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La présente invention se rapporte un nouvel agent antibiotique, dénommé actinoboline, et à des procédés pour le produire.
La présente invention comprend l'actinoboline elle-même et ses sels acides et basiques, tent sous la forme pure que sous la forme de concentrés bruts.
L'actinoboline est une substance blanche, stable et très soluble dans l'eau et modérément soluble dans les alcools aliphati- ques inférieurs comme le mthanol. Elle est optiquement active, ayant une rotation spécifique [[alpha]]D28 de +59 à une concentration de 0,5 dans un tampon de phosphates de pH 7. L'analyse élémentaire de l'actinoboline indique qu'elle contient environ 50,22% de carbone, 6,88% d'hydrogène, 9,17% d'azote et, par différence, 33,73% d'oxygène.
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L'actinoboline donne un essai positif à la ninhydrine et forme une coloration rouge profond avec le chlorure ferrique.
L'actinoboline réduit également les solutions de cuivre.
L'actinoboline est caractérisée par des spectres d'absorption de l'ultraviolet et de l'infrarouge uniques.en leur genre.
Le spectre d.'absorption de l'ultraviolet de l'actinoboline dans un tampon de phosphates de pH 7 est caractérise par un maximum à une longueur d'onde de 263 millimicrons; dans de l'acide chlorhydrique 0,1 N,, de 262 millimicrons, et dans une solution d'hydroxyde de sodium 0,1 N, de 288 millimicrons .
Le spectre d'absorption de l'infrarouge de l'actinoboline est caractérisé par des maxima aux longaurs d'onde de 2,90, 3,20, 3,30, 3,36, 6,04, 6,27,6,85, 7,09, 7,86, 8,10, 8,39, 8,77, 8,95, 9,28, 9,45, 9,93, 11,42, 11,74 et 13,08'microns.
L'actinoboline est de caractère amphotère étant donné' qu'elle forme des sels avec divers acides et bases. Les sels acides et basi- ques de l'actinoboline peuvent être préparés en traitant le composé amphotère par approximativement un équivalent de l'acide ou de la base choisi. Ceci peut se faire en solution aqueuse ou dans un solvant approprié. Inversement, un sel particulier de l'actinoboline peut être transformé en actinoboline sous forme de la base libre ou en un sel de la base libre, différent, par des procédés connus.
L'un des sels mentionnés, l'acétate d'actinoboline, est une' substance blanche cristalline, stable, très soluble dans l'eau, . moins soluble dans l'éthanol absolu chaud, et très peu dans l'étha- nol absolu froid. Il est optiquement actif, ayant une rotation spé- cifiçue de [[alpha]]D26 de + 58 à une concentration de 0,5% dans l'eau.
L'analyse élémentaire de 1'acétate d'actinoboline indiaue qu'il contient environ 49,60% de carbone; 7,05% d'hydrogène, 7,86% d'azoté, et par différence, 35,49% d'oxygène. L'acétate d'actinoboline donne un essai positif à. la ninhydrine et forme une coloration rouge profond avec le chlorure ferrique. L'acétate d'actinoboline possède des spectres uniques d'absorption de l'infrarouge et de l'ultraviolet.
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Le 810ctre infrarouge de l'acétate d'actinoboline est carsct(ris( pf'r d io maxim.a aux longueurs d'onde de 2,9, 3,07, 3,2.6, 5,31, 5,98,6,20, 6,45, 6>5, 6,97, 7,09, 7,69, 7,80, 7,92, 8,11, 8,O, 8,37, 8, 77, 8,96, 9,10, 9,26, 9,47, 9,63, 10,78, 11,78, lez, 07, 13,15 et 13,38 .microns. Le spectre ultraviolet de l'acétate d'actinoboline dans un tampon de phosphates as nH 7 est caractérisé par un Llaximum à une longueur d'onde de 264 millimicrons; dans l'acide cblorhydrioue 0,1 N, de 262,5 milll--niicrons; et dans l'hydro-
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xyde de sodium 0,1 N, de 289 millimicrons.
EMI3.3
Le Vf leur Rf de l'acétate d'actinoboline D.f'ns un système N-bvtéinol (10), acide acétique (1), eau. (4) se trouve cl,:ns: l g8. ;.le dh 0,12 ?J, 0,19, cette valeur re-présentr.nt-le rD1Jport, du
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mouvement sur une bande de papier ascendante du front de solvant
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a.u Mouvement de 1acétate d'sctinoboline. Le titrage par fixation d'hydrogène cte l'ac4.tate d'actinoboline dans 1'eau. indique des pK à 4,6, 7,5 et 8,8.
Un autre des sels mentionnrs, le sulfate d'pctil1.0bolir+e,
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est une substance blanche, cristalline, stable qui est très soluble
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dans l'eau et très peu soluble cU ns 1',ahanol absolu et d'autres. solvants orsanicues moins polaires co::zme l'acétone, 1':thcr, etc..
Une analyse tY:?1.l!ue du. sulfate d'actinoboline obtr'nu cnnforFl( '11Emt à la: 'Or'-'sente invention indique la présence de 42,0 à 42,5% de carbone, de 6,6 à 6,7% d'hydrogène, de 7,5 à 7,8% dl, 7ote, Gic 15,7,' de sulfate 10[1;.(lU8 et de 0,4 à 1,06% de cendres. Le titrage par fi- é xation d'hydrogène du sulfate cl'1ctinoboline dans l'eau doilne des plii - à 7,5 et 8,8, cu qui indique l'absence d'une fonction crrboxyle (pT±â 4,5). La formule P*.L ' 13"?/2 7 "2 4 pour le sulfate d3pcti-nn'holine est tar'e -.-i,,r des preuves.
Le sulfate d'actinoboline possède des .;C'Ctx'6. uniques d't7TJ- \ sorntion cte l'infrarouge et de l'ultrrviolet. Le spectre infrarouge du sulfate d'actinobniino est cr'I'r,cterÜ',é r; r des : :1.r.=<ii,ia aux lonsueurs suivantes ,1'nn.',c, <..>, pr 1-më<= en micrO'loS: 2 , Qo , j , z à , 5,90, 6,00, 6,18, 6,39,6,59,7,16, 7,5, 8,12, 8,21, 8,75, 8,96, 9,15, 9,32,
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3!aE, 11,20, 12,IÍO et 13,] 6. le f')ectre ultr,'vil)let dhns un'tampon ru'; 1;:.. t<=r -c nI{ 7 est ciri et'ri:" ' ;)r'r une absorption :::1fximum à ,'J.i . 1 i LI. L .d. c1'ons; d: tm de l'rcide chlorhydrique 0,1 Il, à 263 milli- ...j{:1'lH1:" ut ,1: n:; {': -L-lhy.-Iroxrdo de soc"..ill'1 0,1 N, à 288 ?illi:zicrons.
