WO2020213665A1 - Ｉｌ－６阻害剤及びｃｃｒ２阻害剤を組み合わせて投与することを特徴とする泌尿器がんの治療剤 - Google Patents

Ｉｌ－６阻害剤及びｃｃｒ２阻害剤を組み合わせて投与することを特徴とする泌尿器がんの治療剤 Download PDF

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Hiroshima University NUC
Tokyo Womens Medical University
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention is characterized in that an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor are administered in combination, and the treatment of urinary cancer, particularly lysine (K) -specific demethylase 6A (KDM6A), is impaired.
  • urinary cancer particularly lysine (K) -specific demethylase 6A (KDM6A)
  • KDM6A lysine -specific demethylase 6A
  • Bladder cancer is a malignant tumor of urothelial cells, and its incidence is increasing with the aging of the population. Early superficial cancer can be treated by transurethral resection of the bladder tumor, but it has the characteristic of being prone to recurrence. In addition, the prognosis of advanced muscular layer invasive cancer and metastatic cases has not been improved, and a new treatment method based on the molecular pathology is required.
  • UTX ubiquitously translated tetratricopeptide repeat X chromosome, also known as lysine (K) -specific demethylase 6A (KDM6A)
  • KDM6A lysine -specific demethylase 6A
  • Patent Document 1 bladder cancer is the most common, and prostate cancer and penile cancer are also high, and UTX function deficiency causes tumor development in the urological field. It is considered to be deeply involved (Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3).
  • Non-Patent Document 4 As a paper showing the involvement of Utx in the development of bladder cancer, an experimental model of transplantation into immunodeficient mice using a human bladder cancer cell line having a Utx mutation has been reported (Non-Patent Document 4). Is the result of xenotransplantation using cultured cells, and it is hard to say that it is a model that reflects the deletion of Utx function in vivo. So far, no studies have been reported in which bladder-specific Utx-deficient (Utx ⁇ / ⁇ ) mice were produced and analyzed by focusing on bladder cancer using a genetic modification method.
  • IL-6 is a cytokine also called B cell stimulator 2 (BSF2) or interferon ⁇ 2.
  • BSF2 B cell stimulator 2
  • IL-6 was discovered as a differentiation factor involved in the activation of B lymphoid cells (Non-Patent Document 5), and was subsequently revealed to be a multifunctional cytokine that affects the functions of various cells. (Non-Patent Document 6). IL-6 has been reported to induce maturation of T lymphocytes (Non-Patent Document 7).
  • CCL2 is a chemokine related to innate immunity, Th2 effector response, CD4 + T cell differentiation, etc., and is also referred to as CC-chemokine ligand 2, monocyte chemotactic protein 1, MCP-1 (Non-Patent Document 8).
  • CCR2 is known as a receptor for CCL2.
  • Non-Patent Document 9 the infiltration ability of sphere-forming MB49 cells has been reduced by blocking IL-6 in vitro for the obtained sphere-forming cells (sMB49) after suspension-culturing mouse bladder cancer MB49 cells. It has been reported (Non-Patent Document 9). In addition, it has been reported that as a result of administration of anti-IL-6 antibody and anti-CCL2 antibody to mice with invasive breast cancer, cancer infiltration was suppressed and survival time was extended (Non-Patent Document 10). However, the therapeutic effect of the combined use of IL-6 inhibitor and CCR2 inhibitor on bladder cancer has not been reported.
  • An object of the present invention is to provide a novel therapeutic agent for urinary cancer.
  • the present inventors conducted diligent research to solve the above problems. As a result, for urinary cancers, especially urinary cancers in which the function of lysine (K) -specific demethylase 6A (KDM6A) was reduced, tumor growth was significantly increased by suppressing both CCL2 / CCR2 activity and IL-6 activity. It was found that it can be suppressed.
  • KDM6A lysine -specific demethylase 6A
  • the present invention is based on such findings, and specifically includes the following.
  • the therapeutic agent and / or preventive agent according to any one of [1] to [3], wherein the IL-6 inhibitor is an anti-IL-6 antibody or an anti-IL-6 receptor antibody.
  • KDM6A lysine
  • the present invention further includes the following aspects.
  • a method for treating and / or preventing urinary cancer which comprises a step of administering an effective amount of an IL-6 inhibitor to an individual and a step of administering an effective amount of a CCR2 inhibitor to an individual.
  • a method for treating and / or preventing urinary cancer which comprises a step of administering an effective amount of a combination of an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor to an individual.
  • KDM6A lysine -specific demethylase 6A
  • Preventive method or use [34] The inhibitor, combination, therapeutic method, preventive method or use according to [18] to [33], wherein the cancer is a cancer having a mutation in the KDM6A gene.
  • the inhibitor, combination, therapeutic method, preventive method or use according to [34] wherein the mutation in the KDM6A gene is a function-deficient mutation.
  • [36] The inhibitor, combination, therapeutic method, preventive method or use according to any one of [18] to [35], wherein the cancer is a cancer in which the expression or function of p53 is reduced.
  • Figure 1A shows control mice (Utx +/+ , p53 +/- mice) and Utx ⁇ / ⁇ , p53 + 10 weeks after administration of N-butyl-N- (4-hydro-oxybutyl) nitorosamine (BBN).
  • / -It is a figure which shows the ratio of normal tissue (Normal), dysplasia-carcinoma in situ (Dysplasia-CIS), and invasive cancer to muscle layer (Muscle invasive cancer) in a mouse bladder.
  • FIG. 1B is a photograph showing the results of hematoxylin and eosin staining of tissue sections collected from the bladder of Utx ⁇ / ⁇ , p53 +/- mice to which BBN was administered. Arrows in the figure indicate infiltrating cancer into the muscle layer.
  • Figure 2 shows the results of transcriptome analysis and pathway analysis by KEGG using RNA extracted from the urothelium of control Utx +/+ and Utx ⁇ / ⁇ mice at 4 weeks of BBN administration. It is a figure.
  • Figure 2A is a diagram of control mice and UTX delta / delta mice Pathways comparison result shows a path that increased expression as compared to control mice at UTX delta / delta mice.
  • FIG. 3A shows the expression of UTX protein in Utx-expressing strain (EV clones) and Utx-deficient strain (KO clones) derived from mouse bladder cancer cell line MBT2 by Western blotting using anti-UTX antibody or anti- ⁇ -actin antibody. It is a photograph showing the result of analysis by.
  • FIG. 3B is a diagram showing the administration schedule of propagermanium and / or MR16-1 in tumor-transplanted mice.
  • 3C and D are diagrams showing the tumor volume (Estimated tumor volume) and tumor weight (Tumor weight) of a tumor resulting from transplantation of a Utx-expressing strain (C) or a Utx-deficient strain (D) into C3H mice. ..
  • a therapeutic or prophylactic agent for urinary cancer a drug for treating or preventing urinary cancer, which is characterized by suppressing both IL-6 activity and CCR2 / CCL2 activity.
  • composition a therapeutic or prophylactic agent for urinary cancer
  • the urinary cancer is bladder cancer, prostate cancer, kidney cancer, or penile cancer.
  • urinary cancer is a cancer in which the expression of lysine (K) -specific demethylase 6A (KDM6A) is reduced, or a cancer in which the function of KDM6A is reduced, and is optionally mutated to the KDM6A gene ( For example, a cancer having a function-deficient mutation).
  • the urinary cancer is a urinary cancer with a mutation in p53.
  • the combined use of an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor has a synergistic effect in the treatment or prevention of urinary cancer as compared to treatment with an IL-6 inhibitor or CCR2 inhibitor alone. Can be obtained.
  • a therapeutic or prophylactic agent for urinary cancer which contains an IL-6 inhibitor as an active ingredient and is to be administered in combination with a CCR2 inhibitor.
  • the therapeutic or prophylactic agent for urinary cancer containing the IL-6 inhibitor is administered separately or sequentially at the same time as the CCR2 inhibitor.
  • the dosage forms of these inhibitors may be the same or different dosage forms. For example, both may be one of a parenteral preparation, an injection, a drip, and an intravenous drip and may have different dosage forms, and both may be a parenteral preparation, an injection, a drip, an intravenous drip. It may be one of the drip infusions and may be of the same type.
  • the embodiment comprises an IL-6 inhibitor; a step of administering an IL-6 inhibitor and a step of administering a CCR2 inhibitor for use in the treatment or prevention of urinary cancer in combination with a CCR2 inhibitor. It can be described as the use of an IL-6 inhibitor in the manufacture of a therapeutic or prophylactic agent for urinary cancer for administration in combination with a method of treating or preventing the disease; or a CCR2 inhibitor.
  • a therapeutic or prophylactic agent for urinary cancer for administration in combination with an IL-6 inhibitor, which contains a CCR2 inhibitor as an active ingredient.
  • the therapeutic or prophylactic agent for urinary cancer containing the CCR2 inhibitor is administered separately or sequentially at the same time as the IL-6 inhibitor.
  • the dosage forms of these inhibitors may be the same or different dosage forms. For example, both may be one of a parenteral preparation, an injection, a drip, and an intravenous drip and may have different dosage forms, and both may be a parenteral preparation, an injection, a drip, an intravenous drip. It may be one of the drip infusions and may be of the same type.
  • This embodiment is a CCR2 inhibitor for use in the treatment or prevention of urinary cancer in combination with an IL-6 inhibitor; a step of administering an effective amount of an IL-6 inhibitor to an individual and an effective amount of CCR2 inhibition to an individual.
  • Methods of treating or preventing urinary cancer including the step of administering the agent; or the use of a CCR2 inhibitor in the manufacture of a therapeutic or prophylactic agent for urinary cancer for administration in combination with an IL-6 inhibitor. Can be expressed.
  • a therapeutic or prophylactic agent for urinary cancer containing a combination of an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor as an active ingredient.
  • the embodiment is a combination of an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor for use in the treatment or prevention of urinary cancer; a step of administering to an individual an effective amount of a combination of an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor.
  • a method of treating or preventing urinary cancer including; or can also be described as the use of a combination of an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor in the manufacture of a therapeutic or prophylactic agent for urinary cancer.
  • the "IL-6 inhibitor” in the present invention is a substance that blocks signal transduction by IL-6 and inhibits the biological activity of IL-6.
  • the IL-6 inhibitor is preferably a substance having an inhibitory effect on the binding of any of IL-6, IL-6 receptor and gp130.
  • Examples of the IL-6 inhibitor of the present invention include anti-IL-6 antibody, anti-IL-6 receptor antibody, anti-gp130 antibody, IL-6 variant, soluble IL-6 receptor variant, or IL-6 or IL. Examples thereof include a partial peptide of the -6 receptor and a low molecular weight substance exhibiting an activity similar to these, but the present invention is not particularly limited.
  • an antibody that recognizes the IL-6 receptor can be preferably mentioned.
  • IL-6 transmits its biological activity on cells via two proteins.
  • One is the IL-6 receptor of a ligand-binding protein having a molecular weight of about 80 kD to which IL-6 binds (Non-Patent Documents 4 and 5).
  • the IL-6 receptor exists as a soluble IL-6 receptor mainly composed of its extracellular region, in addition to the membrane-bound type that penetrates the cell membrane and is expressed on the cell membrane.
  • the other is the membrane protein gp130 having a molecular weight of about 130 kD involved in non-ligand-binding signal transduction.
  • IL-6 and IL-6 receptors form an IL-6 / IL-6 receptor complex, which then binds to gp130 to transfer the biological activity of IL-6 into cells (Taga). , T. et al., Cell (1989) 58, 573-581).
  • the "CCR2 inhibitor” in the present invention is a substance that blocks signal transduction by CCL2, CCL7 or CCL8 and inhibits the biological activity of CCL2, CCL7 and / or CCL8, and is a CCL2 inhibitor, CCL7 inhibitor and Contains a CCL8 inhibitor.
  • the "CCL2 inhibitor” in the present invention is a substance that blocks signal transduction by CCL2 and blocks the biological activity of CCL2.
  • Examples of the CCL2 inhibitor of the present invention include an anti-CCL2 antibody, an antibody against CCR2 which is a receptor for CCL2 (anti-CCR2 antibody), and a low molecular weight substance which binds to CCR2 and blocks signal transduction by CCL2, but is particularly limited. It is not something that is done.
  • the CCL2 inhibitor of the present invention preferably includes an anti-CCL2 antibody, a low molecular weight substance (for example, propagermanium) that binds to CCR2 and blocks signal transduction by CCL2.
  • CCL2 is a chemokine related to innate immunity, Th2 effector response, CD4 + T cell differentiation, etc., and is also referred to as CC-chemokine ligand 2, monocyte chemotactic protein 1, MCP-1 (Paul, W.E., Fundamental Immunology, 5 th). Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (Philadelphia, 2003) p.801-840).
  • CCL2 is known to bind and signal via the chemokine receptor CCR2.
  • CCR2 is a 7-transmembrane G protein-coupled receptor expressed on numerous cells, including monocytes, T cells, B cells and basophils.
  • the origin of the antibody in the present invention is not particularly limited, but an antibody derived from a mammal is preferable, and an antibody derived from a human can be mentioned more preferably.
  • the anti-IL-6 antibody, anti-IL-6 receptor antibody, anti-gp130 antibody, anti-CCL2 antibody and anti-CCR2 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody by using known means.
  • As the anti-IL-6 antibody, anti-IL-6 receptor antibody, anti-gp130 antibody, anti-CCL2 antibody and anti-CCR2 antibody used in the present invention a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced by hybridomas and those produced by hosts transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques.
  • IL-6 By binding to IL-6, such anti-IL-6 antibody inhibits the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocks the intracellular transmission of IL-6 biological activity.
  • anti-IL-6 antibodies include MH166 (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18,951-956) and SK2 antibody (Sato, K. et al., 21st Japan). The General Assembly of the Japan Society for Immunology, Academic Records (1991) 21, 1 66), etc. can be mentioned.
  • an anti-IL-6 antibody and the like will be described as examples of various antibodies used in the present invention, but other antibodies basically use the same method and known techniques (anti-CCL2 antibody).
  • the anti-IL-6 antibody-producing hybridoma can be produced basically by using a known technique as follows. That is, IL-6 is used as a sensitizing antigen, immunized according to a normal immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and by a normal screening method. It can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells. Specifically, the following may be used to prepare an anti-IL-6 antibody.
