BE520686A - - Google Patents

Description

   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  PROCEDE DE FABRICATION D'INSULINE CRISTALLISEE. (Inventeurs : K. Petersen et J.   Scnlichtkrull).   



   Dans la fabrication   dinsuline   cristallisée, les caractéristiques   principales   du procédé sont que l'insuline est mise à cristalliser à partir d'un milieu aqueux en changeant la valeur du pH du milieu jusqu'au voisinage du point isoélectrique de l'insuline.

   Si l'insuline   d'elle-même   ne contient pas à l'avance des quantités suffisantes d'un métal promoteur de cristallisation, du zinc habituellement., on communique la teneur requise de ce métal au milieu de cristallisation, tandis que, généralement, on fait également usage de substances tampons pour la fixation de la valeur du pH durant la cris-   tallisationo   
Dans la cristallisation de l'insuline suivant les procédés connus, on obtient des cristaux d'apparence très variable, suivant l'origine et la pureté de l'insuline aussi bien que suivant les conditions de cristallisationo 
D'après les examens aux rayons X, la structure cristalline de l'insuline est rhomboédrique.

   Cependant, les cristaux d'insuline produits suivant les'procédés habituels n'apparaîtront que rarement à   l'état   de rhomboèdres réguliers limités par des faces de cristal planes. Si avant la cristallisation l'insuline contient de faibles quantités d'impuretés, par exemple la matière d'accompagnement de la fabrication, on obtiendra par les procédés prévalant actuellement des corps cristallins arrondis en forme d'étoiles, de rhomboèdres déformés et de macles rhomboédriques, de citrons, etco contenant une partie des impuretés de la matière de départo Il est le plus souvent impossible d'arriver à une forme en cristaux phomboédriques purs, me me par recristallisations répétéeso Des cristaux déformés de ce genre seront de même le résultat d'une cristallisation à une valeur de pH trop basse ou à trop basse concentration en zinc,

   même dans le cas de la cristallisation d'une insuline très pure. 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 



   Des cristaux déformés semblent donc être un critère de conditions défectueuses de cristallisation ou de la présence d'impuretés 
On a trouvé présentement que la présence d'halogène sous forme ionogène dans le milieu de cristallisation peut améliorer les conditions de cristallisation à un degré tel que l'insuline, indépendamment de l'origine et des faibles quantités d'impuretés, cristallise en un état particulièrement pur et dans une forme rhomboédrique sous forme de corps cristallisés à arêtes vives   limités   par des faces cristallines planes. Il est seulement nécessaire, tout en maintenant les conditions habituelles de cristallisation, de faire en sorte que l'halogène ionogène soit présent en concentration supérieure à 0,2 mole par litre. 



   En conformité avec ce qui est dit plus haut, le procédé suivant l'invention se caractérise en ce qu'on confère au milieu de cristallisation aqueux une teneur en halogène, sous une forme ion%gène, supérieure à la concentration de 0,2 mole par litre. 



   Il est connu que la cristallisation de zinc-protamine-insuline est accélérée par une certaine concentration   de   sel qui est plus grande que celle obtenue par mélange des matières de départ employées par l'ajustement du pH, etc. Cette concentration accrue de sel peut s'obtenir par une concentration accrue de tampon ou par addition d'un sel tel que le chlorure de sodium, ou un choix quelconque d'autres sels. 



   Cependant, la présente invention ne se rapporte pas à la cristallisation d'un composé particulier d'insuline, mais à la cristallisation de l'insuline elle-même. Un choix quelconque de sels ne produira pas l'effet obtenu conformément à l'invention, lequel est dû à la présence d'ions halogénure en une concentration minima définie et n'a aucun rapport avec la vitesse de cristallisation mais envisage l'obtention de cristaux d'insuline particulièrement purs. La présente invention permet d'obtenir toujours l'insuline sous la forme de rhomboèdres à arêtes vives avec des faces cristallines pla-   nes,   indépendamment du fait que l'insuline provient du pancréas de porc, de boeuf ou autres pancréas. 



   On confère le plus aisément la teneur requise en ions halogénure au milieu de cristallisation par addition de sels halogénés. Comme sels de ce genre conviennent particulièrement les sels halogénés de métaux alcalins, de l'ammoniac ou des métaux   alcalino-terreux.   Conviennent moins bien les sels halogénés de métaux lourds, étant donné que ces sels exercent ordinairement une action de précipitation sur les protéines. 