L5-etinoboline et ses sels scindes forcent des complexes c vec des '.1{tE.UX. Le c,m¯plc-- Ó'"lui:J.iniu,ll cic l'çctinoboline est une substance ,-i-iorphe blanche ayant une rotation optique ,L aJ 26 de + 13$ ?'i.1% d2.ns un tampon de phosphates de pH 7,0. Le maximum d'absorption de 1-lultreviolet du complexe d' Flu.;:1iniu:n se "1'o0.ui t
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pour une longueur d'onde de 263 millimicrons.
EMI4.3
L'actinoboline peut être prepprée cOnfOl'r:l.:ment à 1 présente invention en cultivent un organisme appela ;t:ctolvces griseoviridus YF.r. ê'trofrciens d,-ns des conditions é.rtificielles
EMI4.4
EMI4.5
dans un milieu nutritif approprie et en séparant 7¯'r:ctinoboline d4sir'e du milieu, de prc'ff'rence :91".1' des };rocr1cl,';s chr#:H.tof::rplJtques.
L'actïnoboline est le plus eventageuserlent isolée per des procèdes sous la forme du sulfate. La production de 1'actinoboline est
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décrite ci-après.
EMI4.7
Le Streptomyces griseoviridus VEr. atrofeciens est un microorganisme jusquà présent inconnu qui apparaît dpns les sols.
Des cultures de ce nicroorg::nisme meuvent être obtenues en préparant une sur-pension drus l3eFu st r3.le d'un échantiilon de gol qui en
EMI4.8
contient, en laissant déposer les particules les plus lourdes, en
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étendant l' suspension de sol surn2geente obtenue par dilution en s'rie sur des pl:-cue's'd'a['r nutritif, en incubant les placues à 24 à 28C pour assurer des croissances d.e i croorcizismes et en transplantent les crnisoxncef individuelles choisies ressemblant au S. griseoviridus var. atrofa.ciens sur des plaques d'agar nutritif frais.
Par sélections et tr:.nsT1JDntetions r''''p''tces de croisnces cç.r2ct'ristic,ues et non cnntrixin<1.es sur des plaques d-',lc-,er nutritif
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frais, on obtient des thalli constituant des cultures pures du microorganisme désiré. ,
EMI4.11
Le .ê.t. griseoviri..ius var. atrofl?ciens est un iieinbre aérobie
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à sporulation aérienne de l'ordre Actinonycetale et appartient au genre Streptonyces CO('Ulle il est décrit dans la sixième édition du 4a--Qual of Det8rmin-.tive Bnct(0riolog:z de :ergey. Cultivé sur un milieu d' F'.g::<,r lyc':ro1-f'u.L)t;,r.....ine, le mycélium subst.rat:Ü primaire est jaune a jaw1e-vert, devenant parfois noir, le mycélium aérien est jaune-vert clir i roe;e, et il se ioriàe 1'J2rfois di-ns le substrat une couleur vert-noir n noir.
Sur un milieu, cl'["/;F.-r Y:1th::tic....ue-C'...'1li,- âon, le¯ .1yCélium substratol est gris-vert Y noir, le mycélium- aérien est vert c1<..i1' 1. rose et il sc forme dtns le substrat une couleur vert-noir \ noir. Sur le milieu â' .ga r glucose-tryptone, le .;.1ycÓlium 'substrp.tc.1 est gris-vert à noir, le =t.ijrJ6li.um 2.érien .f:st rose et devient rc.rfois vert et il se forme dans le substrat une couleur noir-vert \ noir.
Sur un milieu d'agar 11 sporulation dLnderson le mycélium substre.tE.1 est orsnge-jaune 4 brun, le r.ij,+J41,iiri <:érien est rose et il devient parfois vert et il ne se forme peu ou pas'du tout de coloration dans le substrat '. Le mycélium aérien de cet organisme sur ce milieu d'agar est quelquefois péris de gouttelettes hyalines et la coloration ;se présente souvent en bandes concentriques de blanc, de rose et parfois de vert. Les colonies sont d'abord humides, circulaires et convexes, et deviennent habituellement plus tard dressées ou pulviniformes avec des centres déprimes et
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des surfaces radicalement rainurées et froncées irrégulièrement. Les bords sont d-abord unl3 et deviennent plus tard ondulés.
Les formu- les des milieux de culture citées dans ce paragraphe sont données
EMI5.3
dans le Bulletin of the Torrey fiot.nicil Club, Volume 82, page 110, 1955.
Les hyphes aériennes primaires sont modérément longues et
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comportent des branches latérales bouclées et s;irc,1<Ees apparaissant seules ou en touffes. Les parties distales des hyphes sériennes se subdivisent en chaînes de spores monoJell1qlaires, sphériques à allongés.
EMI5.5
Dans un milieu d'agar sylithétique, on obtient une croissan- ce bonne à dense avec la L-arabinose, le cellobiose, la dextrine,
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le dextrose, le D-gi;1;,ctose, le glycérol, l'i-inocitol, le 1±vulose, le maltose, le D-:na nnitol, le D-mannose, l'fmidon, le t.r:>hzr¯lase ou le D-rylose; une croissance m-"diocre avec le lactose et la salicine;
et on n'obtient aucune Jr;>1,ssi.nJe avec 1':.rlonito1, l'esculine, le diileitoi., l'inul5.ne, le ' Mitose, le 'libiose le rr fr'inose, lc rh[l:1nOS3, le D-sorbitol ou le saccharose corine sources de carbone. f,or'r-nisme licu('fie 1 p:é.1r.tine, w1is il ne se forme dpns le milieu que peu ou pas de coloration. D'orsvni.-^cie pep- - m tonise égE lCY.1cnt le li-it de tournesol, la réaction àu substr-t.
EMI6.2
devencnt besique.
EMI6.3
Le couleur verte du at?yc'1? izTn, aérien de Se ariseovirtdus var. trofciens ressenble 1 celle de S.riseus et la couleur rose du myc':liulIl s6rien du S. griseoviridus var. atroCaciens ressemble il celle du S. lavendulee; j'lais S. sri s eovi ri dus var. s.trofcciens diffère de ces deux ecpàces par leur ,;1icrornorpholorie.
^. griseoviridus sp, nov., une source des G.¯.tibiotir;tzes, 12 griseoviridine et la viridogris0ine, ressemble cgplement à 18 fois'au griseus et au S. lavendu1pe par In couleur du mycélium a,rrien, et son hyphe érienne resrexble z celle de S. vri0eoviridus v r. atrofaciens en cê qu'elles forment des boucles et des spires latérales. Le strentomvces gr4 seoviridv,s¯ v['r. atrof2ciens ressemble â S. griseoviridus par 1:-' couleur du I1ycúliU11 aérien, mr-:.is les riiu3.nces roses et vertes ne sont pas pussi foncées. griseo<riridus var. atrofr"ciens devient noir dp.ns un iiiilieu d'egar sym.thraique, tandis que S. griseoviridus ne le 'fit pas. . nriseoviridus vr.
