<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention est relative à la préparation de l'anti- biotique connu sous le nom d'oxytétracycline.
Une méthode de préparation de cet antibiotique à partir d'un microorganisme appelé Streptomyces rimosus fait l'objet du brevet belge n
495.401, - - - qui prévoit également l'utilisation, au lieu de S. rimosus, de ses mutants obtenus par des moyens de mutation tels que les rayons K, les rayons ultra-violets, les moutardes à l'azote, etc.
Il a été trouvé, et c'est un des objets de la présente invention, qu'on peut également préparer cet antibiotique à partir d'une souche de Strep- tomyces (S.942) non encore décrite à ce jour et différente de S. rimosus.
S.942 se distingue d'abord de S.rimosus par l'absence de produc- tion de pigment exosoluble dans la plupart des cas où cette production est indiquée pour S.rimosus et, au contraire, par la production d'un pigment soluble brun-roux sur milieu peptone-gélatiné, milieu sur lequel S.rimosus ne donne, lui, aucun pigment. Il est à rappeler que la production de pig- ment exosoluble est un caractère important sur lequel BERGEY ("Manual of determinative Bacteriology" Williams and Wilkins C - 6ème ed. 1948 - p.
929-933) se base pour définir les familles du genre Streptomyces. En se ré- férant à cet auteur,S.942 se classe donc dans une famille différente de cel- le à laquelle appartient S.rimosus.
Autre caractère distinctif essentiel : alors que S. rimosus réduit les nitrates en bouillon glucosé, cette réduction ne se produit pas avec S.
942.
De plus, S.942 peptonise le lait tournesolé à 28 et 37 , ce que ne fait pas S. rimosus.
Enfin, une différence importante entre les deux souches réside dans la faculté que possède S.942 de croître (bien qu'assez faiblement) sur milieu agar synthétique, alors qu'au contraire S. rimosus ne se développe pas sur un tel milieu.
Les caractères morphologiques de ces deux espèces de Streptomyces sont comparés dans le tableau dans lequel on pourra noter encore quelques différences de moindre importance.
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
CARACTERES MQEPHÛLQGIJJJES JE S. RIMOSUS ET S. 912
EMI2.2
Milieux 5, kt-LMUjUi .'7'4'-
EMI2.3
<tb> Degré <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Degré <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb> e <SEP> croissance <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble <SEP> Remarques <SEP> de <SEP> crois- <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb> spores <SEP> sance <SEP> spores
<tb> Plaques <SEP> glu- <SEP> Modéré <SEP> à <SEP> bon <SEP> Entre <SEP> Jaunâtre <SEP> Colonies <SEP> Colonies <SEP> Grisâtre <SEP> Aucun <SEP> Mycélium <SEP> gricose <SEP> aspara- <SEP> La <SEP> plupart <SEP> blanc <SEP> très <SEP> pâle <SEP> plates,bords <SEP> sèches <SEP> et <SEP> pla- <SEP> à <SEP> sâtre <SEP> à <SEP> jaune
<tb>
EMI2.4
coseaspara- plupart et gris très pale irregu.3ers tes. ocre .
