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L'invention est relative à l'oxydation de certains composés stéroïdes par des moyens' microbiologiques; et elle concerne, plus particulièrement, l'oxydation de certains composés stéroides 3-céto-4 non saturés à l'aide de certains @ micro-organismes ou certaines enzymes oxydantes produites par ces microorganismes.
On a découvert maintenant, d'une manière inatten- due, que les composés stéroïdes 3-céto- ' peuvent être obtenus à partir des composés stéroïdes 3-céto-#4 en met- tant le stéroïde en contact avec l'activité oxydante pro- duite par des microorganismes du genre Nocardia. Cette ré- action a une très grande valeur car on a constaté que le composé }1,4 -prégndiène-11ss,17 d , 21-triol-3, 20-dione (prednisolone) et le compose 1,4-17 @ ,21-diol-3,11,20- trione (prednisone) sont des produits de grande valeur pour le traitement de certaines affections du corps humain, plus particulièrement de l'arthrite rhumatismale.
Il existe de nombreuses matières initiales que l'on;peut se procurer aisément, pour la synthèse de ces composés mais ces matiè- res ne possèdent qu'une seule liaison double dansle noyau A, c'est-à-dire qu'elles sont des 3-céto #4 stéroïdes. Un procédé pour lequel une deuxième liaison double peut être introduite dans le noyau A a, par conséquent, une grande Valeur pour l'industrie pharmaceutique et pour le bien-être public.
On a déjà spécifié qu'une liaison double peut être introduite, à la position 1, dans certains composés 3-céto #4 par des organismes différents de ceux visés par l'in- 'ntion. Un nombre excessivement 'rand d'organismes ont été essayés en ce qui concerne leur faculté de produire cette
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réaction et on a constaté qu'ils ne convenaient pas à cet effet. On a découvert maintenant, d'une manière surprenante,, que des organismes du genre Nocardia effectuent cette réac- tion avec un rendement élevé.
Des avantages additionnels, obtenus avec les organismes du genre Nocardia, résident dans le fait que le produit obtenu est, en substance, exempt de sous-produits et qu'il peut, par conséquente être aisé- ment purifié. Comme l'opération de purification est coûteu- se, cette absence de sous-produits constitue un avantage très important. Encore un autre avantage obtenu avec le Nocardia est que l'organisme croît d'une Manière relative- ment rapide et qu'il peut être aisément cultivé sur un mi- lieu nutritif économique.
On a découvert maintenant qu'en mettant en contact un composé stéroïde 3-céto-4 non satura avec l'activité oxy- dante d'une espèce du genre Nocardia, on obtient l'oxyda- tion du composé stéroide. La réaction chi igue principale est une déshydrogénation aux positions 1-2, ce qui produit une liaison double entre ces postulons. Le procédé selon l'invention, c'est-à-dire la mise en contact d'un composé stéroïde appropriée avec l'activité oxydante d'une espèce du genre Nocardia peut se f.?ire'en mettant le composé sté- roide choisi, en solution ou suspension noueuse,
en contact avec une culture croissant activement de Nocardia ou avec des cellules de Nocardia enlevées de la culture croissante et mises en suspension drain un Milieu approprié, ou en Met- tant en contact le stéroïde avec de.: extraits d'enzymes oxydantes obtenues à pnrtir de la culture d'une espèce du genre Nocardia.
Un but de l'invention est de r@aliser un procédé pour la préparation de stéroïdes oxydés, plus carticulière- ment des stroïdes 3-céto-#1,4, à partir de composés 3-cé-
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to-4 non saturés correspondants.
Un autre but de 1'invention est de réaliser un procédé économique pour effectuer cette réaction de déshy-. drogénation, ce procédé pouvant être aisément appliqué sur une grande échelle pour la production de grandes quantités.
D'autres buts de l'invention apparaîtront au cours de la description donnée ci-après.