Ptrofaciens ne forme uns s hbituellem¯ent de couleur son1.bre drns un agar de sporulation d'lmdersofi, un, aar nutritif Difeo, ou la gélatine, tondis que c'es-t le cas pour S. g1-iseoviiidus col-liqe le montre le tableeu 1. Dans les essais d'utilisation de carbone; 8, grifeoviridus var. atrofaciens utilise l'i-inosit.^1, tandis que S. griseovi-' ridus n'utilise pas l'iriositol; et S. ri:e-v.ri.:us vsr, atrofaciens n'utilise pis de rhemnoee, tandis que S. griseovirid11s le fait, comme le Dontre le tableau 2.
L
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TABLEAU 1
EMI7.1
Comparaison des colorations de Se riseoviridus var. atrofaciens et de S. griseoviridus cultivés sur divers milieux d'agar.
EMI7.2
Milieu deagar Caractéristcue S.,- griseoviridus var. S.griseovij'16'\): âtrofaciens NRRL 2427
EMI7.3
<tb> Glycérol <SEP> Mycélium <SEP> substratal <SEP> Jaune <SEP> à <SEP> jaune-vert <SEP> à <SEP> noir <SEP> Jaune <SEP> cla.ir <SEP> à <SEP> gris
<tb> AsDaragine <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Jeune-vert <SEP> clair <SEP> (18-D, <SEP> E-1)* <SEP> Rose-tan <SEP> à <SEP> gris-vert
<tb>
EMI7.4
rose (2-A, B-8) (11-Be C..2)
EMI7.5
<tb> Substrat <SEP> parfois <SEP> noir <SEP> Néant
<tb> Amidon <SEP> Mycélium <SEP> substratal <SEP> Vert-gris <SEP> à <SEP> noir <SEP> Tan-gris <SEP> à <SEP> noir
<tb> .
<SEP> Synthétique <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Gris <SEP> clair <SEP> à <SEP> rose <SEP> Tan <SEP> à <SEP> brun <SEP> clair
<tb> Substrat <SEP> Vert-noir <SEP> à <SEP> noir <SEP> Néant <SEP> ou <SEP> gris <SEP> clair
<tb>
EMI7.6
Glucose Mycélium substratal Vert-gris à noir Brun clair à rouce-bruii à r.cL' 1.
Tryptone Hycélium. aérien Rose (2-B, C-8 à gris-rose) Rose-gris (6-C-l} à vert-brl',.," Substrat (4-C-7), parfois-verdâtre -gris 6.-C ert ,rz:r
EMI7.7
<tb> Substrat <SEP> Vert-noir <SEP> à <SEP> noir <SEP> Brim( <SEP> rouge-brun <SEP> au <SEP> voisinage
<tb> du <SEP> mycélium <SEP> substratal)
<tb> Sporulation <SEP> Mycélium <SEP> substratal <SEP> Jaune-orangé <SEP> à <SEP> brun <SEP> Brun <SEP> clair <SEP> à <SEP> brun <SEP> foncé
<tb>
EMI7.8
d'Anderson 1.iycél1uln aérien Rose (2-A, B-7.8), parfois Rose-brun (12-;
.-c,) parfoi
EMI7.9
<tb> Substrat <SEP> verdâtre <SEP> verdâtre
<tb> Néant <SEP> Brun
<tb> * <SEP> Maerz <SEP> & <SEP> Paul, <SEP> Dictionary <SEP> of <SEP> Color, <SEP> deuxième <SEP> édition, <SEP> 1950
<tb> Nutritif <SEP> Mycélium <SEP> substratal <SEP> Gris-.jaune <SEP> clair <SEP> Jaune <SEP> à <SEP> vert-gris <SEP> à <SEP> brun
<tb> Difco <SEP> Mycélium. <SEP> aérien <SEP> Blanc <SEP> (clair-semé) <SEP> gris-rose <SEP> à <SEP> gris-vert
<tb> Substrat <SEP> Néant <SEP> Brun <SEP> clair
<tb>
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TABLEAU 2 Comparaison de l'utilisation de carbone de
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S.zriseoviridus vax, atrofpciens et de s. griseovirudus
EMI8.2
Source de carbone S.arïseoviridus S. riseoviridus , v2.r.
a.trofa ciens NRRL 2427
EMI8.3
<tb>
<tb> L-Arabinose <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> à <SEP> 4 <SEP>
<tb> Rhamnose <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> à <SEP> 4
<tb> D-Xylose <SEP> 3 <SEP> à <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> à <SEP> 3
<tb> Dextrose <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> à <SEP> 4
<tb> D-Galactose <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> à <SEP> 4
<tb> Lévulose <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> à <SEP> 2
<tb> D-Mannose <SEP> 4 <SEP> . <SEP> 2 <SEP> à <SEP> 4
<tb> Cellobiose <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> à <SEP> 4
<tb> Lactose <SEP> 0 <SEP> à <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> à <SEP> 4
<tb> Maltose <SEP> 3 <SEP> à <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> Mélibiose <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Saccharose <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> . <SEP>
<tb>
Tréhalose <SEP> 4 <SEP> 4
<tb>
<tb> Mélézitose <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Raffinose <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> . <SEP> Dextrine <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> Inuline <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Amidon <SEP> 3 <SEP> à <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> à <SEP> 4
<tb> Adonitol <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
EMI8.4
Dt.7.citol 0 0
EMI8.5
<tb>
<tb> Glycérol <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> à <SEP> 4
<tb> i-Inositol <SEP> 4 <SEP> 0
<tb>
EMI8.6
D-Mannitol 4 4
EMI8.7
<tb>
<tb> D-Sorbitol <SEP> 0 <SEP> Q
<tb> Esculine <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Salicine <SEP> 0 <SEP> à <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> à <SEP> 1
<tb>
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#######################-- - .#######. ¯¯¯¯
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<tb>
<tb> Témoin <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
0 = aucune croissance 1 = croissance médiocre 2 = croissance assez bonne 3 = bonne croissance 4 = croissance très dense.
* Chaque source de carbone est essayée à une concentration de 1% en
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poids des le milieu d'ager s1thtique de Pridham et Gottlieb, J.Bact., 2±, 103, 1948.
Etant donné que S. griseoviridus ver. atrofpciens ressemble étroitement à S-griseoviridus par la morphologie et sous certains rapports par la couleur du mycélium aérien, mais diffère de S.
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griseoviridus (1) par la formation d'une colorption noire prononcée
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.i-'l'1.' 11'1 ,-;¯ j-:1 ( 7 - r- T. c;yl1 i;O i '.' " , ,. ne fOl"',18 pà. de couleur fonc'2 I. 113 certu 1,ni '.milieux c^i2',:.ep.;'31': -3.0! l'f..2otl? OrP'%'llirue, (2) par l'nti.li:-,1 tinn de cer't: ins sources de carbone, et (3) pr les types de substances c'lclDorêes, la: J)eÏ1H,ndèresse considère du'il appartient pu G '<r-j.seoviridu8, Mai:: représente une v-'i'tw nouvelle de cette espace. Les cultures de SI griseoviridus var.
