<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention est relative à de nouveaux antibiotiques utiles et à des procédés pour leur production.
Plus particulièrement, elle concerne de nouveaux antibioti- ques sous diverses formes, ainsi que des procédés pour les produire par fermentation, de même que pour les concentrer, les purifier, les isoler et produire leurs sels. Sous sa for- me libre, le nouvel antibiotique est appelé "thiostrepton".
L'antibiotique suivant la présente invention est formé par la culture, dans des conditions contrôlées, d'une espèce non décrite jusqu'ici de Streptomyces.
Le microorganisme.-
Le microorganisme utilisé pour la préparation du thiostrepton est une souche de Streptomyces, isolée d'un é- chantillon de terre désertique obtenue dans le New-Mexico aux Etats-Unis d'Amérique, une culture du microorganisme vivant a été déposée et fait partie de la collection de cultures du Rutgers Institute of Microbiology (New Brunswick, New Jersey) où elle est disponible et où le numéro 3705 lui a été assigné dans la collection Waksman. Cette souche est désignée ci-après comme Streptomyces sp. 3705.
Il est évident que l'invention n'est pas limitée à l'utilisation de l'organisme particulier ici décrit, mais englobe entre autres les mutantes produites à partir des orga- nismes décrits par des agents de mutation, tels que rayons X, rayons ultra-violets, actinophages et moutardes azotées.
Pour isoler et caractériser le microorganisme, une partie de l'échantillon de terre est agitée dans de t'eau distillée stérile et étalée sur un milieu d'agar écran. Ce milieu contient :
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EMI2.1
<tb> Sucrose <SEP> 10,0 <SEP> grs.
<tb>
Avide <SEP> citrique <SEP> 1,2 <SEP> grs.
<tb>
<tb>
(NH4)2HP04 <SEP> 0,4 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
KC1 <SEP> 0,08 <SEP> gr.
<tb>
EMI2.2
MgCl2.H20 0,41$ gr.
EMI2.3
<tb> MnC12.4H2o <SEP> 0,036 <SEP> gr.
<tb>
EMI2.4
FeCl3.bHZ0 0,023 gr.
EMI2.5
<tb> ZnC12 <SEP> 0,021 <SEP> gr.
<tb>
EMI2.6
COC1206H20 0,004 gr.
EMI2.7
<tb> Agar <SEP> 15,0 <SEP> grs.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Les cultures sont alors testées par le procédé d'étalement sur plaque d'agar de boeuf et levure, en vue de déterminer leur activité antibiotique vis-à-vis des bactéries et des fongi. La culture n'inhibe aucun des fongi d'essai,
EMI2.8
mais inhibe les bactéries d'essai suivantes : lViicrococcus pyo- enes var. aureus, Aerroobbacillus po a. Streptococcus faeca- lis, Bacillus subtil, Lactobacillus aCido!,:..Llus, Clostridium septicum, Diplococcus pneumoniae, Corynebacterium diphteriae, et lycobaéterium tuberculosis.
On décrira ci-après des colonies du microorganisme incubé pendant 10 jours à 24 C sur divers milieru (description des couleurs selon l'ouvrage de Ridgway "Color Standars and Color Nomenclature , Washington; D. C. , 1912).
EMI2.9
Agar Czepek-Dox : NaN 3' gr-; 2 4 gr KC1, 0,5 gr.; MgS04.
7H20 0,5 gr.; FeSO .7H 2 , , 0 0 0 1 gr.; glucose, 40 gr.; agar 15 gr.; eau distillée ad 1000 ml. La croissance est bonne et les colonies ont des bords entiers. La sporulation est blanche avec des zones gris-fumée et des taches bleu de médici clair. La croissance par transparence est olive pâle avec des
EMI2.10
taches gris glauque foncé. Pas dfexopigment produit.
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Agar de Sabouraud. cultures inclinées:
Glucose, 40 grs.; néopeptone, 10 grs.; agar, 15 grs.; eau distillée ad 1000 ml. La croissance est bonne et les colonies ont des bords ondulés. Les spores sont blancs et la croissance par transparence Est ocre-tan à brun Mars.
Un exopigment brun est produit..
Agar d'infusion de graines de soja :
Une suspension à 2% de farine de graines de soja est bouillie pendant 30 minutes et filtrée à chaud. Le pH est alors ajusté à 7 à l'aide d'hydroxyde de sodium et 0,2% de glucose, 0,5% de NaCl et 2% d'agar ou gélose sont ajoutés.
