BE531046A

BE531046A -

Info

Publication number: BE531046A
Authority: BE

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  La présente invention est relative à un nouveau   compose   et plus 
 EMI1.1 
 spécialement à un nouvel agent chimiothérapeutique, et à un procède de préparation d'un tel agento Beaucoup d-9agents ohimiothéraFeutiques communément appelés antibiotiques ont été obtenus jusqueà, présent en partant du milieu de culture dans lequel des micro-organismes se sont développés sous des conditions soigneusement régléeso Dans certains cas? l'antibiotique obtenu montre une 
 EMI1.2 
 activité contre un très large groupe "d,\)organis:#es pathogènes et, dans du autres cas, l'antibiotique 1!IO!ltre une activité particulière contre un grou- pe relativement restreint d'organisme. 



   Un but de la présente invention est de procurer un nouveau composé  qui''agit   sur la croissance ou le développement de bactéries et d'organismes   pathogènes,   
Un autre but de l'invention est de procurer un composé qui règle de manière   efficace;

  ,   la croissance ou le développement de souches de bacté- 
 EMI1.3 
 ries et d!>organisI#s pathogènes, qui n'est pas réglée de manière efficace, par   d'autres   antibiotiques   connuso  
Un but de la présente invention est également de prévoir un procédé de production aisée de quantités importantes du nouvel antibiotique. 
 EMI1.4 
 Deautras buts de la présente invention apparaîtront de la des- cription détaillée et des revendications suivanteso 
La nouvelle substance antibiotique a été trouvée efficace contre un groupe relativement particulier de bactéries. Parmi les bactéries qui sont annihilées ou contrôlées, par la nouvelle substance antibiotique, 
 EMI1.5 
 10rsqu.9on procède à des tests par la "Agar Streak Method" de Waksman et Rielly (Indo Engo Che Anal.

   Edo 1 556, (1945), on a le Bacillus ere s ATCC 7064, le BaciZus .btilis ATCC J1JW?,9 le alroplom Qum fatdau ATCC 105419 le StreDtooocau.s py003nes ATOO 9342 le ta la o re ATCC 65-38-P, le Diploooccus pneu#oniae Type I.,le Sarcina lutes. ATeC 9341, le M.voobaotenum. s#cies ATGG 607, et le Ky.gobagte3aum- amag tio ATOC 101430 Des résultats supplémentaires obtenus par un processus de dilution périodique dans des milieux liquides montrent que les bactéries suivantes sont annihilées ou rendues inefficaces par les substances antibiotiques de la 
 EMI1.6 
 présente invention ô S taphylocpoçus aureus, souche de Kozam1k (;

  résistant à la carbomycine et l'érythroIl\Vcine), 9 Stauhwloooozs aureus, Difco 1251 résistant va la pénicilline, l9auréonyciney la terramcôine9 et la chloromycétine) Staphylococçus aureus ATCC 6538-Pg s St entoooa.s '0, Djalag22ZLq¯Me¯UM2nLa,e TYW Il et StroPl9coeùas- faeo s ATOO 10 Les études in vivo sur des souris montrent que les substances antibiotiques cle la présente invention, administrées par voie intrau.tsculairye, protègent les souris contre le pz2genes,, le Sta yl coc eus aureus. et le DiPlocoGous nneumoniae, lorsque ces souris ont été infeo- téesdans le péritoine   aved   les   organismes   de teste Les tests de toxicité intraveineuse violente avec le nouvel antibiotique montrent que le LD 50 dans les souris est compris entre 2 et 3   grammes   par kg de corps.

   La nou- 
 EMI1.7 
 velle matière antibiotique est tolérée intramusculaire4mnt, à un degré de 800 mgr/kg de corps par jour sur une période de 5 jours. 



   L'organisme produisant l'antibiotique de la présente invention était isolé   d'un   échantillon de sol recueilli au   Gardon   of the Gods, Colo- 
 EMI1.8 
 rado Springs, au Golorado, L'isolement était réalisé par des processus stan- dards de dilution,utilisant un milieu solide,le Trypticase Soy Agar des Laboratoires Biologiques de   Baltimore,  dans des   boîtes   de Pétri.

   Du point de vue structurel et fonctionnel, cet organisme est trouvé dans le sol   en,   
 EMI1.9 
 tant qu'un membre de l'espèce Npoardia suivant la classification du Manual of Determinative Bacteriology (6e édition) de Bergeyo La souche particulière de Nocardia actinomycète utilisée dans la présente invention est identifiée ie)[ c :

  mz# -étâil-± une souche Nocardia NA3-TE19, Il doit être entendu, cependant, que le procédé de fermentation de l'invention englobe en .plus 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 
 EMI2.1 
 de l'utilisation de la souche Nocardia NA)=TE19, d'autres souches de cette espèce Nocardia, qui produisent le nouvel antibiotique,de telles souches 
 EMI2.2 
 comprenant des modifications ou variantes de cette souche NA3-TE19> telles qu'aisément produites et isolées par des méthodes courantes d'isolement et de modification de souchequi comprennent le choix de l'organisme dé culture,et l'exposition de   l'organisma  à des moyens modificateurs, tels que les rayons x, la lumière ultra-violette,, et des agents chimiques. 
 EMI2.3 
 



  La souche Nocardia NA3-TE19 se distingue des autres espèces con- nues, et est caractérisée par les nombreux tests physiques physiologiques et de culturedéveloppés dans le paragraphe suivante 
Lors d'un développement sur le Tryptone Dextrin Agar de la So- 
 EMI2.4 
 ciété Upjfx9 ayant la composition suivante Tryptone 0,5% Dextrine 1,0% Agar 2,0% 
 EMI2.5 
 Eau de ville quantité suffisante pour amener à 100%, une croissance modérée est observée, les colonies de Nocardia ayant un. millimètre de diamètre,, après quatre jours de croissance 2 mm de diamètre après 7 jours, et 3 mm de diamètre après 11 jours de ciibissance.

