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PERFECTIONNEMENTS AUX PREPARATIONS D'INSULINE.
La présente invention se rapporte à des perfectionnements apportés aux préparations d'insulineo
L'hormone pancréatique, l'insuline, qui est une hormone essentielle pour le métabolisme des hydrates de carbone chez les animaux et les êtres humains, constitue un agent thérapeutique important pour le traitement de l'affection dénommée diabetes mellitus dans laquelle il se produit un trouble du métabolisme des hydrates de carbone pouvant provenir d'un état dans lequel la sécrétion naturelle d'insuline par le pancréas est compromise.
Les symptômes de cette affection sont atténués en compensant le manque d'insuline sécrétée naturellement par l'injection de solutions d'insuline extraite du pancréas des animaux.
L'effet de l'injection d'une solution d'insuline pure administrée à un patient présentant les symptômes du diabetes mellitus est rapide' mais disparaît bientôt. Pour obtenir des préparations d'insuline ayant une durée d'action plus grande, et éviter ainsi de soumettre le patient à des injections fréquentes, on a combiné l'insuline à une protéine basique, protamine ou globine, par exemple, et on a constaté que la protamine- ou globine-insuline exerce sous cette forme combinée (qui peut aussi contenir du zinc) une action plus prolongée par injection. Le phénomène est dû au fait que la protamine- ou globine-insuline présente une solubilité relativement faible dans le plasma du sang et agit comme un réservoir ou un dépôt libérant lentement l'insuline assimilable dans la circulation.
A ces fins, la globine ou la protamine sont empruntées à des sources naturelles.
Vu l'importance de l'insuline comme agent thérapeutique, il est extrêmement désirable de fixer des critères exacts de la composition et de la pureté des préparations à usage pharmaceutique, ce qui ne va pas sans difficultés dans le cas de préparations contenant une protéine naturelle.
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parce que les protéines provenant de sources naturelles sont très différentes suivant l'état de l'organisme vivant dont elles sont extraites, le temps écoulé entre la mort et l'extraction de la protéine et le processus d'extrac- tion utilisé.
Un autre inconvénient des préparations protéine-insuline est qu'elles ne peuvent être mélangées avec de l'insuline soluble pour obtenir des préparations exerçant un effet régulier et certain.
Un but de la présente invention est de fournir des préparations d'insuline à action prolongée dans lesquelles ces inconvénients et d'autres des préparations de protéines naturelles et d'insuline sont réduits ou évités.
On a déjà décrit l'emploi en combinaison avec l'insuline de poly- peptides synthétiques comportant jusqu'à 4 restes amino-acides par molécule. Ces préparations n'ont cependant pas trouvé d'application en médecine.
On produit suivant la présente invention, comme préparations d'insuline à activité thérapeutique prolongée, des complexes d'insuline avec des polymères obtenus par voie synthétique de certains amino-acides ayant la structure basique d'un polypeptide et formés d'une chaîne de molécules d'amino-acides réunies par des liaisons peptide;ces polymères (appela ci-après polyamino-acides) contiennent au moins 8 restes amino-acides et, de préférence, 10 ou 15 ou davantage par molécule et sont des polymères d'ornithine ou de lysine, ou proviennent de la guanidisation de ces polymères et également des copolymères d'ornithine et de lysine, leurs produits de guanidisation et leurs copolymères l'un avec l'autre ou avec un autre amino-acide, choisi parmi la valine la phényl-alanine, la leucine, l'isoleucine et la glycine.
La poly-ornithina-, la poly-lysine et la poly-arginine conviennent particulièrement aux fins de la présente invention.
Les polyamino-acides peuvent être formas à partir de L-aminoacides existant, dans la nature ou à partir de leurs isomères optiques, les D-amino-acides ou à partir des DL-amino-acides racémiques obtenus par des procédés synthétiques. Les polyamino-acides synthétiques ne sont probablement pas des produits de structure homogène, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas constitués exclusivement de molécules présentant toutes le même nombre d'amino-acides reliés les uns aux autres. Ils sont probablement formés de mélanges de molécules dont la longueur de chaîne est légèrement différente.
Cependant, en choisissant les conditions de réaction, on peut les obtenir avec n'importe quelle longueur de chaîne moyenne désirée et les préparer dans certaines conditions spécifiées, à partir de matières premières de pureté chimique quelconque afin d'obtenir des produits de caractéristiques suffisamment constantes pour les applications pharmaceutiques.
Un procédé qu'on peut utiliser pour former les polyamino-acjdes utilisés dans le procédé de la présente invention comprend une réaction de polymérisation en une phase effectuée sur un dérivé convenable de l'aminoacide, de préférence un Ó -N - carboxy anhydride, le groupe amino libre en position w de la lysine ou de l'ornithine étant protégé par exemple par un radical carbobenzoxy. Des procédés de préparation de poly-amino-acides analogues ont été décrits antérieurement. Dans les procédés décrits, la poly-lysine et la poly-ornithine sont préparées suivant le plan ci-dessous, expliqué avec référence à la poly-lysine.
