Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique L'invention a pour objet un procédé de prépa ration d'un nouvel antibiotique. Le nouvel antibio tique sera dénommé, dans la description qui suit, Amphotéricyne ; il s'agit d'un mélange qui peut être séparé en deux constituants, qui seront appelés Amphotéricyne A et Amphotéricyne B .
Selon l'invention, cet antibiotique est préparé en cultivant une espèce nouvelle de Streptomyces, la souche sp. 3694, ou un mutant de cette souche, dans un milieu nutritif aqueux comprenant une source de carbone et d'énergie assimilable et fermentescible et une source d'azote assimilable, en aérobie et en im mersion, jusqu'au moment où une activité fongicide substantielle est conférée à ce milieu et en isolant l'antibiotique du milieu.
<I>Le microorganisme</I> Le microorganisme utilisé pour la préparation d'Amphotéricyne est une espèce découverte récem ment de Streptomyces isolé d'un échantillon obtenu à Tembladora, sur la rivière Orinoco, en Amérique du Sud. Une culture de l'organisme vivant a été dé posée et constitue une partie de la collection de cul tures mères du Rutgers Institute of Microbiology (New Brunswick, New Jersey), où elle est disponi ble ; et elle a reçu le numéro 3694 dans la collection Waksman et est désignée ci-après sous le nom de Streptomyces sp. 3694.
L'invention est également exécutable avec des mutants de l'organisme particulier décrit ici, mutants qui peuvent être obtenus sous l'action d'agents dé terminant un changement, tels que des rayons X, des radiations ultraviolettes et des ypérites azotées. Le microorganisme, lorsqu'il est examiné par la méthode d'application par bande sur l'agar-agar de levure de bière, quant à son activité antibiotique vis- à-vis à la fois des bactéries et des champignons, ne détruit aucune des bactéries d'essai, mais détruit les champignons d'essai Saccharomyces cerevisiae, Rho- dotorula glutinis,
Candida albicans et Aspergillus piger.
Ci-après, est donnée une description des colo nies du microorganisme soumises à une incubation pendant des périodes différentes et sur des milieux différents <I>Plant de pommes de terre</I> Au bout de 15 jours, la culture s'étend, très lourde, humide, durcie, avec sensiblement la même couleur que les pommes de terre, des spores blancs couvrant la partie de la culture sur la portion in clinée.
<I>Lait de tournesol:</I> En 7 jours, le noyau de la culture à la surface est incolore. Le lait tourne au bleu pourpre, s'éclair cissant progressivement du sommet vers le fond et indiquant une protéolyse sans coagulation.
<I>Agar-agar</I> Czapek-Dox NaN03, 3 gm ; KH2P04, 1 gm ; KCl, 0,5 gin ; MgS04. 7H20, 0,5 gm ; FeS04. 7H20, 0,01 gm ; glu cose, 40 gm ; agar-agar, 15 gm ;eau distillée jusqu'à 1,000 ml.
Aucune croissance en 15 jours en dépit de deux inoculations ou ensemencements. <I>Plant</I> d'agar-agar <I>pourpre au glucose-milieu</I> nutritif- bromocrésol Extrait de boeuf, 3 gin ; peptone de protéine, 10 gin; glucose, 10 gin; NaCl, 5 gm ; agar-agar, 20 gin; pourpre de bromocrésol, 0,15 gin; eau distillée jusqu'à 1,000 ml. pH7.0.
Croissance modérément lourde en 51 jours, ri dée, brillante, asporogène. Le ridage sur tous les agar-agars est très caractéristique. Les rides sont pa rallèles, avec des dentelures en lignes droites dans la culture à angles droits les unes par rapport aux autres, donnant un aspect de mur de maçonnerie avec des rectangles de différentes dimensions. <I>Plant d'agar-agar</I> Sabouraud Glucose, 40 gin ; néopeptone, 10 gin ; agar-agar, 15 gin ; eau distillée 1,000 ml.
Au bout de 4 jours, la culture est jaune, tour nant au brun au bout de 7 jours et toute brune au bout de 15 jours. La culture est lourde, d'abord bril lante, puis tournant au mat, ridée avec un pigment brun diffusible visible au bout de 3 à 4 jours. <I>Plant d'agar-agar</I> glucose-asparagine Glucose, 10 gin ; K2HP04, 0,5 gin ; asparagine, 0,5 gin ; agar-agar, 15 gin ; eau distillée, 1,000 ml.
Au bout de 7 et 15 jours, la culture est modé rément lourde, non ridée, incolore, avec des spores blancs tournant au gris, et un pigment jaune diffu- sible tournant au brun. En plus, une matière insolu- ble dans l'eau et d'un jaune foncé est déposée sur les bords du plant d'agar-agar et à la base du plant. Cette matière est soluble dans le méthanol, le pro panol et la diméthylformamide.
Le microorganisme est caractérisé en outre par le fait que du sulfure d'hydrogène n'est pas produit, comme le montre l'essai avec du papier à l'acétate de plomb dans un milieu comprenant: peptone de protéose, 20 gin ; glucose, 1 gin ; Na2HP04 2 gin ; et eau distillée jusqu'à 1 litre. La culture se déve loppe sous forme d'une pellicule blanche asporogène. De plus, de la gélatine Difco est liquéfiée. La cul ture se développe sous forme d'un noyau légèrement brun et asporogène à la surface.
De plus, dans un bouillon de nitrate Difco, la culture se développe sous forme d'une pellicule légèrement brune et as- porogène. Le bouillon s'assombrit avec un pigment brun de diffusion. Le nitrate est fortement réduit en nitrite. De plus, de l'amidon est hydrolysé par la culture lorsque celle-ci se développe dans un milieu contenant de l'amidon.