EMI2.5
<tb> gine <SEP> agar <SEP> submergé <SEP> pâle <SEP> surface <SEP> lis- <SEP> Sporulation <SEP> blanc <SEP> Envers <SEP> des <SEP> cose <SEP> ; <SEP> sporula- <SEP> pauvre <SEP> lonies <SEP> jaune
<tb> tien <SEP> légère; <SEP> ¯ <SEP> ocre
<tb> mycélium <SEP> aérien
<tb> légère <SEP> envers)
<tb> presque <SEP> jaune
<tb> Ocre <SEP> au <SEP> centre, <SEP> Nombreuses
<tb> chamois <SEP> sur <SEP> le <SEP> spirales <SEP> : <SEP>
<tb> bord; <SEP> spirales <SEP> conidies <SEP> en
<tb> très <SEP> nombreuses, <SEP> chaînes,
<tb> conidies <SEP> en <SEP> chaî- <SEP> courtes <SEP> et
<tb> nes <SEP> 0,6 <SEP> à <SEP> 0,7 <SEP> x <SEP> cylindriques
<tb> 0,8 <SEP> à <SEP> 1,4, <SEP> courtes <SEP> et <SEP> cylindriques <SEP> . <SEP> s <SEP> de <SEP> dilu
<tb> Boites <SEP> de <SEP> dilution <SEP> ;
<SEP> colonies
<tb> essentiellement
<tb> toutes <SEP> semblables
<tb> Colonies <SEP> isolées
<tb> se <SEP> desquamant <SEP> en
<tb> donnant <SEP> des <SEP> systèmes <SEP> isolés <SEP> de
<tb> grands <SEP> amas <SEP> de
<tb> spirales.Odeur <SEP> de <SEP> Brun <SEP> ! <SEP> 2raz- <SEP> Liquéfaction
<tb> terre. <SEP> Brun <SEP> oran- <SEP> Liquéfaction
<tb>
EMI2.6
r.tina Bhric se sur m en cupules, Réta.tinR 'Mnc3éré BlAnc lI",..11,., T.innefaf'tio'n )¯¯¯¯¯Mnn!aT-H 'R1nf-o"na ) limn rflii- ) #.j- --.-
<Desc/Clms Page number 3>
CARACTERES MORPHOLOGIQUES DE S .
RIMOSUS ET S.942 (Suite).-
EMI3.1
<tb> Milieux <SEP> S. <SEP> RIMOSUS <SEP> S.942
<tb> Degré <SEP> de <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Degré <SEP> de <SEP> Mycélium <SEP> Pigment
<tb> croissance <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble <SEP> Remarques <SEP> croissance <SEP> aérien <SEP> et <SEP> Remarques
<tb> spores <SEP> spores <SEP> soluble <SEP> Kamrqaes
<tb> - <SEP> Lait <SEP> tourne- <SEP> Bon,pelli- <SEP> Blanc <SEP> gri- <SEP> Partie <SEP> in- <SEP> Aucune <SEP> hydroly- <SEP> Bon <SEP> Blanc <SEP> gri- <SEP> Légère <SEP> co- <SEP> Légère <SEP> floculation <SEP>
<tb> bon <SEP> Blanc <SEP> gri- <SEP> Legere <SEP> co- <SEP> Légère <SEP> floculatio
<tb> solé <SEP> (à <SEP> 28 )
<SEP> cule <SEP> épais- <SEP> sâtre <SEP> férieure <SEP> se <SEP> ou <SEP> peptoni- <SEP> sâtre <SEP> loration <SEP> et <SEP> peptonisation
<tb> se <SEP> du <SEP> tube <SEP> plus <SEP> sation <SEP> ; <SEP> pH <SEP> in- <SEP> brune <SEP> près <SEP> pH <SEP> passant <SEP> de <SEP> 6,4
<tb> claire <SEP> que <SEP> changé <SEP> de <SEP> la.sur- <SEP> 6,8
<tb> le <SEP> témoin <SEP> face
<tb> face
<tb> Lait <SEP> tourne- <SEP> Très <SEP> bon <SEP> Blanc <SEP> gri- <SEP> Partie <SEP> supé- <SEP> Aucune <SEP> hydroly- <SEP> Très <SEP> bon <SEP> Blanc <SEP> gri- <SEP> Partie <SEP> su- <SEP> Peptonisation
