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Procédé de séparation et de purification de la pénicilline G.
La présente invention se rapporte à la séparation et à la purification de: la pénicilline G dans un mélange de' diffé.- rentes espèces de pénicillines.. Plus particulièrement, elle concerne la préparation de nouveaux dérivés de la pénicilline G, qui en permettent la séparation aisée.
Conformément à la présente invention, on fait réagir u- ne solution d'acide pénicillique dans un solvant organique: a- vec une solution d'amine tertiaire hétérocyclique dans un sol- vant organique, pour former un nouveau sel aminé.- tertiaire hé- térocyclique de pénicilline G. Ce sel intermédiaire! est alors traité, avec un hydroxyde formant alcali dans un solvant orga- nique aqueux, et le sel alcalin correspondant de pénicilline
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G est recueilli à partir de la phase aqueuse.
Il a. été établi avec une certitude raisonable que la pénicilline G, que l'on dénomme parfois "pénicilline benzyl" a la. formule structurale suivante:
EMI2.1
dans laquelle R représente le groupe benzyl (-CH -CE).
2 6 5 D'autre espèces de pénicilline sont de structure similaire, différant uniquement par le remplacement du groupe benzyl par d'autres radicawc organiques monovalents, généralement des ra- dicaux ayant 5 atomes de carbone, ou davantage. Les pénicilli- nes suivantes ont été identifiées:la pénicilline F, dans
EMI2.2
laquelle R est 2 -pentenyï (-CH 2 -CII=CH-CF 2 -CH 3 ); la dihy- dropénicilline F, dans laquelle R est n-amyle;
la pénicil- line X, dans laquelle R est n-hydroxyle benzyle,et la péni- cilline K, dans laquelle R est n-heptyle. Bien que le rem- placement dans la formule précédente, de R par des radicaux hydrocarbones saturés ou non donne des produits ayant l'acti- vité de la pénicilline, on a découvert que la pénicilline G est plus efficace, en thérapeutique, que certaines des autres espèces.
La pénicilline est produite industriellement sous forme de mélange de ces différentes espèces, contenant des pigments et des matières étrangères. Puisque la pénicilline G est l'une des espèces les plus actives, il est désirable de pouvoir - la séparer des espèces moins actives, de même que des impuretés.
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Conformément à un procédé de séparer la pénicilline G, @ décrit dans un rapport soumis par la "Heyden Chemical Corpo- @ ration" au O.S.R.D. ( O.S.R.D. N ). H-II 5-22-44 et O.S.R.D.
N H-III 6-15-44), une solution de triéthylamine dans de l'é- ther fut ajoutée à une solution de pénicilline brute dans de l'éther, et l'on effectua une précipitation des impuretés. A- près une nouvelle addition d'une solution de triéthylamine et d'éther à la solution de pénicilline, il se forma un mélange d'huile et de cristaux. L'éther fut décanté des cristaux, et les cristaux blancs de pénicilline triétylaminée furent lavés @ à l'acétone. Un procédé permettant la conversion du sel de pé- ninilline triéthylaminée fut développé. Il consistait en la dissolution du sel de triéthylamine dans l'eau, l'acidification, l'extraction à l'aide d'éther, puis de nouveau à l'eau, par additions successives de petites quantités de soude caustique.
Ce mélange fut ensuite congelée séché sous vide et recristalli- sé à partir de butanol et d'eau. Le procédé ci-dessus ne per- met cependant pas d'extraire de fortes proportions de pénicil- line. G, et n'est donc pas économique pour la fabrication.
Un but de la présente invention est de créer un procédé permettant d'isoler at de purifier la pénicilline G à partir d'un mélange; ce procédé pouvant être conduit très rapidement et n'entraînant que des pertes insignifiantes de pénicilline.
Considéré sous certains de ses aspects les plus généraux, le procédé conforme à la présente invention comporte le traite- ment d'une solution diacide pénicillique dans un solvant orga- niqua à l'aide d'une solution dans un solvant organique d'une amine hétérocyclique N-substituée (c'est-à-dire à laquelle on a substitué, en position N, un certain radical) de manière à former le sel aminé tertiaire de pénicilline G, à recueillir ce dernier produit, à le dissoudre dans un mélange aqueux orga-
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nique, à faire réagir ce dernier mélange avec un hydroxyde for- mant alcali et à recueillir le sel alcalin correspondant de pénicilline G dans la phase aqueuse.
