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La présente invention'concerne de nouveaux procédés de prépa- ration de composés antiobiotiques et plus particulièrement des procé- dés pour préparer des agents antibiotiques élaborés par un microorga- nime non décrit jusqu'à maintenant.
La demanderesse a isolé de sols provenant des Indes Orientales et un microorganisme dont les caractéristiques morphologiques/de culture concordent avec la description du genre Streptomyces de l'ordre des Ac- tinomycètes, tel que décrit dans le manuel "Determinative Bacteriology"
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ae cergey \ sixième édition) page ce'38. Le nouveau microorganisme se rattache par sa morphologie au microscope, ses caractéristiques de culture et sa physiologie à certains des Cziisant par- tie des groupes S. ¯]'bus et S Fia vus., mais ne concorde avec la descrip- tion d'aucune espèce connue.
Le nouveau r'zcroor:.nisu,e a donc reçu jusqu'ici le nom de SreptoLC8S Oriental' :..On a découvert que plusieurs suuc-hes de l'or- ganisme, qui sont appelées S.Orientalis M l.J-05èib5, 1 w5-lk215 et H5-12C ,produisent les subsziG.:ces antiobiotiques de la présente invention, et ces souches ont été déposées dans la collection de cultures des tfHor'tf
Régional thern/Kesearch Laboratories" (Laboratoires de Recherches Régionaux
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du -,-lord) à Pearia,lllinoi--, où elles ont reçu respectivement les numé- ros de culture NRRL 2450, NERL 2451, et HRRL 2452, et ont été ajoutées à la collection permanente de microoranismes.
Le ciicroorganisme a été isolé d'un échantillon de sol rappor- té de Tengeng,Indonésie, le procédé d'isolement étant le suivant : a mis un échantillon du sol en suspension dans de l'eau distillée sté- rile, on a dilué fortement la suspension et on en a déposé un petit échantillon sur une plaque d'agar-agar nutritif. On soumet la plaque à l'incubation à environ 30 C pendant une semaine. On prélève les P.
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tites colonies discontinues et éparpillées de .Orientalis avec une ',spirale de platine et on les utilise pour inoculer par traînées obli- ques l'agar-agar en vue préparer de plus grandes quantités du micro- organisme .
Une des souches de ce microorganisme, obtenue comme indi-
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qué ci-dessus, a été appelée 3Orientalis,souche 1-143-05665, et on va décrire le procédé de préparation conforme à l'invention en se réfé- rant particulièrement à cette souche de l'organisme. Il est cependant bien entendu que les procédés de fermentation de la présente invention
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comprennent l'utilisation d'autres souches de S.4riantalis produisant des antibiotiques, de telles souches étant facilement produites et isolées-par les procédés d'isolement et de modification, de souche couramment utilisés,qui comprennent la s élection d'organismes culti-
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vés, et l'exposition des organismes à des e.gef.ts- modificateurs., tels
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que les rayons X, la lumière ultra-violette et des agents chmiques,
par exemple les produits nutritifs azotés.
La demanderesse a constaté que, quand on cultive le S.Orientalis sur un milieu nutritif artificiel .contenant.une/source d'azote, une source d'hydrate de carbone, et des sels minéraux appropriés du type reconnu comme étant nécessaire à la croissance des microorganismes et pour tamponner le minlieu nutritif, il se forme une nouvelle subs- tance antibiotique (dnomee ici "vancomycine") qui est caractérisée par son large spectre d'activité contre les organismes Gram-positifs.
En conséquence, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une substance antibiotique du groupe comprenant la van- comycine et ses sels d'addition avec un acide, cette vancomycine étant caractérisée comme suit : unesubstance amorphe blanche, soluble dans l'eau, insoluble dans la plupart des solvants organiques, stable en solution aqueuse à un pH compris entre environ 2,5 et 9, ayant un poids moléculaire compris entre environ 3.000 et 3.200, contenant en- viron 7,17% d'azote et dont une émulsion dans l'huile minérale possè- de un.spectre d'absorption maximum dans la région de l'infra-rouge aux longueurs d'onde suivantes, exprimées en microns:
3,10- 3,41- 6,05 - 6,30 - 6,72 - 6,84- 7,26 - 7,64 - 8,13- 8,50- 8,66 - 8,87- 9,42 - 9,76 - 10,10 - 10,34- et 11,24.
La présente invention concerne en outre un procédé, de prépara- tion d'un agent antibiotique, qui consiste à cultiver, dans des con- ditions aérobies, une souche de Streptomyces orientalis produisant de la vancomycine, dans un milieu de culture contenant des sources d'hydrate de carbone, d'azote et de sels minéraux assimilables, jus- qu'à ce que ces microorganismes produisent une activité antibioti- que notable dans ce' milieu de culture.
Le terme "milieu de culture nutritif artificiel", tel qu'il est utilisé ici, désigne un milieu de culture qu'on prépare en combinant des sources d'azote, d'hydrates de carbone, de sels minéraux et d'eau, par opposition aux strata se trouvant dans la nature.
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Des sources d'azote appropriées à la préparation d'un milieu
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¯e culture nutritif destiné à être utilisé dans le procédé de produc- tion de la nouvelle vancouycine antibiotique loux, r,z',¯sc.it é e. par la farine de soya, la caséine, la farine d'arachide, le corn steep liquor à 11 tat solide, le corn steep "-iquor à l'état liquide, les .r.ixio- acides, les produits solubles de distillerie, les pe:1j()ues. etc...
Des exemples d'hydrat de carbone qui des Lôurcus de car- bone utilisées par le Criantalis peur la c rcissauce du ruicroor&anis- me, piir1:.2.culièrer.:sl. t qand on les :. t,i l.:. e;Ç ::;.0.,::, '1., milieu {le culture e:0ser-lencé par traînée oblique sur 'é-:,--.:'-é<.'-:':,r -ont 3.a glucose, l'adoni- tol, l'arabinose, le xylose, le tréhalose, le r¯.ûtnitol, l'i-inositol le cellobiose, le lactose, etc... Les 3:S qu'on incorpore dans le milieu nutritif artificiel obtenu cGnfvrt.tr:.ent z la présente inven- tion sont les sels ninéraux orliliIi:d:::'us C01LUS dans la technique pour être nécessaires à la croissance des ricroor;aniszr:es et/ou au réglage de l'acidité du milieu, 1.::-=-1" exemple le chlorure de sodium, le nitrate de sodium, le sulfate d'.:ro¯riurrrs le carbonate da calcium, etc...