Une variété de composés stéroïdes 3-céto-4 non saturés peuvent être utilisés connue matières initiales pour les réactions selon l'invention. Ces composés comprennent des matières telles que le :
EMI3.1
Composé F (hydrocortisone) 9 d -fluoro-Composé F Composé E (cortisone) 14 c( -hyàr oj;
y-Composé F Corticostérone 11-épi-hydrocortisone Composé S # -androstadiendione
EMI3.2
14 c( -hydroxy-Composé S 1113 ,17 c(-dihydroyprogestérone Désoxycorticostérone # -déshydro-Composé S androsténédione testostérone nortestostérone progestérone
EMI3.3
17 -hydroxyproges-b6rolie 16-déshydroprogéstérone 11-cétoprogestérone ±1 (11-déshydro-Compoaé S
En général, ce procédé est le mieux applicable aux composés stéroïdes 3-céto-#4 dont le squelette de carbone comprend de 18 à 21 atomes.
Les produits de la réaction peuvent être détectés en comparant soigneusement des chro-
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raatograumes sur papier des produits formés par la réaction selon l'invention avec des composas stéroïdes connus. Cette méthode a été essayée avec une variété de composés et on sait qu'elle donne des résultats auxquels on peut se fier.
Des détails concernant cette .méthode se trouvent dans la littérature chimique .
Pour la mise en oeuvre do l'invention, diverses espèces du genre Nocardia sont utiles pour produire la dés-
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hydrgenation du noyau A. Un peut se procurer facilement ces organismes dans les collections publiques, 'par exemple dans l'American Type Culture Collection de Washington D.C.
Les espèces du genre Nacardia, qui sont utiles pour le pro- cédé selon l'invention, comprennent le Nocardia coeliaca,
Le Nocardia convoluta, le Nocardia corallina, le Nocardia crythropolis, le Nocardia gardneri, le Nocardia minima et le Nocardia polychromogènes. Une valeur particulière est celle des organismes de l'espèce N. opaca et de l'espèce
N. globerula. Des cultures vivantes du N.opace et de N. globerula ont été déposées à la American Type Culture Col- lection of Washington D.C. et on leur a donné les n ATCC 4276 et 9356 . Les différentes espèces de Nocardia varient considérablement en c e qui concerne la facilité et la r.api- : dite avec lesquelles la déshydrogénation est produite.
Il existe également des différences entre les souches d'une même espèce. D'une manière analogue, les divers substrata de stéroïdes diffèrent, en ce qui concerne la facilité et la rapidité auxquellesla déshydrogénation du noyau A a lieu. Toutefois, il est aisément possible, par un minimum d'essais ordinaires, de déterminer les conditions optima pour la déhydrogénation de chaque stérolde spécifique à l'aide de chaque espèce spécifique de l'organisme.
Il existe plusieurs méthodes qui peuvent être adoptées pour la déshydrogénation de composés stéroïdes con- formément à l'invention Avant tout, parmi ces méthodes,on ensemence les milieux nutritifs avec des traînées du Nocar- dia choisi. Un tel milieu peut être constitué, par exemple, par un mélange d'une base de bouillon bactériologique ordi- naire ensemble avec l'hydraté de carbone ajouté. La culture du Nocardia a été décrite, avec de nombreux détail dans plusieurs publications.
Les solutions nutritives, stérili-
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sées et ensemencées peuvent croître dans des flo.cons se- corés rendant deux à trois jours pour former un inoculum pour- des récipients plus grands et, à leur tour, on peut; utiliser le produit obtenu dans les récipients plus grands, agités et aérés pour l'inoculation de cuves pour la produc- tion en grand par une fermentation submergée.
Le même milieu, du genre décrit plus haut, peut être utilisé pour une oxydation sur une grande échelle de stéroïdes conformément à l'invention. Des modifications considérables peuvent, évidemment, être apportées au milieu? En général, il est nécessaire de faire intervenir un hydra- te de carbone, une source d'azote organique, des sels mi- néraux et diverses traces de métaux.
Connue ditplus haut, plutôt que d'effectuer l'oxy-. dation du composé stéroïde choisi en présence de tout le produit de fermentation, on peut enlever des cellules des cultures croissantes et ces cellules peuvent être remises en suspension dans un milieu que l'on a désigné comme étant le mélange de réaction etlzyme. Ce mélange de réaction peut être constitué, par exemple, par une solution 0,01 molécu- laire dans un fumarate de sodium ou d'un autre agent ac- ceptant l'hydrogène et dans du sulfate de magnésium et qui peut être 0,03 moléculaire dans du citrate- de .sodium. On a découvert que la présence d'une certaine quantité de tri- phosphate d'adénosine, par exemple 0,125%, est également très utile.