Les solutions de pénicilline G pouvant être traitées par le procédé de la présente invention peuvent résulter d'opé- rations préliminaires de séparation, ou peuvent être préparées en dissolvant un sel de pénicilline dans l'eau, en l'acidifiant et en 1''extrayant par un solvant organique non miscible.
N'importe quelle solution de solvant organique peut être utilisée comme milieu de mise en solution du sel formé, dans la mise en pratique de l'invention, pourvu que le sel aminé hétérocyclique N-substitué de pénicilline G y soit insoluble.
On préfère l'acétate d'amyle, l'éther, ou un mélange d'acétate d'amyle et d'acétone.
Des examples d'amines hétérocycliques N-substituées convenant pour la présente invention sont l' N-méthylpiperidine, l' N-éthylpipéridine, l' N-méthylmorpholine et l' N-éthylmor- pholine.
Par le terme hydroxyde "formant alcali" tel qu'on l'u- tilise ici, on entend tout hydroxyde de métaux alcalins ou al- calino-terreux.
Conformément à une des réalisations préférables de la. présente invention, de la pénicilline sodique constituée par un mélange de pénicillines de différentes espèces avec des pig- ments et des matières étrangères, est dissoûte dans l'eau, et la solution est diluée à l'a.ide d'acétate d'amyle. On fait réa- gir le mélange avec une quantité suffisante d'acide phosphorique, @@ manière à amener le pH de la solution aux@environs de 2,7.
Il est à remarquer que cette réaction ainsi que les suivantes sont effectuées à environ 0 C, de manière à éviter la décompo- sition de la pénicilline. La pénicilline sodique est ainsi con-
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vertie en acide pénicillique libre, et est extraite dans l'acé- tate d'amyle. Les liquides non miscibles sont séparés, et la @ couche aqueuse est traitée avec de l'acétate d'amyle et de l'a- cide phosphorique supplémentaires, dans le but de récupérer tou- te la pénicilline active qui aurait pu rester dans le mélange aqueux. Les portions d'acétate d'amyle contenant la pénicilline sont alors combinées, lavées et séchées avec du sulfate de soude anhydre, et la solution est diluée dans de l'acétone.
On fait alors réagir le mélange d'acétate d'amyle et d'acétone, conte- nant la pénicilline acide avec de l' N-éthylpipéridine dissoûte dans de l'acétone.
Le mélange est agité pendant une heure environ, après quoi la cristallisation du sel N-éthylpipéridique de pénicilline est complète. Les cristaux jaune pâle sont recueillis égouttés et finalement séchés sous vide à 25 C.
L' N-éthylpipéridine est essentiellement un précipitant quantitatif pour la: pénicilline G. En général, le sel N-éthyl- pipéridique de pénicilline G obtenu conformément à la présente invention est essentiellement pur ; il contient toutefois des quantités faibles, mais variables, de pigments, selon la pureté de la matière de départ* Plusieurs procédés permettant la puri- fication finale du sel N-éthylpipéridique de pénicilline ont été développés. Conformément à l'un de ces procédés, du sel brut N-éthylpipéridique de pénicilline G est cristallisé avec une solution d'acétone et de chloroforme. Ceci s'accomplit en dissol- vant d'abord le sel dans du chloroforme.
La solution ainsi for- mée est alors traitée à 1.'aide d'une solution aqueuse de chloru- re de sodium, grâce à laquelle la plupart des impuretés sont extraites, avec une perte insignifiante de pénicilline dans la .couche aqueuse. Les couches sont alors séparées et la solution de chloroforme est concentrée jusqu'à un faible volume. La solu-
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tion concentrée dans du chloroforme de sel N- éthylpipéridique de pénicilline G est alors traitée avec de l'acétone, et on a- bandonne le mélange pendant une heure environ, pour permettre la précipitation du sel N-éthylpipéridique de pénicilline G.
Une autre méthode pour obtenir la cristallisation du sel brut N-éthylpipéridique de pénicilline G comporte le trai- tement d'une solution du sel dans le chloroforme à l'aide d'u- ne solution de chlorure de sodium. La solution de chloroforme et les solutions aqueuses sont séparées, et.la. solution de chlo- rure de sodium est traitée au butanol. Le chloroforme est éli- miné par évaporation, et le sel N-éthylpipéridique est préci- pité du b@@tanol.