La croissance est bonne, les colonies ont des bords entiers, les spores sont blancs à gris Payne olive, la croissance par transparence est olive pâle. Pas d'exopigment.
Agar d'Henrici :
Caséïnate ou case N.Z, 5 grs.; glycérol, 5 ml. ; K2HOP4, 2 grs.; MgSO4.7H2O, trace ; agar, 15 grs.; eau distil- lée ad 1000 ml.; pH 7,0. La croissance est bonne, les colo- nies ont des bords entiers, les spores sont blancs avec des zones gris foncé mat, la croissance par transparence est brun noirâtre. Pas d'exopigment.
Agar boeuf-levure :
Extrait de boeuf, 1± grs.; extrait de levure, 3 grs.; peptone, 6 grs.; dextrose, 1 gr.; agar, 15 grs.; eau distillée ad 1000 ce. Croissance légère; colonies avec bords entiers, spores blancs; croissance par transparence avellanée.
Pas d!exopigment.
La culture liquéfie la gélatine et produit une coa- gulation acide dans le lait, mais ne produit pas dtindol ou de réduction de nitrate ea nitrite.
L'organisme est capable d'utiliser les sources de
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EMI4.1
carbone suivantes dans un milieu ae 1. oun-.ant du (';;Jl); S04 comme source d'azote : arabinose, I'lf!tnttc3. xyloue, gluco- se, galactose, fructose mannose, ZUCtU.3C, Cr imulino dextrine , {raf1ïnose , amidon, glyc,!rol, inosttol et remuai 1;01.
La croissance est médiocrement supoorte par la salicino le sorbitol, le citrate de sodium et l'acétate de sodium.
La croissance n'est pas supportée par le dulcitol,
EMI4.2
le fonniate d'aumonium, l' oxalate d'ammonium et le tartrate d 1 ;:;m:!oni um. Dans un milieu de base contenant de l'amidon G :-..: ;12 source de carbone, les sources d'azote suivantes suppor- teront la croissance : sulfate d'ammonium, nitrate de sodium nitrite de sodium et asparagine. La croissance est médiocre-
EMI4.3
.#,xï.t supportée par la 1-tyrosine et le d,l-tryptophane. La croissance n'est pas supportée par l'acétamide.
Lfantibiotiaue.- On a constaté que le ttor.yces s. 3705 produit #en :1.,?,;:'lfSe d'antibiotiques. Lorsque la croissance s'opère dane un milieu approprié, au moins trois antibiotiques diffé- rées sont produits. Lorsque le mycélium est séparé du bouil- lon par filtration, un des antibiotiques est présent principa- lement dans la matte de mycelium, tandis que les deux autres antibiotiques sont présents principalement dans le filtrat.
-antibiotique auquel l'invention se rapporte principalement est celui qui est extrait de latte de mycélium et auquel a été donné le nom de "thiostrepton".
-Pour former du thiostrepton, on fait pousser du
EMI4.4
5tom ees ss. 3705 à une température appropriée de 20 à 35 y de préférence à environ 25-27 C, dans des conditions aé- robies submergées, dans un milieu nutritif aqueux contenant une source d'encre et de carbone fermentescible assimilable et une source d'azote assimilable. Des sources appropriées
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. de carbone,., \.Comme indiqué plus haut, comportent des hydrates de carbone, tels que amidon, dextrine ,et des sucres, tels que maltose, lactose et glucose; du glycérol; -des li ides; des graisses, etc...
Comme sources d'azote appropriées, on peut citer les sources d'azote organiques, telles que l'aspa- ragine et la farine de graines de soja$ de même que les sour- ces d'azote inorganiques, telles que le sulfate d'ammonium ou le nitrate de sodium. La fermentation est exécutée pendant environ 72 à l6ô heures à un pH situé entre environ 6 et 8.
A la fin de cette période, une quantité substantielle de thio- strepton a été formée (comme montré par des bioessais), comme décrit plus en détails dans les exemples.
Après la fin de la croissance, le thiostrepton est isolé du bouillon en séparant le gâteau de mycelium du bouil- lon par filtration ou centrifugation. Le thiostrepton est alors extrait du gâteau de mycelium à l'aide d'un solvant organi- que approprié, tel que le chloroforme, le dioxane, une amide d'acide N,N-di-(alcoyl inféreiur)alcanoïque inférieur (par ex- emple, N,N-diméthylformamide ou N,N-diméthylacétamide) ou l'alcool benzylique.
