignocellulose. Les prétraitements biologiques peuvent impliquer l’application de microorganismes capables de solubiliser la lignine (voir, par exemple, Hsu, 1996, Pretreatment of biomass, dans le Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh et Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: une revue, dans Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, Baker, and Overend, eds., ACS Symposium Sériés 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, Cao, Du, et Tsao, 1999, Ethanol production from renewable resources, dans Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241 ; Olsson et Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydro lysâtes for éthanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331 ; et Vallander et Eriksson, 1990, Production of éthanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng J Biotechnol. 42: 63-95).
Polypeptides et compositions à activité polysaccharide-oxydase
Selon un mode de réalisation principal, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus ), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
En particulier, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 40% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Par exemple, un polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon l’invention peut être caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 45% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e- value de le 18 ou moins.
En particulier, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 60% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
En particulier, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 80% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
En particulier, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 90% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Selon certains modes de réalisation, l’invention concerne un des dits polypeptides isolés à activité polysaccharide oxydase, tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence choisie parmi SEQ ID N°5 à SEQ ID N°383, ce qui inclut SEQ ID N°7 à 382 et SEQ ID N°383.
Selon certains modes de réalisation, l’invention concerne un des dits polypeptides isolés à activité polysaccharide oxydase, tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 80% avec une séquence choisie parmi SEQ ID N°5 à SEQ ID N°383, ce qui inclut SEQ ID N°7 à 382 et SEQ ID N°383.
Selon certains modes de réalisation, l’invention concerne un des dits polypeptides isolés à activité polysaccharide oxydase, tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 90% avec une séquence choisie parmi SEQ ID N°5 à SEQ ID N°383, ce qui inclut SEQ ID N°7 à 382 et SEQ ID N°383.
Par exemple, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence choisie parmi SEQ ID N°5 à SEQ ID N°382 et SEQ ID N°383.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins. Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 40% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Par exemple, un polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon l’invention peut être caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 45% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e- value de le 18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 60% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 80% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 90% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Selon un mode de réalisation alternatif, l’invention concerne une composition à activité polysaccharide-oxydase, caractérisée en ce qu’elle comprend un polypeptide à activité polysaccharide oxydase tel que défini ci-dessus.
En particulier, l’invention concerne une composition à activité polysaccharide- oxydase telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre au moins un polypeptide à activité polysaccharide-dégradase choisi parmi : une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une carbohydrate oxydase.
A titre non exhaustif, la dite composition à activité polysaccharide-oxydase peut être caractérisée en ce qu’elle est susceptible d’être obtenue à partir d’un ou plusieurs organismes choisis parmi : Agaricus bisporus, Alternaria alternata, Amanita thiersii, Armillaria ostoyae, Armillaria solidipes, Ascochyta rabiei, Aspergillus arachidicola, Aspergillus bombycis, Aspergillus brasiliensis, Aspergillus campestris, Aspergillus candidus, Aspergillus carbonarius, Aspergillus clavatus, Aspergillus cristatus, Aspergillus fischeri, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus kawachii, Aspergillus lentulus, Aspergillus luchuensis, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus nomius, Aspergillus novofumigatus, Aspergillus ochraceoroseus, Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus, Aspergillus ruber, Aspergillus steynii, Aspergillus sydowii, Aspergillus taichungensis, Aspergillus terreus, Aspergillus thermomutatus, Aspergillus tubingensis, Aspergillus turcosus, Aspergillus udagawae, Aspergillus versicolor, Aspergillus wentii, Aureobasidium melanogenum, Aureobasidium namibiae, Aureobasidium pullulans, Aureobasidium subglaciale, Auricularia subglabra, Bipolaris maydis, Bipolaris oryzae, Bipolaris sorokiniana, Bipolaris victoriae, Bipolaris zeicola, Botryobasidium botryosum, Botrytis cinerea, Ceratocystis fimbriata, Ceratocystis platani, Cercospora berteroae, Cercospora beticola, Cercospora zeina, Chaetomium globosum, Chaetomium globosum, Clohesyomyces aquaticus, Colletotrichum chlorophyti, Colletotrichum fîoriniae, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum higginsianum, Colletotrichum incanum, Colletotrichum nymphaeae, Colletotrichum orbiculare, Colletotrichum orchidophilum, Colletotrichum salicis, Colletotrichum simmondsii, Colletotrichum sublineola, Colletotrichum tofieldiae, Coniella lustricola, Coniochaeta ligniaria, Corynespora cassiicola, Cylindrobasidium torrendii, Daldinia sp., Diaporthe ampelina, Diaporthe helianthi, Diplocarpon rosae, Diplodia corticola, Diplodia seriata, Dothistroma septosporum, Elsinoe, Elsinoe australis, Emergomyces pasteuriana, Epicoccum nigrum, Eutypa lata, Exidia glandulosa, Fungi, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Fusarium fujikuroi, Fusarium graminearum, Fusarium langsethiae, Fusarium mangiferae, Fusarium nygamai, Fusarium oxysporum, Fusarium poae, Fusarium proliferatum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium venenatum, Fusarium verticillioides, Gaeumannomyces tritici, Glarea lozoyensis, Glonium stellatum, Grosmannia clavigera, Helicocarpus griseus, Heterobasidion irregulare, Hirsutella minnesotensis, Histoplasma capsulatum, Hortaea werneckii, Hydnomerulius pinastri, Hypoxylon sp., Jaapia argillacea, Leptosphaeria maculans, Leucoagaricus, Lomentospora prolificans, Magnaporthe oryzae, Magnaporthiopsis poae, Marssonina brunnea, Marssonina coronariae, Meliniomyces bicolor, Meliniomyces variabilis, Microdochium bolleyi, Moniliophthora roreri, Mycosphaerella eumusae, Neofusicoccum parvum, Neonectria ditissima, Ophiocordyceps australis, Ophiocordyceps camponoti- rufipedis, Ophiocordyceps unilateralis, Panaeolus cyanescens, Paraphaeosphaeria sporulosa, Parastagonospora nodorum, Penicilliopsis zonata, Pénicillium arizonense, Pénicillium brasilianum, Pénicillium camemberti, Pénicillium coprophilum, Pénicillium digitatum, Pénicillium expansum, Pénicillium flavigenum, Pénicillium freii, Pénicillium griseofulvum, Pénicillium italicum, Pénicillium nordicum, Pénicillium oxalicum, Pénicillium polonicum, Pénicillium roqueforti, Pénicillium rubens, Pénicillium solitum, Pénicillium subrubescens, Pénicillium vulpinum, Peniophora, Pestalotiopsis fici,Phellinus noxius, Phialocephala, scopiformis, Phialocephala, subalpina, Pleurotus ostreatus,Plicaturopsis crispa, Pseudogymnoascus verrucosus,Pseudomassariella vexata,Punctularia strigosozonata, Pyrenochaeta,Pyrenophora teres,Pyrenophora tritici- repentis, Rhizoctonia solani, Rhynchosporium commune, Rosellinia necatrix, Rutstroemia, Scedosporium apiospermum, Schizophyllum commune, Sclerotinia borealis, Sclerotinia sclerotiorum,Serpula lacrymans,Setosphaeria turcica,Sordaria macrospora,Sphaerulina musiva,Sporothrix brasiliensis,Sporothrix insectorum,Sporothrix schenckii,Stachybotrys chartarum, Stachybotrys chlorohalonata, Stagonospora, Stemphylium lycopersici, Thermothelomyces thermophila, Thielavia terrestris, Thielaviopsis punctulata, Valsa mali, Verruconis gallopava, Verticillium alfalfae, Verticillium dahliae, Verticillium longisporum.
En particulier, la dite composition à activité polysaccharide-oxydase peut être caractérisée en ce qu’elle est susceptible d’être obtenue à partir d’un ou plusieurs organismes de type bactérie, champignon (par exemples champignons filamenteux) ou levure, choisis parmi les genres : Escherichia, Lactococcus, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Phanerochaete, Achlya, Acremonium, Aspergillus, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Endothia, Fusarium, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Pénicillium, Pyricularia, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Podospora, Pycnoporus, Fusarium, Thermonospora tout particulièrement Aspergillus ou Trichoderma ou Podospora, préférentiellement Aspergillus ou Podospora.