<tb> solé <SEP> (à <SEP> 37 ) <SEP> sâtre <SEP> rieure <SEP> du <SEP> li- <SEP> se <SEP> ou <SEP> peptoni- <SEP> sâtre <SEP> périeure <SEP> pH <SEP> passant <SEP> de
<tb> presque <SEP> sation, <SEP> le <SEP> pH <SEP> du <SEP> liquide <SEP> 6,4 <SEP> à <SEP> 7,
<SEP> 1
<tb> noire, <SEP> a <SEP> passé <SEP> de <SEP> 6,1 <SEP> brun <SEP> fon- <SEP>
<tb> à <SEP> 6,6-7,02 <SEP> cé;
<tb> - <SEP> Glucose <SEP> agar <SEP> Modéré, <SEP> sec <SEP> Plus <SEP> clair <SEP> Brun <SEP> jaunâ- <SEP> Envers <SEP> presque <SEP> Bonne <SEP> pouce <SEP> Jaune <SEP> gri- <SEP> Aucun <SEP> Envers <SEP> des
<tb> surface <SEP> fis <SEP> que <SEP> gris <SEP> tre <SEP> orange <SEP> de <SEP> zinc <SEP> Surface <SEP> se <SEP> sâtre <SEP> clair <SEP> colonies <SEP> ocre <SEP>
<tb> surée <SEP> de <SEP> la <SEP> souris <SEP> pâ- <SEP> et <SEP> orange <SEP> fissurant
<tb> culture <SEP> vé- <SEP> le <SEP> cracé
<tb> gétative <SEP> en
<tb> hyphes
<tb> élase <SEP> nutri- <SEP> Pauvre <SEP> Pas <SEP> de <SEP> my- <SEP> Jaune <SEP> Envers <SEP> presque <SEP> Pauvre <SEP> Pas <SEP> de <SEP> my- <SEP> ucun <SEP> Envers <SEP> des <SEP> colotive <SEP> célium
<SEP> aé- <SEP> très <SEP> faible <SEP> chamois <SEP> et <SEP> célium <SEP> Hucun <SEP> Envers <SEP> des
<tb> rien <SEP> déve- <SEP> jaune <SEP> miel <SEP> aérien
<tb> loppé
<tb> Morceau <SEP> de <SEP> Modéré <SEP> Blanchâtre <SEP> Légèrement <SEP> Mycélium <SEP> pres- <SEP> Moyen <SEP> My- <SEP> Gris <SEP> jau- <SEP> Aucun
<tb> pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> plissé <SEP> à <SEP> gris <SEP> pâle <SEP> brun <SEP> jaunâtre <SEP> que <SEP> ocre <SEP> fauve <SEP> célium <SEP> vé- <SEP> ne, <SEP> très
<tb> gétatif <SEP> peu <SEP> dévejaunâtre <SEP> loppés
<tb> Malate <SEP> de <SEP> Pauvre, <SEP> plat <SEP> Aucun <SEP> mycé- <SEP> Aucun
<tb> calcium <SEP> lium <SEP> aérien
<tb> colonies
<tb> presque <SEP> jaune <SEP> de <SEP> Mars
<tb>
<Desc/Clms Page number 4>
CARACTERES MORPHOLOGIQUES DE S.
RJMOSUS ET S. 942 (Suite 2)
EMI4.1
<tb> Milieux <SEP> S. <SEP> RIMOSUS <SEP> S.942
<tb> Degré <SEP> de <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Degré <SEP> de <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb> croissance <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble <SEP> Remarques <SEP> croissan- <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb> spores <SEP> -de <SEP> spores
<tb> - <SEP> Plaques <SEP> d' <SEP> Pauvre, <SEP> Très <SEP> peu <SEP> Aucun <SEP> Légère <SEP> hydro- <SEP> Très <SEP> pauvre <SEP> Pas <SEP> de <SEP> my- <SEP> Aucun <SEP> Colonies <SEP> très
<tb> amidon <SEP> mince <SEP> de <SEP> mycéli- <SEP> lyse <SEP> célium <SEP> aé- <SEP> plates, <SEP> gris
<tb> um <SEP> aérien <SEP> rien <SEP> clair,
<SEP> transcolonies <SEP> lucides
<tb> jaune <SEP> cannelle <SEP> clair