Le thiostrepton est une base faible, qui forme des sels avec les acides, en particulier avec des acides minéraux (par exemple, l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique) par réaction avec ceux-ci dans un solvant organique,tel qu'un alcool, comme l'éthanol. L'antibiotique forme également des complexes avec les sels des métaux alcalino-terreux (par exem- ple, le chlorure de calcium ou le chlorure de magnésium) par réaction avec ceux-ci dans un solvant organique, tel qu'un alcool, comme le méthanol. Les sels d'addition avec les acides 'et les complexes de métaux alcalino-terreux sont hydrolysés, lorsqu'ils sont mis en contact avec de l'eau.
Les exemples suivants illustrent des procédés pour,
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réparer, purifier et former des dérivés des antibiotiques suivant la présente invention.
EXEMPLE 1.-
Fermentation de Streptomyces sp.3705 en flacons à agiter.- Stade de germination
Une cuillerée d'une culture de Streptomyce.s sp.
3705 est transféréedans un flacon de 50 ce contenant le mi- lieu suivant:
EMI6.1
<tb> Farine <SEP> de <SEP> graines <SEP> de <SEP> soja <SEP> 15 <SEP> g.
<tb>
Dextrose <SEP> 30
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 2,5 <SEP> g.
<tb>
<tb>
NaC1 <SEP> 1,0 <SEP> g.
<tb>
<tb>
Eau <SEP> de <SEP> robinet <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Le flacon est incubé pendant 2 jours à 25 C dans un agitateur à mouvement alternatif (140 courses par minute, longueur : 13/4 pouce).
Stade de fermentation
Un inoculum de 10 cc préparé dans le stade de germination est transfère du flacon de germination dans cha- cun de cinq flacons d'un litre contenant le milieu suivant:
EMI6.2
<tb> Farine <SEP> de <SEP> graines <SEP> de <SEP> soja <SEP> 30
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Dextrose <SEP> 20 <SEP> g.
<tb>
EMI6.3
CoC1.6HO ,005 g. CaC03 1,0g.
EMI6.4
<tb> Eau <SEP> de <SEP> robinet <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
.Les flacons sont incubés pendant 7 jours à 25 C dans un agitateur à mouvement de va-et-vient. Au bout de sept jours, des échantillons de bouillon neutre centrifugé sont soumis à des essais en vue de déterminer leur activité vis-à-:
EMI6.5
vis du Wçsçoçïusjvosenes var. aureus et Mycobacterium tuberculosis BCG. Les résultats obtenus sont les suivants :
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EMI7.1
<tb> Activité <SEP> en <SEP> unités'de <SEP> dilution <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb>
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> var <SEP> aureus <SEP> M. <SEP> tuberculosis <SEP> BCG
<tb>
<tb> 250-305 <SEP> 100 <SEP> ¯¯¯¯
<tb>
EXEMPLE 2.-
Fermentation en tank de Streptomyces sp. 3705.-
I-.
Source d'inoculum .-
Des cultures de stock de Streptomyces sp. 3705 .: sont transférées hebdomadairement à des milieux inclinés frais d'agar de Gould ( 2o g. agar, 10 g.glucose, 2,5 g. ex- trait de levure, 1,0 g.K2HOP4 et 1000 cc eau distillée). Les cultures inclinées inoculées sont utilisées après 3 à 5 jours d'inoculation à 25 C.
II.- Préparation d'inoculum.-
Dans un flacon de 500 ce contenant 100 ce du milieu aqueux suivant :
EMI7.2
<tb> Farine <SEP> de <SEP> graines <SEP> de <SEP> soja <SEP> 15 <SEP> g.
<tb>
<tb>
Dextrose <SEP> 20 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
CaCO3 <SEP> 5 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
NaCl <SEP> 1 <SEP> g. <SEP>
<tb>
<tb> Eau <SEP> de <SEP> robinet <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
qui a été stérilisé pendant 30 minutes à 121 C après ajuste- ment du pH à 7,0-7,2 avec de l'hydroxyde de sodium, on place une cuillerée du produit obtenu sous I. La culture est incu- bée pendant 72 heures à 25 C. Au bout de cette période, 10 cc de la culture sont transférés dans un second flacon contenant 100 cc de milieu. Cette seconde culture est incubée pendant 48 heures à 25 C. Au bout de cette période, le contenu du se- cond flacon est transféré dans un flacon d'une capacité de 4 litres contenant 1000 ce du milieu.