La lysine (formule I) réagit avec le carbobenzoxychlorure pour donner la Ó :¼ -dicarbobenzoxy-lysine (formule II dans laquelle, comme dans les formules suivantes, "Cbzo" désigne le groupe carbobenzoxy-O.CO.CH2C6H5) qu'on chlore au moyen de pentachlorure de phosphore pour obtenir le Ó :¼ dicarbobenzoxy-lysil-chlorure (III) qui se transforme en anhydride de carbobenzoxy- Ó -N-carboxy-lysine (IV).
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L'anhydride de -carbobenzoxy Ó -N-carboxy-lysine (IV) est dissous dans un solvant approprié comme le benzène et la polymérisation en.une phase est amorcée par l'addition d'une faible quantité d'eau à la solution. La réaction donne la poly-carbobenzo-lysine (V). Ce composé donne la poly-lysine (VI) par élimination des groupes carbobenzoxy- suivant une méthode appropriée quelconque.
De nombreuses modifications peuvent être apportées aux détails du procédé de synthèse résumé ci-dessus. La polymérisation peut s'effectuer par exemple dans des solvants autres que le benzène, notamment la pyridine, le dioxanne, l'acétate d'éthyle ou le nitro-benzène et d'autres agents d'amor- çage que l'eau, par exemple l'ammoniac ou la glycine-diméthylamide peuvent être utilisés. La longueur de chaîne du poly-amino-acide peut être réglée suivant la quantité d'agent d'amorçage utilisée.
La polymérisation des N-car- boxy-anhydrides est une réaction de polymérisation en chaîne amorcée dans laquelle le poids moléculaire doit être déterminé par une concentration relative de monomères et d'agents d'amorçage, au moins pour les longueurs de chaine allant jusqu'à 15 restes amino-acides, et un polymère d'une longueur de chaîne désirée à peu près quelconque peut être obtenu en choisissant comme rapport monomère/agent d'amorçage le chiffre voulu pour la longueur de chaîne.
La longueur de chaîne d'une préparation déterminée peut être évaluée par des procédés connus, par exemple l'évaluation du nombre des groupes amino libres dans le produit avant l'élimination des groupes de blocage par la méthode de van Slyke, ou la méthode utilisant le dinitro-fluoro-bezé ne.
La poly-ornithine peut être préparée par un procédé analogue en partant de l'ornithine. La poly-arginine peut être préparée à partir de poly-ornithine par guanidisation de l'iodohydrate de poly-ornithine avec un large excès de méthyl-lso-th-ourée dans le méthanol.
La préparation de polymères mixtes peut être effectuée par copolymérisation d'un w carbobenzoxy- Ó -N-carboxy-anhydride de lysine ou d'ornithine avec le Ó -N-carboxy-anhydride de valine, phényl-alanine, leucine, iso-leucine ou glycine de la manière utilisée pour la préparation des polymères d'amino-acides séparés. Lorsqu'on utilise l'ornithine le produit peut être soumis à une réaction de guanidisation. On a constaté que les polymères mixtes ne doivent pas contenir beaucoup moins de 25 proportions moléculaires % de lysine, d'ornithine ou d'arginine.
Les sels de poly-amino-acides comme les halo-hydrates sont solubles dans les liquides aqueuxet des préparations d'insuline à activité thérapeutique peuvent être préparées en ajoutant une solution aqueuse d'insuline et une solution aqueuse du sel de poly-amino-acide (l'une ou les deux solutions pouvant contenir un sel de zinc) les deux solutions étant tamponnées à un pH approprié voisin du pH physiologique, et en précipitant ainsi le complexe insuline-poly-amino-acide à partir du mélange; le pH de la préparation peut être avantageusement compris entre 5 et 8. Le précipité peut être séparé et utilisé pour former des préparations à usage pharmaceutique, où la solution aqueuse mixte contenant le complexe précipité en suspension peut être utilisée telle quelle.
Le précipité peut affecter la forme cristalline si l'insuline et le poly-amino-acide sont dans un rapport pratiquement isophane. Les préparations peuvent contenir un composé phénolique antiseptique comme le phénol ou un crésol, des composés tels que le chlorure de sodium ou la glycérine pour les rendre isotoniques et n'importe quelle substance nécessaire pour amener les solutions au pH désiré et pour les tamponner.
L'invention sera décrite ci-après avec référence aux exemples ci-après dans lesquels toutes les températures sont données en degrés centigrades.
EXEMPLE l.-
Dans la préparation d'une composition d'insuline, on met en
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suspension 0,259 gr d'insuline cristallisée (puissance 23,2 unité/mg. ) dans
25 cm3 d'eau distillée et on agite la suspension pour détruire les agglomé- rats de cristaux d'insuline. On ajoute à la suspension 2,4 cm3 d'aoide chlor- hydrique 0,1 N pour dissoudre l'insuline, puis 2,5 cm3 d'une solution à 1% de chlorure de zinc, 1,9 cm3 de glycérine et 0,225 cm3 de m-crésol. Le volu- me de la solution est étendu à 50 cm3. On ajoute à 10 cm3 de la solution ainsi obtenue 4,18 cm3 d'une solution de chlorhydrate de poly-L-lysine à 0,025% et on porte le volume du mélange à 25 cm3.
