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PERFECTIONNEMENTS RELATIFS A DES COMPOSITIONS CHIMIQUES ET AUX PROCEDES
DE PREPARATION DE CES COMPOSITIONS.
La présente invention se rapporte aux procédés de préparation de composés nouveaux présentant des propriétés antibiotiques.
La présente invention vise un nouveau procédé d'obtention d'une composition antibiotique améliorée se composant d'érythromycine et de ses sels d'addition acides.
La présente invention vise également un procédé de préparation d'érythromycine qui consiste à cultiver une variété de Streptomyces erythreus produisant de l'érythromycine dans un bouillon de culture contenant des sour- ces assimilables d'hydrate de carbone, d'azote et de sels inorganiques jus- qu'à ce qu'une activité antibiotique appréciable soit- produite par cet orga- nisme dans le bouillon de culture, et à récupérer l'érythromycine provenant de ce bouillon de culture.
-En ce qui concerne la préparàtion des nouveaux composés objet de la présente invention, celle-ci à trait à la préparation d'une base azotée que l'on appelle arbitrairement "érythromycine" et des sels d'addition acides de cette base. Ces derniers comprennent un composé que, pour plus de commodité, on appellera ici "complexe d'érythromycine" un sel d'addition acide seccompo- sant d'érythromycine et d'un acide organique non identifié.
L'érythromycine et ses sels d'addition acides sont caractérisés par un spectre antibactérien étendu. Ils possèdent une activité antibiotique contre de nombreux microorganismes, qui prennent ou ne prennent pas le gram.
Une autre propriété antibiotique importante des composés est léur faculté d'inhiber la croissance et le développement de certains des corps du type Rickettsia et des grands virus, par exemple le typhus épidémique et la ménin- go-pneumonite, et d'inhiber efficacement la croissance et le développement de certains spirochèteso Les propriétés antibiotiques des composés ainsi que leurs faibles toxicités les rendent de grande utilité en tant qu'agents thérapeutiques dans le traitement de nombreuses maladies
L'activité antibiotique de l'érythromycine contre des organis-
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mes représentatifs est donnée dans le tableau Sa On a déterminé les'activi- tés antibiotiques soit par des essais connus aux Etats-Unis d'Amérique sous le nom de
"streak-dilution" et de"broth-dilution". Dans le premier essai, on étalait les organismes d'essais sur une série de plaques d'agar-agar con- tenant des concentrations variées de l'antibiotique pour déterminer la con- centration minimum en érythromycine en meg. (microgrammes) par cm3 de substrat qui inhibait la croissance pendant une période de 40 heures. Dans le der- nier essai, les organismes d'essai se sont développés dans un bouillon nutri-
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tif contenant des quantités variées d'érythrom,ycine.
La présence d'environ 10% de sérum de cheval dans le bouillon n'a pas d'effet notable sur l'acti- vité antibactérienne de l'antibiotiques Dans le tableau, les lettres (ag) et (bd) suivent la concen- tration inhibitrice correspondent aux procédés d'essai (respectivement essai par dilution dans l'agar-agar et essai par dilution dans un bouillon de cul- ture) que l'on a utilisés. Les sels d'érythromycine possèdent des activités antibiotiques correspondant aux valeurs données dans le tableau, en tenant compte des poids moléculaires accrus des sels.
TABLEAU I.
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<tb>
Organisme <SEP> d'essai <SEP> Concentration <SEP> inhibitrice
<tb>
<tb> ¯¯¯¯ <SEP> mcg/cm3
<tb>
EMI2.3
Microcoocus p-vogenes var. aureus 0, $ ( ag)
EMI2.4
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 0,4 <SEP> ( <SEP> ag) <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (résistant <SEP> à <SEP> la <SEP> pénicilline)
<tb>
EMI2.5
Microcossus pvpgenes var. avreus 0,8 (ag) Micrococcus 1 op:enes var* aureus 0,8 (ag)
EMI2.6
<tb> (résistant <SEP> à <SEP> la <SEP> streptomycine)
<tb>
EMI2.7
Listeria monogztogenes 0,31 (bd)
EMI2.8
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0,2 <SEP> (ag)
<tb> Vibrio <SEP> cholera <SEP> 0,63 <SEP> (bd)
<tb>
EMI2.9
Rvcobacterium sp.
(607) 6,2 (ag) Rvcrobacterium phlei 0,8 (ag) Hemophilus¯,pertussis. 0,31 (bd) Mycobacterium avium 1,6 (ag) Mvcobagteriwu smeronatis 6,2 ¯ (ag) Klebsiella pneumoniae 6,2 (ag)
EMI2.10
<tb> Brucella <SEP> melitensis <SEP> 1,56 <SEP> (bd)
<tb>
<tb> Brucella <SEP> suis <SEP> 1,56 <SEP> (bd)
<tb>
<tb> Neisseria <SEP> intracellularis <SEP> 5,0 <SEP> (bd)
<tb>
EMI2.11
Diploegoeus PDeumoniB.!3 0,02 (bd)
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<tb> (Variété <SEP> sensible <SEP> aux <SEP> sulfamides)
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0,02 <SEP> (bd)
<tb>
<tb> Hemophilus <SEP> influenzae, <SEP> 1,25 <SEP> (bd)
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0,16 <SEP> (bd)
<tb>
EMI2.13
02=ebacterium dip,hteriae 0,02 (bd)
EMI2.14
<tb> Vibrio <SEP> comma <SEP> 6,25 <SEP> (bd)
<tb>
En ce qui concerne les nouveaux procédés objet de la présen- te invention,
celle-ci englobe des procédés de fermentation comportant la
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croissance d'un actinomvcète dans un bouillon de culture contenant des sources assimilables d'hydrate de carbone, d'azote et de sels minéraux .
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L'actynomyoète utilisé dans les procédés de fermentation objet de la présente invention appartient au genre Streptomyces de l'ordre des Ac.tinvçetales,, conformément à la classification établie dans l'ouvrage f'Bergev's Manual'of Determinative Bacteriology" (6ème Edition), page 938.
Par ses caractéristiques morphologiques, l'organisme apparaît être étroite- ment apparenté à un actinomycète décrit par Waksman sous le nom d'"Actine-
EMI3.2
myes 16111 %Soil Science 8 71-214 (1919) 7 et qu'il a désigné plus tard sous le nom de Strelptg=ces e=threus-. Ainsi qu'on va l'exposer ci-a- près, il existe certaines différences entre les propriétés culturales de l'or- ganisme décrit par Waksman et celles du nouveau microorganisme isolé objet de la présente invention, de sorte qu'il existe un certain doute quant à l'i- dentification convenable du microorganisme isolé. Toutefois, la demanderesse a classé provisoirement le microorganisme isolé objet de la présente invention
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comme étant une variété de SttBptomyces erythreus et, en conséquence,a appelé l'organisme Stre]2t=c e s er vthreus, souche M5m12559.
On isole les microorganismes d'un échantillon de sol de l'Iloilo City, Iloilo, Iles Philippines; le procédé d'isolement étant le suivant : on met un échantillon du sol en suspension dans de l'eau distillée stérile, on dilue fortement la suspension et on dépose un petit échantillon sur de l'agar- agar nutritif. On laisse incuber la plaque à environ 30 C pendant une se- maine. On élimine les colonies minuscules, dures, éparpillées de Streptomy- ces erythreus, avec une boucle de platine et on les utilise pour inoculer des plaques d'agar-agar pour obtenir de plus grandes quantités de l'organisme.