Cette troisième culture est incubée pendant 48 heures à 25 C, puis transférée dans un germinateur d'une capacité de 10 gallons contenant 25 litres
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d'un milieu préalablement stérilisé pendant 15 minutes à 121 C . et présentant la composition suivante:
EMI8.1
<tb> Farine <SEP> de <SEP> graines <SEP> de <SEP> soja <SEP> 750 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Glucose <SEP> 1000 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
CaC03 <SEP> 25 <SEP> g.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> de <SEP> robinet <SEP> 25 <SEP> litres
<tb>
(pH ajusté à 7,0 @ du NaCH avant et après stérilisation)
Le germinateur est aéré et agité pendant 30 à 36 heures à 25 C sous une pressi.. 10 livres par pouce carré.
Un agent anti-mousse est également ajouté au milieu pour em- pêcher un moussage excessif.
III.- Fermentation .-
Dans un fermentateur de 100 gallons contenant 50 gallons d'un milieu, qui a été précédemment stérilisé pendant
15 minutes et contient :
EMI8.2
<tb> 3,0% <SEP> de <SEP> farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> soja
<tb>
<tb> 3,0% <SEP> glucose
<tb>
<tb>
<tb> 0,5% <SEP> CaCO3
<tb>
<tb>
<tb> 0,2% <SEP> Na2SO4
<tb>
<tb>
<tb> 0,25% <SEP> Foamrex <SEP> S <SEP> (Socony <SEP> Vacuum <SEP> Oil <SEP> Company, <SEP> Inc.), <SEP> ou
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> autre <SEP> agent <SEP> anti-mousse <SEP> ajusté <SEP> à <SEP> pH <SEP> 7,0 <SEP> avec
<tb>
NaOH avant stérilisation, on introduit le con- tenu du germinateur. Le fermerlt ateur est aéré et agité pendant 56 à 108 heures à 25 C sous une pression de 10 livres par pouce carré.
Au bout de 50 à 80 heures, l'activité atteint un maximum de 10.000 à 16.000 unités de dilution/ce vis-à-vis du Micrococcus pyogenes var. aureuset reste ensuite sensiblement constante. Le pH du bouillon de fermentation reste sensible- nt constant dans la gamme de 7,0 à 7,4 pendant la période de fermentation .
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Le thiostreptonbeut alors être séparé de tout le bouillon par les procédé,,, illustrés dans :.en exemples sui-
EMI9.1
vant.. Exe!'npj.e¯3. - EXTRACTION.du cHZOSxREo; dtun ifY'CELIUTd.
Le bouillon entier neutre est filtré et le gâteau est séché autant que possible dans une presse. Le gâteau do filtre humide est alors placé dans un volume de chloroforme juste assez grand pour donner une bonne pâte (12-15 gallons par 100 livres de gâteau humide) et qui est agitée vigoureu- sement pendant une =- heure.
Le mélange est filtré, le chloro- forme est séparé de l'eau présente et conserva Le gâteau
EMI9.2
est alors extrait avec un second voilume de chloroforme (F3 à 10 gallons par 100 livres anglaises de gâteau humide), après quoi on filtre et on sépare le chloroforme, qui est combiné
EMI9.3
au premier extrait Les extraits chloroformiques combinés sont alors distillés sous vide( température maximum de l'a- lambic : 25 C) jusqu'à 1/50ème du volume originel. A ce con- centrât, on ajoute 10 volumes d'hexaneAprès repos pendant
EMI9.4
1 heure, le précipité est séparé par :"¯¯traction, lavé à l'acé- tone et séché.
Le précipité (A) contient 70 à 90% de thiostrepton pur et peut être davantage purifié et cristallisé par disso- lution dans du dioxane (1 gramme/10 cc), en ajoutant du car- bone (2% poids/volume), en chauffant le mélange tout en agi- tant à 50 C, puis en filtrant et en ajoutant lentement 5 vo- lumes d'eau au filtrat. Le précipité cristallin ainsi obtenu est assez pur, mais il est encore quelque peu coloré. Il peut être purifié davantage et un produit pus blanc peut être ob- tenu en redissolvant le précipité dans du dioxane (1 gramme/ 15 ce), en filtrant et en ajoutant lentenant au filtrat 5 vo-
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lum@@ @@@e solution aqueuse a 50% de méthanol.
Le mélange est laissé au repos à température ambiante jusqu'au lendemain et le précipité cristallin de thiostrepton est alors séparé lavé à l'acétone et séché. Le produit obtenu est une matière uniformément cristalline blanche ou jaune pâle, qui titre
100. 000-110.000 unités de dilution par mgr (Micrococcus pyo- genes var. aureus).