On traite la solution par 5 cm3 d'une solution de phosphate de sodium M/15 à laquelle on a ajouté assez d'aci- de phosphorique pour donner à la suspension finale d'insuline un pH de 7,1.
La solution tampon de phosphate contient 0,3% de m-crésol pour empêcher le développement des moisissures. On obtient ainsi une suspension isophane con- tenant 40 unités d'insuline par cm3.
On prépare une suspension d'insuline contenant 40 unités par cm3 et le double de la quantité isophane de polylysine suivant un procédé identique au procédé décrit ci=dessus mais en utilisant 8,36 cm3 d'une solu- tion de chlorhydrate de poly-lysine à 0,25%.
Le chlorhydrate de poly-lysine utilisé dans la préparation ci-dessus est obtenu de la façon suivante :
On refroidit à 0 C dans un mélange réfrigérant 41 gr de monochlorhydrate de L-lysine dissous dans 224 cm3 d'hydroxyde de sodium,2!.
On ajoute en quatre portions 137 gr de benzyl-chloro-formate à 85,5% en poids et 280 cm3 d'hydroxyde de sodium 4 N préalablement refroidis à 0 C, en agi- @ tant énergiquement pendant 20 minutes env., la température étant maintenue en dessous de 10 . On ajoute ensuite 400 cm3 d'acide chlorhydrique 5 N et on recueille l'huile libérée dans l'éther (3 x 200 cme) on l'extrait de cette solution par 4 portions successives de 750 cm3 chacune d'une solution de bicarbonate de potassium à 7%. Les extraits par le bicarbonate de potassium sont acidifiés à l'aide de 500 cm3 d'acide chlorhydrique 5 N et l'huile est extraite à nouveau par l'éther (3 x 200 cm3) et séchée sur du sulfate de sodium.
Par élimination de l'éther dans le vide en dessous de 3 0 on obtient un sirop visqueux de Ó : ¼ -dicarbobenzoxy-L-lysine brute.
On refroidit 37 gr. du composé brut dissous dans 145 cm3 d'éther sec et on y ajoute en une fois 22,0 gr. de pentachlorure de phosphore.
On agite énergiquement le mélange et on y ajoute après 10 minutes environ 3 gr. de pentachlorure de phosphore de façon à assurer un large excès. Après 25 minutes d'agitation on filtre rapidement la solution et on ajoute au filtrat 25 cme d'acétate d'éthyle sec. Les solvants sont éliminés dans le vide à l'abri de l'humidité, d'abord à 35 C jusqu'à élimination de la plus grande partie de l'éther puis à 50 C pour éliminer l'acétate d'éthyle.
Le résidu est chauffé à 50 /1-5 mm pendant quelques minutes pour cristalliser l'anhydride. On ajoute 30 cm3 d'éther sec au résidu refroidi qu'on laisse reposer à 0 C pendant 1 heure. L'anhydride est recueilli, lavé à l'éther et recristallisé. Deux fois, aussi rapidement que possible, en le dissolvant dans une quantité minimum d'acétate d'éthyle chaud et sec et en ajoutant graduellement du pétrole léger (point d'ébullition 60-80 ) pour provoquer la cristallisation. L'anhydride est filtré et séché dans le vide pour fournir un solide fondant à 97-99 C. L'anhydride (8,15 gr, recristallisé deux fois à partir d'acétate d'éthyle et de pétrole léger) fondant à 97-99 est dissous dans 350 cm3 de benzène bouillant sec et traité par 1,03 gr d'eau dans 4 cm3 de dioxanne sec, puis chauffé à reflux pendant 6 heures.
Le polymère est séparé par filtration de la solution chaude, lavé à l'éther et séché dans le vide. On trouve par la méthode de van Slyk 0,49 atome d'azote de groupement amino, c'est-à-dire une longueur de chaîne égale à 10,5.
On met en suspension 6,5 gr du polymère en poudre dans 325 cm3 d'acide acétique glacial à 45-50 C et on fait passer de l'acide chlorhydrique sec pendant 6 heures. On obtient du chlorhydrate de poly-L-lysine brut
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qu'on lave à l'éther et qu'on sèche dans le vide (4,2 gr). Le produit sec est dissous dans l'eau (30 cm3) et la solution claire est lavée à l'éther (10 cm3), puis évaporée au bain-marie ( # 80 ) afin d'obtenir le chlorhydrate de poly-L-lysine [Ó] 17 -72.8 (c +1,2 dans l'eau).
D EXEMPLE 2.-
On utilise le procédé décrit dans l'exemple 1 pour la préparation d'une suspension d'insuline contenant 40 unités par cm3 et le double de la quantité isophane de poly-lysine, mais avec 9,6 cm3 d'une solution de chlorhydrate de poly-L-lysine à 0,25%.