  • human IL-6 used as a sensitizing antigen for antibody acquisition is Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550, J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541, or Agr. Biol.
  • IL-6 gene / amino acid sequence disclosed in Chem. (1990) 54, 2685-2688 Obtained by using the IL-6 gene / amino acid sequence disclosed in Chem. (1990) 54, 2685-2688.
  • the desired IL-6 protein is purified from the host cell or the culture supernatant by a known method. Then, this purified IL-6 protein may be used as a sensitizing antigen.
  • a fusion protein of IL-6 protein and another protein may be used as a sensitizing antigen.
  • the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody by using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced by hybridomas and those produced by hosts transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. By binding to the IL-6 receptor, this antibody blocks the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocks the intracellular transmission of IL-6 biological activity.
  • Such antibodies include MR16-1 antibody (Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
  • PM-1 antibody Hirata, Y. et al. , J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), AUK12-20 antibody, AUK64-7 antibody or AUK146-15 antibody (International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • PM-1 antibody is exemplified as a preferable monoclonal antibody against human IL-6 receptor
  • MR16-1 antibody is mentioned as a preferable monoclonal antibody against mouse IL-6 receptor.
  • the anti-IL-6 receptor monoclonal antibody-producing hybridoma can be produced basically by using a known technique as follows. That is, using the IL-6 receptor as a sensitizing antigen, immunizing it according to a normal immunization method, and fusing the obtained immune cells with a known parent cell by a normal cell fusion method, a normal screening method. Can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells. Specifically, the following may be used to prepare an anti-IL-6 receptor antibody.
  • the human IL-6 receptor used as a sensitizing antigen for antibody acquisition is disclosed in European Patent Application Publication No. EP 325474
  • the mouse IL-6 receptor is disclosed in Japanese Patent Application Publication No. 3-155795. Obtained by using the IL-6 receptor gene / amino acid sequence.
  • IL-6 receptor proteins are those expressed on the cell membrane and those released from the cell membrane (soluble IL-6 receptor) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, There are two types, 673-676). Soluble IL-6 receptors are composed substantially of the extracellular region of the IL-6 receptor that binds to the cell membrane, and the membrane is deficient in the transmembrane region or the transmembrane region and the intracellular region. It differs from the bound IL-6 receptor. As the IL-6 receptor protein, any IL-6 receptor may be used as long as it can be used as a sensitizing antigen for the production of the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention.
  • the target IL-6 receptor protein After inserting the gene sequence of the IL-6 receptor into a known expression vector system to transform an appropriate host cell, the target IL-6 receptor protein is known from the host cell or the culture supernatant.
  • the purified IL-6 receptor protein may be used as a sensitizing antigen.
  • cells expressing the IL-6 receptor or a fusion protein of the IL-6 receptor protein and another protein may be used as a sensitizing antigen.
  • the anti-gp130 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody by using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced by hybridomas and those produced by hosts transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. By binding to gp130, this antibody blocks the binding of the IL-6 / IL-6 receptor complex to gp130 and blocks the intracellular transmission of IL-6 biological activity. Examples of such an antibody include AM64 antibody (Japanese Patent Laid-Open No. 3-219894), 4B11 antibody and 2H4 antibody (US5571513) B-S12 antibody and B-P8 antibody (Japanese Patent Laid-Open No. 8-291199).
  • the anti-gp130 monoclonal antibody-producing hybridoma can be produced basically by using a known technique as follows. That is, gp130 is used as a sensitizing antigen, immunized according to a normal immunization method, the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and a monoclonal antibody is obtained by a normal screening method. It can be produced by screening the producing cells. Specifically, the following may be used to prepare a monoclonal antibody. For example, gp130, which is used as a sensitizing antigen for antibody acquisition, is obtained by using the gp130 gene / amino acid sequence disclosed in European Patent Application Publication No. EP 411946.
  • the target gp130 protein After inserting the gene sequence of gp130 into a known expression vector system to transform an appropriate host cell, the target gp130 protein is purified from the host cell or culture supernatant by a known method, and this purification is performed.
  • the gp130 protein may be used as a sensitizing antigen.
  • cells expressing gp130 or a fusion protein of the gp130 protein and another protein may be used as a sensitizing antigen.
  • the mammal immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion, and is generally of rodents. Animals such as mice, rats, hamsters and the like are used. To immunize an animal with a sensitizing antigen, a known method is used. For example, as a general method, the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously in a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, or the like to an appropriate amount, and the suspension is optionally mixed with a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, and after emulsification.
  • a normal adjuvant for example, Freund's complete adjuvant, and after emulsification.
  • a suitable carrier can be used during sensitization antigen immunization.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells attached to cell fusion include splenocytes in particular.
  • Mammalian myeloma cells as the other parental cell fused to the immune cells are already known from various cell lines such as P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al. J. Immunol. (1979) ) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976)) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M.
  • the cell fusion of immune cells and myeloma cells is basically carried out by a known method, for example, the method of Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). It can be done according to the same procedure. More specifically, the cell fusion is carried out, for example, in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like are used, and if desired, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used in order to increase the fusion efficiency.
  • the ratio of immune cells to myeloma cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells, for example.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture medium suitable for the growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other ordinary culture mediums used for this type of cell culture can be used, and further.
  • Serum supplement such as cow fetal serum (FCS) can also be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are well mixed in the culture medium, and a PEG solution preheated to about 37 ° C., for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is usually used.
  • the desired fusion cells are formed by adding at a concentration of 30 to 60% (w / v) and mixing. Subsequently, by repeating the operation of sequentially adding an appropriate culture solution and centrifuging to remove the supernatant, a cell fusion agent or the like that is unfavorable for the growth of hybridoma can be removed.
  • the hybridoma is selected by culturing in a normal selective culture medium, for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing in the HAT culture medium is usually continued for several days to several weeks for a sufficient time for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die. The usual limiting dilution method is then performed to screen and clone hybridomas that produce the antibody of interest.
  • a normal selective culture medium for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing in the HAT culture medium is usually continued for several days to several weeks for a sufficient time for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die.
  • the usual limiting dilution method is then performed to screen and clone hybridomas that produce the antibody of interest.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with a desired antigen protein or antigen-expressing cells, and sensitized B lymphocytes are sensitized to human myeloma cells, such as U266. It is also possible to obtain a desired human antibody having a desired antigen or antigen-expressing cell-binding activity by fusing with (see Special Fair 1-59878). Furthermore, an antigen or antigen-expressing cells may be administered to a transgenic animal having a repertoire of human antibody genes to obtain a desired human antibody according to the method described above (International Patent Application Publication Nos.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture medium and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hybridoma is cultured according to a usual method and obtained as a culture supernatant thereof, or the hybridoma is administered to a mammal compatible with the hybridoma and propagated, and the ascites thereof is obtained.
  • the method of obtaining as is adopted.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibody, while the latter method is suitable for mass production of antibody.
  • an anti-IL-6 receptor antibody-producing hybridoma can be prepared by the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-139293.
  • a method of injecting a PM-1 antibody-producing hybridoma into the abdominal cavity of BALB / c mice to obtain ascites and purifying the PM-1 antibody from the ascites, or using this hybridoma in an appropriate medium for example, 10% bovine fetal serum, Cultivate in RPMI1640 medium containing 5% BM-Condimed H1 (Boehringer Mannheim), hybridoma SFM medium (GIBCO-BRL), PFHM-II medium (GIBCO-BRL), etc., and PM-1 antibody from the culture supernatant. It can be done by the purification method.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique can be used.
  • a gene recombination technique See, for example, Borrebaeck CAK and Larrick JW THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • mRNA encoding the variable (V) region of an antibody is isolated from a cell producing the antibody of interest, for example, a hybridoma.
  • mRNA isolation is performed by known methods such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) etc. to prepare total RNA, and mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia) etc. to prepare mRNA.
  • mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • a cDNA in the antibody V region is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis can be performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • the 5'-Ampli FINDER RACE Kit manufactured by Clontech
  • the 5'-RACE method using PCR for the synthesis and amplification of cDNA 1988
  • 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) can be used.
  • the desired DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated with the vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli or the like, colonies are selected, and a desired recombinant vector is prepared. The base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the dideoxy method.
  • a DNA encoding the V region of the antibody of interest is obtained, it is ligated with the DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • the DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing the DNA of the antibody C region.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter, as described later.
  • the host cell can then be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • a genetically modified antibody artificially modified for the purpose of reducing heterologous antigenicity to humans for example, a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody is used. it can.
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • the chimeric antibody is obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with the DNA encoding the human antibody C region, incorporating this into an expression vector, introducing it into a host, and producing it (Europe). See patent application publication number EP 125023, international patent application publication number WO 92-19759). Using this known method, chimeric antibodies useful in the present invention can be obtained.
  • Humanized antibodies also referred to as reshaped human antibodies or humanized antibodies, are those obtained by transplanting the complementarity determining regions (CDRs) of non-human mammals, such as mouse antibodies, into the complementarity determining regions of human antibodies.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the general gene recombination method is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • oligos prepared by preparing a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody so as to have an overlapping portion at the terminal portion. It is synthesized from nucleotides by the PCR method.
  • the human antibody C region is used for the chimeric antibody and the humanized antibody.
  • the human antibody C region include C ⁇ , and for example, C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3 or C ⁇ 4 can be used.
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • the chimeric antibody consists of a variable region of a non-human mammalian antibody and a C region derived from a human antibody
  • a humanized antibody consists of a complementarity determining region of a non-human mammalian antibody, a framework region derived from a human antibody, and C. It consists of regions, both of which have reduced antigenicity in the human body and are therefore useful as antibodies used in the present invention.
  • a preferred specific example of the humanized antibody of the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention is a humanized PM-1 antibody (see International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • a method for obtaining a human antibody in addition to the method described above, a technique for obtaining a human antibody by panning using a human antibody library is also known. For example, it is also possible to select a phage that binds to an antigen by expressing the variable region of a human antibody as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method. By analyzing the genes of the selected phage, the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • scFv single chain antibody
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed by a known method.
  • mammalian cells When mammalian cells are used, they can be expressed by a commonly used useful promoter, an antibody gene to be expressed, a DNA in which a poly A signal is functionally bound downstream thereof, or a vector containing the same.
  • a promoter / enhancer a human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer can be mentioned.
  • virus promoters / enhancers such as retrovirus, polyomavirus, adenovirus, and Simianvirus 40 (SV40) and human elongation factor 1 ⁇ (HEF1 ⁇ )
  • SV40 Simianvirus 40
  • HEF1 ⁇ human elongation factor 1 ⁇
  • a promoter / enhancer derived from mammalian cells such as the above may be used.
  • the method of Mulligan et al. Mulligan, RC et al., Nature (1979) 277, 108-114
  • HEF1 ⁇ promoter / enhancer the method of Mizushima et al. It can be easily carried out according to Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).
  • a commonly used useful promoter, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed can be functionally linked and expressed.
  • examples of the promoter include the lacZ promoter and the araB promoter.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Ward, ES et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, ES et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter
  • the method of Better et al. (Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043) may be followed.
  • the pelB signal sequence (Lei, S.P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) may be used when it is produced in the periplasm of Escherichia coli. After separating the antibody produced in the periplasm, the structure of the antibody is appropriately refolded and used (see, for example, WO 96/30394).
  • the expression vector can be used as a selectable marker.
  • Aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthing annin phosphoribosyl transferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene and the like can be included.
  • Production systems for antibody production include in vitro and in vivo production systems.
  • Examples of the in vitro production system include a production system using eukaryotic cells and a production system using prokaryotic cells.
  • Animal cells include (1) mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, etc., (2) amphibian cells such as Xenopus oocytes, or (3) insects.
  • Cells such as sf9, sf21, Tn5, etc. are known.
  • a plant cell a cell derived from Nicotiana tabacum is known, and this cell may be cultured in callus.
  • yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, and filamentous fungi, such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger.
  • Escherichia coli E. coli
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis are known as bacterial cells.
  • Antibodies can be obtained by introducing the target antibody gene into these cells by transformation and culturing the transformed cells in vitro. Culturing is carried out according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as the culture medium, and serum replacement fluid such as fetal bovine serum (FCS) can also be used in combination. Further, an antibody may be produced in vivo by transferring the cells into which the antibody gene has been introduced to the abdominal cavity of an animal or the like.
  • FCS fetal bovine serum
  • examples of the in vivo production system include a production system using animals and a production system using plants.
  • animals there are production systems using mammals and insects.
  • mammals goats, pigs, sheep, mice, cows and the like can be used (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993).
  • silkworm can be used as an insect.
  • plants for example, tobacco can be used.
  • the antibody gene is introduced into these animals or plants, and the antibody is produced and recovered in the body of the animal or plant.
  • an antibody gene is inserted in the middle of a gene encoding a protein uniquely produced in milk such as goat ⁇ -casein to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and this embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from milk produced by a transgenic goat or its offspring born from a goat that has received an embryo.
  • Hormones may be used in transgenic goats as appropriate to increase the amount of milk containing the desired antibody produced by transgenic goats. (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702).
  • silkworms When silkworms are used, the silkworms are infected with baculovirus in which the target antibody gene is inserted, and the desired antibody is obtained from the body fluid of the silkworms (Maeda, S.
  • the antibody gene of interest is inserted into a plant expression vector, such as pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens. Infect tobacco, such as Nicotiana tabacum, with this bacterium to obtain the desired antibody from the leaves of this tobacco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138). ..
  • DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) is separately incorporated into an expression vector to co-transform the host. It may be transformed, or the host may be transformed by incorporating DNA encoding the H and L chains into a single expression vector (see International Patent Application Publication No. WO 94-11523).
  • the antibody used in the present invention may be a fragment of the antibody or a modified product thereof as long as it can be suitably used in the present invention.
  • antibody fragments include Fab, F (ab') 2, Fv or single chain Fv (scFv) in which H chain and L chain Fv are linked with an appropriate linker.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector, and then an appropriate host cell is used.
  • an enzyme such as papain or pepsin
  • ScFv is obtained by linking the H chain V region and the L chain V region of an antibody.