   Si on utilise de l'insuline avec une teneur relativement grande en impuretés pour la cristallisation et qu'un solvant organique, tel que l'acétone, n'est pas présent au coûts de la cristallisation, il se précipitera fréquemment de   l'insuline   amorphe en même temps que des cristaux d'insuline. 



  On peut éliminer cette insuline amorphe précipitée en ajoutant un solvant organique tel que l'acétoneo 
La quantité d'insuline amorphe précipitée à la fin du processus de cristallisation dépend également de la concentration en ion halogène et elle augmente pour une concentration en ion halogène croissante. Lorsqu'on effectue la cristallisation à l'échelle industrielle, il ne convient pas d'utiliser une concentration en ion halogène supérieure à 2 - 4 moles par li-   tre.   Les meilleurs résultats ont été obtenus avec une concentration en ions halogène comprise entre environ 0,5 et environ 1,5 moles par litre. 



   Comme mentionné plus haut, le processus de cristallisation peut s'effectuer d'une manière connue en soi. 



   On sait que la cristallisation de l'insuline requiert la présence de certains métaux (zinc, cobalt, nickel, cadmium, cuivre, manganèse ou fer). 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 



  Dans la pratique, on a fait seulement usage jusqu'ici de la présence de zinc. 



   Lorsqu'on fixe la teneur en métal du milieu de cristallisation on doit tenir compte jusqu'à quel point l'insuline employée contient à l'avance de zinc ou de métaux similaires. 



   En vue d9effectuer la cristallisation, on ajuste la valeur du pH du milieu aqueux de cristallisation à 5,   4-6,   2 au moyen d'un acide, par exem- ple de l'acide chlorhydrique, ou d'une base, par exemple de la soude caustique, suivant que le milieu de cristallisation a une valeur de pH plus élevée qu plus basse avant le réglage du pH. Le plus communément on approche le pH de cris- tallisation du côté acide, mais on peut aussi utiliser des solutions d'insuli- ne basiques, dont on réduit la valeur de pH jusqu'au domaine de cristallisation. 



   On utilise généralement une 'substance tampon ou un mélange de ces substances pour fixer le pH de cristallisation. Comme exemples de substances tampons convenables on peut mentionner le tampon acétate, le tampon borate, le tampon citrate, le tampon barbiturate de diéthyle, le tampon maléate ou des mélanges de ceux-cio Parmi toutes ces substances tampons, on préfère les tem- pons acétate et citrate. 



   En ce qui regarde la qualité de l'insuline employée pour la cris- tallisation il est en outre à signaler que l'insuline doit   @être   aussi pure que possible surtout en vue des rendements de la cristallisation.   L'insuli-   ne obtenue par le procédé insustriel courant de récupération d'insuline à par- tir de pancréas est d'ordinaire de pureté convenable Une pureté de 20-23 unités internationales par mg est préférable., L'insuline peut être présente à l'état amorphe ou cristallisé.

     Les*   meilleurs rendements sont obtenus lors- que l'insuline est présente ou a été présente sous la forme   cristalline,   de manière à ce que le procédé de cristallisation conforme à l'invention constitue le dernier stade dans le procédé de fabrication avant ou en relation avec la production de préparations d'insuline destinées aux médicaments pour le diabè- te. 



   Les exemples suivants d'exécution servent à expliquer davantage le procédé de l'invention. 



  Exemple L 
On dissout 1/2 g d'insuline amorphe provenant d'un pancréas de boeuf dans 50 cm3 de HCL 0,02 N, après quoi on ajoute 25 cm3 d'une solution aqueuse d'iodure de potassium contenant 27 g d'iodure de potassium par 100 cm3 d'eau et 10 cm3 d'un tampon citrate contenant 10% d'acide citrique à l'état de citrate de sodium et   0,4%   de zinc sous forme de chlorure. On dilue la solution avec de l'eau pour avoir 100 cm3 , ce qui donne une concentration   d'iom   halogène d'environ 0,43 moles par litre, et on ajuste le pH à 5,7-6,0 La cris- tallisation commence immédiatement, et s'achève au bout de 1 à 2 jours. 



  Exemple 2.    



  On dissout 1/2 g d'insuline amorphe provenant d'un pancréas de porc dans 50 cm3 d'acide chlorhydrique 0,02 N, après quoi on ajoute 10 cm3 d'acétone   et 25 cm3 d'une solution aqueuse de chlorure de sodium contenant 23 g de NaCl par 100 cm3, et 10   cm3   de ce même tampon citrate mentionné dans l'exemple   1.   