Le chlorhydrate de poly-lysine est préparé de la façon suivante: On prépare l'anhydride de ± -carbobenzyloxy- Ó -N-carboxy-L-ly- sine comme dans l'exemple 1. On traite 4,5 gr de l'anhydride (p.f. 98-99,5 après deux recristallisations)-dans 160 cm3 de benzène bouillant par 0,9 gr de glycine-diméthylamide dans 20 cm3 de dioxane. Le mélange est chauffé à reflux pendant 6 heures et la partie solide qui se sépare est isolée par filtration, lavée à l'éther et séchée dans le vide. 2 gr du polymère en poudre (longueur de chaîne ;-- 2? unités par la méthode de van Slyke) sont décarbobenzoxylés par traitement par l'acide chlorhydrique sec dans 100 cm3 de nitrométhane à 45-50 0 pendant 6 heures.
Le chlorhydrate brut qui se sépare est isolé par filtration, lavé à l'éther, séché dans le vide et dissous dans l'eau. la solution aqueuse est évaporée jusqu'à siccité et le résidu est séché dans le vide de façon à obtenir le chlorhydrate de poly-L-lysine [Ó] 21 -60 .
D EXEMPLE 3.-
On applique le procédé décrit dans l'exemple 1 à la préparation d'une suspension d'insuline contenant 40 unités/cm3 et le double de la quantité isophane de poly-lysine, en utilisant 9,2 cm3 d'une solution de chlorhydrate de poly-L-lysine à 0,25%.
Le chlorhydrate de poly-lysine est préparé comme dans l'exem- ple 2 en utilisant 0,1 mole de glycine-diméthylamide comme agent d'amorgage..
Le produite présente un pouvoir rotatoire [Ó] 17 -64,4 et une lon-
D gueur de chaîne de 13 unités déterminée par la méthode de van Slyke sur le dérivé carbobenzyloxy-intermédiaire.
EXEMPLE 4.-
On applique le procédé décrit dans l'exemple 1 à la préparation d'une suspension d'insuline contenant 40 unités/cm3 et le double de la quantité isophane de poly-lysine, en employant 8,4 cm3 d'une solution de chlorhydrate de poly-L-lysine à 0,25%.
Le chlorhydrate de poly-lysine est préparé suivant le procédé de l'exemple 2 avec 0,033 mole de glycine-diméthylamide comme agent d'amor- Çcage. Le produit présente un pouvoir rotatoire [Ó] 17 -76,0 et une
D longueur de chaîne de 42 unités mesurée par la méthode de van Slyke sur le dérivé carbobenzyloxy intermédiaire.
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.EXEMPLE 5.-
On applique le procédé décrit dans l'exemple 1 à la prépara- tion d'une suspension d'insuline contenant 40 unités/cm3 et le double de la quantité isophane de poly-lysine, en utilisant 8,1 cm3 d'une solution de chlor- hydrate de poly-lysine à 0,25%.
Le chlorhydrate de poly-lysine est obtenu comme décrit dans l'exemple 1 en employant du benzène contenant 0,02% d'eau dans la phase de po- lymérisation. La décarbobenzyloxylation s'effectue en faisant passer de l'a- cide chlorhydrique dans une solution d'acide acétique du dérivé carbobenzyl- oxy pendant 24 h. On obtient ainsi le chlorhydrate de poly-L-lysine qui pré- sente un pouvoir rotatoire [Ó] 17 -81. 2 et une longueur de chaine de 100 unités mesurée par la méthode de van Slyke sur le dérivé carbobenzyloxy- intermédiaire.
EXEMPLE 6 . -
On prépare une composition d'insuline contenant 40 unités/cm3 ' d'insuline par les procédés décrits dans les exemples ci-dessus avec du chlorhydrate de poly-L-lysine (longueur de chaîne = 65 d'après la méthode de van Slyke appliquée au dérivé carbobenzyl-oxy-inermédiaire) obtenu en utilisant de la glycine-diméthylamide comme agent d'amorçage, comme dans le procédé de l'exemple 2.
EXEMPLE 7. -
On utilise le procédé de l'exemple 1 pour exécuter une préparation d'insuline à partir de chlorhydrate de poly-ornithine.
On prépare de la manière suivante un chlorhydrate de polyornithine dont la longueur de chaîne est au moins égale à 10 : Dicarbobenzoxy-ornithine
On dissout 25 gr de bromhydrate de DL-ornithine dans 125 cm3 de soude caustique 2N refroidie dans la glace. On ajoute ensuite 71,5 cm3 d'une solution de soude caustique 2N puis 14,5 cm3 de carbobenzoxy-chlorure et on agite la solution jusqu'à ce que la température tombe à 3 C. On recommence trois fois ce processus jusqu'à ce qu'on ait ajoute un total de 286 cm3 de soude caustique et de 58 cm3 de carbobenzoxy-chlorure. On agite le mélange pendant 30 minutes à 5 C puis on l'acidifie au moyen de 80 cm3 d'acide chlorhydrique concentré qu'on ajoute lentement sans agiter. L'huile précipitée est extraite par 500 cm3 d'éther puis par 300 cm3 d'éther.