Les rendements de chacun des stades de cristallisation et de recristallisation sont compris entre environ 75 et 80%. actives
Les matières/additionnelles sont également présen- tes en petites quantités dans le'bouillon, @ne de ces matières peut être obtenue à partir du premier précipité brat (A), en empâtant ce précipité avec de l'acétone. Cette matière parti- culière est soluble dans l'acétone et peur 3n être isolée par précipitation à l'eau ou évaporation de l'acétone jusqu'à sic- cité .
L'activité de cette matière partiellement purifiée est de l'ordre de 6.000 à 8.000 unités de dilation par mgr (Mi- crococous pyogenes var. aureus. )
Une autre matière présente peut être récupérée par cristallisation des liqueurs-mères de la seconde précipitation du thiostrepton. Cette autre matière présente une solubilité Plus grande que le thiostrpton et ne peut être récupérée des liqueurs-mères organiques de comstallisation qu'après addition de beaucoup d'eau. L'activité in vitro de la matière brute-est de l'ordre de 15.000 à 20. 000 unités de dilution par milligram. me (Micrococcus pyogenes var. aureus).
EXEMPLE 4.-
Préparation du chlorhydrate de thiostrepton.-
Le chlorhydrate de thiostrepton est formé en empâ- tant le thiostrepton cristallin ou brut dans un alcool, tel que le méthanol, puis en ajoutant un équivalent d'acide chlor- hy rique sous forme d'une solution aqueuse concentrée. Le thic-
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strepton se dissou' ce qui indique la formation d'un sel.
Le chlorhydrate peut être précipité de cette solution par ad- dition d'éther ou d'acétate d'éthyle. Le chlorhydrate est in- stable sous forme de solide ou dans la solution méthanolique originelle, son activité diminuant rapidement . Si l'on ajou- te de l'eau à la matière solide ou à la solution alcoolique, le sel est immédiatement hydrolysé et la base libre est obte- nue.
D'autres sels d'addition avec des acides , tels, que le sulfate, peuvent être préparés de la même manière que le chlorhydrate et ont les mêmes propriétés générales.
EXEMPLE 5. -
EMI11.1
Préparation du complexe de c.orure ca3;.:i:que - dE thlo-gr on-- Le complexe do chlor'.'re calcique est formé en empâ- tant du thiostrepton dans une @@@@ution méthanolique à 0,5% de chlorure de calcium à une concentration de 4-5 milligrammes par cc. La base se dissout lentement ce qui indique la forma- tion d'un complexe, étant donné qu'en l'absence de chlorure de calcium elle ne se dissout pas. Lorsque la dissolution est complète ,le complexe est précipité par addition d'éther ou d'acétate d' éthyle. L'addition d'eau à la matière solide ou à la solution méthanolique originelle provoque une hydrolyse immédiate du complexe en sorte qu'on obtient la base libre.
Propriétés physiques et chimiques du thiostrepton.-
Le thiostrepton cristallisé a les caractéristiques physiques et chimiques suivantes: Point de fusion : Fo@ce à environ 235 C et fond avec décomposition à envi-
EMI11.2
ron tr5-56 C
<Desc/Clms Page number 12>
Analyse élémentaire (approximatif):
C= 51,75 %
H = 5,30
S = 9,22 %
N = 15,84 %
0 = 17,89% (par différence)
Pas d'autres éléments présents .
Acétyl = 8,70 % .
Pas de groupes méthoxy . Ne forme pas d'esters avec les anhydrides succinique et phtalique .
Poids équivalent = 380
Solubilité :
Bonne solubilité dans dioxane, chloroforme, N,N-dimé- thylformamide, N;N-dimérthylacétamide et alcool benzylique.
Soluble à raison de 100-200 mcg/ml dans alkanols, tels que méthanol, éthanol, isopropanol et butanol, et dans trichloro- éthylène et propylène glycol. Presque insoluble dans l'eau (10-20 mcg/ml). Insoluble dans éther, acétone, benzène, hexa- ne, acétate déthyle , acétate d'amyle, éther dibutylique, glycol, diéthylène glycol, glycérol, huile de maïs, huile de sésame et oléate d'éthyle.
Stabilité :
Stable jusqu'à 1 semaine dans une solution 50%- dioxane-505 eau à pH 7 à 30 C. Très instable dans le même système de solvants à pH 2 et 11. Stable dans la diméthyl- acétamide pendant au moins deux mois à une température infé- rieure à la température ambiante (faible perte d'activité seulement après 2 mois à température ambiante).