   Les colonies for- . meus sont de structure circulaire devenant légèrement irrégulière, sont brillantes avec un aspect vitreux devenant très inégal ou plissé, et un mycélium substratal de couleur dorée comme le miel ou dorée claire (2ic), de couleur bambou ou chamois (2gc), un mycélium aérien blanc crème se formant autour des bords de la colonie,avec un mycélium aérien de couleur crème peu abondait aux surfaces le plus fortement   croissantes,   Les références au code des couleurs, employées ici, sont données suivant le "Color Harmony Manual" 3e édition, Ro   Jacobsen,   W.C   Granville,   et   GoEoFoss,     1948.,   de la Container 
 EMI2.6 
 Corporation of Amaricao 
Lorsqu'il est   examiné   au microscope,

   on observe que le mycélium de la souche d'organisme   NA3-TE19   croît ou se développe de façon modérément denseet a une structure à ramification du type   monopode.   De croissance rapide,il est sans spore cloisonnéeo Cependant, une segmentation du mycélium 
 EMI2.7 
 commence dans les 48 heures et une fragnmtatiàn. complète s'est réalisée dans les 72 à 96 heures. Les fragments ou iodiospores sont en forme de tiges avec des extrémités carrées bien définieso Ils mesurent environ 0, à 1,5 
 EMI2.8 
 micron de longo Le mycén'um mesure environ 0,5 micron de largeo Des enroule- ments à simple ou double boucle sont observés dans le mycélium au fur et 
 EMI2.9 
 à mesure que la 6\Üture vieillit, lorsque celle-ci est développée en vue d' une observation microscopiqueOn n'observe pas de conidies. 



   L'organisme produisant l'antibiotique de la présente invention montre les caractéristiques de culture suivantes, lorsqu'il est développé sur les milieux standard suivant s 
A Tryptone, extrait de boeuf, extrait de levure, dextrose agar croissance modérée, très inégal au début mais, lors d'une incubation ultérieure, l'aspect inégal semble disparaître, mycélium substratal de couleur tan moutarde clair (2ie),mycélium aérien blanc peu développé, pas de spores, pas de pigment soluble dans l'eau. 



   Bo Peptone, extrait de boeuf, dextrose, chlorure de sodium a-   gar -   croissance modérée, aspect fortement inégal durant la période d'in- . cubation, mycélium substratal de couleur brun moutarde (2Pi) , tournant au brun d'or ou brun tabac (3Pi) , mycélium aérien blanc peu développé, pas de spores, pigment soluble dans l'eau. , gris-brun, léger;

   
 EMI2.10 
 Co Forme d'aminé de Carvajal agar - croissance modérée, nircélium substratal de couleun jaune poudreux (1 1/2 gc) , tournant à doré comme le., miel ou doré' clair (2ic) , mycélium aérien blanc mince, pas de spores, pas de   pigment   soluble dans   l'eau;   

 <Desc/Clms Page number 3> 

 
DoDextrose - Asparagine agar - croissance modérée, mycélium substratal de couleur (2ie) tan moutarde clair, pas de   mycélium   aérien, pas de spores, pas de pigment soluble dans l'eau; 
Eo   Czapek-Dox   (Dextrose) agar - croissance modérée, fortement inégal, mycélium substratal de couleur (31e) jaune cannelle ou érable, tour- nant au brun adobe ou brun clair (31g) mycélium aérien blanc peu développé, pas de spores, pas de pigment soluble dans l'eau, ;

   
Fo Malate de calcium agar - croissance modérée,mycélium sub- stratal de couleur (2ec) sable ou écru, mycélium aérien mince de couleur (2ba) perle, pas de spores, pas de pigment soluble dans l'eau ; 
Go Rondelles de pomme de terre-croissance modérée, mycélium substratal de couleur   (2ie)   dorée   comma   le miel ou dorée claire, mycélium aérien mince de couleur perle (2ba) , pas de spores, pas de pigment soluble dans   l'eau;   
Ho Bouillon de glucose - croissance modérée, pellicule formée en 7 jours, aspect très inégal, mycélium substratal, dans la formation de pellicule, et de couleur bambou ou chamois   (2gc)   à doré comma le miel ou doré clair (2ic), pas de mycélium aérien, pas de spores, pas de pigment soluble dans l'eau ; 
Io Lait de tournesol -pas de formation de flocon.

   L'hydrolyse (éclaircissement) commence environ le dixième jour d'incubation à 28 C et est totale le ou avant le 21e jouroUne réaction colorée alcaline était observée à 7 jours. La détermination électrométrique du pH à 21 jours donnait un pH   de 8,0 ,   
Jo Agar d'amidon -croissance modérée, mycélium substratal de couleur (1-1/2PE) or antique aux bords des bandes de croissance, mycélium substratal de couleur gris olive clair (1-1/2gE) à la partie intérieure de croissance;

   lors d'une incubation ultérieure, les bords deviennent de couleur chamois au beige   (3gE)   et la partie intérieure devient beige-brun ou brun brumeux (3ig) ,  mycélium   aérien de couleur (2ba) perle peu développé, pas de spores, pas de pigment soluble dans l'eau, pas d'hydrolyse d'amidon 
Ko Base d'agar sang tryptose croissance modérée, mycélium substratal de couleur (3PN) café ou brun foncé, pas de mycélium aérien pas de spores, hémolyse dans zone de 11 mm 
Lo Gelatine ordinaire -croissance modérée, aspect cotonneux immédiatement sous la surface, devenant floconneux lors d'une incubation ultérieure, mycélium aérien blanc peu développé,   c'est-à-dire,   non perceptible lorsque la gélatine est liquifiée, la croissance tombe à un niveau solide,2/3 du tube liquéfié en 21 jours,

   pas de pigment soluble dans   l'eau;   et 
M Nitrate agar - les tests pour le nitrite étaient   uniformé-   ment négatifso 
L'aptitude de l'antibiotique de la présente invention à utiliser diverses sources commerciales de carbone est donnée dans le   tableau :   suivant :

