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La présente invention se rapporte à un agent antibiotique nouveau ainsi qu'à son procédé de préparation.
L'agent antibiotique nouveau découvert par la demanderes- se, sera, pour plus de simplicité, désignée au cours de la présente description, par le nom arbitraire de "marcomycine".
La présente invention concerne plus particulièrement une nouvelle substance antibiotique, la "marcomycine", présentant les propriétés ci-après : elle possède un poids moléculaire d'en-
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viron 436, calculé d'après les résultats d'analyse; des valeurs pK'# d'environ 7,20 et 8,95, déterminées avec une solution à 66% dans la diméthylformamide; un point de fusion, avec décompo- sition, compris dans la gamme d'environ 1600 à 180 C; elle est relativement insoluble dans des solvants tels que l'éther, le chloroforme, le chlorure d'éthylène, l'hexane et le benzène, elle est soluble dans l'eau et est relativement soluble dans des solvants organiques tels que l'éthanol, le méthanol, la diméthyl- formamide et l'acide acétique glacial ;
est faiblement basi- que et susceptible de former des sels avec des'acides; elle est stable dans des solutions aqueuses dans une gamme de pH comprise entre'environ 1 et environ 10; sa composition en % est la suiyan- te : carbone = 46,40% , hydrogène = 7,48% , azote = 6,82% et (par différence) oxygène = 39,30%; en solution aqueuse, elle ne présente pas de spectre d'absorption dans l'ultraviolet; enfin, quand elle est mélangée à une huile minérale, elle montre les bandes nettes ci-après de spectre d'absorption dans l'infrarouge du spectre : 3,03, 6,01, 6,12, 6,24, 6,34, 8,10, 8,72, 9,30, 9,63 et 11,25 microns.
L'invention vise également un'procédé d'obtention d'un agent antibiotique, qui consiste à cultiver dans des conditions aérobiques une souche produisant la marcomycine de Streptomyces hygroscopicopicus dans un milieu de culture contenant des sources assimilables par les moisissures d'hydrate de carbone, d'azote et de sels minéraux, jùsqu'à ce que l'activité antibiotique effi- cace soit produite par cet organisme dans le milieu de culture précité.
A l'état de base, la marcomycine est une substance solide non cristalline, incolore, qui est très soluble dans l'eau et re- lativement soluble dans des solvants comme l'éthanol, le méthanol, diméthyl la/formamide, l'acide acétique glacial et des produits analogues.
Elle est relativement insoluble dans des solvants comme l'éther, le chloroforme, le chlorure d'éthylène, l'hexane, le benzène, et des produits analogues.
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Elle fond avec décomposition dans une gamme indéterminée compri-' se entre environ 160 -180 C.
La marcomycine est faiblement basique et présente des valeurs pK'# d'environ 7,20 et 8,95, déterminées avec une so- lution à 66% dans la diméthylformamide. La basicité paraît pro- venir de la présence d'un ou plusieurs groupes amino dans la molécule. La marcomycine forme des sels avec des acides ordi- naires. Par exemple, on peut préparer facilement le chlorhydrate, le sulfate, le phosphate, le maléate et des sels analogues. De tels sels sont, en général, très solubles dans l'eau. La marco- mycine forme également des sels ou des complexes analogues à des sels avec des acides de poids moléculaire élevé, par exemple avec l'acide p (p'hydroxyphénylazo)benzène aulfonique, le méthyl- orange et des produits analogues. Ces sels ou complexes sont relativement insolubles dans l'eau.
On constate que l'antibiotique est stable en solution aqueuse à un pH compris entre 1 et 10 environ.
La moyenne de plusieurs analyses élémentaires montre que la marcomycine présente approximativement la composition suivan- te : 46,40% de carbone, 7,48% d'hydrigène, 6,62% d'azote et 39,30% d'oxygène, cette dernière teneur étant calculée par dif- férence. Les valeurs ci-avantindiquent que*la marcomycine répond à la formule empirique C15H30O9N2. Le poids moléculaire de la marcomycine à l'état de base déduit empiriquement à partir des résultats d'analyse se monte à environ 436.
Le spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse de maroomycine ne présente pas de maxima d'absorption.
Le spectre d'absorption dans l'infrarouge d'un échantil- lon de marcomycine mélangé à de l'huile minérale présente les maxima d'absorption nets assez étendus qui' suivent .$,03, 6.01, 6,la, 6,24, 6,34, 8,10, 8,72, 9,30, 9,63 et 11,25 microns. La
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courbe d'absorption dans l'infrarouge de ce mélange est représen- tée sur le dessin annexé, sur lequel on a porté en abscisses les longueurs d'onde en microns et en ordonnée le pourcentage de 'transmission.
La marcomycine à l'état de base montre une activité anti- biotique contre des microorganismes Gram-positifs et 'Gram-néga- tifs, y compris les suivants : Staphylococus aureus, Mycrobacte- rium tuberculosis (H 37 RV), Staphylococus aureus, (résistant à la streptomycine,) Bacillus subtilis, Mycrobacterium phlei, Mycrobacterium tuberculosis (607). Mycrobacterium avium, Salmo- nella gallinarium, Escherichia coli, Aerobacter aerogenes et Klebsiella pneumoniae.
Administrés oralement sous la forme de capsules, de comprimés ou sous forme d'un constituant de l'ali- mentation, la marcomycine est efficace contre des animaux para- sites, tels que les amibes, les flagellaires, les trichines, les parasites pulmonaires, les strongyles et autres parasites stron- gyloldes.
La demanderesse a découvert qu'on peut produire la marco- mycine en cultivant certaines souches d'actinomycètes dans des conditions aérobies dans un milieu de culture contenant des sour- ces assimilables d'hydrates de carbone, d'azote et de sels miné- raux, jusqu'à ce que ce milieu de culture présente une activité antibiotique importante, et en soumettant ensuite le milieu à différents procédés servant à isoler la marcomycine.