Pour déterminer la teneur en carbone et en hy drogène de Streptomyces sp. 3694, des essais ont été effectués comme suit: . quatre séries de tubes d'agar- agar avec des sels minéraux sont préparées avec 1 mg par ml de ces quatre sources de nitrogène respecti vement: (NH4)2S04, NaN03, asparagine -et hydro- lysat de caséine. Dans chaque série, chaque tube est renforcé avec 10 mg par ml de l'une des seize sour ces possibles de carbone et d'énergie.
Celles-ci sont l'amidon, l'inuline, la dextrine, le raffinose, le mal tose, le lactose, le sucrose, le sorbose, le glucose, le dulcitol, l'inositol, le sorbitol, le mannitol, le xylose, l'arabinose et le glycérol.
L'agar-agar dans les tubes (10 ml) est enfermé et les plants sont traités avec une suspension de spo res de Streptomyces sp. 3694 dans de l'eau distillée. Au bout de 9 jours d'incubation, la culture a été examinée et les résultats indiquent que le microor ganisme est susceptible d'assimiler du carbone à par tir de l'amidon, de la dextrine, du maltose, du glu cose et du mannitol, quelle que soit la source de l'hydrogène. Avec les sources organiques d'azote, le lactose, le sucrose, l'inositol et le glycérol peuvent également être utilisés, bien qu'une culture avec ces sources de carbone puisse être plus légère qu'avec le glucose et ses polymères.
Des nitrates ne constituent des sources d'azote avec aucune des sources de car bone et d'énergie, tandis que l'asparagine et l'hydro- lysat de caséine peuvent servir de seules sources de carbone, d'azote et d'énergie. <I>L'antibiotique</I> Le Streptomyces sp. 3694 produit un mélange d'antibiotiques. Le mélange lui-même, aussi bien que les antibiotiques spécifiques isolés de ce même mé lange, présentent un spectre fongicide large, mais pas de propriétés bactéricides significatives.
Dans l'exécution du présent procédé, le Strepto myces sp. 3694 est cultivé d'ordinaire à une tempé rature de 230 C à 301, C, de préférence à environ 25o C.
Des sources appropriées de carbone sont: l'ami don, la dextrine, les sucres tels que maltose, lactose et glucose, le glycérol, etc. Des sources appropriées d'azote sont l'asparagine, l'hydrolisat de caséine, la farine de soja, de l'extrait de boeuf, de l'extrait de levure, etc. La fermentation est mise en aeuvre le plus souvent pendant environ 24 à 150 heures. A la fin de cette période de temps, une quantité substantielle d'Amphotéricyne a été formée (comme montré par des essais biologiques).
L'Amphotéricyne peut être séparée de la culture par l'un des trois moyens suivants 1. Le mycélium est séparé de tout le bouillon par filtration ou centrifugation, et l'Ampho- téricyne est extraite du mycélium après avoir abaissé le pH du mycélium d'environ 2 à 3 par traitement avec un acide.
L'extraction est effectuée avec un solvant approprié, tel qu'un alcanol inférieur (par exemple l'isopropanol, le n-propanol ou le n-butanol). L'évapora tion de l'alcanol provoque la précipitation de l'Amphotéricyne brute.
2. Tout le bouillon est alcalinisé à un pH d'en viron 11, et de préférence à un pH d'environ 12, au moyen d'une base telle que l'hydro xyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium. Le bouillon est ensuite agité et filtré, et le fil- trat est neutralisé à un pH d'environ 7 au moyen d'un acide tel qu'un acide minéral (par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide sulfuri que ou l'acide phosphorique) pour précipiter l'Amphotéricyne brute.
3. Le pH de tout le bouillon est réglé soit à une valeur d'environ 2 à 3 (par traitement avec un acide), soit à une valeur de 10 à 11 (par traitement avec une base), l'Amphotéricyne étant plus soluble à ces gammes de pH. Le bouillon est ensuite extrait avec un agent ap proprié d'extraction, tel que les alcanols men tionnés précédemment, puis est filtré et les phases sont séparées (si du n-butanol est uti lisé). L'Amphotéricyne brute est ensuite pré cipitée directement du filtrat par neutralisa tion à un pH d'environ 7 et par enlèvement d'une partie de l'agent d'extraction par dis tillation dans le vide.
Une purification ultérieure de l'Amphotéricyne brute isolée est le fractionnement en ses deux cons tituants, Amphotéricyne A et Amphotéricyne B. Ce fractionnement est mis en oeuvre par l'un ou l'autre des moyens ci-après 1.
Le précipité d'Amphotéricyne brute est traité en bouillie dans un alcool, tel qu'un alcanol inférieur (par exemple le méthanol, le h-pro- panol, l'isopropanol et le butanol) à un pH bas (obtenu en traitant la bouillie avec un acide tel qu'un acide minéral), et est filtré. La matière insoluble consiste principalement en Amphotéricyne B brute. Le filtrat est neu tralisé avec une base, telle que l'hydroxyde de sodium, pour provoquer la formation d'un précipité d'une matière cristallisée purifiée re présentant principalement l'Amphotéricyne A.
2. Le précipité d'Amphotéricyne brute est traité en bouillie dans un solvant, tel qu'une di- (alcoyle inférieur) amide d'acide alcandïque inférieur (par exemple la diméthylformamide, la diméthylacétamide ou la diéthylforma- mide), et est filtré. La matière insoluble con siste principalement en Amphotéricyne B brute.
En traitant la solution d'amide avec un mélange d'eau et d'un solvant polaire or ganique, tel qu'un alcool aqueux (par exem ple une solution de méthanol et d'eau) ou une cétone aqueuse (par exemple une solu tion d'acétone et d'eau), on obtient un pré cipité cristallisé comprenant principalement l'Amphotéricyne A.
Les Amphotéricynes A et B sont des substances amphotériques qui forment aisément des sels avec à la fois des bases et des acides. Ainsi, en traitant l'Amphotéricyne avec une base inorganique, telle qu'une base d'un métal alcalin (par exemple l'hy droxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium) ou une base d'un métal alcalino-terreux, le sel du métal correspondant est formé. En traitant l'Amphotéricyne avec un sel d'un métal alcalino-terreux (par exemple le chlorure de calcium ou le chlorure de magnésium) dans un alcool tel que le méthanol, des complexes sont formés.
