EP0804557A1 - Lipase, micro-organisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisation de celle-ci - Google Patents

Lipase, micro-organisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisation de celle-ci

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Publication number
EP0804557A1
EP0804557A1 EP95934004A EP95934004A EP0804557A1 EP 0804557 A1 EP0804557 A1 EP 0804557A1 EP 95934004 A EP95934004 A EP 95934004A EP 95934004 A EP95934004 A EP 95934004A EP 0804557 A1 EP0804557 A1 EP 0804557A1
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EP
European Patent Office
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lipase
approximately
gly
enzymatic activity
val
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95934004A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christophe Andre
Lucien Charmoille
Pierre Cornelis
Manzour Hernando Hazbon
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Danisco US Inc
Original Assignee
Solvay SA
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Filing date
Publication date
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Application filed by Solvay SA filed Critical Solvay SA
Publication of EP0804557A1 publication Critical patent/EP0804557A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38627—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas

Definitions

  • the invention relates to a novel lipase.
  • the invention also relates to a new strain of microorganism producing this lipase.
  • the invention also relates to the methods of preparation of this lipase, the uses thereof and the compositions comprising it. It is known to include lipases in detergent compositions in order to remove fatty deposits from the tissues (Enzyme Microb. Technol., 1993 (3), pages 634-645). These fatty deposits contain triglycerides supplied, for example, by sebum, various food products (oil, sauce, butter, fat), cosmetic products. Lipases hydrolyze triglycerides to form more water-soluble products, mono- and di-glycerides, glycerol and free fatty acids.
  • Lipases which can be used in detergent compositions are known, such as in particular lipases originating from strains of Pseudomonas, for example the lipase produced by the strain of Pseudomonas stutzeri (British patent application 1372034), the lipase produced by the strain of Pseudo ⁇ monas mendocina (European patent application 0 571 982), the lipase produced by the strain of Pseudomonas alcaligenes (US patent 5,063,160), and the lipase produced by the strain of Pseudomonas pseudoalcaligenes (European patent application 0 218 272).
  • the detergent compositions containing these enzymes appear to be ineffective.
  • the present invention aims to provide a new lipase, active in a wide range of temperature, active in a wide range of alkaline pH, and effective from the first washing cycle.
  • the present invention also aims to identify, isolate and provide a strain, in particular a strain of Pseudomonas, which naturally produces said lipase.
  • the present invention also aims to prepare and provide a composition containing this lipase, and in particular a deter ⁇ gente composition.
  • the present invention relates to an isolated and purified lipase originating from a strain of Pseudomonas wisconsinensis.
  • the present invention also relates to an isolated and purified lipase originating from a derivative or mutant of a strain of Pseudomonas wisconsinensis capable of producing this lipase.
  • the lipase of the invention comes from the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 or a derivative or mutant of this strain capable of producing this lipase.
  • the lipase of the invention is derived from the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1. Lipase is classified in the international system under number E.C. 3.1.1.3 .; it is a glycerol ester hydrolase.
  • the isolated and purified lipase has a molecular weight of about 30 kDa. It is essentially extracellular.
  • N-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the lipase of the invention is as follows:
  • the invention relates to a lipase which comes from an aerobic bacterium capable of producing lipase in an appropriate nutritive medium containing sources of carbon and nitrogen and mineral salts under aerobic condition. biosis.
  • the invention relates to an isolated and purified lipase comprising the amino acid sequence of 1 to 286 amino acids (SEQ ID NO: 4) or a modified sequence derived therefrom.
  • the lipase of the invention is synthesized in the form of a precursor.
  • the precursor contains 308 amino acids (SEQ ID NO: 7).
  • FIG. 2 (FIGS. 2a and 2b) represents the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5) of the coding part of the lipase as well as its translation into amino acids (SEQ ID NO: 6).
  • the precursor contains the 286 amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the mature lipase and the 22 amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) of the presequence.
  • the mature lipase sequence is preceded by a presequence. It is an additional sequence of 22 amino acids (SEQ ID NO: 10). The corresponding nucleotide sequence is identified (SEQ ID NO: 8), as well as its translation into amino acids (SEQ ID NO: 9). This presequence codes for the signal peptide for the lipase of the invention.
  • said lipase has an estimated isoelectric point of between approximately 9.8 and approximately 10.1. In a particularly preferred manner, said lipase has an estimated isoelectric point equal to approximately 9.95.
  • the lipase of the invention is active over a wide range of temperatures.
  • the isolated and purified lipase of the invention develops an optimal enzymatic activity, measured at a pH of 9.5, in a temperature range greater than about 40 ° C.
  • the isolated and purified lipase of the invention develops an optimal enzymatic activity, measured at a pH of 9.5, in a temperature range below about 60 ° C.
  • the lipase of the invention develops an optimal enzymatic activity, measured at a pH of 9.5, in a temperature range between about 40 ° C and about 60 ° C.
  • the lipase of the invention develops an optimal enzymatic activity, measured at a pH of approximately 9.5, at a temperature of approximately 55 ° C.
  • the isolated and purified lipase of the invention develops an enzymatic activity of more than 50% of the maximum enzymatic activity in a temperature range between approximately 40 ° C. and approximately 60 ° C. for a pH of approximately 9, 5, the maximum enzymatic activity being measured at a temperature of 55 ° C. and at a pH of 9.5.
  • the lipase of the invention is active over a wide range of alkaline pH.
  • the isolated and purified lipase of the invention develops an optimal enzymatic activity, measured at a temperature of approximately 30 ° C., - 4 -
  • the isolated and purified lipase of the invention develops an optimal enzymatic activity, measured at a temperature of approximately 30 ° C., in a range of pH less than or equal at approximately 10. More particularly, the lipase of the invention develops an optimal enzymatic activity, measured at a temperature of approximately 30 ° C., in a pH range of between approximately 8 and approximately 10. In a particularly preferred manner, the lipase of the invention develops an optimal enzymatic activity, measured at a temperature of about 30 ° C, in a pH range between about 8 and about 9.5.
  • the isolated and purified lipase of the invention develops an enzymatic activity of more than 85% of the maximum enzymatic activity in a pH range of between approximately 8 and approximately 10 for a temperature of approximately 30 ° C., the maximum enzymatic activity being measured at a temperature of 30 ° C and a pH of 9.5.
  • the lipase of the invention is thermostable at an alkaline pH. Indeed, the isolated and purified lipase of the invention shows a relative enzymatic activity of at least 55% measured after an incubation of 160 minutes at a temperature of 55 ° C and at a pH of 10 in a buffered solution of hardness 15. It shows a relative enzymatic activity of at least 70% measured after an incubation of 80 minutes under these same conditions.
  • relative enzymatic activity is meant the ratio between the enzymatic activity, measured during a test carried out under given conditions of pH, temperature, substrate and duration, and the maximum enzymatic activity measured during this same test, the enzymatic activity being measured from the hydrolysis of the triolein and the maximum enzymatic activity being arbitrarily fixed at the value of 100.
  • the invention also relates to a modified lipase, that is to say an enzyme whose amino acid sequence differs from that of the wild-type enzyme by at least one amino acid.
  • modifications can be obtained by conventional DNA mutagenesis techniques, such as exposure to ultraviolet radiation, to chemicals, such as ethyl methane sulfonate (EMS), N-methyl-N -nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), sodium nitrite or O-methylhydroxy lamine or by genetic engineering techniques, such as, for example, site-directed mutagenesis or random mutagenesis.
  • the invention also relates to a mutated lipase obtained by modification of the nucleotide sequence of the gene that codes for lipase.
  • the techniques for obtaining such mutated lipases are known to a person skilled in the art and are in particular described in MOLECULAR CLONING - a laboratory manual - SAMBROOK, FRITSCH, MANIA ⁇ S - second edition, 1989, chapter 15.
  • the invention also relates to a lipase having immunochemical properties identical or partially identical to the lipase obtained from the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1.
  • the immunochemical properties can be determined immunologically by identity tests, in particular by using specific, polyclonal or monoclonal antibodies. Identity tests are known to those skilled in the art, such as in particular the Ouchterlony immunodiffusion method, or the immunoelectrophoresis method. Examples of such methods are described by Axelsen NH, Handbook of Immunoprecipitation Gel Techniques, Blackwell Scientific Publications, 1983, chapters 5 and 14, the terms "antigenic identity” and "partial antigenic identity” are described in this document in chapters 5, 19 and 20.
  • a serum containing the specific antibody is prepared according to the method described by immunizing animals (for example mice, rabbits or goats) with a preparation of purified lipase.
  • This preparation can be mixed with an additive, such as Freund's adjuvant, and the mixture obtained is injected into animals.
  • the polyclonal antibody is obtained after one or more immunizations.
  • An example consists in injecting, subcutaneously two weeks apart, four fractions each containing 150 micrograms of purified lipase, the immunization then lasts 8 weeks.
  • the serum is taken after the immunization period and the immunoglobulin can be isolated according to the method described by Axelsen N.H. (1983).
  • the present invention also relates to the isolation, identification and supply of a novel lipase producing bacteria.
  • This aerobic bacteria has been isolated and purified. Generally it belongs to the family of 6 -
  • Pseudomonadaceae Preferably it belongs to the genus Pseudomonas. In a particularly preferred manner, it is a strain of Pseudo ⁇ monas wisconsinensis. Good results have been obtained with the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 strain or a derivative or mutant of this strain.
  • mutant of this strain By derivative of this strain is meant any naturally modified bacteria, that is to say by natural selection.
  • mutant of this strain is meant any artificially modified bacteria. Mutants of this strain can be obtained by known modification techniques, such as ultraviolet radiation, X-rays, mutagens or genetic engineering. These techniques are known to those skilled in the art and are described in particular in SAMBROOK et al., 1989, chapter 15. Examples of mutagenic agents are described in particular by R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 365-368.
  • the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 was deposited in the collection named BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS (LMG culture collection, University of Ghent, Laboratory of Microbiology - KL Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, Belgium) in accordance with the Budapest Treaty under the number LMG P-15151 October 12, 1994.
  • the invention relates to an isolated and purified culture of the strain of Pseudomonas wisconsinensis and a culture derived or mutated thereof.
  • the invention relates to an isolated and purified culture of the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 and a culture derived or mutated therefrom.
  • the strain of the present invention has been identified by its biochemical characteristics. It is an aerobic Gram negative bacterium. It does not develop anaerobically. No spores are formed.
  • the oxidase test is positive in the presence of 1% (w / v) of tetramethyl-1,4-phenylene-diammoniumdichloride. This bacteria is not thermophilic. It does not produce gas from glucose.
  • the invention also relates to the isolation and supply of a DNA molecule comprising the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) which codes for the mature lipase of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 or a modified sequence derived from that -this.
  • modified sequence derived from the DNA molecule is meant any DNA molecule obtained by modification of one or more nucleotides - 7 -
  • the modified sequence derived from the DNA molecule comprises at least 70% homology with the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) of the gene which codes for the lipase of the invention, that is to say at least 70% of identical nucleotides and having the same position in the sequence.
  • the modified sequence derived from the DNA molecule comprises at least 80% of homology with the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) of the gene which codes for the lipase of the invention.
  • the modified sequence derived from the DNA molecule comprises at least 90% of homology with the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) of the gene which codes for the lipase of the invention.
  • the DNA molecule according to the invention comprises at least the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5) which codes for the lipase precursor or a modified sequence derived therefrom.
  • This nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5) comprises the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) coding for the mature lipase of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 and its signal sequence (pre-sequence) (SEQ ID NO: 8).
  • this DNA molecule comprises the entire lipase gene from Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1.
  • the present invention also relates to a process for the production of a lipase.
  • This process comprises the cultivation of an aerobic bacterium capable of producing lipase in an appropriate nutritive medium containing carbon and nitrogen sources and mineral salts under aerobic conditions and the harvesting of the lipase thus obtained.
  • This culture medium can be solid or liquid.
  • the culture medium is liquid.
  • the aerobic bacterium is a strain of Pseudomonas or a derivative or mutant of this strain capable of producing lipase. More particularly, the aerobic bacterium is a strain of Pseudomonas wiscon ⁇ sinensis or a derivative or mutant of this strain capable of producing lipase.
  • the aerobic bacterium is a strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 or a derivative or mutant of this strain capable of producing lipase.
  • the culture conditions of these bacteria which make it possible to obtain the lipase of the invention, such as components of the nutritive medium, culture parameters, temperature, pH, aeration, agitation, are well known to those skilled in the art. Examples of culture conditions are described in particular in European patent application 0 571 982.
  • Lipase harvesting techniques are well known to those skilled in the art and are chosen according to the intended uses of the lipase. Usually, centrifugation, filtration, ultrafiltration, evaporation, microfiltration, crystallization or a combination of one or the other of these techniques such as centrifugation followed by ultrafiltration are used. Examples of such techniques are notably described by R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
  • the lipase can then be purified, if necessary and according to the intended uses.
  • Enzyme purification techniques are well known to those skilled in the art, such as precipitation using a salt, such as ammonium sulfate, or a solvent, such as acetone or an alcohol. . Examples of such techniques are notably described by R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
  • the lipase can also be dried by atomization or lyophilization. Examples of such techniques are notably described by R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
  • the present invention also relates to enzymatic compositions comprising the lipase according to the invention and at least one additive. According to the envisaged uses, the enzymatic compositions comprising the lipase of the present invention can be in solid or liquid form.
  • additives included in the composition according to the invention, are known to those skilled in the art and are chosen according to the intended use of the composition. They must be compatible with lipase and not affect the enzymatic activity of lipase. Usually, these additives are stabilizers of the enzyme, preservatives and formulants. Examples of additives are described in particular in European patent application 0 218 272. Examples of additives that may be mentioned include ethylene glycol, glycerol, 1,2-propanediol, starch, a sugar such as as glucose and sorbitol, a salt such as sodium chloride, calcium chloride, potassium sorbate and sodium benzoate or a mixture of two or many of these products. Good results have been obtained with 1,2-propanediol. Good results have also been obtained with sorbitol.
  • the lipase according to the invention has multiple outlets in various industries, such as, for example, the food industries, the pharmaceutical industries or the chemical industries.
  • Lipase can in particular be used in detergency.
  • the present invention also relates to the use of lipase, as defined above, in detergency.
  • An example of such a use is described in particular in British patent application 1372034 and in European patent application 0 218 272. In this context, it is part of detergency compositions.
  • the present invention therefore also relates to detergent compositions containing lipase.
  • the components of the detergent compositions are known to those skilled in the art and are adapted according to the intended use of the composition. Such components are in particular enzymes, such as for example proteases, amylases and / or cellulases; bulking agents, such as sodium tripolyphosphate; bleaching agents, such as perborate; formulation additives; surfactants.
  • the detergency compositions of the invention can be used, depending on their formulation, as washing powder, granule or liquid for washing clothes; as a stain remover for detaching or degreasing objects or detaching laundry prior to cleaning; and as a powder, granule or liquid for washing dishes.
  • Lipase can in particular be used during the treatment of old paper in order to remove the oil-based inks.
  • An example of such a use is described in particular in the summary Chemical Abstract 113/154607.
  • Lipase can in particular be used during the processing of paper pulp to avoid sticky deposits known under the name of "pitch".
  • An example of such a use is described in particular in the document Enzyme Microb. Technol., 1993 (3), pages 634-645.
  • FIG. 1 (FIGS. 1 a and 1 b) represents the amino acid sequence and the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) coding for mature lipase, as well as its translation into amino acids (SEQ ID NO: 3).
  • Figure 2 ( Figures 2a and 2b) shows the nucleotide sequence
  • the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 strain was isolated from a soil sample taken from the United States in the state of Wisconsin.
  • 1 g of earth is suspended in 10 ml of demineralized water containing 9 g / 1 of NaCl. This suspension is diluted 10 times with demineralized water containing 9 g / 1 of NaCl.
