BE562074A

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Publication number: BE562074A
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Description


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   La présente invention a pour objet la fabrication de la tétracycline, et plus particulièrement, elle s'occupe d'inhiber la chloruration   ermentative   dans'les fermentations chlorotétracycline/tétracycline, de manière à obtenir des rendements élevés en tétracycline o   On   a découvert récemment que les microorganismes du genre Streptomyces, qui produisent la   chlorotétracycline   produisent aussi de la tétracycline, particulièrement si la concentration en chlorures du milieu, de fermentation est main- tenu faible.

   On peut y parvenir en prenant des milieux de fermentation dont les ions chlorure sont exclus, soit en pré-' parant le milieu de fermentation avec des constituants exempts de chorures, soit en traitant le milieu par des agents qui é- liminent ou séquestrent les ions chlorure, les rendant ainsi indisponibles pour la fermentation de la chlorotétracycline. 



   Malheureusement, certains des constituants les plus efficaces de milieux de fermentation pour la préparation des antibiotiques du type tétracycline contiennent des quantités notables d'ions chlorure. La liqueur de m acération de mais est l'une des substances nutritives les plus efficaces pour la préparation 'des antibiotiques du type tétracycline, ainsi que de beaucoup d'autres antibiotiques.   Apparemment,   cette matière contient quelque chose qui est spécialement recherché par le microorganisme fermentateur.   On   obtient donc les rende-' ments d'antibiotique les plus élevés lorsqu'une quantité de liqueur de macération de mais est contenue dans le milieu nu- tritif aqueux. 



   Mais la liqueur de macération de mais contient une quantité appréciable d'ions chlorure, et si l'on veut   mainte-   nir la formation de chlorotétracycline à des niveaux raison- 

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 nablement bas, il est considéré comme nécessaire jusqu'à présent de réduire la teneur en chlore de cette matière. 



  Il en est de même pour plusieurs autres matières nutritives de provenance naturelle , qui sont avantageusement utilisées dans le processus de fermentation . 



   Plusieurs moyens ent été suggérés pour réduire la teneur en ions chlorure des solutions nutritives aqueuses servant à la préparation de la tétracycline. La précipitation de l'ion chlorure sous forme de chlorure d'argent est un moyen très efficace pour réduire la teneur en ions chlorure. 



  Cependant, c'est un procédé coûteux, nécessitant dés matières premières coûteuses, un matériel spécial en un gaz toxique, l'hydrogène sulfuré, pour la récupération de l'argent . 



   Des résines échangeuses d'ions ont aussi été propo-' sées pour réduire la teneur en ions chlorure des milieux de fermentation. Ces substances tendent à éliminer certains sels et substances organiques de composition non identifiée, qui 'sont des constituants désirables des milieux de fermentation. 



  Par suite, on peut obtenir de faibles rendements d'antilbio- tique quand on utilise des solutions nutritives,qui ont été traitées au préalable par des,résines échangeuses d'ions pour éliminer les ions chlorure. 



   Les systèmes d'appauvrissement en chlorures lais- sent encore beaucoup à désirer, en tous cas, à cause des investissements de capitaux nécessaires, des moyens relati- vement compliqués nécessaires pour éliminer les ions chlorure du milieu de fermentation, et aussi parce que le milieu de fermentation peut, en pareil cas, être composé seulement de matières premières dont les ions chlorure sont faciles à é- liminer, ou qui sont naturellement pauvres en chlorures . 



   Il a été aussi proposé de déplacer l'équilibre 

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 dans une fermentation   tétracycline/chlorotétracyclinê,   en utilisant du bromure, ce qui, apparemment, inhibe la forma- tion de la chlorotétracycline à certains égards . 



   La présente invention, dans le but d'obtenir des rendements élevés de tétracycline, a recours à un milieu de fermentation dans lequel il n'est pas nécessaire d'éliminer les ions chlorure du système. La présente invention est basée sur la découverte d'après laquelle, lorsqu'on ajoute à un milieu de fermentation contenant des chlorures un inhibiteur de chloruration du   type'décrit   ci-après, les activités des ' microorganismes se détournent de la synthèse de la   chloroté-'   tracycline, au profit de la synthèse de la tétracycline. 