Les extraits d'éther réunis sont agités avec 4 portions séparées, de 850 cm3 chacune, d'une solution de bicarbonate de potassium à 7% en poids/volume.
La couche aqueuse est acidifiée par 350 cm3 d'acide chlorhydrique concentré et l'huile est extraite par 2 portions d'éther de 400 cm3 chacune, contenant 20'cm3 d'acétate d'éthyle.
Les extraits d'éther réunis sont séchés sur du sulfate de magnésium, filtrés et le solvant est évaporé sous pression réduite à 40 C en laissant 57 gr de produit solide brut. On extrait ce produit par 2 portions de 50 cm3 d'éther séché sur le sodium et on obtient 31,5 gr d'un solide blanc fondant à 106-110 C.
Anhydride de carbobenzoxy-N-carboxy-ornithine.
On dissout 31,5 gr de dicarbobenzoxy-ornithine dans 600 cm3 de benzène séché sur le sodium au point d'ébullition et on refroidit rapidement à 25 C. On ajoute 31,5 gr de pentachlorure de phosphore en poudre et on agite le mélange pendant quelques minutes puis on le refroidit à 20 C.
On filtre le liquide pour éliminer l'excès de pentachlorure de phosphore, on laisse reposer à 25 C pendant 2 h. et on filtre à nouveau. On lave la partie solide au pétrole léger 40/60 et on sèche sous vide; on obtient 12 gr
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d'une matière solide jaune fondant à 105-108 C.
Poly-carbobenzoxy-ornithine.
On dissout 12 gr de l'anhydride dans 550 cm3 de benzène bouil- lant, on traite par le charbon et on filtre à chaud pour obtenir une solution incolore. On ajoute 1,5 cm3 d'eau distillée et on chauffé la solution à re- flux pendant 4 heures. On la réduit ensuite à la moitié de son volume par évaporation sous pression réduite. On lave la partie solide avec 100 cm3 d'éther séché sur le sodium, on filtre et on sèche sous vide ; obtient
7,5 gr d'un produit blanc.
Chlorhydrate de poly-ornithine.
On réduit en poudre 7,5 gr de poly-carbobenzoxy-ornithine qu'on place dans 425 cm3 de dioxane à 50 C. On fait passer de l'acide chlor- hydrique sec dans la suspension pendant 6 1/2 h. Le polymère se gélifie d'abord puis se dissout et après 3 h. le chlorhydrate de poly-ornithine com- mence à se séparer de la solution. On filtre, on lave le filtrat à l'éther et on le dissout dans 100 cm3 d'eau distillée. La solution obtenue est fil- trée, évaporée jusqu'à la siccité et le résidu trituré avec l'acétone donne
3,0 gr de solide blanc.
EXEMPLE 8.-
On suit le procédé de l'exemple 1 pour former une préparation d'insuline à partir de sulfate de poly-arginine. On prépare de la manière suivante un sulfate de poly-arginine présentant une longueur de chaine au moins égale à 10:
On dissout 3,0 gr de chlorhydrate de poly-ornithine dans
27 cm3 d'ammoniaque à 0,880, et on ajoute 7,2 gr de sulfate de S-méthyl- isothiourée en poudre à la solution refroidie qu'on place sous la hotte pour disperser les vapeurs désagréables de méthyl-mercaptan formées pendant la réaction. On laisse reposer la solution à la température ambiante pendant 24 h. puis on la dissout dans 400 cm d'acide sulfurique à 5% en volume en élevant la température si nécessaire. On ajoute 10 gr d'acide flavianique dans 70 cm3 d'eau chaude et on laisse le mélange dans un réfrigérateur jus- qu'au lendemain.
On sépare le précipité formé par filtration et on le lave au moyen de 2 portions de 50 cm3 d'une solution aqueuse saturée de flavia- nate d'arginine puis au moyen d'acétate.
On dissout le précipité dans 300 cm3 d'acide sulfurique à 5% en volume et on extrait l'acide flavianique par 3 portions de butanol (200 cm3-150 cm3 - 150 cm3). La couche aqueuse est rendue à peine alcaline au tournesol au moyen d'une solution concentrée d'hydroxyde de baryum, por- tée à l'ébullition, refroidie et filtrée. On la rend ensuite à peine acide au tournesol au moyen d'acide sulfurique 2N, on la réduit par évaporation à 50 cm3, on la traite par le charbon, on filtre et on réduit à la consistan- ce d'un sirop par évaporation. On ajoute de l'acétone pour obtenir un préci- pité et on évapore le solvant pour obtenir un résidu solide. Ce résidu est trituré avec de l'acétone, filtré et séché ; obtient 3 gr d'un solide blanc.