On va décrire la présente invention en se référant en particu- lier à la variété précitée de l'organisme mentionné ci-dessus, mais il est bien entendu que les procédés de fermentation objet de la présente invention non seulement englobent l'utilisation de Streptomyces erythreus, souche M5-
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12559, mais également celle d'autres variétés de Streptornxces erythreus produisant de l'érythromycine, ces variétés étant facilement obtenues et iso- lées par des procédés couramment appliqués pour l'isolement et la modifica- tion des variétés, procédés qui comprennent la sélection des organismes cul- tivés et l'exposition des organismes à des agents modificateurs tels que les rayons X, la lumière ultraviolette et des agents chimiques, par exemple la moutarde azotée.
Des exemples, donnés à titre indicatif, d'autres variétés
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produisant -de l'érythromycine sont le Stre1:1tomyces erythreus, souches M5- i464k M5-14642 et M5-146430
On peut se procurer des échantillons de ces organismes aux La- boratoires de Recherches de la Société ELI LILLY and COMPANY, à Indianapolis, Indiana (Etats-Unis d'Amérique) .
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Le streDtonvces erythreus, souche M5-12559 est caractérisé par les nombreux essais physiques, culturaux et physiologiques exposés dans les paragraphes suivants. On utilise le système de Ridgway, Color Standards and Nomenclature (1912), pour la désignation de la plupart des couleurs et, lors- qu'on utilise ce système, la lettre initiale de la couleur est une majuscule.
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Lorsqu'il croît sur un bouillon d'agar-agar, le Streutoyces e- rythreus, souche M5-12559, forme un mycélium branchu dont les spores en série sont disposées en chaînes droites ou irrégulièrement enroulées mais, en général, ne sont pas disposées suivant une organisation distincte en spirale.
La croissance est typiquement lente, réduite et va de faibles quantités à des quantités modérées sur la plupart des milieux, l'abondance relative de croissance végétative et en série variant avec le milieu nutritif utilisé.
Sur un simple milieu d'agar-agar synthétique, le mycélium végé- tatif est rare et plato Le mycélium aérien est poudreux, blanc et est pré- sent en quantité modérée. Lorsque la culture mûrit, la partie aérienne de- vient d'une couleur rose pâle. Un pigment soluble roux-lie de vin se forme et fonce au fur et à mesure que la culture vieillit.
Lorsqu'on cultive l'organisme sur des milieux d'agar-agar con- tenant des sources complexes d'azote, le mycélium végétatif est relativement plus abondant que la partie aérienne. La croissance végétative est typique-
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ment élevée et a une tendance à pénétrer dans l'agar-agar. Dans de telles cultures, le mycélium aérien est en général épars et blanc. En plus du pig- ment soluble roux-lie de vin, il se produit un pigment brun sur de nombreux milieux complexes.
L'organisme est physiologiquement très actif. L'amidon et la gélatine sont facilement hydrolysés bien que la caséine dans des cultures au "lait de tournesol" ne soit pas attaquée. On utilise couramment la plupart des sources de carbone communes pour la croissance. Des températures d'en - viron 30 à 37 C paraissent être les meilleures pour la croissance et la sporulation.
MORPHOLOGIE MICROSCOPIQUE.
On donne ci-dessous la morphologie du streptomyces erythreus, souche M5-12559, une fois qu'il s'est développé sur -de l'agar-agar synthéti- que et de l'agar-agar contenant du malate de calcium : Agar-agar synthétique :
Il existe un mycélium aérien qui se ramifie d'une manière modé- rée avec des spores sur conidiophores en chapelets courts, rectilignes ou ir- régulièrement enroulés et courbés, mais rion du genre spirale typique. Les spores sont ovoides et leurs dimensions sont comprises entre environ 0,5 x 0,8 et environ 0,8 x 1,0 . La réaction de coloration au gram est posi- tive.
Agar-agar au malate de calcium.
La morphologie microscopique observée est la même que celle qu'on assure lorsqu'on cultive l'organisme sur de l'agar-agar synthétique, excepté que les chapelets de spores sont considérablement plus crochus et enroulés, mais non en spirales régulières.
CARACTERISTIQUES CULTURALES.
Les caractéristiques culturales de l'organisme dans un certain nombre de milieux courants sont données dans les paragraphes suivants : Agar-agar synthétique.
Développement végétatif modéré ; couleur crème et s'assom- brissant sous l'effet de la couleur intense du pigment soluble ; croissance réduite du mycélium aérien blanc qui assure un reflet pâle fauve lie de vin au fur et à mesure que la culture mûrit; sporulation modérée observée au mi- croscope ; production de pigment soluble plus prononcée que sur d'autres mi- lieux, ce pigment étant roux lie de vin dans les jeunes cultures et devenant brun lie de vin foncé ou presque noir après une longue incubation ; de 4-6 mm. de diamètre avec des centres surélevés et des bords plats, ondu- lés ; mycélium aérien mince, étalé, filamenteux.
Agar-agar au glucose et à l'asparagine.
Croissance végétative incolore, rare, avec croissance limitée de mycélium aérien de couleur blanche à cannelle rosée pâle formé seulement après longue incubation; sporulation éparse par observations microscopiques ; pigment soluble de couleur saumon ocré clair ; de 2 à 3 mmo de dia- mètre, irrégulièrement convexes avec bord complexe ou ondulé; surface lisse ou plissée, de texture poudreuse.
Agar-agar d'Emerson.
Bonne croissance végétative;envers couleur crème devenant brun camée après incubation de 14 jours et roux de foin après 28 jours ; ce en couche mince de mycélium aérien blanc; pigment soluble couleur noisette foncée ; colonies de 3 à 5 mm. de diamètre avec surface ridée et convolutée, centres surélevés ou affaissés et bords ondulés irréguliers; morphologie des colonies variables, certaines manquant de -mycélium aérien et d'autres étant recouvertes d'une croûte de spore poudreuse.
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Agar-agar au malate de calcium.
Croissance végétative incolore, rare, avec quantité modérée'de mycélium aérien de couleur cannelle rosée pale; sporulation modérée par ob-- servation microscopique ; soluble roux lie de vin se fongant jusqu'au brun armée après incubation prolongée ; colonies de 1 à 3 mm. de diamètre avec centres surélevés et bords filamenteux ; de spores de surface de tex- ture fine et poudreuse; hale microscopiquement granulaire de mycélium aérien très rare juste à l'extérieur de la' périphérie de la colonie.
Agar-agar au glucose.
Croissance végétative modérée ; couleur chamois olive fon- cé dèvenant brun de "Rood" fauce ; mycélium aérien blanc en quantité modérée; pigment soluble de couleur brun de "Rood" ressemblant à celui formé sur l'à- gar-agar d'Emerson, mais moins foncé; colonies de 2 à 4 mm. de diamètre, su- rélevées, irrégulièrement convolutées avec bord ondulé ; surface poudreuse.
Agar-agar nutritif.
Mycélium végétatif rare ; envers couleur chamois; mycélium aérien blanc en quantité modérée; pas de pigment soluble; colonies petites, réduites 2 à 3 mm. de diamètre, irrégulièrement convexes avec bord complet et surface poudreuse. Des colonies plus grandes ont souvent une dépression étoilée au centre.
Sur pomme de terre.
Mycélium végétatif abondant avec mycélium aérien abondant gris- beige et formation d'une partie supérieure presque noire fonçant progressi- vement pour devenir brun rougeâtre à la base.
Gélatine.
Croissance modérée de colonies blanches avec hydrolyse presque complète en 14 jours et complète en 20 jours à 25 Co, pigment soluble brun clair.
Bouillon au glucose.
Croissance de pellicule uniforme avec mycélium aérien modéré et blanc formé ultérieurement ; pigment soluble presque ocre rouge.
Bouillon nutritif.
Croissance médiocre, sous forme de quelques colonies éparses, certaines avec mycélium aérien blanc; faible quantité de sédiment perlé et aucun pigment soluble.
Bouillon à la tyrosine.
Croissance médiocre, floconneux ; submergé avec trace de mycélium de surface perlée et aucun pigment soluble.
CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES.
