<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention se rapporte à des substances d'origine bactérienne possédant de l'activité contre des moisissures. L'invention se rapporte en outre à des procédés pour isoler ces substances à partir de liqueurs de fermentation et pour les purifier.
On désigne selon la présente invention par Coliformine un produit nettement défini. Il contient les éléments carbone, hydrogène, azote, oxygène, soufre, phosphore et chlore dans les proportions approximatives suivantes: C = 47,6%, H = 7,02 %, N = 8,22%, 0 (par différence) =
EMI1.1
33,15 ., S = 0,23;, P = 0,47 %, 01 3,31 %, cendres = 0,0 %. Dans la partie ultraviolette du spectre, cette substance montre un maximum d'absorptîe3n étendu à 272 mL(..
Dans la partie infrarouge du spectre, une suspension de la substance dans de la parafl3ne liquide montre les 15 maxima d'absorption suivants exprimés en cc-1 : 3970/ 31601 2730/ 2170/ 2040/ 1660/ 1530/ 1410/ 1230/ ,in70/ 833/ z 757/ 683/ 665
Par l'analyse d'un hydrolysat de cette substance, on montre qu'elle contient environ 70 % d' aminoacides, 15% de glucose et 5% de xylo-
EMI1.2
se. Le poids moléculaire le plus bas correspondant aux données analyti- ques indiquées, est de 1062. Par distillation isotherme on obtient les valeurs suivantes: 3600, 3880, 4120 et 4410. Cette substance présente le spectre fongicide reproduit ci-dessous.
On peut modifier la substance ci-dessus par un nouveau traitement, obtenant un produit avec un spectre fongicide beaucoup plus étroit.
Une telle substance contient les éléments carbone, hydrogène, azote et oxy-
EMI1.3
gène dans les proportions approximatives suivantes: C = 47,88% E = 5599%5 N = 12,2%, 0 (par différence) = 33,93%, et avec les maxima d'absorption suivants dans la partie infrarouge du spectre déterminés pour une sus-
EMI1.4
pension dans de la paraffine liquide. On donne les spectres maxima d' a'ksorption en cm -1 = 3300/ 2900/ 1660/ 1550/ 1410/ 1240/ 1060.
On peut suivre la purification de la Coliformine par l'augmentation de l'activité contre -le Pal7..vlaria pullulans ou le Candida alibi- cana. L'activité donnée dans les exemples se rapporte à l'activité de la substance mentionnée plus haut qui montre les 15 maxima d'absorption dans la partie infrarouge du spectre. On décrit cette substance dans l'exemple 7 ci-dessous.
Comme mentionné plus haut, on a constaté que les nouvelles substances antibiotiques, dans des études in vitro, présentent de l'activité contre un grand nombre de moisissures données en exemple ci-dessous.
EMI1.5
1. - Moisissures pathozénes MME 1-*h2m¯me.
EMI1.6
<tb>
<tb>
Candida <SEP> albicans <SEP> Berkh <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 300 <SEP> 000
<tb> Candida <SEP> tropicalis <SEP> Berkh <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 300 <SEP> 000 <SEP>
<tb> Candida <SEP> Krusei <SEP> Berkh <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 2000 <SEP> 000
<tb>
EMI1.7
Torrlopsis (Cryptococcus)neofor#ans Red 1 : 2000 000 Hormodendru111 Pedrosoi Brumpt 1 :300 000 Microsporum felioam Fox et Blaxall 1 :300 000 Mierosporun gypseum Guiart et Grigoraki 1 : 300 000
EMI1.8
<tb>
<tb> Trichlophton <SEP> mentagropbytes <SEP> Blanchard <SEP> 1 <SEP> :300 <SEP> 000
<tb> Trichophyton <SEP> tonsurans <SEP> Malmsten <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 300 <SEP> 000
<tb>
Moisissures pathogènes pour les plantes.
EMI1.9
<tb>
<tb> Fusarium <SEP> nivale <SEP> Ces <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> 000
<tb>
EMI1.10
Botrytis aili Mmm 1 :
1 000 000
EMI1.11
<tb>
<tb> Rhizoctonia <SEP> solani <SEP> Kühn <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> 000
<tb> Verticillium <SEP> albo-atrum <SEP> R <SEP> et <SEP> Berth <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> 000
<tb> Cladosporium. <SEP> sp. <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> 000
<tb> Trichbdorma <SEP> viride <SEP> Pers <SEP> ex <SEP> F <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 250 <SEP> 000
<tb>
<Desc/Clms Page number 2>
3.