  • Medium A contains 10 g / 1 of tryptone (Difco), 5 g / 1 of yeast extract, 5 g / 1 of NaCl, 20 g / 1 of agar, 2.5 g / 1 of NaHCO 3 , 7 , 5 g / 1 of Na 2 CO 3 , 10 g / 1 of olive oil, 1 g / 1 of polyvinyl alcohol (25/140) and
  • An olive oil emulsion is first prepared as follows. 50 ml of distilled water is heated to 80 ° C. 1 g of polyvinyl alcohol is added in small portions to this heated water. Then, 10 g of olive oil are added to the suspension of polyvinyl alcohol. It is then emulsified using an Ultra-turax mixer at 13,500 revolutions per minute (rod 18 GM). The emulsion obtained is sterilized at 121 ° C for 30 minutes.
  • An agar is then prepared as follows. 10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of NaCl, 20 g of agar are added in 850 ml of distilled water. The agar suspension obtained is sterilized at 121 ° C for 30 minutes.
  • the sterilized olive oil emulsion and the sterilized agar are cooled to 60 ° C, then sterile mixed. Then add the sterilized rhodamine solution to it. Then, 100 ml of sterilized carbonate buffer are added so as to obtain a pH of 9.5.
  • the suspension thus obtained is emulsified by means of an Ultra-turax mixer at 13,500 revolutions per minute (rod 18 GM).
  • the microorganisms producing a lipase are detected using an ultraviolet light, they are surrounded by a fluorescent halo.
  • the microorganisms detected as producing a ,pase are cultured on an agar B nutrient medium.
  • Medium B contains 10 g / 1 of tryptone (Difco), 5 g / 1 of yeast extract, 5 g / 1 of NaCl, 20 g / 1 of agar, 2.5 g / 1 of NaHCO 3 , 7 , 5 g / 1 Na 2 CO 3 .
  • Tryptone, yeast extract, NaCl, agar, which make up medium B are mixed with 900 ml of distilled water, then sterilized at 121 ° C for 30 minutes.
  • the pH is adjusted to 9.5 by the addition of 100 ml of previously sterilized carbonate buffer (containing 25 g / 1 of NaHCO 3 and 75 g / 1 of Na 2 CO 3 ).
  • the microorganism has been identified by its biochemical characteristics: Gram negative bacteria, aerobic. No spores are formed.
  • the size of the vegetative cells is 0.5-0.7 ⁇ m x 1.5-4.0 ⁇ m.
  • the mobility of vegetative cells is positive.
  • the lysis test with 3% (w / v) of KOH is positive.
  • the catalase test is positive in the presence of 10% (v / v) of hydrogen peroxide.
  • the oxidase test is positive in the presence of 1% (w / v) of tetramethyl-1,4-phenylene-diammoniumdichloride.
  • the urease test is negative.
  • the nitrate reduction test is positive. Comparable tests have in particular been described in European patent application 0 218 272. This strain is aerobic, that is to say that it develops aerobically.
  • the abbreviation% (v / v) represents a percentage expressed in volume by volume.
  • the abbreviation% (v / p) represents a percentage expressed by volume by weight.
  • the abbreviation% (w / v) represents a percentage expressed by weight per volume.
  • the abbreviation% (w / w) represents a percentage tage expressed in weight by weight.
  • This strain is not thermophilic. It exhibits normal development after incubation on agar medium B at 20 ° C, 30 ° C, 37 ° C and 41 ° C. The strain does not produce gas from glucose.
  • the strain uses azelate, caprate, citrate, glucose, gluconate, L-arginine, L-histidine, betaine and geraniol.
  • the strain does not use adipate, phenylacetate, L-arabinose and maltose. It does not hydrolyze gelatin, starch and esculin.
  • the strain belongs to the genus Pseudomonas and to the RNA-I group.
  • the biochemical characteristics clearly differentiate the strain of Pseudomonas wisconsinensis, and in particular the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1, of a strain of Pseudomonas mendocina, of a strain of Pseudomonas pseudoalcaligenes, of a strain of Pseudomonas alcaligenes and of a strain of Pseudomonas stutzeri. This appears clearly on reading Table 1 gathering the main biochemical characteristics of these 5 strains.
  • the isolated bacterium therefore belongs to the genus Pseudomonas, no known species could be determined.
  • T 92.677 / 1 The strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 is cultured on a Petri dish containing the medium B agar at 30 ° C for 24 hours.
  • a culture is carried out in 25 ml of a liquid medium C.
  • Medium C contains 10 g / 1 of tryptone (Difco), 5 g / 1 of yeast extract, 10 g / 1 of NaCl, the pH of the medium is adjusted to 7.0 with
  • the medium is sterilized at 121 ° C for 30 minutes.
  • the culture is carried out at 30 ° C. with orbital stirring at the rate of 200 revolutions per minute with an amplitude of approximately 2.54 cm.
  • this culture is introduced into a 20 liter fermenter containing 13 liters of sterilized liquid medium D.
  • Medium D contains K 2 HPO 4 2.5 g / 1, KH 2 PO 4 2.5 g / 1, MgSO 4. 7H 2 0
  • the medium is sterilized in the fermenter for 30 minutes at 121 ° C.
  • the enzyme activity of the culture thus obtained is measured by the following technique. - 15
  • triolein The hydrolysis of triolein is quantified by the neutralization of the fatty acids released under the action of lipase. This measurement is carried out using an automatic titration device, which device maintains the pH constant at a set value by the addition of 0.01 N NaOH.
  • a lipase unit (LU) is defined as the amount of enzyme which catalyzes the release of one micromole of fatty acid per minute under the standard conditions of the test described below.
  • a dilution buffer is prepared containing 2.34 g / l of NaCl, 2.94 g / l of CaCl 2 .2H 2 0 and 0.61 g / 1 of Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-1,3 -propane- diol).
  • An automatic titration apparatus is used, equipped with a burette containing 0.01N NaOH, a temperature probe and a pH probe and equipped with a thermostatically controlled reactor.
  • a magnetic stirring rod 10 ml of triolein emulsion and 20 ml of dilution buffer are introduced.
  • the pH of the solution thus obtained is adjusted to 9.5 with 0.1N NaOH.
  • 0.5 ml of the test sample containing the lipase is introduced, the sample is optionally diluted so that it contains only a maximum of 5 LU.
  • the pH is checked for the first two minutes with 0.01N NaOH.
  • EXAMPLE 3 Preparation of a Concentrated Lipase Solution
  • the pH of the culture is adjusted, as obtained at the end of fermentation to - 16
  • Example 2 at a pH of 8 with 10N concentrated caustic soda. Then, 1% (v / v) of Triton X-114 (SERVA 37214) is added to this culture. The mixture is gently stirred for 2 hours at 15 ° C.
  • the mixture is centrifuged for 15 minutes at 9000 revolutions per minute (Beckman J21, rotor JA10) at a temperature of 4 "C.
  • the centrifuge supernatant is stored.
  • the centrifuge supernatant is heated at 40 ° C. for 5 minutes.
  • phase separation is observed.
  • the upper phase is eliminated.
  • 35% (v / v) of acetone is added to the lower phase at 4 ° C.
  • the suspension is incubated for 15 minutes at 4 ° C. with moderate stirring.
  • the suspension is centrifuged for 15 minutes at 9000 revolutions per minute (BECKMAN J21, rotor JA10) at a temperature of 4 ° C. The centrifugation supernatant is kept.
  • Acetone is added to the centrifugation supernatant at 4 ° C until an acetone concentration of 65% (v / v) is obtained.
  • the mixture is incubated for 16 hours at 4 ° C. Then, the mixture is centrifuged for 15 minutes at 9000 rpm
  • Example 3 To purify the concentrated lipase solution, as obtained in Example 3, the purification technique using hydrophobic interaction chromatography is used, followed by the purification technique using molecular sieving chromatography. . By following the directions for use prescribed by the supplier
  • phobe a Pharmacia Hiload 16/10 Phenyl-Sepharose column (ref. 17-1085-01) is loaded with 140 ml of the concentrated lipase solution, as obtained in Example 3.
  • a balance buffer a 20 mM phosphate buffer at pH 7.2 is used; as elution buffer, a 20 mM phosphate buffer at pH 7.2 containing 30% (v / v) of isopropanol.
  • the flow rate is fixed at 1.5 ml per minute. The lipase is recovered with the fraction eluted with the phosphate buffer containing isopropanol.
  • the enzymatic activity of the fraction is measured according to the method described in Example 2.
  • the eluted fraction, containing the lipase, is diafiltered in an Amicon cell, equipped with a YM10 membrane, with 10 volumes of a buffer (pH 7) containing 25 mM CaCl 2 and 20 mM Tris.
  • the diafiltered fraction is concentrated to 0.5 ml by ultrafiltration using the same Amicon cell, equipped with a YM10 membrane.
  • the fraction containing the purified lipase is used, as obtained in Example 4.
  • N-terminal sequence (SEQ ID NO: 1) is as follows: Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr Gly
  • This sequence differs from the N-terminal sequences of other lipases 18 -
  • amino acid sequence of the lipase of the present invention is indirectly determined from the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5) of the gene which codes for this lipase, the production of which is described in Example 17. This is done using the IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release # 5.4) computer program from IntelliGenetics, Inc. USA.
  • FIG. 2 represents the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5) of the coding part of the lipase as well as its translation into amino acids (SEQ ID NO: 6).
  • Lipase is synthesized in the form of a precursor.
  • the lipase precursor contains 308 amino acids (SEQ ID NO: 7).
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5) coding for the lipase precursor is identified as well as its translation into amino acids (SEQ ID NO: 6).
  • the presequence of the lipase synthesized in the form of a precursor is identified. It is a sequence of 22 amino acids (SEQ ID NO: 10) which constitutes the signal peptide. The corresponding nucleotide sequence is identified (SEQ ID NO: 8).
  • the mature lipase contains 286 amino acids (SEQ ID NO: 4).
  • Figure 1 represents the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) coding for mature lipase as well as its translation into amino acids (SEQ ID NO: 3).
  • SEQ ID NO: 2 represents the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) coding for mature lipase as well as its translation into amino acids (SEQ ID NO: 3).
  • the molecular weight of the lipase is estimated by calculation from the amino acid sequence of the mature form of lipase and from the amino acid sequence of lipase including the signal peptide, as described in example 6.
  • the markers used are phosphorylase b (94 kD), albumin (67 kD), ovalbumin (43 kD), carboanhydrase (30 kD), trypsin inhibitor (20.1 kD) and alpha-lactalbumin (14.4 kD).
  • the gel thus obtained shows that the fraction containing the purified lipase, as obtained in Example 4, is pure. Fast Coomassie staining,
  • the isoelectric point of the lipase is estimated from the amino acid sequence of the mature form of the lipase and from the amino acid sequence of the lipase including the signal peptide, as described in example 6.
  • the enzymatic activity of the lipase is measured at different pHs according to the method described in Example 2.
  • the hydrolysis of the substrate is therefore determined following the action of the lipase at different pHs, all the others conditions being identical to standard conditions, as described in Example 2, that is to say at a temperature of 30 ° C and a duration of two minutes.
  • the fraction containing the purified lipase is used, as obtained in Example 4.
  • the lipase of the invention has an optimal enzymatic activity measured at a pH of 9.5 in a temperature range between about 40 and about 60 ° C.
  • This example also shows that the lipase of the invention develops an optimal enzymatic activity, measured at a pH of 9.5, at a temperature of approximately 55 ° C.
  • the lipase of the invention develops an enzymatic activity of more than 50% of the maximum enzymatic activity in a temperature range between approximately 40 and 60 ° C for a pH of approximately 9.5.
  • Example 12 Determination of the Lipase pH Optimum
  • the enzymatic activity of the lipase is measured at different pHs according to the method described in Example 2.
  • the hydrolysis of the substrate is therefore determined following the action of the lipase at different pH, all the other conditions being identical to the standard conditions, as described in Example 2, that is to say say at a temperature of 30 ° C and a duration of two minutes.
  • the fraction containing the purified lipase is used, as obtained at Example 4.
  • This example shows that the lipase of the invention develops an optimal enzymatic activity, measured at a temperature of approximately 30 ° C, in a pH range between approximately 8 and 10.
  • the maximum enzymatic activity was measured for the sample placed at a pH of approximately 9.5 and at a temperature of approximately 30 ° C. By definition, this sample was therefore assigned a relative enzymatic activity of 100%.
  • the lipase of the invention develops an enzymatic activity of more than approximately 90% of the maximum enzymatic activity in a pH range of between approximately 8 and approximately 10 for a temperature of approximately 30 ° C.
  • the lipase of the invention develops an enzymatic activity of more than approximately 70% of the maximum enzymatic activity in a pH range between approximately 8 and approximately 11 for a temperature of approximately 30 ° C.
  • the part of the fraction containing the purified lipase, as obtained in Example 4 is incubated at pH 10 and at 55 ° C. in an aqueous hardness buffer. (buffer containing 1.98 mM calcium chloride, 0.69 mM magnesium chloride and 2.5 mM sodium bicarbonate).
  • the deactivation constant (k) over the 0-260 minute interval is 0.000333 min-1.
  • In (AJ A) -kt, t being the incubation time, AQ the activity relating to the incubation time 0 and A j the activity relating to the time incubation t.
  • the maximum enzymatic activity was measured for the sample at time 0. By definition, this sample was therefore assigned a relative enzymatic activity of 100%.
  • the lipase of the invention shows a relative enzymatic activity of at least 55% measured after an incubation of 160 minutes at a temperature of 55 ° C and at a pH of 10 in a buffered solution of hardness 15 It shows a relative enzymatic activity of at least 70% measured after an incubation of 80 minutes under these same conditions.
  • Example 14
  • a piece of white fabric (R. Hoppe Gmbh) is prepared, based on cotton (65%) and polyester (35%), 10 cm by 10 cm, impregnated with bacon fat and Sudan red.
  • the impregnation of the fabric is carried out as follows.
  • a homogeneous solution of Sudan red 7B (SIGMA cat. No. F 1000) and bacon fat (Laru Gmbh) is prepared by adding 0.1% (w / w) of Sudan red with bacon fat. The mixture is heated to 90 ° C. until the Sudan red is completely dissolved. A roll of fabric is immersed in the solution of Sudan red and bacon fat kept at 90 ° C and continuously moved into this solution at the speed of 0.5 m / minute. Then, the fabric is spun under constant linear pressure between two rollers. The fabric thus impregnated contains 31.5% (w / w) of fat. The impregnated fabric is placed at -18 ° C for 22 hours until the fat has completely crystallized. The fabric is cut into 10 cm by 10 cm pieces. Then the pieces of impregnated fabric are stored at -18 ° C in the dark.
  • a liquid detergent composition is prepared containing 4 g / l of a compact washing powder (Eurocompact powder from UNILEVER) and various lipase concentrations equivalent to 500, 1000 and 2000 LU / 1, in water of hardness 15 (water containing 1.98 mM calcium chloride, 0.69 mM magnesium chloride and 2.5 mM sodium bicarbonate).
  • the initial pH of the liquid detergent composition is approximately 10.
  • the lipase as obtained in Example 4 is used, which is diluted with water of hardness 15 in order to obtain the concentrations desired.
  • the washing performance in% is defined as the difference between the reflectance (RL) obtained with the washing in the presence of lipase and the reflect - 25
  • the results of this example show that the lipase of the invention is effective at a low dose of enzyme in the detergent composition.
  • the results of this example also show that the lipase of the invention is particularly effective from the second washing cycle and that it retains increased efficiency after three and four washing cycles.
  • lipase is particularly effective at the concentration of 500 LU / 1 after three washing cycles.
  • lipase is particularly effective at the concentration of 1000 LU / 1 from the first washing cycle. Lipase is particularly effective at the concentration of 1000 LU / 1 during all the washing cycles.
  • EXAMPLE 15 Cloning of the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 Lipase Gene 1. Extraction of the chromosomal AFN from the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 strain
  • Genomic DNA is prepared using the technique described by WILSON, 1990, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1 (Unit 2.4), with the modifications described below.