  L'invention est d'une importance pratique considérable, parce qu'elle supprime la dépense et les inconvénients occasionnés par l'élimination des ions chlorure du milieu de fermentation.' Ainsi, suivant la présente invention, on peut facilement convertir un milieu de fermentation de chlorotétracycline contenant des chlorures en un milieu de fermentation de tétra- cycline, en ajoutant, au milieu nutritif, une quantité rela- tivement faible des nouveaux inhibiteurs de chloruration dé- crits ci-après. La présente invention ne s'occupe pas parti- culièrement de tel ou tel microorganisme particulier, sauf en ce sens qu'elle s'occupe des microorganismes qui produi- sent à la fois de la chlorotétracycline et de la tétracycli- ne par biosynthèse ferrnentative.

   Pour autant que l'on sache actuellement, tous ces microorganismes sont du genre Stre to-   myces.   On utilise de préférence l'espèce S. aureofaciens, qui produit de la   hhlorotétracycline   dans des milieux de fermentation contenant des ions chlorure, et aussi de nom-   .breuses   mutantes naturelles et artificielles, et bien entendu ces microorganismes produisent aussi de la tétracycline quand 

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 ils sont privés d'ions chlorure. Plusieurs autres microorga- nismes producteurs de tétracycline sont déjà connus, comme étant prétendument des espèces distinctes'de   Streptoniyces,   comme le S. viridifaciens, le S.savamaensis, le S. feofaciens, et d'autres encore.

   Les données morphologiques publiées sur ces microorganismes ne sont pas suffisamment concluantes pour déterminer s'il s'agit ou non d'espèces nouvelles, ou simple- ment de couches de   S.     aureofaciens.   Mais quoi qu'il en -soit la présente invention n'est pas basée sur le choix d'une es- pèce particulière de microorganisme, mais comme on l'a indi- qué plus haut, elle concerne l'utilisation de   certains inhi-.   biteurs de chloruration qui détournent l'activité des microor- ganismes de la synthèse de la chbrotétracycline, au profit de la synthèse de la tétracycline. Par conséquent, la présente invention s'applique à tout   microorganisme   qui produit de la chlorotétracycline et de la tétracycline . 



   Les inhibiteurs de chloration de la présente inven- tion sont des pyridazines substituées en 3,6, qui peuvent ê- tre représentées par la formule générale suivante' : 
 EMI4.1 
 dans laquelle X est un atome d'hydrogène, de brome, de chlore ou un groupe   RGONH   dans lequel R est un radical alkyle inférieur, tel que méthyle, éthyle, propyle, isopro- pyle, butyle, pentyle, hexyle, etc ; Y est un. atome de sou- fre ou un groupe SO2 ;et   Z,est   un atome d'hydrogène ou un radical méthyle ou benzyle. 



   Comme dans le cas où   l'on   utilise des ions bromure pour inhiber la chloruration fermentative, les inhibiteurs de la présente invention peuvent être quelque peu toxiques pour 

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 le microorganisme, spécialement quand on les utilise à forte concentration. Heureusement, de très petites quantités des inhibiteurs de la présente invention diminuent très notable- ment' la formation de chlorotétracycline. Une partie par mil- lion présente déjà un certain effet. Habituellement, la gam- me préférentielle sera de 5 à 100 parties par million envi- ron,mais on peut utiliser 500 parties par million, ou même davantage si on le désire. De façon générale, plus on ajoute d'inhibiteur, moins   :il se   formera de chlorotétracycline.

   Par contre, à mesure que l'on ajoute de nouvelles quantités d'in- hibiteur, les effets toxiques commencent à sefaire sentir, et le rendement total d'antibiotique diminue. Par suite, on n'a observé jusqu'à présent aucun avantage à dépasser 500 parties par million environ, et encore moins dans certains cas . 