En particulier, la dite composition à activité polysaccharide-oxydase peut être caractérisée en ce qu’elle est susceptible d’être obtenue à partir d’un ou plusieurs organismes de type champignon ou levure, choisis parmi les genres : Achlya, Acremonium, Aspergillus, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Endothia, Fusarium, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Pénicillium, Pyricularia, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Podospora, Pycnoporus, Fusarium, Thermonospora, tout particulièrement Aspergillus ou Trichoderma ou Podospora, préférentiellement Aspergillus ou Podospora.
Selon un mode de réalisation, la dite composition à activité polysaccharide- oxydase peut être caractérisée en ce qu’elle est susceptible d’être obtenue à partir de Aspergillus japonicus.
Un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention peut également être obtenu de façon recombinante.
Ainsi, une composition à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention peut être caractérisée en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase est obtenu de façon recombinante.
Selon certains modes de réalisation, une composition à activité polysaccharide- oxydase selon l’invention comprend seulement un polypeptide (ou « enzyme ») à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention, soit un polypeptide ayant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Selon certains modes de réalisation, une composition à activité polysaccharide- oxydase selon l’invention comprend une pluralité de polypeptides à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention, soit plus d’un polypeptide ayant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus ), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Selon certains de ces modes de réalisation, une composition à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 polypeptides à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention.
Selon certains modes de réalisation, une composition à activité polysaccharide- oxydase selon l’invention comprend en outre au moins un autre polypeptide à activité polysaccharide oxydase ; en particulier choisi(s) parmi les lytic polysaccharide monooxygenases, ce qui inclut les polypeptides appartenant aux groupes de LPMO AA9, AA10, AA11, AA13 et AAl4.
Selon certains modes de réalisation, une composition à activité polysaccharide- oxydase selon l’invention peut être mise en œuvre en tant que composition pour dégrader un substrat polysaccharidique, tel que les biomasses lignocellulosiques.
Selon certains autres modes de réalisation, composition à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention peut être mise en œuvre en tant que composition auxiliaire en combinaison avec un ou plusieurs polypeptides à activité polysaccharide- dégradase.
Aussi, selon un mode de réalisation alternatif un polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon l’invention peut être mis en œuvre sous forme de kit.
Avantageusement, un tel kit peut comprendre un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase ou une composition à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention ; et d’autre part un polypeptide à activité polysaccharide-dégradase ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-dégradase.
Ainsi, l’invention concerne également un kit comprenant au moins :
- une première partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharide- oxydase selon l’invention, ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase;
- une seconde partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharide- dégradase choisi parmi une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une carbohydrate oxydase, ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide- dégradase. De tels kits peuvent, notamment, correspondre à des kits pour :
- l’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique ;
- la préparation d’un produit de fermentation d’un substrat polysaccharidique ;
- la production d’alcool à partir d’un substrat lignocellulosique ;
- la préparation d’un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose ;
- la défibrillation d’un substrat cellulosique ;
- la fabrication de fibres de cellulose.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne un hôte apte à exprimer de manière recombinante un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention. Le dit hôte peut être notamment une cellule procaryote ou eucaryote. Selon un mode particulier de réalisation, le dit hôte est une levure ou une bactérie ou un champignon, par exemple un champignon filamenteux.
Selon l’invention, un « hôte » peut notamment être une levure choisie dans un groupe comprenant : Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia,
Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, et Yarrowia.
En particulier, les levures peuvent être choisies parmi: S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus, or K. fragilis.
Selon certains modes de réalisation, la levure est choisie parmi: Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Issatchenkia orientalis, Candida albicans, Candida mexicana, Pichia pastoris, Pichia mississippiensis, Pichia mexicana, Pichia stipitis, Pichia farinosa, Clavispora opuntiae, Clavispora lusitaniae, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe, Hansenula polymorpha, et Schwanniomyces occidentalis.
Selon d’autres modes de réalisation un « hôte » peut notamment être une bactérie choisie dans un groupe comprenant : Escherichia, Lactococcus, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas. Selon d’autres modes de réalisation un « hôte » peut notamment être un champignon choisi dans un groupe comprenant : Aspergillus, Trichoderma, Podospora, Myceliophthora, Chrysosporium, Neurospora, Fusarium, Phanerochaete, Pénicillium.
Selon un mode de réalisation préféré, le dit hôte est une levure.
L’invention concerne également un acide nucléique isolé codant pour un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention.
Ainsi, un acide nucléique permettant l’expression d’un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention peut être introduit dans le génome d’un hôte (i.e. levure) d’intérêt, ou encore introduit en tant que vecteur non-intégré selon des techniques d’ingénierie génétique connues dans le domaine.
L’invention concerne également un procédé de production d’un polypeptide à activité polysaccharide oxydase; comprenant une étape de mise en culture d’un hôte apte à exprimer un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention.
Aussi, l’invention concerne des vecteurs incluant un acide nucléique codant pour un polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon l’invention. Les dits vecteurs (i.e. plasmides ou YAC) sont en particulier des vecteurs d’expression capable de diriger l’expression d’un gène donné, et associés à un opéron.
L’invention concerne donc également un procédé de production d’un polypeptide à activité polysaccharide oxydase; consistant à:
(a) cultiver un hôte apte à la production d’un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus ), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins ; et
(b) récupérer le dit polypeptide du dit hôte.
Procédés d’obtention de sucres à partir de substrats polysaccharidiques
Les polypeptides à activité polysaccharide-oxydases selon l’invention peuvent être mis en œuvre à la fois dans des procédés d’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique, des procédés de fermentation et de production d’alcool à partir d’un substrat lignocellulosique.
Des procédés d’obtention d’éthanol à partir de substrats polysaccharidiques, tels que les biomasses lignocellulosique, sont ainsi décrit dans Margeot et al. (“New improvements for lignocellulosic éthanol”; Current Opinion in Biotechnology; 20:372-380, 2009). Ainsi, un procédé complet de production d’éthanol à partir de biomasse lignocellulosique comprend généralement quatre étapes principales:
1. un pré-traitement du substrat polysaccharidique (i.e. biomasse lignocellulosique); pour casser la structure de la paroi lignocellulosique, en liquéfiant certains composants et en diminuant la cristallinité de la cellulose.
Il existe des pré-traitements physiques (mécaniques ou hydrothermaux) qui permettent la réduction de la taille des particules et la solubilisation d’une partie des hémicelluloses, des pré-traitements chimiques qui utilisent des acides, bases ou agents oxydants pour solubiliser les hémicelluloses et retirer la lignine, et des prétraitements biologiques qui utilisent des espèces fongiques capables de dégrader la lignine. Certains pré-traitements combinent des méthodes physiques et chimiques comme par exemple l’explosion à la vapeur en présence d’acide dilué ou l’explosion à froid à l’ammoniaque.
2. une hydrolyse enzymatique du dit substrat, consistant à dépolymériser la cellulose et les hémicelluloses restantes en monomères, à l’aide d’enzymes spécifiques.
Ces enzymes sont secrétées par une variété d’organismes cellulo lytiques, aérobies ou anaérobies, mésophiles ou thermophiles, appartenant notamment aux genres Clostridium, Thermomonospora, Cellulomonas, Bacteriodes ou Streptomyces pour les bactéries, et Phanerochaete, Trichoderma, Aspergillus ou Pénicillium pour les champignons filamenteux.
3. une fermentation du dit substrat pour obtenir le dit éthanol à partir des sucres (i.e. pentoses et hexoses) issus de l’étape d’hydrolyse.
Cette étape de fermentation est notamment mise en œuvre par des microorganismes tels que la levure Saccharomyces cerevisiae, qui est le microorganisme le plus utilisé dans l’industrie grâce à ses forts rendements et sa faible sensibilité aux inhibiteurs. Cependant, elle n’est naturellement pas capable d’utiliser les pentoses produits lors de l’hydrolyse enzymatique. Aussi, afin d’améliorer les rendements, des souches modifiées capables de fermenter des sucres tels que le xylose ou l’arabinose ont été développés.
4. une purification du dit éthanol, généralement en vue de son utilisation en tant que carburant, qui doit répondre à un certain nombre de spécifications. Cette purification consiste donc généralement en une distillation, une rectification et une déshydratation.