Etroff'ciens sont naintenues àr:ns une collection de cultures permanentes de 1:)2 r1<e , D,,Vis --,z Co'.'many Culture -bureau, Detroit, 'l-1Íchi>{an, sous le n .05000, et drns la Culture Collection of the Fernent8tion Division; Nothern Utilization ese2rch Branch, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, sous le n NRRL 2563.
Li production d'E'ctinoholine conformément à la présente invention est effectuée en i-1-loculEnt à un milieu nutritif aqueux stérile le S. priseoviridus ver. atrofeciens, en incubant le milieu inoculé dans des conditions aérobies aseptiques à une température comprise entre environ 20 et 35 C, en séparant la matière solide présente dans le mélange de culture et en isolant l'actinoboline désirée du liquide aqueux de culture.
On peut, pour 1-'inoculation, utiliser des spores de S.
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griseoviridus ve.r. 'atrofaciens. Des suspensions aqueuses de ces substances contenant une proportion mineure de savon ou d'un autre
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agent mouillant peuvent 4grl< ment être utilisées. Pour les grandes fer-,iient.-tions, il est préférable d'utiliser des bouillons de culture agitas, aérés, jeunes, vigoureux du microorganisme.
Les milieux luhtritifs aqueux al1I-'rO'priés sont ceux qui ont un pH compris entre 6 et $,5 et contenant une source de carbone assimilable et une source d'azote et de matières min.éreles. Comme sour- ces de carbone assimilable, on peut.utiliser soit les hydrates de
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carbone ou des mélanges d'hydrrtes de carbone se trouvant dans le commerce. Quelques exemples des matières qui conviennent à cette fin
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sont le glucose, le d-mannose, le d-galactose, le sirop de mais, l'a- midon, l'amidon soluble, lesliqueurs de me.lt, les mêlasses de candiserie, les amidons hydrolyses, la glycérine et d'autres matières
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10 nes.
he ouratité d'hydrate de carbone présent dans le milieu nutritif n'est passgécialement criticue et elle peut varier d'en- vi ron0,5% à 5% en poids du poids' total du milieu.
La source d'azote du milieu nutritif peut être de nature organique, inorganique, ou organique-inorganique mixte. Comme exem- ples des nombreuses substances azotées qui peuvent être utilisés dans le milieu nutritif, on peut citer les amino-aeides, les peptones les protéines hydrolysées et non-hydrolysées, la farine de poisson, la farine de soya, la liqueur de macération du mais, les extraits de viande, la farine d'arachide, des nitrates inorganiques, l'urée, des sels d'ammonium, etc.. En aison de la nature brute de la plu- part des substances azotées courantes, la quantité au'il faut incor- porer dans le milieu nutritif varie quelque peu avec la pureté. On peut, toutefois, affirmer que pour des applications pratiques, les matières azotées ne doivent pas dépasser 6% en poids du poids total du milieu de fermentation.
Une certaine quantité de sels minéraux est nécessaire pour obtenir les meilleurs rendements en a ctinoboline. En général, de nombreuses matières brutes, par exemple la liqueur de macération du mais, les résidus de la fermentation du butanol-acétone, les pré- parations de levure, la farine de soya, etc., contiennent des sels minéraux en quantités suffisantes. Cependant, dans le but d'assurer la présence dans le milieu de quantités adéquates de constituants minéraux, il est habituellement avantageux d'ajouter une petite quantité de sels inorganiques comme le chlorure de sodium, le bicar- bonate de sodium, le carbonate de cs.lcium, l'acétate de sodium,etc.
La concentration préférée en sels minéraux se situe entre 0,1 et 1% du milieu nutritif.
La culture de S.griseoviridus var. atrofaciens dans le milieu nutritif aqueux peut être faite de plusieurs façons différen- tes. Par exemple, le microorganisme peut être cultivé dans des conditions aérobies sur la surface du milieu ou encore sous la sur- face du milieu, c'est-à-dire dans des conditions de submersion, si
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de l'oxygène est fourni simultanément.
Le procédé préféré de production de l'actinoboline à grande échelle comprend l'utilisation de cultures submergées ou profondes de S. griseoviridus var, atrofaciens. Suivant cette forme de réali- sation de la présente invention, on inocule à un milieu nutritif aqueux stérile le S. griseoviridus var. atrofaciens et on l'incube sous agitation et aération à une température située entre environ 20 et 35 C, jusqu'au moment où une concentration maximum en acti- noboline est atteinte dans le liquide de culture. Le temps néces- i saire pour cette production maximum d'actinoboline varie avec les di- mensions et le type' d'équipement utilisé.
Par exemple, dans la fer- mentation industrielle à grande échelle, par exemple celle effectuée dans des récipients de fermentation du type cuve, la production maximum d'actinoboline est atteinte en environ trois à six jours.
L'incubation peut être limitée à des temps plus courts, mais les rendements sont habituellement moins bons. Des périodes d'incuba- tion plus longues ne semblent pas réduire la quantité d'actinoboline présente dans le liquide de culture. Lorsqu'on utilise des flacons à agitation pour l'incubation, le temps de production maximum peut 'être quelque peu plus long que celui nécessaire pour les cuves de fermentation à grande échelle.
Dans les conditions de culture sub- mergée, le microorganisme se développe en particules distinctes plus ou moins dispersées dans tout le milieu nutritif, contrairement à la pellicule plus ou moins continue qui' se forme sur la surface du milieu dans le procédé de culture superficielle'. En vertu de cette répartition de l'organisme dans tout le milieu, des volumes importants du milieu nutritif inoculé peuvent être cultivés à la fois dans les grand récipients et cuves utilisés habituellement dans l'industrie de la fermentation.
Les cuves de fermentation sta- tionnaires munies de dispositifs d'agitation et d'aération appro- priés, de même que les tambours de fermentation rotatifs horizontaux se sont avérés particulièrement intéressantssous ce rapport.'Toute- fois, pour la préparation de quantités relativement petites de l'a.n-
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: ' , : -.:"1,¯\1 ')'1: c:a.:Lt¯te:¯ c.u :croor;nisre, le :oroc/d/, de culture : c3;: t m,e 1)\ nt e,-.'cu bé 0; n de petits flacons ou de petits 1,,c,Dients qui sont soit agitas, soit secoués par des moyens mécani- ques appropriés.
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L'agitation et l'aération du rzÉlange de culture peuvent être réalisées de plusieurs façons.