¯ Par suite de l'imprécision des études taxonomiques des groupes des Aatinomyces, il existe toujours un certain doute en ce qui concerne la classification de tout organisme nouvellement découvert. Cepandant, les organismes qui se sont révélés capables de produire la marcomycine paraissent ressembler le plus étroite- ment à un actinomycète, qui est le Streptomyces hygroscopicus, organisme décrit en premier lieu par de%en dans le périodique
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Proc. Linn. New South-Xales, 56 : 345-370 (1931).
Les trois sou- ches d'organisme que la demanderesse a utilisées pour produire la marcomycine sont déposées de manière premanente à la collec- tion des souches de Culture des "Northern Régional Research Labo. ratories" à Peoria (Etat d'Illinois) et sont désirées par les numéros de souches NRRL 2387, NRRL 2388 et NRRL 2389.
Ces trois souches ont été isolées respectivement à partir d'échantillons de terre recueillie dans les régions suivantes : Marion County (Indiana), Saunders County (Nébraska) et Vigo County (Indiana). @ Le procédé d'isolement consiste à déposer sur une plaque un échan tillon fortement dilué de cette terre sur de l'agar nutritif, à faire incuber cette plaque jusqu'à ce que la croissance de l'or- ganisme soit accomplie, puis à prélever des colonies distinctes de cet organisme au moyen d'une boucle de fil de platine stéri- lisé.
Les trois souches précitées ont un aspect différent quand on les regarde superficiellement et sontcaractérisées par leur aptitude à produire la marcomycine dans des conditions de culture appropriées et par certaines caractéristiques particulières qui montrent qu'elles relèvent toutes de l'espèce . hygroscopicus.
Dans la description qui va suivre, on indiquera des études taxo- nomiquea détaillées des souches d'actinomycète mentionnées ci- avant produisant de la marcomycine.
Dans ces études, les procédés utilisés sont ceux qu'on utilise communément dans la taxonomie des actinomycètes. Les essais d'utilisation du carbone et de l'azote sont faits suivant les procédés de Pridham et Cottlieb, J. Bact., 56 107-114 (1948) Les publications de Waksman, Soil Sci., 8:71-215 (1919), Jensen, Soil Sci., 30:59-77 (1930), et "Conn. N.Y. Agr. Exp. Sta. Tech.
Bull. 60, 1-25 (1917)" fournissent les bases pour les autres es- sais et caractérisations. Pour désigner la plupart des colora-
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tions, on a utilisé le système indiqué par Ridgway, Color Standards and Color Nomenclature (1912).
TABLEAU I
EMI6.1
<tb> NRRL <SEP> 2387 <SEP> NRRL <SEP> 2388 <SEP> NRRL <SEP> 2389
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cette <SEP> culture <SEP> forme <SEP> Agar-agar <SEP> synthé-
<tb>
<tb>
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<tb> un <SEP> mycélium <SEP> végéta- <SEP> tique <SEP> -- <SEP>
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<tb>
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<tb> tif <SEP> typique <SEP> couché <SEP> et <SEP> identique <SEP> à <SEP> Identique <SEP> à
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> fortement <SEP> ramifié <SEP> NRRL <SEP> 2387 <SEP> NRRL <SEP> 2387
<tb>
produisant un mycélium aérien ramifié et re- dressé. Les spores aériens prennent nais- sance sur des conidio- phores à courte ramifi- cation en formant des spirales épaisses rap- prochées. A mesure que ' la culture mûrit, des grappes denses de spores mélangées avec des hyphes aériens recouvrent, la surface de la culture.
Vus au microscope, les spores individuels ont une forme géométrique typique soit libre, . soit sous forme de chaînes en spirale.
Ils ont un profil appro- ximativement carré ou rectangulaire, mais la surface de la cellule
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NRRL NRRL 2388 NRRL 2389 - qui est tournée ou a été tournée vers le côté extérieur de la chaîne en spirale est plus longue que la surface tournée vers l'intérieur de la spi- rale,ce qui lui donne l'apparence d'une clé de voûte. Cette forme caractéristique per- siste dans les spores détachés.Après environ 2 semaines d'incuba- tion,des corpuscules sphériques réfringents apparaissent en abondan- ce dans le mycélium aé- rien ou bien à l'extrémi- té ou bien le long du corps des hyphes indi- viduels.
Ces corpuscu- les varient considéra- blement quant à leur dimension, mais ils ont généralement plusieurs fois le diamètre d'un hyphe individuel.Ces structures ne parais- sent pas être cellu- laires mais plutôt for- mées par des globules d'un exsudat liquide.
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Autres milieux
NRRL 2387 NRRL 2388 NRRL 2389
Il se forme également Analogue à NRRL . Il se forme des spirales des spirales caracté- 2387, mais on comme pour le NRRL 2387. ristiques sur un mé- n'observe pas de Les corpuscules globu- lange glucose-aspa- globules sur des laires qu'on trouve ,sur ragine, sur l'amidon cultures de 32 glucose-asparagine et d'Emerson et sur des jours sur gluco- agar-agar à l'amidon ne milieux d'agar-agar se-asparagine, . sont pas observés sur contenant du malate malate de calcium le malate de calcium de' calcium. ou agar-agar d'.E- ou l'agar-agar
Les corpuscules glo- merson.
Pas d'es- d'Emerson. bulaires, qu'on trou- sai avec l'agar- ve sur le glucose- agar d'amidon. asparagine et le ma- late de calcium ne s'observent pas sur l'amidon et l'agar- agar d'Emerson dans des cultures incubées pendant 32 jours.