Des cellules lavées et centrifugées de Nocardia choisi peuvent être mises en suspension dans le mélange de réaction de ce .genre, dont le pH est réglé à environ 6, par exemple avec de l'acide citrique. Après l'addition du com- posé stéroïde que l'on désire oxyder, le mélange peut être . incubé à environ 37 et des échantillons peuvent être pré- levés de temps en temps pour déterminer le point auquel la
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conversion maximum du stéroïde a eu lieu.
En général, ceci se produit après environ un ou plusieurs jours.' On a décou- vert que les cellules provenant d'environ 100 ml des cultu-. res Nocardia agitées et aérées peuvent être mises en sus- pension dans environ 20 ml d'un mélange de réaction enzyme pour donner des résultats convenables. Des modifications considérables peuvent être apportées à ces proportions. Le composé stéroïde peut Atre utilisé dans une proportion d'en- viron 25 à environ 200 mg/100 ml du mélange de réaction enzyme. Le composé, à l'état solide, est simplement ajouté au milieu après le réglage du pH.
Les flacons sont bouchés avec du coton afin que leur contenu soit exposé à l'air pendant l'incubation. On préfère utiliser un petit volume comparé à celui du flacon, par exemple 20 ml dans un fla- con Erlenmeyer de 125 ml. Suivant une variante, le mélange peut être agité et aéré. En général, au moins un agent acceptant l'hydrogène un métal bivalent, plus particulière- ment le magnésium, et un tampon sont nécessaires dens le milieu .
Au lieu d'enlever les cellules de Nocardia et d'effectuer la réaction selon l'invention dans un milieu de réaction enzyme, on peut ajouter directement le composé sté- roïde à une partie stérilisée du milieu nutritif, tel que décrit plus haut, après quoi le milieu est encemencé avec le Nocardia choisi. Approximativement, la même proportion du composé stéroïde choisi peut également être utilisé dans ce cas. Des échantillons du mélange agité et aéré peuvent être prélevés de temps en temps pour déterminer la conver- sion du composé stéroïde en produits oxydés.Le mélange est maintenu entre 20-.37" ou à une température plus élevée pen- dant la croissance des cellules et la conversion du stéroï- de.
En général, de 1/2 à 7 jours environ sont nécessaires pour la production maximum des composés oxydés. Suivant un/
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variante, la croissance des cellules peut être déterminée avaub l'addition du stéroïde.
Une troisième méthode, qui est également très uti- le pour l'oxydation des composés stéroïdes choisis,' consiste à utiliser des enzymes oxydantes produites par le Nocardia.
Celles-ci peuvent être préparées par diverses méthodes à partir des cellules des organismes choisis. Ces matières peuvent être libérées par les cellules par de nombreuses méthodes différentes. Celles-ci comprennent la mouture, plus particulièrement à l'aide de matières abrasives, telles que de la poudre de verre ou du sable, pour rompre les .parois des cellules et libérer les matières essentielles. Une deuxième méthode est l'autolyse. Les cellules peuvent être séparées du milieu dans lequel elles sont cultivées.
Elles sont ensuite lavées et mises en suspension dans l'eau. L'eau peut être recouverte d'une mince couche de toluène pour empêcher la contamination, après quoi on laisse le mélange au repos à une température d'environ 20 à environ -50 . Les cellules se désagrègent en un ou plusieurs jours et le rési- du des cellules peut être enlevé par filtration, par exem- ple à travers un filtre Seitz ou un filtre bactérien en ver- re fritté. Une troisième méthode pour préparer des produits d'élaboration , exempts de cellules, du Nocardia, utiles pour les réactions selon l'invention consiste à congeler et à décongeler rapidement plusieurs fois la matière cellulaire
Une autre méthode consiste à utiliser l'énergie ultrasonique pour rompre les cellules.