  On dilue la solution avec de l'eau pour avoir 100 cm3, ce qui donne une concen- tration d'ion halogène d'environ 1 mole par litre, et on ajuste le pH à 5,8- 6,0. La cristallisation commence immédiatement et   plie-   a'accomplit en l'espa- ce de 1 à 2 jours. 



  Exemple   3.   



   On dissout 1/2 g de cristaux d'insuline provenant d'un pancréas de porc dans 250 cm3 diacide acétique 1/3 No On ajoute alors approximative- ment 1/4 litre d'ammoniaque 1/3 N contenant   6%   de NaCl, de manière à ajuster 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 la valeur du pH à approximativement 6,0 et on a ainsi une concentration d'ion halogène d'environ 0,51 moles par litre. La cristallisation s'accomplit en l'espace de 24 heures environo Exemple 4. 



   On dissout 100 mg d'insuline cristallisée provenant d'un pancréas   de boeuf dans 10 cm3 de HCL 0,1 N, après quoi on ajoute 10 cm3 d'une solution de chlorure de zinc contenant 0,05% de zinco A ceci on ajoute alors 20 cm3   d'une solution aqueuse de chlorure de calcium contenant 7 g de CaCL2 par 100 cm3, après quoi on ajoute 10 cm3 de tampon acétate de sodium contenant   6,8   g de CH3COONa, 3H2O et 20 cm3 de HCL 1 N par 100 cm3 La concentration d'ion ha- logène est alors d'environ 0,57 moles par litre. Finalement on ajuste le pH à 5,4-5.5 La cristallisation s'accomplit après 24   heures,,.   



  Exemple   5 -   
On dissout 100 mg d'insuline cristallisée provenant d'un pancréas de boeuf dans 10 cm3 de HCL 0.01 N, après quoi on ajoute 10 cm3 d'une solution aqueuse de chlorure de zinc contenant   0,05 %   de zinc. On ajoute alors 20 cm3 d'une solution aqueuse de bromure de potassium contenant 15 g de KBr par 100 cm3,puis 10   cm3   de tampon acétate de sodium comme indiqué dans l'exemple 4,   après quoi on ajuste le pH à 5,4-5,5. La cristallisation est achevée après 1 à 2 jours. La concentration en ion halogène au cours de la cristallisation   est d'environ 0,55 moles par litreo Exemple 6. 



   On dissout 4 g d'insuline cristallisée provenant d'un pancréas de boeuf dans 100 cm3 d'une solution acide de chlorure de zinc aqueux contenant 20 mg de zinc et 4   cm3   de HCL IN par 100 cm3, après quoi on ajoute 50 cm3 d'une solution aqueuse d'iodure de potassium contenant 20 g de KL par 100 cm3, et 50 cm3 d'un tampon acétate de sodium contenant 2,72 g de CH3COONa 3H2O et 2 cm3 de NaOH 1 N par 50 cm3, et on ajuste alors le pH à 5,4-5,5 La concen- tration en ions halogène est alors d'environ 0,32 moles par litre. La cris- tallisation s'achève après 1 à 2 jours. 



   Les cristaux d'insuline produits conformément aux exemples précé- dents apparaissent sous forme de rhomboèdres à arêtes vives avec des faces de cristal planes On peut les séparer du milieu de cristallisation par filtra- tion ou centrifugation et les libérer des résidus de milieu de cristallisation qui adhèrent en les lavant, par exemple avec de l'acétone. 



   REVENDICATIONS. 



   1. Procédé de fabrication d'insuline cristallisée, dans lequel l'insuline est mise à cristalliser à partir d'un milieu aqueux en changeant la valeur du pH du milieu jusqu'aux environs du point isoélectrique de l'in- sulins, caractérisé en ce qu'on communique au milieu aqueux de cristallisation une teneur en halogène sous forme ionogène en concentration supérieure à 2 mo- les par litre.

Claims (1)

1. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on a- joute au milieu de cristallisation un sel halogéné d'un métal alcalin, d'am- moniac ou d'un des métaux alcalino-terreux ou un mélange de ces sels.

   3. Procédé suivant les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que de l'insuline amorphe qui a pu être précipitée pendant la cristallisa - tion, est enlevée par addition d'un solvant organique, de l'acétone par exemple. <Desc/Clms Page number 5>

   4. Procédé de fabrication d'insuline cristallisée substantiellement comme décrit dans le texte en se référant particulièrement aux exemples.