Il est également possible d'effectuer cette réaction en supprimant le traitement préalable par le chlorure de sodium.
Généralement le procédé venant d'être décrit suffit. Si toutefois une purification plus poussée est nécessaire, on peut alors recristalliser le sel N-éthylpipéridique de pénicilline G en le recristallisant et en le dissolvant dans du chloroforme, en concentrant la solution jusqu'à un volume très réduit et en diluant avec de l'acétone.
La conversion du sel N-éthylpipéridique de pénicilline G en pénicilline sodique G ou en pénicilline calcique G est accomplie en dissolvant le sel N-éthylpipéridique dans l'eau et en ajoutant de l'acétate d'amyle. Une quantité suffisante de soude ou de potasse caustique diluée est ajoutée au mélange ci-dessus, pour amener le pH de la solution aux environs de 6,5.
La base est ajoutée peu à peu, de manière à ce que la tempéra- ture de la réaction ne dépasse pas 3 C. De cette façon, la pénicilline G sodique ou calcique est extraite dans la couche aqueuse, et l'N-éthylpipéridine est extraite dans l'acétate d'amyle. Les deux couches sont alors séparées. La couche aqueuse
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est lavée à l'acétate d'amyle. La pénicilline sodique amorphe @ est extraite de la. solution aqueuse par congélation de celle- @ ci et séchage sous vide. Un produit essentiellement pur est obtenu. L'N-éthylpipéridine est soluble dans l'acétate d'amyle, et peut être récupérée dans la couche d'acétate d'amyle..
La pénicilline 6: amorphe ainsi obtenue peut être cris- tallisée en agitant le produit avec du butanol, jusque obte- ni@ la dissolution. La cristallisation commence alors presque instantanément.
Il a été découvert que dans le cas ou une pénicilline d'activité très faible, de l'ordre de 200 à 400 U/mg et de très mauvaise couleur est utilisée comme matière de départ, il est préférable de pratiquer un traitement préliminaire à la pyridi- .ne-. Ce procédé comporte une dilution à l'éther de la solution aqueuse de pénicilline de faible activité, l'ajustement du pH de la réaction à 2,5 environ, et le traitement de la solution d'éther à l'aide de pyridine. Les impuretés, sont extraites par la pyridine, et la couche huileuse d'impuretés est éliminée.
On fait alors réagir la solution purifiée d'éther et de péni- cilline avec une solution d'amine hétérocyclique N- substituée dans l'éther' pour précipiter le sel aminé hétérocyclique N- ,substitué de pénicilline G.
Les exemples suivants illustrent une méthode de mise en pratique de l'invention; il est bien évident que ces exemples sont donnés uniquement dans un but illustratif, et qu'ils ne constituent aucune limitation.
Exemple 1.
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Une solution de 25,0 gr. de pénicilline sodique clinique @ (activité, 950 U/mg.), déssoûte dans 120 cc. d'eau distillée est refroidie à 0 C. dans. un bac de glace, tout en agitant, on
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dilue avec 120 ce. d'acétate d'amyle froid. Le pH de la solution agitée froide (OOC) est amené à 2,7, par addition d'une solution de 6,0 ce. d'acide phosphorique à 85% dans 44cc. d'eau. Le mé- lange est séparé, et la couche aqueuse est traitée avec 25 cc. d'acétate d'amyle froid., et une solution d'acide phosphorique en quantité suffisante pour amener le pH de la solution à 2,5.
Il est nécessaire de garder froides en permanence la solution d'acétate d'amyle et la couche aqueuse, pour empêcher la dé- composition de la pénicilline. Les couches sont séparées, et l'acétate d'amyle est combiné avec l'extrait initial. L'extrac- tion est répétée, par une addition supplémentaite de 25cc. d' a- cétate d'amyle. Les extraits résultants sont lavés avec 25cc. d'eau distillée froide, et séchés en les secouant avec une quan- tité suffisante de sulfate de soude anhydre (10 à 15 gr.) pour obtenir une solution claire. Le sulfate de soude est éliminé par filtration, et lavé sur le filtre par 10 cc. d'acétate d'a- myle froid.