TABLEAU II
NRRL 2387 NRRL 2388 NRRL 2389
Ggar-agar synthétique
Une quantité modérée Comme NRRL 2387, sauf Comme NRRL 2387 sauf de mycélium végéta- que la pigmentation - que le mycélium aé- tif incolore est en- du mycélium aérien rien est tout d'a- fouie dans le mi- est uniformément gri- bord brun clair,puis lieu, en même temps se et non tachée et brun, puis finalement qu'une faible quan- devient presque noire presque noir.On cons- tité de mycélium aé- comme du charbon en tate la présence d' rien tacheté gris 2 à 4 semaines.
En une trace d'un pig- et blanc, de couleur outre, la croissance ment verdâtre solu-
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NRRL 2387 NRRL 2388 NRRL 2389 . gris souris pale à la est un peu plus éta- base jusqu'à gris lée et les cavités souris franc au som- de la surface égale- met de la tranche ; plus largement il existe quelques distribuée. zones noires au bord de la tranche. Il existe une couche, produisant des spo-, res, de spores pul- vérulents croissant à plat et très abon- dants à l'observation au microscope.
Il se produit des piqures dans la surface de la croûte des spores, à proximité du bord de croissance,surtout aux emplacements de couleur foncée; la production de cavités coïncide avec la dis- parition des goutte- lettes d'exsudat de di- mension similaire qui s'étaient produites par excrétion pendant la croissance.Pas de pig- ment soluble.
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NRRL 2387 NRRL 2388 NRRL 2389
Agar-agar au glucose-asparagine Mycélium végétatif Comme NRRL 2387, mais Comme NRRL 2387,mais enfoui, incolore, le mycélium aérien l'envers de la cultu- présent en quantité est plus copieux,la re prend une couleur importante.Mycélium couleur grise unifor- chamois par suite aérien plutôt clair- me devenant noire d'une trace d'un pig- semé; coloration comme du charbon et ment soluble. Le my- blanche en dessous humide en 2 4 célium aérien est avec une couche su-. semaines clairsemé, blanc,au périeure de couleur centre de la tranche gris-souris qui de- et plus épais et fon- vient brun foncé à cé le long des bords. presque noir.
Mycé- La couleur va du lium aérien clairse- blanc (au centre) jus- mé,d'abord taché de qu'au gris-souris au gouttelettes d'exsu- sommet dt devient dat aux endroits où noire (couleur suie) apparaissent plus tard et humide au bout de des cavités; la surface 2 à 4 semaines. devient mate et humide.
Il existe une trace d'un pigment brunâtre solu- ble.
Agar-agar au malate de calcium
Quantité modérée de Comme NRRL 2387,mais Comme NRRL 2387,mais croissance végétati- le mycélium aérien il existe un pigment ve, envers chamois- se développe tàrd, soluble de couleur rosé. Quantité mode- devient brun pâle et rose cannelle claire, rée d'un mycélium finalement humide et et un mycélium aé- aérien blanc qui noir.A la base de la rien plat-et blanc.
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NRRL 2387 NRRL 2388 NRRL 2389 prend à la. maturité bande,.11 existe, une Il survient tardive- une- apparence tacheté croissance sous for- ment sur le dessus avec. des petites per- me de colonies non une croissance brun. les gris-souris et a- sporulées et sur- clair qui devient 'noi- vec un peu de crois- élevées. re et humide,, après sance noir de suie. 2 à 4 semaines d'in- Surface inégale avec cubation. Il existe des colonies,sporu- des croissances en co lation faible à mo-' lonies sous forme de dérée surtout au dé- boutons non sporulés but. Le milieu ne à la base de la bande, contient pas de sels comme pour NRRL 2387. insolubles.Présence d'un pigment chamois- rosé soluble.
Agar-agar d'Emerson Croissance importante Comme NRRL 2387,mais Comme NRRL 2387;mais d'un mycélium végéta- le mycélium aérien l'envers de la crois- tif,de couleur Isabel- brun clair devient sance .'végétative est le à lenvers. Mycé- noir et humide en 2 rouge-orange qui fon- lium aérien abondant à 4 semaines, sauf' ce pour prendre une et blanc devenant au bout de la bande couleur terre de Sien- gris-souris et brun où la croissance est ne brûlée.Le mycélium noir avec des touf- transparente. La aérien frais est fes d'une couverture croissance est pro- blanc, devient brun minuscule blanche fondément ridée et foncé et finalement sous forme de colo- fissurée. noir terne.
La crois- nies.Pigment solu- sance est ridée et ble brun clair. fissurée d'un pigment soluble rouge acajou, prend une teinte ter@@ de Sienne brûlée a- près 28 jours.
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NRRL 2387 NRRL 2388 NRRL 2389
Agar-agar nutritif Quantité modérée d'Identique à NRRL Identique à NRRL une croissance végé- 2387 2387 tative incolore et d'un mycélium aérien blanc. Le milieu fonce légèrement en général, mais le pigment est trop pâle pour avoir une couleur caracté- ristique.
Agar-agar nutritif au glucose La croissance est si- La croissance est Croissance du type milàire à celle de comme celle du type Emerson, mais le mycé- l'agar-agar d'Emerson, Emerson, mais il y lium aérien est ridé, mais un peu moins a- a un mycélium aé- clairsemé et blanc bondante. Le mycélium rien encore plus . (presque transparent) aérien pulvérulent abondant.La surfa- une légère coloration blanc et gris-souris ce .entière devient brune apparaissant à devient uniformément finalement noire ; du bout de gris-souris sauf dans très peu de crois- la tranche.
Pigment les zones marginales sance superposée soluble couleur terre blanches et on cons- blanche.Pigment so- de Sienne brûlée après tate une légère luble brun pâle ou 28 jours. croissance de colo- inexistant. nies superposées éga- lement blanches. Pig- ment soluble brun clair.