   

 <Desc/Clms Page number 4> 

 
TABLEAU   Utilisation   de   carbone   
 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> Source <SEP> de <SEP> Utilisation <SEP> Vitesse <SEP> de
<tb> carbone <SEP> croissance
<tb> Pentoses <SEP> Xylose <SEP> # <SEP> modérée
<tb> Arabinose <SEP> # <SEP> modérée
<tb> Rhamnose <SEP> Hexoses <SEP> Dextrose <SEP> # <SEP> modérée
<tb> Galactose <SEP> # <SEP> "
<tb> Mannose <SEP> # <SEP> "
<tb> Cétoses <SEP> Fructose <SEP> # <SEP> modérée
<tb> S <SEP> orbose <SEP> Disaccharides <SEP> Sucrose <SEP> Lactose <SEP> Maltose <SEP> Cellibiose <SEP> # <SEP> rapide
<tb> Trisaccharide <SEP> Raffinose <SEP> Polysaccharide <SEP> Amidon <SEP> soluble <SEP> Cellulose
<tb> Glucoside <SEP> Salicine <SEP> # <SEP> lente
<tb> Alcools <SEP> Glycérol <SEP> # <SEP> modérée
<tb> Mannitol <SEP> # <SEP> rapide
<tb> Dulcitol <SEP> Inositol <SEP> 

  SorbitolAcides <SEP> Citrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> # <SEP> lente
<tb> Lactate <SEP> de <SEP> " <SEP> # <SEP> "
<tb> Succinate <SEP> de <SEP> "
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> " <SEP> # <SEP> modérée
<tb> Tartrate <SEP> de <SEP> "
<tb> potassium
<tb> Témoin
<tb> 
 
Il doit être entendu que les tests ci-avant pour   l'utilisation   de sources d'énergie sont mis en oeuvre sous des conditions spéciales de croissance, et que la carence des actinomycete à utiliser certaines sources d'énergie sous les   conditions   de test n'exclut pas leur .utilisation sous des conditions différentes. (* T.G Pridham et D.   Gottliebo   The Utility of   arbon   Compounds By some Actinomycetales as an Aid to S e s Determination J. Bacteriology 56,107-114,1948). 



   La présence et la concentration de l'antibiotique de la présente invention dans des liqueurs de fermentation et dans d'autres solutions sont déterminées par l'une quelconque des quatre méthodes : (1) la technique de la dilution d'agar avec le Bacillus subitlis comme organisme de test 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 
 EMI5.1 
 préféré e (2 ) l'essai ou la détermination périodique de dilution du bouillon avec de préférence le S treotococous pyoe:

  enes ou le BacilLu .2 subtilig comme organisme de test(3) la détermination ou l'essai   opacimétrique,   et (4) 1' essai du disque de papiero 
 EMI5.2 
 Processus de l'essai de diluton de bouillon L'organisme de test(inpoulum) est d'abord préparé en faisant 
 EMI5.3 
 cioftre l'organisme d'essai désiré, choisi dans le groupe comprenant le Bacillus subtilis ATCC 10707, le Streotococcus faecalis ATCC 1.05.1 , et le Streptococcus Dyoe:

  enes ATCC 9342 Les organismes Baçillus subtilis et Streptocoocus faecalis sont développés dans un milieu d'essai comprenant une base de bouillon Difco ToBo contenant 5& en volumes de glycérol,et l' organisme Streptococcuenes est développé dans un bouillon Difco Tryptose-Phosphateo 
Dans plusieurs tubes de test, on place 5 ml du milieu d'essai comprenant la base de bouillon   bifco   ToBo contenant % en poids de   glycé-   rolo Le milieu et les tubes d'essai sont stérilisés dans un autoclave pendant 15 minutes à une pression de 1,05 kg par centimètre carrée Dans chacun des tubes contenant les 5 ml de milieu d'essai, on ajoute une solution ayant différentes concentrations de la substance antibiotique de la présente invention,en dissolution dans de l'eau distillée stérile contenant environ ' 15% d'alcool méthylique.

   Une dilution appropriée de la solution antibiotique est ajoutée au premier tube de test contenant le milieu d'essai, et des dilutions périodiques (deux fois) sont ensuite réalisées dans les autres tubes, le volume de passage périodique étant rejeté après mélange dans le dernier tube de chaque série.