  • Example 2 From the culture, as obtained in Example 2, a culture of 200 ml of the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 strain is carried out in LB growth medium for 16 hours at 37 ° C.
  • the composition of the LB growth medium is as follows: TRYPTONE (DIFCO) 10 g / 1, yeast extract 5 g / 1, NaCl 10 g / 1.
  • the culture obtained is centrifuged (SORVALL RC 5C Plus centrifuge, SS-34 rotor) at 2000 G for 15 minutes.
  • the centrifugation pellet thus obtained is taken up in a solution containing 9.5 ml of TE buffer at a pH of 8.0; 500 ⁇ l of a 10% (w / v) SDS (sodium dodecyl sulfate) solution; and 50 .mu.l of proteinase K solution (sold by
  • TRIS-HC1 Tris (hydroxymethyl) aminomethane) -HCl
  • ImM EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • This lysate is extracted with 15 ml of a chloroform / isoamyl alcohol mixture (3-methyl-1-butanol) 24/1 under the conditions and following the procedures described in Molecular Cloning - a laboratory manual - SAMBROOK , FRITSCH, MANIA ⁇ S - second edition, 1989, on page E.3, until a clean interface is obtained, as described there.
  • the DNA contained in the viscous suspension is precipitated according to the technique described in SAMBROOK et al., 1989, p. 9.18.
  • the precipitated DNA is wound around a Pasteur pipette, then is washed three times with 70%
  • the chromosomal DNA (15 ⁇ g) of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 is partially cleaved by the restriction enzyme Sau3AI.
  • the method is implemented by successive dilution of the restriction enzyme and the restriction conditions are those described in SAMBROOK et al. , 1989, pages 5.28-5.32.
  • Cleavage is partially inhibited by the addition of i ⁇ l of 0.5 M EDTA at pH 8.0 in the presence of ice.
  • fractions, obtained after cleavage, which contain fragments having a size between 20 and 40 kbp, are determined on an agarose gel. All the fragments thus obtained are then subjected to precipitation according to the technique described in SAMBROOK et al. , 1989, p. 9.18.
  • the DNA fragments are then ligated according to the method described by SAMBROOK et al. , 1989, pages 1.68-1.69, with the plasmid pRG930 (750 ng), previously cut at the BamHI site as described by
  • plasmids which are called pRG930 :: WI.
  • the ligation thus obtained is used to transfect cells of E. coli HB101 (PROMEGA) using the kit sold under the name of
  • E. coli HB101 The transfected cells of E. coli HB101 are cultured on a Petri dish containing LB agar medium, 25 ⁇ g / ml of streptomycin and 50 ⁇ g / ml of spectinomycin, for approximately 24 hours at 37 ° C. This gives a collection of transfected strains which are called E. coli HB101 (pRG930:: WI).
  • nucleotides of several lipases produced by different strains of Pseudomonas and published in Gilbert J. et al., Enzyme Microbiological Technology, 1993, 15, p. 634-645, and, on the other hand, the property known as the "codon usage" of the strain of Pseudomonas aeruginosa and published in West S. et al. , Nucleic Acid research, 1988, 16, p. 9323-9335.
  • This synthetic oligonucleotide is labeled at its termination by means of T - ⁇ 2 P ATP with a T4 polynucleotide kinase enzyme according to the technique described in the SEQUITHERM CYCLE SEQUENCING KIT (BYOZYME). Screening is carried out on the genomic bank by the so-called "colony blot” technique (AMERSHAM) using as probe the synthetic oligonucleotide as prepared above.
  • AERSHAM colony blot
  • the 1,500 colonies of the genomic bank (E. coli HB101 (pRG930:: WI)) are cultured for 18 hours at 37 ° C. on membranes called "hybond-N ⁇ " (AMERSHAM) using the technique indicated by the maker.
  • the membranes (400 cmr) are placed in plastic bags containing 45 ml of prehybridization solution.
  • the solution of contains 15 ml of 20X SSC (3 M NaCl and 0.3 M sodium citrate, pH 7.0), 5 ml of Denhardt's solution and 500 ⁇ g of denatured and fragmented salmon sperm DNA (AMERSHAM) .
  • Denhardt's solution contains 5 g of FICOLL type 400 (PHARMACIA), 5 g of polyvinylpyrrolidone and 5 g of bovine serum albumin.
  • the membranes are then incubated with a hybridization solution at 68 ° C in a water bath with stirring (1U0 revolutions per minute, amplitude of about 2.54 cm) for 18 hours.
  • the hybridization solution is prepared by mixing 5 ml of the prehybridization solution preheated to 68 ° C and the labeled synthetic oligonucleotide, and having been incubated in a water bath for 5 minutes, the final concentration of the synthetic oligonucleotide is 0.3 pMol.
  • the membranes are then recovered.
  • the membranes are then washed with a solution containing 100 ml of 2X SSC (0.3 M NaCl and 0.03 M sodium citrate, pH 7.0) and 0.1% (w / v) of SDS for 5 minutes at room temperature.
  • the washed membranes are dried between two absorbent papers.
  • the dried membranes are covered with a transparent food-grade plastic sheet. They are then subjected to an X-ray autoradiography (AMERSHAM).
  • the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 is used as a positive control and the strains of E. coli HB101 and E. coli HB101 (pRG930) are used as a negative control.
  • E. coli HB101 (pRG930) was obtained by the transformation technique described in Molecular Cloning, a laboratory Manual - MANIA ⁇ S et al. , 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, pages 150-151, using the strain of E. coli HB101 and the plasmid pRG930. There is a clear and strong signal for the wild strain of
  • the DNA is transferred to a so-called “hybond-N + " membrane (AMERSHAM) and hybridization is carried out according to the technique indicated by the manufacturer as illustrated in example 15.
  • AERSHAM hybond-N + " membrane
  • hybridization is carried out according to the technique indicated by the manufacturer as illustrated in example 15.
  • the plasmid pRG930 is used. .
  • the fragment inserted into the plasmid pRG930 :: WI12 is formed, on the one hand, of 4 fragments which together have a size of approximately 18.5 kbp and, on the other hand, of an attached fragment to the vector pRG930. This fragment has a size of approximately 8.5 kbp.
  • the 8.5 kbp fragment attached to the vector pRG930 is then ligated on itself according to the method described by SAMBROOK et al., 1989, pages 1.68-1.69.
  • the plasmid pRG930 :: WI13 is obtained.
  • the ligation thus obtained is used to transform cells of E. coli DH5 ⁇ (GIBCO) as described in SAMBROOK et al., 1989, page 1.82-1.84.
  • E. coli DH5 ⁇ (pRG930 :: WI13) which is isolated and cultured on a Petri dish containing the LB agar medium, 25 ⁇ g / ml of streptomycin and 50 ⁇ g / ml of spectinomycin, for approximately 24 hours at 37 ° C.
  • a partial restriction map of the plasmid pRG930 :: WI13 is established using the technique described in Molecular Cloning, a laboratory Manual - MANIA ⁇ S et al., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, pages 374-379, and using the enzymes restriction restriction Clal, EcoRI, Ncol, Sali, Hindi ⁇ , Bgi ⁇ , Xhol, BamHI, Smal, Sacl, SacII, Kpnl, SphI, Xbal, EcoRV and Spel.
  • a restriction analysis of the plasmid pPRG930 :: WI13 is carried out, using the restriction enzyme Pst1.
  • the DNA fragments obtained are separated by electrophoresis on an agarose gel.
  • An analysis is carried out according to the Southern Blot technique, as described in Example 16.
  • the fragment inserted into the plasmid pRG930 :: WT13 is formed, on the one hand, of 5 fragments and, on the other hand, of a small fragment.
  • This small fragment is approximately 2.5 kbp in size.
  • the 2.5 kbp fragment gives a hybridization signal with the synthetic oligonucleotide (SEQ JD NO: 11), the other 5 fragments give no signal.
  • the 2.5 kbp fragment is ligated with the vector pPRG930 according to the method described by SAMBROOK et al., 1989, pages 1.68-1.69.
  • the plasmid pRG930:: WI14 is obtained.
  • the 2.5 kbp fragment is inserted into the plasmid pBLUESCRIPT.
  • the plasmid pBLUESCRIPT can be obtained from the company STRATAGENE.
  • the plasmid pBLUESCRIPT :: WI14 is obtained.
  • pBLUESCRIPT WI14 is obtained by using the SEQU ⁇ HERM CYCLE SEQUENCING KIT kit (BIOZYM) and by following the technique recommended by the manufacturer.
  • the nucleotide sequence of the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 lipase is identified.
  • the amino acid sequence and the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) coding for mature lipase, as well as its translation into amino acids (SEQ ID NO: 3), is given in FIG. 1 (FIGS. 1a and 1b ).
  • Lipase is synthesized in the form of a precursor.
  • the precursor contains 308 amino acids (SEQ ID NO: 7).
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5) coding for the lipase precursor is identified, as well as its translation into amino acids (SEQ ID NO: 6).
  • the precursor contains the 286 amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the mature lipase and the 22 amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) of the presequence.
  • the mature lipase sequence is preceded by a presequence. It is an additional sequence of 22 amino acids (SEQ ID NO: 10).
  • GGCCACAGTC AGGGCTCGCC GACCTCGCGC GTGGCGGCTT CGTTGCGGCC GGATCTGGTG 360

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Abstract

L'invention concerne une lipase provenant d'une souche de Pseudomonas. Cette lipase est active dans une large gamme de pH alcalin. L'invention concerne également des nouvelles souches de micro-organismes produisant cette lipase et des procédés de préparation de cette lipase. L'invention concerne également des utilisations de celle-ci et les compositions contenant celle-ci.

Description

Lipase. microorganisme la produisant, procédé de préparation de cette l liinpaassee e ett u uttiilliissaattiinonnss d dee c ceellllee--ccii
L'invention concerne une nouvelle lipase. L'invention concerne également une nouvelle souche de microorganisme produisant cette lipase.
L'invention concerne également les procédés de préparation de cette lipase, les utilisations de celle-ci et les compositions comprenant celle-ci. II est connu d'inclure des lipases dans les compositions détergentes en vue d'éliminer les dépôts gras des tissus (Enzyme Microb. Technol. , 1993 (3), pages 634-645). Ces dépôts gras contiennent des triglycérides apportés, par exemples, par le sébum, les différents produits alimentaires (huile, sauce, beurre, matières grasses), les produits cosmétiques. Les lipases hydrolysent les triglycérides en formant des produits plus solubles dans l'eau, mono- et di-glycérides, glycérol et acides gras libres.
Des lipases utilisables dans des compositions détergentes sont connues, telles que notamment des lipases provenant de souches de Pseudomonas, par exemples la lipase produite par la souche de Pseudomonas stutzeri (demande de brevet britanique 1372034), la lipase produite par la souche de Pseudo¬ monas mendocina (demande de brevet européen 0 571 982), la lipase produite par la souche de Pseudomonas alcaligenes (brevet US 5,063,160), et la lipase produite par la souche de Pseudomonas pseudoalcaligenes (demande de brevet européen 0 218 272). Cependant, malgré les propriétés de ces lipases, les compositions détergentes contenant ces enzymes sembleraient peu efficaces.
En conséquence, il y a actuellement un besoin pour une lipase utilisable dans le domaine de la détergence, très stable et également très active dans une large gamme de pH et de température. De plus, il y a également un besoin pour une lipase particulièrement efficace sur les taches grasses, et cela à faible dose d'enzyme. De plus, il y a également un besoin pour une lipase particulièrement efficace sur les taches grasses dès les premiers cycles de lavage.
La présente invention a pour but de fournir une nouvelle lipase, active dans une large gamme de température, active dans une large gamme de pH alcalin, et efficace dès le premier cycle de lavage. La présente invention a également pour but d'identifier, isoler et fournir une souche, en particulier une souche de Pseudomonas, qui produit naturel¬ lement ladite lipase.
La présente invention a également pour but de préparer et fournir une composition contenant cette lipase, et en particulier une composition déter¬ gente.
A cet effet, la présente invention concerne une lipase, isolée et purifiée, provenant d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. La présente invention concerne également une lipase, isolée et purifiée, provenant d'un dérivé ou d'un mutant d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis capable de produire cette lipase. De préférence la lipase de l'invention provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire cette lipase. La lipase de l'invention est dérivée de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. La lipase est classifiée dans le système international sous le numéro E.C. 3.1.1.3.; il s'agit d'une glycérol ester hydrolase.
De préférence, la lipase, isolée et purifiée, a un poids moléculaire d'environ 30 kDa. Elle est essentiellement extracellulaire.
La séquence N-terminale d'acides aminés (SEQ ID NO: l) de la lipase de l'invention est la suivante :
Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr Gly
1 5 10 15
Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu 20 L'invention concerne une lipase qui provient d'une bactérie aérobie capable de produire la lipase dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux sous condition d'aéro- biose.
L'invention concerne une lipase, isolée et purifiée, comprenant la séquence d'acides aminés de 1 à 286 acides aminés (SEQ ID NO:4) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. La séquence d'acides aminés et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO:2) codant pour la lipase mature, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO: 3), est donnée à la figure 1 (figures la et lb). La lipase de l'invention est synthétisée sous forme d'un précurseur. Le précurseur contient 308 acides aminés (SEQ ID NO: 7). On identifie la séquence de nucléotides (SEQ ID NO:5) codant pour le précurseur de la lipase, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO: 6). La figure 2 (figures 2a et 2b) représente la séquence de nucléotides (SEQ ID NO: 5) de la partie codante de la lipase ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO:6).
Le précurseur contient la séquence de 286 acides aminés (SEQ ID NO: 4) de la lipase mature et la séquence de 22 acides aminés (SEQ ID NO: 10) de la préséquence.
La séquence de la lipase mature est précédée d'une préséquence. Il s'agit d'une séquence additionnelle de 22 acides aminés (SEQ ID NO: 10). On identifie la séquence de nucléotides correspondante (SEQ ID NO: 8), ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO:9). Cette préséquence code pour le peptide signal de la lipase de l'invention.
De manière préférée, ladite lipase a un point isoélectrique estimé compris entre environ 9,8 et environ 10,1. De manière particulièrement préférée, ladite lipase a un point isoélectrique estimé égal à environ 9,95. La lipase de l'invention est active dans une large gamme de tempéra¬ ture. La lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, dans une gamme de température supérieure à environ 40 °C. La lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, dans une gamme de température inférieure à environ 60 °C. Plus particulièrement, la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, dans une gamme de température comprise entre environ 40 °C et environ 60 °C. De manière particuliè¬ rement préférée, la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH d'environ 9,5, à une température d'environ 55 °C.
La lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique de plus de 50 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de température comprise entre environ 40 °C et environ 60 °C pour un pH d'environ 9,5, l'activité enzymatique maximale étant mesurée à une température de 55 °C et à un pH de 9,5.
La lipase de l'invention est active dans une large gamme de pH alcalin. Habituellement, la lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 °C, - 4 -
dans une gamme de pH supérieur ou égal à environ 8. Habituellement, la lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 °C, dans une gamme de pH inférieur ou égal à environ 10. Plus particulièrement, la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 °C, dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 10. De manière particulièrement préférée, la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 °C, dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 9,5.
La lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique de plus de 85 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 10 pour une température d'environ 30 °C, l'activité enzymatique maximale étant mesurée à une température de 30 °C et à un pH de 9,5.
La lipase de l'invention est thermostable à un pH alcalin. En effet, la lipase, isolée et purifiée, de l'invention montre une activité enzymatique relative d'au moins 55 % mesurée après une incubation de 160 minutes à une température de 55 °C et à un pH de 10 dans une solution tamponnée de dureté 15. Elle montre une activité enzymatique relative d'au moins 70 % mesurée après une incubation de 80 minutes sous ces mêmes conditions.