En faisant réagir l'Amphotéricyne avec un hydroxyle d'ammonium ou une base azotée or ganique, le sel correspondant d'ammonium ou d7ami- ne est formé.
Chacune des Amphotéricynes réagit de plus avec des acides à la fois minéraux et organiques pour for mer le sel de l'acide correspondant. Ainsi, l'Ampho- téricyne peut être traitée par des acides minéraux, tels que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique, pour former le sel correspon dant ; ou encore elle peut être traitée par des acides organiques, tels que l'acide acétique, l'acide citrique ou l'acide tartrique, pour former les sels des acides correspondants.
Les exemples ci-après illustrent l'invention. <I>Exemple 1</I> <I>Fermentation du Streptomyces</I> sp. <I>3694</I> Une charge de 12 litres de Streptomyces sp. 3694 est mise à fermenter dans le milieu d'ensemencement, pendant une durée et dans des conditions indiquées ci-après <I>Préparation</I> <I>A. Première phase</I> Source d'ensemencement - culture de Strepto myces sp. 3694, développée sur des plants d'agar- agar Gould.
Milieu - 3:% d'agent nutritif de Staley 4S 2 % de glucose 0,0005 0/<B>0</B> COC12. 6H20 0,1 % CaCO3 pH réglé à 7,0 - 7,2 Stérilisation pendant 30 minutes à 1210 C. Volume - 100 ml dans un ballon de 500 ml. Température - 250 C.
Durée d'ensemencement - 72 heures sur un agita teur alternatif (170 cycles par minute). <I>B. Seconde phase</I> Source d'ensemencement - 10 % de la première phase.
Milieu - le même que dans la première phase Stérilisation - 40 minutes à 121 C.
Volume - 480 ml dans un ballon de 2000 ml. Température - 250 C Durée d'ensemencement - 48 heures sur un. agita teur alternatif (120 cycles par minute). <I>Conditions de fermentation</I> Milieu - 3 '% d'agent nutritif de Staley 4S 2 % de glucose 0,25 0/<B>0</B> de CaC03 0,1 % NaCl 0,0005 0/<B>0</B> COC12 Stérilisation - 15 minutes à 1210 C.
Température - 25o C. Puissance dépensée pour l'agitation - 0,2 CV/4541. Aération - courant d'air avec une vitesse linéaire de 60 cm/min.
Cycle de fermentation - 144 heures.
Anti-mousse - Huile de combustion de première qualité (environ 0,5 % de la charge). Importance de l'ensemencement - 480 ml de la se conde phase du ballon (4 fl/o).
Volume - 12.000 ml.
Les résultats de la fermentation sont donnés dans le tableau ci-après (eu égard à deux charges)
EMI0004.0004
Charge <SEP> 1 <SEP> 2
<tb> Durée <SEP> Essai <SEP> sur <SEP> S.Cerevisiae <SEP> Essai <SEP> sur <SEP> S.Cerevisiae
<tb> de <SEP> fermentation, <SEP> Unités <SEP> <B>dé</B> <SEP> dilution/ml <SEP> pH <SEP> Unités <SEP> de <SEP> dilution/ml <SEP> pH
<tb> heures <SEP> Extrait* <SEP> Bouillon* <SEP> Extrait <SEP> Bouillon
<tb> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 6,5 <SEP> - <SEP> - <SEP> 6,6
<tb> 25 <SEP> 1600 <SEP> 120 <SEP> 7,2 <SEP> 640 <SEP> 120 <SEP> 7,2
<tb> 49 <SEP> 1600 <SEP> 120 <SEP> 7,0 <SEP> 120 <SEP> 120 <SEP> 7,1
<tb> 73 <SEP> 8000 <SEP> 180 <SEP> 7,1 <SEP> 12,000 <SEP> 80 <SEP> 7,3
<tb> 97 <SEP> 4000 <SEP> 80 <SEP> 7,0 <SEP> 3,000 <SEP> 120 <SEP> 7,1
<tb> 121 <SEP> 3000 <SEP> 40 <SEP> 6,9 <SEP> 4,000 <SEP> 120 <SEP> 7,
9
<tb> 144 <SEP> 9706 <SEP> 2560 <SEP> 7,2 <SEP> 40 <SEP> 80 <SEP> 8,1
<tb> Des <SEP> échantillons <SEP> ont <SEP> été <SEP> centrifugés <SEP> (les <SEP> essais <SEP> portant <SEP> sur <SEP> le <SEP> milieu <SEP> surnageant <SEP> étant <SEP> classés <SEP> sous <SEP> <SEP> bouillon <SEP> ), <SEP> et
<tb> le <SEP> centrifugat <SEP> extrait <SEP> avec <SEP> un <SEP> volume <SEP> de <SEP> butanol <SEP> égal <SEP> à <SEP> l'échantillon <SEP> original <SEP> (les <SEP> essais <SEP> portant <SEP> sur <SEP> cet <SEP> extrait <SEP> étant
<tb> classés <SEP> sous <SEP> <SEP> extrait <SEP> ). <SEP> Les <SEP> unités <SEP> de <SEP> dilution/ml <SEP> sont <SEP> l'inverse <SEP> du <SEP> nombre <SEP> minimum <SEP> de <SEP> ml <SEP> d'échantillon <SEP> encore <SEP> actif
<tb> en <SEP> dilution <SEP> dans <SEP> un <SEP> ml.