Selon un mode de réalisation, ces étape peuvent être réalisées séparément, ou encore simultanément. Par exemple, ces différentes étapes peuvent être réalisées séparément, comme c’est le cas dans un procédé noté SHF (“ Separate Hydrolysis and Fermentation”) où les enzymes et les levures peuvent être utilisés chacun dans leurs conditions optimales. Il est aussi possible de réaliser ces étapes simultanément, par un procédé que n’on nomme SSCF (“ Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation”). Enfin, le concept de bioprocédé consolidé (“ Consolidated Bioprocessing” ou CBP) propose d’effectuer la production de cellulases, l’hydrolyse enzymatique et la fermentation à l’aide d’un seul microorganisme.
Afin de rendre le bioéthanol lignocellulosique rentable, il est généralement nécessaire d’optimiser chacune des étapes de sa production. Il est notamment essentiel de bien choisir le pré-traitement adapté au type de biomasse traitée, afin de maximiser son effet, tout en limitant la formation d’inhibiteurs et en réduisant les coûts et la consommation d’énergie. L’hydrolyse enzymatique est souvent considérée comme l’étape la plus critique et termes de rendements et de coût.
Les polypeptides à activité polyssaccharide oxydases selon l’invention sont particulièrement avantageux dans le cadre d’une étape d’hydrolyse de substrats polysaccharidiques.
Ainsi, selon un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique, comprenant au moins une étape de mise en contact du dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide- oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus ), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e- value de le 18 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide.
En particulier, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique, comprenant au moins une étape de mise en contact du dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°6 (provenant de Aspergillus aculeatus ), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide.
Ainsi, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique, comprenant les étapes de :
a) disposer d’un substrat polysaccharidique ;
b) mettre en contact le dit substrat polysaccharidique avec un un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide ;
c) collecter le dit sucre obtenu à l’issue de l’étape b).
En particulier, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique, comprenant les étapes de :
a) disposer d’un substrat polysaccharidique ;
b) mettre en contact le dit substrat polysaccharidique avec un un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°6 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide ;
c) collecter le dit sucre obtenu à l’issue de l’étape b).
En particulier, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un sucre tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que le dit substrat est un substrat lignocellulosique, et tout particulièrement une biomasse lignocellulosique.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de préparation d’un produit de fermentation à partir d’un substrat polysaccharidique, caractérisé en ce qu’il comprend l’obtention d’un sucre par un procédé tel que défini ci- dessus, et la fermentation dudit sucre de sorte à obtenir un produit de fermentation.
Ainsi, l’invention concerne un procédé de préparation d’un produit de fermentation à partir d’un substrat polysaccharidique, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes :
a) mettre en contact le dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide, de sorte à obtenir un sucre ;
b) fermenter le dit sucre de sorte à obtenir un produit de fermentation.
En particulier, l’invention concerne un procédé de préparation d’un produit de fermentation à partir d’un substrat polysaccharidique, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes :
a) mettre en contact le dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°6 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide, de sorte à obtenir un sucre ;
b) fermenter le dit sucre de sorte à obtenir un produit de fermentation.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de production d’alcool à partir d’un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu’il comprend l’obtention d’un sucre par un procédé tel que défini ci-dessus, et la fermentation alcoolique dudit sucre par un microorganisme alcooligène.
Le produit de la fermentation est préférentiellement le butanol, d’éthanol, d’isopropanol ou d’un de leurs mélanges.
Ainsi, dans le cadre de la fermentation ethanolique, le produit de fermentation alcoolique considéré est l’éthanol.
Aussi, de manière préférée, un procédé de fermentation et/ou production d’alcool selon l’invention est un procédé de production de butanol, d’éthanol, d’isopropanol ou d’un de leurs mélanges. Ainsi, l’invention concerne un procédé de production d’alcool à partir d’un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes :
a) mettre en contact le dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina ) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide, de sorte à obtenir un sucre ;
b) fermenter le dit sucre par un microorganisme alcooligène de sorte à produire le dit alcool. En particulier, l’invention concerne un procédé de production d’alcool à partir d’un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes :
a) mettre en contact le dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 (provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N°6 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide, de sorte à obtenir un sucre ;
b) fermenter le dit sucre par un microorganisme alcooligène de sorte à produire le dit alcool.
Fibres de cellulose, procédés de préparation de substrats et de défibrillation
Différentes formes de cellulose ont été identifiées avec une dimension de l'ordre du nano mètre, désignées sous le nom générique de « nanocelluloses ». Les propriétés notamment mécaniques des fibres de cellulose, dont ces nanocelluloses, leur capacité à former des films et leur viscosité, leur confèrent également un intérêt majeur dans de nombreux domaines industriels. Plusieurs stratégies de prétraitements des fibres de cellulose ont ainsi été développées afin de réduire la consommation d’énergie requise pour leur délamination mécanique.
Les procédés définis ci-après concernent l’obtention de fibres de celluloses à partir d’un substrat cellulosique. Ils impliquent la mise en œuvre d’un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de préparation d’un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, le dit substrat avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose; caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un procédé de préparation d’un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, le dit substrat avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de défibrillation d’un substrat cellulosique, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose, lequel a été préalablement mis en contact avec un donneur d’électrons et un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d’un donneur d’électron; et
b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de défibriller le dit substrat,
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins. Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un procédé de défibrillation d’un substrat cellulosique, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose, lequel a été préalablement mis en contact avec un donneur d’électrons et un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d’un donneur d’électron; et
b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de défïbriller le dit substrat,
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à:
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, ledit substrat cellulosique avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer lesdites fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique,
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un procédé de fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à:
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, ledit substrat cellulosique avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer lesdites fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique,
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
Le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention est mélangé avec le substrat cellulosique, de manière à permettre la mise en contact entre le dit polypeptide et les fibres de cellulose.
L’étape de traitement enzymatique est de préférence réalisée sous agitation douce, de façon à assurer une bonne dispersion des enzymes au sein des fibres. Cette étape de traitement enzymatique est par exemple mise en œuvre pendant une durée allant de 24h à 72h (de préférence 48h).
De préférence, l’étape de traitement enzymatique est mise en œuvre à une température allant de 30 à 50 °C, notamment de 30 à 45 °C.
Le pH des conditions réactionnelles de l’enzyme au contact du substrat cellulosique est généralement compris entre 3 et 7, ce qui inclut entre 4 et 7, et notamment entre 4 et 6.
Selon l’invention le dit polypeptide peut être ajouté au substrat cellulosique selon un rapport (ou ratio) enzyme/cellulose allant de 1 :l000 à 1 :50, notamment de 1 :500 à 1 :50 ou de 1 : 100 à 1 :50 ou encore de 1 :l000 à 1 :500, de 1 : 500 à 1 : 100.
De préférence, le dit polypeptide est utilisé à une concentration allant de 0,001 à 10 g/L, notamment de 0,1 à 5 g/L, et de préférence encore de 0,5 à 5 g/L.
Selon un mode de réalisation particulier, le substrat cellulosique est soumis à au moins deux (voire seulement à deux) étapes de traitement enzymatique successives (en série, avantageusement séparées par une étape de rinçage).
Le, ou les, polypeptide(s) mis en œuvre au cours de chacune de ces étapes de traitement enzymatique sont identiques ou différentes ; les conditions (notamment le ratio enzyme/substrat) sont identiques ou différentes entre ces étapes successives.
De manière non-exclusive, des tests de clivage de la cellulose par un polypeptide selon l’invention peuvent être menés selon le protocole suivant :
Par exemple un test de clivage peut être réalisé dans un volume de 300 mΐ de liquide contenant 4,4 mM d’enzyme LPMO et 1 mM d’ascorbate et 0,1 % (poids/volume) de poudre de cellulose gonflée à l’acide phosphorique (PASC phosphoric acid-swoller cellulose - préparée comme décrit dans Wood TM, Methods Enzym 1988, 160 : 19-25) dans 50 mM d’un tampon acétate de sodium à pH 4,8 ou 5 mM de cello-oligosaccharides (Megazyme, Wicklow, Ireland) dans 10 mM de tampon acétate de sodium à pH 4,8.
La réaction enzymatique peut être mise en œuvre dans un tube de 2 ml incubé dans un thermomixer (Eppendorf, Montesson, France) à 50°C et 580 rpm (rotation par minute).
Les fibres sont mises en contact des enzymes (à une concentration comprise entre 1 et 5 g/L et selon des rapports enzyme/cellulose de 1 :50, 1 : 100, 1 :500 et 1 :l000) et d’ascorbate (2 mM) puis soumises à une agitation douce pendant 48 heures à 40 °C.