   Chacun des tubes est alors ensemencé de 0,1 ml d'une dilution 1/100 du second bouillon de culture de 24 heures de l'   inooulum   préparé de la manière décrite   ci-avent.   Les tubes sont soumis à 
 EMI5.4 
 agitation et à incubation pendant 48 heures à 37BC, et on les observe en vue de remarquer la croissance de l'organisme de test, après des incubations de 24 et 48 heureso La concentration inhibitrice minimum du composé antibio- 
 EMI5.5 
 tique, qui annihilera complètement la croisamae de l'organisme de test, est ensuite notéeo Praessus de l'essai de dilution d'pgar 
Des dilutions périodiques des échantillons contenant   l'antibio-   tique sont mélangées avec un agar nutritif ayant la composition suivante :

   
 EMI5.6 
 Cérélose 0 ,7, KH POt 0 , l 
Extrait de levure 0,1%   KHPO   0,3% 
Tryptone 0,3%
Extrait de boeuf 0,3%
Agar 2,0%
Eau de ville une quantité suffisante pour amener à 100% 
L'agar nutritif est versé dans des bottes de Pétri où on le laisse se solidifiero Ensuite, la plaque d'agar obtenue est ensemencée d'une culture de l'organisme de test, qui est susceptible d'attaque, en faisant passer à la surface de l'agar durci dans chaque boîte, un dispositif d'application garni de coton stérile, qui a été plongé dans une suspension contenant 
 EMI5.7 
 100000000 de spores par ml de Bacillus subtilis ATCC 10707 (Ill1nois)o Chaque boite est alor incubée à 37 C pendant 24 heures, et ensuite observée pour déterminer le degré de croissance de l'organisme.

   La plus grande dilu- tion du milieu de culture, qui provoque un arret total de la croissance de   l'organisme   de test, est déterminée,en unités arbitraires de dilution d' agar par ml, en observant la plus grande dilution de l'antibiotique à laquelle il n'y a pas de croissance de l'organisme de   testo   
 EMI5.8 
 Processus de l'essai opaciz#triaue 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 
Le processus de l'essai   opacimétrique,   employé avec l'antibiotique de la présente invention, correspond au processus qui a été utilisé avec 
 EMI6.1 
 d'autres antibiotiques et suit les principes décrits par D.À.Joslyn et H. 



  Galbraith dans le Journal of Baeteriolosv. 59 . 711-6 (1950). Pour cet essai, on emploie comme organisme de test le Staphylococcus aureus, souche 314M. 



  Le milieu d'essai est constitué par :   Cérélose   0,1%
Peptone 1,0% 
 EMI6.2 
 NAOL z 
Extrait de levure 0,1%
Extrait de-boeuf 0,3%
Eau distillée une quantité   suffite   pour amener à 100%
Des dilutions des échantillons , standards et d'essai sont réalisées dans de l'eau distillée stérileo   'incubation   est réalisée à 37 C pendant trois heures et demi,après quoi on mesure   l'opacité   par un   néphélomètre   
 EMI6.3 
 photoélectriqueo La courbe standard va de 4 à. 32 unités de dilution d'agar Bac11lus subtiis par millilitre. 



   Processus de l'essai au disque de   papier   
Le processus de l'essai au disque de papier, employé avec le présent antibiotique,   correspond   au processus décrit par T.H Loo, PoS. 
 EMI6.4 
 



  Skell, HoHoThomberry, Jo Ehrlich; Jo3oIecGuire, GoMo Savage, et JoCoSylvester dans le Journal of Baeteriolopy. 50. 701 (1945). Lorsqu'on soumet à essai les milieux de fermentation de la présente invention, la bière centrifugée est placée sur les disques de papier et est alors manipulée, d' une façon générale, de la même manière que la matière contenant de la strep-   tomycine,  dont il est question dans l'article de revue ci-avant.

   On a trouvé désirable, cependant, dans la préparation des échantillons standards et dressai, d'employer une solution un peu plus concentrée de   l'antibioti-   queo   C'est   ainsi que l'échantillon standard est, de préférence, dilué dans 
 EMI6.5 
 un tampon (1) de phosphate de il 8 jusqu'à 400 unités/ml, àp0 unités/ml, 100 unités/mlr 40 unités/ml, lesdites unités étant des unités de dilution d'agar Bac..3.lus subtiJ.,:s (UoDoAo);

   et l'échantillon d'essai est dilué dans un tampon (1%) de phosphate de il 8 jusqu'à environ 150   UDA/mlo   Après que les échantillons d'essai ont été transformés en plaques,   celles-ci   sont réfrigérées pendant deux heures et ensuite soumises à incubation pendant 
 EMI6.6 
 une nuit à 30 Co Ensuite les dimensions de zone sont lues en min, et 1' inclinaison standard est déterminée de la manière habituelleo
Le nouvel antibiotique de la présente invention est préparé en 
 EMI6.7 
 cultivant une source de l'espèce ar " a par voie aérobique, de préférence en fermentation profonde, dans un milieu nutritif contenant une source de carbone, une source convenable d'azote, et des traces nécessaires de minéraux 
Comme source de carbone, on peut utiliser des sucres, tels que dextrose fructose, et   cellibiose,

     ou d'autres substances carbohydratées, telles que alcools de sucre, notamment mannitol, glycérol, etco et des huiles végétales et également de l'oléineo 
Des sources convenables d'azote pour le procédé de fermentation sont constituées par une large variété de   substances,   notamment les farines végétales et animales, telles que la farine de soya, des; extraits de farine, et diverses autres substances azotées d'origine végétale ou animaleo Une liqueur infusée de   froment .qui'.contient   une large variété de substances essentielles de croissance, à la fois organiques et inorganiques, 
 EMI6.8 
 peut être ajoutée" aux milieux de fermentation. 