<I>Exemple 2</I> <I>Fermentation de Streptomyces</I> sp. <I>3694</I> Un ensemencement approprié, préparé suivant la manière décrite dans l'exemple 1, est introduit dans un milieu de fermentation contenant Farine de soja<B>.......... 10</B> gin Pommes de terre pulvérisées 10 gin Dextrose<B>.............. 10</B> gin CoC12. 6H20 <B>..........</B> 10 ml d'une solution à 0,05 fl/o CaCO3 ................
lgm Eau distillée <B>............</B> 1 litre Le milieu est stérilisé dans un autoclave à 121O C pendant 20 minutes préalablement à l'introduction de l'ensemencement. Au bout de quatre jours, des essais ont été effectués vis-à-vis de Saccharomyces cerevisiae avec une partie du bouillon qui a été lyo philisée et reconstituée avec de l'eau jusqu'à environ 2 fois 1/s la concentration originale et avec l'extrait à l'alcool butylique des cellules lavées, reconstituées jusqu'au volume de l'échantillon original,
ces essais ont donné les résultats ci-après
EMI0004.0021
Essai <SEP> sur <SEP> S.Cerevisiae
<tb> Unités <SEP> de <SEP> dilution/ml
<tb> Bouillon <SEP> .............. <SEP> 5000
<tb> Extrait <SEP> des <SEP> cellules <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5000 Ensuite de ces essais, la fermentation est pour suivie pendant 5 jours.
L'Amphotéricyne peut être extraite de l'une ou l'autre des manières indiquées ci-après <I>Extraction à</I> l'isopropanol <I>de tout le bouillon</I> L'extraction de l'Amphotéricyne à partir de tout le bouillon de l'exemple 1 est mise en aeuvre en ajoutant 80 à 170 fl/o du volume du bouillon en iso- propanol et en réglant à un pH de 2,0 avec de l'acide sulfurique. Après agitation pendant environ 1/2 heure, le mélange est filtré, de préférence en utilisant l'aide d'un filtre.
Le pH du filtrat est réajusté à environ 7 avec de l'hydroxyde de sodium et l'isopropanol est éliminé par distillation dans le vide à une tempéra ture non supérieure à 350 C. Le mélange est ensuite laissé dans une chambre froide pendant la nuit, le précipité qui se forme est éliminé par filtration, lavé avec de l'acétone et séché dans le vide. Un mélange d'Amphotéricyne A et d'Amphotéricyne B est obtenu avec un rendement d'environ 40 0/0.
Les essais sur le mélange ont donné environ 1500-2500 ud/mg (Saccharomyces cerevisiae) ; ud/mg (unités de dilu- tion/mg) désigne l'inverse du nombre minimum de mg du mélange qui est encore actif en dilution dans un ml.
Extraction <I>au</I> butanol <I>de tout le bouillon</I> A 9,4 litres du milieu de culture, titrant 3000 ud/ ml, on ajoute un quart de son volume de butanol. Le pH est abaissé à 2.0 avec de l'acide sulfurique et le mélange est bien agité pendant 1/2 heure. Le produit marque Hyflo (5 % P/v) ou tout autre adjuvant de filtrant est alors ajouté et le mélange est filtré. Le filtrat est placé dans un entonnoir de séparation et la couche de butanol est séparée et re tenue.
La solution de butanol est alors distillée jus qu'à 1/s de son volume original sous vide à une tem pérature non supérieure à 35c, C. Il se forme un pré cipité qui est éliminé par filtration, qui est bien lavé avec de l'acétone et qui est séché dans le vide.
Le produit, qui est obtenu avec un rendement d'environ 22 %, est un mélange d'Amphotérieyne A et d'Am- photéricyne B et des essais sont effectués avec envi- ron <B>1600</B> ud/mg vis-à-vis du Saccharomyces cerevi- siae et avec environ 960 ud/mg vis-à-vis du Candida albicans.
<I>Extraction</I> d'Amphotéricyne <I>du mycélium</I> 1 litre du milieu de culture contenant de l'Am- photéricyne est centrifugé pour séparer le filtrat et le mycélium. Le gâteau humide de mycélium est agité avec 200 ml de n-propanol, est réglé à un pH de 2,0 à 3,0 avec de l'acide sulfurique et est laissé dans une chambre froide pendant la nuit.
Le propanol est séparé par centrifugation et le gâteau mycélial est extrait trois nouvelles fois avec 100 ml de portions de n-propanol. Les extraits combinés de propanol sont concentrés dans le vide sous un faible volume d'environ 130 ml, volume pour lequel se forme un précipité. Ce précipité est éliminé par centrifugation et est séché dans le vide.
On récupère environ 1.114 gm, avec une puissance d'environ 1176 ud/mg vis-à- vis du Candida. 820 mg de ce produit solide est fi nement pulvérisé et est dissous par chauffage dans un mélange de 80 ml de n-butanol et de 16 ml de méthanol, alors que 80 ml d'eau sont ajoutés pro gressivement. A cette solution, sont ajoutés 48 ml d'hexane, et le mélange est agité, puis est laissé re poser à la température ambiante pendant la nuit.
Une fraction de cristaux jaune pâle d'Amphotéricyne est formée ; elle est filtrée et séchée dans un dessicca- teur. D'autres fractions d'une matière moins pure peuvent être obtenues par concentration des liqueurs mères dans le vide.
<I>Extraction de tout le</I> bouillon <I>rendu basique</I> A un échantillon de 500 ml du milieu de cul ture contenant l'Amphotéricyne et titrant à l'essai <B>11000</B> ud./ml vis-à-vis du Saccharomyces cerevisiae, est ajouté un volume égal d'alcool isopropylique. Le pH de ce mélange est alors élevé à 10,
5 en utilisant de l'hydroxyde de sodium à 20 %. Ce mélange est ensuite agité pendant 1/2 heure, on ajoute 2'% de Hyflo (P/v),
et le mélange est filtré. Le pH du filtrat est abaissé à 7 en utilisant 20 '% d'acide sul- furique et l'alcool isopropylique est éliminé dans le vide à une température non supérieure à 350 C. Après avoir laissé reposer pendant une nuit, le pré cipité est éliminé par filtration, est lavé à l'eau puis à l'acétone et est séché dans le vide.