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NRRL 2387 NRRL 2388 NRRL 2389 ,..
Agar-agar à l'amidon Quantité modérée de Identique à NRRL Ressemble à NRRL 2387 croissance végétati- 2387,mais non tache- en ce qui concerne la ve avec croissance té; pigmentation u- croissance et la pig- importante de mycé- niforme du mycélium mentation, mais il lium aérien ; aérien à toutes les existe une petite eurement couleur phases, mais passant quantité de pigment blanche tachetée et par la même série de soluble orangé-rose ombres de couleur changements de cou- au sommet de la tran- grise au début, puis leur (du blanc au che de culture.La couleur plus foncée gris-sou-ris et au croissance est plus à mesure que l'incu- noir).
La croissance vigoureuse et plus u- bation continue ; devient finalement niforme que celle de placements gris complètement noire. NRRL 2387 et elle.de- tournant graduelle- L'amidon est hydro- vient finalement com- ment au noir. Peti- lysé (largeur de la plètement noire. L'ami- tes gouttelettes d' zone d'hydrolyse don est hydrolysé (zo- exsudat survenant 28 mm). ne d'hydrolyse plus précocement.La sur- large que 20 mm): face de la croissan- ce présente des cavi- tés microscopiques à la maturité. Traces d'un pigment verdâ- tre soluble. L'ami- don est hydrolysé (la zone d'hydrolyse a une largeur de 21 mm).
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NRRL 2387 NRRL 2388 NRRL 2389
Culture sur tampon de pomme de terre
Croissance variable Comme NRRL 2387,mais Comme NRRL 2387,mais dans les tubes dou- la croissance et la le mycélium aérien est blés.Croissance végé- sporulation sont gris,et l'envers de la tative développée,de moins vigoureuses ; est noir caractère surélevé, présence d'un mycé- aux endroits adhérant rugueuse et fissurée, lium aérien incolore au verre.Le pigment
Croissance abondante ou blanc. sous le tampon est so- d'un mycélium aérien luble dans l'eau. La avec taches blanches couleur cannelle pas- et grises, le pig- se au rouge vineux. ment gris présentant une coloration brun- clair.Le mycélium aérien est surélevé, pulvérulent et pré- sente quelques ca- vités.Le tampon est plus foncé.
Gélatine (25 ) La croissance est mé- Comme NRRL 2387,mais Comme NRRL 2387,mais diocre, amorphe et in- la liquéfaction est la liquéfaction est colore.Liquéfaction légèr.ement moins complète en 28 jours. fortement retardée, complète en 28 débutant après en- jours. viron 20 jours, mais presque complète après 28 jours. Pas de pigment soluble.
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NRRL 2387 NRRL 2388 NRRL 2389
Lait de tournesol(30 C) Anneau de croissance Comme NRRL 2387,mais Comme NRRL 2387; avec une croûte min- l'anneau de crois- pH final 7,6. ce de mycélium aé- santé est plus massif. rien blanc. Hydrolyse pH final 7,6. sans coagulation, presque complète en 6 jours,et complète en 9 jours,réaction alcaline (pH final 7,5).
Lait de-tournesol (3700) Anneau d'une crois- Comme NRRL 2387,mais Comme NRRL 2387. sance de couleur l'anneau de croissan- pourpre bleuté avec ce a une couleur sen- du mycélium aérien siblement acajou. blanc.Hydrolyse rapide précédée, dans cer- tains cas de la for- mation de grumeaux mous. Réaction alca- line. milieu nutritif Croissance médiocre Comme NRRL 2387, Comme NRRL 2387. submergée, flocon- mais la croissance neuse et adhérente. est encore moins Pas de pigment vigoureuse soluble.
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NRRL 2387 NRRL 2388 NRRL 23 89
Milieu nutritif au glucose n Croissace développée, Comme NRRL 2387,mais Comme NRRL 2387. principalement sub- la croissance est mergée,molle et a- quelque peu médiocre. dhérente ; très peu de colonies surna- gantes.Pas de pig- ment soluble.
Milieu à la tyrosine Quelques colonies Comme NRRL 2387 Comme NRRL 2387 blanches surnagean- tes avec une cer- taine croissance a-
EMI16.1
morphe,oubmersée et floconneuse.Pas de pigment soluble.
Bande de cellulose La cellulose est par- Comme NRRL 2387 , Comme NRRL 2387, tiellement consommée, mais la croissance mais la croissance mais la croissance est importante. est importante. n'est pas abondante.
Sur les tableaux III, IV et V ci-après, on a indiqué les résultats d'essais, d'utilisation exécutés avec les souches d'or- ganismes. Sur ces tableaux, on utilise les symboles en vue d'une simplification ; + = croissance et utilisation du produit = pas de croissance, pas d'utilisation # = croissance limitée, utilisation probablement médiocre S = sporulation exceptionnellement bonne f faible
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BSP = pigment brun, soluble OSP = pigment orangé, soluble BUP = pigment brun-orange C . croissance importante
TABLEAU III
Utilisation des sources de carbone pour-les cultures
EMI17.1
<tb> Substratum <SEP> NRRL <SEP> 2387 <SEP> NRRI <SEP> 2388 <SEP> NRRL <SEP> 2389
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> L <SEP> (+) <SEP> arabinose <SEP> + <SEP> + <SEP> (S)
<SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> D <SEP> (+) <SEP> xylose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> D <SEP> (+) <SEP> rhamnose <SEP> '+ <SEP> + <SEP> +
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> D <SEP> (-) <SEP> fructose <SEP> + <SEP> (S,f <SEP> BSP) <SEP> + <SEP> (S,f <SEP> BSP) <SEP> + <SEP> (S, <SEP> BOP)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> D <SEP> (+) <SEP> galactose <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> D <SEP> (+) <SEP> glucose <SEP> +(S,f <SEP> BSP) <SEP> + <SEP> (S) <SEP> + <SEP> (S)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> D <SEP> (+) <SEP> mannose <SEP> + <SEP> (S,f <SEP> BSP) <SEP> +(se± <SEP> BSP) <SEP> + <SEP> (S, <SEP> f <SEP> BSP)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> cellobinose <SEP> +(S,f <SEP> BSP) <SEP> + <SEP> (S,f <SEP> BSP) <SEP> + <SEP> (S, <SEP> OSP)
' <SEP>
<tb>
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<tb>
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<tb>
<tb> D <SEP> (+) <SEP> lactose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> D <SEP> (+) <SEP> maltose <SEP> + <SEP> (S) <SEP> + <SEP> (S) <SEP> + <SEP> (S)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sucrose <SEP> =
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<tb>
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<tb>
<tb> D <SEP> (+) <SEP> raffinose <SEP> ' <SEP> - <SEP> +
<tb>
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<tb>
<tb> inuline- <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mannitol <SEP> + <SEP> (S) <SEP> + <SEP> (S) <SEP> + <SEP> (S)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> dulcitol- <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> D <SEP> (-) <SEP> sorbitol <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
EMI17.2
inositol .