L'agitation peut être assurée par des turbines, des palettes, des hélices, ou par d'autres dispositifs d'agitation mécanique, en faisant tourner ou en secouant la cuve de fermentation elle-même, par divers dispositifs de pompage'ou par le passage d'air dans le milieu. L'aération peut être réalisée en injectant de l'air dans le milieu de fermentation par des tuyaux ouverts, des tuyaux perforés, des milieux poreux de diffusion, par exemple des batons de carbone, de carborundum, du verre fritté etc., ou encore en pulvérisant, en projetant ou en déversant le mélange dans ou à travers une atmosphère contenant de l'oxygène.
Pendant et après'l'incubation, la présence du produit désiré et la quantité approximative de celui-ci dans les liqueurs de fermen- tation et analogues peuvent être établies par le procédé d'essai de disque-plaque. Cet essai est avantageusement effectué en introduisant une partie aliquote représentative d'une solution ou d'une suspension sous examen dans une culture sur plaque du microorganisme Sarcina lutea PCI 1001 W dans des conditions normalement favorables à la croissance du microorganisme :et en observent l'inhibition de la croissance dans la zone d',introduction. Etant donné que l'actinoboline est cara.ctéristiquement antagoniste de la. croissance de l'organis- me, la superficie de la zone résultante d'inhibition varie directement avec la quantité d'actinoboline présente.
A titre d'illustration, une bière contenant 120 unités d'actinoboline par cm3 et diluée à 120 fois donne une zone d'inhibition d'un diamètre moyen de 14',6mm.
Pour la commodité, une "unité" d'actinoboline est définie comme la quantité donnant la zone d'inhibition de diamètre mentionné. Dès lors, les concentrations d'échantillons de puissance inconnue ' pèsent être facilement déterminées ou tapées en utilisant le
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¯jj... procédé indiqué dans lequel le diamètre moyen de la zone résul-
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t: nte d'inhibition de la croissance de a.rcina lutea PCI 1001 W constitue une mesure directe, en relation avec les paramètres zone-
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dilution é'doptr's, de la quantité d'actinoboline présente. Une desc'L'iption des détails de ce procédé de titrage et de la préparation des plaques de culturé est donné ci-après.
Pr(parption des plaoues de culture Un agar nutritif /"Penassay Seed Agar iDifco) 0 composé de
Extrait de boeuf (Bacto) 1,5 g
Extrait de levure (Bacto) 3,0 g
Casitone (Bacto) . 4,0 g
Peptone (Bacto). 6,0 g
Dextrose (Bacto) 1,0 g
Agar 15,0 g
Eau distillée 1 litre est placé dans,des flacons de Roux, inoculé avec Sarcina lutea PCI 1001 W et incubé à 28 C pendant 18 heures.
La culture est récoltée
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en un bouillon -bouillon Penassay (Difeo)¯7 cmpopé de
Extrait de boeuf (Bacto) 1,5g
Extrait de levure (Bacto) 1,5 g
Peptone (Bacto) 5,0 g
Dextrose (Bacto) 1,0 g Chlorure de sodium 3,5 g
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Phosphate dipota.ssiuue 3,68 g Phosphate monopotassioue 1,32 g
Eau distillée 1 litre et la suspension est réglée de façon du'une dilution 1 :10 donneune transmission de lumière de 16% dans un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 555 millimicrons.
La suspension ainsi obtenue est mélangée avec de l'agar d'en.. scmencement de la composition mentionnée plus haut à une concentra.-
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tion de 1;600. Des pla,teé;ux lnesltrpnt 5 x 10 pouces (12,7 x 25,4 em) sont alors pr;lparés, chacun contenant 25 cra3 d'agar ensemencé, et maintenus sous refrig(r"tion jusqu'à l'utilisation finpie.
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Procédé de titrage.
Un échantillon d'actinoboline de puissance inconnue est dilué dans un trmpon de phosphates de pH 7,8 dans la mesure néces- saire pour forner une solution ayant une concentration de 0,1 M par rapport au phosphate et d'approximativement 10 à 20 unités d'actino- boline par cm3. On place un disque ou un tampon de papier filtre d'un o-emi-pouce (12,7 mm) sur le plateau ou la plaque de culture préparé de la manière décrite ci-dessus et on le dose simultanément avec 0,08 cm3de 1',échantillon dilué. Le plateau ou plaque est in- cubé à 37 C pendant 18 heures, après quoi on mesure le diamètre, en millimètres, de la zone d'inhibition.
La mesure observée est-compa- rée avec une coube normalisée reproduisant les diémètres moyens d'une zone d'inhibition correspondant à des solutions d'actinoboline de -puissances connues dans la gamme de 1 à 120 unités par cm3.D'après cette courbe, on établit la concentration de l'échantillon examiné.
Après 1-'achèvement.de la phase de fermentation du proces- sus, on sépare la matière solide présente dans le mélange de cul- ture par des procédés quelconques appropriés, tels que la filtra- tion, la centrifugation, etc., et on isole l'actinoboline désirée du liquide de culture résiduel. L4isolation est commodément accom- plie par adsorption sur et élution d'un adsorbant de l'actinoboline tel que du charbon activé et ces opérations sont suivies par)la con- centration de l'éluat.
Le produit peut être avantageusement obtenu sous forme d'un concentré purifié par une nouvelle adsorption et une nouvelle élution d'un adsorbant échangeur de cations à base d'alumine-silicate tel que le Decalso et puis de charbon activé.:
Le concentré purifié peut être transformé sous une forme cristalline soit par précipitation fractionnée, adsorption sur et élution d'une résine échangeuse de cations, soit par traitement à l'aide d'un agent de chélation.
Dans la préparation de l'rctinoboline sous forme concentrée, comme indiqué ci-dessus, le liquide de culture restant après sépara- tion de la matière solide -du mélange de culture de fermentation
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est réglé à un pH dans la. gamme approximative de 3 à 6 et il est ensuite soumis à une adsorption sur du charbon de bois activé et à une élution, après quoi le concentré est isolé de l'éluat, de nréfé- rence par la concentration de ce dernier.
L'adsorption peut être avantageusement effectuée en ajoutant une certaine quantité de charbon actif, !le préférence avec une même quantité d'un auxiliaire de la filtration comme la terre d'infusoire, au liquide de culture et en séparant du liquide le charbon contenant l'actinoboline adsor- bée désirée. En outre, l'adsorption peut être réalisée en faisant passer le liquide de culture contenant l'actinoboline à travers une colonne d'adsorption contenant du charbon actif de préférence en mélsnge avec une quantité analogue d'un auxiliaire de filtration, par exemple la terre d'infusoire. Après l'adsorption, l'adsorbant est lavé à l'eau et l'actinoboline est éluée avec un éluant approprie, per exemple de l'acétoneaqueuse diluée.
A cette fin, de l'eau con- tenant environ 20 à 80% d'acétone est préférée. L'actinoboline sous forme concentrée peut être obtenue à partir de l'éluat résultant, en concentrant ce dernier sous vide.