Moisissures attaquant le bois et la pulpe de bois.
EMI2.1
<tb>
<tb> Pullularia <SEP> pullmans <SEP> Berkh <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> 000 <SEP>
<tb>
EMI2.2
Cladosporîum elatga Nannf 1 1 000 oye* Oidiodendron grisoum Robak 1 1 000 000 Oidiodendron Bigrum Robak 1 1 000 000 Phialophora Melinii Conant 1 1 000 000 Trichospsmm heterr-èmorohum Nannf 1 1 000 000 Paezilcmyces -variai Bain 1 000 000 Fomes annosus Fr 500000 Gladosporum herbarum Link 1 500 000 Lecyptopoora lignicola Nannf 1 500 000 Oîdîodendron fusccm.
Robak 1 500 000 Mialophora fastigiata Conant 1 500 000 Merulîus Lai3zymans Fr 1 500000
EMI2.3
<tb>
<tb> Rhinocladiella <SEP> atrovirens <SEP> Nannf <SEP> 1 <SEP> 250 <SEP> 000
<tb>
EMI2.4
On peut obtenir la Cbliformine par fermentation d'une souche de bactéries gram-négatives, n.:;D .sporu1.antes et non-motiles, apparaissant en bâtonnets simples ou par paires ou parfais en chaînes avec une di-
EMI2.5
mension d'environ 0,5 - 0,6 à 1,2 - 19 $ microns dans une liqueur de fermentation appropriée contenant une source carbonée comprenant du sucrose, glucose, maltose, xylose et autres carbohydrates hydrnsolubles ou partiel- lement solubles dans l'eau.
Les sources appropriées d'azote pour le procédé de fermentation comprennent une grande variété de substances telles que aminoacides, asparagine, peptone, et autres composés azotés d'origine végétale ou animale. On peut également utiliser comme source d'azote des produits chi-
EMI2.6
miques comme les composés d'ammoniumo On donne ci-dessous un exemple de liqueur de fermentation appropriée pour la fermentation à l'échelle de laboratoire :
EMI2.7
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> g/l
<tb> tartrate <SEP> d'ammonium <SEP> 5
<tb> KH2PO4 <SEP> 1 <SEP> "
<tb>
EMI2.8
MgSO 4' 2FLzO 0,5 "
EMI2.9
<tb>
<tb> CaCl2 <SEP> (0 <SEP> ,1 <SEP> mole/1) <SEP> 5,0 <SEP> ml
<tb>
EMI2.10
FeC13 (2gFe/l) 0,5" ZnSO4 (2g ZD/l) 0,5 " Mgo% (001 Dsle/B 0,5"
EMI2.11
<tb>
<tb> H2O <SEP> 995,0 <SEP> "
<tb>
On met fermenter les bactéries dans des conditions aérobies
EMI2.12
à une température d'environ 25 x 3 et â une valeur de pH d'environ 5, 5. Après environ une semaine, on traite la liqueur,¯de ferment aticn suivant les exemples donnés ci-dessous.
Il y a lieu de noter que dans les exemples 1 à 9 la liqueur de fermentation est mise à bouillir pendant environ une minute, après quoi on enlevé les bactéries, tandis que dans les
EMI2.13
exemples 10 et 11, on n'enlève pas les bactéries après ebullition.
Exemple 1.
On extrait 500 cm3 de liqueur de fermentation à pH = 7 avec trois fois 100 cm3 de n-butanol. On enlève ensuite le solvant sous vide à la température ordinaire ou à une température légèrement supérieure.
<Desc/Clms Page number 3>
Le .résidu consistant en une huile brune montre 500 fois l'activité de la liqueur de fermentation originale, ce qui corres- pond à 5% de l'activité de la substance standard.
Exemple 2
On absorbe 7 litres de liqueur de fermentation sur 10 g de charbon actif pendant 1 heure, après quoi on élue le charbon avec 250 cm3 d'éthanol à 80 %.
La substance de cette solution dans l'éthanol montre une ac- tivité qui est 25 fois celle de la liqueur de fermentation originale.
Exempt 3.
On secoue 3,5 litres de liqueur de fermentation pendant 1 heu- re avec 50 g d'oxyde d'aluminium (Brockman) , après quoi on élue l'oxyde d'aluminium avec des parties égales d'hydroxyde de sodium 0,2 molaire et d'éthanol à 95%. On utilise 4 fois 250 cm3 de ce mélange. On neutralise l'éluat avec de l'acide chlorhydrique.
La substance ainsi obtenue montre une activité qui est 20 fois celle de la liqueur de fermentation.