Le rendement s'élève à environ 1.22 g (77 0/0) d'un mélange d'Am- photéricyne A et d'Amphotéricyne B, dont l'essai donne environ 3400 ud/mg (Saccharomyces cere- visiae).
Les mélanges d'Amphotéricyne peuvent être frac tionnés en leurs constituants, Amphotéricyne A et Amphotéricyne B, comme indiqué ci-après <I>Cristallisation utilisant de</I> l'alcool L'Amphotéricyne obtenue ci-dessus est mélangée,
de façon à former une bouillie avec de l'alcool iso- propylique aqueux à 70 % à une concentration cor- respondant à une activité de 32 000-35 000 ud/ml contre Candida albicans, tout en agitant ; le pH est abaissé à 2 avec de l'acide chlorhydrique. La matière insoluble (Amphotéricyne B brute) est éliminée par filtration et le pH du filtrat est élevé à environ 7,5.
Après avoir laissé reposer pendant une nuit, le pré cipité cristallisé, consistant principalement en Am- photéricyne A purifiée, est éliminé par filtration, est lavé à l'acétone et séché dans le vide. Le rendement d'Amphotéricyne A est d'environ 50 % basé sur l'ac- tivité biologique.
<I>Cristallisation utilisant la</I> diméthylformamide L'Amphotéricyne est mélangée de façon à former une bouillie avec de la diméthylformamide (1 g/ 20 ml). Tout en agitant, le pH est abaissé à 7, en utilisant de l'acide chlorhydrique concentré.
Après agitation pendant 1/2 heure, le produit Hyflo (1 % P/v) est ajouté et le mélange est filtré. Au fil- trat, est ajouté un volume de méthanol, suivi par la lente addition d'un volume d'eau.
(Bien qu'une solution de méthanol et d'eau soit préférée, l'étha nol, l'acétone ou le dioxane dans l'eau exercent éga lement une action efficace). On laisse alors le mé lange reposer pendant la nuit avec le pH résultant de 4,5. Le précipité ainsi formé est éliminé par fil tration, est lavé à l'acétone et est séché.
Il est com- posé de 85-90 % d'Amphotéricyne B, de 5-10 % d'Amphotéricyne A et d'une faible quantité d'impu retés.
Le pH de la liqueur mère résultante d'où l'Amphotéricyne B a été isolée est ensuite élevé à 8 par addition d'hydroxyde de sodium, et on ajoute encore 3 volumes d'eau. Après avoir laissé reposer pendant la nuit, le précipité est éliminé par filtration, est lavé à l'acétone et est séché.
Ce précipité est composé de 80-85 % d'Amphotéricyne A, de 5- 10 % d'Amphotéricyne B et d'une faible quantité d'impuretés.
La récupération de toute l'activité s'élève à 90-95 La fraction contenant en prédominance l'Ampho- téricyne B peut être encore purifiée en en faisant une bouillie avec de l'isopropanol aqueux à 70 %, à une concentration de 1 g par 100 ml à un pH 2 pendant 1/2 heure. Le mélange est ensuite filtré, le filtrat est chauffé à 450 C et le pH est élevé lentement à 5 avec de l'hydroxyde de sodium.
On laisse ensuite le mélange refroidir lentement à la température am biante et reposer pendant la nuit. Le produit cris tallisé (rendement d'environ 50 '0 /0) est ensuite éli miné par filtration, est lavé à l'acétone et est séché. Il représente essentiellement l'Amphotéricyne B pure.
La fraction contenant en prédominance l'Ampho- téricyne A peut être à nouveau purifiée en formant une bouillie dans la diméthylformamide à une concentration de 1 g par 20 ml, en agitant pendant 1 heure,
en éliminant par filtration les matières insolubles et en ajoutant le filtrat lentement à un volume égal de méthanol aqueux à 50 %. Le préci- pité cristallisé est éliminé par filtration après avoir reposé pendant la nuit, est lavé à l'acétone et est séché.
L'Amphotéricyne A sensiblement pure est obtenue ainsi avec un rendement de 70-80% approximativement.
Des sels et des complexes d'Amphotéricyne peuvent être préparés suivant les indications données ci-après <I>Préparation de sels de métaux alcalins</I> d'Amphotéricyne L'Amphotéricyne, soit en un mélange brut, soit sous la forme de cristaux purifiés d'Amphotéricyne A ou B, forme aisément des sels et le mode opératoire suivant est également efficace pour former soit le sel de sodium ou de potassium du mélange,
soit les sels des constituants purifiés A ou B L'Amphotéricyne A cristallisée est mise en sus pension dans une quantité de méthanol telle que la concentration de l'antibiotique soit d'environ 250 000 u/ml (Saccharomyces cerevisiae). 2 équivalents d'hy droxyde de sodium méthanolique 1N sont ajoutés et le mélange est agité pendant 15 minutes pour assurer une solubilisation complète de l'antibiotique. La solution est filtrée et 10 volumes d'acétone sont ajoutés au filtrat.
Un précipité de sel de sodium est ainsi formé, est éliminé par filtration, est lavé à l'acétone et est séché dans un dessiccateur. Le rendement du sel de sodium est d'environ 90 % de l'Amphotéricyne originale basée sur son activité biologique (in vitro).
Le sel de sodium présente dans l'eau une solu bilité plus grande (50-60 mg/ml) que l'Amphotéri- cyne A cristallisée originale. Il présente également une bonne solubilité dans le méthanol et la diméthyl- formamide. Il est quelque peu soluble dans l'éthanol et l'isopropanol, mais insoluble dans l'éther, l'acé tone, le butanol, le chloroforme, le benzène, l'hexane et le dioxane.