Pour purifier le concentré d'actinoboline, on soumet une solution aqueuse du concentré à une nouvelle adsorption sur et à une nouvelle élution d'un silicate synthétique servant d'adsorbant traité et réglé au préa.lable par de l'acide à un pH situé dans la . gamme de 5,5 à 6,5. Conformément à ce procédé, l'actinoboline adsor- bée est lavée à l'eau et luée ensuite au. moyen d'un éluant appro- prié, par exemple l'acétone aqueuse, l'acide acétique aqueux, des mélanges aqueux acides d'alcools etc..
Un éluant préféré pour cet usage est un mélange -contenant 5% d'acide acétique, 10% d'éthanol et 85% d'eau. Après l'élution, l'éluant est séparé et le produit ré¯- siduel est dissous dans l'eau et soumis de nouveau à une adsorption sur et à une élu.tion du charbon activé de la. matière indiquée plus haut. L'éluat résultant peut être concentré pour donner la forme acétate de l'actinoboline sous une'forme purifiée qui peut être transformée ensuite si on le désire, en acétate cristallin d'actino- boline.
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'Un des procédés satisfaisants pour obtenir de l'acétate d'ac- .. tinoboline cristallisé consiste à soumettre des solutions du concen- tré purifié à une précipitation fractionnée au moyen de divers solvants. Les systèmes solvants utilisés sont tels que l'actinobo- line reste en solution, tandis que toutematière étrangère présente éventuellement est amenée à précipiter, une séparation étant alors opérée de la phase acétate d'actinoboline de la phase solide. Confor- mément à un mode préféré de réalisation de ce procédé, on ajoute de l'éthanol absolu à ,une solution,aqueuse d'actinoboline et on sépare le précipité résultant par,des procédés quelconques appropriés.
On ajoute de l'acétone à la solution résiduelle et on sépare le.préci- pité résultant. La solution résiduelle est concentrée jusqu'à siccité extraite à l'acétone et, le précipité résultent est retiré.
.On. concentre le liquide résiduel jusqu'à siccité, on laisse cristal- liser le résidu et, si on le désire, on recristallise le résidu , cristallin dans un solvant approprié tel que l'acétone, l'éthanol chaud etc.
L'acétate d'actinoboline cristallisé peut également être obtenu par des procédés chromatographiques. Dans un procédé chroma- tographique préféré on fait passer une solution aqueuse du concentré purifié dans une colonne contenant une résine échangeuse d'ions car- boxyliques dans le cycle d'hydrogène et on lave la colonne à l'eau.
Le produit de percolation et le liquide de lavage sont recueillis et séchés-par congélation sous vide poussé. Le produit résiduel résultant est cristallisé dans un solvant approprié comme l'acétone chaude, l'éthanol chaud, etc.. Le produit cristallin peut être de nouveau recristallisé, si on le désire, dnns des solvants semblables.
L'acétate d'actinoboline cristallisé peut également être . obtenu par un traitement au moyen d'un agent de chélation. Dans un procédé préféré, on ajoute une solution aoueuse d'un agent de chélation tel que de l'acide éthylènediaminetétraacétique au concen-: tré purifié jusqu'au moment où la solution résultante est exempte de coloration. On concentre la solution incolore jusqu'à siccité à
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l'état congèle et on soumet le produit résiduel à une extraction au moyen d'un solvant approprié tel que l'acétone. Le solvant est chassé de l'extrait par évaporation.
On ajoute un solvant immiscible à l'eau tel que de l'acétate d'éthyle au produit résiduel et on're- cueille le précipité qui se forme et on le recristallise dans un solva.nt approprié tel que l'éthanol absolu. '
L'acétate d'actinoboline peut être commodément transformé en sulfate correspondant en acidifiant une solution aqueuse de l'a- cétate par de l'acide sulfurique, en mettant'en contact la solu- tion acidifiée avec un adsorbant échangeur d'anions sous la forme , hydroxyle, en séparant l'adsorbant de la solution et en 'séparant le sulfate d'actinoboline de la. solution.
La base libre actinoboline peut être commodément obtenue à partir d'une solution aqueuse de 'sulfate d'actinoboline en mettant cette dernière solution en contact avec un adsorbant échangeur d'anions sous la forme hydroxyle pour provoquer l'adsorption des anions, en lavant l'adsorbat à 1'eau, en recueillant le liquide de lavage alcalin et en séparant l'actinobo-.
. line du liquide de lavage par séchage par congélation ou par d'au- tres procédés appropriés.
L'actinoboline et ses sels sont utiles comme agents de chélation. En particulier, l'actinoboline et ses sels sont des agents u.tiles pour éliminer des traces de fer de produits biologi- ques et médicaux aqueux et de solutions aqueuses destinées à l'ad- ministration par voie parentérale. Par exemple, une solution contenant le chlorure de tétraéthylammonium quaternaire (chlorure d'Etamon) et une quantité contaminante indésirable de fer soluble est traitée par une quantitééquivalente d'actinoboline ou un de ses sels pour former un complexe fer-actinobline, la solution résultante est mise en contact avec du charbon activé- exempt de fer et la solu- tion exempte de fer purifiée est séparée du charbon en abandonnant le complexe 'de fer non désiré sous forme d'un adsorbat sur le char- bon.
L'actinoboline et ses sels possèdent également une activité antibactérienne et antimétabolique. L'antibiotique est particulière-
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ment non toxique et il est utile, sous une forme dosée appropriée comme agent pour combattre l'infection bactérienne. L'actinoboline est un antibiotique dit à grand spectre et elle est particulièrement utile contre les infections dues aux streptocoques.
L'invention est illustrée par les exemples suivants : . EXEMPLE 1.
On introduit 16 litres d'un milieu nutritif de la composi tion suivante : ..Pour cent
Glucose monohydraté 1,0
Farine de soya 1,0
Estomac de porc, extrait par une . solution saline 0,5
Chlorure d'ammonium 0,167
Chlorure de sodium' 0,5 Carbonate de calcium 0,1 Hydroxyde de- sodium (10 N) pour,porter le pH à 7,5, et
Eau pour faire 100,0 dans une cuve de fermentation de 30 litres muni d'un arroseur, d'un agitateur, de chicanes et d'une conduite de prélèvement d'échantil- .Ions, et on stérilise le milieu en le chauffant à 121 C pendant 2 heures.
On refroidit le milieu auquel on inocule 20 cm3 d'une sus- pension de spores provenant de deux cultures inclinées sur agar à sporulations d'Andersen de S, griseoviridus var. atrofaciens dans une solution stérile d'heptadécyl-sulfate de sodium à 0,1%. Le mélange de culture inoculé est incubé à 26 C pendant 57 heures pen- dant lesquelles il est agité à 230 tours par minute, tandis qu'on introduit de l'air stérile dans le milieu au moyen de l'arroseur à raison de 16 litres par minute. On utilise le mélange de culture incubé résultant comme inoculum pour une nouvelle incubation décrite immédiatement ci-dessous.