Exemple
On fait absorber sur du silica gel la substance active dans 500 cm3 de liqueur de fermentation, après quoi on élue le gel avec 150 cm3 d'acide chlorhydrique à pH = 2. On neutralise cette solution avec de l'hydroxyde de sodium.
L'activité de la substance isolée à partir de cette solution est 20 fois celle de la liqueur originale de fermentation.
Exemple 5
On ajoute 1 litre de liqueur de fermentation tout en agitant 25 g d'acide benzoique dans 100 cm3 d'acétone On enlève l'acide benzoique après 2 heures,on le lave puis onle sèche à 40 C pendant 48 heures.
L'acide benzoïque sec, sur lequel la substance active est absorbée, est traité avec 400 cm3 d'éther éthylique sec pour dissoudre l'acide benzoïque. On isole le résidu et on l'extrait pendant 24 heures avec de l'éther éthylique. Le résidu gris obtenu est pratiquement exempt d'acide benzoïque.
Cette substance montre 600 fois l'activité de la liqueur de fermentation originale.
Exemple 6.
On extrait 10 g de la substance obtenue suivant l'exemple 5, avec 300 cm3 d'éthanol pendant 18 heures dans un percolateur. On refroidit l'extrait à + 5 C et on sépare la substance précipitée, on la lave avec de l'éther éthylique refroidi, puis on la sèche sur chlorure de calcium dans un exsiccateur.
Cette substance montre une activité qui est 6000 fois celle de la liqueur de fermentation originale et qui représente 63 % de l'activité de la substance la plus pure. Résultats analytiques : C = 49,81%, H = 7,90 %, N = 8,99 %, S = 0,62%, P = 1, 66 %, cendres = 7,3 %.
Exemple 7
On dissout 310 mg de la substance isolée suivant l'exemple 6, dans 50 cm3 de méthanol bouillant On ajoute 5 cm3 d'éthanol absolu contenant 3% d'acide chlorhydrique gazeux et on continue l'ébullition pendant 2 minutes. On filtre la solution pendant qu'elle est encore chau- de, puis on la refroidit à la température ordinaire, après quoi on ajoute
<Desc/Clms Page number 4>
150 cm3 d'éther éthylique. On lave le précipité deux fois avec de l'éther éthylique et on le sèche dans un exsiocateur.
Cette substance montre une activité qui est 9600 fois celle de la liqueur de fermentation. Ce chlorhydrate a pour analyse :C = 47,6%, H = 7,02 %, N = 8,22 %, 0 (par différence) = 33,85, Cl = 3,31 %, S = 0,23 %, P = 0,47 %, cendres = 0,0 %.
Exemple 8
On met absorber 300 cm3 de la solution méthanolique restante de l'exemple 6 sur de l'oxyde d'aluminium, on traite avec de l'acide chlorhydrique dilué à une valeur de pH = 6. On lave le chlorured'aluminium avec 100 cm3 de méthanol et 100 cm3 d'eau, après quoi la majeure partie des composés colorés non actifs sont enlevés . On effectue l'élution avec 3 litres d'acide chlorhydrique 0,36 molaire, puis on neutralise la solution à une valeur de pH de 6,5, valeur à laquelle l'oxyde d'aluminium précipite. On réduit alors le volume à 290 cm3, à 50-60 C.
On extrait cette solution avec 3 fois 150 cm3 de n-butanol, qui est traité avec 3 fois 50 cm3 d'eau pour enlever le chlorure de sodium dissous, après quoi on sépare la solution butanolique et on enlève sous vide à 50 C le butanol.
Le résidu est une huile épaisse, que l'on secoue avec 50 cm3 d'éthanol absolu et 75 cm3 d'éther éthylique et, suite à ce traitement, une substance précipite Après séchage, cette substance montre une activité qui est 8400 fois celle de la liqueur de fermentation originale et représente 87 % de la substance la plus active.
Exemple 9.
On extrait pendant une minute avec 2 fois 50 cm3 de pyridine bouillante 3 g de la substance isolée dans l'exemple 5, après quoi on refroidit la solution à la température ordinaire et on la soumet à un essorage.
On enlève la pyridine sous vide; l' huile brune résiduelle présente une activité qui est 1800 fois selle de la liqueur de fermentation originale et qui correspond à 19 % de la substance la plus active.
Exemple 10.
On fait absorber sur 5 g de silica gel la substance active dans 1000 cm3 de liqueur de fermentation non filtrée, puis, après essorage, on sèche le gel à 40 C et on l'élue avec 25 g de phénol. Après essorage, on précipite la solution phénolique avec 20 cm3 d'acétone.