Après 16 h d’incubation, l’échantillon est porté à l00°C pendant 10 minutes afin de stopper la réaction enzymatique, puis centrifugé à 16 000 tours par minutes (rpm) pendant 15 minutes à 4°C afin de séparer la fraction solution de la fraction insoluble restante.
Les fibres traitées sont ensuite soumises à une action mécanique avec un homogénéiseur-disperseur (Ultra-Turrax puissance 500 W, vitesse maximum pendant 3 minutes), suivie d’un traitement aux ultrasons pendant 3 minutes.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que les fibres de cellulose obtenues à l’issue du procédé sont des nanofïbrilles de cellulose.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le donneur d’électron est choisi parmi l’ascorbate, le gallate, le catéchol, le glutathion réduit, les fragments de lignine et les carbohydrates déshydrogénases fongiques ; et de préférence l’ascorbate. Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le substrat cellulosique est obtenu à partir de bois, d’un végétal fibreux riche en cellulose, de betterave, d’agrumes, de plantes annuelles à paille, d’animaux marins, d’algues, de champignons ou de bactéries.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le substrat cellulosique est choisi parmi les pâtes papetières chimiques, de préférence les pâtes papetières de bois chimiques, de préférence encore l’une au moins des pâtes papetières suivantes : les pâtes blanchies, les pâtes semi-blanchies, les pâtes écrues, les pâtes au bisulfite, les pâtes au sulfate, les pâtes à la soude, les pâtes kraft.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le substrat cellulosique est une pâte papetière dérivée du bois, de plantes annuelles ou de plantes à fibres.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que ladite au moins une étape de traitement mécanique comprend l’un au moins des traitements mécaniques suivants :
- un traitement d’homogénéisation,
- un traitement de micro fluidisation,
- un traitement d’abrasion, et/ou
- un traitement de cryobroyage.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que, suite à ladite étape de traitement mécanique, ledit procédé comprend une étape de post traitement choisie parmi : un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de groupements chimiques portés par les dites fibres de cellulose.
Selon un autre objet, l’invention concerne des fibres de celluloses issues d’un procédé de défibrillation et/ou d’un procédé de fabrication de fibres de cellulose tels que définis ci-dessus.
Les dites fibres de celluloses peuvent être caractérisées en ce que lesdites fibres de cellulose, de préférence de nanocellulose, comportent des cycles de glucose dont au moins un atome de carbone est oxydé en position(s) Ci et/ou C4, voire également CY,. Selon un mode de réalisation préféré, les fibres de celluloses sont des nanofibrilles de cellulose.
Etape(s) de traitement(s) mécanique(s)
Le substrat cellulosique mis en contact avec la dite enzyme est ensuite soumis à au moins une étape de traitement mécanique qui est destinée à délaminer les fibres de cellulose pour l’obtention des nanocelluloses.
La délamination (dite encore « fibrillation » ou « défibrillation ») consiste à séparer, par un phénomène mécanique, les fibres de cellulose au sein du substrat cellulosique, notamment pour la fabrication de nanocelluloses.
Comme démontré, le clivage oxydatif des fibres de cellulose, catalysé par ladite au moins une LPMO, facilite la délamination de ces fibres de cellulose lors de l’étape de traitement mécanique.
Cette étape de délamination mécanique des fibres de cellulose peut alors être réalisée dans des conditions moins drastiques et donc moins coûteuses en énergie.
Les traitements mécaniques visant à délaminer les fibres de cellulose sont connus de l’homme du métier et peuvent être mis en œuvre dans le(s) procédé(s) de l’invention.
De manière générale, on peut citer les traitements mécaniques faibles avec un homogénéiseur-disperseur (par exemple du type d’Ultra-Turrax) et/ou les traitements ultrasons.
On peut encore par exemple se référer au document de Lavoine N et al (Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (pages 740 à 744) des traitements mécaniques pour la préparation de cellulose micro fibrillée (par exemple des nanofibrilles de cellulose).
Typiquement, un traitement mécanique peut être choisi parmi des traitements mécaniques d’homogénéisation, de micro fluidisation, d’abrasion, ou de cryobroyage.
Le traitement d’homogénéisation implique le passage du substrat cellulosique prétraité, typiquement une pâte de cellulose ou une suspension liquide de cellulose, au travers d’un espace étroit sous pression élevée (tel que décrit par exemple dans le brevet US 4,486,743).
Ce traitement d’homogénéisation est de préférence effectué au moyen d’un homogénéiseur de type Gaulin. Dans un tel dispositif, le substrat cellulosique prétraité, typiquement sous forme d’une suspension de cellulose, est pompé à haute pression et distribué au travers d’une valve automatique de faible orifice. Une succession rapide d’ouvertures et de fermetures de la valve soumet les fibres à une importante chute de pression (généralement d’au moins 20 MPa) et à une action de cisaillement à vitesse élevée suivie d'un impact de décélération à vitesse élevée. Le passage du substrat dans l’orifice est répété (généralement de 8 à 10 fois) jusqu’à ce que la suspension de cellulose devienne stable. Afin de maintenir une température du produit dans une gamme allant de 70 à 80°C durant le traitement d’homogénéisation, de l’eau de refroidissement est généralement utilisée.
Ce traitement d’homogénéisation peut également être mis en œuvre à l’aide d’un dispositif de type micro fluidiseur (voir par exemple Sisqueira et al. Polymer 2010 2(4) :728-65). Dans un tel dispositif, la suspension de cellulose passe au travers d’une fine chambre typiquement en forme de « z » (dont les dimensions du canal sont généralement comprises entre 200 et 400 pm) sous pression élevée (environ 2070 bars). Le taux de cisaillement élevé qui est appliqué (généralement supérieur à l07.s_1) permet d’obtenir des nanofibrilles très fines. Un nombre variable de passages (par exemple de 2 à 30, notamment de 10 à 30 ou de 5 à 25, et en particulier de 5 à 20) avec des chambres de tailles différentes peut être utilisé, pour augmenter le degré de fibrillation.
Le traitement d’abrasion ou de meulage (voir par exemple Iwamoto Set al., 2007 Applied Physics A89(2) :46l-66) est basé sur l’utilisation d’un dispositif de meulage apte à exercer des forces de cisaillement fournies par des pierres de meulage.
Le substrat cellulosique prétraité, généralement sous forme d’une pâte de cellulose, est passé entre une pierre de meulage statique et une pierre de meulage en rotation, typiquement à une vitesse de l’ordre de 1500 rotations par minute (rpm). Plusieurs passages (généralement entre 2 et 5) peuvent être nécessaires pour obtenir des fibrilles de taille nanométrique.
Un dispositif de type mixeur (par exemple tel que décrit dans Unetani K et al., B io macro molécules 2011, 12(2), pp.348-53) peut également être utilisé pour produire des microfibrilles à partir du substrat cellulosique prétraité, par exemple à partir d’une suspension de fibres de bois.
Le traitement de cryobroyage (ou cryoconcassage) (Dufresne et al., 1997, Journal of Applied Polymer Science, 64(6) : 1185-94) consiste à broyer une suspension de substrat cellulosique prétraité préalablement congelée avec de l’azote liquide. Les cristaux de glace formés à l’intérieur des cellules font exploser les membranes cellulaires et libèrent des fragments de parois. Ces procédés sont généralement utilisés pour la production de microfibrilles de cellulose à partir de produits, ou de résidus, de l’agriculture.
Etape(s) de post-traitement du substrat cellulosique
Dans certains modes de réalisation, le procédé de défibrillation et/ou de fabrication de fibres de cellulose comprend au moins une étape de post-traitement du substrat cellulosique, mise en œuvre après que ledit substrat ait été soumis au traitement mécanique.
Généralement, ladite au moins une étape de post-traitement vise à augmenter le degré de fibrillation des celluloses (notamment des nanocelluloses) obtenues et/ou à conférer auxdites nanocelluloses de nouvelles propriétés mécaniques, en fonction des applications envisagées.
Ladite au moins une étape de post-traitement peut notamment être choisie parmi un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques portés par les micro fibrilles. On peut également se référer par exemple au document de Lavoine N et al (Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (point 2.3, pages 747 à 748) des post-traitements qui peuvent être combinés à différents prétraitements et traitements mécaniques des fibres de celluloses.