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Les minimes quantités des éKnents à l'état de "traces" nécessaires au tissu vivant sont fournies par les suis ci-dessus dans les quels cet
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éléments se trouvent à l'état d'iLlpur\8s.
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Le S.Orientalis est caractérisé par les nombreux essais physi- ques, morphologiques et de culture exposés ci-après. On utilise le
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système de Rid-:Yav,tColor Standards and ;.or;.0811cla'CureTt (1912) pour la dénomination de quelques-u:¯es des couleurs, et quand Oi- utilise ce
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système, la lettre initiale de la couleur est écrite en capitale. Il
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est bien entendu que la présente inventio-i ne concerne pas les pro- duits que peruet d'obtenir le procédé qui en fait l'objet en tant que produits pharmaceutiques et que toutes les propriétés, méthodes due-
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valuation et applications possibles ne sont mentionnées que pour met-
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tre mieux en lunière les résultats obtenus grâce au procédé ue prépa-
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ration objet de l'invention.
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.!'O.L.l}olo ic microscopique ;,p;#-,gar synthétique y;â-r-s. -ar de Czapek Modifié par Waksraan- 11>):i-:,ycelium substra-cal typique très ratifié, couché, et mycélium aérien droit à ra: ifications portant des chaînes droites ou irréguliè- rement ratifiées de conidios cylindriques ou ovoïdes mesurant 0,7-
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1,0 x z, - 1,- microns. Pas de chaîne conidiale en spirales distinc- tes. Conidies habituellement éparpillées après incubation de 14 jours.
Après vingt-huit jours, une souche présente des spores Modérément abondantes; ceux autres souches produisent très peu de spores.
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nP;ar-éJ.E:étr ,lucose spar7,Fine:"-orpiio -Io microscopique analogue à celle qui est observée sur l! 8.1?;ar-élgar synthétique. morphologie des colonies #gar-agar synthétique (quatorze jours à 30 C): Colonies de 6 t. mf.1 ce diamètre, en relief \;'1.<. léRërement convexes, avec une très min- ce enveloppe de mycélium aérien d'un blanc légèrement teinté. envers incolore.
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igar-é.J.,.u.r avec glucose asûru;:in.e ( quatorze jours à j0 C) :
Co- lonies de b à a mm de c.Ïé:.r;ietre, protubérance avec papille centrale asporogène ou peu sporulée . mycélium aérien poudreux d'un blanc légè- rement teinté. envers de couleur jaune crcme intense.
Caractéristiques de culture
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À/"ar -agar synthétique- : quantité liraitée à modérée de mycélium substratal, de couleur crèt'i8 pâle à l'envers. Trace de mycélium aérien blanc légèrement teinté. Pas de pi ment soluble. D'autres souches pro- duisent légèrement plus de mycélium aérien. Quand l'amidon remplace le sucrose comme source de carbone, toutes les souches présentent une bonne croissance végétative et aérienne, et toutes produisent une tur-
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bidité caractéristique dans l'agar-agar autour de. la bande d'ensemen- cement. La couleur du mycélium substatal, à l'envers, va du crème pâle au chamois crème ou brun intense.
La couleur du-mycélium aérien va or- dinairement d'un blanc légèrement teinté à une teine très légèrement grisâtre, et il se forme un pigment soluble dont la couleur va du brun jaunâtre pâle au brun clair.
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Glucose asparagine sur a.rar-aar: Crois sance modérée ou nette de r -ycélium substratal, de couleur crème devenant chamois ocré clair à l'envers. Quantité modérée de uycélium aérien poudreux de couleur crème pâle qui devient chamois ocré et pâle après une incubation de vingt-huit jours. Trace de pigment soluble jaune verdâtre pâle. D'au-
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tres souches apparaissent indentiques à la culture type sur le iuême milieu.
#b. rar-agar aoez amidon (i:faksr:1an (1 .:. page,, b2, milieu 15 avec ar..idon soluble) : Quantité modérée de mycélium su7ostratule dont l'en- vers est de couleur crème quand il est nouveau, et devient chamois crè-
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me ou brun Nerprun à - fin de l'observation. Quantité modérée de illy- célium aérien poudreux lisse, blanc dans les jeunes cultures, deve- nant de couleur crème pale et finalement légèrement grise pendant la maturation. Trace de pigment soluble de couleur jaune crème pâle dans les jeunes cultures, et se fonçant jusque au brun pâle après vingt- huit jours.Faible hydrolyse de l'amidon sur des plaques (1-3 mm du bord de la culture) au bout de 14 jours ; inchangée au bout de vingt- huit jours.
D'autres souches présentent de légères variations quant à la quantité et la couleur du Mycélium aérien et du pigment soluble formés. Différences qui paraissent être quantitatives. avec
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#agar-agar/glycérol-malate de calcium: Quantité modérée de L1y.:cé- lium substratal dont levers va de la couleur crtme pâle quand il est jeune à jaune crème intense au bout de vingt-huit jours. Quantité mo- dérée de mycélium aérien lisse poudreux, présentant une légère colora- tion blanche faiblement -teintée. Pas de pigment soluble. Croissance
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restreinte à la ligne dfinoculatio4. Balaie insoluble éclairci dans lragar-sgar autour de la culture.
:ar-aar nutritif de -.aksrnan: Quantité modérée de mycélium substratal, de couleur crème à l'envers. Trace de mycélium aérien blanc. Pas de piment soluble. Croissance restreinte à la ligne dino- culation.