L'essai biologique des solutions aqueuses obtenues après l'extraction et le lavage ne révèlent aucune activité no- table de pénicilline.
On ajoute alors 140 cc. d'acétone froid à la solution froide d'acétate d'amyle contenant de l'acide pénicillique.
A cette solution froide,agitée., on ajoute une solution froide de 8,0 gr. d'N-éthylpipéridine, dans 40 cc. d'acétone, et on amène le pH de la solution à 7 à l'aide de papier réactif. Le mélange est agité pendant une heure, au bout de laquelle la cristallisation du sel granulé N-éthylpipéridique de pénicilli- ne G est complète. Dans le but de faciliter la cristallisation, on ajoute des germes de sel N-éthylpipéridique de pénicilline G à la solution, après y avoir ajouté 20% de solution de N-é- thylpipéridine. La solution est filtrée, et les cristaux sont rincés avec 25 cc. d'acétone, filtrés et rincés à nouveau avec 25 ce. d'acétone.
Le produit cristallin est alors aspiré pendant
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1 heure sous un caoutchouc, et finalement séché, sous vide, à 25 C. On obtient de cette manière 15,95 gr. d'un produit gra- @ nulaire jaune pâle présentant un angle de rotation optique ([alpha]) D @ 25 - 227 (mesuré en solution à 1/2 % dans 1'eau;.) et une acti- vité de 1327 Umg. ce qui représente un rendement de 89,2% en activité. L'N- éthylpipéridine est essentiellement un@précipi- tant quantitatif pour la pénicilline G, pour les préparations chimiques ayant une concentration élevée en pénicilline G.
Le rendement en activité, à ce point, varie selon la préparati- on, il dépend. du contenu en pénicilline G. Dans le cas présent, le contenu en pénicilline G de la matière de départ avait été déterminé par d'autres méthodes comme étant voisin de 90%. La cristallisation du sel brut N-éthylpipéridique de pénicilline ; G implique la.dissolution de 20,0 gr. de sel brut dans 85 cc. de chloroforme. La solution colorée en jaune est extraite une première fois avec 1 x 9 cc. puis avec 1 x 5 cc. de solution saturée de chlorure de sodium. La. plupart de la coloration est ainsi extraite par les courbes aqueuses. Les différents extraits aqueux mélangés sont lavés deux fois dans 10 ce. de chloroforme, et le chloroforme presqu'incolore obtenu est alors combiné avec la. solution principale de chloroforme.
La solution de chloroforme est séchée sur 5 à 10 gr. de sulfate de soude anhydre-, puis filtrée et concentrée sous vi- de jusque un volume d'environ 40 cc. Le mélange est dilué a- vec 100 cc. d'acétone, et refroidi à 0 C. pendant une heure, pendant laquelle se-,produit la précipitation du sel N-éthyl- pipéridique de pénicilline G. Les cristaux sont séparés de la solution par filtration, rincés deux fois avec un volume d'a- cétone minimum, et séchés à 25 C. sous vide. Les. cristaux: ain- si obtenus ont un point de fusion de 156 à 157 C., avec dé- composition, et un angle de rotation optique ([alpha]) D = 239 me-
25 suré en solution à 1/2 % dans l'eau.
Une quantité-de 17,2 gr.
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de sel de pénicilline essentiellement pur fut retirée, ce qui représente un rendement de 86 %. Une seconde récolte est obte- nue en concentrant jusqu'à un volume de trois à quatre ce., et en diluant avec 30 cc. d'acétone. On obtient ainsi 0,43 gr. de cristaux désirés, ayant un angle de rotation optique ([alpha]) D -
25 - 239 , mesuré dans une solution à 1/2 %. Ceci représente-un ren- dement global de 88,15 %.
Une autre méthode de cristallisation du sel brut N-éthylpipé- ridique de pénicilline G comporte le traitement du sel par du chloroforme et du butanol. On dissout 100 gr. de sel brut N- éthylpipéridique de pénicilline G dans du chloroforme, on trai- te au charbon de bois activé et on dilue dans 500 cc. de bu- tanol. Le mélange est alors concentré sous vide, jusqu'à ce que tout le chloroforme ait été éliminé. Le sel N-éthylpipéri- dique de pénicilline G cristallise alors complètement pendant la concentration. Le mélange est refroidi à 0 C. pendant 40 minutes, filtré et lavé 3 fois successives avec 100 ce. de b utanol froid, puis deux fois avec 100 cc, d'acétone. Le pro- duit incolore obtenu est séché sous vide à 25 C.