Spectre ultraviolet :
Les ressauts d'absorption d'ultraviolet du thio- strepton cristallin dans le méthanol se présentent aux lon-
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gueurs d'ondes suivantes:
EMI13.1
<tb> # <SEP> (m )/240
<tb>
<tb> 280
<tb>
<tb> 305
<tb>
. Spectre infra-rouge :
Les pointes et ressauts (r) d'absorption d'infra- rouge se présentent aux fréquences et longueurs d'ondes sui- vantes :
EMI13.2
1(cm-1) À yi) 7 ) /\'
EMI13.3
<tb> 3289 <SEP> 3,04 <SEP> 1116 <SEP> 8,96
<tb>
<tb> 1733 <SEP> 5,77 <SEP> 1094 <SEP> 9,14
<tb> 1658 <SEP> 6,03 <SEP> 1060 <SEP> 9,43
<tb>
<tb> 1631 <SEP> 6,13 <SEP> 1033 <SEP> 9,68 <SEP> (r)
<tb>
<tb> 1580 <SEP> 6,33 <SEP> 1020 <SEP> 9,60
<tb>
<tb> 1534 <SEP> 6,52 <SEP> (r) <SEP> 984 <SEP> 10,16
<tb>
<tb> 1511 <SEP> 6,62 <SEP> 971 <SEP> 10,30
<tb>
<tb>
<tb> 1486 <SEP> 6,73 <SEP> 951.
<SEP> 10,52
<tb>
<tb> 1420 <SEP> 7,04 <SEP> (r) <SEP> 935 <SEP> 10,70
<tb> 1376 <SEP> 7,27 <SEP> 9 <SEP> 21 <SEP> 10,86 <SEP> (r)
<tb>
<tb>
<tb> 1366 <SEP> 7,32 <SEP> (r) <SEP> 893 <SEP> 11,20
<tb> 1348 <SEP> 7,42 <SEP> (r) <SEP> 856 <SEP> 11,68
<tb>
<tb> 1309 <SEP> 7,64 <SEP> (r) <SEP> 808 <SEP> 12,38
<tb>
<tb> 1282 <SEP> 7,80 <SEP> 780 <SEP> 12,82
<tb>
<tb> 1269 <SEP> 7,88 <SEP> 769 <SEP> 13,00 <SEP> (r)
<tb>
<tb> 1244 <SEP> 8,04 <SEP> (r) <SEP> 760 <SEP> 13,15
<tb>
<tb> 1203 <SEP> 8,31 <SEP> 740 <SEP> 13,52
<tb>
<tb> 1166 <SEP> 8,58 <SEP> (r) <SEP> 730 <SEP> 13,70
<tb>
<tb> 1152 <SEP> 8,68 <SEP> (r)
<tb>
<tb> 1138 <SEP> 8,79
<tb>
<Desc/Clms Page number 14>
EMI14.1
Propriétés biologiques du thiostrepton.-
Le thiostrepton possède un large spectre antibac- térien vis-à-vis de nombreuses bactéries (et virus),
comme indiqué par la liste partielle suante:
EMI14.2
Microor'anisme Concentration d'inhibi- tion minimum en -;Y/ml.
Micrococcus !?yogeues var. aureus 209P o 01-0 02
EMI14.3
<tb> Cahill <SEP> 0,03
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N 5 <SEP> 1,25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N 376 <SEP> 1,67
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> C203 <SEP> 0,003
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0,03
<tb>
EMI14.4
Streptococcus faecalis ,06 ϱ *2àìïÏH˯aoidoilus 0,06 Clostridium septicwn 0,15 Dr5lococcus pneumoniae type 3 0,3 Xnebacterum¯dijohteriae 2cobactérimn tuberculors var. bovis (BCG) 3,0 Aerobaéter aeroge.es 50 Escherichia coli
EMI14.5
<tb> 50
<tb>
EMI14.6
Pseudomonas aftrSl2!l.
Salmonella schettmulleri Shigella sonnai
EMI14.7
<tb> -### <SEP> 50
<tb>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb> Proteus <SEP> vulgaris
<tb>
<tb> 50
<tb>
EMI14.8
Salmonellatyphosa
EMI14.9
<tb> 30
<tb>
EMI14.10
Shigella dysenteriae
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<tb> ######30
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des D'autres essais ont été exécutés avec des oeufs des souris, des des lapins et des chats pour déterminer la toxicité .l'efficacité du thiostrepton.
