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Procédé de préparation d'une substance antibiotique.
La présente invention se rapporte d'une manière générale à des substances antibiotiques et plus particulière- ment à une substance antibiotique nouvelle et commode) la streptine, et au procédé pour la préparer en culture grâce à des conditions convenables et contrôlées de développement du genre Actinomyces et en particulier du sous-genre Strepto- myces. Le nom Streptomyces, admis actuellement pour définir le groupe desactinomycètes qui produit un mycélium aérien et qui sporule a été employé pour la première fois-par Waksman et Henrici, Journal of Bacteriology, 46, 337 (1943).
EMI1.1
Waksman et Woodru:f'f ",r ...111 ..'rl7iI;"l"IC ont montré dans Proc.Soc.Biol.and Med.49,207 (1942) qu'une substance antibiotique, la streptothricine, $'obtient à partir des produits d'élaboration formés par la culture du microorga- nisme Actinomyces (ou Streptomycès) layendulae dans un milieu.
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de culture convenable. Schatz, Bugie et Wksman ont également
EMI2.1
montré, dans FrocSoc.ExpBioland Med'S5y66-69 (1944) qu'une autre substance antibiotique)la streptomycine, s'obtient à partir des produits d'élaboration formés par la culture du microorganisme Actinomyces (ou Streptomyces) griseus dans un milieu de culture convenable.
Là streptothricine et la strep- tomycine sont, à certains points de vue, semblables, tous deux étant des substances relativement thermostables) basiques et solubles dans l'eau. Ce sont pourtant des substances différen- tes et distinctes, ainsi qu'il ressort par exemple des spectres bactériostatiques comparatifs mentionnés ci-dessus (Proc.Soc.
EMI2.2
p.Bioland Med. 55t6C-63 (1944).
On a trouvé actuellement, conformément à la présente invention, que, à partir de la culture de souches d'un micro- organisme de l'espèce streptomyces, isolé par nous, dans un milieu de culture convenable, on peut obtenir à partir du bouillon de culture une nouvelle substance qui est thermosta- ble; qui possède les propriétés d'une base; qui est soluble dans l'eau, dans l'alcool acidulé et dans les acides dilués, mais qui est insoluble dans l'éther, le chloroforme et dans l'acétone, et qui est bactériologiquement active vis-à-vis de toute bactérie gram-positive ou gram-négative. Cette nouvelle substance a été dénommée streptine.
Bien que les propriétés générales mentionnées ci-dessus ressemblent à certains points de vue à celles de la streptothricine et de la streptomycine, il est bien entendu que la.streptine diffère de ces deux an- tibiotiques connus antérieurement-
Le microorganisme qui produit la streptine s'obte- nait comme suit :de la terre ordinaire était placée dans une petite fiole dans une chambre humide. A intervalles hebdoma- daires, on ajoutait approximativement 200mg de cellules humi- des de M.tuberculosis tués à chaud, par 20 g de terre.
Le but de 1'addition de la mycobactérie était d'enrichir la terre en actinomycetes. Les mycobactéries sont riches en cires et
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composés gras relativement résistants, et les actinomycètes) tout comme les mycobactéries du sol dans l'ensemble, attaquent ces substances plus rapidement que la plupart du reste de la population du sol, et,comme résultat, ils prédominent dans les sols contenant en abondance de tels composés:
En l'espace d'environ un mois, les sols sont étalés dans de l'agar de Long ensemencé de cellules vivantes de M. tuberculosis var.hominis 607. Cette souche à développement rapide présente une bonne croissance pendant une semaine d'in- cubation à 370.
Plusieurs colonies d'actinomycetes se développai -ent pendant les quelques premiers jours d'incubation. La plus grande zone d'inhibition ainsi formée mesurait 8mm de diamètre et l'actinomycete qui la provoquait était isolée en culture pure.
La souche de microorganisme ainsi isolée se distingue immédiatement de streptomyces griseus: Elle se rapproche plus étroitement de streptomyces lavendulae mais peut être distin- guée de cette dernière en comparant la croissance des deux cul- tures sur des milieux différents comme résumé au tableau.I. Les principales différences résident dans la formation relative (ou l'absence) de mycelium aérien et de conidiospores, la nature de l'accroissement de la colonie végétative, la formation de pigment à la fois soluble et insoluble sur les divers milieux essayés. La souche produisant la streptine parait appartenir au type Streptomycès reticulus ruber (S.A.Waksman - Principles of soil micro biology- Sec.Rd.1932 page 294).