(BOP) (BOP) + (BOP) saliciline BOP BOP dextriné0 + (S, f BSP) + ( S, f'SP) + (S, BSP ) amidon + (S, ! BSP) + (S, ! BSP) + ( S, BSP )
EMI17.3
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb> Citrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb> Formiate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> - <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> Malate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Salicylate <SEP> de
<tb>
<tb> sodium <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb> Succinate <SEP> de
<tb>
<tb> sodium <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb> ,
Tartrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> asparagine <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
<Desc/Clms Page number 18>
TABLEAU IV Utilisation des sources d'azote pour les cultures
EMI18.1
<tb> Substratum <SEP> NRRL <SEP> 2387 <SEP> NRRL <SEP> 2388 <SEP> NRRL <SEP> 2389
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d'ammonium <SEP> + <SEP> (S, <SEP> f <SEP> BSP) <SEP> + <SEP> (S, <SEP> f <SEP> BSP) <SEP> + <SEP> (S, <SEP> BOP)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> asparagine <SEP> + <SEP> (S, <SEP> f <SEP> BSP) <SEP> + <SEP> (S, <SEP> f <SEP> BSP) <SEP> + <SEP> (S, <SEP> f <SEP> BSP)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> + <SEP> (f <SEP> BSP).
<SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> TABLEAU <SEP> V
<tb>
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<tb>
<tb>
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<tb> Réduction <SEP> des <SEP> nitrates <SEP> en <SEP> nitrites
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> NRRL <SEP> 2387 <SEP> NRRL <SEP> 2388 <SEP> NRRL <SEP> 2389
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<tb>
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<tb> Source <SEP> de <SEP> Crois- <SEP> Essai <SEP> au <SEP> Crois- <SEP> Essai <SEP> au.Crois- <SEP> Essai <SEP> au
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<tb> carbone <SEP> sance <SEP> nitrite <SEP> sance <SEP> nitrite <SEP> sance <SEP> nitrite'
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<tb> Glycérine <SEP> C <SEP> + <SEP> C <SEP> + <SEP> C <SEP> +
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<tb> Glucose <SEP> C <SEP> - <SEP> C <SEP> trace <SEP> C <SEP> +,
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<tb> Sucrose <SEP> C <SEP> + <SEP> C <SEP> + <SEP> C <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Amidon <SEP> C <SEP> - <SEP> C <SEP> - <SEP> C <SEP> -
<tb>
Comme on l'a noté ci-avant, on peut cultiver les souches
NRRL 2387, NRRL 2388 et NRRL 2389 dans le milieu de culture pour obtenir des agents antibiotiques efficaces. Le milieu de culture peut être constitué par un milieu quelconque pris parmi un grand nombre, étant donné que, comme le montrent les essais d'utilisa- tion ci-avant, les organismes sont capables d'utiliser beaucoup de sources d'énergie. Cependant, pour réaliser une production écono- mique, un rendement maximum et l'isolement facile des antibiotiques, certains milieux de culture sont préférables. Ainsi, la source ac- tuellement préférée de l'hydrate de carbone dans le milieu de cul- ture est le glucose.
D'autres sources qu'on peut incorporer sont l'amidon, le sucrose, la dextrine, les mélasses et des produits analogues. Les sources préférées d'azote sont la liqueur de mais, la farine de soja et les liqueurs solubles de distillation, mais on peut aussi utiliser d'autres sources, y compris la caséine, des mélanges d'amino-acides, des peptones (aussi bien de viande -que de soja) et des produits analogues. On peut utiliser des sources
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d'azote du règne minéral,telles que les nitrates ou les sels'd'am- monium.
Les sels minéraux nutritifs à incorporer au milieu com- prennent les sels habituels capables de libérer des ions sodium, potassium, calcium et des ions phosphate, chlorure, sulfate, etc.
Comme pour la croissance et le développement d'autres microorganismes, il est nécessaire d'incorporer des traces d'élé- ments essentiels au milieu de culture pour produire la croissance de l'actinomycète utilisé conformément à l'invention. De telles traces d'éléments sont introduites habituellement sous forme d'im- puretés occasionnelles par suite de l'addition des autres consti- tuants du milieu. ,
On peut facilement cultiver les souches des organismes utilisés pour produire la marcomycine conforme à l'invention, et leurs conditions de croissance sont beaucoup moins critiques que pour beaucoup d'autres,actinomycètes. Ainsi, par exemple, cet or- ganisme peut se développer dans de nombreux milieux ayant un pH fortement différent.