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Agé!.r-a8r d'.1rerson: Abondant mycélium sub6ratal, dont l'en- brun- vers est de couleur/crème (proche du Jaune de Lars) devenant Brun Ner-
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prun, au bout de vingt-huit jours. Quantité modérée de mycélium aérien poudreux, blanc .légèrement teinté devenant Chamois pale à maturité.
Surface de croissance rugueuse et profondément fissurée; gouttelettes passagères d'exsudat clair près du bout de la souche en pente. Trace de pilent soluble brun pâle dont la quantité augmente progressivement
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avec l'avancement cs 1.tincubat:'OY1. La quotité de ..:ß'C t. : .7.1:'i,l aérien pro- duit par différente c souches varie 1:.. ;et :-lr,, rul1 des Jlre (;1iu:.1 étant moucheté de i.'.:luS C;..¯ s secteurs ayant une couleur oleu très )Gle. La quantité de â w ., ¯::x:t soluble brun varie aussi: uri x.i. ="Li'G'rt'i". brun verdâtre est forraé par une culture.
G.r:xan de ro::^e d c5 terre : quantité modérée de layctliura substrs-
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tal et aérien, restreint et avec une surface légèrement rugueuse (mais
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non ..¯1.'.:IL1L'Fe ) -<VC::.'t.iLilrt aérien blanc - Modification légère ou modérée
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de la coloration du tampon vers le orun.
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Gélatine : quantité r.:odirE> de culture El' surface :'..OC.C7..i..L,4.'JCl'Éi'G' ru- .'02';:r.li. pas de pellicule i1r<..&cto. .ycÉ-liunl aérien peu abondant,
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blanc. Croissance submergée peu abondante. Pas de pigment soluble. Vi-
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tesse de liquéfaction modérée j rien en sept jours, environ à moitié cot:.5léte (w5 - 35 rai) en quatorze jours, et complète e,itre- quatorze
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et dix-sept jours selon la souche.
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Bouillon l-'.8 culture synthétique (formule- nutritive el' af'.'2I.r-a;:r:.... synthétique): Croissance peu abondante d'une ellicule :C".aCGL1..E1'ItE: sans riyc aérien, :;o!::br.3J, ses colonies submergées- attachées aux parois du tube. Pas de pl.-mei..t soluble. ill::'-=-.'" 011 vis t'F'1OEill: P<..1..S de croissance.
3oui2.1ori de ¯.:..:t.CFSe 1..'t:i'?"? é.t..i : y:.i.;'f:e pellicule plissee, avec itlyC <, ..¯üt:= acricn blanc peu abondant, .. 1""" ", ".{-.r GiCiCE.r CiO Crü=.S SI1C e sub- nier.-'.ce ..,. ...vuse. Petite quantité r:.'S pi. ;-..ont ooluble brun en dessous de 1.- pellicule.
L-.i C.i: <:"Y.(;:-""50l 13O C)- : .20:r.0 c r',,:::':3:;,:r:CE: de toutes les sou- ches zouc ¯...¯ .., :t;::-. ;ro3= ;, r..:LC:L.:.C ;1¯is:;& airec uycélium aérien :;ri. terne-, r±-.?. de coa¯:on. :.'" ...,,'.n 1... (.J partielle en onze à quatorze
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jours et complète en quatorze à vingt-et-un jours suivant la race.
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Pil=.icnr, soluble très foncé cache la couleur tournesol après quatorze jours; mais avant c moment, la réaction neutre devient alcaline.. pi final (après vingt-huit jours, sur échantillon 1.10Y011): 7,tu à S, 00 - Pas de différences ;:.t,r-ju.aiite3 des souches.
Lait de tourna soi (J;.7 C)- :l:li:. les Ctltn;¯;tI::crit:i sont identiques à ceux se produisant 3'-00. p final : 7,-0.
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D'une manière nérale, un procéda préféré de production de
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vancor.ycine est le suivant: on inocule =:xe claque ci r agar-agar nutritif stérile avec des spores du r.1icroor",:ar.isn( J.:I''3.$iî'Gë....J¯S eu on fait in- cuber pendant plusieurs jours à environ 30 C pour obtenir G.8S spores
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en abondance. On récolte les spores et on les inocule sur un milieu
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nutritif liquide qu'on utilise pour préparer une seaence végétative d'inocula-,ion après fermentation. Le nilieu inoculé est ...tê dans des conditions aérobies pendant quarante-huit heures à environ 26'C, temps pendant lequel les spores se développent sous forme a'une semen-
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ce végétative.
On utilise la semence végétative ainsi obtenue pour inoculer un milieu de culture nutritif artificiel liquide en vue de
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la production de c;rande s quantités r illon fermenté contenant de
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la vancomycine.
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0àn le désire, or. peut omettre les t&SS de formation ae spo- res et de production de la forme végétative au niicroorganisme , et on peut inoculer uirecte..:ent le milieu de r3-¯,. ¯t:n avec les' spores. Un tel procédé est. )ricip8 :'c: !; -:; 2-c,nroorié à PrDr-lact4on de petites quantités de ¯'..tihioz.e.
Pour 1< roucion à grande échelle, on préfère l'inoc'iltion :nas,sÍ -r-=3 au :.\ -'; e :,'('0(, uC"ti:-J:l :-,u Koyen d'une secierxj T,it C- ü'.. :. sT2 , pour éviter le \'-".t-c?:nr.T, .c la croissance du micro et en CO-'15,;e¯¯C2 :.t . - :'..-3:: 7',j'Jj, de l'appa- re3..' â.¯-e ; é.¯ de échelle. arr s inoculation, on wiit- le '.li.L''L production liquide, dans des conditions aérobie-, 2. ;e ';',:-8r, re entre environ 15 et 37 C ;:êY'.t.:,..:-.t environ -in .:>i:.:
jours..-. la fin de la période d'incubation, r"l..i . . ¯.r.!'-i:. 1 .quelle on yïG...ti'ii une quantité substan-
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tielle d'antibiotique, on élimine le mycélium du bouillon fermente
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par tous noyens convenables, .tels qu'une filtration ou une cc:nLri,'ua scion, et on recueille alors les substances antibiotiques à partir du bouillon par des procédés appropriés, tels que, par exemple, des pro- cédés d'absorption utilisant des absorbants appropriés,par exemple du charbon, des résines échangeuses d'ions, etc ... Dans ce procédé, on
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utilise les complexes ce la varzcorycine avec des réactifs organiques ou ses sels, pour la récupération.