<I>Préparation du complexe de chlorure de calcium</I> Un complexe de chlorure de calcium d'Ampho- téricyne peut être préparé en dissolvant l'Amphoté- ricyne cristallisée soit A, soit B (ou un mélange des deux) dans 1:
% de chlorure de calcium méthanoli- que (1 gin/20 ml), en éliminant par filtration toute matière insoluble et en ajoutant 5 volumes d'acétone au filtrat. Le précipité est éliminé par filtration, est lavé à l'acétone et est séché dans le vide. La solubilité du complexe de chlorure de calcium dans des solvants organiques est analogue à celle des sels métalliques.
Cependant, dans l'eau, le complexe s'hydrolyse et sa solubilité est celle de l'Amphoté- ricyne originale. <I>Préparation d'un sel d'acide</I> L'Amphotéricyne A ou B cristallisée (ou un mélange des deux) est dissoute dans la diméthylfor- mamide (1 g/25 ml), et un équivalent d'acide chlor hydrique concentré y est ajouté. Le mélange est filtré et 10 volumes d'acétone sont ajoutés au filtrat neutre. Le précipité ainsi formé est éliminé par filtration, est lavé à l'acétone et est séché dans un dessiccateur dans le vide.
Le produit, qui est obtenu avec un rendement d'environ 90 '%, contient un équivalent d'acide et présente in vitro une activité biologique équivalente à celle de l'Amphotéricyne cristallisée. Il est quelque peu plus soluble dans l'eau et bien plus soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol et le butanol que ne l'est l'Amphoté- ricyne cristallisée.
Cependant, le sel d'acide est insoluble dans l'acétone, le chloroforme, l'éther, le benzène, l'acétate d'éthyle et l'hexane.
Le sultafe a été préparé de la même manière en substituant un équivalent d'acide sulfurique à l'acide chlorhydrique. Il présente des propriétés analbgues à celles de l'hydrochlorure. <I>Propriétés chimiques et physiques de</I> l'Amphotéricyne L'Amphotéricyne A cristallisée présente les caractéristiques physiques et chimiques suivantes Point de fusion Fonce à 180-185C, brunit et se contracte à 198-2000 C, fond avec décomposition à environ 2100 C.
Analyse élémentaire C - 59,28 0/0 H - 8,43,% N - 1,81 % O - 30,48 % (par différence) Aucun autre élément présent.
Pas de groupes méthoxy ou acétyle. Pouvoir rotatoire spécifique [a]D C -I-- 163o (pyridine) ; -f- 93o (acide acé tique) ; -I- 1361, (diméthylformamide) ; -f- 28,, (0,1N HCl dans le méthanol).
Solubilité Bonne solubilité dans l'acide acétique glacial et la diméthylformamide. Soluble jusqu'à la proportion d'environ 1 mg/ml dans le méthanol, l'alcool isopro- pylique aqueux et le butanol humide, bien plus soluble dans ces solvants lorsqu'il est acidifié ou fortement alcalinisé. (Par exemple dans une solution d'alcool isopropylique à 50 0/0, la solubilité de l'Amphotéricyne A est, comme indiqué, approxima tivement 1 mg/ml à un pH entre 3 et 8 ; à un pH de 2,9 et 10, cependant, la solubilité est 3 mg/ml, alors qu'à un pH 11, la solubilité est augmentée jusqu'à 8-10 mg/ml).
L'antibiotique est insoluble dans l'eau à un pH neutre ou acide dans les conditions ordinaires, mais est soluble à un pH 10 et au-dessus. Cependant, dans des solutions diluées, l'antibiotique peut être dissous dans une solution aqueuse neutre en augmentant le pH d'une suspension de la matière à 11, comme, par exemple, avec de l'hydroxyde de sodium. La solution ainsi formée peut être neutralisée avec un acide sans que se produise une précipitation quelconque.
L'Amphotéricyne A est insoluble dans l'éther, le dioxane, l'acétate d'éthyle, l'acétate d'amyle, le chloroforme, le benzène, l'acétone, l'hexane, l'éthanol absolu, l'isopropanol ou le butanol.
Spectre d'ultraviolet Les maxima d'absorption dans l'ultraviolet de l'Amphotéricyne A cristallisée dans le méthanol sont:
EMI0007.0007
Certains maxima d'absorption dans la région 362 405 peuvent être dus à la présence d'un peu d'Am- photéricyne B.
Spectre d'infrarouge Le spectre d'absorption dans l'infrarouge de l'Amphotéricyne A en suspension dans le milieu Nujol montre des pointes (et des paliers indiqués par sh pour les fréquences et longueurs d'ondes sui vantes
EMI0007.0013
Fréquence <SEP> Longueur <SEP> d'onde <SEP> Fréquence <SEP> Longueur <SEP> d'onde
<tb> (cm-1) <SEP> (R) <SEP> (cm-1)
<tb> 3333 <SEP> 3,00 <SEP> 1129 <SEP> 8,86
<tb> 1695 <SEP> 5,90 <SEP> 1105 <SEP> 9,05
<tb> 1656 <SEP> 6,04 <SEP> 1066 <SEP> 9,38
<tb> 1623 <SEP> 6,16 <SEP> sh <SEP> 1035 <SEP> 9,66
<tb> 1567 <SEP> 6,38 <SEP> sh <SEP> 1008 <SEP> 9,92
<tb> 1546 <SEP> 6,47 <SEP> 992 <SEP> 10,08
<tb> 1425 <SEP> 7,02 <SEP> sh <SEP> 977 <SEP> 10,24 <SEP> sh
<tb> 1403 <SEP> 7,13 <SEP> 949 <SEP> 10,54
<tb> 1374 <SEP> 7,
28 <SEP> sh <SEP> 912 <SEP> 10,96
<tb> 1323 <SEP> 7,56 <SEP> 893 <SEP> 11,20
<tb> 1276 <SEP> 7,84 <SEP> sh <SEP> 877 <SEP> 11,40
<tb> 1232 <SEP> 8,12 <SEP> 850 <SEP> 11,76
<tb> 1201 <SEP> 8,32 <SEP> sh <SEP> 836 <SEP> 11,96
<tb> 1183 <SEP> 8,45 <SEP> 810 <SEP> 12,34
<tb> 1159 <SEP> 8,63 <SEP> 794 <SEP> 12,60
<tb> 760 <SEP> 13,16 Equivalent neutre de l'Amphotéricyne A cristallisée 929 en titrant comme une base 989 en titrant comme un acide Stabilité du pH Stable pour tous les pH entre 3 et 11 pour au moins une durée allant jusqu'à 24 heures. A un pH aussi bas que 2, l'Amphotéricyne A est stable pour une durée de 3 heures avec seulement une faible quantité de décomposition qui se produit.