Par activité enzymatique relative, on entend le rapport entre l'activité enzymatique, mesurée au cours d'un essai réalisé dans des conditions données de pH, température, substrat et durée, et l'activité enzymatique maximale mesurée au cours de ce même essai, l'activité enzymatique étant mesurée à partir de l'hydrolyse de la trioléine et l'activité enzymatique maximale étant fixée arbitrairement à la valeur de 100.
L'invention concerne également une lipase modifiée, c'est-à-dire une enzyme dont la séquence en acides aminés diffère d^ celle de l'enzyme sauvage par au moins un acide aminé. Ces modifications peuvent être obtenues par des techniques classiques de mutagenèse sur l'ADN, telles que l'exposition à des rayonnements ultra-violets, à des produits chimiques, tels que l'éthyl méthane sulfonate (EMS), le N-méthyl-N-nitro-N-nitrosoguani- dine (MNNG), le nitrite de sodium ou l'O-méthylhydroxy lamine ou par des techniques de génie génétique, comme, par exemple, la mutagenèse dirigée ou la mutagenèse aléatoire. Ces techniques sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans MOLECULAR CLONING - a laboratory manual - SAMBROOK, FRITSCH, MANIAΗS - second édition, 1989, chapitre 15. L'invention concerne également une lipase mutée obtenue par modifi¬ cation de la séquence de nucléotides du gène qui code pour la lipase. Les techniques d'obtention de telles lipases mutées sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans MOLECULAR CLONING - a laboratory manual - SAMBROOK, FRITSCH, MANIAΗS - second édition, 1989, chapitre 15.
L'invention concerne également une lipase ayant des propriétés immunochimiques identiques ou partiellement identiques à la lipase obtenue à partir de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. Les propriétés immunochimiques peuvent être déterminées de façon immunologique par des tests d'identité, notamment en utilisant des anticorps spécifiques, polyclonaux ou monoclonaux. Des tests d'identité sont connus de l'homme du métier, tels que notamment la méthode d'immunodiffusion d'Ouchterlony, ou la méthode d'immunoélectrophorèse. Des exemples de telles méthodes sont décrits par Axelsen N.H. , Handbook of Immunoprecipitation Gel Techniques, Blackwell Scientific Publications, 1983, chapitres 5 et 14, les termes "identité antigénique" et "identité antigénique partielle" sont décrits dans ce document aux chapitres 5, 19 et 20. Un sérum contenant l'anticorps spécifique est préparé selon la méthode décrite en immunisant des animaux (par exemples souris, lapin ou chèvre) avec une préparation de lipase purifiée. Cette préparation peut être mélangée avec un additif, tel que l'adjuvant de Freund, et le mélange obtenu est injecté à des animaux. L'anticorps polyclonal est obtenu après une ou plusieurs immunisations. Un exemple consiste à injecter, de façon sous cutanée à deux semaines d'intervalle, quatre fractions contenant chacune 150 microgrammes de lipase purifiée, l'immunisation dure alors 8 semaines. Le sérum est prélevé après la période d'immunisation et l'immunoglobuline peut être isolée selon la méthode décrite par Axelsen N.H. (1983).
La présente invention concerne également l'isolement, l'identification et la fourniture d'une nouvelle bactérie produisant la lipase. Cette bactérie aérobie a été isolée et purifiée. Généralement elle appartient à la famille des 6 -
Pseudomonadaceae. De préférence elle appartient au genre Pseudomonas. De manière particulièrement préférée, il s'agit d'une souche de Pseudo¬ monas wisconsinensis. De bons résultats ont été obtenus avec la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou un dérivé ou mutant de cette souche.
Par dérivé de cette souche, on entend toute bactérie modifiée naturel¬ lement, c'est-à-dire par sélection naturelle. Par mutant de cette souche, on entend toute bactérie modifiée artificiellement. Les mutants de cette souche peuvent être obtenus par les techniques connues de modification, telles que rayonnement ultra-violet, rayons X, agents mutagènes ou génie génétique. Ces techniques sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans SAMBROOK et al., 1989, chapitre 15. Des exemples d'agents mutagènes sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 365-368. La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS (LMG culture collection, Université de Gand, Laboratoire de Microbiologie - K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gand, Belgique) conformément au Traité de Budapest sous le numéro LMG P-15151 le 12 octobre 1994. L'invention concerne une culture isolée et purifiée de la souche de Pseudomonas wisconsinensis et une culture dérivée ou mutée de celle-ci. Plus particulièrement, l'invention concerne une culture isolée et purifiée de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 et une culture dérivée ou mutée de celle-ci. La souche de la présente invention a été identifiée par ses caractéris¬ tiques biochimiques. Il s'agit d'une bactérie Gram négatif, aérobie. Elle ne se développe pas en anaérobiose. Aucune spore n'est formée. Le test de l'oxydase est positif en présence de 1 % (p/v) de tétraméthyl-l ,4-phény- lène-diammoniumdichlorure. Cette bactérie n'est pas thermophile. Elle ne produit pas de gaz à partir de glucose.
L'invention concerne également l'isolement et la fourniture d'une molécule d'ADN comprenant la séquence de nucléotides (SEQ ID NO: 2) qui code pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. Par séquence modifiée dérivée de la molécule d'ADN, on entend toute molécule d'ADN obtenue par modification d'un ou de plusieurs nucléotides - 7 -
du gène qui code pour la lipase de l'invention. Les techniques d'obtention de telles séquences sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans MOLECULAR CLONING - a laboratory manual - SAMBROOK, FRITSCH, MANIAΗS - second édition, 1989, chapitre 15. Habituellement, la séquence modifiée dérivée de la molécule d'ADN comprend au moins 70 % d'homologie avec la séquence de nucléotides (SEQ ID NO:2) du gène qui code pour la lipase de l'invention, c'est-à-dire au moins 70 % de nucléotides identiques et ayant la même position dans la séquence. De préférence, la séquence modifiée dérivée de la molécule d'ADN comprend au moins 80 % d'homologie avec la séquence de nucléotides (SEQ ID NO:2) du gène qui code pour la lipase de l'invention. De manière particulièrement préférée, la séquence modifiée dérivée de la molécule d'ADN comprend au moins 90 % d'homologie avec la séquence de nucléotides (SEQ ID NO: 2) du gène qui code pour la lipase de l'invention.
Habituellement, la molécule d'ADN, selon l'invention, comprend au moins la séquence de nucléotides (SEQ ID NO: 5) qui code pour le précurseur de la lipase ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. Cette séquence de nucléotides (SEQ ID NO:5) comprend la séquence de nucléotides (SEQ ID NO:2) codant pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 et sa séquence signal (préséquence) (SEQ ID NO: 8). De préférence, cette molécule d'ADN comprend tout le gène de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1.
La présente invention concerne également un procédé pour la production d'une lipase. Ce procédé comprend la culture d'une bactérie aérobie capable de produire la lipase dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux sous condition d'aérobiose et la récolte de la lipase ainsi obtenue. Ce milieu de culture peut être solide ou liquide. De préférence le milieu de culture est liquide. Habituellement, la bactérie aérobie est une souche de Pseudomonas ou un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire la lipase. Plus particulièrement, la bactérie aérobie est une souche de Pseudomonas wiscon¬ sinensis ou un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire la lipase. De préférence, la bactérie aérobie est une souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire la lipase. Les conditions de culture de ces bactéries, qui permettent d'obtenir la lipase de l'invention, telles que composants du milieu nutritif, paramètres de culture, température, pH, aération, agitation, sont bien connues de l'homme du métier. Des exemples de conditions de culture sont notamment décrits dans la demande de brevet européen 0 571 982.
Les techniques de récolte de la lipase sont bien connues de l'homme du métier et sont choisies selon les utilisations envisagées de la lipase. Habi¬ tuellement, on emploie la centrifugation, la filtration, l 'ultrafiltration, l'évaporation, la microfiltration, la cristallisation ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques telle qu'une centrifugation suivie d'une ultrafiltration. Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
La lipase peut ensuite être purifiée, si nécessaire et selon les utilisations envisagées. Les techniques de purification d'enzymes sont bien connues de l'homme du métier, telles que la précipitation à l'aide d'un sel, tel que le sulfate d'ammonium, ou de solvant, tel que l'acétone ou un alcool. Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276. La lipase peut également être séchée par atomisation ou lyophilisation. Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276. La présente invention concerne également des compositions enzymatiques comprenant la lipase selon l'invention et au moins un additif. Selon les utilisations envisagées, les compositions enzymatiques comprenant la lipase de la présente invention peuvent être sous forme solide ou liquide.
Les additifs, compris dans la composition selon l'invention, sont connus de l'homme du métier et sont choisis selon l'utilisation envisagée de la composition. Ils doivent être compatibles avec la lipase et ne pas affecter l'activité enzymatique de la lipase. Habituellement, ces additifs sont des stabilisants de l'enzyme, des agents de conservation et des agents de formu¬ lation. Des exemples d'additifs sont notamment décrits dans la demande de brevet européen 0 218 272. Comme exemples d'additifs, on peut citer l'éthylène gly col, le glycérol, le 1,2-propanediol, l'amidon, un sucre tel que glucose et sorbitol, un sel tel que chlorure de sodium, chlorure de calcium, sorbate de potassium et benzoate de sodium ou un mélange de deux ou plusieurs de ces produits. De bons résultats ont été obtenus avec le 1 ,2-propanediol. De bons résultats ont également été obtenus avec le sorbitol.
La lipase selon l'invention a des débouchés multiples dans diverses industries, telles que, par exemple, les industries alimentaires, les industries pharmaceutiques ou les industries chimiques.
La lipase peut notamment être utilisée en détergence. La présente invention concerne également l'utilisation de la lipase, telle que définie ci-dessus, en détergence. Un exemple d'une telle utilisation est notamment décrit dans la demande de brevet britannique 1372034 et dans la demande de brevet européen 0 218 272. Dans ce cadre, elle fait partie de compo¬ sitions de détergence. La présente invention concerne donc également les compositions de détergence contenant la lipase. Les composants des compo¬ sitions de détergence sont connus de l'homme du métier et sont adaptés selon l'utilisation envisagée de la composition. De tels composants sont notamment des enzymes, telles que par exemple des protéases, amylases et/ou cellulases; des agents de charge, tels que du tripolyphosphate de sodium; des agents de blanchiment, tels que du perborate; des additifs de formulation; des tensioactifs. Les compositions de détergence de l'invention peuvent être utilisées, selon leur formulation, comme poudre, granule ou liquide lessiviels pour laver le linge; comme produit détachant pour détacher ou dégraisser des objets ou détacher le linge préalablement au nettoyage; et comme poudre, granule ou liquide pour laver la vaisselle.
La lipase peut notamment être utilisée lors du traitement de vieux papiers en vue d'enlever les encres à base d'huile. Un exemple d'une telle utilisation est notamment décrit dans le résumé Chemical Abstract 113/154607.
La lipase peut notamment être utilisée lors du traitement de pâte à papier pour éviter les dépôts collants connus sous le nom de "pitch" . Un exemple d'une telle utilisation est notamment décrit dans le document Enzyme Microb. Technol., 1993 (3), pages 634-645.
La lipase peut notamment être utilisée en industrie alimentaire pour développer l'arôme de certains produits alimentaires, tels que des fromages; lors de la fabrication de margarines spéciales. Un exemple d'une telle utilisation est notamment décrit dans le document Enzyme Microb. Technol., 1993 (3), pages 634-645. La présente invention est illustrée par les exemples suivants. La figure 1 (figures la et lb) représente la séquence d'acides aminés et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO: 2) codant pour la lipase mature, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO: 3). La figure 2 (figures 2a et 2b) représente la séquence de nucléotides
(SEQ ID NO:5) de la partie codante de la lipase ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO: 6). Exemple 1
Isolement et caractérisation de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été isolée d'un échantillon de terre, prélevé aux Etats-Unis dans l'état du Wisconsin.
1 g de terre est mis en suspension dans 10 ml d'eau déminéralisée contenant 9 g/1 de NaCl. Cette suspension est diluée 10 fois avec de l'eau déminéralisée contenant 9 g/1 de NaCl.
1 ml de la suspension de terre diluée est étalée sur un milieu nutritif gélose A.
Le milieu A contient 10 g/1 de tryptone (Difco), 5 g/1 d'extrait de levure, 5 g/1 de NaCl, 20 g/1 d'agar, 2,5 g/1 de NaHCO3, 7,5 g/1 de Na2CO3, 10 g/1 d'huile d'olive, 1 g/1 d'alcool polyvinylique (25/140) et
0,01 g/1 de rhodamine B (Sigma 6626). Le milieu A se prépare comme suit.
Une émulsion d'huile d'olive est d'abord préparée comme suit. 50 ml d'eau distillée est chauffée à 80 °C. On ajoute 1 g d'alcool polyvinylique par petites fractions à cette eau chauffée. Puis, on ajoute 10 g d'huile d'olive à la suspension d'alcool polyvinylique. On émulsionne ensuite au moyen d'un mélangeur Ultra-turax à 13500 tours par minute (tige 18 GM). On stérilise l' émulsion obtenue à 121 °C durant 30 minutes.
Une gélose est ensuite préparée comme suit. 10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure, 5 g de NaCl, 20 g d'agar sont ajoutés dans 850 ml d'eau distillée. La suspension de gélose obtenue est stérilisée à 121 °C durant 30 minutes.
1 1 de tampon carbonate (pH 9,5), contenant 25 g/1 de NaHCOβ et 75 g/1 de Na2Cθ3, est préparé, puis stérilisé à 121 °C durant 30 minutes. Puis, on prépare 1 ml d'une solution aqueuse de [0,01 % (p/v)] rhoda¬ mine B (Sigma 6626). Cette solution est stérilisée par fύtration sur une - 11
membrane de stérilisation (MILLIPORE) de 0,45 μ.
L'émulsion d'huile d'olive stérilisée et la gélose stérilisée sont refroidies à 60 °C, puis mélangées stérilement. Ensuite, on y ajoute la solution stérilisée de rhodamine. Puis, on ajoute 100 ml de tampon -carbo- nate stérilisé de façon à obtenir un pH de 9,5. On émulsionne, ensuite, la suspension, ainsi obtenue, au moyen d'un mélangeur Ultra-turax à 13500 tours par minute (tige 18 GM).
Le milieu A sur lequel la suspension de terre a été étalée, est incubé 48 heures à 30 °C. Les microorganismes produisant une lipase sont détectés à l'aide d'une lumière ultra-violette, ils sont entourés d'un halo fluorescent. Les microorganismes détectés comme produisant une ϋpase, sont mis en culture sur un milieu nutritif gélose B.
Le milieu B contient 10 g/1 de tryptone (Difco), 5 g/1 d'extrait de levure, 5 g/1 de NaCl, 20 g/1 d'agar, 2,5 g/1 de NaHCO3, 7,5 g/1 de Na2CO3. Tryptone, extrait de levure, NaCl, agar, qui composent le milieu B, sont mélangés avec 900 ml d'eau distillée, ensuite stérilisés à 121 °C durant 30 minutes. Le pH est ajusté à 9,5 par l'addition de 100 ml de tampon carbonate prélablement stérilisé (contenant 25 g/1 de NaHCO3 et 75 g/1 de Na2CO3). Le microorganisme a été identifiée par ses caractéristiques biochi¬ miques : bactérie Gram négatif, aérobie. Aucune spore n'est formée.
La taille des cellules végétatives est de 0,5-0,7 μm x 1,5-4,0 μm. La mobilité des cellules végétatives est positive. Le test de la lyse par 3 % (p/v) de KOH est positif. Le test de la catalase est positif en présence de 10 % (v/v) de peroxyde d'hydrogène. Le test de l'oxydase est positif en présence de 1 % (p/v) de tétraméthyl-l,4-phénylène-diammoniumdichlorure. Le test de l'uréase est négatif. Le test de la réduction du nitrate est positif. Des tests comparables ont notamment été décrits dans la demande de brevet européen 0 218 272. Cette souche est aérobie, c'est-à-dire qu'elle se développe en aérobiose.