"Lait de tournesol"
Dans du "lait de tournesol" à 30 C, la croissance est médiocre et se produit sous forme d'anneau sur la paroi du tube. Il ne se produit aucune hydrolyse ou peptonisation, mais un lent développement d'une réaction alcaline (14jours).
A 37 Ci la croissance est similaire à celle qui a lieu à 30 C, mais la croissance et les changements sont moins prononcés.
Agar à l'amidon.
L'amidon est fortement hydrolyse.
Cellulose (bandes de papier filtre)
Il n'y a aucune croissance avec des ions d'ammonium ou des ions nitrate comme sources d'azote.
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Les essais suivants dans lesquels on utilise du carbone et de l'azote furent effectués conformément au procédé décrit par Pridham et Gottlieb; J. Bacteriology, 56, 107-114 (1948).
Utilisation de sources de carbone pour la croissance. a) Les substrats couramment utilisés comprennent les suivants :
1 (+) arabinose -d (+) raffinose amidon
1 (+) rhamnose inuline acétate de sodium d (-) fructose mannitol citrate de sodium d (+) galactose d (-) sorbitol malate de sodium d (-) glucose i (-) inositol succinate de sodium d (+) maltose dextrine asparagine sucrose b) Les substrats médiocrement utilisés comprennent : d (+) gylose et- salicine.
Il semble qu'on n'utilise que peu ou même pas du tout de d (+) lactose, de dulcitol, de formate de sodium ou de tartrate de sodium. a) Les substrats couramment utilisés comprennent : du sulfate d'ammonium et du nitrate d'ammonium. b) On n'utilise pas de nitrite de sodium.
Il est bien entendu que les essais ci-dessus pour l'utilisation de sources d'énergie sont effectués sous des conditions de croissance spécia- les et que le fait que l'actinomycète n'utilise pas certaines sources d'éner- gie dans des conditions d'essai n'interdit pas leur utilisation dans des conditions différentes.
Le tableau II mentionne certaines différences entre l'Actinomy-
EMI6.1
ces 161 décrit par Waksman et le StreDtomvces¯¯ethteus, douche M57-12559.
TABLEAU II.
EMI6.2
Milieu Souche M ï2 Act.nom ces 161
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<tb> Morphologie <SEP> Microscopique
<tb>
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> spores <SEP> modéré <SEP> Nombreuses <SEP> spirales <SEP> ouver-
<tb>
<tb> sur <SEP> conidiophores <SEP> en <SEP> tes
<tb>
<tb> chapelets <SEP> courts, <SEP> droits
<tb>
<tb> ou <SEP> irrégulièrement <SEP> cour-
<tb>
<tb> bés <SEP> et <SEP> enroulés, <SEP> non <SEP> en
<tb>
<tb> spirales <SEP> typiques <SEP> (14 <SEP> jours)
<tb>
<tb>
<tb> Caractéristiques <SEP> culturales
<tb>
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> Croissance <SEP> végétative <SEP> et <SEP> Croissance <SEP> végétative <SEP> éta-
<tb>
<tb> synthétique <SEP> aérienne <SEP> :
<SEP> modérée <SEP> à <SEP> bonne, <SEP> lée, <SEP> se <SEP> développant <SEP> pro-
<tb>
<tb> Mycelium <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> de- <SEP> fondement <SEP> dans <SEP> le <SEP> milieu.
<tb>
<tb> venant <SEP> partiellement <SEP> rosâ- <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> épais,
<tb>
<tb> tre <SEP> lors <SEP> de <SEP> la <SEP> maturation;
<SEP> plein, <SEP> blanc. <SEP> Pigment
<tb>
<tb> gammes <SEP> de <SEP> couleur <SEP> apparais- <SEP> soluble <SEP> Pourpre <SEP> grenat
<tb>
<tb> sant <SEP> depuis <SEP> fauve <SEP> lie <SEP> de <SEP> Pomme <SEP> tournant <SEP> plus <SEP> tard
<tb>
<tb> vin <SEP> Pale <SEP> jusqu'à <SEP> Saumon <SEP> à <SEP> Bordeaux. <SEP> Par <SEP> trans-
<tb>
<tb> Ocré <SEP> clair, <SEP> ferts <SEP> répétés, <SEP> le <SEP> pigment
<tb>
<tb> Pigment <SEP> soluble <SEP> Roux <SEP> lie <SEP> devient <SEP> couleur <SEP> lie <SEP> de <SEP> vin.
<tb>
<tb> de <SEP> vin <SEP> devenant <SEP> Brun <SEP> lie
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> vin <SEP> ou <SEP> presque <SEP> Noir
<tb>
<tb> après <SEP> longue <SEP> incubation.
<tb>
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<tb>
Gélatine <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> brun <SEP> rare. <SEP> Aucun <SEP> pigment <SEP> soluble.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Agar-agar <SEP> au <SEP> malate <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> Roux <SEP> lie <SEP> Aucun <SEP> pigment <SEP> soluble
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> calcium <SEP> de <SEP> vin <SEP> se <SEP> fonçant <SEP> jusqu'à
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Brun <SEP> Armée <SEP> après <SEP> longue
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> incubation.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
"Lait <SEP> de <SEP> tournesol" <SEP> Croissance <SEP> médiocre; <SEP> au- <SEP> Croissance <SEP> en <SEP> zones <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> cune <SEP> hydrolyse <SEP> ou <SEP> pepto- <SEP> surface <SEP> jaunâtré; <SEP> très
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> nisation. <SEP> Développement <SEP> lente <SEP> coagulation <SEP> (non
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lent <SEP> de <SEP> la <SEP> réaction <SEP> alca- <SEP> complète <SEP> en <SEP> 50 <SEP> jours).
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> line.
<tb>
On peut développer, comme noté ci-dessus, le Streptomyces eryth- reus, souche M5-12559, dans un milieu de culture pour obtenir un agent anti- biotique efficace. Le milieu de culture peut être n'importe lequel d'un certain nombre de milieux de culture car, ainsi qu'il ressort des essais d'u- tilisation décrits ci-dessus, l'organisme est susceptible d'utiliser de nom- breuses sources d'énergie. Toutefois, en vue de l'économie de la production, du rendement maximum d'antibiotique et de la facilité d'isolement de l'éryth- romycine, certains bouillons de.culture sont préférables. Ainsi, par exem- ple, les sources présentement préférées de l'hydrate de carboné présent dans le bouillon de culture sont m'amidon et le glucose.
On peut utiliser égale- ment d'autres sources telles que le sucrose, la dextrine, les mélasses, etc...
Les sources d'azote préférées sont le produit dénommé "corm steep liquor" (liqueur de trempage dans une eau'sulfureuse de grains de mais); la farine de soja et des produits de distillation solubles, mais d'autres sources uti- lisables comprennent la caséine, les mélanges amino acides, les peptones (à la fois de viande et de soja)etc. On peut également utiliser des sources d'azote inorganiques telles que des nitrates ou des sels d'ammonium.
Les sels inorganiques nutritifs qu'on incorpore dans le milieu- comprennent les sels habituels susceptibles de produire des ions, sodium, po- tassium, calcium, chlore phosphate, sulfate ; etc.
Il est nécessaire, pour la croissance et le développement d'au- tres micro-organismes, que des traces d'éléments essentiels soient' également présentes dans le bouillon de culture pour faire croître l'actinomycète uti- lisé dans la présente invention. De telles traces d'éléments se présentent sous forme d'impuretés provenant de l'addition d'autres constituants du mi- lieu de culture.