EXEMPLES
Exemple 1 : Souches fongiques et conditions de culture
La souche d 'Aspergillus japonicus utilisée dans cette étude est maintenue dans la collection du Centre International de Ressources Microbiennes - Champignons Filamenteux (CIRM-CF, INRA, Marseille, France) sous le numéro d'accession CIRM BRFM. Elle a été cultivée sur milieu gélosé MYA2, contenant 20 g/l d'extrait de malt, 20 g/l d’agar et 1 g/l d’extrait de levure. Les spores ont été récoltées et conservées à -80°C dans 20% de glycérol et 80% d’eau.
Les milieux de culture liquides contenant une fraction autoclavée de son de maïs ou de la pulpe de betterave (fournis par ARD, Pomacle, Lrance) en tant que source de carbone et inducteur de sécrétion de protéines ont été préparés da la manière suivante : 15 g/l d’inducteur ; 2,5 g/l de maltose; 1,84 g/l de tartrate diammonium comme source d’azote; 0,5 g/l d’extrait de levure; 0,2 g/L de KH2P04; 0,0132 g/L de CaCl2.2H20 et 0,5 g/L de MgS04.7H20. Un autre milieu inducteur a été préparé en utilisant 4 g/l d'Avicel (Sigma- Aldrich, USA); 10 g/l de xylose; 1,8 g/l de tartrate diammonium; 0,5 g/l d’extrait de levure; 0,2 g/l de KH2P04; 0,0132 g/L de CaCl2.2H20 et 0,5 g/L de MgS04.7H20.
Les trois milieux de culture ont été inoculés par 2xl05spores/mL des cinq souches, et incubés dans des fioles bafflées dans l’obscurité à 30°C sous agitation rotative à 105 rpm (Infors HT, Suisse).
Exemple 2 : Préparation des sécrétomes
Après 7 jours d’incubation, les cultures ont été arrêtées et le milieu liquide a été séparé du mycélium à l'aide de Miracloth (Calbiochem, USA). 40 mL ont été filtrés sur des membranes de polyéthersulfone 0,22 pm (Merck-Millipore, Allemagne) puis diafïltrés et concentrés sur des membranes de polyéthersulfone avec un seuil de coupure de lOkDa (Vivaspin, Sartorius, Allemagne) dans du tampon acétate de sodium 50mM pH5 jusqu'à un volume final de 2 mL. Les sécrétomes ont été conservés à -20°C, et leur concentration totale de protéines a été évaluée par les méthodes de Bradford (Bio-Rad Protein Assay, Ivry, Lrance) et du BCA (Bicinchoninic Acid Protein Assay, Sigma-Aldrich) en utilisant une gamme standard d'albumine sérique bovine (BSA). Exemple 3 : Clonage de gènes et expression recombinante chez Pichia pastoris :
Les séquences protéiques sélectionnées, desquelles on a ôté les séquences prédites des peptides signaux natifs, ont été utilisées pour générer des séquences nucléotidiques codantes optimisées pour une expression chez P. pastoris. La synthèse totale des gènes a été réalisée (Genewiz, USA) et ils ont été clonés dans le vecteur d'expression pPICZaA (Invitrogen), de manière à être en phase avec la séquence signal utilisée (celle du facteur a de la levure) et avec la séquence codant pour l'étiquette poly- histidine C-terminale.
Les plasmides ont été amplifiés via une transformation de cellules compétentes DH5a d'Escherichia coli, puis purifiés à l'aide d'un kit HiSpeed Plasmid Midi (Qiagen, Pays-Bas), linéarisés par l’enzyme de restriction Pme I et transformés dans des cellules X- 33 de Pichia pastoris (Invitrogen) par électroporation. Les transformants ont été isolés sur un milieu gélosé contenant de la zéocine (100 et 500 mg/L).
Pour tester l'expression de chaque vecteur, plusieurs transformants résistants à la zéocine ont été cultivés en plaque de 24 puits, dans 5 mL de milieu de croissance BMGY contenant 0,2 g/L de biotine, à 30°C et 250 rpm pendant environ l6h, jusqu'à atteindre une densité optique à 600 nm comprise entre 2 et 6. Après centrifugation, les cellules ont été reprises dans 1 mL de milieu BMMY et incubées à 20°C et 200 rpm pendant 3 jours afin d'induire l'expression des protéines; le milieu a été supplémenté chaque jour par du méthanol à 3% (vol/vol). Les surnageants de culture ont été purifiés par chromatographie d’affinité avec des billes Ni-NTA selon une procédure automatisée décrite par Haon et al. (« Recombinant protein production facility for fungal biomass-degrading enzymes using the yeast Pichia pastoris ». Front. Microbiol. 6. 2015), et les protéines purifiées ont été déposées sur un gel SDS-PAGE sans coloration avec révélation par photo- activation et fluorescence (BioRad, France) pour vérifier leur production.
Afin de produire les protéines en quantités suffisantes, les transformants ayant le meilleur taux de sécrétion ont été cultivés dans 2 L de milieu BMGY contenant 1 mL/L de sels PTM4 (. Pichia Trace Minerais 4), 0,2 g/L de biotine dans des fioles à 30°C et 250 rpm pendant environ l6h, jusqu'à atteindre une densité optique à 600 nm comprise entre 2 et 6. L'expression des protéines a été induite en incubant les cellules dans 400 mL de milieu BMMY contenant 1 mL/L de sels PTM4 à 20°C et 200 rpm pendant 3 jours, durant lesquels le milieu a été supplémenté par du méthanol à 3% (vol/vol) chaque jour. Les surnageants ont été récupérés par centrifugation (4000xg, 4°C, 10 min) et filtrés sur des membranes de 0,45 pm (Millipore) pour éliminer les cellules restantes. Une colonne de nickel chélaté His-Bind Resin (1,9 cm3 ; GE Healthcare, UK) a été connectée à un appareil de FPLC Àkta (GE Healthcare) et équilibrée avec du Tris-HCl 50 mM (pH 7,8), de NaCl 50 mM et de l’imidazole 10 mM. Après avoir ajusté le pH à 7,8, les surnageants ont été chargés sur la colonne à 4°C. La colonne a été lavée avec le tampon d’équilibrage (Tris- HCl 50 mM pH 7,8, NaCl 50 mM, imidazole 10 mM) et les enzymes ont été éluées avec le même tampon contenant 150 mM d’imidazole. Les éluats ont été concentrés à l’aide d’unités de centrifugation Amicon (seuil de coupure 10 kDa ; Millipore) à 4000xg et lavés à plusieurs reprises avec du tampon acétate de sodium 50 mM (pH 5).
Une fraction de chaque éluat a été chargée sur un gel SDS-PAGE sans coloration avec révélation par photo-activation et fluorescence (Bio Rad, France) pour vérifier leur pureté. La concentration en protéines a été déterminée par absorption à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientifïc) et des masses et coefficients molaires théoriques calculés à partir des séquences protéiques.
Exemple 4 : Tests de dégradation de la cellulose en présence de polypeptides selon l’invention :
Les tests de dégradation de la cellulose par les polypeptides à activité polysaccharide oxydase ont été effectués en triplicats, dans un volume de 300 pL contenant 1% (m/v) dAvicel (Sigma- Aldrich) ou de PASC ( Phosphoric Acid Swollen Cellulose), préparée à partir d'Avicel selon la méthode décrite par Wood (« Préparation of crystalline, amorphous, and dyed cellulase substrates. In Methods in Enzymology, (Academie Press), pp. 19-25) dans du tampon phosphate 50 mM pH 6. Les LPMO (0,5 à 5 mM) et le donneur d'électrons (L-cystéine ou ascorbate, 10 mM à 1 mM) ont été ajoutés, en présence ou non d'H202 (100 mM), et les tubes ont été incubés dans un thermomixer (Eppendorf, Montesson, France) à 50°C et 850 rpm, pendant 4 à l6h. La réaction a été arrêtée en ébouillantant les échantillons à l00°C pendant au moins 10 min, puis ils ont été centrifugés à l5000xg pendant 5 min pour séparer les produits solubles de la fraction insoluble.
Afin de tester la synergie des polypeptides d’intérêt avec la CBHI de T. reesei, un mélange réactionnel d’un volume total de 800 pL contenant 1% (m/v) de nano fibrilles de cellulose dans du tampon acétate 50 mM pH 5,2, ainsi que 8 pg de LPMO et 1 mM d'ascorbate a été incubé dans un thermomixer (Eppendorf) à 50°C et 850 rpm, pendant l6h. Les échantillons (en triplicats) ont été ébouillantés à l00°C pendant au moins 10 min, puis centrifugés à l5000xg pendant 5 min. La fraction insoluble restante du substrat a été lavée deux fois dans le tampon, et l'hydrolyse par la CBHI de T. reesei (0,8 pg; fournie par ILPEN) a été réalisée dans un volume de 800 pL contenant du tampon acétate 50 mM pH 5,2, pendant 30 min à 50°C et 850 rpm. La réaction a été arrêtée comme décrit plus haut, et les fractions solubles et insolubles ont été séparées.