Une autre encore,con- venant au même effet, consiste à utiliser un solvant misci- ble à l'eau, en particulier de l'acétone. Les cellules, quand elles sont placées dans un tel solvant, sont rompues et un extrait des enzymesdésirées est obtenu. Les enzymes de Nocardia peuvent être utilisées pour l'oxydation de com- posés stéroïdes 3-céto-4 non saturés dans des milieux anales
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gues à ceux utilisés pour les cellules cultivées, c'est-à- dire des miteux contenant un agent acceptant l'hydrogène, tel qu'un fumarate, un tampon et, dans certains -cas, un métal bivalent, plus particulièrement du magnésium, ainsi qu'une proportion minime de triphosphate d'adénosine.
Les enzymes oxydantes, exemptes de cellules, de Nocardia, peu- vent être utilisées, dans les milieux spécifiés plus haut,à une température d'environ 20 à environ 40 . En général, l'oxydation des composés stéroïdes désirés a lieu dans une période comprise entre quelques heures et plusieurs jours.
La durée et la température 'optima, ainsi que les autres conditions peuvent être déterminées aisément par un minimum d'essais. Des descriptions, détaillées des milieux appropriés pouvant servir aussi bien pour les cellules isolées, remi- ses en suspension, que pour les produits d'élaboration exempts de cellules, sont'indiquées dans le traité: "Mano- metric Technique in Tissue Metabolism" par W. W. Umbreit et autres, édité par la Burgess Publi@ing Company à Minneapo- lis (1949) et dans le traité: "Respiratory Enzymes" par H.
Lardy, édité par la Burgess Publishing Company, Minneapolis (1949).
La réaction est avantageusement suivie en se ser- vant de la chromatographie sur papier et de nombreuses des- criptions de l'usage de la chromatographie sur papier sont décrites dans la littérature. Les produits, obtenus sel&n l'invention, peuvent être isolés d'avec la solution aqueuse par extraction avec divers solvants organiques non misci- bles à l'eau. Des hydrocarbures halogénés inférieurs tels que le chloroforme,' sont particulièrement utiles.Après extractioh, les solvants peuvent être enlevés par distil- lation et le produit solide est alors isolé.
Cette matière peut être purifiée davantage par des méthodes de recris- tallisation hors de solvants organiques ou par chromato-
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graphie, par exemple sur des colonnes d'alumine ou sur d'autres matières absorbantes solides appropriées. L'usage d'une colonne gel de silice-éthanol avec des mélanges de chlorure de méthylène et de 2 à 5% en volume d'éthanol (à 95%) connue révélateur est particulièrement avantageux. Des méthodes pour la séparation des produits de ce genre ont été décrites déjà dans la littérature* Pour certains usages, les produits ne doivent pas être séparés, mais le mélange brut peut être utilisé tel quel.
On a constaté qu'il est avantageux, dans certains cas, d'acyler les produits bruts et de se servir des esters ainsi obtenus qui sont un peu plus stables .
Divers stéroïdes 3-céto-4 non saturés peuvent constituer des matières initiales pour les réactions selon' l'invention. Ceux-ci comprennent les composés bien connus tels que la testostérone, la progestérone et le Composé S de Reichstein. Les produits sont utiles comme intermédiai- res pour la synthèse d'autres composés utiles. Par exemple, les produits déhydrogénés qui contiennent une non satura- tion à la position.1,2 en même temps que le groupement 3- céto et la non saturation en 4,5 existant initialement dans le milieu primitif sont spécialement susceptibles à l'aroma tisation Inhoffen. Ceci crée un groupe de dérivés de l'es- trone.
Dans le cas du produit de déshydrogénation du Compo- sé S, le clivage de la chaîne latérale pour former un groupement 17-céto peut être aisément obtenu par des métho- des ordinaires, par exemple par oxydation avec lucide chro- mique et quand le produit de cette réaction est aromatisé par la réaction Inhoffen, par exemple en étant chauffé, à' une température élevée, d ans un solvant hydrocarboné, on obtient un composé estrone de grande valeur*
En plus de l'usage indiqué plus haut,' plusieurs
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composés obtenus par cette réaction ont une valeur extrê- de ment grande à cause de leur activité biologique importante.
Par exemple, quand l'hydrocortisone est traitée avec le No-' jardia par le procédé faisant l'objet de l'invention, le composé formé est le prednisolone qui est d'une grande uti- lité et présente des avantages supérieurs à ceux de l'hydro- cortisone pour le traitement de l'arthrite rhumastismale.