En vue d'obtenir la croissance et le développement maxima du Streptomyces erythreus, souche M5-12559, on doit ajuster le pH du milieu de culture avant inoculation de l'organisme entre 6,0 et 7,5, et, de préférence, on le règle à environ 6,5. On a observé que, pendant la période de croissan- ce de l'organisme et de production de l'antibiotique, le milieu devient pro- gressivement alcalin et son alcalinité peut atteindre un pH compris entre environ 7,2 et environ 8,5 ou davantage, le pH final dépendant, au moins en partie, du pH initial du milieu, des solutions tampons présentes dans le mi- lieu et du laps de temps pendant lequel on permet à l'organisme de croître.
Ainsi qu'on le préfère pour la production d'autres antibioti- ques en quantités massives, les conditions de culture aérobies en immersion constituent des conditions de choix pour la production de grandes quantités d'érythromycine. Pour la préparation de quantités limitées, on'peut uti',- liser un flacon agitateur et la culture en surface en bouteilles. En outre ainsi que cela est bien-connu, lorsque la croissance s'effectue dans de gran- des cuves, il est préférable d'utiliser la forme végétative de l'organisme pendant l'inoculation des cuves de production afin d'éviter un retard pro- noncé dans la production de l'antibiotique et l'utilisation inefficace résul- tante de l'équipement.
En conséquence, il est désirable, d'abord de produi- re un inoculum végétatif de l'organisme en inoculant une quantité relative- ment faible de milieu de culture avec l'organisme sous forme de spores et,
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après avoir obtenu un inoculum végétatif jeune et actif, de transférer asep- tiquement l'inoculum végétatif dans de grandes cuves. Le milieu-dans lequel on produit l'inoculum végétatif peut être le même milieu que celui utilisé pour la production de l'antibiotique ou un milieu différent.
Le streptomyces erythreus. souche M5-12559, se développe bien à des températures comprises entre environ 25 C et environ 37 Co La produc- tion antibiotique optimum semble se produire lorsqu'on maintient le bouillon de culture à environ 26-30 Co
Comme à l'accoutumée., lors de la production d'antibiotique par des procédés de culture en immersion, on injecte de l'air stérile dans le milieu de culture. Pour obtenir une croissance de l'organisme et une prodûc- tion efficaces de l'antibiotique, le volume d'air utilisé dans la production en cuve de l'érythromycine est, de préférence, supérieur à 0,1 volume d'air par minute et par volume de milieu de culture.
On assure une croissance et une production de l'antibiotique plus efficaces lorsque le volume d'air uti- lisé est au moins de 0,4 volume d'air par minute et par volume de bouillon de culture.
On peut facilement suivre l'importance de la production de l'an- tibiotique et la concentration de l'activité antibiotique dans le milieu de culture'pendant la période de croissance du microorganisme, par des échantil- lons d'essai du bouillon¯de culture en déterminant leur activité antibiotique sur des organismes connus pour être sensibles à l'antibiotique, par exemple, le Staphylococcus aureus et le Mycobactérium tuberculosis. Pour de telles déterminations, il est avantageux d'utiliser l'essai qui consiste à diluer en série des échantillons de culture, à ajouter des parties des échantillons de culture, à ajouter des parties des échantillons dilués à l'agar-agar nutri- tif en fusion, à faire solidifier l'agar-agar dans une boite de Petri; à i- noculer la plaque avec une jeune culture de S.aureus ou de M.
Tuberculosis et à déterminer quelle est la plus grande dilution du milieu de culture qui provoque la complète inhibition de la croissance de l'organisme sur l'agar- agar nutritif.
On peut également suivre la production de l'antibiotique par des processus d'essais turbidimétriques tels que ceux couramment utilisés lors de la production d'autres antibiotiques.
En général, le production maximum de l'antibiotique après ino- culation du bouillon de culture se produit en 2 à 5 jours environ lorsqu'on utilise une culture aérobie immergée et en 5 à 10 jours environ lorsqu'on utilise la culture en surface ou en flacons agitateurs.
Les composés antibiotiques objet de la présente invention peu- vent être récupérés du bouillon de culture par des techniques d'extraction ou d'adsorption. On préfère les premières pour la production industrielle étant donné qu'elles demandent moins de temps et sont moins coûteuses.
Pour l'extraction du composé antibiotique contenu dans le milieu de culture, on préfère'des solvants non miscibles à l'eau, polaires et organiques, tels que les alkyl esters d'acide gras; par exemple l'acétate d'éthyle et l'acé- tate d'amyle; les hydrocarbures chlorés, par exemple le chloroforme et lé bichlorure d'éthylène; des alcools avant une légère solubilité dans l'eau, par exemple le butanol et l'alcool amylique; des cétones présentant une légère solubilité dans l'eau,par exemple une méthyl amyl cétone et des éthers par exemple l'éther éthylique et l'éther dibutylique. On peut également uti- liser d'autres solvants de nature similaire.
Pour obtenir l'antibiotique sous sa forme brute, on peut évaporer jusqu'à siccité, de préférence, in vacuo, la matière antibiotique contenue dans l'extrait de solvant organique constitué par le bouillon du culture.
Dans une variante, on peut séparer la matière antibiotique du bouillon de culture en mettant le bouillon filtré en contact avec un agent absorbant.
On peut également utiliser efficacement des agents absorbants en vue de la purification par chromatographie d'adsorption en utilisant des absorbants
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tels que de l'alumine activée, du gel de silice, du silicate de magnésium et d'aluminium, etc.. On réalise facilement l'élution de l'antibiotique hors de l'adsorbant en utilisant un solvant organique polaire dans lequél le composé antibiotique est soluble. Le charbon activé n'est pas particuliè- rement bien indiqué pour être utilisé dans une colonne chromatographique étant donné que le charbon adsorbe fortement l'antibiotique de sorte que la matière adsorbée n'est éluée qu'avec difficulté.
Toutefois, on peut'utiliser avec succès le charbon activé pour adsorber directement l'antibiotique du bouillon de culture si le charbon est enduit préalablement d'un agent, par exemple de l'acide acétique dans le but de diminuer l'affinité de liaison du charbon pour l'antibiotique.
Lorsqu'on utilise un procédé d'extraction seul pour récupérer l'antibiotique, un procédé appropriée de récupération de l'antibiotique à' partir du solvant d'extraction comporte l'évaporation du solvant jusqu'à un volume relativement faible et la précipitation de l'antibiotique du solvant par l'addition d'un solvant miscible dans lequel l'antibiotique a une légère
EMI9.1
solubilité. Larmatière antibiotique qui précipite à l'état brut, mais solide, et parfois même sous la forme cristalline, est alors purifiée à nouveau par recristallisation à partir d'un ou de plusieurs solvants ou mélanges de ceux- ci. Des solvants appropriés pour la recristallisation sont l'acétone aqueux, le méthanol aqueux, etc.
EMI9.2
Une manière actuellement préférée pour isoler l'érythromyoine sous la forme de sa base consiste à rendre alcalin le bouillon de culture filtré jusqu'à un pH d'environ 9 à un pH d'environ 10, de préférence 9,5 et à extraire le bouillon ajusté avec un acétate d'alkyle, par exemple de l'acé- tate d'amyle. On extrait ensuite la base d'érythromycine qui se dissout
EMI9.3
dans l'acétate d-laiive dans de l'eau ajustée à un pH inférieur à 6,5, de pré- férence un pH d'environ 5. On réduit le volume de l'extrait aqueux, par exem- ple par évaporation in vacuo pour amorcer la précipitation et on le rend en-
EMI9.4
suite alcalin jusqu'à un pH d'environ 9,5 , après quoi la base-d'érvthromvei- ne se sépare sous la forme solide, habituellement cristalline.
On isole la base par filtration ou centrifugation et on la purifie par recristallisation.