Une seconde récolte est obtenue en concentrant sous vi- de jusqu'à environ 75 ec.9 correspondant à la saturation, en filtrant et en lavant à l'acétone et en séchant sous vide.
La première récolte donne 81,7 gr. du produit désiré, et la se- conde 7,8 gr. ce qui représente un rendement total de 89,5 %.
Les cristaux avaient un angle de rotation optique ([alpha]) D = 239 ,
25 .. mesuré dans une solution à 1/2 % dans l'eau, et avaient un point de fusion de 156 à 157 C., avec décomposition.
Le traitement d'une solution dans le chloroforme de sel N-éthylpipéridique de pénicilline G, comme décrit ci-dessus, @ suivi d'une dilution dans lebutanol et d'une concentration donne un produit incolore, avec un rendement de 83,6 %. Ces
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cristaux avaient un angle de rotation optique de ([alpha]) D = 239 ,
25 la mesure étant faite dans une solution à 1/2 % dans l'eau, et un point de fusion de 156 - 157 C., avec décomposition.
Le sel N-éthylpipéridique de pénicilline S'est généralement pur, à ce stade, et est essentiellement dépourvu de pigments. 11 est parfois nécessaire, cependant, avec des matières de départ de mauvaise qualité, d'effectuer une seconde recristallisation, dans le but d'éliminer les dernières traces de coloration. Ce- ci s'effectue comme suit:
On dissout dans environ 6 ce. de chloroforme 1 partie de sel N-éthylpipéridique de pénicilline- 6 tel qu'obtenu ci- dessus. La solution est concentrée sous vide jusqu'à un volume de 8 ce. environ, et-diluée avec 18 ce. d'acétone. Le mélange est refroidi à 0 pendant une heure dans un bac à glace, pour précipiter le sel N-éthylpipéridique de pénicilline G.
Le mé- lange est ensuite filtré, et les cristaux sont rincés deux fois avec le moins possible d'acétone. Le produit incolore obtenu est séché à 25 C. sous vide. Un rendement de 96 % environ est obtenu.
Le sel N-éthylpipéridique de pénicilline G est converti en pénicilline sodique G pure en dissolvant 6,0 gr. de sel N- éthylpipéridique pur dans 35,8 cc. d'eau froide (exempte d'an- hydre de carbonique) et en recouvrant la couche aqueuse avec 67 cc. d'acétate d'amyle froid. Le mélange est agité à 0 C., et traité avec la,5 ce. d'une solution 0,9955 N de soude caus- tique (exempte de carbonate). La. base est ajoutée à une allure. telle que la température ne dépasse pas 3 C.
Les deux couches sont séparées) et. la. couche aqueuse est extraite deux fois, à l'aide de 35 cc. d'acétate d'amyle froid. La couche aqueuse, qui a un pH de 7, est congelée et séchée sous vide pour donner 4,78 gr. de pénicilline sodique incolore et essentiellement
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pure. Ceci représente théoriquement 100 % du rendement. Le pro- duit avait un angle de rotation optique ([alpha]) D = 292,5 , en me-
25 surant 100 mg. dans 25 cc. d'eau.
L'essai biologique montra une activité de 1652 U/mg. sur staphylocoque doré ( S. Aurens).
Si l'on utilise de la chaux éteinte (hydroxyde de cal- cium) à la.place de soude caustique (hydroxyde de sodium) on obtient de la pénicilline calcique pure.
Ce qui précède représente un rendement total de 76% en activité, pour la conversion de la pénicilline clinique en pé- nicilline sodique.
Analyse. : calculée pour C H N SO NA:
16 17 2 4
C, 53,93; H, 4,81; N, 7, 86. obtenue- : C, 54,08 H, 5,02; N, 7, 74.
L'N-éthylpipéridine est récupérée dans la cpuche d'acé- tate d'amyle en ajoutant de l'acide chlorhydrique 2,5 N à l'a- cé.tate d'amyle. Les couches sont séparées, et la couche aqueu- se est rendue alcaline avec 30 % de soude caustique. L'N-éthyl- pipéridine est séparée, séchée sur des boulettes de potasse caustique, et distillée à la pression atmosphérique.