Cette substance montre une activité 1200 fois plus grande que celle de la liqueur de fermentation originale.
Exemple 11.
On fait bouillir 1 g de la substance obtenue dans l'exemple 10 avec 3 fois 100 cm3 d'eau distillée, chaque fois pendant 30 minutes.
On lyophilise la solution aqueuse, après quoi on obtient une substance qui montre une activité 6600 fois plus grande que celle de la liqueur de fermentation originale, ou qui représente 69 % de l'activité de la substance la plus pure.
Les résultats analytiques pour cette substance sont : C = 47,88 %, H = 5,99 %, N = 12,2%, 0 (par différence) = 33,93%.
Cette substance eontient 6% de glucose, mais pas de xylose.
Ces modifications se traduisent par un spectre fongicide plus étroit et aussi par une absorption modifiée dans la partie infrarouge du spectre.
<Desc/Clms Page number 5>
On obtient les 7 maxima d'absorption suivants avec une suspension dans de la paraffine liquide. Maxima d'absorption exprimés en on-1 : 3300/
2900/ 1660/ 1550/ 1410/ 1240/ 1060.
REVENDICATIONS.
1. Substances efficaces pour l'inhibition de la croissance de moisissures, choisies dans le groupe consistant en une substance capa- ble de former des sels avec des acides, qui contient les éléments car- bone, hydrogène, azote, oxygène, soufre, phosphore et chlore, qui montre des maxima d'absorption caractéristiques dans la partie infrarouge du spectre, lorsqu'elle est en suspension dans de la paraffine liquide, aux fréquences suivantes exprimées en car' - 3970/ 3160/ 2730/ 2170/
2040/ 1660/ 1530/ 1410/ 1230/ 1070/ 833/ 789/ 757/ 683/
665, et en la base libre correspondante.
2. Substance efficace pour l'inhibition de la croissance de moisissures, contenant les éléments carbone, hydrogène, azote, oxygène, soufre, phosphore et chlore dans les pourcentages suivants: C = 47,6%,
H = 7,02%, N = 8,22%, 0 (par différence) = 33,15%, S = 0,23, P = 0,47%,
Cl = 3,31 %, cendres = 0,0 %, et base libre correspondante.
3. Substances efficaces pour l'inhibition de la croissance de moisissures, choisies dans le groupe consistant en une substance, con- tenant les éléments carbone, hydrogène, azote, et oxygène, montrant les maxima d'absorption caractéristiques dans la partie infrarouge du spectre, lorsqu'elle est en suspension dans de la paraffine liquide, aux fréquences suivantes exprimées en cm-1: 3300/ 2900/ 1660/ 1550/ 1410/ 1240/ 1060/.
4. Substance efficace pour l'inhibition de la croissance de moisissures,contenant les éléments carbone, hydrogène, azote, et oxygène dans les pourcentages suivants: C = 47,88 %, H = 5,99%, N = 12,2 %, 0 (par différence) = 33,93%.
5. Procédé de préparation de substances efficaces pour l'inhi- bition de la croissance de moisissures, caractérisé en ce qu'on isole ces substances à partir d'une liqueur de fermentation en faisant fermenter une souche de bactéries gram-négatives, non-sporulantes et non-motiles, apparaissant en bâtonnets simples ou par paires ou parfois en chaînes avec une dimension d'environ 0,5 - 0,6 à 1,2 - 1,8 microns, dans une liqueur de fermentation appropriée.
6. Procédé de préparation de substances efficaces pour l'inhibition de la croissance de moisissures, caractérisé en ce qu'on isole, à partir d'une liqueur de fermentation en faisant fermenter une souche de bactéries gram-négatives, non-sporulantes et non-motiles, apparaissant en bâtonnets simples ou par paires ou parfois en chaînes avec une dimen- sion d'environ 0,5 - 0,6 à 1,2 - 1,8 microns dans une liqueur de fermentation appropriée, une substance contenant les éléments carbone, hydrogène, azote, oxygène, soufre, phosphore et chlore, présentant des maxima d'absorption caractéristiques dans la partie infrarouge du spectre, lorsqu'elle est en suspension dans de la paraffine liquide, aux fréquences suivantes exprimées en cm-1 :
3970/ 3160/ 2730/ 2170/ 2040/ 1660/ 1530/ 1410/ 1230/ 1070/ 833/ 789/ 757/ 683/ 665, et la base libre correspondante.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.