EMI9.5
On peut obtenir les sels acides d'addition de l'érvthromYcine en traitant une solution aqueuse de base d'érythromyoine avec un équivalent d'un acide et en évaporant la solution sous vide jusqu'à siccité. Dans une variante, on peut traiter une base d'érzthronvcine en solution dans un sol- vant organique avec l'acide ou sa solution et on peut précipiter directement le sel d'érythromvcine à partir de la solution. Lorsqu'on prépare des sels d'addition acides d'acides forts, on doit prendre soin, pendant l'addition de l'acide à l'antibiotique, d'éviter'des concentrations locales élevées de
EMI9.6
l'acide étant donné que l'érythromycine est relativement instable dans des solutions de pH faible.
A titre d'exemples illustratifs des sels qu'on peut préparer, on peut citer le chlorhydrate, le sulfate, le citrate, le mandéla- te, l'oléate, le palmitate, le myristate, le stéarate et l'oxalate. On peut facilement préparer d'autres sels similaires grâce aux processus qu'on vient de mentionner. Pour l'utilisation thérapeutique, les sels choisis doivent évidemment être relativement non toxiques.
Quand le bouillon de culture est extrait ou traité avec un agent adsorbant ayant une alcalinité inférieure correspondant à un pH d'environ 9, le composé antibiotique isolé est généralement un complexe d'érythromycine.
Le complexe montre les propriétés antibiotiques caractéristiques de la base
EMI9.7
d' éryi;1ir omy cine , mais présente uns solubilité dans l'eau grandement réduite et, en général, une solubilité plus faible dans les solvants organiques.
On peut obtenir la base d'érythromycine à partir du complexe en dissolvant ou en mettant en suspension le complexe dans l'eau en réglant le pH du mé-
EMI9.8
lange aqueux à environ 9,8 pour séparer la base d'érythromvcine du complexe et en procédant à l'extraction du mélange alcalin avec un solvant organique.
On isole la base d'érythromycine qui passe de l'eau dans le solvant organi- que et on la purifie par recristallisation.
<Desc/Clms Page number 10>
La base qui est constituée par l'érythromycine possède les pro- priétés physiques et chimiques suivantes :
L'érythromycine cristallise en aiguilles blanches qui fondent avec ramollissement préalable à environ 136-1400C. sur un bloc Kôfler pour la micro-détermination du point de fusion. Elle est soluble à raison d'en- viron 2 mmg par cm3 d'eau et elle est très soluble dans l'alcool, l'acétone, le chloroforme,, l'acétonitrile et l'acétate d'éthyle. Elle est modérément soluble dans l'éther, le bichlorure d'éthylène et l'acétate d'amvle.
Un dosage potentiométrique dans une solution de diméthylforma- mide dans l'eau (en proportion de 2/1 en volume) révèle la présence d'un grou- pe susceptible d'être dosé de pK [alpha]' = 8,8.
Le poids moléculaire déterminé par les données du dosage semble être voisin de 725.
L'érythromycine cristallise à partir de l'acétone aqueuse sous forme d'aiguilles et de tiges courtes avant un allongement positif et une extinction parallèle. Des échantillons de cristaux séchés à la température ambiante sous vide sur du pentoxyde de phosphore montrent les indices de ré- fraction suivants dans la lumière monochromatique du sodium à 27 C. n1 = 1,452 n2 = 1,473
La rotation spécifique d'un échantillon séché à la température ambiante sous vide sur du pentoxyde phosphoré pendant 4 heures s'écrit comme suit : [[alpha]] 25=78 D c = 1.99% (poids volume) dans l'éthanol.
Une moyenne de plusieurs analyses élémentaires d'échantillons qui, avant analyse, ont été séchés à 60 C sous vide 'pendant 3 heures sur du pentoxvde de phosphore donne les valeurs suivantes :
EMI10.1
<tb> Carbone <SEP> 60,40 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb> Hydrogène <SEP> 9, <SEP> 26 <SEP> %
<tb>
<tb> Azote <SEP> 2,07 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb> Oxygène <SEP> 28,27 <SEP> % <SEP>
<tb> (par <SEP> différence)
<tb>
Un échantillon de matière dissous à une concentration d'environ 3,14% dans le chloroforme (poids volume) donne les bandes visibles suivantes dans un spectre infra-rouge sur la gamme de 2.4 à 12.0 :
2.82, 3.32, 5. 77, 5.91, 6.86, 7.13, 7.25, 7042, 7.78, 8.02, 8.54, 8.98, 9.16, 9.32, 9.49, 9.86, 10.23, 10.42, 1009, 11.17, 11055 et Il.9.
Un diagramme de diffraction aux rayons X du produit en poudre utilisant une radiation'de chrome non filtrée et une valeur de longueur d'on- de de 2.2896 A pour le calcul des espaces interplanaires donne les valeurs suivantes :
EMI10.2
<tb> "d" <SEP> (Espacement <SEP> interplanaire) <SEP> 1/11 <SEP> (Intensité <SEP> relative)
<tb>
<tb>
<tb> 14,5 <SEP> 0.63
<tb>
<tb> 13.3 <SEP> 1.00
<tb>
<tb>
<tb> 10.9 <SEP> 0.06
<tb>
<tb>
<tb> 9.9 <SEP> 0.38
<tb>
<tb>
<tb> 8.65 <SEP> 0.25
<tb>
<tb>
<tb> 7.70 <SEP> 0.38
<tb>
<tb>
<tb> 7.10 <SEP> 0.13
<tb>
<tb>
<tb> 6.65 <SEP> 0.13
<tb>
<tb>
<tb> 5.80 <SEP> 0025
<tb>
<tb>
<tb> 4.95 <SEP> 0.13
<tb>
<tb> 4.65 <SEP> 0.06
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
Le spectre d'absorption dans l'ultra-violet est caractérisé par un seul sommet large de faible intensité avant un maximum de 280 m pour un pH de 6,3,
# (l'extinction molaire) étant d'environ 50.
Quand on la recristallise dans l'éther de pétrole ou dans un mé- lange d'eau et d'acétone, l'érythromycine donne de fines aiguilles cristal- lisées suivant le système hexagonal.
Le chlorhydrate d'érythromycine possède les =propriétés physiques et chimiques suivantes :
Il cristallise dans des solvants aqueux sous forme d'aiguilles blanches qui fondent à environ 170-173 C sur un bloc Kôfler pour la micro- détermination du point de fusion. Il est très soluble dans l'eau et les al- cools inférieurs et il est légérement soluble dans l'acétate d'éthyle. Il n'est que très légèrement soluble dans des solvants tels que l'éther, l'acé- tate d'amyle, le chloroforme et des produits analogues'.
Une moyenne de plusieurs analyses élémentaires d'échantillons de chlorhydrate d'érythromycine qui, avant l'analyse, ont été séchés sous vide, à 78 C, pendant 3 heures, sur du pentoxyde de phosphore donne les valeurs suivantes :
EMI11.1
<tb> Carbone <SEP> 58,74 <SEP> %
<tb>
<tb> Hydrogène <SEP> 8,89 <SEP> %
<tb>
<tb> Azote <SEP> 1,89 <SEP> %
<tb>
<tb> Chlore <SEP> 4,58 <SEP> %
<tb>
<tb> Oxygène <SEP> (par <SEP> différence) <SEP> 25,90 <SEP> %
<tb>
Un échantillon de chlorhydrate d'érythromycine digéré dans l'é- ther de pétrole donne les bandes visibles suivantes dans un spectre infra- rouge sur une gamme de 2,4 à 12,0 : 2,94. 3, 38. 5,79. 5,88. 6,85. 7,26.
7,43.7,78. 7,88. 8,01. 8,55.9,03. 9,24. 9,46. 9,92. 10,47. Il,15. 11,5et 12,0.
On identifie le complexe de l'érythromycine au moyen des proprié- tés physiques et chimiques suivantes :
Le complexe se cristallise sous la forme d'aiguilles blanches qui fondent à environ 82-83, 5 C (non corrigés) mesurés à l'aide d'un appareil à point de fusion Fisher-Johns. Il est tout à fait soluble dans l'acétone, les alcools inférieurs; le chloroforme et le dichlorure d'acétylène, mais il n'est que légèrement soluble dans les cétones supérieures et dans les éthers.