Tableau I
Etude sur culture de S.reticulus-ruber et S. lavendulae.
EMI3.1
<tb>
Dextrose-asparagine <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> coloré <SEP> en <SEP> Mycélium <SEP> aérien
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> agar <SEP> rose;formation <SEP> spiralée <SEP> rosé; <SEP> chaînes <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb> compacte <SEP> de <SEP> chaines <SEP> de <SEP> spores <SEP> droites
<tb>
<tb>
<tb> spores <SEP> ou <SEP> faiblement
<tb>
<tb>
<tb> spiralées.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Agar <SEP> de <SEP> Czapek <SEP> développement <SEP> semblable <SEP> Développement
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> à <SEP> du <SEP> mycobactérium <SEP> élevé <SEP> sporulé <SEP> rosé
<tb>
<tb>
<tb> et <SEP> plissé <SEP> ;pas <SEP> de <SEP> mycelium <SEP> avec'mycélium
<tb>
<tb>
<tb> ni <SEP> de <SEP> sporulation <SEP> aériens}-aérien <SEP> lourd;
<tb>
<tb>
<tb> face <SEP> inférieure <SEP> de <SEP> la <SEP> co- <SEP> face <SEP> inférieure
<tb>
<tb>
<tb> lonie <SEP> sans <SEP> pigment- <SEP> de <SEP> la <SEP> cononie
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> noire../;
<tb>
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EMI4.1
<tb> Agar <SEP> à <SEP> la <SEP> peptone- <SEP> développement <SEP> superficiel <SEP> mycélium <SEP> aérien
<tb>
<tb> glucose <SEP> humide <SEP> avec <SEP> très <SEP> peu <SEP> de <SEP> rose <SEP> avec <SEP> forte
<tb>
EMI4.2
mycélium aérien;
face inf. sporulat3onJ'ace
EMI4.3
<tb> du <SEP> mycélium <SEP> sans <SEP> pigment; <SEP> inférieure <SEP> du <SEP> mypigment <SEP> brun <SEP> soluble. <SEP> celium <SEP> foncée;
<tb> pigment <SEP> brun <SEP> soluble.
<tb>
<tb>
Agar <SEP> nutritif <SEP> développement <SEP> superficiel <SEP> mycélium <SEP> aérien
<tb> humide <SEP> et <SEP> pas <SEP> de <SEP> mycélium <SEP> rosé <SEP> avec <SEP> forte
<tb> aérien;pigment <SEP> brun <SEP> clair <SEP> sporulation;pigsoluble. <SEP> ment <SEP> brun <SEP> tlair
<tb> soluble.
<tb>
<tb>
Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> développement <SEP> humide <SEP> brun <SEP> mycélium <SEP> aérien
<tb> pas <SEP> de <SEP> mycelium <SEP> aérien; <SEP> rose <SEP> avec <SEP> spoupas <SEP> de <SEP> spores; <SEP> pigment <SEP> lation. <SEP> Pigment
<tb> noir <SEP> soluble. <SEP> brun <SEP> soluble.
<tb>
EMI4.4
La streptine se distingue aussi de la streptat2ari- cine et de la streptomycine par une spécificité antibactérienne de ces produits antibiotiques. Au tableau II figurent les spec- tres antibactériens et l'activité comparative de la streptine et de la streptothricine vis-à-vis de quelques organismes gram- positifs et gram-négatifs. Pour déterminer ces activités) on utilise des concentrés de chlorydrate de streptine et de chlo- rhydrate de streptothricine qui présentent à peu près la même activité vis-à-vis de E.coli, c'est-à-dire 72 unités/mg et 75
EMI4.5
unités/ing respectivement.
(Une unité d'activité est la quanti- té de substance juste suffisante pour inhiber le développement d'une souche standard de Esherichia coli dans 1 ce d'agar nu- tritif en utilisant la technique de la plaque striée.
Tableau II
EMI4.6
pe ae3 ¯P.ithrxine.
EMI4.7
<tb> Bactérie <SEP> d'essai <SEP> Signe <SEP> Unité <SEP> par <SEP> ml.d'agar <SEP> Activité <SEP> Compa-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Gram <SEP> requis <SEP> pour <SEP> inhiber <SEP> rée
<tb>
EMI4.8
le déyelopp¯emen" ¯¯ââBtABô¯¯ --.Qlnl2tine streptine strepto- streptothricine ...........¯...-...¯r.w.¯¯...¯........,....,.¯ ...r....¯¯...¯..r.