La cristallisation de la pénicilline sodiue G obtenue ci-dessus est accomplie en agitant un mélange de 5,0 gr. du produit et de 15 cc. de butanol, jusqu'à ce que. la pénicilline sodique G se dissolve-,, puis cristallise de la solution.
Le mélange est refroidi à 0 C. pendant 5 heures, rincé deux fois avec un volume minimum d'acétone, et séché sous vide.
On obtient ainsi 4,66 de pénicilline sodique G cristalline.
Exemple 2.
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Deux litres. d'une solution aqueuse contenant de la péni- cilline à faible pouvoir actif (Inactivité de cette pénicilline-
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solide et sèche étant d'environ 300 V/mg) sont refroidis à @ 0 C, et secoués avec 120 ce. d'ether froid, exempt d'alcool.
Le pH de la solution est amené à 2,5 par l'addition goutte à goutte de 15 cc. d'acide phosphorique à 10%. La couche d'eau est extraite, en ajoutant 50cc. d'éther froid. On ajoute alors 5 ce. diacide phosphorique à 10%, pour amener le pH de la, solution à 2,2.Les couches sont séparées, et l'on extrait à nouveau l'eau avec 30cc. d'éther froid. Les deux extraits à l'éteher, mélangés, sont lavés deux fois dans 20cc@d'eau froi- de, séchés sur du sulfate de soude anhydre et filtrés.
10 cc. d'une solution à 10% de pyridine dans de l'éther sont ajoutés à La. solution d'éther obtenue ci-dessus, en agi- tant. Après une heure, les couhhes d'éther et d'huile sont sé- parées, et l'on décanté alors la couche d'éther.
La solution d'éther est refroidie à 0 C, et 30cc.d'une solution à 10% d'N-éthylpipéridine dans l'éther sont ajoutés par petites quantités à la fois, durant 4 heures. On laisse reposer la solution pendant 14 heures, puis l'éther s'étant séparé de la matière cristalline huileuse est décanté et re- cueilli. Le mélange huile-cristaux restant est agité avec 30 ce. d'acétone, et l'on ajoute 30cc.d'éther, jusqu'àce que l'on observe un trouble léger. On laisse alors reposer le mélange pendant douze heures, et on filtre. Les cristaux sont rincés avec 20 cc. d'acétone froid, lavés parfaitement sur le filtre avec de l'acétone froid, et séchés.
Ce produit est alors re- cristallisé en le dissolvant dans 20cc.de chloroforme à 50 C, en ajoutant80cc.d'acétone, en refroidissant durant 12 h, puis en filtrant, lavant et séchant. Ces cristaux de pénicilline G N-éthylpipéridique ont un point de fusion de 156-157 Ç avec décomposition, et un angle optique de rotation ([alpha]) D = @ 238 , lorsque 7 mg. sont mesurés dans 0,2 cc d'eau.
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Analyse: calculée, pour C23H33N3O4 S: C, 61.71; H, 7.43; N, 9.39. obtenue : C, 61.70; H, 7.36; N, 9.33.
Une seconde récolte de cristaux est obtenue en concen- trant la liqueur mère jusque 2cc. sous vide, à 25 C, et en ajoutant Icc. de chloroforme et 12cc. d'acétone. Le mélange est ensuite refroidi pendant 12 heures, filtré,lavé et séché.
Ces cristaux ont un point de fusion de 156-157 Ce Analyse. calculée, pour C H N O 'S:
23 33 3 4
C: 61,71; H: 7,43; N: 9,39 obtenue : C: 61,4'; H: 7,53 ; N: 9,47
30 gr. de sel N-éthylpipéridique de pénicàlline G sont dissoûts dans 10 cc. d'eau froide, et secoués avec 25 ce. de solution froide d'éther. On ajoute alors peu à peu en secouant, une solution froide d'acide phosphorique à 10 %, pour amener le pH de la solution à 2,5. Les couches sont séparées, et la couche d'eau est extraite avec 10 cc. d'éther; 0,3 cc. d'aci- de phosphorique à 10 % sont ajoutés pour amener le pH de la solution à 2,2.