Un dosage potentiométrique de la base dans une solution de di- méthylformamide dans l'eau (parties en volume : 2:1) révèle la présence de groupes ionisables de pkD[alpha] 7,6 et pkD[alpha]' 8,4.
Le poids moléculaire tel qu'il est déterminé par les données de cristallographie aux rayons X en utilisant un échantillon séché à l'air à la température ambiante sous vide sur du pentoxyde de-phosphore est d'en- viron 1130.
L'indice de rotation spécifique d'un échantillon séché sous vi- de à la température ambiante sur du pentoxyde de phosphore est le suivant : [[alpha]] 25 = -47 D c = 2 % (poids volume) dans l'éthanol.
Une moyenne de plusieurs analyses élémentaires d'échantillons de complexes d'érythromycine qui, avant l'analyse ont été sèches pendant 12 heures à la température ambiante sous vide sur du pentoxyde de phosphore don- ne les valeurs suivantes.:
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
<tb> Carbone <SEP> 64,71 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb> Hydrogène <SEP> 10,23 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb> Azote <SEP> 1,35 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb> Oxygène
<tb> (calculée <SEP> par <SEP> différence <SEP> 23,71 <SEP> %
<tb>
Un échantillon du complexe séché sous vide à la température am- biante et dissous à une concentration d'environ 5,53% dans le chloroforme .(poids-volume) donne les bandes visibles suivantes dans un spectre infra-rou- ge sur la gamme de 2,8 à 12,0 :
2,85. 3,40. 3,49. 5,79. 6,25. 6,86. 7,14.
7,26. 7.44. 7,80. 8,05. 8.54. 8,98. 9,21. 9,49. 9,88. 10,18. 10,43. Il,04.
11,16. 11,52 et 11,9.
Un diaphragme de diffraction aux rayons X du produit en poudre, en utilisant des radiations de chrome non filtré et une valeur de longueur- d'onde de 2,2896 A pour le calcul des espacements interplanaires, donne les valeurs suivantes :
EMI12.2
<tb> "d" <SEP> (Espacement <SEP> interplanaire) <SEP> I/II <SEP> (Intensité <SEP> relative)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 21,2 <SEP> 0,13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 19,0 <SEP> 1,00
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 16,7 <SEP> 0,03
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 15,3 <SEP> 0,13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Il,0 <SEP> 0,05
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10,4 <SEP> 0,13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10,1 <SEP> 0,13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9,53 <SEP> 0,11
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8,25 <SEP> 0,08
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7,86 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7,57 <SEP> 0,13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7,18 <SEP> 0,
13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6,92 <SEP> 0,13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6,56 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6,30 <SEP> 0,03
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6,20 <SEP> 0,21
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5,89 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5,65 <SEP> 0,05
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5,36 <SEP> 0,05
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5,17 <SEP> 0,11
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5,00 <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4,86 <SEP> 0,21
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4,74 <SEP> 0,05
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4,69 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4,52 <SEP> 0,05
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4,42 <SEP> 0,21
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4,28 <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4,11 <SEP> 0,08
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4,01 <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,87 <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,
77 <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,71 <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,58 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,45 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,28 <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,19 <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,la <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,73 <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,63 <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,59 <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,52 <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,49 <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,34 <SEP> tf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> z34 <SEP> (tf <SEP> signifie <SEP> très <SEP> faible)-tif
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
Le spectre d'absorption dans l'ultra-violet d'une solution dans l'éthanol du complexe montre un maximum à 274 m
1 %
E = 1,07
1 cm.
Quand on le recristallise dans l'éther de pétrole ou dans un mélange d'eau et d'acétone, le complexe donne des aiguillés fines cristalli- sées suivant le système hexagonal qui montrent une extinction parallèle et un allongement positif, l'allongement étant parallèle à l'axe c. A 25 C dans la lumière monochromatique du sodium, les indices de réfaction des cristaux sont les suivants : = 1,509 w = 1,499
Le signe de double réfraction est positif.
Des solutions ou suspensions aqueuses des composés antibiotiques de cette invention sont modérément stables à la température ambiante dans la gamme des pH compris entre environ 5,0 à 8,5. Pour un pH se trouvant en dehors de la gamme précitée, l'activité antibiotique cesse bientôt de se ma- nifester. Des solutions acides encore plus fortes amènent une perte rapide de l'activité antibiotique et des solutions plus basiques entraînent''une perte aussi sûre quoi que moins rapide. La stabilité maximum des solutions des com- posés antibiotiques est obtenue lorsque le pH des solutions se maintient en- tre 6 et 8.
L'érythromycine et ses sels contiennent généralement des quanti- tés d'eau quand on les cristallise dans des solvants contenant de l'eau et ils peuvent contenir des quantités d'alcools ou d'autres solvants similaires quand on les cristallise dans des solutions qui en contiennent. La quantité. d'eau ou d'autre solvant présente semble dépendre, au moins en partie, des conditions dans lesquelles la cristallisation se produit et du degré de sé-- chage auquel la matière est soumise et elle peut varier d'un faible pourcen- tage jusqu'à un pourcentage élevéo
On comprendra mieux l'invention à la lecture des exemples donnés ci-après à titre illustratif seulement.
EXEMPLE 1.
EMI13.1
Préparation de l' érr5jtthromycine :
On prépare un bouillon d'inoculum dont la composition est la suivante :
EMI13.2
<tb> Amidon <SEP> 14,500 <SEP> kg
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 14,500 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb> Matières'solides <SEP> provenant <SEP> du
<tb>
<tb> trempage <SEP> des <SEP> grains <SEP> de <SEP> mais <SEP> 4,500 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 4,500 <SEP> kg.
<tb>
<tb>
<tb>
Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 2,700 <SEP> kg.
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> 945 <SEP> litres
<tb>
On place le bouillon dans une cuve en fer d'une capacité de 1323 litres et on le stérilise par chauffage sous pression à une température d'en- viron 120 Ce pendant 30 minutes. On refroidit le bouillon stérilisé et on l'ensemence aseptiquement avec des spores de Streptomyces erythreus, souche M5-12559. L'organisme se développe dans le bouillon à environ 26 C. pendant 45 heures. Pendant la période de croissance, on agite le bouillon et on l'aère au moyen drair stérilisé à raison d'environ 0,5 volume d'air par volume de bouillon de culture et par minute.
Dans une cuve en fer de 6048 litres, on introduit un bouillon de fermentation avant la composition suivante :
<Desc/Clms Page number 14>
EMI14.1
<tb> Amidon <SEP> 69,300 <SEP> kg.
<tb>
<tb>
<tb>
Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 69,300 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Matières <SEP> solides <SEP> provenant <SEP> du
<tb>
<tb>
<tb> trempage <SEP> de <SEP> grains <SEP> de <SEP> mais <SEP> 23,100 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 15 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 23,100 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> 4.535 <SEP> litres
<tb>
On stérilise le bouillon de culture en le chauffant-sous pression à environ 120 C. pendant environ 30 minutes. On refroidit le bouillon et on ajoute de manière aseptique la culture d'inoculation ci-dessus. On laisse l'organisme se développer dans le bouillon pendant 4 jours à une température de 36 C.
Pendant la période de croissance, on agitele bouillon et on y in- jecte de l'air stérile à raison d'environ 0,5 volume d'air par volume de bouillon et par minute. A la fin de la période de croissance, le bouillon montre une activité antibiotique équivalent à environ 150 mcg. d'érythromyoi- ne par cm3 de bouillon. On règle le pH du bouillon de culture (environ un volume de 4160 litres) à 9,5 avec 40% de solution de soude caustique et on le filtre pour éliminer le mycelium, la filtration étant aidée au moyen de 3 % de "Hyflo Super-Cel" (un produit favorisant la filtration vendu par la Sté Johns Manville Company). On extrait le filtrat clair au moyen d'acétate d'amyle dans un récipient d'extraction de Podbielniak en utilisant 1 volume d'acétate d'amyle pour 6 volumes de bouillon clarifié.