   Un milieu de peptone-mélasses est également intéressant à la fois dans la fermentation avec agitation de flacon et dans la fermentation à culture submergée, 
L a température préférée du procédé de fermentation est compri- 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 se entre environ 24 et 28 C bien que des températures aussi basses   qu'   environ 22 C et aussi élevées qu'environ 32 C puissent être utiliséeso Les productions manima peuvent être obtenues en.

   environ 4 jours de fermentation sous des conditions optima de température et d'aération, telles que décri- teso 
EXEMPLE I 
Un plan d'agar d'un agar de farine d'avoine est préparé en traitant à la vapeur 30 gr d'avoine moulue pendant 30 minutes dans un li- tre d'eau de ville après quoi la matière est filtrée à travers une étamine et 2% d'agar sont ajoutés pour former un milieu   solide   on ensemence ensui- te avec un ;échantillon d'une charge de sol du nouvel antibiotique de la présente invention, souche Nocardia NA3-TE19.

   Le plan est soumis à incuba- tion à 28  pendant 4 à 7 jourso De l'eau distillée stérile est ajoutée au plan et la croissance de surface est enlevée en grattant avec un anneau d'inoculation   stérileo   
Des flacons standards   d'Erlenmeyer   de 500 ml, contenant 125 ml du milieu suivant 
Avoine moulue 20 gr
Dextrine 10 gr   Cérélose   5 gr
NaCL 5 gr
CaCO3 5   gr   
KH2PO4 1 gr 
NH4NO3   5 gr   
Eau de ville 1 litre sont stérilisés à 121 C pendant 30 minutes sous une pression de vapeur et sont ensemencés avec la croissance de surface provenant du plan d'agar stérile ci-avant,, Les flacons sont soumis à incubation sur une machine rotative d'agitation à secousses, opérant à 240 tours par minute, avec un rayon excentrique de 5,7 cm,

   à une température de 28 C pendant une période de 48   heureso   Quatre % en volumes de la croissance provenant des flacons   d'Erlenmeyer   sont utilisés pour ensemencer deux flacons supplémentaires contenant le même milieu de fermentât!on  Ces flacons nouvellement ensemencés sont soumis à incubation pendant 48 heures à 28 C sous les mêmes conditions de rotationo A la fin de la période de croissance de   48   heures, l'inoculum est facile à transférer au milieu de production. 



   Ensuite, des flacons contenant le milieu de croissance suivants 
Cérélose 10 gr
Mélasses 20 gr
Peptone 5 gr
Eau de ville 1 litre sont ensemencés avec 4% en volumes de la croissance contenue dans la dernière paire de flacons   d'Erlenmsyer   et son soumis à incubation de la même manière que les flacons d'Erlenmeyer oi-avanto Après 4 jours d'incubation sur la machine rotative d'agitation à secousses9 la croissance est récoltée et la masse de bière est utilisée comme source de la nouvelle substance antibiotique de la présente   inventiono   Des essais sont réalisés par la technique de dilution d'agar Bacillus subtilis et indiquent une moyenne d'environ 80 à 320 UDA par mlo 
EXEMPLE II 
Un appareil de fermentation de 30 litres, contenant un milieu de fermentation ayant la composition suivante :

     Cérélose   jo gr
Mélasses 20 gr
Peptone 5 gr
Eau de ville 1 litre 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 
 EMI8.1 
 qui a été stérilisé à la vapeur à 3219C pendant une heure, est ensemencé avec 300 m1o (25% en volumes) de la souche N ocardi a4 NA3 TEIg , culture déve- loppée dans les flacons soumis à agitation, de la manière décrite à l'exem- 
 EMI8.2 
 ple 10 La fermentation est réalisée à oc avec une vitesse d'aération de 0,8 litre d'air par litre de milieu par minutée L'agitation est réalisée au moyen d'une roue à 4 aubes de   20,3   cm de diamètre qui opère à 480 tours par minutée De l'oléine,contenant 2,5%   d'octadécanol.,   est utilisée pour régler la production de mousseo On récolte dans, les appareils de fermenta- 
 EMI8.3 
 tilon après quatre jours, et la bière,

   lorsqu'elle est soumise à essai, par la méthode d'essai avec disque en papier, décrite ci-avant, montre des productions comprises entre environ 250 et 500 unités de dilution d'agar   Bacil-   lus subtilis par ml. 



   Le processus de récupération suivi comprend l'absorption de 1' antibiotique sur une élution de carbone de celui-ci avec de   l'atone   aqueu- 
 EMI8.4 
 se acidifiée chaude, l'enlèlvemant du solvant et la concentration des solides par évaporation la précipitation des impuretés avec du méthanol, l'évaporation jusqu'à siccité, l'extraction répétée des solides du méthanol chaud, l'extraction avec   50%   de glycérol dans du méthanol, et la précipitation du produit bactéricide avec du méthanol°   EXEMPLE III   
La nouvelle matière antibiotique est récupérée de la bière de fermentation, produite à l'exemple II, en   traitant   la bière qui a été fil- 
 EMI8.5 
 trée pour en enlever les particules solides, avec 1% de Darco G-60, qui est une matière carbonée absorbante commerciale,

   qui adsorbe plus de 95$ de la matière active de   le(   bièreo Le carbone est recueilli par filtration. avec 
 EMI8.6 
 de l'Hyflo Super-Cello Le gâteau de'filtre est lavé à l'eau et élué avec de l'acétone, aqueuse à z, chaude, acidifiée jusqu'au pH 3 environo Environ 30% de l'acitivité sont élués par un volume de solvant égale au six. semez en volumes de la bière du filtre.