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988)). 85, 5879-5883).
  • the H chain V region and the L chain V region in scFv may be derived from any of the antibodies described above.
  • the peptide linker linking the V region for example, any single-strand peptide consisting of amino acid 12-19 residues is used.
  • the DNA encoding scFv uses the DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody and the DNA encoding the L chain or L chain V region as templates, and encodes the desired amino acid sequence among those sequences.
  • the DNA portion to be used is amplified by the PCR method using a primer pair that defines both ends thereof, and then the DNA encoding the peptide linker portion and the primer that specifies that both ends thereof are linked to the H chain and the L chain, respectively. Obtained by combining pairs and amplifying.
  • an expression vector containing them and a host transformed by the expression vector can be obtained according to a conventional method, and the host can be used according to a conventional method.
  • ScFv can be obtained. Fragments of these antibodies can be obtained, expressed, and produced by the host in the same manner as described above.
  • the "antibody” in the present invention also includes fragments of these antibodies.
  • an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the "antibody” in the present invention also includes these antibody modifications.
  • Such an antibody-modified product can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods have already been established in this area.
  • the antibody produced and expressed as described above can be separated from the inside and outside of the cell and the host and purified uniformly.
  • the antibody used in the present invention can be separated and purified by affinity chromatography.
  • Examples of the column used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • Examples of the carrier used for the protein A column include HyperD, POROS, Sepharose F.F. and the like.
  • the separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and are not limited in any way.
  • the antibody used in the present invention can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. other than the above affinity chromatography.
  • Chromatography includes, for example, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration and the like. These chromatographies can be applied to HPLC (High performance liquid chromatography). Moreover, you may use reverse phase HPLC (reverse phase HPLC).
  • the concentration of the antibody obtained above can be measured by measuring the absorbance or ELISA. That is, in the case of measuring the absorbance, after appropriately diluting with PBS (-), the absorbance at 280 nm is measured, and 1 mg / ml is calculated as 1.35 OD.
  • Elisa it can be measured as follows. That is, 100 ⁇ l of goat anti-human IgG (manufactured by TAG) diluted to 1 ⁇ g / ml with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96-well plate (manufactured by Nunc) and incubated overnight at 4 ° C. to obtain the antibody. Immobilize. After blocking, an appropriately diluted antibody or sample containing the antibody used in the present invention, or 100 ⁇ l of human IgG (manufactured by CAPPEL) as a standard is added and incubated at room temperature for 1 hour.
  • alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG manufactured by BIOSOURCE
  • a substrate solution is added, and after incubation, the absorbance at 405 nm is measured using a MICROPLATE READER Model 3550 (manufactured by Bio-Rad) to calculate the concentration of the target antibody.
  • the IL-6 variant used in the present invention is a substance that has binding activity to the IL-6 receptor and does not transmit the biological activity of IL-6. That is, the IL-6 variant binds to the IL-6 receptor competitively with IL-6, but does not transmit the biological activity of IL-6, thus blocking signal transduction by IL-6.
  • the IL-6 variant is prepared by introducing a mutation by substituting an amino acid residue in the amino acid sequence of IL-6.
  • the origin of IL-6 which is the source of the IL-6 variant, does not matter, but in consideration of antigenicity and the like, human IL-6 is preferable.
  • the amino acid sequence of IL-6 is predicted by using a known molecular modeling program, for example, WHATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56). This is done by assessing the overall effect of the amino acid residues to be substituted.
  • IL- is introduced by introducing a mutation so that the amino acid is replaced by a usual PCR method using a vector containing a base sequence encoding the human IL-6 gene as a template. A gene encoding the 6 variants is obtained. If necessary, this can be incorporated into an appropriate expression vector to obtain an IL-6 variant according to the method for expressing, producing and purifying the recombinant antibody.
  • Specific examples of IL-6 variants include Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269,86-93, and Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO. It is disclosed in 96-18648 and WO96-17869.
  • the IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide used in the present invention has binding activity to IL-6 receptor or IL-6, respectively, and transmits the biological activity of IL-6. It is a substance that does not. That is, the IL-6 partial peptide or the IL-6 receptor partial peptide binds to the IL-6 receptor or IL-6, and by capturing these, the binding of IL-6 to the IL-6 receptor is specific. Inhibits. As a result, it does not transmit the biological activity of IL-6, thus blocking signal transduction by IL-6.
  • the IL-6 partial peptide or the IL-6 receptor partial peptide is an amino acid in part or all of the region involved in the binding of IL-6 to the IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor. It is a peptide consisting of a sequence. Such peptides usually consist of 10-80, preferably 20-50, more preferably 20-40 amino acid residues.
  • the IL-6 partial peptide or the IL-6 receptor partial peptide identifies the region involved in the binding of IL-6 to the IL-6 receptor in the amino acid sequence of the IL-6 or IL-6 receptor, and identifies the region. It can be prepared by a method usually known based on the amino acid sequence of a part or all of the region, for example, a genetic engineering method or a peptide synthesis method.
  • a DNA sequence encoding a desired peptide is incorporated into an expression vector, and a method for expressing, producing and purifying the recombinant antibody. Can be obtained according to.
  • a method usually used in peptide synthesis for example, a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method can be used. Specifically, it may be carried out according to the method described in "Development of Continued Drugs, Vol. 14, Peptide Synthesis (Supervised by Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten, 1991)".
  • an amino acid corresponding to the C-terminal of the peptide to be synthesized is bound to a support that is insoluble in an organic solvent, and the ⁇ -amino group and the side chain functional group are protected by an appropriate protective group.
  • the peptide chain is formed by alternately repeating the reaction of condensing amino acids one amino acid at a time in the order from the C-terminal to the N-terminal and the reaction of removing the protective group of the ⁇ -amino group of the amino acid or peptide bonded on the resin.
  • a method of stretching is used.
  • the solid phase peptide synthesis method is roughly classified into the Boc method and the Fmoc method according to the type of protecting group used.
  • a deprotection reaction and a cleavage reaction from the support of the peptide chain are carried out.
  • hydrogen fluoride or trifluoromethanesulfonic acid can be usually used in the Boc method
  • TFA can be usually used in the Fmoc method.
  • the protective peptide resin is treated in hydrogen fluoride in the presence of anisole. The protecting group is then eliminated and cleaved from the support to recover the peptide. By freeze-drying this, a crude peptide can be obtained.
  • the Fmoc method for example, in TFA, the deprotection reaction and the cleavage reaction from the support of the peptide chain can be carried out by the same operation as described above.
  • the obtained crude peptide can be separated and purified by applying it to HPLC.
  • the elution may be carried out under optimum conditions using a water-acetonitrile solvent usually used for protein purification.
  • the fraction corresponding to the peak of the obtained chromatography profile is fractionated and lyophilized.
  • the peptide fraction purified in this manner is identified by molecular weight analysis by mass spectrum analysis, amino acid composition analysis, amino acid sequence analysis, or the like.
  • Specific examples of the IL-6 partial peptide and the IL-6 receptor partial peptide are disclosed in JP-A 2-188600, JP-A-7-324097, JP-A-8-311098, and US Patent Publication US5210075.
  • the antibody used in the present invention may be a conjugated antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substance, and toxin.
  • PEG polyethylene glycol
  • Such a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. A method for modifying an antibody has already been established in this field.
  • the "antibody” in the present invention also includes these conjugated antibodies.
  • the "antibody” in the present invention includes those that have undergone post-translational modification. Post-translational modifications include, but are not limited to, modification of heavy or light chain N-terminal glutamine or glutamate to pyroglutamylation by pyroglutamylation.
  • anti-IL-6 receptor antibody in the present invention is tocilizumab, which is a humanized anti-IL-6 receptor IgG1 antibody, and a humanized anti-IL-6 receptor in which the variable region and constant region of tocilizumab are modified.
  • examples include antibodies and antibodies that bind to the same epitope as tocilizumab.
  • examples thereof include an antibody containing a chain variable region (heavy chain variable region of SA237) and a light chain variable region of SEQ ID NO: 6 (light chain variable region of SA237).
  • the light chain of SEQ ID NO: 8 (light chain of SA237).
  • Such antibodies can be obtained, for example, according to the methods described in WO2010 / 035769, WO2010 / 107108, WO2010 / 106812 and the like.
  • an antibody can be prepared using a gene recombination technique known to those skilled in the art (for example, Borrebaeck CAK and Larrick JW, THERAPEUTIC). See MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • Recombinant antibodies are produced by cloning the DNA encoding it from antibody-producing cells such as hybridomas or sensitized lymphocytes that produce the antibody, incorporating it into an appropriate vector, and introducing it into a host (host cell). You can get it.
  • the separation and purification of such an antibody may be performed by using the separation and purification method used in the usual purification of an antibody, and is not limited in any way.
  • chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected.
  • the antibody can be separated and purified.
  • an “antibody that binds to the same epitope” as a reference antibody is an antibody that blocks 50% or more of the reference antibody from binding to its own antigen in a competitive assay, and conversely, a reference antibody is a competitive assay. In, the above-mentioned antibody blocks 50% or more of binding to its own antigen. Specifically, an “antibody that binds to the same epitope” as a reference antibody blocks 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% or more of the binding of the reference antibody to its own antigen in a competitive assay. It refers to an antibody.
  • competing assays can be used to identify antibodies that compete with tocilizumab for binding to the IL-6 receptor.
  • such competing antibodies bind to the same epitope (eg, linear or conformational epitope) to which tocilizumab binds.
  • epitope eg, linear or conformational epitope
  • a detailed exemplary method for mapping an epitope to which an antibody binds is provided in Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
  • the immobilized IL-6 receptor is the first labeled antibody that binds to the IL-6 receptor (eg, tocilizumab) and the first with respect to binding to the IL-6 receptor. Incubates in a solution containing a second unlabeled antibody that is tested for its ability to compete with that antibody. The second antibody may be present in the hybridoma supernatant. As a control, the immobilized IL-6 receptor is incubated in a solution containing the first labeled antibody but not the second unlabeled antibody. After incubation under conditions that allow binding of the first antibody to the IL-6 receptor, excess unbound antibody is removed and the amount of label bound to the immobilized IL-6 receptor is measured. Will be done.
  • the amount of label bound to the immobilized IL-6 receptor is substantially reduced in the test sample compared to the control sample, then it is the second antibody with respect to binding to the IL-6 receptor. Shows that it is competing with the antibody of 1. See Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
  • anti-CCL2 antibody examples include the antibodies described in Japanese Patent No. 9067399, Japanese Patent Publication No. 052786986, WO03048083, US20040047860, US20060039913, WO2006 / 125202. Not limited to them. More specific examples include ABN912 and CNTO888 (carlumab). These antibodies are prepared by using any known technique according to the methods described in Japanese Patent No. 9067399, Japanese Patent Publication No. 052769686, WO03040883, US20040047860, US20060039913, WO2006 / 125202. be able to.
  • the CCR2 inhibitor is a low molecular weight substance
  • examples of the substance include those described in Propagermanium (3-oxygelmilpropionic acid polymer), INCB3344, RS-504393, or WO2006 / 187393. Not limited to.
  • the therapeutic agent or preventive agent of the present invention can be prepared by mixing with an appropriate pharmaceutically acceptable carrier, medium, etc., if necessary, to prepare a lyophilized preparation or a solution preparation.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers and vehicles include, for example, sterile water, physiological saline, stabilizers, excipients, antioxidants (ascorbic acid, etc.), buffers (phosphate, citric acid, histidine, etc.) Other organic acids, etc.), preservatives, surfactants (PEG, Tween, etc.), chelating agents (EDTA, etc.), binders, etc. can be mentioned.
  • aqueous solution for injection examples include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride, which are appropriately dissolved.
  • Auxiliary agents such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactants (polysorbate 80, polysorbate 20, poloxamer 188, HCO-50) and the like may be used in combination. It is also possible to administer a larger amount of liquid subcutaneously by mixing hyaluronidase in the formulation (Expert Opin Drug Deliv. 2007 Jul; 4 (4): 427-40.). Moreover, the pharmaceutical composition of this invention may be put in an injection tube in advance. The solution preparation can be prepared according to the method described in WO2011 / 090088.
  • the therapeutic or prophylactic agent of the present invention may be encapsulated in microcapsules (microcapsules such as hydroxymethyl cellulose, gelatin, poly [methyl methacrylate]), or a colloidal drug delivery system (liposomes, albumin microspheres, micro). Emulsions, nanoparticles, nanocapsules, etc.) can also be used (see “Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980), etc.). Furthermore, a method of making the drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the therapeutic or prophylactic agent of the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 267-277 (1981). ); Langer, Chemtech.
  • the therapeutic agent or preventive agent of the present invention is prepared by mixing with an appropriate pharmaceutically acceptable carrier or the like, and is used as a tablet, a capsule, a granule, a powder, or a pill. You can also do it.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers include sugars such as lactose, glucose and sucrose; starches such as corn starch and potato starch; cellulose and derivatives such as sodium carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose and methyl cellulose; tragacanto gum powder; malt Gelatin; talc; solid lubricants such as stearic acid and magnesium stearate; calcium sulfate; vegetable oils such as peanut oil, cottonseed oil, sesame oil, olive oil, corn oil, vegetable oil, cacao oil; propylene glycol, glycerin, sorbitol, mannitol and polyethylene Polyhydric alcohols such as glycol; alginic acid; emulsifiers such as TWEEN; wetting agents such as lecithin; colorants; fragrances; tableting agents; stabilizers; antioxidants; preservatives; pyrogen-free water; etc.
  • examples include, but are not limited to, an aqueous solution of cottonseed oil; and a
  • Administration of the therapeutic or prophylactic agent of the present invention can be administered to the patient via any suitable route.
  • the active ingredient can be selected in the range of 0.0001 mg to 100 mg per 1 kg of body weight at a time.
  • the active ingredient per patient can be selected in the range of 0.001 to 1000 mg / kg / body / weight.
  • the dose per dose includes, for example, about 0.01 to 50 mg / kg, body, and weight.
  • the combination therapies of the invention inhibit cell growth, including administration of effective amounts of IL-6 and CCR2 inhibitors, tumor weight.