Elle ne se développe pas en anaérobiose, c'est-à-dire sous une atmosphère de 84 % (v/v) N2, 8 % (v/v) CO2, 8 % (v/v) H2 à 37 °C.
L'abréviation % (v/v) représente un pourcentage exprimé en volume par volume. L'abréviation % (v/p) représente un pourcentage exprimé en volume par poids. L'abréviation % (p/v) représente un pourcentage exprimé en poids par volume. L'abréviation % (p/p) représente un pourcen- tage exprimé en poids par poids.
Cette souche n'est pas thermophile. Elle présente un développement normal après incubation sur le milieu B gélose à 20 °C, 30 °C, 37 °C et 41 °C. La souche ne produit pas de gaz à partir de glucose.
La souche utilise azelate, caprate, citrate, glucose, gluconate, L-argi- nine, L-histidine, bétaine et geraniol. La souche n'utilise pas adipate, phenylacétate, L-arabinose et maltose. Elle n'hydrolyse pas la gélatine, l'amidon et l'esculine. La souche appartient au genre Pseudomonas et au groupe RNA-I.
Les caractéristiques biochimiques différencient nettement la souche de Pseudomonas wisconsinensis, et notamment la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, d'une souche de Pseudomonas mendocina, d'une souche de Pseudomonas pseudoalcaligenes, d'une souche de Pseudomonas alcaligenes et d'une souche de Pseudomonas stutzeri. Ceci apparait clairement à la lecture du tableau 1 rassemblant les caractéristiques biochi¬ miques principales de ces 5 souches.
Tableau 1
Caractéristiques Pseudomonas
wisconsinensis stutzeri mendo¬ alcali- pseudoalca- T 92.677/1 cina genes ligenes
Taille μm x 0,5-0,7 0,7-0,8 0,7-0,8 0,5 0,7-0,8 μm 1,5-4,0 1,4-2,8 1,4-2,8 2,0-3,0 1 ,2-2,5
Pigment jaune + - + d -
hydrolyse - - -
+ l'amidon '
Arginine - - + 4- d déhydrolase
Utilisation de + + + - - Glucose
Utilisation de + d + - d Gluconate
Utilisation de + - + - - Géraniol
Utilisation de + - + d d L-histidine
Utilisation de + - + + + L-arginine
Utilisation de + - -1- ~ + Bétaine
+ = test positif pour 90 % ou plus des souches
- = test négatif pour 90 % ou plus des souches d = test positif pour plus de 10 %, mais moins de 90 % des souches /12012 -.-„„-.
PCT/BE95/00094
- 14
La bactérie isolée appartient donc au genre Pseudomonas, aucune espèce connue n'a pu être déterminée.
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICRORGANISMS (LMG culture collection) sous le numéro
LMG P-15151 le 12 octobre 1994.
Exemple 2
Production de la lipase par la souche de Pseudomonas wisconsinensis
T 92.677/1 La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est mise en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu B gélose à 30 °C durant 24 heures.
Puis, à partir de cette culture on réalise une culture dans 25 ml d'un milieu liquide C. Le milieu C contient 10 g/1 de tryptone (Difco), 5 g/1 d'extrait de levure, 10 g/1 de NaCl, le pH du milieu est ajusté à 7,0 avec
NaOH 0, 1N, le milieu est stérilisé à 121 °C durant 30 minutes. La culture est réalisée à 30 °C sous agitation orbitale à raison de 200 révolutions par minute avec une amplitude d'environ 2,54 cm.
Après 16 heures d'incubation, on introduit cette culture dans un fermenteur de 20 litres contenant 13 litres du milieu liquide D stérilisé.
Le milieu D contient K2HPO4 2,5 g/1, KH2PO4 2,5 g/1, MgSO4.7H20
1 g/1, (NH4)2SO4 2 g/1, (NH2)2CO 2 g/1, CaCl2 1 g/1, farine de soja
20 g/1, extrait de levure 2 g/1, glucose 20 g/1, antimousse Mazuôl (Mazes
Chemicals) 5 g/1. Le pH est ajusté à 7,4 (par de l'acide phosphorique normal et de la soude caustique normale) avant et après stérilisation dans le fermenteur (30 minutes à 121 °C). Le glucose est stérilisé, à part, à pH 4,0
(pH ajusté avec de l'acide phosphorique normal) durant 30 minutes à
121 °C. Le milieu est stérilisé dans le fermenteur 30 minutes à 121 °C. La culture dans le fermenteur est réalisée à une température de 23 °C, sous une pression de 0, 15.105 Pa (Pa = Pascal)(0,15 bar), avec une aération de 0,3 VVM (volume d'air par volume de milieu de culture par minute), avec une agitation axiale de 200 tours par minutes, la régulation d'oxygène dissous étant fixée à 10 % (v/v) par régulation de la vitesse d'agitation. Après 24 heures de fermentation, on mesure l'activité enzymatique de la culture, ainsi obtenue, par la technique suivante. - 15
L'hydrolyse de la trioléine est quantifiée par la neutralisation des acides gras libérés sous l'action de la lipase. Cette mesure est effectuée à l'aide d'un appareil de titrage automatique, appareil qui maintient le pH constant à une valeur de consigne par l'addition de NaOH 0,01 N. Une unité lipase (LU) est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse la libération d'une micromole d'acide gras par minute dans les conditions standards de l'essai décrit ci-après.
On mélange 10 g de Trioléine (Roth 5423.1) et 10 g de gomme ara¬ bique (Fluka 51200) oans 100 ml d'eau distillée. On émulsionne ce mélange à l'aide d'un mélangeur Ultra-Turrax à 13500 tours par minutes (agitation axiale) durant 3 fois 5 minutes, en maintenant le mélange sous azote et dans un bain de glace.
On prépare un tampon de dilution contenant 2,34 g/1 de NaCl, 2,94 g/1 de CaCl2.2H20 et 0,61 g/1 de Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propane- diol).
On utilise un appareil de titrage automatique, muni d'une burette contenant du NaOH 0,01N, d'une sonde de température et d'une sonde de pH et équipé d'un réacteur thermostatisé.
Dans le réacteur thermostatisé à 30 °C, on introduit un barreau magné- tique d'agitation, 10 ml d'émulsion de trioléine et 20 ml de tampon de dilution. Le pH de la solution, ainsi obtenue, est ajusté à 9,5 avec NaOH 0,1N. Puis, on introduit 0,5 ml de l'échantillon à tester contenant la lipase, l'échantillon est éventuellement dilué de telle sorte qu'il ne contienne qu'un maximum de 5 LU. On contrôle le pH pendant les deux premières minutes avec NaOH 0,01N. Puis, on enregistre la consommation de soude entre 2 et 4 minutes, tout en maintenant le pH constant (volume de soude consommé entre 2 et 4 minutes = VI en μl).
Ensuite, on réalise le même essai en remplaçant l'échantillon contenant la lipase par 0,5 ml de tampon de dilution (volume de soude consommé entre 2 et 4 minutes = V2 en μl).
On détermine une unité lipase (LU) comme suit : 1 LU/ml = (V1-V2) x dilution éventuelle de l'échantillon x 10 Par cette méthode, une activité lipase est détectée dans la culture. Exemple 3 Préparation d'une solution concentrée de lipase
On ajuste le pH de la culture, telle qu'obtenue en fin de fermentation à - 16
l'exemple 2, à un pH de 8 avec de la soude caustique concentrée 10 N. Puis, on ajoute à cette culture 1 % (v/v) de Triton X-114 (SERVA 37214). Le mélange est agité doucement pendant 2 heures à 15 °C.
Ensuite, on ajoute au mélange 1 % (v/v) d'Optifloc FC205 (SOLVAY) sous la forme d'une solution à 10 % (v/v). Le mélange est agité doucement pendant 1 heure à 15 °C.
On centrifuge le mélange 15 minutes à 9000 tours par minutes (Beckman J21, rotor JA10) à une température de 4 "C. On conserve le surnageant de centrifugation. On chauffe le surnageant de centrifugation à 40 °C pendant 5 minutes.
On observe une séparation de phases. On élimine la phase supérieure. On ajoute à la phase inférieure 35 % (v/v) d'acétone à 4 °C. On incube la suspension 15 minutes à 4 °C sous agitation modérée.
Puis, on centrifuge la suspension 15 minutes à 9000 tours par minutes (BECKMAN J21, rotor JA10) à une température de 4 °C. On conserve le surnageant de centrifugation.
On ajoute de l'acétone au surnageant de centrifugation à 4 °C jusqu'à l'obtention d'une concentration en acétone de 65 % (v/v). On incube le mélange 16 heures à 4 °C. Ensuite, on centrifuge le mélange 15 minutes à 9000 tours par minutes
(Beckman J21, rotor JA10) à une température de 4 °C. On conserve le précipité de centrifugation, que l'on met en suspension dans 150 ml d'un tampon (pH 7) contenant 5 mM de Brij 58 (ICI), 25 mM CaCl2 et 20 mM Tris. Puis, on centrifuge la suspension, contenant le précipité, 15 minutes à
9000 tours par minutes (Beckman J21, rotor JA10) à une température de 4 °C. On conserve le surnageant de centrifugation, qui forme une solution concentrée de lipase. Exemple 4 Purification de la lipase
Pour purifier la solution concentrée de lipase, telle qu'obtenue à l'exemple 3, on utilise la techmque de purification mettant en oeuvre une chromatographie d'interaction hydrophobe, suivie de la technique de purifi¬ cation mettant en oeuvre une chromatographie de tamisage moléculaire. En suivant les indications d'utilisation prescrites par le fournisseur
(Pharmacia) au sujet de la colonne de chromatographie d'interaction hydro- - 17
phobe, on charge une colonne Pharmacia Hiload 16/10 Phenyl-Sepharose (réf 17-1085-01) avec 140 ml de la solution concentrée de lipase, telle qu'obtenue à l'exemple 3.
On utilise, comme tampon d'équilibre, un tampon phosphate 20 mM à pH 7,2; comme tampon d'élution, un tampon phosphate 20 mM à pH 7,2 contenant 30 % (v/v) d'isopropanol. Le débit est fixé à 1,5 ml par minute. On récupère la lipase avec la fraction éluée avec le tampon phosphate contenant l'isopropanol.
On mesure l'activité enzymatique de la fraction selon la méthode décrite à l'exemple 2.
On diafiltre la fraction éluée, contenant la lipase, dans une cellule Amicon, munie d'une membrane YM10, avec 10 volumes d'un tampon (pH 7) contenant 25 mM CaCl2 et 20 mM Tris.
Puis, on concentre la fraction diafiltrée jusqu'à 0,5 ml par ultrafiltration à l'aide de la même cellule Amicon, munie d'une membrane YM10.
Ensuite, on injecte la fraction concentrée (0,5 ml) sur une colonne de chromatographie de tamisage moléculaire (colonne Superdex 75 HR 10/30
Pharmacia référence 17-1047-01). La séparation est initiée par un débit de
0,5 ml par minute d'un tampon (pH 7) contenant 25 mM CaCl et 20 mM Tris.
Trois pics d'absorption à 280 nm sont séparés. La lipase correspond au premier pic d'absoφtion à 280 nm. On conserve la fraction correspondante qui contient la lipase purifiée. Exemple 5 Détermination de la séquence N-terminaie
On utilise la méthode décrite par Vandekerkhove J. et al., Eur. J. Biochemistry, 152, 9 (1985), pour déterminer la séquence N-terminale de la lipase.
On met en oeuvre la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4.
La séquence N-terminale (SEQ ID NO:l) est la suivante : Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr Gly
1 5 10 15
Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu 20
Cette séquence diffère des séquences N-terminales des autres lipases 18 -
sécrétées par des autres souches de Pseudomonas, séquences notamment publiées dans Enzyme Microb. Technol. , 1993 (3), pages 634-645. Exemple 6
Séquence d'acides aminés La séquence d'acides aminés de la lipase de la présente invention est indirectement déterminée à partir de la séquence de nucléotides (SEQ ID NO:5) du gène qui code pour cette lipase, dont l'obtention est décrite à l'exemple 17. Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release #5.4) d 'IntelliGenetics, Inc. USA.
La figure 2 (figures 2a et 2b) représente la séquence de nucléotides (SEQ ID NO: 5) de la partie codante de la lipase ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO: 6).
La lipase est synthétisée sous forme d'un précurseur. Le précurseur de la lipase contient 308 acides aminés (SEQ ID NO: 7). On identifie la séquence de nucléotides (SEQ ID NO: 5) codant pour le précurseur de la lipase ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO: 6).
On identifie la préséquence de la lipase synthétisée sous forme d'un précurseur. Il s'agit d'une séquence de 22 acides aminés (SEQ ID NO: 10) qui constitue le peptide signal. On identifie la séquence de nucléotides correspondante (SEQ ID NO: 8).
Ensuite, on identifie la séquence en acides aminés de la lipase mature. La lipase mature contient 286 acides aminés (SEQ ID NO: 4).
La figure 1 (figure la et figure lb) représente la séquence de nucléotides (SEQ ID NO: 2) codant pour la lipase mature ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO: 3). Exemple 7 Distribution en acides aminés
La distribution en acides aminés de la lipase mature, déterminée à partir de la séquence en acides aminés (SEQ ID NO: ) de la lipase (exemple 6), est résumée dans le tableau 2. ΓABLEAU 2
Symbole Acides aminés Nombre % mole (en poids moléculaire)
A alanine 28 9,790
B acide aspartique 0 0
C cystéine 2 0,699
D acide aspartique 10 3,497
E acide glutamique 7 2,448
F phénylalanine 7 2,448
G glycine 35 12,238
H histidine 10 3,497
I isoleucine 14 4,895
K lysine 9 3 147
L leucine 22 7i 692
M méthionine 1 0,350
N asparagine 25 8,741
P proline 11 3,846
Q glutamine 6 2,098
R arginine 13 4,545
S serine 24 8,392
T thréonine 18 6,294
V valine 29 10,140 w tryptophane 5 1,748
X inconnu 0 0
Y tyrosine 10 3,497 z glutamine 0 0 acide glutamique
Exemple 8
Estimation c u poids moléculaire
On estime, par calcul, le poids moléculaire de la lipase à partir de la séquence en acides aminés de la forme mature de la lipase et à partir de la séquence en acides aminés de la lipase y compris le peptide signal, comme décrit à l'exemple 6.
On déduit par calcul un poids moléculaire de 30093 Daltons pour la forme mature et un poids moléculaire de 32365 Daltons pour la forme comprenant le peptide signal. Exemple 9 Détermination du poids moléculaire de la lipase par analyse SDS-PAGE
On effectue sur la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4, une electrophorese en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). Le système de gel utilisé est le système PHASTSYSTEM de PHARMACIA LKB BIOTECHNOLOGY (dossier d' utilisation N° 110), avec des gels contenant un gradient de polyacrylamide de 10-15 % (v/v). Les conditions d'électrophorèse sont celles prescrites par le fournisseur. On utilise comme témoin les marqueurs de poids moléculaire PHARMACIA LM (Low Molecular Weight), référence 17-0446-01. Les marqueurs mis en oeuvre sont la phosphorylase b (94 kD), l'albumine (67 kD), l'ovalbumine (43 kD), la carboanhydrase (30 kD), l'inhibiteur de la trypsine (20,1 kD) et l'alpha-lactalbumine (14,4 kD).
Le gel, ainsi obtenu, montre que la fraction, contenant la lipase puri¬ fiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4, est pure. Une coloration au bleu de Coomassie (Fast Coomassie staining,
Pharmacia, dossier d'utilisation n° 200) du gel fait apparaître un polypep- tide d'un poids moléculaire d'environ 30 (+/- 0,5) kD. Exemple 10
Estimation du point isoélectrique On estime le point isoélectrique de la lipase à partir de la séquence en acides aminés de la forme mature de la lipase et à partir de la séquence en acides aminés de la lipase y compris le peptide signal, comme décrit à l'exemple 6.