Les mono et oligosaccharides issus de la dégradation des substrats cellulosiques ont été détectés par HPAEC-PAD (Dionex, Thermo Lisher Scientifïc), selon la méthode décrite par Westereng et al. (2013), en utilisant des cello-oligosaccharides (DP2 à DP6) non oxydés comme standards (Megazyme, Irlande).
Exemple 5 : Substrats et cocktails enzymatiques :
La paille de blé, le miscanthus et le peuplier prétraités ont été obtenus auprès d’ILP Energies Nouvelles (Rueil-Malmaison, Lrance). Les biomasses ont été prétraitées par explosion à la vapeur en conditions acides, lavées à l'eau chaude pour éliminer les produits libres, et séchées à 55°C. Après une semaine à température ambiante, elles ont été broyées et tamisées afin de ne retenir que les particules de taille inférieure à 0,8 mm, et leur teneur en eau (% m/m) a été déterminée par séchage à l05°C en étuve à convection naturelle (VWR, USA).
Le cocktail dit « K975 », est constitué du sécrétome de la souche CL847 de Trichoderma reesei, produit en présence de lactose selon le protocole détaillé dans Herpoël-Gimbert et al. (Comparative secretome analyses oftwo Trichoderma reesei RUT- C30 and CL847 hypersecretory strains, Biotechnology for Bio fuels 2008, 1 : 18), et dont l'activité b-glucosidase spécifique est de 0,8 Ul/mg. ) li a été complété par un cocktail commercial de b-glucosidases d'Aspergillus niger SP 188 (Novozyme, Danemark).
Exemple 6 : Hydrolyses enzymatiques :
Les hydrolyses enzymatiques en tubes de 2 mL ont été réalisées en triplicats dans un volume réactionnel de 1 mL, en présence de paille de blé, de miscanthus ou de peuplier (50 mg de biomasse sèche), dans du tampon acétate de sodium 50 mM (pH 4,8) auquel a été ajouté du chloramphénicol (0,1 g/F) pour éviter les contaminations microbiennes. Ce mélange a été incubé pendant au moins lh à 45°C sous agitation rotative à 850 rpm (Infors) afin d'imprégner la biomasse, puis le cocktail K975 a été ajouté à raison de 5 mg/g de matière sèche (MS), et le cocktail SP 188 dans des quantités permettant d’obtenir une activité b-glucosidase totale de 80 Ul/g MS.
Pour les tests de supplémentation, 10 pF de sécrétomes ont été ajoutés (ou 10 mΐ de tampon dans les conditions de référence). L’hydrolyse a été réalisée à 45°C sous agitation rotative à 850 rpm (Infors). A chaque temps de prélèvement, les triplicats ont été ébouillantés à l00°C pendant au moins 5 min pour inactiver les enzymes, puis refroidis et centrifugés à l5000xg pendant 5 min, et le surnageant a été prélevé et conservé à -20°C.
Les hydrolyses enzymatiques miniaturisées ont été réalisées en microplaques de 96 puits, dans lesquelles ont été distribués 100 pF de suspension de biomasse à 6,3% (m/v) dans du tampon acétate de sodium 50 mM (pH 4,8) en présence de chloramphénicol (0,1 g/L). Pendant la distribution, la suspension de biomasse a été prélevée à l’aide d'une pipette multicanaux dans un bêcher sous agitation magnétique constante, puis les plaques ont été scellées et conservées à -20°C.
Pour les tests de supplémentation, les enzymes ont été distribuées à l'aide d'un robot Tecan Genesis Evo 200 (Tecan, Lyon, France) : les cocktails K975 et SP 188 ont été distribués dans les quantités indiquées plus haut, dans un volume de 15 pF, puis 10 pL de sécrétomes dilués lOx ont été ajoutés (ou 10 pL de tampon dans les conditions de référence, présentes sur chaque plaque). Chaque essai a été réalisé en septuplicats, auquel s'ajoute un puits contrôle contenant les enzymes seuls (sans biomasse) ; une colonne de chaque plaque a été consacrée aux conditions contrôles contenant la biomasse seule (sans enzymes). Pendant l'hydrolyse, les plaques scellées ont été incubées à 45°C sous agitation rotative à 850 rpm (Infors), pendant 24 à 96h. A chaque temps de prélèvement, les plaques correspondantes ont été centrifugées après ajout de 120 pL de tampon, puis le surnageant a été filtré et conservé à -20°C.
Pour les deux types d’hydrolyses (« séquentiel » ou « simultané »), la concentration de glucose dans les échantillons a été mesurée à l'aide du réactif Glucose GOD-PAP (Biolabo, Maizy, France) à l'aide d'une gamme standard de glucose, et les rendements ont été calculés en tenant compte de la quantité de glucose cellulosique initialement présent. Plusieurs hydrolyses ont été réalisées pour chaque condition, et afin de pouvoir combiner les résultats, les rendements obtenus en présence de sécrétomes ont été traduits en pourcentage d'amélioration par rapport à la référence interne de chaque hydrolyse. Un test t de Student a été réalisé pour chaque condition afin de déterminer si la moyenne des résultats était statistiquement différente de la moyenne des références, en utilisant la valeur de la p-value comme critère.
Exemple 7 : Tests de saccharification de biomasses en supplémentation de T. reesei
Afin de déterminer si les sécrétomes produits peuvent présenter un intérêt pour l’amélioration des rendements d’hydrolyse enzymatique, ils ont été testés dans des conditions se rapprochant de celles envisagées dans les procédés industriels de bioconversion de la biomasse lignocellulosique. Trois biomasses modèles, d’origine et de compositions différentes, ont été choisies pour cette étude : la paille de blé, le miscanthus et le peuplier. Ces substrats, issus de déchets agricoles et de cultures énergétiques dédiées, sont fréquemment envisagés comme matières premières pour la production de bioéthanol en Europe. Ils ont été prétraités par explosion à la vapeur en présence d’acide sulfurique dilué (voir Tableau 1). Après lavage et séchage, leur composition en sucres a été déterminée par CPG après hydrolyse acide Tableau 1: Conditions de prétraitement et composition des trois substrats modèles de cette étude
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Le cocktail cellulolytique de T. reesei utilisé (noté K975) est issu de la souche CL847, cultivée en présence de lactose ; celle-ci ayant une activité b-glucosidase assez faible, une préparation commerciale de b-glucosidases d’A. niger (SP188, Novozyme) y a été ajoutée en excès, afin de s’assurer que les potentielles améliorations de performances lors de la supplémentation ne soient pas dues à une simple augmentation de l’activité b- glucosidase. Ce cocktail de référence a été utilisé pour réaliser l’hydrolyse des trois biomasses choisies, avec une concentration en biomasse relativement élevée (5% m/v) afin de se rapprocher de conditions réalistes du point de vue du procédé, et une dose d’enzyme faible (5 mg/g de matière sèche), correspondant pour l’industrie à des conditions permettant de réduire les coûts, et pour laquelle la marge d’amélioration des rendements d’hydrolyse est élevée.
La cinétique de cette hydrolyse sur 5 jours est présentée sur la Figure 1. Dans les conditions choisies, le rendement final d’hydrolyse de la paille de blé est proche de 100%, ce qui signifie que la quasi-totalité de la cellulose a été transformée en monomères de glucose. Le miscanthus et le peuplier sont plus récalcitrants, puisque dans les mêmes conditions ils ne sont hydrolysés qu’à 50 et 60% respectivement. Les objectifs d’amélioration sont multiples : dans le cas de la paille, il s’agira d’augmenter les rendements au début de l’hydrolyse (à 24 et 48h) et donc d'accélérer la réaction, tandis que pour le miscanthus et le peuplier il sera possible d’améliorer à la fois la cinétique initiale et le rendement après une période plus longue (96h par exemple).