   Un autre avantage de la présente invention est que les inhibiteurs de chloruration   permettent   d'utiliser une large variété de souches de S. auréofaciens,   Autrement   dit, avec les   sytèmes   d'appauvrissement en   clibrures,   les souches qui produisent le plus de tétracycline,   c'est-   à-dire les souches balayeuses de chlorures, ne pouvaient pas être uti- lisées, bien souvent, parce qu'elles donnaient aussi un taux . élevé de   chlorotétracycline.   liais avec la présente invention, on peut utiliser ces souches facilement, car les inhibiteurs de chloruration permettent de déplacer facilement l'équilibre en faveur de la tétracycline. 



   Les conditions de la fermentation sont généralement les mêmes que pour les méthodes actuellement connues de pré- paration de la tétracycline ou de la   chlorotétracyclinepar   fermentation. Autrement dit, le milieu de fermentation con- 

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 tient les principes nutritifs et substances minérales usuels. 



  Des substances nutritives appropriées, qui peuvent fournir les éléments'nécessaires, sont notamment   l'amidon,   le dextro- se, le sucre de canne, le glucose, la   mélasse,   la farine de soja,, la farine d'arachide, la levure, les extraits de viande, la peptone,, le sulfate d'ammonium, l'urée,, la   liqueur-   de macé- ration de mais, les produits solubles de distillerie,, la fari- ne de   poisson,,   et d'autres substances courantes.. Les sels inorganiques. comprennent par exemple le carbonate de calcium, 
 EMI6.1 
 le sulfate d"ammonium, le chlorure d*ammoui#H et les divers oligo-éléments tels que le manganèse, le cobalt,, le zinc, le cuivre, le fer etc... 



   Les autres conditions- générales de la fermentation, telles que le pH, la température,   leftemps ,  le. taux dtaéra- 
 EMI6.2 
 tion la préparation de linoculum,,; la stérilisation, 11--ilio- culation,, etc....; sont ordinaires, et peuvent être similaires à celles qui servent à la préparation de la chlorotétracycli. ne, comme indiqué dans le brevet belge n  487.301 du 11.2.1949 et à la préparation de la   tétracycline,   comme indiqué dans 
 EMI6.3 
 le brevet belge rta 53(Y983 du 'l...a.1.54 pour t "Perfec- tionnements aux   antibiotiques..   



   De même, la récupération de la tétracycline à par- tir de la liqueur de fermentation est usuelle et n'a pas be- soin   d'être   décrite, car de nombreuses méthodes ont été pu- bliées pour récupérer la tétracycline à partir des liqueurs de fermentation. 



   Dans l'exemple qui suit, les rendements en tétra- cycline et en chlorotétracycline sont exprimés en micro- grammes par centimètre cube. On dédrira l'invention plus en détail à propos de l'exemple précis qui suit . 

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    EXEMPLE .-    
On prépare connue suit un milieu de fermentation de chlorotétracycline du type qui peut servir à la production sur une grande échelle, et qui contient une grande quantité d'ions chlorure: Farine de mais 14,5 g/1 amidon 47 liqueur de macération de mais 25   CaC03   9 (NH4)2SO4 5,6 MnSO4(70%)   0,080   CoCl2.6H2O   0,005   huile de saindoux   3%   en volume chlorure d'ammonium 1,7 g/1 
A ce, milieu, on ajoute, dans des opérations sépa- rées, des quantités variables de pyridazines substituées en 3,6 indiquées dans le tableau ci-dessous.

   On distribue les milieux,   enquantités   appropriées, dans des flacons, on sté- rilise, on inocule avec un inoculum végétatif de S.aureo- faciens (souche S77), et on fait incuber à   26 ,5C   sur une secoueuse rotative pendant 96 heures. Puis, on détermine la teneur en chlorotétracycline et en tétracycline. Les résul- tats obtenus sont donnés dans le tableau ci-dessous. 