EXEMPLE 9. -
On applique le procédé de l'exemple 1 à l'exécution d'une pré- paration d'insuline à partir de chlorhydrate de poly-(L-lysine: DL-ornithire).
On prépare de la manière suivante ce polymère avec une lon- gueur de chaîne au moins égale à 10:
On polymérise de la façon décrite dans l'exemple précédent
8,35 gr (0,0273 M) de ¼ -carbobenzoxy-L-lysine-N-carboxy-anhydride et
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7,96 gr (0,0273 M) de J - carbobenzoxy-DL-ornithine-N-carbo-xy-¯anhydride de façon à obtenir 13,75 gr de poly ( -carbobenzoy-L-lysine: , -carbo- benzoxy-DL-ornithine). 12,75 gr de ce polymère sont décarbobenzoxylés par l'acide chlorhydrique dans l'acide acétique de façon à obtenir 5,5 gr de chlor-
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hydrate de poly-(L-lysine: DL-ornithine) dont le pouvoir rotatoire est [Ó] 22 -36,8 et dont le rapport isophane équivaut à 0,88 mg/10 unités
D d'insuline.
Ce polymère contient 50 moles % de DL-ornithine.
EXEMPLE 10. -
On applique le procédé de l'exemple 1 en utilisant de la poly-(L-lysine: glycine) obtenue comme suit :
On polymérise 10,31 gr (0,0337 M) de ¼ -carbobenzoxy-L-ly- sine-N-carboxy-anhydride et 10,21 gr (0,101 M) de glycine -N-oarboxy-anhydride de façon à obtenir 14,45 gr de poly-( . -carbobenzoxy-L-lysine: glycine).
13,4 gr de ce polymère sont décarbobenzoxylés par l'acide chlorhydrique dans le phénol pour obtenir 6,45 gr de poly-(L-lysine:glycine) brute, dont on ex- trait 2,2 gr de matière soluble dans l'eau présentant un pouvoir rotatoire [Ó] 24 -58,1 et un rapport isophane de 1,50 mg/10 unités d'insuline.
D
Ce polymère contient 25 moles % de L-lysine.
.EXEMPLE Il.- Poly-L-lysine-zinc-insuline.
Pour préparer la poly-L-lysine-zinc-insuline on dissout 0,518 mg d'insuline cristallisée (22,5 unités/mg) dans 4,8 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1,N. On ajoute à cette solution 5 cm3 d'une solution aqueuse de chlorure de zinc contenant 1 gr de ZnCl2 dans 100 cm3 d'eau, 4,8 gr de glycérine et 0,6 cm3 de m-crésol et le mélange est amené à un volume final de 100 cm3 par addition du volume d'eau requis. On ajoute 10 cm3 de la solution ainsi ob- tenue à 7,7 cm3 d'une solution aqueuse de chlorhydrate de poly-L-lysine con- tenant 0,25 gr dans 100 cm3 d'eau et on porte le volume du mélange à 25 cm3.
Le chlorhydrate de poly-L-lysine utilisé dans cet exemple est préparé suivant le procédé de l'exemple 1. On ajoute au mélange obtenu 5 om3 d'une solution de phosphate disodique hydrogéné M/15 à laquelle on a ajouté assez d'acide phosphorique pour amener le pH du mélange final à 7,1. Injectée, la suspen- sion du précipité poly-L-lysine-zinc-insuline ainsi formée manifeste une acti- vité d'insuline retard.
EXEMPLE 12. - ' Poly-DL-lysine-zinc-insuline.
Pour la préparation de poly-DL-lysine-zinc-insuline, on adop- te le procédé décrit dans l'exemple 11 en remplaçant les 7,7 cm3 de solution de chlorhydrate de poly-L-lysine à 0,25 % par 7,8 cm3 d'une solution aqueuse de chlorhydrate de poly-DL-lysine à 0,25% (calcula sur une base poids/volume), ce chlorhydrate étant obtenu à partir de DL-lysine par des procédés analogues à ceux qu'on a décrits plus haut pour la poly-L-lysine. Injectée, la suspen- sion du précipité poly-DL-lysine-zinc-insuline ainsi formée manifeste une ac- tivité d'insuline retard.
EXEMPLE 13.- Poly-L-lysine-zinc-insuline.
Pour la préparation de poly-L-lysine-zinc-insuline, on dissout 0,518 mg d'insuline cristallisée (0,25 unités/mg) dans 4,8 cm3 d'acide chlor- hydrique 0,1 N, on ajoute 0,9 cm3 de m-crésol et on porte le volume de la so-
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lution à 100 cm3 par addition d'eau. On ajoute à 10 cm3 de la solution ainsi obtenue 3,1 cm3 d'une solution aqueuse à 0,25% (calculé sur une base poids/vo- lume) de chlorhydrate de poly-L-lysine préparé par un procédé décrit dans le exemples 1 à 6.