  • the combination therapies of the invention suppress cell growth, suppress tumor weight, suppress tumor volume, as compared to monotherapy with IL-6 or CCR2 inhibitors. It is highly effective in treating tumors or preventing cancer.
  • the combination therapies of the invention have synergistic or additive effects that suppress cell growth, suppress tumor weight, suppress tumor volume, treat cancer, or prevent cancer. Have.
  • the "effective amount" in the present invention refers to an IL-6 inhibitor and / or a CCR2 inhibitor effective for treating or preventing a disease in an individual (particularly urinary cancer in the present invention).
  • Means dose for example, if the IL-6 inhibitor is an antibody, a dose in the range of, for example, 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.001 mg to 100 mg, more preferably 0.01 to 50 mg per kg of body weight per administration, for example 1 to 1 to It can be administered once every 10 weeks, preferably every 1 to 8 weeks, and more preferably once every 1 to 4 weeks, but is not limited thereto.
  • the dose ranges from 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.001 mg to 100 mg, and more preferably 0.01 to 50 mg per kg of body weight per administration, for example, 1 to 10. It may be administered weekly, preferably once every 1 to 8 weeks, more preferably once every 1 to 4 weeks, but is not limited thereto.
  • a low molecular weight substance in which a CCR2 inhibitor binds to CCR2 and blocks the signal of CCL2 for example, in the range of 0.01 mg to 40 mg / kg of body weight per day, preferably 1 kg / day of body weight per administration. It can be administered daily in the range of 0.25 mg to 10 mg per dose.
  • the CCR2 inhibitor When the CCR2 inhibitor is propagermanium, for example, it may be administered in the range of 20-40 mg per day, preferably 30 mg per day, for example, in 2-4 divided doses, preferably in 3 divided doses. However, it is not limited to these.
  • the urinary cancer in the present invention is not particularly limited, but is preferably bladder cancer.
  • the "treatment" in the present invention is that the combination therapy of the present invention suppresses tumor growth in an individual's urinary organs, reduces the number of cancer cells, and suppresses the growth of cancer cells. It means that the tumor volume is reduced, the tumor weight is reduced, the metastasis of cancer cells is suppressed, or various symptoms caused by cancer are improved.
  • "prevention" in the present invention means preventing an increase in the number of cancer cells due to the re-proliferation of decreased cancer cells, and re-proliferation of cancer cells in which proliferation is suppressed. To prevent the reduced tumor size from increasing again, or to prevent the cancer that has disappeared (or healed) macroscopically by topical treatment from reappearing macroscopically. means.
  • the combination therapy of the present invention is a method of enhancing the therapeutic or prophylactic effect of a CCR2 inhibitor in treating or preventing cancer with the CCR2 inhibitor by using an IL-6 inhibitor.
  • I will provide a.
  • the combination therapy of the present invention enhances the therapeutic or prophylactic effect of an IL-6 inhibitor in treating or preventing cancer with the IL-6 inhibitor by using the CCR2 inhibitor.
  • the enhancement of the therapeutic or preventive effect means, for example, an increase in the response rate of the treatment, a decrease in the amount of an IL-6 inhibitor or a CCR2 inhibitor administered for the treatment, and / or It means, but is not limited to, shortening the treatment period with an IL-6 inhibitor or a CCR2 inhibitor.
  • the combination therapies of the present invention provide a method of increasing progression-free survival in an individual, comprising administering an effective amount of an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor.
  • the combination therapy of the present invention comprises administration of an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor.
  • IL-6 inhibitors and CCR2 inhibitors can be administered by any suitable method known in the art.
  • IL-6 and CCR2 inhibitors can be administered in parallel (ie, simultaneously) or sequentially (ie, at different times).
  • the interval between administrations of the IL-6 inhibitor and the CCR2 inhibitor is not particularly limited. It can be set in consideration of factors such as the administration route and dosage form. For example, it is 0 to 168 hours, preferably 0 to 72 hours, preferably 0 to 24 hours, and more preferably 0 to 12 hours, but is not limited thereto.
  • the IL-6 inhibitor and the CCR2 inhibitor are co-administered.
  • the IL-6 inhibitor is administered intermittently (ie, intermittently).
  • the IL-6 inhibitor is administered prior to administration of the CCR2 inhibitor.
  • the IL-6 inhibitor is administered after administration of the CCR2 inhibitor.
  • the CCR2 inhibitor is administered intermittently (ie, intermittently). In some embodiments, the CCR2 inhibitor is administered prior to administration of the IL-6 inhibitor. In some embodiments, the CCR2 inhibitor is administered after administration of the IL-6 inhibitor.
  • IL-6 inhibitors and CCR2 inhibitors known or described herein can be used in combination therapies of the invention.
  • additional therapy in addition to the combination therapy of IL-6 inhibitor and CCR2 inhibitor, additional therapy can be given.
  • the therapy in addition to the combination therapies of the invention may include administration of additional IL-6 and / or CCR2 inhibitors.
  • the invention is a cell growth inhibitor (cell growth inhibitor) comprising an IL-6 inhibitor, a CCR2 inhibitor, or a combination of an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor.
  • a cancer cell or an agent for suppressing the volume or weight of a tumor tissue containing a cancer cell, a cancer therapeutic agent or a cancer preventive agent hereinafter, collectively referred to as the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical compositions of the invention can be used in combination therapies of the invention.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention in combination with an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor, suppress cell growth as compared to these monotherapy, cancer cells or It is highly effective in suppressing the volume or weight of tumor tissue containing cancer cells, or treating or preventing cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a cancer cell or a volume of tumor tissue containing a cancer cell that suppresses cell growth when an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor are used in combination. It has a synergistic or additive effect of controlling weight or treating or preventing cancer.
  • a pharmaceutical composition comprising a combination of an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor in the present invention refers to an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor as a disease (particularly in the present invention).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be provided in the form of a combination drug containing both an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor.
  • an agent containing an IL-6 inhibitor and an agent containing a CCR2 inhibitor are provided separately, and these agents may be used simultaneously or sequentially.
  • the urinary cancer is not particularly limited, but is preferably bladder cancer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for use with a CCR2 inhibitor, which comprises an IL-6 inhibitor as an active ingredient. In some embodiments, the present invention provides a pharmaceutical composition for use with an IL-6 inhibitor, comprising a CCR2 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention is a pharmaceutical composition for enhancing the therapeutic effect of a CCR2 inhibitor in treating cancer with the CCR2 inhibitor by combining the IL-6 inhibitor with the CCR2 inhibitor.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for enhancing the therapeutic effect of an IL-6 inhibitor in the treatment of cancer by combining a CCR2 inhibitor with an IL-6 inhibitor. To do.
  • the present invention uses IL-6 inhibitors and / or CCR2 inhibitors thereof to produce pharmaceutical compositions comprising IL-6 inhibitors and / or CCR2 inhibitors as active ingredients. provide.
  • an IL-6 inhibitor and / or its CCR2 inhibitor as an active ingredient means that an IL-6 inhibitor and / or its CCR2 inhibitor is included as a major active ingredient.
  • IL-6 inhibitor and / or its CCR2 inhibitor content is not limited.
  • KDM6A is a histone-modified protein whose gene is located on the X chromosome. KDM6A promotes demethylation of the 27th lysine residue (H3K27) of tri-dimethylated histone H3 via the JmjC domain, and also forms a protein interaction domain called TPR ( t etratrico p eptide r epeat).
  • MLL3 m ixed l ineage l eukemia 3, KMT2C
  • MLL4 m ixed l ineage l eukemia 4, KMT2D
  • COMPASS protein complex of p roteins as It is known to be involved in the methylation of the fourth lysine residue (H3K4) of histone H3 as a component of the sociated with S et1) -like complex.
  • H3K27 methylation is a transcription-suppressing histone mark
  • H3K4 methylation is a transcription-promoting histone mark
  • KDM6A is thought to promote transcriptional activation of target genes through the above functions.
  • the invention comprises a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of urinary cancer, comprising an IL-6 inhibitor, a CCR2 inhibitor, or a combination of an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor.
  • a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of urinary cancer comprising an IL-6 inhibitor, a CCR2 inhibitor, or a combination of an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor.
  • Therapeutic or prophylactic agents for urinary cancer reduced function of KDM6A, decreased expression of KDM6A, and / or mutation of KDM6A gene in biological samples obtained from individuals (eg, patients with urinary cancer)
  • the presence or absence of is evaluated, and an individual having a decrease in KDM6A function, a decrease in KDM6A expression, and / or a mutation in the KDM6A gene (preferably a function-deficient mutation) is defined as the above-mentioned pharmaceutical composition.
  • the invention is an IL-6 inhibitor, CCR2 inhibitor, or a combination of an IL-6 inhibitor and a CCR2 inhibitor for use in the treatment or prevention of urinary cancer.
  • a decrease in KDM6A function, a decrease in KDM6A expression, and / or the presence or absence of a mutation in the KDM6A gene (preferably a function-deficient mutation) in a biological sample obtained from a urinary cancer patient) is evaluated to evaluate KDM6A.
  • the invention comprises administering to an individual (eg, a urinary cancer patient) an effective amount of an IL-6 inhibitor and an individual an effective amount of a CCR2 inhibitor, or IL.
  • an individual eg, a urinary cancer patient
  • an effective amount of an IL-6 inhibitor and an individual an effective amount of a CCR2 inhibitor, or IL.
  • -6 A method of treating or preventing urinary cancer, including the step of administering a combination of an inhibitor and a CCR2 inhibitor, which reduces the function of KDM6A and the expression of KDM6A in biological samples obtained from individuals.
  • a method for treating or preventing urinary cancer which comprises the step of selecting an individual having a type mutation) as a responder to the treatment or prevention.
  • the evaluation step and the selection step are preferably carried out prior to the administration step.
  • decreased expression of p53, decreased function of p53, and / or the presence or absence of mutations in p53 are evaluated in individuals to determine decreased expression of p53, decreased function of p53, and / or mutations in p53. Individuals may be selected as responders to the treatment or prevention. Methods for assessing the presence or absence of mutations in p53 are known in the art.
  • a decrease in KDM6A function, a decrease in KDM6A expression, a mutation in the KDM6A gene, and a function-deficient mutation in the KDM6A gene are described, for example, by using an antibody against KDM6A from a sample collected from a patient with urinary cancer. It can be confirmed by immunostaining by immunostaining or by performing Western blotting or exon sequencing on the sample collected from the patient. For example, as a result of immunostaining using an antibody against KDM6A, a KDM6A positive control (for example, KDM6A function is not reduced, KDM6A expression is not reduced, KDM6A gene mutation is not present, KDM6A gene function is deficient.
  • the decrease in KDM6A function includes deletion of KDM6A function and inactivation of KDM6A.
  • the decrease in the expression of KDM6A includes that the expression of the KDM6A protein is significantly decreased and that the expression of the KDM6A protein is not expressed.
  • the mutation of the KDM6A gene includes a function-deficient mutation of the KDM6A gene.
  • the p53 gene is one of the tumor suppressor genes having functions such as DNA repair, cell cycle control, and induction of apoptosis, and p53 gene mutations are found in various cancers. Mutant p53 protein has a long half-life and accumulates intracellularly, resulting in the appearance of p53 antibody in serum (Lowe SW, Bodis S, McClatchey A et al: p53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo. Science 266: 807-810, 1994).
  • measuring p53 antibodies in serum by the ELIZA method is considered to be useful for detecting cancers associated with p53 gene mutations (Shimada H, Ochiai T, Nomura F et al: Titration of serum p53 antibodies).
  • the decline in p53 function includes deletion of p53 function and inactivation of p53.
  • the decrease in the expression of p53 includes that the expression of the p53 protein is significantly decreased and that the expression of the p53 protein is not detected.
  • specific mutations of p53 gene mutations include missense mutations, nonsense mutations, frameshift mutations, and deletions.
  • mice For the purpose of investigating the involvement of UTX (KDM6A) deletion in bladder cancer, mice (Utx ⁇ / ⁇ ) in which UTX was deleted specifically for bladder epithelium were prepared and analyzed. Deletion of Utx was confirmed in the bladder epithelium of Utx ⁇ / ⁇ mice, but no tumor development was observed in the bladder after long-term observation, and it was considered that a single deficiency of UTX was not sufficient for the development of bladder cancer. ..
  • the most frequently mutated gene in bladder cancer is p53, and Utx deletion and p53 mutation are known to be associated at a high rate (The Cancer Genome Atlas Research Network, Nature 2014, vol. 507, p). .315-322).
  • Utx ⁇ / ⁇ mice were crossed with p53 heterozygous mice to produce Utx ⁇ / ⁇ , p53 +/- mice.
  • Utx ⁇ / ⁇ , p53 +/- mice were observed to develop carcinoma in situ (CIS) after long-term observation, and Utx deletion was associated with the p53 mutation in the bladder. It has been shown to be involved in the development of cancer.
  • Nitorosamine (BBN) was administered.
  • control Utx +/+ , p53 +/- mice showed dysplasia-carcinoma in situ (Dysplasia-CIS) in about 60%, whereas Utx ⁇ / ⁇ , p53. +/- Mice developed 100% dysplasia-carcinoma in situ (Fig. 1A), and some progressed to muscle invasive cancer (Fig. 1B). ..
  • MBT2 is a bladder cancer tumor strain established from the mouse line C3H. Therefore, we created Utx-expressing strains (EV clones) and Utx-deficient strains (KO clones) by introducing empty vector (EV) and Utx knockout (KO) vector into MBT2 (Fig. 3A). This clone was transplanted into syngeneic C3H mice and provided with a 7-day engraftment period, followed by vehicle only, Propagermanium (inhibitor of CCL2 receptor CCR2, daily administration mixed with diet to 0.005% concentration). Treatment was performed with MR16-1 (neutralizing antibody against mouse IL6 receptor, 100 ⁇ g per animal intraperitoneally injected 3 times a week) and with Propagermanium and MR16-1 combined (Combination).
  • MR16-1 neutralizing antibody against mouse IL6 receptor, 100 ⁇ g per animal intraperitoneally injected 3 times a week
  • the EV tumor produced as a result of transplantation with the Utx-expressing strain did not show a significant therapeutic effect compared with the vehicle alone, whereas as shown in Fig. 3D.