On extrait à son tour l'extrait d'acétate d'amyle en discontinu avec de l'eau portée à un pH d'en- viron 5 par addition d'acide sulfurique. On procède à deux extractions, la première avec 1/2 volume et la seconde avec 1/4 volume d'eau portée à un pH de 5 avec de l'acide sulfurique. On combine les extraits aqueux et on ajus- te leur pH à 8,0 avec de la soude caustique en solution. On concentre la solution alcaline sous vide pour l'amener à un volume d'environ 113 litres, puis on ajoute le pH de la solution à 9,5 en ajoutant de la soude caustique aqueuse et on laisse reposer. L'érythromycine se sépare sous forme d'une matière cristalline. On sépare les cristaux par filtration, on ajuste le pH de la liqueur mère à 8 environ en ajoutant de l'acide sulfurique dilué et on concentre sous vide jusqu'à un volume d'environ 76 litres.
On règle . le pH de la solution à environ 9,5 et on laisse reposer, après quoi une quan- tité supplémentaire d'érythromycine se sépare sous la forme de cristaux.
La quantité totale d'érythromycine obtenue est d'environ 256 gr.
On purifie l'érythromycine par plusieurs recristallisations dans l'acétone aqueuse (mélange dans une proportion de 2 : 1).EXEMPLE 2.
Préparation du chlorhydrate d'érythromycineo
On met en suspension 1 gr. d'érythromycine dans 10 cm3 d'eau et on ajoute de l'acide chlorhydrique dilué pour amener le pH du mélange à 6,5. On concentre la solution aqueuse sous vide jusqu'à environ 1/10 de son volume initial et on la refroidit dans un réfrigérateur, après quoi le chlorhydrate d'érythromycine précipite sous forme cristalline. Le chlorhy- drate est purifié par recristallisation dans un mélange d'éthanol et d'éther.
EXEMPLE 3.
Préparation du complexe d'érythromycine.
On prépare un bouillon d'inoculum avant la composition ¯ suivante.:.
EMI14.2
<tb>
-Amidon <SEP> 13, <SEP> 600 <SEP> kg
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 13,600 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb> Matières <SEP> solides <SEP> provenant <SEP> du
<tb>
<tb> trempage <SEP> des <SEP> grains <SEP> de <SEP> mais <SEP> 4,500 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 4,500 <SEP> kg.
<tb>
<Desc/Clms Page number 15>
EMI15.1
<tb>
Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 2, <SEP> 700 <SEP> kg
<tb>
<tb> Eau <SEP> 945 <SEP> litres
<tb>
Le bouillon contenu dans une cuve en fer de 1323 litres de capa- cité' est stérilisé par chauffage sous pression à une température d'environ 120 C pendant 30 minutes. On refroidit le bouillon stérilisé et on l'inocu- le dans des conditions aseptiques des spores Streptomyces erythreus, souche M5-12559. L'organisme se développe dans le bouillon à environ 26 Ce pendant une période de 35 heures. Pendant la période de croissance, on agite le bouillon et on l'aère avec de l'air stérile en proportion d'environ un demi- volume de bouillon de culture par minute. A la fin de la période de crois- sance, on obtient une bonne croissance de l'organisme sous forme végétative.
Dans une cuve en fer de 6.048 litres, on place un milieu de fer- mentation ayant la composition suivante :
EMI15.2
<tb> Glucose <SEP> 113.250 <SEP> kg
<tb>
<tb> Amidon <SEP> 113.250 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 212,900 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb> Matières <SEP> solides <SEP> provenant <SEP> du
<tb>
<tb> trempage <SEP> des <SEP> grains <SEP> de <SEP> mais <SEP> 41,500 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb> Levure <SEP> de <SEP> bière <SEP> 22,650 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 9,060 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 22,650 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> cobalt <SEP> 0,112 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> 4.536 <SEP> litres
<tb>
Le bouillon de culture est stérilisé par chauffage sous pres- sion de la même manière que pour le bouillon d'inoculum..
On inocule ensuite dans des conditions aseptiques le bouillon de fermentation refroidi avec 472,50 litres du bouillon de culture d'inoculum végétatif décrit ci-dessus et l'organisme se développe dans le bouillon pendant 4 jours à une tempé- rature de 26 C. Pendant la période de croissance, on remue le mélange de croissance et on y fait passer de l'air stérile à raison de 0,5 volume d'air par volume de bouillon et par minute. A différents moments de 'la période de croissance, on détermine la quantité d'antibiotique contenue dans le bouillon de culture par le procédé de dilution dans l'agar-agar jusqu'à ce que, à la fin de la période de croissance de 4 jours, la quan- tité d'antibiotique contenue dans le bouillon atteigne une activité équi- valent à environ 250 mcg d'érythromycine par cm3 de bouillon.
Pendant la période de croissance, le pH du bouillon passe de sa valeur initiale de 6,2 à une valeur d'environ 8,0. On isole l'antibiotique du bouillon de culture sous forme de complexe d'érythromycine en procédant comme suit. :
On filtre le bouillon de culture sur une presse de Sperry de 36" à l'aide de 3% du produit "Hyflo-Super-Cel". On dégraisse le filtrat en l'extrayant avec environ 400 litres d'éther de pétrole. On ajuste le pH du filtrat d'extraction à environ 8,5 en ajoutant une solution de soude caus- tique et on l'extrait avec deux fois 1000 litres d'éthyl acétate. On combi- ne les extraits d'éthyl acétate et on les évapore sous vide, ce qui donne environ 661 gr. d'un solide brun foncé.
On triture la matière solide avec de l'éther de pétrole, ce qui permet d'obtenir-le complexe d'érvthromycine sous forme d'un solide couleur claire du tan. On'dissout le solide dans une quantité minimum d'éthanol et on ajoute de l'eau jusqu'à ce que la solution devienne trouble. On refroidit la solution trouble dans un réfrigérateur pendant environ 48 heures, ce qui permet d'obtenir le complexe sous forme de cristaux. On recristallise les cristaux bruts dans un mélange d'alcool et d'eau, comme on l'a décrit ci-dessus et on les recristallise deux fois dans l'acétone aqueux.
La matière afasi obtenue est un complexe d'érythromycine sen-
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siblement pur qui fond à 82-83 C environ.
EXEMPLE 4.
Préparation de complexe d'érythromycine en flacon agitateur.
On obtient une culture sporulée de Streptomyces erythreus, sou- che M5-12559 en faisant croître l'organisme sur une plaque d'agar-agâr nutri- tif, On récupère les spores sous forme d'une suspension aqueuse recouvrant la plaque avec une faible quantité d'eau et en raclant doucement les spores à la surface de la plaque.
On utilise environ 1 cm3 de la suspension de spores ainsi obte- nue pour inoculer dans des conditions stériles le milieu de culture stérili- sé suivant :
EMI16.1
<tb> Glucose <SEP> 1,5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 1,5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Matières <SEP> solides <SEP> provenant <SEP> du
<tb>
<tb>
<tb> trempage <SEP> des <SEP> grains <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,2 <SEP> gr. <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> 100 <SEP> cm3
<tb>
On laisse incuber le milieu de culture inoculé à environ 27 C. pendant environ 48 heures jusqu'à ce qu'on observe un bon développement végétatif. On divise le milieu de culture contenant le mycélium végétatif en 10 parties égales et on utilise cellee-ci pour inoculer dix fioles d'Er- lenmeyer de 1 litre, chacune de ces fioles contenant environ 200 cm3 de milieu de culture de fermentation stérilisé ayant la composition suivan- te :
EMI16.2
<tb> Amidon <SEP> 30 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 30 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
Matières <SEP> solides <SEP> provenant <SEP> du
<tb>
<tb> trempage <SEP> des <SEP> grains <SEP> de <SEP> mais <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 2 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> 2 <SEP> litres <SEP>
<tb>
On place les fioles. contenant les milieux de culture inoculés dans une chambre d'incubation maintenue à une température d'environ 28 C et on secoue pendant environ 80-90 heures sur un appareil de secouage ayant une course de 50 mm et fonctionnant à raison de 114 aller et retour par minute.