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Pour déterminer l'activité :Ll1V:LVO du thiostrepton vis- e-vis du virus méningo-plleumonitis dans des eoufs des
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oeufs embryonnés vieux de 7 jours ont été infectés à l'aide de doses de 100 LD50 d'un inoculum standardisé de virus méningo-pneumonitis par la membrane vitelline.
Les oeufs ont ensuite été traités, un jour après l'infection, par la mem- brane vitelline à l'aide de thiostrepton dissous dans de la diméthylacétamide ( rapport antibiotique: diméthylacétamide 1 :10) aux doses indiquées dans le tableau suivant:
TABLEAU 1.-
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<tb> Doses <SEP> Temps <SEP> moyen <SEP> Différence <SEP> Rapport <SEP> PD50
<tb>
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<tb> (mgr/oeuf <SEP> ) <SEP> de <SEP> survivance <SEP> dans <SEP> le <SEP> temps <SEP> survivan- <SEP> (mar/oeuû
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<tb> (heures) <SEP> de <SEP> survivance <SEP> de/total <SEP> (mgr/oeu)
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<tb> (heures) <SEP> (après <SEP> 10
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<tb> ' <SEP> ours <SEP>
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<tb> Contrôle <SEP> (diméthylacétamide) <SEP> 158 <SEP> 0/18
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<tb> 1,0 <SEP> 219 <SEP> +61 <SEP> 8/16 <SEP> 0,
72
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<tb> 0,5 <SEP> 213 <SEP> +55 <SEP> 7/17
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<tb> 0,25 <SEP> 189 <SEP> +31 <SEP> 1/17
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* -aux embryons vivants, 10 jours après l'infection, on a assigné des temps de survivance de 240 heures pour les besoins du calcul.
** -méthode de Reeds et Muench .
Pour déterminer l'activité in vivo du thiostrepton vis-à-vis du Streptococcus pyogenes C203 chez la souris, des souris ont été infectées avec un inoculum standardisé de Streptococcus pyogens C203 par injection intrapéritonale. Les souris ont ensuite été traitées par injection sous-cutanée avec du thio- strepton dissous dans de la N,N-diméthylacétamide et dilué à l'eau jusqu'à la concentration finale indiquée dans le ta- bleau 2 .
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TABLEAU 2.-
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<tb> Dose <SEP> Pourcentage
<tb>
<tb>
<tb> (mcg/souris <SEP> dans <SEP> de <SEP> survivance
<tb>
<tb>
<tb> 0,5 <SEP> ml. <SEP> de <SEP> solu- <SEP> (%)
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<tb> tion)
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<tb> Contrôle <SEP> (solu-
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<tb> tion <SEP> saline) <SEP> 0
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<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> 40 <SEP> 100
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<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> 20 <SEP> 100
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<tb>
<tb>
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<tb> 10 <SEP> 20
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Des essais ont également été exécutés pour déter- miner l'activité du thiostrepton vis-à-vis du Micrococcus pyogenes var. aureus n 5 (souche sensible à la pénicilline) et vis-à-vis du Micrococcus pyogenes var. aureus n 376 (sou- che résistant à la pénicilline) chez la souris.
Pour ces dé- terminations, des souris pesant 18 à 20 grammes ont été infec- tées, par la voie intrapéritonéale, à l'aide d'un inoculum standardisé des souches respectives dans 5% de mucine.-Les souris infectées ont été ensuite traitées par injection intra- veineuse avec une seule dose de thiostrepton de la manière in- diquée dans le tableau 3. A des fins comparatives, des essais ont également été faits avec le sel potassique de pénicilline G au lieu de l'antibiotique suivant la présente invention .
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TABLEAU 3
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ANTIBIOTIQUE MODE D* ADMINISTRATION Activité -vis-à-vis du 1cgenE.; ;'&.:.:'. arEH.1.S Souche sensible à la Souche résistent à 1 pénicilline n' 5 pénicilline n 3?o r.DST2f S/r Dota Si
EMI17.2
<tb> Solution <SEP> saline <SEP> (con- <SEP> Temps <SEP> de <SEP> survivance <SEP> moyen <SEP> - <SEP> 20 <SEP> heures;
Survivants/Total <SEP> (S/T) <SEP> 0/10
<tb> trôle)
<tb>
EMI17.3
Thiostrepton 100 meizo antibiotique + 1000 mcgQNtNdiéthylncétaide 220 (DMA) dans 0,5 ce solution saline physiologique 222 10 10 220 jazz
EMI17.4
<tb> 50 <SEP> mcg. <SEP> antibiotique <SEP> + <SEP> 500 <SEP> mcg. <SEP> DMA <SEP> dans <SEP> 0,25 <SEP> cc <SEP> solution <SEP> saline <SEP> physiologique <SEP> 200 <SEP> 9/10 <SEP> 109
<tb> 25 <SEP> mcg. <SEP> antibiotique <SEP> + <SEP> 250 <SEP> mog. <SEP> DMA <SEP> dans <SEP> 0,125 <SEP> ce
<tb>
EMI17.5
solution saline physiologique "9 .10 42 2rJ..