Stabilité thermique Stable jusqu'à environ 700 C, dans une solution neutre d'isopropanol à 50 '%.
Essais chimiques Fournit une couleur jaune avec du chlorure ferrique.
L'Amphotéricyne B cristallisée présente les carac téristiques physiques et chimiques suivantes Point de fusion Aucun point de fusion distinct ; fonce et car bonise.
Analyse élémentaire C = 56,70 % H = 7,72 % N = 1,87% O = 33,711% Aucun autre élément présent.
Ni groupes méthoxy ni groupes acétyle. Pouvoir rotatoire spécifique [-a]D C -I- 2380 (diméthylformamide) ; -52,20 (0,1N HCl dans le méthanol).
Solubilité Bonne solubilité dans la dimétyhylformamide et dans l'acide acétique glacial. Soluble jusqu'à la proportion de 0,5 mg/1 dans le méthanol, l'alcool isopropylique aqueux et le butanol humide, et beau coup plus soluble dans ces solvants lorsqu'elle est acidifiée ou fortement alcalinisée.
Spectre d'ultraviolet Les maxima d'absorption dans l'ultraviolet de l'Amphotéricyne B cristallisée dans le méthanol sont:
EMI0007.0049
Spectre d'infrarouge Le spectre d'absorption dans l'infrarouge de l'Amphotéricyne B en suspension dans le milieu Nujol montre des pointes (et des paliers indiqués par sh ) pour les fréquences et longueurs d'ondes suivantes
EMI0008.0003
Fréquence <SEP> Longueur <SEP> d'onde <SEP> Fréquence <SEP> Longueur <SEP> d'onde
<tb> (cm-1) <SEP> W <SEP> (cm-1)
<tb> 3333 <SEP> 3,00 <SEP> 1042 <SEP> 9,60
<tb> 1709 <SEP> 5,85 <SEP> 1008 <SEP> 9,92
<tb> 1577 <SEP> 6,34 <SEP> 981 <SEP> 10,19
<tb> 1401 <SEP> 7,14 <SEP> 965 <SEP> 10,
36 <SEP> sh
<tb> 1374 <SEP> 7,28 <SEP> 903 <SEP> 11,08
<tb> 1323 <SEP> 7,56 <SEP> sh <SEP> 886 <SEP> 11,29
<tb> 1266 <SEP> 7,90 <SEP> 852 <SEP> 11,74
<tb> 1232 <SEP> 8,12 <SEP> 812 <SEP> 12,32 <SEP> sh
<tb> 1192 <SEP> 8,39 <SEP> 794 <SEP> 12,60
<tb> 1174 <SEP> 8,52 <SEP> 758 <SEP> 13,20
<tb> 1134 <SEP> 8,82
<tb> 1106 <SEP> 9,04
<tb> 1068 <SEP> 9,36 Equivalent neutre de l'Amphotéricyne B cristallisée 760 en titrant comme une base.
La stabilité du pH et la stabilité thermique de l'Amphotéricyne B sont analogues aux stabilités cor respondantes de l'Amphotéricyne A.
<I>Propriétés biologiques des</I> Amphotéricynes L'Amphotéricyne, à l'état de mélange et à l'état d'Amphotéricyne A et d'Amphotéricyne B purifiées, présente un large spectre fongicide, comme indiqué par le tableau suivant Le tableau ci-dessous ne représente pas une indi cation exacte de l'activité de l'Amphotéricyne B, puisque cet antibiotique est extrêmement insoluble et que, par suite,
son efficacité dans le milieu agar- agar utilisé pour déterminer le spectre fongicide ci- dessus est grandement diminuée.
Ainsi, dans les essais de tubes dans le bouillon, lorsque l'Ampho- téricyne B est comparée aux Amphotéricynes mélan gées en ce qui concerne l'efficacité vis-à-vis de Candida albicans et Saccharomyces cerevisiae, il a été déterminé que l'Amphotéricyne B était respecti vement 8,10 et 6,17 fois plus efficace que ne le sont les Amphotéricynes mélangées.
L'Amphotéricyne, soit en mélange, soit indivi duellement, est utile pour combattre les champignons pathogènes qui provoquent la dermatomycose et des mycoses généralisées. Spécifiquement elle est effi ciente dans le traitement du pied d'athlète , de la coccidioidomycose, des moniliases, de la blastomy- cose, etc.
Ainsi, pour la prophylaxie et la thérapeu tique dans une infection moniliale et d'autres cham pignons, l'Amphotéricyne peut être administrée à des personnes humaines par voie buccale sous forme de tablettes contenant 1/2 à 1 gm de l'antibiotique ; et elle peut être ainsi utilisée en combinaison avec des antibiotiques bactéricides à large spectre, tels que l'oxytétracycline, la chlorotétracycline ou la tétracy cline, à la place de la nystatine pour inhiber le développement des champignons résultant.