<tb> Agar <SEP> synthé- <SEP> Aucun <SEP> Très <SEP> pauvre <SEP> Très <SEP> légè- <SEP> Aucun <SEP> Plus <SEP> pauvre
<tb> tique <SEP> mais <SEP> nette <SEP> re <SEP> couron- <SEP> que <SEP> sur <SEP> mine <SEP> duveteu- <SEP> lieu <SEP> amidon
<tb> se,blanche
<tb> sur <SEP> le <SEP> pourtour <SEP> de <SEP> certaines <SEP> colonies
<tb> Cellulose <SEP> Aucun
<tb> -Milieu <SEP> d'E- <SEP> Modéré <SEP> à <SEP> Blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> Brun <SEP> Envers <SEP> presque <SEP> Bon-Colonies <SEP> Blanc- <SEP> Aucun <SEP> Envers <SEP> jaune
<tb> merson <SEP> bon <SEP> rugueux, <SEP> pâle,
<SEP> colonies <SEP> jaunâtre <SEP> orange <SEP> de <SEP> zinc <SEP> grosses <SEP> ru- <SEP> colonies <SEP> clair
<tb> surface <SEP> fen- <SEP> en <SEP> masse <SEP> pres- <SEP> pâle <SEP> (chromate <SEP> de <SEP> gueuses,ten- <SEP> jaune
<tb> dillée <SEP> en <SEP> plu- <SEP> que <SEP> jaune <SEP> miel <SEP> zinc) <SEP> dance <SEP> à <SEP> se <SEP> clair
<tb> sieurs <SEP> petits <SEP> à <SEP> orange <SEP> de[ <SEP> fissurer
<tb> morceaux <SEP> zinc <SEP> ou <SEP> orange
<tb> tuellement <SEP> ocrapé <SEP> ,
<tb> - <SEP> Bouillon <SEP> Modéré, <SEP> avec <SEP> Jaune <SEP> Réduction <SEP> des <SEP> Pellicule <SEP> en <SEP> Blanc- <SEP> Aucun <SEP> Pas <SEP> de <SEP> réduction
<tb> glucose <SEP> ni- <SEP> une <SEP> pellicule <SEP> nitrates <SEP> fai- <SEP> surface <SEP> et <SEP> grisâtre <SEP> des <SEP> nitrates.
<tb> trate <SEP> ble <SEP> à <SEP> forte,
<SEP> léger <SEP> dépôt
<tb> dans <SEP> des <SEP> tubes <SEP> au <SEP> fond <SEP> des
<tb> différents <SEP> tubes. <SEP> ¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb> Milieu <SEP> à <SEP> Modéré <SEP> coloration <SEP> Aucun <SEP> Pousse <SEP> plus <SEP> ra-
<tb>
EMI4.2
'1 nvlînmrina marron fon- pide va 37 qu'à
<Desc/Clms Page number 5>
L'expérience ayant montré que de nombreux Streptomyces possédant des caractères morphologiques plus voisins de S. rimosus que S.942 sont in- capables de produire de l'oxytétracycline, la présente invention est d'autant plus surprenante qu'il a été observé que la culture de S.942 donnait lieu à une formation abondante, d'oxytétracycline, comme le montrent les exemples donnés plus loin.
La souche de Streptomyces 942 produit de l'oxytétracycline en cul- ture submergée dans les milieux classiques tels que ceux qui sont mention- nés par exemple à la page 233 de l'ouvrage de BARON - Handbook of antibiotics (Ed. : Reinhold Publ. Corp. ) pour l'obtention de la streptomycine et qui soit constitués par une source d'hydrates de carbone (sucres, amidon, glycérine,) une source organique d'azote (farine de soja, gluten de blé, lactalbumine, tryptone), des distiller's solubles ou de l'extrait de levure, des sels miné- raux, etc...