Dans les mêmes conditions, le cocktail de référence a ensuite été supplémenté par les différents sécrétomes d’Aspergillus. Dans un souci de simplification expérimentale, à une quantité fixe de cocktail, des volumes égaux de chacun des sécrétomes concentrés ont été ajoutés, selon le protocole établi dans Berrin et al. (« Exploring the Natural Fungal Biodiversity of Tropical and Temperate Forests toward improvement of Biomass Conversion. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6483-6490, 2012). Fa quantité de protéines ajoutées n’est pas la même dans tous les échantillons, mais elle reflète les proportions initiales de protéines sécrétées par les souches fongiques sur chaque milieu de culture. Ces essais ont initialement été réalisés en tubes, en triplicats, mais les biomasses utilisées étant hétérogènes, il est apparu que la variabilité des résultats était importante. Les tests de saccharification ont été miniaturisés en microplaques et automatisés à l’aide d’un robot Tecan, selon une méthode déjà développée dans Navarro et al. (« Automated assay for screening the enzymatic release of reducing sugars from micronized biomass. Microb. Cell Factories 9, 58, 2010).
Ainsi, la biomasse est broyée finement et une suspension suffisamment homogène est réalisée pour pouvoir être pipetée en microplaques, avant ajout d’un cocktail de référence et différents sécrétomes. Chaque test compte 7 réplicats. Les données issues de trois séries d’hydrolyse (une en tubes et deux en microplaques) ont été traitées statistiquement à l’aide d’un test de Student.
Grâce aux données issues du test de saccharification mis au point, l’influence sur le rendement d’hydrolyse des sécrétomes peut être comparée pour chaque biomasse (Figure 2A-C). Les différences de performance sur les trois biomasses sont importantes : plusieurs sécrétomes permettent d’améliorer à la fois l’hydrolyse de la paille et celle du miscanthus, dès 24h.
Exemple 8 : Tests de saccharification de biomasse en présence de polypeptides à activité polysaccharide oxydase :
Les tests de supplémentation du cocktail de T. reesei par les polypeptides pour la saccharification du miscanthus ont été réalisés en triplicats selon la méthode d'hydrolyse enzymatique décrite plus haut, en utilisant 5 mg de biomasse, 1 mg/g MS du cocktail K975 et 80 Ul/g MS de b-glucosidase apporté par le cocktail SP 188, pendant 24h à 45°C et 850 rpm. Dans une partie des échantillons, un traitement par les LPMO (2,2 mM) en présence d'ascorbate 1 mM a été effectué pendant 24h avant le début de l’hydrolyse ; dans l'autre partie, les LPMO et l’ascorbate ont été ajoutés au début de l’hydrolyse, en même temps que le cocktail cellulo lytique.
Dans les échantillons de référence, les polypeptides n’ont pas été ajoutés. Après 24h, la réaction a été arrêtée et la concentration de glucose dans les échantillons a été mesurée à l’aide du réactif Glucose GOD-POD (Biolabo).
Exemple 9 : Sélection et production de protéines fongiques d'intérêt Afin de pouvoir étudier la fonction des polypeptides d’intérêt, il a été décidé de les produire de manière hétérologue dans la levure Pichia pastoris, à l’aide de gènes synthétiques placés dans un vecteur. Plusieurs versions de la séquence d 'Aspergillus aculeatus ont été exprimées (avec le module X273 N-terminal seul, avec une extension C- terminale tronquée, et avec l’extension C-terminale complète), ainsi qu’une protéine similaire comportant une extension C-terminale très courte, retrouvée chez Podospora anserina (PaX273).
Chacune des constructions testées débute par un peptide signal, suivi de l’histidine n-terminale impliquée dans la triade catalytique, et se termine à une position terminale variable. Pour les clones issus d 'Aspergillus aculeatus, la séquence polypeptidique de référence est SEQ ID N°2. Pour le clone issu de Podospora anserina, la séquence polypeptidique de référence est SEQ ID N°l.
Tableau 2: Séquences polypeptidiques choisies pour l’expression chez Pichia pastoris.
Figure imgf000057_0001
Au total, 4 gènes ont donc été synthétisés et transformés chez Pichia pastoris (voir Tableau 2). Les transformants correspondants ont été cultivés en petits volumes, selon la procédure accélérée mise en place au laboratoire (Haon et al., « Recombinant protein production facility for füngal biomass-degrading enzymes using the yeast Pichia pastoris. Front Microbiol. 6, 2015) afin de vérifier la bonne expression des protéines. Exemple 10 : Etude d’une nouvelle famille de LPMO fongiques
Analyse bio-informatique de la famille X273
Afin de mesurer l'étendue de la famille X273 dans les génomes fongiques, une recherche d'homologies basée sur la séquence du module X273 de Podospora anserina, d'une longueur de 165 acides aminés, a été effectuée, à l’aide de l’outil NCBI Blast, et en ne gardant que les séquences les plus proches (e-value égale ou inférieure à le-18).
Dans un second temps, en vue d’optimiser la sélection des séquences polypeptidiques d’intérêt, on se base sur un alignement de séquences réalisé à l'aide de Clustal Oméga (EMBL-EBI), puis on réalise une curation manuelle afin d’écarter les séquences suivantes :
- Fragments N-ter ou C-ter ne correspondant pas à des protéines entières (notamment celles ne comportant pas la lere histidine, caractéristique des LPMOs) ;
- Séquences dont l'extrémité N-ter ne correspond pas à un peptide signal selon le logiciel SignalP 4.1. ;
- Séquences comportant des insertions ou des délétions importantes, possiblement dues à de mauvais modèles d'épissage. ;
- Séquences ayant une extension C-terminale très longue.
Outre SEQ ID N°1 et 2, on parvient ainsi à une liste affinée de prêt de 379 séquences polypeptidiques (SEQ ID N°7 à 383), provenant d'organismes fongiques, et principalement d'ascomycètes : 335 séquences, contre 41 provenant de basidiomycètes et 3 de champignons non classifiés.
Les acides aminés consensus sont représentés graphiquement en figure 3, après alignement des 378 modules catalytiques correspondant aux séquences protéiques SEQ ID N°l, 2 et 7 à 382. La figure est générée par l’application WebLogo, selon Crooks et al. (WebLogo : A Sequence Logo Generator. Genome Res. 14, 1188-1190 ; 2004).
L'alignement des séquences correspondant au module X273 révèle plusieurs régions bien conservées au sein de la famille. Toutes les séquences comportent notamment une histidine N-terminale, ainsi qu'une deuxième histidine strictement conservée, ce qui est une caractéristique du centre actif (« Histidine brace ») de toutes les LPMO caractérisées jusqu'à présent. On compte une vingtaine d'autres résidus strictement conservés, dont 6 cystéines potentiellement impliquées dans la formation de ponts disulfures. En plus du module X273, la plupart des protéines de la liste possèdent une extension C-terminale, plus ou moins longue selon les espèces. Pour 7 d'entre elles, trouvées chez 4 organismes différents, cette extension comporte un module de liaison à la cellulose (CBM1).
Dans le tableau 3, les positions relatives de ces acides aminés conservés sont déterminées par rapport aux séquences références SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.
Tableau 3: Positions conservées dans le module catalytique X273
Figure imgf000059_0001
Production hétérologue et test d'activité
Les clones de P. pastoris exprimant les X273 d'A. aculeatus et de P. anserina ont été utilisés pour produire les protéines en fioles de 1L. La version de la protéine d'A. aculeatus retenue est celle ayant été la plus produite en petits volumes, c'est à dire celle qui a été tronquée en laissant une dizaine d’acides aminés de l’extension C-terminale. Après purification, on obtient une quantité totale de 47,5 mg pour AaX273 et 61 mg pour PaX273. Les protéines purifiées ont ensuite été chargées en cuivre, afin que leur centre actif soit fonctionnel, et l’excédent de cuivre éliminé par diafiltration. Une analyse par spectrométrie de masse avec plasma à couplage inductif (ICP-MS) a permis de confirmer la présence d’environ un atome de cuivre par molécule de X273.
Grâce à un essai fluorimétrique en présence d'Amplex Red, la production d'fifiCh par les enzymes X273 en présence d'un donneur d'électron (acide ascorbique) et en l'absence de substrat a pu être établie, ce qui indique que ces enzymes ont une activité d’oxydation et se comportent comme les autres familles de LPMO.