Le volume de la solution est porté à 25 cm3 par addition d'eau et on ajoute au mélange 5 cm3 d'une solution M/15 de phosphate disodique hydrogéné à laquelle on a ajouté assez d'acide phosphorique et de chlorure de sodium pour que le pH du mélange final soit égal à 7,1 et sa teneur en chlorure de sodium 4,56% en poids/volume.
EXEMPLE 14.- Poly-DL-lysine-zinc-insuline.
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Pour la préparation de poly-DL-Iysine-zinc-insuline on utilise le procédé décrit dans l'exemple 13 en remplaçant les 3,1 cm3 de solution de chlorhydrate de poly-L-lysine à 0,25% par 5,4 cm3 d'une solution de chlorhydrate de poly-DL-lysine à 0,25%. Injectée, la suspension du précipité poly-DL-lysine-zinc-insuline ainsi formé manifeste une activité d'insuline retard. Le chlorhydrate de poly-DL-lysine est préparé à partir de DL-lysine par des procédés analogues aux procédés décrits dans les exemples 1 à 6.
EXEMPLE 15.- Poly-lysine-zinc-insuline.
Pour la préparation de poly-lysine-zinc-insuline on dissout 0,173 gr d'insuline cristallisée (0,25 unité/mg) dans 1,6 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N. On ajoute à cette solution 1,66 cm3 d'une solution de chlorure de zinc à 1% en poids/volume, 1,6 cm3 de glycérine et 0,2 cm3 de m-crésol. On porte le volume du mélange à 100 cm3 par addition d'eau. On ajoute à 10 cm3 de la solution ainsi obtenue 2,4 cm3 d'une solution à 0,25% en poids/volume, d'iodhydrate de poly-lysine préparé suivant le procédé décrit dans l'exemple 1 pour le chlorhydrate. Le volume du mélange est porté à 25 cm3 et on ajoute à la solution finale 5 cm3 d'une solution M/15 de phosphate disodique hydrogéné à laquelle on a ajouté assez d'acide phosphorique pour que le pH final du mélange soit égal à 7,1.
EXEMPLE 16.-
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Dans la préparation de poly-lysine-ginc-insuline on utilise le procédé décrit dans l'exemple 15 en employant 3,2 cm3 de solution d'iodhydrate de poly-lysine à 0,25% au lieu des 2,4 cm3 de l'exemple 15.
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EXEMPLE 17.- Poly-lsine-zinc-insuline. un aissout 174,8 mg d'insuline dans la quantité minimum d'acide chlorhydrique en solution aqueuse N/10 et on étend la solution à 80 cm3 au moyen d'une solution tampon au phosphate M/32. On ajoute à la solution obtenue solution de chlorure de zinc 1 cm3 contenant 16,5 mg de chlorure de zinc anhydre tricrésol 0,2 cm3 glycérine 1,6 gr chlorure de sodium 9,0 mg
On prépare une seconde solution contenant 70,6 mg de l'iodhy- drate de poly-lysine préparé par le procédé décrit dans l'exemple 1 pour le chlorhydrate dans 8 cm3 de solution tampon au phosphate.
Les deux solutions sont mélangées et rapidement étendues à 100 cm3. Le mélange est placé dans un réfrigérateur jusqu'au moment de l'emploi.
La poly-lysine-zinc-insuline forme un précipité blanc volumineux qui se dépose en laissant surnager un liquide clair. Ce précipité dient cristallin au repos. L'examen polarographique du liquide surnageant semble indiquer que la précipitation de l'insuline est pratiquement quantitative, un
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maximum de 1 unité/cm3 restant en solution.
On met en suspension la poly-lysine-zinc-insuline dans la solution contenant la glycérine, le tricrésol, le chlorure de sodium et le chlorure de zinc. La quantité de poly-lysine-zinc-insuline est choisie pour obtenir une puissance d'insuline de 40 unités/cm3. On prépare également une solution comparable contenant 40 unités/cm3 d'insuline pure en solution.
Des essais sont effectués sur 10 lapins à la diète. On administre par voie sous-cutanée une dose de 0,035 cm3 par animal.
La teneur en sucre du sang de chaque lapin est déterminée individuellement avant l'injection. Après l'injection, on obtient une évaluation de la teneur moyenne en sucre d'heure en heure pendant 6 heures en analysant ensemble le sang des animaux du même groupe.