Mais on a constaté, et c'est un autre objet de l'invention, que l'on pouvait remplacer entièrement pour la culture de S.942 les hydrates de carbone (sucres, amidon, glycérine) par des graisses animales ou végétales, telles que huile de lard, huile de soja, huile de ricin, dans la proportion de 1 à 5% et de préférence 2,5 à 3,5 %. L'addition de ces graisses au milieu renfermant des hydrates de carbone, n'améliore pas sensiblement la formation de l'antibiotique, mais au contraire la substitution de ces graisses aux hydrates de carbone permet d'obtenir des concentrations bien supérieures en antibiotique ainsi qu'en témoignent les résultats ci-dessous obtenus dans des essais en erlenmeyers agités :
EMI5.1
<tb> Milieu <SEP> de <SEP> base <SEP> :
<SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 4%
<tb>
<tb>
<tb> Distilleras <SEP> solubles <SEP> 0,5 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Milieu <SEP> de <SEP> base <SEP> (suite) <SEP> : <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Elément <SEP> énergétique <SEP> 2%
<tb>
Nature de l'élément énergétique:
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb> Elément <SEP> énergétique <SEP> Activité <SEP> mcg/cm3
<tb>
EMI6.2
¯¯¯¯¯¯¯(2¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI6.3
<tb> Glucose <SEP> 1000 <SEP> 1160 <SEP> 1075
<tb>
<tb> 1365 <SEP> 1360 <SEP> 940
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1580
<tb>
<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> 2490
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1660
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> ricin <SEP> 2450
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1900
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> soja <SEP> 1830
<tb>
EMI6.4
Comparais on :
mélange-sucre/araisse - et graisse seule%- (même milieu de base)
EMI6.5
<tb> Teneur <SEP> % <SEP> Activité
<tb>
<tb> mcg/cm3
<tb>
<tb> Glucose <SEP> Huile <SEP> de
<tb> mard
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 0 <SEP> 930- <SEP> 1060 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 0,4 <SEP> 940- <SEP> 1075 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 0 <SEP> 0,4 <SEP> 885- <SEP> 970
<tb>
<tb>
<tb> 0 <SEP> 1 <SEP> 1360- <SEP> 1360 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 0 <SEP> 2 <SEP> 1830- <SEP> 1900
<tb>
<Desc/Clms Page number 7>
Influence de la concentration en graisses-
EMI7.1
<tb> Teneur <SEP> % <SEP> Activité
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glucose <SEP> Huile <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> soja <SEP> mcg/cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 0,4 <SEP> 1180 <SEP> - <SEP> 1200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> 0,
4 <SEP> 1365 <SEP> - <SEP> 1260
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0 <SEP> 2 <SEP> 2060 <SEP> - <SEP> 1890
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0 <SEP> 2,5 <SEP> 2060 <SEP> - <SEP> 2120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0 <SEP> 3 <SEP> 1900 <SEP> - <SEP> 1900
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0 <SEP> 4 <SEP> 1800 <SEP> - <SEP> 2330
<tb>
Pour l'isolement de l'antibiotique des moûts de culture, on a constaté que les méthodes classiques d'extraction par solvant étaient appli- cables.
Mais alors que les moûts obtenus avec S . rimosus, le butanol, l' alcool amylique' le phénylcellosolve {solvants employés de façon habituelle pour l'extraction des antibiotiques) étaient les solvants préférentiels, on a trouvé, et c'est un autre objet de l'invention, que pour les moûts de cul- ture de S.942 d'autres solvants se prêtaient très bien à cette extraction et qu'en particulier l'alcool benzylique se montrait supérieur aux solvants généralement employés et indiqués ci-dessus.
On a trouvé ,d'autre part, que la nature de l'acide utilisé pour l'acidification des moûts de fermentation avant filtration du mycélium avait une très grosse importance, c'est ainsi, par exemple, que l'acide oxalique se montre bien supérieur à l'acide chlorhydrique ou à l'acide sulfurique, puisqu'il permet un rendement à l'extraction voisin de 100% de l'activité dosée, alors qu'avec les autres acides on obtient que 60-70%.
Les exemples suivants montrent à titre non limitatif comment l'invention peut être mise en pratique.
EXEMPLE 1.-
EMI7.2
<tb> 40 <SEP> litres <SEP> du <SEP> milieu <SEP> suivant <SEP> : <SEP>
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 1%
<tb>
<tb> Peptone <SEP> de <SEP> caséine <SEP> 1%
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> 0,6%
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,5%
<tb>
sont chargés dans un fermenteur de 75 litres. Le pH est ajusté à 6,5 avec de la soude. On stérilise à 120 pendant 45 minutes. Après refroidissement à 27 le milieu est ensemencé avec 200 cm3 d'une culture en erlenmeyer agi- té de S.942. La culture en fermenteur est agitée et aérée pendant 26 heures et sert à ensemencer la culture productrice.
Celle-ci est effectuée en fermenteur de 300 litres, chargé avec 200 litres du milieu suivant :
EMI7.3
<tb> farine <SEP> de <SEP> soja
<tb>
<tb> distilleras <SEP> solubles <SEP> 0,5%
<tb>
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1%
<tb>
<tb> carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 1%
<tb>
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
<tb> huile <SEP> de <SEP> soja <SEP> 1%
<tb> huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> 1%
<tb>
Le pH de ce milieu est de 6,5-6,7 et n'est pas changé par la stérilisation de 45 minutes à 120 . Après culture de 5 jours à 26-27 avec une aération de 5 m3/heure et une agitation de 450 tours /minute'l'activité des bouillons est maximum et égale à 1820 mcg/cm3. Le pH du milieu est pra- tiquement constant durant toute la fermentation.