  • Propagermanium and MR16-1 combination therapy was found to significantly reduce tumor weight.
  • the present invention provides a new therapeutic agent for urinary cancer, particularly lysine (K) -specific demethylase 6A (KDM6A), which has a reduced function.
  • K lysine
  • KDM6A lysine -specific demethylase 6A

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Abstract

IL-6活性及びCCR2/CCL2活性を共に抑制することを特徴とする、泌尿器がん、特にlysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の機能が低下した泌尿器がんの治療剤および治療方法を提供する。

Description

ＩＬ－６阻害剤及びＣＣＲ２阻害剤を組み合わせて投与することを特徴とする泌尿器がんの治療剤
　本発明は、IL-6阻害剤及びCCR2阻害剤を組み合わせて投与することを特徴とする、泌尿器がん、特にlysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の機能が低下した泌尿器がんの治療剤に関する。
　膀胱がんは尿路上皮細胞の悪性腫瘍であり、人口高齢化と共にその発症率は増加傾向にある。早期の表在がんであれば経尿道的膀胱腫瘍切除術による治療が可能であるが、再発し易いという特徴を有している。また、進行した筋層浸潤性がんおよび転移症例の予後は改善されておらず、分子病態に基づく新規治療法が求められている。
　UTX (ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat X chromosome, 別名lysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)) はヒストンH3K27に対する脱メチル化酵素であり、様々なヒト腫瘍で機能欠失型変異が報告されている（非特許文献１）。変異の中では膀胱がん（Bladder cancer）の頻度が最も多く、また前立腺がん（Prostate cancer）及び陰茎がん（Penile cancer）の割合も高く、UTX機能欠失は泌尿器科領域の腫瘍発症に深く関与していると考えられている（非特許文献２、非特許文献３）。
　Utxの膀胱がん発症における関与を示した論文としては、Utx変異を有するヒト膀胱がん細胞株を用いた免疫不全マウスへの移植実験モデルが報告されているが（非特許文献４）、これは培養細胞を用いて異種移植を行った結果であり、生体内でのUtx機能欠失を反映したモデルとは言い難い。これまで、膀胱がんに着目して遺伝子改変の手法を用いて膀胱特異的Utx欠損（UtxΔ/Δ）マウスを作製し解析を行った研究は報告されていない。
　IL-6は、はB 細胞刺激因子2 (BSF2)あるいはインターフェロンβ2とも呼称されたサイトカインである。IL-6は、B リンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（非特許文献５）、その後、種々の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイトカインであることが明らかになった（非特許文献６）。IL-6は、T リンパ球系細胞の成熟化を誘導することが報告されている（非特許文献７）。
　CCL2は、自然免疫及びTh2エフェクター応答及びCD4+T細胞分化等に関するケモカインであり、CC-ケモカインリガンド2、単球走化性タンパク質1、MCP-1とも称される（非特許文献８）。CCL2の受容体としてCCR2が知られている。
　これまで、マウスの膀胱がんMB49細胞を浮遊培養した後、得られたsphere形成細胞(sMB49) についてin vitroでIL-6をブロックすることにより、sphere形成MB49細胞の浸潤能力が低減したことが報告されている（非特許文献９）。
　また、抗IL-6抗体及び抗CCL2抗体を浸潤性の乳がんのマウスに投与した結果、がんの浸潤が抑制され、生存期間が延びたことが報告されている(非特許文献１０)。
　しかし、IL-6阻害剤及びCCR2阻害剤の併用による膀胱がんの治療効果は報告されていない。
van Haaften et al. Nature Genetics, volume 41, number 5, 2009 Van der Meulen et al. Epigenetics, volume 9, Issue 5, 2014 Lu Wang, et al., UTX mutation in Human Cancer. Cancer Cell, 2019 Ler et al, Science Translational Medicine, 9, eaai8321 (2017) Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76 Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78 Lotz, M. et al., J. Exp. Med. （1988）167, 1253-1258 Paul, W. E., Fundamental Immunology, 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (Philadelphia, 2003) p.801-840 Annals of Surgical Oncology, Nov. 2018, vol.25, Issue 12, pp3518-3526 Nature, Vol.515, 6, 2014, 130-133
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものである。本発明は、新規な泌尿器がんの治療剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、泌尿器がん、特にlysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の機能が低下した泌尿器がんに対して、ＣＣＬ２／ＣＣＲ２活性とＩＬ－６活性を共に抑制することにより腫瘍増大を有意に抑制できることを見出した。
　本発明はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下を含む。
〔１〕IL-6阻害剤を含有する、CCR2阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤。
〔２〕CCR2阻害剤を含有する、IL-6阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤。
〔３〕IL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを含む、泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤。
〔４〕前記IL-6阻害剤が抗IL-6抗体又は抗IL-6受容体抗体である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔５〕前記抗IL-6抗体及び抗IL-6受容体抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、〔４〕に記載の治療剤及び／または予防剤。
〔６〕前記CCR2阻害剤がCCL2阻害剤である、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔７〕前記CCR2阻害剤が抗CCL2抗体又はプロパゲルマニウムである、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔８〕前記抗CCL2抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、〔７〕に記載の治療剤及び／または予防剤。
〔９〕前記がんが膀胱がん、前立腺がん、又は腎臓がんである、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１０〕前記がんが膀胱がんである、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１１〕前記がんが、lysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の発現または機能が低下したがんである、〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１２〕前記がんが、KDM6A遺伝子に変異を有するがんである、〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１３〕前記KDM6A遺伝子の変異が機能欠失型変異である、〔１２〕に記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１４〕前記がんが、p53の発現または機能が低下したがんである、〔１〕～〔１３〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１５〕前記がんが、p53遺伝子に変異を有するがんである、〔１〕～〔１４〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１６〕KDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異を有すると判定された個体に投与するための、〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１７〕p53の発現の低下、機能の低下、及び/又はp53遺伝子の変異を有すると判定された個体に投与するための、〔１〕～〔１０〕および〔１６〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
　本発明はさらに、以下の態様も含む。
〔１８〕CCR2阻害剤と組み合わせて泌尿器がんの治療及び／または予防において用いるための、IL-6阻害剤。
〔１９〕IL-6阻害剤と組み合わせて泌尿器がんの治療及び／または予防において用いるための、CCR2阻害剤。
〔２０〕泌尿器がんの治療及び／または予防において用いるための、IL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせ。
〔２１〕個体に有効量のIL-6阻害剤を投与する工程および個体に有効量のCCR2阻害剤を投与する工程を含む、泌尿器がんの治療及び／または予防方法。
〔２２〕個体に有効量のIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを投与する工程を含む、泌尿器がんの治療及び／または予防方法。
〔２３〕CCR2阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤の製造における、IL-6阻害剤の使用。
〔２４〕IL-6阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤の製造における、CCR2阻害剤の使用。
〔２５〕泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤の製造における、IL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせの使用。
〔２６〕前記IL-6阻害剤が抗IL-6抗体又は抗IL-6受容体抗体である、〔１８〕～〔２５〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔２７〕前記抗IL-6抗体及び抗IL-6受容体抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、〔２６〕に記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔２８〕前記CCR2阻害剤がCCL2阻害剤である、〔１８〕～〔２７〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔２９〕前記CCR2阻害剤が抗CCL2抗体又はプロパゲルマニウムである、〔１８〕～〔２７〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３０〕前記抗CCL2抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、〔２９〕に記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３１〕前記がんが膀胱がん、前立腺がん、腎臓がんである、〔１８〕～〔３０〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３２〕前記がんが膀胱がんである、〔１８〕～〔３１〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３３〕前記がんが、lysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の発現または機能が低下したがんである、〔１８〕～〔３２〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３４〕前記がんが、KDM6A遺伝子に変異を有するがんである、〔１８〕～〔３３〕に記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３５〕前記KDM6A遺伝子の変異が機能欠失型変異である、〔３４〕に記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３６〕前記がんが、p53の発現または機能が低下したがんである、〔１８〕～〔３５〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３７〕前記がんが、p53に遺伝子変異を有するがんである、〔１８〕～〔３６〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３８〕KDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異を有すると判定された個体に投与するための、〔１８〕～〔３２〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３９〕p53の発現の低下、機能の低下、及び/又はp53遺伝子の変異を有すると判定された個体に投与するための、〔１８〕～〔３２〕及び〔３８〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
　本発明により、新規の泌尿器がんの治療剤が提供された。
図1Aは、N-butyl-N-(4-hydro-oxybutyl) nitorosamine（BBN）の投与から10週間後のコントロールマウス（Utx+/+, p53+/-マウス）およびUtxΔ/Δ, p53+/-マウスの膀胱における、正常組織（Normal）、異形成～上皮内がん（Dysplasia～CIS）、および筋層への浸潤がん（Muscle invasive cancer）の比率を示す図である。図1Bは、BBNを投与されたUtxΔ/Δ, p53+/-マウスの膀胱より採取された組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色した結果を示す写真である。図中の矢印は、筋層への浸潤がんを示している。 図2は、BBN投与4週の時点でのコントロールのUtx+/+マウスおよびUtxΔ/Δマウスの尿路上皮から抽出されたRNAを用いたトランスクリプトーム解析およびKEGGによるパスウェイ解析の結果を示す図である。図2Aは、コントロールマウスとUtxΔ/Δマウスのパスウェイ比較結果の図であり、コントロールマウスと比べてUtxΔ/Δマウスで発現亢進している経路を示している。図2Bは、コントロールマウスとUtxΔ/Δマウスの”Cytokine-cytokine receptor interaction”経路の142遺伝子の発現比較結果を示している。 図3Aは、マウス膀胱がん細胞株MBT2に由来するUtx発現株（EV clones）およびUtx欠損株（KO clones）におけるUTX蛋白質の発現を、抗UTX抗体または抗βアクチン抗体を用いたウエスタンブロット法により解析した結果を示す写真である。図3Bは、腫瘍移植マウスにおけるプロパゲルマニウム（Propagermanium）および/またはMR16-1の投与スケジュールを示す図である。図3CおよびDは、C3HマウスにUtx発現株（C）またはUtx欠損株（D）を移植した結果として生じた腫瘍の腫瘍体積（Estimated tumor volume）および腫瘍重量（Tumor weight）を示す図である。
　本発明の非限定的な一局面として、IL-6活性及びCCR2/CCL2活性を共に抑制することを特徴とする、泌尿器がんの治療剤または予防剤（泌尿器がんの治療または予防用の医薬組成物とも表現される）および併用療法が提供される。当該局面の一態様において、泌尿器がんは、膀胱がん、前立腺がん、腎臓がん、又は陰茎がんである。当該局面の一態様において、泌尿器がんは、lysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の発現が低下したがん、又はKDM6Aの機能が低下したがんであり、任意で、KDM6A遺伝子に変異（例えば、機能欠失型変異）を有するがんである。当該局面の一態様において、泌尿器がんは、p53に変異を有する泌尿器がんである。当該局面の一態様において、IL-6阻害剤とCCR2阻害剤を併用することによって、IL-6阻害剤又はCCR2阻害剤単独による処置と比べて、泌尿器がんの治療または予防において相乗的な効果を得られる。
　前記局面の一態様において、IL-6阻害剤を有効成分として含有する、CCR2阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤または予防剤が提供される。当該態様において、IL-6阻害剤を含有する泌尿器がんの治療剤または予防剤は、CCR2阻害剤と同時に、別々に、または、順次に投与される。これらの阻害剤の剤型は、同じ剤型であっても異なる剤型であってもよい。例えば、双方が非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって互いに異なる剤型であってもよく、双方が非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって同種の剤型であってもよい。当該態様は、CCR2阻害剤と組み合わせて泌尿器がんの治療または予防において用いるための、IL-6阻害剤；IL-6阻害剤を投与する工程およびCCR2阻害剤を投与する工程を含む、泌尿器がんを治療または予防する方法；又はCCR2阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤または予防剤の製造における、IL-6阻害剤の使用と表現することできる。
　前記局面の別の態様において、CCR2阻害剤を有効成分として含有する、IL-6阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤または予防剤が提供される。当該態様において、CCR2阻害剤を含有する泌尿器がんの治療剤または予防剤は、IL-6阻害剤と同時に、別々に、または、順次に投与される。これらの阻害剤の剤型は、同じ剤型であっても異なる剤型であってもよい。例えば、双方が非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって互いに異なる剤型であってもよく、双方が非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって同種の剤型であってもよい。当該態様は、IL-6阻害剤と組み合わせて泌尿器がんの治療または予防において用いるための、CCR2阻害剤；個体に有効量のIL-6阻害剤を投与する工程および個体に有効量のCCR2阻害剤を投与する工程を含む、泌尿器がんを治療または予防する方法；又はIL-6阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤または予防剤の製造における、CCR2阻害剤の使用と表現することできる。
　前記局面の他の態様において、IL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを有効成分として含有する、泌尿器がんの治療剤または予防剤が提供される。当該態様は、泌尿器がんの治療または予防において用いるための、IL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせ；個体に有効量のIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを投与する工程を含む、泌尿器がんを治療または予防する方法；又は泌尿器がんの治療剤または予防剤の製造における、IL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせの使用と表現することもできる。
　本発明における「ＩＬ－６阻害剤」とは、ＩＬ－６によるシグナル伝達を遮断し、ＩＬ－６の生物学的活性を阻害する物質である。ＩＬ－６阻害剤は、好ましくはＩＬ－６、ＩＬ－６受容体及びgp130のいずれかの結合に対する阻害作用を有する物質である。
　本発明のＩＬ－６阻害剤としては、例えば抗ＩＬ－６抗体、抗ＩＬ－６受容体抗体、抗gp130抗体、ＩＬ－６改変体、可溶性ＩＬ－６受容体改変体あるいはＩＬ－６又はＩＬ－６受容体の部分ペプチドおよび、これらと同様の活性を示す低分子物質が挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明のＩＬ－６阻害剤としては、好ましくはＩＬ－６受容体を認識する抗体を挙げることが出来る。
　ＩＬ－６は、細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、ＩＬ－６が結合する分子量約８０ｋＤのリガンド結合性蛋白質のＩＬ－６受容体である（非特許文献４、５）。ＩＬ－６受容体は、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からなる可溶性ＩＬ－６受容体としても存在する。
　もう一つは、非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約１３０ｋＤの膜蛋白質ｇｐ１３０である。ＩＬ－６とＩＬ－６受容体はＩＬ－６／ＩＬ－６受容体複合体を形成し、次いでｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ－６の生物学的活性が細胞内に伝達される（Ｔａｇａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８９）５８，５７３－５８１）。