EMI4.9
<tb> S.aureus <SEP> + <SEP> 31 <SEP> 2.
<SEP> 4 <SEP> 0.13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> S.albus <SEP> + <SEP> .15 <SEP> ..44 <SEP> 0.33
<tb>
EMI4.10
Mîcro-conglomeratus + .87 7.0 0.13
EMI4.11
<tb> Micro.lysodeikticus <SEP> + <SEP> .07 <SEP> .44 <SEP> 0.16
<tb> S.pyogenes <SEP> MIT <SEP> + <SEP> 18.00 <SEP> 35.00 <SEP> 0.51
<tb>
EMI4.12
S-pyogenes M + 25.00 35.00 0.71
EMI4.13
<tb> S.pyogenes <SEP> + <SEP> 18.00 <SEP> 35.00 <SEP> 0.51
<tb>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumo- <SEP> + <SEP> 18.00 <SEP> 35.00 <SEP> 0.51
<tb>
<tb> niae <SEP> III
<tb>
EMI4.14
B-cereus + 15.00 18.00 0.83 B.subtïlïs + .I6 .39 0.46
EMI4.15
<tb> Pasteurella- <SEP> ,70 <SEP> .70 <SEP> 1.00
<tb>
EMI4.16
pa.seruginosa - 9.0 18.00 0.50 S)1.sgottmulleri 1.2 .1.8. 0.67 âatyphi - IÎ5 . :
6:g 4-colt - 1.2 - 1.2 1.00 0
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En considérant le tableau II il devient apparent que la streptine est nettement plus active vis à vis de mi'- crococcus lysodeikticus, M. conglomératus, staphylococcus albus et S.aureus que ne l'est la streptothricine qui à son tour est plus active vis à vis de ces organismes que la streptomycine.
Conformément à la présente invention) la nouvelle substance antibiotique identifiée ci-dessus, la streptine, est préparée sous forme de son sel d'acide selon un procédé comprenant comme étapes le traitement d'un bouillon de culture filtrée obtenu par culture de souches productrices de strep- tine provenant du microorganisme Streptomyces reticulus-ruber à environ 30 C dans un milieu de culture convenable) avec du charbon de bois activé pour adsorber la streptine à partir du bouillon en question, la séparation du produit adsorbé du char- bon de bois activé, à l'aide d'un acide alcoolique à basse nor- malité et sous forme du sel de streptine du même acide,
le trai- tement du produit éliminé par environ quatre volumes de solvant miscible à l'eau et qui n'est pas un solvant pour l'acide en question, formant ainsi une couche aqueuse comprenant un con- centré du sel d'acide de streptine, et la récupération du sel d'acide de streptine à partir de la dite couche.
Le bouillon de culture soumis au traitement du charbon actif peut être obtenu en cultivant des souches de streptomyces reticulus-ruber dans des conditions aérobiques stationnaires ou submergées (à savoir développement submergé avec agitation et aération) dans un milieu nutritif contenant de préférence de l'extrait de levure, et en séparant le développement des organismes du bouillon de culture.
Pour la préparation de la streptine conformément à la présente invention on utilise un milieu de culture compre- nant une solution aqueuse contenant environ 1% de matière protéique, par exemple une protéine telle que la tryptone, un extrait de protéine, tel qu'un extrait de levure, le N-Z case (un extrait diastasique de la caséine du lait) etc. ou
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une protéine constituant un amino-acide telle que la glycine; ou environ 2% d'un mélange de l'un des produits signalée ci- dessus avec un hydrate de carbone comme l'amidon.
On emploie environ 0,2% d'une solution tampon au phosphate pour maintenir un pH de 7,0 à 8,2. Quand un tel milieu de culture est inoculé avec une suspension aqueuse de spores d'une souche de strepto- myces reticulus-ruber, incubée à une température d'environ 30 C durant 24. à 48 h. avec agitation et aération, et ensuite filtrée afin de séparer la matière végétative du bouillon de culture; on obtient un bouillon contenant la streptine et possédant une activité antibiotique considérable. Des bouillons à pouvoir élevé, c'est à dire 140-150 unités/cc paraissent devoir être obtenus quand le milieu de culture contient environ 1% d'ex- trait de levure.
On a trouvé qu'une incubation pendant des pé- riodes plus longues de 3, 4 ou 5 jours en utilisant un milieu de culture du type décrit, ne correspond pas à un accroissement mais en certains cas à un décroissement de l'activité du bouil- lon résultant.