On peut réaliser la purification par extraction à contre-courant en utilisant des systèmes contenant un solvant organique, etc...
Les exemples suivants illustrent le procédé de préparation de la vancomycine.
Exemple 1,
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On prépare une plaque deagur-a,,ar contenant les produits sui- vants:
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<tb> amidon <SEP> 20 <SEP> gr
<tb>
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as-paragine 1 gr
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<tb> extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 3 <SEP> gr
<tb>
<tb> agar-agar <SEP> 20 <SEP> gr
<tb>
<tb> eau <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
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Dans la plaquer or. inocule des spores de Orientali8, souche ':1r3-05àô5,. et on la fait incuber pendant- environ 10 jours à 30 C.. On recouvre ensuite le milieu avec de l'eau distillée stérile et on le racle pour décoller les spores. La suspension de spores résultante
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est conservée pour une eutre utilisation au cours du procédé..
On prépare un silieu de culture nutritif liquide comme suit:
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<tb> glucose <SEP> 15 <SEP> gr
<tb>
<tb> farine <SEP> de-soya. <SEP> 15 <SEP> gr <SEP>
<tb>
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:::a:-;Í::;res solides de corn-steep I.i.ca.Gr' Su Chlorure de 50di.um si* carbonate G6:: calciua 2 :"...1:
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<tb> eau <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
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vil stérilise le milieu à 10 G pendant 30 minutes dans uu ±le.¯ cc ¯ ¯ rrié , et or: le refroidit. Dn utilise lu cm 2 d'unie suspension de spores préparée coeee indiqué ci-dessus pour inoculer le milieu.
On agite le nilieu inoculé pondant t.<:- heures à o Q avec un .itateur à nouvener-t alterna tir ayant une course de 5 cas, à llu tours par Mi- nute. en utilise le ..'.lieu de culture feri..=.nt'. contenant une SClliè11Ce végétative pour ens,..encer un T:Z3.C:.,t de culture nu&ritif coûtenant les produits suivants :
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i-.:
élassesde blackstrap 20 gr
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<tb> Peptone <SEP> de <SEP> soya <SEP> 5 <SEP> gr
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> gr
<tb>
<tb> Sucrose <SEP> 20 <SEP> gr
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 2,5 <SEP> r
<tb>
<tb> Eau <SEP> 1 <SEP> liure
<tb>
On place le milieu dans un récipient ayant un excès de capaci- té convenable de façon à assurer la présence d'oxygène en quantité
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suffisante, et on le stérilise par chauffage à 120 C pendant environ 30 minutes. quand il est froid, on inocule le milieu avec environ 25 cm3 de semence végétative décrite ci-dessus et on agitealors la cul-
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ture pendant environ o0 heures à 6 G.
Le pH du milieu est compris au commencement de la fermentation, entre environ ô,,5 et environ z0 et le pH final est d'environ 7,0 à environ 8,0. Un bouillon de fermenta-
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tion ainsi obtenu contient environ 1G racg de vancomycine par cet On prépare comte suit un milieu de culture adc,. snel pour 1. production de vanconycine à c.:>ra>Ae échelle. n mélange les produits suivants:
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<tb> amidon <SEP> 30 <SEP> parties
<tb>
<tb> mélasses <SEP> 20 <SEP> parties
<tb>
<tb> Peptone <SEP> de <SEP> soya <SEP> 7,5 <SEP> parties
<tb>
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Hvdrolysat et acide de protéine vébétale (qualité dite:n5ta.ino type ri., 3tleyn} ,5 parties 2À}x !OGO parties
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On ajuste le pH du milieu à environ 7-7.) et ou -pusve ensuite la solution à .rLl'liOC.ûv2 pendant 30 minutes sous une prussien de va- peur :':\:1J.viroll 1,05 :..
On prépare un autre nilieu de culture approprié à la mené pro- c:lctic ':::.: :¯:slç:Y:.,8.!l:. 1:.s c ..1'rJl:..,....W... s1:¯i V6.r:ts:
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Ariidon 30 parvins 7o.tz.ta d'huile .. soya hydrolyses 13 parties Produits de- f-:- -.,;tation solbics obtenus v,-v.rtir de la ..'retc'-ticn du als pc.r le ur- 2.C'3 -::) "j-c::tylicum pe-ries i'au 1000 parties
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On ajuste le milieu au pH 7,0-7,2 et on le fait passer à 1 au- toclave sous une pression de 1,05 à :::',200 kls pendant 30 minutes, avant u tz xi y et t 2. on Pour la production de V211cof.1ycine en utilisant les milieux de culture "turc indiqués ci-dessus, on place ces milieux dans des réservoirs munis é::. dispositifs pour l'introduction d'air sous pression, on les inocule avec une culture végétative du microorgéü1Ísme .LT'lGitc:l.S¯ et on les fait fermenter pendant;
environ L--6 jours à des températures comprises entre 3 et 33 , tout en agitant et en .introduisant envi- ion 0,4 volume d'air par volume de culture et par minute. ensuite, on
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élimine le mycélium du milieu de culture'et on traite le bouillon
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clair pour recueillir'la vancomycine, connue indiqué dans les exemples
EMI11.6
suivants.
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Exemple 2...
On prépare un bouillon ci' eU5er.,STIC8..:0 ,1J ayant la composition
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suivante:
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Glucose 6 vu gr Tryptone i,Cu r "Hstv..inbaet" (Ttio-cides produits ¯ CC'¯".' "1.?'awi.W e: Z-".-¯c ii;:Li' t.E 2Tït.Y' priire) ICC gr iiau 0 libres
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On place vin¯t libres du nilieu dans une cuve de fermentation
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de 40 litres de capacité et on les stérilise par chauffage avec de la vapeur sous pression à environ 120 C pendant environ 20 minutes.