100 mcg. antibiotique + 1000 mcg. dioxam '....::..ns 0,5 cc solution saline physiologique 190 8/10 1 3 //#
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<tb> 50 <SEP> mcg. <SEP> antibiotique <SEP> '- <SEP> 500 <SEP> mcg. <SEP> dioxane <SEP> dans <SEP> 0,25 <SEP> ce
<tb> solution <SEP> saline <SEP> physiologique <SEP> 44 <SEP> 2/10 <SEP> 0 <SEP> ci')
<tb> 25 <SEP> mcg. <SEP> antibiotique <SEP> + <SEP> 250 <SEP> mcg. <SEP> dioxane <SEP> dans <SEP> 0125 <SEP> 0/10
<tb>
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ce solution saline physiologique 32 1/10 0 cIL':
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<tb> Pénicilline <SEP> G <SEP> potas'- <SEP> 60 <SEP> mcg. <SEP> antibiotique <SEP> dans <SEP> 0,5 <SEP> ce <SEP> solution <SEP> saline
<tb> sique <SEP> physiologique <SEP> 155 <SEP> 7/10 <SEP> 0 <SEP> 0/10
<tb> 30 <SEP> mcg. <SEP> antibiotique <SEP> dans <SEP> 0,25 <SEP> ce <SEP> solution <SEP> saline <SEP> l) <SEP> 3
<tb> physiologique <SEP> 123 <SEP> 5/10 <SEP> 0 <SEP> 0/9
<tb> 15 <SEP> mcg.
<SEP> antibiotique <SEP> dans <SEP> 0,125 <SEP> ce <SEP> solution <SEP> saline <SEP> 133 <SEP> bzz10
<tb> pysiologique <SEP> 133 <SEP> 6/10 <SEP> 0 <SEP> 0/10
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* DST - Différence (en heures) dans le temps de survivance par rapport aux contrôles ** Souche résistant à 100 unités de pénicilline in vitro
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Les essais précédents démontrent l'efficacité par- ticulière du thiostrepton in vivo contre les infections mi- crococciques et streptococciques.
Pour déterminer la toxicité aiguë du thiostrepton chez la souris, une solution à 10% de l'antibiotique dans de la N,N-diméthylacétamide a été diluée de 1 & 2C dans de l'eau distillée et administrée par la voie intraveinesse (0,lcc/5sec à des souris. La dose léthale LD50 s'est avéré;: d'environ 41,7 mgr/Kg et la dose LD2 estimée à 23,1 mgr/kg.
On a également constaté qu'une seule injection intraveineuse da 5 mg de thio- strepton par kg. n'a pas d'effet fâcheu: sur des animaux d'es- sai , tels que chats, rats et lapins
En thérapie humeine, le thi@ostrepton possède le même spectre antibiotique général que la pénicilline et peut ainsi être utilisé pour combattre les infections dues à des -les coques à gram positif, tel/que les infections dues aux strepto. coques, staphylocoques et pneumocoques. Le thiontrepton. peut être administré entre autres par la voie buccale et par la voie intraveineuse.
Pour l'administration par la bouche, dans le traitement des infections staphylococciques du tractus gastro- intestinal, l'antibiotique est administré en capsules en deux parties à une dose d'environ 1 à 2 gr. par jour. Pour l'ad- ministration par voie intraveineuse, l'antibiotique est d'a- bord dissous dans de la N,N-diméthylacétamide à 100%, la solu- tion obtenue étant mélangée avant l'injection à de l'eau, de façon à donner une composition finale contenant environ 10% de N,N-diméthylacétamide et environ 90% d'eau. Cette composi- tion est alors administrée par voie intraveineuse à raison d'environ 300 à 400 mgr de thiostrepton par j our.
Des modifications peuvent évidemment être apportées aux détails décrits ci-dessus sans sortir du cadre de l'inven- tion tel qu'il est défini dans les revendications suivantes.