　本発明における「ＣＣＲ２阻害剤」とは、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７又はＣＣＬ８によるシグナル伝達を遮断し、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７及び／又はＣＣＬ８の生物学的活性を阻害する物質であり、ＣＣＬ２阻害剤、ＣＣＬ７阻害剤およびＣＣＬ８阻害剤を含む。本発明における「ＣＣＬ２阻害剤」とは、ＣＣＬ２によるシグナル伝達を遮断し、ＣＣＬ２の生物活性を遮断する物質である。
　本発明のＣＣＬ２阻害剤としては、例えば抗ＣＣＬ２抗体、ＣＣＬ２の受容体であるＣＣＲ２に対する抗体（抗ＣＣＲ２抗体）、ＣＣＲ２に結合しＣＣＬ２によるシグナル伝達を遮断する低分子物質が挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明のＣＣＬ２阻害剤としては、好ましくは抗ＣＣＬ２抗体、ＣＣＲ２に結合しＣＣＬ２によるシグナル伝達を遮断する低分子物質（例えばプロパゲルマニウム）を挙げることが出来る。
　ＣＣＬ２は、自然免疫及びＴｈ２エフェクター応答及びＣＤ４＋Ｔ細胞分化等に関するケモカインであり、ＣＣ－ケモカインリガンド２、単球走化性タンパク質１、ＭＣＰ－１とも称される(Paul, W. E., Fundamental Immunology, 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (Philadelphia, 2003) p.801-840)。ＣＣＬ２は、ケモカイン受容体ＣＣＲ２を介して結合しシグナル伝達することが知られている。ＣＣＲ２は、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び好塩基球を含む数多くの細胞に発現する、７回膜貫通領域Ｇタンパク質共役受容体である。
　本発明における抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。
　本発明で使用される抗ＩＬ－６抗体、抗ＩＬ－６受容体抗体、抗ｇｐ１３０抗体、抗ＣＣＬ２抗体および抗ＣＣＲ２抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＩＬ－６抗体、抗ＩＬ－６受容体抗体、抗ｇｐ１３０抗体、抗ＣＣＬ２抗体および抗ＣＣＲ２抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマによって産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主によって産生されるものがある。このような抗ＩＬ－６抗体はＩＬ－６と結合することにより、ＩＬ－６のＩＬ－６受容体への結合を阻害してＩＬ－６の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
　このような抗ＩＬ－６抗体としては、MH166(Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18,951-956)やSK2抗体（Sato, K. et al., 第21回 日本免疫学会総会、学術記録(1991)21, 1 66）等が挙げられる。以下に、本発明で使用される各種抗体の例として抗ＩＬ－６抗体の作製方法等を記載するが、他の抗体も基本的には同様の手法及び公知技術を使用して（抗CCL2抗体については、日本国特許第９０６７３９９号、日本国特許公開平０５２７６９８６号、ＷＯ０３０４８０８３号、ＵＳ２００４００４７８６０号、ＵＳ２００６００３９９１３号、ＷＯ２００６／１２５２０２号の記載を参照することによっても）作製することができる。
　抗ＩＬ－６抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＩＬ－６を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
　具体的には、抗ＩＬ－６抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＩＬ－６は、Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550 、J. Immunol.(1988)140, 1534-1541 、あるいはAgr. Biol. Chem.(1990)54, 2685-2688に開示されたＩＬ－６遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
　ＩＬ－６の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のＩＬ－６蛋白質を公知の方法で精製し、この精製ＩＬ－６蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、ＩＬ－６蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
　本発明で使用される抗IL-6受容体抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗IL-6受容体抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマによって産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主によって産生されるものがある。この抗体はIL-6受容体と結合することにより、IL-6のIL-6受容体への結合を阻害してIL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
　このような抗体としては、MR16-1抗体（Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928)、PM-1抗体 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906）、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体あるいはAUK146-15抗体（国際特許出願公開番号WO 92-19759)などが挙げられる。これらのうちで、ヒトIL-6受容体に対する好ましいモノクローナル抗体としてはPM-1抗体が例示され、またマウスIL-6受容体に対する好ましいモノクローナル抗体としてはMR16-1抗体が挙げられる。
　抗IL-6受容体モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、IL-6受容体を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
　具体的には、抗IL-6受容体抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトIL-6受容体は、欧州特許出願公開番号EP 325474に、マウスIL-6受容体は日本特許出願公開番号特開平3-155795に開示されたIL-6受容体遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
　IL-6受容体蛋白質は、細胞膜上に発現しているものと細胞膜より離脱しているもの（可溶性IL-6受容体）（Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676）との二種類がある。可溶性IL-6受容体は細胞膜に結合しているIL-6受容体の実質的に細胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型IL-6受容体と異なっている。IL-6受容体蛋白質は、本発明で用いられる抗IL-6受容体抗体の作製の感作抗原として使用されうる限り、いずれのIL-6受容体を使用してもよい。
　IL-6受容体の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のIL-6受容体蛋白質を公知の方法で精製し、この精製IL-6受容体蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、IL-6受容体を発現している細胞やIL-6受容体蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
　本発明で使用される抗gp130抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗gp130抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマによって産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主によって産生されるものがある。この抗体はgp130と結合することにより、ＩＬ－６／ＩＬ－６受容体複合体のgp130への結合を阻害してＩＬ－６の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
　このような抗体としては、AM64抗体（特開平3-219894）、4B11抗体および2H4抗体（US5571513）B-S12抗体およびB-P8抗体（特開平8-291199）などが挙げられる。
　抗gp130モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、gp130を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
　具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるgp130は、欧州特許出願公開番号EP 411946に開示されたgp130遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
　gp130の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のgp130蛋白質を公知の方法で精製し、この精製gp130蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、gp130を発現している細胞やgp130蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
　感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
　感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4～21日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
　このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
　前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、P3X63Ag8.653（Kearney, J. F. et al. J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550）、P3X63Ag8U.1 （Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7)、NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415 ）、SP2/0（Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 ）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.(1978) 148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133）等が適宜使用される。
　前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルシュタインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46）等に準じて行うことができる。
　より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1～10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
　細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、37℃程度に加温したPEG溶液、例えば、平均分子量1000～6000程度のPEG溶液を通常、30～60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
　当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日～数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。
　また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、感作Bリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735参照）。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
　当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
　例えば、抗IL-6受容体抗体産生ハイブリドーマの作製は、特開平3-139293に開示された方法により行うことができる。PM-1抗体産生ハイブリドーマをBALB/cマウスの腹腔内に注入して腹水を得、この腹水からPM-1抗体を精製する方法や、本ハイブリドーマを適当な培地、例えば、10％ウシ胎児血清、5％BM-Condimed H1（Boehringer Mannheim製）含有RPMI1640培地、ハイブリドーマSFM培地（GIBCO-BRL製）、PFHM-II培地（GIBCO-BRL製）等で培養し、その培養上清からPM-1抗体を精製する方法で行うことができる。
　本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
　具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（V）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ）、AGPC法（Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987)162, 156-159)等により全RNA を調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia製）等を使用してmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製することができる。
　得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行うことができる。また、cDNAの合成および増幅を行うには5'-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002；Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989)17, 2919-2932）を使用することができる。得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシ法により確認する。
　目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
　本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
　本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体、ヒト（human）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
　キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
　ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR)をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。
　具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（FR; framework region）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。
　CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。
　キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体C領域が使用される。ヒト抗体C領域としては、Cγが挙げられ、例えば、Cγ1、Cγ2、Cγ3又はCγ4を使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。
　キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のC領域からなり、またヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびC領域からなり、両者はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
　本発明に使用される抗IL-6受容体抗体のヒト化抗体の好ましい具体例としては、ヒト化PM-1抗体が挙げられる（国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。
　また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を含む適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388を参考にすることができる。
　前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させることができる。哺乳類細胞を用いた場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させたDNAあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
　また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV40)等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
　例えば、SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114) 、また、HEF1αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322 ）に従えば容易に実施することができる。
　大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合、Wardらの方法（Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546；Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427 ）、araBプロモーターを使用する場合、Betterらの方法（Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043 ）に従えばよい。
　抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（refold）して使用する（例えば、WO96/30394を参照）。
　複製起源としては、SV40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
　本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
　真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、(1)哺乳類細胞、例えば、CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Veroなど、(2)両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは(3)昆虫細胞、例えば、sf9、sf21、Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Aspergillus)属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。
　原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E.coli)、枯草菌が知られている。
　これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivoにて抗体を産生してもよい。
　一方、in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
　哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
　これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい。（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。
　また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばpMON530に挿入し、このベクターをAgrobacterium tumefaciensのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばNicotiana tabacumに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994)24, 131-138）。
　上述のようにin vitro又はin vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H鎖）又は軽鎖（L鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号WO 94-11523参照）。
　本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得るかぎり、抗体の断片やその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Fab、F(ab')2、Fv又はH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv（scFv）が挙げられる。