De temps en temps, on soumet à l'essai des échantillons du milieu de culture en vue de connaître leur degré d'activité antibiotique. Quand le degré d'activité antibiotique atteint une valeur d'environ 200 mcg/cm3 de bouillon, on réunit les bouillons des fioles agitées et on les filtre pour éliminer le mycélium.
On récupère du bouillon le produit présentant l'activité anti- biotique sous la forme d'un complexe d'érythromycine en extrayant la bouil- lon deux fois avec des volumes égaux de butanol et en évaporant le butanol jusqu'à siccité sous vide. On purifie le complexe solide d'érythromycine qui reste comme résidu par plusieurs recristallisations dans l'acétone aqueux.
EXEMPLE 5
Purification du complexe d'érythromycine par adsoption sur du charbon.
On traite 1 litre du bouillon de culture filtré obtenu par le procédé au flacon de l'exemple 4 avec 2 gr de "Norit SG" (charbon activé)
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traité par l'acide, prépare en agitant le charbon dans 5 fois son poids d'acide acétique à 5% pendant 15 minutes, on sépare le charbon par filtra- tion et on le lave avec 25 fois son poids d'eau (à sec). Le mélange bouil- lon-charbon est agité pendant environ 1/2 heure, on sépare le charbon pàr filtration et on lave avec 500 cm3 d'eau. On agite le charbon activé avec 500 cm3 de butanol pour éluer le complexe d'érythromycine. On filtre le mé- lange pour éliminer le charbon et on évapore de manière azéotropique jusqu'à siccité le filtrat de butanol qui contient le complexe.
On purifie le ré- sidu de complexe d'érythromycine en le recristallisant dans de l'éthanol a- queux.
EXEMPLE 6.
Purification du complexe d'érythromycine par chromatographie.
L'érythromycine brut tel qu'il est obtenu par extraction par l'a- cétate d'éthyle du bouillon de culture (de l'exemple 3) est dissous dans le benzène à raison d'environ 200 mg de complexe brut pour 5 cm3 de benzène.
On fait passer la solution de benzène sur une colonne de gel de silice, d'une dimension de 19,04 mm x 279 mm. On lave la colonne avec un mélange de 15 % de méthanol dans le benzène pour enlever une matière inac- tive de couleur brune. On élue le complexe de la colonne par un lavage au méthanol. On évapore l'éluat de méthanol jusqu'à siccité sous vide et on purifie le résidu du complexe d'érythromycine dont la pureté est supérieure à 90% par recristallisation dans l'acétone aqueux.
EXEMPLE 7.
Préparation de l'érythromycine dans des flacons agitateurs.
Un bouillon de culture présentant une activité antibiotique est obtenu conformément au procédé décrit dans l'exemple 4. Le produit présentant l'activité antibiotique du bouillon de culture est récupéré du bouillon sous forme d'érythromycine de la manière suivante :
On alcalinise le bouillon en l'amenant à un pH d'environ 9,8 en ajoutant de la soude caustique et on procède à l'extraction avec 2 parties de 1/4 de volume d'acétate d'éthyle. Les extraits d'acétate d'éthyle combinés qui contiennent l'érythromycine sont extraits avec deux parties en volume égal d'eau acidifiée avec de l'acide sulfurique de manière à porter son pH à environ 5,0. On combine les extraits aqueux et on règle le pH à environ 7,0 avec de la soude caustique aqueuse.
On réduit la solution neutralisée à environ 1/10 de son volume initial jusqu'au point de démarrage de la pré- cipitation. On amène le pH du mélange aqueux à environ 9,5 avec une solution de soude caustique et on laisse reposer au froid pendant plusieurs heures.
On sépare par filtration l'érythromycine qui décante et on la recristallise dans l'éthanol aqueux.
EXEMPLE 8.
Purification de l'érythromycine par le procédé chromatographique.
On ajuste à 9,5 le pH d'une solution aqueuse (contenant de l'é- . rythromycine telle que celle obtenue conformément au procédé de l'exemple 1, en extrayant le bouillon de culture filtré avec de l'acétate d'amyle et l'ex- trait d'acétate d'amyle avec de l'eau) avec de l'alcali aqueux et on l'extrait avec du benzène.
Une partie aliquote de 100 cm3 de l'extrait de benzène ayant une-activité antibiotique équivalent à 10 mg d'érythromycine par cm3 de ben- 3ène passe sur une colonne de silicate d'aluminium et de magnésium ("Florisel") de 25 mm de diamètre et de 304 mm de long. On lave la colonne avec 5% de méthanol dans me benzène pour éliminer une bande brune apparaissant dans la colonne, et jusqu'à ce que l'éluat devienne sensiblement incolore. On éli- mine l'antibiotique absorbé dans la colonne par élution avec du méthanol à 5% dans le benzène. On évapore l'éluat à siccité sous vide et on recristal- lise le résidu d'érythromycine dans l'acétone aqueux.
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EXEMPLE 9.
Préparation de l'érythromycine à partir du complexe d'érythro- mycine.
On met en suspension 1 gr de complexe d'érythromycine dans 100 cm3 d'eau et on ajuste le pH de la suspension à environ 6,3 en ajoutant de' l'acide chlorhydrique dilué. On extrait le mélange aqueux avec du chlorofor- me dilué et on ajuste le pH de la solution extraite à environ 9,8 avec de la soude caustique aqueuse. On extrait la solution alcaline deux fois avec des parties égales en volume d'acétate d'amyle, on combine les extraits d'a- cétàte d'amyle et on évapore à siccité sous vide. On recristallise le rési- du de l'érythromycine basique dans l'éthanol aqueux.
EXEMPLE 10.
Préparation du chlorhydrate d'érythromycine.
On ajuste à 9,5 le pH 600 cm3 d'une solution aqueuse d'un anti- biotique telle que celle décrite dans 1''exemple 6 et ayant une activité an- tibiotique équivalent à environ 525 mcg d'érythromycine par cm3 de solution, à l'aide d'une solution aqueuse de soude caustique, et on extrait avec 15 cm3 d'acétate d'amyle, ce qui permet d'obtenir une solution avant uné activité antibiotique équivalent à 14,8 mg l'érythromycine par cm3 de solution. On ajoute à l'extrait d'acétate d'amyle, 0,1 cm3 d'éthanol contenant 0,0087 cm3 d'acide chlorhydrique aqueux concentré. On refroidit le mélange dans le ré- frigérateur pendant plusieurs heures, après quoi le chlorhydrate d'érythro- mycine se sépare sous forme de cristaux sensiblement purs.
REVENDICATIONS.
1. Procédé de préparation de l'érythromycine et'de ses sels d'addition acides,consistant à cultiver une souche de Streptomyces ervthreus produisant de l'érythromycine, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables d'hydrate de carbone, d'azote et de sels inorganiques, jusqu'à ce qu'on obtienne une activité antibiotique sensible dans cet orga- nisme, dans ce milieu de culture; à récupérer ensuite l'érythromycine à par- tir du milieu de culture et, si on le désirée à faire réagir l'érythromycine avec un acide approprié pour former le sel d'addition correspondant.