On introduit 64 litres de milieu nutritif ayant la composi- tion donnée ci-dessus en parties égales dans 4 récipients de fermen-' tation de 30 litres et on stérilise les diverses parties par un chauffage à 121 C pendant 2 heures et on les laisse refroidir;
On inocule au milieu nutritif de chacune des cuves de fermentation
800 cm3 du mélange de culture incubé décrit ci-dessus et on l'incu-
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be a .. OC j7E:114 'nt 72 heures au cours desquelles on assure une pgi'tetacfr tt une rr ti.on cotrune on l's de=crit ci-dessus. Le moussaka au cnnr tlc ¯L' i¯rtcuh. tion est combpttu ps'r lsdition, suivsnt les néces- .itr:, d'un...:"lange st(,rile de lard cru et d'huile minérale contenant r!e& :ono- et des di-lyccrides.
Périodiquement, tout au long de l'incubation, on titre l'activité de l'actinoboline sur des échantillons représentatifs prélevés sur le mélange de culture et on obtient des résultats dont celui ci-après est typique :
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<tb>
<tb> Temps <SEP> d'incubation <SEP> Activité <SEP> de <SEP> l'actinoboline-
<tb>
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n c o 1,'z (heures) (unii:, rr cm3) ,,¯,,,,,
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<tb>
<tb> 0
<tb> 8 <SEP> 5.
<tb>
16 <SEP> 23
<tb> 24 <SEP> 45
<tb> 32 <SEP> 47
<tb> 40 <SEP> 63
<tb> 48 <SEP> 78
<tb> 56 <SEP> 105
<tb> 64 <SEP> 120
<tb> 72 <SEP> 121
<tb>
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d,tp.r¯,1in"<'e nar l'inhibition, de IF croissance de Sarcine. lu.tea PCI 1001 W.
Les mélanges de culture incubes résultants sont réglés par de l'acide sulfurique concentré au pH 2,0 et filtres. La filtration est réalisée en forment une suspension avec 2,0% (poids/volume) de terre d'infusoire (par exemple la Celite n 545) et en faisant passer la suspension à trc.vers un lit préperé au moyen d'une suspen-
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sion à 2,0; (poids/voltmE) de terre d'infusoire dsns l'eau. Les 43 litres de l'ensemble des filtrats, titrant 115 unités par cm3, sont réglés par une solution d'hydroxyde de sodium 10 N au pH 4,0 à la.,,5, on a.joute 2,2 kg de charbon de bois activé (Darco G-60) et 2,2 kg
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de terre d'infusoirp et on agite le .,i'lange pendant une demi-heure et on le filtre ensuite dans un châssis-presse sous succion.
On lave le gâteau de filtrr.tion avec 20 litres d'c:v, on l'enlevé et on le met en suspension dr'ns 1'eau. et on l'introduit au moyen d'une pompe dans une colonne en verre de6 pouces(15,2 cm). Le lit de la colonne est chargn sous une pression de 5 livres/pouce cprr (0,35kg/cm2) et élue ensuite avec 20 il 25% d'acétone aqueuse. On obtient l'acti-
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noboline brute en s^parrnt l'acétone de 1" 'luflt r.sultint et en
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ehûtt le-'re'ëidu par -e#ir:tt1r 'b progression de la s4parétion de ; aotin:ob(1:1!ine de . .la ca.on,ie' s't çontr3Iée n titrant diverses fractions de 1: êlua:t req!1!il1. àqé6j îe . i'passage" du front d' 8.cé'tone
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et on obtient -le résultat typique suivant :
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::=
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, . ?raEio2- c.uat ' 'q.s 3 é - .Activité de 1 ' ctinob- , . gramme, s line (uni tp s/m)?) -Premier litre é,-Pr,'s ,le " '35 '4. ''- 10 \'le'litre', suiVRH.t' '936''"'' 42 les qua''9'litTes suivants ! 172-. les qnafWe 'litieÉ suiven%s j ¯ ' ,.' ' 44 les dix-neuf litres sui;ran 1 39 les quatre litres,, suivants. :: -±, 5 ' , 29 les quatre litre,$ uivts ,yi ,T7?74 - - 26
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'Ça'Nouvelle, purification du produit ci-dessus est effectuée , eorame , sç.it,': . on dissout a 5 ; dfactinoboline brute titrant 20 unités par mg dans 0'ç' d'eau et on'f.it passer 1D solution.dsns un éch.-n.
" geur en, .colonne $r4pàré'l en ôe sant un itagma aqueux de 62 en3 de sili' c&te'double de sôàiµà lét" d' al di1wl .(D.eealxo) rëg-le au pil 6 G.r de 1'.cil'chlorhdier'di:t \..'' et.bnne pouce 5lez cru) .
' lRctd-e' chlorhydiqne'dHue dans/une colcnne de pouce (2 54'on). lave ;11. cpjlàÉe iÔv)l '' - \"t t 1'<µiule pir m;<lc nage ' On lave la. colonne 'sec 100 ' \.deau et oh l'rlue per un Tn..-'imge d'acide âcµ tiqube .1 (5$) ;',d' érthanoX (10%) et d eau (85%). On recueille l?-6luat carecteTisé'pap,une'couleur rose, on le concentre nar éir;.po- .. ration sous vide pour chas-s-e'r l'éthanol, et on le sèche par conpds.- -. tions.' dissout'.le. résidu'sec 4,-ns 25 cm 3'd -eau et on introduit la solution din.9 ua caloni7.è d'adsorption préparée en chargeant une suspension:w3 de 10,g de-charbon activé (Darcq G-60) et .de 10 p, de terre d' inîusoire,.dans une colonne ,d'un diamètre de 1 pouce (2,54 cm) .
On lave ' la colonne avec 100 ça d'eau et on ensuite avec 250 cm d'une solution aqueuse d'acétone à 20%. On recueille l's=lut t caractérisé par une. couleur rouge distincte et on .concentre une pir- 'tie de 7. .u.t :pr éypor.tiQEL sous vide pour chasser 1'r c -tOne. on sèche.ensuite par Qon.glatio a.ne pr,tie de 11 solution acueuse exeMpte â'ac6ton?: -Lé produite'qui titre,72 imités di-ctinobolîile sous 1a, i'orxae.,dtt.'.psr est carsatceris : par un fa&yirium .'d'absort.ôn d .^.1-txai:ae . ,xx,e longueur d'onde de 263 milli Y erona -(Fc0.;¯22 *'',', rt .'. ¯".,.,.* ' ;y ,;;¯c,",*,dZ'n,Qt.3.n= ;rst,o1a-éu anus la forme cristal-
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Ji; i;> en a,pi¯,,mcnt un <uaF1congue des oroed's c), b), et c). : a) On ¯':isrout 212 -"', .=#v¯ produit s'chn c-::E:
u. dans de l' c,u (0,1 cri et on ajoute 3 C11 de .ëth11o1 absolu, à la solution.