EXEMPLE 2.-
Une fermentation est conduite comme dans l'exemple 1 mais le milieu de production est le suivant :
EMI8.2
<tb> farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 4%
<tb>
<tb> glucose <SEP> 2,5 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb> distilleras <SEP> solubles <SEP> 0,5%
<tb>
<tb>
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb> carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb> huile <SEP> de <SEP> soja <SEP> 0,4 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> 0,4 <SEP> % <SEP>
<tb>
Après 5 jours de culture 13'activité est de 1150 mcg/cm3.
EXEMPLE 3.-
Une fermentation est conduite comme dans l'exemple 1 mais avec le milieu de production suivant :
EMI8.3
<tb> farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 3,5 <SEP>
<tb>
<tb> glucose <SEP> 2,5 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb> distiller's <SEP> solubles <SEP> 0,5 <SEP>
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1%
<tb>
<tb> carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 1%
<tb>
<tb> huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> 0,4 <SEP> %
<tb>
Après 5 jours de culture, l'activité obtenue est de IL,. mcg/cm3
EXEMPLE 4.-
20 litres de moût de fermentation sont acidifiés à pH 2 par de l'acide sulfurique et agités une heure après addition d'adjuvant de filtra- tion. La suspension est filtrée et le gâteau lavé à l'eau ; on obtient 20 litres de filtrat renfermant 24,4 millions de mcg d'antibiotique.
La solu- tion obtenue est extraite par 8 litres d'alcool butylique normal en plusieurs foisle pH du mélange étant amené à 9 par addition de lessive de soude diluée.
La solution butylique est concentrée, sous pression réduite., au dixième de son volume ; le concentré est amené à pH 6 par addition d'acide chlorhydrique et saturé d'eau. L'antibiotique précipité sous forme de base amorphe est es- soré et séché.
On obtient 16,4 g d'oxytétracycline brute titrant 668 mcg/mg.
EXEMPLE 5.-
20 litres de moût de fermentation renfermant 23 millions/mcg d'oxytétracycline sont acidifiés à pH 2 par addition d'acide oxalique ; après agitation d'une heure en présence d'adjuvant de filtration, la suspension est filtrée et le gâteau lavé à l'eau. La solution obtenue est extraite par 8 litres d'alcool butylique normal en plusieurs fois,, le pH du mélange étant amené à 9 par addition de lessive de soude diluée. L'extrait butylique est
<Desc/Clms Page number 9>
concentré à basse température, sous pression réduite, au septième de son volume. Le concentré est extrait en plusieurs fois par deux litres d'eau acidifiée à pH 2 au moyen d'acide chlorhydrique.
La solution aqueuse est concentrée sous pression réduite au dixième de son volume, le pH est amené à 6 par addition de lessive de soude diluée ce qui a pour effet d'insolu- biliser l'antibiotique qui se sépare sous forme de base. L'oxytétracycline est essorée, lavée et séchée.
On obtient 22,3 g d'oxytétracycline brute titrant 750 mcg/mg.
Il est possible de remplacer le butanol utilisé pour l'extrac- tion par divers autres solvants comme le montrent les coefficients de partage suivants déterminés à partir du filtrat ci-dessus à pH 9.
EMI9.1
<tb>
Solvant <SEP> Coefficient <SEP> de <SEP> partage
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> Solvant <SEP> / <SEP> phase <SEP> aqueuse¯¯¯¯
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> butanol <SEP> normal <SEP> 14
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> alcool <SEP> benzylique <SEP> 18
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> alcool <SEP> phényléthylique
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> secondaire <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> oxyde <SEP> de <SEP> mésityle <SEP> 9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> aniline <SEP> 4,5
<tb>
EXEMPLE 6. -
10 litres de filtrat obtenu comme dans l'exemple 1 et renfer- mant 9.22 millions de mcg d'oxytétracycline sont extraits à pH 9 par 1,5 litre d'alcool benzylique en deux fois.