Les teneurs moyennes en sucre du sarg de 10 lapins pour les deux préparations s'établissent comme suit :
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<tb> Sucre <SEP> en <SEP> % <SEP> dans <SEP> le <SEP> sang <SEP> : <SEP> Solution <SEP> à <SEP> : <SEP> Suspension <SEP> poly-
<tb> : <SEP> 40u./cm3 <SEP> : <SEP> lysine-zinc- <SEP>
<tb> .. <SEP> : <SEP> insuline. <SEP>
<tb>
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, ¯¯¯----------------------¯-- µ O ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ----------------------------
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<tb>
<tb> Initial <SEP> 100.0 <SEP> 100.0
<tb> 1 <SEP> h. <SEP> après <SEP> injection <SEP> 46.9 <SEP> 66.7
<tb> 2 <SEP> h. <SEP> " <SEP> " <SEP> 47.1 <SEP> 66.4
<tb>
<tb> 3 <SEP> h. <SEP> " <SEP> " <SEP> 63.2 <SEP> 64.2
<tb> 4 <SEP> h. <SEP> " <SEP> " <SEP> 84.6 <SEP> 62.4
<tb> 5 <SEP> h. <SEP> " <SEP> " <SEP> 96.6 <SEP> 65.8
<tb> 6 <SEP> h. <SEP> " <SEP> " <SEP> 105.8 <SEP> 69.1
<tb>
On peut voir que la suspension de poly-lysine-zinc-insuline exerce encore une action correspondant à une teneur en sucre de 67% lorsque le groupe de contrôle a retrouvé sa teneur en sucre initiale. La préparation satisfait donc à l'essai d'action prolongée généralement appliqué' à la protamine-zinc-insuline.
EXEMPLE 18.-
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Poly-ornithine-zinc-insu1ine.
On prépare une solution crésol-glycérine-eau contenant 2cm3 de tricrésol et 16 gr de glycérine par litre d'eau et on dissout dans 25 cm3 de cette solution au pH 3,2, 87 mg d'insuline cristallisée (23 unités/mg) et 0,84 cm3 d'une solution de chlorure de zinc à 1% au pH 3,4. On ajoute à la solution de zinc-insuline 2,6 cm3 d'une solution crésol-glycérine-eau à 1% de chlorhydrate de poly-ornithine préparé comme décrit dans l'exemple 7, puis 7 cm3 d'une solution crésol-glycérine-eau à 2,2% de phosphate de sodium (Na2HP0412 H20) et on règle le pH à 7,1 au moyen d'hydroxyde de sodium. On porte ensuite le volume à 50 cm3.
La préparation contient 0,174% d'insuline (40 unités/cm3) et 0,052% de chlorhydrate de poly-ornithine.
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Par neutralisation, la po1y-ornithine-zinc-insuline forme un précipité blanc assez volumineux ressemblant à la protamine-zinc-insuline.
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EXEMPLE 19.- Poly-arginine-zinc-insuline.
On reprend 1?exemple 18 en utilisant du sulfate de poly-arginine préparé comme dans l'exemple 8 au lieu du chlorhydrate de poly-ornithine en quantité équivalente mais sous la forme de 3,0 cm3 d'une solution à 1% de sulfate de poly-arginine.
La teneur moyenne en sucre du sang de 5 lapins, exprimée sous forme de pourcentage de la teneur initiale est consignée dans le tableau cidessous.
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--------------------------------------------------------------------------
<tb> : <SEP> Solution <SEP> : <SEP> Polyorni- <SEP> : <SEP> Poly-arginine- <SEP> : <SEP>
<tb> Sucre <SEP> en <SEP> @ <SEP> dans <SEP> le <SEP> sang <SEP> : <SEP> à <SEP> thine <SEP> zinc- <SEP> : <SEP> zinc-
<tb> 40 <SEP> unités/ <SEP> : <SEP> insuline <SEP> insuline
<tb> : <SEP> : <SEP> cm3 <SEP> : <SEP> : <SEP> :
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<tb> Initial <SEP> 100.0 <SEP> 100.0 <SEP> 100.0
<tb> : <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> :
<tb> 1 <SEP> h. <SEP> après <SEP> injection <SEP> 47.2 <SEP> 54.1 <SEP> 54.2
<tb> 2 <SEP> h. <SEP> " <SEP> 50.5 <SEP> 59.1 <SEP> 48.9
<tb> 3 <SEP> h. <SEP> " <SEP> " <SEP> 61.8 <SEP> 63.3 <SEP> 51.2
<tb> 4 <SEP> h. <SEP> " <SEP> " <SEP> 90.9 <SEP> 62. <SEP> 7 <SEP> 59. <SEP> 5 <SEP> :
<tb> : <SEP> : <SEP> :
<SEP> :
<tb> 5 <SEP> h. <SEP> " <SEP> " <SEP> 102.5 <SEP> 73.0 <SEP> 73.0
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;¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
On voit qu'au moment où le sang du groupe de contrôle a retrouvé sa teneur en sucre initiale, les suspensions poly-ornithine- et polyarginine-zinc-insuline exercent encore une action correspondant à une teneur en sucre de 70% environ et satisfont donc à l'essai d'action prolongée généralement appliqué à la protamine-zinc-insuline.
REVENDICATIONS.
1.- Procédé de production d'une préparation d'insuline à action prolongée, caractérisé en ce qu'on fait réagir en solution l'insuline et un poly-amino-acide comportant plus de 8 restes amino-acides par molécule, ledit poly-amino-acide étant la polylysine, la poly-ornithine ou la poly-arginine ou un copolymère de lysine et d'ornithine l'une avec l'autre ou avec d'autres acides choisis parmi la valine, la phényl-alanine, la leucine, l'iso-leucine et la glycine ou un produit de guanidisation de ce copolymère.