   Une triple répétition de l'élution réoupà- re une nouvelle   fois 30%.     Les  fractions   d'éluat   sont combinées, neutralisées, et évaporées à pression réduite pour enlever l'acétoneo L'évaporation est poursuivie jusqu'à ce qu'un volume final d'environ 5% du volume de la bière soit   obtenuo   Un volume égal de méthanol est ajouté et un pricipité inactif est enlevé par   filtrationo   Le liquide de filtration est évaporé jusqu'à siccité, et le résidu est extrait de manière répétée avec du méthanol absolu chaud jusqu'à ce que la dernière portion de celui-ci ne soit que légère-   ment   colorée.

   La matière pcudreuse brune restante est alors extraite avec 505 de glycérine dans du méthanol, qui est centrifugé pour enlever les solides inactifs. la substance active est alors précipitée par l'addition d'un quintuple volume de méthanolo Le précipité est refroidi par centrifugation, 
 EMI8.7 
 lavage au mét4noly et séchage pour produire une poudre de couleur gris-tano Le produit impur titre environ 250 UDA Bacillus subtilis par mgr. 



   EXEMPLE IV Un appareil de fermentation de 30 litres, contenant un milieu de fermentation ayant la composition suivante
Farine de soya 10 gr   Cérélose   10 gr
NaCL 5 gr 
 EMI8.8 
 GAGO3 1 gr Oléine 5 ml Eau de ville 1 litre 
 EMI8.9 
 qui a été stérilisé à la vapeur à 121 G pendant une heure, est ensemencé avec 300 ml (2 ,5%  mTvolumes) de la souche o ardia N13 E19 , culture déve- loppée dans les flacons soumis à agitation, de la manière décrite dans l' exemple Io La fermentation est réalisée à 24 C avec une vitesse d'aération de 0,8 litre d'air par litre de milieu par minuteL'agitation est réalisée 
 EMI8.10 
 au moyen à'une roue à quatre aubes de 2 0 ,3 cm de diamètre,

   qui opère à 480 

 <Desc/Clms Page number 9> 

 
 EMI9.1 
 tours par minuteo De l'oléine contenant 2 5% d'octadéoanol est utilisée pour régler la production de mousse. On récolte dans les appareils de fer-   mentation   après 4 jours, et la bière, lorsqu'elle est soumise à essai par la méthode, décrite ci-avant, d'essai au disque de papier, montre des 
 EMI9.2 
 productions d'environ 500 à 1000 UDA Bacill,s ,sabt3.lis par mlo 
Le processus de récupération suivi comprend l'absorption de l'antibiotique sur une élution de carbone de celui-ci avec de l'acétone 
 EMI9.3 
 ueuse acidifiée chaude, l'enlèvebant du solvant et la concentration des solides par évaporation, la précipitation des impuretés avec du méthanol, l'évaporation jusqu'à siccité, l'extraction répétée des solides avec du méthanol chaud,

   l'extraction avec 50% de glycérol dans du méthanol, et la précipitation du produit bactéricide atec du méthanol, substantiellement comme spécifié à l'exemple III. 



   La matière de la présente invention est soluble dans l'eau, les acides dilués et les alcalis, en donnant une solution brune foncée, et insoluble dans les alcools méthylique et éthylique, l'acétone, l'éther le   dioxane,   le chloroforme, et l'acide acétique glaciale 
Des tests périodiques de sensibilité de dilution montrent que le nouvel antibiotique est efficace contre des souches de staphylocoques et de   streptocoques   qui   résistent   à la pénicilline, l'auréomycine, la ter- 
 EMI9.4 
 ramyoine, la streptomycine, l'érythromycine, ou la carbonycine. 



  Des tests de c1Vomatographie au papier étaient réalisés dans des cylindres graduésde   100-   ml par la technique de la bande ascendante, dans laquelle des bandes étaient suspendues dans le solvant développateur 
 EMI9.5 
 (irriguant) contenu au fond du cylindre, en engageant à frot##nt la ban- de entre le bouchon du cylindre en verre poli, et le goulot dudit cylindre. 



  Dans certains des systèmes solvants utilisée les bandes étaient équilibrées avec l'atmosphère du cylindre en les laissant pendre au-dessus de la surface du solvant pendant une certaine période avant de les abaisser dans le solvant. Tous les systèmes solvants fonctionnaient dans un incuba- 
 EMI9.6 
 teur à air maintenu à 280C.

   Des systèmes solvants ianscibles étaient admis à se séparer à 28ego L'organisa de test pour des bioautogr,phes était le Bacii1us subtilis 1TCG 10707, et le papier employé était une bande de 1,60 cm de Faton,-Dikeman 4, 5JJ 0 Système de  solvant 1   : n-Butanol saturé d'eau désionisée Equilibrage - 3 heures Durée de développement - 16 à 17   heureso   Vitesse de circulation = 0 Système de solvant II n- Butanol saturé   d'eau   désionisée 2,0% poids/volume d'acide paratoluènesulfonique ajoutés à la couche riche en   n-butanolo   Equilibrage - 3 heures Durée de développement - 16 à 17 heureso 
 EMI9.7 
 Vitesse de circulation =0 - oa359 0,!L6 (l'activité mineure 0 ,16 apparaît avec 500 mogi/bande)o système de solvant III :

   n-Butanol saturé d'eau désionisée 2,0%   poids/volume   d'acide   parat oluène sulfoni que   et 2,0% de pipéridine volo/volo ajoutésà la couche riche en butanol. 