On déduit un point isoélectrique de 9,95 pour la forme mature et de 10,12 pour la forme comprenant le peptide signal. Exemple 11 Détermination de l'optimum de pH de la lipase
On mesure l'activité enzymatique de la lipase à différents pH selon la méthode décrite à l'exemple 2. On détermine donc l'hydrolyse du substrat (émulsion de trioléine) suite à l'action de la lipase à différents pH, toutes les autres conditions étant identiques aux conditions standards, telles que décrites à l'exemple 2, c'est-à-dire à une température de 30 °C et une durée de deux minutes.
On utilise la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 3. Tableau 3
Température Activité relative °C %
18 19 24 26
30 41 34 45
40 56 45 52
49 91 55 100
60 54 76 43
Au cours de l'essai l'activité enzymatique maximale a été mesurée pour l'échantillon placé à un pH d'environ 9,5 et à une température d'environ 55 °C. Par définition, on a donc attribué à cet échantillon une activité enzymatique relative de 100 %. Cet exemple montre que la lipase de l'invention présente une activité enzymatique optimale mesurée à un pH de 9,5 dans une gamme de température comprise entre environ 40 et environ 60 °C.
Cet exemple montre également que la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, à une température d'environ 55 °C.
La lipase de l'invention développe une activité enzymatique de plus de 50 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de température comprise entre environ 40 et 60 °C pour un pH d'environ 9,5. Exemple 12 Détermination de l'optimum de pH de la lipase
On mesure l'activité enzymatique de la lipase à différents pH selon la méthode décrite à l'exemple 2.
On détermine donc l'hydrolyse du substrat (émulsion de trioléine) suite à l'action de la lipase à différents pH, toutes les autres conditions étant identiques aux conditions standards, telles que décrites à l'exemple 2, c'est-à-dire à une température de 30 °C et une durée de deux minutes.
On utilise la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 4.
Tableau 4
1 PH Activité relative
%
7,0 17
8,0 100
9,0 100
9,5 100
10,0 91
10,5 71
11 ,0 72
12,0 47
Cet exemple montre que la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 °C, dans une gamme de pH compris entre environ 8 et 10.
Au cours de l'essai l'activité enzymatique maximale a été mesurée pour l'échantillon placé à un pH d'environ 9,5 et à une température d'environ 30 °C. Par définition, on a donc attribué à cet échantillon une activité enzymatique relative de 100 % . La lipase de l'invention développe une activité enzymatique de plus d'environ 90 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 10 pour une température d'environ 30 °C.
La lipase de l'invention développe une activité enzymatique de plus d'environ 70 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 11 pour une température d'environ 30 °C. Exemple 13
Stabilité de la lipase vis-à-vis de la température On incube la partie de la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4, à pH 10 et à 55 °C dans un tampon aqueux de dureté 15 (tampon contenant du chlorure de calcium 1 ,98 mM, du chlorure de magnésium 0,69 mM et du bicarbonate de sodium 2,5 mM).
A intervalles réguliers, tels que précisés dans le tableau 4 (temps d'incubation en minutes), on prélevé un échantillon dont on mesure l'acti¬ vité enzymatique selon la méthode décrite à l'exemple 2. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 5.
Tableau 5
Temps d'incubation Activité relative minutes %
0 100
10 84
20 81
30 79
40 93
50 86
60 80
80 72
100 59
120 59
130 60
140 61
160 61
260 39
1140 25
La constante de désactivation (k) sur l'intervalle 0-260 minutes est de 0.000333 min-1. [On obtient la constante de désactivation k selon la défi¬ nition In (A-J A ) = -k.t, t étant le temps d'incubation, AQ l'activité relative au temps d'incubation 0 et Aj l'activité relative au temps d'incubation t.] Au cours de cet essai l'activité enzymatique maximale a été mesurée pour l'échantillon au temps 0. Par définition on a donc attribué à cet échantillon une activité enzymatique relative de 100 % .
De cet exemple on conclut que la lipase de l'invention montre une activité enzymatique relative d'au moins 55 % mesurée après une incubation de 160 minutes à une température de 55 °C et à un pH de 10 dans une solution tamponnée de dureté 15. Elle montre une activité enzymatique relative d'au moins 70 % mesurée après une incubation de 80 minutes sous ces mêmes conditions. Exemple 14
Utilisation d'une composition détergente contenant la lipase
On prépare un morceau de tissu blanc (R. Hoppe Gmbh) à base de coton (65 %) et de polyester (35 %) de 10 cm sur 10 cm, imprégné de graisse de lard et de rouge Soudan. L'imprégnation du tissu est réalisée comme suit.
On prépare une solution homogène de rouge Soudan 7B (SIGMA cat. N° F 1000) et de graisse de lard (Laru Gmbh) en ajoutant 0,1 % (p/p) de rouge Soudan à la graisse de lard. Le mélange est chauffé à 90 °C jusqu'à complète dissolution du rouge Soudan. Un rouleau de tissu est plongé dans la solution de rouge Soudan et de graisse de lard maintenue à 90 °C et déplacé en continu dans cette solution à la vitesse de 0,5 m/minute. Ensuite, le tissu est essoré sous une pression linéaire constante entre deux rouleaux. Le tissu ainsi imprégné contient 31,5 % (p/p) de matières grasses. Le tissu imprégné est placé à -18 °C durant 22 heures jusqu'à complète cristalli¬ sation de la matière grasse. Le tissu est découpé en morceaux de 10 cm sur 10 cm. Ensuite, les morceaux de tissu imprégné sont stockés à - 18 °C dans le noir.
On prépare une composition détergente liquide contenant 4 g/1 d'une poudre compacte lessivielle (poudre Eurocompact d'UNILEVER) et diverses concentrations de lipase équivalentes à 500, 1000 et 2000 LU/1, dans une eau de dureté 15 (eau contenant du chlorure de calcium 1 ,98 mM, du chlorure de magnésium 0,69 mM et du bicarbonate de sodium 2,5 mM). Le pH initial de la composition détergente liquide est d'environ 10. On met en oeuvre la lipase telle qu'obtenue à l'exemple 4, que l'on dilue avec de l'eau de dureté 15 en vue d'obtenir les concentrations souhaitées.
Puis, on lave le tissu imprégné de graisse de lard et de rouge Soudan avec 200 ml de la composition détergente liquide dans un réacteur de
250 ml. Le lavage a lieu à 35 °C durant 45 minutes sous une agitation de 40 RPM (agitation va et vient de 20 secondes). Après le lavage, le tissu est rincé trois fois avec 200 ml d'eau distillée, puis séché à 22 °C entre deux papiers durant 24 heures. Ensuite, on détermine la réflectance (RL) à 460 nm du tissu séché à l'aide d'un colorimètre (Tricolor LFM 3).
On reproduit ce test trois fois, c'est-à-dire on effectue ensuite trois fois le cycle de lavage avec la composition détergente liquide contenant la lipase et le cycle de rinçage sur le même échantillon de tissu sans l'imprégner de rouge Soudan et de graisse de lard entre chaque cycle. A chaque fin de cycle, on détermine la réflectance à 460 nm du tissu séché.
Un essai strictement identique est réalisé avec une composition déter¬ gente ne contenant pas de lipase. A chaque fin de cycle, on détermine la réflectance (RO) à 460 nm du tissu séché. On définit la performance de lavage en % comme la différence entre la réflectance (RL) obtenue avec la lavage en présence de lipase et la réflec- - 25
iance (RO) obtenue avec la lavage en absence de lipase, c'est-à-dire RL - RO exprimé en % .
-Les résultats de cet exemple montrent que la lipase de l'invention est efficace à faible dose d'enzyme dans la composition détergente. Les résultats de cet exemple montrent également que la lipase de l'invention est particulièrement efficace dès le second cycle de lavage et qu'elle conserve une efficacité accrue après trois et quatre cycles de lavage. Notamment, la lipase est particulièrement efficace à la concentration de 500 LU/1 après trois cycles de lavage. De plus, la lipase se montre tout particulièrement efficace à la concen¬ tration de 1000 LU/1 dès le premier cycle de lavage. La lipase se montre tout particulièrement efficace à la concentration de 1000 LU/1 durant tous les cycles de lavage. Exemple 15 Clonage du gène de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 1. Extraction de l'APN chromosomique à partir de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
L'ADN génomique est préparé en suivant la technique décrite par WILSON, 1990, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1 (Unit 2.4), avec les modifications décrites ci-après.
A partir de la culture, telle qu'obtenue à l'exemple 2, une culture de 200 ml de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est réalisée en milieu de croissance LB durant 16 heures à 37 °C. La composition du milieu de croissance LB est la suivante : TRYPTONE (DIFCO) 10 g/1, extrait de levure 5 g/1, NaCl 10 g/1.
La culture obtenue est centrifugée (centrifugeuse SORVALL RC 5C Plus, rotor SS-34) à 2000 G pendant 15 minutes. Le culot de centrifugation ainsi obtenu est repris dans une solution contenant 9,5 ml de tampon TE à un pH de 8,0; 500 μl d'une solution de SDS (sodium dodécyl sulfate) à 10 % (p/v); et 50 μl d'une solution de protéinase K (vendue par
BOEHRINGER Mannheim) à 20 mg/ml φréparée extemporanément).
Le tampon TE (pH 8,0) est constitué de 10 mM TRIS-HC1 ( TRIS-HC1 = Tris(hydroxyméthyl)aminométhane)-HCl ) et ImM EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) . La suspension ainsi obtenue, contenant le culot de centrifugation, est incubée 90 minutes à 65 °C. 26
Puis, on ajoute à cette suspension 1,8 ml d'une solution de NaCl 5 M et 15 ml d'une solution de CTAB/NaCl à 10 % (p/v) ( CTAB = bromure d'ammonium cetyltriméthyle, NaCl à 0,7 M). La suspension ainsi obtenue est incubée 20 minutes à 65 °C. Un lysat est obtenu. On effectue à partir de ce lysat une extraction avec 15 ml d'un mélange chloroforme/alcool isoamylique (3-méthyl-l-butanol) 24/1 sous les conditions et en suivant les procédures décrites dans Molecular Cloning - a laboratory manual - SAMBROOK, FRITSCH, MANIAΗS - second édition, 1989, à la page E.3, jusqu'à l'obtention d'une interface propre, comme cela y est décrit.
A la phase aqueuse récupérée, on ajoute 0,6 volumes (v/v) d'isopropanol, une suspension visqueuse est obtenue.
On précipite l'ADN contenu dans la suspension visqueuse selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, p. 9.18. L'ADN précipité est enroulé autour d'une pipette Pasteur, puis est lavé trois fois avec 70 %
(v/v) d'éthanol. L'ADN lavé est séché 5 minutes à l'air à température ambiante. L'ADN séché est mis en suspension dans 2,5 ml de tampon TE à pH 8,0.
2. Construction d'une banque génomique de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
A partir de la suspension obtenue ci-dessus, l'ADN chromosomique (15 μg) de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est clivé partiellement par l'enzyme de restriction Sau3AI. On met en oeuvre la méthode par dilution successive de l'enzyme de restriction et les conditions de restriction sont celles décrites dans SAMBROOK et al. , 1989, pages 5.28-5.32.
Le clivage est partiellement inhibé par l'addition d'iμl d'EDTA 0,5 M à pH 8,0 en présence de glace.
On détermine sur gel d'agarose les fractions, obtenues après le clivage, qui contiennent des fragments ayant une taille comprise entre 20 et 40 kpb. L'ensemble des fragments ainsi obtenus est ensuite soumis à une précipitation selon la technique décrite dans SAMBROOK et al. , 1989, p. 9.18.
Les fragments d'ADN sont ensuite ligaturés selon la méthode décrite par SAMBROOK et al. , 1989, pages 1.68-1.69, avec le plasmide pRG930 (750 ng), préalablement coupé au site BamHI comme décrit par
SAMBROOK et al. , 1989, pages 1.60-1.61. On obtient une collection de 27
plasmides que l'on dénomme pRG930::WI.
Le procédé d'obtention du plasmide pRG930 est décrit dans Molecular Plant-Microbe Interactions, 1992, vol. 5 (3), pages 228-234.
La ligation ainsi obtenue est utilisée pour transfecter des cellules de E. coli HB101 (PROMEGA) en utilisant le kit vendu sous le nom de
GIGAPACK π PACKAGING EXTRACT KIT (STRATAGENE) et en suivant les recommandations d'utilisation du fabricant.
Les cellules transfectées d'E. coli HB101 sont mises en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélose, 25 μg/ml de streptomycine et 50 μg/ml de spectinomycine, durant environ 24 heures à 37 °C. On obtient ainsi une collection de souches transfectées que l'on dénomme E. coli HB101 (pRG930: :WI).
A partir de 12 colonies d'E. coli HB101 (pRG930::WI) choisies au hasard, on isole des fragments d'ADN selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, page 1.85.
On effectue une analyse par restriction de ces fragments d'ADN (SAMBROOK et al., 1989, page 1.85) après un clivage avec les enzymes de restriction EcoRI et Pstl.
Cette analyse indique que la taille des fragment insérés présents dans les plasmides pRG930: : WI est comprise entre environ 20 et 30 kpb (kpb = 1000 paires de bases) et que ces fragments sont différents les uns des autres. Ceci indique que la banque génomique qui a été constituée est représentative.
1500 colonies d'E. coli HB101 (pRG930::WI) sont alors mises en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélose, 25 μg/ml de streptomycine et 50 μg/ml de spectinomycine, durant environ 24 heures à 37 °C. Ces 1500 colonies d'E. coli HB101 (pRG930::WI) constituent la banque génomique.
3. Obtention d'un fragment chromosomique contenant le gène de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
Enfin d'établir la séquence nucléotidique d'une sonde apte à cribler la banque génomique, on prend comme base de référence initiale la séquence N-terminale de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 , telle qu'obtenue à l'exemple 5. Pour lever le maximum d'ambiguïté dans la traduction des acides aminés vers les nucléotides, on prend en compte d'une part les séquences de 28
nucléotides de plusieurs lipases produites par différentes souches de Pseudomonas et publiées dans Gilbert J. et al., Enzyme Microbiological Technology, 1993, 15, p. 634-645, et, d'autre part, la propriété connue sous le nom de "codon usage" de la souche de Pseudomonas aeruginosa et publiée dans West S. et al. , Nucleic Acid research, 1988, 16, p. 9323-9335. Sur base de ces éléments on établit la séquence d'un oligonucléotide synthétique de 72 pb (pb = paire de bases). Cet oligonucléotide synthétique est préparé selon la technique décrite dans BEAUCAGE et al. (1981), Tetrahedron Letters, 22, pages 1859-1882 et en utilisant des /3-cyanoéthyl phosphoramidites dans un appareil de BIOSEARCH CYCLONE SYNTHESIZER. a a séquence de cet oligonucléotide synthétique est la suivante : SEQ ID NO: 11 ' - AACTACACCAAGACCAAATACCCCATCGTGCTGGTCCA - - CGGCGTGACCGGCTTCAACACTATCGGCGGGCTC -
Cet oligonucléotide synthétique est marqué à sa terminaison au moyen de T -^2P ATP avec une enzyme T4 polynucléotide kinase en suivant la technique décrite dans le kit SEQUITHERM CYCLE SEQUENCING KIT (BYOZYME). Un criblage est effectué sur la banque génomique par la technique dite de "colony blot" (AMERSHAM) en utilisant comme sonde l'oligonucleotide synthétique tel que préparé ci-dessus.
Les 1500 colonies de la banque génomique (E. coli HB101 (pRG930: : WI)) sont mises en culture durant 18 heures à 37 °C sur des membranes dites "hybond-N^ " (AMERSHAM) en suivant la technique indiquée par le fabricant.
Les membranes (400 cmr) sont placées dans des sacs plastiques contenant 45 ml de solution de préhybridisation.