Caractérisation des produits de dégradation de la cellulose
Afin de déterminer si les LPMO ont une activité sur la cellulose, on peut observer indirectement leur effet en utilisant leur synergie avec les cellulases. Ainsi, après avoir laissé agir les protéines X273 sur des nanofibrilles de celluloses (NCF), celles-ci ont été hydrolysées par la CBHI (Cel7A) de T. reesei. La quantité de cellobiose mesurée par chromatographie d'échange d'ions (HPAEC-PAD) à la suite de cette hydrolyse est plus importante dans les échantillons ayant été traités par les X273 que dans l’échantillon témoin (voir Figure 4).
Cela indique que les X273 semblent introduire dans les chaînes de cellulose des coupures servant de nouvelles extrémités d'attaque à la cellobiohydrolase, qui libère donc plus de cellobiose que lorsqu'elle agit seule.
La visualisation de l’action directe des LPMO sur les fibres de cellulose est plus difficile, étant donné que seuls les polysaccharides solubles (dont le degré de polymérisation est généralement inférieur à 6) sont détectés par les méthodes de chromatographie. On peut toutefois quantifier les courtes chaînes de cellulose libérées par l’accumulation de ces clivages, et déterminer s’il s’agit d’oligosaccharides natifs, ou oxydés (notamment en Ci et/ou en C4).
Ainsi, des tests ont menés sur PASC ( Phosphoric Acid Swollen Cellulose ) et Avicel (cellulose microcristalline), en présence de H2O2, et en diminuant la quantité de donneur d’électrons selon les conditions proposées par Bissaro et al. (« Oxidative cleavage of polysaccharides by monocopper enzymes dépends on H2O2 ». Nat. Chem. Biol. 13, 1123- 1128 ; 2017). En augmentant les quantités d’enzyme AaX273, des produits ont pu être observés sur les deux substrats. Les deux enzymes libèrent du cellobiose, du cellotriose, du cellotetraose et du cellopentaose. Saccharification de biomasse prétraitée
Après aperçu de l’activité des X273 sur la cellulose, leur activité sur des substrats plus complexes a été évaluée.
Les deux sécrétomes contenant des X273 ayant montré une amélioration de l'hydrolyse sur le miscanthus prétraité, c'est cette biomasse qui a été choisie pour réaliser les tests de saccharification. Afin de faciliter l’homogénéisation, une proportion plus faible de biomasse a été utilisée que précédemment (0,5% m/v), et la dose d'enzyme du cocktail de référence a également été diminuée (1 mg/g de matière sèche). Une dose de X273 de 0,2 mg/g de matière sèche a été ajoutée. Deux types d'hydrolyse ont été effectués :
- en mettant en contact les protéines X273 avec la biomasse pendant 24h puis en ajoutant le cocktail de référence ; et
- en faisant agir simultanément les dites protéines et le cocktail de référence.
Les données obtenues après 24h d’hydrolyse du miscanthus par le cocktail de référence, avec ou sans ajout de AaX273 ou PaX273, et en particulier de AaX273, sont illustrées en Figure 5.
Ainsi, après 24h d'hydrolyse, on observe une augmentation de la quantité de glucose en présence des LPMO, principalement lorsque l'ajout des protéines s'est fait de manière simultanée. Il existe donc une synergie entre les X273 et le cocktail cellulolytique de T. reesei.
Exemple 11 : pré-traitement de substrat cellulosique PASC en présence d’une sélection d’enzymes appartenant à la famille X273.
Les résultats obtenus sont représentés en figure 6, selon un protocole similaire à celui utilisé pour la figure 4. Quatre enzymes sont testées, et leur impact sur le niveau de cellobiose libéré en présence d’une cellulase de Trichoderma reesei a été comparé avec un contrôle PASC sans mise en contact préalable avec la dite enzyme.
Il apparaît ainsi que l’ensemble de ces enzymes testées, de séquence SEQ ID N°2, SEQ ID N°175, SEQ ID N°208, et SEQ ID N°383, améliore l’accessibilité de la cellulose aux cellulases, par rapport à un simple traitement PASC, en améliorant la cellobiose libérée après traitement avec une cellulase de T. reesei (effet synergique). Pour référence, la séquence SEQ ID N°383 présente au moins 40% d’identité de séquence avec SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.
LISTAGE DE SEQUENCES
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SEP ID NO. 1
MHFSTVSSALGLASLVSAHGVVLKPASRKPGDATTEACGRAMVNFYKQDETSYP EAFLRSNPLPDRNKCNLFLCKGYQFADNAANVQSYKPGDSVEYEVYIRIPHSGYA NVSIVDTTTNKVFGSPFVSWASGYAASSKPPADQTKFSVKIPEFGAQCAAAGVCV FQ WH WF G AGQT Y Q S CTDFT V AAP V AP AEP APEHGHGHRIRGQ SRW
SEP ID NO. 2
MKQTGSIFAFAGFVSMANAHGFVTSPQPRMPGSAMEKACGQQVYNNQEADNYG NIQGEFQIASGQSDYDAEACDIWFCKGYKYADNTANVQSYKPGEVIDFTVDIRAP HTGTANVSVVDTATNTMFSQPFIYWSVYASTATGVTANETSFSVTMPTDFGDKC NEAGACVFQWWWDARSIDQTYESCVDFTFSGSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSAA AAV AT S AAS S ST S S A AETTT AAS AAVT SP AAANNI AP V S S S GPTTF AT S VKQT ATA AAVSSATSTSVSFPTDGTAEEQFTWVASVFKAFFNYAN
SEP ID NO. 3
MHFST V S S AEGE ASEV SA SEP ID NO. 4
MKQTGSILALAGLV SMANA
SEP ID NO. 5
HGVVLKPASRKPGDATTEACGRAMVNFYKQDETSYPEAFLRSNPLPDRNKCNLFL CKGYQFADNAANVQSYKPGDSVEYEVYIRIPHSGYANVSIVDTTTNKVLGSPLVS WAS GY AAS SKPP ADQTKF S VKIPELG AQC AAAG V C VLQ WH WF G AGQT Y Q S CTD ET SEP ID NO. 6
HGFVTSPQPRMPGSAMEKACGQQVYNNQEADNYGNIQGELQIASGQSDYDAEAC DI WLCKG YKY ADNT AN V Q S YKPGE VIDFT VDIRAPHT GT AN V S V VDT ATNTML S QPLIYWSVYASTATGVTANETSFSVTMPTDLGDKCNEAGACVLQWWWDARSIDQ TYESCVDFT

Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°l, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e- value de le 18 ou moins.
2. Polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 40% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°l, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
3. Polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 80% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°l, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
4. Polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence choisie parmi SEQ ID N°5 à SEQ ID N°383.
5. Composition à activité polysaccharide-oxydase, caractérisée en ce qu’elle comprend un polypeptide à activité polysaccharide oxydase tel que défini selon la revendication 1 ou 2 ou 3 ou 4.
6. Composition à activité polysaccharide-oxydase selon la revendication 5, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre au moins un polypeptide à activité polysaccharide-degradase choisi parmi : une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une carbohydrate oxydase.
7. Kit comprenant au moins :
- une première partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase tel que défini selon la revendication 1 ou 2 ou 3 ou 4, ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase; - une seconde partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharide-dégradase choisi parmi une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une carbohydrate oxydase, ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-dégradase.
8. Un hôte apte à exprimer de manière recombinante un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase tel que défini selon la revendication 1 ou 2 ou 3 ou 4 ;
9. Acide nucléique isolé codant pour un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase tel que défini selon la revendication 1 ou 2 ou 3 ou 4.
10. Procédé d’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique, comprenant au moins une étape de mise en contact du dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase tel que défini selon la revendication 1 ou 2 ou 3 ou 4, ou d’une composition à activité polysaccharide-oxydase telle que définie selon la revendication 5 ou 6.
11. Procédé de production d’alcool à partir d’un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu’il comprend l’obtention d’un sucre par un procédé tel que défini selon la revendication 10, et la fermentation alcoolique dudit sucre par un microorganisme alcooligène.
12. Procédé de préparation d’un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, le dit substrat avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°l, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
13. Procédé de défibrillation d’un substrat cellulosique, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose, lequel a été préalablement mis en contact avec un donneur d’électrons et un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d’un donneur d’électron; et b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de défibriller le dit substrat,
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°l, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
14. Procédé de fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à:
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, ledit substrat cellulosique avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer lesdites fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique,
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°l, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le 18 ou moins.
15. Fibres de celluloses issues d’un procédé de défibrillation selon la revendication 13, et/ou d’un procédé de fabrication de fibres de cellulose selon la revendication 14.
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