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  TABLEAU.- 
 EMI8.1 
 
<tb> Composé <SEP> parties <SEP> par <SEP> Chlorotétra- <SEP> Tétracycli- <SEP> % <SEP> de <SEP> tétracycli-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> million <SEP> cycline <SEP> ne <SEP> ne
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb>  g/cm3 <SEP>  g/cm3
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 3-chloro-6- <SEP> ' <SEP> 0 <SEP> 6050 <SEP> 497 <SEP> 7,5
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> méthylpercap- <SEP> 5 <SEP> 4550 <SEP> 515 <SEP> 10,1
<tb> 
<tb> 
<tb> topyridamine <SEP> 10 <SEP> 3360 <SEP> 525 <SEP> 13,5
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 25 <SEP> 1690 <SEP> 407 <SEP> 19,4
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 3-chloro-6- <SEP> 0 <SEP> 6050 <SEP> 497 <SEP> 7,5
<tb> 
<tb> 
<tb> méthylsulfo- <SEP> 5 <SEP> 2250 <SEP> 3975 <SEP> 63,8
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> nyl-pyridazine <SEP> 10 <SEP> 950 <SEP> 4190 <SEP> 81,4
<tb> 
<tb> 
<tb> 25 <SEP> 255 <SEP> 4250 <SEP> 94,

  3
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 3-chloro-6- <SEP> 0 <SEP> 5750 <SEP> 775 <SEP> 11,9
<tb> 
<tb> 
<tb> mercapto- <SEP> 5 <SEP> 3580 <SEP> 2690 <SEP> 42;9
<tb> 
<tb> 
<tb> pyridazine <SEP> 10 <SEP> 1040 <SEP> 4455 <SEP> 81,0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 25 <SEP> 180 <SEP> 2325 <SEP> 92,8
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 3-acétamido-6- <SEP> 0 <SEP> 5050 <SEP> 590 <SEP> la,5
<tb> 
<tb> 
<tb> benzylmercapto- <SEP> 5 <SEP> 3100 <SEP> 700 <SEP> le,4
<tb> 
<tb> 
<tb> pyridazine <SEP> 10 <SEP> 2600 <SEP> 885 <SEP> 25,3
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 25 <SEP> 1750 <SEP> 885 <SEP> 33,6
<tb> 
 
REVENDICATIONS.-   @@@@@@@@   
1.- Procédé de préparation de la tétracycline, dans lequel on conduit une fermentation aérobie en milieu de fer- mentation aqueux contenant des ions chlorure, avec un micro- organisme du genre Streptomyces,

   en ajoutant au milieu   un   inhibiteur de   cbloruration   de formule : 
 EMI8.2 
 dans   laquelle K   est un atome d'hydrogène, de brome ou de chlore ou un groupe   RCONH   dans lequel R est un radical alkyle inférieur; Y est un atome de soufre, ou un groupe SO2, et Z est un atome d'hydrogène ou un radical méthyle ou benzyle;

Claims

on inhibe ainsi la formation de la chlorotétracycline et on obtient des quantités notables de tétracycline.

2.- Procédé suivant la revendication 1, dans le- quel on ajoute au milieu de fermentation aqueux 5 à 500 parties par million de l'inhibiteur de chloruration .

3.- Procédé suivant la revendication 1, dans lequel EMI9.1 l'inhibiteur est la 3-chloro-6-métkiylmercapto-pyridazine.

4.- Procédé suivant la revendication 1, dans lequel l'inhibiteur est la 3-chloro-6-niéthylsuliony>.pyridazine.

5.- Procédé suivant la revendication 1, dans lequel l'inhibiteur est la 3-chloro-6-mercaptopyridazine.

6.- Procédé suivant la revendication 1, dans lequel ltinhibiteur est la 3-acétamido-6-benzyl-merca.ptopyridazine.

7.- Procédé de préparation de la tétracycline, en substance, tel que décrit plus haut.

8.- Tétracycline, lorsqu'elle est obtenue par le procédé suivant l'une ou l'autre des/revendicatins précédentes