Cependant, il est préférable de régler le pH du milieu de culture avant l'inoculation de l'organisme à une va- leur comprise entre 6,0 et 7,5 et, de préférence) égale à environ 6,5. Comme on l'a observé pour d'autres actinomycètes, le milieu devient graduellement alcalin pendant toute la durée de croissance de l'organisme servant à la production de l'antibiotique, et cette alcalinité peut atteindre un pH compris entre 7,2 et 8,0 environ ou davantage, le pH final étant fonction, au moins en partie, du. pH initial du milieu, des tampons présents dans ce milieu, et de la période de temps pendant laquelle on laisse croître l'organisme.
Comme on le préfère pour la production d'autres antibioti- ques en quantitésmassives, les conditions de culture, à l'état sub- mergé et aérobie, sont celles qu'on préfère pour la production de grandes quantités de marcomycine. Pour préparer des quantités
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limitées de l'antibiotique, on peut utiliser des flacons de se- couage et des cultures en surface dans des flacons. Pour la préparation de grande quantités de produit, il est désirable d'utiliser la culture aérobie submergée dans des bacs.
Il est bien connu que, lors de la production dans de grand bacs spé- ciaux, il est préférable d'utiliser la forme végétative des or- ganismes pour l'inoculation des bacs de production afin d'éviter une perte prononcée dans la production de l'antibiotique et, par conséquent, une utilisation inefficace de l'installation.
En conséquence, il est désirable de produire tout d'abord un vé inoculum/gétatif des organismes en inoculant une quantité rela- tivement faible du milieu de culture avec la forme sporulée des organismes et, quand on a obtenu un inoculum végétatif, frais et actif, de transférer cet inoculum végétatif aseptiquement dans les grands bacs. Le milieu dans lequel on produit l'inocu- lum végétatif peut être le même que celui qui est utilisé pour la production des antibiotiques ou être différent.
On peut obtenir une bonne croissance des organismes à des températures comprises entre environ 25 et environ 32 C La production optimum de l'antibiotique paraît se manifester quand on maintient le milieu de culture à environ 26-30 G.
Comme on le fait habituellement pour produire des anti- biotiques à l'aide de procédés de culture à l'état submergé, on insuffle de l'air stérile dans le milieu de culture. Pour la croissance efficace de l'organisme et pour la production de l'antibiotique, le volume d'air utilisé dans la production de la marcomycine dans des bacs dépasse de préférence 0,1 volume d'air par minute et par volume de milieu de culture. On ob- tient une croissance plus efficace et une meilleure production de l'antibiotique quand le volume de l'air utilisé se monte à au moins un volume par minute par volume de bouillon de culture.
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La vitesse de production de la marcomycine et la con- centration de l'antibiotique actif dans le milieu de culture peuvent être facilement suivies pendant la période de croissan- ce du microorganisme en soumettant à des essais des échantil- lons du milieu de culture en vue de)déterminer leur activité antibiotique vis-à-vis d'organismes connus pour être sensibles à l'antibiotique, par exemple le Bacillus subtilis. On peut exécuter l'essai biologique en utilisant les procédés normali- sés de mesure du trouble, ou les procédés sur une plaque dis- posée dans une coupe, ou encore l'essai au disque de papier sur une plaque d'agar-agar.
En général, on obtient une production maximum des anti- biotiques après inoculation du milieu de culture dans un délai d'environ deux à cinq jours, quand on utilise une culture aéro- bie submergée ou une culture dans un flacon de secouage, et dans un délai d'environ cinq à dix jours quand on utilise la culture en surface.
On peut récupérer la marcomycine à partir du milieu de culture et la séparer des autres substances qui peuvent être présentes, à l'aide de techniques d'extraction et d'adsorption.
Par suite de la solubilité très élevée de'la marcomycine en solution aqueuse et du rapport de distribution défavorable qui en résulte pour l'antibiotique dans des mélanges de solvants organiques et d'eau, il est nécessaire d'utiliser des volumes relativement importants de solvants organiques d'extraction.
En conséquence, il est désirable de saturer, avant l'extraction, le bouillon de culture filtré avec un sel minéral fortement soluble, par exemple du sulfate d'ammonium, pour réaliser un de distribution coefficient/plus favorable pour le solvant servant à l'extrac- tion.
Les substances antibiotiques qu'on extrait au sein du
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solvant organique, lequel est de préférence un alcool inférieur, tel que le propanol, le butanol, etc., peuvent être recueillies sous forme brute par évaporation sous vide du solvant. On pu- rifie ensuite le produit relativement brut ainsi obtenu à l'aide d'une précipitation à partir de solvants appropriés, par chro- - matographie ou par extraction à contre-courant.
On préfère utiliser actuellement les procédés d'adsorp- tion en vue de la récupération de la marcomycine parce que de tels procédés suppriment l'utilisation de volumes relativement importants de solvants qui sont nécessaires quand on utilise des techniques extractives. Actuellement, le carbone constitue la matière adsorbante préférée pour la séparation des antibioti- ques à partir du bouillon de culture filtré. On récupère la subs tance antibiotique fixée sur l'agent adsorbant au moyen des procédés d'élution habituels, en utilisant un solvant organi- ' que aqueux.
Pour récupérer la marcomycine, on utilise des résines échangeuses d'ions de caractère acide, par exemple un échangeur de cations constitué par un copolymère de l'acrylate de méthyle .et da divinyl benzène comportant des groupes hydroxyl fonction- nels, tels que le produit commercial connu sous la marque de fabrique "IRC-50". On pèut réaliser facilement la séparation de la marcomycine des autres antibiotiques, en utilisant des rési- nes échangeuses d'ions et en tirant profit de la nature basique de la marcomycine.