Un
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refroidit le bouillon stérilisé et on l'ensemence asepti,lu-,r,,4olit avec des spores de S Grientalis, LRRL 24$0, obtenues par raclage alune cul- ture de cet organisme sur traînée oblique d f agar-agar, cornue décrit ci-dessus. L'organisée se développe dans le bouillon à environ 32 C pendant une période d'environ 24 heures. Pendant la période de crois-
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sance, on agite 3sboui..lon à environ 25 ovrs/rr:inutes et on l'aère avec de 1 T &ir stérile -. raison d'environ gaz volume d'air par volume de bouillon de culture et par minute. Après fermentation, on utilisée bouillon pour ensemencer le milieu de production décrit ci-dessous.
Dans une cuve de fermentation en fer de 1.325 litres, on pla ce un milieu ie fermentation, approprié à la production de vancomycine à grande échelle et ayant la composition suivante:
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<tb> Dextrine <SEP> blanche <SEP> 18,9 <SEP> kg
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 14,2 <SEP> kg
<tb>
<tb> Hydrolysol <SEP> acide <SEP> de <SEP> protéine <SEP> végétale
<tb>
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(qualité dite: n 3t.a-Kir.o type  3taleylt) 2 , - kg Peutone de viande ("Peptone de lîlson :
159",mouillée) li.,2 kg Produits solubles obtenus par fenieritation du aï:5 avec du 'Îiostridium acetobutylicum (Produits solubles fer#ntables ls-1) 1y,73 kg Agent anti-ïcousse siliconé("àTItifoam tif
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<tb> de <SEP> la <SEP> Dow-Corning: <SEP> à <SEP> la <SEP> demande
<tb>
<tb> Eau <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 945 <SEP> litres
<tb>
On rèle le pH du milieu de sulfure à un niveau d'environ 6,7
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à l'aide d TïiTdrQX3rde le sodium en >a''ßd aqueuse à ...(Ji'" et- on stéri- lise ensuite le ailieu de culture en :.e chauffant avec de la vapeur sous pression l environ 120 G pendant environ 20 minutes On refroi- dit ensuite 1$ bouillon, et on ajoute a3epti ..-ônt environ 16 litres d'une semence ÎE.'e:.l.#? obtenue sortie décrit 2i-dessus L'Ori;é1nisme se développe :
,ans le ri lieu pendant environ 6 .nF?Tp une températu- re a'environ *±# 3O01 C.GÎ.Sr rC r'w'.f de croissance, on aite le
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bouillon à environ 150 tours/minute et on y insuffle de l'air stérile dans le bouillon à raison de 340 litre s par : minute, ou d'environ 0,4 volume d'air par volume de bouillon et par Minute. De temps en temps, on ajoute à la demandé des quantités d'agent anti-mousse. A la fin de la période de croissance, un essai microbioloique du bouillon indique qu'il a un pouvoir antibiotique équivalant à environ 200 mcg de van- comycine active par cm3 de bouillon.
Le pH du bouillon après fermenta- tion est d'environ 7,8.On filtre le bouillon pour éliminer le mycé- lium,et on soumet le filtrat clair aux traitements décrits ci-après pour en retirer la vancomycine.
On règle le pH de 66 litres de filtrai. u bouillon de culture auniveau 7 av&c de l'acide chlorhydrique concentré et on les fait passer sur 2 litres d'une suspension aqueuse de "Permutit DR" (échan- geur d'ions décolorant vendu par la Permutit company,New York) à un pH de 6,5 contenus dans une colonne de verre de. 10 mm. On a'ramené au préalable la résine à la forme hydroxyle à partir de la forme de sulfa te en faisant passer à travers le lit de la colonne un volume de MaOH à 4% à la vitesse de 3cm3/cm2 de surface transversale et par minute.
On lave la résine pendant environ une heure avec de l'eau distillée à la vitesse d'environ 6 car par cm2 de surface transversale par minu- te. On lave ensuite la résine avec de l'eau distillée à la vitesse d'environ 0,5 cm3/cm2 de surface transversale et par minute jusqu'à ce que le pH de l'effluent tombe en dessous de 9.
On rejette l'effluent et on lave la contenant la substance antibiotique absorbée, avec 10 litres d'eau,. après quoi on rejette les lavages: à l'eau. On élue la substance antibiotique à partir de la résine avec 20 litres ci,,*un mélange comprenant 1 partie d'acide acétique glacial, 30 parties d'acétone et 69 parties d'eau. L'éluat, dont l'activité est égale à environ 85, de celle de l'antibiotique initial du bouillon, est con- centré sous vide à un volume de 15 litres pour éliminer l'acétone.
On ajuste la solution aqueuse au pH 7 avec une solution de HaOH et on l'agite pestant, 80 minutes avec 860 gr de charbon actif ("Norit SG"ven- du par la "American Norit Company" à dacksonville, Floride). On sépare
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le charbon par filtration sous vide sur du papier filtre Whatman N 4, en utilisant comme adjuvant de filtration un tampon de "Hyflo Super- Cel" (terre d'infusoires vendue par la "Johns-Manville Company"). On jette le filtrat et on lave le charbon avec 10 litres d'eau, puis on le filtre de nouveau. On jette l'eau de lavage.
On élue la substance antibiotique à partir du charbon avec trois portions de 10 litres cha- cune d'acétone aqueuse à 30% acidifiée au pH 2 avc de l'acide sulfu- rique concentré. Les @@uats mélangés, contenant environ 75% du pro- duit actif initial du bouillon, sont concentrés sous vide à un volume d'environ 10 litres et le concentrât est neutralisé au pH 7 avec une solution de soude caustique. La solution aqueuse neutralisée est de nouveau concentrée à environ 730 cm3 par évaporation sous vide, avec acidification progressive jusqu'à un pH d'environ 2,1 par addition diacide sulfurique. La substance antibiotique est précipitée de la so- lution acide par addition d'un volume égal d'une solution saturée d'a- cide picrique, suivie d'une réfrigération à environ 5 C pendant envi- ron 16 heures.