La solution de contient 15 ml de 20X SSC (3 M NaCl et 0,3 M de citrate de sodium, pH de 7,0), 5 ml de la solution de Denhardt et 500 μg d'ADN de sperme de saumon dénaturé et fragmenté (AMERSHAM).
500 ml de solution de Denhardt contient 5 g de FICOLL de type 400 (PHARMACIA), 5 g de polyvinylpyrrolidone et 5 g d'albumine de sérum bovin.
Les membranes placées dans des sacs plastiques sont incubées à 68 °C - 29 -
dans un bain-marie sous agitation (100 tours par minute, amplitude d'environ 2,54 cm) durant 4 heures.
Les membranes sont alors incubées avec une solution d'hybridisation à 68 °C dans un bain-marie sous agitation (1U0 tours par minute, amplitude d'environ 2,54 cm) durant 18 heures.
La solution d'hybridisation est préparée en mélangeant 5 ml de la solution de préhybridisation préchauffée à 68 °C et l'oligonucleotide synthétique marqué, et ayant été incubé au bain-marie durant 5 minutes, la concentration finale de l'oligonucleotide synthétique est de 0,3 pMol. Les membranes sont ensuite récupérées. Les membranes sont alors lavées avec une solution contenant 100 ml de 2X SSC (0,3 M NaCl et 0,03 M de citrate de sodium, pH de 7,0) et 0,1 % (p/v) de SDS durant 5 minutes à température ambiante.
Puis, les membranes lavées sont séchées entre deux papiers absorbants. Les membranes séchées sont couvertes d'une feuille plastique transparente de qualité alimentaire. Elles sont alors soumises à une autoradiographie aux rayons X (AMERSHAM).
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est utilisée comme contrôle positif et les souches d'E. coli HB101 et d'E. coli HB101 (pRG930) sont utilisées comme contrôle négatif.
La souche d'E. coli HB101 (pRG930) a été obtenue par la technique de la transformation décrite dans Molecular Cloning, a laboratory Manual - MANIAΗS et al. , 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, pages 150-151, en mettant en oeuvre la souche d'E. coli HB101 et le plasmide pRG930. On observe un signal clair et fort pour la souche sauvage de
Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 et aucun signal pour les souches d'E. coli HB101 et d'E. coli HB101 (pRG930). Le criblage de la banque génomique met en évidence 80 colonies donnant un signal. Ceci est confirmé par un nouvel essai d'hybridisation. Une colonie de la banque génomique présentant ur signal fort est isolée et mise en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélose, 25 μg/ml de streptomycine et 50 μg/ml de spectinomycine, durant environ 24 heures à 37 °C. Cette colonie est dénommée E. coli HB101 (pRG930::WI12). Un essai d'hybridisation est de nouveau effectué avec la colonie d'E. coli HB101 (pRG930::WI12) en vue de confirmer les résultats obtenus. 30
Exemple 16
Analyse du plasmide pRG930::WI12 présent dans la souche d'E. coli HB101 (pRG930::WI12) - Analyse par la technique dite du Southern Blot On isole l'ADN à partir de la souche d'E. coli HB101 (pRG930::WI12), obtenu à l'exemple 15, selon le technique décrite par
SAMBROOK et al., 1989, pages 1.25-1.28, et on effectue une analyse par restriction en utilisant l'enzyme de restriction EcoRI. Les fragments d'ADN obtenus sont séparés par electrophorese sur gel d' agarose selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, pages 6.01-6.19. Cette analyse montre que le fragment d'ADN inséré dans le plasmide pRG930::WI12 a une taille d'environ 27 kpb.
Puis, l'ADN est transféré sur une membrane dite "hybond-N+ " (AMERSHAM) et on effectue une hybridisation en suivant la technique indiquée par le fabricant comme illustrée à l'exemple 15. Comme contrôle négatif, on utilise le plasmide pRG930.
On observe une seule bande donnant un signal d'hybridisation avec l'oligonucleotide synthétique (SEQ ID NO: 11) sur le gel d'électrophorèse. Le fragment porté par cette bande a une taille d'environ 24,5 kpb, il est lié au vecteur pRG930. Exemple 17
Séquence de nucléotides du gène complet qui code pour la lipase de
Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
1. Obtention de la souche de Pseudomonas wisconsinensis RC13
On effectue une analyse par restriction du plasmide pRG930::WI12 en utilisant l'enzyme de restriction EcoRI. Les fragments d'ADN obtenus sont séparés par electrophorese sur gel d' agarose.
On effectue une analyse selon la technique du Southern Blot, telle que décrite à l'exemple 16.
Ceci met en évidence que le fragment inséré dans le plasmide pRG930::WI12 est formé, d'une part, de 4 fragments qui ont ensemble une taille d'environ 18,5 kpb et, d'autre part, d'un fragment attaché au vecteur pRG930. Ce fragment a une taille d'environ 8,5 kpb.
Le fragment de 8,5 kpb, attaché au vecteur pRG930, donne un signal d'hybridisation avec l'oligonucleotide synthétique (SEQ ID NO: 11), les 4 autres fragments ne donnent aucun signal.
Le fragment de 8.5 kpb attaché au vecteur pRG930 est ensuite ligaturé sur lui-même selon la méthode décrite par SAMBROOK et al., 1989, pages 1.68-1.69. On obtient le plasmide pRG930::WI13.
La ligation ainsi obtenue est utilisée pour transformer des cellules de E. coli DH5α (GIBCO) comme décrit dans SAMBROOK et al., 1989, page 1.82-1.84.
On obtient une colonie d'E. coli DH5α (pRG930::WI13) que l'on isole et met en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélose, 25 μg/ml de streptomycine et 50 μg/ml de spectinomycine, durant environ 24 heures à 37 °C. On établit une carte de restriction partielle du plasmide pRG930::WI13 en utilisant la technique décrite dans Molecular Cloning, a laboratory Manual - MANIAΗS et al., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, pages 374-379, et en mettant en oeuvre les enzymes de restriction Clal, EcoRI, Ncol, Sali, Hindiπ, Bgiπ, Xhol, BamHI, Smal, Sacl, SacII, Kpnl, SphI, Xbal, EcoRV et Spel.
2. Identification de la séquence de nucléotides de la lipase
On effectue une analyse par restriction du plasmide pPRG930::WI13, en utilisant l'enzyme de restriction Pstl. Les fragments d'ADN obtenus sont séparés par electrophorese sur gel d' agarose. On effectue une analyse selon le technique du Southern Blot, telle que décrite à l'exemple 16.
Ceci met en évidence que le fragment inséré dans le plasmide pRG930::WT13 est formé, d'une part, de 5 fragments et, d'autre part, d'un petit fragment. Ce petit fragment a une taille d'environ 2,5 kpb. Le fragment de 2,5 kpb donne un signal d'hybridisation avec l'oligonucleotide synthétique (SEQ JD NO: 11), les 5 autres fragments ne donnent aucun signal.
Le fragment de 2,5 kpb est ligaturé avec le vecteur pPRG930 selon la méthode décrite par SAMBROOK et al., 1989, pages 1.68-1.69. On obtient le plasmide pRG930: :WI14.
A partir du plasmide pRG930::WI14, le fragment de 2,5 kpb est inséré dans le plasmide pBLUESCRIPT.
Le plasmide pBLUESCRIPT peut être obtenu auprès de la société STRATAGENE. On obtient le plasmide pBLUESCRIPT::WI14.
La séquence de fragment de 2,5 kpb inséré dans le plasmide 32
pBLUESCRIPT: :WI14 est obtenue en mettant en oeuvre le kit SEQUΓΓHERM CYCLE SEQUENCING KIT (BIOZYM) et en suivant la technique préconisée par le fabricant.
Pour compléter et vérifier la séquence de nucléotides obtenue, on répète l'exemple ci-dessus avec la modification suivante. On effectue l'analyse par restriction du plasmide pPRG930::WI14, en mettant en oeuvre successivement les enzymes de restriction Sali, Kpnl ou SacII en lieu et place de l'enzyme de restriction Pstl.
On identifie la séquence de nucléotides de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. La séquence d'acides aminés et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO:2) codant pour la lipase mature, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO: 3), est donnée à la figure 1 (figures la et lb).
On vérifie que les premiers acides aminés de la séquence de la lipase, ainsi identifiés, correspondent à la séquence N-terminale déterminée à l'exemple 5.
La lipase est synthéti.sée sous forme d'un précurseur. Le précurseur contient 308 acides aminés (SEQ ID NO: 7). On identifie la séquence de nucléotides (SEQ ID NO:5) codant pour le précurseur de la lipase, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO: 6).
Le précurseur contient la séquence de 286 acides aminés (SEQ ID NO: 4) de la lipase mature et la séquence de 22 acides aminés (SEQ ID NO: 10) de la préséquence.
La séquence de la lipase mature est précédée d'une préséquence. Il s'agit d'une séquence additionnelle de 22 acides aminés (SEQ ID NO: 10).
On identifie la séquence de nucléotides correspondante (SEQ ID NO: 8), ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO:9). Cette préséquence code pour le peptide signal de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: SOLVAY (Société -anonyme)
(B) RUE: rue du Prince Albert, 33
(C) VILLE: Bruxelles
(E) PAYS: Belgi-que
(F) CODE POSTAL: 1050
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Lipase, microorganisme la produisant, procédé de préparation de cette lipase et utilisations de celle-ci
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 11
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (v) TYPE DE FRAGMENT: N-terminal
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Pseudomonas
(B) SOUCHE: Pseudomonas wisconsinensis
(C) INDIVIDU/ISOLE: T 92.677/1
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr 1 5 10 15
Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 861 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Pseudomonas
(B) SOUCHE: Pseudomonas wisconsinensis
(C) INDIVIDU/ISOLE: T 92.677/1
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
AACTACACCA AGACCAAGTA TCCGATCGTG CTGGTACACG GCGTGACCGG GTTCAûTACC 60
ATCGGCGGGC TGGTCAATTA CTTCCATACC ATTCCCTGGA ACCTAGAGCG CGATGGCGCC 120
CGGGTGCACG TCGCCAGTGT CGCTGCCTTC AATGACAGCG AGCAGCGCGG CGCCGAGCTG 180
GCCCGGCAGA TCGTGCCCTG GGCCGCAGGC GGAGGCGGCA AGGTCAACCT GATCGGCCAC 240
AGTCAGGGCT CGCCGACCTC GCGCGTGGCG GCTTCGTTGC GGCCGGATCT GGTGGCATCG 300
GTGACCTCGA TCAACGGCGT CAACAAGGGC TCCAAGGTCG CCGATGTGGT GCGCGGCGTG 360
CTGCCACCGG GTAGCGGTAT CGAAGGCGGC GCCAATGCCA TCGCCAACGC CCTCGGTGCG 420
GTGATCAATC TGCTGTCTGG CTCAAGCAAC CCGCAAAACG GTATCAACGC GCTAGGCACC 480
CTGACCACCG CGGGCACCAG TGCGCTGAAC AGTCGCCACC CGTGGGGCGT CAACACCAGC 540
AGCTACTGCG CCAAGTCCAC CGAAGTGCAC AATGTGCGCG GTCACAGCAT CCGCTACTAC 600
TCCTGGACCG GTAATGCCGC CTATACCAAC GTGCTCGATG CGGCCGATCC CTTCCTGGCC 660
TTCACCGGCC TGGTGTTCGG CAGCGAGAAG AACGACGGTC TGGTGGGCGT ATGTTCCACC 720
TATCTGGGGC AGGTGATCGA CGACAGCTAC AACATGAACC ACGTCGATGC GATCAACCAC 780
CTGTTCGGCA TTCGTGGCTG GACCGAACCG GTGTCGCTGT ATCGCCAGCA CGCCAACCGC 840
CTGAAGAACA AGGGCGTCTG A 861
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 861 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..858
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AAC TAC ACC AAG ACC AAG TAT CCG ATC GTG CTG GTA CAC GGC GTG ACC 48 Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr 1 5 10 15
GGG TTC AAT ACC ATC GGC GGG CTG GTC AAT TAC TTC CAT ACC ATT CCC 96 Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu Val Asn Tyr Phe His Thr Ile Pro 20 25 30
TGG AAC CTA GAG CGC GAT GGC GCC CGG GTG CAC GTC GCC AGT GTC GCT 144 Trp Asn Leu Glu Arg Asp Gly Ala Arg Val His Val Ala Ser Val Aia 35 40 45
GCC TTC AAT GAC AGC GAG CAG CGC GGC GCC GAG CTG GCC CGG CAG ATC 192 Ala Phe Asn Asp Ser Glu Gin Arg Gly Ala Glu Leu Ala Arg Gin Ile 50 55 60
GTG CCC TGG GCC GCA GGC GGA GGC GGC AAG GTC AAC CTG ATC GGC CAC 240 Val Pro Trp Ala Ala Gly Gly Gly Gly Lys Val Asn Leu Ile Gly His 65 70 75 80
AGT CAG GGC TCG CCG ACC TCG CGC GTG GCG GCT TCG TTG CGG CCG GAT 288 Ser Gin. Gly Ser Pro Thr Ser Arg Val Ala Ala Ser Leu Arg Pro Asp 85 90 95
CTG GTG GCA TCG GTG ACC TCG ATC AAC GGC GTC AAC AAG GGC TCC AAG 336 Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Asn Gly Val Asn Lys Gly Ser Lys 100 105 110
GTC GCC GAT GTG GTG CGC GGC GTG CTG CCA CCG GGT AGC GGT ATC GAA 384 Val Ala Asp Val Val Arg Gly Val Leu Pro Pro Gly Ser Gly Ile Glu 115 120 125
GGC GGC GCC AAT GCC ATC GCC AAC GCC CTC GGT GCG GTG ATC AAT CTG 432 Gly Gly Ala Asn Ala Ile Ala Asn Ala Leu Gly Ala Val Ile Asn Leu 130 135 140
CTG TCT GGC TCA AGC AAC CCG CAA A C GGT ATC AAC GCG CTA GGC ACC 480 Leu Ser Gly Ser Ser Asn Pro Gin Asn Gly Ile Asn Ala Leu Gly Thr 145 150 155 160
CTG ACC ACC GCG GGC ACC AGT GCG CTG AAC AGT CGC CAC CCG TGG GGC 528 Leu Thr Thr Ala Gly Thr Ser Ala Leu Asn Ser Arg His Pro Trp Gly 165 170 175
GTC AAC ACC AGC AGC TAC TGC GCC AAG TCC ACC GAA GTG CAC AAT GTG 576 Val Asn Thr Ser Ser Tyr Cys Ala Lys Ser Thr Glu Val His Asn Val 180 185 190 -36
CGC GGT CAC AGC ATC CGC TAC TAC TCC TGG ACC GGT AAT GCC GCC TAT 624 Arg Gly His Ser Ile Arg Tyr Tyr Ser Trp Thr Gly Asn Ala Ala Tyr 195 200 205
ACC AAC GTG CTC GAT GCG GCC GAT CCC TTC CTG GCC TTC ACC GGC CTG 672 Thr Asn Val Leu Asp Ala Ala Asp Pro Phe Leu Ala Phe Thr Gly Leu 210 215 220
GTG TTC GGC AGC GAG AAG AAC GAC GGT CTG GTG GGC GTA TGT TCC ACC 720 Val Phe Gly Ser Glu Lys Asn Asp Gly Leu Val Gly Val Cys Ser Thr 225 230 235 240
TAT CTG GGG CAG GTG ATC GAC GAC AGC TAC AAC ATG AAC CAC GTC GAT 768 Tyr Leu Gly Gin Val Ile Asp Asp Ser Tyr Asn Met Asn His Val Asp 245 250 255
GCG ATC AAC CAC CTG TTC GGC ATT CGT GGC TGG ACC GAA CCG GTG TCG 816 Ala Ile Asn His Leu Phe Gly Ile Arg Gly Trp Thr Glu Pro Val Ser 260 265 270
CTG TAT CGC CAG CAC GCC AAC CGC CTG AAG AAC AAG GGC GTC TGA 861
Leu Tyr Arg Gin His Ala Asn Arg Leu Lys Asn Lys Gly Val 275 280 285