L'extrait benzylique est, additionné d'éther et extrait en plusieurs fois par 3 litres d'eau acidifiée à pH 2 au moyen d'acide chlorhydrique. L'extrait aqueux est concentré, sous pression réduite, à 0,4 litre et neutralisé à pH 6 par de la soude en solution di- luée .
On obtient 8,7 g d'oxytétracycline brute titrant 500 mcg/mg.
EXEMPLE 7.-
20 litres de moût de fermentation renfermant 31,4 millions de mcg d'antibiotique sont alcalinisés à pH 8,5 par addition de lessive de soude diluée et filtrés en présence d'adjuvant de filtrat ion. Le gâteau de filtra- tion est extrait par agitation deux fois avec 7,5 litres d'eau acidifiée à pH 2 au moyen d'acide chlorhydrique à 25-300. L'extrait aqueux est addition- né de 30% de chlorure de sodium et extrait par 7 litres d'alcool butylique normal en plusieurs fois. L'extrait butylique est lavé par un litre d'eau et cpncentré sous vide au dixième de son volume. Le concentré est neutralisé à pH 6 au moyen d'une solution d'ammoniaque. L'antibiotique brut, précipité sous forme de base est essoré,lavé et séché.
On obtient 33 g d'oxytétracycline brute titrant 470 mcg/mg.
Au cours de l'extraction de la solution aqueuse acide, il est possible de remplacer le butanol normal par d'autres solvants, en particu- lier l'alcool benzylique, comme le montrent les coefficients de partage sui- vants déterminés à partir de solutions aqueuses à pH 2 renfermant 30% de chlorure de sodium.
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb>
Solvant <SEP> Coefficient <SEP> de <SEP> partage
<tb>
<tb> Solvant/phase <SEP> aqueuse
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> butanol <SEP> normal <SEP> 8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> alcool <SEP> benzylique <SEP> @ <SEP> 17
<tb>
<tb>
<tb> diacétone <SEP> alcool <SEP> 6
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<tb>
<tb>
<tb> alcool <SEP> phényléthylique
<tb>
<tb> secondaire <SEP> 7
<tb>
EXEMPLE 8.-
L'antibiotique peut être préparé sous diverses formes cristalli- sées selon le procédé suivant : a) Chlorhydrate.-
262 g de base amorphe titrant 590 mcg/mg sont dissous dans 1 li- tre de méthanol amené à pH 4 par addition d'acide chlorhydrique ; la solution est filtrée et la cristallisation provoquée par acidification à pH 2 au moyen d'une nouvelle addition d'acide chlorhydrique.
Après mûrissage de 15 heures sous agitation lente, le produit cristallisé est essoré, lavé et séché.
On obtient 140 g de chlorhydrate cristallisé titrant 940 mcg/mg.
Le chlorhydrate peut être recristallisé selon la technique sui- vante :
220 g de chlorhydrate titrant 820 mcg/mg sont dissous dans 110 cm3 de méthanol anhydre par neutralisation au moyen de diéthylamine, la solu- tion filtrée est acidifiée à pH 2 par de l'acide chlorhydrique provoquant la cristallisation du chlorhydrate.
On obtient 151 g de chlorhydrate titrant 950 mcg/mg.
La diéthylamine utilisée pour la dissolution peut être remplacée par d'autres bases telles que la diméthylamine, la monopropylamine, la mono- ou la di-éthanolamine, choisies de manière à obtenir une solubilité suffisante de l'oxytétracycline. b) Base.-
130 g de chlorhydrate cristallisé sont dissous dans 1,2 litre de méthanol par neutralisation au moyen de base comme en a), la solution fil- trée est additionnée lentement de 240 cm3 d'eau provoquant la cristallisation de la base, Après mûrissage de 20 heures la base est essorée lavée et séchée.
On obtient 93 g de base cristallisée titrant 940 mcg/mg.
REVENDICATIONS
1.- Procédé pour la préparation par fermentation de l'antibiotique connu sous le nom d'oxytétracycline, caractérisé par l'emploi d'une nouvelle souche de Streptomyces : S.942, telle qu'identifiée dans le présent mémoire.