    Equilibrage - 3   heures Durée de développement - 16 à 17 heures Vitesse de circulation = 0,L'activité mineure à la vitesse 
 EMI9.8 
 o,7 apparaît avec 500 mcgr/bandeo 

 <Desc/Clms Page number 10> 

 Système de solvant IV :   Méthylisobutyl   cétone saturée d'eau désionisée   Equilibrage   néant Durée de développement - 3 heures Vitesse de circulation = 0 Système de   solvant   V   Méthylisobutyl   cétone saturée d'eau à laquelle sont ajoutés 2,0% d'acide paratoluènesulfonique en   pods/volume   
 EMI10.1 
 Equilibrage néant Durée de' dévè7oppent m 3 heures Vitesse de circulation = 0 Systène de solvant VI Méthylisobutyl cétone saturée   d'eau   désionisée plus   2%   vol/vol.

   de pipéridineo   Equilibrage -   néant Durée de développement - 3 heures Vitesse de circulation = 0 
 EMI10.2 
 Svstème de solvant VII Eau désionisée saturée de méthylisobutyl cétone , Equilibrage - néant Durée de développement - 3 heures 
 EMI10.3 
 n.t.e.sSIL..4e 11 ation = 0 m 0,05, 0,80o Ces deux fracions ap- paraissent avec 500 mcgr/bande; la fraction lente apparaît avec moins de 100 mcgr/bande seulement. 



  Système de solvant VIII Eau désionisée saturée avec de la méthylisobutyl cétone avec addition de 1,0 %   poids/volo   d'acide   paratoluènesulfonique.   



  Equilibrage - néant Durée de développement - 3 heures 
 EMI10.4 
 Vitesse. de circulation = 0 ,68, 0,880 Deux fractions d'activite-.à; peu'près égale (diamètre de zone) à 500 mcgr/bandeo La fraction lente disparaît après application de moins de   pids   à la   bandeo   
 EMI10.5 
 S:.vstèz# de solvant IX Eau désionisée saturée de   méthylisobutyl   cétone à laquelle on ajoute 1,0% volo/volo de pipéridineo Equilibrage -néant Durée de développement - 3 heures Vitesse de circulation = environ 0 ,75 , 0,90 zones fondues. 



  Système de solvant X 3 parties d'eau désionisée, 1 partie d'un mélange de méthanol/ 
 EMI10.6 
 acétone, à 3/1 volo/volo Régler le il à 1D,5 avec NH40H, ensoi-ëe retour à pH   7 , 5   avec acide phosphorique. 



  Equilibrage - néant Durée de développement - 3 heures Vitesse de circulation = à 500 mcgr/bande, apparemment deux 
 EMI10.7 
 zones fondues avec des vitesses d'environ 0,75 et D,90o Lorsquon empleia moins de   100     mcgr/bande,   seule une zone à   0,90   apparaît. 



  Système de solvant XI   Méthanol$ 89   parties; eau désionisée, 20 parties volo/volo 
 EMI10.8 
 plus 1,5% de NaCL poids/volo ajoutés à; la solutibno Les bandes sont tamponnées avec une solution contenait 0,95 3 NagS04 et 0,05 ï NaHSO/,0   Equilibrage -   3 heures Durée de développement 16 à 17 heures Vitesse de circulation   = 0,16,   0,41 Deux zones ayant à peu près 
 EMI10.9 
 le même diamètre à 500 mcgrfbandeQ Avec moins de 100 mcgr/bande, 

 <Desc/Clms Page number 11> 

 la zone à 0.16 seule   apparaito   
Système de solyant XII :

   
80 parties   d'éthanol,   20 parties d'eau désionisée,  vola/vola   
On ajoute   1,5 %   de NaCL   poids/volo   à cette   solution,,   Les   bandes sont tamponnées avec une solution de 0,95 M Na2SO4 et 0,05 M NaHSO4 dans de l'eau désioniséeo   
Equilibrage - 3 heures 
Durée de développement - 16 à 17 heureso 
Vitesse de circulation =0,20. 



   Système de solvant AA 
Acétate d'amyle saturé de 0,1 M phosphate de potassium tampon   à 6,15 Le tampon est réalisé en partant de sels K2HPOet KH2PO4 dans de l'eau désionisée   
Equilibrage - 3 heures 
Durée de développement - 16 à 17 heures (une partie du solvant - passe au goulot du cylindre et s'évapore)o 
Vitesse de circulation =0 
Système de solvant MO 
40 ml de n-butanol, 10 ml de méthanol, 20 ml d'eau désionisée. 



   Mélanger ensemble et ajouter un excès de méthylorange (environ 
1,5 gr) et laisser au repos à 28 C 
Séparer du méthylorange non dissous. 



   Equilibrage - 3 heures 
Durée de développement - 16 à 17 heures 
Vitesse de   circulation =0,30 -0,34   et 0 Avec moins de 100 mogr/bande, seule l'activité à 0,30 et 0,34 apparaît aux bio- autographeso 
Les étudesde chromatographie au papier montrent que l'antibi- otique peut se distinguer de n'importe lequel des antibiotiques ou agents chimiothérapeutiques connuso De plus, le test de chromatographie au papier montre également que l'antibiotique de la présente invention est un membre d'une nouvelle famille d'agents chimiothérapeutiques, et il semble être plus qu'un composant et peut contenir jusqu'à 3 ou 4 membres du groupe. 



   Il doit être entendu que l'invention n'est pas limitée aux caractéristiques ci-avant mais que bien desvariantes ou modifications pourraient être prévues sans sortir du cadre du présent breveté 
REVENDICATIONS.