On ï'î.r centrifugation le précipite rose résultent et on ajoute 6 c'fi d'acétone eu liquide suirne.e:,l.fi.- Le qui se forme est nat, cent -Lion et le liquide surnag-ernt est concentr:' jüsq,u'à siccité. On e=-trit le résidu 118,1' 10 c:a3 d'G.ectone
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chaude et on sépare le précipita résultent par centrifugation.' Le
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1#quiâe .c,'toniçue est concentre 5 5 cm j on ajoute 2-3cm3 d't:ther et on sépare par centrifugation le précipité rose résultant.
Le liquide surnegéant est e;:en8 à siccit2 et le produit résiduel, qui cristallise reidos, est recristallisé dpns 1''acétone. Le produit cristallisa l':c,,4tc d'.ct,'¯.oboli¯2e, fond partiellement à 128-13qoC, se resolictiiie environ 145 C et fond finc.IE:;:ent avec à.,ico'i.Jos1t4,on à 263-266 C. 1-.vec référence a l'inhibition de la croissr.nce de S a reine lutea PCI 1001 1.{, le produit titre s0 uni t,>; par Big.
Le titrsge par fixation d'hydrosëne d'une solution aqueuse du prao- 'duit indique des pi±± de 4,6, 7, et 8,8 et'un poids 'noiF.culaire arproxi-nstif de 368. b) On introduit 125 cii3 d'une solution aqueuse exempte d'acétone obtenue 3. nartir de l' lue t #xentioiii,é en dernier lieu et contenant 149.000 unitcs d'actinoboline sous forme de 1'<> ta.te dans léàl ÙC)1É llgeitt en colonne préparent en chergeent 25 c d'une résine ..du type acide c",,''('boxyliclle (!mlerl3¯t;.e IrC-50) :::OU>'3 forme acide dans i'une colonne de 1 pouce (2,54 cm) de diamètre (volume retenu, 15 c-en 3 vitesse d'ecoul:2ent par 'gr;.irit4, 60 cm3 par heure). L'effluent est recueilli et Ic colonne est lev'e avec 15 c\"l3 d'eau. On recueille
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l'effluent et les eaux de lavage et on les concentre sous vide et
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DU les sèche 'f'sr conqXli>t4.on.
Le moitié résiduel est dissous dsns
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de l'acétone bouillante et la solution est concentrée par évaporation lente du solvant. 'G';:c!tc.te d'ëC'L:i.ilo'OOlixlecristal7¯isc résultant est recristallise dans de l' ét:J.8.l1.01 absolu chaud. Les ¯roLricvt(=s de ce produit sont 1<]=enticpes i-, celle du produit a) ci-dessus.
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.
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c) On ('-ll1.Centre sous vide urie e.rtie de 330 ci:3 de lléluct <i;1-iannl c; 1 l Üer lieu pour chasser IJ ac(tonei Une solution :¯l11217se d'.ci-le ethy1211ed c^asi2let'E'tr2.Ct'-aj;Çtte z3 Molaire <.ye.nt uli pli de 6,0 est ajoutée et rfsiduy coritenant 260.000 v.n3,té9 d'acti- noboline sous forme acétate jusqu'au moment où la solution résultan-
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te devient incolore et on sèche ensuite la solution par c:or1;le.tiÓn.. On extrait le produit résiduel par de l'acétone chaude, on concentre la solution dans l'acétone et on ajoute un excès d'acétate
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d4th yle. L'acétate d'actinobollne qui ge s,pare sous forme d'un précipité incolore est purifié ptr recristallisttiort dsns de 1'lt%- nol absolu cheud.
Les propriétés du produit cristallisa pont les mêmes que celles des produits de a) et de b) ci-dessus.
EXEMPLE 2.
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On dissout 100 mg d'acétate d'satinoi>oline crtsti11sé dans 10 cn3 d'eau et on règle le'Il à 1,2 per de l'9ide sulfurique aqueux dilué. Apres un repos de 5 heures à la température ordinaire, on mélange la solution avec 5 car '3 d'une résine échangeuse d'anions faibles (Amberlite lR-45) sous la forme hydroxyle et on agite le
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mélange jusqu'au moment où le pH s'élève à 3,5. 'Onséptre la rs1ne par filtration et on sèche le filtrat par congélation. Le produit, le sulfate d'actinoboline peut être purifié par recristallisation dans de l'éthanol aqueux.
EXEMPLE 3.
On percale lentement une solution de 1 g de sulfate d'actinoboline cristallisé dans 15 cm3d'eau dans une colonne contenant 12 cm3 d'une résine échangeuse d'anions faibles (Amberlite 1R-45) sous la forme hydroxyle. On lave la colonne à 1'eau jusqu'au moment où les produits de lavage ne sont plus alcalins. Onrecueille l'effluent et les produits de lavage et on lessèche à l'état congelé
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sous vide.. Le produit sec, levctïnobolinc, contient, par L'nalyse moyenne, 50,22% de carbone, 6,88% d'hydrogène et 9,17% d'azote.
EXEMPLE 4.
On ajoute une solution de 500 mg de chlorure d'aluminium
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;c11.S 10 cm3 d','twl101 a une solution de 200 mg d'acétete Ilïctinôboline criPtollisé è!Pl1S 2 cin3 d';th2nol absolu chaud. Il se forte un précipite' qui, au refroiaisse=acnt . OOC, est isolé par fi1tr;: tion et lavé par de l'.'''thanol froid et par cle l'ccétate c1'.' t:lyle. On sèche le gâteau de filtration sous vide et'on le dissout dans l'eau. On sèche le solution aqueuse par congélation et on triture le produit résiduel avec de l'éthanol absolu et on le sèche ensuite sous
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vide. Le complexe résultant d3altiiiiini-tun et d'Elctinoboline a une rotation opticjue fJ 0 6 de + 1380 (l'; dans un tampon de phosphates, pli 7,0).
Le produit accuse un ueximum. car?ct'-''ristique d'ebsorI1tion de l'ultra:violet à une longueur d'onde de 263 millimicrons.
R E V F N D I C A T ION S .
1. Actinoboline et ses sels-acides et basiques.
2. L'actinoboline sous forme de la base libre.
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3. J:..C.;tE,te d' 2ctinoboline. 4. Sulfate d' a ctinoboline.
5. Procédé de production d"actinoboline, caractérisé en ce qu'on inocule à un milieu nutritif aqueux stérile le Streptomyces
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gtiseoviriàas ver. 8.trof;::ciens, on incube le milieu inoculé', on sépa- re le matière solide du milieu après l'incubation et on isole
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l'actinoboline 'de le solution aqueuse.