Ainsi, on peut soumettre des solutions conte-' nant des antibiotiques, y compris la marcomycine, à un traite- ment successif par des échangeurs d'ions acides et basiques, puis à l'élution de la marcomycine à partir des résines acideso
Les spécialistes comprendront aisément qu'on peut utiliser dif- férentes combinaisons des procédés et des modifications préci- tées pour isoler et purifier le nouvel antibiotique conforme à l'invention.
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On peut récupérer la marcomycine à partir des milieux de culture utilisés pour sa préparation, en mélange avec de l'hygromycine eous une forme plus ou moins purifiée, et on peut utiliser un tel mélange pour l'ajouter à l'alimentation des ani- maux ou pour des utilisations semblables et pour obtenir les intéressants . effets/des deux antibiotiques.
La mise en oeuvre de l'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs ci-après : EXEMPLE 1
On produit une culture sporulée du Streptomyces h ros- copicus, souche NRRL 2387, en faisant croître cet organisme sur un milieu d'agar-agar nutritif ayant la composition suivante-.-
EMI23.1
<tb> Amidon <SEP> - <SEP> 20
<tb>
<tb> Asparagine
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 3 <SEP> gr
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> 20 <SEP> gr
<tb>
<tb> Eau, <SEP> quantité <SEP> suffisante
<tb> pour <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
.Le
On inoculé le milieu avec des spores, et on/fait incu- ber pendant environ cinq jours à environ 26 C.
On recouvre la culture sporulée d'une faible quantité d'eau et on gratte douce- ment le support pour détacher les spores et pour obtenir une suspension aqueuse de ces spores.
On utilise la suspension ainsi obtenue des spores pro- venant de la souche NRRL 2387 pour inoculer 1500 cm3 d'un mi- lieu de culture végétative stérile ayant la composition suivante
EMI23.2
<tb> Glucose <SEP> 15 <SEP> gr
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 15 <SEP> gr
<tb>
<tb> Matières <SEP> solides <SEP> de <SEP> la
<tb> . <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> mais <SEP> 5 <SEP> gr
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> gr
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 2,5 <SEP> gr
<tb>
<tb> Eau, <SEP> quantité <SEP> suffisante
<tb> pour <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
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On fait croître le milieu ainsi inoculé, contenu dans un ballon de 6 litres, en le secouant constamment pendant 48 heures à une température de 2800 afin d'obtenir la forme végé- tative de l'organisme.
On utilise ensuite l'inoculum végétatif pour inoculer un milieu de culture productif stérile ayant la composition suivante (les pourcentages indiqués sont des pour- cents poids-volume) :
EMI24.1
<tb> Olucoe <SEP> 3,0%
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 2,5%
<tb>
<tb> Matières <SEP> solides <SEP> de <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,5%
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,2%
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,5%
<tb>
<tb> Eau, <SEP> quantité <SEP> suffisante
<tb> pour <SEP> 666 <SEP> litres
<tb>
On maintient le bouillon de culture inoculé, qui est contenu dans un appareil de fermentation de 946 litres, à une température d'environ 28 C et on l'agite pendant la période de fermentation,
puis on procède à une aération au moyen d'air stérile pris en ..Une quantité d'environ un volume par volume de bouillon de cul- ture par minute. On laisse la fermentation s'accomplir pendant environ 100 heures, temps pendant lequel le pH du bouillon de culture varie graduellement entr @iron 6,2 et 7,0. A la fin de la période de fermentation, on paut déterminer de la manière habituelle l'activité antibiotique de ce milieu. Un bouillon de fermentation ainsi obtenu contient environ 200 gr de maro- mycine (teneur qu'on peut déterminer à l'essai au disque de pa- pier en utilisant le B. subtilis comme organisme témoin).
On fait passer le bouillon de culture filtré, dans une colonne d'une dimension de 102 x 864 mm, qui contient une résine échangeuse de cations (lavée auparavant à l'aide de soude caustique pour lui donner un état sodique) formée par un copolymère d'acrylate de méthyle et de divinyl benzène, et comportant des groupes hydroxy
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fonctionnels, le passage se faisant à un débit d'environ 100 cm3 par minute. On cite comme exemple d'une résine échangeuse de cations appropriée de ce type, celle qu'on trouve dans le commerce sous la désignation "IRC-50" et qui est vendue par la Société "Röhm et Haas Company". Après avoir fait passer la to-' talité du bouillon à travers la colonne, on lave celle-ci avec de l'eau déionisée jusqu'à de que l'effluent soit sensiblement incolore.
On procède ensuite à l'élution de la colonne avec en- viron 55 litres d'acide chlorhydrique 0,1 N, moment auquell'ef- fluent est incolore'et le pH est d'environ 1,5. On règle le pH du produit d'élution acide à un taux de 6,9 en utilisant une solution aqueuse de soude caustique à 10%, et on le concentre' à faible volume. Le produit d'élution concentré est ensuite congelé et séché à l'état encore congelé. On reprend le résidu dans 29 litres d'eau déionisée et on le filtre. On élimine le précipité obtenu. On règle le pH du filtrat à 10,5, on ajoute environ 2,9 kg de charbon actif(marque "Norite SG") et on agite le mélange pendant environ une heure à la température ordinaire.
On retire ensuite le charbon à l'aide d'une filtration et on lave le gâteau de filtre en le remettant en suspension dans environ 14,5 litres d'eau déionisée tout en agitant pendant environ 30 minutes. On filtre la suspension et on répète encore une fois le lavage par mise en suspension. On rejette les filtrats. On procède à l'élution du gSteau de filtre, constitué par le charbon ' actif ayant adsorbé la marcomycine, en agitant celui-ci pendant environ une heure à la température ambiante dans environ 14,5 litre d'un mélange contenant 1,45 litre d'ammoniaque concentré, 4,35 litres d'eau et 8,7 litres d'acétone. Un retire le liquide d'élution à l'uide d'une filtration et on répète cette élution en utilisant le même mélange d'ammoniaque, d'acétone et d'eau.