EMI0008.0039
Amphotéricynes <SEP> Amphotéricyne <SEP> Amphotéricyne
<tb> mélangées <SEP> A <SEP> B
<tb> <U>CIM <SEP> <B>*</B></U> <SEP> y/ml <SEP> CIM <SEP> <B><U>'Y/MI</U></B> <SEP> C<U>IM <SEP> <B>7/mi</B></U>
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> <B>................</B> <SEP> 3,1 <SEP> 3,1 <SEP> 25
<tb> Aspergillus <SEP> fumigatus <SEP> <B>....................</B> <SEP> 3,1 <SEP> 3,1 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> <B>.........</B> <SEP> . <SEP> <B>..............</B> <SEP> 3,1 <SEP> 3,1 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> notatum <SEP> <B>....................</B> <SEP> 3,1 <SEP> 3,1 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Ceratostomella <SEP> Ulmi <SEP> <B>................</B> <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> 1,6 <SEP> 1,6 <SEP> 3,1
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> ......................
<SEP> 1,6 <SEP> 1,6 <SEP> 6,3
<tb> Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> 9533 <SEP> <B>........</B> <SEP> 1,6 <SEP> 1,6 <SEP> 12,5
<tb> Microsporum <SEP> audouini <SEP> <B>..................</B> <SEP> 12,5 <SEP> 3,1 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Microsporum <SEP> canis <SEP> <B>......................</B> <SEP> 3,1 <SEP> 3,1 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Botrytis <SEP> tulipae <SEP> <B>........................</B> <SEP> 6,3 <SEP> 6,3 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Rhodotorula <SEP> glutinis <SEP> <B>....................</B> <SEP> 3,1 <SEP> 3,1 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Fusarium <SEP> bulbigenium <SEP> <B>..................</B> <SEP> 6,3 <SEP> 6,3 <SEP> > <SEP> 100
<tb> CIM <SEP> désigne <SEP> la <SEP> concentration <SEP> inhibitrice <SEP> minimum.
<I>Comparaison de</I> l'Amphotéricyne <I>avec d'autres</I> <I>antibiotiques</I> Etant donné que l'Amphotéricyne manifeste cer taines caractéristiques analogues à celles d'autres antibiotiques, des essais physiques et biologiques comparatifs ont été effectués pour établir qu'il s'agit de nouveaux antibiotiques, non préparés ni décrits précédemment.
L'Amphotéricyne présente une gamme élevée d'activité si on la compare à la nystatine et à la rimocidine. Une comparaison d'un mélange purifié d'Amphotéricynes A et B avec une charge purifiée de nystatine vis-à-vis de deux organismes-témoins donne le résultat suivant
EMI0008.0048
Rapport <SEP> d'activité
<tb> Organisme-témoin <SEP> Amphotéricyne/nystatine
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> . <SEP> .
<SEP> 2,86
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> <B>........</B> <SEP> 5,62 Comme la rimocidine présente un spectre fon gicide analogue à celui de la nystatine et de l'Am- photéricyne, elle a été essayée sous la forme de son sulfate à côté de l'Amphotéricyne et de la nystatine vis-à-vis de S. cerevisiae. Elle est moins active que la nystatine ou l'Amphotéricyne sur la base du poids, comme l'indique le tableau suivant
EMI0009.0003
CIM <SEP> vis-à-vis <SEP> de <SEP> S. <SEP> cerevisiae
<tb> y/ml
<tb> Nystatine <SEP> <B>..........</B> <SEP> 0,512 <SEP> (8 <SEP> essais)
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> rimocidine <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,915 <SEP> (9 <SEP> essais)
<tb> Amphotéricynes <SEP> .... <SEP> 0,160 <SEP> (10 <SEP> essais) Ces résultats montrent les propriétés supérieures de l'Amphotéricyne par comparaison avec la nysta- tine et la rimocidine vis-à-vis de Saccharomyces cerevisiae et Candida albicans.
En dehors des différences biologiques précitées, l'Amphotéricyne diffère physiquement de la nysta- tine, de la rimocidine et de l'ascosine, comme indiqué par les comparaisons suivantes du pouvoir rotatoire spécifique <I>Pouvoir rotatoire spécifique de</I> l'Amphotéricyne <I>A,</I> <I>de</I> l'Amphotéricyne <I>B, de la nystatine, de la</I> rimocidine <I>et de</I> l'ascosine [ajD C
EMI0009.0022
Solvant <SEP> Diméthyl- <SEP> 0,
1N <SEP> HCl
<tb> Antibiotique <SEP> Pyridine <SEP> Acide <SEP> acétique <SEP> formamide <SEP> dans <SEP> le <SEP> méthanol
<tb> Amphotéricyne <SEP> A <SEP> <B>..............</B> <SEP> -I- <SEP> 163o <SEP> +93o <SEP> -I- <SEP> 136o <SEP> +28o
<tb> Amphotéricyne <SEP> B <SEP> <B>.............. <SEP> +2380</B> <SEP> -52,20
<tb> Nystatine <SEP> .................... <SEP> -I- <SEP> 110 <SEP> - <SEP> 70 <SEP> -I- <SEP> 6,5o <SEP> - <SEP> 3,50
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> rimocidine <SEP> <B>.....</B> <SEP> . <SEP> <B>....</B> <SEP> +102o <SEP> +67o
<tb> Ascosine <SEP> (50 <SEP> % <SEP> NaHC03 <SEP> en <SEP> poids) <SEP> -f- <SEP> 12,2o <SEP> -130 Les données de ce tableau peuvent être mises en parallèle avec les données d'absorption dans l'ultra violet pour les deux Amphotéricynes ;
il est évident que l'Amphotéricyne A, bien qu'elle ait un spectre d'ultraviolet qui est analogue à celui rapporté pour la nystatine et la rimocidine, s'en différencie par les pouvoirs rotatoires spécifiques respectifs ; et, de même, bien que l'Amphotéricyne B ait un spectre d'ultraviolet qui est très semblable à celui de l'asco- sine, les deux produits se distinguent par les différen ces dans leurs pouvoirs rotatoires spécifiques res pectifs.
La conclusion à tirer de ces comparaisons réside donc dans le fait que l'Amphotéricyne diffère de la nystatine, de la rimocidine ou de l'ascosine à la fois dans ses effets biologiques et dans ses caractéristiques physiques.