　具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496 、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515 、Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663 、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66、Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137参照）。
　scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域を連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883）。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸12-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
　scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖又はH鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖又はL鎖V領域をコードするDNAを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNAおよびその両端を各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
　また、一旦scFvをコードするDNAが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、scFvを得ることができる。
　これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
　抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG)等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
　前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。プロテインAカラムに用いる担体として、例えば、HyperD、POROS、SepharoseF.F.等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
　例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはHPLC（High performance liquid chromatography）に適用し得る。また、逆相HPLC（reverse phase HPLC）を用いてもよい。
　上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又はELISA等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、PBS(-)で適当に希釈した後、280nmの吸光度を測定し、1mg/mlを1.35ODとして算出する。また、ELISAによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、0.1M重炭酸緩衝液（pH9.6）で1μｇ/mlに希釈したヤギ抗ヒトIgG(TAG製）100μｌを96穴プレート（Nunc製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトIgG（CAPPEL製)100μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
　洗浄後、5000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG（BIO SOURCE製）100μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、MICROPLATE READER Model 3550（Bio-Rad製）を用いて405nmでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
　本発明で使用されるＩＬ－６改変体は、ＩＬ－６受容体との結合活性を有し、且つＩＬ－６の生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、ＩＬ－６改変体はＩＬ－６受容体に対しＩＬ－６と競合的に結合するが、ＩＬ－６の生物学的活性を伝達しないため、ＩＬ－６によるシグナル伝達を遮断する。
　ＩＬ－６改変体は、ＩＬ－６のアミノ酸配列のアミノ酸残基を置換することにより変異を導入して作製される。ＩＬ－６改変体のもととなるＩＬ－６はその由来を問わないが、抗原性等を考慮すれば、好ましくはヒトＩＬ－６である。
　具体的には、ＩＬ－６のアミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえば、WHATIF（Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56 ）を用いてその二次構造を予測し、さらに置換されるアミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行われる。適切な置換アミノ酸残基を決定した後、ヒトＩＬ－６遺伝子をコードする塩基配列を含むベクターを鋳型として、通常行われるPCR法によりアミノ酸が置換されるように変異を導入することにより、ＩＬ－６改変体をコードする遺伝子が得られる。これを必要に応じて適当な発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じてＩＬ－６改変体を得ることができる。
　ＩＬ－６改変体の具体例としては、Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269,86-93 、及びSavino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367 、WO 96-18648 、WO96-17869に開示されている。
　本発明で使用されるＩＬ－６部分ペプチド又はＩＬ－６受容体部分ペプチドは、各々ＩＬ－６受容体あるいはＩＬ－６との結合活性を有し、且つＩＬ－６の生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、ＩＬ－６部分ペプチド又はＩＬ－６受容体部分ペプチドはＩＬ－６受容体又はＩＬ－６に結合し、これらを捕捉することによりＩＬ－６のＩＬ－６受容体への結合を特異的に阻害する。その結果、ＩＬ－６の生物学的活性を伝達しないため、ＩＬ－６によるシグナル伝達を遮断する。
　ＩＬ－６部分ペプチド又はＩＬ－６受容体部分ペプチドは、ＩＬ－６又はＩＬ－６受容体のアミノ酸配列においてＩＬ－６とＩＬ－６受容体との結合に係わる領域の一部又は全部のアミノ酸配列からなるペプチドである。このようなペプチドは、通常１０～８０、好ましくは２０～５０、より好ましくは２０～４０個のアミノ酸残基からなる。
　ＩＬ－６部分ペプチド又はＩＬ－６受容体部分ペプチドは、ＩＬ－６又はＩＬ－６受容体のアミノ酸配列において、ＩＬ－６とＩＬ－６受容体との結合に係わる領域を特定し、その特定した領域の一部又は全部のアミノ酸配列に基づいて通常知られる方法、例えば遺伝子工学的手法又はペプチド合成法により作製することができる。
　ＩＬ－６部分ペプチド又はＩＬ－６受容体部分ペプチドを遺伝子工学的手法により作製するには、所望のペプチドをコードするDNA配列を発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じて得ることができる。
　ＩＬ－６部分ペプチド又はＩＬ－６受容体部分ペプチドをペプチド合成法により作製するには、ペプチド合成において通常用いられている方法、例えば固相合成法又は液相合成法を用いることができる。
　具体的には、「続医薬品の開発 第１４巻 ペプチド合成（監修：矢島治明、廣川書店、1991年）」に記載の方法に準じて行えばよい。固相合成法としては、例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成しようとするペプチドのC末端に対応するアミノ酸を結合させ、α-アミノ基及び側鎖官能基を適切な保護基で保護したアミノ酸をC末端からN末端方向の順番に１アミノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したアミノ酸又はペプチドのα-アミノ基の該保護基を脱離させる反応を交互に繰り返すことにより、ペプチド鎖を伸長させる方法が用いられる。固相ペプチド合成法は、用いられる保護基の種類によりBoc法とFmoc法に大別される。
　このようにして目的とするペプチドを合成した後、脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応をする。ペプチド鎖との切断反応には、Boc法ではフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸を、又Fmoc法ではTFAを通常用いることができる。Boc法では、例えばフッ化水素中で上記保護ペプチド樹脂をアニソール存在下で処理する。次いで、保護基の脱離と支持体からの切断をしペプチドを回収する。これを凍結乾燥することにより、粗ペプチドが得られる。一方、Fmoc法では、例えばTFA中で上記と同様の操作で脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応を行うことができる。
　得られた粗ペプチドは、HPLCに適用することにより分離、精製することができる。その溶出にあたり、蛋白質の精製に通常用いられる水-アセトニトリル系溶媒を使用して最適条件下で行えばよい。得られたクロマトグラフィーのプロファイルのピークに該当する画分を分取し、これを凍結乾燥する。このようにして精製したペプチド画分について、マススペクトル分析による分子量解析、アミノ酸組成分析、又はアミノ酸配列解析等により同定する。
　ＩＬ－６部分ペプチド及びＩＬ－６受容体部分ペプチドの具体例は、特開平2-188600、特開平7-324097、特開平8-311098及び米国特許公報US5210075に開示されている。
　本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
　また、本発明における「抗体」には、翻訳後修飾を受けたものが含まれる。翻訳後修飾は、重鎖又は軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。
　本発明における「抗IL-6受容体抗体」の好ましい例としては、ヒト化抗IL-6レセプターＩｇＧ１抗体であるトシリズマブ、トシリズマブの可変領域及び定常領域の改変を行ったヒト化抗IL-6レセプター抗体、及びトシリズマブと同じエピトープに結合する抗体があげられる。
　具体的には配列番号：１の重鎖可変領域（トシリズマブの重鎖可変領域）および配列番号：２の軽鎖可変領域（トシリズマブの軽鎖可変領域）を含む抗体、ならびに配列番号：５の重鎖可変領域（ＳＡ２３７の重鎖可変領域）及び配列番号：６の軽鎖可変領域（ＳＡ２３７の軽鎖可変領域）を含む抗体があげられる。
　更に具体的には、配列番号：３の重鎖（トシリズマブの重鎖）及び配列番号：４の軽鎖（トシリズマブの軽鎖）を含む抗体、ならびに配列番号：７の重鎖（ＳＡ２３７の重鎖）及び配列番号：８の軽鎖（ＳＡ２３７の軽鎖）を含む抗体が挙げられる。
　このような抗体は、例えばＷＯ２０１０／０３５７６９、ＷＯ２０１０／１０７１０８、ＷＯ２０１０／１０６８１２などに記載の方法に従って取得することができる。具体的には、上記抗IL-6受容体抗体の配列を基に、当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて抗体を作製することが可能である（例えば、Borrebaeck CAK and Larrick JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照）。組換え型抗体は、それをコードするDNAをハイブリドーマ、または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（宿主細胞）に導入し産生させて得ることができる。
　このような抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。
　参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその参照抗体が自身の抗原へする結合を５０％以上阻止する抗体のことをいい、また逆にいえば、参照抗体は、競合アッセイにおいて前述の抗体が自身の抗原へする結合を５０％以上阻止する。具体的には、参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその参照抗体が自身の抗原へする結合を６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上阻止する抗体のことをいう。
　別の局面において、IL-6受容体への結合に関してトシリズマブと競合する抗体を同定するために、競合アッセイが使用され得る。特定の態様において、そのような競合抗体は、トシリズマブによって結合されるのと同じエピトープ（例えば、線状または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングする、詳細な例示的方法は、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
　例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたIL-6受容体は、IL-6受容体に結合する第1の標識された抗体（例えば、トシリズマブ）およびIL-6受容体への結合に関して第1の抗体と競合する能力に関して試験される第2の未標識の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第2の抗体は、ハイブリドーマ上清に存在し得る。対照として、固定化されたIL-6受容体が、第1の標識された抗体を含むが第2の未標識の抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。第1の抗体のIL-6受容体に対する結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、余分な未結合の抗体が除去され、固定化されたIL-6受容体に結合した標識の量が測定される。固定化されたIL-6受容体に結合した標識の量が対照サンプルと比較して試験サンプルにおいて実質的に減少している場合、それは第2の抗体がIL-6受容体への結合に関して第1の抗体と競合していることを示す。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) を参照のこと。
本発明における「抗CCL2抗体」の例としては、日本国特許第９０６７３９９号、日本国特許公開平０５２７６９８６号、ＷＯ０３０４８０８３号、ＵＳ２００４００４７８６０号、ＵＳ２００６００３９９１３号、ＷＯ２００６／１２５２０２号に記載の抗体が挙げられるが、それらに限定されない。より具体的な例としては、ABN912及びCNTO888(carlumab)があげられる。これらの抗体は、日本国特許第９０６７３９９号、日本国特許公開平０５２７６９８６号、ＷＯ０３０４８０８３号、ＵＳ２００４００４７８６０号、ＵＳ２００６００３９９１３号、ＷＯ２００６／１２５２０２号に記載の方法に従って、任意に公知技術を使用することにより作製することができる。
　CCR2阻害剤が低分子物質の場合、当該物質の例としては、プロパゲルマニウム（３－オキシゲルミルプロピオン酸ポリマー）、ＩＮＣＢ３３４４、ＲＳ－５０４３９３、又はＷＯ２００６／１８７３９３に記載のものがあげられるが、これらに限定されない。
　本発明の治療剤または予防剤は、必要に応じて、適当な薬学的に許容される担体、媒体等と混和して調製し、凍結乾燥製剤又は溶液製剤とすることができる。適当な薬学的に許容される担体、媒体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤(アスコルビン酸等)、緩衝剤（リン酸、クエン酸、ヒスチジン、他の有機酸等）、防腐剤、界面活性剤（PEG、Tween等）、キレート剤（EDTA等）、結合剤等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、メチオニン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マンニトールやソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、PEG等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポロキサマー188、HCO-50）等と併用してもよい。また、製剤中にヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）を混合することによって、より大きな液量を皮下投与することも可能である（Expert Opin Drug Deliv. 2007 Jul;4(4):427-40.）。また、本発明の医薬組成物は予め注射筒に入れられていてもよい。尚、溶液製剤はWO2011/090088に記載の方法に従って作製することができる。
　また、必要に応じ本発明の治療剤または予防剤をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（"Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明の治療剤または予防剤に適用し得る（Langer et al., J.Biomed. Mater.Res. 15: 267-277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982);米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983);EP第133,988号）。
　本発明の治療剤または予防剤は、有効成分として低分子物質を含む場合、適当な薬学的に許容される担体等と混和して調製し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤とすることもできる。
　薬学的に許容される担体等の例としては、乳糖、ブドウ糖、ショ糖などの糖類；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンなどのデンプン類；セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、メチルセルロースなどの誘導体；トラガカントガム粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸やステアリン酸マグネシウムなどの固形潤滑剤；硫酸カルシウム；ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、植物油、カカオ油などの植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどの多価アルコール；アルギン酸；TWEENのような乳化剤；レシチンのような湿潤剤；着色剤；香料；錠剤化剤(tableting agent)；安定剤；坑酸化剤；防腐剤；パイロジェンフリー水；等張塩水溶液；及びリン酸緩衝液などがあげられるが、これらに限定されない。
　本発明の治療剤または予防剤の投与は、任意の適切な経路を介して患者に投与することができる。例えば、ボーラスとしてまたは一定期間にわたる持続注入による静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、経皮、皮下、皮内、関節内、舌下、滑液内、経口、吸入、局所または外用による経路により患者に投与される。
　投与量としては、例えば、1回につき体重1 kgあたり活性成分が0.0001 mg～100 mgの範囲で選ぶことが可能である。または、例えば、ヒト患者に投与する場合、患者あたり活性成分が0.001～1000 mg/kg・body・weightの範囲を選ぶことができる。抗体を有効成分とするIL-6阻害剤又はCCR2阻害剤であれば、1回当たり投与量としては、例えば0.01～50mg/kg・body・weight程度の量が含まれることが好ましい。
併用療法及び医薬組成物
　本発明における非限定の一態様において、本発明の併用療法は、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤の有効量を投与することを含む、細胞増殖を抑制する、腫瘍重量を抑制する、腫瘍体積を抑制する、がんを治療する、またはがんを予防する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明の併用療法は、IL-6阻害剤またはCCR2阻害剤の単独療法と比較して、細胞増殖を抑制する、腫瘍重量を抑制する、腫瘍体積を抑制する、がんを治療する、またはがんを予防する効果が高い。別の実施態様において、本発明の併用療法は、細胞増殖を抑制する、腫瘍重量を抑制する、腫瘍体積を抑制する、がんを治療する、またはがんを予防する相乗効果または相加効果を有する。
　いくつかの実施態様において、本発明における「有効量」は、個体における疾患（本発明においては特に泌尿器がん）を治療または予防するために有効なIL-6阻害剤および／またはCCR2阻害剤の用量を意味する。例えば、IL-6阻害剤が抗体の場合、一回の投与につき体重1 kgあたり例えば0.0001 mgから1000 mg、好ましくは0.001mgから100mg、更に好ましくは0.01～50mgの範囲の用量で、例えば１～１０週間毎に、好ましくは1～８週間毎に、更に好ましくは１～４週間毎に１回投与することがあげられるが、これらに制限されるものではない。また、CCR2阻害剤が抗CCL2抗体の場合、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mg、好ましくは0.001mg～100mg、更に好ましくは0.01～50mgの範囲の用量で、例えば1～１０週間毎に、好ましくは１～８週間毎に、更に好ましくは１～４週間毎に１回投与することがあげられるが、これらに制限されるものではない。また、CCR2阻害剤がCCR2に結合しCCL2のシグナルを遮断する低分子物質の場合、一回の投与につき、例えば1日あたり体重1kgあたり0.01mgから40mgの範囲で、好ましくは１日あたり体重1kgあたり0.25mgから10mgの範囲で毎日投与することがあげられる。CCR2阻害剤がプロパゲルマニウムの場合、例えば1日あたり20-40mgの範囲で、好ましくは1日あたり30mgで、例えば2-4回に分けて、好ましくは3回に分けて投与することがあげられるが、これらに制限されるものではない。
本発明における前記泌尿器がんは特に限定されないが、好ましくは膀胱がんである。