On réunit les liqueurs d'élution et on les concentre par évapora-
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tion sous vide jusqu'à un volume d'environ 550 cm3. On ajoute au résidu concentré 3,5 litres d'acétone) tout en agitant. On obtient un précipité de produit gommeux, contenant la marcomyci- ne, lequel adhère aux parois et au fond du récipient. On décante le liquide surnageant de cette gomme et on dissout cette dernié- re dans une quantité minimum de méthanol absolu. On verse ensui-' te la solution méthanolique lentement dans 9 litres d'éther, tout en agitant, opération qui produit la précipitation de la marcomycine.
On décante la mélange méthanol-éther surnageant du précipité, puis on lave ce dernier trois fois avec de l'éther, en décantant l'éther du précipité après chaque lavage. On sèche le précipité par évaporation soue vide de l'éther adhérant. On obtient ainsi environ 144 gr de marcomycine ayant les propriétés mentionnées dans la présente description.
La marcomycine irrite la peau et on doit prendre des mesures de protection quand on la manipule à l'état de poudre sèche.
On peut préparer les sels d'addition avec des acides de la marcomycine en faisant réagir des, quantités équivalentes de marcomycine et l'acide choisi en solution dans un solvant inerte approprié. La précipitation du sel, suivie d'une filtra- tion et d'un séchage, donne le sel désiré sous forme solide.
On faite une solution d'environ 250 mg de marcomycine dans environ 3 cm3 de méthanol avec 0,3 cm3 d'acide sulfurique concentré. Il se forme immédiatement un précipité amorphe blanc, qu'on sépare à l'aide d'une filtration et qu'on lave avec une faible quantité d'éther. Le produit solide amoche est le sel d'addition avec l'acide sulfurique de la marcoimycine.
Le sulfate de marcomycine est une substance blanche et amorphe. Quand on le dissout dans des solutions aqueuses acides ou alcalines, et qu'on examine l'absorption de la lumière dans
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la région ultraviolette du spectre, on constate uniquement une absorption générale de faible intensité. Le tiage électrométri- que du sulfate de marcomycine en solution à 66% dans la diméthyl- formamide aqueuse indique des valeurs de pK # de 7,2 et 8,9, la valeur initiale du pH étant de 2,4. Le poids moléculaire calculé à partir des résultats du tirage est approximativement de 532.
Pour la préparation du dichlohydrate de marcomycine, on dissout 0,5 gr de marcomycine dans 20 cm3 de méthanol et on ajoute 0,3 cm3 d'acide chlorhydrique concentré à cette solution.
On chauffe le mélange jusqu'à ce qu'il soit homogène, puis on ajoute de l'éther jusqu'à ce que la précipitation commence. Lors d'un refroidissement ultérieur, le dichlorhydrate de marcomycine se sépare sous la forme d'un precipité blanc et amorphe. On re- cueille ce précipité au moyen d'une filtration, on le lave avec de l'éther et on le sèche. On peut effectuer une purification supplémentaire en redissolvant le sel dans une quantité minimum de métahnol chaud et en précipitant le produit au moyend'éther.
Le dichlorhydrate de marcomycine est une substance blanche, amorphe, qui est soluble dans l'eau, et qui fond avec décomposi- tion à environ 170-175 C.
A une solution contenant 4 gr de marcomycine dans 50 cm3 d'eau, on ajoute 'goutte à goutte une solution aqueuse saturée d'acide p-(p'hydroxyphénylazo)benzène sulfonique, jusqu'à ce que la précipitation soit achevée. On recueille à l'aide d'une filtra- tion le précipité cristallin résultant. Après recristallisation du produit dans une solution alcool-eau, le sel obtenu fond avec décomposition à environ 220-230 C. Le p-(p'-hydroxyphénylazo) benzène sulfonate de marcomycine ainsi préparé contient 2 moles d'acide p-(p'-hydroxyphénylazo) benzène sulfonique par mole de marcomycine.
Quand on traite des solutions aqueuses de marcomycine par des solutions d'acide phosphotungstique, par du méthyl-orange
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ou par du sel de Reinicke, il se forme des précipités qu'on peut utiliser pour récupérer la marcomycine à partir de cette solu- tion. On peut aussi récupérer l'antibiotique à partir des préci- pités du genre ci-avant en les traitant avec une quantité d'al- cali aqueux en excès afin de scinder le sel complexe ou le pro- duit d'addition, puis appliquer des procédés.d'extraction et de récupération similaires à ceux qui sont indiqués ci-avant.
EXEMPLE 2
On règle à 4,0 le pH de 37, 85 litres d'un bouillon de fermentation obtenu par le procédé de l'exemple 1, puis on les soumet à la centrifugation pour en retirer le mycélium. On règle ensuite à 8,0 le pH du liquide surnageant et on fait passer ce liquide dans une colonne de 102 mm x 457 mm, qui contient du charbon activé (marque commerciale "Norite SG"). Les substances antibiotiques présentes dans le bouillon de fermentation sont . ainsi absorbées sur le charbon. Après avoir fait passer la tota- lité du bouillon de fermentation à travers la colonne, on utilisa un mélange en parties égales d'acétone et d'acide chlorhydrique 0,02 N pour retirer les antibiotiques de la colonne.
Lorsque l'antibiotique actif est sensiblement éliminé, ce qui résulte de l'essai microbiologique du produit d'élution, on évapore de dernier à siccité sous vide, ce qui fournit un résidu constitué par de la marcomycine et conjointement par une certaine quantité d'autres substances antibiotiques telles que les organismes de la famille des Streptomyces. Ce mélange est approprié à l'in- corporation à la nourriture des animaux, afin d'obtenir des effets anthelmintiques.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.