Claims

1, Procédé de production d'une substance chimiothérapeutique, qui est caractérisé par le développement ou la croissance d'une souche d'un organisme de Nocardia MAb- TE19 dans un milieu aqueux contenant un nutritif, sous des conditions aérobiques submergées, jusqu'à ce qu'une ac- tivité bactéricide importante soit communiquée à ladite solution, et en- suite la récupération de la substance chimiothérapeutiquey de cette solu- tiono 2Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu contenant un nutritif comprend une source de carbone assi- milable une source d'azote assimilable;

,et des traces de minéraux né ce s- saireso 3 Procédé suivant la revendication 2 caractérisé en ce que l'organisme de Nocardia NA3 - TE19 se développe dans ledit milieu à une température comprise entre 24 et 28 C 4 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu contenant le nutritif comprend du glucose, des mélasses, et une peptoneo <Desc/Clms Page number 12> 5 Procédé suivant la revendication 1, caractérise en ce que le milieu contenant le nutritif comprend du glucose,-de la farine de soya, et de l'oléineo 60 Procédé suivant la revendication 1 caractérisé en ce qu'on récupère ladite substance chimiothérapeutique en adsorbant ladite substance sur du carbone activé, et en éluant ensuite ladite substance avec un solvant organique aqueux acidifié,

et en isolant de celui-ci la substance chimiothé- EMI12.1 ,Wapeutiq1e solideo 7o Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend g la mise à évaporation du solvant organique aqueux acidifié con- EMI12.2 tenant la substance chimiothérapeutique pour enlever ledit solvant organique; l'addition deigthanol à la solution exempte de solvant organique, pour précipiter les impuretés que cette solution contient; l'évaporation, jusqu'à siccité, de la solution restante et l'extraction du résidu avec du méthanol absolu, chaud, ensuite, l'extraction de la matière pulvérulente restante avec 50% de glycérine dans du méthanol,et la récupération de la EMI12.3 substance chiniothérapeutique active par précipitation avec du méthanol, filtration et séchageo 8.

Procédé de promotion d'une substance chimiothérapeutique, substantiellement comme décrit ci-avant.

9. Profits obtenus grâce au procédé ci-avant.

10.Une substance efficace pour l'inhibition ou l'empêchement de la croissance ou développement d'organismes pathogènes qui prent le gram choisie dans le groupe de substances qui sont solubles dans l'eau., les acides dilués, et les alcalis dilués, et insolubles dans l'alcool méthyli- que, l'alcool éthylique, l'éther, le dioxane, le chloroforme, et l'acide acétique glaciale et qui, lorsqu'elle est soumise aux tests de chromatp- graphie courants au papier, comprend une fraction majeure qui ne montre pas de vitesse de circulation significative avec des systèmes de solvants comprenant le n-butanol saturé d'eau désionisée, le n-butanol saturé d'eau EMI12.4 désionisée contenant 2 ,0$ poi ds/vol8 ) d'acide paratoluène sulf onique ,

le n-butanol saturé d'eau désionisée contenant 2YO%(poids/vol.) d'acide para- toluènesulfonique et 2% (volo/volo) de pipéridine, de la méthylisobutyl cétone saturée d'eau désionisée,de la méthylisobutyl cétone saturée d'eau EMI12.5 désionisée contenant 2 ,0$(poids/volo ) d'acide paratoluënesuif onique, de la méthylisobutyl cétone saturée d'eau désionisée contenant 2% (volo/vol) EMI12.6 de pipéridine, de l'eau désionisée saturée de thyli sqbutyl cétone, et de l'acétate d'amyle saturée de 0,01 hi solution de HPO et de KE F0 dans de l'eau désionisée, ayant un pH de 6,I5 ; et q3i montre des vitesses de circulations de 0/ 0 05 et 0'80 dans le système de solvant consistant en eau désionisée saturée de méthylisobutyl cétone;

de 0,68 et 0,88 dans le système de solvant consistant en eau désionisée saturée de méthhylisobutyl cétone avec 1% (poids/volume) d'acide paratoluènesulfonique; de 0,75 et 0,90 avec des zones se fondant, dans le système de solvant consis- EMI12.7 tant en eau. désionisée saturée de aofthylisoboe%12aétonj - à- laquelle on ajoute 1% (volo/volo) de pipéridine; de 0 ,75 et 0 ,90 avec des zones se fondant, dans le système de solvant consistant en 3 parties d'eau désionisée pour 1 partie d'un mélange de 3 parties de méthanol pour 1 partie d'acétone (volo/volo ) , qu'on a d'abord réglé à un pH de 10,5 avec de 1' ammoniaque, et-ensuite réglé au il de 7,5 avec de l'acide phosphorique;

de 0,16 et 0,41 dans un système de solvant consistant en 80 parties de méthanol pour 20 parties d'eau désionisée (volo/volo) contenant 1,5% (poids/ volo ) de chlorure de sodium, dans lequel des bandes sont tamponnées avec une solution contenant 0,95 M sulfate de sodium et 0,05 M sulfate acide de sodium dans de l'eau désionisée; de 0,30,0,34 et 0 dans un système de EMI12.8 solvant comprenant 40 ml de n=butanpl, 10 ml d'alcool alcoolique, et 20 ml d'eau désionisée, mélangés ensemble et contenant du méthylorange;

et une vitesse de circulation de 0,20 dans le système de solvant qui consiste en 80 parties d'alcool éthylique et 20 parties d'eau désionisée (vol./ <Desc/Clms Page number 13> volo ) avec 1,5% (poids/voie) de chlorure de sodium, dans lequel les bandes sont tamponnées avec une solution de 0,95 K sulfate de sodium et 0,05 M sulfate acide de sodium dans de l'eau désionisée; et les sels de cette sub- stance. llo Une substance chimiothérapeutique substantiellement telle que décrite ci-avant.