　いくつかの実施態様において、本発明における「治療」は、本発明の併用療法によって、個体の泌尿器における腫瘍増大が抑制されること、がん細胞数が減少すること、がん細胞の増殖が抑制されること、腫瘍体積が減少すること、腫瘍重量が減少すること、がん細胞の転移を抑制すること、またはがんに起因する様々な症状が改善されることを意味する。また、いくつかの実施態様において、本発明における「予防」は、減少したがん細胞が再度増殖することによるがん細胞数の増加を防止すること、増殖が抑制されたがん細胞の再増殖を防止すること、減少した腫瘍のサイズが再度増大することを防止すること、または局所治療により肉眼的に消失した（または治癒した）がんが再度肉眼的に出現することを予防すること、を意味する。
　いくつかの実施態様において、本発明の併用療法は、IL-6阻害剤を使用することにより、CCR2阻害剤によるがんの治療または予防に際して、当該CCR2阻害剤の治療または予防効果を増強する方法を提供する。別の実施態様において、本発明の併用療法は、CCR2阻害剤を使用することにより、IL-6阻害剤によるがんの治療または予防に際して、当該IL-6阻害剤の治療または予防効果を増強する方法を提供する。ここで、治療または予防効果の増強とは、例えば、治療の奏功率が上昇すること、治療のために投与されるIL-6阻害剤またはCCR2阻害剤の量が低減すること、および／または、IL-6阻害剤またはCCR2阻害剤による治療期間が短くなることをいうが、これらに限定されない。別の実施態様においては、本発明の併用療法は、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤の有効量を投与することを含む、個体において無増悪生存期間を増加させる方法を提供する。
　いくつかの実施態様において、本発明の併用療法は、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤の投与を含む。IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤は、当技術分野で公知の任意の適切な方法で投与することができる。例えば、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤を、並行して（すなわち同時に）または連続して（すなわち異なる時点で）投与することができる。いくつかの実施態様において、該IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤を連続して（すなわち異なる時点で）投与する場合、該IL-6阻害剤とCCR2阻害剤の投与間隔は特に限定されず、投与経路や剤型等の要因が考慮されて設定され得る。例えば、０時間～１６８時間であり、好ましくは０時間～７２時間であり、また好ましくは０～２４時間であり、さらに好ましくは０時間～１２時間であるが、これらに限定されない。
　いくつかの実施態様では、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤は同時投与される。いくつかの実施態様では、IL-6阻害剤は間欠的に（すなわち断続的に）投与される。いくつかの実施態様では、IL-6阻害剤は、CCR2阻害剤の投与前に投与される。いくつかの実施形態では、IL-6阻害剤は、CCR2阻害剤の投与後に投与される。
　いくつかの実施態様では、CCR2阻害剤は間欠的に（すなわち断続的に）投与される。いくつかの実施態様では、CCR2阻害剤は、IL-6阻害剤の投与前に投与される。いくつかの実施態様では、CCR2阻害剤は、IL-6阻害剤の投与後に投与される。
　いくつかの実施態様において、公知または本明細書に記載のIL-6阻害剤およびCCR2阻害剤が、本発明の併用療法に使用され得る。
　いくつかの実施態様においては、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤の併用療法に加えて、さらに追加療法を行うことができる。いくつかの実施態様において、本発明の併用療法に追加する療法には、追加のIL-6阻害剤および／またはCCR2阻害剤の投与を含んでもよい。
　本発明の非限定の一態様として、本発明は、IL-6阻害剤、CCR2阻害剤、またはIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを含有する、細胞増殖抑制剤（細胞増殖阻害剤）、がん細胞もしくはがん細胞を含む腫瘍組織の体積または重量の抑制剤、がん治療剤またはがん予防剤（以下、本発明の医薬組成物と総称する）を提供する。いくつかの実施態様において、本発明の医薬組成物は、本発明の併用療法に用いられ得る。いくつかの実施態様において、本発明の医薬組成物は、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤が併用されることにより、これらの単独療法と比較して、細胞増殖を抑制する、がん細胞もしくはがん細胞を含む腫瘍組織の体積または重量を抑制する、またはがんを治療もしくは予防する効果が高い。別の実施態様において、本発明の医薬組成物は、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤が併用されることにより、細胞増殖を抑制する、がん細胞もしくはがん細胞を含む腫瘍組織の体積または重量を抑制する、またはがんを治療もしくは予防する相乗効果または相加効果を有する。
　いくつかの実施態様において、本発明におけるIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを含有する」医薬組成物とは、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤を、疾患（本発明においては特に泌尿器がん）の治療または予防において同時に、別々に、または、順次に投与するために組み合わせた医薬組成物を意味する。例えば、本発明の医薬組成物は、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤が共に含有される配合剤の形で提供することができる。また、例えば、本発明の医薬組成物は、IL-6阻害剤を含有する薬剤とCCR2阻害剤を含有する薬剤とが別々に提供され、これらの薬剤が、同時に、または順次に使用されてもよい。前記泌尿器がんは特に限定されないが、好ましくは膀胱がんである。
　いくつかの実施態様において、本発明は、IL-6阻害剤を有効成分として含む、CCR2阻害剤と併用するための医薬組成物を提供する。
　いくつかの実施態様において、本発明は、CCR2阻害剤を有効成分として含む、IL-6阻害剤と併用するための医薬組成物を提供する。
　いくつかの実施態様において、本発明は、IL-6阻害剤をCCR2阻害剤と組み合わせることにより、CCR2阻害剤によるがんの治療に際して、当該CCR2阻害剤の治療効果を増強するための医薬組成物を提供する。
　いくつかの実施態様において、本発明は、CCR2阻害剤をIL-6阻害剤と組み合わせることにより、がんの治療に際して、当該IL-6阻害剤の治療効果を増強するための医薬組成物を提供する。
　いくつかの実施態様において、本発明は、IL-6阻害剤および／またはCCR2阻害剤を有効成分として含む医薬組成物を製造するためのIL-6阻害剤および／またはそのCCR2阻害剤の使用を提供する。
　なお、本発明において、IL-6阻害剤および／またはそのCCR2阻害剤を有効成分として含むとは、IL-6阻害剤および／またはそのCCR2阻害剤を主要な活性成分として含むという意味であって、IL-6阻害剤および／またはそのCCR2阻害剤の含有率を制限するものではない。
　KDM6Aは、ヒストン修飾蛋白質であり、その遺伝子はX染色体上に位置する。KDM6AはJmjCドメインを介してトリ・ジメチル化されたヒストンH3の27番目のリジン残基（H3K27）の脱メチル化を促進すると共に、TPR (tetratricopeptide repeat)と呼ばれる蛋白質相互作用ドメインを介してヒストンメチル化酵素であるMLL3 (mixed lineage leukemia 3, KMT2C) またはMLL4 (mixed lineage leukemia 4, KMT2D)と結合し、蛋白質複合体であるCOMPASS  (complex of proteins associated with Set1)-like complexの構成要素としてヒストンH3の4番目のリジン残基（H3K4）のメチル化に関与することが知られている。H3K27メチル化は転写抑制のヒストンマーク、H3K4メチル化は転写促進のヒストンマークであり、KDM6Aは上記の機能を介して標的遺伝子の転写活性化を促進すると考えられる。
　前記局面の一態様において、本発明は、IL-6阻害剤、CCR2阻害剤、またはIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを含む、泌尿器がんの治療用または予防用の医薬組成物（泌尿器がんの治療剤又は予防剤）であって、個体（例えば、泌尿器がん患者）から得られた生物試料におけるKDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異（好ましくは機能欠失型変異）の有無を評価し、KDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異（好ましくは機能欠失型変異）を有する個体を前記医薬組成物による治療または予防に対する応答者として選択し、当該選択された個体に投与するための、前記医薬組成物を提供する。
　別の態様において、本発明は、泌尿器がんの治療または予防における使用のためのIL-6阻害剤、CCR2阻害剤、またはIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせであって、個体（例えば、泌尿器がん患者）から得られた生物試料におけるKDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異（好ましくは機能欠失型変異）の有無を評価し、KDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異（好ましくは機能欠失型変異）を有する個体を前記治療または予防に対する応答者として選択し、当該選択された個体に投与するための、IL-6阻害剤、CCR2阻害剤、またはIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを提供する。
　他の態様において、本発明は、個体（例えば、泌尿器がん患者）に有効量のIL-6阻害剤を投与する工程および個体に有効量のCCR2阻害剤を投与する工程を含むか、またはIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを投与する工程を含む、泌尿器がんを治療または予防する方法であって、個体から得られた生物試料におけるKDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異（好ましくは機能欠失型変異）の有無を評価する工程、およびKDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異（好ましくは機能欠失型変異）を有する個体を前記治療または予防に対する応答者として選択する工程を含む、泌尿器がんを治療または予防する方法を提供する。前記評価する工程および選択する工程は、好ましくは前記投与する工程の前に実施される。
　これらの態様において、個体におけるp53の発現の低下、p53の機能の低下、及び/又はp53の変異の有無を評価し、p53の発現の低下、p53の機能の低下、及び/又はp53の変異を有する個体を前記治療または予防に対する応答者として選択してもよい。p53の変異の有無を評価する方法は当技術分野において公知である。
　本発明において、KDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、KDM6A遺伝子の変異、及びKDM6A遺伝子の機能欠失型変異は、例えば、泌尿器がんの患者から採取した試料をKDM6Aに対する抗体を使用して免疫染色することにより、又は患者から採取した試料についてウエスタンブロット法又はエクソンシークエンス法を実施することにより、確認することができる。
　例えば、KDM6Aに対する抗体を使用した免疫染色の結果、KDM6A陽性コントロール（例えばKDM6Aの機能が低下していない、KDM6Aの発現が低下していない、KDM6A遺伝子の変異を有さない、KDM6A遺伝子の機能欠失型変異を有さない患者から採取した生物試料）と比較して、KDM6A蛋白質の発現が顕著に低下している場合、KDM6Aの機能が低下している、KDM6Aの発現が低下している、KDM6A遺伝子が変異を有する、又はKDM6A遺伝子が機能欠失型変異を有すると判定することができる。
　本発明において、KDM6Aの機能の低下には、KDM6A機能の欠失、KDM6Aの不活化が含まれる。
　本発明において、KDM6Aの発現の低下には、KDM6A蛋白質の発現が顕著に低下すること、KDM6A蛋白質が発現しないことが含まれる。
　本発明において、KDM6A遺伝子の変異には、KDM6A遺伝子の機能欠失型変異が含まれる。具体的な変異としては、ナンセンス変異、フレームシフト変異、スプライス変異、欠失などが挙げられる。
　
　p53遺伝子は、DNA修復や細胞周期の制御、アポトーシスなどの誘導などの機能を有するがん抑制遺伝子の一つで、p53遺伝子変異は多様ながんにおいて認められている。変異型p53 蛋白は半減期が長く，細胞内に蓄積するため，血清中にp53 抗体が出現する（Lowe SW, Bodis S, McClatchey A et al：p 53　status and the efficacy of cancer therapy in vivo. Science 266：807―810, 1994）．このため血清中p53 抗体をELIZA法で測定することは，p53 遺伝子変異を伴ったがんの発見に有用と考えられており（Shimada H, Ochiai T, Nomura F et al：Titration of serum p 53 antibodies in 1085 patients with
various types of malignant tumors. Cancer 97：682―689, 2003），2007 年11 月から食道がん，大腸がんおよび乳がんにおける腫瘍マーカー検査として保険適応が認められている。
　本発明において、p53の機能の低下には、p53の機能の欠失、p53の不活化が含まれる。
　本発明において、p53の発現の低下には、p53蛋白質の発現が顕著に低下すること、p53蛋白質の発現が検出されないことが含まれる。
　本発明において、p53遺伝子の変異の具体的な変異としては、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、欠失などがあげられる。
　次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　膀胱がんにおけるUTX(KDM6A)欠失の関与を検討する目的で、膀胱上皮特異的にUTXを欠失したマウス（UtxΔ/Δ）を作製し、解析を行った。UtxΔ/Δマウスの膀胱上皮ではUtxの欠失が確認されたが、長期間の観察で膀胱に腫瘍発症は認めず、UTXの単独欠損は膀胱がん発症には十分ではないと考えられた。
　膀胱がんで最も高頻度に変異を認める遺伝子はp53であり、Utx欠失とp53変異は高率に合併することが知られている（The Cancer Genome Atlas Research Network, Nature 2014, vol. 507, p.315-322）。そこで、UtxΔ/Δマウスをp53ヘテロマウスと交配し、UtxΔ/Δ, p53+/-マウスを作製した。興味あることに、UtxΔ/Δ, p53+/-マウスは長期間の観察の結果上皮内がん（carcinoma in situ, CIS）の発症が認められ、Utx欠失はp53変異と協調して膀胱がん発症に関与していることが示された。
　さらに、膀胱がん発症には喫煙等の変異源への暴露が発症に重要と考えられているため、マウスに実験的膀胱がん誘発物質であるN-butyl-N-(4-hydro-oxybutyl) nitorosamine（BBN）の投与を行なった。その結果、投与から10週でコントロールのUtx+/+, p53+/-マウスは約60%に異形成～上皮内がん（Dysplasia～CIS）を認めたのに対し、UtxΔ/Δ, p53+/-マウスは100%異形成～上皮内がんを発症しており（図1A）、さらに一部は筋層への浸潤がん（Muscle invasive cancer）へと進行していた（図1B）。これらの結果は、Utx欠失とp53変異は膀胱がん感受性を亢進させ、変異源と協調して進行がんへと進展することを示している。我々のマウスは、ヒト膀胱腫瘍を遺伝子変異の蓄積および環境変異源の影響の見地から作製した、初めてのin vivoモデルと考えられる。
　膀胱がん発症におけるUTX欠失の関与について解析する目的で、我々はBBN投与4週の時点でコントロールのUtx+/+マウスおよびUtxΔ/Δマウスの膀胱から尿路上皮を採取し、RNAを抽出してトランスクリプトーム解析およびKEGG によるパスウェイ解析を行った。その結果、UtxΔ/Δマウスの膀胱上皮で最も亢進している経路は”Cytokine-cytokine receptor interaction”であり（図2A；太枠）、その他”MAPK pathway”および”JAK-STAT pathway”の亢進が認められた。これらの結果は、UTX欠失により膀胱上皮においてサイトカイン経路が活性化し、その結果MAPKやJAK-STATなどの細胞内情報伝達系が活性化していることを示している。さらに、”Cytokine-cytokine receptor interaction”経路で発現亢進している遺伝子を調べたところ、最も発現が高いのはケモカインCCL2であり、次にサイトカインIL6であることが判明した（図2B；太字）。
　そこでこれらのサイトカイン・ケモカインの機能を抑制することにより、膀胱がんの進展が抑制できるかどうかを検討する治療モデル実験を行なった。MBT2はC3Hというマウスラインから確立された膀胱がん腫瘍株である。そこで我々はMBT2にempty vector (EV)およびUtx knockout (KO) vectorを導入することにより、Utx発現株（EV clones）とUtx欠損株（KO clones）を作成した（図3A）。このクローンを同系のC3Hマウスに移植し、7日生着期間を設けて、その後にvehicleのみ、Propagermanium（CCL2の受容体CCR2の阻害剤、0.005%濃度となるよう餌に混ぜて連日投与）のみ、MR16-1（マウスIL6受容体に対する中和抗体、1匹あたり100μgを週3回腹腔内注射）のみ、およびPropagermanium とMR16-1の併用（Combination）による治療を行なった。
　その結果、図3Cに示す様に、Utx発現株を移植した結果生じたEV tumorではいずれの治療法もvehicleのみに比較して有意な治療効果を認めなかったのに対し、図3Dに示す様にUtx欠損株を移植した結果生じたKO tumorに対しては、Propagermanium とMR16-1の併用（Combination）療法が有意に腫瘍重量を抑制することが明らかとなった。
　これらの結果は、Utx欠損膀胱がんに対して、CCL2/CCR2活性とIL6活性を共に抑制することにより腫瘍増大を有意に抑制できることを示している。
　Utxの膀胱がん発症における関与を示した論文としては、Utx変異を有するヒト膀胱がん細胞株を用いた免疫不全マウスへの移植実験モデルが報告されているが（Deer Lee et al. Sci Trans Med 2017）、これは培養細胞を用いて異種移植を行った結果であり、生体内でのUtx機能欠失を反映したモデルとは言い難い。これまで、膀胱がんに着目して遺伝子改変の手法を用いて膀胱特異的Utx欠損（UtxΔ/Δ）マウスを作製し解析を行った研究は報告されておらず、本発明に関する研究とその手法は独自のものと考えられる。
　本発明は、泌尿器がん、特にlysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の機能が低下した泌尿器がんに対する新たな治療剤を提供するものである。

Claims (15)

  1. 　IL-6阻害剤を含有する、CCR2阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤。
  2. 　CCR2阻害剤を含有する、IL-6阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤。
  3. 　IL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを含む、泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤。
  4. 　前記IL-6阻害剤が抗IL-6抗体又は抗IL-6受容体抗体である、請求項１～３のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
  5. 　前記抗IL-6抗体及び抗IL-6受容体抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項４に記載の治療剤及び／または予防剤。
  6. 　前記CCR2阻害剤がCCL2阻害剤である、請求項１～５のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
  7. 　前記CCR2阻害剤が抗CCL2抗体又はプロパゲルマニウムである、請求項１～６のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
  8. 　前記抗CCL2抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項７に記載の治療剤及び／または予防剤。
  9. 　前記がんが膀胱がん、前立腺がん、腎臓がんである、請求項１～８のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
  10. 　前記がんが膀胱がんである、請求項１～９のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
  11. 　前記がんが、lysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の発現または機能が低下したがんである、請求項１～１０のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
  12. 　前記がんが、KDM6A遺伝子に変異を有するがんである、請求項１～１１のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
  13. 　前記KDM6A遺伝子の変異が機能欠失型変異である、請求項１２に記載の治療剤及び／または予防剤。
  14. 　前記がんが、p53の発現または機能が低下したがんである、請求項１～１３のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
  15. 　前記がんが、p53遺伝子に変異を有するがんである、請求項１～１４のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
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