Quand la cortisone est traitée avec du Nocardia, on obtient le composé connu sous le nom de prednisone, qui est égale- ment d'une grande utilité pour. le traitement de l'arthrite rhumatismale. On a découvert aussi que d'autres stéroïdes 3-céto-#1,4 possèdent une grande activité comme hormones adrénacortisales et sont utiles pour le même genre de thé- rapeutie que l'hydrocortisone .
De nombreux stéroïdes, que l'on trouve dans la nature ou ceux préparés aisément à par- tir de stéroïdes naturels ont une structure 3-céto- mais on ne trouve pas aisément des composés 3-céto-#1,4 comme matières brutes.Il en résulte que le procédé selon l'inven- tion, qui permet de transformer un composé 3-céto-#4, ayant de 18 à 21 atomes dans son squelette de carbone, en un composé 3-céto- 1,4 en une seule opération et pour une production industrielle sur grande échelle, a une importais ce considérable
Les exemples ci-dessous sont donnés à titre il- lustratif sans caractère limitatif ni restrictif car de nombreux modes de réalisation,, apparemment très différents, peuvent être réalisés sans sortir des limites de protection de l'invention .
EXEMPLE I. -
Dans un vase an verre Pyrex, d'une capacité de quatre litres et agencé pour une fermentation aérée et sub- mergée, on verse deux litres du milieu suivant:
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N-Z aminé B (marque de fabrique de la Sheffield
EMI11.1
<tb> Farms- <SEP> hydrolysat <SEP> de <SEP> caséine) <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
<tb> dextrose <SEP> hydraté <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> ' <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
<tb> carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
<tb> eau <SEP> du <SEP> robinet <SEP> pour <SEP> faire <SEP> un <SEP> litre <SEP> . <SEP>
<tb>
Le milieu aqueux est [stérilisé et'traité ensuite avec 0,25 g d'hydrocortisone* Le mélange est alors ensemencé avec 100 ml d'une culture de N. opaca (ATCC Il 4276) culti- vée dans un flacon secoué sur un bouillon nutritif. Le mé- lange est agité et aéré avec de l'air stérile. L'ensemble du mélange est ensuite extrait plusieurs fois avec 2 litres de chloroforme. L'extrait est appliqué sur une colonne Chromatographique au gel de silice qui est élûtes avec des mélanges de chlorure de méthylène et d'éthanol. On obtient de cette manière la prednisolone .
EXEMPLE II. -
Une expérience est faite de. la Manière- expliquée plus haut excepté que, dans ce cas, l'organisme utilisé est le N.loberula (ATCC n 9356). On obtient la prednisolone de la même manière .
EXEMPLE III. -
Le procédé de l'exemple I est répété en utilisant la cortisone comme matière initiale. On obtient la predni- sone .
EXEMPLE IV.-
Le procédé de l'exemple II est répété en utilisant la cortisone comme matière initiale. La prednisone est ob- tenuede la même manière .
EXEMPLE V.-
Une série d'expériences ont été faites en procé- dant comme dans les exemples précédents et'.en utilisant- les composés stéroïdes suivants ! -12--12-
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Composé S 16-déhydroprogestérone
EMI12.1
9o{-fluoro-Coinposé F 11-cétoprogestérbne 6 4,6 -androstadiendiène . 6..9(11) -déshydro-Composé S 11Â17 d-hydroxyprogestérone 14d,l5 c(-époxydo-Composé S (114 -déhydro-Gomposé.
S l. c , l5 ci -époxydo-Composé F androsténédiène 14 c-hydroxy hydrlacortisone 19-nortestostérone l4d-hydroxy cortisone 17 c(-hydroxyprogestérone
Dans chaque cas, les produits sont obtenus à par- tir du milieu de réaction par extraction et sont soumis à une évaluation par la méthode de chromatographie au papier.
EMI12.2
Dans chaque es on trouve qu '1ulle 1 liaison double a été in- troduite à lk pasition 1.
REVENDICATIONS .-
1.- Procédé pour l'oxydation nucléaire d'un com- posé stéroïde 4-céto-#4 ayant de 1 à 21 atomes dans le squelette de carbone, dans lebuel procédé on met le stérol- de en contact avec l'activité oxydante d'un organisme du genre Nocardia.