On centrifuge la suspension froide et on élimine le liquide surnageant. On lave le produit solide humide avec 500 cm3 d'eau glacée, on jette l'eau de lavage et on dissout le produit solide dans un mélange de 100 cm3 de méthanol et de 20 cm3 d'acide chlore-hydrique en solution aqueuse à 10%. On verse la solution acide dans 2 litres d'acétone, ce qui précipite un produit solide de couleur havane clair.
Après repos à basse température pendant environ'2 heures, on sépare la suspension par centrifugation et on rejette le liquide,surnageant.
On lave le produit solide restant avec 2,8 litres d'acétone et 200- tm3 d'éther diéthylique. On sépare les liquides de lavage ar décanta- tion et on sèche le produit solide pendant une nuit sous vide. Le chlorhydrate de vancomycine ainsi obtenu est une poudre amorpne de cou- leur havane blanchâtre qui pèse environ 10,88 gr et qui titre environ 900 mcg/mg.
Exemple 3.
On ajuste 16,25 litres de bouillon de culture filtré, obtenu par le procédé de l'exemple 2, au pH 8,5 avec de la soude caustique
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aqueuse à 10% et on les fait passer sur environ 6,5 litres d'une ré- sine échangeuse de cations("IRC-50", résine échangeuse de cations du type acide carboxylique vendue par la Société Rohm & Haas Coupany") se trouvant à l'état sodique à un pH d'environ 8,5. La résine a été préalablement régénérée à partir de l'état hydrogéné avec de la soude caustique aqueuse à 4, jusqu'à une valeur de pH supérieur à environ
8,5, et ensuite lavée avec de l'eau jusqu'à un pH de 8,5.
Après avoir fait circuler le bouille:, filtré sur la résine, on lave cette derniè- re avec de l'eau -jusqu'à ce que l'effluent devienne incolore. On élue le produit antibiotique actif absorbé sur la résine en faisant passer de l'acide sulfurique 0,1 N sur la résine, et on recueille l'effluent jusqu'à ce que son pH atteigne 2. (Dans ce procédé d'élution, on peut aussi utiliser une solution diluée d'hydroxyde d'ammonium, comme va- riante du procédé de séparation de l'agent antibiotique et de la ré- sine). On neutralise l'éluat en amenant son pH à 7 avec une solution aqueuse chaude d'hydroxyde de baryum, on sépare par filtration le sul- fate de baryum précipité et on concentre le filtrat à un volume d'en- viron 2,25 litres, par évaporation sous vide.
On agite ce résidu pen- dant environ 60 minutes avec 250 gr de charbon actif lavé à l'acide acétique ("Norit SG"). On filtre la suspension de charbon et on rejette le filtrat. On lave le gâteau avec deux litres d'eau, on rejette les lavages et en élue le produit antibiotique à partir du charbon avec trois portions de 3 litres d'éthanol à 50%, acidifié à un pH d'envi- ron 2 avec de l'acide chlorhydrique. Cn concentre sous vide les éluats mélangés jusqu'à un volume d'environ 20 car et on les traite avec un volume égal d'une solution saturée d'acide picrique. On sépare le pré- cipité de produit antibiotique résultant par centrifugation. On jette le liquide surnageant et on dissout le produit solide dans 20 cm3 de méthanol saturé d'acide chlorhydrique.
On ajoute environ 200 cm3 d'é- ther, après quoi il se forme un précipité formé de chlorhydrate de vancomycine à l'état brut. On recueille le produit précipité par filtra -tion. On jette le liquide surnageant, on dissout le résidu de chlor- hydrate brut dans du méthanol et en le reprécipite par addition d'acé-
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tone. Le chlorhydrate de vancomycine ainsi préparé est une poudre amorphe blanche pesant; environ 440 mg et ayant une activité antibioti- qued'environ 900 mc /mg.
Exemple 4.
On ajuste dix-neuf litres d'un filtrat de bouillon de culture, obtenu par le procédé de l'exemple 2, à un pH d'environ 7, avec de l'hydroxyde de sodium aqueux à 10%, et on filtre le nélane neutre.
On fait passer le filtr@t à travers une colonne contenant un lit d'une résine échangeuse d'ions ("Permutit DR") de 5 cm de diamètre et de 32 cm de haut, qui a été préalablement amenée à l'état hydroxylé con- formément au procédé décrit dans l'exemple 2. après avoir fait passer la totalité du filtrat sur la colonne, on lave la résine échangeuse d'ions avec de 1'eau jusqu'à ce que 1'affluent soit sensiblement inco- lore.
On élue à partir de la résine la substance antibiotique, qui est retenue dans la colonne, en utilisant 5 litres d'un mélange compre- riant 1 partie d'acide acétique glacial, 30 parties d'acétone et 69 parties d'eau. On concentre l'éluat à environ 800 cm3 par évaporation sous vide. On règle le résidu aqueux trouble résultant au pH 7,0 par addition d'hydroxyde de sodium aqueux à 10%, à la suite de quoi se forme une solution claire. A la solution neutralisée, on ajoute 2200 gr de charbon actif ("Korit SG"). Après avoir mélangé énergiquerient, on sépare le charbon par filtrait on et on lave vigoureusement avec de l'eau.
On rejette le filtrat et les lavages et on élue la vancomy- cine se trouvant sur le charbon avec 6 litres d'éthanol à 50% dont le pH a été préalablement ajusté à 2 avec de l'acide sulfurique. On con- centre l'éluat par évaporation sous vide à un volume d'environ 500 cm3, et on filtre le résidu. On règle le filtrat à un pH d'environ 3 par addition d'une solution chauoe a'hydroxyde de baryum aqueux, puis on concentre de nouveau jusqu'à un volume d'environ 80 cm3. A la solution concentrée, on ajoute 150 cm d'une solution aqueuse saturée d'acide picrique. Un précité de picrate de vancomycine se forme et on le sépa- re par centrifugation.