Il est également possible de préparer de la strepti- ne en cultivant l'organisme streptomyces reticulus-ruber dans un milieu synthétique tel que le milieu synthétique de Long (dont la composition est donnée dans l'exemple IV), de prêté. rence à une température d'incubation d'environ 30 C. Avec ce type de milieu, l'incubation doit être poursuivie pendit une période beaucoup plus longue, et on a trouvé qu'un bouillon à pouvoir ou à activité maximum s'obtient après environ 12 jours d'incubation. orillon
La streptine est récupérée à partir du bouillon de culture, obtenu par le procédé de fermentation soit long soit court, en traitant de préférence le bouillon avec environ 1% en poids de charbon activé.
Le produit actif est adsorbé sur le charbon et après agitation vigoureuse du mélange, le char- bon et la streptine adsorbée sont séparés par filtration et lavés à l'eau. Le charbon est ensuite mis en suspension dans @
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une solution alcoolique acide de basse normalité, telle qu'une solution 0,1 N d'acide chlorhydrique dans l'éthanol, ce qui . provoque la désorption de la streptine du charbon et la forma- tion du sel d'acide de streptine, correspondant' Le charbon est éliminé par filtration et on ajoute environ quatre volumes d'éther au filtrat.
Ce mélange est laissé au repos à tempéra- ture réduite, environ 40C, durant environ 16 heures, temps durant lequel il se sépare une couche aqueuse contenait du sel d'acide de streptine brut.L'éther est ensuite éliminé et la couche aqueuse est diluée jusqu'au volume convenable Pour l'essai ou l'emploi, ou bien elle est évaporés} de préférence par sécharge-congélation, pour donner le sel d'acide de strep- tine brut. S'il y a présence d'un excès d'acide dans la couche aqueuse on la neutralise de préférence avec de 1',hydroxyde de dilué sodium, jusqu'à pH 6-7 et tout précipité qui se forme est éli- miné par filtration et écarté:
Grâce au procédé ci-dessus on obtient un sel d'acide tel que le chlorhydrate de streptine, ayant une activité d'environ 90-100 unités/mg.
Il est bien entendu que d'autres acides inorganiques, et aussi des acides organiques tels que l'acide formique en so- lution dans des alcools aliphatiques inférieurs aqueux peuvent être utilisés pour désorber la streptine du charbon actif. Les sels d'acides organiques et inorganiques ainsi obtenus ont Une activité du même ordre que celle du chlorhydrate susmentionné.
Pour la séparation d'un concentré aqueux du sel d'acide il est aussi entendu qu'on peut employer, en addition à l'éther, d'au- tres solvants organiques miscibles à l'eau, tels que l'acétone, qui ne sont pas des solvants du sel d'acide:
Les exemples suivants illustrent la méthode pour ef- fectuer la présente invention, mais il est bien entendu que ces exemples sont donnés à titre d'illustration et non comme limitation.
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Exemple 1
Environ 80 cc d'une solution aqueuse d'extrait de levure à 1%, contenant environ 0,2% de tampon au phosphate et ayant un pH initial de 7,0 environ, sont placés dans une fiole de 250 cc et stérilisés à environ 10 1bs de pression de vapeur durant 45-50 minutes. Ce milieu est ensuite ensemen- cé avec une suspension aqueuse de spores provenant d'une sou- che de S.reticulus-ruber et la fiole est placée dans un appa- reil à secousses rotatif. Après une incubation à environ 30 durant 24 heures,le milieu est filtré afin d'éliminer le mycélium.
Le filtrat possède une activité d'environ 120 uni- tés/cc comparé (essai à la coupe) à une préparation de strep- tine standard, une unité est la quantité juste suffisante pour provoquer l'inhibition de la souche de E.coli essayée d'après la méthode de la plaque striée.
Une charge composite d'environ 300 ce de bouillon fil- tré, préparé selon le procédé précédent et ayant une activité d'environ 105 unités/ce est agitée durant 1/2 heure avec en- viron 1% en poids de charbon actif; Le charbon actif est éli- miné, lavé deux fois à l'eau distillée et ensuite mis en sus- pension durant environ 20 minutes dans de l'acide chlorhydri- que alcoolique à environ 0,1N, c'est à dire de l'éthanol à 95% contenant suffisamment de HCl pour faire une solution 0,1 N.
Après avoir éliminé le charbon activé, le filtrat est ajouté à 4 volumes d'éther éthylique et le mélange est laissé au re- pos à environ 4 durant 16 heures. Ceci provoque l'apparition d'une couche aqueuse contenant le chlorhydrate de streptine brut, lequel est séparé de l'éther, porté à 10 cc et essayé.