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 286 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr 1 5 10 15
Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu Val Asn Tyr Phe His Thr Ile Pro 20 25 30
Trp Asn Leu Glu Arg Asp Gly Ala «rg Val His Val Ala S-. *- Val Ala 35 40 45
Ala Phe Asn Asp Ser Glu Gin Arg Gly Ala Glu Leu Ala Arg Gin Ile 50 55 60
Val Pro Trp Ala Ala Gly Gly Gly Gly Lys Val Asn Leu Ile Gly His 65 70 75 80
Ser Gin Gly Ser Pro Thr Ser Arg Val Ala Ala Ser Leu Arg Pro Asp 85 90 95 - 37
Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Asn Gly Val Asn Lys Gly Ser Lys 100 105 110
Val Ala Asp Val Val Arg Gly Val Leu Pro Pro Gly Ser Gly Ile Glu 115 120 125
Gly Gly Ala Asn Ala Ile Ala Asn Ala Leu Gly Ala Val Ile Asn Leu 130 135 140
Leu Ser Gly Ser Ser Asn Pro Gin Asn Gly Ile Asn Ala Leu Gly Thr 145 150 155 160
Leu Thr Thr Ala Gly Thr Ser Ala Leu Asn Ser Arg His Pro Trp Gly 165 170 175
Val Asn Thr Ser Ser Tyr Cys Ala Lys Ser Thr Glu Val His Asn Val 180 185 190
Arg Gly His Ser Ile Arg Tyr Tyr Ser Trp Thr Gly Asn Ala Ala Tyr 195 200 205
Thr Asn Val Leu Asp Ala Ala Asp Pro Phe Leu Ala Phe Thr Gly Leu 210 215 220
Val Phe Gly Ser Glu Lys Asn Asp Gly Leu Val Gly Val Cys Ser Thr 225 230 235 240
Tyr Leu Gly Gin Val Ile Asp Asp Ser Tyr Asn Met Asn His Val Asp 245 250 255
Ala Ile Asn His Leu Phe Gly Ile Arg Gly Trp Thr Glu Pro Val Ser 260 265 270
Leu Tyr Arg Gin His Ala Asn Arg Leu Lys Asn Lys Gly Val 275 280 285
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 927 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: ATGCGTCGCG TCTATACCGC TGCCCTGGCA ACACTCGCTC TGCTTGGCGC CGTCGAGGCC 60 CAGGCCAACT ACACCAAGAC CAAGTATCCG ATCGTGCTGG TACACGGCGT GACCGGGTTC 120 AATACCATCG GCGGGCTGGT CAATTACTTC CATACCATTC CCTGGAACCT AGAGCGCGAT 180 -38-
GGCGCCCGGG TGCACGTCGC CAGTGTCGCT GCCTTCAATG ACAGCGAGCA GCGCGGCGCC 240
GAGCTGGCCC GGCAGATCGT GCCCTGGGCC GCAGGCGGAG GCGGCAAGGT CAACCTGATC 300
GGCCACAGTC AGGGCTCGCC GACCTCGCGC GTGGCGGCTT CGTTGCGGCC GGATCTGGTG 360
GCATCGGTGA CCTCGATCAA CGGCGTCAAC AAGGGCTCCA AGGTCGCCGA TGTGGTGCGC 420
GGCGTGCTGC CACCGGGTAG CGGTATCGAA GGCGGCGCCA ATGCCATCGC CAACGCCCTC 480
GGTGCGGTGA TCAATCTGCT GTCTGGCTCA AGCAACCCGC AAAACGGTAT CAACGCGCTA 540
GGCACCCTGA CCACCGCGGG CACCAGTGCG CTGAACAGTC GCCACCCGTG GGGCGTCAAC 600
ACCAGCAGCT ACTGCGCCAA GTCCACCGAA GTGCACAATG TGCGCGGTCA CAGCATCCGC 660
TACTACTCCT GGACCGGTAA TGCCGCCTAT ACCAACGTGC TCGATGCGGC CGATCCCTTC 720
CTGGCCTTCA CCGGCCTGGT GTTCGGCAGC GAGAAGAACG ACGGTCTGGT GGGCGTATGT 780
TCCACCTATC TGGGGCAGGT GATCGACGAC AGCTACAACA TGAACCACGT CGATGCGATC 840
AACCACCTGT TCGGCATTCG TGGCTGGACC GAACCGGTGT CGCTGTATCG CCAGCACGCC 900
AACCGCCTGA AGAACAAGGG CGTCTGA 927
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 927 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: Simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: sigjpeptide
(B) EMPLACEMENT:1..66
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: mat_peptιde
(B) EMPLACEMENT:67..924
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE. CDS
(B) EMPLACEMEN :1..924
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6-
ATG CGT CGC GTC TAT ACC GCT GCC CTG GCA ACA CTC GCT CTG CTT GGC 48 Met Arg Arg Val Tyr Thr Ala Ala Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu Gly -22 -20 -15 -10 39 -
GCC GTC GAG GCC CAG GCC AAC TAC ACC AAG ACC AAG TAT CCG ATC GTG 96 Ala Val Glu Ala Gin Ala Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val -5 1 5 10
CTG GTA CAC GGC GTG ACC GGG TTC AAT ACC ATC GGC GGG CTG GTC AAT 144 Leu Val His Gly Val Thr Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu Val Asn 15 20 25
TAC TTC CAT ACC ATT CCC TGG AAC CTA GAG CGC GAT GGC GCC CGG GTG 192 Tyr Phe His Thr Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Asp Gly Ala Arg Val 30 35 40
CAC GTC GCC AGT GTC GCT GCC TTC AAT GAC AGC GAG CAG CGC GGC GCC 240 His Val Ala Ser Val Ala Ala Phe Asn Asp Ser Glu Gin Arg Gly Ala 45 50 55
GAG CTG GCC CGG CAG ATC GTG CCC TGG GCC GCA GGC GGA GGC GGC AAG 288 Glu Leu Ala Arg Gin Ile Val Pro Trp Ala Ala Gly Gly Gly Gly Lys 60 65 70
GTC AAC CTG ATC GGC CAC AGT CAG GGC TCG CCG ACC TCG CGC GTG GCG 336 Val Asn Leu Ile Gly His Ser Gin Gly Ser Pro Thr Ser Arg Val Ala 75 80 85 90
GCT TCG TTG CGG CCG GAT CTG GTG GCA TCG GTG ACC TCG ATC AAC GGC 384 Ala Ser Leu Arg Pro Asp Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Asn Gly 95 100 105
GTC AAC AAG GGC TCC AAG GTC GCC GAT GTG GTG CGC GGC GTG CTG CCA 432 Val Asn Lys Gly Ser Lys Val Ala Asp Val Val Arg Gly Val Leu Pro 110 115 120
CCG GGT AGC GGT ATC GAA GGC GGC GCC AAT GCC ATC GCC AAC GCC CTC 480 Pro Gly Ser Gly Ile Glu Gly Gly Ala Asn Ala Ile Ala Asn Ala Leu 125 130 135
GGT GCG GTG ATC AAT CTG CTG TCT GGC TCA AGC AAC CCG CAA AAC GGT 528 Gly Ala Val Ile Asn Leu Leu Ser Gly Ser Ser Asn Pro Gin Asn Gly 140 145 150
ATC AAC GCG CTA GGC ACC CTG ACC ACC GCG GGC ACC AGT GCG CTG AAC 576 Ile Asn Ala Leu Gly Thr Leu Thr Thr Ala Gly Thr Ser Ala Leu Asn 155 160 165 170
AGT CGC CAC CCG TGG GGC GTC AAC ACC AGC AGC TAC TGC GCC AAG TCC 624 Ser Arg His Pro Trp Gly Val Asn Thr Ser Ser Tyr Cys Ala Lys Ser 175 180 185
ACC GAA GTG CAC AAT GTG CGC GGT CAC AGC ATC CGC TAC TAC TCC TGG 672 Thr Glu Val His Asn Val Arg Gly His Ser Ile Arg Tyr Tyr Ser Trp 190 195 200 40 -
ACC GGT AAT GCC GCC TAT ACC AAC GTG CTC GAT GCG GCC GAT CCC TTC 720 Thr Gly Asn Ala Ala Tyr Thr Asn Val Leu Asp Ala Ala Asp Pro Phe 205 210 215
CTG GCC TTC ACC GGC CTG GTG TTC GGC AGC GAG AAG AAC GAC GGT CTG 768 Leu Ala Phe Thr Gly Leu Val Phe Gly Ser Glu Lys Asn Asp Gly Leu 220 225 230
GTG GGC GTA TGT TCC ACC TAT CTG GGG CAG GTG ATC GAC GAC AGC TAC 816 Val Gly Val Cys Ser Thr Tyr Leu Gly Gin Val Ile Asp Asp Ser Tyr 235 240 245 250
AAC ATG AAC CAC GTC GAT GCG ATC AAC CAC CTG TTC GGC ATT CGT GGC 864 Asn Met Asn His Val Asp Ala Ile Asn His Leu Phe Gly Ile Arg Gly 255 260 265
TGG ACC GAA CCG GTG TCG CTG TAT CGC CAG CAC GCC AAC CGC CTG AAG 912 Trp Thr Glu Pro Val Ser Leu Tyr Arg Gin His Ala Asn Arg Leu Lys 270 275 280
AAC AAG GGC GTC TGA 927
Asn Lys Gly Val 285
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 308 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Met Arg Arg Val Tyr Thr Ala Ala Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu Gly -22 -20 -15 -10
Ala Val Glu Ala Gin Ala Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val -5 1 5 10
Leu Val His Gly Val Thr Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu Va]. Asn 15 20 25
Tyr Phe His Thr Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Asp Gly Ala Arg Val 30 35 40
His Val Ala Ser Val Ala Ala Phe Asn Asp Ser Glu Gin Arg Gly Ala 45 50 55
Glu Leu Ala Arg Gin Ile Val Pro Trp Ala Ala Gly Gly Gly Gly Lys 60 65 70 41
Val Asn Leu Ile Gly His Ser Gin Gly Ser Pro Thr Ser Arg Val Ala 75 80 85 90
Ala Ser Leu Arg Pro Asp Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Asn Gly 95 100 105
Val Asn Lys Gly Ser Lys Val Ala Asp Val Val Arg Gly Val Leu Pro 110 115 120
Pro Gly Ser Gly Ile Glu Gly Gly Ala Asn Ala Ile Ala Asn Ala Leu 125 130 135
Gly Ala Val Ile Asn Leu Leu Ser Gly Ser Ser Asn Pro Gin Asn Gly 140 145 150
Ile Asn Ala Leu Gly Thr Leu Thr Thr Ala Gly Thr Ser Ala Leu Asn 155 160 165 170
Ser Arg His Pro Trp Gly Val Asn Thr Ser Ser Tyr Cys Ala Lys Ser 175 180 185
Thr Glu Val His Asn Val Arg Gly His Ser Ile Arg Tyr Tyr Ser Trp 190 195 200
Thr Gly Asn Ala Ala Tyr Thr Asn Val Leu Asp Ala Ala Asp Pro Phe 205 210 215
Leu Ala Phe Thr Gly Leu Val Phe Gly Ser Glu Lys Asn Asp Gly Leu 220 225 230
Val Gly Val Cys Ser Thr Tyr Leu Gly Gin Val Ile .Asp Asp Ser Tyr 235 240 245 250
Asn Met Asn His Val Asp Ala Ile Asn His Leu Phe Gly Ile Arg Gly 255 260 265
Trp Thr Glu Pro Val Ser Leu Tyr Arg Gin His Ala Asn Arg Leu Lys 270 275 280
Asn Lys Gly Val 285
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: ATGCGTCGCG TCTATACCGC TGCCCTGGCA ACACTCGCTC TGCTTGGCGC CGTCGAGGCC 60 CAGGCC 66
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..66
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: sig_peptide
(B) EMPLACEMEN :1..66
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
ATG CGT CGC GTC TAT ACC GCT GCC CTG GCA ACA CTC GCT CTG CTT GGC 48 Met Arg Arg Val Tyr Thr Ala Ala Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu Gly 1 5 10 15
GCC GTC GAG GCC CAG GCC 66
Ala Val Glu Ala Gin Ala 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
Met Arg Arg Val Tyr Thr Ala Ala Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ala Val Glu Ala Gin Ala 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 72 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
AACTACACCA AGACCAAATA CCCCATCGTG CTGGTCCACG GCGTGACCGG CTTCAACACT 60
ATCGGCGGGC TC 72

Claims

/12012 -.,-_ -.
PCT/BE95/00094
44
R E V E N D I C A T I O N S
1 - Lipase, caractérisée en ce qu'elle provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis ou d'un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire cette lipase.
2 - Lipase, caractérisée en ce qu'elle provient de la souche de
Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151) ou d'un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire cette lipase.
3 - Lipase, caractérisée en ce que sa séquence N-terminale d'acides aminés (SEQ ID NO: l) est la suivante : Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His 1 5 10
Gly Val Thr Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu 15 20
4 - Lipase, isolée et purifiée, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides aminés de 1 à 286 acides aminés (SEQ ID NO:4) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
5 - Lipase, isolée et purifiée, caractérisée en ce que la séquence de la lipase mature est précédée d'une préséquence de 22 acides aminés (SEQ ID NO: 10) qui code pour le peptide signal de la lipase.
6 - Lipase, isolée et purifiée, caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 30 kDa.
7 - Lipase, isolée et purifiée, caractérisée en ce qu'elle a un point isoélectrique estimé compris entre environ 9,8 et environ 10,1.
8 - Lipase, caractérisée en ce qu'elle provient d'une bactérie aérobie capable de produire la lipase dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux sous condition d'aérobiose.
9 - Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, dans une gamme de température supérieure à environ 40 °C. 10 - Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, dans une gamme de température inférieure à environ 60 °C.
11 - Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, dans une gamme de température comprise entre environ 40 °C et environ 60 °C.
12 - Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, à une température d'environ 55 °C.
13 - Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique de plus de 50 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de température comprise entre environ 40 °C et environ 60 °C pour un pH d'environ 9,5, l'activité enzymatique maximale étant mesurée à une température de 55 °C et à un pH de 9,5.
14 - Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 °C, dans une gamme de pH supérieur ou égal à environ 8.
15 - Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 °C, dans une gamme de pH inférieur ou égal à environ 10.
16 - Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 °C, dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 10.
17 - Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique de plus de 85 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 10 pour une température d'environ 30 °C, l'activité enzymatique maximale étant mesurée à une température de 30 °C et à un pH de 9,5.
18 - Lipase, caractérisée en ce qu'elle montre une activité enzymatique relative d'au moins 55 % mesurée après une incubation de 160 minutes à une température de 55 °C et à un pH de 10 d< s une solution tamponnée de - 46 -
dureté 15.
19 - Une culture isolée et purifiée de Pseudomonas wisconsinensis et culture dérivée ou mutée de celle-ci.
20 - Une culture isolée et purifiée de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151) et culture dérivée ou mutée de celle-ci.
21 - Molécule d'ADN comprenant la séquence de nucléotides (SEQ ID NO: 2) qui code pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P- 15151) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
22 - Molécule d'ADN selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence de nucléotides (SEQ ID NO:5) qui code pour le précurseur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
23 - Procédé pour la production d'une lipase selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une bactérie capable de produire la lipase dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux et la récolte de la lipase ainsi obtenue.
24 - Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que la bactérie aérobie est une souche de Pseudomonas.
25 - Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la bactérie aérobie est la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P- 15151) et un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire la lipase.
26 - Une composition enzymatique contenant la lipase selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 et au moins un additif.
27 - La composition enzymatique selon la revendication 26, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition de détergence.
28 - Utilisation de la lipase selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 en détergence.
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