On rejette le liquide surnageant et on ajoute
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au résidu solide un mélange contenant 10 cm3 d'acide sulfurique 6 N dans 100 cm3 d'acétone aqueuse, à la suite de quoi le picrate de van- comycine est dissous et transformé en sulfate de vancomycine qui demeu- re en solution. A la solution aqueuse d'acétone, on ajoute 800 cm3 d'a-
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cétone, ce qui précipite le sulfate de vancornycine. On sépare le pré- cipité par îiltratï,;. , on le lave avec de l'acétone et on le sèche. Le sulfate de vancomyci." ainsi obtenu pèse environ 1,125 gr et e st une poudre amorphe et sel -élément blanche qui, à l'essai microbiologi- que, confient environ ,00 n.cg/rï;.
Exemple 5.
On dissout dans 13 litres d'eau 64 grammes d'une préparation brute de chlorhydrate de vanccmycine obtenue par le procédé de l'exem- ple 2, donnant à l'essai environ 820 mog/mg et contenant une quantité considérable de pigment brun. La solution est ajustée au pH d'environ 7,0 avec de l'hydroxvde de sodium solide, et devient trouble à mesure qu'elle est neutralisée. On acidifie la solution trouble à un pH d'en- viron 5,0 avec de l'acide chlorhydrique concentré, à la suite de quoi la solution devient claire.
On agite la solution acide claire pendant
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environ une heure avec 1420 gr de charbon actif ( "JMorit SG" ' , qui a été préalablement lavé successivement avec de l'acide acétique' et de l'eau et séché à l'étuve). On sépare le charbon par filtration et on le lave vigoureusement avec de l'eau. On élue le gâteau de charbon la- vé avec 3 portions successives d'éthanol à 50% ajusté à un 'pH d'environ 3 avec de l'acide chlorhydrique, le volume du premier éluat étant de 1/5 litres et celui des deux éluats suivants étant de 12,5 litres.
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dn concentre les éluats combinés à e¯<v:a. 3 crr, sous vide, le pH étant L.ain'G8nu à environ 3.
On verse la solution concentrée dans 4 li- tres <¯. 'acétone froide, après quoi un précipité blanc do sol de chlor- hydrate de vanconycine est formé On refroidit l'acétone contenant le précipité de chlorhydrate de va:c0..yci:::le pendant environ 2 jours et on filtre ensuite.On lave le A ce filtre ÇTac àe l'acétone et avec d ï l'éther et on le 0che sous vide per.dariO <:.viron ,2 heures. On ter-
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mine le séchage du produit solide en le laissant reposer pendant une nuit à la température ambiante. On obtient une quantité totale de 39 gr de chlorhydrate de vancoi.ycine amorphe blanc et l'on constate,
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par-essai microbiolonique, qu'il possède une activité antibiotique d'environ 9C0 mcg/mg.
Exemple 6.
On dissout un -tnirie de chlorhydrate de vancorivcine (préparé conformément au procé'-'"- de l'exemple 5) dans 20 cnu de méthanol aqueux à 75% et on a juste le pH de la solution à environ , par addition d'hy- droxyde de sodium aqueux dilué. Un précipité de vancomycine libre se forme et on le laisse reposer pendant environ 18 heures à 5 C. On sou- met la suspension blanche résultante à la centrifugation, on lave le produit solide avec des portions successives de méthanol et d'éther froids, et on le sèche sous vide.
Le vancomycine préparée pèse environ 815 mg et constitue une poudre amorphe, d'un blanc légèrement teinté, donnant à l'eusai 950 mcg/mg.
Le titrage électrométrique de la v ancomycine dans une solution
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de àiI1léhyl-formamide et d'eau (2:1 parties en volume);. dont le pH de départ est de 7,75, révèle la présence de groupes ionisables de pK'Ó à 5,2 - 6,1 - 7,5 - 9,3 - 10,1 et 11,5.
Exemple 7.
On prépare une solution contenant 43 gr de sulfate de vacomy-
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cine, donnant à l'essai environ 0CO mcgÍmg, dans un litre d'eau. La solution claire, qui a un pH ci 'environ 2,2, est ajusté à un pH d'envi-
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ron o,l par l'addition d'une résine échangeuse d'anions marque ("IR- 45") sous forme basique ou hydroxylée. Gn répare le liquide trouble surnageant par décantation et on lave la résine avec 500 cm3 d'eau.
On ajoute l'eau de lavage au liquide surnageant et on abaisse le pH de la solution à environ 1,6 par addition d'une résine échangeuse de
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cations marque (":-: - 45") sous l'orne acide, On sépare la résine du liu;:ide cl ¯r par filtration et on traite de nouveau le filtrat avec pane racine échét.,,:}se d'anions basique marque ("IR -45") jusqu'à ce
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que le pH soit d'environ 7,2. On décante de nouveau le liquide surna-
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#:ar.t, or- l'acidifie à un pH d'environ 1,8 avec de la résine Échan- [-;:,T..se de citions acice et on le filtre.
On net valise : >;:..t;e le fil- trat avec de la réside échangeuse d'unions b&6L;L:i;; au ph 7,0 on décan- te le liquide surnageant et on ::. f e.judte 2:. un ph ¯¯ 'ùI;V:..2'±1i..H: y avec de l'acide chlorhydrique v::: solution &(::I.i. v.6e à IL .. ',&. solution résul- tante, contenant du C!.... :hydrate de ve....:,ço...ycÍw::', (;tj concentrée sous pression réduite à ur. '¯urne d'environ 150 c nz, . ¯ or, ajoute la solu- ton concentrée à 2 litres d'acétone froide On aU t=ï:'t le mélange à une réfrigération pendant environ 4 jours, aprs quoi on sépare à l'aide d'une filtration le précipité blanc de chlorhydrate de vancomy- cine qui 'est formé et on le lave successivement avec des portions d'acétone et d'éther.
On soumet le produit solide humide à un sécha- ge sous pression réduite pendant 2 jours, et on le laisse ensuite re- poser à l'air pour achever le séchage. On obtient un rendement total
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de 39)4 gr de chlorhydrate de vancor:1ycine blanc amorphe qui, à l'essai microbiologique, contient environ 925 Iacg/mg..