Le concentré de chlorhydrate ainsi obtenu accuse 95 unités/mg environ.
Exemple 2
Une charge de bouillon filtré est traitée par environ 1% de charbon actif comme décrit dans l'exemple 1 et après filtration et lavage à l'eau, le charbon est mis en suspension durant 20 à 30 minutes, avec agitation, dans de l'acide formi-
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que 0,1 N dans le méthanol. Le charbon actif est ensuite en- levé et le filtrat est ajouté à 4 fois son volume d'acétone et laissé au repos dans le froid, environ 5 C durant 12-le heures- Ceci fait apparaitre une couche accuse contenant le sel de streptine de l'acide formique lequel est sépare de l'é- ther et évaporé par séchage-congélation pour donner un concen- tré grisâtre de formiate de streptine brut.
Par dilution avec une faible quantité d'eau et un essai) cette substance accuse une activité de 95-100 unités/mg environ.
Exemple 3
Un nombre de milieux différents) ensemencés avec une souche de S.reticulus-ruber et incubés à 30 C environ comme décrit dans l'exemple 1, et les bouillons de culture sont exa- minés quant à l'activité et au pH à des intervalles de 2,3,4 et 5 jours. Les résultats consignés ci-dessous indiquent clai- rement que par ce moyen on atteint un maximum de production de streptine dans une période limitée d'incubation et qu'une incubation plus prolongée donne généralement un rendement moindre en produit actif.
EMI9.1
àgàà iàiae la streptine
EMI9.2
<tb> @
<tb> Milieu <SEP> Jours
<tb> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb>
EMI9.3
b E.I. 142 58 48 36 8.1 ses 81I 8.Y 1% amidon 1% E*L. 142 40 22 'à 7.6 7;k 7]5 7;
5 l6 tryptone " 96 36 26 28 7.0 811 7il 1% amidon 1% tryptone 54 44 36 '- zoé 7.1 7.9 ?Il I 6 N¯z cel 20 20 20 20 8.0-7.9 810 1% amidon 1% N-Z c 22 20 20 20 7.7 7.7 Ç 7.8 1% glycine 20 20 20 20 7.3 6.9 7.1 1% amidon 1% glycine 32 32 30 28 7.5 7è5 '5 # Activité exprimée en unités/ce.
EMI9.4
emP7 g¯¯4 On prépare un milieu ayant la composition suivante; (milieu synthétique de Long).
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb> 1. <SEP> Eau <SEP> 1000 <SEP> cc
<tb> 2. <SEP> Glycérol <SEP> 50 <SEP> g
<tb>
EMI10.2
3. Citrate ferro-ammonique 0,05 g 4:. 50 4 Mg 190 g
EMI10.3
<tb> 5. <SEP> NaCl <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> 6. <SEP> Co3Na2 <SEP> 3,0 <SEP> g
<tb>
EMI10.4
7. P04KH2 3 t 0 g 8.
Citrate d'ammonium 5,0 g
EMI10.5
<tb> 9. <SEP> Asparagine <SEP> 5,0 <SEP> g
<tb>
Des portions d'environ 80 cc de ce milieu sont stérile sées, inoculées avec une suspension aqueuse de spores prove-
EMI10.6
nant d'une souche de S.reticulus-ruber et incubées à 4 et 3Ô ) Le tableau suivant montre l'activité du milieu filtré obtenue à partir de ces essais; l'activité étant exprimée en unité par cc.
EMI10.7
emp r d' 3.ncub um*#¯àiinigioeyn 4¯8¯65 ?2 9 T$¯ T92 T240 288 240 10 10 10 10 10 11 13 20
EMI10.8
<tb> 30 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 38 <SEP> 30 <SEP> 42 <SEP> 48 <SEP> 51
<tb>
R e v n d i c at ion s.
EMI10.9
--------------------------- ri Procédé de préparation de la nouvelle substance antibioti- que, la streptine, sous forme de ses sels d'acide comprenant comme phases: le traitement d'un bouillon de culture filtré obtenu en cultivant des souches du microorganisme du "strep-
EMI10.10
tomyces reticulus rub er" produi4ant de la stréptine à, 30oC. dans un milieu de culture convenable avec du charbon activé afin d'adsorber la streptine du dit bouillon, la désorption
EMI10.11
du produit adsorbé du charbon activé, à lyaide d'acidé3 en
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.