Les extraits à l'éther sont combinés et lavés dans deux parties de 5 ce. d'eau froide., puis sont alors mélan- gés, neutralisés et mis à part. La solution d'éther est extrai- te dans 10 cc. d'eau froide, en ajoutant peu à peu 2,6 ce. de solution froide 2,5 N de soude caustique, pour obtenir un pH de 6,0. Les couches sont séparées, et l'éther est de nouveau ex- trait avec 5 cc. d'eau froide,à laquelle on ajàute 0,4 ce. d'une base, pour amener le pH à. 6,5. Une autre extraction de- 2,5 cc. est faite, avec un pH de 7,2. Les extraits sont com- binés, et le pH de la solution est amené à 6,2, à l'aide,de quelques gouttes supplémentaires d'une base.
La solution est alors congelée et séchée sous vide, pour obtenir de la pénicil-
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line sodique G amorphe.
Si l'on utilise de la chaux éteinte à la place de soudes caustique, on obtient de la.pénicilline calcique G pure.
Le produit amorphe obtenu ci-dessus est dissous dans 9,0 cc. de mélange acétone-eau à 85 %, filtré, puis additionné de 90 cc. d'acétone. La pénicilline' sodique G cristallise de la solution. La réaction continue pendant 12 heures. La solu- tion est ensuite filtrée, les cristaux lavées soigneusement à l'acétone et séchés. Le produit est cristallisé en le dissol- vant dans 9,5 cc. de butanol saturé d'eau. Cette solution est @ filtrée; on ajoute. 500 cc. de butanol au filtrat, et on laisse reposer la solution une nuit. Elle est ensuite filtrée, lavée à l'acétone et séchée.
La pénicilline.sodique obtenue avait un angle de rotation optique(OE) 25 = + 298 , la mesure étant fai- te dans l'ean, Analyse: calculée, pour C H N O SNa;
16 17 2 4
C, 53.93; H, 4.81; N, 7.86. obtenue : C, 53.74; H, 4.95; N, 7.93.
Les différentes fractions obtenues au cours de la. réac- tion peuvent être converties en pénicilline sodique clinique.
La récupération de ces fractions s'effectue. de la manière ha- bituelle.
Exemple 3.
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En procédant d'une manière. similaire à celle décrite dans l'exemple é, la pénicilline sodique est convertie en sel N-eméthylpipéridique de pénicilline G. De la pénicilline sodi- que. G (activité, environ 1000 U/mg.) est dissoute: dans Peau, en solution riche, puis acidifiée et extraite dans de l'éther.
La solution d'éther est refroidie, traitée à la. pyridine, et les. impuretés sont éliminées avec la couche- de pyridine. Une
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solution de N-méthylpipéridine dans de l'éther est ajoutée à la couche d'éther obtenue ci-dessus, et le sel N-méthylpipéri- dique de pénicilline G est extrait. Le produit est purifié de la manière décrite ci-dessus. L'N-méthylpipéridine ainsi obte- nue avait un point de fusion de 135 à 136 C., et un angle de rotation optique ([alpha]) 25 = + 244 ,10 mg. étant mesurés dans 0,2 cc. d'eau.
Exemple 4.
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Conformément à un procédé similaire à celui décrit dans l'exemple 2, de la pénicilline sodique est convertie en sel N-. éthylmorpholique de pénicilline G.
Une solution riche de pénicilline 62.000 U/ml.), est acidifiée et extraite dans l'éther. La solution d'éther est refroidie, traitée à la pyridine, et les impuretés sont élimi- nées avec la couche de pyridine. Une solution de N-éthylmor- pholine dans de l'éther est ajoutée à la couche d'éther obte- nue ci-dessus, et le sel N-éthylmorpholique de pénicilline G est extrait.
Le produit est purifié de la manière décrite ci-dessus.
Ces cristaux ont un point de fusion de 140-141 C., et un an- gle de rotation optique ([alpha]) 25 = + 258 , lorsque 10 mg. sont meD surés dans 0,2 cc. d'eau..
Analyse: calculée, pour C H N O S;
22 31 3 5
C, 58.77; H, 6.95; N, 9.34. obtenue : C, 58.78; H, 7.39; N, 9.30.
REVENDICATIONS.
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