A titre indicatif, l'action inhibitrice du chlorhydrate de van- comycine antibiotique contre des microorganismes représentatifs est mentionnée sur le tableau I. On détermine les activités antibactérien- nes par le procédé d'essai de dilution du bouillon. Dans ce procédé, les organismes à essayer sont cultivés dans un bouillon nutritif con-
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tenant diverses concentrations de vancomycine. Les concenti"b.1Jions in- diquées sur le tableau sont les concentrations minima de vancomycine, en mog/cm3de substrat, qui inhibent la croissance des organismes à essayer pendant des périodes d'incubation respectives de 24 et 48 heures, à 37 C.
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TABLEAU I
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<tb> Concentration <SEP> inhibitrice
<tb>
<tb> Organisme <SEP> à <SEP> essayer <SEP> mcg/cm3
<tb>
<tb>
<tb> 24 <SEP> heures <SEP> 48 <SEP> heures
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> brevis <SEP> 3,13 <SEP> 3,13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> 3,13 <SEP> 3,13
<tb>
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Bacillus licheni.cr..is 0,7 o78 Bacillus .eatler:¯ . gaz 0,2 Èacil1us polymyxa 0,39 0,39 Bacillus subtilis 0,9 0,9 Gorynebacterium diphteriae au 0178 1licrococcus pyogones var.aureus 0,7 oe78 wepyogenes var4aureus (résistant à lérythroniy-cine) 1,56 1,56 .Pvogenes var.aureus (résistant à la - ####pénicilline) o78 0278 1;
i'.p7ogenes var.aureus (résistant à la streptomycine) 1,56 1,56 1'l.PYOP,Ones var.aureus H , , iîycobacterium phlei 12,5 25
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<tb> Mycobacterium <SEP> smegmatis <SEP> 3,13
<tb>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 0,78 <SEP> 0,78
<tb>
<tb> Achromobacter <SEP> fischeri <SEP> >100 <SEP> >100
<tb>
<tb> Aerobacter <SEP> aerogene <SEP> >100 <SEP> 100
<tb>
<tb> Brucella <SEP> bronchiseptica <SEP> 100 <SEP> >100
<tb>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> ;
>100 <SEP> >100
<tb>
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Klebsiella pneumoniae 1GG /-2iQ0 Kycobacteriua avium 100 100
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<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> >100 <SEP> 100
<tb>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> >100 <SEP> >100
<tb>
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Shigella paradysenteriae .1GG >1E70
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<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> >100 <SEP> >100
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> carlsbergensis <SEP> >100 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> >100 <SEP> >100
<tb>
<tb>
<tb> Trichophyton <SEP> rubrum <SEP> >100 <SEP> >100
<tb>
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substances connues d'après le système de classification de
Waksman, mais la comparaison montre, que la vancomycine se dif- férencie nettement des autres antibiotiques.
Nétropsine : active contre les bactéries gram-néga- tives ettoxiques,sa toxicité étant aiguë (LD50), quand on l'in- jecte par voie i@@ aveineuse à une souris blanche;, de 17 mg/kg; chlorhydrate de @@@@comycine, 453,7 mg/kg.
Amicétine: extractible par un solvant et possédant une activité plus forte contre les mycobactéries que contre les bactéries gram-positives; la vancomycine n'est pas extractible par un solvant et est active contre les bactéries gram-positives.
Griséoflavine : soluble dans l'acétate d'éthyle; la vancomycine est 'insoluble dans l'acétate d'éthyle .
Sulfactine : soluble dans le chloroforme, la vancomy- cine est insoluble dans le chloroforme.
Vinacétine : soluble dans des solvants organiques, tels que le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle et l'acétone; la vancomycine est insoluble dans ces solvants.
Cinnamycine : inactive contre les bactéries gram- positives en forme de bâtonnets; la vancomycine est active con- tre ces bactéries.
Viomycine ; active principalement contre les mycobacw têries ; la vancomycine est active contre les bactéries gram- positives...¯
Nocardine : active contre le E.Coli; la vancomycine n'est pas active contre le E.Coli.
Erythromycine : soluble dans l'acétate d'éthyle; la vancomycine est insoluble dans l'acétate d'éthyle;
Carbomycine:soluble dans l'acétate d'éthyle; la vancomycine est insoluble dans l'acétate d'éthyle.
Micromonosporine: une protéine; la vancomycine n'est pas une protéine.
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Néonocardine : active contre le E.Coli; la vancomycine est inac- vive contre ce microorganisme.
Cariicine : soluble dans le butanol et accive contre les champignons et les bactériophages; la vancomycine est inso- luble dans le butanol et active contre les microorgamismes gram- positifs.
Proactinomycine : soluble dans l'acétate d'éthyle; la vancomyéine est insoluble dans l'acétate d'éthyle.
Picromycine : peut être extraite avec de l'éther; la vancomycine est insoluble dans l'éther.
Le dessin annexé représente des chromatogrammes sur papier obtenus en chromatographiant, avec différents systèmes de solvants, la vancomycine et d'autres agents antibiotiques représentatifs. Sur chacune des figures, la ligne de base du chromatogramme sur papier est indiquée pour chaque antibiotique par une courte ligne droite.
La figure 1 représente le chromatogramme obtenu quand de la vancomycine (VA) , de la viomycine (VI), de la streptothrici. ne (ST), de la cinnamycine (CI),de la néomycine (NE), de la dihydrostreptomycine (DI),de l'hydroxystreptomycine (HY),de la mannosidostreptomycine (MA) et de la caténuline(CA) sont déposées sur du papier filtre ahatman n 4 et sont développées avec un solvant aqueux comprenant 80% d'éthanol et 1,5% de chlorure de sodium, tamponné avec du sulfate de sodium 0,95 M et du sulfate acide de sodium monohydraté (0,05 M).
La figure 2 représente le chromatogramme obtenu quand on dépose les substances antibiotiques énumérées ci-avant sur un papier filtre Chatman n 1, et qu'on les développe avec un sol vant constitué par un mélange de 2 parties de n-Butanol, de 1 partie d'acide acétique et de 1 partie d'eau.